PL186761B1 - Sposób otrzymywania roślin odpornych na wirus Y ziemniaka /PVY/ - Google Patents

Abstract

1 Sposób otrzymywania roslin odpornych na wirus Y ziemniaka, na drodze transformacji genetycznej materialu roslinnego, znamienny tym, ze genom rosliny-gospodaiza transformuje sie za pomoca binarnego wektora zawierajacego nie ulegajaca translacji wstawke fragmentu genu NIb polimerazy RNA wirusa Y ziemniaka, pozbawionego kodonu inicjatorowego, w wersji sens lub antysens, o sekwencji: 5' GATC TAATCGATCA TGATGTAGTG GTGGAGCAAG CTAAGCATTC TGCATGGATG TTTGAAGCCT TGACAGGAAA TTTGCAAGCT GTCGCAACAA TGAAGAGCCA ATTAGTAACC AAGCATGTAG TTAAAGGAGA GTGTCGACAC TTCACAGAAT TTCTGACTGT GGATGCAGAG GCAGAGGCAG AGGCATTCTT CAGGCCTTTG ATGGATGCGT ATGGGAAAAG CTTGCTAAAT AGAGATGCGT ACATCAAGGA CATAATGAAG TATTCAAAAC CTATAGATGT TGGTGTCGTG GATCGGATGC ATTTGAGGAA GCCATCAATA GGGTTATCAT CTACCTGCAA TGTGCACGGC TTCAAGAAGT GTGCATATGT CACTGATGAG CAAGAAATTT TCAAAGCGCT CAACATGAAA GCTGCAGTCG GAGCCAGTTA TGGGTGCAAA AAGAAAGACT ATTTTGAGCA TTTCACTGAT GCAGATAAGG AAGAAATAGT CATGCAAAGC TGTCTGCGAT TGTATAAAGG TTTGCTTGGC ATTTGGAACG GATCATTGAA GGCAGAGCTC CGGTGT AAGG AGAAGATACT TGCAAATAAG ACGAGGACGT TCACTGCTGC ACCTCTAGAC ACTTTGCTGG GTGGTAAAGT GTGTGTTGAT GACTTCAATA ATCAATTTTA TTCAAAGAAT ATTGAATGCT GTTGGACAGT TGGGATGACT AAGTTTTATG GTGGTTGGGA TAAACTGCTT CGGCGTTTAC CTGAGAATTG GGTATACTGT GATGCTGATG GCTCACAGTT TGATAGTTCA CTAACTCCAT ACCTAATCAA TGCTGTTCTC ACCATCAGAA GCACATACAT GGAAGACTGG GATGTGGGGT TGCAGATGCT GCGCAATTTA TACACTGAGA TTGTTTACAC ACCAATTTCA ACTCCAGATG GAACAATTGT CAAGAAGTTT AGAGGTAATA ATAGTGGTCA.... PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania roślin odpornych na wirus Y ziemniaka (PVY) metodą inżynierii genetycznej wprowadzania do uprawnych odmian rodziny

186 761

Solanaceae odporności transgenicznej na wirus Y ziemniaka, skierowanej zarówno przeciw dawniej występującym izolatom, jak i należącym do nowej podgrupy szczepu nekrotycznego.

W Europie Centralnej w ciągu ostatnich dziesięciu lat pojawiły się nowe izolaty zaklasyfikowane do szczepu nekrotycznego PVY (PVY^N). Wirus ten poraża ziemniaki, pomidory, paprykę, tytoń, czyli podstawowe rośliny uprawne rodziny Solanaceae. Nowe izolaty przełamują relatywną, częściową odporność wprowadzoną do odmian uprawnych tradycyjnymi metodami hodowlanymi.

Istnieją odmiany ziemniaka skrajnie odporne na PVY, których odporność na ten wirus nie została dotychczas przełamana żadnym ze szczepów pVy. Lecz takich odmian jest niewiele i nie zawsze mają one wysokie wartości użytkowe czy konsumpcyjne.

Okazało się, że wykorzystanie metod inżynierii genetycznej może pozwolić na szybsze uzyskiwanie odmian odpornych, które łączyłyby odporność na PVY z wysoką jakością bulw i/lub odpornością na inne niż PVY patogeny, czy szkodniki.

Dotychczas prowadzono próby genetycznej modyfikacji ziemniaka w celu uzyskania odmian odpornych na wirus PVY na drodze krzyżowania odmian uprawnych z gatunkami niosącymi gen odporności. Nie dawały one zadowalających rezultatów, ponieważ powszechnie uprawiane odmiany nie posiadają dostatecznej odporności na nowe izolaty PVY\

Nie udało się dotychczas otrzymać ani tradycyjnymi metodami hodowlanymi ani metodami biologii molekularnej, roślin odpornych na nowe izolaty zaklasyfikowane do szczepu nekrotycznego PVY (PVY’¹’).

Nieoczekiwanie okazało się, że metodą według wynalazku można otrzymać rośliny uprawnych odmian z rodziny Solanaceae odpornych na wirus Y ziemniaka, zwłaszcza na szczepy należące do nowej podgrupy szczepu nekrotycznego.

Sposób według wynalazku polega na tym, że genom rośliny-gospodarza transformuje się za pomocą binarnego wektora zawierającego nie ulegającą translacji wstawkę fragmentu genu NIb polimerazy RNA wirusa Y ziemniaka, pozbawioną kodonu inicjatorowego, po czym uzyskuje się materiał roślinny w znany sposób.

W sposobie według wynalazku jako binarny wektor do transformacji stosuje się plazmid pROK2, do którego wprowadzono wstawkę genu NIb, w wersji sens lub antysens o sekwencji:

5' GATC TAATCGATCA TGATGTAGTG

GTGGAGCAAG CTAAGCATTC TGCATGGATG TTTGAAGCCT TGACAGGAAA

TTTGCAAGCT GTCGCAACAA TGAAGAGCCA ATTAGTAACC AAGCATGTAG

TTAAAGGAGA GTGTCGACAC TTCACAGAAT TTCTGACTGT GGATGCAGAG

GCAGAGGCAG AGGCATTCTT CAGGCCTTTG ATGGATGCGT ATGGGAAAAG

CTTGCTAAAT AGAGATGCGT ACATCAAGGA CATAATGAAG TATTCAAAAC

CTATAGATGT TGGTGTCGTG GATCGGATGC ATTTGAGGAA GCCATCAATA

GGGTTATCAT CTACCTGCAA TGTGCACGGC TTCAAGAAGT GTGCATATGT

CACTGATGAG CAAGAAATTT TCAAAGCGCT CAACATGAAA GCTGCAGTCG

GAGCCAGTTA TGGGTGCAAA AAGAAAGACT ATTTTGAGCA TTTCACTGAT

GCAGATAAGG AAGAAATAGT CATGCAAAGC TGTCTGCGAT TGTATAAAGG

TTTGCTTGGC ATTTGGAACG GATCATTGAA GGCAGAGCTC CGGTGTAAGG

AGAAGATACT TGCAAATAAG ACGAGGACGT TCACTGCTGC ACCTCTAGAC

ACTTTGCTGG GTGGTAAAGT GTGTGTTGAT GACTTCAATA ATCAATTTTA

TTCAAAGAAT ATTGAATGCT GTTGGACAGT TGGGATGACT AAGTTTTATG

GTGGTTGGGA TAAACTGCTT CGGCGTTTAC CTGAGAATTG GGTATACTGT

GATGCTGATG GCTCACAGTT TGATAGTTCA CTAACTCCAT ACCTAATCAA

TGCTGTTCTC ACCATCAGAA GCACATACAT GGAAGACTGG GATGTGGGGT

TGCAGATGCT GCGCAATTTA TACACTGAGA TTGTTTACAC ACCAATTTCA

ACTCCAGATG GAACAATTGT CAAGAAGTTT AGAGGTAATA ATAGTGGTCA

186 761

ACCTTCTACC GTTGTGGATA ATTCTCTCAT GGTTGTCCTT GCTATGCATT ACGCTCTCAT TAAGGAGTGC GTTGAGTTTG AAGAAATCGA CAGCACGTGT

GTATTCTTTG TTAATGGTGA TGACTTATTG ATTGCTGTGA ATCCGGAGAA

AGAGAGCATT CTCGATAGAA TGTCACAACA TTTCTCA 3', przy czym gen wirusowy wprowadza się do genomu rośliny, korzystnie przez agroinfekcię.

Wprowadzona wersja genu odpowiada skróconej formie genu NIb z izolatu PVY, bardzo podobnego genetycznie do nowych izolatów szczepu nekrotycznego, zidentyfikowanych w Europie Centralnej (Marie-Jeanne Tordo V., Chachulska A.M., Fakhfakh H., Le Romancer M., Robaglia C., Astier-Manifacier S. (1995), J. Gen. Virol., 76, 939-949; Chachulska A.M., Chrzanowska M., Robaglia C., Zagórski W. (1997), Arch. Virol., 142, 365-375).

Poniżej przedstawiono przykład wykonania wynalazku nie ograniczający jego zakresu.

Przykład.

1. Konstrukcja wektorów binarnych i transformacja bakterii A. tumefaciens

Plazmid pBSS₁₅, niosący 3' końcową część genomowego cDNA PVY -Fr, (Robaglia C., Durand-Tardif M., Tronchet M, Boudazin G., Astier-Manifacier S., Casse-Delbart F. (1989) J. Gen. Virol., 70, 935-947) został poddany trawieniu enzymem restrykcyjnym BglII w celu wyizolowania fragmentu 1.2 kb obejmującego gen NIb, bez 400 C-końcowych nukleotydów. Fragment ten został oczyszczony z żelu agarozowego przy użyciu preparatu Glass Milk (Bio 101). Wektor binary pROK.2 został strawiony enzymem BamHI i zdefosforylowany. Fragment polimerazy PVY poddano ligacji z wektorem binarnym pROK.2 i wprowadzono do komórek bakterii kompetentnych E. coli szczepu HB 101 poprzez elektroporację. Transformanty hodowano na podłożu LB z dodatkiem kanamycyny (50 pg/ml), kolonie bakterii niosących plazmidy zawierające wstawkę wirusową identyfikowano izolując plazmidy metodą lizy alkalicznej i trawiąc je enzymami restrykcyjnymi Xbal lub Sa1I. Wyselekcjonowano dwa klony - pROKY, i pROKY?, pierwszy niosący wstawkę wirusową w orientacji sens, drugi zawierający wstawkę w orientacji antysensownej. Elektrokompetentne komórki bakterii A. tumefaciens szczepów C58 pmp90 i LBA 4404 transformowano wektorami pROKY 1 ipROKY? metodą elektroporację Obecność wstawki wirusowej w koloniach kanamycyno-odpomych potwierdzano trawiąc enzymem restrykcyjnym Hindlll plazmidy otrzymane metodą lizy alkalicznej. Sekwencję sklonowanego fragmentu genu polimerazy PVY przedstawiono powyżej, zaś zastosowaną strategię klonowania na załączonym rysunku.

2. Transformacja tytoniu metodą agroinfekcji

20-30 ml pożywki Lb, zawierającej kanamycynę (50 mg/l) inokulowano 0.05-0.1 objętości dwudniowej hodowli bakterii A. tumefaciens, zawierających plazmidy pROKYt i pROKY₂ i hodowano przez noc w 28°C. Bakterie odwirowywano przez 10 min przy 6 krpm i zawieszano w 1 ml płynnej pożywki MS (Murashige, T, Skoog F. (1962), Physiol. Plant., 15, 473-497). Krążki liściowe (1 cm/1 cm) wycinano ze sterylnego materiału roślinnego, raniąc je w kilku miejscach skalpelem i umieszczano w 20 ml płynnej pożywki MS. Przygotowywano około 100 krążków dla każdego konstruktu, do pożywki dodawano bakterie i inkubowano krążki z bakteriami przez 10-20 min. Następnie szybko osuszano krążki na sterylnym papierze, przenoszono je do szalek Petriego na pożywkę MS zawierającą NAA (0.1 mg/l), szalki zaklejano parafilmem i inkubowano 2-3 dni w ciemności w 25°C. Po przepłukaniu sterylną wodą krążki przenoszono na pożywkę MS zawierającą NAA (0.1 mg/l) i BA (1 mg/l) a także selekcyjne antybiotyki - kanamycynę (50 pg/ml) i cefotaksym (500 pg/m). Czynność tę powtarzano co dwa tygodnie, regenerujące pędy ukorzeniano na stałej pożywce MS, zawierającej antybiotyki.

Otrzymane transgeniczne rośliny tytoniu są morfologicznie identyczne z roślinami nietransformowanymi.

3. Transformacja ziemniaka metodą agroinfekcji (według Matini N., Egen M., Runtz I., Strittmatter G. (1993), Mol. Gen. Genet., 236, 179-186; zmodyfikowana).

Bakterie A. tumefaciens niosące plazmidy pROKYj i pROKY2 hodowano przez jedną lub dwie noce w 28°C w pożywce YEB zawierającej odpowiednie antybiotyki (inokulując 5 ml pożywki jedną kolonią bakterii). 100 pl hodowli Agrobacterium wgłaskiwano w pożyw186 761 kę MS na szalkach Petriego. Świeżo zebrane, sterylne liście i międzywęźla cięto skalpelem, każdy fragment tkanki raniąc w wielu miejscach. Skrawki roślinne umieszczano na szalkach Petriego z pożywką MS i bakteriami; szalki inkubowano w ciemności przez dwa dni w temperaturze pokojowej, w pudełku w komorze laminamej. Następnie materiał roślinny przenoszono na pożywkę MCI z antybiotykami: kanamycyną (50 pg/ml) i cefotaksymem (500 pg/ml). Po 10-14 dniach tkanki roślinne przenoszono na pożywkę GR2 z antybiotykami, powtarzając tę czynność co dwa tygodnie. Regenerujące pędy przenoszono na pożywkę T&L z obydwoma antybiotykami.

Generalnie, wyhodowane transgeniczne rośliny ziemniaka były identyczne z roślinami nietransformowanymi.

4. Stwierdzenie obecności w genomie roślin wprowadzonego genu wirusowego

Obecność transgenu w roślinach potwierdzano metodą PCR i hybrydyzacji (metoda Southern biot).

a. Izolacja DNA roślinnego

DNA roślinny izolowano z roślin ziemniaka i tytoniu hodowanych in vitro i w szklarni. Na małą skalę, do celów PCR, izolację DNA prowadzono stosując metodę wg: Edwards K., Johnstone C., Thompson C. (1991), Nucleic Acids Res., 19, 1349, na dużą skalę - metodę wg Doyle JJ. and Doyle J.L. (1987), Phytochem. Bulletin. 19, 11-15. W pierwszej metodzie, stosowanej najczęściej, krążki liściowe ucierano w probówkach Eppendorfa odpowiednimi tłoczkami, w temperaturze pokojowej, bez buforu, przez 15 s. Dodawano 400 pl buforu do ekstrakcji (200 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS), próbki wytrząsano przez 5 s i pozostawiano w temperaturze pokojowej do jednej godziny. Po żwirowaniu (5 min przy 13 krpm), 300 pl supematantu przenoszono do nowej probówki, mieszano z 300 pl zimnego izopropanolu i pozostawiano w temperaturze pokojowej na 2 min. Próbki wirowano przy 13 krpm przez 15 min, płukano 70% etanolem, osady suszono i rozpuszczano w 50-100 pl Te. DNA przechowywano w 4°C, 2-4 pl próbki stosowano w 50 pl reakcji PCR.

b. Hybrydyzacja

Hybrydyzację produktów PCR i genomowego DNA roślin z sondą znakowaną digoksygeniną prowadzono wg przepisu producenta zestawu do hybrydyzacji bezizotopowej (Boehringer Mannheim) i publikacji: Wełnicki M. and Hiruki C. (1992), J. Virol. Meth. 39, 91-99. i Wełnicki M., Żekanowski C. and Zagórski W. (1994), Acta Bioch. Polon. 41, 473-475.

5. Analiza odporności na wirus Y ziemniaka

Transgeniczne rośliny tytoniu i ziemniaka inokulowano sokiem z roślin tytoniu zainfekowanych PVY^N-Wi, dwukrotnie rozcieńczonym wodą. Zakażano rośliny wcierając sok w liście uprzednio posypane karborundem. Obecność wirusa wykrywano metodą DAS-ELISA używając przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw PVY (z firmy Bioreba).

Rozmnożone wegetatywnie linie tytoniu pROKY 1 i pROKY2 pokolenia Ro zostały poddane testom na odporność po trzech do czterech tygodniach po przeniesieniu do ziemi. Po zainokulowaniu sokiem roślinnym zawierającym PVYN ewentualne pojawianie się objawów chorobowych obserwowane było przez kilka tygodni. Testy ELISA, wykonane około dwa tygodnie po infekcji, pozwoliły na zidentyfikowanie linii, które były częściowo lub całkowicie odporne na PVY (patrz tabela). Rośliny z tych linii nie wykazywały objawów chorobowych lub tylko bardzo słabe, ograniczone do lekkiego przejaśnienia nerwów. Wartości ekstynkcji A405 testów ELlSA były bardzo niskie. Obserwowano także „pozorne ozdrowienie”, które charakteryzowało się zmniejszeniem wartości ELISA i zanikaniem symptomów w młodszych liściach. Cztery z tych linii tytoniu zawierały transgen wyrażający antysensowny RNA.

Transgeniczne klony ziemniaka rozmnożono, przeniesiono do ziemi i uprawiano w szklarni aż do otrzymania minibulw. Bulwy zebrano, skiełkowano i posadzono w doniczkach w szklarni. Dziesięć roślin z każdego klonu zainokulowano PVY po pojawieniu się czwartego Iub piątego liścia. Testy ELISA wykonano dwukrotnie, w piątym i siódmym tygodniu po inokulacji. Wyselekcjonowano klony nie wykazujące objawów chorobowych i o bardzo niskich wartościach A405 w teście ELISA, podobnych do otrzymanych dla niezainfekowanych roślin kontrolnych (tabela). Tylko dwa z tych odpornych klonów zawierały transgen wyrażający sensowny RNA.

186 761

Wykorzystanie nie ulegającego translacji, niepełnego genu PVY, wyrażającego RNA, a szczególnie a^tysensowny RNA, powinno zmniejszyć ryzyko związane z zachodzeniem rekombinacji RNA i komplementacją zmutantowanych izolatów PVY w transgenicznych liniach. Istotnym elementem jest to, że odporne rośliny nie produkują obcego wirusowego białka, nie są więc źródłem dodatkowych antygenów.

Tabela

Wstępne badania odporności na wirus PVY transgenicznych linii tytoniu (pokolenia RO) i klonów ziemniaka.

Typ konstruktu	Liczba badanych linii	Liczba linii odpornych
Tytoń
pROKYi	18	3
pROKY2	19	4
Ziemniak
pROKYi	15	2
pROKY2	19	4

W opisie i przykładach zastosowano następujące skróty

BA - benzyloamina

NAA - kwas naftalenooctowy

DNA - kwas dezoksyrybonukleinowy krpm - tysiące obrotów na minutę rNa - kwas rybonukleinowy

Wszystkie metody nie przedstawione szczegółowo w tym opisie zawarte są w publikacji: Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania roślin odpornych na wirus Y ziemniaka, na drodze transformacji genetycznej materiału roślinnego, znamienny tym, że genom rośliny-gospodarza transformuje się za pomocą binarnego wektora zawierającego nie ulegającą translacji wstawkę fragmentu genu NIb polimerazy RNA wirusa Y ziemniaka, pozbawionego kodonu inicjatorowego, w wersji sens lub antysens, o sekwencji:

   5' GATC TAATCGATCA TGATGTAGTG GTGGAGCAAG CTAAGCATTC TGCATGGATG TTTGAAGCCT TGACAGGAAA

   TTTGCAAGCT GTCGCAACAA TGAAGAGCCA ATTAGTAACC AAGCATGTAG TTAAAGGAGA GTGTCGACAC TTCACAGAAT TTCTGACTGT GGATGCAGAG

   GCAGAGGCAG AGGCATTCTT CAGGCCTTTG ATGGATGCGT ATGGGAAAAG CTTGCTAAAT AGAGATGCGT ACATCAAGGA CATAATGAAG TATTCAAAAC

   CTATAGATGT TGGTGTCGTG GATCGGATGC ATTTGAGGAA GCCATCAATA GGGTTATCAT CTACCTGCAA TGTGCACGGC TTCAAGAAGT GTGCATATGT

   CACTGATGAG CAAGAAATTT TCAAAGCGCT CAACATGAAA GCTGCAGTCG GAGCCAGTTA TGGGTGCAAA AAGAAAGACT ATTTTGAGCA TTTCACTGAT

   GCAGATAAGG AAGAAATAGT CATGCAAAGC TGTCTGCGAT TGTATAAAGG TTTGCTTGGC ATTTGGAACG GATCATTGAA GGCAGAGCTC CGGTGTAAGG

   AGAAGATACT TGCAAATAAG ACGAGGACGT TCACTGCTGC ACCTCTAGAC ACTTTGCTGG GTGGTAAAGT GTGTGTTGAT GACTTCAATA ATCAATTTTA

   TTCAAAGAAT ATTGAATGCT GTTGGACAGT TGGGATGACT AAGTTTTATG GTGGTTGGGA TAAACTGCTT CGGCGTTTAC CTGAGAATTG GGTATACTGT

   GATGCTGATG GCTCACAGTT TGATAGTTCA CTAACTCCAT ACCTAATCAA TGCTGTTCTC ACCATCAGAA GCACATACAT GGAAGACTGG GATGTGGGGT

   TGCAGATGCT GCGCAATTTA TACACTGAGA TTGTTTACAC ACCAATTTCA ACTCCAGATG GAACAATTGT CAAGAAGTTT AGAGGTAATA ATAGTGGTCA

   ACCTTCTACC GTTGTGGATA ATTCTCTCAT GGTTGTCCTT GCTATGCATT ACGCTCTCAT TAAGGAGTGC GTTGAGTTTG AAGAAATCGA CAGCACGTGT

   GTATTCTTTG TTAATGGTGA TGACTTATTG ATTGCTGTGA ATCCGGAGAA AGAGAGCATT CTCGATAGAA TGTCACAACA TTTCTCA 3', po czym uzyskuje się materiał roślinny w znany sposób.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że gen wirusowy wprowadza się do genomu rośliny przez agroinfekcję.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako materiał roślinny stosuje się uprawne odmiany ziemniaka i tytoniu, korzystnie odmiany ziemniaka Irga oraz tytoniu Xanthi.

   * * *