PL186760B1

PL186760B1 - Nowy wektor binarny i sposób jego konstrukcji

Info

Publication number: PL186760B1
Application number: PL97322518A
Authority: PL
Inventors: Anna M. Chachulska; Włodzimierz Zagórski-Ostoja
Original assignee: Pan Inst Biochemii I Biofizyki
Priority date: 1997-10-09
Filing date: 1997-10-09
Publication date: 2004-02-27
Also published as: PL322518A1

Abstract

1. Nowy wektor binarny zawiera sklonowaną w wektorze pROK2, w wersji sens lub antysens, wstawkę fragmentu genu polimerazy PVY (NIb) o sekwencji: 5' GATCTAATCGATCA TGATGTAGTG GTGGAGCAAG CTAAGCATTC TGCATGGATG TTTGAAGCCT TGACAGGAAA TTTGCAAGCT GTCGCAACAA TGAAGAGCCA ATTAGTAACC AAGCATGTAG TTAAAGGAGA GTGTCGACAC TTCACAGAAT TTCTGACTGT GGATGCAGAG GCAGAGGCAG AGGCATTCTT CAGGCCTTTG ATGGATGCGT ATGGGAAAAG CTTGCTAAAT AGAGATGCGT ACATCAAGGA CATAATGAAG TATTCAAAAC CTATAGATGT TGGTGTCGTG GATCGGATGC ATTTGAGGAA GCCATCAATA GGGTTATCAT CTACCTGCAA TGTGCACGGC TTCAAGAAGT GTGCATATGT CACTGATGAG CAAGAAATTT TCAAAGCGCT CAACATGAAA GCTGCAGTCG GAGCCAGTTA TGGGTGCAAA AAGAAAGACT ATTTTGAGCA TTTCACTGAT GCAGATAAGG AAGAAATAGT CATGCAAAGC TGTCTGCGAT TGTATAAAGG TTTGCTTGGC ATTTGGAACG GATCATTGAA GGCAGAGCTC CGGTGTAAGG AGAAGATACT TGCAAATAAG ACGAGGACGT TCACTGCTGC ACCTCTAGAC ACTTTGCTGG GTGGTAAAGT GTGTGTTGAT GACTTCAATA ATCAATTTTA TTCAAAGAAT ATTGAATGCT GTTGGACAGT TGGGATGACT AAGTTTTATG GTGGTTGGGA TAAACTGCTT CGGCGTTTAC CTGAGAATTG GGTATACTGT GATGCTGATG GCTCACAGTT TGATAGTTCA CTAACTCCAT ACCTAATCAA TGCTGTTCTC ACCATCAGAA GCACATACAT GGAAGACTGG GATGTGGGGT TGCAGATGCT GCGCAATTTA TACACTGAGA TTGTTTACAC ACCAATTTCA ACTCCAGATG GAACAATTGT CAAGAAGTTT AGAGGTAATA ATAGTGGTCA ACCTTCTACC GTTGTGGATA ATTCTCTCAT GGTTGTCCTT GCTATGCATT ACGCTCTCAT TAAGGAGTGC GTTGAGTTTG AAGAAATCGA CAGCACGTGT GTATTCTTTG TTAATGGTGA TGACTTATTG ATTGCTGTGA ATCCGGAGAA AGAGAGCATT CTCGATAGAA TGTCACAACA TTTCTCA 3'.

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowy wektor binarny przeznaczony do wprowadzania do uprawnych odmian roślin, zwłaszcza ziemniaka i tytoniu, w celu uzyskania odporności transgenicznej na wirus ziemniaka Y, skierowanej zarówno przeciw dawniej występującym izolatom, jak i należącym do nowej podgrupy szczepu nekrotycznego oraz sposób konstrukcji tego wektora.

Na polach Europy Centralnej w ciągu ostatnich dziesięciu lat pojawiły się nowe izolaty zaklasyfikowane do szczepu nekrotycznego PVY (PVY^N). Wirus ten poraża ziemniaki, pomidory, paprykę, tytoń, czyli podstawowe rośliny uprawne rodziny Solanaceae. Nowe izolaty przełamują relatywną odporność wprowadzoną do odmian uprawnych tradycyjnymi metodami hodowlanymi.

Istnieją odmiany ziemniaka skrajnie odporne na PVY, których odporność na ten wirus nie została dotychczas przełamana żadnym ze szczepów PVY. Lecz takich odmian jest niewiele i nie zawsze mają one wysokie wartości użytkowe czy konsumpcyjne.

Okazało się, że wykorzystanie metod inżynierii genetycznej może pozwolić na szybsze uzyskiwanie odmian odpornych, które łączyłyby odporność na PVY z wysoką jakością bulw i/lub odpornością na inne niż PVY patogeny, czy szkodniki.

Dotychczas prowadzono próby genetycznej modyfikacji ziemniaka w celu uzyskania odmian odpornych na wirus PVY na drodze krzyżowania z gatunkami dzikimi lub uprawnymi niosącymi naturalny gen odporności. Jednak nie dawały one zadowalających rezultatów, ponieważ powszechnie uprawiane odmiany nie posiadają dostatecznej odporności na nowe izolaty PVYN

Nie udało się dotychczas, ani tradycyjnymi metodami hodowlanymi ani metodami biologii molekularnej otrzymać roślin odpornych na nowe izolaty zaklasyfikowane do szczepu nekrotycznego PVY (PVYN).

Nieoczekiwanie okazało się, że konstrukty otrzymane sposobem według wynalazku nadają się do otrzymywania roślin odpornych na wirus Y ziemniaka, zwłaszcza na nowe izolaty szczepu nekrotycznego PVY (PVY^N).

Nowy wektor binarny według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera sklonowaną w wektorze pROK.2, w wersji sens lub antysens, wstawkę fragmentu genu polimerazy PVY (NIb) lub jej zmutowane pochodne, o sekwencji:

5' GATC TAATCGATCA TGATGTAGTG GTGGAGCAAG CTAAGCATTC TGCATGGATG TTTGAAGCCT TGACAGGAAA

TTTGCAAGCT GTCGCAACAA TGAAGAGCCA ATTAGTAACC AAGCATGTAG TTAAAGGAGA GTGTCGACAC TTCACAGAAT TTCTGACTGT GGATGCAGAG

GCAGAGGCAG AGGCATTCTT CAGGCCTTTG ATGGATGCGT ATGGGAAAAG CTTGCTAAAT AGAGATGCGT ACATCAAGGA CATAATGAAG TATTCAAAAC

CTATAGATGT TGGTGTCGTG GATCGGATGC ATTTGAGGAA GCCATCAATA GGGTTATCAT CTACCTGCAA TGTGCACGGC TTCAAGAAGT GTGCATATGT

CACTGATGAG CAAGAAATTT TCAAAGCGCT CAACATGAAA GCTGCAGTCG GAGCCAGTTA TGGGTGCAAA AAGAAAGACT ATTTTGAGCA TTTCACTGAT

GCAGATAAGG AAGAAATAGT CATGCAAAGC TGTCTGCGAT TGTATAAAGG TTTGCTTGGC ATTTGGAACG GATCATTGAA GGCAGAGCTC CGGTGTAAGG

AGAAGATACT TGCAAATAAG ACGAGGACGT TCACTGCTGC ACCTCTAGAC ACTTTGCTGG GTGGTAAAGT GTGTGTTGAT GACTTCAATA ATCAATTTTA

TTCAAAGAAT ATTGAATGCT GTTGGACAGT TGGGATGACT AAGTTTTATG GTGGTTGGGA TAAACTGCTT CGGCGTTTAC CTGAGAATTG GGTATACTGT

186 760

GATGCTGATG GCTCACAGTT TGATAGTTCA CTAACTCCAT ACCTAATCAA

TGCTGTTCTC ACCATCAGAA GCACATACAT GGAAGACTGG GATGTGGGGT

TGCAGATGCT GCGCAATTTA TACACTGAGA TTGTTTACAC ACCAATTTCA

ACTCCAGATG GAACAATTGT CAAGAAGTTT AGAGGTAATA ATAGTGGTCA

ACCTTCTACC GTTGTGGATA ATTCTCTCAT GGTTGTCCTT GCTATGCATT

ACGCTCTCAT TAAGGAGTGC GTTCACTTTC AAGAAATCGA CAGCACGTGT

GTATTCTTTG TTAATGGTGA TGACTTATTG ATTGCTGTGA ATCCGGAGAA

AGAGAGCATT CTCGATAGAA TGTCACAACA TTTCTCA 3'.

Sposób wytwarzania binarnego wektora według wynalazku polega na tym, że plazmid niosący 3' końcową część genomowego cDNA PVY^ zawierający wstawkę fragmentu genu polimerazy PVY (NIb) o sekwencji:

TTTCCAAGCT GTCGCAACAA TGAAGAGCCA ATTAGTAACC AAGCATGTAG TTAAAGGAGA GTGTCGACAC TTCACAGAAT TTCTGACTGT GGATGCAGAG

GCAGATAAGG AAGAAATAGT CATGCAAAGC TGTCTGCGAT TGTATAAAGG TITCCTTGGC ATTTGGAACG GATCATTGAA GGCAGAGCTC CGGTGTAAGG

GATGCTGATG GCTCACAGTT TGATAGTTCA CTAACTCCAT ACCTAATCAA TGCTGTTCTC ACCATCAGAA GCACATACAT GGAAGACTGG GATGTGGGGT

TGCAGATGCT GCGCAATTTA TACACTGAGA TTGTTTACAC ACCAATTTCA ACTCCAGATG GAACAATTGT CAAGAAGTTT AGAGGTAATA ATAGTGGTCA

ACCTTCTACC GTTGTGGATA ATTCTCTCAT GGTTGTCCTT GCTATGCATT ACGCTCTCAT TAAGGAGTGC GTTGAGTTTG AAGAAATCGA CAGCACGTGT

GTATTCTTTG TTAATGGTGA TCACTTATTG ATTGCTGTGA ATCCGGAGAA AGAGAGCATT CTCGATAGAA TGTCACAACA TTTCTCA 3', poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym Bglll wyizolowując fragment 1.2 kb obejmującego gen NIb, bez 400 C-końcowych nukleotydów, oczyszcza z żelu agarozowego, a następ6

186 760 nie tak otrzymany fragment polimerazy PVY poddaje się ligacji z uprzednio strawionym enzymem BamHI i zdefosforylowanym wektorem binarnym pROK2 i wprowadza do komórek bakterii kompetentnych E. coli, korzystnie szczepu HB101, poprzez elektroporację, hodując transformanty, na podłożu LB z dodatkiem kanamycyny, następnie izoluje się plazmidy, korzystnie metodą lizy alkalicznej, po czym wyselekcjonowanymi klonami: pROKYi - niosącym wstawkę wirusową w orientacji sens i pROKY? - niosącym wstawkę w orientacji antysensownej, transformuje się elektrokompetentne komórki bakterii A. tumefaciens, korzystnie szczepów C58 pmp90 i LBA 4404 metodą elektroporację

W sposobie według wynalazku jako plazmid niosący 3' końcową część genomowego cDNA PVY^N, korzystnie stosuje się plazmid pBSS15 zawierający wstawkę genu polimerazy PVY (NIb).

W sposobie według wynalazku z kolonii kanamycyno-odpomych wyselekcjonowuje się klony pROKYi ipROKY?, korzystnie trawiąc enzymem restrykcyjnym Hindlll plazmidy otrzymane metodą lizy alkalicznej.

W sposobie według wynalazku kolonie bakterii niosących plazmidy zawierające wstawkę wirusową, korzystnie identyfikuje się prowadząc hodowle nocne bakterii i trawiąc wyizolowane plazmidy enzymami restrykcyjnymi Xbal lub Sali.

Sekwencję klonowanego fragmentu genu polimerazy PVY przedstawiono powyżej, zaś zastosowaną strategię klonowania na załączonym rysunku.

Poniżej przedstawiono przykład wykonania wynalazku nie ograniczający jego zakresu.

Przykład.

1. Konstrukcja wektorów binarnych i transformacja bakterii A. tumefaciens

Plazmid pBSS15, niosący 3' końcową część genomowego cDNA PVY^N-Fr, został poddany trawieniu enzymem restrykcyjnym BglII w celu wyizolowania fragmentu 1.2 kb obejmującego gen NIb, bez 400 C-końcowych nukleotydów. Fragment ten został oczyszczony z żelu agarozowego przy użyciu preparatu Glass Milk (Bio 101). Wektor binary pROK2 został strawiony enzymem BamHI i zdefosforylowany. Fragment polimerazy PVY poddano ligacji z wektorem biNarNym pROK2 i wprowadzono do komórek bakterii kompetentnych E. coli szczepu HBioi poprzez elektroporację. Transformanty hodowano na podłożu LB z dodatkiem kanamycyny (50 pg/ml), kolonie bakterii niosących plazmidy zawierające wstawkę wirusową identyfikowano prowadząc hodowle nocne bakterii, izolując plazmidy metodą lizy alkalicznej i trawiąc je enzymami restrykcyjnymi Xbal lub Sali. Wyselekcjonowano dwa klony pROKY 1 i pROKY2, pierwszy niosący wstawkę wirusową w orientacji sens, drugi zawierający wstawkę w orientacji antyseNsowNęj. Elektrokompetentne komórki bakterii A. tumefaciens szczepów C58 pmp90 i LBA 4404 transformowano wektorami pROKY1 ipROKY? metodą elektroporacji. Obecność wstawki wirusowej w koloniach kanamycyno-odpomych potwierdzano trawiąc enzymem restrykcyjnym Hindlll plazmidy otrzymane metodą lizy alkalicznej.

Sekwencja sklonowanego fragmentu genu polimerazy PVY była identyczna z przedstawioną w istocie wynalazku.

2. Transformacja tytoniu wektorem według wynalazku z zastosowaniem metody agroinfekcji.

20-30 ml pożywki LB, zawierającej kanamycynę (50 mg/l) inokulowano 0.05-0.1 objętości dwudniowej hodowli bakterii A. tumefaciens, zawierających plazmidy pROKYi i pROKY2 i hodowano przez noc w 28°C. Bakterie odwirowywano przez 10 min przy 6 krpm i zawieszano w 1 ml płyNnej pożywki MS (Murashige, T, Skoog F. (1962), Physiol. Plant., 15, 473-497). Krążki liściowe (1 cm/1 cm) wycinano ze sterylnego materiału roślinnego, raniąc je w kilku miejscach skalpelem i umieszczano w 20 ml płynnej pożywki MS. Przygotowywano około 100 krążków dla każdego konstruktu, do pożywki dodawano bakterie i inkubowano krążki z bakteriami przez 10-20 min. Następnie szybko osuszano krążki na sterylnym papierze, przenoszono je do szalek Petriego na pożywkę MS zawierającą NAA (0.1 mg/l), szalki zaklejano parafilmem i inkubowano 2-3 dni w ciemności w 25°C. Po przepłukaniu sterylną wodą, krążki przenoszono na pożywkę MS zawierającą NAA (0.1 mg/l) i bA (1 mg/l) a także selekcyjne antybiotyki - kanamycynę (50 ng/ml) i cefotaksym (500 pg/m). Czynność tę po186 760 wtarzano co dwa tygodnie, regenerujące pędy ukorzeniano na stałej pożywce MS, zawierającej antybiotyki.

Otrzymane transgeniczne rośliny tytoniu były morfologicznie identyczne z roślinami nietransformowanymi.

3. Transformacja ziemniaka konstruktem według wynalazku z zastosowaniem metody agroinfekcji (według Matini N., Egen M., Runtz I., Strittmatter G. (1993), Mol. Gen. Genet., 236,179-186; zmodyfikowana)

Bakterie A. tumefaciens niosące plazmidy pROKYj ipROKY2 hodowano przez jedną lub dwie noce w 28°C w pożywce YEB zawierającej odpowiednie antybiotyki (inokulując 5 ml pożywki jedną kolonią bakterii). 100 μl hodowli Agrobacterium wgłaskiwano w pożywkę MS na szalkach Petriego. Świeżo zebrane, sterylne liście i międzywęźla cięto skalpelem, każdy fragment tkanki raniąc w wielu miejscach. Skrawki roślinne umieszczano na szalkach Petriego z pożywką MS i bakteriami; szalki inkubowano w ciemności przez dwa dni w temperaturze pokojowej, w pudełku w komorze laminamej. Następnie materiał roślinny przenoszono na pożywkę MCI z antybiotykami: kanamycyną (50 pg/ml) i cefotaksymem (500 pg/ml). Po 10-14 dniach tkanki roślinne przenoszono na pożywkę GR2 z antybiotykami, powtarzając tę czynność co dwa tygodnie. Regenerujące pędy przenoszono na pożywkę T&L z obydwoma antybiotykami.

Generalnie wyhodowane transgeniczne rośliny ziemniaka były identyczne z roślinami nietransformowanymi.

4. Stwierdzenie obecności w genomie roślin wprowadzonego genu wirusowego

Obecność transgenu w roślinach potwierdzano metodą PCR i hybrydyzacji (metoda Southern błot).

a. Izolacja DNA roślinnego

DNA roślinny izolowano z roślin ziemniaka i tytoniu hodowanych in vitro i w szklarni. Na małą skalę, do celów PCR, izolację DNA prowadzono stosując metodę wg: Edwards K., Johnstone C., Thompson C. (1991), Nucleic Acids Res., 19, 1349, na dużą skalę - metodę wg Doyle J.J. and Doyle J.L. (1987), Phytochem. Bulletin. 19, 11-15. W pierwszej metodzie, stosowanej najczęściej, krążki liściowe ucierano w probówkach Eppendorfa odpowiednimi tłoczkami, w temperaturze pokojowej, bez buforu, przez 15 s. Dodawano 400 (4 buforu do ekstrakcji (200 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0.5% SDS), próbki wytrząsano przez 5 s i pozostawiano w temperaturze pokojowej do jednej godziny. Po żwirowaniu (5 min przy 13 krpm), 300 pl supematantu przenoszono do nowej probówki, mieszano z 300 pl zimnego izopropanolu i pozostawiano w temperaturze pokojowej na 2 min. Próbki wirowano przy 13 krpm przez 15 min, płukano 70% etanolem, osady suszono i rozpuszczano w 50-100 pl TE. DNA przechowywano w 4°C, 2 - 4 pl próbki stosowano w 50 pl reakcji PCR.

b. Hybrydyzacja

Hybrydyzację produktów PCR i genomowego DNA roślin z sondą znakowaną digoksygeniną prowadzono według przepisu producenta zestawu do hybrydyzacji bezizotopowej (Boehringer Mannheim) i publikacji: Wełnicki M. and Hiruki C. (1992), J. Virol. Meth. 39, 9ł-99. i Wełnicki M., Żekanowski C. and Zagórski W. (1994), Acta Bioch. Polon. 41,473-475.

5. Analiza odporności na wirus Y ziemniaka

Transgeniczne rośliny tytoniu i ziemniaka inokulowano sokiem z roślin tytoniu zainfekowanych PVY^N-Wi, dwukrotnie rozcieńczonym wodą. Zakażano rośliny wcierając sok w liście uprzednio posypane karborundem. Obecność wirusa wykrywano metodą DAS-ELISA używając przeciwciał monoklonalnych skierowanych przeciw PVY (z firmy Bioreba).

Rozmnożone wegetatywne linie tytoniu pROKYi i pROKY2 pokolenia Ro zostały poddane testom na odporność po trzech do czterech tygodniach po przeniesieniu do ziemi. Po zainokulowaniu sokiem roślinnym zawierającym pVyN ewentualne pojawianie się objawów chorobowych obserwowane było przez kilka tygodni. Testy ELISA, wykonane około dwa tygodnie po infekcji, pozwoliły na zidentyfikowanie linii, które były częściowo lub całkowicie odporne na PVY (patrz tabela). Rośliny z tych linii nie wykazywały objawów chorobowych lub tylko bardzo słabe, ograniczone do lekkiego przejaśnienia nerwów. Wartości ekstynkcji w teście ELISA były bardzo niskie. Obserwowano także pozorne ozdrowienie, który charakte8

186 760 ryzowało się zmniejszaniem wartości w ELISA i zanikaniem symptomów w młodszych liściach. Cztery z tych linii tytoniu zawierały transgen wyrażający antysensowny RNA.

Transgeniczne klony ziemniaka rozmnożono, przeniesiono do ziemi i hodowano w szklarni aż do otrzymania minibulw. Bulwy zebrano, skiełkowano i posadzono w doniczkach w szklarni. Dziesięć roślin z każdego klonu zainokulowano PVY po pojawieniu się czwartego lub piątego liścia. Testy ELISA wykonano dwukrotnie, w piątym i siódmym tygodniu po inokulacji. Wyselekcjonowano klony nie wykazujące objawów chorobowych i o bardzo niskich wartościach w teście ELISA, podobnych do otrzymanych dla niezainfekowanych roślin kontrolnych. Wyniki przedstawiono w tabeli. Tylko dwa z tych odpornych klonów zawierały transgen wyrażający sensowny RNA.

Wykorzystanie nie ulegającego translacji, niepełnego genu PVY, wyrażającego RNA, a szczególnie antysensowny RNA, zmniejszyło znacznie ryzyko związane z zachodzeniem rekombinacji RNA i komplementacją zmutowanych izolatów PVY w transgenicznych liniach. Istotnym elementem jest to, że odporne rośliny nie produkują obcego wirusowego białka, nie są więc źródłem dodatkowych antygenów.

Tabela

Wstępne badania odporności na wirus pvy transgenicznych linii tytoniu (pokolenia r₀) i klonów ziemniaka.

Typ konstruktu	Liczba badanych linii	Liczba linii odpornych
Tytoń
pROKY[	18	3
pROKY2	19	4
Ziemniak
pROKY,	15	2
pROKY2	19	4

W opisie i przykładach zastosowano następujące skróty

BA - benzyloamina

NAA - kwas naftalenooctowy

DNA - kwas dezoksyrybonukleinowy krpm - tysiące obrotów na minutę RNA - kwas rybonukleinowy

Wszystkie stosowane metody, nie przedstawione szczegółowo w tym opisie zawarte są w publikacji: Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning. A laboratory manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 2,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Nowy wektor binarny zawiera sklonowaną w wektorze pROK.2, w wersji sens lub antysens, wstawkę fragmentu genu polimerazy PVY (NIb) o sekwencji:

5' GATCTAATCGATCA TGATGTAGTG GTGGAGCAAG CTAAGCATTC TGCATGGATG TTTGAAGCCT TGACAGGAAA

TTTGCAAGCT GTCGCAACAA TGAAGAGCCA ATTAGTAACC AAGCATGTAG TTAAAGGAGA GTGTCGACAC TTCACAGAAT TTCTGACTGT GGATGCAGAG

GCAGAGGCAG AGGCATTCTT CAGGCCTTTG ATGGATGCGT ATGGGAAAAG CTTGCTAAAT AGAGATGCGT ACATCAAGGA CATAATGAAG TATTCAAAAC

CTATAGATGT TGGTGTCGTG GATCGGATGC ATTTGAGGAA GCCATCAATA GGGTTATCAT CTACCTGCAA TGTGCACGGC TTCAAGAAGT GTGCATATGT

CACTGATGAG CAAGAAATTT TCAAAGCGCT CAACATGAAA GCTGCAGTCG GAGCCAGTTA TGGGTGCAAA AAGAAAGACT ATTTTGAGCA TTTCACTGAT

GCAGATAAGG AAGAAATAGT CATGCAAAGC TGTCTGCGAT TGTATAAAGG TTTGCTTGGC ATTTGGAACG GATCATTGAA GGCAGAGCTC CGGTGTAAGG

AGAAGATACT TGCAAATAAG ACGAGGACGT TCACTGCTGC ACCTCTAGAC ACTTTGCTGG GTGGTAAAGT GTGTGTTGAT GACTTCAATA ATCAATTTTA

TTCAAAGAAT ATTGAATGCT GTTGGACAGT TGGGATGACT AAGTTTTATG GTGGTTGGGA TAAACTGCTT CGGCGTTTAC CTGAGAATTG GGTATACTGT

GATGCTGATG GCTCACAGTT TGATAGTTCA CTAACTCCAT ACCTAATCAA TGCTGTTCTC ACCATCAGAA GCACATACAT GGAAGACTGG GATGTGGGGT

TGCAGATGCT GCGCAATTTA TACACTGAGA TTGTTTACAC ACCAATTTCA ACTCCAGATG GAACAATTGT CAAGAAGTTT AGAGGTAATA ATAGTGGTCA

ACCTTCTACC GTTGTGGATA ATTCTCTCAT GGTTGTCCTT GCTATGCATT ACGCTCTCAT TAAGGAGTGC GTTGAGTTTG AAGAAATCGA CAGCACGTGT

GTATTCTTTG TTAATGGTGA TGACTTATTG ATTGCTGTGA ATCCGGAGAA AGAGAGCATT CTCGATAGAA TGTCACAACA TTTCTCA 3'.
2. Sposób wytwarzania binarnego wektora, znamienny tym, że plazmid niosący 3' końcową część genomowego cDNA PVy o sekwencji:

5' GATC TAATCGATCA TGATGTAGTG GTGGAGCAAG CTAAGCATTC TGCATGGATG TTTGAAGCCT TGACAGGAAA

TTTGCAAGCT GTCGCAACAA TGAAGAGCCA ATTAGTAACC AAGCATGTAG TTAAAGGAGA GTGTCGACAC TTCACAGAAT TTCTGACTGT GGATGCAGAG

186 760

GCAGAGGCAG AGGCATTCTT CAGGCCTTTG ATGGATGCGT ATGGGAAAAG

CTTGCTAAAT AGAGATGCGT ACATCAAGGA CATAATGAAG TATTCAAAAC

CTATAGATGT TGGTGTCGTG GATCGGATGC ATTTGAGGAA GCCATCAATA

GGGTTATCAT CTACCTGCAA TGTGCACGGC TTCAAGAAGT GTGCATATGT

CACTGATGAG CAAGAAATTT TCAAAGCGCT CAACATGAAA GCTGCAGTCG

GAGCCAGTTA TGGGTGCAAA AAGAAAGACT ATTTTGAGCA TTTCACTGAT

GCAGATAAGG AAGAAATAGT CATGCAAAGC TGTCTGCGAT TGTATAAAGG

TTTGCTTGGC ATTTGGAACG GATCATTGAA GGCAGAGCTC CGGTGTAAGG

AGAAGATACT TGCAAATAAG ACGAGGACGT TCACTGCTGC ACCTCTAGAC

ACTTTGCTGG GTGGTAAAGT GTGTGTTGAT GACTTCAATA ATCAATTTTA

TTCAAAGAAT ATTGAATGCT GTTGGACAGT TGGGATGACT AAGTTTTATG

GTGGTTGGGA TAAACTGCTT CGGCGTTTAC CTGAGAATTG GGTATACTGT

GATGCTGATG GCTCACAGTT TGATAGTTCA CTAACTCCAT ACCTAATCAA

TGCTGTTCTC ACCATCAGAA GCACATACAT GGAAGACTGG GATGTGGGGT

TGCAGATGCT GCGCAATTTA TACACTGAGA TTGTTTACAC ACCAATTTCA

ACTCCAGATG GAACAATTGT CAAGAAGTTT AGAGGTAATA ATAGTGGTCA

ACCTTCTACC GTTGTGGATA ATTCTCTCAT GGTTGTCCTT GCTATGCATT

ACGCTCTCAT TAAGGAGTGC GTTGAGTTTG AAGAAATCGA CAGCACGTGT

GTATTCTTTG TTAATGGTGA TGACTTATTG ATTGCTGTGA ATCCGGAGAA

AGAGAGCATT CTCGATAGAA TGTCACAACA TTTCTCA 3', poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym Bglll wyizolowując fragment 1.2 kb obejmującego gen NIb, bez 400 C-końcowych nukleotydów, oczyszcza z żelu agarozowego, a następnie tak otrzymany fragment polimerazy PVY poddaje się ligacji z uprzednio strawionym enzymem BamHI i zdefosforylowanym wektorem binarnym pROK2 i wprowadza do komórek bakterii kompetentnych E. coli, korzystnie szczepu HB101, poprzez elektroporację, hodując transformanty, na podłożu LB z dodatkiem kanamycyny, następnie izoluje się plazmidy, korzystnie metodą lizy alkalicznej, a wyselekcjonowanymi klonami: pROKYt - niosącym wstawkę wirusową w orientacji sens i pROKY2 - niosącym wstawkę w orientacji antysensownej, transformuje się elektrokompetentne komórki bakterii A. tumefaciens, korzystnie szczepów C58 pmp90 i lBa 4404 metodą elektroporację
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako plazmid niosący 3' końcową część genomowego cDNA PVY^N stosuje się plazmid pBSS15 zawierający wstawkę genu polimerazy PVY (NIb).
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że kolonie bakterii niosących plazmidy zawierające wstawkę wirusową, korzystnie identyfikuje się prowadząc hodowle nocne bakterii i trawiąc wyizolowane plazmidy enzymami restrykcyjnymi Xbal lub Sali.
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że obecność wstawki wirusowej w koloniach kanamycyno-odpomych pROKYt ipROKY? potwierdza się trawiąc enzymem restrykcyjnym Hindlll plazmidy otrzymane metodą lizy alkalicznej.

186 760