JPH03505663A

JPH03505663A - ハロアリールニトリル分解性遺伝子、その使用および該遺伝子を含有する細胞

Info

Publication number: JPH03505663A
Application number: JP63505852A
Authority: JP
Inventors: ストーカー，デビツド
Original assignee: ローヌ―プーラン・アグロシミ
Priority date: 1988-07-04
Filing date: 1988-07-04
Publication date: 1991-12-12

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ハロアリールニトリル分解性遺伝子、その使用および該遺伝子を含有する細胞関連出願の相互関係本発明は１９８７年１月５日付は出願の国際特許出願ＰＣＴ／ｖ　Ｓ　８７１０Ｏ［１４４号の部分継続出願であり、前記ＰＣＴ出願は１９８６年３月２８日付は出願の米国特許出願第８４５，８８２号の部分継続出願であり、さらに前記米国出願は１９８６年１月ｗ日付は出願の米国特許出願第８１７，２２６号の部分継続出願であり、これら両者の開示を参考のためここに引用する。

微生物および高等生物の細胞に対し新規な遺伝学的可能性を付与する機会は、新たな可能性に対する広範な途を切り開いている。１つの領域は、細胞毒性作用につき利用される各種の薬剤に関する。たとえば、農薬に使用される多くの化合物は害虫、雑草などの死滅に向けられる。多くの場合、これらの化合物は比較的長い滞留時間または増大した残留を示しうる。

多くの状況においては、保持すべき種類と死滅させるべき種類とを区別することが望ましい。たとえば、雑草を選択的に死滅させる一方、作物に対し最小の感作用を示すことがしばしば望ましい。大抵の場合、広スペクトル除草剤の多くは作物に対し顕著な有害作用を示し、したがってその使用は主として発芽前の使用または慎重な発芽後の使用に制限される。

したがって、たとえば細胞毒性剤のようなストレスに対し耐性にするよう生存細胞を改変しうろことに極めて興味がある。

関連文献の説明米国特許第４，５３５，０６０号公報は、グリホセート（ｇｌｙｌ）ｈＯ８ａｔｅ）感受性細胞に対しグリホセート耐性を付与するための細菌ａｒｏＡ遺伝子の使用を記載している。スーおよびキャンバ−、キャナディアン・ジャーナル・マイクロバイオロジー（１９７Ｂ）、第２２巻、第５３７〜５４３頁は、土壌補充培養物からのイオキシニル分解体の分離を記載している。スーおよびクレムソン、ディサチージョン・アブストラクト・インターナショナル、第Ｂ３Ｂ巻（１９７Ｂ）、第８号、第３７０８頁は、３．５−ジハロゲノ−４−ヒドロキシベンゾニトリルの１群の除草剤における微生物分解を記載している。イングラムおよびプリン、ペスチシド・サイエンス（１’９７４）、第５の持続性を記載している。スミス、アブストラクト・ミーティング・ウイード・ソサエティ・アメリカン（１９７１）、第１６〜１７頁は、レジャイナ重質粘土におけるブロモキシニルの分解を記載している。スミスおよびフレッチャー、ホルチカルチャー・リサーチ（１９６４）、第４巻、第６０〜６２頁は３．５−ジハロゲノ−４−ヒドロキシベンゾニトリルおよび土壌微生物につき報告している。

ニトリラーゼ、これらニトリラーゼをコードする核酸配列、ニトリラーゼ遺伝子が外来性である所望の宿主により識別される制御遺伝子の転写および翻訳制御の下でこの種のニトリラーゼをコードする遺伝子を含有した構築物、この種の構築物を含有する宿主細胞、並びにこの種の構築物を含有する生物および生物部分もしくは生産物が提供される。ブロモキシニル−および／またはイオキシニル−特異性ニトリラーゼは、ブロモキシルおよび関連除草剤を含有する生育地を解毒すると共に、この種の除草剤の細胞毒性作用から宿主細胞を保護するための用途を有する。構築物は、この構築物を含有する宿主細胞とこの種の構築物を含有しない宿主細胞とを区別する用途を有する。

本発明によれば、ハロゲン化ヒドロキシベンゾニトリル、特に３．５−ジブロモ −もしくは３．５−シイオド−４−ヒドロキシベンゾニトリルの加水分解に関係する新規なりＮＡ配列、構築物、形質転換細胞、植物およびペプチドが提供される。本発明は、ニトリルの除草剤活性を解毒すると共に除草剤に対し感受性の細胞もしくは宿主に対し保護を与え、或いは除草剤で汚染された環境を解毒するようニトリルを加水分解しつる酵素を産生させることに関する。

興味ある構造遺伝子は、ベンゾニトリルを窒素源として使用し得、通常ベンゾニトリルを唯一の窒素源として使用しうることが示された単細胞微生物、特に細菌から得ることができる。

以下ベンゾニトリルもしくはニトリラーゼの説明に関し、ベンゾニトリルはハロゲン化ｐ−ヒトＩロキシベンゾニトリル、特に３．５−シイオド−もしくは３．５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンゾニトリルとし、かつニトリラーゼはこの種のハロゲン化ベンゾニトリルを窒素源として使用しうる。特にその唯一の窒素源として使用しうるニトリラーゼとすることを意図する。

酵素は、種々異なる方法で便利にはブロモキシニルもしくはイオキシニルを含有する環境に天然に存在する細菌から得ることができる。特に腸内細菌、一層特定的には菌種クレブシェラできる。土壌から分離することなく、生物は順次増大する濃度のベンゾニトリルと減少量の代替窒素源とにおいて、ベンゾニトリルを唯一の窒素源として使用しながら生存する生物が得られるまで、土壌もしくはその他の培地で増殖させることができる。

ニトリラーゼを含有する細菌の出所とは無関係に、ニトリラーゼがベンゾニトリルの解毒に効果的となるよう確保すべくスクリーニングを行なわねばならない。

さらにニトリラーゼは、ハロゲンを持たず他の置換基などを有する他の同族体ではなくベンゾニトリルに対し特異性を有しなければならない。したがって、本発明のニトリラーゼは上記ベンゾニトリルに対し特異性であり、かつ同族体に対し比較的不活性であり或いは同族体に対し活性が実質的に低い。望ましくは、増殖速度に顕著な低下が存在してはならず、すなわち同等な濃度における窒素源としてのベンゾニトリルと対比して、たとえばアンモニアのような通常の窒素源の存在下で約１０９６未満の細菌増殖の低下を示すものとする。このような結果は、特定されないベンゾニトリルでは観察されない。

１種もしくはそれ以上の宿主菌株が固定されたら、ニトリラーゼ子は、染色体もしくはプラスミドに存在し得る。ゲノムを特に制限エンドヌクレアーゼにより断片化することができ、ここで１種もしくは複数のエンドヌクレアーゼを用いて約５〜５０ｋｂの範囲の断片を形成することができる。これらの断片を便利な細菌（たとえば大腸菌）に適当なベクターでクローン化させると共に、得られた形質転換体をニトリラーゼ活性につきスクリーニングすることができ、その際宿主生物は陰性バックグラウンドとなる。

１種もしくはそれ以上のクローンがニトリラーゼ活性を有すると確認された後、所望のＤＮＡ断片、プラスミドもしくはウィルスを含有する染色体外の要素をたとえば宿主の溶菌、ＤＮＡの沈澱および染色体ＤＮＡからのベクターＤＮＡ、プラスミドもしくはウィルスＤＮＡの分離のような慣用の技術により分離することができる。次いで染色体外の要素をエンドヌクレアーゼ制限により切断し、所望の断片を種々異なる寸法の断片の分離および堵定に関する各種の技術、たとえば電気泳動、密度勾配遠心分離などによって分離することができる。

よびその側方（ｆｌａｎｋｉｎｇ）制御領域の寸法に一層近似するよう寸法を減少させる。酵素をコードする配列およびその制御側面配列を持った断片を処理するには種々の技術が存在する。種々異なる反応混合物における種々異なる制限酵素による部分切断を用い、次いでこれら断片をクローン化して、どの断片がまだニトリラーゼの発現を与える能力を保持するかを決定することができる。

或いは、酵素を分離しかつ部分的に配列化することもできる。

アミノ酸配列に基づきプローブを作成し、次いでこれを用いて酵素切断と組合せることにより、これら断片をクローン化しかつ所望遺伝子の存在にっきスクリーニングすることができる。

さらに、たとえばＢａｌ　３１のようなエキソヌクレアーゼを用いてヌクレオチドを断片の１つの端部もしくは両端部から除去することにより、余分なヌクレオチドの個数をさらに減少させることができる。

或いは、遺伝子を適当な宿主にクローン化させ、かつメツセンジャＲＮＡを適当なインビトロもしくはインビボの翻訳系、たとえばツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞もしくは細網分解物−ニングして分離することができる。次いで、分離されたメツセンジャーを用いて、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼによる相補連鎖の形成を含む慣用の技術によりＤＮＡを作成することができる。この場合、得られる構造遺伝子は、転写に関連する制御領域を欠如する。

両者を切除したり或いは５′−もしくは３′−末端を延長させたりする種々の方法で改変することができる。一般の２５個以下、より一般的には約２０個以下のコドンが天然産ニトリラーゼに関与する。ニトリラーゼは５０個程度、一般には約３０個以下のアミノ酸だけ延長することができる。置換と切除と延長との組合せを用いることもできる。このように、遺伝子を種々の方法で処理して、プラスミドなどの操作において便利となるよう酵素の特性を変化させることができる。

ニトリラーゼを発現する構造遺伝子を持ったＤＮＡ配列を広範な種類の他のＤＮＡ配列に結合させて、適当な宿主細胞中に導入することができる。相手方の配列は宿主の種類、宿主中へのＤＮＡ配列の導入方法、およびエピワームとしての保持もしくは一体化が望ましいかどうかに依存する。

原核宿主については、形質転換、接合、形質導入またはトランスフェクション原核宿主中へのＤＮＡ配列の導入のために使用しうる広範な種類のベクターが存在する。ＤＮＡ配列はたとえばｐＢＲ３２２，ｐＡｃＹｃ１８４．　ｐＭＢ９．　ｐＲＫ２９０などの広範な種類のプラスミド；コスミド、たとえばＩ）ＶＫｌｏｏ　、またはウィルス、たとえばＰ２２などを包含する。

真核宿主については宿主中へのＤＮＡ導入に関し広範な種類の技術を用いることができ、たとえば非複製ＤＮＡ配列、プラスミドもしくは微小染色体を含むＣａ　　−沈澱されたＤＮＡによる形質転換、アグロバクテリウムにおけるＴ−ＤＮＡ含有配列での形質転換、マイクロピペットによるマイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションを用いることができる。

コンピテント複製系がＤＮＡ構造に存在するかどうかに応じて、ＤＮＡをエビソーム要素として複製させうるか或いはＤＮＡを宿主ゲノム中に組込んで構造遺伝子を宿主にて発現させうるかどうかが決定される。宿主に対し致命的でない腫瘍誘発性プラスミド、たとえばＴｉもしくはＲｉまたはその断片もしくはウィルス、たとえばＣａＭＶ、ＴＭＶもしくはその断片のようなエピソーム要素を用いることができ、ここで構造遺伝子はその構造遺伝子の発現が可能な形でそのようなエピソーム要素に存在する。特に興味あるものは、複製機能を有するがたとえば発癌性、毒性などの他の機能を欠如した断片である。

ニトリラーゼ源から得られる断片は、適当なりローニングベクターを用いてクローン化させることができる。クローン化は、適当な単細胞微生物、たとえば大腸菌のような細菌で行なうことができる。望ましくは、部分もしくは完全消化がほぼ所望の寸法を有する断片を形成するようなコスミドを用いることができる。たとえば、コスミドｐＶＫ１００を適当な制限酵素で部分消化し、プラスミド、染色体またはその断片の部分もしくは完全消化から得られた断片に結合させることができる。パッケージングは、所望寸法の断片のみのパッケージと、宿主生物中への形質導入を確保するものとする。

宿主生物は、ベンゾニトリル耐性につき選択することができる。受容体菌株を改変して、形質導入体の選択を可能にする適当な遺伝的特徴を付与することができる。微生物においては、形質導入体を用いて所要に応じ移動性プラスミドの使用により他の微生物に接合させることができる。ニトリラーゼ用の構造遺伝子を有する断片の寸法をさらに減少させるには、種々の技術を用いることができる。たとえばコスミドベクターを分離し、ター、便利には従前に使用したコスミドベクターにクローン化させることができる。コスミドベクターの代りに、たとえばｐＡｃＹｃ１７７およびｐＡｃＹｃ１８４のような小寸法の各種のクローン化ベクターを用いることもできる。かくして、好ましくは約５ｋｂ未満、一般に約４ｋｂ未満、より好ましくは約２ｋｂ未満の断片をクローン化させて、ベンゾニド・リル耐性を与えることができる。

望ましくは、断片は約１ｋｂおよび約５ｋｂ未満、好ましくは約４ｋｂ未満、特に少なくとも約１０４７ｂｐ、より詳細には少なくとも約ｔｔｏｏｂｐ、好ましくは約１．５ｋｂ未満の側方領域を含むものであである。

５′−末端にて約５個のコドンまでおよび３′−末端にて約１０個のコドンまでニトリラーゼ遺伝子を切除すること或いは約５０個まで、一般に約３０個以下、好ましくは２０個以下のコドンを５′−および３′−末端に付加することに特に興味が持たれる。

かくして、得られる酵素は天然産の酵素とは多くとも５０個程度のアミノ酸、より一般的には約３０個以下のアミノ酸、好ましくは約２５個以下のアミノ酸だけ相違し、これは置換と延長と切除との組合せを含む。

ニトリラーゼ酵素は細菌、酵母、糸状カビ、植物細胞などを包含する原核もしくは真核の任意便利なものにより発現させることができる。分泌が得られない場合、酵素は細胞を溶解させかつニトリラーゼを公知方法で分離することにより単離することができる。有用な方法はクロマトグラフィー、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィーなどを包含する。便利には、ブロモキシニルを適当な官能基（たとえばカルボキシル基）を介して不溶性支持体に結合させ、これをニトリラーゼの分離用のバッキングとして使用することができる。

ニトリラーゼ比活性は、バー杉−によりバイオケミカル・ジャーナル（１９７７）、第１６７巻、第６８５〜６９２頁に記載されたような条件下で少なくとＣ約０．１μモルアンモニア／ｍｉｎ／■蛋白、一般に少なくとも約０．５もしくはそれ以上である。

積装された酵素は、各種の方法で使用することができる。これはブロモキシニル、イオキシニルまたはその他の関連ベンゾニトリルに関する分析に直接使用することができる。或いは、この酵素は興味ある分析物、たとえばハブテンまたは抗原に結合させ或いは抗体に結合させることにより診断分析におけるラベルとして使用することもでき、この種の分析は米国特許第されている。結合方法および分析物の濃度決定はこれら特許公報に極めて詳細に記載されており、その開示の適当な部分を参考のためここに引用する。

ニトリラーゼをコードするＤ　Ｎ　Ａ配列は、各種の方法で使用することかできる。ＤＮＡ配列は、野性型または突然変異ニトリラーゼを分離するためのプローブとして使用することができる。或いは、このＤＮＡ配列は、組換えにより宿主中に一体化して、この宿主に対しベンゾニトリル耐性を付与するために使用することもできる。

植物細胞の場合は、構築物の一部としての構造遺伝子を組換えにより植物ゲノム中へ一体化させるべくミクロピペット注入により植物細胞核に導入することができる。或いは、構造遺伝子を植物宿主細胞に導入するため、エレクトロポレーションセ用いることもできる。植物宿主により識別されない制御信号を持った出所から構造遺伝子が得られた場合は、適当な制御信号を発現用に導入する必要がある。ウィルスもしくはプラスミド、たとえば腫瘍誘発性プラスミドを用いかつマツピングされていここに構造遺伝子をプロモータから適当な距離にて挿入することができる。ＤＮＡ配列が適当な制限部位を与えない場合は、たとえば旺シ３１のようなエキソヌクレアーゼにより種々の時点で切断し、かつ合成制限エンドヌクレアーゼ部位（リンカ−）を挿入することができる。

腫瘍誘発性プラスミド、たとえばＴｉもしくはＲｉを使用し、ここでニトリラーゼ遺伝子を植物細胞の染色体に一体化させることに特に興味が持たれる。Ｔｉ− プラスミドおよびＲｉ−プラスミドの使用に関する説明はＰＣＴ特許出願ＷＯ３４１０２９１３号、０２９１９号および０２９２０号、並びにＥＰＯ出願第０１１６７１８号、並びにマツヶおよびチルトン、ジャーナル・モレキュラーアプライド・ジエネチクラス（１９８１）、第１巻、第３９〜４９頁に見ることができる。

植物宿主により識別される開始および停止のための転写および翻訳制御信号の下でニトリラーゼ構造遺伝子を含む発現カセットに境界が隣接（ｆ’１ｉｎｋ）する場合、Ｔ−ＤＮＡ右側境界または画境界を用いることにより、発現カセットを植物ゲノム中に組込んで種々の分化段階にてニトリラーゼ酵素を植物細胞中に発現させることができる。

種々の構築物を作成して、植物細胞中に発現させることができる。これら構築物は、植物宿主中にニトリラーゼを発現させるべく植物中にて機能する発現カセットを与える。

転写を行なうには、構成的または誘発性のいずれかである各種の転写開始領域（プロモータ領域）を用いることができる。

転写開始領域はニトリラーゼをコードする構造遺伝子に結合を欠失している開始コドンの約２００塩基の内部にて転写を開始させる。

構造遺伝子の３′−末端は１個もしくはそれ以上の停止コドンを有し、これらを植物宿主中で機能する転写停止領域に結合させ、この停止領域は開始領域と同じまたは異なる構造遺伝子と結合することができる。

発現カセットは、開始領域と、この開始領域の転写制御下にある構造遺伝子と、必要に応じ転写の停止及びメツセンジャーＲＮＡのプロセッシングをもたらす停止領域とを転写方向に有することを特徴とする。

転写および翻訳制御領域としては、ニトリラーゼ遺伝子の構成的発現を可能にするオピン（ｏｐｉｎｅ）プロモータおよびターミネータ領域を好適に用いることができる。或いは、他のプロモータおよび／またはターミネータ、特に植物宿主にて誘発性発現もしくは制御発現を与えるプロモータを用いることができる。

Ｔｉ−プラスミドからの使用しうるプロモータ領域はオピンプンシンターゼプロモータ、アグロビンシンターゼプロモータ、マンノビン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）シンターゼプロモータなどを包含する。

他のプロモータはウィルスプロモータ、たとえばＣａＭＶ領域Ｖｌプロモータもしくは全長（３５Ｓ）プロモータ、リブロース−１，５−ビスホスフェートカルボキシレート、たとえば小サブユニット遺伝子に関連するプロモータ、ファセオリン、蛋白貯蔵、Ｂ−コングリシニン、セルロース形成に関連する遺伝子に関するプロモータなどを包含する。

種々の配列を便利な方法で合体させることができる。プロモータ領域は構造遺伝子（たとえばオビン遺伝子）から５′に位置する領域により同定することができ、さらに制限地図化および配列決定により選択しかつ分離することができる。同様に、ターミネータ領域は、構造遺伝子から３′の領域として分離することができる。これら配列をクローン化させ適正な向きで結合させて、植物宿主にてニトリラーゼ遺伝子を構成的に発現させることができる。

ニトリラーゼ酵素を発現する機能遺伝子を導入して作用植物細胞を改変することにより、広範な種類の作物につきブロモキシニル、イオキシニルまたは同類の除草剤を、雑草を実質的に完全または完全に除去すると共に作物には比較的影響を与えないよう確保する濃度で使用することができる。このようにして、肥料および水を一層効率的に利用しうる相当な経済性を達成することができ、さらに雑草の存在により生ずる悪影響を回避することができる。

ニトリラーゼ酵素を発現する発現カセットはトウモロコシ、小麦、大豆、タバコ、綿、トマト、馬鈴苫、油菜（Ｂｒａｓｓ　ｔｅａ）、稲、落花生、ペチュニア、ヒマワリ、甜菜、芝生などを包含する単子葉および双子葉の両者を含む広範な種類の植物に導入することができる。遺伝子はカルス、組織、根、塊根、零余子、苗木、種子、葉、実生、花粉などを包含する細胞もしくは植物部分に存在することができる。

ベンゾニトリル耐性植物を与えることにより、広範な種類の組成物を用いて雑草から作物を保護し、作物成長を向上させると共に栄椿品減少させることができる。たとえばブロモキシニルだけを用いて雑草を発芽後抑制すると共に、たとえばヒマワリ、大豆、トウモロコン、綿などの作物を安全にすることができ、或いは他の物質と組合せた組成物として使用すること０．１〜４ポンド／ニーカー、好ましくは０．２〜２ポンド／ニーカーのブロモキシニルを放出させ、ここには他の除草剤を約０．１〜４ボンド／ニーカーの活性成分を放出する量にて存在させる。組成物はたとえば洗剤、アジュバント、展延剤、付着剤、安定剤などの他の添加剤を含む。組成物は湿潤もしくは乾燥した組成物のいずれであってもよく流動性粉末、乳化性濃厚物および液体濃厚物を包含し、これらは当業界で周知されている。

除草剤溶液は、たとえば噴霧、潅厩、散布などにより便利な方法で施すことができる。

以下、限定はしないが例示として実施例を示す。

制限酵素および結合用のＴ４リガーゼを、製造業者の推奨にしたがって用いた。

クローン化および分子分析における標準法は、マニアチス等（１９８２）、モレキュラ・クローニング：ラボラトリ−・マニュアル、コールド・スプリング−＼ −ツクー・ラボラトリ−、ニューヨークにしたがって行なった。クローン分析は、イシューホロビッツ等、ヌクレイ・ツク・アシ・ソド・リサーチ（１９８１）、第９巻、第２９８９〜２９９８頁に記載されたように行なった。

全てのクローン化実験は大腸菌菌株ＭＭ２９４を用いた［）翫ナノーン、モレキュラ・バイオロジー（１９８３）、第１６８巻、第５５７〜８０頁］。

使用する場合、抗生物質のレベルには次の通りとした二〇ｍ（クロラムフェニコール）２５μｇ／ｍｌ；Ｔｅ（テトラサイクリン）１０％ｇ／ｍｌ　；　Ａ　ｐ　（ペニシリン）　３００　μｇ／ｍｌ。

大腸菌におけるプラスミドＤＮＡの形質転換は、マンデルおよびヒガ、ジャーナル・モレキュラ・バイオロジー（１９７０）、第５３巻、第１５９〜１６２頁にしたがって行なった。

ブロモキシニルで汚染された土壌試料からの細菌分離物を分離しかつスクリーニングした。この生物の１種は、クレブシェラ・ニューモニア亜種オゼナエと同定された。上記生物からのブロモキシニル特異性ニトリラーゼの部分精製および特性化により、３４ｋＤａｌの見掛は分子量を有する活性酵素を生成した。

固体り一寒天にてに、オゼナエの副培養を反復してブロモキシニルを唯一の窒素源としてもはや使用しえない変種を分離し、その際この変種生物を１Ω当りＫ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４（１、５ｇ　）とに２　ＨＰ　４　　（３−５ｇ　）とＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４７Ｈ２０（０，１ｇ　）と酵母抽出物（５０＋ｎｇ）とクエン酸塩、グリセリンおよびコハク酸塩のそれぞれ０，１％と微量要素とを含有する所定の液体培地でバーネットおよびイングラハムによりジャーナル・アプライド・バクテリオロジー（１９７５）、第１８巻、第１’（１〜１４３頁に記載されたように増殖させた。この培地は従来、ＹＥＴＥマルチカーボン培地として知られている。

このＹＥＴＥマルチカーボン培地は０．０５％のブロモキシニルを含有した。この生物はブロモキシニルを唯一の窒素源として利用しなかったが、０．０５％のブロモキシニルを含有するし一ブロスにて充分な密度まで増殖し、た。Ｋ、オゼナエ変種コロニーを選択し、１０ｍ１のし一ブロスで増殖させた。さらに、３種の独立したに、オゼナエコロニーをブロモキシニルを含有するＬＢプレートから選択して同じ条件下で増殖させた。これらの同し４種のに、オゼナエコロニーを、０．０５％のブロモキシニルが補充された１０ｍ１のＬ−ブロスで同時に増殖させた。培養物を最高密度まで３０℃にて増殖させ、各培養物からイシューホロビッツ等の方法［ヌクレイツク・アシド・リサーチ（１９８１）、第９巻、第２９８９頁］によってミニプレツブ・プラスミドＤＮＡを作成した。未消化のプラスミドＤＮＡを０．５９６アガロースゲルにて電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色によりブラスミドノくンドを可視化させた。

Ｋ、オゼナエ変種生物は、ブロモキシニルの存在下もしくは不存在下のいずれても増殖する単一のプラスミド種類（寸法１’１８ｋｂ）を示した。３種のに、オゼナエコロニーは、０．０５％ブロモキシニルの存在下で増殖させた場合、より大きいプラスミド種類（９０ｋｂ）を示した。ブロモキシニルの不存在下で両種類のプラスミドは３種のに、オゼナエコロニーのうち２種に存在する。このデータはより大きいプラスミド種類からより小さい形態への変換を示すと同時に、ブロモキシニルを選択しなければ約２２　ｋ　ｂのプラスミドＤＮＡを喪失することを示している。

４種のコロニー全てを、０．０５％ブロモキシニルを含有する２００　ｍｌのし一ブロスで増殖させた。細胞をフレンチプレスで破壊し、高速度で上澄液を０．０５Ｍ　Ｋ　Ｐ　Ｏ：　２．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する緩衝液（ｐＨ７，５）に対し透析し、さらに個々の粗抽出物をブロモキシニル特異性ニトリラーゼ活性につき分析した。１つのＫ、オゼナエ変種から作成された粗抽出物は検出しうるニトリラーゼ活性を持たなかったのに対し、他のに、オゼナエの粗抽出物はそれぞれ０．１２４　、０．１０５および０．１４３μモルＮ　Ｈ，／ａ＋ｔｎ　／ｍｇ蛋白のニトリラーゼ比活性を示した。

細胞（２００ｍｌ）を、０．１％のグルコースと０．０４％のブロモキシニルとを含有するＭ９培地［ミラー（１９７２）、エキスベリメンツ・イン・モレキュラ・ジエネチクラス、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリーコにて中間対数増殖期まで３０℃にて増殖させた。細胞破壊、超遠心分離および０．０５ＭのＫ２Ｏ２および２．５ＩＤＭのＤＴＴを含有する緩衝液（ｐＨ７，５）における上澄液の透析によって、粗抽出物を作成した。全ての分析において基質濃度は３ｍＭのブロモキシニルとした。ハーバ−、バイオケミストリー・ジャーナル（１９７７）、第１６７巻、第６８５〜６９２頁にしたがってＮＨ３の放出を監視した。ブロモキシニルを含有するし一ブロスにてに、オゼナエ変種が増殖する能力は、化合物に対する生物の後天的な非透過性をもたらし得る。しかしながら、この生物はブロモキシニルを唯一の窒素源として用いると所定の培地で増殖できない。

要するに、Ｋ、オゼナエのニトリラーゼはプラスミドにコードされると思われる。該酵素をコードする遺伝子は、プロモキシラ忙シル選択のない場合、Ｋ、オゼナエプラスミドから自然に喪失する２２ｋｂのプラスミドＤＮＡ断片に存在すると思われる。

０．０５％ブロモキシニルの選択下に増殖させたに、オゼナエからのプラスミドＤＮＡを作成し、かつこのＤＮＡを大腸菌株ＭＭ２９４（ｔｈｉ　、　ｇｙｒ　Ａ９６．　ｅｎｄｌ−、ｈｓｄ　Ｒ１７）に形質転換された。これら形質転換体を窒素欠乏した（Ｎ−）の固体アガロース最小培地（１ρ当りＫＨ２ＰＯ４（１，５ｇ）とに２ＨＰＯ４（３，５ｇ）とＭｇ５０　　・７　Ｒ２０（０，１ｇ　）と０．１％グルコースとを含有する）にてｏ、ｏｓｏｇのブロモキシニルを唯一の窒素源として添加することにより選択した。５日間培養した後、１０個のコロニーが選択プレート上に出現した。これらのコロニーを０．０５％のブロモキシニルを含有するし一寒天プレート上に再塗沫し、ＭＭ２９４におけるチアミン栄養要求性マーカーの存在につき試験した。これらコロニーはいずれもチアミンの不存在下では最小培地にて増殖せず、この菌株が大腸菌ＭＭ２９４であることを示した。全コロニーはチアミンと唯一の窒素源として０．０５％のブロモキシニルとが補充されたＭ９培地にて増殖することができた。

ブロモキシニルの不存在下では、この培地にて増殖は観察されなかった。これらコロニーのうち２種をさらに分析用に選択した。９０ｋｂプラｐミドを含有する大腸菌ＭＭ２９４の粗抽出ン調製物をブロモキシニル特異性ニトリラーゼ活性につき分析した場合、０．２１８μモル放出ＮＨ３／ｍｉｎ　／ｍｇの比活性が得られた。より小さい種類のプラスミドを含有する大腸菌ＭＭ２９４は、検出しうるニトリラーゼ活性を示さなかった。大腸菌における大きい９０（６８ｋｂ）をｐＢｒ”％−１Δと命名した。

ニル特異性ニトリラーゼ反応の結果として適当な代謝物を産生ずることを確認するため、ＭＭ２９４（ｐＢｒ　ｆ　１　）の２ｍｌ培養物を０．０５％ブロモキシニルが補充されたＭ９培地にて３０℃で２４時間増殖させた。培養物の濾液試料をＣｌ８ＨＰＬＣカラムでクロマトグラフにかけた。培養濾液における投入された全ブロモキシニルは、新たな代謝物ピークまで変換された。代謝物ピークの確認をスペクトル分析により行なって、３′、５’−ジブロモ−４−ヒドロキシ安息香酸（ＤＢＨＢ）であると決定された。したがって大腸菌におけるブロモキシニル特異性プラスミドでコードされるニトリラーゼ発現の産生物は、Ｋ、オゼナエにつき観察されたものと同じである。

ブロモキシニル特異性酵素をコードするＤＮＡ断片が大腸菌にクローン化させうるかどうかを決定するため、プラスミドターｐＡｃＹｃ１８４　［チャンダおよびコーエン、ジャーナル・バクテリオロジ−（１９７８）、第１３４巻、第１１４１頁］のＢａｒＡＨＩ部位に結合させ、かつ大腸菌株ＭＭ２９４に形質転換させた。ｐＡｃＹｃ１８４のサイクリン感受性の１０種の財２９４コロニーを選択し、ミニブレツブ・クローン分析ＤＮＡを作成し、かつこのＤＮＡを後に残留するＤＮＡ断片に一致する。１０種のクローンを全て２０＃μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールの存在下（プラスミドにつき選択するため）で２００　ｍｌのし一ブロス中にて増殖させ、粗抽出調製物を得、ブロモキシニル特異性ニトリラーゼ活性につき分析した。３７ｋｂＢａｉ　Ｈｌ断片を含有する４種のクローンは０．１４０　ｕモル放出ＮＨ３／ｍｊｎ　／ｍｇ蛋白の範囲のニトリラーゼ比活性を示したのに対し、他の６種のクローンにはニトリラ−ゼ活性が検出されなかった。このデータは、ブロモキシニル特よびブロモキシニル選択のない場合に自然に喪失される２２ｋｂのつ０．０７％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。プラスミド″Ｌ１ｐＢｒ　ａ　１およびｐＢｒ−）２１ΔのＥｃｏ　ＲＩ切断物を合したものも分乙ｐＢｒ〆３から自然に除去される２２ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片に対し内部であることも確認された。これらＥｃｏ　Ｒ１断片の寸法はそれぞれ１８ｋｂ、　３ｋｂおよび１．９ｋｂである。ブロモキシニル特異性ニトリラーゼをコードする遺伝子は、このニトリラーゼ構造遺伝子が大腸菌のブロモキシニル特異性ニトリラーゼの位置につき検ブロモキシニル特異性ニトリラーゼは大腸菌におけるペリプラズム酵素であるトルエン処理細胞（Ｌ−ブロス）　　　　　　　ｏ、ｇ２９リゾチーム処理細胞（Ｌ−ブロス）　　　　　　０．７９１３全細胞（Ｌ−ブロス）　　　　　　　　　　　　０．７７０全細胞（Ｌ−ブロス＋ＢｒＸ　１　）　　　　　　　　１．２５全細胞ＣＭ９）　　　　　　　　　　　　　　　０．９５０全細胞＜Ｍ　９　＋ＢｒＸ　１　）　　　　　　　　　　　１．４５全細胞／ｐＡｃＹｃ１１１４　（Ｍ　９　）　　　　　　　　　　０培地にて５ｍｌの培養物として３７ ℃で定常期まで増殖させた。

培養物は２０Ｍｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを示した場合物から１ｍｌを採取し、ニトリラーゼ緩衝液（０，１ＭＫＰＯ４、ｐｌ＋７．５）で１回洗浄し、かつ菌体をこの同じ緩衝液０．１　ｍｌにリー・ジャーナル（１９７７）、第１６７巻、第６８５〜６９２頁にしたがい基質としての３ｍＭブロモキシニルを用いて或いは用いずにニトリラーゼ活性につき分析した。

ｂ二μモルＮＨ／１１ｉｎ／ｍｇ蛋白は１．４のＯ，Ｄ、０ｏ−１０菌体／ｍ１＝１５０μｇであるとして決定された。

これらのデータは、ニトリラーゼ酵素の細胞位置がペリプラズム空間であることを示す。第２の観察は酵素が培地中のブロモキシニルの不存在下に発現されることであり、これは酵素発現にブロモキシニル誘発か必要とされないことを示唆する。

ブロモキシニル特異性ニトリラーゼの再精製に、オゼナエニトリラーゼの精製をさらに行なって、次の結果を得た。

第２表ブロモキシニル特異性ニトリラーゼの大腸菌からの精製（出発物質６ｇ細胞）粗抽出物ａＪ、００ｍ１　２１０ｏ＋ｇ　　　　１ｇ、１５　　　０．０８６３５−５０％ＮＨ４５０４８ｍ１　８３１１ｇ　　　２Ｂ、７７　　　０．２５０ＥＡＥセファデックス　　５６ｍ１　　１９＋ｎｇ　　　　１５．５２　　　０．８２０ａ：菌体は、０．０４％のブロモキシニルとグルコースとを含有するＭ９培地にて３０℃で中間対数増殖期まで増殖させた。粗抽出物は細胞破壊、超遠心分離および０．０５Ｍ　　Ｋ　Ｐ　０４（ｐｌ＋７．５）および２．５ｍＭＤＴＴを含有する緩衝液に対する透析により作成した。基質濃度は、全てのニトリラーゼ分析において３ＩＩＩＭとした。

ｂ＝μモルＮ　Ｈ３／　ｍｉｎ　／　ｍｇ。

２．５　ｃｄ　Ｘ　１０ｃｍ０カラムを、０．０５％Ｋ　Ｐ　０４（＋）８７．５）と２．５ｍＭ試料入れ、カラムを上記カラム緩衝液における０、０２Ｍ−０，４０ＭＮａＣｆ１の３００　ｍｌ直線濃度勾配で展開した。ＩＭのＮａＣΩを含有する緩衝液を濃度勾配の最後に施した。５ｍｌの各フラクションを集め、１つおきのフラクションの０．０７５　ｍｌアリコートについてニトリラーゼ活性を分析した。単一ピークの酵素活性が０．２２Ｍの塩にて溶出した。投入ニトリラーゼ活性の約７５％が活性フラクションに回収された。

ＤＥＡＥカラムからのニトリラーゼピークを含むフラクションを０．０２ＭのＫ　Ｐ　０４（ｐＨ７，５）に対し透析すると共に、各フラクションの５０Ｍｇ　（６μｇの蛋白）を１１．２５％の変性用レムリゲルに施した。ＤＥＡＥカラムからの活性ピークに相当する濃縮蛋白バンドは、分子量３４１口００のポリペプチドである。活性カラムフラクションにより、他のポリペプチドは濃縮されなかった。これらのデータは、ブロモキシニル特異性ニトリラーゼが約３４，０００の分子量を有するポリペプチドおよびおそらく単一遺伝子の生産物であることを裏付ける。

前記と同様に大腸菌中に形質転換させた。プラスミドを常法で分離し、かつＢｇｌ　ｎで切断して約６．７ｋｂの断片を得、これはｐＡｃＹｃ１８４ベクターに挿入されたままであった。次いで、分離さ１）ＡＣＹＣ１７７（３，７ｋｂ）　　［チャンおよびコーエン、ジャーナル、バクテリオロジ−（１９７ｇ）、第１３４巻、第１１４１〜１１５６頁］に挿入した。

ペニシリン耐性を与える得られたプラスミドを上記と同様に大腸菌中に形質転換させ、かつ形質転換体をペニシリン選択培地は３．９ｋｂ断片上にニトリラーゼ遺伝子を有する。

切断されたｐＵｃ１８　　［ヤニシューベロン等、データ（１９８５）、第３３巻、第１０３〜１１９頁］に挿入した。得られたプラスミドを大腸菌中にクローン化させ、かつニトリラーゼ活性につきスクリーニングした。１種のクローンは５．３ｋｂのプラスミドｐＢｒ＆９をを得た。このＰｓｔ　ｌ−Ｈ１ｎｃＩＩ断片をサンガー等の方法［プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ（１９７７）、第７４巻、第５４６３ル５４６８得られた配列（コードされた適するアミノ酸をも含む）を下記配列に示す。

ＣＴにＣＡＩＩ；ＧＡＴＡＧＴＡＧＣＧにＣＴｒＧｋＡＧＡ（、ＧＡＴＡＣＧＣＴＣＴＴｒＧにＣＣＡＧＣＣＡＴＣＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣに`ＴｎＴＣＭｅｔ　　Ａｓｐ　　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　　Ｐｈｅ　　Ｌｙｚ　　＾１＆　人１ａ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｇｉｎ　　Ａｌｍ　　にｌｕ　　oｒｏ　　Ｖａｌ　　τｒｐ　　Ｍｅｅ　　Ａｓｐ　　Ａｌａ　　＾１晶１５５　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１Ｂ５Ａｓｎ　　Ａｒｇ　　Ｃｈｉｎ　　Ａｒｇ　　Ｃ１ｎ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　　Ｖａｔ　　Ｓｅｒ　　Ｇｌｕ、Ｖａｌ　　Ｉｃｅ　　Ａｉｐ@　Ｓｅｒ　　Ａｓｎ　　Ｃ１ｙ　　Ａｓｐ　　Ｃ１ｕ　　Ａｓｐ　　Ｐｒ口＾ｒｇ＾１ｘＡＬａＣｙｓＧｌｕＰｒｏ人ｓｐ（：１ｕにｌｙＡｓｐＡｒｇＧｌｕＶａｔＶａｌＩｌｅＳｅｒＴｈｒＡｌａＩＬｅＣ１ｙ５′−および３′−非コード側方領域を実質的に持たないにより植物発現カセット中へ導入することができる。

ｐｃＧＮ４５１はオクトビンカセットを含み、このカセットはＥｃ。

Ｒ１リンカ−を介し遺伝子の３′末端に融合した５′−非コード領域の約１５ａｅｂｐと３′−非コードＤＮＡの約１３４９ｂｐとを有する。

ｐＴｉ対応物は、バーカー等、プラント・モレキュラ・バイオロジー（１９８３）　、第２巻、第３３５頁に規定されたように、３領域につき１１　、２０７〜１２．８２３でありかつ５′領域につき１３，６４３〜ブクロ一ン化断片をプラスミドｐｃＧＮ４０７としてｐＢＲ３２２にクロージョンをクローン化させかつ配列決定した。１つの場合、全コード領域と５′非翻訳配列の１．Ｏｂｐとが除去されて、５′非転写領域、１ＲＮＡキャップ部位及び５′非翻訳領域（Ｂａｍ　Ｈ１部位まで）の１８ｂｐとを完全のまま残した。７％アクリルアミドゲルでの寸法分別により、この小さい断片を得ると共に、長さ約１３０ｂｐのこれら断片を溶出させた。この寸法分別されたＤＮＡをＭ１３ＩＩｌｐ９に結合させ、かつ数種のクローンを配列決定し、この配列をオクトビンシンターゼ遺伝子の公知配列と比較した。Ｍ１Ｂ構築物をｐＩ４と命名し、このプラスミドをＢａｍ　ＨＩおよびＥｅ。

Ｒ１で切断して小断片を得、これをｐＴ＋Ａ６　［ガルフィンケルおよびネスター、ジャーナル・バクテリオロジ−（１９８０）　、第のプラスミドは、ＤＮＡポリメダーゼＩにより充填された単一のおいて、ｐｕｃ　ｓとは相違する。得られたプラスミドｐｃｃＮ４５１は、蛋白コード配列を５′−非コード側方領域（これはＴ−ＤＮＡの右側境界を含む５′非転写配列の１．５５０ｂｐとｍＲＮＡキャップ部位と５−非翻訳配列の１６ｂｐとを含有する）と３′領域（これはコード領域の２６７ｂｐと停止コドンと３′非翻訳ＤＮＡの１９６ｂｐとポリ八部位と３′非転写配列の１．１５３ｂｐとを有する）との間に挿入するをプラスミドｐｃＧＮ５１７に挿入し、これはテトラサイクリン耐性遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子とを有する。ｐｃＧＮ５１７は、唯ン（１９８２）　、第１９巻、第２５９頁］から導入することによりｐ）ＩＣ７９［ホーン、ジーン（１９８０）　、第１１巻、第２９１頁］から作成した。ｐｃＧＮ５１７をｐａｌ　　Ｉで切断し、かつＸｈｏ　Ｉ断片を唯一の跳し１部位に挿入した。

さらに、Ｘｈｏ　Ｉ断片を第２のプラスミドｐＣＧＮ　５２９に挿入した。

ｐＣＧＮ５２９は、Ｔｎ５［ｏススタイン等（１９８１）　、ムーバブル・ジーバー・ラボラドリース、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨークコからのＫａｎ　７遺伝子の挿入によりｐＡｃＹｃ１８４から作成し、ｐＲｉＡ４　　Ｔ−ＬＤＮＡ　［ホワイトおよびネスター、ジャーナル・バクテリオロジー（１９８０）　、第１４４巻、第７１０頁］がらのした。

５１７およびｐＣＧＮ５２９のそれぞれに挿入して、２種のプラスミド１）ＮｌおよびｐＮ２を生成させ、これらを用いてそれぞれＡ、ツメファシェンスもしくはＡ、リゾゲネスに導入することによりＴｉ−もしくはＲｉ−プラスミドのＴ− ＤＮＡに組込んだ。各プラスミド中への組込みはコマイ等、プラスミド（１９８３）第１０巻、第２１〜３０頁に記載されたように３一方向接合で達成することができる。プラスミドｐＲＫ２０７３　、ｐＮｌもしくはｐＮ　２ｎ有する大腸菌宿−ナル・バクテリオロジ−（１９８０）　、第１４４巻、第７３２頁コもしくはＡ、リゾゲネスＡ４Ｔ　（ホワイト、上記（１９８０）　、第１４４巻、第７１０頁］の１晩培養物を１晩培養し、がっ適当な培養物を混合すると共に、１５Ｃ１ｕｇ／ｍｌのカナマイシンを含有す特表平３−５０５６６３　（１２）るＡＢプレート上に展延した。単一のコロニーを２回にわたり再塗沫した。正確な組込みは、全アグロバクテリウムＤＮＡのサザン分析によって証明される。エンドヌクレアーゼ切断されたＤＮＡは、ニラｍ：　ｐＢ　ｒ蒼８で検査される。

ブロモキシニル特異性ニトリラーゼ遺伝子を菌コブ組織で発現させる。

２．８ｋｂ断片上にニトリラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＢｒ達成した。得られたプラスミドはアンピシリン耐性を示し、これを前記と同様に大腸菌中に形質転換させ、かつ形質転換体をアンピシリン選択培地で選択して５．２ｋｂのプラスミドｐＢｒ＆１６ＨｊｎｃＵで部分切断して１．２ｋｂのニトリラーゼ遺伝子断片を与えた。

巨１−１１−肛凹■断片を輿岬−Ｈ１−とａｌ切断されたｐｃＧＮ４８に挿入して、ニトリラーゼ遺伝子断片を有する６、６ｋｂのプラスｐＣＧＮ４６　［コマイ等、ネイチャー（１９８５）　、第３１７巻、第７４１〜７４４頁］はマンノピンシンターゼ（ＭＡＳ）発現カセットであって、ＭＡＳプロモータとｏｃｓ３ ’領域とを有する。ｐＣＧＮ４６の構築は次のように行った。マンノビンシンターゼプロモータ領域（ＰＭＡｓ）を含むＴ−ＲＤＡＡ　　［−＜−カー等、プラント・モレキュラ・バイオロジー（１９８３）　、第２巻、第３２５頁］の１部を有する約５．５ｋｂｐのＥｃｏ　ＲＩ断片（Ｅｃｏ　１３もしくはＥｃｏＣ）を、１）ＶＫ２３２と称するベクターにクローン化させた。Ｅｃｏ　ＲＩでｐＶＫ　２３２を切断した後、Ｅｃｏ　１３をｐＡＣＹＣ１８４のＥｃｏ　ＲＩ部位に挿び２０１２ｇ　）で切断して２ＭＡｓ領域を除去し、この領域をＳｐｈ　ＩおよびＡｃｅ　Ｉで予め切断されているｐＵｃ１９　　［ファルマシア社］に挿入して、ｐｃＧＮ４０を生成させた。ＰＭＡ８領域は９レユＩ認識部位を有し、その内部は切断に抗するようメチル化される。

ｐｃＧＮ４０をＥｃｏＲＶおよびＥｃｏ　ＲＴで切断し［ここでＥｃｏＲＶ部位はＴ−ＤＮＡに存在する一方、Ｅｃｏ　ＲＩ部位はｐＵｃ１９のポリリンカーに位置する”２ＭＡｓ領域を有する断片を生成させた。

よびＥｃｏ　ＲＩで切断し、かつオクトピンシンターゼ５′領域が２ＭＡｓ領域をオクトビンシンターゼ５′領域の代りにｐｃＧＮ４５１中に置換させ、ここで転写の開始および停止領域をポリリンカーにより分離してｐＣＧＮ４６を得た。

１．２ｋｂのニトリラーゼ遺伝子断片を含有するプラスミドルＢｒ２５塩基対の細菌５′未翻訳配列を有するブロモキシ矛ル遺伝子ｐｃＧＮ１６７を作成するため、ＣａＭＶ　（ｂｐ７１４４〜７７３５）　　Ｃガードナー等、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（１９８１）　、第９巻、第２８７１〜２８８８頁］の旦ｕｌ断片をＡｌｕ　Ｉでの切断によって得、これをＭ１３ｍｐ７　［ビエイラ、ジーン（１９８２）　、第１９巻、第２５９６１４のＥｃｏ　ＲＩ切断物は３５５プロモータを含有するＣ６１４からのＥｃｏ　Ｒｌ断片を生成し、これをｐｕｃ　８　［ビエイラ等、ジーン（１９８２）　、第１９巻、第２５９頁］のＥｃｏ　Ｒｎ部位にクローン化させてｐｃＧＮ１４Ｂを得た。

プロモータ領域を切断するため、Ｂｇｌ　Ｉｎ部位（ｂｐ７８７０）をＢｇｌ　ＩＩおよび坦［３１で処理し、次いで超し■リンカーをＢａｌ　３１−処理されたＤＮＡに付若させてｐｃＧＩＪ１４７を得た。

プロモータ領域と選択しうるマーカー（２ＡＴＧ’ｓを有する位かｐＣＧＮ５２８のカナマイシン遺伝子の近位となるよ・うにｐＣＧＮ５２８のＢｇＩ　　ｎ部位にクローン化させた。

この構築に使用したシャトルベクター、すなわちｐＣＧＮ５２Ｂは次のように作成した。カナマイシン遺伝子を有するＴｎ５を持ったプラスミド［ヨルゲンソン等、モレキュラ・ジーン（１９７９）、第１７７巻、第６５頁］を旧ｎｄＩＩＩ −Ｂａｍ　ＨＩで切断しかつカナマイシン遺伝子を有するＨｌｎｄｍ−Ｂａ＋ｎ　Ｈｌ断片をｐＡｃＹｃ１８４　［チャンおよびコーエン、ジャーナル・バクテリオロジー（１９７８）　、第１３４巻、第１１４１〜１１５６頁］のテトラサイクリン遺伝子のおけるＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａａ　Ｈ１部位に挿入することにより、ｐＣＧＮ５２５を作成した。ｐＴｉＡ６　［）マショー等、セル（１９８０）　、第１９巻、第７２９ル７３９５２Ｂを得た。

ｐＭＢ　９Ｋａｎ　ＸＸ　ＩからのＢａＩＩＨ　Ｉ力８シン遺伝子をｐＣＧＮ１４８ａのＢａｒＡＨ　ｎ部位にクローン化させることにより、ｐｃＧＮ１４９ａを作成した。

ｐＭＢ　９Ｋａｎ　ＸＸ　Ｉは、Ｘｈｏ　１部位を喪失しているがＴｎ９０３からの機能的カナマイシン遺伝子を有してアグロバクテリウムにおける効率的選択を可能にするｐｕｃ４に変種［ビエイラおよびメッシング、ジーン（１９８２）　、第１９巻、第２５９〜２６８頁］である。

ｐｃＧＮ１４９ａをＢｇｌ　ＩＩおよびｓｐｈ　　！で切断した。ｐｃＧＮ１４９ａのこの小さいＢｇｌ　ｎ−　Ｓｐｈ　ｌ断片を、Ｍｌ（下記参照）からのＢａｆｆ１Ｈ　ＩおよびＳｐｈ　Ｉで切断して分離されたＢａａ＋　Ｈ　Ｉ−　Ｓｐｈ　ｌ断片で置換した。これによりｐＣＧＮ１８７　、すなわち全長ＣａＭＶプロモータ、１　ＡＴＧ−カナマイシン遺伝子、３′末端及び細菌Ｔｎ９０３型カナマイシン遺伝子とを含有する構築物を生成する。ＭｌはｐｃＧＮ５５０化部位にクローン化させた。

７０９（　Ｉ　ＡＴＧ−カナマイシン−３′領域）の構築ｐｃｃＮｓｅｅは、ｐｕｃ１８−ａｍ　ＣＫ，バラフレー博士論文、ＤＣ−サンする。ＯＲＦ　１および２［バーカー等（１９８３）、上記コを含有するｐＮν３１ｃｍ　８、２９− １［１−マショー等（１９８０）、セル、第１９巻、第７２９頁コの肛回■−租し■断片をｐＣＧＮ５６Ｂの肛皿■ーシリ−ＨＩｙ部位　ブクローン化させてｐＣＧＮ７０３を得た。

ｐＴｉＡ６　［ｐＴ１］５９５５　（バーカー等、１９８３、上記）の塩基２３９６〜２９２０に相当コからの転写物７の３′領域を有するｐｃＧＮ７０３の５ａｕ３Ａ断片をｐｕｃ１８　　［ヤニシューベロン等（１９８５）　、上記］ＣａＭＶ−　３５８プロモータとＩ　ＡＴＧ−カナマイシン遺伝子とｐＴｊＡ６皿 ■−馬ａｎＨＩ断片をｐＬＩｃ１９　　けランダー等（１９８３）　、上記；ヤニュシニーベロン等（１９８５）　、上記］のＢａａ＋　Ｈ　Ｉ　−　）１ｊｎｄＩ１１部位にクローン化させて、ｐｃＧＮ９７Ｂを生成させた。

とｐＣＧＮ７０９　　（転写物７：３′上記構築参照）の０．５ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒ　ｌ−８ａｉｌ断片とをｐｃＧＮ５６Ｇの旧ｎｄＩＩＩ−　Ｓａｌ　　ｎ部位に挿入することにより転写物７からの３５Ｓプロモータおよび３′領域を発生させてｐｃＧＮ７６８ｃを生成させた。

Ｓａｔ　　ｌ断片に結合させて、ｐｕｃ１１９　［　Ｊ　、　　ビエイラ、ルットガース大学、ニューシャーシー州］の旧ｎｄＩＩＩ−　Ｓａｌ　　１部位中に組込んでｐＣＧＮ７７８を生成させた。

ｐＣＧＮ７７８の２．２ｋｂ領域、すなわちＣａＭＶ３５Ｓプロモータ（１−ＡＴＧ−ＫＡＮ−　３　’領域）を有する肛封■−巨Ｉ断片でｐＣＧＮ７３９のＨｉｎｄＩＩＩ−　Ｓａｌ　　Ｉポリリンカー領域を置換してｐＣＧＮ７８３を得た。

ｐＢｒ　Ｎ１７をＢａｎ　ＨＴで切断しかつ１ＩｉｎｃＩＩで部分切断して、生成させた。

ｐｃＧＮ５６Ｂは次のように構築した。ｐＬＩｃ１３　　（Ｃ＋ｅＲ）　　［ケン・バラフレー、博士論文Ｕ、Ｃ，サンジエゴ］をＥｃｏ　ＲＩおよびＨｉｎｄＩ］Ｉで切断し、かつｐＵｃ１８およびｐＵｃ１９からのポリリンカーをそれぞれ線状化されたｐＵｃ１３に挿入してｐｃＧＮ５１３Ｂを生成させた。これはクロラムフェニコール耐性マーカーを有する。

を、上記したように大腸菌中に形質転換させた。プラスミドを常法で分離し、かつＢａｎ　ＨＩおよびＥｃｏ　ＲＩで切断して再び１．２ｋｂニトリラ一ゼ遺伝子断片を得た。Ｂａｍ　ＨＩおよびＥｅ。

Ｒ１断片をＢａｍ　ＨＩおよびＥｃｏ　ＲＩ切断されたｐｃＧＮ４６に挿入して、ニトリラーゼ遺伝子断片を有する８、６ｋｂのプラスミドｐＢｒｐＩｌｒ　Ｎ２７を上記と同様に大腸菌中に形質転換させた。プラス、ジ翻訳配列の細菌５′の１１塩基対を有するプロモキンル遺伝子と、　ψ ツメファンエン菌株に１２［ネスター、アニュアル・レビュー・マイクロバイオロジー（１９８１）　、第３５巻、第５３１頁：へ端等、ネイチャー（１９８３）　、第３０３巻、第１７９頁コに形質転換させた。

Ｐ　′Ｌ　　　　　　　　ｐ　ヱに１２　（ＪＢｒ　ｍ２８）およびに１２　（ＪｆＢｒ　Ｘ２９）を用いて、カランコニ（Ｋａｌａｕｃｈｏｅ）　［ガルフィンケル、ジャーナル・バクテリオロジ−（１９８０）　、第１４４巻、第７３２頁コ上に菌コブ組織（ｇａｌｌ）を形成させた。

約１ｆ（新鮮重量）の菌コブ組織を液体窒素中で０．１Ｍ）リス（ｐＨ７，５）と１１０Ｉｎ＃ＥＤＴＡ、　０．１５Ｍ　　Ｎ　ａ　ＣＤ　、０．０５％ＮＰ− ４０，２５ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、　１　ｍＭ　ＤＴＴ、　０．１：（ｃｚ　ｇ　／ｍｌのロイペプチンとを含有する緩衝液にて磨砕した。試料を０．０５ｇのポリビニルピロリドン（シグマ社）の添加後にホモゲナイズし、次いで１５，０００ｇにて４℃で１５分間遠心分離した。精製ニトリラーゼをウサギ中に注射して作成した２５μｇの抗血清と２５０ｇｇの１０％（Ｖ／Ｖ）のＳ、アウレウス（カルビオケム社）の懸濁物とを各上澄液に添加して、４℃で１６時間インキュベートした。次いで試料を遠心分離し、かつベレットを２０ＩａＭトリス（ｐＨ７，５）、１　ｍＭ＄ＥＤＴＡ。

１５０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃｌ３．０．０５％ＮＰ−４０で２回洗浄した。ペレットを１００μｇの０．１２５　Ｍ　トリス（ｐＨ６，８＞　、４％のＳＤＳ　、　２０％グリセリン、１０％Ｂ庭に再懸濁させ、９０℃にて２分間加熱した。全試料を１０９６アクリルアミドゲルで電気泳動にかけた［Ｖ、に、レムリ、ネイチャー、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０）　］。溶解したポリペプチドをニトロセルロースフィルタ（シュライヒャーおよびシュエル）にバーネット［アナリチカル・バイオケミストリー、第１１２巻、第１９５〜２０３頁（１９８１）　］により記載されたようにしてで移した。次いで、ニトロセルロースフィルタ（シュライヒャーおよびシュエル）をプロット（ＢＬＯＴＴＯ）　［ジョンソン等、ジェネラル・アナリチカル・テクノロジー、第１巻、第３８〜４２頁（１９８３）コにて４２℃で１〜３時間時間インベニベート次いで抗−二トリラーゼ血清の１＝５０溶液を含有するプロット（ＢＬＯＴＴＯ）にて室温で１晩インキユベートした。フィルタを２０ＩＩＭのトリス（ｐＨ７，５）、１５０ｆｆ１ＭＮ　ａ　ＣΩで１０分間、０．０５％のツイーン−２０を含有する同じ緩衝液で２０分間、およびツイーン−２０を含有しない緩衝液でさらに１０分間洗浄した。１１０６ｃｐ／ｍｌの１１２５−標識された蛋白Ａ（９μＣｉ／ｍｇ　：　ＮＥＮ）を含有するプロットを次いでフィルタに添加し、かつ室温にて２時間インキュベートした。これらフィルタを５０１１ＩＭのトリス（ｐＨ７，５）、ＩＭのＮａＣｊＪおよび０．４％のサルコシルで１晩洗浄した。濯ぎかつ乾燥した後、フィルタをデュポン・クロネクラス増感血清を用いてコダックＡＲＸ線フィルムに一７０℃で露出させた。

タバコ植物を無菌培養した［２５℃、白色光（１Ｂ時間）；ＭＳ（１ｍｇ／　Ｌ　　ＩＡＡ　、　０．１５ｍｇ／　Ｌキネチン）］。主若枝移植物を通して維持された３週令の植物を組織供与体として使用した。若い葉（頂部から４番目まで）を選択し、直径２ｍｍの葉内盤を抜打ち、ベトリ皿（直径３ｃｍ）中のｌｌｌ１ｇ／ΩのＩＡＡを含有する１ｍｌのＭＳ培地に入れた。全くの暗所にて円盤を１晩保った後、アゲ中１０８〜１０９／ｍｌ）をこれら培養物に添加した。暗所にて１８〜２４時間にわたり共培養（Ｃｏ−ｃｏ　Ｉ　ｆ　１ｖａｔ　ｉ　ｎ）　Ｌ、た。ホルモンを含有せず３５０Ｉｌ１ｇ／Ｊ２のセホタキシン（ベーリンガーマンハイム社）を含有するＭＳ培地で３回洗浄することにより、葉切片からアグロバクテリウムを除去した。葉切片を直径９ｃｍのペトリ皿内のホルモンを含まない１０ｍ１のＭＳ培地に移した。フィトアガー（ギブコ社、０．６％；セホタキシン、３５０　ｍｇ／ｆ！　）のベトリ皿をバラフィルムで月止し、かつ組織供与体植物と同じ条件下で保持した。再生する若枝は次の２〜５週間で見られる。

６葉段階にて、ブロモキシニル溶液のスプレーを鉢植え植物に向けて植物に噴霧した。それぞれ４インチのポット１本の植物を含みかつ２．５ｍｌのスプレーを受けた。植物を２５℃、相対湿度７０％、６０時間の光照射期間にて生育室内で成長させた。噴霧してから９日後に０．５　ｃｍより長い新たな葉を計数することにより成長を測定した。

タバコ小サブユニット遺伝子を有するゲノムクローンを、ニ部分ゲノムライブラリーから分離した。エントウ豆小サブユニットｃＤＮＡクローン［プログリ−等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンスＬＩＳＡ（１９８１）　、第７８巻、第７３０４〜−ニングした。タバココード領域と５′−側方（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列とを有する３、４ｋｂのＥｃｏ　ＲＩ断片を、シャロン３２λフアージクローン（３〜８）からＭ１３ａ＋ｐ１ｇ　［ヤニシニーベロン等、ジーン（１９８５）　、第３３巻、第１０３〜１１９頁〕中にクローン化し、このサブクローンをＮＳＵＥ２０１ｇと称する。小サブユニット蛋白のＴＡＴ人ボックス（プロモータ）および推定ＡＴＧ開始コドンの位置を、ＤＮＡ配列決定により決定した。一本鎖ＤＮＡ鋳型をＮＳＵＥ２０１ｇから作成し、これを２５塩基の一本鎖合成オリゴマー（５’　ＴＧＴＴＡＡＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＡＧＡＣＡＧＡＡＡ３’　）にアニールさせた。この配列は、タバコ小サブユニット遺伝子の推定ＡＴＧにおける５′直後に位置する２５塩基に相補的である。その際ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片を用いてプライマを延長させてｄｓＤＮＡを作成し、次い断し、かつ上記のように作成したｄｓＤＮＡ断片をポリリンカー中に挿入して４．１ｋｂのｐｃＧＮ６２５と称する材抽０プラスミドを得た。

ｐＬｌｃｌｇに挿入して４．１ｋｂのプラスミドｐＣＧＮ８２７を得た。８．３ｋｂのＤＮＡセグメントを得、これはｐＡｃＹｃ１７７　［チャンおよびコーエン、ジャーナル・バタテリオロジ−（１９７ｇ）　、第１３４巻、第すなわちｂｐ１２８２３（必恕−ＲＩ）〜ｂｐ１００６９　　（カリニ■）を含む［バーカー等、プラント・モレキュラ・バイオロジー（１９８４）　、第断片に隣接する。ｃｓ３’領域を与え、７．７ｋｂのプラスミド、すなわちｐｃＧＮ６３０を生成させた。

Ｂｇｌ　ＩＩで切断し、クレノーポリメラーゼで平滑末端化し、次いでＨｉｎｄｍリンカ−と結合させた。得られたプラスミドｐｃＧＮ１５１０ネータ領域との間に正しい向きに位置せしめた。得られた８、９工中に挿入してｐＢｒ　Ｎ３９およびｐＢｒ　４４０を得、これらはそれぞれニトリラーゼ遺伝子をカナマイシン遺伝子とは反対および同一の転写方向に有する。

これらのプラスミドをＡ９　ツメファシェンス菌株ＬＢ＾４４０４に形質転換させ、次いでタバコにコチアナ・タバクムｃｖ、　　ｒキサンチ」）の子葉外植片と一緒に培養した。カナマイシン耐性若技を、慣用技術にしたがってタバコ植物中に再発生させた。

ブロモキシニル特異性ニトリラーゼ遺伝子を発現するトランス形質転換されたタバコ植物（５〜６葉段階）からの葉組織は、慣用のウェスタン分析によりニトリラーゼ蛋白を発現することが示された。表面殺菌された葉（１０％次亜塩素酸塩；水洗）の約５ｍｍの葉セクションを、光合成独立栄養条件の下でブロモキシニル含有培地に懸濁させた。使用した培地は、０．９３ｍｇ／Ｎのナフチル酢酸と０．１１ｍｇ／ｊ！のベンジルアミノプリンとを含有するＭＳ塩とし、ブロモキシニルの量を変化させた。ブロモキシニルの濃度は、０．１希釈率にて１０−３〜１０−６Ｍの範囲で変化させた。

光合成独立栄養条件は５％Ｃ０１０％０８５％Ｎ２とした。

２　′　　　　　　２　′ 形質転換されていない比較のタバコ葉セクションは、ｌＯ’Ｍのブロモキシニルで漂白された（阻止された）。それに対して、Ｌ　　　　　　　　　　χ それぞれプラスミドｐＢｒ〆３９およびｐＢｒ　ｔ４０からのブロモキシニル特異性ニトリラーゼを発現する形質転換された葉セクションはｌＯ’Ｍおよび１０ −’Ｍのブロモキシニルに対し耐性であった。

タバコにつき前記したと同様にトマト（リコベルシコン・エスクレンツムｃｖ、ＬＩｃ８２８）の子葉移植片の同時培養を行ない、かつカナマイシン若技を再生させた。形質転換されたトマト植物（７〜ｌＯ葉段階）からの葉組織は、標準ウェスタン分析によりニトリラーゼ蛋白を発現することが示された。表面殺菌された葉（１０％次亜塩素酸塩；水洗）からの約５關の葉セクションを、光合成自己栄養条件下で、変化する濃度のブロモキシニル含有培地に懸濁させた。培地は２ｍｇ／Ωの２．４−ジクロル酢酸とｌａｇ／ｇのイソペンチルアデニンとｌＯ口ｍｇ／Ωミオイノシトールと１０−５もしくは１０’Ｍのブロモキシニルとを含有するＭＳ塩とした。

タバコにつき記載したと同じ光合成自己栄養条件を用いた。形質転換されていない比較の葉セクションはｌｏ’Ｍプロモキシニリラーゼ遺伝子を発現する形質転換植物はｌｏ−５Ｍのブロモキシニルに対し耐性であった。トランスジェニックトマト植物（１０〜２０葉段階）にブロモキシニルの市販組成物（ブクトリル）を噴霧したところ、０．５ポンド／ニーカーにて耐性であることが判明した。

トリラーゼ遺伝子のＣ末端におけるコード領域に欠失部を導入鎚Ｌ１部位と共にリーディングフレームに存在し、ｐＵｃ１８からのＴＧＡコドンに対し約１０個のコドンが付加される。

追加１０個のコドンの存在は偶発的であり、これらコドンを除去してニトリラーゼの活性に顕著に影響を及ぼすことなく切断ニトリラーゼを作成しうるという事実を裏付けている。

下記配列は、Ｃ−末端改変二トリラーゼ（ｎｉｔ−３，１）の配列を推定アミノ酸と共に示した。

ＧＡＣＴＴＡ　　ＣＡに　ＧＴＣＧＣＣＣＡＡ　　ＡＣＴ　ＡＧＣＣ，τＴ　　ＧＣＴ　ＣＧＣＧＴ（：　Ｃ，ＧＴ　ＧＣＣＧＴＣＡＡＩ：@　τＧＣＧＣＧ＾ｘｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ｖａｔ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　にｌｙ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ@Ｃｙｓ＾１！にｌｕ　Ａｓｎ　　Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　　Ｌｙｓ　　Ｐｈｅ　　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　Ａｌａ　　人１ａ　　（C１ｕ　Ｇｌｙ　　Ｇｌｕ　　Ｇｉｎ　　ＩＬｅＨｉｓ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＶａＬ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ@Ａｓｐ　５ｅｒ１１ｅ　Ｇｌｙ＾ｌａ　ｒｌｅ　Ａｓｒ＋　Ｇｉｎ　Ｖａ１τｒｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　にＬｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　kｅｕ　ＭＥτ Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　（：ｉｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　ＧＬｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　にｌｙ　１１ｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｃ１普@Ａｓｐ　ＡｒｇＬｙｓ　Ｌｃｕ　Ｃ１ｙ　Ｔｈｒ　Ｃ】、ｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　　、　　Ｌｅｕ　にｌｙ　Ｌｙｓ　ＰｒｏＴｒｐOｒｇ　Ｔｙｒ τ丁Ａ　　ＣＡ＋：　　にＴＣＣＣＣＣＡＡ　　ＡＣＴ　　ＡＧＣＧＴＴ　　（、ＧＴ　　ＣＧＧ　　にＴ（：　　ににＴ　　にＣＣＣＴＣ`ＡＣＴにＣＧＣＧ　　ＧＡ（：Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　　Ｃｈｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＶＪＬＩ　　Ｃ１ｙ　Ａｌａ　　Ｌａｕ@　Ａｓｎ　　Ｃｙｓ　　人ＩＪＬ　　（：１ｕ６２Ｌ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６に８ＡＴＣＴＣＣＧＣＣＴＧＣＣＣＡ　　ＴｒＣＡＣＧ　　ＣＴＴ　ＣにＡ　　ＡＣＣＣＣＴ　にＴＧ　　ＣＴＣに″ｒＣＧＧＡ　　に人ＣＴＣ bＡＴＣｌｌｅ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｃ１，ｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓ吹@Ｓｅｒ　ｌ１ｅＧｃｃ　ｃｃｃ　ＡＴＣＡＡＣＣＡＧ　ＧＴＣＴＡＣにＣＯＧＣＣＧＡＧ　ＡＣＧ　ＣＧＧ　ＡＣＣＴＴＣＧＴｒ　ＣＴＣＡＴＣＴＣＣＣ１ｙ＾ＩＪＬ　Ｉｌｅ　Ａｓｒ＋　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ＾ｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｅ’ｈｅ　Ｖａｌ　Ｌｅ普@ＫＥＴ　５ｅｒＡＣＩＩ；　ＣＡに　ＧＴＣにＴｒ　ＧＧＡ　ＣＣＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣ：ＣＴＣＧＡに　ＡＴＣＣ，ｋＡ　にＡＣＡ（：Ｇ　sＡＣ τｈｒ　Ｇｉｎ　ＶａＩＶａｌ　にｌｙ　Ｅ’ｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ４１ｅ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｃ１ｕ　Ｉｌｅ　ＧｌｕＡｓｐ＾ｒ■■凾■ ７８３　　　　　　　　　　　　’　　　　　　　　　　　　　　　　８１０ＡＡＣＣＣＣＡＡＴ　　ＣＡＧ　　ＴＡＴ　　ＣＴｒ　　ＧＧＴ　　Ｇｌｌ；Ｔ　　ＧＧＧ　　ＴＡＣＧＣＣ；　　ＣＧＧ　　ＡＴＣＴＡＣfＣに　　ＣＣＴ　　にＡＣＡＴＧ＾ｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｃ１ｙ　にｌｙ　Ｔｙｒ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｔｉｅ　Ｔｙｒ　Ｇｕｙ　Ｐｒｏ　`ｓｐ　ＦＶ＋τ Ｃ声ＣＴＴに　　ＡＡ（：　　ＡＧＣＡＡＧ　　ＴＣＧ　　ＴＴＧ　　ＴＣＡ　　ＣＣに　　ＡＣＣＧＡＡ　　（：Ａに　　ＣにＣＡＴＣＧsＣＴＡＣにＣＣＣＲＡＧＧｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｙ　Ｃ１ｕ　にｌｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　ＶａＬτｙｒ　`ｌａ　Ｇｌｕ８９１、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９１８ｆｉ、ＴＣＧＡＣＣＴＣＴＣＧＡＴＧＣＴＴＧＡＧにＣＡＧＣＡＡＡＧＴＡＣＴＣＧＣτ ＣにＡＴＣＣＣＡＣにＧにＣＣＡＣ１ｉｅ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　Ｓｅｒ　　ＭＥτ　Ｌｅｕ　　Ｇｌｕ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　@Ａｓｐ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　ＨｉｓτＡτ　ＴＣＣＣＧＣＣＣＴ　　ＧＡＴ　　ＧＴＧ　　ＴｒＣＡＧＣＧＴＧ　　ＴＣＧ　　ＡＴＴ　ＡＡＣＣＣＧ　　ＣＡＡ　　ＣにＧ　　bＡＧ　　ＣＣＴ　　ＣＣＣ τｙｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＩＬｅ　Ａｓｒ＋　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｇｉ氏@Ｐｒｏ＾１ａり９９　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０２６（Ｔに　　ＴＣＡ　　ＣＡＡ　　ＧＴＴ　　ＡＴＣ（人ＣＴＣＡ　　ＡＡＣＧ（Ｔ　　ＧＡＣにＡに　　ＧＡＣＣＣＣＡＧＡ　　（：ＣＡ　@ＧＣＡ　　ＴにＣＧＡＧＶ、ａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ｒｕｅ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ｋｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｌａ＾ｌａ@Ｃｙｓ　に１ｕ１０５３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０Ｂ０ＡτＣＴＣＣＡにＡ　ＣにＣＡＧＡんり、τ＾τ＾にＣＣＣＡ　ＧＡに　ＴＴＡ　ＡＡＡ　ＣにＣＣｋＡ　にＣＣＡＴＣにＣＴ　ＴｒＡＭＥＴ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｒｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｃ１ｕ＾ｌａ　Ｉｌｅ＾撃＝@Ｌｅｕ人ＣＣＣＣＴ　　Ｃ・Ｔｈｒ　Ａｒｇ　ｌ１ｉｓＮ−末端置換を有する改変ニトリラーゼの作成５分間にわたり再切断して約５１ｎｔを除去した。この酵素を失活ＨＩで完全に切断して、５′−末端にて切除されたニトリラ−ｐＬｌｃ１９からのポリリンカーとクララムフェニコール耐性遺伝子し、ここでｐＵｃ１９配列によりコードされた１７個のアミノ酸は天然ニトリラーゼのアミノ酸を置換している。

上記配列に基づき、延長Ｎ−末端アミノ酸配列を有するニトリラーゼは、Ｎ−末端配列で切断されているか或いはＮ−末端配列の天然アミノ酸を他のアミノ酸で置換されている場合と同様に活性を保持する。

下記にＮ−末端改変二トリラーゼ（ｎｉｔ−２３）の配列を示す。

ＡＴ（：　ＴＣＡ　ＣＡＡ　ＡＴに　ｃｒｒ　ＡＴＣＣＡＴ　ＧＣＣＣＡＴ　ｃｃｃ　ＡＴＣＡＣＣＡＡＡ・ｈｒｒ　ＣＧＴ　ＣＣＴ、Ｃに`　ＡＡＣＫＥＴ　　Ｓｅｒ　　Ｇｉｎ　　ＭＥＴ　　Ｌｅｕ　　Ｉｃｅ　　Ａｓｐ　　ＡＩＪＩ　　ＡＭＰ　　Ｃ１ｙ　　ｒｌｅ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙ刀@　Ｉｌｅ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　ＬｙｓＬｅｕ　Ｇｉｎ　　Ｖａｌ　　Ａｌａ　　Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　　Ｃ１ｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　　Ｃ１ｙ　人１ａ　　Ｌｅｕ@Ａｓｎ　Ｃｙｓ　　Ａｌａ　ＧＬｕ＾ｓｎ　Ｌｅｕ　にｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ＾Ｌｍ　Ｇｌｕ　ＧＬｙ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｉ撃■@Ｈｉｓ＾τＣＴＣＣにＣＣＴＧＧ　　ＣＣ八　ＴｒＣＡＣＧ　　ＣＴＴ　　ＧＯ＾　ＡＣＣＣＣＴ　　にτＧ　　ＣＴＣＧＴＣＧにＡ　　ＣＡＣＴbＣ人τＣ１１ｅ　Ｓｅｒ＾ｌａ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　にｌｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ’Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　rｅｒ　ｌ１ｅにＱＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＣＡＧ　ＣＴＣτＡＣＧＣＧ　ＧＣＣＧＡＣＡＣ（：　Ｇにに　ＡＣＣＴｒＣＧＴｒ　ＣＴＣＡＴＣＴＣＧＣ１ｙ＾Ｌａ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｖａｌτｙｒ　Ａｌａ＾Ｌａ　（：ｌｕ　Ｔｈｒ　ＣＬｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＭdＴＢｅｒＴｈｒ　　Ｇｉｎ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｃ１ｙ　　Ｐｒｏ　　丁ｈｒ　　ＣＬｙ　　ｒｌｅ　　Ａｌａ　＾ｉｓ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｕ　@ｒｙｅ　　ＧＬｕ　　Ａｓｐ　　Ａｒｇ　　Ｔｙｒ野生型および改変されたニトリラーゼの精製定常期のＭＭ２９４大腸菌からニトリラーゼを作成した。全細胞のニトリラーゼ分析値が約２．０の０Ｄ６４ｏを与えるまで培養物をアンピシリン選択の下で増殖させた。培養物を８，０００　Ｘ　ｇにて４℃で１５分間遠心分離した。菌体を０，１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）で洗浄し、再ベレット化し、乾燥させ、−２０℃で凍結ささせた。ペレットを４℃で解凍させ、１１１Ｍのジチオトレイトールおよび０．１ｍＨのＥＤＴＡを含有する４０ｍ１の５０ａＭ燐酸カリウム緩衝液（ＫＤＥ）に再懸濁させた。次いで、菌体懸濁物をフレンチプレッシャーセルに通し、ｅｏ、ｏｏｏｘ　ｇにて４℃で４０分間遠心分離した。得られた上澄液（粗抽出物）をＫＤＥ緩衝液で１２ｍｇ　／　ｍｌの蛋白濃度まで希釈した（フラクションＩ）。硫酸アンモニウム分別を粗抽出物につき行ない、２５〜３５％のフラクション（フラクション■）は８５％のニトリラーゼ活性を有することが判明した。このフラクションを１０ｍ１のＫＤＥ　緩衝液に再懸濁させ、同じ緩衝液に対し徹底的に透析した。

さらにフラクション■をＫＤＥ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファデックスクラ５０カラム（４，９ｃシｘ４０ｃｍ）で精製した。ニトリラーゼピークを、ＫＤＥ緩衝液における０、１〜０．４　ＭのＮａＣ９濃度勾配により溶出させた。活性フラクションを集め（フラクション旧）、硫酸アンモニウムで沈澱させ、さらに２５ｍＭのヒスチジン（ｐＨ８，２）に対し透析した。ＰＢＥ９４を有するファルマシア社のクロマトフオーカシングカラム（１，７５ｃｄ　Ｘ　２０（至））を用意し、２５ＩＩＩＭのヒスチジン（ｐＨ８，２）で平衡化させた。このカラムを先ず最初にポリバッファー７４　（ｐＨ４，０）で洗浄して６〜４のｐＨ濃度勾配を形成させ、酵素をＩＭのＮａＣ１で溶出させた。活性酵素フラクションを含有するピークを硫酸アンモニウム沈澱させ、かつＫＤＥで透析した（フラクション■）。その１１．２５％ゲル上での５ＤＳ−ＰＡＧＥにより約３７．０００に強力なバンドが示され、約７０．０００の分子量に僅かな汚染物を有した。密度計走査は、フラクション■のニトリラーゼ調製物が９９％均質であることを示した。

下表は、精製の結果および精製ニトリラーゼ産生物の特性を示している。

野性型および改変されたブロモキシニル特異性ニトリラーゼの精製および性質の比較ｎ１ｌ−Ｗｔ　　　　　　ｎ１ｔ−１１ｎ１ｔ−２３硫酸７　：／％　＝　’ｙ　ｌ−２５−３５％　　　　１０−２５％　　　２０−３５％溶出タロマドフォーカシング溶出ｐ）１６−４濃度　　ＩＭ　ＮａＣｎ　　　　ｐＨ４，８ＬＭ　ＮａＣｆ１勾配／　ＬＭ　ＮａＣｊ７洗浄比活性　　　２５．７　　５５　　１９．７反復（ｆｏｌｄ）精製　　　　１０．３　　　　　１６．４　　　　３５．８Ｋｍ　　（ｍＭ）　　　　　　　　０．３１　　　　　０．０５　　　　０．１１Ｖｍａｘ（モル７分１０＋ｇ）　　１５　　　　　　３６　　　　　９活性酵素型　　　　　　ダイマー　　マルチマー　　ダイマー上記手順にしたがって、ブロモキシニル耐性である植物を得ることができ、これらをその成長に顕著な悪影響を及ぼすことなくブロモキシニルの存在下の畑で使用することができる。

本発明は植物を除草剤耐性、特に特定のベンゾニトリル除草剤に対し耐性にすることによる植物の改良を与える。すなわち、ニトリラーゼをコードする遺伝子を植物宿主中に導入することにより、遺伝子を発現させ植物に対しベンゾニトリル耐性を付与することができる。さらに該酵素は、便利な細菌宿主において遺伝子のクローン化して該酵素を発現させることにより産生できる。監視しうる活性を持った酵素は、各種の分析物またはベンゾニトリル基質の検査において広範な種類の用途を有する。

さらに、これら酵素および酵素を発現する細菌を用いて、汚染された環境からベンゾニトリル除草剤を除去することもできる。

以上、本発明の明瞭な理解のために実施例により詳細に説明したが、本発明の範囲内において一定の改変をなしうろことは明らかであろう。

補正書の写しくＩＩ訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成２年１月８日特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、特許出願の表示　　ＰＣＴ／ＥＰ　　８８１００５８８２、発明の名称　　　　ハロアリールニトリル分解性遺伝子、その使用および該遺伝子を含有する細胞３、特許出願人住　所　　フランス国、６９００９−リヨン、ルウ・ビニール・ベイゼ、１４− ２０名　称　　ローヌープ−ラン・アグロシミ４、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ピル５、補正書の提出年月日　　１９８８年８月１９日明　　細　　書ハロアリールニトリル分解性遺伝子、その使用および該遺伝子を含有する細胞関連出願の相互関係本発明は１９８７年１月５日付は出願の国際特許出願ＰＣＴ／Ｕ　Ｓ　８７１０００４４号の部分継続出願であり、前記ＰＣＴ出願出願４１９竿８願であり、さらに前記米国出願は１９８６年１月寞日付は出願の米国特許出願第８１７．２２８号の部分継続出願であり、これら両者の開示を参考のためここに引用する。

したがって、たとえば細胞毒性剤のようなストレスに対し耐性にするよう生存細胞を改変しうることに極めて興味がある。

関連文献の説明米国特許第４，５３５，０６０号公報は、グリホセート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）感受性細胞に対しグリホセート耐性を付与するための細菌ａｒｏＡ遺伝子の使用を記載している。スーおよびキャンパー、キャナディアン・ジャーナル・マイクロバイオロジー（１９７Ｂ）、第２２巻、第５３７〜５４３頁は、土壌補充培養物からのイオキシニル分解体の分離を記載している。スーおよびクレムソン、ディサチージョン・アブストラクト・インターナショナル、第８３Ｇ巻（１９７Ｇ）、第８号、第３７０８頁は、３．５−ジハロゲノ−４−ヒドロキシベンゾニトリルの１群の除草剤における微生物分解を記載している。インダラムおよびプリン、ベスチシド・サイエンス（１９７４）、第５の持続性を記載している。スミス、アブストラクト・ミーティング・ウイード・ソサエティ・アメリカン（１９７１）、第１６〜１７頁は、レジャイナ重質粘土におけるブロモキシニルの分解を記載している。スミスおよびフレッチャー、ホルチカルチャー・リサーチ（１９８４）、第４巻、第６０〜６２頁は３，５−ジハロゲノ−４−ヒドロキシベンゾニトリルおよび土壌微生物につき報告している。

本発明によれば、ハロゲン化ヒドロキシベンゾニトリル、特に３，５−ジブロモ −もしくは３，５−シイオド−４−ヒドロキシベンゾニトリルの加水分解に関係する新規なりＮＡ配列、構築物、形質転換細胞、植物およびペプチドが提供される。本発明は、ニトリルの除草剤活性を解毒すると共に除草剤に対し感受性の細胞もしくは宿主に対し保護を与え、或いは除草剤で汚染された環境を解毒するようニトリルを加水分解しうる酵素を産生させることに関する。

興味ある構造遺伝子は、ベンゾニトリルを窒素源として使用し得、通常ベンゾニトリルを唯一の窒素源として使用しうろことが示された単細胞微生物、特に細菌から得ることができる。

以下ベンゾニトリルもしくはニトリラーゼの説明に関し、ベンゾニトリルはハロゲン化ｐ−ヒトｌロキシベンゾニトリル、特に３．５−シイオド−もしくは３．５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンゾニトリルとし、かつニトリラーゼはこの種のノ＼ロゲン化ベンゾニトリルを窒素源として使用しうる。特にその唯一の窒素源として使用しうるニトリラーゼとすることを意図する。

さらにニトリラーゼは、ハロゲンを持たず他の置換基などを有する他の同族体ではなくベンゾニトリルに対し特異性を有しなければならない。したがって、本発明のニトリラーゼは上記ベンゾニトリルに対し特異性であり、かつ同族体に対し比較的不活性であり或いは同族体に対し活性が実質的に低い。望ましくは、増殖速度に顕著な低下が存在してはならず、すなわち同等な濃度における窒素源としてのベンゾニトリルと対比して、たとえばアンモニアのような通常の窒素源の存在下で約１０％未満の細菌増殖の低下を示すものとする。このような結果は、特定されないベンゾニトリルでは観察されない。

１種もしくはそれ以上の宿主菌株が固定されたら、ニトリラーゼ子は、染色体もしくはプラスミドに存在し得る。ゲノムを特に制限エンドヌクレアーゼにより断片化することができ、ここで１種もしくは複数のエンドヌクレアーゼを用いて約５〜５゜ｋｂの範囲の断片を形成することができる。これらの断片を便利な細菌（たとえば大腸菌）に適当なベクターでクローン化させると共に、得られた形質転換体をニトリラーゼ活性につきスクリーニングすることができ、その際宿主生物は陰性バックグラウンドとなる。

１種もしくはそれ以上のクローンがニトリラーゼ活性を有すると確認された後、所望のＤＮＡ断片、プラスミドもしくはウィルスを含有する染色体外の要素をたとえば宿主の溶菌、ＤＮＡの沈澱および染色体ＤＮＡからのベクターＤＮＡ、プラスミドもしくはウィルスＤＮＡの分離のような慣用の技術により分離することができる。次いで染色体外の要素をエンドヌクレアーゼ制限により切断し、所望の断片を種々異なる寸法の断目片の分離および着定に関する各種の技術、たとえば電気泳動、密度勾配遠心分離などによって分離することができる。

アミノ酸配列に基づきプローブを作成し、次いでこれを用いて酵素切断と組合せることにより、これら断片をクローン化しかつ所望遺伝子の存在につきスクリーニングすることができる。

両者を切除したり或いは５′−もしくは３′−末端を延長させたりする種々の方法で改変することかできる。一般の２５個以下、より一般的には約２０個以下のコドンが天然産ニトリラーゼに関与する。ニトリラーゼは５０個程度、一般には約３０個以下のアミノ酸だけ延長することができる。置換と切除と延長との組合せを用いることもできる。このように、遺伝子を種々の方法で処理して、プラスミドなどの操作において便利となるよう酵素の特性を変化させることができる。

ニトリラーゼを発現する構造遺伝子を持ったＤＮＡ配列を広範な種類の他のＤＮＡ配列に結合させて、適当な宿主細胞中に導入することができる。相手方の配列は宿主の種類、宿主中へのＤＮＡ配列の導入方法、およびエピソームとしての保持もしくは一体化が望ましいかどうかに依存する。

原核宿主については、形質転換、接合、形質導入またはトランスフェクション原核宿主中へのＤＮＡ配列の導入のために使用しうる広範な抄類のベクターが存在する。ＤＮＡ配列はたとえばｐＢＲ３２２，ｐＡｃＹｃ１８４．　ｐＭＢ９．　ｐＲＫ２９０などの広範な種類のプラスミド；コスミド、たとえばｐＶＫｌｏｏ　；またはウィルス、たとえばＰ２２などを包含する。

コンピテント複製系がＤＮＡ構造に存在するかどうかに応じて、ＤＮＡをエピソーム要素として複製させうるか或いはＤＮＡを宿主ゲノム中に組込んで構造遺伝子を宿主にて発現させうるかどうかが決定される。宿主に対し致命的でない腫瘍誘発性プラスミド、たとえばＴｉもしくはＲｉまたはその断片もしくはウィルス、たとえばＣａＭＶ、ＴＭＶもしくはその断片のようなエビソーム要素を用いることができ、ここで構造遺伝子はその構造遺伝子の発現が可能な形でそのようなエピソーム要素に存在する。特に興味あるものは、複製機能を有するがたとえば発癌性、毒性などの他の機能を欠如した断片である。

宿主生物は、ベンゾニトリル耐性につき選択することができる。受容体菌株を改変して、形質導入体の選択を可能にする適当な遺伝的特徴を付与することができる。微生物においては、形質導入体を用いて所要に応じ移動性プラスミドの使用により他の微生物に接合させることができる。ニトリラーゼ用の構造遺伝子を有する断片の寸法をさらに減少させるには、種々の技術を用いることができる。たとえばコスミドベクターを分離し、各種の制限エンドヌクレアーゼ、たとえばＥｃｏ　ＲＩ　、　Ｂｇｌ　ＩＩ。

Ｓｍａ　Ｉなどを用いて切断し、さらに得られた断片を適するベクター、便利には従前に使用したコスミドベクターにクローン化させることができる。コスミドベクターの代りに、たとえばｐＡｃＹｃ１７７およびＩ）ＡＣＶＣ１８４のような小寸法の各種のクローン化ベクターを用いることもできる。かくして、好ましくは約５ｋｂ未満、一般に約４ｋｂ未満、より好ましくは約２ｋｂ未満の断片をクローン化させて、ベンゾニトリル耐性を与えることができる。

望ましくは、断片は約１ｋｂおよび約５ｋｂ未満、好ましくは約４ｋｂ未満、特に少なくとも約１０４７ｂｐ、より詳細には少なくとも約１１００ｂｐ、好ましくは約１．５ｋｂ未満の側方領域を含むものであである。

５′−末端にて約５個のコドンまでおよび３′−末端にて約１０個のコドンまでニトソラーゼ遺伝子を切除すること或いは約５０個まで、一般に約３０個以下、好ましくは２０個以下のコドンを５′−および３′−末端に付加することに特に興味が持たれる。

ニトリラーゼ比活性は、ノ＼−杉一によりノくイオケミカル・ジャーナル（１９７７）、第１６７巻、第６８５〜６９２頁に記載されたよう一般に少なくとも約０．５もしくはそれ以上である。

精製された酵素は、各種の方法で使用することができる。・これはブロモキシニル、イオキシニルまたはその他の関連ベンゾニトリルに関する分析に直接使用することができる。或いは、この酵素は興味ある分析物、たとえばハブテンまたは抗原に結合させ或いは抗体に結合させることにより診断分析におけるラベルとして使用することもでき、この種の分析は米国特許第３．６５４．０９０号、第３．８１７．８３７号およが１．８５０．７５２号公報に記載されている。結合方法および分析物の濃度決定はこれら特許公報に極めて詳細に記載されており、その開示の適当な部分を参考のためここに引用する。

ニトリラーゼをコードするＤＮＡ配列は、各種の方法で使用することができる。

ＤＮＡ配列は、野性型または突然変異ニトリラーゼを分離するためのプローブとして使用することができる。或いは、このＤＮＡ配列は、組換えにより宿主中に一体化して、この宿主に対しベンゾニトリル耐性を付与するために使用することもできる。

植物細胞の場合は、構築物の一部としての構造遺伝子を組換えにより植物ゲノム中へ一体化させるべくミクロピペット注入により植物細胞核に導入することができる。或いは、構造遺伝用いることもできる。植物宿主により識別されない制御信号を持った出所から構造遺伝子が得られた場合は、適当な制御信号を発現用に導入する必要がある。ウィルスもしくはプラスミド、たとえば腫瘍誘発性プラスミドを用いかつマツピングされていここに構造遺伝子をプロモータから適当な距離にて挿入することができる。ＤＮＡ配列が適当な制限部位を与えない場合は、たとえばＢａｔ　３１のようなエキソヌクレアーゼにより種々の時点で切断し、かつ合成制限エンドヌクレアーゼ部位（リンカ−）を挿入することができる。

腫瘍誘発性プラスミド、たとえばＴｉもしくはＲｉを使用し、ここでニトリラーゼ遺伝子を植物細胞の染色体に一体化させることに特に興味が持たれる。Ｔｉ− プラスミドおよびＲｉ−プラスミドの使用に関する説明はＰＣＴ特許出願Ｗ　Ｏ８４１０２９１３号、０２９１９号および０２９２０号、並びにＥＰＯ出願第０１１６７１８号、並びにマツテおよびチルトン、ジャーナル・モレキュラーアプライド・ジェネチックス（１９８１）、第１巻、第３９〜４９頁に見ることができる。

植物宿主により識別される開始および停止のための転写および翻訳制御信号の下でニトリラーゼ構造遺伝子を含む発現カセットに境界が隣接（ｆｌａｎｋ）する場合、Ｔ−ＤＮＡ右側境界または両境界を用いることにより、発現カセットを植物ゲノム中に組込んで種々の分化段階にてニトリラーゼ酵素を植物細胞中に発現させることができる。

Ｔｉ−プラスミドからの使用しうるプロモータ領域はオピンプロモータ、たとえばオクトビンシンターゼプロモータ、ツメリンシンターゼプロモータ、アグロピンシンターゼプロモータ、マンノビン（ｍａｎｎｏｐｉｎｅ）シンターゼプロモータなどを包含する。

ニトリラーゼ酵素を発現する機能遺伝子を導入して作用植物細胞を改変することにより、広範な扛類の作物につきブロモキシニル、イオキシニルまたは同類の除草剤を、雑草を実質的に完全または完全に除去すると共に作物には比較的影響を与えないよう確保する濃度で使用することができる。このようにして、肥料および水を一層効率的に利用しうる相当な経済性を達成することができ、さらに雑草の存在により生ずる悪影響を回避することができる。

ニトリラーゼ酵素を発現する発現カセットはトウモロコシ、小麦、大豆、タバコ、綿、トマト、馬鈴薯、油菜（Ｂｒａｓｓｔｃａ）、稲、落花生、ペチュニア、ヒマワリ、甜菜、芝生などを包含する単子葉および双子葉の両者を含む広範な種類の植物に導入することができる。遺伝子はカルス、組織、根、塊根、零余子、苗木、種子、葉、実生、花粉などを包含する細胞もしくは植物部分に存在することができる。

ベンゾニトリル耐性植物を与えることにより、広範な種類の組成物を用いて雑草から作物を保護し、作物成長を向上させると共に栄ｍｌ減少させることができる。たとえばブロモキシニルだけを用いて雑草を発芽後抑制すると共°に、たとえばヒマワリ、大豆、トウモロコシ、綿などの作物を安全にすることができ、或いは他の物質と組合せた組成物として使用すること０．１〜４ポンド／ニーカー、好ましくは０，２〜２ポンド／ニーカーのブロモキシニルを放出させ、ここには他の除草剤を約０．１〜４ボンド／ニーカーの活性成分を放出する二にて存在させる。組成物はたとえば洗剤、アジュバント、展延剤、付着剤、安定剤などの他の添加剤を含む。組成物は湿潤もしくは乾燥した組成物のいずれであってもよく流動性粉末、乳化性濃厚物および液体濃厚物を包含し、これらは当業界で周知されている。

除草剤溶液は、たとえば噴霧、濯厩、散布などにより便利な方法で施すことができる。

以下、限定はしないが例示として実施例を示す。

クローン化および分子分析における標準法は、マニアチス等（］、９８２）、モレキュラ・クローニング：ラボラトリ−・マニュアル、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−、ニューヨークにしたがって行なった。クローン分析は、イシューホロビッツ等、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（、］、９８１）、第９巻、第２９８９〜２９９８頁に記載されたように行なった。

全てのクローン化実験は大腸菌菌株肋２９４を用いた［ハナハン、モレキュラーバイオロジー（１９８３）、第１６６巻、第５５７ル８０使用する場合、抗生物質のレベルには次の通りとした二〇ｍ（クロラムフェニコール）２５μｇ／ｍｌ；Ｔｅ（テトラサイクリン）１０μｇ／ｍｌ　；　Ａ　ｐ　（ペニシリン）　３００　μｇ／ｍｌ。

ブロモキシニルで汚染された土壌試料からの細菌分離物を分離しかつスクリーニングした。この生物の１種は、クレブシェラ・ニューモニア亜種オゼナエと同定された。上記生物からのブロモキシニル特異性ニトリラーゼの部分精製および特性化により、３４ｋＤａｌの見掛は分子量を有する活性酵素を生成１−た。

固体り一寒天にてに．オゼナエの副培養を反復してブロモキシニルを唯一の窒素源としてもはや使用しえない変種を分離し、その際この変種生物を１Ω当りＫＨ　２　Ｐ　Ｏ　４（１　−　５　ｇ　）とに２ＨＰ今　（３．５ｇ）とＭｇＳＯ４７Ｈ２０（０．１ｇ）と酵母抽出物（５０ｍｇ）とクエン酸塩、グリセリンおよびコハク酸塩のそれぞれ０．１％と微量要素とを含有する所定の液体培地でバーネットおよびイングラハムによりジャーナル・アプライド・バクテリオロジ− （１９７５）、第１８巻、第１３１〜１４３頁に記載されたように増殖させた。

この培地は従来、ＹＥＴＥマルチカーボン培地として知られている。このＹＥＴＥマルチカーボン培地は０．０５％のブロモキシニルを含有した。この生物はブロモキシニルを唯一の窒素源として利用しなかったが、０．０５％のブロモキシニルを含有するし一ブロスにて充分な密度まで増殖し，た。Ｋ．オゼナエ変種コロニーを選択し、１０ｍ１のＬ−ブロスで増殖させた。さらに、３種の独立したに，オゼナエコロニーをブロモキシニルを含有するＬＢプレートから選択して同じ条件下で増殖させた。これらの同じ４種のに．オゼナエコロニーを、０．０５％のブロモキシニルが補充された１０ｍ１のし一ブロスで同時に増殖させた。培養物を最高密度まで３０℃にて増殖させ、各培養物からイシューホロビッツ等の方法［ヌクレイツク・アシド・リサーチ（１９８１）、第９巻、第２９８９頁］によってミニプレツブ・プラスミドＤＮＡを作成した。未消化のプラスミドＤＮＡを０，５％アガロースゲルにて電気泳動にかけ、臭化エチジウム染色によりプラスミドバンドを可視化させた。

Ｋ．オゼナエ変種生物は、ブロモキシニルの存在下もしくは不存在下のいずれても増殖する単一のプラスミド種類（寸法８８ｋｂ）を示した。３種のに，オゼナエコロニーは、０．０５％ブロモキシニルの存在下で増殖させた場合、より大きいプラスミド種類（９０ｋｂ）を示した。ブロモキシニルの不存在下で両種類のプラスミドは３種のに、オゼナエコロニーのうち２種に存在する。このデータはより大きいプラスミド種類からより小さい形態への変換を示すと同時に、ブロモキシニルを選択しなければ約２２ｋｂのプラスミドＤＮＡを喪失することを示している。

４ｔ’ｆｆのコロニー全てを、０．０５％ブロモキシニルを含有する２００　ｍｌのし一ブロスで増殖させた。細胞をフレンチプレスで破壊し、高速度で上澄液を０．０５Ｍ　Ｋ　Ｐ　Ｏ：　２．５ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含有する緩衝液（ｐＨ７，５）に対し透析し、さらに個々の粗抽出物をブロモキシニル特異性ニトリラーゼ活性につき分析した。１つのに、オゼナエ変種から作成された粗抽出物は検出しうるニトリラーゼ活性を持たなかったのに対し、他のに、オゼナエの粗抽出物はそれぞれ０．１２４　、０．１０５および０．１４３μモルＮ　Ｈｉ　／　ｍ　ｉｎ　／　ｆｆ１ｇ蛋白のニトリラーゼ比活性を示した。

細胞（２００ｍｌ）を、０．１％のグルコースと０．０４％のブロモキシニルとを含有するＭ９培地［ミラー（１９７２）、エキスベリメンッ・イン・モレキニラ・ジエネチックス、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−］にて中間対数増殖期まで３０℃にて増殖させた。細胞破壊、超遠心分離および０．０５ＨのＫＰＯ４および２．５ｄのＤＴＴを含有する緩衝液（ｐＨ７，５）における上澄液の透析によって、粗抽出物を作成した。全ての分析において基質濃度は３ＩＩＩＭのブロモキシニルとした。ハーバ−、バイオケミストリー・ジャーナル（１９７７）、第１６７巻、第６８５〜６９２頁にしたがってＮＨ３の放出を監視した。ブロモキシニルを含有スルし一ブロスにてに、オゼナエ変種が増殖する能力は、化合物に対する生物の後天的な非透過性をもたらし得る。しかしながら、この生物はブロモキシニルを唯一の窒素源として用いると所定の培地で増殖できない。

要するに、Ｋ、オゼナエのニトリラーゼはプラスミドにコードされると思われる。該酵素をコードする遺伝子は、ブロモキシ史；ル選択のない場合、Ｋ、オゼナエブラスミドから自然に喪失する２２ｋｂのプラスミドＤＮＡ断片に存在すると思われる。

０．０５％ブロモキシニルの選択下に増殖させたに、オゼナエからのプラスミドＤＮＡを作成し、かつこのＤＮＡを大腸菌株ＭＨ２９４（ｔｈｆ　、　ｇｙｒ　Ａ９Ｂ、　ｅｎｄｌ−、ｈｓｄ　Ｒ１７）に形質転換された。これら形質転換体を窒素欠乏した（Ｎ−）の固体アガロース最小培地（１ｆ！当りＫＨ２ＰＯ４（１，５ｇ）とに２　ＨＰ　Ｏ４（３−５ｇ　）とＭｇ５Ｏ・７　Ｈ２０（０、１ｇ　）と０．１％グルコースとを含有する）にて０．０５９６のブロモキシニルを唯一の窒素源として添加することにより選択した。５日間培養した後、１０個のコロニーが選択プレート上に出現した。これらのコロニーを０．０５％のブロモキシニルを含有するＬ−寒天プレート上に再塗沫し、ＭＭ２９４におけるチアミン栄養要求性マーカーの存在につき試験した。これらコロニーはいずれもチアミンの不存在下では最小培地にて増殖せず、この菌株が大腸菌ＭＭ２９４であることを示した。全コロニーはチアミンと唯一の窒素源として０．０５％のブロモキシニルとが補充されたＭ９培地にて増殖することができた。

ブロモキシニルの不存在下では、この培地にて増殖は観察されなかった。これらコロニーのうち２種をさらに分析用に選択した。９０ｋｂブラ夢ミドを含有する大腸菌）１Ｍ２９４の粗抽出材調製物をブロモキシニル特異性ニトリラーゼ活性につき分析した場合、０．２１Ｂμモル放出ＮＨ３／ｍｉｎ　／＋ｎｇの比活性が得られた。より小さい種類のプラスミドを含有する大腸ｍＭＭ２９４は、検出しうるニトリラーゼ活性を示さなかった。大腸菌における大きい９０ニル特異性ニトリラ一ゼ反応の結果として適当な代謝物を産生ずることを確認するため、ＭＭ２９４ＣｐＢｒ　ａ　１　）の２ｍｌ培養物を０．０５％ブロモキシニルが補充されたＭ９培地にて３０”Ｃで２４時間増殖させた。培養物の濾液試料をＣｌ８ＨＰＬＣカラムでクロマトグラフにかけた。培養濾液における投入された全ブロモキシニルは、新たな代謝物ピークまで変換された。代謝物ピークの確認をスペクトル分析により行なって、３’、５’−ジブロモ−４−ヒドロキシ安息香酸（Ｄ　Ｂ　ＨＢ）であると決定された。したがって大腸菌におけるブロモキシニル特異性プラスミドでコードされるニトリラーゼ発現の産生物は、Ｋ、オゼナエにつき観察されたものと同じである。

ブロモキシニル特異性ニトリラーゼ遺伝子を大腸菌中でクローン化させる。

ブロモキシニル特異性酵素をコードするＤＮＡ断片が大腸菌にクローン化させうるかどうかを決定するため、プラスミドターｐＡｃＹｃ１８４　［チャンダおよびコーエン、ジャーナル・バクテリオロジ−（１９７ｇ）、第１３４巻、第１１４１頁］のＢａｍ　Ｈ１部位に結合させ、かつ大腸菌株ＭＭ２９４に形質転換させた。ｐＡｃＹｃ１ｇ４のサイクリン感受性の１０種のＭＭ２９４コロニーを選択し、ミニブレツブ・クローン分析ＤＮＡを作成し、かつこのＤＮＡを後に残留するＤＮＡ断片に一致する。１０種のクローンを全て２０！μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールの存在下（プラスミドにつき選択するため）で２００　ｍｌのし一ブロス中にて増殖させ、粗抽出：Ａ製物を得、ブロモキシニル特異性ニトリラーゼ活性につき分析した。３７ｋｂＢａｍ　ＨＩ断片を含有する４種のクローンは０．１４０　ｕモル放出Ｎ　Ｈ３／ｌ０ｉｎ　／＋ｎｇ蛋白の範囲のニトリラーゼ比活性を示したのに対し、他の６種のクローンにはニトリラーゼ活性が検出されなかった。このデータは、ブロモキシニル特よびブロモキシニル選択のない場合に自然に喪失される２２ｋｂのつ０．０７％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。プラスミドえｐＢｒ〆３から自然に除去される２２ｋｂＤ　Ｎ　Ａ断片に対し内部であることも確認された。これらＥｃｏ　ＲＩ断片の寸法はそれぞれ１８ｋｂ、　３ｋｂおよび１．９ｋｂである。ブロモキシニル特異性ニトリラーゼをコードする遺伝子は、このニトリラーゼ構造遺伝子が大腸菌のブロモキシニル特異性ニトリラーゼの位置につき検ブロモキシニル特異性ニトリラーゼは大腸菌におけるペリプラズム酵素であるトルエン処理細胞（Ｌ−ブロス）　　　　　　　０．８２９リゾチーム処理細胞（Ｌ−ブロス）　　　　　　０．７９６全細胞（Ｌ−グロス）　　　　　　　　　　　　０．７７０全細胞（Ｌ−ブロス＋ＢｒＸ　１　）　　　　　　　　１．２５全細胞（Ｍ　９　）　　　　　　　　　　　　　　　０．９５０全細胞ＣＭ　９　＋ＢｒＸ　１　）　　　　　　　　　　　１．４５全細胞／ｐＡｃＹ０１８４　（Ｍ９）　　　　　　　　　　０培地にて５ｍｌの培養物として３７℃で定常期まで増殖させた。

培養物は２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを示した場合物から１ｍｌを採取し、ニトリラーゼ緩衝液（０，１ＭＫＰＯ４、ｐＨ７，５）で１回洗浄し、かつ菌体をこの同じ緩衝液０．１ｍｌにリー・ジャーナル（１９７７）、第１６７巻、第６８５〜６９２頁にしたがい基質としての３１！１Ｍブロモキシニルを用いて或いは用いずにニトリラーゼ活性につき分析した。

体／ｍ１＝１５０μｇであるとして決定された。

これらのデータは、ニトリラーゼ酵素の細胞位置がペリプラズム空間であることを示す。第２の観察は酵素が培地中のブロモキシニルの不存在下に発現されることであり、これは酵素発現にブロモキシニル誘発が必要とされないことを示唆する。

第２表ブロモキシニル特異性ニトリラーゼの大腸菌からの精製（出発物質６ｇ細胞）粗抽出物ａ１００ｍｌ　　２１０ｍｇ　　　　１８．１５　　　　Ｃ１，０８６３５−５０％ＮＨ４５０４６ｍ１　　８３ＩＤｇ　　　　２Ｂ、７７　　　０．２５０ＥＡＥセファデックス　　５６ｍ１　　１９ｍｇ　　　　１５．５２　　　　Ｑ、８２０ａ：菌体は、０．０４％のブロモキシニルとグルコースとを含有するＭ９培地にて３０°Ｃで中間対数増殖期まで増殖させた。粗抽出物は細胞破壊、超遠心分離および０．０５Ｍ　　ＫＰＯ４（ｐｔ１７．５）および２．５１１Ｍ　ＤＴＴを含有する緩衝液に対する透析により作成した。基質濃度は、全てのニトリラーゼ分析において３＋ｎＭとした。

ｂ二μモルＮ　Ｈ３／　ｍｉｎ　／　ｍｇ。

試料入れ、カラムを上記カラム緩衝液における０、０２Ｍ〜０．４０ＭＮａＣＪ７の３００　ｍｌ直線濃度勾配で展開した。ＩＭのＮａＣｌ２を含有する緩衝液を濃度勾配の最後に施した。５ｍｌの各フラクションを集め、１つおきのフラクションの０．０７５　ｍｌアリコートについてニトリラーゼ活性を分析した。単一ピークの酵素活性が０．２２Ｍの塩にて溶出した。投入ニトリラーゼ活性の約７５％が活性フラクションに回収された。

ＤＥＡＥカラムからのニトリラーゼピークを含むフラクションを０．０２ＭのＫ　Ｐ　Ｏ４（ＰＨ７，５）に対し透析すると共に、各フラクションの５０Ｍｇ　（６μｇの蛋白）を１１．２５％の変性用レムリゲルに施した。ＤＥＡＥカラムからの活性ピークに相当する濃縮蛋白バンドは、分子ｆｆ１３４．０００のポリペプチドである。活性カラムフラクションにより、他のポリペプチドは濃縮されなかった。これらのデータは、ブロモキシニル特異性ニトリラーゼが約３４，０００の分子量を有するポリペプチドおよびおそらく単一遺伝子の生産物であることを裏付ける。

前記と同様に大腸菌中に形質転換させた。プラスミドを常法で分離し、かつＢｇｌ　ＩＩで切断して約８．７ｋｂの断片を得、これはｐＡＣＹＣ１８４ベクターに挿入されたままであった。次いで、分離さｐＡｃＹｃ１７７（３，７ｋｂ）　　［チャンおよびコーエン、ジャーナル、バクテリオロジ−（１９７ｇ）、第１３４巻、第１１４１〜１１５６頁］に挿入した。

切断されたｐＬＩｃ１８　　［ヤニシューペロン等、データ（１９８５）、第３３巻、第１０３〜１１９頁］に挿入した。得られたプラスミドを大腸菌中にクローン化させ、かつニトリラーゼ活性につきスクリー父ニングした。ＩＦｆｉのクローンは５ＪｋｂのプラスミドｐＢｒ’１９をを得た。このＰｓｔ　ｌ−Ｈ１ｎｃＩＩ断片をサンガー等の方法［プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンス・ＵＳＡ（１９７７）、第７４巻、第５４６３〜５４６８頁］にしたがって配列決定した。

得られた配列（コードされた適するアミノ酸をも含む）を下記配列に示す。

ＣＴＣＣＡＣＣ人ＴＡＧＴＡＧにＧＣＣＴｒ（：ＡＡＣ；ＡＧＧＡτＡＣにＣＴ ’ＣｍＣＣＣにＡｌｌ；ＣＣＡＴＣ人ＡＡＡＴ人ＡＣＣＧＧ`ＴＴｒｒＣ τｈｒ　にｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒａ　　Ｐｈｅ　　Ｘ１ｅ　　Ｈｅ　　Ｌｙｓ　　Ｔｒｙ　Ａｒｇ　　Ｌｙｓ　　Ｇｉｎ　　Ａ１．ａ@　ｒｙｅ　　ＡＬａ　　人ＩＩＩ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒ。

Ｃ１ｕ　　ｒｌｃ　（：１ｕ　Ｌｙｓ　　１１ｅ　　Ａｒｇ　　Ｃｙｓ　　八１！　人Ｌａ、Ｇ１ｒ＋　　Ｃ１ｕ　Ｈｉｓ　　Ａｇｎ　　ｌ奄■@八ｉｓ　　Ｌｇｕ　　Ｓｅｒ　　Ｐｈｅ　　Ｇｌｙ　τｙｒＳｃｒ　Ｃ１ｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　　Ｃｒｙ　　Ａｒｇ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　　Ｓｅｒ　　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　　Ｌｔｕ　@Ｉｌｅ　　人ｓｐ　　＾１ｍ　　Ａｓｐ　　Ｇｌｙ　　ｌ１ｅＴｈｒ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　ＡｒＨＡｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒａ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｃｂ１人ｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌ■普@Ｐｈｅ　Ｃ１ｙ　Ｃ１ｕＧｌｙ　Ａｓｐ　　Ｃ１ｙ　　５ｅｒ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　　Ｇｉｎ　　Ｖｉｌ　　人ｌａ　Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　　Ｖｍｌ　　■kｙ　Ａｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｃ１ｙ　　Ａｌ鳳　Ｌｅｕ　人５ｎＳｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＧＬｕ　Ｃ１ｕ　Ｇ１．ｙ　Ｉｌｅ　ＶａＬＴｙｒ　ＡＬａ　ＣＬｕ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ@Ｌｅｕ　にｌｕ＾ｌａ、　ＡｌａＬｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　　人ｇｐ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　ＣＬｙ　ＥＬＩ　　Ｔｙｒ　　Ｓｃｒ　　Ａｒｇ　　Ｐｒｏ　@Ａｓｐ　　Ｖａｌ　　Ｐｈｅ　　Ｓｅｒ　　ＶａＩ　Ｓｅｒ　　１１ｅＡＡＣＣＧ（、ＣＡＡ　　ＣにＣＣＡＣＣＣＴ　　ＱＣに　　Ｃ丁ＣＴＣＡ　　（：ＡＡ　Ｃ丁τ　＾工ＣＧＡＣＴＣＡ、ＡＡＣにＧｊ　Ｇ`ＣＣＡＣにＡＣＣＣＧＡｓｎ　Ａｒｇ　　Ｇｉｎ　　Ａｒｇ　　Ｃ１ｎ　　Ｐｒｏ　　Ａｌａ　ＶａＬ　　Ｓｅｒ　　にｌｕ、Ｖａｌ　　Ｉｌｅ　　Ａｓｐ　　Ｓ■秩@Ａｓｎ　　Ｃ１ｙ　Ａｓｐ　　Ｃ１ｕ　Ａｓｐ　　ｌ’ｒ。

Ａｒｇ　Ａｌａ＾ｌａ　Ｃｙｓ　ＧＬｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｃ１ｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｃｉｕ　ＶａＬ　Ｖａｔ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒτ■秩Oｌａ　Ｉｌｅ　Ｃ１ｙＶａ、Ｌ　　Ｌｅｕ　　Ｐｒｏ　　ＡｒＨＴｙｒ　　Ｃｙｓ　　Ｃ１ｙ　ＨＬｓ　　５ｅｒ５′−および３′−非コード側方領域を実質的に持たないにより植物発現カセット中へ導入することができる。

ＲＩリンカ−を介し遺伝子の３′末端に融合した５′−非コード領域の約１５Ｂ６ｂｐと３′−非コードＤＮＡの約１３４９ｂｐとを有する。

ｐＴｉ対応物は、バーカー等、プラント・モレキュラ・バイオロジー（１９８３）　、第２巻、第３３５頁に規定されたように、３領域につき１１，２０７〜１２，８２３でありかつ５′領域につき１３，６４３〜ブクロ一ン化断片をプラスミドｐｃＧＮ’４０７としてｐＢＩ？３２２にクロージョンをクローン化させかつ配列決定した。１つの場合、全コード領域と５′非翻訳配列の１Ｏｂｐとが除去されて、５′非転写領域、ｍＲＮ＾キャップ部位及び５′非翻訳領域（ＢａｌｌｌＨＩ部位まで）の１８ｂｐとを完全のまま残した。７％アクリルアミドゲルでの寸法分別により、この小さい断片を得ると共に、長さ約１３０ｂｐのこれら断片を溶出させた。この寸法分別されたＤＮＡをＭＩＳｏ＋ｐ９に結合させ、かつ数種のクローンを配列決定し、この配列をオクトピンシンターゼ遺伝子の公知配列と比較した。ｈｉｔａ構築物をｐＩ４と命名し、このプラスミドをＢａωＨＩおよびＥｃ。

ＲＩで切断して小断片を得、これをｐＴｊＡ６　［ガルフィンケルおよびネスター、ジャーナル・バクテリオロジ−（１９８０）　、第Ｘｈｏ　１部位にクローン化させ、これをｐＣＧＮ４２６と命名した。このプラスミドは、ＤＮＡポリメダーゼＩにより充填された単一のＥｃｏ　Ｒ１部位を有しかつＸｈｏ　Ｉリンカ −をｐＵＣ８の唯一の旧ｎｃ■部位に挿入した際に旧ｎｃＩＩ制限エンドヌクレアーゼのヌクレアーゼ汚染によりＰｓｔ　Ｉおよび旧ｎｄｍ部位を喪失している点において、ｐＵｃ　８とは相違する。得られたプラスミドｐＣＧＮ　４５１は、蛋白コード配列を５′−非コード領域（これはＴ−ＤＮＡの右側境界を含む５ ′非転写配列の１．５５０ｂｐとｍＲＮＡキャップ部位と５−非翻訳配列の１６ｂｐとを含有する）と３′領域（これはコード領域の２６７ｂｐと停止コドンと３′非翻訳ＤＮＡの１９１３ｂｐとポリＡ部位と３′非転写配列の１．１５３ｂｐとを有する）との間に挿入するをプラスミドｐｃＧＮ５１７に挿入し、これはテトラサイクリン耐性遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子とを有する。ｐｃＧＮ５１７は、唯一のＰｓｔ　　Ｉ部位中へＫａｎ　７遺伝子をｐυＣ４Ｋ［ビエイラ、ジーン（１９８２）　、第１９巻、第２５９頁］から導入することによりｐＨ０７９［ホーン、ジーン（１９８０）　、第１１巻、第２９１頁］から作成した。ｐｃＧＮ５１７をＳａｔ　　Ｉで切断し、かつＸｈｏ　Ｉ断片を唯一の鈷旦１部位に挿入した。

ｐＣＧＮ５２９は、Ｔｎ５　［０ススタイン等（１９８１）　、ムーバブル・ジーバー・ラボラドリース、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨークコからのＫａｎ　７遺伝子の挿入によりｐＡｃＹｃ１８４から作成し、ｐＲｉＡ４　　Ｔ−ＬＤＮＡ　Ｅホワイトおよびネスター、ジャーナル・バクテリオロジー（１９８０）　、第１４４巻、第７１０頁］からの２．４ｋｂのＢａｔ　ＩＩ断片をＴｎ５のＫａｎ　”遺伝子で　ｐＡｃＹｃ１８４のＨｉｎｄした。

５１７およびｐＣＧＮ５２９のそれぞれに挿入して、２種のプラスミドｐＮ１およびｐＨ２を生成させ、これらを用いてそれぞれＡ、ツメファシェンスもしくはＡ、リゾゲネスに導入することによりＴｉ−もしくはＲｉ−プラスミドのＴ−ＤＮＡに組込んだ。各プラスミド中への組込みはコマイ等、プラスミド（１９８３）第１０巻、第２１〜３０頁に記載されたように３一方向接合で達成することができる。プラスミドｐＲＫ２０７３　、ｐＮｌもしくはｐＮＷ有する大腸菌宿− ナル・バクテリオロジー（１９８０）　、第１４４巻、第７３２頁］もしくはＡ、リゾゲネスＡ４Ｔ　［ホワイト、上記（１９８０）　、第１４４巻、第７１０頁］の１晩培養物を１晩培養し、かつ適当な培養物を混合すると共に、１５０μ ｇ　／　ｍｌのカナマイシンを含有するＡＢプレート上に展延した。単一のコロニーを２回にわたり再塗沫した。正確な組込みは、全アグロバクテリウムＤＮＡのサザン分析によって証明される。エンドヌクレアーゼ切断された４桁γ　んＤＮＡは、ニラ　　　　　たｐＢｒ〆８で検査される。

２．８ｋｂ断片上にニトリラーゼ遺伝子を有するプラスミドｐＢｒ達成した。得られたプラスミドはアンピシリン耐性を示し、これを前記と同様に大腸菌中に形質転換させ、かつ形質転換体をアンピシリン選択培地で選択して５．２ｋｂのプラスミドｐＢｒ×１６た。

Ｂａｍ　ＨＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片をＢａｍ　ＨＩ−Ｓｍａ　Ｉ切断されたｐｃＧＮ４Ｂに挿入して、ニトリラーゼ遺伝子断片を有する８、６ｋｂのプラスｐｃＧＮ４８　［コマイ等、ネイチャー（１９８５）　、第３１７巻、第７４１〜７４４頁］はマンノビンシンターゼ（ＭＡＳ）発現カセットであって、ＭＡＳプロモータとｏｃｓ３’領域とを有する。ｐｃＧＮ４Ｂの構築は次のように行った。マンノビンシンターゼプロモータ領域（ＰＭＡｓ）を含むＴ−ＲＤＡＡ　　［ベーカー等、プラント・モレキュラ・バイオロジー（１９８３）　、第２巻、第３２５頁］の１部をび２０１２８　）で切断してＰＭＡＳ領域を除去し、この領域をｓｐｈ　１およびＡｃｃ　Ｉで予め切断されているｐＵｃＬ９　　［ファルマシア社］に挿入して、ｐｃＧＮ４０を生成させた。ＰＭＡ８領域は９リ工Ｉ認識部位を有し、その内部は切断に抗するようメチル化される。

ンカーに位置する”ＰＭＡＳ領域を有する断片を生成させた。

よびＥｃｏ　Ｒ１で切断し、かつオクトビンシンターゼ５′領域がＰＭＡＳ領域をオクトピンシンターゼ５′領域の代りにｐｃＧＮ４５１中に置換させ、ここで転写の開始および停止領域をポリリンカーにより分離してｐｃＯＮ４Ｂを得た。

１．２ｋｂのニトリラーゼ遺伝子断片を含有するプラスミドｐＢｒ芙茶２２を、前記したように大腸菌中に形質転換させた。グラスミ２５塩基対の細菌５′未翻訳配列を有するブロモキシ矛ル遺伝子ｐｃＧＮ１６７を作成するため、ＣａＭＶ　（ｂｐ７１４４〜７７３５）　　［ガードナー等、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ（１９８１）　、第９巻、第２８７１ル２８８８これをＭ　１３ｍｐ　７　［ビエイラ、ジーン（１９８２）　、第１９巻、第２５９６１４のＥｃｏ　Ｒ　Ｉ切断物は３５Ｓプロモータを含有するＣ６１４からのＥｃｏ　Ｒ　Ｉ断片を生成し、これをｐｕｃ　８　［ビエイラ等、ジーン（１９８２）　、第１９巻、第２５９頁］のＥｃｏ　Ｒ　Ｉ部位にクローン化させてｐｃＧＮ１４６を得た。

プロモータ領域を切断するため、Ｂｇｌ　ＩＩ部位（ｂｐ７６７０）をＢｇｌ　ＩＩおよびＢａｌ　３１で処理し、次いでＢｇｌ　ＩＩクリンカをＢａｔ　３１ −処理されたＤＮＡに付着させてｐｃＧＮ１４７を得た。

プロモータ領域と選択しつるマーカー（２ＡＴＧ’ｓを有する位がｐＣＧＮ５２８のカナマイシン遺伝子の近位となるようにｐＣＧＮ５２８のＢｇｌ　１１部位にクローン化させた。

この構築に使用したシャトルベクター、すなわちｐＣＧＮ５２８は次のように作成した。カナマイシン遺伝子を有するＴｎ５を持ったプラスミド［ヨルゲンソン等、モレキュラ・ジーン（１９７９）、およびコーエン、ジャーナル・バクテリオロジ−（１９７８）　、第１３４巻、第１１４１〜１１５６頁］のテトラサイクリン遺伝子のおけるＨｉｎｄＩ［Ｉ−　Ｂａｍ　Ｈ　１部位に挿入することにより、ｐＣＧＮ５２５を作成した。ｐＴｉＡ６［）マショー等、セル（１９８０）　、第１９巻、第７２９５２８を得た。

を作成した。

ｐＭＢ　９Ｋａｎ　ＸＸ　Ｎは、Ｘｈｏ　Ｉ部位を喪失しているがＴｎ９０３からの機能的カナマイシン遺伝子を有してアグロバクテリウムにおける効率的選択を可能にするｐｕｃ４に変種［ビエイラおよびメッシング、ジーン（１９８２）　、第１９巻、第２５９ル２６８る。

換した。これによりｐｃＧＮ１６７　、すなわち全長ＣａＭＶプロモータ、１　ＡＴＧ−カナマイシン遺伝子、３′末端及び細菌Ｔｎ９０３型カナマイシン造伝子とを含有する構築物を生成する。ＭｌはｐｃＧＮ５５０化部位にクロ化部化させた。

７０９（１人ＴＧーカナマイシンー３′領域）の構築ｐｃＧＮ５６６は、ｐｕｃｉａ−印［Ｋ，バラフレー博士論文、ＵＣ−サンする。ＯＲＦ　１および２［バーカー等（１９８３）、上記］を含有するｐＮＷ３１ｃｍ　８、２９−１［ドアショー等（１９８０）、セル、第１９巻、第７２９頁コの肛皿■−超ＩＩＩ断片をｐｃＧＮ５［ｉ６の肛皿■ー肪ｍＨＩ部位，％ークローン化させてｐｃＧＮ７０３を得た。

ｐＴｉＡ６　［ｐＴ１１５９５５　（バーカー等、１９８３、上記）の塩基２３９６〜２９２０に相当コからの転写物７の３′領域を有するｐｃＧＮ７０３のＣａＭＶ−３５５プロモータとＩ　ＡＴＣ−カナマイシン遺伝子とｐＴｉＡ６位にクローン化させて、ｐＣＧＮ９７Ｂを生成させた。

とｐｃＧＮ７０９　　（転写物７：３′上記構築参照）の０．５ｋｂ　Ｅｃｏ　Ｒｌ−３ａｌｌ断片とをｐｃＧＮ５６Ｂの旧ｎｄＩ［Ｉ−Ｓａｔ　　Ｉ部位に挿入することにより転写物７からの３５Ｓプロモータおよび３′領域を発生させてｐｃＧＮ７６８ｃを生成させた。

ｐｃＧＮ７８３の最終的構築ｐｃＧＮ７６８ｅ（ＣａＭＶ−３５３プロモータ）の０．７ｋｂ　ＨｉｎｄＤＩ −Ｅｃ、ｏ　Ｒ１断片をｐＣＧＮ７２６ｃ　（１−ＡＴＧ−ＫＡＮ−３’領域）の１．５ｋｂＥＣｏ　ＲＩ　−３ａｌ　　Ｉ断片に結合させて、ｐＬｌｃ１１９　［Ｊ　、　　ビエイラ、ルットガース大学、ニューシャーシー州コのＨｆｎｃｌＩｆｆ−Ｓａｌ　　Ｉ部位中に組込んでｐＣＧＮ７７８を生成させた。

ｐｃＧＮ７７ｇの２．２ｋｂ領域、すなわちＣａＭＶ３５　Ｓプロモータ（１− ｐＢｒにｌ’ｌヲＢａｍ　ＨＩで切断しがっ肛匹■で部分切断して、Ｈ断片をＢａｍ　ＨＩ−Ｓｍａ　ｌ切断されたｐｃＧＮ５６６中に挿入して、ニトリラーゼ遺伝子断片を有する３、７ｋｂプラスミドｐＢｒＪ２５を生成させた。

ｐＣＧＮ５６６ハ次ノヨウニ構築シタ。ｐＵ０１３（ＣＩＩＩＲ）［ケン・ハックレー、ｌＩｖ士論文Ｕ、Ｃ，サンジエゴ］をＥｅｏ　ＲＩおよびＨｉｎｄｍで切断し、かつｐＵｃ１８およびｐＵｃＩ９がらのポリリンカーをそれぞれ線状化されたｐＵｃ１３に挿入してｐｃｃＮ５ｅｅを生成させた。これはクロラムフェニコール耐性マーカーを有する。

１．２ｋｂニトリラ一ゼ遺伝子断片を有するプラスミドｐＢｒ　Ｎ２５を、上記したように大腸菌中に形質転換させた。プラスミドを常法で分離し、かっＢａｎ＋　ＨＩおよびＥｃｏ　ＲＩで切断して再び１．２ｋｂニトリラ一ゼ遺伝子断片を得た。Ｂａｍ　ＨＩおよびＥｃ。

Ｒ１断片をＢａｍ　ＨＩおよびＥｃｏ　Ｒｌ切断されたｐｃＧＮ４Ｂに挿入して、ニトリラーゼ遺伝子断片を有する６、６ｋｂのプラスミドｐＢｒ翻訳配列の細菌５′の１１塩基対を有するプロモキヒイ遺伝子と、　ψ ツメファンエン菌株Ｋ１２　［ネスター、アニュアル・レビュー・マイクロバイオロジー（１９８１）　、第３５巻、第５３１頁；ぐジ４等、ネイチャー（１９８３）　、第３０３巻、第１７９頁コに形質転換させた。

ｐｉ　　　　　　　　　、　　ヱＫ１２　（ＪＢｒ　）Ａ２８）およびＫ１２　（ＪＢｒ　Ｘ２９）を用いて、カランコニ（Ｋａｌａｕｃｈｏｅ）　Ｃガルフィンケル、ジャーナル・バクテリオロジ−（１９８０）　、第１４４巻、第７３２頁］上に菌コブ組織（ｇａｌｌ）を形成させた。

約１ｇ（新鮮重量）の菌コブ刊織を液体窒素中でＯ，１Ｍトリス（ｐＨ７，５）と１０ｍＭ＃ＥＤＴＡ、　０．１５Ｍ　　Ｎ　ａ　Ｃｌ）　、０．０５％　ＮＰ −４０゜２５ｍｇ／＋ｎｌ　ＢＳＡ、１　ｍＭ　ＤＴＴ、０．１３ｇｇ／ｍｌのロイペプチンとを含有する緩衝液にて磨砕した。試料を０．０５ｇのポリビニルピロリドン（シグマ社）の添加後にホモゲナイズし、次いで１５，０００ｇにて４℃で１５分間遠心分離した。精製ニトリラーゼをウサギ中に注射して作成した２５μｇの抗血清と２５０ｇｇの１０％（Ｖ／Ｖ）のＳ、アウレウス（カルビオケム社）の懸濁物とを各上澄液に添加して、４℃で１６時間インキュベートした。次いで試料を遠心１５０ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃρ、０．０５％ＮＰ−４０で２回洗浄した。ペレットを１００　ｕＤ　ノ０．１２５　Ｍ）’Ｊス（ｐＨ６，８）　、４％ノＳＤＳ　、　２０％グリセリン、１０％Ｂ艦に再懸濁させ、９０℃にて２分間加熱した。全試料を１０％アクリルアミドゲルで電気泳動にがけた［Ｖ、に、レムリ、ネイチャー、第２２７巻、第６８０〜６８５頁（１９７０）　］。

溶解したポリペプチドをニトロセルロースフィルタ（シュライヒャーおよびシュエル）にバーネット［アナリチヵル・バイオケミストリー、第１１２巻、第１９５〜２０３頁（１９８１）　］により記載されたようにしてデ移した。次いで、ニトロセルロースフィルタ（シュライヒャーおよびシュエル）をプロット（ＢＬＯＴＴＯ）　［ジョンソン等、ジェネラル・アナリチカル・テクノロジー、第１巻、第３８〜４２頁（１９８３）］にて４２℃で１〜３時間時間インベニベート次いで抗−二トリラーゼ血清の１：５ｏ溶液を含有するプロット（ＢＬＯＴＴＯ）にて室温で１晩インキユベートした。フィルタを２０ｍＭのトリス（ｐＨ７，５＞、１５０ｄ　Ｎ　ａ　Ｃ（ｌでｉｏ分間、０．０５％のツィ−シー２０を含有する同じ緩衝液で２０分間、およびツイーン−２０を含有しない緩衝液でさらに１０分間洗浄した。１１０８ｃｐ／ｍｌの１１２５−標識された蛋白Ａ　Ｃ９ｕ　Ｃｉ／　ｍｇ　：　ＮＥＮ）を含有するプロットを次いでフィルタに添加し、かつ室温にて２時間インキュベートした。これらフィルタを５０ｍＭのトリス（ｐＨ７，５）、ＩＭのＮａＣΩおよび０．４％のサルコシルで１晩洗浄した。

濯ぎかつ乾燥した後、フィルタをデュポン・クロネツクス増感血清を用いてコダックＡＲＸ線フィルムに一７０℃で露出させた。

タバコ植物を無菌培養した［２５℃、白色光（１６時間）；ＭＳ（１１Ｉ１ｇ／　Ｌ　　ＩＡＡ　、　Ｏ，１５ｍｇ／　Ｌキネチン）］。主若枝移植物を通して維持された３週令の植物を組織供与体として使用した。若い葉（頂部から４番目まで）を選択し、直径２ｍｍの葉円盤を抜打ち、ペトリ皿（直径３ｃｍ）中のｌｏｇ／、ＱのＩＡＡを含有する１ｍｌのＭＳ培地に入れた。全くの暗所にて円盤を１晩保った後、アゲ中１０８〜１０”／ｍｌ）をこれら培養物に添加した。暗所にて１８〜２４時間にわたり共培養（Ｃｏ−ｃｏ　ｌ　ｒ　１ｖａｔ　ｉｎ）　Ｌ、た。ホルモンを含有せず３５０　ｒｒ１ｇ／Ｉのセホタキシン（ベーリンガーマンハイム社）を含有するＭＳ培地で３回洗浄することにより、葉切片からアグロバクテリウムを除去した。葉切片を直径９ｃｔｎのベトリ皿内のホルモンを含まない１０ｍ１の８８培地に移した。フィトアガー（ギブコ社、０．６％；セホタキシン、３５０　ｍｇ／ｌ　）のベトリ皿をパラフィルムで封止し、かつ組織供与体植物と同じ条件下で保持した。再生する若枝は次の２−・５週間で見られる。

６葉段階にて、ブロモキシニル溶液のスプレーを鉢植え植物に向けて植物に噴霧した。それぞれ４インチのポット１本の植物を含みかつ２．５ｍｌのスプレーを受けた。植物を２５℃、相対湿度７０％、６０時間の光照射期間にて生育室内で成長させた。噴霧してから９日後に０．５印より長い新たな葉を計数することにより成長を測定した。

タバコにてブロモキシニル特異性ニトリラーゼを発現させるためのタバコ小サブユニットプロモーターブロモキシニル遺伝子キメラの構築タバコＳＳＵプロモータカセットの構築タバコ小サブユニット遺伝子を有するゲノムクローンを、二部分ゲノムライブラリーから分離した。エントウ豆小サブユニットｃＤＮＡクローン［プログリ−等、プロシーディング・ナショナル・アカデミ−・サイエンスＵＳＡ（１９８１）　、第７８巻、第７３０４〜−ニングした。タバココード領域と５′−側方（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列とを有する３、４ｋｂのＥｃｏ　ＲＩ断片を、シャロン３２λフアージクローン（３〜８）からＭ１３＋ｎｐ１８　［ヤニシューペロン等、ジーン（１９８５）　、第３３巻、第１０３〜１１９頁］中にクローン化し、このサブクローンをＮ５ＵＥ２０１８と称する。小サブユニ・ノド蛋白のＴＡＴ人ボックス（プロモータ）および推定ＡＴＣ開始コドンの位置を、ＤＮＡ配列決定により決定した。一本鎖ＤＮＡ鋳型をＮ５ＵＥ２０１８から作成し、これを２５塩基の一本鎖合成オリゴマー（５’　ＴＧＴＴＡＡＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＡＧＡＣＡＧＡＡＡ３’　）にアニールさせた。この配列は、タバコ小サブユニット遺伝子の推定ＡＴＧにおける５′直後に位置する２５塩基に相補的である。その際ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片を用いてプライマを延長させてｄｓＤＮＡを作成し、次いオーバーハングから始まる。ｐＵｃ１８をＳｍａ　ＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切断し、かつ上記のように作成したｄｓＤＮＡ断片をポリリンカー中に挿入して４．１ｋｂのｐｃＧＮ６２５と称すミ井油リブラスミドを得た。

ｐＵｃ１８に挿入して４．１．ｋｂのプラスミドｐｃＧＮ８２７を得た。８．３ｋｂのＤＮＡセグメントを得、こねはＩ）ＡＣＹＣＬ７７　［チャンおよびコーエン、ジャーナル・バクテリオロン−（１９７Ｂ）　、第１３４巻、第一カー等、プラント・モレキュラ・バイオロジー（１９８４）　、第断片に隣接する。ｃｓ３’領域を与え、７．７ｋｂのプラスミド、すなわちｐｃＧＮ６３０を生成させた。

Ｂｇｌ　ＩＩで切断し、クレノーポリメラーゼで平滑末端化し、次いネータ領域との間に正しい向きに位置せしめた。得られた８、９ｋｂプラスミドをｐＢｒ− Ｘ３８と称する。

ニトリラーゼ遺伝子をカナマイシン遺伝子とは反対および同一の転写方向に有する。

これらのプラスミドをＡ、ツメファシェンス菌株ＬＢＡ４４０４に形質転換させ、次いでタバコにコチアナ・タバクムｃｖ、　　ｒキサンチ」）の子葉外殖片と一緒に培養した。カナマイシン耐性若技を、慣用技術にしたがってタバコ植物中に再発生させた。

形質転換されたタバコ植物（５〜６葉段階）からの葉組織は、慣用のウェスタン分析によりニトリラーゼ蛋白を発現することが示された。表面殺菌された葉（１０％次亜塩素酸塩；水洗）の約５ｍｍの葉セクションを、光合成独立栄養条件の下でブロモキシニル含有培地に懸濁させた。使用した培地は、０．９３ｍｇ／Ｉのナフチル酢酸と０．１１ｍｇ／ρのベンジルアミノプリンとを含有するＭＳ塩とし、ブロモキシニルの量を変化させた。ブロモキシニルの濃度は、０．１希釈率にて１０−３〜ｌＯ’Ｍの範囲で変化させた。

光合成独立栄養条件は５％Ｃｏ２．１０％０２，８５％Ｎ２とした。

形質転換されていない比較のタバコ葉セクションハ、１０−６Ｍ＋７）ブロモキシニルで漂白された（阻止された）。それに対して、ｚ　　　　　　　ＺそれぞれプラスミドｐＢｒ　ｔ３９およびｐＢｒ／４０からのブロモキシニル特異性ニトリラーゼを発現する形質転換された葉セクショ、−５ノは１０　　ＭおよびｌＯ’Ｍのブロモキシニルに対し耐性であった。

タバコにつき前記したと同様にトマト（リコベルシコン・エスクレンツムｃｖ、Ｕｃ８２８）の子葉移植片の同時培養を行ない、かつカナマイシン若枝を再生させた。形質転換されたトマト植物（７〜１０葉段階）からの葉組織は、標準ウェスタン分析によりニトリラーゼ蛋白を発現することが示された。表面殺菌された葉（１０％次亜塩素酸塩；水洗）からの約５市の葉セクションを、光合成自己栄養条件下で、変化する濃度のブロモキシニル含有培地に懸濁させた。培地は２ｍｇ／Ωの２，４−ジクロル酢酸と１＋ｎｇ／ｇのイソペンチルアデニンと１００　ｍｇ／Ωミオイノシトールと１０　　もしくは１０’Ｍのブロモキシニルとを含有するＭＳ塩とした。

タバコにつき記載したと同じ光合成自己栄養条件を用いた。形質転換されていない比較の葉セクションは１０’Ｍプロモキシニリラーゼ遺伝子を発現する形質転換植物は１０’Ｍのブロモキシニルに対し耐性であった。トランスジェニックトマト植物（１０〜２０葉段階）にブロモキシニルの市販組成物（ブクトリル）を噴霧したところ、０．５ポンド／ニーカーにて耐性であることがトリラーゼ遺伝子のＣ末端におけるコード領域に欠失部を導入扛Ｌ１部位と共にリーディングフレームに存在し、ｐＵｃ１８からのＴＧＡコドンに対し約１０個のコドンが付加される。

下記配列は、Ｃ−末端改変二トリラーゼ（ｎｊｔ−１１）の配列を推定アミノ酸と共に示した。

ＭＥＴ　　Ｌｅｕ　　Ｔｈｒ　　Ｈｉｓ　　Ａｓｎ　　Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｕ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｉｌｅ　@Ｉｌｅ　　Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ａｒｇ　　ＬｙｓＣＡＣＣＣＡ　　人τｃ　　ｃｃｃ　　ｃｃｃ　　ｃ＾τ　ＣにＡ　　ＣＣＡ　　ＣＩＩＩＡ　ＡＴＣＣ人＾　λＡＡ　ＡＴＴ　ＣＣ；ＣＴbＣＧＣＧ　　ＧＣＴ　　ＣＡＧＧｉｎ　：人１ａ　　Ｉｌｅ　　＾１＆　＾ＩＪＬ　　Ａｓｐ　　（：Ｌｙ　　Ｐｒｏ　　ＧＬｕ　　ＩＬｅ　　にＬｕ　　Ｌｙｓ−１１ｅ@　Ａｒｇ　　Ｃｙｓ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｇ１ｎＣＲＡＧ　　ＣＡＴ　人＾Ｇ　　ＡＴＴ　Ｃ，ＣＧ　　ＣＴＣＴＣＣｍ　　ＣＣＣＴＡＣＡＣＣＣＡＡ　　ＣＧに　　ＣＣＴ　　ＧＧＣＣ０噤@人Ｃに　　ＣＴＣＧｌｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　ｒｙｅ＾Ｌａ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　にｌｙτｙｒ　Ｓｅｒ　Ｃ１ｕ　Ａｒｇ　Ａｌａ　ＧＬｙ　Ａｒｇ　Ｔ■秩@ＬｅｕＩｔ１６　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｂｋ３τＡＣＡＴＣ７０人　ＣＡ、＾　ＡＴＣＣＴｒ　　ＡＴＣＣＡＴ　　ＧＣＣにＡＴ　　ＧＣＣＡＴＣＡＣＣ人ＡＡ　　ＡＴｒ　　ＣＧＴ　　bにＴ　　ＣＣＡ τｙｒＭΣτ　Ｓｅｒ　　Ｃ１ｎ　ＭＥＴ　Ｌｅｕ　　Ｉｌｅ　　人ｓｐ　　Ａｌａ　　ＡＪＰ　　Ｇｌｙ　、Ｘ１ｅ　　Ｔｈｒ　　Ｌｙｓ@　Ｉｌｅ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ　　Ａｒｇ５７８　　、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　６０５ＧＡ（：　　ＡＡτ　ＩＴＣＣＡに　ＴＣに　　ＣＴＡ　−請Ｃ人ＡＣ１て「Ｉ“ｃｃｃ　ｃτＴＧＣτ　ＧＣＣＧＡＧ　ＣＧＴ　Ｃん＼　bＡＣ＾Ｔ＾にｌｕ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｌａｕ　Ａｌａ＾Ｌｍ　Ｇｌｕ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｕ　f］、ｎ　ＩＬｅＣＡＴ　　ＡＴＣＴＣＣｃｃＣＴｃｃ　　ＣＣＡ　　ＴＴＣＡＣＧ　　ＣＴｒ　　（、ＧＡ　　ＡＧＣＣＯＴ　　（：丁ＣＣＴＣＧＴＣｃｃ`　　にＡＣＴＣＣＨｉｇ　　工ｌｅ　　Ｓｅｒ　　Ａｌａ　　Ｔｒｐ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ　　Ｌｅｕ　　Ｃ１ｙ　　Ｓｅｒ　　Ｐｒｏ　　Ｖａｌ@　Ｌｅｕ　　Ｖａｌ　　ＧＬｙ　　Ａｓｐ　　５ｅｒＡＴＣににＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＣＡＧ　　ＧＴＣＴＡＣＧＣＣＧＣＣＧＡＣＡｃｅ　　Ｃ；Ｃ；ＣＡＣＣＴＴＣＣＴＴ　Ｃ τＣＡ丁Ｃ１１ｅ　　Ｃ１１ｙ　Ａｌａ　　Ｉｌｅ　　Ａｓｎ　　Ｇｉｎ　　Ｖａｉ　　Ｔｒｙ　　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔ■秩@　Ｐｈｅ　　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　ＭＥ丁７ム０　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　７６７丁ＣＣＡＣＧ　　ＣＡ（：　　Ｃ；ＴＧ　　ＧＴＴ　　ＧＧＡ　　ＣＣＧ　　ＡＣＣＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧＣＣＴｒＣＧＡに　　ＡＴＣＧＧ`　　ＧＡＣＡＧＧＳｅｒ　　Ｔｈｒ　　Ｇｉｎ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ｇｌｙ　　Ｉｌｅ　　Ａｌａ　Ａｌａ　　Ｐｈｅ　@Ｇｌｕ　　ＩＬｅ　　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　Ａｒｇτ丁人　ＣＡＧ　　ＧＴＣ（：ＣＣＣＭ　　ＡＣＴ　　ＡＧＣ（、ＴＴ　　ＣＣＴ　　Ｃにに　　ＧＴに　　ＣにＴ　ＧＣＣＣＴＣＡＡＣＴ■bにＣ（：　　ＧＡにＬｅｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ａｌａ　　Ｇｉｎ　　Ｔｈｒ　　Ｓｅｒ　Ｖｄ　　にｌｙ　人ｒｇ　　Ｖａｌ　　Ｇｌｙ　Ａｌａ　　Ｌｅｕ　人唐氏@Ｃｙｓ　　Ａｌａ　　（：Ｌｕ＾τＣＴＣＣＧＣＣＴにＣＣＣＡ　　ＴｒＣＡＣＧ　　ＣＴＴ　Ｃ，０人　＾（：ＣＣＣＴ　　Ｃ；ＴＯＣＴＣにＴＣににＡ　　ＣＡＣＴＣb人τＣ１１ｅ　　Ｓｅｒ人１＆τｒｐ　　Ｐｒｏ　　Ｐｈｅ　　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｃ１ｙ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　　Ｌｅｕ　Ｖａｉ　Ｇｌｙ　`ｓｐ　Ｓｅｒ　　ｌ１ｅに＋：Ｃ（ＣＣＡＴＣＡＡＣＣＡにＧＴＣＴＡＣＣＣＧＣＣＣＧＡＧＡＣＧ’、ＣＧＡＣＣＴＴＣＧＴｒＣＴＣ人τＣＴｅ１：Ｇｌｙ　Ａｌａ　ＩＬｅ　Ａｓｎ　Ｇｌｒ＋　Ｖａｌ　　Ｔｙｒ　Ａｌａ人Ｌａ　Ｃ１ｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　　Ｌ■普@ＭＩＥτ５ｅｒＡＣＧ　　ＣＡに　　にＴＯにＴＴ　　ＧＣＡ　　ＣＣに　　ＡＣＣに（、ＣＡＴＣＧＣＣにＣＣＩＴＣＣＡＧ　　ＡＴＣ［；ＡＡ　　ＧＡbＡＣに　　ＴＡＣ τｈｒ　　Ｇｉｎ　　Ｖａｌ　　ｖａｔ　　にｌｙ　　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ｇ１ｙ４１ｅ’Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｐｈｅ　　Ｃ１ｕ　　Ｉ撃■@　Ｇｌｕ　　Ａｓｐ　　Ａｒｇ　　丁ｙｒ７１ｉ１３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　８１０ＡＡＣＣＣＧ　人＾τ　ＣＡＣＴＡＴ　　ＣＴＴ　　ＧＧＴ　ＧＧＴ　Ｃ：（ＣＴＡＣＧＣに　　Ｃ（：Ｇ　　ＡＴＣＴＡＣＧにＧ　　ＣＣs　にＡＣＡＴＣＡｓｎ　　Ｐｒｏ　　Ａｓｎ　　Ｇｉｎ　　Ｔｙｒ　　Ｌｅｕ　　ＧＬｙ　　Ｃ１ｙ　　Ｇｌｙ　　Ｔｙｒ　　人Ｌａ　　Ａｒｇ　　Ｈｅ　@Ｔｙｒ　　にｌｙ　　！’ｒｏ　　Ａｓｐ　　ＫＥ丁Ｃｆｉｊ、ＴＴに　　ＡＡＧ　　ＡにＣＡＡＧ　　ＴＣＧ　　丁τＣ丁ＣＡ　　ＣＣＧ　　ＡＣＣＣＡＡ　　ＧＡＧ　　ＧＧＣＡＴＣＣＴＣsＡＣＧＣＣＧＡＧにｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　５ｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｙ　にｌｕ　Ｇｌｕ　にｌｙ　Ｉｌｅ　ＶａＬτｙｒ　`ｌａ　に１ｕ８９１、　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　９１ＳＡＴＣＧＡＣＣＴに　ＴＣＣＡＴＣＣＴＴ　　ＣＡＧ　　ＧＣＡ　　ＧＣＡ　　ｋＡＣ，ＴＡＣＴＣＧ　　ＣＴＣＣＨＡＴ　　ＣＣＣＡＣに@　ＧＣ；ＣＣＡＣＨｅ　　Ａｓｐ　　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　　ＭＥＴ　　Ｌｅｕ　　のｕ　Ａｌａ　　Ａｌａ　　Ｌｙｓ　　Ｔｙｒ　　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　Ａｓｐ@　Ｐｒｏ　　Ｔｈｒ　　Ｇａｙ　　ＨＬｓ９９９　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＬＯ２６ＡＣＣＣＣＴ　ＣＴｈｒ　Ａｒｇ　ＨｉｓＮ−末端置換を有する改変ニトリラーゼの作成５分間にわたり再切断して約５１．ｎｔを除去した。この酵素を失活Ｈ１で完全に切断して、５′−末端にて切除されたニトリラ−ｐＵｃ１９からのポリリンカーとクララムフェニコール耐性遺伝子し、ここでｐＵｃ１９配列によりコードされた１７個のアミノ酸は天然ニトリラーゼのアミノ酸を置換している。

Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　ＴＬｔ＾１ａ＾Ｌａ　Ｐｈｅ　ＣＬｕ　ＩＬｅ　ＧＬｕ　Ａｓｐ＾ｒ■@ＴｙｒにτＳｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｌｙｓτｙｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｕ　Ｓ＠ｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　（：Ｌｕ　Ａｌａ　Ｉｌｅ＾ｌ＝@Ｌａｕ野生型および改変されたニトリラーゼの精製定常期のＭＭ２９４大腸菌からニトリラーゼを作成した。全細胞のニトリラーゼ分析値が約２．０の０Ｄ６４ｏを与えるまで培養物をアンピシリン選択の下で増殖させた。培養物を８．０００Ｘｓｒにて４℃で１５分間遠心分離した。菌体を０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，４）で洗浄し、再ペレット化し、乾燥させ、−２０℃で凍結ささせた。ベレットを４℃で解凍させ、ＩＩＩＩＭのジチオトレイトールおよびＯ，１ｍＭのＥＤＴ＾を含有する４０ｍ１の５０ｍＭ燐酸カリウム緩衝液（ＫＤＥ）に再懸濁させた。次いで、菌体懸濁物をフレンチプレッシャーセルに通し、ｅｏ、ｏｏｏｘ　ｇにて４℃で４０分間遠心分離した。得られた上澄液（粗抽出物）をＫＤＥ緩衝液で１２ｃｇ／ｍｌの蛋白濃度まで希釈した（フラクションＩ）。硫酸アンモニウム分別を粗抽出物につき行ない、２５〜３５％のフラクション（フラクション■）は８５％のニトリラーゼ活性を有することが判明した。このフラクションをｌｏｍｌのＫＤＥ緩衝液に再懸濁させ、同じ緩衝液に対し徹底的に透析した。

さらにフラクション■をＫＤＥ緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセファデックスＡ− ５０カラム（４，９ｃｊ　Ｘ　４０ｃｍ）で精製した。ニトリラ−ゼピークを、ＫＤＥ緩衝液における０、１−０．４　ＭノＮ　ａ　Ｃ４７濃度勾配により溶出させた。活性フラクションを集め（フラクション■）、硫酸アンモニウムで沈澱させ、さらに２５ｍＭのヒスチジン（ｐ）１８．２）に対し透析した。ＰＢＥ９４を有するファルマシア社のクロマトフオーカシングカラム（１，７５ｃｊ　Ｘ　２０ｃｍ）を用意し、２５ＩｎＭのヒスチジン（ｐＨ８，２）で平衡化させた。このカラムを先ず最初にポリバッファー７４　（ｐＨ４，０）で洗浄して６〜４のｐＨ濃度勾配を形成させ、酵素をＩＭのＮａ（Ｊｌで溶出させた。活性酵素フラクションを含有するピークを硫酸アンモニウム沈澱させ、かつＫＤＥで透析した（フラクション■）。その１１．２５％ゲル上での５ＤＳ−ＰＡＧＥにより約３７．０００に強力なバンドが示され、約７０．０００の分子量に僅かな汚染物を有した。密度計走査は、フラクション■のニトリラーゼ調製物が９９％均質であることを示した。

野性型および改変されたブロモキシニル特異性ニトリラーゼの精製および性質の比較ｎ１ｔ−ｖｔ　　　　　　ｎ１ｔ−１１ｎ１ｔ−２３硫酸７＞％０つ”　　　２５−３５％　　　　　１０−２５％　　　２０−３５％クロマトフォーカシング溶出１）Ｈａ−４濃度　　ＬＭ　ＮａＣｆ１　　　　ｐＨ４，６ＬＭ　ＮａＣｊ２勾配／ＬＭ　ＮａＣ４洗浄比活性　　　２５．７　　５５　　１９．７反復（ｒｏｌｄ）精製　　　　１０．３　　　　　１Ｂ、４　　　　３５．８Ｋｍ　　（ｍＭ）　　　　　　　　０．３１　　　　　０．０５　　　　０．１１Ｖ　ｍａｘ　（モル７分／ｌｌ１ｇ）　　１５　　　　　　３８　　　　　９活性酵素型　　　　　　ダイマー　　マルチマー　　ダイマー上記手順にしたがって、ブロモキシニル耐性である植物を得ることができ、これらをその成長に顕著な悪影響を及ぼすことなくブロモキシニルの存在下の畑で使用することができる。

以上、本発明の明瞭な理解のために実施例により詳細に説明したが、本発明の範囲内において一定の改変をなしつることは明らかであろう。

補正書の写しくＲ訳文）捉出書（特ｉ法第１８４条の８）平成２年１月８日１、特許出願ノ表示　　ＰＣＴ／ＥＰ　　８８１００５８８２、発明の名称　　　　ハロアリールニトリル分解性遺伝子、その使用および該遺伝子を含有する細胞３、特許出願人住　所　　フランス国、６９００９−リヨン、ルウ・ビニール・ベイゼ、１４− ２０名　称　　ローヌープ−ラン・アグロシミ４、代　理　人　　　東京都新宿区新宿１丁目１番１４号　山田ビル５、補正書の提出年月日　　１９８９年８月２４日請求の範囲１．３．５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリルに対し実質的に特異性であ・す、基質としてのブロモキシニルに対し少なくとも約０．１μモルＮＨ３／分／　ｍｇ蛋白の比活性を有する約３４ＫＤのＫｌｅｂｓｉｅｌ　Ｉａからの実質的に純粋な改変細菌ニトリラーゼであって、全部で約５０個以下のアミノ酸の置換、切除もしぐは延長の少なくとも１柵により改変されている前記細菌ニトリラーゼ。

改変細菌ニトリラーゼ。

、２　　ψ ３．３．５−ンハロケ化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリルに対し特異性を有する実質的に純粋な改変細菌ニトリラーゼを発現する外来遺伝子を持った細菌宿主。

４、前記細菌宿主がＥ、　ｃｏｌｔである請求の範囲第４項記載の細菌宿主。

５、転写方向に、植物細胞にて機能的な転写および翻訳開始制御領域と請求の範囲第１項記載の実質的に純粋な改変ニトリラーゼをコードする遺伝子とを含み、前記ニトリラーゼが基質としてのブロモキシニルに対し少なくとも約０．１μモルＮＨ３／分／　ｍｇ蛋白の比活性を有することを特徴とする発現カセット。

６、前記カセットが右側Ｔ−ＤＮＡ境界をさらに含む請求の範囲第５項記載の発現カセット。

７、前記転写および翻訳開始制御領域が植物細胞にて機能的である請求の範囲第５項記載の発現カセット。

８、前記転写および翻訳開始制御領域がオビンの転写に関する制御領域である請求の範囲第７項記載の発現カセット。

９、転写方向に、植物細胞にて機能的な転写および翻訳開始制御領域と、３．５ −ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリルに対し少な（とも約０．１μモルＮＨ３／分／ｌ！１ｇ蛋白の比活性を有する実質的に純粋な改変ニトリラーゼをコードする遺伝子とを含む発現カセットを含む、Ｅ、　ｃｏｌｔもしくはＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの少なくとも１種に安定に維持しうるプラスミド。

１０、前記発現カセットが右側Ｔ−ＤＮＡ境界を含む請求の範囲第９項記載のプラスミド。

１１、前記転写および翻訳開始制御領域が植物細胞にて機能的である請求の範囲第９項記載のプラスミド。

１２、前記転写および翻訳開始制御領域がオビン領域にて機能的である請求の範囲第１１項記載のプラスミド。

１３、前記転写および翻訳開始制御領域がマンノビンシンターゼ開始制御領域である請求の範囲第１２項記載のプラスミド。

１４、３．５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリルに対し実質的に特異性であり、基質としてのブロモキシニルに対し少なくとも約０．１μモルＮＨ３／分／ｌｌ１ｇ蛋白の比活性を有する実質的に純粋な改変ニトリラーゼをコードするオープンリーディングフレームを含み、野生型以外のＤＮＡに対し５′　もしくは３′末端のいずれか陥されたことを特徴とするＤＮＡ配列。

１５、前記オーブンリーディングフレームが細菌ＤＮＡである請求の範囲第１４項記載の１）ＮＡ配列。

１６、前記細菌ＤＮＡがＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ　ＤＮＡである請求の範囲第１５項記載のＤＮＡ配列。

１７、請求の範囲第５項〜第７項のいずれか一項に記載の発現カセットを含む植物細胞。

１８、請求の範囲第１７項記載の植物細胞を含む植物部分。

１９、請求の範囲第１７項記載の植物細胞を含む植物。

２０、この植物が双子葉である請求の範囲第１９項記載の植物。

２１、３．５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリルを特異的に加水分解しつる特異性ニトリラーゼの産生方法であって、窒素源としてハロゲン化ｐ− ヒドロキシベンゾニトリルを使用しうるＫｌｅｂｓｉｅｌ　ｌａ菌捕を選択し、前記細菌のゲノムを切断して所望寸法範囲のＤＮＡ断片を生成させ、適するベクターにより該ＤＮＡ断片を大腸菌中にクローン化させ、０．１〜０．５μモルＮＨ３／分／　ｍｇ酵素の範囲の活性を持った３４ｋｄの純粋な細菌ニトリラーゼを選択し、前記ニトリラーゼの構造遺伝子を有するＤＮＡ配列を分離し、前記構造遺伝子を少なくとも置換、切除もしくは延長の１種で改変させて少なくとも置換、切除もしくは延長の１種により改変されたニトリラーゼを産生ずる改変遺伝子を得、ツ醸開もしくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕａ＋　ｔｕｍｅｆａｃｔｅ、Ｉｓにて複製しうるプラスミドを作成することからなり、該プラスミドは、転写量π（転）藷、始領域がオビンをコードする遺伝　　　　　　ニトリラーゼの構造遺伝子を有するＤＮＡ配列を含み、植物細胞にて機能的な制御領域の翻訳および転写制御下にある発現カセットを含むもの国際調査報告＋ｍｓｍａｅ−＾−＝”　　ＰＣＴ／ＥＰ　８８１００５８８１４１ｇ−〇−＾ −ｍｓａ＋１ｌＩＩＩＮ・　ＰＣＴ／ＥＰ　８８１００５８ｇ国際調査報告 εＰ　８８００５８８ＳＡ　　２３２１４

Claims

【特許請求の範囲】

１．３，５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリルに対し実質的に特異性であり、基質としてのブロモキシニルに対し少なくとも約０．１μモルＮＨ３／分／ｍｇ蛋白の比活性を有する約３４ＫＤの実質的に純粋な改変細菌ニトリラーゼであって、全部で約５０個以下のアミノ酸の置換、切除もしくは延長の少なくとも１種により改変されている前記細菌ニトリラーゼ。
２．前記細菌ニトリラーゼが基質としてのブロモキシニルに対し少なくとも約０．１μモルＮＨ３／分／ｍｇ蛋白の比活性を有する請求の範囲第１項記載の実質的に純粋な改変細菌ニトリラーゼ。
３．前記細菌ニトリラーゼが少なくとも約０．５μモルＮＨ３／分／ｍｇ蛋白の比活性を有する請求の範囲第１項記載の実質的に純粋な改変細菌ニトリラーゼ。
４．前記細菌ニトリラーゼがＫｌｅｂｓｉｅｌｌａからのニトリラーゼである請求の範囲第１項記載の実質的に純粋な改変細菌ニトリラーゼ。
５．３，５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリルに対し特異性を有する実質的に純粋な改変細菌ニトリラーゼを発現する外来遺伝子を持った細菌宿主。
６．前記細菌宿主がＥ．ｃｏｌｉである請求の範囲第５項記載の細菌宿主。
７．転写方向に、植物細胞にて機能的な転写および翻訳開始制御領域と請求の範囲第１項記載の実質的に純粋な改変ニトリラーゼをコードする遺伝子とを含み、前記ニトリラーゼが基質としてのブロモキシニルに対し少なくとも約０．μモルＮＨ３／分／ｍｇ蛋白の比活性を有することを特徴とする発現カセット。
８．前記カセットが右側Ｔ−ＤＮＡ境界をさらに含む請求の範囲第７項記載の発現カセット。
９．前記転写および翻訳開始制御領域が植物細胞にて機能的である請求の範囲第７項記載の発現カセット。
１０．前記転写および翻訳開始制御領域がオピンの転写に関する制御領域である請求の範囲第９項記載の発現カセット。
１１．転写方向に、植物細胞にて機能的な転写および翻訳開始制御領域と、３，５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリルに対し実質的に特異性でありかつ基質としてのブロモキシニルに対し少なくとも約０．１μモルＮＨ３／分／ｍｇ蛋白の比活性を有する実質的に純粋な改変ニトリラーゼをコードする遺伝子とを含む発現カセットを含む、Ｅ．ｃｏｌｉもしくはＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの少なくとも１種に安定に維持しうるプラスミド。
１２．前記発現カセットが右側Ｔ−ＤＮＡ境界を含む請求の範囲第１１項記載のプラスミド。
１３．前記転写および翻訳開始制御領域が植物細胞にて機能的である請求の範囲第１１項記載のプラスミド。
１４．前記転写および翻訳開始制御領域がオピン領域にて機能的である請求の範囲第１３項記載のプラスミド。
１５．前記転写および翻訳開始制御領域がマンＨピンシンターゼ開始制御領域である請求の範囲第１４項記載のプラスミド。
１６．３，５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリルに対し実質的に特異性であり、基質としてのブロモキシニルに対し少なくとも約０．１μモルＮＨ３／分／ｍｇ蛋白の比活性を有する実質的に純粋な改変ニトリラーゼをコードするオーブンリーディングフレームを含み、野性型以外のＤＮＡに対し５′もしくは３′末端のいずれかにおいて結合されたことを特徴とするＤＮＡ配列。
１７．前記オーブンリーディングフレームが細菌ＤＮＡである請求の範囲第１６項記載のＤＮＡ配列。
１８．前記細菌ＤＮＡがＫｌｅｂｓｉｅｌｌａＤＮＡである請求の範囲第１７項記載のＤＮＡ配列。
１９．請求の範囲第７項〜第９項のいずれか一項に記載の発現カセットを含む植物細胞。
２０．請求の範囲第１９項記載の植物細胞を含む植物部分。
２１．請求の範囲第１９項記載の植物細胞を含む植物。
２２．３，５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリルに特異的なニトリラーゼの産生方法であって、−前記３，５−ジハロゲン化−ｐ−ヒドロキシベンゾニトリルに特異的なニトリラーゼを産生するＫ．ｏｚａｅｎａｅを単離し、− 該Ｋ．ｏｚａｅｎａｅを適当な培地で増殖させ、−該Ｋ．ｏｚａｅｎａｅを分離して前記ニトリラーゼを単離することからなる前記方法。