JPH11510694A - Ｄｎａ構築体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ａｌｃＲ遺伝子から誘導され、調節タンパク質をコードする調節配列に機能的に結合した第１プロモーターと、昆虫を殺傷するタンパク質をコードするターゲット遺伝子又はその発現が、昆虫を殺傷する代謝産物を産生する代謝経路を誘導するターゲット遺伝子に機能的に結合した誘導プロモーターとを含み、誘導プロモーターが有効な外因性誘導物質の存在下で調節タンパク質によって活性化されるため、誘導物質の供給がターゲット遺伝子を発現させる、化学的に誘導可能な植物遺伝子発現カセット

Description

【発明の詳細な説明】 ＤＮＡ構築体 本発明はＤＮＡ構築体とそれらを取り込んだ植物とに関する。特に、本発明は プロモーター配列と、植物に殺虫活性を与える遺伝子の発現へのそれらの使用と に関する。 植物バイオテクノロジーにおける進歩は、餌を食べる昆虫幼虫から保護された トランスジェニック植物の発生を生じている。 多くの微生物(organism)は昆虫に有害であるタンパク質を産生し、これらの微 生物の中には、昆虫幼虫を摂取時に殺す結晶関連(crystal-associated)タンパク 質δエンドトキシンを産生する微生物Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ ｓｉｓ が含まれる。しかし、これは哺乳動物には有害ではない。したがって、こ れは農業用殺虫剤として非常に有用である。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓの 多くの株は昆虫有害生物に対して活性であり、昆虫エンドトキシンをコードする 遺伝子が解明されている。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓδエンドトキシンは Ｌｅｐｉｄｐｔｅｒａｎ幼虫に特異的に殺虫性であるもの（例えばＣｒｙＩ型タ ンパク質）、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａｎ幼虫に特異的に殺虫性であるもの（例えば 、ＣｒｙＩＩＩ型タンパク質）及びＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａとＣｏｌｅｏｐｔｅ ｒａの両方に二重特異性を有するもの（例えば、ＣｒｙＶ）を包含する。Ｂ．ｔ ｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ エンドトキシンの少なくとも一部を含むキメラタンパ ク質も何らかの方法でエンドトキシンの性質を改良する目的（例えば、殺害速度 の改良）を有して提案されている。殺虫性エンドトキシンをコードする遺伝子を 発現するトランスジェニック植物も知られている。 昆虫を殺傷する他の方法は、殺虫性である代謝産物を産生する植物代謝経路を 刺激することを包含する。 例えばＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシンのような有効な殺虫性 タンパク質をコードする遺伝子が特異的に活性化する化学物質の供給に依存して 誘導可能な方法で発現すると考えられる系を、我々は提供する。或いは、昆虫に 対して殺傷性である代謝産物を産生する経路の誘導を達成することができる。こ のアプローチは下記を含めて多くの利点を有する： １．例えばＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシンのような昆虫耐性 遺伝子の植物における構成的発現が耐昆虫性種に対する選択圧力(selection pre ssure)を有意に増加させる。昆虫耐性遺伝子の誘導的調節(inducible regulatio n)は耐性な有害生物が発生する危険性を減ずる。例えば、保護が必要である成長 シーズンの時点においてのみ殺虫性遺伝子発現を誘導することができる。さらに 、殺虫性遺伝子発現を誘導する化学的処理が標準的な殺虫性の有害生物殺滅剤処 理と交替することができる統合有害生物処理系の一部として、スイッチ可能な(s witchable)昆虫耐性を用いることができる。 ２．強い構成的プロモーターからの過剰発現が植物発生に不利な影響をもたら し、異常な発芽開花を生じて、不利益を生じうる危険性が存在する。誘導可能な 発現は、導入遺伝子を発生の敏感な時点を避けて短期間にわたって発現させるこ とができるので、不利な影響という危険性を減ずると考えられる。 ３．スイッチ化学物質を標準的な殺虫剤製剤に加えて、化学的効果と遺伝子効 果との両方を与えて、２つの独立した機構によって昆虫を殺すことができる。 ある一定のアルコールとケトンの存在下でａｌｃＡプロモーターから遺伝子発 現を活性化する、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓからのａｌｃＲ調 節タンパク質に基づいた誘導性遺伝子調節系（遺伝子スイッチ）を、我々は開発 した。この系は、本明細書に援用される国際特許公報第ＷＯ９３／２１３３４号 に述べられている。 真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓからのａｌｃＡ／ａｌｃＲ遺 伝子活性化系も十分に解明されている。Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓにおけるエタノー ル利用経路はアルコール及びアルデヒドの分解に責任がある。３種類の遺伝子が エタノール利用回路に関与することが判明している。遺伝子ａｌｃＡとａｌｃＲ は連鎖群ＶＩＩ上で共に接近して存在することが判明しており、ａｌｄＡは連鎖 群ＶＩＩＩに位置する（Ｐａｔｅｍａｎ ＪＨ等，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ ．Ｌｏｎｄ．，Ｂ２１７：２４３〜２６４；Ｓｅａｌｙ−Ｌｅｗｉｓ ＨＭとＬ ｏｃｋｉｎｇｔｏｎ ＲＡ，１９８４，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．８：２５３〜２ ５９）。遺伝子ａｌｃＡはＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓにおけるＡＤＨＩをコードし、 ａ ｌｄＡはａｌｄＤＨ、エタノール利用に責任ある第２酵素をコードする。ａｌｃ ＡとａｌｄＡの両方の発現は、エタノール及び多くの他の誘導物質によって転写 活性因子(transcription activator)ａｌｃＲを介して誘導される（Ｃｒｅａｓ ｅｒ ＥＨ等，１９８４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊ．，２５５：４４９〜４ ５４）。ａｌｃＲにおける多くの突然変異及び欠失がＡＤＨＩ及びａｌｄＤＨの 多面的欠損を生じるので、ａｌｃＲ遺伝子と補助誘導物質(co-inducer)はａｌｃ ＡとａｌｄＡの発現に責任がある（Ｆｅｌｅｎｂｏｋ Ｂ等，１９８８，Ｇｅｎ ｅ，７３：３８５〜３９６；Ｐａｔｅｍａｎ等，１９８４，Ｓｅａｌｙ−Ｌｅｗ ｉｓ ＆ Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ，１９８４）。ＡＬＣＲタンパク質はａｌｃＡ プロモーター中の特異的な３部位に結合することによって、ａｌｃＡからの発現 を活性化する（Ｋｕｌｍｂｅｒｇ Ｐ等，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ，２６７：２１１４６〜２１１５３）。 ａｌｃＲ遺伝子はクローン化され（Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ ＲＡ等，１９８５ ，Ｇｅｎｅ，３３：１３７〜１４９）、配列決定されている（Ｆｅｌｅｎｂｏｋ 等，１９８８）。ａｌｃＲ遺伝子の発現は誘導可能であり、自己制御され、ＣＲ ＥＡリプレッサーによって仲介されるグルコース抑制を受ける（Ｂａｉｌｅｙ ＣとＡｒｓｔ ＨＮ，１９７５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５１：５７３〜 ５７７；Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ ＲＡ等，１９８７，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏ ｌｏｇｙ，１：２７５〜２８１；Ｄｏｗｚｅｒ ＣＥＡとＫｅｌｌｙ ＪＭ，１ ９８９，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１５：４５７〜４５９；Ｄｏｗｚｅｒ ＣＥＡ とＫｅｌｌｙ ＪＭ，１９９１，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５７０１ 〜５７０９）。ＡＬＣＲ調節タンパク質はそのＮ末端近くに、亜鉛二核クラスタ ー中に配位結合した(co-ordinated)６システインを含有する（Ｋｕｌｍｂｅｒｇ Ｐ等，１９９１，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｓ．，２８０：１１〜１６）。このクラ スターは他の子嚢菌の転写因子に見い出される高度に保存されたＤＮＡ結合ドメ インに関連する。転写因子ＧＡＬ４及びＬＡＣ９は、２個のＺｎ（ＩＩ）原子を 含有するクローバー葉型構造を有する二核錯体を含むことが判明している（Ｐａ ｎ ＴとＣｏｌｅｍａｎ ＪＥ，１９９０，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９： ３０２３〜３０２９；Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ ＹＤＣ等，１９９０，Ｊ．Ｂｉｏｌ ．Ｃ ｈｅｍ．２６５：１３２８３〜１３２８９）。ＡＬＣＲの構造は、Ｃｙｓ−３と Ｃｙｓ−４の間の１６残基の非対称ループが存在することを除いて、この型に類 似する。ＡＬＣＲはそのプロモーター領域における特異的な２部位に結合するこ とによってそれ自体の発現を正に活性化する（Ｋｕｌｍｂｅｒｇ Ｐ等，１９９ ２，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：１９３２〜１９３９）。 エタノール利用経路に関与した３種類の遺伝子、ａｌｃＲ、ａｌｃＡ及びａｌ ｄＡの調節は転写のレベルにおいてである（Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ等，１９８７ ；Ｇｗｙｎｎｅ Ｄ等，１９８７，Ｇｅｎｅ，５１：２０５〜２１６；Ｐｉｃｋ ｅｔｔ等，１９８７，Ｇｅｎｅ，５１：２１７〜２２６）。 Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ中には他の２種類のアルコール脱水素酵素が存在する。 ＡＤＨＩＩは非誘導培地中で成長した菌糸体中に存在し、エタノールの存在によ って抑制可能である。ＡＤＨＩＩはａｌｃＢによってコードされ、ａｌｃＲの調 節をも受ける（Ｓｅａｌｙ−Ｌｅｗｉｓ ＆ Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ，１９８４ ）。第３アルコール脱水素酵素も、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのａｄｈ−菌株と の相補性によってクローン化されている。この遺伝子ａｌｃＣは連鎖群ＶＩＩに 位置するが、ａｌｃＡとａｌｃＲに結合しない。 遺伝子（ａｌｃＣ）はＡＤＨＩＩＩをコードし、エタノールを極めて軽度に利 用する（ＭｃＫｎｉｇｈｔ ＧＬ等，１９８５，ＥＭＢＯ Ｊ．，４：２０９４ 〜２０９９）。ＡＤＨＩＩＩは嫌気性ストレスの期間中のＡ．ｎｉｄｕｌａｎｓ の生残に関与することが判明している。ａｌｃＣの発現はグルコースの存在によ って抑制されず、このことはａｌｃＣがａｌｃＲの調節を受けないことを示唆し ている（Ｒｏｌａｎｄ ＬＪとＳｔｒｏｍｅｒ ＪＮ，１９８６，Ｍｏｌ．Ｃｅ ｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：３３６８〜３３７２）。 要約すると、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓは、種々なアルコール及びケトンの存在下 で増殖する場合にのみ、遺伝子ａｌｃＡによってコードされる酵素アルコール脱 水素酵素Ｉ（ＡＤＨＩ）を発現する。誘導はａｌｃＲ遺伝子によってコードされ て構成的に発現される調節タンパク質によって中継される(relayed)。誘導物質 （アルコール又はケトン）の存在下では、調節タンパク質はａｌｃＡ遺伝子の発 現を活性化する。調節タンパク質は誘導物質の存在下でそれ自体の発現をも刺激 する。このことは、高レベルのＡＤＨＩ酵素が誘導条件下で（即ち、アルコール 又はケトンが存在するときに）産生されることを意味する。これに反して、ａｌ ｃＡ遺伝子とその産物（ＡＤＨＩ）は誘導物質の不存在下では発現されない。ａ ｌｃＡの発現と酵素の産生はまたグルコースの存在下で抑制される。 したがって、ａｌｃＡ遺伝子プロモーターは、誘導物質の存在下でａｌｃＲ調 節タンパク質によって（即ち、タンパク質／アルコール又はタンパク質／ケトン の組合せによって）活性化される誘導性プロモーターである。ａｌｃＲとａｌｃ Ａ遺伝子（それぞれのプロモーターを含有する）はクローン化されており、配列 決定されている（Ｌｏｃｋｉｎｇｔｏｎ ＲＡ等，１９８５，Ｇｅｎｅ，３３： １３７〜１４９；Ｆｅｌｅｎｂｏｋ Ｂ等，１９８８，Ｇｅｎｅ，７３：３８５ 〜３９６；Ｇｗyｎｎｅ等，１９８７，Ｇｅｎｅ，５１：２０５〜２１６）。 アルコール脱水素酵素（ａｄｈ）遺伝子はある種の植物種において研究されて いる。とうもろこし及び他の穀類では、これらは嫌気性条件によってスイッチオ ンされる。とうもろこしからのａｄｈ遺伝子のプロモーター領域は、嫌気性条件 下での発現のために必要な３００ｂｐ調節要素を含有する。しかし、如何なる植 物にもａｌｃＲ調節タンパク質の均等物は見い出されていない。このため、ａｌ ｃＲ／ａｌｃＡ型の遺伝子調節系は植物においては知られていない。植物細胞に おけるａｌｃＲの構成的発現は内因性ａｄｈ活性の活性化を生じない。 本発明の第１態様によると、化学的に誘導可能な植物遺伝子発現カセットであ って、ａｌｃＲ遺伝子から誘導され、調節タンパク質をコードする調節配列に機 能的に結合した第１プロモーターと、昆虫を殺傷するタンパク質をコードするか 又はその発現が昆虫を殺傷する代謝産物を産生する代謝経路を誘導するターゲッ ト遺伝子に機能的に結合した誘導プロモーターとを含み、誘導プロモーターが有 効な外因性誘導物質の存在下で調節タンパク質によって活性化されるので、誘導 物質の供給がターゲット遺伝子を発現させる植物遺伝子発現カセットが提供され る。 ターゲット遺伝子が昆虫殺傷タンパク質をコードするときに、このタンパク質 が経口的に活性であることが有利である。経口的に活性な殺虫性タンパク質の例 はＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓδエンドトキシンであるので、ターゲット遺 伝子はＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓδエンドトキシンの少なくとも一部をコ ードすることができる。 ａｌｃＡ／ａｌｃＲスイッチがＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエンドトキシ ンをコードする遺伝子を駆動するために少なくとも下記理由から特に適すること を、我々は発見した。 ａｌｃＡ／ａｌｃＲスイッチは高レベルの遺伝子発現を駆動するために開発さ れている。さらに、調節タンパク質ａｌｃＲは好ましくは例えばポリウビキチン のような強い構成的プロモーターから駆動される。例えば３５ＣａＭＶのような 強い構成的プロモーターからの発現に匹敵する、高レベルの誘導された導入遺伝 子発現を達成することができる。 図１は、誘導化学物質の供給後のマーカー遺伝子発現（ＣＡＴ）の時間的経過 を示す。この研究は、誘導化学物質の葉面供給後のＣＡＴ発現の迅速な増加（２ 時間）を示す。誘導の前初期速度(kinetics)が構成的方法での調節タンパク質の 発現にもたらされるので、転写因子の合成がおこなわれるときに時間的遅延は見 られない。さらに、我々は複雑なシグナルトランスダクション系に依存しない、 単純な２成分系を選択している。 我々はａｌｃＡ／ａｌｃＲ系の特異性を作物栽培の実施に用いられる範囲の溶 媒によって試験した。水栽培苗木系は、エタノール、ブタン−２−オール及びシ クロヘキサノンのすべてが高レベルの誘導レポーター遺伝子発現を生じたことを 示す（図２）。これとは対照的に、表１に列挙した、栽培の実施に用いた種々な アルコール及びケトンを葉面スプレーとして供給した場合には、エタノールのみ が高レベルの誘導レポーター遺伝子活性を生じた（図３）。このことは、導入遺 伝子の非正統的な誘導が配合溶媒(formulation solvent)への偶然の暴露によっ て見られないので、重要である。エタノールは農薬配合物の一般的な成分ではな いので、適当なスプレー処理によって、現場状況でのａｌｃＡ／ａｌｃＲ遺伝子 スイッチの特異的誘導物質として考えられる。 例えば、病原菌感染、熱、寒さ、干ばつ(drought)、外傷、冠水のような、あ る範囲の生物的及び非生物的ストレスは全てａｌｃＡ／ａｌｃＲスイッチを誘導 することができなかった。さらに、ある範囲の非溶媒化学物質処理、例えばサリ チル酸、エチレン、アブシシン酸(absisic acid)、オーキシン、ギベレリン酸、 種々な農薬は全てａｌｃＡ／ａｌｃＲ系を誘導することができなかった。 本発明は如何なる特定のエンドトキシンにも限定されず、キメラエンドトキシ ンにも適用可能である。 第１プロモーターは構成的又は組織特異的であることも、発生的にプログラム されることも、誘導性であることさえも考えられる。調節配列、ａｌｃＲ遺伝子 はＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓから得ることができ、ａｌｃＲ調 節タンパク質をコードする。 誘導プロモーターは好ましくはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓか ら得られるａｌｃＡ遺伝子プロモーターか、又はａｌｃＡプロモーターの調節配 列と、植物細胞中で機能する遺伝子プロモーター（任意の植物遺伝子プロモータ ーを包含する）からのコアプロモーター領域とから誘導される“キメラ”プロモ ーターである。ａｌｃＡプロモーター又は関連“キメラ”プロモーターは、アル コール又はケトン誘導物質が供給されたときに、ａｌｃＲ調節タンパク質によっ て活性化される。 誘導プロモーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓから得るこ とができるａｌｄＡ遺伝子プロモーター、ａｌｃＢ遺伝子プロモーター又はａｌ ｃＣ遺伝子プロモーターから誘導されることもできる。 誘導物質は任意の有効な化学物質（例えば、アルコール又はケトン）であるこ とができる。ａｌｃＡ／ａｌｃＲ誘導カセットと共に用いるために適当な化学物 質は、例えばブタン−２−オン（エチルメチルケトン）、シクロヘキサノン、ア セトン、ブタン−２−オール、３−オキソ酪酸、プロパン−２−オール、エタノ ールのような、Ｃｒｅａｓｅｒ等（１９８４，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２２５，４ ４９〜４５４）によって列挙されたものを包含する。 遺伝子発現カセットは供給された外因性化学的誘導物質に反応して、このカセ ットによって調節されるターゲット遺伝子発現の外部活性化を可能にする。この 発現カセットは高度に調節され、植物における一般的な使用に適する。 発現カセットの２部分は同じ構築体上にあることも、別々の構築体上にあるこ ともできる。第１部分は調節ｃＤＮＡ又は発現ベクターにサブクローン化された 遺伝子配列をその発現を駆動する植物機能性(plant-operative)プロモーターと 共に含む。第２部分は下流のターゲット遺伝子の発現を調節する誘導プロモータ ーの少なくとも一部を含む。適当な誘導物質の存在下で、カセットの第１部分に よって産生される調節タンパク質は、カセットの第２部分中の誘導プロモーター を刺激することによってターゲット遺伝子の発現を活性化するであろう。 実施においては、本発明の発現カセットを含む構築体（単数又は複数）を形質 転換によって植物に挿入する。次に、本発明の化学的にスイッチ可能なプロモー ターの調節下にある構築体中でのターゲット遺伝子発現が、植物への化学的誘導 物質の供給によって活性化されることができる。 組換えＴｉプラスミドを含有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａ ｃｉｅｎｓ による感染、エレクトロポレーション、細胞及びプロトプラストの微 量注入、マイクロプロジェクティル(microprojectile)形質転換、及び花粉管形 質転換を含めた、ターゲット植物又は植物細胞に適した任意の形質転換方法を用 いることができる。次に、形質転換された細胞を、適当な場合には、新しい核物 質がゲノムに安定に組み込まれた、完全な植物に再生させることができる。形質 転換された単子葉植物と双子葉植物の両方をこの方法で得ることができる。 生成することができる遺伝的修飾植物の例は、多栽培作物(field crop)、穀類 、果物及び野菜類、例えば、カノラ、ヒマワリ、タバコ、サトウダイコン、綿、 大豆、とうもろこし、小麦、大麦、米、モロコシ、トマト、マンゴー、桃、リン ゴ、セイヨウナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニンジン、レタス、 キャベツ、たまねぎを包含する。 本発明はさらに、本発明による遺伝子発現カセットを含有する植物細胞を提供 する。遺伝子発現カセットは形質転換によって植物ゲノム中に安定に組み込むこ とができる。本発明はまた、このような細胞を含む植物組織若しくは植物と、そ れから誘導された植物若しくは種子とを提供する。 本発明はさらに、植物遺伝子発現の調節方法であって、ａｌｃＲ遺伝子から誘 導され、調節タンパク質をコードする調節配列に機能的に結合した第１プロモー ターと、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓδエンドトキシンをコードするターゲ ット遺伝子に機能的に結合した誘導プロモーターとを含み、誘導プロモーターが 有効な外因性誘導物質の存在下で調節タンパク質によって活性化されるので、誘 導物質の供給がターゲット遺伝子を発現させる、化学的に誘導可能な植物遺伝子 発現カセットによって植物細胞を形質転換することを含む方法を提供する。 次に、本発明の種々な好ましい特徴と実施態様とを下記の非限定的実施例と図 面とによって説明するが、図面において、 図１は、ＡＲ１０分離集団(segregating population)の７．５％エタノールに よる誘導の時間的経過を示すプロットであり； 図２は、種々な化学物質による根ドレンチング(root drenching)時のＡＲ１０ 〜３０ホモ接合体系統におけるＣＡＴ活性を示すプロットであり； 図３は、種々な化学物質による根ドレンチング時のＡＲ１０〜３０ホモ接合体 系統におけるＣＡＴ活性を示すプロットであり； 図４は３５Ｓ調節構築体の作製を示し； 図５はレポーター構築体の作製を示し； 図６はスイッチ可能な昆虫耐性ベクターを説明し； 図７は最適化ＣｒｙＩａ（ｃ）遺伝子の配列を説明し： 図８は最適化ＣｒｙＩａ（ｃ）遺伝子中の制限部位を示し； 図９はＣｒｙＶ遺伝子の配列を説明し； 図１０は、ＣｒｙＶ遺伝子を含有するベクター５１２９ｂｐを示し； 図１１はベクターｐＭＪＢ１の配列を説明し；そして 図１２はベクターｐＪＲＩｉのマップである。実施例１ ａｌｃＲ調節構築体の作製 ａｌｃＲゲノムＤＮＡ配列は発表されており、ａｌｃＲｃＤＮＡのサンプルの 単離が可能である。 ａｌｃＲｃＤＮＡを発現ベクター，ｐＪＲ１（ｐＵＣ）にクローン化した。ｐ ＪＲ１はカリフラワーモザイクウイルス（Cauliflower Mosaic Virus）３５Ｓプ ロモーターを含有する。このプロモーターは構成的植物プロモーターであり、連 続的に調節タンパク質を発現する。ｎｏｓポリアデニル化シグナルを発現ベクタ ーに用いる。 図４は、ａｌｃＲｃＤＮＡのｐＪＲ１中へのライゲーションによる３５Ｓ調節 構築体の作製を説明する。ａｌｃＲｃＤＮＡクローンのＢａｍＨＩによる部分的 制限に続いて、アガロースゲル中での電気泳動、２．６ｋｂフラグメントの切断 と精製をおこなった。次に、このフラグメントを、ＢａｍＨＩによって制限され 、再環状化を阻止するためにホスファターゼ処理されたｐＪＲ１ベクターにライ ゲートした。このようにして、ａｌｃＲ遺伝子はＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの 調節下に置かれ、ｎｏｓ３’ポリアデニル化シグナルがこの“３５Ｓ−ａｌｃＲ ”構築体に配置された。実施例２ キメラプロモーターを含有するａｌｃＡ−ＣＡＴレポーター構築体の作製 プラスミドｐＣａＭＶＣＮは３５Ｓプロモーターとｎｏｓ転写ターミネーター との間に細菌クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）レポーター遺 伝子を含有する（“３５Ｓ−ＣＡＴ”構築体）。 ａｌｃＡプロモーターをベクターｐＣａＭＶＣＮにサブクローン化して、“ａ ｌｃ Ａ−ＣＡＴ”構築体を作製した。ａｌｃＡプロモーターの一部と３５Ｓプロ モーターの一部との融合により、その調節下で遺伝子の発現を可能にするキメラ プロモーターを作製した。 図５はレポーター構築体の作製を説明する。ａｌｃＡプロモーターと３５Ｓプ ロモーターとは同じＴＡＴＡボックスを有し、これらのボックスはこれらの２プ ロモーターを組換えＰＣＲ方法を用いて一緒に結合させるために用いられた：即 ち、ａｌｃＡプロモーターからの２４６ｂｐ領域とｐＣａＭＶＣＮからのＣＡＴ 遺伝子の５’末端（３５Ｓプロモーターの−７０コア領域の一部を含有）とを別 々に増幅してから、ＰＣＲを用いて一緒にスプライスした。次に、この組換えフ ラグメントをＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩによって制限消化させた。ｐＣａＭＶ ＣＮベクターをＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩによって部分的に消化させ、次に、 適切なフラグメントが単離され、組換えフラグメントにライゲートされることが できるように電気泳動させた。 ライゲーション混合物をＥ．ｃｏｌｉ中に形質転換させ、富化寒天培地上で培 養した。プラスミドＤＮＡを生成コロニーからのミニプレプ(miniprep)によって 単離し、組換えクローンをサイズ電気泳動(size electrophoresis)と制限マッピ ングによって回収した。適切な組換え体が回収されたことを検査するために、ラ イゲーション結合を配列決定した。実施例３ 遺伝子構築体 我々は図６に要約した下記構築体を作製した： ベクター１は、タバコモザイクウイルスω配列翻訳エンハンサー（ＴＭＶ）Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＣｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子と、ノポリ ン(nopoline)シンターゼ（ｎｏｓ）ターミネーターとに融合した強化３５Ｓ Ｃ ａＭＶプロモーターを含有する。 ベクター２は、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓＣｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子をＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ ＣｒｙＶ遺伝子に置換した以外は、ベクター１と同 じである。ベクター３ は、３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターから駆動されたＡｓｐｅｒｇｉｌ ｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓからのａｌｃＲ調節タンパク質遺伝子と、ａｌｃＡプ ロモーター領域と、ＴＭＶエンハンサーＣｒｙＩＡ（ｃ）と、ｎｏｓターミネー ターとを含有する。ベクター４ は、ＣｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子をＣｒｙＶ遺伝子に置換した以外は、ベ クター３と同じである。 ＣｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子はＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエン ドトキシンをコードする最適化Ｌｅｐｉｄｏｔｅｒａ特異性合成配列であり、図 ７と８に説明される。この配列はＭｉｃｈｉｇａｎ州立大学、Ｐａｍｅｌａ Ｇ ｒｅｅｎ研究室から得られた。 ＣｒｙＶ遺伝子はＣｏｌｅｏｐｔｅｒａｎとＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎの幼虫に とって殺昆虫性の、新規なＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓエン ドトキシンであり、我々の国際特許公報第ＷＯ９０／１３６５１号に説明される 。このＣｒｙＶ遺伝子は、植物コード使用のために最適化された修飾合成配列で あり、ＲＮＡ不安定性領域を除去されている。これは図９と１０に説明する。実施例４ ベクター調製ベクター１ ：構成的ＣｒｙＩＡ（ｃ） ＸｈｏＩ部位に隣接したＳａｌＩ部位を添加し（順方向オリゴヌクレオチドを 参照）、ＮｃｏＩ部位を破壊し、逆方向オリゴヌクレオチドにＳａｌＩとＢｇｌ ＩＩ部位を加えることによって、ｐＭＪＢ１中のＴＭＶω配列を増幅するために （図９参照）、ＰＣＲプライマーを設計した。順方向オリゴヌクレオチド（配列番号：１） ＳａｌＩ 逆方向オリゴヌクレオチド（配列番号：２） 鋳型上のｐＭＪＢ１プラスミドＤＮＡを用いて順方向プライマーと逆方向プラ イマーとによってＰＣＲをおこなった。得られたＰＣＲ産物をｐＴＡｇベクター （ＬｉｇＡＴｏｒキット，Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓ）にクローン化し、次に、これ をＡｓｐ７１８とＸｈｏＩ消化によって放出し、ＸｈｏＩ／Ａｓｐ７１８消化ｐ ＭＪＢ１にクローン化して（図１０）、ｐＭＢＪ３を形成した。ｐＭＪＢ１はＣ ａＭＶ３５プロモーターを含有するｐＩＢＴ２１１に基づくものであり、タバコ エッチ(tobacco etch)ウイルス５’非翻訳リーダーに代わるタバコモザイクウイ ルス翻訳エンハンサー配列に結合した二重エンハンサーを有し、ノパリンシンタ ーゼポリ（Ａ）シグナル（ｎｏｓ）を末端に有する。 ＣｒｙＩＡ（ｃ）合成遺伝子をＢｇＩ ＩＩ ＢａｍＨＩフラグメントとして 切断し、ｐＭＪＢ３にクローン化する。強化された３５ＣａＭＶプロモーターＴ ＭＶω配列と、ＣｒｙＩＡ（ｃ）と、ｎｏｓターミネーターとを含有するフラグ メントを、ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩとを用いて単離した。得られたフラグメ ントをＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ切断ｐＪＲＩｉにライゲートして（図１２） 、Ｂｉｎ１９に基づく植物形質転換ベクターを作製した。ベクター２ ：構成的ＣｒｙＶ ｐＭＪＢ３をＨｉｎｄＩＩＩによって切断して、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ −ＨｉｎｄＩＩＩリンカーを挿入した。得られたベクターを次にＢａｍＨＩによ って切断し、ＢａｍＨＩフラグメントとしてＣｒｙＶ遺伝子を含有するフラグメ ントを挿入した。ＣｒｙＶ遺伝子を制限酵素消化と配列決定との組合せを用いて 、方向を決定した(orientated)。得られたベクターから、強化３５ＣａＭＶプロ モーターと、ＴＭＶω配列と、ＣｒｙＶ遺伝子と、ｎｏｓターミネーターとを含 有する、ＥｃｏＲＩフラグメントをＪＲＩＲｉＭＣＳ、ｐＵＣ多重クローニング 部位を含有するＢｉｎ１９に基づくベクターに移した。ベクター３ ：誘導ＣｒｙＩＡ（ｃ） ＣｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子を含有するｐＭＪＢ３をＳａｌＩによって切断して、 ＣｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子に融合したＴＭＶω配列を含有するフラグメントを放出 した。得られたフラグメントをＳａｌＩ切断ｐａｌｃＡ ＣＡＴにクローン化し 、制限酵素消化によって方向を決定した。ＴＭＶω配列に融合したａｌｃＡプロ モーターと、ＣｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子と、ｎｏｓターミネーターとを含有するフ ラグメントをＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断し、ＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐ３５Ｓａｌ ｃ ＲａｌｃＡｃａｔ、ａｌｃＲｃＤＮＡに融合した３５ＣａＭＶプロモーターを 含有するＢｉｎ１９に基づくベクターに移したが、ａｌｃＡｃａｔレポーターカ セットはＨｉｎｄＩＩＩ消化時に除去された。ベクター４ ：誘導ＣｒｙＶ ＣｒｙＶ遺伝子を含有するｐＭＪＢ３をＳａｌＩによって切断して、ＣｒｙＶ 遺伝子に融合したＴＭＶω配列を含有するフラグメントを放出した。得られたフ ラグメントをＳａｌＩ切断ｐａｌｃＡＣＡＴにクローン化し、制限酵素消化と配 列分析とによって方向を決定した。ａｌｃＡプロモーターＣｒｙＶ遺伝子とｎｏ ｓターミネーターとを含有する２フラグメントをＨｉｎｄＩＩＩによる消化によ って放出した。２個のＨｉｎｄＩＩＩフラグメントの三方向ライゲーションをお こなって、ａｌｃＡ ＣｒｙＶｎｏｓカセットを、ＨｉｎｄＩＩＩによって消化 されてａｌｃｃａｔカセットを除去されたｐ３５ａｌｃＲａｌｃＡｃａｔ中に挿 入した。カセットの適切な組み立てを制限酵素消化と、サザン・ブロッティング と、配列分析とによって確認した。実施例５ 植物形質転換 Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによる葉の形質転換 Ｂｅｖａｎ，１９８４によって述べられている方法に従って、形質転換をおこ なった。ＭＳ上で成長したタバコの３〜４週間経過無菌培養物（Ｎｉｃｏｔｉａ ｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ Ｓａｍｓｕｍ）を形質転換のために用いた。葉の 縁を切断し、葉を小片に切断した。次に、これらをインサート、サスペンジョン （菌株ＬＢＡ４４０４）と共にｐＪＲ１ＲＩプラスミドを含有する形質転換Ａｇ ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞中に２０分間入れた。小片をＮＢＭ培地（１ｍｇ／ ｌの６−ベンジルアミノプリン（６−ＢＡＰ）と、０．１ｍｇ／ｌのナフタレン 酢酸（ＮＡＡ）とを補充したＭＳ培地）を含むプレートに載せた。２日間後に、 カルベニシリン（５００ｍｇ／ｌ）とカナマイシン（１００ｍｇ／ｌ）とを補充 したＮＢＭ培地を含有する培養ポットに、外植片を移した。５週間後に、１苗条 (shoot)/葉ディスクを、カルベニシリン（２００ｍｇ／ｌ）とカナマイシン（１ ００ｍｇ／ｌ）とを補充したＮＢＭ培地上に移した。２〜３週間後に、根の付い た苗条を新鮮な培地に移した。必要な場合には、各苗条からの２切断物(cutting )を別々のポットに移した。１つは組織培養物ストックとして保存し、他方は根 付き(rooting)後に温室で成長させるために土壌に移す。 この形質転換方法を用いて、４ベクターをタバコに導入し、カナマイシン耐性 一次形質転換体(transformant)を作製した。構成的Ｃｒｙ１Ａ（ｃ）に関して５ ３個の一次形質転換体と、構成的ＣｒｙＶに関して５４個の一次形質転換体と、 誘導Ｃｒｙ１Ａ（ｃ）に関して７３個の一次形質転換体と、誘導ＣｒｙＶに関し て６２個の一次形質転換体とが存在した。実施例６ ＰＣＲ反応のための葉ＤＮＡ抽出 無菌条件下で成長させた３〜４週間経過植物から、葉サンプルを採取した。直 径約５ｍｍの葉ディスクを２００μｌの抽出緩衝液（０．５％ドデシル硫酸ナト リウム（ＳＤＳ）、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ト リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩），ｐＨ８）中で３０秒間磨砕し た。サンプルを１３，０００ｒｐｍにおいて５分間遠心分離し、その後に１５０ μｌのイソプロパノールを同量の上層に加えた。 サンプルを氷上に１０分間放置し、１３，０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心 分離し、乾燥させた。次に、これらを１００μｌの脱イオン水中に再懸濁させた 。２．５μｌをＪｅｐｓｏｎ等，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ ｇｙ Ｒｅｐｏｒｔ９（２），１３１〜１３８（１９９１）によって述べられて いる条件でのＰＣＲ反応に用いた。 得られた一次トランスジェニックをＰＣＲ分析によって試験して、全長導入遺 伝子を含有した植物を同定した。構成的Ｃｒｙ１Ａ（ｃ） 下記プライマー組合せを用いて、これらの抽出物に対して２回のＰＣＲ反応を おこなった： ＰＣＲ条件は９５℃ １．２分間、６２℃ １．８分間、７２℃ ２．５分間 及び７２℃における６分間の延長の３５サイクルであった。 ＰＣＲ条件は９５℃ ０．８分間、６１℃ １．８分間、７２℃ ２．５分間 及び７２℃における６分間の延長の３５サイクルであった。 ９個の一次形質転換体が両方のプライマー組合せに関するＰＣＲ産物を生じ； これらと２個のＰＣＲネガティブ系統(negative line)を温室内の７．５”ポッ トの土壌中に移植した。構成的ＣｒｙＶ 下記プライマー組合せを用いて、これらの抽出物に対して２回のＰＣＲ反応を おこなった： ＴＭＶＩ（上記参照） ＰＣＲ条件は９４℃ ０．８分間、６４℃ １．８分間、７２℃ ２．５分間 及び７２℃における６分間の延長の３５サイクルであった。 ＮＯＳ（上記参照） ＰＣＲ条件は９４℃ ０．８分間、５８℃ １．８分間、７２℃ ２．０分間 及び７２℃における６分間の延長の３５サイクルであった。 ２４個の一次形質転換体が両方のプライマー組合せに関するＰＣＲ産物を生じ ；これらと７個のＰＣＲネガティブ系統を温室内の７．５”ポットの土壌中に移 植した。誘導ＣｒｙＩＡ（ｃ） 下記プライマー組合せを用いて、これらの抽出物に対して３回のＰＣＲ反応を おこなった： ＮＯＳ 上記と同様 ＰＣＲ条件は９４℃ １．０分間、６０℃ １．０分間、７２℃ １．５分間 及び７２℃における６分間の延長の３５サイクルであった。 プライマー組合せＴＭＶＩ／ＣＲＹ１Ａ２Ｒ，ＣＲＹ１Ａ１／ＮＯＳを上記と 同様に用いた。４５個の植物が全てのプライマー組合せに関してＰＣＲ産物を生 じた；これらと２個のＰＣＲネガティブ系統とを温室内の６”ポットの土壌中に 移植した。誘導ＣｒｙＶ ６２個の一次形質転換体が作製されたが、ＰＣＲ分析は現在おこなわれていな い。実施例７ ウェスタンブロット分析 無菌条件下で成長した３〜４週間経過植物からの１２０ｍｇの葉を、フェノー ル化合物を吸着するための０．０６ｇのポリビニルポリ−ピロリドン（ＰＶＰＰ ）と０．５ｍｌの抽出緩衝液（１Ｍ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ エチレンジアミン−テトラアセテート）、５ｍＭ ＤＴＴ（ジチオトレイトール ）、ｐＨ７．８）中で４℃において磨砕した。さらに２００ｍｌの抽出緩衝液を 加えた。サンプルを混合し、４℃において１５分間遠心分離した。上清を取り出 し、タンパク質濃度を、基準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いるＢｒ ａｄｆｏｒｄ分析によって測定した。サンプルを必要時まで−７０℃に保存した 。 ３３％ｖ／ｖＬａｅｍｍｌｉ染料（９７．５％Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（６２． ５ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ、１０％ｗ／ｖスクロース、２％ｗ／ｖＳＤＳ、ｐＨ ６．８）、１．５％ピロニンＹ及び１％ｂ−メルカプトエタノール）を含む２５ ｍｇのタンパク質のサンプルを、２分間沸騰させた後に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ド デシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲル（１７．７％３ ０：０．１７４アクリルアミド：ビスアクリルアミド）上に装填させた。 翻訳産物を下記緩衝液（１４．４％ｗ／ｖグリシン、１％ｗ／ｖＳＤＳ、３％ ｗ／ｖＴｒｉｓ Ｂａｓｅ）中で電気泳動によって分離した。次に、これらを下 記ブロッティング緩衝液（１４．４％ｗ／ｖグリシン、３％ｗ／ｖＴｒｉｓ Ｂ ａｓｅ，０．２％ｗ／ｖＳＤＳ、２０％ｖ／ｖメタノール）中での４０ｍＶにお ける一晩のエレクトロブロッティング方法（Ｂｉｏｒａｄユニット）を用いてニ トロセルロース（Ｈｙｂｏｎｄ−ＣＯ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に移した。 新たにブロットされたニトロセルロースを０．０５％ＣＰＴＳ（銅フタロシア ニンテトラスルホン酸、四ナトリウム塩）と１２ｍＭ ＨＣｌ中で染色すること によって、タンパク質の等しい装填量を検査した。次に、これらのブロットを１ ２ｍＭ ＨＣｌ溶液中で２〜３回すすぎ洗いし、過剰な染料を０．５Ｍ ＮａＨ ＣＯ₃溶液によって５〜１０分間除去し、その後に、脱イオン水中ですすぎ洗い することによって脱色した。フィルターを５％ｗ／ｖＢＳＡを含有するＴＢＳ− Ｔｗｅｅｎ（２．４２％ｗ／ｖＴｒｉｓ ＨＣｌ、８％ｗ／ｖＮａＣｌ、５％Ｔ ｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート）、ｐＨ７．６） によって１時間ブロックした。次いで、それらを２％ｗ／ｖＢＳＡを補充したＴ ＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中で２０分間洗浄した。一次抗体としてのＣｒｙＩＡ（ｃ）又 はＣｒｙＶ抗血清の１：２０００希釈と、ホースラディッシュペルオキシダーゼ （ＨＲＰ）に結合した、二次抗体としてのウサギ抗ウサギ抗血清の１：１０００ 希釈とによって間接的免疫検出(indirect immunodetection)をおこなった。過剰 な抗血清は２％ｗ／ｖＢＳＡを補充したＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎによって洗浄した。 ＥＣＬ（強化化学発光）検出をＡｍｅｒｓｈａｍが述べているプロトコールを用 いておこなった。膜を上述した溶液中でさらに洗浄することによって、バックグ ラウンドを除去した。膜を次にＥＣＬ検出に付した。Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎ ｓｉｓ 遺伝子の発現レベルの推定をＬＫＢ２２２２−０２０Ｕｌｔｒｏｓｃａｎ ＸＬレーザーデンシトメーター（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上でおこなった。ヘリ ウム−ネオンレーザービーム（波長６３３ｎｍ）でオートラジオグラフ上の２． ４ｍｍ幅の帯を、翻訳産物に相当する帯の中央において走査した。各ピークを、 ビーム位置の吸光度関数の曲線から内部ソフトウェアによって測定されたその面 積によって特徴づけた。実施例８ ノザンブロット分析 ２．２Ｍホルムアルデヒドを含有する１．２％アガロースゲル上で、全ＲＮＡ を分画した。電気泳動後に、ＲＮＡを２０Ｘ ＳＳＰＥ中での毛管ブロッティン グによってＨｙｂｏｎｄ−Ｎ膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上に移した。ＲＮＡを組合 せＵＶ層結合(strata linking)（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）と８０℃における２０ 分間の焼成とを用いて膜に固定した。ＥｃｏＲＩによる消化によってｐＢｌｕｅ ｓｃｒｉｐｔＳＫ^-から切断されたｃＤＮＡプローブを、ＦｅｉｎｂｅｒｇとＶ ｏｇｅｌｓｔｅｉｎが述べているランダムプライミングプロトコールを用いて、³² ＰｄＣＴＰによって標識した。プレハイブリダイゼーションを５Ｘ ＳＳＰＥ 、０．１％ＳＤＳ、０．１％Ｍａｒｖｅｌ（ドライミルク粉末）、１００ｍｇ／ ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で６５℃において４時間実施した。ハイブリダイゼー ションは標識プローブを含有する同じ緩衝液中で６５℃において１２〜２４時間 行った。フィルターを６５℃において３ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で３０分間 洗浄し、０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて３０分間１回洗浄してから、 −８０℃においてオートラジオグラフィーした。 昆虫食餌試験 本発明の構築体を含有するトランスジェニック植物の葉を昆虫の幼虫に誘導物 質の存在下及び不存在下（対照として）の両方で与えることによって、本発明の 効果を便宜的に試験することができる。実施例９ 一次スクリーニング 植物から葉を採取し、多くの１ｃｍ²葉小片を切り取ることによって、一次ス クリーニングをおこなった。レプリカ（ｒｅｐｌｉｃａ）を別に０．７５％寒天 上に置き、それぞれ、約１０個の滅菌Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ 卵を寄生させた(infested)。葉ディスクを覆って、２５℃、７０％ＲＨにおいて ５日間インキュベートしてから幼虫食餌の影響を評価した。葉損傷に０．５増分 で ０〜２の範囲のスコアを割り当てた；２は葉損傷なし（完全な昆虫食餌からの保 護）を意味し；０は葉ディスクが完全に食されたことを意味する。 全ての構成的Ｃｒｙ１Ａ（ｃ）組織培養物一次形質転換体と野生型タバコ（ｗ ｔ ｔｏｂａｃｃｏ）からの葉を採取して、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃ ｅｎｓ に対する効果を上述したように試験した。結果は以下の表２に示す： 典型的なバイオアッセイ実験では、野生型（ｗｔ）タバコは主として０．５未 満の平均スコアを生じた。実施例１０ 一次スクリーニング−再テスト １１個の温室成長構成的Ｃｒｙ１Ａ（ｃ）植物と野生型タバコとを再試験した 。これは、組織培養後の３週間にわたって温室条件下の土壌中で成長した構成的 Ｃｒｙ１Ａ（ｃ）植物もＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓによる葉損傷 の低下を示すことを実証するためであった。 実施例１１ ＣｒｙＶ一次形質転換体による一次スクリーニング 構成的ＣｒｙＶ一次形質転換体と野生型タバコとからの葉を上記方法によって 試験した。切断した葉小片が受けた損傷を以下の表４に記録する。 実施例１２ 二次スクリーニング 一次スクリーニングから得られたデータを実証するために、トランスジェニッ ク系統に関して第３齢期幼虫を用いて大きい葉片上で二次分析をおこなった。 タバコ葉を植物から切り取り、氷上に１時間まで貯蔵した。４０ｍｍ直径の葉 ディスクを切り取り、クチクラ側を下にして、５０ｍｍプラスチックポット中の ３％寒天上に置いた。ＬＳＵ人工餌で５日間２５℃において飼養された第３齢期Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａを秤量して、各葉ディスク上に、１匹／葉で寄生さ せた。この寄生(infestation)後に、ポットに蓋を載せ、ポットを散乱光下で２ ５℃において貯蔵した。３日間後に、死亡率、発育段階及び食された葉ディスク ％に関して処理を評価した。幼虫を寄生時と３日間後に秤量した。 実施例１３ 誘導殺虫活性 ６”ポット中の４５誘導Ｃｒｙ１Ａ（ｃ）ＰＣＲポジティブ系統、２ＰＣＲネ ガティブ系統及びｗｔタバコを１００ｍｌの５％エタノールによって根ドレンチ した。２８時間後に、４枚のレプリカの小さい葉を採取し、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ 卵を寄生させた。結果は下記に示す（表６）。エタノールの 存在下で成長させた４５系統のうちで、６６％は一次スクリーニング時にＨｅｌ ｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓに対する完全な耐性を示した。これらの植物 が誘導可能であり、構成的発現体ではないことを実証するために、８日間後に７ 種の高スコア系統から葉を採取し、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ卵 を寄生させた。３５ＳａｌｃＲａｌｃＡスイッチプロモーターによって駆動され るレポーター遺伝子からの以前のデータは、ＣＡＴタンパク質レベルが２４／４ ８時間にピークに達し、４８時間後は下降することを示した（図１）。他のデー タ（示さず）は、誘導から９日間後にＣＡＴタンパク質が検出されないことを実 証した。 表７は、エタノール刺激の不存在下では死亡率レベルが野生型対照によって見 られる死亡率レベルに匹敵すると判明したことを実証する。 対照としての構成的ＣｒｙＩＡ（ｃ）系統１０と野生型タバコと共に、昆虫食 餌に対する誘導の影響を試験するための二次スクリーニングのために、数系統を 選択した。各系統の１０枚の葉を一次形質転換体から、それらが１００ｍｌの５ ％エタノールによる根ドレンチングによって誘導されてから１２日間後に採取し て、蓋付き５０ｍｍポット中の３％寒天上に置いて、２５℃、６０％湿度におい て一晩インキュベートした。Ｃｒｙ１Ａ（ｃ）タンパク質の発現は１２日間後に 低いか又は検出不能であると予想された。次に、植物を１００ｍｌの５％エタノ ールによって根ドレンチングした。２２時間後に、葉を切断し、１０枚の４０ｍ ｍ葉を取り出し、蓋付き５０ｍｍポット中の３％寒天上に置いた。５枚の非誘導 葉ディスクと５枚のエタノール誘導葉ディスクに第３齢期Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ ｚｅａ を寄生させ、各々の５枚に、上述のように飼養したＨｅｌｉｏｔｈｉｓ ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ を寄生させた。表８は、野生型対照がエタノールの存在下で も不存在下でも食された葉ディスクの高い割合を示すが、３５Ｓ対照が両方の化 学的処理法(chemical regime)下で良好な昆虫抑制を示すことを実証する。Ａｌ ｃＣｒｙＩＡ（ｃ）構築体を含有するトランスジェニック系統は、エタノール処 理の不存在下では不良な昆虫抑制を示した。表８は、エタノールによる誘導が３ ５ＳＣｒｙＩＡ（ｃ）対照に見られる昆虫抑制に匹敵する昆虫抑制を生じること を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，Ｈ Ｕ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．化学的に誘導可能な植物遺伝子発現カセットであって、ａｌｃＲ遺伝子 から誘導され、調節タンパク質をコードする調節配列に機能的に結合した第１プ ロモーターと、昆虫を殺傷するタンパク質をコードするターゲット遺伝子又はそ の発現が、昆虫を殺傷する代謝産物を産生する代謝経路を誘導するターゲット遺 伝子に機能的に結合した誘導プロモーターとを含み、誘導プロモーターが有効な 外因性誘導物質の存在下で調節タンパク質によって活性化されるため、誘導物質 の供給がターゲット遺伝子を発現させる前記植物遺伝子発現カセット。 ２．ターゲット遺伝子が経口的に活性な殺虫性タンパク質をコードする、請 求項１記載の化学的に誘導可能な植物遺伝子発現カセット。 ３．経口的に活性な殺虫性タンパク質がＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇ ｉｅｎｓｉｓ δエンドトキシンの少なくとも一部である、請求項２記載の化学的 に誘導可能な植物遺伝子発現カセット。 ４．誘導プロモーターがａｌｃＡ遺伝子プロモーターに由来する、請求項１ 〜３のいずれかに記載の植物遺伝子発現カセット。 ５．誘導プロモーターがキメラプロモーターである、請求項１〜４のいずれ かに記載の植物遺伝子発現カセット。 ６．請求項１〜５のいずれかに記載の植物遺伝子発現カセットを含有する植 物細胞。 ７．植物遺伝子発現カセットが植物ゲノム中に安定に組み込まれた、請求項 ６記載の植物細胞。 ８．請求項６又は請求項７のいずれかに記載の植物細胞を含む植物組織。 ９．請求項６又は請求項７のいずれかに記載の植物細胞を含む植物。 １０．請求項９記載の植物から誘導される植物。 １１．請求項９又は請求項１０のいずれかに記載の植物に由来する種子。 １２．請求項１〜５のいずれかに記載の植物遺伝子発現カセットによって植 物細胞を形質転換することを含む、昆虫抑制方法。