CZ36998A3 - Rekombinantní molekuly DNA pro chemicky indukovatelnou expresi proteinu s insekticidním účinkem v rostlinách - Google Patents

Rekombinantní molekuly DNA pro chemicky indukovatelnou expresi proteinu s insekticidním účinkem v rostlinách Download PDF

Info

Publication number
CZ36998A3
CZ36998A3 CZ98369A CZ36998A CZ36998A3 CZ 36998 A3 CZ36998 A3 CZ 36998A3 CZ 98369 A CZ98369 A CZ 98369A CZ 36998 A CZ36998 A CZ 36998A CZ 36998 A3 CZ36998 A3 CZ 36998A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
plant
gene
promoter
inducible
recombinant dna
Prior art date
Application number
CZ98369A
Other languages
English (en)
Inventor
Ian Jepson
Jacqueline Ann Mary Paine
Original Assignee
Zeneca Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zeneca Limited filed Critical Zeneca Limited
Publication of CZ36998A3 publication Critical patent/CZ36998A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8237—Externally regulated expression systems
    • C12N15/8238—Externally regulated expression systems chemically inducible, e.g. tetracycline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8286—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for insect resistance
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Insects & Arthropods (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Rekombinantni molekuly DNA pro chemicky indukcv«telnou expresi proteinu s insekticidním účinkem v rostlinách
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká rekombinantnich molekul DNA. a rostlin tyto molekuly obsahujících. Zvláště se týká promotorových sekvencí a jejich použití pro expresi genů, které souvisí s insekticidní aktivitou rostlin.
Dosavadní stav techniky
Pokroky v rostlinné biotechnologii vedly k vytvoření transgenních rostlin, které jsou chráněné proti napadení larvami hmyzu.
Mnohé organismy produkují proteiny, které jsou škodlivé pro hmyz. Jedním z nich je Bacillus thuringiensis, produkující krystalický protein δ-endotoxin, který po pozření zabíjí larvy hmyzu, přitom však není toxický pro savce. Je proto velmi užitečný jako insekticid v zemědělství. Mnoho kmenů B. thuringiensis aktivně účinkuje proti hmyzím škůdcům a geny kódující hmyzí endotoxiny byly charakterizovány. 5endotoxiny z B. thuringiensis zahrnují takové toxiny, které jsou specificky insekticidní pro larvy motýlů - řád Lepidoptera (např. proteiny typu Cryl) nebo brouků - řád Coleoptera (např. proteiny typu CrylII) anebo proteiny s dvojí specifitou proti larvám obou řádů Lepidoptera i Coleoptera (např.CryV). Chimérické proteiny, obsahující alespoň část δ-endotoxinu z B. thuringiensis byly navrženy s cílem do určité míry změnit některé vlastnosti endotoxinu, např. rychlost usmrcováni. Transgenní rostliny exprimující hmyzí endotoxiny jsou již také známy.
Ve kódí τη o '“'Ό \uje genový thuringiensis r na jako žíná metabolická
• » s insekticidnim systém, j sou k produkci kde geny, např.
δexprimovány specifické indukována metabolitů j ej ichž proti hmyzu δ-endotoxinů thuringiensis ) v rostlinách vede k exprese, t.j.
odolných škůdců. Tak např. exprese insekticidních genů může být indukována pouze v takovém okamžiku růstového období, kdy je ochrana vyžadována. Navíc lze využít i regulovatelné tolerance k hmyzu jako součást systému integrované ochrany rostlin, při němž se ošetření chemickou látkou indukující expresi insekticidního genu střídá se standardním ošetřením insekticidními pesticidy.
2. Existuje nebezpečí, že nadměrná exprese ze silného konstitutivního promotoru může negativně ovlivnit vývoj rostlin, a to může vést k poruchám klíčeni nebo kveteni anebo ke snížení výnosů. Indukovatelná exprese snižuje nebezpečí škodlivých vlivů, neboť transgen je exprimován jen po krátké období mimo citlivá vývojová stadia.
3. Chemická látka - induktor, účinkující jako spínač exprese, se může přidat do směsi se standardním insekticidnim • · prostředkem, který pak má dvojí účinek, vlastní chemický a genový, hubí tedy škůdce dvěma nezávislými způsoby.
Byl vyvinut indukovatelný genový regulační systém (genový spínač), založený na regulačním proteinu alcR z Aspergillus nidulans, který aktivuje expresi genů z promotoru alcA za přítomnosti určitých alkoholů a ketonů. Tento systém byl popsán v naší mezinárodní patentové přihlášce č. WO93/21334, která je uvedena v odkazech.
Genový aktivační systém alcA/alcR z houby Aspergillus nidulans je dobře charakterizovaný. Metabolická dráha očerněny ethanolu v A. nidulans je zodpovědná za rozklad alkoholů a aldehydů. Ukázalo se, že v této metabolické dráze se účastní produkty 3 genů. Geny alcA a alcR leží vzájemně si nablízku, v VII. vazebné skupině a aldA spadá do VIII. vazebné skupiny (Pateman J.H. a kol., 1984, Proč. Soc. Lond. B217: 243-264, Sealy-Lewis H.M. a Lockington R.A., 1984, Curr. Genet. 8: 253-259) . Gen alcA- kóduje ADHI v A. nidulans a aldA kóduje AldDH, druhý enzym zodpovědný za metabolickou utilizaci alkoholu. Exprese jak alcA tak i aldA. je indukována ethanolem a řadou dalších indukujících látek (Creaser E.H. a kol., 1984, Biochem. J. 255: 449-454) prostřednictvím transkripčního aktivátoru alcR. Gen alcR a ko-induktor jsou zodpovědné za expresi alcA a aldA, neboť řada mutací a delecí v genu alcR vede k pleiotropnímu sníženi aktivity ADHI a AldDH (Felenbok B. a kol., 1988, Gene, 73: 385-396, Pateman a kol., 1984, Sealy-Lewis H.M. a Lockington R.A., 1984). Protein ALCR aktivuje expresi z alcA tím, že sekvence váže na 3 specifická místa promotoru alcA (Kulmberg P a kol.,1992,J. Biol. Chem., 267: 21146-21153).
Gen alcR byl klonován (Lockington R.A. a kol., 1985, Gene, 33: 137-149) a sekvenován (Felenbok B. a kol., 1988). Exprese genu alcR je indukovatelná, autoregulovaná a podléhá a Arst H.N.,
1975,
Eur .
R.A. a kol.,
1987, a Kelly J.M.,
1989,
Kelly J.M. , 1991, protein obsahuje uspořádaných do dvoujaderného shluku • ·· ·· • * · ·· • · ·· • · · · ·· ···· (Kulmberg P a kol., 1991, FEBS Letts. 280:11-16). Tento shluk je podobný vysoce konzervativním vazebným doménám DNA pro transkripční faktory faktory GAL4 a LAC9 strukturou jetelového a Coleman
J.E., 1990,
Biocnemistry, 29:3023-5029, Halvorsen
Y.D.C. a
Struktura
ALCR je podobná tomuto t asymetrickou smyčku tvořenou mezi molekulami Cys-3 a Cys-4 a:
vlastni exoresi dvě
ypu az na to, ze obsahuj e
aminokyselinovými rezidui
CR sám pozitivně aktivuj e
í soecifická mi S ÍL 3 S V Θ
• f
1992,
Ca 1 1 oromotorové oblasti tři genů a 1 cR, alcA a aldA, metabolickou dráhu transkripce (Lockington a , 1987, Gwyne D. a kol., 1987,
Gene, 51:205-216, Pickett nidulans se dvě alkoholdehydrogenázy. ADHII se vyskytuje v mycéliu, když je houba pěstována na neindukuj icim médiu a podléhá reores i ethanolem. ADHII je kódována genem alcB kontrolována alďR (Sealy-Lewis
Lockington, alkoholdehydrogenáza byla také klonována komplementaci s kmenem S. cerevisiae adh-. Gen alcC spadá do vazebné skuoiny
VII, ale není ve vazbě ani s alcA ani s alcR.
c;
τ d_l že
A.
niďalans alkoholdehydrogenázu I (ADHI) kódovanou roste-li za přítomnosti různých alkoholů • ·
exprimuje enzym genem alcA pouze a ketonů.
Indukce je přenášena prostřednictvím regulačního proteinu (regulátoru) kódovaného genem alcR a konstitutivně exprimovaného. Je-li přítomen induktor (t.j. alkohol nebo keton), regulační protein aktivuje expresi genu alcA. V přítomnosti induktoru regulační protein také stimuluje svou vlastní expresi. To znamená, že v indukujících podmínkkách (t.j. je-li přítomen alkohol nebo keton) vzniká velké množství enzymu ADHI. A. naopak, gen alcA a tedy jeho produkt ADHI nejsou exprimovány v nepřítomnosti induktoru. Exprese alcA. a tvorba enzymu podléhá represi v přítomnosti glukózy.
Tudíž promotor genu alcA je indukovatelný promotor, aktivovaný regulačním proteinem alcR v přítomnosti induktoru (t.j. kombinací protein/alkohol nebo protein/keton). Geny alcR a alcA. (včetně příslušných promotorů) byly klonovány a sekvenovány (Lockington R.A. a kol, 1985, Gene, 33:137-149, Felenbok B. a kol., 1988, Gene, 73:385-396, Gwyne a kol., 1987, Gene, 51:205-216).
Geny pro alkoholdehydrogenázu (adh) byly zkoumány u určitých rostlinných druhů. U kukuřice a jiných obilovin je jejich exprese spouštěna anaerobními podmínkami. Promotorova oblast genu adh z kukuřice obsahuje regulační element o velikosti 300 bp, který je nezbytný pro expresi v anaerobních podmínkách. Avšak žádný ekvivalent regulačního proteinu alcR nebyl nalezen v žádné rostlině. Tedy genový regulační systém typu alcR/alcA není znám v rostlinách. Konstitutivní exprese genu alcR v rostlinných buňkách nevede k aktivaci endogenní adh.
• ·
Podstata vynálezu
Vynález poskytuje rekombinantní molekulu DNA - chemicky indukovatelnou genovou expresní kazetu - obsahující první promotor operativně spojený s regulační sekvencí odvozenou z genu alcR, který kóduje regulační protein, a indukovatelný promotor operativně spojený s cílovým genem kódujícím protein, který je škodlivý pro hmyz nebo jehož exprese indukuje metabolické dráhy vedoucí k metabolitům poškozujícím hmyz, přičemž indukovatelný promotor je aktivován regulačním proteinem v přítomnosti účinného exogenního induktoru, jehož aplikace spouští expresi cílového genu.
Pokud cílový gen kóduje protein poškozující hmyz, je výhodné, aby tento protein byl orálně aktivní. Příkladem takových orálně aktivních insekticidních proteinů jsou 5endotoxiny z B. thuringiensis a proto cílový gen kóduje alespoň část δ-endotoxinu z B. thuringiensis.
V naší práci se zjistilo, že genový spínač alcR/alcA je zvláště vhodný pro expresi genů, které kódují δ-endotoxiny z B. thuringiensis, a to přinejmenším z následujících důvodů: Systém genového spínače alcR/alcA byl vyvinut pro vysokou úroveň genové exprese. Navíc exprese regulačního proteinu alcR je přednostně zahajována ze silného konstitutivního promotoru jako je např. polyubichitin. Lze tak dosáhnout vysoké úrovně exprese transgenu ve srovnání s expresí ze silného konstitutivního promotoru jako např. promotoru 35 CaMV.
Obr. 1 ukazuje časový průběh exprese markerového genu (CAT) po aplikaci indukující chemické látky (induktoru). Tato studie ukazuje náhlý vzestup exprese (2 hodiny) CAT po aplikaci induktoru na list. Počáteční časná kinetika indukce je způsobena konstitutivní expresí regulačního proteinu, proto není patrno žádné zpoždění (lag fáze; zatímco procitá syntéza transkripčnich faktorů. Navíc byl· vybrán jednoduchý dvousložkový systém, který nezávisí na celém složitém systému signální transdukce.
Specifita systému alcR/aloA se testovala s celou škálou rozpouštědel běžných v agronomické praxi. Test na hydroponické kultuře mladých rostlin prokázal, že ethanol, butan-2-ol a cyklohexanon způsobily vysokou hladinu indukované exprese reporterového genu (Obr. 2). Naproti tomu, když se aplikovaly v podobě spreje na list různé alkoholy a ketony (jejichž seznam je uveden v tab. 1), běžné v agronomické praxi, pouze ethanol vedl k vysoké úrovni indukované genové aktivity reporterového genu významné, indukci transqenu při náhodném setkáni agrochemických není běžnou ti agrochemických genového spínače alcR/alcA v polních podmínkách.
TABULKA 1
1. Isobutylmethylketon 13 . acetonylaceton
2. Fenchon 14 . JF5969(cyklohexanon)
3. 2-heptanon 15. N-methylpyrrolidon
4 . Di-isobutylketon 16. polyethylenglykol
5. 5-methylhexanon 17 . propylenglykol
6. 5-methylpentan-2, 4-diol 18 . acetofenon
7. ethylmethylketon 19. JF4400(methylcyklohexanon
8. 2-pentanon 20. propan-2-ol
9. glycerol 21. butan-2-ol
10. . γ-butyrolakron 22. aceton
11. . diacetonalkohol 23. ethanol
12. . tetrahydrofurfurylalkohol 24. destilovaná H20
• ·
Žaar.y z ceié řady biotických a abiotických stresů, jako napr. mtexce patogenem, teplo, chlad, sucho, poranění a zaplaveni, neidukuje funkci genového spínače alcR/alcA. Navíc ani řada dalších chemických látek, které nejsou rozpouštědly, jako např. kyselina salicylová, ethylen, kyselina aoscisová, auxin, kyselina giberelová, a ani různé další agrochemikálie neindukovaly alcR/alcA systém.
Předkládaný vynález se neomezuje na žádný zvláštní endotoxin, mohou se uplatnit i chimérické endotoxiny.
První promotor je bud’ konstitutivní nebo tkáňově specifický, nebo může být vývojově programován anebo dokonce indukovatelný. Regulační sekvence, tedy gen alcR, se získá z Aspergillus nidulans, a kóduje regulační protein alcR.
Indukovatelný promotor je výhodně promotor genu alcA, který se získá z Aspergillus nidulans, nebo je to „chimérický promotor odvozený z regulačních promotoru alcA. a ústřední promotorové oblasti sekvencí genového aktivní v rostlinné buňce jakéhokoliv promotoru rostlinného genu).
Promotor alcA nebo odvozený „chimérický promotor je aktivován regulačním proteinem alcR po aplikaci alkoholového nebo ketonového induktoru.
Indukovatelný promotor se také dá odvodit z promotoru genu aldA, alcR nebo alcC, které se získají z Aspergillus nidulans.
Induktorem je jakákoliv účinná chemická látka (např. alkohol' nebo keton). Vhodné chemické látky pro použití s genovou expresní kazetou odvozenou ze systému alcR/alcA jsou ty, které uvádí Creaser a kol (1984, Biochem. J., 225:449454) jako např. butan-2-on (ethylmethylketon), cyklohexanon, aceton, butan-2-ol, 3-oxobutyrová kyselina, propan-2-ol a ethanol.
• ·
Genová expresní kazeta reaguje chemického induktoru a tím umožňuje externí aktivaci exorese cílového genu regulovaného kazetou.
Expresní kazeta ie silně regulována a je vhodná pro použití
Dvě části expresní kazety jsou teze re komb i na n t n í molekuly
DNA nebo tvoří rekombinantní molekuly
DNA.
První část regulačního genu nebo genovou sekvenci subklonovanou do expresního vektoru, ve kterém je ooeratrvnim promotorem.
část indukovatelného promotoru, který řídí expresi cílového genu ležícího po směru od promotoru. Regulační protein, který je produktem v přítomnosti vhodného induktoru aktivuie exoresi cílového
Ti
V praktickém použití je rekombinantní molekula DNA, nebe· rekombinantní molekuly DNA, obsahující expresní kazetu podle vynálezu, vnesena do rostliny transformací.
pro zvolenou rostlinu pomocí Agrobacterium nebo rostlinnou buňku, včetně infekce tumefacienns, který nese rekombinantní
Ti plasmidy, elektroporace, mikroinjekce buněk nebo protoplastů, transformace mikroprojektily a nebo transformace pylové láčky. Z úspěšné transformovaných buněk se regenerují celé rostliny, v jejichž genomu je trvale vložen nový jaderný materiál. Takto lze transformovat jak jednoděložné tak i dvouděložné rostliny.
Příklady rostlin, které mohou být takto geneticky modifikovány jsou polní plodiny, obiloviny, ovoce a zelenina jako např. řepka, slunečnice, tabák, cukrová řepa, bavlník, sója, kukuřice, pšenice, ječmen, rýže, čirok, rajčata, • ·
mangovník, broskvoň, jabloň, nrušeň, janodníx, banánovník, meloun, brambor, mrkev, hlávkový salát, hlávkové zelí a cibule.
Vynález dále poskytuje rostlinnou buňku obsahující rekombinantní molekulu DNA s genovou excresní kazetou oodle vynálezu. Tato genová expresní kazeta je vnesena transformací a trvale inkorporována v rostlinném genomu. Vynález také poskytuje rostlinné pletivo nebo celou rostlinu obsahující takové transformované buňky, a také rostliny nebo semena z nich odvozené.
Vynález dále poskytuje způsob řízení genové exprese v rostlině zahrnující transformování rostlinné buňky rekombinantní molekulou DNA., která představuje genovou expresní chemicky indukovatelnou kazetu, obsahující první promotor operativně spojený s regulační sekvencí odvozenou z genu alcR, který kóduje regulační protein, a inaukovatelný promotor operativně spojený s cílovým genem kódujícím δendotoxin z B. thuringiensis, přičemž indukovatelný promotor je aktivován regulačním proteinem v přítomnosti účinného exogenního induktoru, jehož aplikace způsobí expresi cílového genu.
Různé výhodné znaky a provedeni předkládanho vynálezu jsou popsány v následujících příkladech a obrázcích, aniž by se provedení vynálezu omezovala pouze na tyto příklady.
Popis obrázků
Obr.l ukazuje časový průběh indukce po aplikaci 7,5% ethanolu u segregující populace AR10.
Obr. 2 ukazuje aktivitu reportérového genu CAT u homozygotní linie AR10-30 po namáčení kořenů v různých chemických látkách.
h p, -7 \ 7' • · 99
99999 • · 9 9 99
9 9 99
999999
Ocr. r ukazuje aktivitu reportérového genu
Linie AR10-30 po namáčeni kořenů v
CAT různých chemických znázorňuje vytvoření regulační prvek 35S.
znázorňuje vytvoření rekombinantni molekuly DNA rekombinantni molekuly DNA obsahui regulovatelného kcoru DNA. nesoucího odolnost proti hmyzu. Obr. 7 ukazuje sekvenci optimalizovaného genu (obsahuje ukazuje restrikční místa v optimalizovaného genu Cryla(c).
Obr. 9 ukazuje sekvenci optimalizovaného genu CryV.
Obr. 10 znázorňuje vektor DNA. o velikosti 5129 sekvenci bp
Obr. 11 ukazuje sekvenci vektoru pMJBl.
Obr. 12 je znázornění mapy vektoru pJRIi.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Vytvoření rekombinantni molekuly regulátoru alcR
Sekvence genomové DNA alcR byla publikována, což umožňuje izolaci vzorku cDNA genu alcR.
cDNA. alcR byla klonována do expresního vektoru pJRl(pUC). pJRl obsahuje promotor 35S viru mozaiky květáku (CaMV). Tento promotor je konstitutivní rostlinný promotor a nepřetržitě exprimuje regulační protein. V expresním vektoru je použit polyadenylační signál nos.
·
4 4 · • 4 4 44 4 · · ···· • 4 4 4 · · · · · · · · ·
4 · 4 *4444 • 4 44 44 4444 4444
Obr. 4 ukazuje vytvoření regulační rekomioinantni molekuly s prvkem 35S ligací cDNA alcR do pJR1. Po částečném štěoeni klonu cDNA alcR enzymem BamHI následovala elektroforéza v agarózovém gelu a vyříznutí a ourifikace fracmentu o velikosti 2,6 Kb. Fragment byl poté ligován (vložen) do vektoru pJRl, který byl naštěpen BamHI a ošetřen fosfatázou, aby se zabránilo recirkularizaci. Gen alcR byl poté v této rekombinantní molekule „35S-alcR umístěn tak, že je řízen promotorem 35S CaMV a polyadenylačním signálem nos 3'.
Příklad 2
Vytvoření rekombinantní molekuly regulátoru alcR obsahující chimérický promotor
Plazmid pCaMVCN obsahuje reportérový gen bakteriální chloramfenikoltransferázy (CAT) mezi promotorem 35S a terminátorem transkripce (rekombinantní molekula „35S-CAT) .
Promotor alcA byl subklonován do vektoru pCaMVCN za tvorby rekombinantní molekuly „alcA-CAT. Fúzí části promotoru alcA a části promotoru 35S se vytvořil chimérický promotor, který umožňuje kontrolovat expresi genů.
Obr. 5 ukazuje vytvoření rekombinantní molekuly reportérového genu. Promotor alcA a promotor 35S mají totožné sekvence TATA, které byly použity ke spojení těchto dvou promotorů dohromady za použití metody rekombinantní polymerázové řetězové reakce (PCR): oblast 246 bp z promotoru alcA a 5' konec genu CAT z pCaMVCN (obsahující část -70 ústřední oblasti promotoru 35S) byly odděleně amplifikovány, a poté spojeny k sobě za použití PCR. Rekombinantní fragment byl poté štěpen BamHI a HindlII. Vektor pCaMVCN byl částečně štěpen BamHI a HindlII, a poté podroben elektroforéze, takže • · · · · · · · · · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·· ·· ···· ·· ·· mohl oyt izolován správný fragment a. iigován s rekombinantnim fragmentem.
na bonate agarové živné půdy. Plazmidová DNA byla izolována.
minipreparaci z výsledných kolonii a rekombinantni klony byly znovu zacnyceny podle velikosti při elektroforéze a restrikcnim mapováním. Pro kontrolu, zda byly zachyceny správné rekombinanty, byly sekvenovány oblasti ligačni spoj eni.
Přiklao 3
Rekombinantni gen
Vytvořili jsme následující rekombinantni geny - molekuly DNA., které jsou shrnuty na obrázku 6:
Vektor 1 obsahuje zesílený promotor 35S CaMV fúzovaný se sekvencí omega translačniho zesilovače viru tabákové mozaiky (TMV), genem Cry I A(c) z Bacillus thuringiensis a terminátorem nopalinsyntázy (nos).
Vektor 2 je totožný s vektorem 1 kromě toho, že gen Cry I A.(c) z B. thuringiensis je nahrazen genem Cry V z B. Thuringiensis.
Vektor 3 obsahuje gen regulačního proteinu alcR z Aspergilus nidulans řízeného promotorem 35S CaMV, oblast promotoru alcA, zesilovač TMV, Cry I A(c) a terminátor nos.
Vektor 4 je totožný s vektorem 3 kromě toho, že gen Cry I A(c) je nahrazen genem Cry V.
Gen Cry I A(c) je optimalizovaná syntetická sekvence specifická pro Lepidoptera kódující endotoxin z Bacillus thuringiensis a je ukázána na obrázcích 7 a 8. Sekvence byla získána z laboratoře Pamely Greenové, Michigan Statě University.
····· · · · ···· • 9 9 9 9 9 9 · · ···· · • 9 9 · ··· ··· ·· ·> 99 9999 99 99
Gen Cry V je nový endotoxin z Bacillus thuringiensis entomocidní pro larvy řádů Coleoptera a Lepidoptera, a je popsán v naši Mezinárodní patentové přihlášce č. WO 90/13651. Gen Cry V je modifikovaná syntetická sekvence, optimalizovaná pro genetické kódováni v rostlinách, ze které byly odstraněny oblasti nestability RNA. Je ukázána na obrázcích 9 a 10.
Příklad 4
Příprava vektoru
Vektor 1 - konstitutivní Cry 1 A(c)
Oligonukleotidové primery pro PCR byly navrženy tak, aby amplifikovaly sekvenci omega TMV v pMJBl (viz obrázek 9) s přidáním restrikčního místa Sáli sousedícího s místem Xhol (viz souhlasný oligonukleotid) a s porušením místa Ncol a přidáním míst Sáli a BglU do reverzního oligonukleotidu.
Souhlasný oligonukleotid(sekvence s identifikačním číslem 1) Sáli
5' CTACTCGAGTCGACTATTTTTACAACAATTACCAAC 3'
Xhol
Reverzní oligonukleotid (sekvence s identifikačním číslem 2) 5' CTAGGTACC GTCGAC GGATCCGTAAGATCTGGTGTAATTGTAAATAGTAATTG 3'
KpnI Sáli BamHI BglII
Se souhlasným a reverzním oligonukleotidovým primerem se za použiti plazmidové DNA z pMJBl jako templátu provedla PCR. Výsledný produkt PCR byl klonován do vektoru pTAg (LigATor kit, R&D systems), poté byl uvolněn štěpením s Asp 718 a Xhol a klonováon do plazmidu pMJBl štěpeného Xhol/Asp 718 (obrázek 10), čímž vznikl plazmid pMJB3. Plazmid pMJBl je založen na pIBT 211 obsahujícím promotor CaMV3oS s duplikovar ικ zesilovačem spojeným se sekvencí tabákové mozaiky nahrazující sekvenci viru skvrnitosti tabáku viru s ianálem nopalinsyntázy (nos).
Syntetický gen Cry 1 A(c) BglII-BamHI a klonován do pMJB3. byl izolován fragment obsahující sekvenci omega fragment byl EcoRI/HindlII zesílený oromotor
TMV, Cry ligován (obrázek nos.
12) a vytvořil tak transformační vektor založený na Bin 19.
Vektor 2 - konstitutivní Cry V pMJB3 byl štěpen HindlII a byla do něj vložena soojka HindlII - EcoRI - HindlII. Výsledný vektor byl poté štěpen BamHI a byl do něho vložen fragment BamHI obsahující gen Cry V. Gen Cry V byl orientován za použití kombinace restrikčního štěpení a sekvenování. Fragment EcoRI z výsledného vektoru, obsahující zesílený promotor 35 CaMV, sekvenci omega TMV, gen Cry V a terminátor nos, byl přenesen do JRIRíMCS, vektoru založeném na Bin 19 obsahujícím mnohonásobné klonovací místo z pUC18.
Vektor 3 - indukovatelný Cry 1 A(c) pMJB3 obsahující gen Cry 1 A(c) byl štěpen Sall, čímž se uvolnil fragment obsahující sekvenci omega TMV fúzovanou s genem Cry 1 A(c). Výsledný fragment byl klonován do palcA CAT štěpeného Sall a orientován restrikčním štěpením. Pomocí HindlII byl vystřižen fragment obsahující promotor alcA fúzovaný se sekvencí omega TMV, gen Cry 1 A{c) a terminátor nos, a byl přenesen do HindlII naštěpeném p35SaicRa2cAcat,
coz je vesioi založený na Bin 19 obsahující promotor 3o CaMV fúzovaný s cDNA alcR, s reportérovou kazetou alcAcat odstraněnou štěpením HindlII.
Vektor 4 - indukovatelný Cry V pMuB3 obsanujici gen Cry V byl štěpen Sáli, čímž se uvolnil fragment obsanujíci sekvenci omega TMV fúzovanou s genem Cry V. Výsledný fragment byl klonován do paicA CAT štěpeného Sáli a orientován restrikcním štěpením a sekvenační analýzou. Štěpením s HindlII byly uvolněny dva fraqmenty obsahující promotor alcA genu Cry V a terminátor nos. Byla provedena trojitá ligace dvou fragmentů HindlII tak, že se vložila kazeta alcA Cry V nos do p35alcRalcAcat naštěpeného HindlII a odstranila se kazeta alccat. Správné sestaveni kazety bylo potvrzeno restrikcním štěpením, Southernovým přenosem a sekvenační analýzou.
Příklad 5
Transformování rostlin
Tranformování listů pomocí Agrobacterium tumefaciens
Transformace byla provedena postupem, který publikoval Bevan 1984. Rostliny tabáku (Nicotiana tabacum cv. Samsum), staré 3 až 4 týdny, pěstované sterilně na médiu MS, byly použity pro transformaci. Okraje listů byly odříznuty a listy rozřezány na kousky. Kousky listu byly vloženy na 20 minut do suspenze buněk Agrobacterium tumefaciens (kmen LBA 4404) transformovaných plasmidem pJRlRI s inzertem. Kousky listů byly poté umístěny na misky s médiem NBM (t.j. médium MS doplněné o 6-benzylaminopurin (6-BAP) v koncentraci 1 mg/1 a kyselinu naftalenoctovou (NAA) v koncentraci 0,1 mg/1). Po dvou dnech byly explantáty přemístěny do kultivačních nádobek ·· ν· • · ·
·· • · ·· · • · · · · • φ · ♦ ·· • · s médiem ΝΒΜ s přídavkem antibiotik karbenicilinu (500 mg/1) a kanamycinu (100 mg/1). Po 5 týdnech byl 1 výhonek z každého listového disku přenesen na médium NBM s karbenicilinem (200 mg/1) a kanamycinem (100 mg/1) . Po dalších 2 až 3 týdnech byly kompletní regenerované rostlinky (prýt s kořeny) přemístěny na čerstvé médium a bylo-li třeba, výhonek byl rozdělen na 2 části, které byly umístěny do samostatných nádobek. Jeden výhonek pak byl udržován jako stálá tkáňová kultura a druhý byl regenerován v rostlinu, která byla přesazena do půdy a po zakořenění dále pěstována ve skleníku.
Tímto transformačním postupem byly do rostlin tabáku vneseny 4 vektory a byly regenerovány primární transformanty (t.j. 1. generace transformované rostliny) rezistentní ke kanamycinu. Bylo tak získáno 53 primárních transformant s rekombinantni molekulou DNA nesoucí konstitutivní CrylA(c), 54 transformant nesoucích konstitutivní CryV, 73 transformant s indukovatelným CrylA(c) a 62 nesoucích indukovatelný CryV.
Příklad 6
Extrakce listové DNA pro reakce PCR
Vzorky listů byly odebírány z rostlin starých 3 až 4 týdny, které rostly ve sterilních podmínkách. Listové disky o průměru 5 mm byly drceny po 30 sekund ve 200 μΐ extrakčního pufru (0,5 % dodecylsulfát sodný (SDS), 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (tris(hydroxymethyl)aminometan hydrochlorid), pH 8). Vzorky byly stočeny na centrifuze po dobu 5 minut ve 13 000 rpm, a poté bylo přidáno 150 μΐ isopropanolu ke stejnému objemu vrchní vrstvy.
Vzorky byly ponechány 10 minut na ledu, stočeny 10 minut ve 13 000 rpm a ponechány uschnout. Poté byly resuspendovány • 9 · ve 100 μΐ deionizované vody. 2,5 μΐ bylo ccužito orc PCR, provedenou za podmínek poosaných Jecscnem et al., Planí Molecular Biology Report 9(2), 131-138, 1991.
Primární transgenni rostliny byly testováno pomoci PCR, aby se rozpoznaly rostliny, které obsahovaly zransgen v siné délce:
Konstitutivní Cry 1 A(c)
Na extraktech z těchto rostlin se prováděly dvě reakce PCR za použití následujicích párů primerů:
TMV1 5' CTA CTC GAG TCG ACT ATT TTT AGA ACA ATT ACC AAC (sekvence s identifikačním číslem 3)
CRY1A2R 5' CGA TGT TGA AGG GCC TGC GGT A (sekvence s identifikačním číslem 4)
Podmínky PCR byly: 35 cyklů, 95°C 1,2 min, 62°C 1,8 min a 72°C 2,5 min a konečné prodloužení řetězce po 6 min v 72°C. CRY1A1 5' GCA CCT CAT GGA CAT CCT GAA CA (sekvence s identifikačním číslem 5)
NOS 5' CAT CGC AAG ACC GGC AAC AG (sekvence s identifikačním číslem 6)
Podmínky PCR byly: 35 cyklů, 95°C 0,8 min, 62°C 1,8 min, 72°C 2,5 min a konečné prodloužení řetězce po 6 min v 72°C.
Devět primárních transformant, které poskytly produkty PCR pro obě sady primerů, byly spolu s dvěma PCR negativními liniemi vysazeny do půdy do květináčů o velikosti 7,5 palců (19 cm)a umístěny do skleníku
Konstitutivní Cry V
Na těchto extraktech se prováděly dvě reakce PCR za použití následujících párů primerů:
TMV1 (viz výše)
CRYV1R 5' GCT GTA GAAT GGT CAC CTG CTC CA (sekvence s identifikačním číslem 7) • ·
PoC: Tíincy PCR tyly: 35 c y ,< 1 ů, 94° C 0, 8 min, 64°C 1,8 mi η,
p o °r Q z 'Z Z , 0 min a prodloužení řetězce po 6 min v 72°C.
CRYVl 5 7 TGT ACk CCG ACG CCA T γγί 1 Cr GCA (sekvence s
identit i kačním číslem 8)
NOS (viz výš θ ΐ
Pod.· nínky PCR byly: 35 cyklů, 94° c 0, 8 min, 58°C 1,8 min,
7 2 ° C 2,0 min a prodloužení řetězce po 6 min v 72°C.
produkty transformant poskytlo
PCR pak byly spolu se do půdy do květináčů o velikosti ve
Indukovatelný Cryl A(c)
Na těchto extraktech se prováděly tři reakce PCR za použiti následujících párů prímerů:
ALCR1 5' GCG GTA AGG CTT TCP. ACA GGC T (sekvence s identifikačním číslem 9)
NOS jako výše
Podmínky PCR byly: 35 cyklů, 94°C 1,8 min, 60°C 1,0 min, 72°C 1,5 min a prodloužení řetězce po 6 min v 72°C.
Páry prímerů TMV1/CRY1A2R, CRY1A1/NOS byly použity, jak je uvedeno výše.
Čtyřicetpět rostlin, které poskytly produkty PCR pro všechny sady prímerů, bylo spolu se dvěma PCR negativními liniemi vysazeno do půdy ve skleníku do květináčů o velikosti 6palců (15,2 cm).
Indukovatelný CryV
Vzniklo šedesátdva primárních transformant, ale až doposud nebyla provedena žádná analýza PCR.
• · ·
Přiklad 7
Analýza westernovým přenosem
120 mg pletiva z listu rostlin starých 3 až 4 týdny, které rostly ve sterilních podmínkách, bylo rozdrceno ve 4°C v 0,06 g polyvinylpolypyrolidonu (PVPP), aby se adsorbovaly fenolové sloučeniny a v 0,5 ml extrakčního pufru (1 M TrisHC1, 0,5 M EDTA (sodná sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové), 5 mM DTT (dithiotreitol) , pH 7,8). Poté se přidalo ještě 200 ml extrakčního pufru. Vzorky se promísily a poté stočily na centrifuze po 15 minut ve 4°C. Supernatant se odstranil a koncentrace proteinu se stanovila zkouškou podle Bradforda za použiti bovinního sérového albuminu (BSA) jako standardu. Vzorky byly uskladněny v -70°C až do doby použití.
Vzorky 25 mg proteinu s 33 % (objem/objem) barvy dle Laemmliho (97,5% Laemmliho pufr (62,5 mM Tris-HCl, 10% (hmotnost/objem) sacharóza, 2% (hmotnost/objem) SDS, pH 6,8), 1,5% pyronin y a 1% β-merkaptoethanol) byly po 2 minutách varu naneseny na 17,7% (30:0,174 akrylamidzbisakrylamid) gel SDS-PAGE (elektroforéza v polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným).
Produkty translace byly elektroforeticky odděleny v následujícím pufru (14,4% (hmotnost/objem) glycin, 1% (hmotnost/objem) SDS, 3% (hmotnost/objem) Tris-Baze). Poté byly přeneseny na nitrocelulózový filtr (Hybond-CO, Amersham) pomocí elektropřenosu (Biorad unit) v následujícím přenosovém pufru (14,4% (hmotnost/objem) glycin, 3% (hmotnost/objem) Tris-Baze, 0,2% (hmotnost/objem) SDS, 20% (objem/objem) methanol) při 40 mV přes noc.
Zda bylo naneseno stejné množství proteinu se kontrolovalo obarvením nitrocelulózového filtru těsně po ukončeni přenosu v 0,05% CPTS (čtyřsodná sůl Cu-ftalocyaninu » · * ·
Ί
tetrasulfonové kyseliny; a 12 ~A HC1. Poté byly filtry odbarveny 2 až 3 propláchnutími v roztoku 12 mM HC1 a přebytek barviva odstraněn roztokem 0,5 M NaHCO3 po dobu 5 až 10 minut, pote následovio orociácnnutí v deionizované vodě. Filtry se blokovaly po 1 hodinu v roztoku TBS-Tween '2,42% (hmotnost/objem) Tris HC1, 81 (hmotnost/objem) NaCl, 5% Tween 20 (polyxyethylensorbitan monolaurat;, pH 7,6) obsahující 5% (hmotnost/objem; BSA. Poté byly 20 minut cromývány v roztoku TBS-Tween doplněném 2% (hmotnost/objem; BSA. Nepřímé imunodetekce se prováděly s antisérem Cryl A(c) nebo Cry V v ředění 1:2000 jako první protilátkou a s králičím orotikráličím antisérem v ředění 1:1000 jako druhou protilátkou, konjugovanou s křenovou peroxidázou (HRP). Jakýkoliv přebytek antiséra byl cdmyt TBS-Tween doplněném 2% (hmotnost/objem; BSA. Detekce ECD (zesílená chemíluminiscence} se prováděla za použiti protokolů popsaných firmou Amersham. Jakékoliv pozadí bylo odstraněno dalším promývánim membrán v roztoku uvedeném výše. Poté byla provedena detekce ECL.
Stanoveni úrovně exprese genu z B. tnurinaiensis bylo provedeno na laserovém denzitometru uKB 2222-020 Ultroscan XL (Pharmacia).
Helium-neonový laserový paprsek (vlnová délka
633 nm) na autoradiogramu prohlížel pás široký 2,4 mm uprostřed pásu odpovídajícího translačním produktům.
Každý vrchol byl charakterizován svou plochou, vypočtenou vnitřním programovým vybavením přístroje ze křivky závislosti absorbance na pozici paprsku.
Příklad 8
Analýza northernovým přenosem
Celková RNA byla rozdělena do frakcí na 1,2% agarózovém gelu obsahujícím 2,2 M formaldehyd. Po elektroforéze byla RNA přenesena na membránu Hybond-M (Amersham) kapilárním přenosem • · ·
c · v 20x SSPE. RNA tyla fixována na membrány kombinací ozářením UV světlem (Stratalink, Stratagene) a zapékáním 20 minut v 80°C. cDNA sondy vystřižené z pBluescript SK’ štěpením s EcoRI byly označeny izotopem 32PdCTP pomocí náhodných primerů postupem popsanými Feinbergem a Vogelsteinem. Prehybridizace se prováděly v roztoku 5x SSPE, 0,1% SDS, 0,1% Marvel (sušené mléko), 100 mg/ml denaturované DNA lososího spermatu po 4 h v 65°C. Hybridizace se prováděly ve stejném pufru obsahujícím značenou sondu v 65°C po 12 až 24 hodin. Filtry byly promyty při 65°C v 3x SSC, 0,1% SDS po dobu 30 min a jednou v 0,5x SSC, 0,1% SDS po dobu 30 min před autoradiografií v -80°C.
Pokusy s hmyzími škůdci
Účinnost předkládaného vynálezu může být pohodlně testována sledováním toho, jak hmyzí larvy požírají listy transgenních rostlin obsahujících rekombinantní molekuly podle předkládaného vynálezu, a to jak v přítomnosti tak i v nepřítomnosti induktoru (kontrola).
Příklad 9
Primární sledování
Primární sledování se listů z vzorky byly umístěny listu byl Heliothis infikován odděleně v 25°C, virescens.
provádělo odebráním kousky velké 1 cm2. Jendotlivé na 0,75% agar a každý kousek sterilizovanými vajíčky inkubovány dnů zakryty a dobu 5 přibližně 10
Listové disky byly 70% relativní vlhkosti po zaznamenáním účinků larválního požírání, přiřazena škála v rozmezí od 0 do 2
Poškození listů před byla odstupňováno po
Stupeň 2 označuje nulové poškození listů (t.j.úplná ochrana
0,5.
• · · •i · t 1 · * · · ·· ·»·· před požíráním hmyzem je poskytnuta) a stupeň 0 znamená, že listový disk byl larvami úplně zlikvidován.
Listy ze všech tkáňových kultur primárních transformant konstitutivního Cryl A(c) a tabáku divokého typu byly odebrány a testovány s larvami Heliothis virescens, jak popsáno výše. Výsledky jsou ukázány v tab. 2:
TABULKA 2
Vzorky: PCR +/- A B C D E
35SCrylA(c) 1 1 1 2 2 2
2 Ί 1 1,5 1 1 r 5
3 0 0 0 0 0
/1 •i 1 z b 1 X 1 c n 1,5
5 PCR + 0 1,5 0 1,5 0
6 1,5 0 1 1,5 1,5
7 PCR + Λ z x_z 1,5 1,5 1,5 Ί C. X f
8 2 1,5 i Z 2
9 PCR + 2 2 1,5 2 2
10 1,5 2 Ί Ί 1 £ - t
1_1_ 0 1,5 0 0 0
12 0 0 0 0 1
13 2 2 0 n V; 3
14 1,5 1 0 0 0
15 2 1 2 0 0
16 PCR + 2 2 2 2 1,5
17 2 0 0 1 2
18 0 0 0 1,5 2
19 PCR + 1,5 1,5 1,5 0 1,5
20 PCR + 1,5 1,5 2 1,5 1,5
• · * · · · · · · « » · · · · · · • · · · · · v · • · · * · · · ·* ·♦ ··
Vzorky: PCR +/- A B c D E
21 c vy L· v 0
22 0, 5 r\ U p v 2 2
23 U 1 o 0, 5 0,5
24 X f — λ u 0 Cl v
25 2 1 1 2
26 _L 0 r> 1 1
27 n X -L ř 0 0 1,5 .n v
2 S PCR τ ± / xj 1, 5 1,5 1,5 1,5
2 9 o Γ\ u 1 X 1, 5
O c J u η c u n u t c: x , z 0
31 PCR + 1 o 1 c _U / sj 0 1,5
32 2 1 1,5 0 1,5
3 J 2 z 9 2 2
34 1 o u r\ u 1,5 2
35 0 2 0 1 1,5
36 2 C\ n 2 n
37 2 2 1,5 - ± f
38 PCR + 1,5 1, 5 1,5 1,5 2
39 1 , 5 r\ u r\ U 0 Ί
4 0 1 -i 1 0 0 0
41 0 0 1 Ί 1 0
42 zí 1,5 1,5 1,5 n Z
43 1,5 1,5 1,5 1,5 2
44 2 1,5 1,5 1,5 2
45 z z 1 0 0
46 0 2 0 2 1
47 2 2 2 0 0
divoký typ tabáku 1 -'•Λ z z 2 0
··· · · · · ♦ · · · • · · · · » · 9 · ·· ·
Í· · ♦ · · · · 9 ····· ··· «· · · ··· ·* ·· ·· ···« 4···
V typických biologických pokusech dává divoký typ tabáku převážně průměrné skóre méně než 0,5.
Přiklad 10
Primární sledování - opakováni
Jedenáct z konstitutivních Cryl A(c) rostlin pěstovaných ve skleníku a tabák divokého typu byly opětně testovány. Bylo to proto, aby se dokázalo, že konstitutivní Cryl A(c) rostliny, které rostly v půdě ve skleníkových podmínkách po dobu tří týdnů po tkáňové kultuře, ukazovaly také snížené poškození listů larvami Heliothis virescens.
TABULKA 3
vzorek a b c d e
35SCrylAíc) 6 V f 0,5 2 2 2
7 2 1 2 2 n Z
9 0,5 0,5 2 1 0,5
16 2 2 2 2 2
19 2 2 1,5 2 1,5
20 1,5 1 0 0,5 2
28 0,5 1,5 2 2 2
31 0 0 0 0 1,5
33 2 2 2 2 2
38 1 0 2 1
42 1 1 1 i 1_
divoký typ tabáku 0 0 0 0 1,5
• · · · ·
. ..» ♦ · *
999 · 9 ·· ··»·
Příklad 11
Primární sledování primárních transformant CryV
Způsobem popsaným výše byly testovány listy primárních transformant konstitutivního Cry V a divokého typu tabáku. Poškození způsobené na vyříznutých kouscích listů je zaznamenáno níže v tabulce 4.
TABULKA 4
vzorek PCR +/- a b c d
35SCryV 1 -U 0 0 0 P
2 0 0 0 0
3 1,5 0 1 u
Λ ~x -4- 0 0 0 0
5 0 0 0 0
6 0 r\ U r\ u /Λ u
7 -i- 0 0 r\ U ýj
8 4- 0 0 0 0
9 + 0 0 0 0
10 0 /-i u 0 n v
11 + 0 0 0 0
12 0,5 1 1 0,5
13 + 0 0 0 0
14 + 0 0 0 0
15 + 0 0 0 0
16 0 0 0 0
17 0 0 0 0
18 0 0 0 0
19 0 0 0 0
• *
é
9··Λ
vzorek PCR +/- a b c d
2 0 u u 0 0
21 n v Λ V Ω n v
O Z z + u rx u 0 0
23 0 Q 0 0
o /1 Δ. -s + n z p\ n v n v
i— z o + 0 0 0 0
2 6 + n U 0 r·. u 0
O 1-7 3. / n u n u n v n L·’
2 8 0 1 f 5 1
29 -r 0 0 0 0
o n S kJ n n v r\ U fk u
31 4~ 0,5 t— υ, o 0,5 0
32 + r\ u /Λ u 0 0
O o z υ n u u A U fk u
34 0 1! 5 0 0
35 0 0 0 0
36 n u n U rk u Λ u
37 0 0 0 1 z d
38 0 0 0 0
39 n u n u n U n U
40 0 0 0 0
41 + 0 0,5 0 1,5
A 4 Z r\ U r\ U 0 0
43 0 0 0 0
44 0 0 0 0
45 -r r\ U 0 r\ U υ
46 + 0 0 0 0
• ·
vzorek PCR +/- a b c d
47 0 0 0 0
4 8 -i“ 0 0 0 0
49 0,5 0,5 0 0
0 u 0 0 0 0
c 1 0 0 1 1
0 z 1 0,5 0, 5 0,5
-h Π Trrs/T. 7 — τ 7y~\ tclΌα Ku 0 0 0 1,5
Přiklad 12
Aby se ověřila data získaná z primárního sledování, provedlo se sekundární sledování poškození listů na větších kouscích listu z transgenních liniích za použití larev ve třetím larválním stadiu.
Listy tabáku byly odříznuty z rostliny a přechovány na ledu až po dobu jedné hodiny. Z listů byly vyřezány disky o průměru 40 mm. a umístěny, epidermis dolů, na 3% agar v plastových miskách o velikosti 50 mm. Larvy Heliothis zea chované na umělé výživě LSU po dobu pěti dnů ve 25°C, byly ve třetím larválním stadiu zváženy a použity k infikování listových disků, vždy jedna na disk. Po infikování byly misky uzavřeny víčkem a uskladněny ve 25°C pod rozptýleným světlem. Po 3 dnech byla vyhodnocena mortalita, vývojové stadium a kolik % listového disku bylo larvou sežráno. Larvy byly zváženy také po 3 dnech.
TABULKA 5
% POŠKOZENÍ DISKU
VZOREK A B C D E F G H I J
divoký typ tabáku 20 15 70 2 0 30 30 8 0 u 95
35SCrylA(c) 7 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <b
16 <5 <5 <5 <5 10 10 <5 <5 <5 <5
19 <5 1 n _L V 10 1 o _L V 3 1 u <5 <5 2 0
20 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5
28 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5 <5
29 20 <5 <5 30 25 25 30 25 2 5 Z 3
LARVÁLNÍ VÝVOJOVÉ STADIUM
divoký typ tabáku 4 3 0 3 3 3 4 3 ó 5
35SCrylA(c) 7 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
16 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
1 9 Q q 3 3 3 3 3 P 4
20 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
28 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3
29 4 3 3 5 4 4 4 4 3 3
MORTALITA
VZOREK A B c D E F G H I J
divoký typ tabáku L _L L L L L L L D L
35SCrylA(c) 7 L D r\ fy L D D D D D D
16 D D D D L L L L D L
19 D L L L L L D L L
20 u D U D D D L L D L
28 D XJ D D D D D L T D
29 L D L L L L L L T J-J
Přiklad 13
Indukovatelná insekticidní aktivita
Čtyřicetpět indukovatelných Cryl A(c) PCR pozitivních linií, dvě PCR negativní linie a divoký typ tabáku z květináčů velikosti 6 palců (15,2 cm), byly kořeny ponořeny ve 100 ml 5% ethanolu. 0 28 hodin později byly odebrány malé kousky listů ve 4 opakováních a infikovány vajíčky Heliothis virescens.
Výsledky jsou ukázány v tab. 6. Ze 45 linií rostoucích rezistenci při se dokázalo, přítomnosti etahanolu vykazovalo 66% plnou primárním sledování s Heliothis virescens. Aby rostliny byly opravdu indukovatelné a že neexprimovaly gen rezistence konstitutivně, byly o 8 dní později odebrány listy ze linií s vysokým skóre a infikovány vajíčky
Heliothis virescens. Předešlá data ze sledování reportérového genu řízeného spínacím promotorem
35SalcRalcA ukazovala, že hladiny aktivity proteinu CAT vrcholily za 24 až 48 hodin a byly na sestupu po 48 hodinách
♦ · · · · · · • · · ·· · · · · · • · * · · · · ·· · r · • · · · · · · · • · ·· ···♦ ·· ·· (obrázek 1) . Další data (neuvedena) ukazovala, že po 9 dnech po indukci nebyl protein CAT vůbec detekován.
Tabulka 7 ukazuje, že bez postřiku ethanolem byla úroveň mortality srovnatelná s úrovní pozorovanou u kontrolního divokého typu.
TABULKA 6
Heliothis virescens na ALC CrylA(c)
primární transgenní rostliny ze skleníku
kořeny v 5% ethanolu 28 hodin před testem.
vzorek PCR +/- a b c d
3 5 S C v V 1 + 1 2 2 2
2 -h 2 2 2 2
3 4- 0 0 0 1,5
4 -r 2 2 2 n Z
5 + 0,5 0,5 0,5 i
6 - 2 1 0,5 0
7 0 2 1 z 2
8 + 2 2 2 2
9 + 2 2 2 2
10 + 2 2 2 2
11 + 2 2 2 2
12 + 2 2 2 2
13 -U 2 2 2 2
14 + 2 2 2 2
15 + 2 2 2 2
16 + 2 2 2 2
17 + 2 2 2 2
18 + 2 2 2 2
19 + 2 2 2 2
• · · · ♦ · » · · · · • · · · · · · · · · · · • · » ··· · 9 « ···« · «••8 · · · ··· ·* ·· ·· ···· ·· ♦·
vzorek PCR +/- a b c d
20 4- 2 'Λ Z 2
21 4- 0 0 Ό 1
22 + 0, 5 2 Ό f 2
23 ~T 2 2 2 2
24 + 2 2 2 2
25 4- 2 2 2 2
26 + 2 2 2 2
27 1 2 2 9
28 “Γ 0,5 2 2 2
29 -l· 2 2 2 2
30 + 2 2 --X z 2
31 + 2 2 1 2
32 4- 2 2 2 2
33 + - 2 2 2
34 -r 2 2 2 2
35 + 1 2 2 2
3 6 2 2 2 1
37 4- 0 0,5 0 4
38 - 0,5 0,5 0,5 0,5
39 4- 2 2 2 2
40 -Γ z 2 2 2
41 + 2 2 2 2
42 4- 2 2 2 2
43 4- 2 2 2 2
44 + 2 z 2 z
45 + 2 2 2 0,5
46 4- 2 2 2 2
47 + 1 2 2 2
divoký typ tabáku 0 0, 5 0 0,5
ΤΑΒϋοΚΑ 7
INDUKOVANÉ NEINDUKOVANÉ
í --N v> 4- 4 PCR-/- 3 b (2 d ident it y pOR4_/_ a b c d
17 - 2 2 2 2 17 + 0, 5 0,5 0,5 1 _L
32 2 2 2 2 32 + 1,5 1 7 ± 0,5
39 2 2 2 2 39 _L 2 2 0,5 0, 5
40 a 2 2 2 2 40 4- 0,5 0, 5 0,5 0,5
41 T 2 2 2 2 41 0,5 2 0 1
43 - 2 2 2 2 43 -μ 0,5 0,5 0,5 0,5
44 -k 2 2 2 2 44 + 0,5 0 0,5 0,5
G -i V O K ' /' tabák 0 0,5 0 0,5 divoký tabák 0 0 0,5 0,5
divoký t α Ο a k 0 i 0 0
Několik linií bylo vybráno pro sekundární sledování, aby se ověřil účinek indukce na požírání hmyzem, spolu s konstitutivní Cryl A(c) linií 10 a divokým typem tabáku jako konroly. Z primárních transformant každé linie bylo odebráno 10 kousků listu 12 dni poté, co byly indukovány máčením kořenů ve 100 ml 5% ethanolu a umístěny na 3% agar v miskách o velikosti 50 mm s víčky a inkubovány přes noc ve 25°C a 60% vlhkosti. Očekávalo se, že exprese proteinu Cryl A(c) bude po 12 dnech nízká nebo nedekovatelná. Kořeny rostlin byly poté máčeny v 100 ml 5% ethanolu. 0 22 hodin později byly listy nařezány a bylo odebráno 10 kousků listu o velikosti 40 mm, které byly umístěny na 3% agar v miskách o velikosti 50 mm s víčky. 5 neindukovaných listových disků a 5 listových disků • · • · · ··· · 4 · ···· · « · · · · · · ··· • * · · ·♦ · · · · ·· · · indukovaných ethanolem bylo infikováno larvami HelicAhis zea ve třetím stadiu a 5 disků každého typu bylo infikováno larvami Heliothžs virescens chovaných jak popsáno výše. Tabulka 8 ukazuje, že kontrolní divoký typ ukazuie v přítomnosti či nepřítomnosti ethanolu vysoké procento požraných listových disků, zatímco kontrolní vzorky 35S vykazují při obou chemických režimech doořou kontrolu poškození hmyzem. Transgenní linie obsahující rekombinantní molekulu Ale Cryl A(c) vykazují slabou kontrolu poškození hmyzem, pokud nebyly ošetřeny ethanolem. Tab. 8 ukazuje, že indukce ethanolem poskytuje míru kontroly poškozeni hmyzem s kontrolou u 35S Cryl A(c).
• · · · · 9 9 99
9 999 9 99
9 9 9 9 9 9 99
9 9 9 9 99
99 999999 • ·
9
TABULKA 8
čísla 1 až 5 = H. zea
čísla 6 až 10 = H. viresceas
_L poškození % poškození
divoký cyp ne i ndu ková n ý Ί 45 divoký typ indukovaný 1 55
2 0 2 55
3 25 3 95
4 30 4 50
□ 4 5 5 25
6 95 6 25
/ 5 7 55
8 50 8 30
9 2 0 9 20
10 15 10 25
3 5 S /10 neindukovaný 1 10 <5
2 <5 2 <5
3 15 3 5
4 10 4 5
5 u
6 0 6 <5
7 <5 7 10
8 <5 8 <5
9 <5 9 0
10 <5 10 5
čísla 1 až 5 = H. zea
čísla 6 až 10 = H. virescens
linie O, o poško- zení O. ~O poško- zeni
66 neindukovaný 15 66 indukovaný 1 <5
2 10 2 <5
3 0 3 <5
4 50 4 <5
5 50 5 10
6 10 6 0
7 10 7 <5
8 15 8 <5
9 0 9 <5
10 10 10 <5
Průmyslová využitelnost
Ve vynálezu se předkládá takový genový systém, kde geny, kódující aktivní insekticidní proteiny, jako např. δendotoxiny z B. thuringiensis, jsou exprimovány indukovatelným způsobem, závislým na použiti specifické chemické látky. Protein s insekticidním účinkem je tedy v rostlině exprimován pouze po exogenní aplikaci chemické látky - induktoru. Jinou možností je obdobným způsobem indukovat metabolickou cestu, která vede k produkci metabolitů poškozujících hmyz.
• · • · φ ·· · · · φ φφφ φ φφ · · φ φ φ · · · φ · φ • φφφ φφφ φφφ ·· ·· ·♦ ·♦·· ·· φφ
3'
Použiti rekombinantni molekuly DNA s genovou expresní kazetou podle vynálezu pro transformaci rostlin sníží poškozeni takto transformovaných rostlin hmyzími škůdci řádu Lepidoptera a Coleoptera.
Použití rekombinantni molekuly DNA s třenovou exoresní kazetou podle vynálezu ziepši účinnost systému integrované ochrany rostlin.
Příklady rostlin, které mohou být podle vynálezu geneticky modifikovány jsou polní plodiny, obiloviny, ovoce a zelenina jako např. řepka, slunečnice, tabák, cukrová řepa, bavlník, sója, kukuřice, pšenice, ječmen, rýže, čirok, rajčata, mangovník, broskvoň, jabloň, hrušeň, jahodník, banánovník, meloun, brambor, mrkev, hlávkový salát, zelí hlávkové a cibule.
SEZNAM SEKVENCÍ (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů baží (B) TYP: nukleové kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:
CATCTCGAGT CGACTATTTT TACAACAATT ACCAAC 36 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 53 párů baží (B) TYP: nukleové kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:
CTAGGTACCG TCGACGGATC CGTAA.GATCT GGTGTAATTG TAAATAGTAA TTG • · • ·· 4 4 4 4 · 4 4 4 4 44 • 4 4 4 444444 «4 44 ·*·· ···· (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 36 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:
CTACTCGAGT CGACTATTTT TACAACAATT ACCAAC 36 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:
CGATGTTGAA GGGCCTGCGG TA 22 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5;
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů bázi (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:
GCACCTCATG GACATCCTGA ACA 23 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 20 párů baží (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:
CATCGCAAGA CCGGCAACAG
(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM I
(i) CHARAKTERISTIKY SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 23 párů bací
(B) TYP: nukleová kyselina
(C) TYP VLÁKNA: ledncduché
(D) TOPOLOGIE: lineární
( ii ) TYP MOLEKULY: DNA
(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM /:
GCTGTAGATG GTCACCTGCT CCA (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA; 21 párů bací (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:
TGTACACCGA CGCCATTGGC A (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:
(A) DÉLKA: 22 párů bací (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:
GCGGTAAGGC TTTCAACAGG CT • 4 •4
4· • 4
4
4 4
4
4
4 • · •·
4· •f
4· • 9 • 4 *
· · • · • · • · • · • ·

Claims (11)

  1. ROKY molekula
    DNA, která je chemicky rostlinnou genovou expresní kazetou, obsahující první promotor operativně spojený s regulační a indukovatelný promotor kódujícím protein, který exogenního induktoru, alcR a kódující regulační protein, operativně spojený s cílovým genem je škodlivý pro hmyz nebo jehož dráhu produkující metabolit přičemž indukovatelný promotor je proteinem v přítomnosti účinného a tudíž aplikace takového induktoru zoůsobí expresi cílového aenu.
    Re k omb i n an tni která indukovatelnou rostlinnou genovou expresní nároku 1, kde cílový gen kóduje orálně aktivní insekticidní
  2. 3. Rekombinantní molekula DNA, která je chemicky indukovatelnou rostlinnou genovou expresní kazetou, podle nároku 2, kde orálně aktivní insekticidní protein je přinejmenším část δ-endotoxinu z B. thuringiensis.
  3. 4. Rekombinantní molekula DNA, která je chemicky indukovatelnou rostlinnou genovou expresní kazetou, podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde indukovatelný promotor je odvozený z promotoru genu alek.
    • 4 4 «4 44
    4444
    44 4
    44 44
    4 4 4 · • 44
    44 4 4 4 • 4 · ·· 4·
  4. 5. Rekombinantní molekula DNA, která je cnemicky indukovatelnou rostlinnou genovou expresní kazetou, ocdle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, kde indukovatelný promotor je chimérický promotor.
  5. 6. Rostlinná buňka obsahující rekombinantní molekulu DNA., která je chemicky indukovatelnou rostlinnou genovou excresni kazetou, podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5.
  6. 7. Rostlinná buňka podle nároku 6, kde rekombinantní moleuula DNA, která je chemicky indukovatelnou rostlinnou genovou expresní kazetou, je trvale vložena do rostlinného genomu.
  7. 8. Rostlinné pletivo obsahující rostlinnou buňku oodle kteréhokoliv z nároků 6 a 7.
  8. 9. Rostlina obsahující rostlinnou buňku podle kteréhokoliv z nároků 6 a 7.
  9. 10. Rostlina odvozená z rostliny podle nároku 9.
  10. 11. Semeno pocházející z rostliny podle kteréhokoliv z nároků 9 a 10.
  11. 12. Způsob kontroly hmyzích škůdců vyznačuj ící se t i m, že zahrnuje transformování rostlinné buňky rekombinantní molekulou DNA, která je chemicky indukovatelnou rostlinnou genovou expresní kazetou, podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5.
CZ98369A 1995-08-08 1996-07-29 Rekombinantní molekuly DNA pro chemicky indukovatelnou expresi proteinu s insekticidním účinkem v rostlinách CZ36998A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9516241.8A GB9516241D0 (en) 1995-08-08 1995-08-08 Dna constructs

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ36998A3 true CZ36998A3 (cs) 1998-06-17

Family

ID=10778942

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ98369A CZ36998A3 (cs) 1995-08-08 1996-07-29 Rekombinantní molekuly DNA pro chemicky indukovatelnou expresi proteinu s insekticidním účinkem v rostlinách

Country Status (19)

Country Link
EP (1) EP0846179A2 (cs)
JP (1) JPH11510694A (cs)
KR (1) KR19990036251A (cs)
CN (1) CN1199425A (cs)
AP (1) AP863A (cs)
AR (1) AR002914A1 (cs)
AU (1) AU704172B2 (cs)
BR (1) BR9609873A (cs)
CA (1) CA2227445A1 (cs)
CZ (1) CZ36998A3 (cs)
GB (1) GB9516241D0 (cs)
HU (1) HUP9900057A3 (cs)
IL (1) IL123172A0 (cs)
MX (1) MX9801008A (cs)
NZ (1) NZ313724A (cs)
PL (1) PL324880A1 (cs)
SK (1) SK16998A3 (cs)
TR (1) TR199800177T1 (cs)
WO (1) WO1997006268A2 (cs)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9606062D0 (en) 1996-03-22 1996-05-22 Zeneca Ltd Promoters
GB9817704D0 (en) * 1998-08-13 1998-10-07 Zeneca Ltd Gene switch
GB9902234D0 (en) * 1999-02-01 1999-03-24 Zeneca Ltd Expression system
GB9902236D0 (en) * 1999-02-01 1999-03-24 Zeneca Ltd Formulation
GB9918154D0 (en) * 1999-08-02 1999-10-06 Zeneca Ltd Expression system
EP1925672A1 (en) 2001-06-22 2008-05-28 Syngeta Participations AG Abiotic stress responsive polynucleotides and polypeptides
DE10212158A1 (de) 2002-03-19 2003-10-02 Metanomics Gmbh & Co Kgaa Population transgener Pflanzen, davon abgeleitetes biologisches Material, entsprechende Plasmidkollektion und Population transformierter Wirtsorganismen, sowie deren Verwendung und Verfahren zu deren Erzeugung
WO2004057003A2 (de) 2002-12-20 2004-07-08 Metanomics Gmbh & Co. Kgaa Verfahren zur herstellung von aminosäuren mittels transgener organismen
BRPI0407514A (pt) 2003-02-17 2006-02-14 Metanomics Gmbh método para preparar um organismo não humano, polinucleotìdeo, método para preparar um vetor, vetor, célula hospedeira, polipeptìdeo, anticorpo, ácido polinucléico de anti-sentido, método para preparar uma planta, célula vegetal, tecido vegetal transgênicos, célula de um animal útil, animal útil ou um microorganismo transgênico organismo não humano, microorganismo transgênico, rendimento ou um material de propagação de uma planta ou de um animal útil, biomassa de um microorganismo, método para preparar produtos quìmicos finos, e, uso de polipeptìdeo
WO2005014828A2 (en) 2003-08-01 2005-02-17 Basf Plant Science Gmbh Process for the production of fine chemicals in plants
WO2006069610A2 (en) 2004-07-02 2006-07-06 Metanomics Gmbh Process for the production of fine chemicals
EP1774004B1 (en) 2004-07-31 2013-07-10 Metanomics GmbH Preparation of organisms with faster growth and/or higher yield
EP2096177A3 (en) 2004-12-17 2010-01-13 Metanomics GmbH Process for the production of lutein
EP2194140A2 (en) 2005-03-02 2010-06-09 Metanomics GmbH Process for the production of fine chemicals
EP2573188A2 (en) 2005-03-02 2013-03-27 Metanomics GmbH Process for the production of fine chemicals
EP2166100B1 (en) 2005-03-08 2012-07-18 BASF Plant Science GmbH Expression enhancing intron sequences
CN101258246B (zh) 2005-07-06 2012-09-05 克罗普迪塞恩股份有限公司 Ste20样基因表达对植物产率的提高
EP1931788A2 (en) 2005-09-15 2008-06-18 CropDesign N.V. Plants having increased yield and method for making the same
EP2439280A1 (en) 2006-03-31 2012-04-11 BASF Plant Science GmbH Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same
EP2090662A3 (en) 2006-04-05 2012-10-31 Metanomics GmbH Process for the production of a fine chemical
ES2402309T3 (es) 2006-05-31 2013-04-30 Metanomics Gmbh Manipulación del metabolismo de nitrógeno usando transportador de amonio o glucosa 6-fosfato deshidrogenasas o farnesil fosfato sintetasas (FPP)
BRPI0712304A2 (pt) 2006-06-08 2012-01-17 Basf Plant Science Gmbh método e processo para melhorar caracterìsticas de crescimento de planta em relação ás plantas de controle correspondentes, planta, parte de planta ou célula de planta, molécula de ácido nucleico isolada, construto de gene, vetor, planta transgênica, e, uso de uma molécula de ácido nucleico ou do construto de gene ou do vetor
EP2199396A1 (en) 2006-08-02 2010-06-23 CropDesign N.V. Plants transformed with SYT-polypeptide having increased yield under abiotic stress and a method for making the same
ITUD20060280A1 (it) 2006-12-29 2008-06-30 Univ Degli Studi Udine Sequenza artificiale di dna evente funzione di leader in 5' (5'-utr) ottimizzata per la sovraespressione di proteine eterologhe in pianta
EP2492346A3 (en) 2007-05-04 2013-03-27 BASF Plant Science GmbH Seed enhancement by combinations of pyruvate kinases
AU2008252998A1 (en) 2007-05-22 2008-11-27 Basf Plant Science Gmbh Plant cells and plants with increased tolerance and/or resistance to environmental stress and increased biomass production-KO
CA2704271C (en) 2007-12-03 2016-07-19 Syngenta Participations Ag Engineering enzymatically susceptible phytases
WO2009080743A2 (en) 2007-12-21 2009-07-02 Basf Plant Science Gmbh Plants with increased yield (ko nue)
US20130055471A1 (en) 2009-12-15 2013-02-28 Edwin Henricus Antonius HOLMAN Transgenic Ozone-Resistant Plants
AR083029A1 (es) 2010-12-09 2013-01-23 Syngenta Participations Ag Metodos y composiciones que utilizan arn interferente pequeño (arnip) para el control de nematodos en plantas
CN103314115A (zh) 2011-01-18 2013-09-18 先正达参股股份有限公司 用于改性乙醇诱导型启动子系统的方法及组合物
US8951752B2 (en) 2011-10-20 2015-02-10 University Of Iowa Research Foundation N-demethyase genes and uses thereof
EP2814965B1 (en) 2012-02-16 2018-03-21 Syngenta Participations AG Engineered pesticidal proteins
WO2013187957A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 University Of Iowa Research Foundation Caffeine responsive promoters and regulatory genes
EP2864484A1 (en) 2012-06-22 2015-04-29 Syngenta Participations AG Biological control of coleopteran pests
US9816102B2 (en) 2012-09-13 2017-11-14 Indiana University Research And Technology Corporation Compositions and systems for conferring disease resistance in plants and methods of use thereof
EP3132039B1 (en) 2014-04-17 2019-07-24 Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG Recombinant host cell for expressing proteins of interest
CA2948369C (en) 2014-04-17 2023-09-26 Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg Recombinant host cell engineered to overexpress helper proteins
EP2952584A1 (en) 2014-06-04 2015-12-09 Boehringer Ingelheim RCV GmbH & Co KG Improved protein production
US20170327834A1 (en) 2014-12-15 2017-11-16 Syngenta Participations Ag Pesticidal microrna carriers and use thereof
BR112017013528A2 (pt) 2014-12-23 2018-03-06 Syngenta Participations Ag controle biológico de pragas de coleópteros
EP3280271A4 (en) 2015-04-10 2019-04-10 Syngenta Participations AG ANIMAL FEED COMPOSITIONS AND METHODS OF USE
WO2018076335A1 (en) 2016-10-31 2018-05-03 Institute Of Genetics And Developmental Biology, Chinese Academy Of Sciences Compositions and methods for enhancing abiotic stress tolerance
CN110612352A (zh) 2017-03-29 2019-12-24 贝林格尔·英格海姆Rcv两合公司 具有改变的膜脂组成的重组宿主细胞
EP3625340A4 (en) 2017-05-18 2021-02-24 Cargill, Incorporated GENOME EDITING SYSTEM
BR112020016306A2 (pt) 2018-02-12 2020-12-15 Curators Of The University Of Missouri Gene (saur) suprarregulado pequeno de auxina para o melhoramento da arquitetura do sistema radicular da planta, tolerância ao encharcamento, resistência à seca, e rendimento
WO2022171827A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg Signal peptides for increased protein secretion

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5447858A (en) * 1984-04-13 1995-09-05 Mycogen Plant Sciences, Inc. Heat shock promoter and gene
UA48104C2 (uk) * 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
ES2164659T3 (es) * 1992-04-13 2002-03-01 Syngenta Ltd Construcciones de dna y plantas que las incorporan.
WO1995014098A1 (en) * 1993-11-19 1995-05-26 Biotechnology Research And Development Corporation Chimeric regulatory regions and gene cassettes for expression of genes in plants

Also Published As

Publication number Publication date
NZ313724A (en) 1999-04-29
EP0846179A2 (en) 1998-06-10
CA2227445A1 (en) 1997-02-20
KR19990036251A (ko) 1999-05-25
WO1997006268A3 (en) 1997-03-13
IL123172A0 (en) 1998-09-24
SK16998A3 (en) 1998-09-09
TR199800177T1 (xx) 1998-05-21
HUP9900057A3 (en) 2001-06-28
WO1997006268A2 (en) 1997-02-20
PL324880A1 (en) 1998-06-22
AP9801194A0 (en) 1998-03-31
JPH11510694A (ja) 1999-09-21
MX9801008A (es) 1998-04-30
HUP9900057A2 (hu) 1999-04-28
AR002914A1 (es) 1998-04-29
CN1199425A (zh) 1998-11-18
BR9609873A (pt) 1999-03-23
AU6625296A (en) 1997-03-05
AP863A (en) 2000-08-04
AU704172B2 (en) 1999-04-15
GB9516241D0 (en) 1995-10-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ36998A3 (cs) Rekombinantní molekuly DNA pro chemicky indukovatelnou expresi proteinu s insekticidním účinkem v rostlinách
RU2181380C2 (ru) Индуцируемая гербицидная устойчивость
MXPA98001008A (en) Constructs of
Khanna et al. Elite indica transgenic rice plants expressing modified Cry1Ac endotoxin of Bacillus thuringiensis show enhanced resistance to yellow stem borer (Scirpophaga incertulas)
Donaldson et al. Soybean plants expressing an active oligomeric oxalate oxidase from the wheat gf-2.8 (germin) gene are resistant to the oxalate-secreting pathogen Sclerotina sclerotiorum
US11261456B2 (en) Plant regulatory sequence
EP2183355B1 (en) Compositions and methods for the modification of physiological responses in plants
CZ20013859A3 (cs) Herbicidně rezistentní rostliny
BRPI0712392B1 (pt) A nucleic acid moleculum of the mirror maize event, kit and methods for the detection of the same, amplicon, biological sample and extract derived from plants of the reference event, methods for production of a lepidopter pest resistant corn plant understanding the event mir162 and hybrid corn seeds, as well as insecticide protein, nucleic acid molecule, chemical gene, recombinant vector, and procasitic transgenic host cell
AU2014307915B2 (en) Methods for enhancing drought tolerance in plants
BRPI0615649A2 (pt) método para aumentar o acúmulo de uma proteìna inseticida em uma célula hospedeira, para produzir uma célula vegetal resistente a uma praga de inseto, para controlar infestação e para proteger uma cultura, composição inseticida, produto de mercadoria, planta transgênica ou célula vegetal, sequência de nucleotìdeo, proteìna inseticida, progênie ou semente de planta, vetor, célula hospedeira e cassete de expressão
Wu et al. The Suaeda liaotungensis kitag betaine aldehyde dehydrogenase gene improves salt tolerance of transgenic maize mediated with minimum linear length of DNA fragment
US20100218278A1 (en) Method for improved stress tolerance
RU2685927C2 (ru) Cry1d для борьбы с хлопковой совкой
US5496732A (en) Enhanced insect resistance in plants genetically engineered with a plant hormone gene involved in cytokinin biosynthesis
Hazarika et al. Enhanced expression of Arabidopsis rubisco small subunit gene promoter regulated Cry1Ac gene in chickpea conferred complete resistance to Helicoverpa armigera
Jung Enhanced resistance to bacterial pathogen in transgenic tomato plants expressing cathelicidin antimicrobial peptide
Radi et al. Expression of sarcotoxin IA gene via a root-specific tob promoter enhanced host resistance against parasitic weeds in tomato plants
Imran et al. Genetically transformed tobacco plants expressing synthetic EPSPS gene confer tolerance against glyphosate herbicide
ES2287482T3 (es) Expresion inducible por lesion de plantas.
Ahmad et al. Expression of synthetic cry1ab and cry1ac genes in basmati rice (Oryza sativa L.) variety 370 via Agrobacterium-mediated transformation for the control of the European corn borer (Ostrinia nubilalis)
UA124831C2 (uk) Молекула нуклеїнової кислоти для забезпечення інсектицидних властивостей у рослин
EP0926241A2 (en) Use of dehydrodiconferyl alcohol glucosyl transferase in the regulation of plant development and defence
Jacks et al. Transformation of plants with a chloroperoxidase gene to enhance disease resistance
Wood The role of basal resistance in Arabidopsis thaliana against the parasitic weed Striga gesnerioides.

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic