SK16998A3

SK16998A3 - Chemically-inducible plant gene expression cassette

Info

Publication number: SK16998A3
Application number: SK169-98A
Authority: SK
Inventors: Ian Jepson; Jacqueline A M Paine
Original assignee: Zeneca Ltd
Priority date: 1995-08-08
Filing date: 1996-07-29
Publication date: 1998-09-09
Also published as: NZ313724A; EP0846179A2; CA2227445A1; KR19990036251A; WO1997006268A3; IL123172A0; TR199800177T1; HUP9900057A3; WO1997006268A2; PL324880A1; AP9801194A0; JPH11510694A; MX9801008A; HUP9900057A2; AR002914A1; CZ36998A3; CN1199425A; BR9609873A; AU6625296A; AP863A

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka rekombinantných molekúl DNA a rastlín obsahujúcich tieto molekuly. Predovšetkým sa týka promótorových sekvencií a ich použitia na expresiu génov, ktoré súvisia s insekticídnou účinnosťou rastlín.

Doterajší stav techniky

Pokroky v rastlinnej biotechnológii viedli k vytvoreniu transgénnych rastlín, ktoré sú chránené proti napadnutiu larvami hmyzu.

Mnohé organizmy produkujú proteíny, ktoré sú škodlivé pre hmyz. Jedným z nich je Bacillus thuringiensis, produkujúci kryštalický proteín 6-endotoxín, ktorý po požití zabíja larvy hmyzu, pritom však nie je toxický pre cicavce. Je preto veľmi užitočný ako insekticíd v poľnohospodárstve. Mnoho kmeňov B. thuringiensis aktívne účinkuje proti hmyzím škodcom a boli charakterizované gény kódujúce hmyzie endotoxíny. δ-endotoxíny z B. thuringiensis zahŕňajú také toxíny, ktoré sú špecificky insekticídne pre larvy motýľov - rad Lepidoptera (napríklad proteíny typu Cryl) alebo chrobákov - rad Coleoptera (napríklad proteíny typu CrylII) alebo proteíny s dvojitou špecificitou proti larvám obidvoch radov Lepidoptera a Coleoptera (napríklad CryV). Chimérické proteíny, obsahujúce aspoň časť 5-endotoxínu z B. thuringiensis boli navrhnuté s cieľom, do určitej miery zmeniť niektoré vlastnosti endotoxínu, napr. rýchlosť usmrcovania. Transgénne rastliny exprimujúce hmyzie endotoxíny sú už tiež známe.

Iná cesta, ako zničiť hmyzích škodcov, je stimulovať rastlinný metabolizmus na produkciu metabolitov s insekticidnym účinkom.

Vo vynáleze sa navrhuje génový systém, kde gény kódujúce aktívne insekticídne proteíny, ako napríklad δ-endotoxíny z B. thuringiensis, sú exprimované indukovateľným spôsobom, závislým na použití špecifickej chemickej látky; alebo ako iná možnost je indukovaná metabolická cesta, ktorá vedie k produkcii metabolitov poškodzujúcich hmyz. Tento prístup prináša rad výhod, ktorých príklady sú uvedené v nasledujúcom odstavci:

1. Konštitutívna expresia génov rezistencie proti hmyzu (napríklad δ-endotoxínov z B. thuringiensis) v rastlinách vedie k významnému zvýšeniu selekčného tlaku zvýhodňujúcemu odolné druhy hmyzu. Možnosť kontroly expresie, t. j. indukovatelná expresia génov rezistencie proti hmyzu, znižuje riziká vývoja odolných škodcov. Napríklad expresia insekticídnych génov môže byť indukovaná iba v takom okamihu rastového obdobia, kedy je ochrana vyžadovaná. Naviac je možné využiť i regulovateľnú toleranciu voči hmyzu ako súčasť systému integrovanej ochrany rastlín, pri ktorom sa ošetrenie chemickou látkou, indukujúce expresiu insekticídneho génu, strieda so štandardným ošetrením insekticídnymi pesticídmi.

2. Existuje nebezpečenstvo, že nadmerná expresia zo silného konštitutívneho promótora môže negatívne ovplyvniť vývoj rastlín, a to môže viesť k poruchám klíčenia alebo kvitnutia alebo k zníženiu výnosov. Indukovateľná expresia znižuje nebezpečenstvo škodlivých vplyvov, pretože transgén je exprimovaný iba počas krátkeho obdobia mimo citlivých vývojových štádií.

3. Chemická látka - induktor, účinkujúci ako spínač expresie, sa môže pridať do zmesi so štandardným insekticídnym prostriedkom, ktorý má potom dvojitý účinok, vlastný chemický a génový, ničí teda škodcov dvoma nezávislými spôsobmi.

Bol vyvinutý indukovateľný génový regulačný systém (génový spínač), založený na regulačnom proteíne alcR z Aspergillus nidulans, ktorý aktivuje expresiu génov z promótora alck za prítomnosti určitých alkoholov a ketónov. Tento systém bol opísaný v našej medzinárodnej patentovej prihláške č.

WO 93/21334, ktorá je uvedená v odkazoch.

Génový aktivačný systém alcA/alcR z huby Aspergillus nidulans je dobre charakterizovaný. Metabolická dráha premeny etanolu v A. nidulans je zodpovedná za rozklad alkoholov a aldehydov. Ukázalo sa, že v tejto metabolickej dráhe sa zúčastňujú produkty troch génov. Gény alcA a alcR ležia blízko seba v VII. väzbovej skupine a aldA spadá do VIII. väzbovej skupiny (Pateman J. H. a kol., 1984, Proc. Soc. Lond. B217: 243-264? Sealy - Lewis H. N. a Lockington R. A., 1984, Curr. Genet. 8: 253-259). Gén alcA kóduje ADHI v A. nidulans a aldA kóduje AldDH, druhý enzým zodpovedný za metabolickú utilizáciu alkoholu. Expresia ako alcA, tak aj aldA je indukovaná etanolom a radom ďalších indukujúcich látok (Creaser E. H. a kol., 1984, Biochem. J. 255: 449-454) prostredníctvom transkripčného aktivátora alcR. Gén alcR a ko-induktor sú zodpovedné za expresiu alcA a aldA, pretože rad mutácií a delécií v géne alcR vedie k pleiotropnemu zníženiu aktivity ADHI a AldDH (Felenbok B. a kol., 1988, Gene 73: 385-396, Pateman a kol., 1984, Sealy - Lewis H. M. a Lockington R. A., 1984). Proteín ALCR aktivuje expresiu z alcA tým, že sekvencie viaže na tri špecifické miesta promótora alcA (Kulmberg P. a kol., 1992, J. Biol. Chem. 267: 21146-21153).

Gén alcR bol klonovaný (Lockington L. A. a kol., 1985, Gene 33: 137-149) a sekvenovaný (Felenbok B. a kol., 1988). Expresia génu alcR je indukovateľná, autoregulovaná a podlieha glukózovej represii sprostredkovanej represorom CREA (Bailey C. a Arst H. N., 1975, Eur. J. Biochem. 51: 573-577; Lockington R. A. a kol., 1987, Mol. Microbiol. 1: 275-281; Dowzer C. E. A. a Kelly J. M., 1989, Curr. Genet. 15: 457-459; Dowzer C. E. A. a Kelly J. M., 1991, Mol. Celí Biol. 11: 5701-5709). Regulačný proteín obsahuje 6 molekúl cysteínu blízko svojho N-konca usporiadaných do dvoj jadrového zhluku obsahujúceho zinok (Kulmberg P. a kol., 1991, FEBS Letts. 280: 11-16). Tento zhluk je podobný vysoko konzervatívnym doménam DNA pre transkripčné faktory u vreckovýtrusných húb. Transkripčné faktory GAL4 a LAC9 obsahujú také dvojjadrové komplexy so štruktúrou ďatelinového listu obsahujúce 2 atómy Zn(II) (Pan T. a Coleman

J. E., 1990, Biochemistry 29: 3023-3029; Halvorsen Y. D. C. a kol., 1990, J. Biol. Chem. 265: 13283-13289). Štruktúra ALCR je podobná tomuto typu až na to, že obsahuje asymetrickú slučku tvorenú 16 aminokyselinovými rezíduami medzi molekulami Cys-3 a Cys-4. ALCR sám pozitívne aktivuje vlastnú expresiu väzbou na dve špecifické miesta svojej promótorovej oblasti (Kulmberg P. a kol., 1992, Mol. Celí Biol. 12: 1932-1939).

Regulácia všetkých troch génov alcR, alck a aldk, tvoriacich metabolickú dráhu utilizácie etanolu, prebieha na úrovni transkripcie (Lockington a kol., 1987, Gwyne D. a kol., 1987, Gene 51: 205-216; Pickett a kol., 1987, Gene 51: 217-226).

V A. nidulans sa vyskytujú dve ďalšie alkoholdehydrogenázy. ADHII sa vyskytuje v mycéliu vtedy, keď je huba pestovaná na neindukujúcom médiu a podlieha represii etanolom. ADHII je kódovaná génom alcB a je tiež kontrolovaná alcR (Sealy-Lewis a Lockington, 1984). Tretia alkoholdehydrogenáza bola tiež klonovaná komplementáciou s kmeňom S. cerevisiae adh-. Gén alcC spadá do väzbovej skupiny VII, ale nie je vo väzbe ani s alcA ani alcR.

Je možné zhrnúť, že A. nidulans exprimuje enzým alkoholdehydrogenázu I (ADHI) kódovanú génom alcA, iba ak rastie za prítomnosti rôznych alkoholov a ketónov. Indukcia sa prenáša prostredníctvom regulačného proteínu (regulátora) kódovaného génom alcR a konštitutívne exprimovaného. Ak je prítomný induktor (t.j. alkohol alebo ketón), regulačný proteín aktivuje expresiu génu alcA. V prítomnosti induktora regulačný proteín stimuluje tiež svoju vlastnú expresiu. To znamená, že v indukujúcich podmienkach (t.j. ak je prítomný alkohol alebo ketón) vzniká veľké množstvo enzýmu ADHI. A naopak, gén alcA a teda jeho produkt ADHI nie sú exprimované v neprítomnosti induktora. Expresia alcA a tvorba enzýmu podlieha represii v prítomnosti glukózy.

Takže promótor génu alcA je indukovateľný promótor, aktivovaný regulačným proteínom alcR v prítomnosti induktora (t.j. kombináciou proteín/alkohol alcR a alck (vrátane príslušných a sekvenované (Lockington R. A. 137-149, Felenbok B. a kol., 1988 a kol., 1987, Gene 51: 205-216).

alebo proteln/ketón). Gény promótorov) boli klonované a kol., 1985, Gene 33: , Gene 73: 385-396; Gwyne

Gény pre alkoholdehydrogenázu (adh) sa sledovali na určitých rastlinných druhoch. V kukurici a iných obilninách je ich expresia spúšťaná anaeróbnymi podmienkami. Promótorová oblasť génu adh z kukurice obsahuje regulačný element s veľkosťou 300 bp, ktorý je nevyhnutný na expresiu v anaeróbnych podmienkach. Avšak žiaden ekvivalent regulačného proteínu alcR sa nenašiel v žiadnej rastline. Teda génový regulačný systém typu alcR/alck nie je v rastlinách známy. Konštitutívna expresia génu alcR v rastlinných bunkách nevedie k aktivácii endogénnej adh.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje chemicky indukovateľnú génovú expresnú kazetu, obsahujúcu prvý promótor operatívne spojený s regulačnou sekvenciou odvodenou od génu alcR, ktorý kóduje regulačný proteín, a indukovateľný promótor operatívne spojený s cieľovým génom kódujúcim proteín, ktorý je škodlivý pre hmyz, alebo jeho expresia indukuje metabolické dráhy vedúce k metabolitom poškodzujúcim hmyz, pričom indukovateľný promótor je aktivovaný regulačným proteínom v prítomnosti účinného exogénneho induktora, ktorého aplikácia spúšťa expresiu cieľového génu.

Ak cieľový gén kóduje proteín poškodzujúci hmyz, je výhodné, aby tento proteín bol orálne aktívny. Príkladom takýchto orálne aktívnych insekticídnych proteínov sú 6-endotoxíny z B. thuringiensis, a preto cieľový gén kóduje aspoň časť á-endotoxínu z B. thuringiensis.

t

V našej práci sa zistilo, že génový spínač alcR/alck je vhodný najmä na expresiu génov, ktoré kódujú 6-endotoxíny z B. thuringiensis, a to prinajmenšom z nasledujúcich dôvodov: Sys6 tém génového spínača alcR/alch bol vyvinutý na dosiahnutie vysokej úrovne génovej expresie. Naviac expresia regulačného proteínu alcR je prednostne zahajovaná zo silného konštitutívneho promótora, ako je napríklad polyubichitín. Takto je možné dosiahnuť vysokú úroveň expresie transgénu v porovnaní s expresiou zo silného konštitutívneho promótora, ako napríklad promótora 35 CaMV.

Obr. 1 ukazuje časový priebeh expresie markerového génu (CAT) po aplikácii indukujúcej chemickej látky (induktora). Táto štúdia ukazuje náhly vzostup expresie (2 hodiny) CAT po aplikácii induktora na list. Počiatočná včasná kinetika indukcie je spôsobená konštitutívnou expresiou regulačného proteínu, preto nie je zjavné žiadne oneskorenie (lag fáza), zatiaľ čo prebieha syntéza transkripčných faktorov. Naviac bol vybraný jednoduchý dvojzložkový systém, ktorý nezávisí na celom zložitom systéme signálnej transdukcie.

Špecifickosť systému alcR/alck sa testovala s celou škálou rozpúšťadiel bežných v agronomickej praxi. Test na hydroponickej kultúre mladých rastlín dokázal, že etanol, butan-2-ol a cyklohexanón spôsobili vysokú hladinu indukovanej expresie reportérového génu (obr. 2). Naopak, keď sa aplikovali v podobe spreja na list rôzne alkoholy a ketóny (ktorých zoznam je uvedený v tab. 1), bežné v agronomickej praxi, iba etanol viedol k vysokej úrovni indukovanej génovej aktivity reportérového génu (obr. 3). Je to významné, pretože tak nemôže dôjsť k nelegitímnej indukcii. transgénu pri náhodnom stretnutí s rozpúšťadlami v rôznych agrochemických prípravkoch. Etanol nie je bežnou súčasťou agrochemických prípravkov a tak vhodne organizovaný postrek etanolom je možné považovať za špecifický induktor génového spínača alcR/alcA v poľných podmienkach.

TABUĽKA 1

1. Izobutylmetyketón	13. acetonylacetón
2. Fenchon	14. JF5969 (cyklohexanón)
3. 2-heptanón	15. N-metylpyrolidón
4. Di-izobutylketón	16. polyetylénglykol
5. 5-metylhexanón	17. propylénglykol
6. 5-metylpentán-2,4-diol	18. acetofenón
7. etylmetylketón	19. JF4400 (metylcyklohexanón)
8. 2-pentanón	20. propan-2-ol
9. glycerol	21. butan-2-ol
10. τ-butyrolaktón	22. acetón
11. diacetónalkohol	23. etanol
12. tetrahydrofurfurylalkohol	24. destilovaná voda

Žiadny z celého radu biotických a abiotických stresov, ako napríklad infekcia patogénom, teplo, chlad, sucho, poranenie a zaplavenie, neindukuje funkciu génového spínača alcR/alcA. Naviac ani rad ďalších chemických látok, ktoré nie sú rozpúšťadlami, ako napríklad kyselina salicylová, etylén, kyselina abscisová, auxín, kyselina giberelová, a ani rôzne ďalšie agrochemikálie neindukovali alcR/alck systém.

Predložený vynález sa neobmedzuje na žiadny zvláštny endotoxín, môžu sa uplatniť aj chimérické endotoxíny.

Prvý promótor je buď konštitutívny alebo tkanivovo špecifický, alebo môže byť vývojovo programovaný alebo dokonca indukovateľný. Regulačná sekvencia, teda gén alcR, sa získa z Aspergillus nidulans a kóduje regulačný proteín alcR.

Indukovateľný promótor je výhodne promótor génu alck, ktorý sa získa z Aspergillus nidulans, alebo je to chimérický promótor odvodený od regulačných sekvencií promótora alck a ústrednej promótorovej oblasti génového promótora, ktorý je aktívny v rastlinnej bunke (vrátane akéhokoľvek, promótora rastlinného génu). Promótor alck alebo odvodený chimérický pro8 motor je aktivovaný regulačným proteínom alcR po aplikácii alkoholového alebo ketónového induktora.

Indukovateľný promótor sa dá tiež odvodiť od promótorového génu aldk, alcB alebo alcC, ktoré sa získajú z Aspergillus nidulans.

Induktorom je akákoľvek účinná chemická látka (napríklad alkohol alebo ketón). Vhodné chemické látky na použitie s génovou expresnou kazetou odvodenou zo systému alcR/alck sú tie, ktoré uvádza Creaser a kol. (1984, Biochem. J. 255: 449-454) ako napríklad butan-2-ón (etylmetylketón), cyklohexanón, acetón, butan-2-ol, 3-oxobutyrová kyselina, propa-2-ol a etanol.

Génová expresná kazeta reaguje na aplikáciu exogénneho chemického induktora a tým umožňuje externú aktiváciu expresie cieľového génu regulovaného kazetou. Expresná kazeta je silne regulovaná a je vhodná na všeobecné použitie v rastlinách.

Dve časti expresnej kazety sú súčasťou jednej a tej istej rekombinantnej molekuly DNA alebo tvoria dve samostatné rekombinantné molekuly DNA. Prvá časť obsahuje cDNA regulačného génu alebo génovú sekvenciu subklonovanú do expresného vektora, v ktorom je ich expresia riadená operatívnym rastlinným promótorom. Druhá časť obsahuje aspoň časť indukovateľného promótora, ktorý riadi expresiu cieľového génu ležiaceho v smere od promótora. Regulačný proteín, ktorý je produktom regulačného génu v prvej časti; kazety, v prítomnosti vhodného induktora aktivuje expresiu cieľového génu tým, že stimuluje indukovateľný promótor v druhej časti génovej kazety.

V praktickom použití je rekombinantná molekula DNA alebo rekombinantné molekuly DNA, obsahujúce expresnú kazetu podľa vynálezu, vnesené do rastliny transformáciou.

Na transformáciu sa môže použiť akýkoľvek spôsob vhodný pre zvolenú rastlinu alebo rastlinnú bunku, vrátane infekcie pomocou Agrobacterium tumefacienns, ktorý nesie rekombinantné

Ti plazmidy, elektroporácie, mikroinjekcie buniek alebo protoplastov, transformácie mikroprojektilmi alebo transformácie peľového mechúrika. Z úspešne transformovaných buniek sa regenerujú celé rastliny, v ktorých genóme je trvalo vložený nový jadrový materiál. Takto je možné transformovať ako jednoklíčnolisté tak aj dvojklíčnolisté rastliny.

Príklady rastlín, ktoré môžu byť takto geneticky modifikované sú poľné plodiny, obilniny, ovocie a zelenina ako napríklad repka, slnečnica, tabak, cukrová repa, bavlník, sója, kukurica, pšenica, jačmeň, ryža, cirok, paradajky, mangovník, broskyňa, jabloň, hruška, jahoda, banánovník, melón, zemiaky, mrkva, hlávkový šalát, hlávková kapusta a cibuľa.

Vynález ďalej poskytuje rastlinnú bunku obsahujúcu rekombinantnú molekulu DNA s génovou expresnou kazetou podľa vynálezu. Táto génová expresná kazeta je vnesená transformáciou a trvalo inkorporovaná v rastlinnom genóme. Vynález tiež poskytuje rastlinné pletivo alebo celú rastlinu obsahujúcu takéto transformované bunky a takisto rastliny alebo semená od nich odvodené.

Vynález ďalej poskytuje spôsob riadenia génovej expresie v rastline, zahrňujúci transformovanie rastlinnej bunky rekombinantnou molekulou DNA, ktorá predstavuje génovú expresnú chemicky indukovateľnú kazetu, obsahujúcu prvý promótor operatívne spojený s regulačnou sekvenciou odvodenou od génu alcR, ktorý kóduje regulačný proteín, a indukovateľný promótor operatívne spojený s cieľovým génom kódujúcim δ-endotoxín z B. thuringiensis, pričom indukovateľný promótor je aktivovaný regulačným proteínom v prítomnosti účinného exogénneho induktora, ktorého aplikácia spôsobí expresiu cieľového génu.

Rôzne výhodné znaky a uskutočnenie predloženého vynálezu sú opísané v nasledujúcich príkladoch a obrázkoch, hoci sa uskutočnenie vynálezu neobmedzuje iba na tieto príklady.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 zobrazuje časový priebeh indukcie po aplikácii

7,5 % etanolu u segregujúcej populácie AR10.

Obr. 2 zobrazuje aktivitu reportérového génu CAT u homozygotnej línie AR10-30 po namáčaní koreňov v rôznych chemických látkach.

Obr. 3 zobrazuje aktivitu reportérového génu CAT u homozygotnej línie AR10-30 po namáčaní koreňov v rôznych chemických látkach.

Obr. 4 znázorňuje vytvorenie rekombinantnej molekuly DNA obsahujúcej regulačný prvok 35S.

Obr. 5 znázorňuje vytvorenie rekombinantnej molekuly DNA obsahujúcej reportérový gén.

Obr. 6 znázorňuje vytvorenie regulovateľného (obsahuje spínač) vektora DNA nesúceho odolnosť proti hmyzu.

Obr. 7 zobrazuje sekvenciu optimalizovaného génu Cryla(c).

Obr. 8 zobrazuje reštrikčné miesta v sekvencii optimalizovaného génu Cryla(c).

Obr. 9 zobrazuje sekvenciu optimalizovaného génu CryV.

Obr. 10 znázorňuje vektor DNA s veľkosťou 5129 bp obsahujúci gén CryV.

Obr. 11 zobrazuje sekvenciu vektora pMJBl.

Obr. 12 je znázornenie mapy vektora pJRIi.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Vytvorenie rekombinantnej molekuly regulátora alcR

Sekvencia genómovej DNA alcR bola publikovaná, čo umožňuje izoláciu vzorky cDNA génu alcR.

cDNA alcR bola klonovaná do expresného vektora pJRl(pUC). pJRl obsahuje promótor 35S vírusu mozaiky karfiolu (CaMV). Tento promótor je konštitutívny rastlinný promótor a nepretržite exprimuje regulačný proteín. V expresnom vektore je použitý polyadenylačný signál nos.

Obr. 4 zobrazuje vytvorenie regulačnej rekombinantnej molekuly s prvkom 35S ligáciou cDNA alcR do pJRl. Po čiastočnom štiepení klonu cDNA alcR enzýmom BamHI nasledovala elektroforéza v agarózovom géle a vyrezanie a purifikácia fragmentu s veľkosťou 2,6 Kb. Fragment bol potom ligovaný (vložený) do vektora pJRl, ktorý sa naštiepil BamHI a ošetril fosfatázou, aby sa zabránilo recirkularizácii. Gén alcR sa potom v tejto rekombinantnej molekule ”35S-alcR^M umiestnil tak, aby bol riadený promótorom 35S CaMV a polyadenylačným signálom nos 3'.

Príklad 2

Vytvorenie rekombinantnej molekuly regulátora alcR obsahujúcej chimérický promótor

Plazmid pCaMVCN obsahuje reportérový gén bakteriálnej chloramfenikoltransferázy (CAT) medzi promótorom 35S a terminátorom transkripcie (rekombinantná molekula 'LiSS-CAT).

Promótor alcA bol subklonovaný do vektora pCaMVCN, pričom sa vytvorila rekombinantná molekula alcA-CAT. Fúziou časti promótora alcA a časti promótora 35S sa vytvoril chimérický promótor, ktorý umožňuje kontrolovať expresiu génov.

Obr. 5 ukazuje vytvorenie rekombinantnej molekuly reportérového génu. Promótor alcA a promótor 35S majú totožné sekvencie TATA, ktoré sa použili na spojenie týchto dvoch promótorov dohromady s použitím metódy rekombinantnej polymerázovej reťazovej reakcie (PCR): oblasť 246 bp z promótora alcA a 5' koniec génu CAT z pCaMVCN (obsahujúceho časť -70 ústrednej oblasti promótora 35S) sa oddelene amplifikovali a potom spojili k sebe s použitím PCR. Rekombinantný fragment sa potom štiepil BamHI a HindlII. Vektor pCaMVCN sa čiastočne štiepil BamHI a HindlII a potom bol podrobený elektroforéze, takže sa mohol izolovať správny fragment a ligovať s rekombinantným fragmentom.

Ligačné zmesi sa transformovali do E. coli a naniesli na bohaté agarové živné pôdy. Plazmidová DNA sa izolovala minipreparáciou z výsledných kolónií a rekombinantné klony sa znova zachytili podľa veľkosti pri elektroforéze a reštrikčným mapovaním. Pre kontrolu, či sa zachytili správne rekombinanty, boli sekvenované oblasti ligačného spojenia.

Príklad 3

Rekombinantný gén

Vytvorili sme nasledujúce rekombinantné gény - molekuly DNA, ktoré sú Zhrnuté na obrázku 6:

Vektor 1 obsahuje zosilnený promótor 35S CaMV fúzovaný so sekvenciou omega translačného zosilňovača vírusu tabakovej mozaiky (TMV), génom Cry 1 A(c) z Bacillus thuringiensis a terminátorom nopalínsyntetázy (nos).

Vektor 2 je totožný s vektorom 1 okrem toho, že gén Cry 1 A(c) z Bacillus thuringiensis je nahradený génom Cry V z Bacillus thuringiensis.

Vektor 3 obsahuje gén regulačného proteínu alcR z Aspergillus nidulans riadeného promótorom 35S CaMV, oblasť promótora alcA, zosilňovač TMV, Cry 1 A(c) a terminátor nos.

Vektor 4 je totožný s vektorom 3 okrem toho, že vektor Cry 1 A(c) je nahradený génom Cry V.

Gén Cry 1 A(c) je optimalizovaná syntetická sekvencia špecifická pre Lepidoptera kódujúca endotoxín z Bacillus thuringiensis a je zobrazená na obrázkoch 7a 8. Sekvencia bola získaná z laboratória Pamely Greenovej, Michigan State University.

opísaný v WO 90/13651.

Gén Cry V je nový endotoxín z Bacilluss thuringiensis entomocídny pre larvy radu Coleoptera a Lepidoptera a je našej Medzinárodnej patentovej prednáške č. Gén Cry V je modifikovaná syntetická sekvencia, optimalizovaná pre genetické kódovanie v rastlinách, z ktorej boli odstránené oblasti nestability RNA. Je zobrazená na obrázkoch 9 a 10.

Príklad 4

Príprava vektora

Vektor 1 - konštitutívny Cry 1 A(c)

Oligonukleotidové primery na PCR boli navrhnuté tak, aby amplifikovali sekvenciu omega TMV v pMJBl (viď obr. 9) s pridaním reštrikčného miesta Sali susediaceho s miestom Xhol (viď súhlasný oligonukleotid) a s porušením miesta Ncol a pridaním miest Sali a BglII do reverzného oligonukleotidu.

Súhlasný oligonukleotid (sekvencia s identifikačným číslom 1) Sali

5' CTACTCGAGTCGACTATTTTTACAACAATTACCÄAC 3’

Xhol

Reverzný oligonukleotid (sekvencia s identifikačným číslom 2)

5' CTAGGTACC GTCGAC GGATCCGTAAGATCTGGTGTAATTGTAAATAGTAATTG 3'

Kpnl Sali BamHI BglII

Zo súhlasným a reverzným oligonukleotidovým primerom sa pri použití plazmidovej DNA z pMJBl ako templátu uskutočnila PCR. Výsledný produkt PCR bol klonovaný do vektora pTAg (LigATor kit, R&D systém), potom bol uvoľnený štiepením s Asp 718 Xhol a klonovaný do plazmidu pMJBl štiepeného Xhol/Asp 718 (obr. 10), čím vznikol plazmid pMJB3. Plazmid pMJBl je založený na pIBT 211 obsahujúcom promótor CaMV35S s duplikovaným zosilňovačom spojeným so sekvenciou translačného zosilňovača vírusu tabakovej mozaiky nahradzujúcou 5' netranslatovanú vedúcu sekvenciu vírusu škvrnitosti tabaku a ukončeným poly(A) signálom nopalínsyntetázy (nos).

Syntetický gén Cry 1 A(c) bol vystrihnutý ako fragment BglII-BamHI a klonovaný do pMJB3. Pri použití HindlII a EcoRI bol izolovaný fragment obsahujúci zosilnený promótor 35 CaMV, sekvenciu omega TMV, Cry 1 A(c) a terminátor nos. Výsledný fragment bol ligovaný do plazmidu pJRIi štiepeného EcoRI/HindlII (obr. 12) a vytvoril tak rastlinný transformačný vektor založený na Bin 19.

Vektor 2 - konštitutívny Cry V pMJB3 bol štiepený HindlII a bola do neho vložená spojka

HindlII-EcoRI-HindlII. Výsledný vektor bol potom štiepený BamHI a bol do neho vložený fragment BamHI obsahujúci gén Cry V. Gén Cry V bol orientovaný pri použití kombinácie reštrikčného štiepenia a sekvenovania. Fragment EcoRI z výsledného vektora, obsahujúci zosilnený promótor 35 CaMV, sekvenciu omega TMV, gén Cry V a terminátor nos, bol prenesený do JRIRiMCS, vektora založenom na Bin 19 obsahujúcom mnohonásobné klonovacie miesto z pUC18.

Vektor 3 - indukovateľný Cry 1 A(c) pMJB3 obsahujúci gén Cry 1 A(c) bol štiepený Sali, čím sa uvoľnil fragment obsahujúci sekvenciu omega TMV fúzovanú s génom Cry 1 A(c). Výsledný fragment bol klonovaný do palcA CAT štiepeného Sali a orientovaný reštrikčným štiepením. Pomocou HindlII bol vystrihnutý fragment obsahujúci promótor alcA fúzovaný so sekvenciou omega TMV, gén Cry 1 A(c) a terminátor nos, a bol prenesený do HindlII naštiepenom p35SalcRalcAcat, čo je vektor založený na Bin 19 obsahujúci promótor 35CaMV fúzovaný s cDNA alcR, s reportérovou kazetou alcAcat odstránenou štiepením HindlII.

Vektor 4 - indukovateľný Cry V pMJB3 obsahujúci gén Cry V bol štiepený Sali, čím sa uvoľnil fragment obsahujúci sekvenciu omega TMV fúzovanú s génom Cry V. Výsledný fragment bol klonovaný do palcA CAT štiepeného Sali a orientovaný reštrikčným štiepením a sekvenčnou analýzou. Štiepením s HindlII boli uvoľnené dva fragmenty obsahujúce promótor alcA génu Cry V a terminátor nos. Bola uskutočnená trojitá ligácia dvoch fragmentov HindlII tak, že sa vložila kazeta alcA Cry V nos do p35a!cRalcAcat naštiepeného HindlII a odstránila sa kazeta alccat. Správne zostavenie kazety bolo potvrdené reštrikčným štiepením, Southernovým prenosom a sekvenčnou analýzou.

Príklad 5

Transformovanie rastlín

Transformovanie listov pomocou Agrobacterium tumefaciens

Transformácia bola uskutočnená postupom, ktorý publikoval

Bevan 1984. Rastliny tabaku (Nicotiana tabacum cv. Samsum), staré 3 až 4 týždne, pestované sterilné na médiu MS, boli listov boli odrezané a listy boli vložené na 20 minút do tumefaciens (kmeň LBA 4404) použité na transformáciu. Okraje rozrezané na kúsky. Kúsky listu suspenzie buniek Agrobacterium transformovaných plazmidom pJRIRI s inzertom. Kúsky listov boli potom umiestnené na misky s médiom NBM (t.j. médiom MS doplneným o 6-benzylaminopurín (6-BAP) v koncentrácii 1 mg/1 a kyselinu naftalénoctovú (NAA) v koncentrácii 0,1 mg/1). Po dvoch dňoch boli explantáty premiestnené do kultivačných nádobiek s médiom NBM s prídavkom antibiotík karbenicilínu (500 mg/1) a kanamycínu (100 mg/1). Po 5 týždňoch bol 1 výhonok z každého listového disku prenesený na médium NBM s karbenicilínom (200 mg/1) a kanamycínom (100 mg/1). Po ďalších 2 až 3 týždňoch sa kompletné regenerované rastlinky (konárik s koreňmi) premiestnili na čerstvé médium a ak bolo potrebné, výhonok sa rozdelil na 2 časti, ktoré sa umiestnili do samostatných nádobiek. Jeden výhonok sa potom udržoval ako stála tkanivová kultúra a druhý sa regeneroval na rastlinu, ktorá bola presadená do pôdy a po zakorenení ďalej pestovaná v skleníku.

Týmto transformačným postupom sa do rastlín tabaku vniesli 4 vektory a regenerovali primárne transformanty (t.j. 1. generácia transformovanej rastliny) rezistentné voči kanamycínu. Takto sa získalo 53 primárnych transformantov s rekombinantnou molekulou DNA nesúcou konštitutívny Cry 1 A(c), 54 transformantov nesúcich konštitutívny Cry V, 73 transformantov s indukovateľným Cry 1 A(c) a 62 nesúcich indukovateľný Cry V.

Príklad 6

Extrakcia listovej DNA na reakcie PCR

Vzorky listov boli odoberané z rastlín starých 3 až 4 týždne, ktoré rástli v sterilných podmienkach. Listové disky s priemerom 5 mm sa drvili 30 sekúnd v 200 μΐ extrakčného pufra (0,5 % dodecylsulfát sodný (SDS), 250 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (tris(hydroxymetyl)aminometán hydrochlorid), pH 8). Vzorky boli centrifugované 5 minút pri 13000 ot/min, a potom sa pridalo 150 μΐ izopropanolu k rovnakému objemu vrchnej vrstvy.

Vzorky sa ponechali 10 minút na ľade, centrifugovali 10 minút pri 13000 ot/min a nechali sa vysušiť. Potom sa resuspendovali v 100 μΐ deionizovanej vody. 2,5 μΐ sa použilo na PCR, uskutočnenú za podmienok opísaných Jepsonom a kol., Plánt Molecular Biology Report 9(2): 131-138, 1991.

Primárne transgénne rastliny sa testovali pomocou PCR, aby sa rozpoznali rastliny, ktoré obsahovali transgén v plnej dĺžke:

Konštitutívny Cry 1 A(c)

Na extraktoch z týchto rastlín sa uskutočňovali 2 reakcie PCR s použitím nasledujúcich párov primerov:

TMV1 5’ CTA CTC GAG TCG ACT ATT TTT ACA ACA ATT ACC AAC (sekvencia s identifikačným číslom 3)

CRY1A2R 5' CGA TGT TGA AGG GCC TGC GGT A (sekvencia s identifikačným číslom 4)

Podmienky PCR boli: 35 cyklov, 95 ’C 1,2 min, 62 ’C

1,8 min a 72 ’C 2,5 min a konečné predĺženie reťazca po 6 min v 72 ’C.

CRY1A1 5' GCA CCT CAT GGA

CAT CCT.GAA CA (sekvencia s identifikačným číslom 5)

NOS 5' CAT CGC AAG ACC GGC AAC AG (sekvencia s identifikačným číslom 6)

Podmienky PCR boli: 35 cyklov, 95 ’C 0,8 min, 62 ’C

1,8 min a 72 ’C 2,5 min a konečné predĺženie reťazca po 6 min v 72 ’C.

Deväť primárnych transformantov, ktoré poskytli produkty PCR pre obe sady primerov, boli spolu s dvoma PCR negatívnymi líniami vysadené do pôdy v kvetináčoch s veľkosťou 7,5 palca (19 cm) a umiestnené do skleníka.

Konštitutívny Cry V

Na týchto extraktoch sa uskutočňovali 2 reakcie PCR s použitím nasledujúcich párov primerov:

TMV1 (viď vyššie)

CRYV1R 5' GCT GTA GAAT GGT CAC CTG CTC CA (sekvencia s identifikačným číslom 7)

Podmienky PCR boli: 35 cyklov, 94 C 0,8 min, 64 C

1,8 min a 72 C 2,8 min a predĺženie reťazca po 6 min v 72 C. CRYV1 5' TGT ACA CCG ACG CCA TTG GCA (sekvencia s identifikačným číslom 8)

NOS (viď vyššie)

Podmienky PCR boli: 35 cyklov, 94 C 0,8 min, 58 C

1,8 min a 72 C 2,,0 min a predĺženie reťazca po 6 min v 72 C.

Dvadsaťštyri primárnych transformantov poskytlo produkty PCR pre obe sady primerov, tie sa potom spolu so siedmimi PCR negatívnymi líniami vysadili do pôdy v kvetináčoch s veľkosťou

7,5 palca (19 cm) a umiestnili v skleníku.

Indukovateľný Cry 1 A(c)

Na týchto extraktoch sa uskutočňovali tri reakcie PCR s použitím nasledujúcich párov primerov:

ALCR1 5' GCG GTA AGG CTT TCA ACA GGC T (sekvencia s identifikačným číslom 9)

NOS ako vyššie

Podmienky PCR boli: 35 cyklov, 94 C 1,8 min, 60 C 1,0 min a 72 C 1,5 min a predĺženie reťazca po 6 min v 72 C.

Páry primerov TMV1/CRY1A2R, CRY1A1/NOS sa použili, ako je uvedené vyššie.

Štyridsaťpäť rastlín, ktoré poskytli produkty PCR pre všetky sady primerov, sa spolu s dvoma PCR negatívnymi líniami vysadili do pôdy v kvetináčoch s veľkosťou 6 palcov (15,2 cm) v skleníku.

Indukovateľný Cry V

Vzniklo šesťdesiatdva primárnych transformantov, ale až doteraz nebola uskutočnená žiadna analýza PCR.

Príklad 7

Analýza westernovým prenosom

120 mg pletiva z listov rastlín starých 3 až 4 týždne, ktoré rástli v sterilných podmienkach, sa rozdrvilo v 4 ’C v 0,06 g polyvinylpolypyrolidonu (PVPP), aby sa absorbovali fenolové zlúčeniny a v 0,5 ml extrakčného pufra (1 M Tris-HCl, 0,5 M EDTA (sodná soľ kyseliny etyléndiamíntetraoctovej), 5 mM DTT (ditiotreitol), pH 7,8). Potom sa pridalo ešte 200 ml extrakčného pufra. Vzorky sa premiešali a potom centrifugovali 15 minút pri 4 C. Supernatant sa odstránil a koncentrácia proteínu sa stanovila skúškou podľa Bradforda s použitím bovinného sérového albumínu (BSA) ako štandardu. Vzorky sa uskladnili v -70 ’C až do doby použitia.

Vzorky 25 mg proteínu s 33 % (objem/objem) farby podľa Laemmliho (97,5 % Laemmliho pufor (62,5 mM Tris-HCl, 10 % (hmotnosť/objem) sacharóza, 2 % (hmotnosť/objem) SDS, pH 6,8), 1,5 % pyronín y a 1 % β-merkaptoetanol) sa po 2 minútach varu naniesli na 17,7 % (30:0,174 akrylamid : bisakrylamid) gél SDS-PAGE (elektroforéza v polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným).

Produkty translácie sa elektroforeticky oddelili v nasledujúcom pufre (14,4 % (hmotnosť/objem) glycín, 1 % (hmotnosť/objem) SDS, 3 % (hmotnosť/objem) Tris-Baze). Potom sa preniesli na nitrocelulózový filter (Hybont-CO, Amersham) pomocou elektroprenosu (Biorat unit) v nasledujúcom prenosovom pufri (14,4 % (hmotnosť/objem) glycín, 3 % (hmotnosť/objem) Tris-Baze, 0,2 % (hmotnosť/objem) SDS, 20 % (ob jem/ob jem) metanol) pri 40 mV cez noc.

To, či sa nanieslo rovnaké množstvo proteínu, sa kontrolovalo odfarbením nitrocelulózového filtra tesne po ukončení prenosu v 0,05 % CPTS (štvorsodná soľ Cu-ftalocyanínu tetrasulfónovej kyseliny) a 12 mM HC1. Filtre sa potom odfarbili 2 až 3 prepláchnutiami v roztoku 12 mM HC1 a prebytok farbiva sa odstránil roztokom 0,5 M NaHCO₃ počas 5 až 10 minút, potom nasledovalo prepláchnutie v deionizovanej vode. Filtre sa blokovali 1 hodinu v roztoku TBS-Tween (2,42 % (hmotnosť/objem) Tris-HCl, 8 % (hmotnosť/objem) NaCl, 5 % prebytok antiséra (hmotnosť/objem) BSA.

Tween 20 (polyxyetylénsorbitan monolaurát), pH 7,6) obsahujúci 5 % (hmotnosť/objem) BSA. Potom sa 20 minút premývali v roztoku TBS-Tween doplnenom 2 % (hmotnosť/objem) BSA. Nepriame imunodetekcie sa uskutočňovali s antisérom Cry 1 A(c) alebo Cry V v riedení 1:2000 ako prvou protilátkou a s králičím protikráličím antisérom v riedení 1:1000 ako druhou protilátkou konjugovanou s chrenovou peroxidázou (HRP). Akýkoľvek sa vymyl TBS-Tween doplnenom 2 % Detekcia ECL (zosilnená chemiluminiscencia) sa uskutočňovala s použitím protokolov opísaných firmou Amersham. Akékoľvek pozadie sa odstránilo ďalším premývaním membrán v roztoku uvedenom vyššie. Potom sa uskutočnila detekcia ECL.

Stanovenie úrovne expresie génu B. thuringiensis sa uskutočnilo na laserovom denzitometri LKB 2222-020 Ultroscan XL (Pharmacia). Hélium-neónový laserový lúč (vlnová dĺžka 633 nm) na autorádiograme prezeral pás široký 2,4 mm uprostred pásu zodpovedajúceho translačným produktom.

Každý vrchol bol charakterizovaný svojou plochou, vypočítanou vnútorným programovým vybavením prístroja z krivky závislosti absorbancie na pozícii lúča.

Príklad 8

Analýza northernovým prenosom

Celková RNA sa rozdelila do frakcií na 1,2 % agarózovom géle obsahujúcom 2,2 M formaldehyd. Po elektroforéze sa RNA preniesla na membránu Hybont-N (Amersham) kapilárnym prenosom v 20x SSPE. RNA bola fixovaná na membrány kombináciou ožiarenia UV svetlom (Strataling, Stratagene) a zapekania 20 minút v 80 ‘C. cDNA sondy vystrihnuté z pBluescript SK“ štiepením s EcoRI sa označili izotopom ³²PdCTP pomocou náhodných primerov postupom opísaným Feinbergom a Vogelsteinom. Prehybridizácie sa uskutočňovali v roztoku 5x SSPE, 0,1 % SDS, 0,1 % Marvel (sušené mlieko), 100 mg/ml denaturovanej DNA lososej spermy štyri hodiny v 65 'C. Hybridizácie sa uskutočňovali v rovnakom pufre obsahujúcom značenú sondu v 65 °C 12 až 24 hodín.

Filtre sa premyli pri 65 ‘C v 3x SSC, 0,1 % SDS počas 30 minút a raz v 0,5x SSC, 0,1 % SDS počas 30 minút pred autorádiografiou v -80 ’C.

Pokusy s hmyzími škodcami

Účinnosť predloženého vynálezu môže byť pohodlne testovaná sledovaním toho, ako hmyzie larvy požierajú listy transgénnych rastlín obsahujúcich rekombinantné molekuly podľa predloženého vynálezu, a to ako v prítomnosti, tak i v neprítomnosti induktora (kontrola).

Príklad 9

Primárne pozorovanie

Primárne pozorovanie sa uskutočňovalo odohraním listov z rastlín a rozrezaním listov na kúsky veľké 1 cm². Jednotlivé vzorky sa umiestnili oddelene na 0,75 % agar a každý kúsok listu bol infikovaný približne 10 sterilizovanými vajíčkami Heliothis virescens. Listové disky sa zakryli a inkubovali sa v 25 ’C a 70 % relatívnej vlhkosti počas 5 dní pred zaznamenaním účinku larválneho požierania. Poškodeniu listov sa priradila škála v rozmedzí od 0 do 2, odstupňovaná po 0,5. Stupeň 2 označuje nulové poškodenie listov (t.j. úplná ochrana pred požieraním hmyzom je poskytnutá) a stupeň 0 znamená, že listový disk bol larvami úplne zlikvidovaný.

Listy zo všetkých tkanivových kultúr primárnych transformantov konštitutívneho Cryl A(c) a tabaku divého typu sa odobrali a testovali s larvami Heliothis virescens, ako je opísané vyššie. Výsledky ukazuje tab. 2:

TA.BUEKÄ 2

Vzcťc;: \|	PCR+Z-	A	B	c	D	E
35SCrvlA(c) 1 \|	1	1	1 1	2	2 \|	2
2 1	1	1	1	1.5	1	1.5
·*» J		0	0	0 1	o 1	0
d	1	1.5	1	1.5 \|	o 1	1.5
5 \|	PCR + I	0	1.5	o 1	1.5 1	0
6	\|	1.5	0	i 1	1.5	1.5
7	PCR + \|	1.5	1.5	1.5 1	1.5	1.5
S		2	1.5	1	2	'2
9	PCR +	2	2	1.5	2	2
10		1.5	2	1	1	1.5
11		0	1.5	0	0	0
12		0	0	0	0	1
13		2	2	0	0	1
14		1.5	1	0	0	1 o
15		2	1	2	0	0
16	PCR +	2	2	2	2	I 1.5 '
17		2	0	0	1	2
18		0	0	0	1.5	2
19	PCR +	1.5	1.5	1.5	0	1.5
20	PCR +	1.5	1.5	2	1.5	1.5
21		1	0	0	0	0
22		0.5	0	0	2	2
23	1	0	1	0	0.5	1 0.5
24		1.5	1.5	1 0	1 o	0
25		2	1 2	1	1	1 2
26		1	0	0	1 i	1
27		0	1 1-5	1 o	1 1.5	t o
28	\| PCR.+	1 1.5	1 1-5	1.5	\| 1.5	1 1.5
29		0	0	1	1	1.5

Vzorky:	PCR+/-	A	B	C	D	E
30		1	o	0	1.5	0
31	PCR +	1	0	1.5	o 1	1.5
32		2	1	1.5	0	1.5
n		2	2	2	2 1	2
34		1	0	0	1.5	2
35		0	2	0	1	1.5 \|
36		2	0	2	2	0
37		2	1	1.5	1	1.5
38	PCR +	1.5	1.5	1.5	1.5	2
39		1.5	0	0	0	1
40		1	1	0	0	0
41		0	0	1	1	0
42		2	1.5	1.5	1.5	2
43		1.5	1.5	1.5	1.5	2
44		2	1.5	1.5	1.5	1 2
45		2	1 2	1	0	0
46		0	2	1 o	2	1
47		2	2	2	0	0 .
div. typ tabaku		1	2	2	2	0

V typických biologických pokusoch dáva divý typ tabaku prevažne priemerné skóre menej ako 0,5.

Príklad 10

Primárne pozorovanie - opakovanie

Jedenásť z konštitutívnych. C ry 1 A(c) rastlín pestovaných v skleníku a tabak divého typu sa opätovne testovali. Bolo to preto, aby sa dokázalo, že konštitutívne Cry 1 A(c) rastliny, ktoré rástli v pôde v skleníkových podmienkach počas troch týždňov po tkanivovej kultúre, vykazovali tiež znížené poškodenie listov larvami Seliothis virascens.

TABUĽKA 3

vzorka	a	b	c	d	e
35SCrvlA(c) 6	0.5	0.5	2	2	2
M /	2	1	2	2	2
9	0.5	0.5	2	1	0.5
16	2	2	2	2
19	2	2	1.5	2	1.5
20	1.5	1	0	0.5	2
28	0.5	1.5	2	2	2
31	0	0	o	0	1.5
-í *»	2	•2	2	2	7
38	1	0	1	2	1
42	1	1	1	1	1
div. typ tabaku	0	0	0	0	1.5

Príklad 11

Primárne pozorovanie primárnych transromantov cry v

Spôsobom coísaným vyššie sa teszovali listy priroárnycn transformantov konštitutívneho Cry V a divého typu tabaku. Poškodenie spôsobené na vyrezaných kúskocn listov je zaznamenané nižšie v tabulke 4.

TABUĽKA 4

vzorka 1	PCR+/-	a	b 1	c	d
3SSCrvV 1 1	+	0	0	0	0
2		0	0	0	0
3 1		1.5	0	1	0
4	+	0	0	0	0
5		0	0	0	0
6		0	0	0	0
7	+	0	0	0	0
8		0	0	0	0
9	+	0	0	0	0
10	+	0	0	0	1 o
11	+	0	0	0	0
12	0.5	1	1	0.5
13	+	0	1 0	0	0
14	+ .	0	0	0	0
15	+	0	0	0	0
16	0	0	1 o	0
17		0	0	0	0
18		0	0	1 o	t 0
19	1	0	1 o	0	1 0
I 20	0	0	0	0

vzorka 1 PCR+/- a	b	c	d
21 1 0 \| 0 \| 0 \| 0
22	+	0	0	0	0
23 +	0 0 t 0 1 0
24	+ .	0 \| 0	0 \| 0
25 +	0	0 0	0
26	+	0	0	0	0
27	o \| o	0	0
28	1 0	1.5	1
29 \| + \| 0 \| 0	0 1 0
30		0	0 \| 0 \| 0
31 \| + 0.5 0.5 \| 0.5	0
32 + 0 0 \| 0 \| 0
33 \|	0	0	0	0
34	0	1.5	0	0
35		0 0 0 0
36 0 0 0 0
37	0	0	0	1.5
38		0	0 1 0 0
39	0	0	0	0
40	1 o	0 0	0
41 +	0 0.5	0	1.5
42 \| 0 0 0	0
43 \|	0 0 0	0
44		0	0 0 0
45 + 1 0 \| 0	0 0
46 +	0	0	0 0
47 0	0 0	0
88	+	0	0 0	0
49		0.5 0.5 0 0
50		0 0 0	0
51 \| 1 0 \| 0 \| 1
52	1	0.5	0.5	0.5
div. typ tabaku		0	0	0	1.5

Príklad 12

Sekundárne pozorovanie

Aby sa overili údaje získané z primárneho pozorovania, uskutočnilo sa sekundárne pozorovanie poškodenia listov na väčších kúskoch listu z transgénnych línií s použitím lariev v treťom larválnom štádiu.

Listy tabaku sa odrezali z rastliny a prechovávali na ľade až počas jednej hodiny. Z listov sa vyrezali disky s priemerom 40 mm a umiestnili, epidermis smerom dolu, na 3 % agar v plastových miskách s veľkosťou 50 mm. Larvy Heliothis zea chované na umelej výžive LSU počas piatich dní v 25 C sa v treťom larválnom štádiu zvážili a použili na infikovanie listových diskov, vždy jedna na disk. Po infikovaní sa misky uzavreli viečkom a uskladnili v 25 C pod rozptýleným svetlom. Po troch dňoch sa vyhodnotila mortalita, vývojové štádium a koľko percent listového disku bolo larvou skonzumované. Larvy sa zvážili tiež po troch dňoch.

TABUĽKA 5

% POŠKODENIA DISKU 1
VZORKA	A 1	B	1 c 1	D	E 1	F I	G	1 H	1 I 1	J 1
div. typ tabaku	20 \|	15	1 70 1	20	1 30 \|	80	30	I 80	1 o	95 \|
35SCrvlAŕc) 7	<5 1	<5	1 <5	<5	1 <5 1	<5	<5	1 <5	1 <5	<5 1
16	<5 1	<5	1 <5	<5	1 10 1	10	<5	1 <5	1 <5	<5 \|
19	<5 \|	10	1 10	15	1 10 \|	5	10	1 <5	1 <5	20 \|
20	<5 1	<5	1 <5	<5	1 <5 1	<5	<5	1 <5	1 <5	<5 1
28	<5 1	<5	1 <5	<5	1 <5 1	<5	<5	1 <5	1 <5	<5 1
29	20 \|	<5	1 <5	30	1 25 1	25	30	1 25	1 25	i 25 \|

		LARVÁLNE	VÝVOJOVÉ	ŠTÁDIUM					1
div. typ tabaku \|	4	3 \|	5	1 3 \| 3	1	5	1	4 1	5	1	3 1	5 1
35SCrvlAíc) 7 \|	3	3 1	J	1 3 1 3	1	«·» J	1	3 1	J	1	3 i	3 1
16 \|	□	3 1	3	1 3 \| 3	1	J	1	3 1	3	1	3 1	3 1
19 !	J	3 1	J	I 3 1 3	1	0	1	3 1	3	1	3 1	4 1
20 \|	3	3 1	3	1 3 \| 3	1	n J	1	3 1	J	1	3 1	3 1
28 \|	J	3 1	J	1 3 \| 3	1	J	1	3 i	J	1	3 1	3 1
29 \|	4	3	3	1 5 \| 4	1	4	1	4	4	l·	j I	3 1
1
MORTALITA
div. typ tabaku \|	L	1 L	. L	1 L \| L	1	L	1	L	L	1	D	L
35SCrvlA(c)7	L	1 D	D	1 L \| D	1	D	1	D	D	1	D	D
16	D	1 D	D	t D \| L	1	L	1	L	L	1	D	L
19	D	1 L	L	1 L I L	1	L	1	L	D	1	L	1 L
20	D	1 D	D	1 D I D	1	D	1	L	1 L	1	D	1 L
28	D	1 L	D	\| D \| D	1	D	1	D	1 L	1	L	1 D
29	L	1 L	1 D	1 L 1 L	1	L	1	L	1 L	1	L	1 L

'«I Π

Príklad 13

Indukovateľná insekticídna aktivita

Štyridsaťpäť indukovateľných Cry 1 A(c) PCR pozitívnych línií, dve PCR negatívne línie a divý typ tabaku z kvetináčov s veľkosťou 6 palcov (15,2 cm), sa koreňmi ponorili do 100 ml 5 % etanolu. O 28 hodín neskôr sa odobrali malé kúsky listov v 4 opakovaniach a infikovali vajíčkami Heliothis virescens. Výsledky sú zobrazené v tabuľke 6. Zo 45 línií rastúcich v prítomnosti etanolu vykazovalo 66 % plnú rezistenciu pri primárnom pozorovaní s Heliothis virescens. Aby sa dokázalo, že rastliny boli skutočne indukovateľné a neexprimovali gén rezistencie konštitutívne, boli o 8 dní neskôr odobrané listy zo 7 línií s vysokým skóre a infikované vajíčkami Heliothis virescens. Predchádzajúce údaje zo sledovania reportérového génu riadeného spínacím promótorom 35SalcRalcA ukazovali, že hladiny aktivity proteínu CAT vrcholili za 24 až 48 hodín a boli na zostupe po 48 hodinách (obr. 1). Ďalšie údaje (neuvedené) ukazovali, že po 9 dňoch po indukcii nebol proteín CAT vôbec detekovaný.

Tabuľka 7 ukazuje, že bez postreku etanolom bola úroveň mortality porovnateľná s úrovňou pozorovanou u kontrolného divého typu.

TABUĽKA 6

Heliothis virescens na ALC Cryl A(c)
primárne transgénne rastliny zo skleníka
korene v 5% etanole, 28 hodín pred testom
1	\|	1	1
Identita j	PCR+/- 1	3. I	b 1	c 1	♦ a
ALCCrvlA(c) 1 \|	+ i	i 1	2 \|	2	2
2 1	+	2	2 1	2 1
<» J	+ 1	0	o 1	o 1	1.5
4 1	+ i	2	2 \|	2 1	2
5 1	1 T	0.5	0.5	0.5 \|	1
6 )	-	2	1	0.5	0
7	+ 1	0 I	2	1.5	2
8	+	2	2	2	2
9	+	2	2	2	2
10	+	2	2	2	2
11	+	2	2	2	2
12	+	2	2	2	2
13		2	2	2	1 2
14	+	2	2	1 2	2
15	+	2	2	1 2	1 2
16		2	2	2	2
17	+	2	2	2	2
18	+	2	2		1 2
19	+	2	2	2	2
20	+	2	2	2	) 2

21 \|	+	0	0	0	1
22	+	0.5	2	0.5	2
23	+	2	2	2 1	2
24 \|		2 1	2	7	2
25	+	2	2	2	2
26	+	2	2	2	2
27	+	1	2	2	2
28	+	0.5	2	2	2
29	+	2	2	2	7
30	+	2	2	7	2
31	+	2	2	1	2
32	+	2	2	2	2
33	+	1	2	2	7
34	+	2	2	2	2
35	+	1	7	2	2
36	+	2	2	2	1
37	+	0	0.5	0	1
38	-	0.5	0.5	0.5.	0.5
39	+	2	2	2	2
40	+	2	2	2	2
41	+	2	2	2	7
42	-U	2	2	2	2
43	+	2	2	2	2
44	+ i	2	2	2	2
45	+	2	2	2	0.5
46	+	2	2	2	2
47	-L	1	2	2	2
div. typ tabaku		0	0.5	0	0.5

>

<

iá

H

O

CQ <

Eh

•tí z < > J*. w \> z r-°i ž	Ό	—	0.5	0.5	0.5	—	0.5	0.5	0.5	o
a	0.5 I	—	0.5	0.5	o	0.5	0.5	0.5	o
	0.5	—	n	in Ó	04	0.5	o	o	—
cú-	0.5	1.5	O-l	0.5	0.5	0.5	0.5	o	o
t + & u Ph	+	+	+	+	+	+	+
idculihi	r-	32	39	o	T	ΟΊ 'T	44		?

1 INDUKOVANÉ	Ό	04	04	n	04	04	04	04	0.5
O	04	04	04	04	04	04	04	o
_ω	04	04	04	M	04	04	04	m Ó
cti	04	04	04	04	04	04	04	o
PCR+/-	+	+	+	+	+	+	+
J3	θ'-	\| 32	39	O 'T		m 'T	^r	ŕ

Niekoľko línií sa vybralo na sekundárne pozorovanie, aby sa overil účinok indukcie na požieranie hmyzom, spolu s konštitutívnou Cry 1 A(c) líniou 10 a divým typom tabaku ako kontroly. Z primárnych transformantov každej línie sa odobralo 10 kúskov listov 12 dní potom, čo boli indukované namáčaním koreňov v 100 ml 5 % etanolu a umiestnené na 3 % agar v miskách s veľkosťou 50 mm s viečkami a inkubované cez noc pri 25 C a 60 % vlhkosti. Očakávalo sa, že expresia proteínu Cry 1 A(c) bude po 12 dňoch nízka alebo nedetekovateľná. Korene rastlín sa potom namáčali v 100 ml 5 % etanolu. O 22 hodín neskôr sa listy narezali a odobralo sa 10 kúskov listov s veľkosťou 40 mm, ktoré sa umiestnili na 3 % agar v miskách s veľkosťou 50 mm s viečkami. 5 neindukovatelných listových diskov a 5 listových diskov indukovateľných etanolom sa infikovalo larvami Heliothis zea v treťom štádiu a 5 diskov každého typu sa infikovalo larvami Heliothis virescens chovaných ako je opísané vyššie. Tabuľka 8 ukazuje, že kontrolný divý typ vykazuje v prítomnosti či neprítomnosti etanolu vysoké percento skonzumovaných listových diskov, zatiaľ čo kontrolné vzorky 35S vykazujú pri oboch chemických režimoch dobrú kontrolu poškodenia hmyzom. Transgénne línie obsahujúce rekombinantnú molekulu Ale Cry 1 A(c) vykazujú slabú kontrolu poškodenia hmyzom, pokiaľ neboli ošetrené etanolom. Tabuľka 8 ukazuje, že indukcia etanolom poskytuje mieru kontroly poškodenia hmyzom s kontrolou u 35S Cry 1 A(c).

TABUĽKA 8

čí	.sla 1 až	S = H. zea
čisla	6 až 10	= Ξ. vix;	55CSS3

línia	% poško-			% poško-
	denia			denia
div. typ neindukovaný }	45		div. typ indukovaný 1	55
2	0			55
J	25		j	95
4	30 \|		4	50
5	45 \|		5	25
	1
6	95		6	25
7	5		7	55
8	50		8	30
Q ✓	20		9	20
10	15		10	25

35S /10 neindukovaný 1	10		35S /10 indukovaný 1	<5
2	<5		2	<5
n J	15		n J	3
4	10		4	5
5	<5		5	5

6	0		6	<5
7	<5		7	10
8	<5		8	<5
Q ✓	<5		9	0
10	<5		1C	5

66 neindukovaný 1	15 \|	66 indukovaný l\| <5
2	10		2i <5
** J	0		3\| <5
4	50 \|	4( <5
	50 \|	51 10
	1 1
6	ίο 1	6\| 0
** /	10		71 <5
8\| 15	1 8\| <5
9	o 1	91 <5
10	10	10\| <5

Priemyselná -využiteľnosť

Vo vynáleze sa predkladá taký génový systém, kde gény kódujúce aktívne insekticídne proteíny, ako napríklad

6-endotoxíny z B. thuringiensis, sú exprimované indukovateľným spôsobom závislým na použití špecifickej chemickej látky. Proteín s insekticídnym účinkom je teda v rastline exprimovaný iba po exogénnej aplikácii chemickej látky - induktora. Iná možnosť je podobným spôsobom indukovať metabolickú cestu, ktorá vedie k produkcii metabolitov poškodzujúcich hmyz.

Použitie rastlinnej génovej expresnej kazety podľa vynálezu na transformáciu rastlín zníži poškodenie takto transformovaných rastlín hmyzími škodcami radu Lepidoptera a Coleoptera .

Použitie rastlinnej génovej expresnej kazety podľa vynálezu zlepší účinnosť systému integrovanej ochrany rastlín.

Príklady rastlín, ktoré môžu byť podľa vynálezu geneticky modifikované sú poľné plodiny, obilniny, ovocie a zelenina, ako napríklad repka, slnečnica, tabak, cukrová repa, bavlník, sója, kukurica, pšenica, jačmeň, ryža, cirok, paradajky, mangovník, broskyňa, jabloň, hruška, jahoda, banánovník, melón, zemiaky, mrkva, hlávkový šalát, hlávková kapusta a cibuľa.

ZOZNAM SEKVENCIÍ (1) VŠEOBECNÉ INFORMÁCIE (i) PRIHLASOVATEĽ :

(A) MENO: ZENECA LIMITID (B) ULICA: 15 Stanhope Gate (C) MESTO: Londýn (E) ŠTÁT: UK (F) POŠTOVÝ KÓD: W1Y6LN (ii) NÁZOV VYNÁLEZU: CHEMICKY INDUKOVATEĽNÁ

GÉNOVÁ KAZETA (iii) POČET SEKVENCIÍ: 9 (iv:) POČÍTAČOM ČITATEĽNÁ FORMA:

(A) TYP MÉDIA: Floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC compatible (C) OPERAČNÝ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIN Release #1.0, #1.30 (EPO) (vi) PRIORITNÁ PRIHLÁŠKA:

(A) ČÍSLO PRIHLÁŠKY: GB 9516241.8 (B) DEŇ PODANIA: 08-AUG-1995 (2) INFORMÁCIE K SEQ ID NO. 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO. 1:

CATCTCGAGT CGACTATTTT TACAACAATT ÄCCAAC

RASTLINNÁ

Version (2) INFORMÁCIE K SEQ ID NO. 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 53 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO. 2:

CTÄGGTACCG TCGÄCGGATC CGTAAGATCT GGTGTAATTG TAAATAGTAA TTG 53 (2) INFORMÁCIE K SEQ ID NO. 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 36 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO. 3:

CATCTCGAGT CGACTATTTT TACAACAATT ACCAAC 36 (2) INFORMÁCIE K SEQ ID NO. 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO. 4:

CGATGTTGAA GGGCCTGCGG TA 22 (2) INFORMÁCIE K SEQ ID NO. 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 23 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO. 5:

GCACCTCATG GACATCCTGA ACA 23 (2) INFORMÁCIE K SEQ ID NO. 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 20 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO. 6:

CATCGCAAGA CCGGCAACAG 20 (2) INFORMÁCIE K SEQ ID NO. 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 23 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: K SEQ ID NO. 7:

GCTGTAGATG GTCACCTGCT CCA 23 (2) INFORMÁCIE K SEQ ID NO. 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 21 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (Xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO. 8

TGTACACCGA CGCCATTGGC A (2) INFORMÁCIE K SEQ ID NO. 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCIE:

(A) DĹŽKA: 22 párov báz (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLÓGIA: lineárna (ii) TYP MOLEKULY: DNA (xi) OPIS SEKVENCIE: SEQ ID NO. 9:

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Chemicky indukovateľná rastlinná génová expresná kazeta, obsahujúca prvý promótor operatívne spojený s regulačnou sekvenciou odvodenou z génu alcR a kódujúcou regulačný proteín, a indukovateľný promótor operatívne spojený s cieľovým génom kódujúcim proteín, ktorý je škodlivý pre hmyz, alebo ktorého expresia indukuje metabolickú dráhu produkujúcu metabolit škodlivý pre hmyz, pričom indukovateľný promótor je aktivovaný regulačným proteínom v prítomnosti účinného exogénneho induktora, takže aplikácia takéhoto induktora spôsobí expresiu cieľového génu.
2. Chemicky indukovateľná rastlinná génová expresná kazeta, podľa nároku 1, kde cieľový gén kóduje orálne aktívny insekticídny proteín.
3. Chemicky indukovateľná rastlinná génová expresná kazeta podľa nároku 2, kde orálne aktívny insekticídny proteín je prinajmenšom časť 6-endotoxínu z B. thuringiensis.
4. Rastlinná génová expresná kazeta podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 3, kde indukovateľný promótor je odvodený z promótora génu alcA.
5. Rastlinná génová expresná kazeta podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 4, kde indukovateľný promótor je chimérický promótor.
6. Rastlinná bunka obsahujúca rastlinnú génovú expresnú kazetu podľa ktoréhokoľvek z predchádzajúcich nárokov 1 až 5.
7. Rastlinná bunka podľa nároku 6, kde rastlinná génová expresná kazeta je trvalo vložená do rastlinného genómu.
8. Rastlinné pletivo obsahujúce rastlinnú bunku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 a 7.
9. Rastlina obsahujúca rastlinnú bunku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 a 7.
10. Rastlina odvodená z rastliny podľa nároku 9.
11. Semeno pochádzajúce z rastliny podľa ktoréhokoľvek z nárokov 9 a 10.
12. Spôsob kontroly hmyzu vyznačujúci sa tým, že zahrňuje transformovanie rastlinnej bunky rastlinnou génovou expresnou kazetou podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 5.