BE1011397A3 - Procede pour confere une resistance aux insectes a une plante monocotyledone utilisant une sequence de codage de peroxydase. - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne, d'une manière générale, des procédés et des compositions pour lutter contre les insectes dans les plantes monocotylédones (monocotes), en particulier le maïs. Plus précisément, l'invention concerne (1) un procédé pour lutter contre les insectes dans lequel on nourrit un insecte ou on le met en contact avec une quantité insecticide de cellules de plantes monocotylédones transgéniques comprenant une séquence d'ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase et (2) une plante monocote transgénique fertile comprenant une séquence d'ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase.

Description

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  PROCEDE POUR CONFERER UNE RESISTANCE AUX INSECTES A UNE
PLANTE MONOCOTYLEDONE UTILISANT UNE SEQUENCE DE CODAGE
DE PEROXYDASE 
La présente invention concerne, d'une manière générale, des procédés et des compositions pour lutter contre les insectes dans les plantes monocotylédones (monocotes), en particulier le mais. Plus précisément, l'invention concerne (1) un procédé pour lutter contre les insectes dans lequel on nourrit un insecte ou on le met en contact avec une quantité insecticide de cellules végétales monocotylédones transgéniques comprenant de   l'ADN   recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase et (2) une plante monocote transgénique fertile comprenant de   l'ADN   recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase. 



   Les insectes nuisibles sont un facteur majeur dans la perte des récoltes agricoles commercialement importantes dans le monde. On a utilisé de façon poussée un large spectre de pesticides chimiques pour 

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 combattre ou éradiquer les parasites d'importance agricole. Bien que les insecticides soient efficaces pour lutter contre la plupart des insectes nocifs, l'utilisation de ces composés pose des problèmes considérables. Les insecticides sont coûteux à produire et à appliquer. Souvent, des applications répétées sont nécessaires pour obtenir une maîtrise effective. On se soucie également de la résistance qu'ont ou que peuvent acquérir les insectes à un grand nombre des produits chimiques utilisés pour lutter contre eux.

   Les insecticides détruisent souvent des insectes bénéfiques qui sont des pollinateurs ou qui s'attaquent aux insectes herbivores. En outre, l'utilisation   2. long   terme d'insecticides chimiques est un danger pour l'environnement. 



   Des programmes de gestion des parasites sont en cours d'introduction ; ils diminuent l'utilisation d'insecticides chimiques. Ces programmes comprennent l'amélioration des récoltes par la sélection, l'emploi d'agents de lutte biologique et de prédateurs d'insectes, et l'incorporation de gènes résistants aux insectes par des programmes d'élevage et le génie génétique. Les gènes les plus utilisés pour le génie génétique sont les gènes de protéine cristal de Bacillus thuringiensis. Cf, par exemple, Rice et al., EP-A-292 435 et Koziel et al., WO   93/07278.   La majorité des protéines cristal produites par Bacillus sont toxiques pour les larves d'insectes des ordres des lépidoptères, des diptères et des coléoptères.

   En général, lorsqu'une protéine cristal insecticide est ingérée par un insecte sensible, le cristal est solubilisé et agit comme partie toxique. Pour éviter le développement d'insectes qui sont résistants à ces 

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 toxiques, on a besoin de toxines additionnelles qui ont des effets additifs ou synergiques. 



   Les peroxydases appartiennent à une sous-classe d'oxydoréductases qui utilisent un peroxyde   corXme H-Or   en tant que substrat. Les peroxydases sont des glycoprotéines monomères contenant un hème capable de lier des cations bivalents (principalement Ca mais également   Mn') (Maranon   et Van Huystee, Phytochemistry   37 : 1217-1225 (1994) ). Les groupes prosthétiques pour   la peroxydase ont des rôles différents. Tandis que leur groupe hème intervient dans la catalyse, les cations bivalents stabilisent la partie hème, et les groupes glycosyle peuvent aider 2 stabiliser la peroxydase en diminuant sa   vitesse de remplacement (Maranon et Van   Huystee, Phytochemistry 37 : 1217-1225 (1994)). 



   Les peroxydases sont souvent groupées en formes anioniques, cationiques et neutres selon leur   migration   sur des gels à focalisation isoélectrique. Bien que comme enzymes elles   soient considérées comme ayant une   large   spécificité   de substrat, elles semblent bien 
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 avoir certaines"préférences"de substrat pour des isoenzymes différentes (Van Huystee, rin. Pe''. P-ar. t Physio2., 205-219 (1987)). Il existe plusieurs types de peroxydases et d'enzymes apparentées, y   compris la   peroxydase de gualacol, la   NADH peroxydase, la   peroxydase de cytochrome C, la catalase, la glutathicn   peroxydase, la L-ascorbate peroxydase,   et la manganèse peroxydase. 



   Chez les plantes, les peroxydases sont des protéines monomères qui sont des enzymes hautement complexes dont les   activités sont étroitement régulées   par la plante. Les peroxydases sont critiques dans la biosynthèse des parois ces cellules   végatales.   Les   peroxydases favorisent la polymérisation par   

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 peroxydation des monolignols que sont les alcools coniférylique, r-coumarylique et sinapylique en lignine (Greisbach, dans The Biochemistry of Plants, Ed. Conn., Academic, New York pp. 457-480 (1991)). Différentes espèces de plantes ont des rapports différents de l'espèce monolignol assemblée d'une manière semialéatoire (Hwang et al., Carbohydrate Polymers 14 : 77-88 (1991)). La lignification sert à renforcer les parois cellulaires.

   Le résultat global est un durcissement du tissu végétal. 



   On utilise une peroxydase anionique de tabac pour transformer N. tabacum et N.   syl vestri s (Lagr imini,   Plant Cell 2 : 7-18 (1990) ; Lagrimini, Plant Physiology 96 : 577-583 (1991)). Ces plantes transgéniques surexpriment de manière constitutive une peroxydase anicnique de tabac à partir d'un promoteur 35S. Le 
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 phénotype le plus frappant de la surexpression de la y peroxydase est un flétrissement chronique qui commence approximativement au moment de la floraison. En outre, les plantes ont une croissance   retardée,   ont des cellules plus petites et compactées, et brunissent rapidement en réponse à la blessure. 



   On utilise également le même produit d'assemblage pour transformer des plants de tomate (Lagrimini et 
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 al., J. Am. Soc. Hort. Sci. 117 : 1012-1016 (1992) ;   Lagrimini et al., Hortscience 28 : 218-221 (1193) ). On   trouve également que ces plants se flétrissent sévèrement après floraison, et présentent un brunissement excessif et une réduction de la taille des fruits. 



   Des études initiales ont montré que certains tissus de plants de tabac et de tomate transgéniques exprimant un gène de peroxydase anionique de tabac sont résistants à certains insectes   (Dowd et   al., 

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 Présentation au Congrès national de la société d'entomologie   d'Amérique,   Indianapolis, décembre 1993). 



  Le tabac et la tomate sont des plantes dicotylédones   ("dicotes") étroitement   apparentées, appartenant à la même famille, celle des solanacées. En revanche, les monocotes transgéniques de l'invention ont une physiologie, une biochimie, une anatomie et un métabolisme très différents lorsqu'on les compare aux dicotes. Ainsi, les monocotes ont un usage de codon différent, ils emploient le métabolisme C4 au lieu de C3, ont une teneur en acide gras différente, des fleurs imparfaites, etc. Ainsi on ne savait pas s'il existait chez les monocotes des substrats pouvant être utilisés par la peroxydase pour lutter contre les insectes. 



   En outre, les   peroxydases sont des glycoprotéines   qui doivent subir une modification de posttranscription spécifique et une incorporation de groupes   contenant de l'hème   pour être stables et   enzymatiquement actives.   Les peroxydases interviennent dans la synthèse des métabolites secondaires et des lignines dont la nature dépend des substrats disponibles dans la   plante spécifique. Par conséquent,   les produits finals obtenus par expression de peroxydases peuvent différer d'une plante à l'autre. 



   En outre, la résistance aux vers de l'épi de mais est en corrélation négative avec le brunissement de la soie, ce qui indique qu'un accroissement de la peroxydase abaisserait la résistance (Byrne et al., Environ. Entomoi. 18 : 356-360   (1989))   Ceci enseigne qu'il faut s'abstenir d'utiliser une peroxydase pour lutter contre les insectes dans les monocotes. 



   En   outre, l'altération ce la production de Lignine   dans le   mals (dans les mutants bm) provoque ur.   

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 accroissement de la sensibilité aux insectes (Barrière    et Argillier, Agronomie 13 : 865-876 (1983) ). Ainsi, on   ne s'attendrait pas qu'une peroxydase étrangère modifiant la lignification diminue la sensibilité aux insectes. En outre, il était inattendu d'après les enseignements de Bergvinson et al., The Canadian Entomologist 127 : 111-122,1995, qu'une résistance aux insectes soit conférée aux plantes par un durcissement des tissus dû à l'activité de peroxydase dans les premiers stades de la croissance. 



   Par conséquent, avant l'invention, l'effet de l'expression d'un peroxydase recombinante dans les monocotes était imprévisible. 



   Il est fourni des procédés pour lutter contre les insectes et des plantes monocotes résistantes aux insectes. 



   L'invention fournit plus spécifiquement un procédé pour lutter contre les insectes, dans lequel on nourrit un insecte ou on le met en contact avec une quantité insecticide de cellules de plantes monocotylédones transgéniques, comprenant un ADN   reconbinant incluant   une séquence de codage codant pour la peroxydase, où l'expression de la peroxydase confère une résistance aux insectes dans les cellules de plantes monocotylédones transgéniques. 



   L'invention fournit également une plante monocotylédone transgénique fertile dont au moins une partie comprend des cellules ayant un ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase, l'expression de la peroxydase conférant à la plante monocotylédone un trait phénotypique. 



   L'invention fournit également une cellule, un tissu ou une graine de plante transgénique obtenus à partir de la plante décrite ci-dessus. 

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   L'invention fournit en outre les descendants transgéniques de la plante décrite ci-dessus. 



   L'invention fournit également une cellule, un tissu ou une graine de plante transgénique obtenue à partir des descendants décrits ci-dessus. 



   D'autres buts et avantages de l'invention apparaîtront d'après la description qui suit. 



   FIGURE 1. Le plasmide, pJS20293, est présenté comme contenant une peroxydase anionique de tabac insérée entre (1) le promoteur CaMV 35S lié à l'intron rétréci et (2) le terminateur   Cal'-N 35S.   



   FIGURE 2. Représentation du plasmide, pUBIAc. 



   Les définitions suivantes aideront à préciser l'invention. 



   Cellule végétale   : L'unité   structurelle et physiologique des plantes, constituée d'un   protoplaste   et d'une paroi cellulaire. Le   terme de"cellule     végétale"se réfère à   toute cellule qui soit fait partie d'une plante, soit en dérive. Certains exemples de cellules comprennent des cellules différenciées qui font partie   d'une   plante vivante ; des cellules   différenciées   en culture ; des cellules non différenciées en culture ; des cellules d'un tissu non différencié comme un cal ou des tumeurs ; des cellules différenciées de graines, d'embryons, de propagules et de pollen. 



   Tissu végétal : Groupe de cellules végétales organisées en une unité structurelle et fonctionnelle.
Est inclus tout tissu d'une plante dans des planta ou en culture. Le terme inclut, sans s'y limiter, les plantes entières, les organes de plantes, les graines de plantes, les cultures tissulaires ou tout groupe de cellules végétales organisé en unités structurelles   et/ou fonctionne'les. L'utilisation de   ce terme 

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 conjointement avec, ou en l'absence de, tout type spécifique de tissu végétal tel qu'énuméré ci-dessus ou autrement compris par cette définition n'est pas conçue pour exclure un quelconque autre type de tissu végétal. 



   Protoplaste : cellule végétale sans paroi. 



   Plante descendante : plante de génération future obtenue par voie sexuée ou asexuée qui inclut, sans s'y limiter, des plantes progénitures. 



     Plante transgénique : plante   dans laquelle est incorporé de façon stable un ADN recombinant dans son génome. 



   ADN recombinant : toute molécule d'ADN formée par réunion de segments   d'ADN   provenant de différentes sources et produite en utilisant la technologie de l'ADN recombinant. 



   Technologie de   l'ADN   recombinant : technologie qui produit de   l'ADN   recombinant in vitro et transfère   l'ADN   recombinant dans des cellules où il peut être exprimé ou propagé (Cf. Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, dir.

   publ., Juo, CRC   Press, Boca Raton (1996) ), par exemple transfert d'ADN   dans un ou plusieurs protoplastes ou cellules sous diverses formes, y compris, par exemple (1) un   l'ADN   nu sous forme circulaire, linéaire ou superenroulée, (2) un ADN contenu dans des nucléosomes ou des nucléosomes ou leurs noyaux ou parties de noyaux, (3) un ADN complexé ou associé avec d'autres molécules, (4) un ADN inclus dans des liposomes, des sphéroplastes, des cellules ou des protoplastes ou (5) un ADN transféré à partir d'organismes autres que l'organisme hôte (par   exemple Agrobacterium tumefaciens).   Ces procédés d'introduction de   l'ADN   recombinant dans les cellules, ainsi que d'autres,

   sont connus des spécialistes et peuvent être utilisés pour produire les cellules 

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 transgéniques et les plantes transgéniques de l'invention. 



   La technologie de   l'ADN   recombinant inclut également les procédés de haute combinaison homologue décrits dans Treco et al., WO 94/12650 et Treco et al., WO 95/31560 qui peuvent être appliqués à une activité croissante de peroxydase dans une monocote. 



  Spécifiquement, on peut introduire des régions régulatrices (par exemple des promoteurs) dans le génome de la plante afin d'accroître l'expression de la peroxydase endogène. 



   Est également incluse comme technologie de l'ADN   reccmbinant l'insertion d'une séquence de codage   de peroxydase dépourvue de signaux d'expression choisis dans une monocote et le dosage de la plante monocote transgénique pour déterminer l'accroissement de l'expression de peroxydase du aux séquences de   commande     endogène   dans la monocote. Ceci aboutirait à une augmentation du nombre d'exemplaires et de séquences de codage de peroxydase dans la plante. 



   L'insertion initiale de l'ADN recombinant dans le génome de la plante   R' n'est pas définie comme étant   accomplie par des procédés classiques de sélection des plantes mais plutôt par des procédés techniques tels qu'ici décrits. Après l'insertion initiale, on peut propager les descendants transgéniques en utilisant essentiellement des procédés de sélection traditionnels. 



   Gène chimérique :   Molécule d'ADN   contenant au moins deux parties hétérologues, par exemple des parties dérivées de séquences   d'ADN préexistantes   qui ne sont pas associées dans les états préexistants, ces séquences ayant   été ce préférence engendrées en     employant la technique de l'ADN recomb-nan' :.   

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   Cassette d'expression : Molécule d'ADN comprenant un promoteur et un terminateur entre lesquels une séquence de codage peut être insérée. 



   Séquence de codage : Une molécule d'ADN qui lorsqu'elle est transcrite et traduite, aboutit à la formation d'un polypeptide ou d'une protéine. 



   Gène : Région chromosomique discrète comprenant une séquence d'ADN régulatoire à l'origine de la commande de l'expression,   c'est-à-dire   de la transcription et de la traduction, et une séquence de codage qui est transcrite et traduite pour donner un polypeptide et une protéine distincts. 



   Trait phénotypique : Propriété observable résultant de l'expression d'un ou plusieurs gènes. 



   L'invention concerne des procédés pour lutter contre les insectes tels que les coléoptères, les diptères, les hyménoptères, les lépidoptères, les mallophages, les homoptères, les hémiptères, les orthoptères, les thysanoptères, les   dermaptères,   les isoptères, les anoploures, les siphonaptères, et les trichoptères.

   Comme exemples particuliers de tels insectes parasites on peut citer la pyrale européenne du mais, la pyrale de la tige de mais, la noctuelle ypsilon, le ver de l'épi du mais, la chenille de la leucanie, la pyrale du mais du sud-ouest des EtatsUnis, la petite pyrale de la tige de mais, la chenille mineuse de la canne à sucre, le ver des racines du mais de l'ouest de Etats-Unis, le ver des racines de mais du nord des Etats-Unis, le ver des racines du mais du sud des Etats-Unis, les vers fil-de-fer, le hanneton masqué du nord des Etats-Unis, le hanneton masqué du sud des Etats-Unis, le hanneton japonais, l'altise du mais, le charançon du mais, le puceron des feuilles de mais, le puceron des racines de mais, le"chinch bug", le 

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 criquet à pattes rouges, le criquet migrateur, le ver des graines de mais, les teignes des taches du mais,

   les thrips de l'herbe, les fourmis voleuses et les acariens à deux taches. Tout procédé dans lequel l'expression de la peroxydase confère une résistance aux insectes chez les cellules végétales monocotylédones est comprise dans l'invention. 



   Dans un mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé pour lutter contre les insectes en nourrissant les insectes ou en les mettant en contact avec une quantité insecticide de cellules   végétales   mcnocotylédones transgéniques, le génome desdites cellules végétales codant pour une enzyme ayant une activité de peroxydase. Lors de l'expression, la peroxydase confère une résistance aux insectes aux cellules   végétales   transgéniques. Le   transgéne   codant pour la peroxydase constitue un gène additionnel inséré dans le génome   d'une plante progénitrice qui ne   code pas naturellement pour ladite peroxydase. 



   Dans un autre mode de réalisation préféré, on utilise les procédés de recombinaison homologues décrits dans Treco et al.,   WQ   94/12650 et Treco et   al.,     MO     95/31560   pour   augmenter l'activité de percxydase   dans une monocote et ainsi la résistance aux insectes. Spécifiquement, on introduit des régions   régula to ires   (par exemple des promoteurs) dans le génome de la plante pour accroître l'expression de la peroxydase endogène, ce qui augmente la résistance de la plante aux insectes. 



   Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne l'insertion d'une séquence de codage de peroxydase dépourvue de signaux d'expression   sélectionnée dans une monocote   et on dose dans la   plante monoccte transgénique l'accroissement de   

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 l'expression de la peroxydase dû aux séquences de commande endogènes dans la monocote. Ceci aboutit à une augmentation du nombre d'exemplaires de séquences codant pour la peroxydase dans la plante. 



   Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention concerne un procédé pour augmenter le nombre d'exemplaires du gène de peroxydase endogène dans lequel on confère une résistance aux insectes à la plante monocote. Un tel procédé s'accomplit de préférence en utilisant des procédés traditionnels de sélection des plantes ou en utilisant des techniques de culture tissulaire. 



   Les plantes résistant aux insectes comprennent une résistance aux insectes accrue par rapport à celle que l'on trouve dans les plantes natives non manipulées, étant donné les niveaux accrus de peroxydase. 



   L'invention concerne en outre un sachet commercial comprenant des graines d'une plante monocotylédone transformée avec un ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase, où l'expression de la peroxydase confère à ladite plante un trait phénotypique. On préfère dans l'invention un sachet commercial comprenant des graines d'une plante transgénique où l'expression de la peroxydase confère à ladite plante une résistance et une capacité accrue à lutter contre les insectes. Un autre but préféré de l'invention est un sachet commercial de ce type avec des instructions sur une étiquette pour l'utilisation des graines qu'il contient. 



  Résistance aux insectes
De préférence, les monocotes transgéniques de l'invention sont résistantes aux insectes choisis dans les odres incluant, sans s'y limiter, les coléoptères, les diptères, les hyménoptères, les   lépidoptères,   les 

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 mallophages, les homoptères, les hémiptères, les orthoptères, les thysanoptères, les dermaptères, les isoptères, en particulier les coléoptères et les lépidoptères. Pour les buts de l'invention, on reconnaît que les plantes transgéniques de l'invention peuvent être résistantes non seulement aux insectes mais également aux champignons, aux bactéries, aux nématomes, aux mites, etc. 



   Les plants de mais de l'invention sont de préférence résistants à un ou plusieurs insectes choisis dans le groupe qui inclut, sans s'y limiter, Ostrinia nubilalis, la pyrale européenne du mais ; Sesamia nonegrioides, la pyrale de la tige du mais ;   Agrotis ipsilon,   la noctuelle ipsylon ; Helicoverpazea, le ver de   l'épi   de   mais ; SpodcpCera rrugiperda, la   chenille de la leucanie ; Diatraea grandiosella, la pyrale du mais du sud-ouest des états-Unis 
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 E'J. asopa-pus-'ignosellus, la petite pyrale de la tige de mais ; Diatraea. saccharai. s, la chenille mir. euse de la canne à sucre ;   Diabrotica virçifera, le ver de   la   racine du mais de l'ouest des Etats-Unis   ;

   Diabrotica   J. onc'icornis barben,   le ver de la racine de mais du nord des Etats-Unis ; Oiabrotica undecimpunctata howardi, le ver de la racine du mais du sud des EtatsUnis   ;   Milanotus spp, les vers fil-de-fer ; Cyclocephala borealis, le hanneton masqué du nord des Etats-Unis (ver blanc) ;   Cyclocephala immaculaCa,   le hanneton masqué du sud des Etats-Unis (ver blanc)   Popillia   japonica, le hanneton japonais (forme ver et adulte), Chaetocnema pulicaria, l'altise du mais, Spher. ophorus maidis, le charançon du mais ; Rhopalosiphurum maidis, le puceron des feuilles de 
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 mais, Anurapnis maid. 2. radicis, le puceron des raClnes de 

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   maïs, Blissus leucopterus, le "chinch bug" ;

   Melanoplus   femurrubrum, le criquet à pattes rouges ; melanoplus sanguinipes, le criquet migratoire ;   Hylemya platura,   le ver des graines de   maïs Agromyza   parvicornis, la teigne des taches du maïs ; Anaphothrips obscurus, le thrips de l'herbe ; Solenopsis milesta, la fourmi voleuse, et Tetranycus urticae, l'araignée à deux taches. 



   Les plantes de sorgho de l'invention sont de préférence résistantes à un ou plusieurs insectes choisis dans le groupe qui inclut, sans s'y limiter, Chilo pertellus, la pyrale du sorgho ; Spodoptera 
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 frugiperda, la chenille de la leucanie ; eiicoverpa zea, le Over de l'épi de mais ; ascpalpus lignosellus, la petite pyrale de la tige de mais ; Feltia subterranea, la noctuelle granulée ; Phyllophaga   crinita,   ver blanc ; Eleodes Conoderus et Aeolus   spp.,   vers fil-de-fer ; Ouleam melanopus, l'altise des céréales ; Chaetocnema publicaria, l'altise du mais ; Sphenophorus maidis, le   charançon   du    F-. ais     P, rhopalosiphum   maidis, le puceron des feuilles de mais ; 
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 Sipha f 1 ara, le puceron jaune de la canne à sucre ;

   Blissus leucopterus leucopterus, le"chinch bug" Contarinia sorghicola, le moucheron du sorgho Tetranychus cinnabarinus, l'araignée rouge ; et Tetranychus urticae, l'araignée à deux taches. 



   Les plants de blé de l'invention sont de préférence résistants à un ou plusieurs insectes choisis dans le groupe qui inclut, sans s'y limiter, Pseudaletia   unipunctala,   chenille ; Spodoptera frugiperda, la chenille de la leucanie ; Elasmopalpus lignosellus, la 
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 petite pyrale de la tige de mais ; Agrotis orthogonia, la noctuelle pâle de l'ouest des Etats-Unis ; Oulema 

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 melanopus, le hanneton des feuilles de céréale ; Hypera punctata, le charançon des feuilles de trèfle ;   Daibrotica     undecimpunctata   howardii, le ver des racines de maïs du sud des Etats-Unis ; le puceron du blé de   Russie ; Schizaphis graminum,   la punaise verte ;

   Macrosiphum avenae, le puceron des graines d'Angleterre ;   Melanoplus femurrubrum,   le criquet à pattes rouges ;   Melanoplus differentialis,   le criquet différencié ; Melanoplus sanguinipes, le criquet migratoire ; Mayetiola destructor, la mouche de Hesse ; Sitodiplosis moesllana, le moucheron du blé ; Neromyza americana, le ver des tiges de blé ;   h'yernya coarctata, la mouche   grise du blé ;   Frankliniella fusca,   le thrips du tabac ; Cephus cinctus, tenthrède de la tige de blé ; et Aceria tulipae, la mite enroulée du blé. 



   Les plants de riz de l'invention sont de préférence résistants à un ou plusieurs insectes choisis dans le groupe comprenant, sans s'y limiter, Diatraea sacralis, la chenille mineuse de la canne à sucre ; Spodoptera   fruyiperda,   la chenille de la leucanie ; Helicoverpa zea, le ver de l'épi de mais ; Colapsis brunnea, le colaspis du raisin ; Lissorhoptrus oryzophilus, le charançon d'eau du riz   ; Sitophilus oryzae,   le   charançon   du riz ;   Nephotecix nigropictus,   le criquet du riz ; Blissus leucopterus leucopterus, le"chinch bug" ; et Acrosternum hilare, la punaise verte. 



   Les plants d'orge de l'invention sont de préférence résistants à un ou plusieurs insectes choisis dans le groupe comprenant sans s'y limiter, l'Ostrinia   nubilalis,   la pyrale du mais d'Europe ; Agrotis ypsilon, la noctuelle ypsilon ; Schizaphis graminum, la punaise verte ; Blissus leucopterus leucopterus, le 
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 "chinch bug" . crosCernL.'.'r are, la punaise verte 

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 puante ; Euschistus sevos, la punaise brune puante ;
Hylemya platura, le ver des graines de mais ; Alayetiola destructor, la mouche de Hesse ; Thysanoptera, le thrips   ; et Petrobia latens, la   mite brune du blé. 



   Dans un mode de réalisation, l'invention concerne une plante monocotylédone (monocote) transgénique fertile comprenant un ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour une peroxydase. 



   Les monocotes sont des plantes dont l'embryon présente un cotylédon. Les monocotes appartiennent à une des deux grandes classes d'angiospermes (les dicotes étant l'autre grande classe). 



   Les familles préférées dans la classe des monocotes comprennent les graminées (famille de l'herbe ; les membres préférés des graminés comprennent les herbes à fourrage (par exemple Festuca (fétouque)),   hordes. :     (orge), Avena (avoine),   Zea mays   (mais), Tricc   (blé),Secale(seigle),Sorgumvulgare(sorgho),et Oryza saliva (riz) ; les liliacées (familles du lys ; de préférence Allium (oignon) et Asparagus ; et les   dioscoréacées   (famille des ignames) qui sont tous compris dans l'invention.

   L'invention inclut   également   sans s'y limiter, les espèces monocotes, par exemple les lignées préférées de Zea mays comprennent Funk 5N984, Funk 5N986, Funk 2717,   Funk 211D,   Funk   2N217A,   B73, A632, CM105, B37, B84, B14,   Mol7, A188, CG00526,   CG00615 et CG00714. 



   Les propriétés génétiques conférées par génie génétique à des graines et à des plantes transgéniques mentionnées ci-dessus se tranmettent par reproduction sexuée ou croissance végétative et peuvent être ainsi maintenues ou propagées dans les plantes descendantes. Généralement le maintien et ladite propagation font appel à certains procédés agricoles connus mis au point 

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 pour s'adapter à des   objectifs spécifiques cornue   le labourage, l'ensemencement ou la récolte. On peut également appliquer des procédés spécialisés comme la culture hydroponique ou les techniques en serre.

   Etant donné que la culture en cours de croissance est vulnérable à l'attaque et au dommage causé par les insectes ou aux infections ainsi qu'à la comptétition par des mauvaises herbes, des mesures sont prises pour lutter contre les mauvaises herbes, les maladies de plantes, les insectes, les nématodes et autres conditions négatives afin d'améliorer le rendement. Ces mesures comprennent des mesures mécaniques   cornue   le labourage du sol et l'enlèvement des mauvaises herbes et des plantes infectées ainsi que l'application de produits agrochimiques   comme   les herbicides, les fongicides, les gamétocides, les nématicides, les régulateurs de croissance, les agents de mûrissement et les insecticides. 



   L'utilisation des   propriétés génétiques   avantageuses des plantes et graines transgéniques selon l'invention peut encore se faire dans la sélection des plantes qui visent au développement de plantes ayant des   propriétés améliorées comme   la tolérance aux parasites, herbicides ou au stress, une valeur   nutrltionnelle   accrue, un rendement augmenté, ou une structure améliorée provoquant moins de pertes par verse ou destruction. Les divers stades de sélection sont caractérisés par une intervention humaine bien définie comme une sélection des lignées à croiser, une conduite dirigée de la pollinisation des lignées parer. tales, ou une sélection des plantes descendantes appropriées. Selon les   propriétés   désirées, on prend différentes mesures de sélection.

   Les techniques pertinentes sont bien connues des   spécialistes et   

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 comprennent, sans s'y limiter, l'hybridation, la sélection consanguine, le rétrocroisement, la sélection multilignée, le mélange de variétés, l'hybridation interspécifique, les techniques   aneuploides,   etc. Les techniques d'hybridation comprennent également la stérilisation des plantes pour donner des plantes stériles mâles ou femelles par des moyens mécaniques, chimiques ou biochimiques. La pollinisation croisée d'une plante stérile mâle avec un pollen d'une lignée différente assure que le génome de la plante mâle stérile mais fertile sous forme femelle reçoivent uniformément les propriétés des deux lignées parentales.

   Ainsi, les graines et plantes transgéniques selon l'invention peuvent être utilisées pour la sélection de lignées végétales améliorées qui par exemple augmentent l'efficacité des procédés classiques comme le traitement par herbicides ou pesticides ou permettent de se dispenser desdits procédés de par leurs propriétés génétiques modifiées. On peut également obtenir de nouvelles récoltes   ayan une   tolérance au stress améliorée qui, de par leur "équipement   génétique"optimisé,   donnent   des produits   récoltés de meilleure qualité que les produits qui ne peuvent tolérer des conditions de développement défavorables qui soient comparables. 



   Dans la production des graines, la qualité de la germination et l'uniformité des graines sont les caractéristiques essentielles du produit, tandis que la qualité et l'uniformité de germination des graines recueillies et vendues par l'agriculteur n'est pas importante. Etant donné qu'il est diffile de maintenir une récolte pure de toutes autres graines de plantes cultivées et de mauvaises herbes, pour lutter contre les maladies portées par les graines, et pour produire 

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 des graines ayant une bonne germination, les producteurs de graines ont mis au point des pratiques de production de graines assez extensives et bien définies, avec l'expérience de la technique de culture, du conditionnement et de la mise sur le marché de graines pures.

   Ainsi, la pratique courante des agriculteurs consiste à acheter des semences certifiées répondant à certaines normes de qualité spécifiques au lieu d'utiliser des graines recueillies dans leurs propres cultures. Les matériaux de propagation à utiliser comme graines sont habituellement traités avec un revêtement protecteur comprenant des herbicides, des insecticides, des fongicides, des bactéricides, des nématicides, des   mollusquicides   ou leurs mélanges. Les revêtements protecteurs habituellement utilisés comprennent des composés comme le captan, la carboxine, le thirame   (TMTDO),   le   méthalaxyle (A ? ron&commat;), et le     pirimiphos-méthyle (Actellic&commat;).

   Si on   le désire, on formule ces composés avec d'autres supports, agents   tensio-actifs   ou adjuvants favorisant l'application habituellement employés dans la technique de formulation peur conférer une protection contre les dommages provoqués par les parasites bactériens, fongiques ou animaux. On peut appliquer les revêtements protecteurs en imprégnant le matériau de propagation avec une formulation liquide ou en le revêtant d'une formulation humide ou sèche combinée. D'autres procédés d'application sont   également possibles, comme   le traitement dirigé vers les bourgeons ou les fruits. 



   Un autre aspect de l'invention consiste à fournir de nouveaux   procédés agricoles   tels que les procédés donnés en exemple ci-dessus qui se caractérisent par   l'utilisation de plantes transgéniques, de matériaux   

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 végétaux transgéniques, ou de graines transgéniques selon l'invention. 



   Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne une cellule végétale, un tissu, un organe, une graine ou une partie de plante transgénique obtenus à partir de la plante transgénique. Sont également inclus dans l'invention les descendants transgéniques de la plante ainsi que les cellules, tissus, organes, graines et parties de plantes transgéniques obtenus à partir des descendants. 



   Telle qu'ici décrite, l'invention concerne une plante monocote transgénique fertile transformée avec une séquence de codage de peroxydase. De préférence, la séquence de codage de peroxydase confère à la plante monocote un trait phénotypique que l'on ne trouve pas chez une plante parente dépourvue de la séquence codant pour la peroxydase ou de sa   surexpresslon.   Les traits phénotypiques qui peuvent être produits comprennent la résistance aux insectes et une capacité accrue à lutter. 



   De préférence encore, la séquence de codage de peroxydase dans la plante transgénique est sexuellement transmise. Dans un mode de réalisation préféré, la séquence de codage de peroxydase est sexuellement transmise par un cycle sexué normal complet de la plante RO à la génération   RI.   On préfère en outre que la séquence de codage de peroxydase   soit : exprimée   de manière que le niveau de peroxydase dans les cellules, les tissus, les graines ou les plantes soient accru audessus du niveau que l'on trouve dans les cellules, les tissus, les graines ou les plantes d'une monocote qui ne diffère qu'en ce que la séquence de codage de la peroxydase est absente. 



   Dans un mode de réalisation   préféré,   la séquence de codage de peroxydase est une séquence de codage de 

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 peroxydase anionique, cationique ou neutre. Dans un autre mode de réalisation préféré, la peroxydase est une peroxydase de guaïacol, la NADH-peroxydase, la cytochrome-C peroxydase, la catalase, la glutathion peroxydase, la L-ascorbate peroxydase, la manganèse peroxydase, la peroxydase produisant le peroxyde d'hydrogène, et/ou la peroxydase formant la lignine. 



   Les spécialistes disposent et peuvent employer dans l'invention de diverses séquences codant pour la peroxydase. Ainsi, on a   cloné   des peroxydases à partir du tabac, (Lagrimini,   H.   et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 



  USA 84 : 7542-7546 (1987), de la pomme de terre (Roberts et al., Plant Molecular Biology 11 : 5-26 (1988) ; du 
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 raifort (Fujiyama et al., European Journal cf Biochemistry, 173, 681-687   (19E8)   ;   Fujiyama   et al. 



  Gene 89 : 163-169 (1990) et Welinder, K. G., European Journal of Biochemistry 96 : 483-502   (1979)),   de la tomate (Roberts, E. et Kolattukudy, P.   E. Noiecular Genes   and   Genèses,   217,223-232 (1989)), de l'arachide (Buffard 
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 et al., Proc. NaU. Acad. 5ci. USA 87 : 8874-8878 (1990)), du concombre (Morgens el aL., PlaC blecular Biology, 14 : 715-725 (1990)), d'Arabidcpsis (Intapruk et al. Gene 98 : 237-241   (1991))   ; du blé   (Hertig   et al., Plant Molecular Biology 16 : 171-174 (1991) ; et Rebmann   et al., Plant Molecular Biology 16 : 329-331 (1991) ), de   l'orge (Rasmussen, S. K. et al., Plant molecular Biology 16 : 317-327 (1991) ; et Theilade, 3. et Rasmussen, S.

   K.,    Gene 118 : 261-266 (1992) ), du riz (Reimman et al., Plant   Physiology 100 : 1611-1612 (1992)), du mais (Hwang, thèse de Ph. D., université d'état de l'Ohio), et du navet   (Mazza     et Welinder, European Journal of   Biochemistry 108 : 481-489 (1980)). 



   Les séquences de   codage de peroxydase utilisées   dans l'invention ne   doivent pas être limitées aux   

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 séquences de codage de peroxydase connues. On peut isoler de nouvelles séquences de peroxydase pour utilisation dans l'invention par identité ou similitude avec des séquences connues. La peroxydase anionique de tabac présente une identité ou une similitude avec les séquences d'acides aminés de la peroxydase cationique de raifort et de la peroxydase cationique de navet. 



  L'identité ou similitude globale entre le tabac et le raifort est de 52% ; pour le tabac et le navet, les peroxydases ont une identité ou une similitude de   46.   



  En outre, il existe des régions dans la séquence de codage de peroxydase dans laquelle l'identité ou la similitude approche de   loots.   Quatre de ces régions conservées correspondent à des domaines critiques pour l'activité générale de peroxydase. Par conséquent, on peut utiliser des séquences d'ADN provenant des régions conservées pour cloner d'une manière   générale   les séquences codant pour la peroxydase provenant ce n'importe quelle espèce de plante en utilisant des procédés bien connus des spécialistes (cf. par exemple, Current Protocols in Molecular Biology, dlr. publ. : Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc.   York, buzz   (printemps 1996)). 



   De même, on peut isoler de nouvelles séquences de peroxydase en utilisant des anticorps suscités contre une enzyme de peroxydase afin d'isoler d'autres enzymes de peroxydases. On a mis en évidence une homologie entre les divers lyzozymes de peroxydases avec des anticorps suscités avec la peroxydase anionique de tabac. Par analyse d'immunobuvardage, ces anticorps réagissent fortement de façon croisée avec les isozymes de raifort et de navet et réagissent également de façon croisée avec la plupart des autres lsozymes de tabac (cf. Lagrimini, M. et   al.,   Proc. Natl. Acas.   5ci. USA   

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 84 : 7542-7546 (1987).

   On peut séquencer les nouvelles enzymes peroxydases en utilisant des procédés bien connus des spécialistes, et l'on peut isoler leurs séquences de codage correspondantes en utilisant des procédés bien connus des spécialistes (par exemple voir, Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2ème édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1988)). 



   L'expression transgénique dans les plantes de séquences de codage de peroxydase dérivées de sources autres que la plante hôte (par exemple de sources bactériennes) peut nécessiter la modification de ces séquences de codage pour réaliser et optimiser leur expression chez la plante hôte. Dans certains cas, une modification des séquences de codage et de la séquence adjacente n'est pas nécessaire. Il suffit d'isoler un fragment contenant la séquence de codage à laquelle on s'intéresse et de l'insérer en aval d'un promoteur végétal. Par exemple voir, Gaffney et al., Science 261 :   754-756   (1993). De   préférence,   on doit laisser aussi peu que possible de séquences microbiennes adjacentes attachées en   amont de l'ATG   et en aval du codon d'arrêt. 



   On peut optimiser l'accroissement de l'expression de la séquence de codage de peroxydase dans la monocote hôte. Ainsi, étant donné que l'usage du codon et la fréquence du codon   préférées   chez la plante hôte peuvent différer de l'usage et de la fréquence des séquences de codage de peroxydase auxquelles on s'intéresse, la comparaison de l'usage et de la fréquence des codons dans une séquence de codage clonée avec l'usage et la fréquence dans des séquences de codage de plantes   (et en particulier des séquences   de codage   prcvenant de la plante cible) permet une   

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 identification des codons dans la séquence de codage que l'on peut modifier de préférence.

   Les codons préférés peuvent être déterminés à partir des codons ayant la fréquence la plus élevée dans les protéines exprimées en plus grande quantité dans la plante ou à partir des codons les plus préférés dans la plante. (Cf par exemple, Adang et al., EP-A-359 472 ; Fischhoff et al., EP-A-385 962 ; Cornelissen et al., WO 91/16432 ; Koziel et al., WO 93/07278 ; Perlak et   al.,   Proc. Natl. 



    Acad.   Sei. USA 88 : 3324-3328 (1991) ; et Hurry et   al.,   Nucleic Acids Research 17 : 477-498 (1989). 



   De cette manière, on peut optimiser l'expression des séquences nucléotidiques dans la plante spécifique à laquelle on s'intéresse. On reconnaît que la totalité ou une quelconque partie de la séquence de codage peut être optimisée ou synthétique. Autrement dit, on peut également utiliser des séquences synthétiques ou partiellement optimisées. 



   Les plantes diffèrent des micro-organismes en ce que leurs messages ne possèdent pas un site de liaison ribosomique défini. Les ribosomes s'attachent plutôt à   l'extrémité   5'du message et balayent pour rechercher le premier ATG disponible auquel commencer la traduction. Chez les plantes, il existe une préférence pour certains nucléotides adjacents à l'ATG et ainsi, l'expression des gènes microbiens peut être accrue par l'inclusion d'un initiateur de traduction consensus eucaryotique à l'ATG. Clontech (1993/1994 catalogue, page 110) ont suggéré une séquence comme initiateur de traduction consensus pour l'expression du gène d'E. coli   nid. 4 dans   les plantes. En outre, Joshi,   Muck.   Acid.

   Res. 15 : 6643-6653 (1987) compare de nombreuses séquences végétales adjacentes à   l'ATG   et suggère également une séquence consensus. Dans les situations 

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 dans lesquelles on rencontre des difficultés dans l'expression de séquences de codage microbiennes dans les plantes, on préfère l'inclusion de l'une de ces séquences à l'ATG initiateur. 



   Les séquences de codage clonées à partir de sources non végétales peuvent également contenir des motifs qui peuvent être reconnus dans les plantes sous forme des sites d'épissage en 5'ou 3', produisant ainsi des messages tronqués ou délétés. Ces sites peuvent être retirés en utilisant les techniques connues des spécialistes (cf. par exemple, Current Protocols in Molecular Biology, dir. publ.   Ausubel   et al., John Wiley & Sons, Inc. New York, NY (printemps   1996)).   



   On peut utiliser un ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour une peroxydase dans le but de produire des tissus   végétaux transgéniques. Cn   transforme de préférence une plante avec au moins un ADN recombinant qui peut en cutre comprendre une région d'initiation de transcription et un promoteur, tous deux étant liés de manière opératoire à la séquence de codage de la peroxydase. 



   Les régions   d'initiation de transcription peuvent   être natives ou étrangères pour l'autre. Le terme d'étrangère signifie que la région d'initiation de transcription ne se trouve pas chez l'hôte de type sauvage dans lequel la région d'initiation de transcription est introduite. 



   On peut obtenir la région de terminaison à partir de (1) le même gène que celui à partir duquel on a obtenu la région d'initiation de transcription, (2) le gène de peroxydase utilisé, ou (3) une autre source. 



   La séquence de codage de peroxydase est de préférence   fusionnée de manière opératoire   à un promoteur   expressible dans la plante, e les promoteurs   

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 préférables comprennent des promoteurs constitutifs, inductibles, temporairement régulés, régulés dans leur développement, chimiquement régulés, préférés d'un tissu et/ou spécifiques d'un tissu. Dans un mode de réalisation préféré, la séquence de codage de peroxydase est liée de manière opératoire à son promoteur naturel et/ou à la séquence signal de polyadénylation. 



   Les promoteurs constitutifs préférés comprennent les promoteurs CaMV   355   et 19S (Fraley et al, brevet américain   NO 5   352 605). Un promoteur préféré additionnel est dérivé de l'une quelconque ou de plusieurs des gènes d'actine, qui sont connus pour être exprimés dans la plupart des types cellulaires. Les cassettes d'expression de promoteur décrites par McElroy et al, Mol. Gen. Genet. 231 : 150-160 (1991) peuvent être facilement modifiés en vue de l'expression de la séquence de codage de la peroxydase et conviennent particulièrement pour utilisation chez les hôtes monocotylédones. 



   Un autre promoteur constitutif encore préféré est dérivé de l'ubiquitine, qui est un autre produit génique connu pour s'accumuler dans de nombreux types cellulaires. On a clone le promoteur de l'ubiquitine à partir de plusieurs espèces aux fins d'utilisation dans des plantes transgéniques (parexemple le tournesolBinet et al., Plant Science 79 : 87-94 (1991), le maisChristensen et al. Plant Molec. Biol. 12 : 619-632   (1989)).   On a mis au point le promoteur de l'ubiquitine de mais dans des systèmes monocotes transgéniques et les vecteurs construits pour la transformation d'une monocote sont décrits dans Christiansen et al., EP-A- 342 926. Le promoteur de l'ubiquitine convient pour l'expression de la séquence de codage de peroxydase 

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 chez les plantes transgéniques, en particulier les monocotylédones. 



   Les promoteurs spécifiques d'un tissu ou préférentiels d'un tissu utiles pour la séquence de codage de peroxydase chez les plantes, en particulier le mais, sont ceux qui dirigent l'expression dans la racine, la médulla, la feuille ou le pollen. De tels promoteurs sont décrits dans   Koziel et al., HO   93/07278. On préfère également des promoteurs chimiquement inductibles utiles pour diriger l'expression de la séquence de codage de la peroxydase dans les plantes (cf, Alexander et   al.,   HO 95/19443). 



   Outre les promoteurs, on dispose également de divers terminateurs de transcription pour utilisation dans la construction d'un gène chimérique utilisant une séquence de codage de peroxydase. Les terminateurs de transcription sont à l'origine de la terminaison de la transcription au-delà du transgène et de sa   polyadénylation   correcte. Les terminateurs de transcription appropriés et ceux qui sont connus pour fonctionner dans les plantes comprennent le terminateur   CaMV   35S, le terminateur tml, le terminateur rbcS   E9 du   pois et d'autres connus des spécialistes. On trouve des régions de terminaison commodes dans le plasmide Ti d'A.   tumefaciens, commue   les régions de terminaison de l'octopine synthétase et de la nopaline synthétase.

   Voir également Rosenberg et   al.,   Gene 56 : 125   (1987)   ; Guerineau et al.,   illol.   Gen. Genet., 262 : 141-144 (1991) ; Proudfoot, Cell, 64 : 671-674 (1991) ; Sanfacon et al., Genes   Dev.,   5 : 141-149 ; Iogen et al., Plant Cell, 2 :   1261-1272 (1990) ; Munroe   et   al.,   Gene, 91 : 151-158 
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 (1990) ; Ballas et al., cleic Acids Res. 17 : 7891-7903 (1989) ; Joshi et al., 'clec cid Res. 15 : 9627-9639 (1987)). 

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   On a également trouvé que de nombreuses séquences accroissent l'expression du gène à partir duquel l'unité de transcription et ses séquences peuvent être utilisées conjointement à la séquence de codage de la peroxydase pour accroître l'expression dans les plantes transgéniques. On a montré que diverses séquences d'intron accroissent l'expression, en particulier dans les cellules monocotylédones. Ainsi, on a trouvé que l'intron du gène Adh 1 du mais accroît de manière significative l'expression de gène de type sauvage sous son promoteur apparenté lorsqu'on l'introduit dans des cellules de maïs (Callis et al., Genes Develop. 1 :   1183-1200 (1987) ). On a incorporé de manière habituelle   des séquences d'intron dans des vecteurs de transformation de plantes, typiquement dans la séquence de tête non traduite. 



   Le produit d'assemblage peut également induire un régulateur comme un signal de localisation nucléaire (Kalderon et   al.,   Cell 39 : 499-509   (1984)   et Lassner et   al.,   Plant Molecular Biology 17 : 229-234 (1991)), une séquence consensus de traduction végétale (Joshi, C. P., Nucleic Acids Research 15 : 6643-6653 (1987)), un intron (Luehrsen et Walbot,   tool.   Gen. Genet. 225 : 81-93 (1991)), etc liée de manière opératoire à la séquence nucléotidique appropriée. 



   De préférence, la séquence de tête Sc est incluse dans le produit d'assemblage de la cassette d'expression. De telles séquences de têtes peuvent agir pour accroître la traduction. Les séquences de tête de traduction sont connues des spécialistes et comprennent : le séquences de tête de picornavirus, par exemple la séquence de tête d'EMCV (région non codante 5 c   d'Encéphalomyocardite)   (Elroy-Stein,   O.   Fuerst, T. R. et Moss, Proc.   aU. Acad. 5ci.

   U5A 86   : 6126-6130 

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   (1989) ) ; les séquences de tête de potyvirus, par   exemple, la séquence de tête de TEV, par exemple le virus de l'attaque du tabac) ; Virology, 154 :   9-20   (1986), et la protéine de liaison à chaîne lourde de l'immunoglobuline humaine   (BiP),   (Macejak, D. G., et Samow, P, Nature, 353 : 90-94 (1991) ; la séquence de tête non traduite de   l'ARNm   de la protéine d'enveloppe du virus de la mosaïque de la luzerne   (AMV   ARN 4) (Jobling, S. A. et Gebrke, L., Nature, 325 : 622-625   (1987) ) ; la séquence de tête du virus de la mosaïque   du tabac   (TMV) (Gallie, D.

   R.   et al., Molecular-Biolocy   or RNA,   pages 237-256 (1989)) ; et la séquence de tête du virus des   taches chlorctiques du mais (MCMV)   (Lommel, S. A. et   al.,   Virology 91 : 382-385   (1991)).   Cf également, Della-Cicppa et al., Plant Physiolcgy   84 : 965-968   (1987). 



   Lorsqu'on prépare l'ADN recombinant, on peut manipuler divers   fragments d'ADN de manière   à pourvoir aux séquences d'ADN dans l'orientation correcte et, de manière appropriée, dans le cadre de lecture convenable. A cet effet, on peut employer des adaptateurs ou des lieurs pour réunir les fragments d'ADN, ou bien on peut faire appel à d'autres manipulations pour assurer des sites de restriction commodes, l'élimination de l'ADN superflu, cn emploie de préférence une mutagenèse in vitro, une réparation des amorces, une restriction, un annelage, une résection, une ligature, etc, lorsqu'il s'agit d'insertions, de délétions ou de substitutions, par exemple de transitions et de transversions. 



   On dispose de   nombreux   vecteurs de transformation pour la transformation des plantes, et l'cn peut utiliser les séquences de codage de la peroxydase conjointement avec n'importe lequel de ces vecteurs. La 

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 sélection d'un vecteur pour l'utilisation dépend de la technique de transformation préférée et de l'espèce cible pour la transformation. Pour certaines espèces cibles, on préfère des antibiotiques ou des marqueurs de sélection d'herbicides différents.

   Les marqueurs de sélection employés habituellement dans la transformation comprennent le gène   nptII qui   confère la résistance à la kanamycine et aux antibiotiques apparentés (Messing & Vierra, Gene 19 : 259-268   (1982)   ;   Bevan et al., Nature 304 : 184-187 (1983) ), le gène bar   qui confère une résistance à l'herbicide phosphinothricine (White et al.,   Nue1.   Acids Res. 



  18 : 1062 (1990), Spencer et al., Theor.   Applic.   Genet. 



    79 : 625-631 (1990) ), le gène hph qui confère une   résistance à l'antibiotique hygromycine (Blochinger & Diggelmann, Mol. Cell. Biol. 4 : 2929-2931), et le gène dhfr, qui confère une résistance au   méthotrèxate   (Bourouis et al., EMBO J. 2 : 1099-1104 (1983). 



   De nombreux vecteurs sont disponibles pour la 
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 transformation en utilisant çrobacer tumefaciens. Ils portent typiquement au moins une séquence   c'ADN-T   et comprennent des vecteurs tels que pBIN19 (Bevan,   Nucl.   Acids. Res. 12 (22) : 8711-8721 (1984)). Dans un mode de réalisation préféré, la séquence de codage de la peroxydase peut être insérée dans l'un ou l'autre des vecteurs binaires pCIB200 et pCIB2001 pour utilisation avec Agrobacterium.

   Ces cassettes de vecteur pour la transformation se faisant par la médiation d'Agrobacterium peuvent être cosntruites de la manière suivante. pTJS75kan a été créé par digestion par   NarI   de pTJS75 (Schmidhauser &   Hellr1s : l, J   Bactoril. 164 : 446-455   (1985))   permettant l'excision du gène de la résistance à la tétracycline, puis par insertion d'un fragment   AccI   provenant   de pUC4K pcrtan   

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 un NPTII (Messing & Vierra, Gene 19 : 259-268 (1982) ; Bevan et   al.,   Nature 304 184-187 (1983)   ; McBride   et    al., Plant Molecular Biology 14 : 266-276 (1990) ).

   On   ligature des lieurs   XhoI   au fragment EcoRV de pCIB7 qui contient les bordures d'ADN T droite et gauche, un gène 
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 chimérique nos/nptII sélectionnable par une plante et le lieur multisite pUC (Rothstein et al., Gene 53 : 153- 161 (1987)), et on clone le fragment digéré par XhoI dans pTJS75kan digéré par SalII pour créer pCIB200 (voir également EP-A-332 104, exemple 19). pCIB200 contient les sites de restriction de lieurs multisites 
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 uniques suivant : EcoRI/SstI/Kp ! 1I/ BglII/X'caI et SalI. pCI2001 est un dérivé de pCIB200 qui est créé par insertion de sites de restriction additionnels dans le lieur multisite.

   Les sites de restriction uniques dans le lieur multisite de pCIB20001   sont EcoRI/SstI/KpnI/   
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 BglII, XbaI, SaT u, BcTT, '.-rTI. pal. pd. et StuI pCI2001, outre qu'il contient ces sites de restriction uniques, possède également une sélection vis-à-vis de la   kanamycine végétale   et bactérienne, des bordures d'ADN-T droite et gauche pour la transformation se faisant par la médiation   d'Agrobacterium,   la fonction   trf. 4 dérivée   de   RK2   pour la mobilisation entre E. coli et d'autres hôtes, et les fonctions OriT et OriV provenant également de   RK2.   Le lieur multisite pCIB2001 convient pour le clonage de cassettes d'expression de plantes contenant leur propre signaux régulatoires. 



   Un autre vecteur utile pour la transformation se faisant par la médiation   d'Agrobacterium   est le vecteur binaire   pCIBIO qui contient un gène codant pour la   résistance à la kanamycine aux fins de sélection dans des plantes, des   séquences bordures droite   et gauche d'ADN-Tetincorporedesséquencesprovenantdu 

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 plasmide pRK252 à large gamme d'hôtes, lui permettant de se répliquer à la fois dans E. coli et dans Agrobacterium. Sa construction est décrite par Rothstein et al., Gene 53 : 179-188 (1983). On a construit divers dérivés de pCIB10 qui incorporent le gène de l'hygromycine B phosphotransférase décrit par Gritz et al., Gene 25 : 179-188 (1987).

   Ces dérivés permettent la sélection de cellules végétales transgéniques sur l'hygromycine seule (pCIB743), ou l'hygromycine et la kanamycine (pCIB715, pCIB717). 



   Un vecteur de ce genre utile pour les techniques de transfert de gène direct en combinaison avec la sélection par l'herbicide Basta (ou phosphinothricine) est pCIB3064. Ce vecteur se fonde sur le plasmide pCIB246, qui comprend le promoteur   CaMV   35S en fusion opératoire avec le gène GUS d'E. coli et le terminateur de transcription CeNS 35S et est décrit dans Koziel et   al., WO   93/07278. Le gène fournissant une résistance à la phosphinothricine est le gène bar de   Streptomyces   hygroscopicus (Thompson et al., E. ! 30 J. 6 : 2519- 2523   (1987)).   Ce vecteur convient pour le clonage de cassettes d'expression de plantes contenant leurs propres signaux régulatoires. 



   Un vecteur de transformation additionnelle est pSOG35 qui utilise le gène de dihydrofolate réductase d'E. coli (DHFR) comme marqueur sélectionnable conférant une résistance au méthotrexate. On utilise la PCR pour amplifier le promoteur 355 (environ 800 pb), l'intron 6 provenant du gène Adhl du mais (environ 550 pb ; cf   Dennis et al., Nucleic Acid Res. 12 : 3983-4000 (1984) )   et 18 pb de la séquence de tête non traduite de GUS (cf. Jefferson et al., Proc.   Nat. Acad. Sci.

   USA   83 : 8477-8451   (1986)).   On amplifie également un fragment à   250   pb codant pour le gène type II de la 

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 dihydrofolate réductase d'E. coli en utilisant une PCR et on assemble ces deux fragments PCR avec un fragment SacI-PstI de pB1221 (Clontech) qui comprend l'ossature du vecteur pUC19 et le terminateur de nopaline synthétase. L'assemblage de ces fragments engendre pSOG19 qui contient le promoteur 35S en fusion avec la séquence d'intron 6, la séquence de tête GUS, le gène DHFR et le terminateur de nopaline synthétase.

   Le remplacement de la séquence de tête GUS dans pSOG19 avec la séquence de tête du virus de la tache chlorotique du mais   (MCMV) produit   le vecteur pSOG35.   pSOG19   et   pSOG35   portent le gène pUC de la résistance à l'ampicilline et ont des sites HindIII, SphI, PstI et EcoRI disponibles pour le clonage de séquences   étrangères.   



   L'ADN recombinant décrit ci-dessus peut être introduit dans la cellule végétale selon un certain nombre de manières reconnues des spécialistes. Ces spécialistes apprécieront que le choix du procédé peut dépendre du type de plante ciblée pour la transformation. Les   procédés   appropriés de transformation des cellules   végétales   comprennent la micro-injection (Crossway et al., Bio Techniques 4 : 320-    334 (1986) ), l'élécroporation (Riggs et al., Proc.   



    Nacl. Acad. Sci. USA   83 : 5602-5606 (1986), la transformation se faisant par la médiation d'Agrobacterium (hinchee et al., Biotechnology 6 : 915- 921   (1988)     ; voir également, Ishida   et al., Nature Biotechnology 14 : 745-750 (juin   1996)   pour la transformation du mais, le transfert direct de gène (Paszokowski et al., EMBO J., 3 : 2717-2722 (1984)   ;  
Hayashimoto et al., Plant Physiol. 93 : 857-863 (1990)   (riz)), et l'accélération ce particules     balistiques utilisant des dispositifs commercialisés   

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 par Agracetus Inc., Madison, Wisconsin et Dupont, Inc., Wilmington, Delaware (voir par exemple Sanford et al., brevet américain NO 4 945 050 ;

   et   McCabe   et al.,    Biotechnology 6 : 923-926 (1988) ). Cf également,   Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22 : 421-477 (1988) ; Sanford et al., Particulate Science and Technology 5 : 27-37 91987) (oignon) ; Svab et   al.,   Proc. 



  Natl. Acad. Sei. USA 87 : 8526-8530 (1990) (chloroplaste du tabac) ; Christou et al., Plant Physiol. 87 : 671- 674 (1988) (soja) ; Klein et al., Proc.   Natl. Aead. Sei.   



  USA, 85 : 4305-4309 (1988) (mais) ; Klein et al.,   Biollechnology   6 : 559-563 (1988) (mais) ; Klein et al.,   Plant Physiol. 91   : 440-444 (1988) (mais) ; Fromm et al., Bio/Technology 8 : 833-839 (1990) ; et Gordon-Kamm et   al.,   Plant Cell 2 : 603-618 (1990) (mais) ; Koziel et al.

   Biotechnology 11 : 194-200 (1993) (mais)   ; Shimamoto   et   al.,   Nature 338 : 274-277 (1989) (riz) ; Christou et al., Biotechnology 9 : 957-962 (1991) (riz)   ; Delta et     al.,   Bio/Technology   8 :   736-740 (1990) (riz) ; demande de brevet européen-A-332 581 (dactyle   pelotor. né et   autres Pooideae), Vasil et al., Biotechnology   ij :     1553-1558   (1993) (blé) Weeks et al., Plant Physio. 



  102   : 1077-1084   (1993) (blé) ; Wan et al., Plant Physiol. 104   : 37-48   (1994) (orge) ; Jahne et al., theor. Appl. Genet. 89 : 525-533 (1994) (orge) ; Umbeck et al., Bio/Technology 5 : 263-266 (1987) (coton) ; 
 EMI34.1 
 Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90 : 11212- 11216 (déc. 1993) (sorgho) ; Somers et   al.,     Bio/Technology 10   : 1589-1594 (déc. 1992) (avoine) ; Torbert et   al.,   Plant Cell Reports 14 : 635-640 (1995) (avoine) ; Weeks et al., Plant Physio.   102 :   1077-1084 (1993) (blé) ; Chang et al.,   WO   94/13822 (blé) 

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 et Nehra et al., The Plant Journal 5   : 285-297   (1994) (blé). 



   Un ensemble de modes de réalisation particulièrement préférés pour l'introduction des molécules d'ADN recombinantes dans le mais par bombardement de microprojectiles se trouve dans Koziel et al., Biotechnology 11 : 194-200 (1993), Hill et al., Euphytica 85 : 119-123 (1995) et Koziel et al., Annals of the New York Academy of Sciences 792 : 164-171 (1996). Un autre mode de réalisation préféré est le procédé de transformation d'un protoplaste pour le mais tel que décrit dans Shillito et al., EP-A-292   435.   



   On peut procéder à la transformation de plantes avec une seule espèce   d'ADN   ou des espèces   d'ADN   multiples,   c'est-à-dire   une cotransformation, et ces deux techniques conviennent pour utilisation avec la séquence de codage de la peroxydase. 



   On fait appel à des procédés utilisant soit une forme de   transfert direct   de gène, une technique de canon à particules ou un transfert se faisant par la médiation   d'A -robacterium   de manière habituelle, mais non nécessaire, avec un marqueur sélectionnable ou criblable qui fournit une résistance à un antibiotique (par exemple kanamycine, hygromycine ou méthotrexate) ou un herbicide (par exemple phosphinothricine).

   Comme 
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 exemples de tels marqueurs on peut citer la néomycine phosphotransférase, l'hygromycine phosphotransférase, la dihydrofolate réductase, la phosphinothricine acétyltransférase, l'acide 2, 2-dichloropropionique déshalogénase, l'acétohydroxyacide synthétase, la 5- énolpyruvyl-shikimate phosphate synthétase, l'haloarylnitrilase, l'acétylcoenzyme A carboxylase, la dihydroptéroate   synthètase, la chloroamphènicol acétyl      transférase, et la P-glucuronidase. Cependant, le choix   

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 de marqueurs sélectionnables ou criblables pour la transformation des plantes n'est pas critique pour l'invention. 



   La séquence de codage de la peroxydase est de préférence utilisée seule ou en combinaison. Autrement dit, on peut insérer une ou plusieurs séquences de codage de peroxydase dans une plante pour combattre différents insectes parasites. On peut le faire en (1) transformant une plante hôte avec une séquence d'ADN comprenant plus d'une séquence de codage de peroxydase, (2) transformant une plante hôte avec une séquence d'ADN comprenant une seule séquence de codage de peroxydase et en identifiant les insertions multiples de la séquence d'ADN dans le génome hôte, ou (3) en transformant de façon répétée une plante hôte avec une séquence de codage de peroxydase jusqu'à ce que la plante hôte comprenne le nombre désiré de séquences de codage de peroxydase. 



   On peut également accroitre le niveau de protection d'une plante contre les insectes, contre un insecte donné et/ou son spectre d'activité insecticide en combinant une séquence de codage de peroxydase avec d'autres séquences de codage codant pour des protéines capables de lutter contre les insectes. 



     Bacillus thuringiensis   (Bt) est une bactérie sporulante gram-positive qui produit un cristal parasporal au cours de la sporulation. On en trouvera 
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 un examen dans Koziel et al., Biotech. and Gen. Engin. Reviens 11 : 171-228 (1993)). Ces cristaux sont contitués de manière prédominante d'une ou plusieurs protéines, appelées 5-endotoxines ou protéines cristal insecticides, connues pour posséder une activité insecticide lorsqu'elles sont ingérées par certains insectes. On connaît à l'heure actuelle de nombreuses 

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 souches de Bt. Chaque souche produit des nombres différents de 8-endotoxines ayant diverses activité insecticides.

   Comme exemples d'endotoxines Bt que l'on peut utiliser en combinaison avec les peroxydases on peut citer, sans s'y   restreindre, CryIA (b)   (Koziel et al., Bio/Technology 11 : 194-200 (1993)), CryA (c) (brevet américain NO 5 530 197), CrylH (également appelée Cry9C) (Lambert et al., Appl. 



    Environ. Microbiol. 62 : 80-86 (1996) ) et CryIIIA   (Adang et al., Plant   Hol. Biol. 21   : 1131-1145 (1993). 



   Les protéines pesticides produites au cours de la croissance végétative de souches de Bacillus (protéines insecticides   végétatives, FIV) peuvent   également être utilisées en combinaison avec   les   peroxydases. On trouvera des exemples de   PIV dans Marren   et   al.,     MO   94/21795 ;   Warren et al., WO 96/10083   ; et Estruch et al., Proc. Natl.   Acad.     Sci.   USA 93 : 5369-5394 (1996). 



   Comme exemples d'autres protéines avec des composés insecticides qui peuvent être utilisés en combinaison avec les peroxydases on peut citer, sans s'y limiter, les cholestérols oxydases (brevet américain N  5 518 908), les inhibiteurs de   protéase,   les lectines et les a-amylases. 



   On peut préparer des monocotes exprimant plus d'une séquence de codage de la résistance aux insectes, par n'importe quel procédé connu des spécialistes. Ainsi, on peut utiliser la séquence de codage de la peroxydase pour transformer une monocote en même temps qu'un autre gène principal   d'insecte (cotransformation),   le second gène principal d'insecte peut être introduit dans une plante qui a déjà été   transformée avec une séquence   de codage de peroxydase, ou vice versa, ou encore des plantes transgéniques,   l'une   exprimant une séquence de codage de   peroxydase et l'autre exprimant un second   

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 gène principal d'insecte peuvent être réticulées pour amener les séquences de codage ensemble dans la même plante. 



   L'invention est décrite plus en détail dans les exemples non limitatifs qui suivent. Dans les exemples, les procédés de préparation, de manipulation, et d'analyse des acides nucléiques sont réalisés par des modes opératoires de référence tels que décrits dans Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2ème édition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA (1988). 



  EXEMPLES Exemple 1 : Plants de maïs transgéniques comprenant une séquence de codage de peroxydase Construction du vecteur   pPOD. :   (Lagrimini et al., Proc. Natl. Acad. Sei.    



  84 : 438-442 (1987) ) contient l'ADNc de peroxydase   anionique du tabac à 1256 pb qui comprend toute la séquence de codage de la peroxydase, y compris un signal peptide à 22 acides aminés qui facilite la sécrétion dans l'espace de la paroi cellulaire. On digère pPOD3.5 avec BamHI et on le clone dans les sites   BamHI   de pCIB710 (Rothstein et al., Gene 53 : 153-161 (1987)). On digère ce nouveau produit d'assemblage avec EcoRI et on le sous-clone dans Bluescript SK+ (Catalogue Stratagene,   1994)-on   met le produit d'assemblage résultant désigné par pJIS20293 (figure 1) en dépôt   2. l'Agricultural   Research Culture Collection (NRRL) Autorité internationale de dépôt, 1818   N.   



  University Street, Peoria IL 61604 U.   S.     A.   le 27 septembre 1996 sous le NO NRRL B-21626. pJS20293 contient le   clone'd'ADNc   de peroxydase à   1200   pb derrière le promoteur   CaMV 35S   et l'intron rétréci   (Werr et   al.,   D O J. 4   : 1373-1380 (1985)) suivi par 

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 le terminateur CaMV 35S dans un plasmide Blue Script (Stratagene) (figure 1). On cotransforme pJS20293 avec pUBI/Ac   (figure 2),   plasmide contenant un gène bar chimérique codant pour la résistance à la phosphinothricine. 



  Transformation utilisant des embryons zygotiques immatures
Dans deux expériences séparées, on excise de façon aseptique 600 embryons immatures de CG00526, type Lancaster sélectionné en consanguinité, 12-13 jours après pollinisation à partir des épis cultivés en serre et stérilisés à leur surface. Cn dépose en plaques des embryons   d'une   taille de 1,5 à 20 mm avec le scutellum côté haut sur un milieu d'initiation de cal, 2DG4 + 5 
 EMI39.1 
 mg/litre de chloramben. Le milieu 2DG4 est le milieu "D"de Duncan (Duncan et al., Planta 165 : 322-332 (1985)) modifié pour contenir 20 mg/litre de glucose. 



   On précipite l'ADN de pJS20293 sur 1 mm de   microsuppcrt   tel que décrit par le manuel Biolistic de Dupent. On prépare le   mélange ADN/or de marlère à   ce qu'ilfournisseenviron1mgd'ADNdepJS20293par bombardement. Peur la transformation de l'embryon 
 EMI39.2 
 immature, on utilise 6, 34 mg de pJS20293 + 7, 2 : r.. g de pUBIAc pour 50 ml de microsuppcrt. On amène à 85 ml les deux préparations avec de   l'éthanol   et on sèche 10 ml de chacune sur des microsupports. 



   Quatre heures avant le bombardement, on transfère les embryons sur 12DG4 + 5   mg/litre   de chloramben pour le traitement osmotique. On bombarde 36 embryons sur une lame en utilisant le dispositif Biolisics PDS- 1000He selon les instructions du fabricant (Dupont). On dispose les embryons sur la lame cible autour d'un cercle de 2 cm de diamètre au centre de la lame avec les   extrémités colèorhizales du scutellum toutes   

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 orientées dans la même direction. On dispose alors les lames cibles selon un angle de 30  vers le haut, de manière que les extrémités coléorhizales soient touchées les premières par le bombardement de particules.

   On utilise un écran standard de 24 x 24   n-ju   fourni par le fabricant Biolistic avec des disques de rupture d'une valeur de 10850 kPa pour les bombardements. Trois heures après le bombardement, on renvoie les embryons dans des milieux 2DG4 + 5   mç/litre   de chloramben puis on les cultive dans l'obscurité à 
 EMI40.1 
 25OC. 



   Quatorze jours après le bombardement, on transfère les réponses embryogéniques à des milieux d'entretien de cal 2DM4 + 0, 5 mg/litre d'acide 2, 4dichlorophénoxyacétique (2, 4-D). Le   milieu M4 est le   même que G4 moins les acides casamino. Ce milieu contient 5 mg/litre de   Basta&commat;   et on augmente graduellement jusqu'à 20 mg/litre. 



   On amorce la régénération au bout de 12 semaines sur une sélection   Basta&commat;.   On   sous-cultivé le   cal ce type I sur un milieu de Murashige et   Skoog, Pnys-ologia   Plantarum 15 : 473-497 (1962)) modifié contenant   3j ce   saccharose, 0,25 mg/litre de 2, 4-D, 5   mg/lire ce   benzyliminopurine et 5 mg/litre de   Basta#   et on cultive sous 16 heures de lumière (50 mE/m-2/s-l), 8 heures d'obscurité, 25"C. Deux semaines plus tard, on transfère le tissu sur un milieu MS contenant   3'. ce   saccharose et 5 mg/litre de   Basta&commat;. On cultive   les plantes régénérées sur milieu MS modifié pour contenir la moitié de la concentration de sels et 3, ce saccharose dans des récipients GA7. 



  Transformation utilisant le cal embryogénique type I
Pour la transformation du mais utilisant le   c21   embryogénique type I, on obtient le cal aurpés 

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 d'embryons zygotiques immatures en utilisant des techniques de culture de référence. Pour la fourniture du gène, on prépare environ 300 mg du cal de type I soit en réduisant en morceaux avec une lame de scalpel, soit en effectuant une sous-culture 3-5 jours avant la fourniture du gène. Avant la fourniture du gène, on place le cal préparé sur un milieu de culture semisolide contenant encore 122 de saccharose. Au bout d'environ 4 heures, on bombarde le tissu avec pJS20293 en utilisant le dispositif   PDS-lOOO/Biolistic   He de BioRad. On précipite 2 mg de pJS20293 sur 1 mm de particules d'or en utilisant essentiellement le protocole standard de Biorad.

   Environ 16 heures après fourniture du gène, on transfère le cal sur un milieu de culture standard contenant 2% de saccharose et 1   mg/litre   de phosphinothricine. On sous-cultive le cal sur une sélection pendant 8 semaines, après quoi on transfère le cal qui survit et qui croit sur un milieu de   régénération standard   pour la production de plantes. 



  On dose la résistance des plantes régénérées au pyrale du mais   d'Europe.   On obtient des plants résistants. 



   On utilise les plants transgéniques résultants dans un schéma de sélection de plantes classiques pour produire un plus grand nombre de plantes transgéniques ayant des propriétés insecticides similaires. On croise également les plantes transgéniques avec d'autres variétés de la même plante. Les plantes transgéniques produisent également des semences qui contiennent le gène de la   percxydase chimérique inséré   de façon stable dans leur génome. 



   On identifie par analyse de   buvardage   Southern des   plants de mais transçéniques   contenant la séquence de codage de la   perc ydase. Lorsqu'on digère l'ADN     génomique des plantes transgéniques avec l'enzyme ce   

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 restriction EcoRI, on peut détecter une bande d'environ 1, 3 Kb en utilisant le gène de la peroxydase comme sonde spécifique signalant la présence d'un gène de peroxydase intact. 



   On identifie également par analyse de buvardage northern le mais transgénique exprimant la séquence de codage de la peroxydase. On observe une bande d'une taille d'environ 1,2 Kb dans la tache de   l'ARN   lorsqu'on hybride avec une sonde spécifique de la peroxydase. 



  Bio-essai sur les insectes
On évalue à l'origine l'activité insecticide d'un total de 46 plants de mais transgéniques contre 
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 Ostrinia nubilalis (ECB). On réalise ce premier groupe de bio-essais en appliquant 10 larves d'ECB de premier instar à des morceaux de feuilles qui ont été mis dans une boîte de Petri Gelman avec un tampon de filtre humidifié afin d'empêcher la dessication des morceaux de feuilles. On laisse les larves se nourrir sans les perturber pendant 2 jours. Deux plantes du phénomène 554 sont positives dans le bio-essai préliminaire. Ces deux échantillons de plantes ne présentent pas de signe d'alimentation des insectes, et les larves sont mortes. 



  Le reste des plantes de ce phénomène et d'autres phénomènes présentent des insectes qui se nourrissent de façon saine. 



   Cette activité étant notée, on réalise des répétitions supplémentaires dans le bio-essai ECB suivant. On procède à quatre répétitions avec cinq larves par répétition. On prend la lecture du pourcentage de mortalité au bout de deux Dours. Etant donné que les plantes semblent toujours contenir une activité insecticide, on décide de les tester à nouveau contre d'autres insectes cibles. 

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   On dose l'activité insecticide de plants de mais transgéniques exprimant l'enzyme peroxydase au moyen de bio-essais d'insectes. Le procédé est semblable à celui utilisé pour n'importe quel plant de mais transformé avec n'importe quel gène insecticide, mais il est décrit ici en utilisant comme exemple une séquence de codage de peroxydase. On découpe des sections de 1 à 4 cm à partir d'une feuille étendue d'un plant de mais transformé. On met chaque morceau de feuille sur un disque filtre humidifié dans une boîte de Pétri de 50 x 9 mm. On place sur chaque morceau de feuille chaque larve nouvelle née de l'insecticide (pyrale du mais d'Europe, chenille de la leucanie, ver de   l'épi   de mais, chenille de la betterave et noctuelle noire). 



  Etant donné qu'on échantillonne chaque plante de multiples fois, ceci fait un total de 5 à 20 larves par plante. On fait incuber les   boites   de Petri à 30 C et on évalue les   dommages   sur l'alimentation en feuilles et les données de mortalité au   bout de 24, 42 et "72   heures. Les données de toxicité sont présentées au tableau I. 



  Tableau I : Valeurs de mortalité de différents insectes lorsqu'on les expose à des feuilles de mais exprimant l'enzyme peroxydase 
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<tb> 
<tb> 554-1 <SEP> 554-3
<tb> Ostrinia <SEP> nubilalis <SEP> (ECB) <SEP> 100% <SEP> 100%
<tb> Spodoptera <SEP> frugiperda <SEP> (FAW) <SEP> 15% <SEP> 15%
<tb> Spodoptera <SEP> exigua <SEP> (BAW) <SEP> 0% <SEP> 5%
<tb> Heliothis <SEP> zea <SEP> (CEW) <SEP> 100% <SEP> 100%
<tb> Agrotis <SEP> ipsilon <SEP> (BCW) <SEP> 0% <SEP> 0%
<tb> 
 Ces feuilles ont un fort effet anorexigéne contre la chenille de la leucanie. 

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  Descendants transgéniques
On soumet à des essais aux champs des plants de mais transgénique provenant des phénomènes   NO 554   et 755 (dont on a montré qu'ils possèdent des propriétés insecticides contre la pyrale du mais d'Europe dans des bio-essais in vitro). Lorsque les plantes aux champs atteignent environ 40 cm de hauteur des feuilles étendues, on commence l'infestation avec les larves ECB. On dépose environ 300 larves nouvelles nées mélangées avec du gruau d'épi de mais dans le verticille de chaque plante.

   On poursuit les infestations sur une base hebdomadaire pendant 4 semaines pour simuler la pyrale du mais de première   généra t ion (ECBl).   En commençant deux semaines après l'infestation initiale, on évalue chaque plante semaine après semaine, et on note une évaluation du dommage moyen par ECBl (voir tableaux II et III). Lorsque les plants de mais atteignent l'anthèse, on applique chaque semaine 300 larves nouvelles nées par plante pendant 4 semaines pour simuler l'infestation de seconde génération (ECB2). Au bout de 50 Jours après le début de l'infestation simulée par ECB2, on divise les tiges, on mesure les dommages causés au canal (voir tableaux 2 et 3). Les conditions expérimentales sont t données plus en détail par Koziel et al.,   Bio/Technolocy-n :   194- 200 (1993). 

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  Tableau II 
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<tb> 
<tb> Croisements <SEP> de <SEP> plantes <SEP> Evaluation <SEP> des <SEP> Dommage <SEP> dûs <SEP> à <SEP> ECB2
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> dommages <SEP> aux <SEP> Longueur <SEP> du <SEP> calal2 <SEP> (cm)
<tb> feuilles <SEP> par <SEP> ECB11
<tb> (CG00526 <SEP> x <SEP> 554-3) <SEP> 5 <SEP> self
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 58
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> 15 <SEP> 1 <SEP> 15
<tb> Plante <SEP> N  <SEP> 22 <SEP> 1 <SEP> 8
<tb> (CG00526 <SEP> x <SEP> 554-3)

   <SEP> 6 <SEP> self
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> 5 <SEP> 2 <SEP> 5
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> 9 <SEP> 1 <SEP> 7
<tb> Plante <SEP> N  <SEP> 14 <SEP> 2 <SEP> 5
<tb> Plante <SEP> N  <SEP> 19 <SEP> 1 <SEP> 4
<tb> Plante <SEP> N  <SEP> 20 <SEP> 1 <SEP> 3
<tb> Plante <SEP> N  <SEP> 25 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Plante <SEP> N  <SEP> 28 <SEP> 1 <SEP> 9
<tb> Plante <SEP> ? <SEP> 29 <SEP> 1 <SEP> 7
<tb> Plante <SEP> ? <SEP> 32 <SEP> 1 <SEP> 0
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> cas <SEP> positifs <SEP> 13
<tb> évalués
<tb> Total <SEP> canal <SEP> 121
<tb> Moyenne <SEP> 9,3
<tb> Ecart-type <SEP> 15
<tb> (CG00526non
<tb> transformé)

  
<tb> 1 <SEP> @
<tb> 2 <SEP> @
<tb> 3 <SEP> @
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> cas <SEP> négatifs <SEP> 3
<tb> évalues
<tb> Canal <SEP> total
<tb> Moyenne
<tb> Ecart-type
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 46> 

 1 Les évaluations des dommages aux feuilles sont faites comme suit : 1. Pas d'atteinte visible aux feuilles 2. Traces d'atteinte fine en"carreau de fenêtre" uniquement sur les feuilles non enroulées là où les larves additionnées de gruau d'épi de mais tombent dans le verticille. Pas de pénétration des feuilles en trou d'épingle. 



  3. Trace de fins dommages en"carreaux de fenêtre" sur deux feuilles non recourbées là où les larves tombent dans le verticille avec du gruau d'épi de maïs. Pas de pénétration en trou d'épingle des feuilles. 



  4. Trace d'atteinte d'absorption en trou d'épingle ou en trou de balle de fusil pénétrant sur deux ou plusieurs feuilles qui émergent du verticille (toute lésion de moins de 6,35 mm de longueur). 



  5. Lésions allongées et/ou absorption à la nervure médiane évidente sur plus de trois feuilles qui émergent du verticille. Lésions de moins de 25,4 mm de longeur. 



  6. Plusieurs feuilles avec   lésions allongées   (19, 05 mm à 38,10 mm de longueur) et/ou pas plus d'une feuille avec nervure médiane brisée. 



  7. Longues lésions (plus de 25,4 mm) communes sur au moins la moitié des feuilles et/ou deux ou trois feuilles avec nervures médianes brisées. 



  8. Longues lésions (plus de 25,4 mm) communes sur environ deux tiers des feuilles et/ou plus de trois feuilles avec nervures médianes brisées. 



  9. La plupart des feuilles portent des lésions longues. Plusieurs feuilles présentent des nervures moyennes brisées. Possibilité de 

 <Desc/Clms Page number 47> 

 plantes rabougries due à une absorption par ECB. 



   2 On mesure l'étendue des dommages internes par ECB dans le canal dans une section de 92 cm de tige, 46 cm au-dessus et en-dessous du premier noeud d'épi sur des plantes transgéniques et des plantes témoin. Le dommage maximum que l'on peut évaler est de 92 cm. Les plantes témoins sont complètement détruites vers la fin de l'expérience, et par conséquent aucune mesure n'est possible. 
 EMI47.1 
 
<tb> 
<tb> 



  Tableau <SEP> III
<tb> Croisements <SEP> de <SEP> plantes <SEP> Evaluation <SEP> des <SEP> Dommage <SEP> dûs <SEP> à <SEP> ECB2
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> dommages <SEP> aux <SEP> Longueur <SEP> du <SEP> canal' <SEP> (cm)
<tb> feuilles <SEP> par <SEP> ECB11
<tb> (CG00714x <SEP> 755-
<tb> 9) <SEP> Segregants <SEP> positifs
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> 6 <SEP> 3 <SEP> 15
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> 12 <SEP> 3 <SEP> 31
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> 16 <SEP> 3 <SEP> 19
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> 20 <SEP> 4 <SEP> 24
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> 24 <SEP> 3 <SEP> 18
<tb> plante <SEP> N  <SEP> 25 <SEP> 1 <SEP> 26
<tb> (CGOO714 <SEP> x <SEP> 755-
<tb> 9)

   <SEP> Ségrégants <SEP> negatifs
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> plante <SEP> morte
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> 8 <SEP> plante <SEP> morte <SEP> plante <SEP> morte
<tb> Plante <SEP> N'9-7 <SEP> plante <SEP> morte
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> plante <SEP> route
<tb> Plante <SEP> NO <SEP> 11 <SEP> 9 <SEP> plante <SEP> morte
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> cas <SEP> positifs
<tb> évalues <SEP> 6
<tb> Canal <SEP> total <SEP> 133
<tb> Moyenne <SEP> 22,17
<tb> Encart-type <SEP> 5,91
<tb> Nombre <SEP> de <SEP> cas <SEP> négatifs <SEP> 5
<tb> évalués
<tb> Canal <SEP> total-
<tb> : <SEP> @oyenne
<tb> Zcart-type
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 48> 

   l Les   évaluations des dommages aux feuilles sont faites comme il est dit pour le tableau II : 1. Pas d'atteinte visible aux feuilles 2.

   Trace de fins dommages en"carreaux de fenêtre" uniquement sur les feuilles non recourbées là où des larves additionnées de gruau d'épi de maïs tombent dans le verticille. Pas de pénétration de la feuille en trou d'épingle. 



  3. Trace de fins dommages en"carreaux de fenêtre" sur deux feuilles non recourbées là où des feuilles additionnées de gruau d'épi de mais tombent dans le verticille. Pas de pénétration en trou d'épingle de la feuille. 



  4. Trace d'atteintes par absorption en trou d'épingle ou en trou de balle de fusil   pénétrant   sur deux ou plusieurs feuilles qui émergent du verticille (toute lésion de moins de 6, 35 cm de longueur). 



  5. Lésions allongées et/ou absorption à la nervure médiane évidente sur plus de trois feuilles qui émergent du verticille. Lésions de moins de 25,4 mm de longeur. 



  6. Plusieurs feuilles présentent des lésions allongées (19,05 mm à 38,10 mm de longueur) et/ou pas plus d'une feuille avec nervure médiane brisée. 



  7. Longues lésions (plus de 25,4 mm) commune sur environ la moitié des feuilles et/ou deux ou trois feuilles avec nervures médianes brisées. 



  8. Longues lésions (plus de 25,4 mm) communes sur environ deux tiers des feuilles et/ou plus de trois feuilles avec nervures médianes brisées. 



  9. La plupart des feuilles portent des lésions longues. Plusieurs feuilles présentent des 

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 nervures moyennes brisées. Possibilité de plantes rabougries due à une absorption par ECB. 



  On mesure sur des plantes transgéniques et des plantes témoins l'étendue des dommages internes au canal par ECB dans une section de 92 cm de tige, 46 cm au-dessus et en-dessous du premier noeud d'épi. Le dommage maximum que l'on peut évaler est de 92 cm. Les plantes témoins sont complètement détruites vers la fin de l'expérience, et par conséquent aucune mesure n'est possible. 



  Exemple 2 : Plants de blé transgéniques comprenant une séquence de codage de peroxydase
On utilise   pJS20293   (figure 1) et pUBIAc (figure 2) pour transformer blé en utilisant les procédés de Char. g 
 EMI49.1 
 et al., MO 94/13822, tVees et a.. PanC. Physio. 



    102   : 1077-1084   (1993) ou Nehra   et al., The Plant Journal 5   (2) : 285-297   (1994). 



   On   expose brièvement la transformation du blé   en utilisant un procédé Chang et al., WO   94/13S22 comme   suit (d'autres procédés exposés dans Chang et al.   peuvent également être utilisés) : Préparation d'un cal de blé, génotype UC703  
On cultive des plants de blé de génotype UC703 jusqu'à floraison et on effectue une autopollinisation. 



  On retire des plantes des épis contenant des embryons contenant de 1 à 2,5 mm de longueur et on les stérilise avec une solution de Clorox à   10' ;   pendant 10 minutes. 



  On retire les embryons des graines immatures et on les met avec   l'axe de l'embryon   vers le bas dans un milieu de Murashige et Skoog contenant 5 ou   10   mg par litre de 2,   4-D,   13,   7   p/v de maltose, 100 mg/litre de   proline   et 100 mg/litre de myoinositol solidifié avec de la   phytogélose à   0,   7-0, 8 v/v ou de   la   geinte   à 0,1- 0,2%(milieu d'initiation). Au bout de trois semaines de 

 <Desc/Clms Page number 50> 

 culture dans l'obscurité à   27 C,   on reconnaît un cal préféré par la présence d'embryons somatiques globulaires bien formés (cal de type M) se développant sur le scutellum de certains explants.

   On retire ces cals et on les met soit sur du milieu MS contenant de 1,0 à 5, 0 mg/litre de 2,4-D et du saccharose à   2-3,   soit sur un milieu contenant un niveau réduit   (55)   de maltose avant de les mettre sur le milieu de saccharose. On sous-cultive alors la matière chaque semaine sur du milieu MS frais contenant du saccharose 
 EMI50.1 
 à 3 ;. 



    Préparation cellulaire   pour   bombardement  
On donne aux cellules pour bombardement un traitement de plasmolyse avant et après le bombardement. On mesure le volume cellulaire empilé et on dilue les cellules dans un milieu liquide   HS   avec addition d'osmoticum : sorbitol 0,4 M pour les cellules en suspension et sorbitol 0,6   H   pour les cellules de cal. Les cellules sont diluées de manière que le volume final empilé par cible est de un trentième de ml pour une suspension fine et de   1/10éme de ml pour un   cal. On met les cellules diluées dans un ballon de 250   ml   contenant une barre d'agitation et on agite pendant un minimum de 30 minutes, jusqu'à quelques heures.

   Pour déposer les cellules en lames, on retire 2 ml du ballon et on les met avec une pipette au sommet d'un ballon vide sur lequel on place un filtre   Hhatman GFA   de 2,5 cm. On applique un vide jusqu'à ce que les cellules soient séchées sur le filtre. On place les filtres sur des boîtes de Petri de 60 x 15 mm contenant 5 ml de milieu de plasmolyse post-bombardement solide, qui est du 1 MS contenant du sorbitol 0,2 M pour les cellules en suspension ou du sorbitol 0,4 M pour les cellules de cal. On met deux filtres sur chaque boite. 

 <Desc/Clms Page number 51> 

 



  Vecteurs utilisés pour le bombardement
On peut utiliser les vecteurs suivants dans lesquels on insère une cassette d'expression contenant de la peroxydase pour le bombardement des particules (outre la cotransformation de pJS20293 (figure 1) et de pUBIAc (figure 2) en utilisant des quantités égales d'ADN) : pSOG30 est un vecteur d'expression de bglucuronidase (Gus) dérivé du plasmide pBI121, commercialisé par Clontech Laboratories, Palo Alto, Californie. On amplifie l'intron 6 du gène Adhl de mais par PCR à partir du plasmide pB428, décrit dans Bennetzen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4125- 4128 (1987) et on le ligature dans le site   BamHI   de pBI121, qui est entre le promoteur   CatS 35S   et le gène Gus.

   On insère une séquence de tête du virus des taches chlorotiques du   nais   de 17 pb, décrit dans   Lommel   et   al.,     Viroloçy   181 : 382-385 (1995), dans la séquence de tête non traduite du gène 35S-Gus. La fusion génique finale contient la structure : promoteur 35S-intron 6 d'Adh 1-séquence de tête de MCMV-Gusterminateur Nos, tous dans l'ossature du vecteur pUC19. pSOG35 est un vecteur d'expression de dihydrofolate réductase (dhrf). On obtient ce produit d'assemblage en fusionnant le promoteur 35S, l'intron 6   d'Adh 1   et la séquence de tête de   MCMV   décrite ci-dessus au gène dhfr du plasmide   pHCO,   décrite dans Bourouis et   al.,   EMBO J. 



  2 : 1099-1104 (1983). La fusion génique finale contient la structure : 35S-intron 6   d'Adh   1-séquence de tête de MCMV-dhfr-terminateur Nos, tous dans l'ossature du vecteur   pUC19.   pTG48   comprend le cène Gus   sous la commande du provoteur ant43D spécifique de l'anthère et un gène dhfr dans une ossature de pUC19. C'est le résultat de 

 <Desc/Clms Page number 52> 

 la combinaison de 4 fragments d'ADN différents. On obtient le fragment 1 à partir de pSOG35 après coupure par restriction avec HindIII et EcoRI. On adapte   l'extrémité EcoRI   du fragment isolé contenant le gène dhfr à une extrémité de restriction SalI. Le fragment 2 consiste en un promoteur ant43D spécifique de l'anthère isolé à partir du plasmide pCIB 3178 après coupure par resctriction avec HindIII et XbaI.

   Le plasmide pCIB 3178 est décrit en détail dans EP-578 611, dont les parties pertinentes sont ici incorporées à titre de référence et qui a été déposé sous le numéro d'accès NRRL B-18978. On obtient le fragment 3 à partir du plasmide pSOG30 après coupure par restriction avec XbaI et EcoRI, et il contient le gène Gus, et le fragment 4 correspond au vecteur pUC19 du commerce coupé avec Sali et EcoRI. 



  Préparation des particules
On lave des particules d'or (1,0 micron ; de BioRad) par addition de façon aliquote dans un tube de microcentrifugation, en ajoutant envircn 1 ri d'éthanol à   lOO'o,   en centrifugeant, en décantant, en enlevant le surnageant, et en répétant deux   fOL5     l'eau     stérile.   



  Après le lavage final, on enlève autant d'eau que possible et on ajoute une solution de   polylysir. e   (polylysine à 0, 02% + acétate   d'ammonium 15 ml- !) pour   immerger complètement les particules. On centrifuge les particules, on les décante, et on enlève le surnageant. 



  On laisse les particules séchées pendant la nuit dans une hotte à écoulement laminaire ou pendant 30 minutes sous un courant d'azote doux. 



   Pour   une"pleine"préparation   de particules, on pèse 10 mg de particules et on les met dans un tube de microcentrifugation stérile contenant une barre d'agitation. On ajoute 100 ml (1   mg/ml) de chaque ADM   

 <Desc/Clms Page number 53> 

 (ou encore 50 ml (1 mg/ml) de chaque ADN) puis on centrifuge. Ensuite on ajoute 10 ml de   NaHPO, 100 mM,   puis on centrifuge. On ajoute 10 ml de   CaClj 100 nM,   puis on centrifuge. Enfin on ajoute 380 ml d'éthanol à   1006,   puis on centrifuge. Tout en agitant vigoureusement la suspension, on en prélève 3 ml qu'on jette avec une pipette sur des feuilles de matière plastique (projectiles). On laisse sécher les particules sur les feuilles pendant au moins 15 minutes avant le bombardement. 



  Bombardement des cultures cellulaires
On renverse la boite de Petri contenant les filtres cellulaires sur la place-forme située au sommet de la platine, et centrée sur l'ouverture de la rampe des particules. Le couvercle clair est placé au sommet de la plate-forme. Un   micrccrojectile   est placé sur la goupille de culasse et la culasse fermée. On appuie sur le bouton "armer" pour remplir le réservoir avec la quantité   appropriée de ga hélium (généralement 12600-   13300 kPa). On fait un vice sur la chambre à environ 27    mm. Après qu'on ait arrêté de faire le vide, on appuie   sur les bontons"armer"et"déclencher". On met alors    le bouton"armer"sur la position"arrêt". Chaque   filtre fait   généralement   l'objet de deux tirs. 



    Culture après bombardement et sélection  
Après bombardement, on maintient les cellules dans l'obscurité pendant la nuit. Le jour suivant on enlève les filtres du milieu de plasmolyse et on les met sur un milieu 1 MS. On applique une sélection 1 à 10 jours après le bombardement pour les cellules en suspension et au bout de 14 jours pour les cellules de cal. On gratte les cellules de filtre et on les étend à la 
 EMI53.1 
 surface de lames'contenant 1 MS + 2 mc/litre de méthotrexate fou d'un âge".' : de sélection approprié). On ) ronrl 

 <Desc/Clms Page number 54> 

 fait incuber les lames dans l'obscurité pendant plusieurs semaines. On transfère les colonies résistantes qui apparaissent au bout de quelques semaines sur 1 MS + 4 mg/litre de méthotrexate (ou milieu de sélection approprié).

   On transfère alors les colonies qui continuent à proliférer pendant environ 3 semaines sur un milieu de maintien"0, 5 Ms"qui est une solution aqueuse de sels de MS, de vitamines, de fer, de saccharose à   3%,   de gélose à 0,   dz   et de 0,5 mg/litre de 2,4-D. On sous-cultive le tissu sur ce milieu deux fois par semaine jusqu'à ce que des structures embryogènes apparaissent ou que le tissu semble approprié à la régénération. 



  Régénération
On transfère le tissu sur le milieu   MS contenant   soit 3   mg/litre   de BAP, soit 1 mg/litre de   J\ +   5 mg/litre de GA, et on déplace les lames à la lumière. Au bout de 2 à 4 semaines, on transfère le tissu sur milieu MS sans hormones. Les pousses qui apparaissent sont mises dans des récipients avec soit du milieu MS sans hormone, soit du milieu NS avec 0,5 mg/litre de   NAA.   Lorsqu'une croissance suffisante des rac-nefs et des pousses s'est produite, on transfère les plantules dans le sol et on les met dans un phytotron. 



  Weeks et   al., Plant Physiol. 102   :   1077-1084 (1993)  
On expose la transformation du blé avec le procédé 
 EMI54.1 
 de Weeks et < 3jL P. lanC Physio2. 102 : 1077-1084 (1993), brièvement comme suit : on cultive des plants de blé   (Triticum aestivum L. ) et on excise des embryons   immatures de 0,5 à 1 mm de longueur à partir de plantes cultivées en serre (10-18 jours après l'anthèse, selon le moment de l'année) et on les met,   côté scutellum   exposé, sur des milieux d'entretien de cal   contenant   1,5 mg/litre de 2,4-D. Cinq jours après   l'amorçage   dans 

 <Desc/Clms Page number 55> 

 une culture tissulaire, le tissu proliférant du cal est visible aux bords des embryons.

   A ce stade, on bombarde les embryons avec des particules d'or revêtues de 7 mg de pJS20293 et 7 mg de pUBIAc. 



  Bombardement de particules
Avant le bombardement, on revêt des particules d'or de 1 mm avec de l'ADN de pJS20293 et pUBIAc par le procédé de Daines, Biolistic Systems Newsletter 1: 1-4 (1990). On met en suspension une suspension de réserve de particules d'or (BioRad) à raison de 60 mg/ml dans l'éthanol absolu. On verse de façon aliquote 35 ul de la suspension dans des tubes de   microcentnfugation   de 1,5 ml, on les lave dans de l'eau distillée stérile et on les remet en suspension dans 25 ml   de Tris-EDTA   contenant 25 mg d'ADN de   plasmide superenroulé. On   ajoute les solutions suivantes, dans l'ordre : 220 ml d'eau stérile, 250   ni     de Cad :   2, 5   :'1,   et 50 ml de sperm dine 0,5   M   (base libre).

   On agite les tubes de microcentrifugation avec un mélangeur   vortex à 40C   pendant 10 minutes et on   centrifuge à 16 ooe g pendant   5 minutes. On enlève le surnageant et on lave le précipité avec 600 ml d'éthanol. On remet en suspension les précipités d'or revêtus d'ADN dans 36 ml d'éthanol. 



  Pour le bombardement, on met 10   ml de la suspension   d'ADN-or dans le centre d'un   macroprojectile (également   connu sous le nom de feuille support). 



   On met environ 25 embryons au centre d'une boite de   Petri   de 15 x 100 mm contenant un milieu d'entretien de cal solidifié avec du Phytagel à 0,   35..   Au bout de 5 jours de culture, on bombarde les cals dérivés de l'embryon sous vide avec des particules d'or revêtues de   pJS20293,   en utilisant Le système d'administration
Biolistic DuPont à vecteur hélium et les composants   Jetables fournis par BioRad. La distance entre la   

 <Desc/Clms Page number 56> 

 plaque d'arrêt et la cible est de 13 cm, et la résistance du disque à la rupture est de 7700 kPa. 



  Immédiatement après le bombardement, on transfère les cals à des milieux de sélections MS contenant la quantité appropriée d'agents de sélection telle qu'un spécialiste peut la déterminer. 



    Régénération   des plants de blé
Pour la régénération, on transfère les cals embryogéniques à un milieu MS contenant 0,5 mg/litre de dicamba comme il est dit par Hunsinger et Schautz, Plant Breeding 98 : 119-123 (1987). On transfère les pousses dérivées de cals dans des tubes à essais pcur culture en Pyrex contenant des milieux d'enracinement composés de MS à demi-concentration sans hormone. Aux fins de sélection après bombardement, on   complément   les milieux gélosés à chaque étape avec la quantité appropriée d'agent de sélection comme peuvent le déterminer les spécialistes. 



   On transfère les plantules de milieux d'enracinement à des pots de mélange de sol et on les acclimate à une plus faible humidité à 21 C dans une chambre environnementale. Au bout de deux semaines, en transfère les plantes en serre. Ces   régénérant   transgéniques primaires sont appelés plantes T,. 



  Analyse des plantes transgéniques
On analyse les tissus et plantes transgéniques en utilisant les techniques Southern et northern pour mettre en évidence la présence de la séquence de codage de la peroxydase et de   l'ARN,   respectivement. 



   On évalue l'activité insecticide de plants de blé dont on a montré qu'ils contiennent la séquence de codage de la peroxydase au moyen d'une analyse Southern, contre   Pseudaletia   unipunctata, chenille ; Spodoptera frugiperda, chenille de la   leucanie   

 <Desc/Clms Page number 57> 

 
 EMI57.1 
 Elasmopalpus lignosellus, petite pyrale de la tige de mais ; Agrotis orthogonia, noctuelle pâle de l'ouest des Etats-Unis ; Oulema melanoplus, altise des céréales ; Hypera punctata, charançon des feuilles de trèfle ; Diabrotica undecimpunctata howardi, ver de la racine du mais du sud des Etats-Unis, puceron du blé de Russie ;   Schizaphis   graminum, punaise verte ; Macrosiphum avenae, puceron des graines   d'Angleterre   ; Melanoplus 
 EMI57.2 
 femurrubrum, criquet à pattes rouges ;

   Alelanoplus differentialis, criquet différecié ; Me1anop1us sanguinipes, criquet migratoire ;   Mayetiola   destructor, mouche de Hesse ;   Sitodiplosis moselana, moucheron   du blé ; Meropyza americana, ver des tiges de blé Hylemya coarctata, mouche grise du blé ; Frankiniella fusca, thrips du tabac ; Cephus cinctus, tenthrède des tiges de blé ; ou Aceria tulipae, mite enroulée du blé en utilisant des techniques bien connues des spécialistes. On soumet à des essais aux champs les plants de blé   transgéniques ayant des propriétés   insecticides. 



  Exemple 3 : Plants de sorgho transgénique comprenant une séquence de codage de peroxydase
On utilise pJS20293 (figure 1) et pUBIAc (figure 2) pour transformer du sorgho en utilisant le procédé de Casas et al., Proc. Natl.   Acad.   Sci. USA 90 : 11212-11216 (décembre 1993) tel que décrit brièvement comme suit. 



  Bombardement de microprojectiles
On conduit des expériences avec le système 
 EMI57.3 
 Bio1istics PDS 1000/He (Sanford et al., Technique J. ethod Ce Mo. Bic. J : 3-16 (1991) en utilisant des microprojectiles de tungstène (M-25, 1, 7 mm de dlamètre, DuPont N  75056) ou d'or (1, 5-3, 0 mm de diamètre, Aidrich ? 32 655-5). On revêt les particules 

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 d'or (3 mg) ou de tungstène (0,75 mg) préalablement lavées dans l'éthanol dans une suspension aqueuse (50 ml) avec 5-10 ml d'ADN plasmidique, comme il est dit par le fabricant (BioRad). On détermine expérimentalement les pressions de bombardement et les distances à partir de la lame de lancement. 



   On bombarde des embryons zygotes immatures, à raison de 10 à 5 par boîte de Petri en matière plastique (15 x 60 mm) pendant 24 à 72 heures après culture sur le milieu. On transfère les embryons des papiers filtres (4,5 cm de diamètre) qui sont   pré. humidifiés   mais non saturés en milieu liquide. Les papiers filtres fonctionnent pour absorber l'eau à partir de la surface des embryons et or. laisse les embryons pendant 2 à 3 heures sur les papiers avant le bombardement.

   Immédiatement après le bombardement, on enlève des papiers les embryons immatures, et on les transfère sur un milieu semi-solide.   régénération   des plants transgéniques et   évaluacjon ce   leur résistance aux insectes
Les procédés de sélection et d'entretien des tissus embryogéniques et pour la formation des pousses et ces racines à partir de structures organisées sont tels que   décrits (Cai   & Butler, Plant Cell Tissue Organ   Cult.,   20 : 101-110 (1990). On utilise l'agent de sélection approprié connu des spécialistes. 



   On analyse les tissus et plantes transgéniques en utilisant les techniques Southern et northern pour mettre en évidence la présence de la séquence de codage de peroxydase et de l'ARN, respectivement. On évalue l'activité PAT dans le cal et les extraits de feuilles selon De Block et al., EMBO J. 6 : 2513-2518   (1987).   



   On évalue l'activité insecticide de plants de sorgho dont on a montré qu'ils contiennent la séquence 

 <Desc/Clms Page number 59> 

 de codage de la peroxydase par une analyse Southern, en les essayant contre Chilo partellus, la pyrale du sorgho ; Spodoptera frugiperda ; la chenille de la leucanie ; Helicoverpa zea, le ver de l'épi de mais ; Elasmopalpus lignosellus, petite pyrale de la tige de mais ; Feltia subterranea, noctuelle granulée ; Pyllophaga crinita, ver blanc ; Eleodes, Conoderus et Aeolus spp., les vers fil-de-fer ; Ouléma melanopus, l'altise des céréales   ; Chaetoctnema pulicaria,   l'altise du mais ; Sphenophorus mai dis, le charançon du mais ; Rhopalosiphum mardis, le puceron des feuilles de maïs ; Anuraphis maidiradicis, le puceron des racines de mais ;   81issues   leucopterus leucopterus, le "chinch bug" ;

   Contarinia   sorgicola, le mcuchercn   du sorgho ; Tetranychus cinnabarinus, l'araignée rouge ; cu Tetranychus urticae, l'araignée à deux taches, en utilisantdestechniquesbienconnuesdesspécialistes. On soumet à des essais aux champs les plants de sorgho   : ransgé : 1iques ayant   des propriétés insecticides. 



  Exemple 4 : Plants de riz transgénique comprenant une séquence de codage de peroxydase
On utilise pJS20293 (figure 1) et pUBIAc (figure 2) pour transformer du riz en utilisant les procédés de   Shimamoto   et al., Nature 338 : 274-277 (1989) (riz) ; Christou et al., Biotechnology 9 : 957-962 (1991) ; Datta et   al.,   Biotechnology 8 : 736-740   (1990)   (riz) et/ou Hayashlmoto et   al.,   Plant Physiol. 93 : 857-863 (1990) (riz). 



   On exposera brièvement comme suit la transformation du riz utilisant le procédé de Christou et al., Biotechnology 9 : 957-962 (1991) : 

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 Préparation de   l'ADN  
On prépare des particules d'or revêtues d'ADN en mélangeant des particules d'or (10 mg) avec une solution de l'ADN (20 mg) dans 100 ml de tampon (chlorure de sodium 150   mM,   Tris-HCl 10 mM, pH 8,0) et on centrifuge doucement pendant 5 à 10 secondes. On ajoute de la spermidine (100 ml d'une solution O, 1M) et 100 ml d'une solution de PEG à   255   (PM 1300-1600) tout en centrifugeant, puis on ajoute goutte à goutte 100 ml de chlorure de calcium (2,5 M). On laisse reposer le mélange à la température ambiante, puis on le fait passer dans une microcentrifugeuse.

   On enlève le surnageant et on remet en suspension l'or   précipité   avec le complexe d'ADN dans 10 ml d'éthanol à   1005.   On dépose alors la suspension résultante sur une feuille support de 18 mm x 18 mm à raison de 163 ml par feuille support, soit un taux calculé de 0,05   mg/cm.   



  Isolement d'embryons immatures et préparation pour le bombardement de particules
On récolte des embryons immatures de riz âgés de 12 à 15 jours à partir de panicules dilatés et on stérilise avec de l'hypochlorite de sodium à 27 pendant 5 minutes. On les rince ensuite de façon répétée avec de l'eau stérile et on enlève les glumes sous un mircoscope à dissection. On prélève alors les embryons de manière aseptique et on les dépose sur une lame de gélose aqueuse, le côté faisant face à l'axe étant en contact avec le milieu. 



  Bombardement de particules
On charge la feuille support portant les perles sur l'accélérateur de particules, qui utilise la décharge d'un capaciteur haute tension par l'intermédiaire d'une petite gouttelette d'eau comme force motrice.   os   place un écran de retenue de 0,149 mm entre la feuille et le 

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 tissu cible suspendu au-dessus de la machine. On fait alors le vide dans l'assemblage jusqu'à 500 mm de mercure pour réduire la résistance aérodynamique. On décharge de 10 à 16 Kv d'un capaciteur de 2 mF à travers une gouttelette d'eau de 10 ml dans la chambre d'expansion. On souffle ainsi la feuille contre l'écran de retenue, permettant aux particules d'or de continuer sur leurs lancée jusqu'à toucher le tissu cible suspendu au-dessus de l'écran.

   Les embryons immatures ciblés sont positionnés sur une plaque de gélose aqueuse de manière que, lorsque la plaque est insérée au-dessus de l'écran, la région scutellaire des embryons soit dans le trajet direct des particules accélérées. 



  Régénération des plantes
Après le bombardement particulaire, on dépose les embryons en plaques sur des   milieux MS et CC   additionnés de 2,4-D à raison de 0, 5 ou 2 mg/litre et on recueille le cal embryogénique et les plantules comme il dit   (Hartke,   S. et Lara, H., Genet & Breed. 
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  43 : 205-214 (1989) Datza, S.' ; et al., Sc-i. 



  67 : 85-88 (1990)). 



  Récupération du cal embryogénique transformé et des plantes
On recuille le cal transformé et les plantes dans des conditions tant sélectives que non sélectives. Dans de expériences dans lesquelles la sélection est incorporée dans le protocole de transformation/régénération, on emploie la quantité appropriée d'agent de sélection connue par les spécialistes. On soumet les   transformants   putatifs ainsi analysés à   une ar. a-yse moléculaire et génétique   pour   confirmer l'intégration stable   et le caractère   hérité du gène introduit.   

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  Analyse des plantes transgéniques
On analyse les tissus et plantes transgéniques en utilisant des techniques Southern et northern pour mettre en évidence la présence de la séquence de codage de la peroxydase et de l'ARN, respectivement. On évalue l'activité PAT dans le cal et les extraits de feuilles selon DeBlock et al.,   EMBO   J. 6 : 2513-2518 (1987). 



   On évalue dans des plants de riz dont on a montré qu'ils contiennent la séquence de codage de peroxydase par une analyse Southern, l'activité insecticide contre Diatraea saccharalis, chenille mineuse de la canne à sucre ; Spodoptera frugiperda, chenille de la leucanie ;   Helicoverpa   zea, ver de l'épi de   mais ; Colaspis   brunnea, colaspis du raisin   ;   Lissorhoptrus oryzophil us, charançon d'eau du riz ; Sitophilus oryzae, charançon du   riz ; Nephrotettix nigrcpictus,   criquet du riz ; Blissus leuccpterus leucopterus, "chinch bug" ; ou Acrosternum hilare, punaise suante verte, en utilisant des procédés bien connus des spécialistes. 



  Exemple 5 : Plantes d'avoine transgénique comprenant une séquence de codage de peroxydase
On utilise pJS20293 (figure 1) et pUBIAc (figure 2) pour transformer de l'avoine en utilisant les procédés de Somers et al.,   Bio/Technology   10 : 1589-1594 (décembre 
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 1992) (avoine) et/ou Torbert et al., Plant Cell Reports 1 : 635-640 (1995) (avoine). 



  On exposera brièvement la transformation de l'avoine en utilisant le procédé de Somers et   al.,   Bio/Technology 10 : 1589-1594 (décembre 1992) comme suit. 



  *Cultures cellulaires
On utilise des   embryons immatures   de lignées d'avoine dérivés de GAF-30/Park pour amorcer un cal   (Rines, H. M.   & Luke, H. H., Theor.   i'. ppl. Genet ì2   : 16-21 

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   (1985) ). On sélectionne à l'oeil nu des lignées de cals   embryogéniques friables (Bregitzer, P. et al., Crop. 



    Sci 29 : 798-803 (1989) ) et on en effectue une sous-   culture toutes les deux semaines sur des milieux MS2D solidifiés avec du Gelrite à 0, 2% contenant du sel MS (Murashige, T. & Skoog, F., Physiol. Plant 15 : 473-497   (1962) ) avec 150 mg/litre d'asparagine, 0,5 mg/litre de   chlorhydrate de thiamine, 20 g de saccharose et 2,0 mg/litre de 2, 4-D à pH 5,8. On amorce des cultures en suspension en plaçant environ 1 g de cal embryogénique friable dans 35 ml de milieu MS2D liquide. On sélectionne dans les cultures en suspension par la détection de la présence de petits aggrégats de cellules   cytoplasmiquement   denses colorées en jaune et on effectue une sous-culture toutes les semaines. 



  Préparation de   particules revécues d'ADN  
On revêt des particules de tungstène avec de   l'ADM   de pJS20293 (figure 1) et de pUBIAc (figure 2) en utilisant des procédés semblables à celui décrit par   Cordon-kamm et al., Plant Cell 2 : 603-618 (1990) ). On   remet en suspension des particules de tungstène prélavées (1,25 mg)   dans 250 ml d'eau stérile dans un   tube Eppendorf de 1,5 ml. Cn ajoute une partie aliquote de 25 ml de 1 mg/ml de chaque ADN, 250 ml de   CaClj   2,5 M et 50 ml de spermidlr. e 0,1   H   (base libre), dans cet ordre.

   On centrifuge le mélange en utilisant un appareil Vortex Génie 2 (Scientific Industries,   Inc.)   à pleine vitesse pendant une minute, on le met sur de la glace pendant 5 à 10 minutes et on centrifuge à 14 000 tpm pendant 1 minute dans une centrifugeuse Eppendorf 5415. Après centrifugation, on prélève avec une pipette 550 ml de surnageant et on les jette. On remet en 
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 s,-ispm-. nsion les suspension les particules ce tungstène revêtues d'AD e : 1 les déplaçant avec une cicette plusleurs fois vers 

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 le haut et vers le bas et on charge 1 ml de la suspension de particules d'ADN sur le macrosupport du système de fourniture de particules. 



  Fourniture de l'ADN
On rince trois fois des cellules de culture en suspension avec du milieu MS2D dépourvu d'asparagine avant le bombardement. Trois à cinq jours après la sous-culture, on recueille les cellules de culture en suspension par filtration sous vide sur un tampon support MF Millipore AP 10 de 4,7 cm de diamètre   (Millipore Corp. ) pour former une couche mince   régulièrement répartie de cellules de cultures tissulaire d'un poids frais d'environ 0,5 g. On transfère alors les tampons portant les cellules dans des boites de Petri de 60 x 20 mm. Pour le bombardement du cal, on répartit également un cal   embryogénique   friable âgé de deux semaines (0,5 g) sur les campons supports Millipore préhumidifiés avec 2 ml de milieu MS2D moins l'asparagine dans des boites de   Pétri de 60   x 20 mm.

   On positionne les boites de Pétri   cc-. tenant   des échantillons en suspension ou dans un cal   (cordon-   Kamm et al., Plant Cell 2   : 603-618 (1990)) à une   distance de 5 cm de la lame d'arrêt et on bombarde ave le système de fourniture de particules Biolistic PDS- 1000 (poudre à canon) (DuPont Co.). 



  Sélection des transformants
Après bombardement, on enlève les cellules par lavage de chaque tampon support Millipore avec   S   ml de milieu liquide MS2D dépourvu d'asparagine dans une boite de Petri de 60 x 20 mm, que l'on scelle avec une pellicule de paraffine que l'on fait incuber entre 21 et 23 C dans l'obscurité. Au bout   de 5 Jours   d'incubation en milieu liquide, on dépose les cellules bombardées en une mince couche sur des   disces   de 

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 papier filtre Whatman   N l   de 7,0 cm de diamètre surmontant un milieu de sélection   HS2D   solidifié avec de la Gelrite, dépourvu d'asparagine et contenant 3 mg/litre de phosphinothricine (PPT) (Crescent Chemical Co. Inc).

   Les cellules provenant d'un bombardement sont typiquement réparties sur deux ou plusieurs papiers filtres selon la densité des cellules. On transfère les papiers filtres revêtus de cellules dans un milieu de sélection frais à des intervalles de 2 à 3 semaines. 



  Les colonies résistant au PPT commencent à apparaître 7 à 8 semaines après le bombardement et on les souscultive directement sur milieu de sélection frais sans papier filtre toutes les deux à trois semaines car la suite. 



    Régénération   des plantes
On met les cultures tissulaires résistant à PPT sur 
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 un milieu de régénération des plants d'avoine N-E (Brgitzer, P., et al., Crop Sc. 29 : 798-803 (1989)) (sels MS (Murashige, T. & Skoog, F., P. ysiol. Pj'ant 25 : 473- 497 (1962)), 2 mg/litre d'acide naphtaléne acétique, 0,2 mg/litre de   benzylamir. cpurine) contenant 3 mg/litre   de   PPT. Au bout de 2 à 6 semaines, on enlève   les pousses du cal et on les transfère sur milieu MS sans hormone mais contenant 3   mg/litre   de PPT pour la formation des racines. On transfère les plants enracinés dans un mélange de sol d'enrobage et on les cultive jusqu'à maturité dans des chambres de croissance. 



  Analyse des plantes transgéniques
On analyse les tissus et plantes transgéniques en utilisant les techniques Southern et northern pour mettre en évidence la   présence de la séquence   de codage de la   peroxydase et de l'APN, respectivement.   

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   On évalue l'activité PAT dans le cal et les extraits de feuilles selon DeBlock et al.,   EMBU   J. 



  6 : 2513-2518 (1987). 



   On évalue, en utilisant des procédés bien connus des spécialistes, l'activité insecticide de plants d'avoine dont on montre par une analyse Southern qu'ils contiennent la séquence de codage de peroxydase. 



  Exemple 6 : Plants d'orge transgénique comprenant une séquence de codage de peroxydase
On utilise pJS20293 (figure 1) et pUBIAc (figure 2) pour transformer de l'orge en utilisant les procédés de Wan et al., Plant Physiol. 104 : 37-48 (1994) et/ou Jahne et   al.,   Theor.   Appl.   Genet. 89 : 525-533 (1994). 



   On procède en bref à la transformation ce l'orge en utilisant le procédé de Wan et al., Plant Physio. 



  104 : 37-48 (1994) de la façon suivante :   Matériaux   végétaux
On cultive des plants du cultivar ce printemps   d'orge (Hordeum vulgare L. ) Golden Promise dans des   
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 chambres de croissance avec une période de 16 heures de lumière/8 heures d'obscurité à 120C et c 60 à 80 d'humidité (Hunier, C. P., Plant Régénération from Micropores of Barley, Hordeum vulgare, thèse de PhD,   Wye   College, Université de Londres, Ashford, Kent (1988)). Les niveaux lumineux à hauteur de tête sont d'environ 350 à 400 mE. On fait germer des graines d'un cultivar d'hiver, Igri dans le sol de la chambre de croissance dans les mêmes conditions.

   Lorsqu'ils ont environ 17 cm de hauteur, on vernalise les plantes de semis pendant 8 semaines sous une période de 10 heures   de lumière (10-15 mE) /14 heures d'obscurité à 40C   (Hunter, C. P., Plant Regeneration from Microspores of Barley, Hordeum vulgare, thèse de PhD, Wye College, Université de Londres, Ashford, Kent (1988)). Après 

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 vernalisation, on les cultive sous le même régime que les plants Golden Promise. On fertilise tous les plants avec Osmocote (Sierra, 17-6-12 plus des quantités mineures d'autres matières) au moment de l'implantation puis deux fois par semaine avec du Verdi à 0, 02% (Peter's, 20-20-20). 



  Embryons immatures et cal dérivé d'embryons immatures
On stérilise la surface   d'épis   de cultivars Golden Promise avec des embryons immatures d'une taille d'environ 1,5 à 2,5 mm dans une lessive à 20% (v/v) (hypochlorite de sodium à 5,   25)   pendant 5 minutes, on rince brièvement trois fois, et on lave pendant   5   minutes avec de l'eau stérile. Cn dissèque les embryons immatures à partir de jeunes caryopses et on les laisse intacts ou on les coupe en deux dans le sens de la longueur. Pour l'induction du cal en vue du bombardement, on place les embryons (intacts ou coupés en deux) côté scutellum vers le bas sur le milieu d'induction de cal, qui est le milieu de Murashige et Skoog (Murashige, T. & Skoog, F.,   Fhysiol.

   Fla ;, c 15   :   473-497   (1962)) additionné de 30 g/l de meltose, 1, 0 mh/l de chlorhydrate de thiamine, 0, 25 g/l de myoinositol, 1,0 g/l   d'hydrolysat   de caséine, 0, 69 g/l de Pro, et 2,   5     mg/1   de dicamba,   or.   solidifie avec 3,5 g/1 de gelrite (Scott, Carson,   ÇA)   ou de Phytagel (Sigma). 



  On fait incuber les embryons à 25 C dans l'obscurité, et on sélectionne le cal embryogénique pour le bombardement au bout de 2 semaines. 
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  Culture d'anthère et embryons dérivés de micrcspores (EDM On recueille des épis, enveloppés par les feuilles du"drapeau", à partir de cultivars de plantes Igri lorsque les   microspores sont au stade uninucléé médian   jusqu'aux stades binucléés précoces et   en stérilise   

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 brièvement la surface avec de l'éthanol à   70.   On dissèque les anthères d'épillets et on place 60 anthères dans chaque boite de Petri (35 x 10 mm) avec 3 ml de mannitol 0,3 M. On scelle les boites de Petri avec une pellicule de paraffine et on fait incuber à   25 C   dans l'obscurité pendant 3 ou 4 jours.

   On transfère ensuite les anthères dans des boites de Petri 
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 avec 3 ml de milieu FHG liquide de Hunter (milieu de Murashige et Skoog modifié à teneur faible en NHJNO, et élevée en Gin ; Kasha, K., et   al.,"Haploids   in Cereal Improvement : Anther and Microspore Culture", J. P. Gustafson, dir. Publ., Gene   Manipula : ion in Plant   Improvement II, Plenum Press, NY (1990), pp. 213-235, sans Ficoll-400 et on complète avec 1   mg/1 d'IAA   et 0,2   mg/1   de kinétine (appelé FHG') et on fait incuber comme il est dit. Les EDM sont visibles au bout d'environ 2 ou 3 semaines et sont utilisés pour le bombardement au bout d'environ 4 semaines. 



  Préparation des lames de   bombarde.-enc ec bombardement   
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 par microprojectiles 
Un jour avant le bombardement, on coupe en deux dans le sens de la longueur des El (1,5-2,   5 mm)   provenant de jeunes caryopses de cultivars Golden Promise et on les met dans trois orientations différentes (côté scutellum vers le haut, côté scutellum vers le bas, ou surface découpée vers le haut) sur un milieu d'induction de cal au centre de boîtes de Petri (100 x 15 mm). Pour le bombardement du cal, on découpe environ 0,5 g de cal embryogénique, provenant d'EI cultivés, en petits morceaux (environ 2 
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 mm) et on les met au centre d'une boite ce Petrl (100 x 15 mm) contenant un milieu d'induction de cal.

   On recueille les EDM à partir de lames de culture d'anthères en utilisant une pipette Pasteur et on 

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 répartit de façon régulière dans des boites de Petri (100 x 15 mm) sur un morceau de papier filtre   Whatman     N 3   de 5 cm porté par deux filtres de 7 cm. Avant bombardement, on retire des filtres l'excès de milieu. 



   On adsorbe de l'ADN plasmidique sur des particules d'or (1,0 mm, Dupont, Wilmington, Delaware, Etats-Unis) comme il a été dit plus haut (Daines, R. J., Biolistic    Particle Delivery Systems Newsletter 1 : 1,4 (1990) ).   



  Lorsqu'on utilise deux plasmides, on mélange des quantités égales (en mg) d'ADN des deux plasmides. On bombarde une fois tous les matériaux cibles, en utilisant un système de délivrance Dupont PDS 1000 He Biolistic. On positionne les matériaux cibles à environ 13 cm en-dessous de la lame d'arrêt ces microprojectiles ; on utilise des disques à rupture à 7700 kPa. 



  Transformants de sélection
EI et cals
Un jour après bombardement, on transfère individuellement des semi-embryons et des morceaux de cals dans un milieu   d'induction de cal avec 5 mç/litre   de bialaphos ; on cultive   les semi-embryons côè   scutellum vers le bas, quelle que soit leur orientation pendant le bombardement. Le tissu reste sur la première lame de sélection pendant environ 10 à 14 jours.   Lcrs   du transfert sur la seconde lame de sélection (5 mg/litre de bialaphos), on brise les divers embryons pour formation de cals ou les morceaux de cal en utilisant un forceps, pour obtenir plusieurs petits morceaux que l'on maintient séparés.

   Au cours des deux à trois passages de sélection ultérieurs   (d'environ   10 à 20 jours chacun,   a' ; ec 5 mg/litre   de bialaphos), on transfère plus   tôt les morceaux   de cal montrant des   témoignages de croissance plus vigoureuse vers de   

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 nouvelles lames de sélection et on manipule le tissu de manière identique. Tout tissu de cal qui se développe originellement à partir de chaque morceau d'embryon ou de cal est définie comme une lignée. On entretient les lignées de cal résistant au bialaphos par une sousculture mensuelle sur milieu d'induction de cal avec 5 mg/litre de bialaphos. 



  EDM
Après bombardement, on ajoute plusieurs gouttes de milieu   FHG'aux   EDM. Au bout de 2 ou 3 jours, on transfère individuellement les embryons de plus de 1,5 mm sur un milieu d'induction de cal avec 3 ou 5 mg/litre de bialaphos. Les plus petits embryons restent sur les filtres et on les transfère dans le milieu de sélection lorsqu'ils ont environ 1,5 on lave les papiers-filtre tous les 2 ou 3 jours par des additions et enlèvement répétés de milieu FHG* liquide. Les EDM restent sur le premier milieu de sélection pendant 10 à 20 jours. On transfère les EDM montrant des signes de formation de cal dans des milieux de sélection frais avec 5 mg/litre de bialaphos. Au cours du transfert, on brise chaque EDM en quelques petits morceaux. La suite de la sélection est telle que décrite dans la section précédente. 



  Régénération des plantes et application d'herbicide
On régénère les plantes à partir de lignées de cals PAT-positives en transférant un cal embryogène dans un milieu FHG avec 1 mg/litre de bialaphos à   23 C   ou   25 C   sous des lumières fluorescentes   (45-55   mE, 16   h/jour).   



  Au bout d'environ 2 semaines, on observe des plantules. 



   On transfère les plantules vertes, d'environ 2 cm, dans des boites magenta contenant un milieu de croissance pour plantules (milieu d'induction de cal sans hormone) avec 1 mg/litre de bialaphos. Avant 

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 qu'elles ne croissent jusqu'au   sommet   de la boite, on transfère les plantules dans des pots de 15,24 cm contenant du Supersoil et on les met en serre (période 
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 lumineuse de 16 heures, à 18 C). Les régénérants croissent jusqu'à maturité et sont autopollinisés. Certaines des plantes sont testées pour leur réponse à Basta (200 g/litre de PPT, Hoechst AG, Francfort, Allemagne) par pulvérisation avec une solution à 0,   5}   additionnée de Tween 20 à 0,   1'6.   On régénère également les plantes à partir d'un cal de type sauvage sur le milieu sans bialaphos. 



  Analyse ces plantes transgéniques
On analyse les tissus et plantes transgéniques en utilisant les techniques Southern et northern pour   mettre en évidence la   présence de la séquence de codage de la peroxydase et de l'. ARN respectivement. 



   On évalue, sur des plants d'orge dont on a montré qu'ils contiennent la séquence de codage de la   peroxydase au moyen d'une analyse Southern, l'activité   insecticide contre Ostrinia nubilalis, la pyrale gu   mais d'Europe,. grotis ipsilon, la noctuelle ypsilon ;   Schizaphis graminum, la punaise   verte ; 51iss !. 1s   leucopterus   ieucopterus,   le"chinch bug" ; Acrosternum hilare, la punaise verte puante ; Euscniscus servos, punaise brune puante ; Hylemya plature, le ver des grair. s de mais ;   Nayetiola   destructor ; la mouche de   Hesse ; T1 : rysanoptera,   le thrips ; ou   Petrobia iatens,   l'acarien brun du blé en utilisant des procédés bien connus des spécialistes. 



   Toutes les   publications mentionnées ci-dessus sont   ici incorporées dans leur totalité à titre de   référence.   



   Eien que   l'invention ait été décrite avec   un certain détail dans des buts de clarté et de 

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 compréhension, les spécialistes apprécieront à la lecture de sa description que l'on peut procéder à diverses modifications de forme et de détail sans s'écarter de la véritable portée de l'invention et des revendications jointes. 



   Les souches telles que déposées, en particulier la souche NRRL B-21626 de l'exemple 1, ne devront être accessibles qu'à un expert, conformément aux dispositions de la loi sur les brevets.

Claims (29)

1. REVENDICATIONS 1. Procédé de lutte contre les insectes dans lequel on nourrit un insecte ou on le met en contact avec une quantité insecticide de cellules de plantes monocotylédones transgéniques, lesdites cellules végétales comprenant un ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit procédé comprend la transformation d'une plante monocotylédone avec une séquence d'ADN comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase.
3. 3. Procédé de la revendication 1, dans lequel ladite séquence d'ADN comprend un promoteur lié de manière opératoire à ladite séquence de codage.
4. 4. Procédé de la revendication 3, dans lequel ladite séquence d'ADM comprend un gène chimérique comprenant un promoteur lié de manière opératoire à ladite séquence de codage.
5. 5. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite peroxydaseestuneperoxydaseanionique.
6. 6. Procédé selon la revendication 1, dans lequel lesdites cellules comprennent une partie d'une plante fertile transgénique.
7. 7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel ladite plante est choisie dans le groupe constitué par le blé, le riz, l'avoine, l'orge, le sorgho et mais.
8. 8. Procédé de la revendication 7, dans lequel ladite plante est un plant de mais.
9. 9. Procédé de la revendication 8, dans lequel ledit plant de mais provlent d'une lignée de mais sélectionnéedanslegroupeconstituéparCG00526, CG00615, et CG00714. <Desc/Clms Page number 74>
10. 10. Procédé de la revendication 1, dans lequel ladite plante est transformée en utilisant une technique choisie dans le groupe constitué par le bombardement de particules, l'électroporation et et le traitement au polyéthylène glycol.
11. 11. Procédé de la revendication 1 dans lequel ladite séquence d'ADN comprend en outre un gène marqueur sélectionnable ou criblable.
12. 12. Procédé de la revendication 11, dans lequel ledit gène marqueur code pour une enzyme choisie dans le groupe constitué par la néomycine phosphotransférase, l'hygromycine phosphotransférase, la dihydrofolate réductase, la phosphinothricine acétyltransférase, l'acide 2, 2-dichloropropionique déshalogénase, l'acétohydroxy acide synthétase, la 5- énolpyruvylshikimate phosphate synthétase, l'haloarylnitrilase, l'acétyl-coenzyme A carboxylase, la dihydropteroate synthétase, la chlorophénicol acétyl transférase, et la P-glucuronidase.
13. 13. Procédé de la revendication 1, dans lequel ledit insecte provient d'un ordre choisi dans le groupe consitué par les coléoptères, les diptères, les hyménoptères, les lépidoptères, les mallophages, les homoptères, les hémiptères, les orthoptères, les thysanoptères, les dermaptères, les isoptères, les anoploures, les siphonaptères et les trichoptères.
14. 14. Procédé de la revendication 13, dans lequel ledit insecte est choisi dans le groupe constitué par la pyrale du mais d'Europe, la pyrale de la tige de mais, la noctuelle ypsilon, le ver de l'épi de mais, la chenille de la leucanie, la pyrale du mais du sud-ouest des Etats-Unis, la petite pyrale des tiges de mais, la chenille mineuse de la canne à sucre, le ver des racines de mais de l'ouest des Etats-Unis, le ver des <Desc/Clms Page number 75> racines du mais du nord des Etats-Unis, le ver des racines de mais du sud des Etats-Unis, les vers fil-defer, le hanneton masqué du nord des Etats-Unis, le hanneton masqué du sud des Etats-Unis, le hanneton du Japon, l'altise du mais, le charançon du mais, le puceron des feuilles de mais, le puceron des racines de mais, le"chinch bug", le criquet à pattes rouges, le criquet migratoire,

    le ver des graines de maïs, les teignes des taches de mais, le thrips de l'herbe, la fourmi voleuse et l'araignée à deux taches.
15. 15. Plante monocotylédone fertile transgénique comprenant un ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase, dans laquelle l'expression de la percxydase confère a ladite plante monocotylédone un trait phénotytique.
16. 16. Plante de la revendication 15, dans laquelle ledit trait phénotypique est choisi dans le groupe constitué par la résistance aux insectes et une capacité accrue à lutter.
17. 17. Plante de la revendication le, dans laquelle ledit trait phénotypique est la résistance aux insectes.
18. 18. Plante de la revendication 15, dans laquelle ladite séquence de codage de percxydase es : n gène de peroxydase anionique.
19. 19. Plante de la revendication 15, où ladite plante est choisie dans le groupe constitué par le blé, le riz, l'avoine, l'orge, le sorgho et le mais.
20. 20. Plante de la revendication 19, où ladite plante est un plant de mais.
21. 21. Plante de la revendication 20, où ledit plant de mais provient d'une lignée de mais choisie dans le groupe constitué par CG00526, CG00615, et CG00714.
22. 22. Plante de la revendication 15, où ladite séquence EMI75.1 d'ADN comporte en outre un gène marqueur sélectionnable ou cnlclable. <Desc/Clms Page number 76>
23. 23. Plante de la revendication 22, dans laquelle ledit gène marqueur code pour une enzyme choisie dans le groupe constitué par la néomycine phosphotransférase, l'hygromycine phosphotransférase, la dihydrofolate réductase, la phosphonothricine acétyltransférase, l'acide 2,2-dichloropropionique déshalogénase, l'acétohydroxy acide synthétase, la 5- énolpyruvylshikimate phosphate synthétase, l'haloarylnitrilase, l'acétyl-coenzyme A carboxylase, la dihydroptéroate synthétase, la chlorophénicol acétyl transférase, et la ss-glucuronidase.
24. 24. Cellule, tissu ou semence ou graine de plante transgénique, obtenue à partir de la plante selon la revendication 15.
25. 25. Descendant transgénique de la plante selon la revendication 15.
26. 26. Cellule, tissu ou graine de plante transcenique obtenue à partir du descendant selon la revendication 25.
27. 27. Utilisation d'un ADN recombinant codant pour la peroxydase dans le but de conférer une résistance aux insectes aux cellules de plantes monocotylédones.
28. 28. Utilisation d'une plante comprenant un ADN recombinant codant pour la peroxydase pour lutter contre les dommages aux plantes provoqués par l'attaque des insectes.
29. 29. Procédé agricole faisant appel à un matériau végétal transgénique ou à des plantes comprenant un ADN recombinant comprenant une séquence de codage codant pour la peroxydase, dans lequel l'expression de la peroxydase confère à ladite plante monocotylédone un trait phénotypique.