KR20000069581A

KR20000069581A - 퍼옥시다제 암호화 서열을 사용하여 단자엽 식물에 곤충 내성을 부여하는 방법

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Publication number: KR20000069581A
Application number: KR1019997005541A
Authority: KR
Inventors: 마르타 비일 휠; 마르타 라이트; 후안 호세 에스트러치; 패트릭 프란시스 다우드; 로렌스 마크 랙리미니; 로라 스테인 프로밸레
Original assignee: 한스 루돌프 하우스, 헨리테 브룬너, 베아트리체 귄터; 오하이오 스테이트 유니버시티; 노파르티스 아게; 유.에스. 디파트먼트 오브 애그리컬쳐
Priority date: 1996-12-19
Filing date: 1997-12-17
Publication date: 2000-11-25
Also published as: HUP0000643A2; BR9714150A; FR2758045A1; ZA9711359B; GR1002990B; WO1998027218A2; HUP0000643A3; ITMI972798A1; PL334192A1; FR2758045B1; JP2001510337A; EP0946102A2; TR199901421T2; BE1011397A3; AR010363A1; AU6090198A; IL130426A0; CA2274901A1; AU735312B2; WO1998027218A3

Abstract

본 발명은 일반적으로, 단자엽 식물(모노코트; monocots), 특히 옥수수에 있어서 곤충을 방제하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 (1) 퍼옥시다제를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 재조합 DNA 서열을 포함하는 유전자전이 단자엽 식물 세포의 살충량을 곤충에 공급하거나 접촉시킴을 포함하는 곤충의 방제방법 및 (2) 퍼옥시다제를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 DNA 서열을 포함하는 번식가능한 유전자전이 단자엽 식물에 관한 것이다.

Description

퍼옥시다제 암호화 서열을 사용하여 단자엽 식물에 곤충 내성을 부여하는 방법{Methods for conferring insect resistance to a monocot using a peroxidase coding sequence}

본 발명은 일반적으로, 단자엽 식물(모노코트; monocots), 특히 옥수수에 있어서 곤충을 방제하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 (1) 퍼옥시다제를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 재조합 DNA를 포함하는 유전자전이(transgenic) 단자엽 식물 세포의 살충량을 곤충에 공급하거나 접촉시킴을 포함하는 곤충의 방제방법 및 (2) 퍼옥시다제를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 DNA를 포함하는 번식가능한 유전자전이 단자엽 식물에 관한 것이다.

세계적으로 상업상 중요한 농작물의 소실에 있어서 곤충은 주요 인자이다. 광범위한 스펙트럼의 화학적 살충제를 강력하게 사용하여 농업상 중요한 곤충을 방제하거나 박멸하고 있다. 살충제가 대부분의 해로운 곤충을 방제하는데 있어서 효과적이지만, 이들 화합물 사용과 관련된 심각한 문제점이 있다. 살충제는 값이 비싸 도포하는데 비용이 많이든다. 효과적인 방제를 위해서는 흔히 반복적인 사용이 필수적이다. 또한, 곤충이 이들을 방제하는데 사용되는 수많은 화학물질에 대해 내성을 갖거나 가질 것이라는 점이 우려 되고있다. 살충제는 통상 수분자(pollinator)이거나 초식성 곤충에 대한 먹이인 유익한 곤충도 사멸시킨다. 또한, 화학적 살충제를 장기간 사용하는 것과 관련된 환경적 위험이 있다.

곤충 방제 프로그램은 화학적 살충제를 보다 적게 사용하는 것이다. 이들 프로그램에는 선택에 의한 작물의 개량, 생물학적 방제제 및 곤충 포식동물의 사용, 및 육종 프로그램 및 유전자 조작을 통한 곤충 내성 유전자의 혼입이 포함된다. 유전자 조작에 가장 널리 이용되는 유전자는 바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis)로부터의 결정 단백질 유전자이다(참조: Rice et al., EP-A-292 435 및 Koziel et al., WO93/07278). 바실러스에 의해 만들어지는 결정 단백질의 대다수는 레피도프테라(Lepidoptera), 디프테라(Diptera), 콜레오프테라(Coleoptera) 목의 곤충 유충에 대해 독성이 있다. 일반적으로, 살충성 결정 단백질은 감수성 곤충에 의해 섭취될 경우, 결정이 가용화되어 독성 부분으로 작용한다. 이들 독소에 대해 내성이 있는 곤충이 발달하는 것을 피하기 위해서는, 추가적인 또는 상승적인 효과를 갖는 추가의 독소가 필요하다.

퍼옥시다제는 기질로서 H₂O₂와 같은 과산화물을 사용하는 옥시도-리덕타제의 서브클래스이다. 퍼옥시다제는 2가 양이온(주로 Ca²⁺이나 또한 Mn²⁺)에 결합할 수 있는 헴(heme)-함유 단량체 당단백질이다[참조 문헌: Maranon and Van Huystee, Phytochemistry 37:1217-1225(1994)]. 퍼옥시다제의 경우 보결 원자단(prosthetic group)는 상이한 역할을 한다. 헴기는 촉매작용에 관련되는 반면, 2가 양이온은 헴 잔기를 안정화시키고, 글리코실기는 퍼옥시다제의 회전율(turnover rate)을 감소시켜 퍼옥시다제를 안정화시키는데 도움을 줄 수 있다[참조 문헌: Maranon and Van Huystee, Phytochemistry 37:1217-1225(1994)].

퍼옥시다제는 통상 등전 포커싱 겔상에서 이들의 이동에 따라서 음이온성, 양이온성 및 중성 형태로 그룹화된다. 효소로서 이들이 광범위환 기질 특이성을 갖는 것으로 인식되어 있지만, 이들은 상이한 동위 효소(isoenzyme)에 대해 일부 기질 "선호성"을 갖는 것으로 나타났다[참조 문헌: Van Huystee, Ann. Rev. Plant Physiol., 205-219(1987)]. 수가지 타입의 퍼옥시다제와 구아이아콜 퍼옥시다제, NADH 퍼옥시다제, 시토크롬-C 퍼옥시다제, 카탈라제, 글루타티온 퍼옥시다제, L-아스코르베이트 퍼옥시다제 및 망간 퍼옥시다제를 포함한 관련 효소가 있다.

식물에 있어서, 퍼옥시다제는 활성이 식물에 의해 밀접하게 조절되는 고도로 복잡한 효소인 단량체성 단백질이다. 퍼옥시다제는 식물 세포벽의 생합성에 있어서 중요하다. 퍼옥시다제는 모노리그놀 코니페릴, γ-쿠마릴 및 시나필 알코올이 리그닌으로 되는 과산화성 중합 반응을 촉진시킨다[참조 문헌: Greisbach, In: The Biochemistry of Plants, Ed. Conn, Academic, New York pp. 457-480(1991)]. 상이한 식물종은 반랜덤식으로 조합된 다양한 비율의 모노리그놀 종(monolignol species)을 갖는다[참조 문헌: Hwang et al., Carbohydrate Polymers 14:77-88(1991)]. 리그닌화는 세포벽을 강화시키고 보강시키는 작용을 한다. 전체적인 결과는 식물 조직의 경화이다.

담배 음이온성 퍼옥시다제는 엔. 타바쿰(N. tabacum) 및 엔. 실베스트리스(N. sylvestris)를 형질전환시키는데 이용되었다[참조 문헌: Lagrimini, Plant Cell 2:7-18(1990); Lagrimini, Plant Physiology 96:577-583(1991)]. 이들 유전자전이 식물은 35S 프로모터로부터 담배 음이온성 퍼옥시다제를 구조적으로 과발현시킨다. 퍼옥시다제 과발현의 가장 두드러진 표현형은 대략 개화 시기에 시작되는 만성적인 시들음(wilting) 현상이다. 또한, 상기 식물은 성장이 지연되고, 더 작고 치밀하게된 세포를 가지며, 손상에 대한 반응으로 신속하게 갈변된다.

동일한 작제물을 또한 이용하여 토마토 식물을 형질전환시켰다[참조 문헌: Lagrimini et al., J. Am. Soc. Hort. Sci. 117:1012-1016(1992); Lagrimini et al., Hortscience 28:218-221(1993)]. 이들 식물은 또한 개화후 심하게 시드는 것으로 밝혀졌으며, 과도한 갈변화가 나타나고 과일 크기가 감소되는 것으로 밝혀졌다.

초기 연구로 담배 음이온성 퍼옥시다제 유전자를 발현시키는 유전자전이 담배 및 토마토 식물의 일부 조직이 일부 곤충에 대해 내성이 있는 것으로 밝혀졌다[참조 문헌: Dowd et al., presentation at the National Meeting of the Entomological Society of America, Indianapolis, December 1993)]. 담배 및 토마토는 동일한 과인 솔라나세아에(Solaneceae)에 속하는 밀접하게 관련된 쌍자엽 식물이다. 대조적으로, 본 발명의 유전자전이 단자엽 식물은 쌍자엽 식물과 비교시 크게 상이한 생리학, 생화학, 해부학 및 대사작용을 갖는다. 예를 들면, 단자엽 식물은 상이한 코돈 용도를 가지며, C3 대사작용 대신 C4를 이용하고, 상이한 지방산 함량, 불완전한 꽃 등을 갖는다. 따라서, 곤충을 방제하기 위하여 퍼옥시다제를 사용할 수 있는 단자엽 식물중에 기질이 존재하는지 여부는 미지 상태이다.

또한, 퍼옥시다제는, 특이적인 전사후에 개질시키고 헴-함유기를 안정하고 효소적으로 활성인 상태로 혼입시켜야하는 당단백질이다. 퍼옥시다제는 특정 식물에서 이용가능한 기질에 따르는 특성을 갖는 2차 대사물 및 리그닌의 합성에 관련되어 있다. 그러므로, 퍼옥시다제를 발현시켜 수득한 최종 생성물은 식물에 따라 상이할 수 있다.

또한, 옥수수 이삭 벌레에 대한 내성은 옥수수 수염의 갈변화와 음성으로 상호 관련있는데, 이는 퍼옥시다제가 증가하면 내성이 저하됨을 나타낸다[참조 문헌: Byrne et al., Environ. Entomol. 18:356-360(1989)]. 이는 단자엽 식물에 있어서 곤충을 방제하기 위하여 퍼옥시다제를 사용하는 것과는 거리가 멀다는 것을 교시하는 것이다.

또한, 옥수수(bm 돌연변이체)에 있어서 변화된 리그닌의 생산은 곤충에 대한 감수성을 증가시킨다[참조 문헌: Barriere and Argillier, Agronomie 13:865-876(1993)]. 따라서, 리그닌화를 변형시키는 외부 퍼옥시다제는 곤충에 대한 감수성을 감소시킬 것으로 기대되지 않았다. 또한, 성장 초기 단계에서 퍼옥시다제 활성으로 인한 조직의 경화에 의해 식물에 곤충 내성을 부여한다는 버그빈슨 등(Bergvinson et al., The Canadian Entomologist 127:111-122, 1995)의 교시로부터 기대되지 않았다.

그러므로, 본 발명 이전에는 단자엽 식물에 있어서 재조합 퍼옥시다제 발현 효과를 예측할 수 없었다.

곤충을 방제하는 방법 및 곤충 내성인 단자엽 식물이 제공된다.

더욱 상세하게는, 본 발명은 퍼옥시다제의 발현이 유전자전이 단자엽 식물 세포에 곤충 내성을 부여하는, 퍼옥시다제를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 재조합 DNA를 포함하는 유전자전이 단자엽 식물 세포의 살충량을 곤충에게 공급하거나 접촉시킴을 특징으로하는 곤충의 방제법을 제공한다.

본 발명은 또한 퍼옥시다제의 발현이 유전자전이 단자엽 식물 세포에 표현형 특성을 부여하는, 퍼옥시다제를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 재조합 DNA를 갖는 세포를 포함하는 적어도 일부의 번식가능한 유전자전이 단자엽 식물을 제공한다.

본 발명은 또한 상기 식물로부터 수득한 유전자전이 식물 세포, 조직 또는 종자를 제공한다.

본 발명은 또한 상기 식물의 유전자전이 후손을 제공한다.

본 발명은 상기 후손으로부터 수득한 유전자전이 식물 세포, 조직, 또는 종자를 제공한다.

본 발명의 목적 및 잇점은 하기 설명으로부터 자명해질 것이다.

도 1은 주름진(shrunken) 인트론에 결합된 (1) CaMV 35S 프로모터와 (2) CaMV 35S 터미네이터 사이에 삽입된 담배 음이온성 퍼옥시다제를 포함하는 플라스미드 pJS20293을 나타낸 것이다.

도 2는 플라스미드 pUBIAc를 나타낸 것이다.

다음 정의는 본 발명의 이해를 도울것이다.

식물 세포: 원형질체와 세포벽으로 이루어진, 식물의 구조적 및 생리학적 단위. 용어 "식물 세포"는 식물의 일부 또는 식물로부터 유래된 임의의 세포를 언급한다. 세포의 일부예로는 살아있는 식물의 일부인 분화된 세포; 배양물중의 분화된 세포; 배양물중의 비분화된 세포; 유합 조직(callus) 또는 종양(tumors)과 같은 비분화된 조직의 세포; 종자, 배아, 번식체 및 화분의 분화된 세포가 포함된다.

식물 조직: 구조 및 기능성 단위로 조직화된 식물 세포군. 식물계 또는 배양물중 식물 조직이 포함된다. 이 용어는 비제한적으로, 전체 식물, 식물 기관, 식물 종자, 조직 배양물 및 구조 및(또는) 기능성 단위로 조직화된 식물 세포를 포함한다. 상기 열거한 것이거나 상기 정의에 포함되는 특정 타입의 식물 조직과 함께 또는 이와 별개로 상기 용어를 사용하는 것은 다른 타입의 식물 조직을 포함하는 것만은 아니다.

원형질체: 세포벽이 없는 식물 세포.

후손 식물: 비제한적으로 자손 식물을 포함하는 유성적 또는 무성적으로 유래된 후기 세대 식물.

유전자전이 식물: 게놈중에 안정하게 혼입된 재조합 DNA를 갖는 식물.

재조합 DNA: 상이한 공급원으로부터의 DAN 절편을 연결하여 형성되고 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산한 DNA 분자.

재조합 DNA 기술: 재조합 DNA를 시험관내에서 생산하고 DNA를 발현시키거나 보급시킬 수 있는 세포중으로 재조합 DNA를 운반하는 기술[참조: Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Bioligy, Ed. Juo, CRC Press, Boca Raton(1996)]로, 예를 들면, DNA를 여러가지 형태, 예를 들어, (1) 원형, 선형 또는 초나선(supercoil) 형태의 나상(naked) DNA, (2) 뉴클레오솜 또는 염색체 또는 핵 또는 이의 일부중에 포함된 DNA, (3) 다른 분자와 복합되거나 연관된 DNA, (4) 리포좀, 스페로플라스트(spheroplast), 세포 또는 원형질체중에 함포된 DNA 또는 (5) 숙주 유기체(예: Agrobacterium tumefiaciens) 이외의 유기체로부터 운반된 DNA로 원형질체(들) 또는 세포(들)중으로 운반하는 기술이다. 이들 및 다른 여러가지 세포중으로 재조합 DNA를 도입시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 이를 사용하여 본 발명의 유전자전이 세포 또는 유전자전이 식물을 생산할 수 있다.

재조합 DNA 기술은 또한 문헌[참조 문헌: Treco et al., WO 94/12650 및 Treco et al., WO 95/31560]에 기술된 상동성 재조합 방법을 포함하는데, 이는 단자엽 식물중 퍼옥시다제 활성을 증가시키는데 적용할 수 있다. 구체적으로, 조절 영역(예: 프로모터)을 식물 게놈중에 도입시켜 내인성 퍼옥시다제의 발현을 증가시킬 수 있다.

선택된 발현 시그날이 결여되어 있는 퍼옥시다제 암호화 서열을 단자엽 식물중에 삽입시키고 단자엽 식물중에서 내인성 조절 서열로 인한 퍼옥시다제의 증가된 발현에 대해 유전자전이 단자엽 식물을 검정하는 것이 또한 재조합 DNA 기술에 포함된다. 이는 식물내에서 퍼옥시다제 암호화 서열의 복제 수를 증가시킨다.

R⁰식물의 게놈중으로 재조합 DNA를 초기에 삽입시키는 것은 전통적인 식물 육종법으로 수행하는 것으로 한정되기 보다는 본 명세서에 기술된 바와 같은 기술 방법으로 수행한다. 초기 삽입 이후, 유전자전이 후손 식물을 본질적으로 전통적인 육종법을 사용하여 보급시킬 수 있다.

키메릭 유전자(chimeric gene): 2종 이상의 이종성 부분, 예를 들면, 이미-존재하는 단계와 관련없는 이미-존재하는 DNA 서열로부터 유래된 2가지 이상의 이종성 부분을 포함하는 DNA 분자로, 이들 서열은 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성하는 것이 바람직하다.

발현 카세트: 프로모터와 터미네이터 사이에 암호화 서열을 삽입시킬 수 있는, 프로모터와 터미네이터를 포함하는 DNA 분자.

암호화 서열: 전사되고 해독시 폴리펩타이드 또는 단백질을 형성시키는 DNA 분자.

유전자: 발현, 즉, 전사 및 해독, 및 명확한 폴리펩타이드 또는 단백질로 전사 및 해독되는 암호화 서열의 조절에 작용하는 조절 DNA 서열을 포함하는 별개의 염색체 영역.

표현형 특성: 1개 이상의 유전자 발현으로부터 발생되는 관찰가능한 특성.

본 발명은 콜레오프테라(Coleoptera), 디프테라(Diptera), 하이메노프테라(Hymenoptera), 레피도프테라(Lepidoptera), 말로파가(Mallophaga), 호모프테라(Homoptera), 헤미프테라(Hemiptera), 오르토프테라(Orthroptera), 티사노프테라(Thysanoptera), 데르마프테라(Dermaptera), 이소프테라(Isoptera), 아노플루라(Anoplura), 시포나프테라(Siphonaptera) 및 트리코프테라(Trichoptera)와 같은 곤충을 방제하는 방법에 관한 것이다. 상기와 같은 곤충의 특정 예로는 유럽 옥수수 벌레, 줄기 옥수수 벌레, 흑색 야도충, 옥수수 이삭 벌레, 폴 행렬구더기, 남서 옥수수 벌레, 레서 옥수수 줄기 벌레, 당밀 벌레, 서구 옥수수 뿌리벌레, 북구 옥수수 뿌리벌레, 서구 옥수수 뿌리벌레, 와이어벌레, 북구 마스크 풍뎅이과 곤충, 남구 마스크 풍뎅이과 곤충, 일본 딱정벌레, 옥수수 벼룩 딱정벌레, 옥수수 바구미, 옥수수잎 진딧물, 옥수수뿌리 진딧물, 빈대 벌레, 빨간 다리 메뚜기, 이주성 메뚜기, 종자옥수수 구더기, 옥수수 반점 리프마이너, 잔디 삽주벌레, 도둑 개미 및 2점박이 거미 진드기가 있다. 퍼옥시다제의 발현으로 단자엽 식물 세포에 곤충 내성을 부여하는 방법이 본 발명에 포함된다.

바람직한 양태중 하나로, 본 발명은 단자엽 식물 세포의 게놈이 퍼옥시다제 활성을 갖는 효소를 암호화하는, 살충량의 유전자전이 단자엽 식물 세포를 곤충에게 공급하거나 접촉시킴으로써 곤충을 방제하는 방법에 관한 것이다. 발현시 퍼옥시다제는 유전자전이 식물 세포에 곤충 내성을 부여한다. 퍼옥시다제를 암호화하는 전이유전자는 퍼옥시다제를 천연적으로 암호화하지 않는 선조 식물의 게놈중에 삽입된 추가의 유전자로부터 유래되는 것이다.

바람직한 다른 양태로, 문헌[참조 문헌: Treco et al., WO 94/12650 및 Treco et al., WO 95/31560]에 기술된 상동성 재조합법을 사용하여 단자엽 식물에서 퍼옥시다제 활성을 증가시켜 곤충 내성을 증가시킨다. 상세하게는, 조절 영역(예: 프로모터)을 식물 게놈내에 도입시켜 식물의 곤충 내성을 증가시키는 내인성 퍼옥시다제의 발현을 증가시킨다.

다른 바람직한 양태로, 본 발명은 선택된 발현 시그날이 결여되어 있는 퍼옥시다제 암호화 서열을 단자엽 식물중에 삽입시키고 단자엽 식물중 내인성 조정 서열로 인한 퍼옥시다제의 증가된 발현을 위한 유전자전이 단자엽 식물을 검정하는 것에 관한 것이다. 이로써 식물내 퍼옥시다제 암호화 서열의 복제 수가 증가된다.

다른 바람직한 추가 양태로, 본 발명은 단자엽 식물에 곤충 내성을 부여하는 내인성 퍼옥시다제 유전자의 복제 수를 증가시키는 방법에 관한 것이다. 상기와 같은 방법은 전통적인 식물 육종법을 사용하거나 조직 배양 기술을 사용하여 수행하는 것이 바람직하다.

곤충 내성 식물은 퍼옥시다제의 증가된 수준으로 인하여 천연 비조작된 식물에서 발견되는 것보다 증가된 곤충 내성을 갖는다.

본 발명은 또한 퍼옥시다제가 발현되어 단자엽 식물에 표현형 특성을 부여하는, 퍼옥시다제를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 재조합 DNA로 형질전환시킨 단자엽 식물의 종자를 포함하는 상업적 백(bag)에 관한 것이다. 퍼옥시다제가 발현되어 유전자전이 식물에 곤충 내성 또는 저항성을 부여하는 유전자전이 식물의 종자를 포함하는 상업적 백이 본 발명내에서 바람직하다. 본 발명의 다른 바람직한 목적은 백에 함유되어 있는 종자를 사용하기 위한 지시 사항이 표시된 상기와 같은 상업용 백을 제공하는 것이다.

〈곤충 내성〉

본 발명의 유전자전이 단자엽 식물은 비제한적으로 콜레오프테라, 디프테라, 하이메노프테라, 레피도프테라, 말로파가, 호모프테라, 헤미프테라, 오르토프테라, 티사노프테라, 데르마프테라, 이소프테라, 특히 콜레오프테라 및 레피도프테라를 포함한 목으로부터 선택되는 곤충에 대해 내성인 것이 바람직하다. 본 발명의 목적을 위하여, 본 발명의 유전자전이 식물은 곤충 뿐만 아니라 진균류, 세균류, 선충류, 진드기 등에 대해서도 내성일 수 있는 것으로 인지되어 있다.

본 발명의 옥수수과 식물은 비제한적으로 오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis), 유럽 옥수수 벌레; Sesemia nonegrioides, 줄기 옥수수 벌레; Agrotis ipsilon, 흑색 야도충; Helicoverpa zea, 옥수수 이삭 벌레; Spodoptera frugiperda, 폴 행렬구더기; Diatraea grandiosella, 남서 옥수수 벌레; Elasmopalpus lignosellus, 레서 옥수수줄기 벌레; Diatraea saccharalis, 당밀 벌레; Diabrotica virgifera virgifera, 서구 옥수수 뿌리벌레; Diabrotica longicornis barberi, 북구 옥수수 뿌리벌레; Diabrotica undecimpunctata howardi, 남구 옥수수 뿌리벌레; Melanotus spp., 와이어벌레; Cyclocephala borealis, 북구 마스크 풍뎅이과 곤충(백색 땅벌레); Cyclocephara immaculata, 서구 마스크 풍뎅이과 곤충(백색 땅벌레); Popillia japonica, 일본 딱정벌레(땅벌레 및 성충 형태); Chaetocnema pulicaria, 옥수수 벼룩 딱정벌레; Sphenophorus maidis, 옥수수 바구미; Rhopalosiphum maidis, 옥수수잎 진딧물; Anuraphis maidiradicis, 옥수수뿌리 진딧물; Blissus leucopterus leucopterus, 빈대 벌레; Melanoplus femurrubrum, 빨간 다리 메뚜기; Melanoplus sanguinopes, 이주성 메뚜기; Hylemya platura, 종자옥수수 구더기; Agromyza parvicornis, 옥수수 반점 리프마이너; Anaphothrips obscurus, 잔디 삽주벌레; Solenopsis milesta, 도둑 개미 ; Tetranycus urticae, 및 2점박이 거미 진드기로부터 선택된 곤충에 대해 내성이 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 사탕수수과 식물은 비제한적으로 Chilo partellus, 사탕수수 벌레; Spodoptera frugiperda, 폴 행렬구더기; Helicoverpa zea, 옥수수 이삭 벌레; Elasmopalpus lignosellus, 레서 옥수수 줄기 벌레; Feltia subterranean, 과립 야도충; Phyllophara crinita, 백색 땅벌레; Eleodes, Conoderus 및 Aeolus spp., 와이어벌레; Oulema Melanopus, 곡물 잎 딱정벌레; Chaetocnema pulicaria, 옥수수 벼룩 딱정벌레; Sphenophorus maidis, 옥수수 바구미; Rhopalosiphum maidis, 옥수수 잎 진딧물; Sipha flara, 황색 당밀 진딧물; Blissus leucopterus leucopterus, 빈대 벌레; Contarinia sorghicola, 사탕수수 벌레; Tetranychus cinnabarinus, 카민 거미 진드기; 및 Tetranychus urticae, 2점 박이 거미 진드기를 포함하는 군으로부터 선택된 곤충에 대해 내성인 것이 바람직하다.

본 발명의 밀과 식물은 비제한적으로 슈달레티아 우니펑카타(Pseudaletia unipunctata), 행렬구더기; Spodoptera frugiperda, 폴 행렬구더기; Elasmopalpus lignosellus, 레서 옥수수줄기 벌레; Agrotis orthogonia, 페일 서구 야도충; Oulema Melanopus, 곡물 잎 딱정벌레; Hypera punctata, 클로버잎 바구미; Diabrotica undecimpunctata howardi, 남구 옥수수 뿌리벌레; 러시아 밀 진딧물; Schizaphis graminum, 녹색벌레; Macrosiphum avenae, 영국 곡물 진딧물; Melanoplus femurrubrum, 빨간 다리 메뚜기; Melanoplus differentialis, 분와 메뚜기; Melanoplus sanguinipes, 이주성 메뚜기; Mayetiola destructor, 헤시안 파리; Sitodiplosis mosellana, 밀 벌레; Meromyza americana, 밀 줄기 구더기; Hylemya coarctata, 밀 구근 파리; Frankliniella fusca, 담배 삽주벌레; Cephus cinctus, 밀 줄기 잎벌; 및 Aceria tulipae, 밀 쿠리 진드기를 포함하는 군으로부터 선택된 곤충에 대해 내성인 것이 바람직하다.

본 발명의 벼과 식물은 비제한적으로 디아트라에아 사카랄리스(Diatraea saccharalis), 당밀 천공충; Spodoptera frugiperda, 폴 행렬구더기; Helicoverpa zea, 옥수수 벌레; Colaspis brunnea, 포도 콜라스피스(grape colaspis); Lissorhoptrus oryzophilus, 벼 물바구미; Sitophilus oryzae, 벼 바구미; Nephotettix nigropictus, 벼멸구; Blissus leucopterus leucopterus, 빈대 벌레; 및 Acrosternum hilare, 녹색 방귀벌레를 포함하는 군으로부터 선택된 곤충에 대해 내성인 것이 바람직하다.

본 발명의 보리과 식물은 비제한적으로 오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis), 유럽 옥수수 벌레; Agrotis ipsilon, 흑색 야도충; Schizaphis graminum, 녹색벌레; Blissus leucopterus leucopterus, 빈대 벌레; Acrosternum hilare, 녹색 방귀벌레; Euschistus servos, 갈색 방귀벌레; Hylemya platura, 종자옥수수 구더기; Mayaetiola destructor, 헤시안 파리; Thysanoptera, 삽주벌레; 및 Petrobia latens, 갈색 밀 진드기를 포함하는 군으로부터 선택된 곤충에 대해 내성인 것이 바람직하다.

하나의 양태로, 본 발명은 퍼옥시다제를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 재조합 DNA를 포함하는 번식가능한 유전자전이 단자엽 식물(monocot)에 관한 것이다.

단자엽 식물은 배가 1개의 자엽을 갖는 식물이다. 단자엽 식물은 2개의 큰 부류의 피자식물중 하나이다(쌍자엽 식물은 다른 큰 부류이다).

단자엽 식물 부류내의 바람직한 강은 그래미네아에[풀과; 그래미네아에중 바람직한 것은 마초 풀(예: Festuca(김의털 풀)), Hordeum(보리), Avena(귀리), Zea mays(옥수수), Triticum(밀), Secale(호밀), Sorgum vulgare(사탕수수) 및 Oryza sativa(벼)]; 릴라세아에(백합과; 바람직하게는 Allium(양파) 및 Asparagus); 및 디오스코레아세아에(참마족)이 있으며, 이들은 모두 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 비제한적으로 단자엽 식물을 포함하며, 예를 들면, 제아 메이즈(Zea mays)의 바람직한 주는 Funk 5N984, Funk 5N986, Funk 2717, Funk 211D, Funk 2N217A, B73, A632, CM105, B37, B84, B14, Mo17, A188, CG00526, CG00615 및 CG00714를 포함한다.

상기 언급한 유전자전이 종자 및 식물중으로 조작된 유전적 특성은 유성 번식 또는 식물성 성장에 의해 전수되어 후손 식물에서 유지되고 보급될 수 있다. 일반적으로 상기 유지 및 보급은 경작, 파종 또는 수확과 같은 특정 목적에 맞게 개발된 공지된 영농방법을 사용할 수 있도록 한다. 수경재배 또는 온실 기술과 같은 특정 공정을 또한 적용할 수 있다. 성장하는 작물은 곤충 또는 감염뿐만 아니라 잡초 식물과의 경쟁으로 야기되는 공격 및 손상을 받기 쉽기 때문에, 잡초, 식물 질병, 곤충, 선충류, 및 수율을 증진시키는데 부정적인 기타 조건을 조절하기 위한 수단을 실시한다. 이들 수단에는 토양의 경작, 또는 잡초 및 감염된 식물의 제거와 같은 기계적 수단 뿐만 아니라 제초제, 살진균제, 배우자제거제(gametocides), 살선충제, 성장 조절제, 숙성제 및 살충제와 같은 농약의 사용이 포함된다.

본 발명에 따른 유전자전이 식물 및 종자의 유리한 유전적 특성은, 곤충, 제초제 또는 스트레스에 대한 내성, 향상된 영양 가치, 증가된 수율, 또는 손실 또는 분해로부터의 소실량을 보다 감소시키는 개선된 구조를 갖는 식물의 개발을 목적으로하는 식물 육종에 사용할 수 있다. 여러가지 육종 단계는 교배시킬 주의 선택, 부모주의 수분 지시, 또는 적절한 후손 식물의 선택과 같이 익히 정의되어 있는 사람의 개입을 특징으로 한다. 목적하는 특성에 따라서 상이한 육종 수단을 선택한다. 관련 기술은 당해 분야에 공지되어 있으며 비제한적으로 하이브리드화, 동종번식, 역교배 번식, 다중 번식, 다양성 블렌드, 내부특이적 하이브리드화, 이수성 기술 등이 있다. 하이브리드화 기술로는 기계적, 화학적 또는 생화학적 수단으로 웅성 또는 자성 불임 식물을 생산하기위한 식물의 중성화가 있다. 웅성 불임 식물을 상이한 주의 화분으로 타가 수분시킴으로써 웅성 불임이지만 자성 번식가능한 식물의 게놈이 두 부모주의 특성을 균일하게 수득하도록 한다. 따라서, 본 발명에 따르는 유전자전이 종자 및 식물은, 예를 들어 제초제 또는 살충제 처리와 같은 통상의 방법의 효과를 증가시키거나 이들의 개질된 유전자 특성으로 인하여 상기 방법을 수행하지 않아도 되는 개량된 식물주의 육종에 사용할 수 있다. 달리, 최적화된 유전적 "장치"로 인하여, 필적하는 나쁜 성장 조건을 견딜 수 없는 생성물 보다 품질이 더욱 우수한 생성물을 수확하도록하는 개선된 스트레스 내성을 갖는 신규한 작물을 수득할 수 있다.

종자 생산에 있어서 종자의 발아 품질과 균일성은 필수적인 생성물 특징이지만 농부에 의해 수확되어 판매되는 종자의 발아 품질과 균질성은 중요하지 않다. 한 작물은 다른 작물 및 잡초 종자와 분리시켜 보관하기 어렵기 때문에, 종자태생의 질병을 방지하고 발아가 양호한 종자를 생산하기 위해서, 순수한 종자의 성장, 정련 및 판매 분야에 있어서 경험이 풍부한 종자 생산업자에 의해 극히 집중적이고 잘 정의된 종자 생산 관례가 개발되어 있다. 따라서, 농부가 생산한 작물로부터 수확한 종자를 사용하는 대신 특정 품질 기준을 만족시키는 인증된 종자를 구입하는 것이 농부들의 관례이다. 종자로서 사용될 보급물은 통상적으로 제초제, 살충제, 살진균제, 살균제, 살선충제, 연체동물제거제(molluscicides) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 보호성 피복물로 처리한다. 통상적으로 사용되는 보호성 피복물은 캅탄, 카르복신, 티람(TMTD^R), 메탈락실(Apron^R) 및 피리미포스-메틸(Actellic^R)과 같은 화합물을 포함한다. 경우에 따라, 이들 화합물은 제형 분야에서 통상적으로 이용되는 추가의 담체, 계면활성제 또는 적용 증진 보조제와 함께 제형화되어 세균성, 진균성 또는 동물 기생충에 의해 야기되는 손상에 대한 보호를 제공한다. 보호성 피복물은 보급물을 액체 제형으로 함침시키거나 혼합 습윤물 또는 건식 제형물로 피복시켜 적용시킬 수 있다. 발아눈 또는 과실에 직접 처리하는 것과 같은 다른 적용법도 가능하다.

본 발명의 다른 양태는 본 발명에 따르는 유전자전이 식물, 유전자전이 식물 물질, 또는 유전자전이 종자를 사용함을 특징으로하는, 상기 예시된 방법과 같은 신규한 영농방법을 제공하는 것이다.

다른 양태로, 본 발명은 유전자전이 식물로부터 수득한 유전자전이 식물 세포, 조직, 기관, 종자 또는 식물 부분에 관한 것이다. 또한 상기 식물의 유전자전이 후손 뿐만 아니라 상기 후손으로부터 수득한 유전자전이 식물 세포, 조직, 기관, 종자 및 식물 일부가 본 발명내에 포함된다.

본 명세서에 기재된 바와 같이, 본 발명은 퍼옥시다제 암호화 서열로 형질전환시킨 번식가능한 유전자전이 단자엽 식물에 관한 것이다. 바람직하게는, 퍼옥시다제 암호화 서열은 퍼옥시다제 암호화 서열 또는 이의 과발현이 결여되어 있는 부모 식물에서 발견되지 않는 표현형 특성을 단자엽 식물에 부여한다. 생성될 수 있는 표현형 특성은 곤충 내성 및 향상된 저항성을 포함한다.

더욱 바람직하게는, 유전자전이 식물중 퍼옥시다제 암호화 서열이 유성적으로 전달되는 것이다. 바람직한 양태중 하나는, 퍼옥시다제 암호화 서열은 R⁰식물에서 R¹세대로의 완전히 정상적인 유성적 사이클을 통하여 유성적으로 전달된다. 퍼옥시다제 암호화 서열이 발현되어 세포, 조직, 종자 또는 식물중 퍼옥시다제의 수준을, 퍼옥시다제 암호화 서열이 없다는 것만이 상이한 단자엽 식물의 세포, 조직, 종자 또는 식물중에서의 수준 이상으로 증가시키는 것이 추가로 바람직하다.

바람직한 양태중 하나에서, 퍼옥시다제 암호화 서열은 음이온성, 양이온성 또는 중성 퍼옥시다제 암호화 서열이다. 다른 바람직한 양태로, 퍼옥시다제는 구아이아콜 퍼옥시다제, NADH 퍼옥시다제, 시토크롬-C 퍼옥시다제, 카탈라제, 글루타티온 퍼옥시다제, L-아스코르베이트 퍼옥시다제, 망간 퍼옥시다제, 과산화수소 생성 퍼옥시다제 및(또는) 리그닌 형성 퍼옥시다제이다.

여러가지 퍼옥시다제 암호화 서열을 당해 분야에서 입수할 수 있으며 본 발명에서 사용하기 위하여 입수할 수 있다. 예를 들어, 퍼옥시다제가 담배[참조 문헌: Lagrimini, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7542-7546(1987)], 감자[참조 문헌: Roberts et al., Plant Molecular Biology 11:5-26(1988)], 서양고추냉이[참조 문헌: Fujiyama et al., European Journal of Biochemistry, 173, 681-687(1988); Fujiyama et al., Gene 89:163-169(1990); 및 Welinder, K.G., European Journal of Biochemistry 96:483-502(1979)], 토마토[참조 문헌: Roberts, E. and Kolattukudy, P.E., Molecular Genes and Genetics, 217, 223-232(1989)], 땅콩[참조 문헌: Buffard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8874-8878(1990)], 오이[참조 문헌: Morgens et al., Plant Molecular Biology 14:715-725(1990), 아라비도프시스(Arabidopsis)[참조 문헌: Intapruk et al., Gene 98:237-241(1991)], 밀[참조 문헌: Hertig et al., Plant Molecular Biology 16:171-174(1991); 및 Rebmann et al., Plant Molecular Biology 16:329-331(1991)], 보리[참조 문헌: Rasmussen et al., Plant Molecular Biology 16:317-327(1991); 및 Theilade, B. and Rasmussen, S.K, Gene 118:261-266(1992)], 벼(Reimman et al., Plant Physiology 100:1611-1612(1992)), 옥수수[참조 문헌: Hwang, Ph. D. thesis, Ohio State University), 및 순무[Mazza and Welinder, 참조 문헌: European Journal of Biochemistry 108:481-489(1980)]로부터 클로닝되었다.

본 발명에서 사용되는 퍼옥시다제 암호화 서열은 공지된 퍼옥시다제 암호화 서열로 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용하기 위한 신규한 퍼옥시다제 암호화 서열을 공지된 서열과의 동일성 또는 유사성에 의해 단리시킬 수 있다. 담배 음이온성 퍼옥시다제는 서양고추냉이 양이온성 퍼옥시다제 및 순무 양이온성 퍼옥시다제의 아미노산 서열과 동일성 또는 유사성을 나타낸다. 담배와 서양고치냉이간의 전체적인 동일성 또는 유사성은 52%이고; 담배와 순무의 경우, 퍼옥시다제의 동일성 또는 유사성은 46%이다. 또한, 퍼옥시다제 암호화 서열중에 동일성 또는 유사성이 100%에 달하는 영역이 있다. 이들 보존된 영역중 4개는 일반적인 퍼옥시다제 활성에 있어서 중요한 도메인에 상응한다. 따라서, 보존된 영역으로부터의 DNA 서열을 이용하여 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 임의의 식물종으로부터 퍼옥시다제 암호화 서열을 일반적으로 클로닝할 수 있다[참조 문헌: Current Protocols in Molecular Biology, eds.: Ausubel et al., John Wiley ＆ Sons, Inc., New York, NY(Spring 1996)].

마찬가지로, 퍼옥시다제 효소중 하나에 대해 생성된 항체를 사용하여 신규한 퍼옥시다제 암호화 서열을 단리하여 다른 퍼옥시다제 효소를 단리시킬 수 있다. 여러가지 퍼옥시다제 동위효소간의 상동성이 담배 음이온성 퍼옥시다제에 대해 생성된 항체를 사용하여 증명되었다. 면역블롯 검정(immunoblot assay)에 의해 이들 항체는 서양고추냉이 및 순무 동위효소와 강력하게 교차 반응하고 또한 대부분의 다른 담배 동위효소와도 교차 반응하였다[참조 문헌: Lagrimini, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7542-7546(1987)]. 신규한 퍼옥시다제 효소는 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 서열화시킬 수 있으며, 이들의 상응하는 암호화 서열은 당해 분야에 익히 공지된 방법을 사용하여 단리시킬 수 있다[참조 문헌: Sambrook et al. Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA(1988)].

숙주 식물이외의 공급원(예를 들면, 세균성 공급원)으로부터 유래된 퍼옥시다제 암호화 서열의 식물중에서의 전이유전자 발현은 숙주 식물중에서 이들의 발현을 성취하고 최적화시키기 위하여 암호화 서열을 개질시킬 필요가 있다. 일부 경우에 있어서, 암호화 서열 및 인접 서열에 대한 개질을 필요하지 않다. 흥미로운 암호화 서열을 포함하는 단편을 단리시켜 식물 프로모터의 하부스트림에 삽입시키는 것으로 충분하다. 예를 들면, 다음 문헌을 참조한다[참조 문헌: Gaffney et al., Science 261:754-756(1993)]. 바람직하게는, 미생물 서열을 ATG의 상부스트림과 종결 코돈의 하부스트림에 거의 인접하지 않도록 부착시켜야 한다.

퍼옥시다제 암호화 서열은 숙주 단자엽 식물중에서의 발현이 향상되도록 최적화시킬 수 있다. 예를 들면, 숙주 식물중에서 바람직한 코돈 사용법 및 코돈 빈도가 당해 퍼옥시다제 암호화 서열의 사용법 및 빈도와 상이할 수 있기 때문에, 클로닝된 암호화 서열내에서 코돈의 사용법 및 빈도를 식물 암호화 서열(특히 표적 식물로부터의 암호화 서열)중에서의 사용법 및 빈도와 비교함으로써 바람직하게 변화시킬 수 있는 암호화 서열내의 코돈을 확인할 수 있다. 바람직한 코돈은 최대량으로 발현된 단백질중 빈도수가 최대인 코돈으로부터, 또는 식물에서의 가장 바람직한 코돈으로부터 결정될 수 있다[참조 문헌: Adang et al., EP-A-359 472; Fischhoff et al., EP-A-385 962; Cornelissen et al., WO 91/16432; Koziel et al., WO 93/07278; Perlak et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:3324-3328(1991); 및 Murray et al., Nucleic Acids Research 17:477-498(1989)].

이 방법으로, 뉴클레오티드 서열을 당해 특정 식물중에서의 발현시키기 위하여 최적화할 수 있다. 암호화 서열 전체 또는 일부를 최적화할 수 있거나 합성할 수 있다는 것이 인지되어 있다. 즉, 합성 서열 또는 부분적으로 최적화된 서열을 또한 사용할 수 있다.

식물은 이들의 메시지가 구획된 리보솜 결합 부위를 갖지 않는다는 점에서 미생물과 구별된다. 단지, 리보솜은 메시지의 5' 말단에 부착되어 해독이 개시되는 1차 이용가능한 ATG에 대해 스캐닝한다. 식물에서는, ATG에 인접한 특정 뉴클레오티드가 선호되며, 따라서 ATG에서 진핵세포의 공통(consensus) 해독 개시제를 포함시킴으로써 미생물 유전자 발현을 향상시킬 수 있다. 클론테크(Clontech; 1993/1994 catalog, 210면)에는 식물중에서 이. 콜리(E. coli) uidA 유전자의 발현에 대한 공통 해독 개시제로서의 서열이 제시되어 있다. 또한, 문헌[참조 문헌: Joshi, Nucl. Acid Res. 15; 6643-6653(1987)]에는 ATG에 인접한 수많은 식물 서열이 비교되어 있으며 또한 공통 서열이 제시되어 있다. 식물중에서 미생물 암호화 서열의 발현에 있어서 난관에 봉착한 경우, 개시 ATG에 이들 서열중 하나를 포함시키는 것이 바람직하다.

비식물 공급원으로부터 클로닝된 암호화 서열은 또한 식물에서 5' 또는 3' 스플라이싱 부위로서 인지될 수 있는 모티프(motif)를 포함할 수 있으며, 따라서 절단되거나 결실된 메시지를 생성할 수 있다. 이들 부위는 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 제거할 수 있다[참조 문헌: Current Protocols in Molecular Biology, eds.; Ausubel et al., John Wiley ＆ Sons, Inc., New York, NY(Spring 1996)].

퍼옥시다제를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 재조합 DNA는 유전자전이 식물 조직을 생산하는데 사용될 수 있다. 식물은 퍼옥시다제 암호화 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 전사 개시 영역 및 프로모터 둘다를 또한 포함할 수 있는 재조합 DNA중 1개 이상으로 형질전환시킨 것이 바람직하다.

전사 개시 영역은 숙주에 대해 천연의 것이거나 외래의 것일 수 있다. 외래의 것이란 전사 개시 영역이 도입되는 야생형 숙주에서 발견되지 않는 전사 개시 영역을 의미한다.

종결 영역은 (1) 전사 개시 영역이 수득되는 동일한 유전자, (2) 사용되는 퍼옥시다제 유전자로부터 수득할 수 있거나 (3) 다른 공급원으로부터 유래될 수 있다.

퍼옥시다제 암호화 서열은 식물 발현성 프로모터에 작동가능하게 융합되는 것이 바람직하며, 바람직한 프로모터는 구성성, 유발성, 일시 조절성, 발생적 조절성, 화학적 조절성, 조직-선호성 프로모터 및(또는) 조직-특이적 프로모터이다. 바람직한 양태중 하나로, 퍼옥시다제 암호화 서열은 이의 천연적인 프로모터 및(또는) 폴리아데닐화 시그날 서열에 작동가능하게 연결되어 있다.

바람직한 구성성 프로모터로는 CaMV 35S 및 19S 프로모터가 있다[참조 문헌: Fraley et al., U.S. Patent No. 5,352,605]. 추가로 바람직한 프로모터는 대부분의 세포 유형에서 발현되는 것으로 공지된, 수개의 액틴 유전자 중 하나로부터 유래된다. 문헌[참조 문헌: McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231:150-160(1991)]에 기술된 프로모터 발현 카세트를 퍼옥시다제 암호화 서열의 발현용으로 용이하게 개질시킬 수 있으며, 이는 특히 단자엽 식물 숙주에서 사용하기에 적합하다.

또 다른 바람직한 구성성 프로모터는 수많은 세포 타입에서 축적되는 것으로 공지된 다른 유전자 생성물인 유비퀴틴으로부터 유래된다. 유비퀴틴 프로모터는 유전자전이 식물에 사용하기 위해 수많은 종으로부터 클로닝되었다[예를 들면, 해바라기 - 참조 문헌: Binet et al. Plant Science 79:87-94(1991), 옥수수 - 참조 문헌: Christensen et al. Plant Molec. Biol. 12:619-632(1989)]. 옥수수 유비퀴틴 프로모터는 유전자전이 단자엽 식물계에서 발달되었으며 이의 서열과 단자엽 식물 형질전환용으로 작제된 벡터가 문헌[참조 문헌: Christiansen et al., EP-A-342-926]에 기술되어 있다. 유비퀴틴 프로모터는 유전자전이 식물, 특히 단자엽 식물중에서 퍼옥시다제 암호화 서열을 발현시키는데 적합하다.

식물, 특히 옥수수중에서 퍼옥시다제 암호화 서열의 발현에 유용한 조직-특이적 또는 조직-우선적 프로모터는 뿌리, 심, 잎 또는 화분중에서 발현을 지시하는 것들이다. 이러한 프로모터는 문헌[참조 문헌: Koziel et al., WO 93/07278]에 기술되어 있다. 식물중에서 퍼옥시다제 암호화 서열의 발현을 지시하는데 유용한 화학적 유발성 프로모터가 또한 바람직하다[참조 문헌: Alexander et al., WO 95/19443].

프로모터외에, 여러가지 전사 터미네이터가 또한 퍼옥시다제 암호화 서열을 사용하는 키메릭 유전자 작제에 사용될 수 있다. 전사 터미네이터는 전이유전자를 통과하여 전사를 종결시키고 이의 정확한 폴리아데닐화에 관여한다. 적절한 전사 터미네이터 및 식물에서 작용하는 것으로 공지된 것들로는 CaMV 35S 터미네이터, tml 터미네이터, 완두의 rbcS E9 터미네이터 및 당해 분야에 공지된 다른 것들이 있다. 편리한 종결 영역은 옥토핀 신타제 및 노팔린 신타제 종결 영역과 같이, A. tumefaciens의 Ti-플라스미드로부터 입수가능하다[참조 문헌: Rosenberg et al., Gene, 56:125(1987); Guerineau et al., Mol. Gen. Genet., 262:141-144(1991); Proudfoot, Cell, 64:671-674(1991); Sanfacon et al., Genes Dev., 5:141-149; Mogen et al., Plant Cell, 2:1261-1272(1990); Munroe et al., Gene, 91:151-158(1990); Ballas et al., Nucleic Acids Res. 17:7891-7903(1989); Joshi et al., Nucleic Acid Res., 15:9627-9639(1987)].

수많은 서열이 또한 전사 단위로부터 유전자 발현을 향상시키는 것으로 밝혀졌으며, 이들 서열을 퍼옥시다제 암호화 서열과 함께 사용하여 유전자전이 식물에서의 발현을 증가시킬 수 있다. 여러가지 인트론 서열이 발현, 특히 단자엽 식물 세포중에서의 발현을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 예를 들면, 옥수수 Adh1 유전자의 인트론은 옥수수 세포중으로 도입시 동족(cognate) 프로모터하에서 야생형 유전자의 발현을 현저히 향상시키는 것으로 밝혀졌다[참조 문헌: Callis et al., Genes Develop. 1:1183-1200(1987)]. 인트론 서열은 식물 형질전환 벡터중으로, 전형적으로는 비해독되는 리더(leader)내에 통상적으로 혼입시킨다.

작제물은 또한 적절한 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는, 핵 편재화 시그날[참조 문헌: Kalderon et al. Cell 39:499-509(1984); 및 Lassner et al., Plant Molecular Biology 17:229-234(1991)], 식물 전사 공통 서열[참조 문헌: Joshi, C.P., Nucleic Acids Research 15:6643-6653(1987)), 인트론[참조 문헌: Luehrsen and Walbot, Mol. Gen. Genet. 225:81-93(1991)] 등과 같은 조절자를 포함할 수 있다.

5￠ 리더 서열이 발현 카세트 작제물에 포함되어 있는 것이 바람직하다. 상기화 같은 리더 서열은 해독을 향상시키는 작용을 할 수 있다. 해독 리더는 당해 분야에 공지되어 있으며, 피코르나바이러스 리더, 예를 들면, EMCV 리더(Encephalomyocarditis 5￠ 비암호화 영역)[참조 문헌: Glroy-Stein, O., Fueist, T.R., and Moss, Proc. Natl: Acad, Sci. USA 86:6126-6130(1989)]; 포티바이러스 리더, 예를 들면, TEV 리더(Tobacco Etch Virus)[참조 문헌: Allison et al., MDMV 리더(Maize Dwarf Mosaic Virus); Virology, 154:9-20(1986)] 및 사람의 면역글로불린 중쇄 결합 단백질(BiP)[참조 문헌: Macejak, D.G., and Samow, P., Nature 353:90-94(1991)]; 알팔파 모자이크 바이러스의 피복 단백질 mRNA로부터의 비해독된 리더(AMV RNA4)[참조 문헌: Jobling, S.A., and Gebrke, L., Nature, 325:622-625(1987)]; 담배 모자이크 바이러스 리더(TMV)[참조 문헌: Gallie, D.R. et al., Molecular-Biology of RNA, pages 237-256(1989)]; 및 옥수수 클로로틱 모틀 바이러스 리더(MCMV)[참조 문헌: Lommei, S.A. et al., Virology 91:382-385(1991)]가 있다. 다음 문헌을 또한 참조한다[Della-Cioppa et al., Plant Physiology 84:965-968(1987)].

재조합 DNA를 제조하는데 있어서, 적절한 배향으로, 경우에 따라 적합한 판독 프레임내에 DNA 서열을 제공하도록 여러가지 DNA 단편을 조작할 수 있다. 상기한 목적에 대하여, 어댑터(adapter) 또는 링커(linker)를 사용하여 DNA 단편을 연결할 수 있거나 다른 조작법을 사용하여 편리한 제한 부위, 여분의 DNA 제거, 제한 부위의 제거 등을 제공할 수 있다. 상기한 목적을 위하여, 삽입, 결실 또는 치환, 예를 들어 전위 및 전환이 수반되는 경우, 시험관내 돌연변이, 프라이머 수복, 제한, 어닐링(annealing), 절제, 결합 등을 이용하는 것이 바람직하다.

식물 형질전환을 위하여 수많은 형질전환 벡터를 입수할 수 있으며, 퍼옥시다제 암호화 서열을 상기와 같은 벡터와 결합시켜 사용할 수 있다. 사용하기 위한 벡터의 선택은 바람직한 형질전환 기술, 및 형질전환을 위한 표적 종에 따른다. 특정의 표적 종의 경우, 상이한 항생제 또는 제초제 선택 마커가 바람직하다. 형질전환에 통상적으로 사용되는 선택 마커로는 가나마이신 및 관련 항생제에 대한 내성을 부여하는 nptII 유전자[참조 문헌: Messing ＆ Vierra, Gene 19:259-268(1982); Bevan et al., Nature 304:184-187(1983)], 제초제 포스피노트리신에 대한 내성을 부여하는 bar 유전자[참조 문헌: White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062(1990), Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625-631(1990)], 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hph 유전자[참조 문헌: Blochinger ＆ Diggelmann, Mol. Cell. Biol. 4:2929-2931] 및 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr 유전자[참조 문헌: Bourouis et al., EMBO J. 2:1099-1104(1983)]가 있다.

아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용하여 형질전환시키기 위하여 수많은 벡터를 입수할 수 있다. 이들은 전형적으로 1개 이상의 T-DNA 보더(border) 서열을 탑재하고 있으며, pBIN19[참조 문헌: Bevan, Nucl. Acids Res. 12(22):8711-8721)]과 같은 벡터가 이에 포함된다. 바람직한 양태중 하나로, 퍼옥시다제 암호화 서열을 아그로박테리움과 함께 사용하기 위하여 이분열(binary) 벡터 pCIB200 및 pCIB2001중 하나로 삽입시킬 수 있다. 이들 아그로박테리움-매개된 형질전환용 벡터 카세트는 다음 방법으로 작제할 수 있다. 테트라사이클린 내성 유전자가 절단되도록 pTJS75[참조 문헌: Schmidhauser ＆ Helinski, J Bacteriol. 164:446-455(1985)]를 NarI로 분해시킨 다음, NPTII[참조 문헌: Messing ＆ Vierra, Gene 19: 259-268(1982); Bevan et al., Nature 304:184-187(1983); McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266-276(1990)]을 포함하고 있는 pUC4K로부터의 Accl 단편을 삽입시켜 pTJS75kan을 제조한다. XhoI 링커를 좌측 및 우측 T-DNA 보더, 식물 선택성 nos/nptII 키메릭 유전자 및 pUC 폴리링커[참조 문헌: Rothstein et al.,gene 53:153-161(1987)]를 함유하는 pCIB7의 EcoRV 단편에 연결하고, Xhol 분해된 단편을 SalI-분해된 pTJS75kan중으로 클로닝시켜 pCIB200을 제조한다(참조: EP-A-332 104, 실시예 19). pCIB200은 하기 독특한 폴리링커 제한 부위를 포함한다: EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI 및 SalI. pCIB2001은 추가의 제한 부위를 폴리링커중으로 삽입시켜 생성된 pCIB2000의 유도체이다. pCIB2001의 폴리링커중 독특한 제한 부위는 EcoRI, SstI, KpnI, BglII, XbaI, SalI, MluI, BclI, AvrII, ApaI, HpaI 및 StuI이다. 이들 독특한 제한 부위를 포함하는 것외에, pCIB2001은 또한 식물 및 세균성 가나마이신 선택성, 아그로박테리움 매개된 형질전환을 위한 좌측 및 우측 T-DNA 보더, 이. 콜리와 다른 숙주간의 이동을 위한 RK2-유래된 trfA 기능 및 RK2로부터의 OriT 및 OriV 기능을 갖는다. pCIB2001 폴리링커는 자체적인 조절 시그날을 포함하는 식물 발현 카세트를 클로닝하는데 적합하다.

아그로박테리움 매개된 형질전환에 유용한 추가의 벡터는 식물에서의 선택을 위한 가나마이신 내성을 암호화하는 유전자, T-DNA 우측 및 좌측 보더 서열을 포함하고 이. 콜리 및 아그로박테리움 둘다에서 복제되도록하는 광범위한 숙주 범위 플라스미드 pRK252로부터의 서열을 혼입시킨 이분열 벡터 pCIB10이다. 이의 작제는 문헌[참조 문헌: Rothstein et al., Gene 53:153-161(1987)]에 기재되어 있다. 문헌에 기술되어 있는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제에 대한 유전자를 혼입시켜 pCIB10의 여러가지 유도체를 작제한다[참조 문헌: gritz et all., Gene 25:179-188(1983)]. 이들 유도체는 하이그로마이신에 대해서만(pCIB743), 또는 하이그로마이신과 가나마이신(pCIB715 및 pCIB717)에 대한 유전자전이 식물 세포를 선택할 수 있도록 한다.

제초제 Basta(또는 포스피노트리신)에 의한 선택과 결합하여 직접적인 유전자 전달 기술에 유용한 상기와 같은 벡터중 하나가 pCIB3064이다. 이 벡터는 플라스미드 pCIB246을 기본으로하며, 이. 콜리 GUS 유전자에 작동가능하게 융합된 CaMV 35S 프로모터와 CaMV 35S 전사 터미네이터를 포함하며, 이는 문헌에 기재되어 있다[참조 문헌: Koziel et al., WO 93/07278]. 포스피노트리신에 대한 내성을 제공하는 유전자는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus)로부터의 bar 유전자이다[참조 문헌: Thompson et al., EMBO J. 6:2519-2523(1987)]. 이 벡터는 자체적인 조절 시그날을 포함하는 식물 발현 카세트의 클로닝에 적합하다.

추가의 형질전환 벡터는 pSOG35로 이는 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 선택성 마커로서 이. 콜리 유전자 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)을 이용한다. PCR을 사용하여 35S 프로모터(대략 800 bp), 옥수수 Adh1 유전자로부터의 인트론 6[대략 550 bp; 참조: Dennis et al., Nucleic Acid Res. 12:3983-4000(1984)] 및 GUS 비해독된 리더 서열의 18 bp[참조: Jefferson et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83:8447-8451(1986)]를 증폭시킨다. 이. 콜리 디하이드로폴레이트 리덕타제 타입 II 유전자를 암호화하는 250 bp 단편을 또한 PCR로 증폭시키고 이들 2개의 PCR 단편은 pUC19 벡터 주쇄와 노팔린 신타제 터미네이터로 이루어진 pBI221(Clontech)로부터의 SacI-PstI 단편과 조립한다. 이들 단편의 조립으로 pSOG19가 생성되는데, 이는 인트론 6 서열과 융합된 35S 프로모터, GUS 리더, DHFR 유전자 및 노팔린 신타제 터미네이터를 포함한다. pSOG19중의 GUS 리더를 옥수수 클로로틱 모틀 바이러스(MCMV)로부터의 리더 서열로 대체시키면 벡터 암피실린 내성에 대한 pUC 유전자를 탑재하고 있으며 외래 서열의 클로닝에 이용될 수 있는 HindIII, SphI, PstI 및 EcoRI 부위를 갖는 벡터 pSOG35, pSOG35 및 pSOG19가 생성된다.

상기한 재조합 DNA 서열을 수많은 인지된 방법으로 식물 세포중으로 도입시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련가들은 방법의 선택이 형질전환용으로 표적화된 식물의 타입에 따를수 있음을 인지할 것이다. 식물 세포를 형질전환시키는데 적합한 방법으로는 미세주사법[참조 문헌: Crossway et al., Bio Techniques 4:320-334(1986)], 전기천공법[Electroporation; 참조 문헌: Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606(1986)], 아그로박테리움 매개된 형질전환법[참조 문헌: Hinchee et al., Biotechnology 6:915-921(1988); 또한, 옥수수 형질전환의 경우 Ishida et al., Nature Biotechnology 14:745-750(June 1996)], 직접적인 유전자 전달[Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717-2722(1984); Hayashimoto et al., Plant Physiol. 93:857-863(1990)(벼)] 및 아그라세투스 인코포레이티드(Agracetus, Inc., Madison, Wisconsin) 및 듀폰 인코포레이티드(Dupont, Inc., Wilmington, Delaware)로부터 입수가능한 장치를 사용하는 충돌 입자 가속법[참조: Sanford et al., 미국 특허 제4,945,050; 및 McCabe et al., Biotechnology 6:923-926(1988)]이 있다. 또한 다음 문헌을 참조한다[참조 문헌: Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22:421-477(1988); Sanford et al., Particulate Science and Technology 5:27-37 91987(양파); Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530(1990)(담배 엽록체); Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674(1988)(대두); McCabe et al., Bio/Technology 6:923-926(1988)(대두); Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4305-4309(1988)(옥수수) Klein et al., Bio/Technology 6:559-563(1988)(옥수수); Klein et al., Plant Physiol. 91:440-444(1988)(옥수수); Fromm et al., Bio/Technology 8:833-839(1990); 및 Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618(1990)(옥수수); Koziel et al., Biotechnology 11:194-200(1993)(옥수수); Shimamoto et al., Nature 338:274-277(1989)(벼); Christou et al., Biotechnology 9:957-962(1991)(벼); Datta et al., Bio/Technology 8:736-740(1990)(벼); 유럽 특허원 EP-A-332 581(과수원 풀 및 기타 Pooideae); Vasil et al., Biotechnology 11:1553-1558(1993)(밀); Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084(1993)(밀); Wan et al., Plant Physiol. 104:37-48(1994)(보리); Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89:525-533(1994)(보리); Umbeck et al., Bio/Technology 5:263-266(1987)(면화); Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11212-11216(Dec. 1993)(사탕수수); Somers et al., Bio/Technology 10:1589-1594(Dec. 1992)(귀리); Torbert et al., Plant Cell Reports 14:635-640(1995)(귀리); Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084(1993)(밀); Chang et al., WO 94/13822(밀) 및 Nehra et al., The Plant Journal 5:285-297(1994)(밀)].

미세추진 충돌법에 의해 재조합 DNA 분자를 옥수수중으로 도입시키기에 특히 바람직한 세트의 양태중 하나를 다음 문헌으로부터 알 수 있다[참조 문헌: Koziel et al., Biotechnology 11:194-200(1993), Hill et al., Euphytica 85:119-123(1995) 및 Koziel et al., Annals of the New York Academy of Sciences 792:164-171(1996)]. 추가의 바람직한 양태는 하기 문헌에 기술된 바와 같은 옥수수에 대한 원형질체 형질전환법이다[참조 문헌: Shillito et al., EP-A-292 435].

식물의 형질전환은 단일 DNA 종 또는 다수 DNA 종(즉, 동시-형질전환)으로 수행할 수 있으며, 이들 기술 둘다가 퍼옥시다제 암호화 서열에 대해 사용하기에 적합하다.

직접적인 유전자 전달 형태인 입자 건 기술 또는 아그로박테리움 매개된 전달법을 이용하는 방법은 일반적으로, 그러나 필수적이지 않게 항생제(예: 가나마이신, 하이그로마이신 또는 메토트렉세이트) 또는 제초제(예: 포스피노트리신)에 대한 내성을 제공하는 선택성 또는 선별성 마커를 사용하여 수행한다. 상기와 같은 마커의 예로는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 2,2-디클로로프로프리온산 데할로게나제, 아세토하이드록시산 신타제, 5-에놀피루빌-쉬키메이트-포스페이트 신타제, 할로아릴니트릴라제, 아세틸-조효소 A 카복실라제, 디하이드로프테로에이트 신타제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 및 β-글루쿠로니다제가 있다. 그러나, 식물 형질전환용 선택성 또는 선별성 마커의 선택은 본 발명에 있어서 중요한 것은 아니다.

퍼옥시다제 암호화 서열은 단독으로 또는 혼합되어 바람직하게 사용된다. 즉, 퍼옥시다제 암호화 서열 1개 이상을 식물중에 삽입시켜 상이한 곤충을 방제할 수 있다. 이는 (1) 숙주 식물을 퍼옥시다제 암호화 서열 1개 이상을 포함하는 DNA 서열로 형질전환시키고, (2) 숙주 식물을 단일 퍼옥시다제 암호화 서열을 포함하는 DNA 서열로 형질전환시켜 숙주 게놈중으로의 DNA 서열의 다중 삽입을 확인하거나 (3) 숙주 식물이 목적하는 수의 퍼옥시다제 암호화 서열을 포함할 때까지 숙주 식물을 퍼옥시다제 암호화 서열로 반복해서 형질전환시킴으로써 성취할 수 있다.

제시된 곤충에 대한 식물의 곤충 보호 수준 및(또는) 이의 살충 활성 스펙트럼은, 또한 퍼옥시다제 암호화 서열을, 곤충을 방제할 수 있는 단백질을 암호화하는 다른 암호화 서열과 결합시킴으로써 증가시킬 수 있다.

바실러스 투링기엔시스(Bacillus thuringiensis; Bt)는 그램-포지티브, 포자-형성 세균으로 포자형성(sporulation)중 기포자 결정(parasporal crystal)을 생산한다[참조: Koziel et al., Biotech. and Gen. Engin. Reviews 11:171-228(1993)]. 이들 결정은 주로 특정 곤충에 의해 섭취시 살충 활성을 갖는 것으로 공지된, δ-내독소 또는 살충성 결정 단백질로 불리우는 단백질 1종 이상으로 이루어져 있다. Bt의 수많은 균주가 현재 공지되어 있다. 각 균주는 여러가지 살충 활성을 갖는 상이한 수의 δ-내독소를 생산한다. 퍼옥시다제와 혼합되어 사용될 수 있는 Bt 내독소의 예로는 비제한적으로, CryIA(b)[참조 문헌: Koziel et al., Bio/Technology 11:194-200(1993)), CryA(c)(미국 특허 제5,530,197), Cry1H(Cry9C로도 불리움)[참조 문헌: (Lambert et al. Appl. Environ. Microbiol. 62:80-86(1996)] 및 CryIIIA[참조 문헌: Adang et al. Plant Mol. Biol. 21:1131-1145(1993)]이 포함된다.

바실러스 균주의 식물성 성장중 생산되는 살충 단백질(식물성 살충 단백질, VIPs)을 또한 퍼옥시다제와 혼합하여 사용할 수 있다. 예를 들어 다음 문헌을 참조한다[참조 문헌: Warren et al., WO 94/21795; Warren et al., WO 96/10083; 및 Estruch et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA 93:5389-5394(1996)].

퍼옥시다제와 혼합하여 사용할 수 있는 살충성 화합물을 갖는 다른 단백질의 예로는 비제한적으로, 콜레스테롤 옥시다제(미국 특허 제5,518,908호), 프로테아제 억제제, 렉틴 및 α-아밀라제가 포함된다.

곤충 내성 암호화 서열 1개 이상을 발현시키는 단자엽 식물은 당해 분야에 공지된 방법으로 만들 수 있다. 예를 들면, 퍼옥시다제 암호화 서열을 사용하여 다른 곤충 성분 유전자를 동시에 단자엽 식물을 형질전환시킬 수 있고(동시형질전환), 제2 곤충 성분 유전자를 퍼옥시다제 암호화 서열로 이미 형질전환시킨 식물중으로 도입시킬 수 있거나 역으로 수행할 수 있으며, 달리, 유전자전이 식물, 퍼옥시다제 암호화 서열을 발현시키는 것과 제2 곤충 성분을 발현시키는 것을 동일한 식물에서 함께 암호화 서열을 포함하도록 교배시킬 수 있다.

본 발명은 다음 비제한적인 실시예에서 더욱 상세하게 기술된다. 실시예에서, 핵산을 만들고 조작하고 분석하는 공정은 하기 문헌에 기술된 바와 같은 표준 공정으로 수행한다: Sambrook et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA(1988).

실시예 1

퍼옥시다제 암호화 서열을 포함하는 유전자전이 옥수수 식물

벡터 작제:

pPOD_3.5[참조 문헌: Lagrimini et al., Proc. Natl. Acad. Sci 84:438-442(1987)]는 세포벽 공간내로의 분비를 촉진시키는 22-아미노산 시그날 펩타이드를 포함하는, 완전한 퍼옥시다제 암호화 서열을 포함하는 1256-bp 담배 음이온성 퍼옥시다제 cDNA를 포함한다. pPOD_3.5를 BamHI로 분해시키고 pCIB710의 BamHl 부위로 클로닝시킨다[참조 문헌: Rothstein et al., Gene 53:153-161(1987)]. 상기 신규한 작제물을 EcoRI로 분해시키고 블루스크립트 SK+(Stratagene Catalogue, 1994)중으로 서브클로닝시킨다 - pJS20293(도 1)으로 표시된, 생성된 작제물을 1996년 9월 27일자로 다음과 같은 국제 기탁 기관에 NRRL B-21626으로 기탁하였다: Agricultural Research Culture Collection(NRRL) International Depositary Authority, 1815 N. University Street, Peoria IL 61604 U.S.A. pJS20293은 CaMV 35S 프로모터를 지나서 1200 bp 퍼옥시다제 cDNA 클론과 주름진 인트론[참조 문헌: Werr et al., EMBO J.4:1373-1380(1985)], 이어서 CaMV 35S 터미네이터를 블루스크립트(Stratagene) 플라스미드중에 포함한다(도 1). pJS20293을 포스피노트리신에 대한 내성을 암호화하는 키메릭 bar 유전자를 포함하는 플라스미드인 pUBl/Ac(도 2)로 동시에 형질전환시킨다.

미성숙 접합배를 사용한 형질전환:

2개의 별개 실험으로, CG00526, 랭카스터-타입 근교계(inbred) 600개의 미성숙 배를 표면 멸균시킨 온실에서 성장시킨 이삭으로부터 수분한지 12 내지 13일후 무균적으로 절개한다. 크기가 1.5 내지 20㎜인 배를 유합 조직 개시 배지, 2DG4+ 5㎎/ℓ 클로람벤상에 소순판이 위로 가도록 플레이팅시킨다. 2DG4 배지는 20㎎/ℓ 글루코스를 함유하도록 개질된 던칸(Duncan)의 "D" 배지이다[참조 문헌: Duncan et al., Planta 165:322-332(1985)].

pJS20293 DNA를 듀폰 바이오리스틱(Dupont Biolistic) 매뉴얼에 기재된 바와 같이 1㎜ 금 미세담체(microcarrier)상에 침전시킨다. DNA/금 혼합물은 충돌당 약 1㎎의 pJS20293 DNA가 운반되도록 제조한다. 미성숙 배 형질전환을 위하여, pJS20293 6.34㎎ + pUBl/Ac 7.21㎎을 미세담체 50㎖ 당 사용한다. 두 제제를 에탄올을 사용하여 85㎖가 되도록 하고 각각 10㎖를 거대담체(macrocarrier)상에서 건조시킨다.

충돌 4시간 전에 배를 삼투 처리를 위하여 12DG4 + 5㎎/ℓ 클로람벤으로 옮긴다. 플레이트상의 36개의 배를 PDS-1000He 바이오리스틱 장치를 사용하여 제조업자의 지시(Dupont)에 따라서 충돌시킨다. 상기 배를 플레이트의 중앙에서 원의 직경이 약 2㎝인 표적판상에 동일한 방향으로 모두 배향된 소순판의 근초 말단으로 배열시킨다. 이어서 표적 플레이트를 30。로 위로 각지게하여 근초 말단이 먼저 입자 스프레이에 의해 부딪히도록 한다. 바이오리스틱 제조업자에 의해 공급되는 24x24㎜ 표준 스크린을 충돌에 대해 1550psi 수치의 파열 디스크와 함께 사용한다. 충돌 3시간 후, 배를 2DG + 5㎎/ℓ 클로람벤 배지로 반환한 다음 암실에 25℃에서 배양시킨다.

충돌 14일 경과후, 배발생성 반응이 유합 조직 보유 배지 2DM4 + 0.5㎎/ℓ 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-D)으로 전달된다. M4 배지는 카스아미노산을 뺀 G4에서와 동일하다. 5㎎/ℓ Basta^R이 함유되어 있는 상기 배지는 이의 양을 20㎎/ℓ로 점진적으로 증가시킨다.

Basta^R선택시 12주 후 재생이 개시된다. 타입 1 유합 조직을, 3% 슈크로스, 0.25㎎/ℓ 2,4-D, 5㎎/ℓ 벤질아미노퓨린 및 5㎎/ℓ Basta^R를 함유하는 개질된 무라시게 및 스쿠그(Murashige and Skoog) 배지(MS)(Murashige and Skoog, Physiologia Plantarum 15:473-497(1962))상에서 제대배양하고, 명(50mE/m-2/s-1)에서 16시간, 암에서 8시간 동안 25℃에서 배양시킨다. 2주후 조직을 3% 슈크로스 및 5㎎/ℓ Basta^R을 함유하는 MS 배지로 옮긴다. 재생된 식물을 GA7 용기중 염 농도를 1/2로 줄이고 3% 슈크로스를 함유하도록 개질시킨 MS 배지상에서 성장시킨다.

타입 1 배발생성 유합 조직을 사용한 형질전환:

타입 1 배발생성 유합 조직을 사용하여 옥수수를 형질전환시키기 위하여, 유합 조직을 표준 배양 기술을 사용하여 미성숙 접합 배로부터 유합 조직을 수득한다. 유전자 전달을 위하여, 약 300㎎의 타입 1 유합 조직을 외과용 메스로 쵸핑시키거나 유전자 전달전 3 내지 5일간 제대배양시켜 준비한다. 유전자 전달전에, 준비된 유합 조직을 12% 슈크로스를 함유하는 반고체 배양 배지상에 다시 놓는다. 대략 4시간 후, 바이오래드(BioRad)로부터의 PDS-1000/He 바이오리스틱 장치를 사용하여 상기 조직을 pJS20293과 충돌시킨다. pJS20293 2㎎을 바이오래드로부터의 표준 프로토콜을 필수적으로 사용하여 1㎜ 금 입자상에 침전시킨다. 유전자 전달 후 대략 16시간 후, 유합 조직을 2% 슈크로스 및 1㎎/ℓ 포스피노트리신을 함유하는 표준 배양 배지로 옮긴다. 유합 조직을 8주간의 선택을 위해 서브배양하고, 이후 생존하여 성장하는 유합 조직을 식물 생산을 위한 표준 재생 배지로 옮긴다. 재생된 식물을 유럽 옥수수 벌레에 대한 내성에 대해 검정한다. 내성이 있는 식물이 수득된다.

생성된 유전자전이 식물을 통상의 식물 육종 방법에 사용하여 유사한 살충 특성을 갖는 보다 유전자전이성이 큰 식물을 생산한다. 상기 유전자전이 식물을 또한 동일한 식물의 다른 개체와 교배시킨다. 유전자전이 식물은 또한 이들의 게놈중에 안정하게 삽입된 키메릭 퍼옥시다제 유전자를 포함하고 있는 종자를 생산한다.

퍼옥시다제 암호화 서열을 포함하는 유전자전이 옥수수 식물은 써던 블롯 분석법으로 확인한다. 유전자전이 식물로부터의 게놈성 DNA를 EcoRI 제한 효소로 분해시, 완전한 퍼옥시다제 유전자의 존재를 시그날화하는 특이적인 프로브(probe)로서 퍼옥시다제 유전자를 사용하여 대략 1.3Kb의 밴드를 검출할 수 있다.

퍼옥시다제 암호화 서열을 발현시키는 유전자전이 옥수수를 또한 노던 블롯 분석법으로 확인한다. 퍼옥시다제 특이적 프로브와 하이브리드화시 크기가 대략 1.2Kb인 밴드가 RNA 블롯에서 관찰된다.

곤충 생검:

총 46개의 유전자전이 옥수수 식물을 오스트리니아 누빌랄리스(Ostrinia nubilalis(ECB))에 대한 살충 활성에 대해 최초로 평가하였다. 상기 제1군의 생검은 제1영(instar) ECB 애벌레 10마리를 잎 절단물이 건조되는 것을 방지하기 위하여 습윤화된 필터 패드가 있는 젤만(Gelman) 페트리 접시중에 놓인 잎 절단물에 놓고 수행한다. 애벌레가 2일간 방해받지 않고 섭취하도록 한다. 554개중 2개의 식물이 예비 생검에서 포지티브였다. 이들 2개의 식물 샘플은 곤충 섭취에 있어서 어떠한 징후도 나타내지 않았으며 애벌레는 죽었다. 이번 검사와 다른 검사의 나머지 식물은 곤충이 건강하게 섭취하였다.

나타난 상기 활성을 사용하여, 이후의 ECB 생검에서 반복 수행한다. 반복당 5마리의 애벌레로 4회 반복한다. 2일후 사망율을 판독한다. 식물이 여전히 살충 활성을 함유하는 것으로 나타났기 때문에, 다른 표적 곤충에 대해 이들을 시험하기로 결정하였다.

퍼옥시다제 효소를 발현시키는 유전자전이 옥수수 식물을 곤충 생검법으로 살충 활성에 대해 검정한다. 공정은 살충 유전자로 형질전환시킨 임의의 옥수수에 대한 것과 유사하지만, 여기에서는 퍼옥시다제 암호화 서열을 예로서 사용하는 것으로 기재한다. 4㎝ 단편 1 내지 4개를 형질전환된 옥수수 식물의 확장된 잎으로부터 절단한다. 각각의 잎을 50x9㎜ 페트리 접시중 습윤화된 필터 디스크상에 놓는다. 표적 곤충(유럽 옥수수 벌레, 폴 행렬구더기, 옥수수 벌레, 사탕무 행렬구더기 및 흑색 야도충)의 신생 애벌레 5마리를 각각의 잎에 놓는다. 각 식물을 여러번 샘플링하기 때문에, 식물당 애벌레가 총 5 내지 20 마리가 된다. 페트리 접시를 30℃에서 배양하고 잎의 섭취에 의한 손상 및 사망율 데이타를 24, 48 및 72시간에 평가한다. 독성 데이타를 표 1에 나타내었다.

퍼옥시다제 효소를 발현시키는 옥수수잎에 노출시 상이한 곤충의 사망율 수치

	554-1	554-3
오스트리니아 누빌라리스(ECB)	100%	100%
스포도프테라 프루기페르다(FAW)	15%	15%*
스포도프테라 엑시구아(BAW)	0%	5%
헬리오티스 제아(CEW)	100%	100%
아그로티스 입실론(BCW)	0%	0%

*이들 잎은 폴 행렬구더기에 대해 강력한 항식이 효과를 갖는다.

유전자전이 후손:

554 및 755 횟수로부터의 유전자전이 옥수수 식물(이는 시험관내 생검에서 유럽 옥수수 벌레에 대한 살충 특성을 갖는 것으로 나타났음)을 밭에서 시험한다. 밭에서 식물의 확대된 잎 높이가 약 40㎝에 도달하였을 때, ECB 애벌레가 창궐하도록 한다. 옥수수 속대가루와 혼합한 약 300마리의 신생 애벌레를 각 식물 윤생체(whorl)에 부착시킨다. 4주간 주단위로 계속 창궐시켜 1세대 옥수수 벌레(ECB1)를 모의 실험한다. 초기 창궐후 2주부터 시작하여, 각 식물을 주마다 평가하고, 평균 ECB1 손상율을 평가한다(표 2 및 3 참조). 옥수수 식물이 개화기에 도달함에 따라, 300마리의 신생 애벌레/식물을 4주간 매주 적용시켜 제2세대 창궐(ECB2)을 모의 실험한다. 초기 ECB2 모의 실험 창궐 약 50일후, 줄기를 쪼개 터널 손상을 평가한다(표 2 및 3 참조). 실험 조건은 하기 문헌에 상세하게 기재되어 있다[참조 문헌: Koziel et al., Bio/Technology 11:194-200(1993)].

식물 교배 식물수	ECB1 잎 손상율¹	ECB2손상 터널 길이²(㎝)
(CG00526 x 554-3) 5 자체
식물 #10	1	58
식물 #15	1	15
식물 #22	1	8
(CG00526 x 554-3) 6 자체
식물 #4	1	0
식물 #5	2	5
식물 #9	1	7
식물 #14	2	5
식물 #19	1	4
식물 #20	1	3
식물 #25	1	0
식물 #28	1	9
식물 #29	1	7
식물 #32	1	0
평가된 포지티브의 수		13
전체 터널		121
평균		9.3
표준편차		15
(비-형질전환된 CG00526)
1		죽은 식물, ECB에 의해 사멸
2		죽은 식물, ECB에 의해 사멸
3		죽은 식물, ECB에 의해 사멸
평가된 네가티브의 수		3
전체 터널		-
평균		-
표준편차		-

¹잎 손상율은 다음과 같이 측정한다:

1. 가시적인 잎의 손상이 없음.

2. 애벌레와 옥수수 속대 가루가 윤생체에 들어가 있는 감기지않은 잎에서만 양호한 "창유리(window pan)" 손상이 입증됨.

3. 애벌레와 옥수수 속대 가루가 윤생체속에 들어가 있는 감기지않은 2개의 잎에서만 양호한 "창유리" 손상이 입증됨.

4. 윤생체로부터 나온 2개 이상의 잎이 천공되는, 핀홀 또는 숏홀 섭취 손상이 입증됨(병소 〈 길이 0.25 인치).

5. 윤생체로부터 나온 3개 이상의 잎상의 신장된 병소 및(또는) 중앙의 엽맥 섭취가 입증됨. 병소 〈 길이 1.0 인치.

6. 신장된 병소(길이 0.75 인치 내지 1.5 인치)를 갖고(갖거나) 중앙 엽맥이 파괴된 잎이 1개 이하인 수개의 잎.

7. 잎의 약 1/2 상에서 공통의 긴 병소(〉 1.0 인치) 및(또는) 중앙 엽맥이 파괴된 잎이 2 또는 3개.

8. 잎의 약 2/3 상에서 공통의 긴 병소(〉 1.0 인치) 및(또는) 중앙 엽맥이 파괴된 잎 3개 이상.

9. 병소가 긴 잎이 대부분. 중앙 엽맥이 파괴된 잎이 수개. ECB 섭취로 인하여 가능하게는 발육이 정지된 식물.

²줄기의 92㎝ 단편중 내부 ECB 터널 손상의 정도, 46㎝ 이상 및 이하의 1차 이삭 마디를 유전자전이 식물 및 대조 식물상에서 측정한다. 평가될 수 있는 최대 손상은 92㎝이다. 대조 식물은 실험 말기에 완전히 파괴되어 측정할 수 없다.

식물 교배 식물수	ECB1 잎 손상율¹	ECB2 손상 터널 길이²(㎝)
(OG00714 x 755-9) 포지티브 분리 개체
식물 #6	3	15
식물 #12	3	31
식물 #16	3	19
식물 #20	4	24
식물 #24	3	18
식물 #25	1	26
(OG00714 x 755-9) 네가티브 분리 개체
식물 #7	7	죽은 식물
식물 #8	죽은 식물	죽은 식물
식물 #9	7	죽은 식물
식물 #10	7	죽은 식물
식물 #11	9	죽은 식물
평가된 포지티브의 수		6
전체 터널		133
평균		22.17
표준편차		5.91
평가된 네가티브의 수		5
전체 터널		-
평균		-
표준편차		-

¹잎 손상율은 표 2에 대해 기술된 바와 같이 측정한다:

1. 가시적인 잎의 손상이 없음.

2. 애벌레와 옥수수 속대가 소용돌이속에 들어가 있는 감기지않은 잎에서만 "창유리" 손상이 입증됨.

4. 소용돌이로부터 나온 2개 이상의 잎이 천공되는, 핀홀 또는 숏홀 섭취 손상이 입증됨(병소 〈 길이 0.25 인치).

실시예 2

퍼옥시다제 암호화 서열을 포함하는 유전자전이 밀과 식물

pJS20293(도 1)과 pUBlAc(도 2)를 사용하여 하기 문헌의 방법을 이용하여 밀을 형질전환시킨다[참조 문헌: Chang et al., WO 94/13822, Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084(1993) 또는 Nehra et al., The Plant Journal 5(2):285-297(1994).

문헌[참조 문헌: Chang et al., WO 94/13822]의 방법을 사용하여 밀을 전환시키는 것은 하기에 간략하게 기술한다(창 등에 의해 기재된 다른 방법을 또한 사용할 수 있다).

밀의 유합 조직, 유전형 UC703의 제조:

유전형 UC703의 밀과 식물을 개화시기까지 성장시켜 자가 수분시킨다. 길이가 1 내지 2.5㎜인 배를 함유하는 이삭을 식물로부터 제거하여 10% 클로락스 용액으로 10분간 멸균시킨다. 미성숙 종자로부터 배를 제거하여 배축이 아래쪽으로가도록, 5 또는 10㎎/ℓ 2,4-D, 13.7% w/v 말토오스, 100mg/ℓ 프롤린, 100mg/ℓ 마이오이노시톨을 함유하며 0.7 내지 0.8% v/v 피트아가 또는 0.1 내지 0.2% 겔라이트(초기 배지)로 고화시킨 무라시게 및 스쿠그상의 배지에 놓는다. 암실에서 27℃에서 3주간 배양시킨후, 특정 외식편의 소순판에서 성장하는 잘 형성된 구형의 체세포 배(타입 M 유합 조직)의 존재로 바람직한 유합 조직을 인지한다. 이들 유합 조직을 제거하여, 슈크로오스 배지상에 놓기전에 1.0 내지 5.0㎎/ℓ 2,4-D 및 2 내지 3% 슈크로스를 함유하는 MS 배지 또는 감소된 수준(5%)의 말토오스를 함유하는 배지상에 놓는다. 이후 상기 물질을 3% 슈크로오스를 함유하는 신선한 MS 배지로 매주마다 제대배양한다.

충돌용 세포 제제:

충돌전 및 후에 충격용 세포를 원형질 분리시킨다. 충전된 세포 용적을 측정하고 세포를 삼투물을 첨가한 1 MS 액체 배지에 희석시킨다: 현탁 세포의 경우 0.4M 솔비톨 및 유합 조직 세포의 경우 0.6M 솔비톨. 세포를 표적당 최종 충전된 세포 용적이 미세 현탁의 경우 1/30㎖이고 유합 조직의 경우 1/10㎖가 되도록 희석시킨다. 희석된 세포를 교반 막대를 포함하는 250㎖ 플라스크에 놓고 최소 30분간, 최대 수시간 동안 교반시킨다. 세포를 플레이팅시키기 위하여, 상기 플라스크로부터 2㎖를 빼내어 와트만(Whatman) 2.5㎝gFA 필터가 놓여있는 진공 플라스크의 상부로 피펫팅한다. 세포가 필터상에서 건조될 때까지 진공을 적용한다. 고체의 충돌후 원형질 분리 배지 5㎖를 함유하는 60x15㎜ 페트리 플레이트상에 상기 필터를 놓는데, 상기 배지는 현탁 세포의 경우 0.2M 솔비톨을 함유하거나 유합 조직 세포의 경우 0.4M 솔비톨을 함유하는 1 MS이다. 2개의 필터를 각각의 접시상에 플레이팅시킨다.

충돌에 사용되는 벡터:

퍼옥시다제를 포함하는 발현 카세트가 삽입되어 있는 다음 벡터를 입자 충돌용으로 사용할 수 있다(등량의 DNA를 사용하여 pJS20293(도 1)과 pUBlAc(도 2)를 동시 형질전환시키는것 이외에):

pSOG30은 클론텍크 래보러토리즈(Clonech Laboratories, Palo Alto, California)로부터 구입한, 플라스미드 pBl121로부터 유래된 b-글루쿠로니다제(Gus) 발현 벡터이다. 옥수수 Adh 1 유전자의 인트론 6을 문헌[참조 문헌: Bennetzen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:4125-4128(1987)]에 기술되어 있는 플라스미드 pB428로부터 PCR에 의해 증폭시켜 pB121의 BamHI 부위에 결합시키는데, 이 부위는 CaMV 35S 프로모터와 Gus 유전자 사이에 있다. 문헌[참조 문헌: Lommel et al., Virology 181:382-385(1991)]에 기술되어 있는 17 bp 옥수수 클로로틱 모틀 바이러스(MCMV) 리더를 35S-Gus 유전자 비해독 리더중으로 삽입시킨다. 최종 유전자 융합체는 모두 pUC19 벡터의 골격중에 있는 구조인 35S 프로모터-Adh 1 인트론 6-MCMV 리더-Gus-Nos 터미네이터를 포함한다.

pSOG35는 디하이드로폴레이트 리덕타제(dhrf) 발현 벡터이다. 상기 작제물은 문헌[참조 문헌: Bourouis and Jarry, EMBO J, 2:1099-1104(1983)]에 기재되어 있는, 플라스미드 pHCO로부터의 dhrf 유전자에 대해 상기한 35S 프로모터, Adh 1 인트론 6 및 MCMV 리더를 융합시킴으로써 유도시킨다. 최종 유전자 융합체는 모두 pUC 19 벡터 골격에 있는 구조인 35S 프로모터-Adh 1 인트론 6-MCMV 리더-dhfr-Nos 터미네이터를 포함한다.

pTG48은 pUC19 골격중의 다른 특이적 ant43D 프로모터와 dhfr 유전자의 조절하에 있는 Gus 유전자를 포함한다. 이는 4개의 상이한 DNA 단편을 조합한 결과이다. 단편 1은 HindIII 및 EcoRI로 제한 절단한 후 pSOG3로부터 수득된다. dhfr 유전자를 포함하는 단리된 단편의 EcoRI 말단을 SalI 제한 말단에 적응시킨다. 단편 2는 HindIII 및 XbaI로 제한 절단한 후 플라스미드 pCIB 3178로부터 단리된 다른 특이적 ant43D 프로모터로 이루어져 있다. 플라스미드 pCIB 3178은 EP-578 611에 상세하게 기재되어 있으며, 이의 관련 부분은 본 명세서에서 참고로 인용되고 이는 수탁번호 NRRL B-18978로 기탁되어 있다. 단편 3은 XbaI 및 EcoRI로 제한 절단한 후 플라스미드 pSOG30으로부터 수득된 Gus 유전자, 및 SalI 및 EcoRI로 절단된 상업적으로 입수가능한 벡터 pUC19에 대응하는 단편 4를 포함한다.

입자 제조:

금 입자(1.0 μ; Bio-Rad로부터 입수)를 미세퓨즈관중으로 분취시키고, 대략 1㎖의 100% 에탄올을 가하여 볼텍싱시키고 아래로 스피닝시켜 상등액을 제거하고, 멸균수로 2회 반복하여 세척한다. 최종 세척후, 가능한 많은 물을 제거하고 폴리라이신 용액(0.02% 폴리라이신 + 15mM 암모늄 아세테이트)을 가하여 입자가 완전히 잠기도록 한다. 상기 입자를 볼텍싱시키고 스피닝시켜 상등액을 제거한다. 입자를 적층 유동 후드중에서 밤새 건조시키거나 온화한 질소 스트림하에 30분간 건조시킨다.

"완전한" 입자 제조를 위하여, 10㎎ 입자를 칭량하여 교반 막대를 포함하는 멸균 미세퓨즈관에 넣는다. 각각 DNA 100㎖(1㎎/㎖)(달리, 각 DNA 50㎖(1㎎/㎖))를 가한 다음, 볼텍싱시킨다. 이어서, 100mM Na₂HPO₄10㎖를 가한 다음 볼텍싱시키다. 100nM CaCl₂10㎖를 가한 다음 볼텍싱시킨다. 마지막으로, 100% 에탄올 380㎖를 가한 다음 볼텍싱시킨다. 현탁액을 강력하게 교반시키면서, 3㎖를 플라스틱 필러(발사체)상에 피펫팅한다. 충돌 전에 15분 이상 입자를 필러상에서 건조시킨다.

세포 배양물 충돌:

세포 필터를 포함하는 페트리 접시를 상단의 플랫폼으로 역위시키고, 개구부상에서 떠다니는 입자를 중앙에 집중시킨다. 플랫폼의 상부에 투명한 뚜껑을 덮는다. 미세 발사체를 브리치 핀상에 놓고 브리치를 밀폐시킨다. "암(arm)" 버튼을 눌러 저수조를 적합한 양의 헬륨 가스로 채운다(통상 1800 내지 1900psi). 챔버상의 진공을 대략 27㎜로 끌어올린다. 진공을 끈 후, "암"과 "발사" 버튼을 누른다. 이후 "암" 버튼은 "오프(off)"위치로 누른다. 각 필터는 통상적으로 2회 발사한다.

충돌 후 배양 및 선택:

충돌 후 세포를 암실에서 밤새 보관한다. 다음날, 필터를 원형질 분리 매질로부터 제거하고 1 MS 배지상에 놓는다. 현탁 세포의 경우 충돌 1 내지 10일 후, 유합 조직 세포의 경우 충돌 14일후 선택을 실시한다. 세포를 필터에서 긁어내어 1 MS와 2㎎/ℓ 메토트렉세이트(또는 적합한 선택제)를 함유하는 플레이트의 표면상에 스프레딩시킨다. 플레이트를 암실에서 수주간 배양시킨다. 수주후 발생하는 내성 콜로니를 1MS + 4㎎/ℓ 메토트렉세이트(또는 적합한 선택제)로 옮긴다. 약 3 내지 4주간 계속 증식하는 콜로니를 "0.5 MS" 유지 배지로 옮기는데, 이 유지 배지는 MS 염, 비타민, 철분, 3% 슈크로오스, 0.7% 아가, 0.5㎎/ℓ 2,4-D의 수용액이다. 배발생 구조가 나타나거나 조직이 재생에 적합한 것으로 보일때까지 상기 배지에서 2주 마다 조직을 제대배양한다.

재생:

조직을 3㎎/ℓ BAP 또는 1㎎/ℓ NAA+ 5㎎/ℓgA를 함유하는 MS 배지로 옮겨 플레이트를 명실로 이동시킨다. 2 내지 4주후, 조직을 호르몬이 없는 MS 배지로 옮긴다. 출현하는 어린 싹을 호르몬이 없는 MS 배지 또는 0.5㎎/ℓ NAA가 있는 MS 배지가 들어있는 용기에 넣는다. 충분한 뿌리와 어린 싹의 성장이 이루어졌을때, 묘목을 토양으로 옮겨 피토트론(phytotron)에 넣는다.

윅스 등의 방법(Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084(1993)):

윅스 등의 방법(Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077-1084(1993))을 사용하여 밀을 형질전환시키는 것을 다음과 같이 간략하게 기술한다: 밀과 식물(Triticum aestivum L.)을 성장시켜 길이가 0.5 내지 1㎜인 미성숙 배를 온실 성장 식물(년수에 따라, 개화후 10 내지 18일)로부터 절제하여 1.5㎎/ℓ 2,4-D를 함유하는 유합 조직 유지 배지상에 소순판이 노출되도록 놓는다. 조직 배양 개시 5일 경과후, 배의 모서리에서 증식하는 유합 조직 조직을 볼 수 있다. 이 단계에서, pJS20293 7㎎ 또는 pUBlAc 7㎎으로 피복시킨 금 입자로 배를 충돌시킨다.

입자 충돌:

충돌전, 1㎜ 금 입자를 pJS20293 및 pUBlAc DAN로 문헌[참조 문헌: Daines, Biolistic Systems Newsletter 1:1-4(1990)]의 방법으로 피복시킨다. 금 입자의 스톡 현탁액(Bio-Rad)을 60㎎/㎖로 무수 에탄올중에 현탁시킨다. 상기 현탁액 35㎕를 1.5㎖ 미세원심분리관으로 분취하여, 멸균 증류수로 세척하여 초나선 플라스미드 DNA 25㎎을 함유하는 Tris-EDTA 25㎖에 재현탁시킨다. 다음 용액을 순서대로 가한다: 멸균수 220㎖, 2.5 M CaCl₂250㎖ 및 0.1M 스퍼미딘 50㎖(유리 염기). 상기 미세퓨즈관을 볼텍스 혼합기로 4℃에서 10분간 진탕시키고 16,000g에서 5분간 원심분리시킨다. 상등액을 제거하고 펠릿을 에탄올 600㎖로 세척한다. DNA 피복된 금 입자를 에탄올 36㎖에 재현탁시킨다. 충돌을 위하여, 상기 DNA-금 현탁액 10㎖를 거대 발사체(aka, 담체 쉬트)의 중앙에 놓는다.

대략 25개의 배를 0.35% 피타겔(Phytagel)로 고화시킨 유합 조직 유지 배지를 함유하는 15x100㎜ 페트리 접시의 중앙에 놓는다. 배양물중에서 5일후, 배-유래된 유합 조직을 진공하에서 헬륨-추진 듀폰 바이오리스틱 운반 시스템(DuPont Biolostic Delivery System) 및 바이오-래드로부터 공급되는 1회용 구성 성분을 사용하여 pJS20293 피복된 금 입자와 충돌시킨다. 정지판으로부터 표적물까지의 거리는 13㎝이고, 파열 디스크 강도는 1100 p.s.i.이다. 충돌후 즉시, 유합 조직을 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있는 적절한 양의 선택제를 함유하는 MS 선택 배지로 옮긴다.

밀과 식물의 재생:

재생의 경우, 배발생성 유합 조직을 문헌[참조 문헌: Hunsinger and Schauz, Plant Breeding 98:119-123(1987)]에 기술된 바와 같이 0.5㎎/ℓ 디캄바를 함유하는 MS 배지로 옮긴다. 유합 조직으로부터 유래된 어린싹을 호르몬이 없는 1/2 농도의 MS로 이루어져 있는 뿌리화 배지를 함유하는 파이렉스 배양 시험관으로 옮긴다. 충돌후 선택을 위해, 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있는 바와 같이 각 단계에서 아가 배지에 적절한 양의 선택제를 보충한다.

묘목을 뿌리화 배지로부터 토양 혼합물의 포트로 옮겨 환경 챔버중에서 21℃에 낮은 습도에 순응시킨다. 2주후, 식물을 온실로 옮긴다. 이들 1차 유전자전이 재생물을 T₀식물로 명명한다.

유전자전이 식물의 분석:

유전자전이 조직 및 식물을 써던 및 노던 기술을 사용하여 퍼옥시다제 암호화 서열 및 RNA의 존재를 각각 증명한다.

써던 분석에 의해 퍼옥시다제 암호화 서열을 포함하는 것으로 증명된 밀과 식물을 슈다레티아 우니펑카타(Pseudaletia unipunctata), 행렬구더기; Spodoptera frugiperda, 폴 행렬구더기; Elasmopalpus lignosellus, 레서 옥수수줄기 벌레; Agrotis orthogonia, 페일 서구 야도충; Oulema melanopus, 곡물 잎 딱정벌레; Hypera punctata, 클로버잎 바구미; Diabrotica undecimpunctata howardi, 남구 옥수수 뿌리벌레; 러시아 밀 진딧물; Schizaphis graminum, 녹색벌레; Macrosiphum avenae, 영국 곡물 진딧물; Melanoplus femurrubrum, 빨간 다리 메뚜기; Melanoplus differentialis, 차별적인 메뚜기; Melanoplus sanguinipes, 이주성 메뚜기; Mayetiola destructor, 헤시안 파리; Sitodiplosis mosellana, 밀 벌레; Meromyza americana, 밀 줄기 구더기; Hylemya coarctata, 밀 구근 파리; Frankliniella fusca, 담배 삽주벌레; Cephus cinctus, 밀 줄기 잎벌; 또는 Aceria tulipae, 밀 컬 진드기에 대한 살충 활성에 대해 당해 분야에 숙지된 기술을 사용하여 평가한다. 살충 특성을 갖는 유전자전이 밀과 식물을 밭에서 시험 재배한다.

실시예 3

퍼옥시다제 암호화 서열을 포함하는 유전자전이 사탕수수과 식물

pJS20293(도 1) 및 pUBlAc(도 2)를 사용하여 하기와 같이 간략하게 기술된 바와 같은 문헌[참조 문헌: Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11212-11216(1993년 12월)]의 방법을 이용하여 사탕수수를 형질전환시킨다.

미세 발사체 충돌:

실험은 텅스텐(M-25, 직경 1.7㎜, DuPont no. 75056) 또는 금(직경 1.5 내지 3.0㎜, Aldrich no 32,658-5) 미세 발사체를 사용하여 바이오리스틱 PDS 1000/He 시스템[Sanford et al., Technique J. Methods Cell. Mol. Biol. 3:3-16(1991)]로 수행한다. 수성 현탁액(50㎖)중 에탄올에서 미리 세척시킨 금(3㎎) 또는 텅스턴(0.75㎎) 입자를 제조업자(Bio-Rad)에 의해 기술된 바와 같이, 플라스미드 DNA 5 내지 10㎎으로 피복시킨다. 충돌 압력 및 발사대로부터의 거리는 실험적으로 결정한다.

플라스틱 페트리 접시(15x60㎜) 당 미성숙 접합 배 10 내지 15개를 배지상에서 배양 24 내지 72시간후에 충돌시킨다. 액체 배지로 습윤시키지만 포화시키지는 않은 여과지(직경 4.5㎝)로 배를 옮긴다. 여과지는 배의 표면으로부터 물을 흡수하는 작용을 하며, 충돌전에 배를 종이상에서 2 내지 3시간 동안 방치시킨다. 충돌 직후, 미성숙 배를 종이로부터 제거하여 반고체 배지로 옮긴다.

유전자전이 식물 재생 및 곤충 내성에 대한 평가:

배발생성 조직의 선택 및 유지 방법과 유기체화 구조로부터 어린 싹 및 뿌리 형성은 문헌[참조 문헌: Cal ＆ Butler, Plant Cell Tissue Organ Cult., 20:101-110(1990)]에 기술되어 있다. 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 적합한 선택제를 사용한다.

유전자전이 조직 및 식물을 써던 및 노던 기술을 사용하여 분석하여 퍼옥시다제 암호화 서열 및 RNA의 존재를 각각 증명한다.

PAT 활성을 유합 조직 및 잎 추출물에서 문헌[참조 문헌: DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518(1987)]에 따라서 평가한다.

써던 분석에 의해 퍼옥시다제 암호화 서열을 포함하는 것으로 증명된 사탕수수 식물을, Chilo partellus, 사탕수수 벌레; Spodoptera frugiperda, 폴 행렬구더기; Helicoverpa zea, 옥수수 벌레; Elasmopalpus lignosellus, 레서 옥수수 줄기 벌레; Feltia subterranean, 과립 야도충; Phyllophaga crinita, 백색 땅벌레; Eleodes, Conoderus 및 Aeolus spp., 와이어벌레; Oulema melanopus, 곡물 잎 딱정벌레; Chaetocnema pulicaria, 옥수수 벼룩 딱정벌레; Sphenophorus maidis, 옥수수 바구미; Rhopalosiphum maidis, 옥수수 잎 진딧물; Anuraphis maidiradicis, 옥수수 뿌리 진딧물; Blissus leucopterus leucopterus, 빈대 벌레; Contarinia sorghicola, 사탕수수 벌레; Teranychus cinnabarinus, 카민 거미 진드기; 또는 Tetranychus urticae, 2점 박이 거미 진드기에 대한 살충 활성에 대해 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 평가한다. 살충 특성을 갖는 유전자전이 사탕수수 식물을 밭에서 시험한다.

실시예 4

퍼옥시다제 암호화 서열을 포함하는 유전자전이 벼과 식물

pJS20293(도 1) 및 pUBlAc(도 2)를 사용하여 하기 문헌의 방법을 이용하여 벼를 형질전환시킨다[참조 문헌: Shimamoto et al., Nature 338:274-277(1989)(벼); Christou et al., Biotechnology 9:957-962(1991)(벼); Datta et al., Bio/Technology 8:736-740(벼) 및(또는) Hayashimoto et al., Plant Physiol. 93:857-863(1990)(벼)].

크리스토우 등의 방법[Christou et al., Biotechnology 9:957-962(1991)]을 사용한 벼의 형질전환을 하기와 같이 간략하게 기술한다:

DNA 제조:

금 입자(10㎎)를 완충액(150mM 염화나트륨, 10mM Tris-HCl, pH 8.0) 100㎖중 DNA(20㎎)의 용액과 혼합한 다음 5 내지 10초간 온화하게 볼텍싱시켜 DNA-피복된 금 입자를 제조한다. 스퍼미딘(0.1M 용액 100㎖)과 25% PEG 용액(MW 1300-1600) 100㎖를 볼텍싱시키면서 가한 다음, 염화칼슘의 용액(2.5 M) 100㎖를 적가한다. 혼합물을 실온에서 10분간 정치시킨 다음 미세퓨즈관중에 회전시킨다. 상등액을 제거하고 DNA 복합물과 함께 침전된 금을 100% 에탄올 10㎖중에 재현탁시킨다. 생성된 현탁액을 18x18㎜ 담체 쉬트상에서 담체 쉬트당 163㎖의 비율로, 또는 0.05㎎/㎠의 계산된 비율로 피복시킨다.

미성숙 배의 단리 및 입자 충돌을 위한 제제:

12 내지 15일된 벼의 미성숙 배를 확장된 원추꽃차례(panicle)로부터 수확하여 2% 차아염소산나트륨으로 5분간 멸균시킨다. 이들을 계속해서 멸균 증류수로 반복해서 세정하고 해부용 현미경하에서 낟껍질(glume)을 제거한다. 이어서 배를 무균적으로 제거하여 배지와 접하여 축면에서 물-아가 플레이트상에 플레이팅시킨다.

입자 충돌:

비드를 품고 있는 담체 쉬트를 입자 가속기에 부하하는데, 입자가속기는 이동력으로서 작은 물방울을 통한 고전압 축전기의 방전을 이용한다. 100 메쉬 보유 스크린을 상기 기계상에 현탁되어 있는 쉬트와 표적 조직 사이에 놓는다. 이어서 상기 조립체를 500㎜Hg로 배기시켜 공기 역학 견인을 감소시킨다. 2mF 축전기로부터 10 내지 16Kv가 팽창 챔버내부의 물방울 10㎖를 통하여 방전된다. 금 입자가 스크린위에 현탁된 표적 조직에 대해 계속 충격을 주도록하는 보유 스크린에 대해 쉬트가 취입된다. 표적 미성숙 배가 물-아가 플레이트상에 위치하게되어, 플레이트가 스크린상에 삽입될 경우, 배의 소순판 영역이 가속화된 입자의 직접적인 경로중에 있게 된다.

식물 재생:

입자를 충돌시킨 다음, 배를 0.5 또는 2㎎/ℓ의 2,4 D가 보충되는 MS 또는 CC 배지상에 플레이팅시키고, 배발생 유합 조직과 묘목을 문헌에 기재된 바와 같이 회수한다[참조 문헌: Harke, S. and Lara, H., Genet. ＆ Breed. 43:205-214(1989); Datta, S.K. et al., Plant Sci. 67:85-88(1990)].

형질전환된 배발생 유합 조직 및 식물의 회수:

형질전환된 유합 조직과 식물을 선택적 및 비선택적 조건 둘다에서 회수한다. 선택을 형질전환/재생 프로토콜에 포함시킨 실험에서는, 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 적절한 양의 선택제를 사용한다. 상기 확인된 추정적인 형질전환체를 분자적 및 유전적으로 분석하여 도입된 유전자의 안정된 통합 및 유전성을 확인한다.

유전자전이 식물의 분석:

유전자전이 조직 및 식물을 써던 및 노던 기술을 이용하여 분석하여 퍼옥시다제 암호화 서열 및 RNA의 존재를 각각 증명한다.

써던 분석에 의해 퍼옥시다제 암호화 서열을 포함하는 것으로 증명된 벼과 식물을 디아스라에아 사카랄리스(Diatraea saccharalis), 당밀 천공충; Spodoptera frugiperda, 폴 행렬구더기; Helicoverpa zea, 옥수수 벌레; Colaspis brunnea, 포도 콜라스피스(grape colaspis); Lissorhoptrus oryzophilus, 벼 물바구미; Sitophilus oryzae, 벼 바구미; Nephotettix nigropictus, 벼멸구; Blissus leucopterus leucopterus, 빈대 벌레; 및 Acrosternum hilare, 녹색 방귀벌레에 대한 살충 활성에 대해 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 평가한다.

실시예 5

퍼옥시다제 암호화 서열을 포함하는 유전자전이 귀리 식물

pJS20293(도 1) 및 pUBlAc(도 2)를 사용하여 문헌[참조 문헌 Somers et al., Bio/Technology 10:1589-1594(1992년 12월)(귀리) 및/또는 Torbert et al., Plant Cell Reports 14:635-640(1995)(귀리)]의 방법을 이용하여 귀리를 형질전환시킨다.

소머즈 등의 방법을 사용한 귀리의 형질전환을 다음과 같이 간략하게 기술한다[참조 문헌: Somers et al., Bio/Technology 10:1589-1594(1992년 12월)]:

세포 배양:

GAF-30/Park로부터 유래된 귀리주의 미성숙 배를 사용하여 유합 조직을 개시시킨다[참조 문헌: Rines, H.W. ＆ Luke, H.H., Theor. Appl. Genet 71:16-21(1985)]. 부스러지기쉬운 배발생성 유합 조직주는 육안으로 선택하고[참조 문헌: Bregitzer, P., et al., Crop Sci 29:798-803(1989)], 150㎎/ℓ 아스파라긴, 0.5㎎/ℓ 티아민-HCl, 20g/ℓ 슈크로오스 및 2.0㎎/ℓ 2,4-D(pH 5.8)와 함께 MS 염(Murashige, T. ＆ Skoog, F., Physiol. Plant 15:473-497(1962)을 함유하는 0.2% 겔라이트-고화된 MS2D 배지상에서 2주 마다 제대배양시킨다. 대략 1g의 부서지기쉬운 배발생성 유합 조직을 액체 MS2D 배지 35㎖에 놓아 현탁액 배양을 개시한다. 현탁액 배양물을 황색으로 착색된, 세포질적으로-조밀한 세포의 작은 응집체의 존재로 선택하여 매주 마다 제대배양시킨다.

DNA-피복된 입자의 제조:

텅스텐 입자를 문헌[참조 문헌: Gordon-Kamm, et al., Plant Cell 2:603-618(1990)]에 기술된 것과 유사한 공정을 사용하여 pJS20293(도 1) 및 pUBlAc(도 2) DNA로 피복시킨다. 미리 세척한 텅스텐 입자(1.25㎎)를 1.5㎖ 에펜도르프관중에서 멸균수 250㎖중에 재현탁시킨다. 각 DNA 1㎎/㎖의 분취량 25㎖, 2.5M CaCl₂250㎖ 및 0.1M 스퍼미딘(유리 염기) 50㎖를 순서대로 상기 에펜도르프관에 가한다. 혼합물을 볼텍스 제니(Vortex Genie) 2(Scientific Industries, Inc.)를 사용하여 최상 속도에서 1분간 볼텍싱시키고, 빙상에 5 내지 10분간 놓고 14,000rpm에서 1분간 5415 에펜도르포 원심분리기에서 원심분리시킨다. 원심분리시킨 다음, 상등액 550㎖를 피펫팅하여 버린다. 이들을 아래 위로 수회 피펫팅하여 DNA-피복된 텅스텐 입자를 재현탁시키고, DNA-입자 현탁액 1㎖를 입자 운반 시스템의 거대담체상에 부하한다.

DNA의 운반:

현탁액 배양 세포를 충돌전에 아스파라긴이 결여되어 있는 MS2D 배지로 3회 세정시킨다. 제대배양후 3 내지 5일째에, 현탁액 배양 세포를 4.7㎝ 직경의 밀리포어(Millipore) AP 10, MF 지지체 패드(Millipore Corp.)상에서 진공여과에 의해 수집하여 대략 0.5g의 신선한 조직 배양 세포의, 균일하게 스프레딩된 박층을 형성시킨다. 이어서 세포를 지지하고 있는 패드를 60x20㎜ 페트리 접시로 옮긴다. 유합 조직의 충돌을 위하여, 2주된 부서지기쉬운 배발생 유합 조직(0.5g)를 60x20㎜ 페트리 접시에 아스파라긴이 없는 MS2D 배지 2㎖로 미리 습윤시킨 밀리포어 지지체 패드상에 균일하게 스프레딩시킨다. 현탁액 또는 유합 조직 샘플을 함유하는 페트리 플레이트를 종결판으로부터 5㎝ 거리에 배치시켜[참조 문헌: Gordon-Kamm, et al., Plant Cell 2:603-618(1990)] 바이오리스틱 PDS-1000^-(gun powder) 입자 운반 시스템(DuPont Co.)과 충돌시킨다.

형질전환체의 선택:

충돌시킨 다음, 각각의 밀리포어 지지체 패드로부터 세포를 60x20㎜ 페트리 디스크중으로 아스파라긴이 결여되어 있는 액체 MS2D 배지 5㎖로 세척한 다음, 이를 파라필름으로 밀봉하여 21 내지 23℃의 암실에서 항온처리한다. 액체 배지중에서 5일간 배양시킨후, 충돌시킨 세포를 아스파라긴이 결여되어 있으며 3㎎/ℓ 포스피노트리신(PPT)(Crescent Chemical Co. Inc.)을 함유하는 겔라이트 고화된 MS2D 선택 배지가 오버레이(OVerlay)된 7.0㎝ 직경의 와트만 제1 여과지 디스크상에 박층으로 플레이팅시킨다. 1차 충돌로부터의 세포를 세포 밀도에 따라 2개 이상의 여과지상에 전형적으로 분배한다. 세포가 오버레이된 여과지를 2 내지 3주 간격으로 신선한 선택 배지로 옮긴다. 충돌후 7 내지 8주후에 PPT-내성 콜로니가 출현하기 시작하며, 여과지 없이 신선한 선택 배지상으로 2 내지 3주 마다 직접 제대배양시킨다.

식물 재생:

PPT-내성 조직 배양물을 3㎎/ℓ PPT를 함유하는 N + B 귀리 식물 재생 배지[Bregitzer, P., et al., Crop Sci 29:798-803(1989)][MS 염(Murashige, T. ＆ Skoog, F., Physiol. Plant 15:473-497(1962)], 2㎎/ℓ 나프탈렌아세트산, 0.2㎖/g 벤질아미노퓨린)상에 놓는다. 2 내지 6주후, 유합 조직으로부터 어린 싹을 제거하고 호르몬은 없지만 3㎎/ℓ PPT를 함유하는 뿌리 형성용 MS 배지로 옮긴다. 뿌리내린 식물을 포트의 토양 혼합물로 옮겨 성장 챔버에서 성숙할 때까지 성장시킨다.

유전자전이 식물의 분석:

PAT 활성을 문헌[참조 문헌: DeBlock et al., EMBO J. 6:2513-2518(1987)]에 따라서 유합 조직 및 잎 추출물에서 평가한다.

써던 분석에 의해 퍼옥시다제 암호화 서열을 포함하는 것으로 증명된 귀리 식물을 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 살충 활성에 대해 평가한다.

실시예 6

퍼옥시다제 암호화 서열을 포함하는 유전자전이 보리과 식물

pJS20293(도 1)과 pUBlAc(도 2)를 사용하여 문헌[참조 문헌: Wan et al., Plant Physiol. 104:37-48(1994) 및(또는) Jahne et al., Theor. Appl. Genet. 89:525-533(1994)]의 방법을 이용하여 보리를 형질전환시킨다.

완 등의 방법을 사용하여 보리를 형질전환시키는 것에 대해 하기와 같이 간략하게 기술한다[참조 문헌: Wan et al., Plant Physio, 104:37-48(1994)].

식물 재료:

보리(Hordeum vulgare L.) 봄 재배종 골든 프로마이즈(Golden Promise)의 식물을 성장 챔버에서 16시간 광/8시간 암 주기하에 12℃ 및 60 내지 80% 습도에서 성장시킨다[참조 문헌: Hunter, C.P., Plant Regeneration from Microspores of Barley, Hordeum vulgare, PhD Thesis, Wye College, University of London, Ashford, Kent(1988)]. 머리 높이에서의 광 수준은 대략 350 내지 400mE이다. 겨울 재배종, 이그리(Igri)의 종자를 동일한 조건하의 성장 챔버중 토양에서 발아시킨다. 높이가 약 10㎝일 때, 모종을 10시간 광(10 내지 15mE)/14시간 암 주기하에 4℃에서 8주간 춘화시킨다[참조 문헌: Hunter, C.P., Plant Regeneration from Microspores of Barley, Hordeum vulgare, PhD Thesis, Wye College, University of London, Ashford, Kent(1988)]. 춘화후, 이들을 골든 프로마이즈 식물과 동일한 양생법하에서 성장시킨다. 식물을 모두 오스모코트(Osmocote)(Sierra, 17-6-12 plus minors)로 식수기에 수정시킨 다음 격주로 0.02% 베르디(Verdi)(Peter's, 20-20-20)로 수정시킨다.

미성숙 배 및 미성숙 배로부터 유래된 유합 조직:

크기가 약 1.5 내지 2.5㎜인 미성숙 배가 있는 cv 골든 프로마이즈의 이삭을 20%(v/v) 표백제(5.25% 차아염소산나트륨)중에서 5분간 표면 멸균시키고, 간단하게 3회 세정하고, 멸균수로 5분간 세척한다. 미성숙 배를 어린 영과(caryopsis)로부터 절제하여 천연 상태로 방치하거나, 종방향으로 이분한다. 충돌용 유합 조직을 유발시키기위하여, 배(천연 또는 이분된 것)를, 30g/ℓ 말토오스, 1.0㎎/ℓ 티아민-HCl, 0.25g/ℓ 미오-이노시톨, 1.0g/ℓ 카제인 가수분해물, 0.60g/ℓ Pro, 및 2.5㎎/ℓ 디캄바로 보충되고 3.5g/ℓ 겔라이트(Scott, Carson, CA) 또는 피타겔(Phytagel)(Sigma)로 고화된 무라시게 및 스쿠스 배지[Murashige, T. ＆ Skoog, F., Physiol Plant 15:473-497(1962)]인, 유합 조직 유발 배지상에 소수판이 아래쪽으로 가도록 놓는다. 배를 25℃ 암실에서 항온처리하고, 충돌용 배발생성 유합 조직을 2주후에 선택한다.

꽃밥 배양 및 소포자-유래된 배(MDEs):

소포자가 중간-단핵 단계 내지 조기 이핵 단계에 있을때 잎사귀로 싸여있는 이삭을 cv 이그리 식물로부터 수확하여 70% 에탄올로 간단하게 표면 멸균시킨다. 이삭으로부터 꽃밥을 절제하고, 60개의 꽃밥을 0.3M 만니톨 3㎖가 있는 각각의 페트리 접시(35 x 10㎜)에 놓는다. 상기 페트리 접시를 파라필름으로 밀봉하여 25℃ 암실에서 3 내지 4일간 항온처리시킨다. 이어서 꽃밥을 피콜-400이 없고 1㎎/ℓ IAA 및 0.2㎎/ℓ 키네틴이 보충된 헌터(Hunter)의 액체 FHG 배지(NH₄NO₃가 더 낮고 Gln이 높은 개질된 무라시게 및 스쿠그 배지[Kasha, K., et al., "Haploids in Cereal Improvement: Anther and Microspore Culture," J.P. Gustafson, ed., Gene Manipulation in Plant Improvement II, Plenum Press, NY(1990), pp. 213-235)(FHG⁺로 표시)]로 옮기고 상기한 바와 같이 항온처리한다. 대략 2주 또는 3주후 MDEs가 가시화되며 대략 4주후 충돌용으로 사용한다.

충돌판의 준비 및 미세 발사체 충돌:

충돌 하루전에, cv 골든 프로마이즈의 어린 영과로부터 1Es(1.5 내지 2.5㎜)를 종방향으로 반으로 절단하여 페트리 접시(100 x 15㎜) 중앙의 유합 조직 유발 배지상에 3개의 상이한 배향(소수판면이 위, 소순판면이 아래, 또는 절단면이 위로 가도록)으로 놓는다. 유합 조직의 충돌을 위하여, 배양시킨 1Es로부터 배발생성 유합 조직의 대략 0.5g을 작은 조각(약 2㎜)으로 절단하여 유합 조직 유발 배지를 함유하는 페트리 접시(100 x 15㎜)의 중앙에 놓는다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 꽃밥 배양 플레이트로부터 MDEs를 수확하여 2개의 7-㎝ 필터에 의해 지지되는 5-㎝ 와트만 No. 3 여과지 조각상에 페트리 접시(100 x 15㎜)에서 균일하게 분배시킨다. 충돌전, 과량의 배지를 필터로부터 제거한다.

플라스미드 DNA를 상기한 바와 같이[참조 문헌: Daines, R. J., Biolistic Particles Delivery Systems Newsletter 1:1,4(1990)] 금 입자(1.0㎜, DuPont, Wilmington, DE)에 흡착시킨다. 2종의 플라스미드를 사용할 경우, 2종의 플라스미드로부터 등량(㎎)의 DNA를 혼합한다. 듀폰 PDS 1000 He 바이오리스틱 운반 시스템을 사용하여 표적물을 모두 한번에 충돌시킨다. 표적물은 발사체 종결판으로부터 대략 13㎝ 아래에 배치한다; 1100-p.s.i. 파열 디스크를 사용한다.

형질전환체 선택:

IEs 및 유합 조직

충돌후 첫째날, ½의 배와 유합 조직 조각을 각각 5㎎/ℓ 비알라포스가 보충된 유합 조직 유발 배지로 옮긴다; ½의 배를 충돌중 배향과는 무관하게, 소순판이 아래로 가도록 배양시킨다. 조직은 대략 10 내지 14일간 1차 선택 플레이트상에 남아있다. 2차 선택판(5㎎/ℓ 비알라포스)으로 옮겼을 때, 각각의 유상체화 배 또는 유합 조직 조각을 족집게를 사용하여 수개의 작은 조각으로 나누어 별도로 유지시킨다. 후속적인 2 내지 3회의 선택중(각각 대략 10 내지 20일, 5㎎/ℓ 비알라포스), 더욱 왕성한 성장 징후를 나타내는 유합 조직 조각을 보다 일찍 새로운 선택 플레이트로 옮기고 동일한 방법으로 조직을 다룬다. 각각의 배 또는 유합 조직 조각으로부터 원래 발달하는 모든 유합 조직 조직은 모두 동일주로 정의된다. 비알라포스-내성 유합 조직주를 5㎎/ℓ 비알라포스가 보충된 유합 조직 유발 배지상에서 매달 제대배양하여 유지시킨다.

MDEs

충돌시킨 다음, 수방울의 FHG⁺배지를 MDEs에 가한다. 2 또는 3일후, 1.5㎜를 초과하는 배를 개별적으로 3 또는 5㎎/ℓ 비알라포스가 보충된 유합 조직 유발 배지상으로 옮긴다. 더 작은 배는 필터상에 유지시키고 이들이 대략 1.5㎜가 되었을 때 선택 배지로 옮긴다. 여과지를 2 또는 3일 마다 액체 FHG⁺배지의 반복 첨가 및 제거에 의해 세척한다. MDEs가 1차 선택 배지상에 10 내지 20일간 남아있다. 유합 조직 형성 징후를 나타내는 MDEs를 5㎎/ℓ 비알라포스가 보충된 신선한 선택 배지로 옮긴다. 옮기는중, 각각의 유합 조직 형성 MDE를 몇개의 작은 조각으로 나눈다. 추가의 선택은 선행 선택에서 기재된 바와 같다.

식물 재생 및 제초제 적용

배발생성 유합 조직을 1㎎/ℓ 비알라포스가 보충된 FHG 배지로 옮겨 23℃ 또는 25℃에 형광(45 내지 55mE, 16시간/일)하에서 PAT-포지티브 유합 조직주로부터 식물을 재생시킨다. 대략 2주내에, 묘목이 관찰된다. 대략 2㎝인 녹색 묘목을 1㎎/ℓ 비알라포스가 보충된 묘목 성장 배지(호르몬이 없는 유합 조직 유발 배지)를 함유하는 마겐타(Magenta) 박스로 옮긴다. 이들이 박스의 상부까지 성장하기전에, 묘목을 슈퍼소일(Supersoil)을 함유하는 6-인치 포트로 옮겨 온실(16시간 광, 15 내지 18℃)에 놓는다. 재생물을 성숙하게 성장시켜 자가-수분시킨다. 식물중 일부를 0.1% Tween 20이 첨가된 0.5%(v/v) 용액으로 분무하여 Basta(200g/ℓ PPT, Hoechst AG, Frankfurt,germany)에 대한 이들의 반응을 시험한다. 식물을 또한 비알라포스가 없는 배지상에서 야생형 유합 조직으로부터 재생시킨다.

유전자전이 식물의 분석

유전자전이 조직과 식물을 써던 및 노던 기술을 사용하여 분석하여 퍼옥시다제 암호화 서열 및 RNA의 존재를 각각 증명한다.

써던 분석에 의해 퍼옥시다제 암호화 서열을 포함하는 것으로 증명된 보리과 식물을 오스트리니아 누빌라리스(Ostrinia nubilalis), 유럽 옥수수 벌레; Agrotis ipsilon, 흑색 야도충; Schizaphis graminum, 녹색벌레; Blissus leucopterus leucopterus, 빈대 벌레; Acrosternum hilare, 녹색 방귀벌레; Euschistus servos, 갈색 방귀벌레; Hylemya platura, 종자옥수수 구더기; Mayetiola destructor, 헤시안 파리; Thysanoptera, 삽주벌레; 또는 Petrobia latens, 갈색 밀 진드기에 대한 살충 활성에 대해 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 평가한다.

여기 언급된 공보는 모두 본 명세서에서 참고로 전문 인용된다.

상기 본 발명이 명백함과 이해를 목적으로 다소 상세하게 기재되었지만, 상기 내용을 판독함으로써 당해 분야의 숙련가들은 본 발명의 범주 및 첨부되는 특허청구의 범위로부터 벗어나지 않고 형식과 세부사항을 다양하게 변화시킬 수 있음을 인식할 것이다.

Claims

퍼옥시다제를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 재조합 DNA를 포함하는, 살충량의 유전자전이 단자엽 식물 세포를 곤충에게 공급하거나 접촉시킴을 포함하는 곤충의 방제방법.
제1항에 있어서, 방법이 단자엽 식물을 퍼옥시다제를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 DNA 서열로 형질전환시킴을 포함하는 방법.
제1항에 있어서, DNA 서열이 암호화 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함하는 방법.
제3항에 있어서, DNA 서열이 암호화 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 프로모터를 포함하는 키메릭 유전자를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 퍼옥시다제가 음이온성 퍼옥시다제인 방법.
제1항에 있어서, 세포가 번식가능한 유전자전이 식물의 일부를 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 식물이 밀, 벼, 귀리, 보리, 사탕수수 및 옥수수로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제7항에 있어서, 식물이 옥수수과 식물인 방법.
제8항에 있어서, 옥수수과 식물이 CG00526, CG00615, 및 CG00714로 이루어진 그룹으로부터 선택된 옥수수주인 방법.
제1항에 있어서, 식물을 입자 충돌법(particle bombardment), 전기천공법(electroporation) 및 폴리에틸렌 글리콜 처리법으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 기술을 사용하여 형질전환시키는 방법.
제1항에 있어서, DNA 서열이 선택성 또는 선별성 마커 유전자를 추가로 포함하는 방법.
제11항에 있어서, 마커 유전자가 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 2,2-디클로로프로프리온산 데할로게나제, 아세토하이드록시산 신타제, 5-에놀피루빌-쉬키메이트-포스페이트 신타제, 할로아릴니트릴라제, 아세틸-조효소 A 카복실라제, 디하이드로프테로에이트 신타제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 및 β-글루쿠로니다제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효소를 암호화하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 곤충이 콜레오프테라(Coleoptera), 디프테라(Diptera), 하이메노프테라(Hymenoptera), 레피도프테라(Lepidoptera), 말로파가(Mallophaga), 호모프테라(Homoptera), 헤미프테라(Hemiptera), 오르트로프테라(Orthroptera), 티사노프테라(Thysanoptera), 데르마프테라(Dermaptera), 이소프테라(Isoptera), 아노플루라(Anoplura), 시포나프테라(Siphonaptera) 및 트리쵸프테라(Trichoptera)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제13항에 있어서, 곤충이 유럽 옥수수 벌레, 줄기 옥수수 벌레, 흑색 야도충, 옥수수 이삭 벌레, 폴 행렬구더기, 남서 옥수수 벌레, 레서 옥수수 줄기 벌레, 당밀 벌레, 서구 옥수수 뿌리벌레, 북구 옥수수 뿌리벌레, 서구 옥수수 뿌리벌레, 와이어벌레, 북구 마스크 풍뎅이과 곤충, 남구 마스크 풍뎅이과 곤충, 일본 딱정벌레, 옥수수 벼룩 딱정벌레, 옥수수 바구미, 옥수수잎 진딧물, 옥수수뿌리 진딧물, 빈대 벌레, 빨간 다리 메뚜기, 이주성 메뚜기, 종자옥수수 구더기, 옥수수 반점 리프마이너, 잔디 삽주벌레, 도둑 개미 및 2점박이 거미 진드기로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
퍼옥시다제의 발현으로 단자엽 식물에 표현형 특성이 부여되는, 퍼옥시다제를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 재조합 DNA를 포함하는 번식가능한 유전자전이 단자엽 식물.
제15항에 있어서, 표현형 특성이 곤충 내성 및 저항성(standability)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 식물.
제16항에 있어서, 표현형 특성이 곤충 내성인 식물.
제15항에 있어서, 퍼옥시다제 암호화 서열이 음이온성 퍼옥시다제 유전자인 식물.
제15항에 있어서, 식물이 밀, 벼, 귀리, 보리, 사탕수수 및 옥수수로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 식물.
제19항에 있어서, 식물이 옥수수과 식물인 식물.
제20항에 있어서, 옥수수과 식물이 CG00526, CG00615 및 CG00714로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 옥수수주인 식물.
제15항에 있어서, DNA 서열이 선택성 또는 선별성 마커 유전자를 추가로 포함하는 식물.
제22항에 있어서, 마커 유전자가 네오마이신 포스포트랜스퍼라제, 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 2,2-디클로로프로프리온산 데할로게나제, 아세토하이드록시산 신타제, 5-에놀피루빌-쉬키메이트-포스페이트 신타제, 할로아릴니트릴라제, 아세틸-조효소 A 카복실라제, 디하이드로프테로에이트 신타제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 및 β-글루쿠로니다제로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 효소를 암호화하는 식물.
제15항에 따르는 식물로부터 수득한 유전자전이 식물 세포, 조직 또는 종자.
제15항에 따르는 식물의 유전자전이 후손.
제25항에 따르는 후손으로부터 수득한 유전자전이 식물 세포, 조직 또는 종자.
단자엽 식물 세포에 곤충 내성을 부여하기위한, 퍼옥시다제를 암호화하는 재조합 DNA의 용도.
곤충의 공격에 의해 유발되는 식물에 대한 손상을 방지하기위한, 퍼옥시다제를 암호화하는 재조합 DNA를 포함하는 식물의 용도.
퍼옥시다제의 발현으로 단자엽 식물에 표현형 특성이 부여되는, 퍼옥시다제를 암호화하는 암호화 서열을 포함하는 재조합 DNA를 포함하는 유전자전이 식물 재료 또는 식물을 사용하는 영농방법.