BR112020008931A2

BR112020008931A2 - proteína inseticida ativa para hemípteros

Info

Publication number: BR112020008931A2
Application number: BR112020008931-1A
Authority: BR
Inventors: William Beeson Iv; Jeffrey Church; Samantha Griffin
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2017-11-09
Filing date: 2018-10-29
Publication date: 2020-11-10
Also published as: BR112020008931B1; US11578338B2; CA3082256A1; WO2019094213A1; AR113693A1; US20200267993A1

Abstract

A presente invenção descrição refere-se a composições e métodos para proteínas pesticidas inovadoras, polinucleotídeos que codificam tais proteínas, uso de tais proteínas pesticidas inovadoras para controlar pragas de Hemípteros/Lepidópteros de plantas, e plantas transgênicas que produzem, e são protegidas, por essas proteínas pesticidas inovadoras.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTEÍ- NA INSETICIDA ATIVA PARA HEMÍPTEROS".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisório número de série U.S. 62/583684, depositado em 9 de no- vembro de 2017, que está expressamente incorporado a título de refe- rência ao presente documento, em sua totalidade.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA DE MATERIAL ENVIADO ELETRONICAMENTE

[002] É incorporada a título de referência, em sua totalidade, uma listagem de sequência de nucleotídeo/aminoácido legível por compu- tador enviada concomitantemente com o presente documento e identi- ficada conforme o seguinte: um arquivo ASCII (Texto) de 70,2 KB no- meado "81125 Sequences_ST25" criado em 25 de outubro de 2018.

CAMPO DA TÉCNICA

[003] A presente invenção refere-se, em geral, ao campo de bio- logia molecular conforme aplicada às ciências agrícolas. Mais particu- larmente, determinadas modalidades referem-se a métodos para o uso de sequências de polinucleotídeos como modelos para a produção de proteínas, e o uso de proteínas para o controle de insetos. São apre- sentados, também, métodos de produção e utilização das sequências de polinucleotídeos no desenvolvimento das proteínas pesticidas ino- vadoras em células vegetais transgênicas contendo as sequências de polinucleotídeos descritas no presente documento.

ANTECEDENTES

[004] O controle biológico de pragas de insetos de importância agrícola utilizando uma proteína pesticida produz uma alternativa eco- lógica e comercialmente atrativa aos pesticidas químicos sintéticos. De modo geral, o uso de proteínas pesticidas apresenta um risco mais baixo de poluição e riscos ambientais, e proteínas pesticidas fornecem maior especificidade ao alvo do que é característico de inseticidas químicos de largo espectro tradicionais. Além disso, as proteínas pes- ticidas normalmente têm uma produção menos dispendiosa e melho- ram, desse modo, o rendimento econômico para uma ampla variedade de culturas.

[005] Certas espécies de micro-organismos do gênero Bacillus são conhecidas por terem atividade inseticida contra uma faixa de pra- gas de insetos incluindo Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera e outras. Bacillus thuringiensis e Bacillus popilliae estão dentre as prote- ínas pesticidas mais bem-sucedidas descobertas até hoje. A patogeni- cidade para insetos também foi atribuída a cepas de B. larvae, B. len- timorbus, B. sphaericus e B. cereus. As proteínas pesticidas, particu- larmente aquelas obtidas de cepas de Bacillus, têm exercido uma fun- ção importante na agricultura como alternativas ao uso de pesticidas químicos sintéticos para o controle de insetos.

[006] As plantas de culturas foram desenvolvidas com resistência a insetos potenciada, manipulando geneticamente as plantas de cultu- ra para produzir proteínas pesticidas a partir de Bacillus. Por exemplo, plantas de milho e algodão foram geneticamente modificadas para produzir proteínas pesticidas isoladas de cepas de Bacillus thuringien- sis. Essas culturas geneticamente modificadas contendo proteínas pesticidas inovadoras são agora amplamente usadas na agricultura e proporcionaram ao agricultor uma alternativa ecológica aos métodos tradicionais de controle de insetos. Embora tenham provado ser muito bem-sucedidas comercialmente, estas plantas de cultivo geneticamen- te modificadas, resistentes aos insetos, fornecem resistência apenas a uma estreita gama de pragas de insetos economicamente importantes. Em alguns casos, os insetos podem desenvolver resistência a com- postos inseticidas diferentes, o que gera a necessidade de identificar agentes de controle biológico alternativos para controle de pragas.

[007] Consequentemente, existe uma necessidade de novas pro- teínas pesticidas com diferentes faixas de atividade inseticida contra pragas de inseto, por exemplo, proteínas pesticidas que são ativas contra uma variedade de insetos na ordem Lepidoptera e a ordem Hemiptera incluindo, porém sem limitação, espécies que pertencem à família Pentatomidae, à família Plataspidae e à família Cydnidae. Além disso, existe uma necessidade de proteínas pesticidas que tenham atividade contra uma variedade de pragas de insetos que desenvolve- ram resistência aos pesticidas existentes.

BREVE SUMÁRIO

[008] Nas modalidades da presente descrição, a descrição refe- re-se a uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo IRDIG37126 ou uma va- riante do mesmo. Em alguns aspectos desta modalidade, o polipeptí- deo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é oralmente ativo. Em outros aspectos desta modalidade, o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo tem atividade inseticida contra uma praga de inse- tos na ordem Hemiptera. Aspectos adicionais incluem quando o poli- peptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo tem atividade inseti- cida contra uma praga de insetos na família Pentatomidae. Em um as- pecto da modalidade, o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ou 100% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Em alguns as- pectos, a molécula de ácido nucleico isolada compreende um polinu- cleotídeo da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36, um fragmento ou um complemento do mesmo. Em aspectos adicionais, o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo compreende uma sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24 ou um frag-

mento da mesma. Em um outro aspecto, o polipeptídeo IRDIG37126 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24 compreende ainda pelo me- nos uma substituição de aminoácido, pelo menos uma adição de ami- noácido ou pelo menos uma deleção de aminoácido. Em um aspecto adicional, o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo con- siste na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24.

[009] Nas modalidades da presente descrição, a descrição refe- re-se a uma planta ou progênie da mesma, que compreende uma mo- lécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo. Em alguns aspectos, a planta ou progênie da mesma é transformada de maneira estável com a mo- lécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo. Em um aspecto adicional, a planta é uma monocotiledônea. Em um outro aspecto, a planta é uma dicotiledônea. Exemplos da planta que compreende uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo podem incluir Zea mays, trigo, arroz, sorgo, aveia, centeio, banana, cana-de-açúcar, Glycine max, algodão, Arabi- dopsis, tabaco, girassol e canola. Em um outro aspecto, a planta que compreende uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo pode compreen- der ainda um ou mais traços transgênicos adicionais. Exemplos de tais traços transgênicos adicionais incluem um traço que codifica uma pro- teína marcadora selecionável, uma proteína com resistência a insetici- da, uma proteína com tolerância a herbicida, uma proteína com efici- ência de uso de nitrogênio, uma proteína com eficiência de uso de água, uma molécula de RNA pequena, uma proteína de qualidade nu- tricional ou uma proteína de ligação a DNA. Em outros aspectos, a planta produz um produto de consumo. Os exemplos de tais produtos de consumo incluem concentrado proteico, isolado proteico, grão, fare-

lo, farinha, óleo ou fibra. Em um outro aspecto, a planta que compre- ende uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipep- tídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é usada para proteger a planta contra uma praga de insetos.

[0010] Nas modalidades da presente descrição, a descrição refe- re-se a um método para produzir uma célula vegetal. O método inclui as seguintes etapas: a) transformar uma célula vegetal com um gene que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo; b) isolar a célula vegetal transformada que compreende o gene que codi- fica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo; e, c) pro- duzir uma célula vegetal transgênica que compreende o gene que co- difica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. O méto- do pode incluir as etapas adicionais de: d) regenerar a célula vegetal transgênica formando uma planta transgênica; e, e) obter a planta transgênica, em que a planta transgênica compreende o gene que co- difica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. Em um aspecto adicional, a transformação da célula vegetal é realizada com um método de transformação de planta. Os exemplos de tais métodos de transformação incluem um método de transformação mediada por Agrobacterium, um método de transformação biolística, um método de transformação de carbeto de silício, um método de transformação de protoplasto, e um método de transformação de lipossomo. Em aspec- tos adicionais, a sequência de polinucleotídeos de interesse é constitu- tivamente expressa em uma célula vegetal. Em aspectos adicionais, a sequência de polinucleotídeos de interesse é integrada de modo está- vel ao genoma da célula vegetal transgênica. Em alguns aspectos, a célula vegetal transgênica é uma célula vegetal transgênica monocoti- ledônea ou uma célula vegetal transgênica dicotiledônea. Exemplos de células vegetais transgênicas dicotiledôneas incluem uma célula vege- tal de Arabidopsis, uma célula vegetal de tabaco, uma célula vegetal de Glycine max, uma célula vegetal de canola e uma célula vegetal de algodão. Exemplos de células vegetais transgênicas monocotiledô- neas incluem uma célula vegetal de Zea mays, uma célula vegetal de arroz e uma célula vegetal de trigo. Em um outro aspecto, a célula ve- getal que compreende uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica um polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é usada para proteger a planta contra uma praga de insetos.

[0011] Nas modalidades da presente descrição, a descrição refe- re-se a um método para expressar uma sequência de polinucleotídeos de interesse em uma célula vegetal, sendo que o método compreende introduzir na célula vegetal um cassete de expressão gênica que com- preende o gene que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma vari- ante do mesmo. Em alguns aspectos, o cassete de expressão gênica que compreende o gene que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é introduzido na célula vegetal por um método de transformação de plantas. Exemplos de tal método de transforma- ção incluem um método de transformação mediada por Agrobacterium, um método de transformação biolística, um método de transformação de carbeto de silício, um método de transformação de protoplasto, e um método de transformação de lipossomo. Em outros aspectos, a sequência de polinucleotídeos de interesse é expressa constitutiva- mente em tecido de célula vegetal. Em aspectos adicionais, a sequên- cia de polinucleotídeos de interesse é integrada de modo estável ao genoma da célula vegetal. Em aspectos adicionais, a célula vegetal transgênica é uma célula vegetal monocotiledônea ou uma célula ve- getal dicotiledônea. Exemplos de células vegetais dicotiledôneas in- cluem uma célula vegetal de Arabidopsis, uma célula vegetal de taba- co, uma célula vegetal de Glycine max, uma célula vegetal de canola e uma célula vegetal de algodão. Exemplos de células vegetais monoco- tiledôneas incluem uma célula vegetal de Zea mays, uma célula vege-

tal de arroz e uma célula vegetal de trigo. Em um outro aspecto, a planta ou célula que compreende uma molécula de ácido nucleico iso- lada que codifica um polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é expressada na planta ou célula para proteger a planta contra uma praga de inseto.

[0012] Em modalidades da presente descrição, a descrição se re- fere a um cassete de expressão de gene que compreende um promo- tor ligado de maneira funcional a uma sequência de codificação hete- róloga, em que as sequências de codificação heterólogas codificam um polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. Em alguns aspectos, as sequências de codificação heterólogas que codificam um polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo têm pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ou 100% de identidade com a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Em ou- tros aspectos, as sequências de codificação heterólogas que codificam um polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo consistem na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Em aspectos adicionais, a sequência de polinucleotídeos de codifica- ção heteróloga que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma varian- te do mesmo compreende uma sequência de polinucleotídeos com pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ou 100% de identidade com a sequência de polinucleotídeos da SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36. Em outros aspectos, o cassete de expressão gênica com- preende ainda um ou mais traços transgênicos adicionais. Exemplos de tais traços transgênicos adicionais incluem uma sequência de codi- ficação heteróloga que confere resistência a inseticida, tolerância a herbicida, um ácido nucleico que confere eficiência de uso de nitrogê- nio, um ácido nucleico que confere eficiência de uso de água, um áci-

do nucleico que confere qualidade nutricional, um ácido nucleico que confere proteína de ligação de DNA, e um ácido nucleico que codifica um marcador selecionável.

Em um aspecto adicional, a sequência de codificação heteróloga está ligada de maneira funcional a uma ou mais sequências reguladoras que dirigem a expressão do polipeptídeo IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo.

Em aspectos adicionais, o poli- peptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é oralmente ativo.

Em outros aspectos, o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo tem atividade inseticida contra uma praga de insetos da ordem Hemiptera.

Em um aspecto, o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma vari- ante do mesmo tem atividade inseticida contra uma praga de insetos da família Pentatomidae.

Em um outro aspecto, o polipeptídeo IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo tem atividade inseticida contra uma praga de insetos da ordem Lepidoptera como Lagarta falsa- medideira.

Em um aspecto adicional, o vetor recombinante que com- preende o cassete de expressão gênica é um plasmídeo, um cosmí- deo, um cromossomo artificial bacteriano, um vírus e um bacteriófago.

Em outras modalidades, o cassete de expressão gênica está contido no interior de uma célula microbiana recombinante.

Exemplos de tal célula microbiana recombinante incluem uma bactéria, baculovírus, algas, levedura e fungos.

Exemplos adicionais de uma célula bacteria- na incluem uma célula de Pseudomonas, uma célula de Agrobacterium e célula de Escherichia.

Em alguns aspectos, a célula microbiana re- combinante é cultivada sob condições em que a sequência de codifi- cação heteróloga que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma va- riante do mesmo é expressa para produzir um polipeptídeo com ativi- dade inseticida.

Em modalidades adicionais, o cassete de expressão gênica está contido no interior de uma célula transgênica.

Em alguns aspectos, a célula transgênica é uma célula vegetal transgênica.

Em outras modalidades, o cassete de expressão gênica está contido no interior de uma planta transgênica. Em um aspecto, a planta transgê- nica é uma planta monocotiledônea ou planta dicotiledônea. Exemplos de tal planta monocotiledônea incluem uma planta de maís, uma plan- ta de arroz e uma planta de trigo. Em uma outra modalidade, o cassete de expressão gênica está contido no interior de uma semente de plan- ta.

[0013] Nas modalidades da presente descrição, a descrição refe- re-se a um método para controlar uma população de pragas de insetos que compreendem colocar a população de praga de insetos em conta- to com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de um polipeptí- deo IRDIG37126 recombinante ou uma variante do mesmo. Em um aspecto, a praga de insetos é exposta a uma célula vegetal transgêni- ca, planta ou parte da planta, em que a dita célula vegetal, planta ou parte da planta expressa uma quantidade eficaz como inseticida do polipeptídeo IRDIG37126 recombinante ou uma variante do mesmo. Em aspectos adicionais, a praga de insetos pertence à espécie de Le- pidópteros e/ou Hemípteros. Em aspectos adicionais, a planta é plan- tada em um campo de cultura.

[0014] Em modalidades adicionais, a presente descrição refere-se a um método para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de insetos que compreende colocar a praga de insetos em contato com uma quantidade eficaz como inseticida de um polipeptídeo IR- DIG37126 recombinante ou uma variante do mesmo. Em um aspecto, a praga de insetos é exposta a uma célula vegetal transgênica, planta ou parte da planta, em que a dita célula vegetal, planta ou parte da planta que expressa uma quantidade eficaz como inseticida do poli- peptídeo IRDIG37126 recombinante ou uma variante do mesmo. Em outros aspectos, a praga de insetos pertence à espécie de Lepidópte- ros e/ou Hemípteros. Em aspectos adicionais, a planta é plantada em um campo de cultura.

[0015] Em outras modalidades, a presente descrição refere-se a um método para controlar uma população de pragas de insetos resis- tente a uma proteína pesticida, que compreendem colocar a população de praga de insetos em contato com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de um polipeptídeo IRDIG37126 recombinante ou uma va- riante do mesmo. Exemplos de tal proteína pesticida, à qual as popu- lações de pragas de insetos são resistentes, incluem uma proteína CrylAc, uma proteína CrylAb, uma proteína Cry1A.105, uma proteína CrylAc, uma proteína Cry1 F, uma proteína Cry1 Fa2, uma proteína Cryl F, uma proteína Cry2Ab, uma proteína Cry3A, uma proteína mCry3A, uma proteína Cry3Bb1, uma proteína Cry34Ab1, uma proteí- na Cry35Ab1, uma proteína Vip3A, uma proteína Cry9c, uma proteína eCry3.1Ab, uma proteína CBI-Bt, uma proteína patatina, uma proteína de lectina vegetal, uma proteína fitoecdisteroide, uma proteína insetici- da Xenorhabdus, uma proteína inseticida Photorhabdus, uma proteína inseticida Bacillus laterosporous e uma proteína inseticida Bacillus sphaericus. Em um outro aspecto, a praga de insetos é exposta a uma célula vegetal transgênica, planta ou parte da planta que expressa uma quantidade eficaz como inseticida do polipeptídeo IRDIG37126 recombinante ou uma variante do mesmo. Em aspectos adicionais, a praga de insetos pertence a uma espécie de Lepidópteros e/ou Hemíp- teros. Em aspectos adicionais, a planta é plantada em um campo de cultura.

[0016] Em uma modalidade adicional, a presente descrição refere- se a um método para proteger uma planta contra uma praga de inse- tos, que compreende expressar na planta ou célula da mesma uma proteína inseticida isolada de um polipeptídeo IRDIG37126 recombi- nante ou uma variante do mesmo. Em um outro aspecto, a praga de insetos é exposta a uma célula vegetal transgênica, planta ou parte da planta, em que a dita célula vegetal, planta ou parte da planta expres-

sa uma quantidade eficaz como inseticida do polipeptídeo IRDIG37126 recombinante ou uma variante do mesmo. Em outros aspectos, a pra- ga de insetos pertence à espécie de Lepidópteros e/ou Hemípteros. Em aspectos adicionais, a planta é plantada em um campo de cultura.

[0017] Em uma modalidade adicional, a presente descrição refere- se a um método para reduzir a emergência de insetos Lepidópteros e/ou Hemípteros que são resistentes a plantas transgênicas. Em um aspecto, as plantas transgênicas são transformadas com um polinu- cleotídeo que expressa uma proteína inseticida IRDIG37126 recombi- nante. Em um outro aspecto, o polinucleotídeo que expressa uma pro- teína inseticida IRDIG37126 recombinante é expresso em combinação com uma proteína inseticida que tem um modo de ação diferente em comparação com a proteína inseticida IRDIG37126. Em outros aspec- tos, a planta transgênica que compreende a proteína inseticida IR- DIG37126 em combinação com a outra proteína inseticida tem ativida- de inseticida contra uma praga de insetos na ordem Hemiptera e/ou Lepidoptera. Em aspectos adicionais, a planta é plantada em um cam- po de cultura.

[0018] Em uma modalidade adicional, a presente descrição refere- se a um método para o gerenciamento de resistência de insetos Lepi- dópteros e/ou Hemípteros. O método que compreende a etapa de co- expressar duas ou mais moléculas inseticidas que são tóxicas a inse- tos Lepidópteros e/ou Hemípteros em uma planta transgênica. Em um aspecto, as duas ou mais moléculas inseticidas exibem modos de ação de atividade inseticida diferentes contra os insetos Lepidópteros e/ou Hemípteros. Em aspectos adicionais, a atividade inseticida é a inibição do crescimento de insetos. Em outros aspectos, a atividade inseticida é a mortalidade de insetos. Em um aspecto, as duas ou mais moléculas inseticidas compreendem uma proteína inseticida IR- DIG37126 recombinante e uma proteína Cry. Em aspectos adicionais,

as duas ou mais moléculas inseticidas compreendem uma proteína inseticida IRDIG37126 recombinante e uma proteína VIP. Em aspectos adicionais, as duas ou mais moléculas inseticidas compreendem uma proteína inseticida IRDIG37126 recombinante e uma molécula peque- na de RNA. Em aspectos adicionais, a planta transgênica é plantada em um campo de cultura.

[0019] Em uma modalidade adicional, a presente descrição refere- se a uma composição que compreende uma quantidade eficaz como inseticida de um polipeptídeo IRDIG37126 recombinante ou uma vari- ante do mesmo. Em outros aspectos desta modalidade, a composição compreende ainda um veículo, um tensoativo, um organossilicone, um protetor, um fertilizante, um micronutriente, um atrativo para insetos, e um regulador de crescimento de insetos agricolamente adequado. Um exemplo do veículo pode incluir um pó, uma poeira, péletes, grânulos, pulverizador, emulsão, coloide e solução. Em outros aspectos, a com- posição compreende ainda um ou mais herbicidas, inseticidas ou fun- gicidas. Em alguns aspectos, o um ou mais inseticidas são proteínas pesticidas. Exemplos de tais proteínas pesticidas incluem uma proteí- na Cry1, uma proteína Cry2, uma proteína Cry3, uma proteína Cry4, uma proteína Cry5, uma proteína Cry6 , uma proteína Cry7, uma pro- teína Cry8, uma proteína Cry9, uma proteína Cry15, proteína Cry22, uma proteína Cry23, uma proteína Cry32, uma proteína Cry34, uma proteína Cry35, uma proteína Cry36, uma proteína Cry37, uma proteí- na Cry43, uma proteína Cry46, uma proteína Cry51, uma proteína Cry55, uma toxina binária Cry, uma proteína Cyt , uma toxina VIP, uma proteína SIP , uma lipase inseticida, uma quitinase inseticida, uma pro- teína do veneno de cobra, uma proteína patatina, uma proteína de lec- tina de plantas, uma proteína fitoecdisteroide, uma proteína inseticida Xenorhabdus, uma proteína inseticida Photorhabdus, uma proteína inseticida Bacillus laterosporous e uma proteína inseticida Bacillus sphaericus. Em outros aspectos, o um ou mais inseticidas são produ- tos químicos pesticidas. Exemplos de tal produto químico pesticida in- cluem piretrinas e piretroides sintéticos; derivados de oxadizina; cloro- nicotinilas; derivados de nitroguanidina; triazóis; organofosfatos; pir- róis; pirazóis; fenilpirazóis; diacil hidrazinas; produtos biológicos/de fermentação; e carbamatos.

[0020] Em uma modalidade adicional, a presente descrição refere- se a um polipeptídeo ativo hemíptero recombinante que compreende uma ou mais propriedades selecionadas dentre: a) um polipeptídeo que compreende pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24; b) um fragmento enzimaticamente ativo da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24; c) uma variante de polipeptídeo de a) ou b); ou, e) um segmento de peptídeo que exibe pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Em um aspecto, o polipeptídeo ativo hemíptero recombi- nante que compreende atividade inseticida. Em aspectos adicionais, a atividade inseticida compreende atividade inseticida contra uma praga de insetos da ordem Lepidoptera. Em outros aspectos, o polipeptídeo ativo hemíptero recombinante tem atividade inseticida que compreen- de atividade inseticida oralmente ativa. Em outros aspectos, a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24 compreende ainda pelo menos uma substituição de aminoácido, pelo menos uma adição de aminoácido ou pelo menos uma deleção de aminoácido.

[0021] Em uma modalidade adicional, a presente descrição refere- se a um polinucleotídeo isolado que codifica o polipeptídeo ativo he- míptero recombinante, em que o polinucleotídeo isolado é selecionado dentre o grupo que consiste em: a) uma sequência de nucleotídeos da

SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36; b) uma sequência de nucleotí- deos que codifica um polipeptídeo da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24; c) uma sequência de nucleotídeos que hibridiza com a) sob con- dições de hibridização estringentes; d) uma fita complementar de a) ou b); e) um fragmento de a) ou b) que compreende pelo menos 20 nu- cleotídeos; e f) uma sequência de nucleotídeos que é degenerada co- mo resultado do código genético de qualquer uma das sequência con- forme definido em a) ou b).

[0022] Em algumas modalidades, a descrição refere-se a um poli- nucleotídeo ligado de maneira funcional a um promotor heterólogo, em que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identi- dade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24, que quando alinhada com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24, compreende uma glutamina na posição corres- pondente à posição 19 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24,uma leucina na posição correspondente à posição 20 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24, uma histidina na posição correspondente à posi- ção 21 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24, uma valina na posi- ção correspondente à posição 22 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24, uma glicina na posição correspondente à posição 23 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24, um ácido glutâmico na posição corres- pondente à posição 24 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24, e uma valina na posição correspondente à posição 25 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Em algumas modalidades, a variante de polipep- tídeo IRDIG37126 compreende qualquer uma ou mais substituições de aminoácidos correspondentes às posições 6, 13, 18, 23, 28 ou 75 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24, em qualquer combinação. Em algumas modalidades, a descrição refere-se a um método para contro- lar, inibir o crescimento, ou exterminar uma população de pragas de inseto, que compreende uma etapa de administrar um polinucleotídeo de modo que o polinucleotídeo entre em contato com a praga de inse- tos, em que o peptídeo compreende a sequência de aminoácidos QLHVGEV (SEQ ID NO:37) ou uma variante da SEQ ID NO:37, sendo que a dita variante tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:37. Em outras modalidades, a descrição refere-se a um polinucleo- tídeo que tem atividade inseticida e tem uma sequência de aminoáci- dos incluindo, quando alinhada com uma sequência de aminoácidos que consiste na SEQ ID NO:2, o seguinte motivo de QLHVGEV (SEQ ID NO:37). Em modalidades adicionais, a descrição refere-se a uma célula vegetal transgênica que compreende um polinucleotídeo re- combinante que codifica uma proteínaIRDIG37126 que exibe atividade inseticida em que a dita atividade inibe o crescimento de uma praga de insetos, ainda em que a dita proteínaIRDIG37126 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 97,8% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2; e um motivo de IRDIG37126 que tem a fórmula geral de QLHVGEV (SEQ ID NO:37).

[0023] As características anteriores e outras serão tornadas mais evidentes a partir da descrição detalhada de diversas modalidades a seguir, que seguem com referência às figuras anexas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0024] A Figura 1 apresenta um alinhamento de sequências da proteína de IRDIG37126 da SEQ ID NO:2 com o PIP-1 da SEQ ID NO:3 (número de listagem de sequência de polinucleotídeos 2 da Pa- tente US n.º 9688730) e proteínas IRDIG22274 da SEQ ID NO:4 (N.º de acesso no GenBank WP_011534324).

[0025] A Figura 2 apresenta um alinhamento de árvore filogenéti- ca da proteína de IRDIG37126 da SEQ ID NO:2 com as proteínas mencionadas na Tabela 1. A árvore filogenética inclui IRDIG31504 (N.º de acesso no GenBank EPX60094.1, fornecida no presente documen- to como a SEQ ID NO:11) e WP_071902674.1 (N.º de acesso no GenBank WP_071902674.1, fornecida no presente documento como a SEQ ID NO:12) essas duas proteínas que não têm atividade contra insetos Hemípteros como BSB.

[0026] A Figura 3 apresenta um gráfico dos resultados do bioen- saio de insetos para um bioensaio de alta dose com a proteína de IR- DIG37126 expressa. O eixo geométrico Y mostra a porcentagem mé- dia de mortalidade de quatro poços replicados. A proteína de IR- DIG37126 foi testada contra BSB no bioensaio baseado em dieta pa- drão. As amostras testadas incluem; 10 kDa FT (controle de tampão), IRDIG37126.1 C1 (IRDIG37126.1 prep de uma proteína na colônia), IRDIG37126.1 C5 (IRDIG37126.1 prep de cinco proteínas na colônia), Controle Negativo (apenas dieta) e Controle Positivo (IRDIG31502 a uma concentração final de 1000 ppm).

[0027] A Figura 4 apresenta um gráfico da avaliação da proteína de IRDIG37126 expressa no bioensaio baseado em dieta padrão em doses variadas. O eixo geométrico Y mostra a porcentagem média de mortalidade de 3 poços replicados. As amostras testadas incluem; Apenas dieta (controle negativo), Positivo (IRDIG31502 a 1000 ppm), S1-2000 ppm (IRDIG37126 testada a uma concentração final de 2000 ppm), S2-1500 ppm (IRDIG37126 testada a 1500 ppm), S3-1000 ppm (IRDIG37126 testada a 1000 ppm), S4-500 ppm (IRDIG37126 testada a 500 ppm), S5-250 ppm (IRDIG37126 testada a 250 ppm), e S6-125 (IRDIG37126 testada a 125 ppm).

[0028] A Figura 5 apresenta um gráfico da avaliação da proteína de IRDIG37126 no bioensaio baseado em dieta padrão em doses vari- adas. O eixo geométrico Y mostra a porcentagem de mortalidade. Ca- da ponto representa a porcentagem de mortalidade de insetos em um único poço. A proteína de IRDIG37126 da presente descrição mostrou taxas de mortalidade mais altas em doses mais baixas em compara- ção com a proteína IRDIG31502 inseticida controle.

[0029] As Figuras 6A, 6B e 6C apresentam um alinhamento de sequências da proteína de IRDIG37126 da SEQ ID NO:2 com as pro- teínas IRDIG37126 variantes da SEQ ID NO:13 a 24. Os alinhamentos foram feitos usando o programa de alinhamento AlignX do pacote Vec- tor NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA). As proteínas compartilham pelo menos 97,8% de identidade de sequência umas com as outras como resultado das várias mutações que foram produzidas ao longo da se- quência de proteínas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0030] As sequências de ácidos nucleicos mencionadas na lista- gem de sequência em anexo são mostradas usando abreviações de letras padrão para bases nucleotídicas, conforme definido em 37 C.F.R. § 1.822. Em vista da redundância do código genético, será en- tendido que uma sequência de nucleotídeos incluindo uma sequência de codificação também descreve o gênero de polinucleotídeos que co- dificam o mesmo polipeptídeo como um polinucleotídeo que consiste na sequência de referência. Apenas uma fita de cada sequência de ácidos nucleicos é mostrada, porém a fita complementar é entendida como incluída por qualquer referência à fita exibida. Como o comple- mento e o complemento reverso de uma sequência primária de ácidos nucleicos são necessariamente descritos pela sequência primária, a sequência complementar e a sequência complementar reversa de uma sequência de ácidos nucleicos estão incluídas por qualquer referência à sequência de ácidos nucleicos, exceto onde explicitamente indicado em contrário (ou, de outro modo, é evidente a partir do contexto em que a sequência aparece).

DESCRIÇÃO DETALHADA I. Visão geral de diversas modalidades

[0031] A identificação de proteínas pesticidas inovadoras que po- dem controlar espécies de insetos é benéfica para sistemas de produ- ção de culturas modernos. A presente descrição fornece composições e metodologias para controlar tais pragas de insetos. Pela primeira vez, são fornecidas proteínas pesticidas inovadoras que conferem ati- vidade inseticida contra tais pragas de insetos. Além disso, são forne- cidos polinucleotídeos que codificam tais proteínas pesticidas que con- ferem atividade inseticida contra as pragas de insetos. Essas molécu- las biológicas podem ser manipuladas em cassetes de expressão gê- nica e transformadas em plantas, células vegetais, sementes de plan- tas ou partes de plantas para fornecer resistência contra pragas de insetos. Ou, as moléculas biológicas da presente descrição podem ser manipuladas em cassetes de expressão gênica que são transformados em micro-organismos como bactérias, vírus, levedura ou fungos. As composições resultantes que contêm a atividade inseticida inovadora podem ser usadas para controlar uma população de pragas de inseto ou para reduzir a emergência de resistência a insetos dentro de plan- tas transgênicas. Essas composições e metodologias fornecidas na presente descrição servem para controlar tais pragas de insetos.

[0032] As pragas de insetos da Ordem dos Hemípteros – como percevejos – causam problemas econômicos significativos em plantas de cultura alimentando-se das plantas de cultura. Este comportamento resulta em danos e destruição das plantas de cultura. Além disso, es- sas pragas de insetos infestam as plantas de cultura em todo o mun- do, especialmente na América Latina. Essas pragas podem se alimen- tar de soja, tabaco, pêssegos, crucíferas, tomates, grãos pequenos, cravo vermelho e algodão. Além disso, as mesmas podem se alimen- tar de milho em casos específicos. Os percevejos, tipicamente, se ali- mentam de fluidos vegetais inserindo suas peças bucais similares a agulhas em caules, folhas ou vagens de sementes. Durante a alimen-

tação, os mesmos injetam materiais na planta para ajudar na digestão e remoção da seiva. A penetração pelas peças bucais pode causar danos físicos, similar à perfuração da planta com uma agulha fina. Uma combinação de danos mecânicos e químicos ao ponto de cres- cimento da planta pode ser responsável pela lesão e sintomas obser- vados no campo de cultura. Tipicamente, a alimentação de percevejos causa três tipos de danos. Os mesmos podem exterminar pequenas mudas, produzir plantas atrofiadas ou causar "perfilhação" (a produção de perfilhos a partir da base de plantas danificadas). Frequentemente, uma série de plantas ao longo de uma fileira pode exibir uma progres- são desses sintomas, dando uma aparência de degrau de escada (mudas mortas, plantas atrofiadas e perfilhamento). Até ao momento, apenas algumas proteínas da superfamília monalisina das toxinas de Pseudomonas foram identificadas e exemplificadas para controlar pra- gas de insetos da Ordem dos Hemípteros, como percevejos.

[0033] No entanto, o polipeptídeo IRDIG37126 da presente descri- ção fornece um membro da família monalisina inovador que comparti- lha ~80% de identidade de sequência no nível de aminoácidos com outras proteínas monalisina resistentes a insetos conhecidas publica- mente. Por exemplo, o polipeptídeo IRDIG37126 foi comparado com outras sequências de proteínas monalisina conhecidas. Verificou-se que IRDIG37126 tem 79,7% de identidade com PIP-1 (número de lis- tagem de sequência de polinucleotídeos 2 da Patente U.S. n.º 9688730) e 74,2% de identidade com a monalisina prototípica de IR- DIG22274 (n.º de acesso no GenBank WP_011534324,); ambas as moléculas foram identificadas como tendo atividade inseticida contra espécie de Hemípteros, como o percevejo. Além disso, verificou-se que IRDIG37126 tem 80,1% de identidade com a proteína de n.º de acesso no GenBank WP_078473056.1; verificou-se que IRDIG37126 tem 80,8% de identidade com a proteína de n.º de acesso no GenBank

WP_020294695.1; verificou-se que IRDIG37126 tem 80,6% de identi- dade com a proteína de número de listagem de sequência de polinu- cleotídeos 4 da Patente de n.º U.S. 9688730; verificou-se que IR- DIG37126 tem 79,9% de identidade com a proteína de número de lis- tagem de sequência de polinucleotídeos 9 do Pedido de Patente de n.º U.S. 20170175134; verificou-se que IRDIG37126 tem 76,0% de identi- dade com a proteína de número de listagem de sequência de polinu- cleotídeos 332 da Patente de n.º U.S. 9688730; e verificou-se que IR- DIG37126 tem 77,1% de identidade com a proteína de número de lis- tagem de sequência de polinucleotídeos 82 do Pedido de Patente de n.º U.S. 20170175134. A partir desta análise bioinformática, determi- nou-se que a sequência de proteínas inovadoras de IRDIG37126 compartilhava no máximo 80,8% de identidade de sequência com uma sequência de proteínas monalisina conhecida.

[0034] A presente descrição é projetada para composições e mé- todos para controlar pragas de insetos através do uso do polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo, ou sequências de polinucleo- tídeos que codificam este polipeptídeo. Em particular, as sequências de ácidos nucleicos das modalidades são úteis para preparar plantas, composições e micro-organismos que têm atividade inseticida como conferida pelo polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. Por exemplo, o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo resulta em inibição do crescimento e mortalidade de pragas de insetos significativas. Além disso, o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo e sequências de polinucleotídeo que codificam este poli- peptídeo podem ser usados para identificar e isolar outras sequências variantes (por exemplo, homólogas ou parcialmente homólogas) que contêm atividade inseticida, e para a geração de polipeptídeo IR- DIG37126 alterado ou sequências variantes do mesmo por métodos conhecidos na técnica, como mutagênese sítio-dirigida, troca de domí-

nios ou embaralhamento de DNA. O polipeptídeo IRDIG37126 e as sequências variantes podem ser usados para controlar, inibir o cresci- mento ou exterminar pragas de insetos; como percevejos e Lagarta falsa-medideira. II. Termos e Abreviações

[0035] Ao longo da pedido, vários termos são usados. A fim de fornecer um entendimento claro e consistente do relatório descritivo e reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a esses termos, as se- guintes definições são fornecidas.

[0036] Conforme usado no presente documento, os artigos, "um", "uma" e "o/a" incluem referências ao plural a menos que o contexto dite claramente e de modo não ambíguo de outro modo.

[0037] O termo "isolado", conforme usado no presente documento, significa ter sido removido de seu ambiente natural, ou removido de outros compostos presentes quando o composto é formado inicialmen- te. O termo "isolado" abrange materiais isolados de fontes naturais, assim como materiais (por exemplo, ácidos nucleicos e proteínas) re- cuperados após a preparação por expressão recombinante em uma célula hospedeira, ou compostos quimicamente sintetizados, como moléculas de ácido nucleico, proteínas e peptídeos.

[0038] O termo "purificado", conforme usado no presente docu- mento, se refere ao isolamento de uma molécula ou composto em uma forma que é substancialmente livre de contaminantes normalmente associados à molécula ou composto em um ambiente nativo ou natu- ral, ou substancialmente enriquecido em concentração em relação a outros compostos presentes quando o composto é formado inicialmen- te, e meios que aumentaram em pureza como resultado de serem se- parados de outros componentes da composição original. O termo "áci- do nucleico purificado" é usado no presente documento para descrever uma sequência de ácidos nucleicos que foi separada, produzida sepa-

rada de ou purificada distante de outros compostos biológicos incluin- do, mas sem limitação, polipeptídeos, lipídeos e carboidratos, enquan- to efetua uma mudança química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser purificado de um cromossomo removendo-se os contaminantes de proteína e rompendo ligações químicas que conectam o ácido nucleico ao DNA restante no cromos- somo).

[0039] O termo "sintético", conforme usado no presente documen- to, se refere a uma molécula de polinucleotídeo (isto é, um DNA ou RNA) que foi criada por meio de síntese química como um processo in vitro. Por exemplo, um DNA sintético pode ser criado durante uma re- ação em um tubo Eppendorf™, de modo que o DNA sintético seja en- zimaticamente produzido a partir de uma fita nativa de DNA ou RNA. Outros métodos de laboratório podem ser utilizados para sintetizar uma sequência de polinucleotídeos. Os oligonucleotídeos podem ser quimicamente sintetizados em um sintetizador oligo por meio de sínte- se de fase sólida com o uso de fosforamiditas. Os oligonucleotídeos sintetizados podem ser recozidos entre si como um complexo, produ- zindo assim um polinucleotídeo "sintético". Outros métodos para sinte- tizar quimicamente um polinucleotídeo são conhecidos na técnica, e podem ser prontamente implementados para uso na presente descri- ção.

[0040] O termo "cerca de", conforme usado no presente documen- to, significa maior ou menor do que o valor ou faixa de valores decla- rado em 10 por cento, mas não é destinado a designar qualquer valor ou faixa de valores apenas dentro de essa definição mais ampla. Cada valor ou faixa de valores precedido pelo termo "cerca de" também é destinado a abranger a modalidade do valor absoluto ou faixa de valo- res declarado.

[0041] Para os propósitos da presente descrição, um "gene" inclui uma região de DNA que codifica um produto de gene (consultar infra), assim como todas as regiões de DNA que regulam a produção do pro- duto de gene, caso tais sequências reguladoras sejam ou não adja- centes às sequências de codificação e/ou transcritas. Consequente- mente, um gene inclui, porém não está necessariamente limitado a, sequências promotoras, terminadores, sequências reguladoras de tra- dução, como sítios de ligação de ribossomo e sítios de entrada de ri- bossomo internos, intensificadores, silenciadores, isoladores, elemen- tos de limiar, origens de replicação, sítios de ligação de matriz, íntrons e regiões de controle de locus.

[0042] Conforme usado no presente documento, os termos "nati- vo" ou "natural" definem uma condição encontrada na natureza. Uma "sequência de DNA nativa" é uma sequência de DNA presente na na- tureza que foi produzida por meios naturais ou técnicas de reprodução tradicionais, mas não gerada por modificação genética (por exemplo, com o uso de biologia molecular/técnicas de transformação).

[0043] Conforme usado no presente documento, um "transgene" é definido como uma sequência de ácido nucleico que codifica um pro- duto de gene, incluindo, por exemplo, mas sem limitação, um mRNA. Em uma modalidade, o transgene/sequência de codificação heteróloga é um ácido nucleico exógeno, em que o transgene/sequência de codi- ficação heteróloga foi introduzida em uma célula hospedeira por mani- pulação genética (ou a progênie da mesma) em que o transge- ne/sequência de codificação heteróloga não é normalmente encontra- do. Em um exemplo, um transgene/sequência de codificação heterólo- ga codifica um composto industrialmente ou farmaceuticamente útil, ou um gene que codifica um traço agrícola desejável (por exemplo, um gene de resistência a herbicida). Em ainda outro exemplo, um trans- gene/sequência de codificação heteróloga é uma sequência de ácidos nucleicos antissenso, em que a expressão da sequência de ácidos nu-

cleicos antissenso inibe a expressão de uma sequência de ácidos nu- cleicos alvo. Em uma modalidade, o transgene/sequência de codifica- ção heteróloga é um ácido nucleico endógeno, em que cópias genômi- cas adicionais do ácido nucleico endógeno são desejáveis, ou um áci- do nucleico que está na orientação antissenso em relação à sequência de um ácido nucleico alvo em um organismo hospedeiro.

[0044] Conforme usado no presente documento, "sequência de codificação de DNA heteróloga" significa qualquer sequência de codifi- cação diferente daquela que codifica naturalmente a proteína de IR- DIG37126 ou qualquer homólogo/variante da proteína de IRDIG37126 expressa. O termo "heterólogo" é usado no contexto desta descrição para qualquer combinação de sequências de ácidos nucleicos que não são normalmente encontradas intimamente associadas na natureza.

[0045] Um "produto de gene", conforme definido no presente do- cumento, é qualquer produto produzido pelo gene. Por exemplo, o produto de gene pode ser o produto de transcrição direto de um gene (por exemplo, mRNA, tRNA, rRNA, RNA antissenso, RNA de interfe- rência, ribozima, RNA estrutural ou qualquer outro tipo de RNA) ou uma proteína produzida por tradução de um mRNA. Os produtos de gene também incluem RNA que são modificados, por processos, como capeamento, poliadenilação, metilação, e edição, e proteínas modifi- cadas por, por exemplo, metilação, acetilação, fosforilação, ubiquitina- ção, ADP-ribosilação, miristilação e glicosilação. A expressão de gene pode ser influenciada por sinais externos, por exemplo, exposição de uma célula, tecido, ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão de gene. A expressão de um gene também pode ser re- gulada em qualquer parte da via desde DNA a RNA a proteína. A regu- lação de expressão de gene ocorre, por exemplo, através de controles que atuam na transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias, como mRNA, ou atra-

vés da ativação, desativação, compartimentalização, ou degradação de moléculas de proteína específicas após terem sido feitas, ou por combinações das mesmas. A expressão de gene pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot, ou ensaio(s) de atividade de proteína in vitro, in situ ou in vivo.

[0046] Conforme usado no presente documento, o termo "expres- são de gene" se refere ao processo pelo qual as informações codifica- das de uma unidade de transcrição de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA genômico) são convertidas em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, incluindo frequentemente a síntese de uma proteína. A expressão de gene pode ser influenciada por sinais externos, por exemplo, exposição de uma célula, tecido, ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão de gene. A expressão de um gene também pode ser regulada em qualquer par- te da via desde DNA a RNA a proteína. A regulação de expressão de gene ocorre, por exemplo, através de controles que atuam na transcri- ção, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias, como mRNA, ou através da ativação, desa- tivação, compartimentalização, ou degradação de moléculas de prote- ína específicas após terem sido feitas, ou por combinações das mes- mas. A expressão de gene pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot, ou ensaio(s) de atividade de proteína in vitro, in situ ou in vivo.

[0047] Conforme usado no presente documento, o termo "molécu- la de ácido nucleico" (ou "ácido nucleico" ou "polinucleotídeo") pode se referir a uma forma polimérica de nucleotídeos, a qual pode incluir tan- to fitas senso quanto antissenso de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas e polímeros misturados do supracitado. Um nucleotí-

deo pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma "molécula de ácido nucleico", conforme usado no presente documento, é sinôni- mo de "ácido nucleico" e "polinucleotídeo". A molécula de ácido nuclei- co tem normalmente pelo menos 10 bases em comprimento, a menos que especificado de outro modo. O termo pode se referir a uma molé- cula de RNA ou DNA de comprimento indeterminado. O termo inclui formas de fita simples e dupla de DNA. Uma molécula de ácido nuclei- co pode incluir qualquer um dentre ou ambos os nucleotídeos de ocor- rência natural e modificados ligados entre si por ligações de nucleotí- deo de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural.

[0048] As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente, ou podem conter bases de nucleo- tídeo não natural ou derivadas, assim como serão prontamente obser- vadas por aqueles versados na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, identificações, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações in- ternucleotídeo (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosforamiditas, carbamatos, etc.; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; porções químicas pendentes: por exemplo, peptídeos; intercala- dores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; quelantes; alquilantes; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de fita simples, de fita dupla, parcialmente duplexadas, triplexadas, em formato de gram- po, circulares e de cadeado.

[0049] A transcrição avança de maneira 5ʹ a 3ʹ ao longo de uma fita de DNA. Isso significa que RNA é feito pela adição sequencial de ribonucleotídeo-5ʹ-trifosfatos à terminação 3ʹ da cadeia crescente (com uma eliminação necessária do pirofosfato). Em uma molécula de ácido nucleico linear ou circular, os elementos distintos (por exemplo, se- quências de nucleotídeo particulares) podem ser denominados "a montante" ou "5ʹ " em relação a um elemento adicional se forem liga- dos ou seriam ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 5ʹ daquele elemento. De modo similar, os elementos distintos podem estar "a ju- sante" ou "3ʹ" em relação a um elemento adicional se forem ou seriam ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 3ʹ desse elemento.

[0050] Uma "posição" de base, conforme usado no presente do- cumento, se refere à localização de um dado resíduo de nucleotídeo ou base em um ácido nucleico designado. O ácido nucleico designado pode ser definido por alinhamento (consultar abaixo) com um ácido nucleico de referência.

[0051] A hibridização se refere à ligação de duas fitas de polinu- cleotídeo por meio de ligações de hidrogênio. Os oligonucleotídeos e seus análogos hibridizam por ligação de hidrogênio, as quais incluem ligação de hidrogênio Watson-Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen reversa, entre bases complementares. Em geral, as moléculas de ácido nuclei- co consistem em bases nitrogenosas que são pirimidinas (citosina (C), uracila (U), e timina (T)) ou purinas (adenina (A) e guanina (G)). Essas bases nitrogenosas formam ligações de hidrogênio entre uma pirimidi- na e uma purina, e a ligação da pirimidina à purina é denominada "pa- reamento de base." Mais especificamente, A fará ligação de hidrogê- nio com T ou U, e G se ligará a C. "Complementar" se refere ao pare- amento de base que ocorre entre duas sequências de ácido nucleico distintas ou duas regiões distintas da mesma sequência de ácidos nu- cleicos.

[0052] "Especificamente hibridizável" e "especificamente comple- mentar" são termos que indicam um grau suficiente de complementari- dade de modo que a ligação estável e específica ocorra entre o oligo-

nucleotídeo e o alvo de DNA ou RNA. O oligonucleotídeo não precisa ser 100% complementar à sua sequência alvo para ser especificamen- te hibridizável. Um oligonucleotídeo é especificamente hibridizável quando a ligação do oligonucleotídeo à molécula de DNA ou RNA alvo interfere com a função normal do DNA ou RNA alvo, e há grau sufici- ente de complementaridade para evitar a ligação não específica do oligonucleotídeo a sequências não alvo sob condições em que a liga- ção específica é desejável, por exemplo, sob condições fisiológicas no caso de ensaios ou sistemas in vivo. Tal ligação é denominada como uma hibridização específica.

[0053] As condições de hibridização que resultam em graus parti- culares de estringência variarão dependendo da natureza do método de hibridização escolhido e a composição e comprimento das sequên- cias de ácido nucleico de hibridização. Em geral, a temperatura de hi- bridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg2+) do tampão de hibridização contribuirá para a estringência de hibridização, embora tempos de lavagem também influenciem a es- tringência. Os cálculos em relação às condições de hibridização ne- cessárias para alcançar graus particulares de estringência são discuti- dos em Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manu- al, 2.ª edição, volumes 1 a 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989, capítulos 9 e 11.

[0054] Conforme usado no presente documento, "condições es- tringentes" abrangem condições sob as quais a hibridização ocorrerá apenas se houver menos do que 50% de divergência entre a molécula de hibridização e o alvo de DNA. "Condições estringentes" incluem ainda níveis particulares de estringência. Desse modo, conforme usa- do no presente documento, condições de "estringência moderada" são aquelas sob as quais as moléculas com mais do que 50% de diver- gência de sequência não hibridizarão; as condições de "alta estringên-

cia" são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 20% de divergência não hibridizarão; e condições de "estringência muito alta" são aquelas sob as quais as sequências com mais do que 10% de di- vergência não hibridizarão.

[0055] Em modalidades particulares, as condições estringentes podem incluir hibridização a 65 °C, seguida por lavagens a 65 °C com SSC 0,1x/SDS 0,1% por 40 minutos.

[0056] As seguintes são condições de hibridização não limitantes representativas: Estringência Muito Alta: A hibridização em tampão SSC 5x a 65 °C por 16 horas; foi duas vezes em tampão SSC 2x à temperatura ambiente por 15 minutos cada um; e lavar duas vezes em tampão SSC 0,5x a 65°C por 20 minutos cada um. Estringência Alta: A hibridização em tampão SSC 5x a 6x a 65 a 70 °C por 16 a 20 ho- ras; lavar duas vezes em tampão SSC 2x à temperatura ambiente por 5 a 20 minutos cada uma; e lavar duas vezes em tampão SSC 1x a 55 a 70 °C por 30 minutos cada um. Estringência Moderada: Hibridização em tampão SSC 6x à temperatura ambiente a 55 °C por 16 a 20 horas; lavar pelo menos duas vezes em tampão SSC 2x a 3x à temperatura ambiente a 55 °C por 20 a 30 minutos cada um.

[0057] Em modalidades particulares, moléculas de ácido nucleico especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condi- ções de hibridização de estringência muito alta. Nessas e em modali- dades adicionais, moléculas de ácido nucleico especificamente hibridi- záveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de estringência alta. Nessas e em modalidades adicionais, moléculas de ácido nucleico especificamente hibridizáveis podem permanecer liga- das sob condições de hibridização de estringência moderada.

[0058] Conforme usado no presente documento, o termo "oligonu- cleotídeo" se refere a um polímero de ácido nucleico curto. Os oligo- nucleotídeos podem ser formados por clivagem de segmentos de áci-

do nucleico mais longos, ou por polimerização de precursores de nu- cleotídeo individual. Os sintetizadores automatizados permitem a sín- tese de oligonucleotídeos até diversas centenas de pares de bases em comprimento. Devido ao fato de que os oligonucleotídeos podem se ligar a uma sequência de nucleotídeos complementar, os mesmos po- dem ser usados como sondas para detectar DNA ou RNA. Os oligonu- cleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser usados em PCR, uma técnica para a amplificação de sequências de DNA pequenas. Em PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente deno- minado como "iniciador", o qual permite que uma DNA polimerase es- tenda o oligonucleotídeo e replique a fita complementar.

[0059] Os termos "porcentagem de identidade de sequência" ou "porcentagem de identidade" ou "identidade" são usados de modo in- tercambiável para se referir a uma comparação de sequência com ba- se em correspondências idênticas entre posições consequentemente idênticas nas sequências comparadas entre duas ou mais sequências de aminoácidos ou nucleotídeo. A porcentagem de identidade se refe- re à extensão em que duas sequências de polinucleotídeo ou peptídeo alinhadas de modo otimizado são invariáveis ao longo de uma janela de alinhamento de componentes, por exemplo, nucleotídeos ou ami- noácidos. Os experimentos de hibridização e algoritmos matemáticos conhecidos na técnica podem ser usados para determinar a porcenta- gem de identidade. Muitos algoritmos matemáticos existem como pro- gramas de computador de alinhamento de sequência conhecidos na técnica que calculam a porcentagem de identidade. Esses programas podem ser categorizados como programas de alinhamento de sequên- cia globais ou programas de alinhamento de sequência locais.

[0060] Os programas de alinhamento de sequência globais calcu- lam a porcentagem de identidade de duas sequências por comparação de alinhamentos de extremidade a extremidade a fim de encontrar cor-

respondências exatas, dividindo o número de correspondências exatas pelo comprimento das sequências mais curtas, e, então, multiplicando- se por 100. Basicamente, a porcentagem de nucleotídeos idênticos em uma sequência de polinucleotídeos linear de uma molécula de polinu- cleotídeo de referência ("consulta") em comparação com uma molécu- la de polinucleotídeo de teste ("assunto") quando as duas sequências são alinhadas de modo otimizado (com inserções, deleções ou lacu- nas de nucleotídeo apropriadas).

[0061] Os programas de alinhamento de sequência locais são si- milares em seu cálculo, mas apenas comparam fragmentos alinhados das sequências em vez de utilizar uma análise de extremidade-a- extremidade. Os programas de alinhamento de sequência locais, como BLAST podem ser usados para comparar regiões específicas de duas sequências. Uma comparação de BLAST de duas sequências resulta em um valor E, ou valor de expectativa, que representa o número de alinhamentos diferentes com pontuações equivalentes a ou melhores do que a pontuação de alinhamento bruta, S, que se espera que ocor- ram em uma busca de banco de dados ao acaso. Quanto mais baixo o valor E, mais significativa a correspondência. Devido ao fato de que o tamanho de banco de dados é um elemento em cálculos de valor E, valores E obtidos por BLASTing em relação a bancos de dados públi- cos, como GENBANK, em geral, aumentaram ao longo do tempo para qualquer determinada correspondência de consulta/entrada. Em crité- rios de definição para segurança de previsão de função de polipeptí- deo, uma "alta" correspondência de BLAST é considerada no presente documento como tendo um valor E para o acerto de BLAST superior de menos do que 1E-30; um valor E de BLASTX médio é 1E-30 a 1E- 8; e um valor E de BLASTX baixo é maior que 1E-8. A atribuição de função de proteína na presente descrição é determinada com o uso de combinações de valores E, porcentagem de identidade, cobertura de consulta e cobertura de acerto. A cobertura de consulta se refere à porcentagem da sequência de consulta que é representada no alinha- mento de BLAST. A cobertura de acerto se refere à porcentagem da entrada de banco de dados que é representada no alinhamento de BLAST. Em uma modalidade da descrição, a função de um polipeptí- deo de consulta é inferida a partir da função de um sequência de pro- teína conservada em que ou (1) hit_p<1e-30 ou % de identidade >35% E query_coverage >50% E hit_coverage >50%, ou (2) hit_p<1e-8 E query_coverage >70% E hit_coverage >70%.

[0062] Os métodos para alinhar as sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Diversos programas e algoritmos de alinhamento são descritos. Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo de porcentagem de identidade entre duas sequên- cias de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso de um programa de alinhamento AlignX do pacote Vector NTI (Invitrogen, Carlsbad, CA). O programa de alinhamento AlignX é um programa de alinhamento de sequência global para polinucleotídeos ou proteínas. Em uma modali- dade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa MegAlign do pacote de computação de bioin- formática LASERGENE (MegAlign™ (©1993-2016). DNASTAR. Madi- son, WI). O programa MegAlign é um programa de alinhamento de se- quência global para polinucleotídeos ou proteínas. Em uma modalida- de, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de iden- tidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do pacote Clustal de programas de alinhamento, incluindo, po- rém, sem limitação, ClustalW e ClustalV (Higgins e Sharp (1988) Ge- ne. Dez. 15;73(1):237 a 244; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151 a 153; Higgins et al. (1992) Comput. Appl. Biosci. 8:189-91). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoáci- do com o uso do pacote BLAST de programas de alinhamento, por exemplo, porém, sem limitação, BLASTP, BLASTN, BLASTX, etc. (Al- tschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403 a 410). Outros exemplos de tais programas de alinhamento BLAST incluem Gapped-BLAST ou PSI-BLAST (Altschul et al., 1997). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre du- as sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do paco- te de EMBOSS de programas de alinhamento, incluindo, porém, sem limitação: Matcher, Needle, Stretcher, Water, Wordmatch, etc. (Rice, P., Longden, I. & Bleasby, A. EMBOSS: The European Molecular Bio- logy Open Software Suite. Trends in Genetics 16(6) 276 a 277 (2000)). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequências de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de alinhamento Gap de Ne- edleman e Wunsch (Needleman e Wunsch, Journal of Molecular Bio- logy 48:443 a 453, 1970). Em uma modalidade, a presente descrição se refere ao cálculo da porcentagem de identidade entre duas sequên- cias de polinucleotídeos ou aminoácido com o uso do programa de ali- nhamento BestFit de Smith e Waterman (Smith e Waterman, Advan- ces in Applied Mathematics, 2:482 a 489, 1981, Smith et al., Nucleic Acids Research 11:2205 a 2220, 1983). Esses programas produzem alinhamentos de múltiplas sequências biologicamente significativos de sequências divergentes. Os alinhamentos de melhor correspondência calculados para as sequências selecionadas são alinhados de modo que identidades, similaridades e diferenças possam ser observadas.

[0063] O termo "similaridade" se refere a uma comparação entre sequências de aminoácidos e leva em consideração não só aminoáci- dos idênticos em posições correspondentes, mas também aminoáci- dos de funcionalidade similar em posições correspondentes. Desse modo, similaridade entre sequências de polipeptídeos indica similari- dade funcional, além de similaridade de sequência.

[0064] O termo "homologia" é, algumas vezes, usado para se refe- rir ao nível de similaridade entre duas ou mais sequências de aminoá- cidos ou ácidos nucleicos em termos de porcentagem de identidade posicional (isto é, similaridade de sequência ou identidade). Homologia também se refere ao conceito de relação evolucionária, em geral, evi- denciada por propriedades funcionais similares dentre diferentes áci- dos nucleicos ou proteínas que compartilham sequências similares.

[0065] Conforme usado no presente documento, o termo "varian- tes" significa sequências substancialmente similares. Para sequências de nucleotídeos, variantes de ocorrência natural podem ser identifica- das com o uso de técnicas de biologia molecular bastante conhecidas, tais como, por exemplo, com técnicas de reação em cadeia de polime- rase (PCR) e de hibridização conforme delineado no presente docu- mento.

[0066] Para as sequências de nucleotídeos, uma variante compre- ende uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios internos dentro do polinucleotídeo nativo e/ou uma substi- tuição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios no polinucle- otídeo nativo. Conforme usado no presente documento, uma sequên- cia de nucleotídeos "nativa" compreende uma sequência de nucleotí- deos de ocorrência natural. Para sequências de nucleotídeos, as vari- antes de ocorrência natural podem ser identificadas com o uso de téc- nicas de biologia molecular bem conhecidas, como, por exemplo, com técnicas de reação em cadeia da polimerase (PCR) e hibridização, conforme delineado abaixo. As sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos sinteticamente deriva- das, como aquelas geradas, por exemplo, usando-se mutagênese de local direcionado. Geralmente, as variantes de uma sequência de nu-

cleotídeos particular da descrição terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de se- quência com aquela sequência de nucleotídeos particular conforme determinado por programas de alinhamento de sequência e parâme- tros descritos em outro local no presente documento. Uma variante biologicamente ativa de uma sequência de nucleotídeos da descrição pode diferir daquela sequência desde 1 a 15 resíduos de ácido nuclei- co, desde 1 a 10, como 6 a 10, desde 5, desde 4, 3, 2, ou até mesmo 1 resíduo de ácido nucleico.

[0067] Conforme usado no presente documento, o termo "ligado operacionalmente" se refere a uma primeira sequência de ácidos nu- cleicos que é ligada operacionalmente a uma segunda sequência de ácidos nucleicos quando a primeira sequência de ácidos nucleicos es- tá em uma relação funcional com a segunda sequência de ácidos nu- cleicos. Por exemplo, um promotor é ligado operacionalmente a uma sequência de codificação quando o promotor afeta a transcrição ou expressão da sequência de codificação. Quando produzidas de modo recombinante, sequências de ácidos nucleicos ligadas operacional- mente são geralmente contíguas e, quando necessário, para unir duas regiões de codificação de proteína, no mesmo quadro de leitura. No entanto, os elementos não precisam ser contíguos para serem ligados operacionalmente.

[0068] Como usado no presente documento, o termo "oralmente ativo" refere-se a uma proteína que inibe a proliferação de pragas de insetos quando oralmente ingerida pela praga de insetos.

[0069] Como usado no presente documento, o termo "atividade inseticida" refere-se à atividade de um organismo ou uma substância (como, por exemplo, uma proteína) que pode ser medida por, porém sem limitação, mortalidade de insetos, perda de peso de insetos, repe-

lência de insetos e outras alterações comportamentais e físicas de um inseto após alimentação e exposição durante um período de tempo apropriado. Deste modo, um organismo ou substância com atividade inseticida influencia adversamente pelo menos um parâmetro mensu- rável da condição dos insetos.

[0070] Como usado no presente documento, o termo "praga" refe- re-se a qualquer inseto que seja indesejável, e prejudicial ou destrutivo para o crescimento e desenvolvimento de culturas agrícolas. O termo "praga de insetos" inclui, porém sem limitação, insetos, fungos, bacté- rias, nematódeos, ácaros, carrapatos e similares. Pragas de insetos incluem insetos selecionados dentre as ordens Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichop- tera, etc., particularmente Lepidoptera e Hemiptera.

[0071] Como usado no presente documento, o termo "transforma- ção estável" ou "transformado de maneira estável" pretende significar que a construção de nucleotídeo introduzida em uma planta se integra no genoma da planta e é capaz de ser herdada pela descendência da mesma. "Transformação transiente" pretende significar que um polinu- cleotídeo é introduzido na planta e não se integra no genoma da planta ou um polipeptídeo é introduzido em uma planta. Por "planta" entende- se plantas inteiras, órgãos de plantas (por exemplo, folhas, caules, raí- zes, etc.), sementes, células de plantas, propágulos, embriões e des- cendência dos mesmos. As células de planta podem ser diferenciadas ou não diferenciadas (por exemplo, calo, células de cultura em sus- pensão, protoplastos, células de folha, células de raiz, células de floe- ma e pólen).

[0072] Como usado no presente documento, o termo "regenera- ção" significa o processo de cultivar uma planta a partir de uma célula vegetal (por exemplo, protoplasto vegetal ou explante).

[0073] Como usado no presente documento, o termo "cultivo" refe- re-se à propagação in vitro de células ou organismos ou em meios de vários tipos de modo que a manutenção ou crescimento celular dentro de um meio de cultura líquido seja controlado sob um conjunto de condições físicas. Entende-se que os descendentes de uma célula cul- tivada em cultura podem não ser completamente idênticos (isto é, mor- fologicamente, geneticamente ou fenotipicamente) à célula progenito- ra.

[0074] Como usado no presente documento, o termo "controlar" (por exemplo, como em "controlar uma população de pragas de inse- tos"), como usado no presente documento refere-se a monitorar, tratar, minimizar, exterminar ou prevenir pragas de insetos como percevejos. Em casos específicos, as espécies de insetos são controladas para reduzir o número de insetos que causam redução do rendimento bené- fico de plantas.

[0075] Como usado no presente documento, o termo "quantidade eficaz como inseticida" refere-se a uma quantidade de uma substância ou organismo que tem atividade inseticida quando presente no ambi- ente de uma praga de insetos. Para cada substância ou organismo, a quantidade eficaz como inseticida é determinada empiricamente para cada praga afetada em um ambiente específico. De modo similar, uma "quantidade eficaz como pesticida" pode ser usada para se referir a uma quantidade eficaz como inseticida.

[0076] Como usado no presente documento, o termo "proteína pesticida" ou "proteína inseticida" pretende se referir a um polipeptídeo que tem atividade tóxica contra uma ou mais pragas, incluindo, mas sem limitação, membros das ordens Lepidóptera, Diptera, Hemiptera e Coleóptera ou do filo Nematoda ou uma proteína que tem homologia com tal proteína. Proteínas pesticidas foram isoladas de organismos, incluindo, por exemplo, Bacillus sp., Pseudomonas sp., Photorhabdus sp., Xenorhabdus sp., Clostridium bifermentans e Paenibacillus popil- liae.

As proteínas pesticidas incluem, porém sem limitação: proteínas inseticidas de Pseudomonas sp. tal como PSEEN3174 (Monalysin, (2011) PLoS Pathogens, 7:1-13), de Pseudomonas protegens cepas CHA0 e Pf-5 (anteriormente fluorescens) (Pechy-Tarr, (2008) Envi- ronmental Microbiology 10:2368 a 2386: n.º de Acesso no GenBank EU400157); de Pseudomonas taiwanensis (Liu, et al., (2010) J.

Agric.

Food Chem. 58:12343-12349) e de Pseudomonas pseudoalcligenes (Zhang, et al., (2009) Annals of Microbiology 59:45-50 e Li, et al., (2007) Plant Cell Tiss.

Organ Cult. 89:159-168); proteínas inseticidas de Photorhabdus sp. e Xenorhabdus sp. (Hinchliffe, et al., (2010) The Open Toxinology Journal 3:101-118 e Morgan, et al., (2001) Applied and Envir.

Micro. 67:2062-2069), Pat n.º U.S. 6.048.838 e a Patente n.º U.S. 6.379.946; e δ-endotoxinas.

Exemplos de δ-endotoxinas ou proteínas Cry são bem conhecidos por um versado na técnica (consul- tar Crickmore, et al., "Bacillus thuringiensis toxin nomenclature" (2011), em lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/ que pode ser aces- sado na rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). A atividade inseticida de proteínas Cry é bem conhecida por uma pes- soa versada na técnica (para análise, consultar van Frannkenhuyzen, (2009) J.

Invert.

Path. 101:1-16). O uso de proteínas Cry como traços de planta transgênica é bem conhecido por um indivíduo versado na técnica e plantas transgênicas Cry incluindo, mas sem limitação, Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-Bt receberam a aprovação regulatória (consultar Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283- 300 e CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. em cera-gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). Mais de uma proteína pesticida bem conhecida por um indiví- duo versado na técnica também pode ser expressa em plantas como Vip3Ab e Cry1Fa (US2012/0317682), Cry1BE e Cry1F (US2012/0311746), Cry1CA e Cry1AB (US2012/0311745), Cry1F e CryCa (US2012/0317681), Cry1DA e Cry1BE (US2012/0331590), Cry1DA e Cry1Fa (US2012/0331589), Cry1AB e Cry1BE (US2012/0324606) e Cry1Fa e Cry2Aa, Cry1I ou Cry1E (US2012/0324605). As proteínas pesticidas também incluem lipases inseticidas incluindo acil hidrolases lipídicas da Patente n.º U.S.

7.491.869, e colesterol oxidases como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413). As proteínas pesticidas também incluem toxinas VIP (proteínas inseticidas vegetati- vas) das Patentes n.os U.S. 5.877.012, 6.107.279, 6.137.033,

7.244.820, 7.615.686 e 8.237.020, e similares. Outras proteínas VIP são bem conhecidas por um versado na técnica (consultar lifes- ci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html que pode ser aces- sado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). As proteínas pesticidas também incluem proteínas de comple- xo de toxina (TC), obteníveis a partir de organismos, como Xenorhab- dus, Photorhabdus e Paenibacillus (consultar as Patentes números U.S. 7.491.698 e 8.084.418). Algumas proteínas TC têm atividade in- seticida "autônoma" e outras proteínas TC melhoram a atividade das toxinas autônomas produzidas pelo mesmo dado organismo. A toxici- dade de uma proteína TC "independente" (de Photorhabdus, Xe- norhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser aumentada por um ou mais "potenciadores" de proteína TC derivados de um organismo- fonte de um gênero diferente. Há três tipos principais de proteínas TC. Conforme referido no presente documento, as proteínas de Classe A ("Proteína A") são toxinas autônomas. As proteínas de Classe B ("Pro-

teína B") e as proteínas de Classe C ("Proteína C") melhoram a toxici- dade das proteínas de Classe A. Os exemplos de proteínas de Classe A são TcbA, TcdA, XptA1 e XptA2. Os exemplos de proteínas de Clas- se B são TcaC, TcdB, XptB1Xb e XptC1Wi. Os exemplos de proteínas de Classe C são TccC, XptC1Xb e XptB1Wi. As proteínas pesticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e escorpião. Os exemplos de peptídeos de veneno de aranha incluem, mas sem limitação, peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (Patente n.o US 8.334.366).

[0077] Como usado no presente documento, o termo "inibir o cres- cimento" ou "inibição do crescimento" significa uma redução ou inibi- ção no crescimento de um organismo de inseto, em algumas modali- dades, em pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95%. A inibição de crescimento de inseto pode ser determinada mediante a medição do peso ou tamanho do inseto.

[0078] Como usado no presente documento, o termo "mortalidade" refere-se ao extermínio dos insetos.

[0079] Como usado no presente documento, o termo "resistente", "resistência" e "resistência de plantas hospedeiras" refere-se à capaci- dade de uma planta hospedeira para prevenir ou reduzir a infestação e danos de uma praga dentre o grupo que compreende insetos, nema- tódeos, patógenos, fungos, vírus e doenças.

[0080] Como usado no presente documento, o termo "produto transgênico com resistência a insetos", pode significar um "pesticida", um "Bt" ou "polipeptídeo de Bt" em que o protetor de planta é uma pro- teína, ou uma variante da mesma, derivado de Bacillus thuringiensis, um "não-Bt" ou "polipeptídeo não-Bt", em que o protetor é uma proteí- na, ou uma variante da mesma, derivado de uma bactéria diferente de Bacillus thuringiensis ou uma planta, particularmente de um feto ou outra planta primitiva, ou "RNA" em que o protetor de planta é uma molécula de RNA, particularmente um RNAi ou dsRNA. Os produtos inseticidas transgênicos podem ser expressos a partir de um evento transgênico que compreende um transgene que codifica um traço de resistência a inseto transgênica.

[0081] Como usado no presente documento, o termo "proteger" refere-se a evitar ou minimizar a quantidade de ataque da planta por uma praga do solo a um ponto em que não mais represente uma ame- aça à vitalidade da planta, morte seletiva da planta, perda de qualida- de e/ou rendimento reduzido.

[0082] Como usado no presente documento, o termo "campo de cultura" se refere a uma extensão de terra cultivada que um agricultor usa para cultivar uma espécie de cultura. Um campo de cultura varia em tamanho dependendo da espécie de cultura e do propósito. Em um exemplo, um campo de cultura pode incluir fileiras e pode ser plantado em vários comprimentos. Em um outro exemplo, um campo de cultura pode ser plantado espalhando a semente em todo o campo de cultura. Em um exemplo adicional, um campo de cultura pode ser plantado perfurando a semente em todo o campo de cultura.

[0083] Como usado no presente documento, o termo "modos de ação" significa o meio biológico ou bioquímico por meio do qual uma estratégia de controle de pragas ou composto inibe a alimentação de pragas e/ou aumenta a mortalidade de pragas.

[0084] Como usado no presente documento, o termo "coexpres- sar" refere-se a dois ou mais produtos genéticos que são produzidos ao mesmo tempo no mesmo organismo hospedeiro.

[0085] Como usado no presente documento, o termo "degenerar" refere-se a um ácido nucleico iniciador ou sonda em que determinadas posições não são definidas por um único nucleotídeo específico. Des- sa forma, em tal posição degenerada, a sequência iniciadora ou de sonda pode ser qualquer uma dentre pelo menos dois nucleotídeos diferentes. Tais posições geralmente representam uma diferença em genótipos do ácido nucleico alvo. Uma sequência degenerada também pode ser representada como uma mistura de múltiplas sequências in- dividuais não-degeneradas que, para o propósito desta descrição, dife- rem em pelo menos duas posições.

[0086] Como usado no presente documento, o termo "fragmento enzimaticamente ativo", "fragmento" ou "porção biologicamente ativa" incluem fragmentos de polipeptídeo que compreendem sequências de aminoácidos suficientemente idênticas a um polipeptídeo e que exi- bem atividade inseticida. "Fragmentos" ou "porções biologicamente ativas" incluem fragmentos de polipeptídeo que compreendem se- quências de aminoácidos suficientemente idênticas à sequência de aminoácidos que exibe atividade inseticida. Uma porção biologicamen- te ativa de um polipeptídeo pode ser um polipeptídeo que tem, por exemplo, 8, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250 ou mais aminoácidos de comprimento. Tais porções biologicamente ativas podem ser prepara- das por técnicas recombinantes e avaliadas em relação à atividade inseticida. Conforme usado no presente documento, um fragmento compreende pelo menos 8 aminoácidos contíguos de um polipeptídeo. As modalidades abrangem outros fragmentos, entretanto, como qual- quer fragmento na proteína maior que cerca de 10, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 250 ou mais aminoácidos.

[0087] Como usado no presente documento, o termo "segmento peptídico" refere-se a uma molécula de proteína que foi isolada livre de outras sequências de proteínas e de resíduos de aminoácidos.

[0088] Como usado no presente documento, o termo "segmento de DNA" refere-se a uma molécula de DNA que foi isolada livre de DNA genômico total de uma espécie específica. Portanto, um segmen- to de DNA que codifica uma proteína ou peptídeo refere-se a um seg-

mento de DNA que contém sequências de codificação de proteína ain- da assim é isolado de, ou purificado livre de, DNA genômico total da espécie a partir da qual o segmento de DNA é obtido, que no presente caso é o genoma do gênero de bactérias Gram-positivas, Bacillus, e em particular, a espécie conhecida como B. thuringiensis. Incluídos dentro do termo "segmento de DNA", estão segmentos de DNA e fra- gmentos menores de tais segmentos, e também vetores recombinan- tes, incluindo, por exemplo, plasmídeos, cosmídeos, fagomídeos, fago, vírus, e similares.

[0089] Como usado no presente documento, o termo "proteína in- seticida formulada" refere-se a uma proteína inseticida purificada ou isolada que foi expressa ou colocada em uma composição sintética adequada para aplicações agrícolas, incluindo, porém sem limitação, plantas transgênicas, formulações líquidas pulverizáveis, formulações sólidas em pó ou formulações granulares.

[0090] Como usado no presente documento, o termo "expressão" refere-se à combinação de processos intracelulares, incluindo transcri- ção e tradução à qual uma molécula de DNA codificante como um ge- ne estrutural foi submetida para produzir um polipeptídeo.

[0091] Como usado no presente documento, o termo "célula trans- gênica" significa qualquer célula derivada ou regenerada de uma célu- la transformada ou derivada de uma célula transgênica. As células transgênicas exemplificadoras incluem calos vegetais derivados de uma célula vegetal transformada e células específicas, como folha, raiz, caule, por exemplo, células somáticas ou células reprodutivas (germinativas) obtidas de uma planta transgênica.

[0092] Como usado no presente documento, o termo "planta transgênica" significa uma planta ou progênie da mesma derivada de uma célula ou protoplasto vegetal transformado, em que o DNA da planta contém uma molécula de DNA exógena introduzida não origi-

nalmente presente em uma planta não transgênica nativa da mesma cepa. Os termos "planta transgênica" e "planta transformada", às ve- zes, foram usados na técnica como termos sinônimos para definir uma planta cujo DNA contém uma molécula de DNA exógena. Entretanto, considera-se mais cientificamente correto referir-se a uma planta ou calo regenerado obtido a partir de uma célula ou protoplasto vegetal transformado como sendo uma planta transgênica, e esse uso será seguido no presente documento.

[0093] Conforme usado no presente documento, o termo "promo- tor" se refere a uma região de DNA que geralmente está localizada a montante (em direção à região 5' de um gene) de um gene e é neces- sário para iniciar e acionar transcrição do gene. Um promotor pode permitir ativação ou repressão apropriadas de um gene que o mesmo controla. Um promotor pode conter sequências específicas que são reconhecidas por fatores de transcrição. Esses fatores podem se ligar a uma sequência de DNA de promotor, que resulta no recrutamento de polimerase de RNA, uma enzima que sintetiza RNA da região de codi- ficação do gene. O promotor geralmente se refere a todos os elemen- tos reguladores de gene localizados a montante do gene, incluindo, promotores a montante, UTR 5', íntrons e sequências líder.

[0094] Conforme usado no presente documento, o termo "promo- tor a montante" se refere a uma sequência de polinucleotídeos contí- gua que é suficiente para direcionar iniciação de transcrição. Conforme usado no presente documento, um promotor a montante abrange o sítio de iniciação de transcrição com diversos motivos de sequência, que incluem TATA Box, sequência de iniciadores, elementos de reco- nhecimento de TFIIB e outros motivos de promotor (Jennifer, E.F. et al., (2002) Genes & Dev., 16: 2583-2592). O promotor a montante for- nece o sítio de ação para polimerase de RNA II que é uma enzima de múltiplas subunidades com os fatores basais ou gerais de transcrição como, TFIIA, B, D, E, F e H. Esses fatores se agrupam em um com- plexo de pré-iniciação de transcrição que catalisa a síntese de RNA do modelo de DNA.

[0095] A ativação do promotor a montante é realizada pela se- quência adicional de elementos reguladores de sequência de DNA aos quais diversas proteínas se ligam e interagem de modo subsequente com o complexo de iniciação de transcrição para ativar expressão de gene. Essas sequências de elementos reguladores de genes intera- gem com fatores de ligação de DNA específicos. Esses motivos de sequência podem, algumas vezes, ser denominados de cis-elementos. Tais cis-elementos, aos quais fatores de transcrição específicos de desenvolvimento ou específicos de tecido se ligam, individualmente ou em combinação, podem determinar o padrão de expressão espaço- temporal de um promotor no nível de transcrição. Esses cis-elementos variam amplamente no tipo de controle que os mesmos exercem em genes ligados de maneira funcional. Alguns elementos atuam para aumentar a transcrição de genes ligados operacionalmente em respos- ta a respostas ambientais (por exemplo, temperatura, umidade e feri- mento). Outros cis-elementos podem responder a sugestões desen- volvimentais (por exemplo, germinação, maturação de semente e flo- rescimento) ou a informações espaciais (por exemplo, especificidade de tecido). Consultar, por exemplo, Langridge et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23. Esses cis-elementos estão localizados em uma distância variável de ponto de partida de transcrição, alguns cis- elementos (chamados elementos proximais) são adjacentes a uma re- gião de promotor de núcleo mínimo enquanto outros elementos podem ser posicionados diversos quilobases a montante ou a jusante do pro- motor (intensificadores).

[0096] Conforme usado no presente documento, os termos "região não traduzida 5'" ou "UTR 5'" são definidos como o segmento não tra-

duzido no terminal 5’ de pré-mRNA ou mRNA maduros. Por exemplo, em mRNA maduros, uma UTR 5' tipicamente abriga em sua extremi- dade 5' uma cap de 7-metilguanosina e é envolvida em muitos proces- sos, como splicing, poliadenilação, exportação de mRNA em direção ao citoplasma, identificação da extremidade 5' do mRNA pelo maqui- nário de tradução, e proteção dos mRNA contra degradação.

[0097] Conforme usado no presente documento, o termo "íntron" se refere a qualquer sequência de ácidos nucleicos compreendida em um gene (ou sequência de polinucleotídeos expressada de interesse) que é transcrito, mas não traduzido. Íntrons incluem sequência de áci- dos nucleicos não traduzida em uma sequência expressa de DNA, as- sim como a sequência correspondente em moléculas de RNA transcri- tas a partir da mesma. Um construto descrito no presente documento também pode conter sequências que intensificam a tradução e/ou es- tabilidade de mRNA, como íntrons. Um exemplo de tal íntron é o pri- meiro íntron de gene II da variante histona H3 de Arabidopsis thaliana ou qualquer outra sequência de íntrons comumente conhecida. Os íntrons podem ser usados em combinação com uma sequência promo- tora para intensificar a tradução e/ou estabilidade de mRNA.

[0098] Conforme usado no presente documento, os termos "termi- nador de transcrição" ou "terminador" é definido como o segmento transcrito no terminal 3' de pré-mRNA ou mRNA maduros. Por exem- plo, estiramentos mais longos de DNA além de sítio de "sinal de polia- denilação" são transcritos como um pré-mRNA. Essa sequência de DNA normalmente contém sinal de terminação de transcrição para o processamento apropriado do pré-mRNA em mRNA maduro.

[0099] Conforme usado no presente documento, o termo "região não traduzida 3'" ou "UTR 3'" é definido como o segmento não traduzi- do em um terminal 3' dos pré-mRNA ou mRNA maduros. Por exemplo, em mRNA maduros, essa região abriga a cauda poli-(A) e é conhecida por ter muitos papéis em estabilidade de mRNA, iniciação de tradução, e exportação de mRNA. Além disso, a UTR 3' é considerada como in- cluindo o sinal de poliadenilação e terminador de transcrição.

[00100] Conforme usado no presente documento, o termo "sinal de poliadenilação" designa uma sequência de ácidos nucleicos presentes em transcrições de mRNA que permitem transcrições, quando na pre- sença de uma poli-(A) polimerase, a ser poliadenilado no sítio de poli- adenilação, por exemplo, localizado 10 a 30 bases a jusante do sinal poli-(A). Muitos sinais de poliadenilação são conhecidos na técnica e são úteis para a presente descrição. Uma sequência exemplificativa inclui AAUAAA e variantes dos mesmos, como descrito em Loke J., et al., (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468.

[00101] Conforme usado no presente documento, o termo "trans- formação" abrange todas as técnicas que uma molécula de ácido nu- cleico pode ser introduzida em tal célula. Exemplos incluem, porém, sem limitação: transfecção com vetores virais; transformação com ve- tores de plasmídeo; eletroporação; lipofecção; microinjeção (Mueller et al., (1978) Cell 15:579-85); transferência mediada por Agrobacterium; absorção de DNA direta; transformação mediada por WHISKERS™; e bombardeamento de microprojétil. Essas técnicas podem ser usadas tanto para transformação estável quanto transformação transitória de uma célula vegetal. "Transformação estável" se refere à introdução de um fragmento de ácido nucleico em um genoma de um organismo hospedeiro resultando em herança geneticamente estável. Após trans- formação estável, o fragmento de ácido nucleico é integrado de forma estável no genoma do organismo hospedeiro e qualquer geração sub- sequente. Os organismos hospedeiros que contêm os fragmentos de ácido nucleico transformados são chamados de organismos "transgê- nicos". "Transformação transiente" se refere à introdução de um frag- mento de ácido nucleico no núcleo, ou organela que contém DNA, de um organismo hospedeiro, resultando em expressão gênica sem he- rança geneticamente estável.

[00102] Uma sequência exógena de ácidos nucleicos. Em um exemplo, um transgene/sequência de codificação heteróloga é uma sequência de genes (por exemplo, um gene resistente a herbicida), um gene que codifica um composto industrial ou farmaceuticamente útil, ou um gene que codifica um traço agrícola desejado. Em ainda outro exemplo, o transgene/sequência de codificação heteróloga é uma se- quência de ácidos nucleicos antissenso, em que a expressão da se- quência de ácidos nucleicos antissenso inibe a expressão de uma se- quência de ácidos nucleicos alvo. Um transgene/sequência de codifi- cação heteróloga pode conter sequências reguladoras ligadas opera- cionalmente ao transgene/sequência de codificação heteróloga (por exemplo, um promotor). Em algumas modalidades, uma sequência de polinucleotídeos de interesse é um transgene. No entanto, em outras modalidades, uma sequência de polinucleotídeos de interesse é uma sequência endógena de ácidos nucleicos, em que cópias genômicas adicionais da sequência endógena de ácidos nucleicos são desejadas, ou uma sequência de ácidos nucleicos que está na orientação antis- senso em relação à sequência de uma molécula alvo de ácido nucleico no organismo hospedeiro.

[00103] Conforme usado no presente documento, o termo um "evento" transgênico é produzido por transformação de células vege- tais com DNA heterólogo, isto é, um construto de ácido nucleico que inclui um transgene/sequência de codificação heteróloga de interesse, regeneração de uma população de plantas que resulta da inserção do transgene/sequência de codificação heteróloga no genoma da planta, e seleção de uma planta particular caracterizada por inserção em uma localização de genoma particular. O termo "evento" se refere ao trans- formador original e progênie da transformação que incluem o DNA he-

terólogo. O termo "evento" também se refere a progênie produzida por um cruzamento sexual entre o transformante e outra variedade que inclui o DNA genômico/transgene. Mesmo após retrocruzamento repe- tido para um progenitor recorrente, o DNA de transgene/sequência de codificação heteróloga inserido e DNA genômico de flanqueamento (DNA genômico/transgene) do progenitor transformado está presente na progênie do cruzamento na mesma localização cromossômica. O termo "evento" também se refere a DNA do transformante original e progênie do mesmo que compreende o DNA inserido e sequência ge- nômica de flanqueamento imediatamente adjacente ao DNA inserido que se esperava que fosse transferido para uma progênie que recebe DNA inserido, incluindo o transgene/sequência de codificação heteró- loga de interesse como resultado de um cruzamento sexual de uma linhagem parental que inclui o DNA inserido (por exemplo, o transfor- mante original e progênie que resultam de autopolinização) e uma li- nhagem parental que não contém o DNA inserido.

[00104] Conforme usado no presente documento, os termos "rea- ção em cadeia de polimerase" ou "PCR" definem um procedimento ou técnica na qual quantidades mínimas de ácido nucleico, RNA e/ou DNA são amplificadas, conforme descrito na patente n.o U.S.

4.683.195 emitida em 28 de julho de 1987. Em geral, informações de sequência das extremidades da região de interesse ou além precisam estar disponíveis, de modo que iniciadores de oligonucleotídeo pos- sam ser projetados; esses iniciadores serão idênticos ou similares em sequência às fitas opostas do modelo a ser amplificado. Os nucleotí- deos de terminal 5' dos dois iniciadores podem coincidir com as extre- midades do material amplificado. PCR pode ser usada para amplificar sequências de RNA específicas, sequências de DNA específicas de DNA genômico total, e cDNA transcrito do RNA celular total, sequên- cias de bacteriófago ou plasmídeo, etc. Consultar geralmente Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989).

[00105] Conforme usado no presente documento, o termo "inicia- dor" se refere a um oligonucleotídeo com capacidade de atuar como um ponto de iniciação de síntese ao longo de uma fita complementar quando condições são adequadas para síntese de um produto de ex- tensão de iniciador. As condições de sintetização incluem a presença de quatro trifosfatos de desoxirribonucleotídeo diferentes e pelo menos um agente de indução de polimerização como transcriptase reversa ou DNA polimerase. Os mesmos estão presentes em um tampão ade- quado, que pode incluir constituintes que são cofatores ou que afetam condições, como pH e similares em diversas temperaturas adequadas. Um iniciador é, tipicamente, uma sequência de fita única, de modo que eficiência de amplificação seja ideal, mas sequências de fita dupla possam ser utilizadas.

[00106] Conforme usado no presente documento, o termo "sonda" se refere a um oligonucleotídeo que hibridiza para uma sequência al- vo. No procedimento de ensaio TaqMan® ou de estilo TaqMan®, a sonda hibridiza para uma porção do alvo situado entre o sítio de reco- zimento dos dois iniciadores. Uma sonda inclui cerca de oito nucleotí- deos, cerca de dez nucleotídeos, cerca de quinze nucleotídeos, cerca de vinte nucleotídeos, cerca de trinta nucleotídeos, cerca de quarenta nucleotídeos, ou cerca de cinquenta nucleotídeos. Em algumas moda- lidades, uma sonda inclui de cerca de oito nucleotídeos a cerca de quinze nucleotídeos. Uma sonda pode incluir ainda uma identificação detectável, por exemplo, um fluoróforo (Texas-Red®, isotiocianato de fluoresceína, etc.,). A identificação detectável pode ser fixada de modo covalente diretamente ao oligonucleotídeo de sonda, por exemplo, lo- calizado na extremidade 5' da sonda ou na extremidade 3’ da sonda. Uma sonda que inclui um fluoróforo pode também incluir ainda um ar-

refecedor brusco, por exemplo, Black Hole Quencher™, Iowa Black™, etc.

[00107] Conforme usado no presente documento, os termos "endo- nucleases de restrição" e "enzimas de restrição" se referem a enzimas bacterianas, cada uma das quais corta DNA de fita dupla em ou pró- ximo a uma sequência específica de nucleotídeos. As enzimas de res- trição do tipo 2 reconhecem e clivam DNA no mesmo sítio, e incluem porém, sem limitação, XbaI, BamHI, HindIII, EcoRI, XhoI, SalI, KpnI, AvaI, PstI e SmaI.

[00108] Conforme usado no presente documento, o termo "vetor" é usado de modo intercambiável com os termos "construto", "vetor de clonagem" e "vetor de expressão" e significam o veículo pelo qual uma sequência de DNA ou RNA (por exemplo, um gene exógeno) pode ser introduzida em uma célula hospedeira, de modo a transformar o hos- pedeiro e promover expressão (por exemplo, transcrição e tradução) da sequência introduzida. Um "vetor não viral" se destina a significar qualquer vetor que não compreende um vírus ou retrovírus. Em algu- mas modalidades, um "vetor" é uma sequência de DNA que compre- ende pelo menos uma origem de replicação de DNA e pelo menos um gene marcador selecionável. Exemplos incluem, mas sem limitação, um plasmídeo, cosmídeo, bacteriófago, cromossomo artificial bacteria- no (BAC), ou vírus que transporta DNA exógeno em uma célula. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, moléculas antissenso, e/ou genes de marcador selecionável e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infec- tar uma célula, fazendo, dessa maneira, com que a célula expresse as moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificadas pelo vetor.

[00109] O termo "plasmídeo" define uma fita circular de ácido nu- cleico com capacidade de replicação autossômica em uma célula hos- pedeira tanto procariótica como eucariótica. O termo inclui ácido nu-

cleico que pode ser DNA ou RNA e pode ser de fita única ou dupla. O plasmídeo da definição também pode incluir as sequências que cor- respondem a uma origem bacteriana de replicação.

[00110] Conforme usado no presente documento, o termo "gene de marcador selecionável" como usado aqui define um gene ou outro cassete de expressão que codifica uma proteína que facilita a identifi- cação de células nas quais o gene de marcador selecionável é inseri- do. Por exemplo, um "gene de marcador selecionável" abrange genes repórter, assim como genes usados em transformação de planta para, por exemplo, proteger células vegetais de um agente seletivo ou for- necer resistência/tolerância a um agente seletivo. Em uma modalida- de, apenas essas células ou plantas que recebem um marcador sele- cionável funcional têm capacidade para se dividir ou desenvolver me- diante condições que têm um agente seletivo. A frase "positivo para marcador" se refere a plantas que foram transformadas de modo a in- cluir um gene de marcador selecionável.

[00111] Conforme usado no presente documento, o termo "marca- dor detectável" se refere a uma identificação com capacidade de de- tecção, como, por exemplo, um radioisótopo, composto fluorescente, composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, quelan- te de metal ou enzima. Exemplos de marcadores detectáveis incluem, porém sem limitação, o seguinte: identificações fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos lantanídeos), identificações enzi- máticas (por exemplo, peroxidase de rábano, β-galactosidase, lucife- rase, fosfatase alcalina), quimioluminescentes, grupos biotinila, epíto- pos de polipeptídeo predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de par de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, etiquetas de epítopo). Em uma modalidade, um marcador detectável pode ser fixado por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o potencial impedimento estérico.

[00112] Conforme usado no presente documento, os termos "casse- te", "cassete de expressão" e "cassete de expressão de gene" se refe- rem a um segmento de DNA que pode ser inserido em um ácido nu- cleico ou polinucleotídeo em sítios de restrição específicos ou por re- combinação homóloga. Conforme usado no presente documento, o segmento de DNA compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, e o cassete e sítios de restrição são projeta- dos para garantir a inserção do cassete no quadro de leitura apropria- do para transcrição e tradução. Em uma modalidade, um cassete de expressão pode incluir um polinucleotídeo que codifica um polipeptí- deo de interesse e que tem elementos além do polinucleotídeo que facilitam a transformação de uma célula hospedeira específica. Em uma modalidade, um cassete de expressão de gene também pode in- cluir elementos que permitem expressão aperfeiçoada de um polinu- cleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse em uma célula hospedeira. Esses elementos podem incluir, porém sem limitação: um promotor, um promotor mínimo, um intensificador, um elemento de resposta, uma sequência terminadora, uma sequência de poliadenila- ção e similares.

[00113] Conforme usado no presente documento, um "ligante" ou "espaçador" é uma ligação, molécula ou grupo de moléculas que ligam duas entidades separadas entre si. Ligantes e espaçadores podem fornecer espaçamento ideal das duas entidades ou podem fornecer ainda uma ligação lábil que permite que as duas entidades sejam se- paradas umas das outras. As ligações lábeis incluem grupos fotoclivá- veis, porções químicas ácidas-lábeis, porções químicas de base-lábeis e grupos cliváveis por enzima. Os termos "poliligante" ou "múltiplos sítios de clonagem", conforme usados no presente documento, defi- nem um agrupamento de três ou mais sítios de enzima de restrição de

Tipo 2 localizados dentro de 10 nucleotídeos uns em relação aos ou- tros em uma sequência de ácidos nucleicos. Em outros exemplos, o termo "poliligante", conforme usado no presente documento, se refere a um estiramento de nucleotídeos que são alvejados para unir duas sequências por meio de qualquer método de clonagem contínuo co- nhecido (isto é, Gibson Assembly®, NEBuilder HiFiDNA Assembly®, Golden Gate Assembly, BioBrick® Assembly, etc.). Os construtos que compreendem um poliligante são utilizados para a inserção e/ou exci- são de sequências de ácidos nucleicos como a região de codificação de um gene.

[00114] Conforme usado no presente documento, o termo "controle" se refere a uma amostra usada em um procedimento analítico para propósitos de comparação. Um controle pode ser "positivo" ou "negati- vo". Por exemplo, quando o propósito de um procedimento analítico é detectar uma transcrição expressa de modo diferente ou polipeptídeo em células ou tecido, é geralmente preferencial incluir um controle po- sitivo, como uma amostra de uma planta conhecida que exibe a ex- pressão desejada, e um controle negativo, como uma amostra de uma planta conhecida que não tem a expressão desejada.

[00115] Conforme usado no presente documento, o termo "planta" inclui uma planta completa e qualquer descendente, célula, tecido, ou parte de uma planta. Uma classe de planta que pode ser usada na presente descrição é geralmente tão abrangente quanto a classe de plantas inferiores e superiores passíveis de mutagênese, incluindo an- giospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnosper- mas, samambaias e algas multicelulares. Desse modo, "planta" inclui plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. O termo "partes de planta" inclui qualquer parte (ou quaisquer partes) de uma planta, incluindo, por exemplo e sem limitação: semente (incluindo semente madura e semente não madura); um corte de planta; uma célula vegetal; uma cultura de célula vegetal; um órgão de planta (por exemplo, pólen, em- briões, flores, frutos, brotos, folhas, raízes, caules e explantes). Um tecido vegetal ou órgão de planta pode ser uma semente, protoplasto, calo ou qualquer outro grupo de células vegetais que é organizado em uma unidade estrutural ou funcional. Uma célula vegetal ou cultura de tecido pode ter capacidade de regenerar uma planta que tem as carac- terísticas fisiológicas e morfológicas da planta a partir da qual a célula ou tecido foi obtido, e de regenerar uma planta que tem substancial- mente o mesmo genótipo que a planta. Em contrapartida, algumas cé- lulas vegetais não têm capacidade de serem regeneradas para produ- zir plantas. As células regeneráveis em uma célula vegetal ou cultura de tecido podem ser embriões, protoplastos, células meristemáticas, calo, pólen, folhas, anteras, raízes, pontas de raiz, seda, flores, grãos, espigas, sabugos, cascas ou caules.

[00116] As partes de planta incluem partes passíveis de colheita e partes úteis para a propagação de plantas de progênie. As partes de planta úteis para propagação incluem, por exemplo, e sem limitação: semente; fruta; um corte; uma muda; um tubérculo; e um porta- enxerto. Uma parte passível de colheita de uma planta pode ser qual- quer parte útil de uma planta, incluindo, por exemplo, e sem limitação: flor; pólen; muda; tubérculo; folha; caule; fruta; semente; e raiz.

[00117] Uma célula vegetal é a unidade estrutural e fisiológica da planta, que compreende um protoplasto e uma parede celular. Uma célula vegetal pode estar na forma de uma única célula isolada, ou um agregado de células (por exemplo, um calo friável e uma célula culti- vada), e pode ser parte de uma unidade organizada superior (por exemplo, um tecido vegetal, órgão de planta, e planta). Desse modo, uma célula vegetal pode ser um protoplasto, um gameta que produz célula, ou uma célula ou coleção de células que podem se regenerar em uma planta completa. Dessa maneira, uma semente, que compre-

ende múltiplas células vegetais e tem capacidade de se regenerar em uma planta completa, é considerada uma "célula vegetal" em modali- dades no presente documento.

[00118] Conforme usado no presente documento, o termo "RNA pequeno" se refere a diversas classes de ácido ribonucleico de não codificação (ncRNA). O termo RNA pequeno descreve as cadeias cur- tas de ncRNA produzido em células bacterianas, animais, plantas e fungos. Essas cadeias curtas de ncRNA podem ser produzidas natu- ralmente dentro da célula ou podem ser produzidas pela introdução de uma sequência exógena que expressa a cadeia curta ou ncRNA. As sequências de RNA pequeno não codificam diretamente uma proteína, e diferem em função de outro RNA uma vez que as sequências de RNA pequeno são apenas transcritas e não traduzidas. As sequências de RNA pequeno são envolvidas em outras funções celulares, incluin- do expressão de gene e modificação. As moléculas RNA pequeno são normalmente constituídas de cerca de 20 a 30 nucleotídeos. As se- quências de RNA pequeno podem ser derivadas de precursores mais longos. Os precursores formam estruturas que se dobram novamente umas nas outras em regiões autocomplementares; os mesmos são, então, processados pela nuclease Dicer em animais ou DCL1 em plan- tas.

[00119] Muitos tipos de RNA pequeno existem ou naturalmente ou produzidos artificialmente, incluindo microRNA (miRNA), RNA curtos de interferência (siRNA), RNA antissenso, RNA curto em formato de grampo (shRNA), e RNA nucleolares pequenos (snoRNA). Determina- dos tipos de RNA pequeno, como microRNA e siRNA, são importantes em silenciamento de gene e interferência de RNA (RNAi). O silencia- mento de gene é um processo de regulação genética no qual um gene que seria normalmente expresso é "desligado" por um elemento intra- celular, nesse caso, o RNA pequeno. A proteína que seria normalmen-

te formada por essas informações genéticas não é formada devido à interferência, e as informações codificadas no gene são bloqueadas da expressão.

[00120] Conforme usado no presente documento, o termo "RNA pequeno" abrange moléculas de RNA descritas na literatura como "RNA minúsculo" (Storz, (2002) Science 296:1.260 a 1.263; Illangase- kare et al., (1999) RNA 5:1.482 a 1.489); "RNA pequeno" procariótico (sRNA) (Wassarman et al., (1999) Trends Microbiol. 7:37 a 45); "RNA de não codificação (ncRNA)" eucariótico; "micro-RNA (miRNA)"; "não mRNA pequeno (snmRNA)"; "RNA funcional (fRNA)"; "RNA de transfe- rência (tRNA)"; "RNA catalítico" [por exemplo, ribozimas, incluindo ri- bozimas de auto-acilação (Illangaskare et al., (1999) RNA 5:1.482 a

1.489); "RNA nucleolares pequenos (snoRNA)," "tmRNA" (também co- nhecido como "10S RNA," Muto et al., (1998) Trends Biochem Sci. 23:25 a 29; e Gillet et al., (2001) Mol Microbiol. 42:879-885); moléculas de RNAi, incluindo sem limitação "RNA pequeno de interferência (siR- NA)," "siRNA preparado por endoribonuclease (e-siRNA)," "RNA curto em formato de grampo (shRNA)," e "RNA regulado temporariamente pequeno (stRNA)," "siRNA cortado (d-siRNA)," e aptâmeros, oligonu- cleotídeos e outros ácidos nucleicos sintéticos que compreendem pelo menos uma base de uracila.

[00121] A menos que especificamente explicado de outro modo, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado que o comumente entendido por aqueles de habilidade comum na técnica à qual esta descrição pertence. As defi- nições de termos comuns em biologia molecular podem ser constata- das em, por exemplo: Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Mo- lecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive

Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). III. IRDIG37126 Polypeptide and Nucleic Acids Comprising the Same

[00122] São fornecidos métodos e composições que revelam o po- lipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. Em uma modali- dade o polipeptídeo IRDIG37126 pode ser SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13-24. Em outras modalidades, o polipeptídeo IRDIG37126 pode compreender um polipeptídeo com 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Em uma modalidade adicional, o polipeptídeo IRDIG37126 pode com- preender a SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Em modalidades adicionais, o polipeptídeo IRDIG37126 pode consistir na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Outras modalidades incluem composições de substâncias que poderiam permitir que o versado na técnica obtenha e trabalhe com o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. Por exemplo, o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo pode ser fornecido como uma sequência de polipeptídeos isolada. Em alguns aspectos, a sequência de polipeptídeos isolada pode constituir uma composição. Em outros casos, o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo pode ser fornecido como um polipeptídeo ex- presso em uma planta, célula vegetal, semente da planta ou parte da planta. Em casos adicionais, o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma vari- ante do mesmo pode ser fornecido como um polipeptídeo expresso em um organismo microbiano.

[00123] São ainda fornecidos métodos e composições para o uso de uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, a sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo IR- DIG37126 compreende a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36. Em outras modalidades, a sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo IRDIG37126 compreende um polinucleotídeo que com- partilha pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36. Em modalida- des adicionais, a sequência de polinucleotídeos que codifica um poli- peptídeo IRDIG37126 consiste na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a

36. Outras modalidades incluem composições de substâncias que po- deriam permitir que o versado na técnica obtenha e trabalhe com o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma vari- ante do mesmo. Por exemplo, o polinucleotídeo que codifica o polipep- tídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo pode ser fornecido em um cassete de expressão gênica. Em outros casos, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo pode ser fornecido em um vetor. Em casos adicionais, o polinucleotí- deo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mes- mo pode ser fornecido pela integração da sequência de polinucleotí- deos dentro do genoma de uma planta, célula vegetal, semente da planta ou parte da planta. Em casos adicionais, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo pode ser fornecido como um polinucleotídeo isolado. Em alguns casos, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma vari- ante do mesmo pode ser fornecido dentro de um micro-organismo.

[00124] Um outro aspecto da presente descrição compreende uma variante funcional que difere em um ou mais nucleotídeos daqueles do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126, fornecido no presente documento. Tal variante é produzida como o resultado de uma ou mais modificações (por exemplo, deleção, substituição ou adi- ção) das sequências de nucleotídeos que compreendem a sequência que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, o polipeptídeo IRDIG37126 é alterado para produzir uma sequência de polipeptídeos variante IR- DIG37126. Em um aspecto desta modalidade, o polipeptídeo variante IRDIG37126 compartilha pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2 ou uma variante do mesmo. Em outros aspectos, o polipeptídeo variante IRDIG37126 compreende pelo menos uma deleção de resíduo de aminoácidos. Em aspectos adicionais o polipeptídeo variante IRDIG37126 ou uma vari- ante do mesmo compreende pelo menos uma adição de resíduo de aminoácidos. Em alguns aspectos, o polipeptídeo variante IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo compreende pelo menos uma substituição de resíduo de aminoácidos. Em aspectos adicionais o po- lipeptídeo variante IRDIG37126 ou uma variante do mesmo compre- ende qualquer combinação de pelo menos uma adição, deleção e/ou substituição de resíduo de aminoácidos.

[00125] Em algumas modalidades, as sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos da presente descrição podem incluir resíduos adicio- nais, como aminoácidos N ou C-terminal ou sequências 5′ ou 3′, e ain- da assim serem essencialmente como apresentado em uma das se- quências descritas no presente documento, desde que a sequência atenda aos critérios de manutenção da atividade biológica das proteí- nas no que diz respeito à expressão proteica. A adição de sequências terminais particularmente se aplica a sequências de ácidos nucleicos que podem, por exemplo, incluir várias sequências não codificantes que flanqueiam cada uma das porções 5′ ou 3′ da região codificante ou podem incluir várias sequências internas, ou seja, íntrons, que são co- nhecidas por ocorrerem dentro de genes.

[00126] As sequências de polinucleotídeos da presente descrição, independentemente do comprimento da própria sequência de codifica- ção, podem ser combinadas com outras sequências de DNA, como promotores, sinais de poliadenilação, sítios de enzima de restrição adicionais, múltiplos sítios de clonagem, outras regiões de codificação, e similares, de modo que seu comprimento total possa variar conside- ravelmente. Portanto, é contemplado que uma sequência de polinucle- otídeos de quase qualquer comprimento pode ser empregue, com o comprimento total sendo, de preferência, limitado pela facilidade de preparação e uso no protocolo de DNA recombinante destinado. Por exemplo, os fragmentos de sequência de polinucleotídeos podem ser preparados incluindo um trecho contíguo curto de polinucleotídeos que codificam toda ou uma porção da sequência de polipeptídeos descrita na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24, ou que são idênticas ou complementares a sequências de DNA que codificam a sequência de polipeptídeos descrita na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24, e par- ticularmente o segmento de sequência de polinucleotídeos revelado na SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36.

[00127] Os vetores recombinantes e segmentos de DNA isolados podem, portanto, incluir diversamente as próprias regiões de codifica- ção de peptídeos, regiões codificantes contendo alterações ou modifi- cações selecionadas na região de codificação básica, ou as mesmas codificam polipeptídeos maiores que incluem essas regiões de codifi- cação de polipeptídeos ou podem codificar proteínas equivalentes bio- logicamente funcionais ou polipeptídeos que têm sequências de ami- noácidos variantes.

[00128] As sequências de polinucleotídeos da presente descrição abrangem proteínas equivalentes biologicamente funcionais. Tais se- quências podem surgir como uma consequência da redundância de códons e equivalência funcional que se sabe que ocorrem naturalmen- te dentro de sequências de polinucleotídeos e as proteínas assim codi- ficadas. Alternativamente, as proteínas ou polipeptídeos funcionalmen- te equivalentes podem ser criados através da aplicação de tecnologia de DNA recombinante, em que alterações na estrutura da proteína po- dem ser manipuladas, com base em considerações das propriedades dos aminoácidos trocados. Alterações projetadas manualmente podem ser introduzidas através da aplicação de técnicas de mutagênese sítio- dirigida, por exemplo, para introduzir aprimoramentos na antigenicida- de da proteína ou para testar mutantes de modo a examinar a ativida- de no nível molecular.

[00129] Em uma modalidade, os fragmentos e variantes do polinu- cleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24 podem ser usados em um construto de DNA ou em um cassete de expressão gênica para dirigir a expressão de uma sequência de codificação heteróloga. Conforme descrito acima, um fragmento refere-se a uma porção da sequência de ácidos nucleicos. Os fragmentos do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IR- DIG37126 da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24 podem manter a atividade biológica de iniciação de transcrição, mais particularmente, dirigindo a transcrição dentro dos tecidos da planta. Alternativamente, os fragmentos de uma sequência de nucleotídeos que são úteis como sondas de hibridização podem não reter necessariamente a atividade biológica. Os fragmentos de um polinucleotídeo da SEQ ID NO:1 po- dem estar na faixa de pelo menos cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, cerca de 200 nucleotí- deos, cerca de 300 nucleotídeos, cerca de 400 nucleotídeos, cerca de 500 nucleotídeos, cerca de 600 nucleotídeos, cerca de 700 nucleotí- deos, cerca de 800 nucleotídeos, até à sequência de nucleotídeos de comprimento completo da presente descrição para o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 da SEQ ID NO:2.

[00130] Uma porção biologicamente ativa do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 da SEQ ID NO:2 pode ser prepa- rada isolando-se uma porção da SEQ ID NO:1 e avaliando-se a ativi-

dade enzimática da porção. Moléculas de ácido nucleico que são fra- gmentos de um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IR- DIG37126 da SEQ ID NO:2 compreendem pelo menos cerca de 16, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800 ou até o número de nucleotídeos presentes em uma sequên- cia de comprimento completo da SEQ ID NO:1 descrita no presente documento.

[00131] As sequências de nucleotídeos variantes também abran- gem as sequências derivadas de um procedimento mutagênico e re- combinogênico, como embaralhamento de DNA. Com tal procedimen- to, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 da SEQ ID NO:2 pode ser manipulado para criar um novo polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126. Dessa maneira, bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma popula- ção de polinucleotídeos de sequência relacionada que compreendem regiões de sequência que têm identidade de sequência substancial e podem ser homologamente recombinadas in vitro ou in vivo. As estra- tégias para tal embaralhamento de DNA são conhecidas na técnica. Consultar, por exemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA i:

10.747 a 10.751; Stemmer (1994) Nature 570:389 a 391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 75:436 a 438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272:336 a 347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 4:4.504 a 4.509; Crameri et al. (1998) Nature 527:288 a 291; e as patentes n.os U.S. 5.605.793 e 5.837.458.

[00132] As sequências de nucleotídeos da presente descrição po- dem ser usadas para isolar sequências correspondentes de outros or- ganismos, particularmente outras espécies bacterianas como Pseu- domonas spp. Dessa forma, métodos como PCR, hibridização, e simi- lares podem ser usados para identificar tais sequências com base em sua identidade de sequência com as sequências apresentadas no pre-

sente documento. As sequências isoladas com base em sua identida- de de sequência com a sequência de polinucleotídeos completa que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 apresentado no presente docu- mento ou aos fragmentos das mesmas são abrangidas pela presente descrição.

[00133] Em uma abordagem de PCR, iniciadores de oligonucleotí- deo podem ser projetados para uso em reações PCR para amplificar sequências de DNA correspondentes de DNA genômico extraído de qualquer planta de interesse. Os métodos para projetar iniciadores de PCR e clonagem de PCR são geralmente conhecidos na técnica e são descritos em Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nova Iorque), doravante no presente documento, Sambrook. Também con- sultar Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nova Iorque); Innis e Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nova Iorque); e Innis e Gel- fand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nova Ior- que). Métodos conhecidos de PCR incluem, porém não se limitam, aos métodos que usam iniciadores pareados, iniciadores aninhados, inici- adores únicos específicos, iniciadores degenerados, iniciadores espe- cíficos de gene, iniciadores específicos de vetor, iniciadores parcial- mente não correspondidos e similares.

[00134] Em técnicas de hibridização, toda ou parte de uma sequên- cia de nucleotídeos conhecida é usada como uma sonda que hibridiza seletivamente para outras sequências de nucleotídeos corresponden- tes presentes em uma população de fragmentos de DNA genômico clonado de um organismo escolhido. As sondas de hibridização podem ser identificadas com um grupo detectável, como P32 ou qualquer outro marcador detectável. Assim, por exemplo, sondas para hibridização podem ser produzidas marcando-se oligonucleotídeos sintéticos com base na sequência do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo da descrição. Os métodos para a preparação de sondas para hibridização e para construção de biblio- tecas genômicas são geralmente conhecidos na técnica e são descri- tos em Sambrook. Por exemplo, toda a sequência do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é descrita no presente documento ou uma ou mais porções da mesma podem ser usadas como uma sonda com capacidade para hibridizar especificamente as sequências correspondentes do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo e RNA mensageiros. Para obter hibridização específica sob uma varie- dade de condições, tais sondas incluem sequências que são exclusi- vas dentre sequências do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo e têm pelo menos cerca de 10 nucleotídeos de comprimento ou pelo menos cerca de 20 nucleotí- deos de comprimento. Tais sondas podem ser usadas para amplificar a sequência correspondente do polinucleotídeo que codifica o polipep- tídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo a partir de qualquer ma- terial biológico por PCR. Essa técnica pode ser usada para isolar as sequências de codificação adicionais de um organismo desejado, ou como um ensaio diagnóstico para determinar a presença de sequên- cias de codificação em um organismo. As técnicas de hibridação inclu- em o rastreamento da hibridação de bibliotecas de DNA transferidas para placas (placas ou colônias; consultar, por exemplo, Sambrook).

[00135] Modificações e alterações podem ser feitas na estrutura primária das sequências de polipeptídeos da presente descrição para produzir derivados, análogos e mutantes e segmentos de DNA que codificam as mesmas e ainda obtêm atividade inseticida funcional. Em modalidades específicas da descrição, proteínas mutadas são con- templadas para serem úteis para aumentar a atividade inseticida da proteína e consequentemente aumentar a atividade inseticida ou ex- pressão do transgene recombinante em uma célula vegetal.

[00136] Por exemplo, determinados resíduos de aminoácidos po- dem ser substituídos por outros aminoácidos em uma estrutura protei- ca sem uma perda considerável da capacidade de ligação interativa com estruturas como, por exemplo, regiões de ligação ao antígeno de anticorpos ou sítios de ligação nas moléculas de substrato. Uma vez que é a capacidade interativa e a natureza de uma proteína que defi- nem a atividade funcional biológica dessa proteína, determinadas substituições de sequência de aminoácidos podem ser feitas em uma sequência de proteínas e, naturalmente, na sua sequência de codifica- ção de DNA subjacente e, no entanto, obtem-se uma proteína com propriedades similares. Dessa forma, é contemplado pelos inventores que várias alterações podem ser feitas nas sequências peptídicas das composições descritas, ou sequências correspondentes de DNA que codificam os ditos peptídeos sem perda considerável de sua utilidade ou atividade biológica.

[00137] Na realização de tais alterações, o índice hidropático de aminoácidos pode ser considerado. A importância do índice hidropáti- co de aminoácidos ao conferir a função biológica interativa em uma proteína é geralmente entendida na técnica. É aceite que o caráter hi- dropático relativo do aminoácido contribui para a estrutura secundária da proteína resultante, o que por sua vez define a interação da proteí- na com outras moléculas, por exemplo, enzimas, substratos, recepto- res, DNA, anticorpos, antígenos e similares.

[00138] Cada aminoácido recebeu um índice hidropático com base em sua hidrofobicidade e características de carga, esses são: isoleuci- na (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteí- na/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (−0,4); treoni- na (−0,7); serina (−0,8); triptofano (−0,9); tirosina (−1,3); prolina (−1,6);

histidina (−3,2); glutamato (−3,5); glutamina (−3,5); aspartato (−3,5); asparagina (−3,5); lisina (−3,9); e arginina (−4,5).

[00139] É conhecido na técnica que determinados aminoácidos po- dem ser substituídos por outros aminoácidos que têm índice ou pontu- ação hidropático similar e ainda resultar em uma proteína com ativida- de biológica similar, isto é, ainda obter uma proteína equivalente funci- onalmente biológica. Na realização de tais alterações, a substituição de aminoácidos cujos índices hidropáticos estão dentro de ±2 é usada em algumas aplicações, aquelas das quais estão dentro de ±1 são usadas em outras aplicações, e aquelas dentro de ±0,5 são usadas em aplicações adicionais.

[00140] Compreende-se também na técnica que a substituição de aminoácidos similares pode ser feita efetivamente com base na hidrofi- licidade. A Patente n.º U.S. 4.554.101 incorporada no presente docu- mento a título de referência. declara que a maior hidrofilicidade média local de uma proteína, conforme manipulado pela hidrofilicidade de seus aminoácidos adjacentes, se correlaciona a uma propriedade bio- lógica da proteína.

[00141] Conforme detalhado na Patente n.o US 4.554.101, os valo- res de hidrofilicidade a seguir foram atribuídos a resíduos de aminoá- cido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0±1); glutamato (+3,0±1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (−0,4); prolina (-5±1); alanina (−0,5); histidina (−0,5); cisteína (−1,0); metionina (−1,3); valina (−1,5); leucina (−1,8); isoleucina (−1,8); tirosina (−2,3); fenilalanina (−2,5); triptofano (−3,4).

[00142] Entende-se que um aminoácido pode ser substituído por outro com um valor de hidrofilicidade similar e ainda obter uma proteí- na biologicamente equivalente e, em particular, imunologicamente equivalente. Em tais alterações, a substituição de aminoácidos cujos valores de hidrofilicidade estão dentro de ±2 são aplicáveis para fazer tais modificações, aqueles dentro de ±1 são aplicáveis para fazer tais modificações e aqueles dentro de ±0,5 são aplicáveis para fazer tais modificações.

[00143] Como descrito acima, as substituições de aminoácidos ge- ralmente são, portanto, baseadas na similaridade relativa dos substi- tuintes de cadeia lateral de aminoácidos, por exemplo, sua hidrofobici- dade, hidrofilicidade, carga, tamanho e similares. Exemplos de substi- tuições que levam em consideração as características anteriores são bem conhecidos dos versados na técnica e incluem: arginina e lisina; glutamato e aspartato; serina e treonina; glutamina e asparagina; e valina, leucina e isoleucina.

[00144] Em modalidades adicionais, as substituições de aminoáci- dos podem incluir a modificação do polipeptídeo da presente descrição fazendo pelo menos uma substituição de aminoácido. Em outras mo- dalidades, as substituições de aminoácidos podem incluir a modifica- ção do polipeptídeo da presente descrição fazendo pelo menos uma adição de aminoácido. Em algumas modalidades, as substituições de aminoácidos podem incluir a modificação do polipeptídeo da presente descrição fazendo pelo menos uma deleção de aminoácido.

[00145] Em outras modalidades, os polipeptídeos da presente des- crição podem incluir sequências de aminoácidos deduzidas a partir das sequências de ácido nucleico de comprimento completo descritas no presente documento e sequências de aminoácidos que são mais curtas que as sequências de comprimento completo, devido ao uso de um sítio inicial a jusante alternado ou devido ao processamento que produz uma proteína mais curta que tem atividade inseticida. O pro- cessamento pode ocorrer no organismo após a proteína ser expressa ou na praga após a ingestão da proteína.

[00146] Em algumas modalidades, as sequências de aminoácidos e ácidos nucleicos da presente descrição podem conter na posição ope-

rável dentro do polipeptídeo um segmento peptídico de motivo da SEQ ID NO:37. Em que o segmento de peptídeo motivo exibe pelo menos cerca de 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade com uma se- quência consenso especificada para o segmento peptídico de motivo da SEQ ID NO:37. O segmento peptídico de motivo da SEQ ID NO:37 corresponde às posições de sequência de aminoácidos 19 a 25 da SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 e SEQ ID NO:24. A presença do segmento peptídico de motivo da SEQ ID NO:37 ou de um segmento peptídico que exibe pelo menos cerca de 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 99,9% de identidade de sequência de ami- noácido com esse segmento peptídico de motivo em uma proteína de toxina específica é determinante que a proteína da toxina seja um membro do gênero de proteínas descrito no presente documento, par- ticularmente quando também é mostrado que a proteína exibe proprie- dades de atividade inseticida de insetos. Tal segmento peptídico de motivo exibe atividade inseticida contra espécies de lepidópteros e/ou hemípteros.

[00147] Um outro aspecto da presente descrição inclui um vetor de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo que codifica o po- lipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo como revelado no presente documento. Em uma modalidade, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um bacteriófago, um vírus, ou um fragmento de polinucleotídeo exci- sado para uso em transformação direta ou alvejamento de gene como um DNA doador.

[00148] Os vetores recombinantes que contêm o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo podem ser ainda manipulados para conter elementos reguladores co- mo promotores, 5'UTR, íntrons, 3' UTR e terminadores. Em algumas modalidades, as sequências que constituem esses elementos regula- dores podem ser ligadas de maneira funcional ao polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. Em uma modalidade, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo é fornecido como um cassete de expressão gênica. Na preparação do cassete de expressão gênica, os vários fragmentos de DNA podem ser manipulados de modo a pro- porcionar as sequências de DNA na orientação adequada e, conforme apropriado, no quadro de leitura adequado. Para este fim, podem ser utilizados adaptadores ou ligantes para juntar os fragmentos de DNA ou outras manipulações podem estar envolvidas para proporcionar lo- cais de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, remoção de locais de restrição ou similares. Para esse propósito, podem estar envolvidos mutagênese in vitro, reparo de iniciadores, restrição, ane- lamento, novas substituições, por exemplo, transições e transversões.

[00149] Em alguns aspectos desta modalidade, o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é posicionado sob o controle de um promotor. Em tais modalidades, é contemplado que determinadas vantagens serão obtidas posicionan- do-se o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo sob o controle de um promotor recombinante ou heterólogo. Como usado no presente documento, um promotor re- combinante ou heterólogo destina-se a se referir a um promotor que normalmente não está associado a um segmento de DNA que codifica uma proteína ou peptídeo em seu ambiente natural. Tais promotores podem incluir promotores normalmente associados a outros genes, e/ou promotores isolados de qualquer célula bacteriana, viral, eucarió-

tica ou vegetal. Naturalmente, será importante empregar um promotor que dirija de maneira eficaz a expressão do segmento de DNA no tipo de célula, organismo, ou ainda animal, selecionado para expressão. O uso do promotor e combinações de tipos de células para a expressão de proteína é geralmente conhecido pelos versados na técnica de bio- logia molecular, por exemplo, consultar Sambrook et al., 1989. Os promotores empregues podem ser constitutivos, induzíveis ou prefe- renciais de tecido, e podem ser usados sob as condições adequadas para dirigir a expressão de alto nível do segmento de DNA introduzido no cassete de expressão gênica, como é vantajoso na produção de proteínas recombinantes dentro de plantas transgênicas ou na expres- são heteróloga de proteínas recombinantes dentro de um micro- organismo.

[00150] Podem ser utilizados vários promotores na prática das mo- dalidades. Os promotores podem ser selecionados com base no resul- tado desejado. Os ácidos nucleicos podem ser combinados com pro- motores constitutivos, preferenciais para tecidos, induzíveis ou outros para expressão no organismo hospedeiro. Os promotores constitutivos adequados para utilização em uma célula hospedeira vegetal incluem, por exemplo, o promotor nuclear do promotor Rsyn7 e outros promoto- res constitutivos divulgados no documento WO 1999/43838 e na Pa- tente n.º U.S. 6.072.050; o promotor nuclear 35S de CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy, et al., (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675- 689); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (Patente n.º U.S. 5.659.026) e similares. Outros promotores constitutivos inclu- em, por exemplo, os discutidos nas Patentes n.os U.S. 5.608.149;

5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463;

5.608.142 e 6.177.611.

[00151] Dependendo do resultado pretendido, pode ser benéfico expressar o gene de um promotor induzível. De interesse particular para regular a expressão das sequências de nucleotídeos das modali- dades em plantas são promotores induzíveis por ferimento. Tais pro- motores induzíveis por ferimento podem responder a danos causados por alimentação de insetos e incluem o gene inibidor de proteinase de batata (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425 a 449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:494 a 498); wun1 e wun2, Paten- te n.o U.S. 5.428.148; win1 e win2 (Stanford, et al., (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200 a 208); sistemina (McGurl, et al., (1992) Science 225:1570 a 1573); WIP1 (Rohmeier, et al., (1993) Plant Mol. Biol. 22:783 a 792; Eckelkamp, et al., (1993) FEBS Letters 323:73 a 76); gene MPI (Corderok, et al., (1994) Plant J. 6(2):141 a 150) e similares, incorporados ao presente documento a título de referência.

[00152] Além disso, podem ser empregues promotores induzíveis por agentes patogênicos nos métodos e construções de nucleotídeos das modalidades. Tais promotores induzíveis por patógeno incluem aqueles de proteínas relacionadas à patogênese (proteínas PR), que são induzidos após infecção por um patógeno; por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase, etc. Consultar, por exemplo, Redolfi et al., (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; e Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Consultar também, WO 1999/43819, incorporado no presente documento a título de referência.

[00153] De interesse são os promotores que são expressos local- mente no sítio ou perto do sítio da infecção patogênica. Consultar, por exemplo, Marineau, et al., (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton, et al., (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch, et al., (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98 e Yang, (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Consultar também Chen et al. (1996) Plant J. 10:955 a 966; Zhang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2.507 a 2.511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191 a 201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961 a 968; Patente n.o U.S. 5.750.386 (induzível por nemátodo); e as referências citadas nas mesmas. É de interesse particular o promotor induzível para o gene PRms de maís, cuja ex- pressão é induzida pelo patógeno Fusarium moniliforme (consultar, por exemplo, Cordero, et al., (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200).

[00154] Os promotores regulados quimicamente podem ser utiliza- dos para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor quimicamente induzível, em que a aplicação da substância química induz a expressão de gene ou um promotor quimicamente repressível, em que a aplicação da substância química reprime a expressão de gene. Os promotores induzíveis qui- micamente são conhecidos na técnica e incluem, mas não estão limi- tados ao promotor In 2-2 de maís, que é ativado por meio de fitoprote- tores de herbicidas benzenossulfonamidas, o promotor GST de maís, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são utiliza- dos como herbicidas pré-emergentes e o promotor PR-1a do tabaco, que é ativado por ácido salicílico. Outros promotores de interesse re- gulados quimicamente incluem promotores responsivos a esteroides (consultar, por exemplo, o promotor induzível por glicocorticoide em Schena et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421 a 10425 e McNellis et al., (1998) Plant J. 14(2):247 a 257) e promotores induzí- veis por tetraciclina e repressíveis por tetraciclina (ver, por exemplo, Gatz et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229 a 237 e Patentes núme- ros U.S. 5.814.618 e 5.789.156), incorporadas no presente documento a título de referência.

[00155] Os promotores preferidos de tecido podem ser utilizados para direcionar a expressão de polipeptídeo aprimorada dentro de um tecido vegetal particular. Promotores preferidos de tecido incluem aqueles discutidos em Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al., (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al., (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525- 535; Canevascini et al., (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yama- moto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Re- sults Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco, et al., (1993) Plant Mol Bi- ol. 23(6):1129-1138; Matsuoka, et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590 e Guevara-Garcia, et al., (1993) Plant J. 4(3):495-

505. Tais promotores podem ser modificados, se necessário, para ex- pressão fraca.

[00156] Os promotores preferidos de folha são conhecidos na técni- ca. Consultar, por exemplo, Yamamoto et al., (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al., (1994) Plant Physiol. 105:357-367; Yama- moto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-518; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129- 1138 e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-

9590.

[00157] Os promotores preferidos de raiz ou promotores específicos de raiz são conhecidos e podem ser selecionados de entre os muitos disponíveis na literatura ou isolados de novo a partir de várias espé- cies compatíveis. Consultar, por exemplo, Hire, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207 a 218 (gene de glutamina sintetase específico de raiz de soja); Keller e Baumgartner, (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elemento de controle específico de raiz no gene GRP 1.8 de Vagem); Sanger, et al., (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor especí-

fico de raiz do gene de manopina sintase (MAS) de Agrobacterium tu- mefaciens) e Miao, et al., (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (glutamina sinte- tase (GS) citosólica codificadora de clone de cDNA de comprimento completo, a qual é expressa em raízes e nódulos de raiz de soja). Consultar também Bogusz, et al., (1990) Plant Cell 2(7):633-641, em que dois promotores específicos de raiz isolados de genes de hemo- globina da não leguminosa de fixação de nitrogênio Parasponia ander- sonii e a não leguminosa de não fixação de nitrogênio Trema tomento- sa relacionada são descritos. Os promotores desses genes foram liga- dos a um gene repórter de 6-glicuronidase e introduzidos tanto na não leguminosa Nicotiana tabacum quanto na leguminosa Lotus cornicula- tus, e em ambos os casos a atividade de promotor específico de raiz foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem sua análise dos promotores dos genes indutores de raízes de roIC e rolD altamente expressos de Agrobacterium rhizogenes (consultar, Plant Science (Li- merick) 79(1):69-76). Concluiu-se que o aprimorador e os determinan- tes de DNA preferidos de tecidos estão dissociados nesses promoto- res. Teen, et al., (1989) usaram fusão de gene para lacZ para mostrar que o gene de T-DNA de Agrobacterium codificador de octopina sin- tase é especialmente ativo na epiderme da ponta de raiz e que o gene de TR2' é específico de raiz na planta intata e estimulado por ferimento no tecido de folha, uma combinação de características especialmente desejável para uso com um gene inseticida ou larvicida (consultar, EMBO J. 8(2):343-350). O gene TR1' fundido com nptII (neomicina fos- fotransferase II) apresentou características similares. Os promotores preferidos de raiz adicionais incluem o promotor de gene de VfENOD- GRP3 (Kuster, et al., (1995) Plant Mol. Biol. 29(4):759-772) e o promo- tor rolB (Capana, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. Consul- tar também as Patentes n.os U.S. 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363;

5.459.252; 5.401.836; 5.110.732 e 5.023.179.

[00158] Os promotores "preferidos por semente" incluem tanto os promotores "específicos de semente" (aqueles promotores ativos du- rante o desenvolvimento de semente, como promotores de proteínas de armazenamento de semente), assim como promotores de "germi- nação de semente" (aqueles promotores ativos durante a germinação de semente). Consultar Thompson, et al., (1989) BioEssays 10:108, incorporado no presente documento a título de referência.

Tais promo- tores preferidos para semente incluem, mas sem limitação, Cim1 (mensagem induzida por citoquinina); cZ19B1 (zeína de 19 kDa de maís); e milps (mio-inositol-1-fosfato sintase) (consultar a Patente n.º U.S. 6.225.529, incorporada no presente documento a título de refe- rência)). Gama-zeína e Glb-1 são promotores específicos de endos- perma.

Para dicotiledôneas, promotores específicos de semente inclu- em, mas sem limitação, inibidor de tripsina Kunitz 3 (KTi3) (Jofuku, K.

D. e Goldberg, R.

B.

Plant Cell 1:1.079-1.093, 1989), β-faseolina de feijão, napina, β-conglicinina, glicinina 1, lectina de soja, cruciferina e similares.

Para monocotiledôneas, promotores específicos para se- mente incluem, mas sem limitação, zeína de 15 kDa de maís, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, ceroso, murcho 1, murcho 2, globu- lina 1, etc.

Consultar também, WO 2000/12733, em que promotores preferenciais para semente de genes de end1 e end2 são descritos; incorporados no presente documento a título de referência.

Em dicoti- ledôneas, os promotores específicos para semente incluem, mas sem limitação, promotor de revestimento de semente de Arabidopsis, pBAN; e os promotores para semente iniciais de Arabidopsis, p26, p63 e p63tr (Patentes n.os U.S. 7.294.760 e 7.847.153). Um promotor que tem expressão "preferencial" em um tecido específico é expresso nes- se tecido até um grau maior do que em pelo menos um outro tecido vegetal.

Alguns promotores preferidos de tecido mostram a expressão quase exclusivamente no tecido particular.

[00159] Quando a expressão de nível baixo for desejada, os promo- tores fracos serão usados. Geralmente, o termo "promotor fraco", con- forme usado no presente documento, se refere a um promotor que aciona a expressão de uma sequência de codificação em um nível baixo. Por expressão de nível baixo, níveis de cerca de 1/1000 trans- critos a cerca de 1/100.000 transcritos a cerca de 1/500.000 transcritos são pretendidos. Alternativamente, é reconhecido que o termo "promo- tores fracos" também abrange os promotores que acionam a expres- são apenas em algumas células e não em outras para gerar um nível baixo total de expressão. Quando um promotor aciona a expressão em níveis inaceitavelmente altos, as porções da sequência promotora po- dem ser deletadas ou modificadas para diminuir os níveis de expres- são.

[00160] Tais promotores fracos constitutivos incluem, por exemplo, o promotor central do promotor Rsyn7 (WO 1999/43838 e Patente n.º U.S. 6.072.050), o promotor central 35S CaMV, e similares. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, os descritos nas Pa- tentes n.os U.S. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597;

5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142 e 6.177.611, incorporados no presente documento a título de referência.

[00161] A lista acima de promotores não é destinada a ser limitante. Qualquer promotor apropriado pode ser usado nas modalidades.

[00162] Os cassetes de expressão gênica podem conter ainda se- quências-líder 5'. Tais sequências líder podem atuar para potenciar a tradução. Os líderes de tradução são conhecidos na técnica e incluem: líderes de picornavírus, por exemplo, líder EMCV (região de não codi- ficação 5' de Encefalomiocardite) (Elroy-Stein, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6.126 a 6.130); líderes de potivírus, por exemplo, líder TEV (Vírus Gravado do Tabaco) (Gallie, et al., (1995) Gene 165(2):233-238), líder MDMV (Vírus Mosaico Anão de Maís), proteína de ligação de cadeia pesada de imunoglobulina humana (BiP) (Mace- jak, et al., (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido da proteína mRNA de revestimento de vírus do mosaico da alfafa (AMV RNA 4) (Jobling, et al., (1987) Nature 325:622-625); líder de vírus do mosaico do tabaco (TMV) (Gallie, et al., (1989) em Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, Nova Iorque), páginas 237-256) e líder de vírus de mancha clorótica do maís (MCMV) (Lommel, et al., (1991) Virology 81:382-385). Também consultar Della-Cioppa, et al., (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Tais construtos também contêm uma "sequência de sinais" ou "sequência líder" para facilitar o transporte de cotradução ou pós-tradução do peptídeo para determinadas estruturas intracelula- res, como o cloroplasto (ou outro plastídeo), retículo endoplasmático ou aparelho de Golgi.

[00163] Por "sequência de sinal" entende-se uma sequência que é conhecida ou que há suspeitas de resultar em transporte de peptídeo de cotradução ou pós-tradução através da membrana de célula. Em eucariotas, isso envolve tipicamente a secreção no aparelho de Golgi com parte resultando em glicosilação. As proteínas pesticidas inovado- ras são frequentemente sintetizadas como protoxinas, as quais são ativadas de modo protolítico no intestino da praga direcionada (Chang, (1987) Methods Enzymol. 153:507-516). Em algumas modalidades, a sequência de sinal está localizada na sequência nativa ou pode ser derivada de uma sequência das modalidades. Por "sequência-líder" entende-se qualquer sequência que, quando traduzida, resulta em uma sequência de aminoácidos suficiente para acionar o transporte de cotradução da cadeia peptídica a uma organela subcelular. Desse mo- do, isso inclui sequências líder que direcionam o transporte e/ou glico- silação pela passagem para o retículo endoplasmático, passagem para vacúolos, plastídeos incluindo cloroplastos, mitocôndrias e similares. As proteínas codificadas nucleares direcionadas ao compartimento de lúmen de tilacoide de cloroplasto têm um peptídeo de transição bipar- tido característico, composto por um peptídeo sinal de direcionamento estromal e um peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen. As in- formações de direcionamento estromal estão na porção aminoproximal do peptídeo de transição. O peptídeo sinal de direcionamento de lú- men está na porção carboxila-proximal do peptídeo de transição e con- tém todas as informações para direcionamento ao lúmen. Pesquisa recente em proteômica do cloroplasto de plantas superiores alcançou a identificação de numerosas proteínas do lúmen codificadas de modo nuclear Kieselbach et al. FEBS LETT 480:271-276, 2000; Peltier et al. Plant Cell 12:319-341, 2000; Bricker et al. Biochim. Biophys Acta 1503:350-356, 2001), cujo peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen pode ser potencialmente usado de acordo com a presente des- crição. Cerca de 80 proteínas de Arabidopsis, assim como proteínas homólogas de espinafre e ervilha, são relatadas por Kieselbach et al., Photosynthesis Research, 78:249-264, 2003. Em particular, a Tabela 2 dessa publicação, a qual está incorporada à descrição do presente do- cumento a título de referência, revela 85 proteínas do lúmen do cloro- plasto, identificadas por seu número de acesso (consultar também a Publicação de Pedido de Patente n.º US 2009/09044298). Além disso, a versão de rascunho recentemente publicada do genoma de arroz (Goff et al, Science 296:92-100, 2002) é uma fonte adequada para peptídeo sinal de direcionamento para o lúmen, a qual pode ser usada de acordo com a presente descrição.

[00164] Em outras modalidades, a sequência de polinucleotídeos expressa pode ser direcionada ao cloroplasto e pode ser otimizada para a expressão no cloroplasto para contabilizar as diferenças em uso de códon entre o núcleo de planta e essa organela. Dessa manei- ra, os ácidos nucleicos de interesse podem ser sintetizados com o uso dos códons preferidos de cloroplasto. Consultar, por exemplo, a Paten-

te n.o U.S. 5.380.831 incorporada no presente documento a título de referência.

[00165] Peptídeos de transição de cloroplasto (CTP) adequados são bastante conhecidos para um indivíduo versado na técnica inclu- indo CTP quiméricos que compreendem, mas sem limitação, um do- mínio de terminal N, um domínio central ou um domínio de terminal C de um CTP a partir de Oryza sativa 1-deóxi-D xiulose-5-Fosfato Sin- tase, Superóxido de Oryza sativa dismutase, amido solúvel em oryza sativa Sintase, Enzima de ácido málico dependente de NADP-oryza sativa, oryza sativa-Fosfo-2-de-hidro-3-deoxi-heptonato Aldolase 2, oryza sativa-L-Ascorbato peroxidase 5, oryza sativa-Fosfoglucano água diquinase, Zea Mays ssRUBISCO, Zea Mays-beta-glicosidase, Zea Mays-Malato desidrogenase, Zea Mays Tioredoxina tipo M. Outros CTP adequados para o uso com os polinucleotídeos da presente des- crição incluem as sequências de nucleotídeos de TraP conforme des- crito nos documentos WO 2013116700, WO 2013116758, WO 2013116764, WO 2013116768, WO 2013116773, e WO 2017031211 incorporados no presente documento a título de referência em sua to- talidade.

[00166] Em algumas modalidades, a região de terminação pode ser nativa com a região de iniciação de transcrição, pode ser nativa com a sequência de DNA de interesse ligada de modo operacional, pode ser nativa com o hospedeiro de planta ou pode ser derivada de outra fonte (isto é, estranha ou heteróloga ao promotor, à sequência de interesse, ao hospedeiro de planta ou qualquer combinação dos mesmos). As regiões de terminação convenientes estão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, como as regiões de terminação de octopina sintase e nopalina sintase. Ver também Guerineau et al., (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671- 674; Sanfacon et al., (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al.,

(1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al., (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

[00167] Em outras modalidades, o cassete de expressão gênica recombinante é ligado operacionalmente a uma borda de T-DNA de Agrobacterium. De acordo com uma modalidade, o cassete de gene recombinante compreende ainda uma primeira e uma segunda bordas de T-DNA, em que a primeira borda de T-DNA é ligada operacional- mente a uma extremidade de um construto de gene, e a segunda bor- da de T-DNA é ligada operacionalmente à outra extremidade de um construto de gene. A primeira e a segunda bordas de T-DNA de Agrobacterium podem ser independentemente selecionadas a partir de sequências de borda de T-DNA que se originam de cepas bacterianas selecionadas dentre o grupo que consiste em uma borda de T-DNA de sintetização de nopalina de Agrobacterium, uma borda de T-DNA de sintetização de ocotopina de Agrobacterium, uma borda de T-DNA de sintetização de manopina de Agrobacterium, uma borda de T-DNA de sintetização de succinamopina de Agrobacterium, ou qualquer combi- nação das mesmas. Em uma modalidade, é fornecida uma cepa de Agrobacterium selecionada dentre o grupo que consiste em uma cepa de sintetização de nopalina, uma cepa de sintetização de manopina, uma cepa de sintetização de succinamopina, ou uma cepa de sinteti- zação de octopina, em que a dita cepa compreende um plasmídeo, em que o plasmídeo compreende um transgene/sequência de codificação heteróloga do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. Em outra modalidade, a primeira e a se- gunda bordas de T-DNA de Agrobacterium podem ser independente- mente selecionadas a partir de sequências de borda de T-DNA que se originam de cepas bacterianas selecionadas dentre o grupo que con- siste em uma borda de T-DNA de sintetização de nopalina de

Agrobacterium, uma borda de T-DNA de sintetização de ocotopina de Agrobacterium, uma borda de T-DNA de sintetização de manopina de Agrobacterium, uma borda de T-DNA de sintetização de succinamopi- na de Agrobacterium, ou qualquer combinação das mesmas. Em uma modalidade, é fornecida uma cepa de Agrobacterium selecionada den- tre o grupo que consiste em uma cepa de sintetização de nopalina, uma cepa de sintetização de manopina, uma cepa de sintetização de succinamopina, ou uma cepa de sintetização de octopina, em que a dita cepa compreende um plasmídeo, em que o plasmídeo compreen- de um transgene/sequência de codificação heteróloga do polinucleotí- deo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mes- mo. Em uma modalidade, é fornecida uma cepa de Agrobacterium se- lecionada dentre o grupo que consiste em uma cepa de sintetização de nopalina, uma cepa de sintetização de manopina, uma cepa de sin- tetização de succinamopina, ou uma cepa de sintetização de octopina, em que a dita cepa compreende um plasmídeo, em que o plasmídeo compreende um transgene/sequência de codificação heteróloga ligado de maneira funcional a uma sequência do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. Em uma mo- dalidade, é fornecida uma cepa de Agrobacterium selecionada dentre o grupo que consiste em uma cepa de sintetização de nopalina, uma cepa de sintetização de manopina, uma cepa de sintetização de succi- namopina, ou uma cepa de sintetização de octopina, em que a dita cepa compreende um plasmídeo, em que o plasmídeo compreende um transgene/sequência de codificação heteróloga ligado de maneira funcional a uma sequência do polinucleotídeo que codifica o polipeptí- deo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo.

[00168] Os transgenes de interesse podem ser empilhados com o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo da presente descrição. Transgenes de interesse exemplificadores que são ade-

quados para uso nos construtos presentemente descritos incluem, po- rém sem limitação, sequências de codificação que conferem (1) resis- tência a pragas ou doença, (2) tolerância a herbicidas, (3) traços agronômicos de valor adicionado como; aprimoramento de rendimen- to, eficiência de uso de nitrogênio, eficiência de uso de água, e quali- dade nutricional, (4) ligação de uma proteína a DNA de uma maneira específica de sítio, (5) expressão de RNA pequeno e (6) marcadores selecionáveis. De acordo com uma modalidade, o transge- ne/sequência de codificação heteróloga do polinucleotídeo que codifi- ca o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é ainda empilhado com pelo menos um outro transgene/sequência de codifica- ção heteróloga que codifica um marcador selecionável ou um produto genético que confere resistência inseticida, tolerância a herbicidas, ex- pressão de RNA pequeno, eficiência no uso de nitrogênio, eficiência no uso da água ou qualidade nutricional.

1. Resistência a Insetos

[00169] Vários genes de resistência a insetos podem ser ainda em- pilhados com o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo. O cassete de expressão gênica que codifica o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo pode ser ligado de maneira funcional a pe- lo menos um outro cassete de expressão gênica contendo um gene de resistência a insetos. As sequências ligadas operacionalmente podem, então, ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir identifica- ção e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). As se- quências de codificação de resistência de inseto exemplificativas são conhecidas na técnica. Como modalidades de sequências de codifica- ção de resistência de inseto que podem ser ligadas operacionalmente aos elementos reguladores da presente descrição, os traços a seguir são fornecidos. As sequências de codificação que fornecem resistên-

cia de inseto de Lepidópteros exemplificativa incluem: cry1A; cry1A.105; cry1Ab; cry1Ab(truncado); cry1Ab-Ac (proteína de fusão); cry1Ac (comercializado como Widestrike®); cry1C; cry1F (comerciali- zado como Widestrike®); cry1Fa2; cry2Ab2; cry2Ae; cry9C; mocry1F; pinII (proteína inibidora de protease); vip3A(a); e vip3Aa20. As se- quências de codificação que fornecem resistência de inseto de Co- leóptero exemplificativa incluem: cry34Ab1 (comercializado como Her- culex®); cry35Ab1 (comercializado como Herculex®); cry3A; cry3Bb1; dvsnf7; e mcry3A. As sequências de codificação que fornecem resis- tência de múltiplos insetos exemplificativa incluem ecry31.Ab. A lista acima de genes de resistência de inseto não se destina a ser limitante. Quaisquer genes de resistência de inseto são abrangidos pela presen- te descrição.

2. Tolerância a Herbicidas

[00170] Vários genes de tolerância a herbicidas podem ser ainda empilhados com o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo. O cassete de expressão gênica que codifica o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo pode ser ligado de maneira funcional a pe- lo menos um outro cassete de expressão gênica contendo um gene de tolerância a herbicidas. As sequências ligadas operacionalmente po- dem, então, ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). As sequências de codificação de tolerância a herbicida exemplificati- vas são conhecidas na técnica. Como modalidades de sequências de codificação de tolerância a herbicida que podem ser ligadas operacio- nalmente aos elementos reguladores da presente descrição, são for- necidos os traços a seguir. O herbicida glifosato contém um modo de ação inibindo-se a enzima EPSPS (sintase de 5-enolpiruvilshikimato-3- fosfato). Essa enzima é envolvida na biossíntese de aminoácidos aro-

máticos que são essenciais para o crescimento e desenvolvimento de plantas.

Diversos mecanismos enzimáticos são conhecidos na técnica que podem ser utilizados para inibir essa enzima.

Os genes que codifi- cam tais enzimas podem ser ligados operacionalmente aos elementos reguladores de gene da presente descrição.

Em uma modalidade, ge- nes de marcador selecionável incluem, porém sem limitação, genes que codificam genes de resistência a glifosato que incluem: genes mu- tantes de EPSPS, como genes 2mEPSPS, genes cp4 EPSPS, genes mEPSPS, genes dgt-28; genes aroA; e genes de degradação de glifo- sato, como genes de acetil transferase de glifosato (gat) e genes de oxidase de glifosato (gox). Esses traços são atualmente comercializa- dos como Gly-TolTM, Optimum® GAT®, Agrisure® GT e Roundup Re- ady®. Os genes de resistência para compostos de glufosinato e/ou bialafos incluem genes dsm-2, bar e pat.

Os traços de bar e pat são atualmente comercializados como LibertyLink®. Também são incluídos genes de tolerância que fornecem resistência a genes 2,4-D, como genes aad-1 (deve ser observado que genes aad-1 têm ainda ativida- de em herbicidas de arloxifenoxipropionato) e genes aad-12 (deve ser observado que genes aad-12 têm ainda atividade em auxinas sintéti- cas de piidiloxiacetato). Esses traços são comercializados como tecno- logia de proteção de cultura Enlist®. Os genes de resistência para ini- bidores de ALS (sulfonilureias, imidazolinonas, triazolpirimidinas, piri- midiniltiobenzoatos e sulfonilamino-carbonil-triazolinonas) são conhe- cidos na técnica.

Esses genes de resistência resultam mais comumen- te de mutações de ponto para o ALS que codifica sequência de genes.

Outros genes de resistência de inibidor de ALS incluem genes hra, os genes csr1-2, genes Sr-HrA e genes surB.

Alguns dos traços são co- mercializados sob o nome comercial Clearfield®. Os herbicidas que inibem HPPD incluem as pirazolonas, como pirazoxifeno, benzofenona e topramezona; tricetonas, como mesotriona, sulcotriona, tembotriona,

benzobiciclona; e dicetonitrilas como isoxaflutol.

Esses herbicidas de HPPD exemplificativos podem ser tolerados por traços conhecidos.

Exemplos de inibidores de HPPD incluem genes hppdPF_W336 (para resistência a isoxaflutol) e genes avhppd-03 (para resistência a meos- triona). Um exemplo de traços tolerantes a herbicida oxinila incluem o gene bxn, que tem se mostrado como conferindo resistência ao herbi- cida/antibiótico bromoxinil.

Os genes de resistência para dicamba in- cluem o gene de mono-oxigenase de dicamba (dmo), como revelado no Pedido Internacional PCT n.º WO 2008/105890. Os genes de resis- tência para herbicidas do tipo inibidor de PPO ou PROTOX (por exem- plo, acifluorfeno, butafenacil, flupropazil, pentoxazona, carfentrazona, fluazolato, piraflufeno, aclonifeno, azafenidina, flumioxazina, flumiclo- rac, bifenox, oxifluorfeno, lactofeno, fomesafeno, fluoroglicofeno e sul- fentrazona) são conhecidos na técnica.

Genes exemplificativos que conferem resistência a PPO incluem sobre-expressão de uma enzima de PPO de Arabidopsis thaliana de tipo selvagem (Lermontova I e Grimm B, (2000) Overexpression of plastidic protoporphyrinogen IX oxidase leads to resistance to the diphenyl-ether herbicide acifluorfen.

Plant Physiol 122:75–83.), o gene de PPO de B. subtilis (Li, X. e Ni- choll D. 2005. Development of PPO inhibitor-resistant cultures and crops.

Pest Manag.

Sci. 61:277 a 285 e Choi KW, Han O, Lee HJ, Yun YC, Moon YH, Kim MK, Kuk YI, Han SU e Guh JO, (1998) Generation of resistance to the diphenyl ether herbicide, oxyfluorfen, via expressi- on of the Bacillus subtilis protoporphyrinogen oxidase gene in transge- nic tobacco plants.

Biosci Biotechnol Biochem 62:558 a 560.) Os ge- nes de resistência para ácidos propiônicos piridinóxi ou fenóxi e ciclo- hexonas incluem os genes de codificação de inibidor de ACCase (por exemplo, Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3). Genes exemplificativos que conferem resistência a ciclo-hexanodionas e/ou ácido ariloxifenoxipro- panoico incluem haloxifop, diclofop, fenoxiprop, fluazifop e quizalofop.

Finalmente, herbicidas podem inibir fotossíntese, incluindo triazina ou benzonitrila são fornecidos com tolerância por genes psbA (tolerância a triazina), genes 1s+ (tolerância a triazina), e genes nitrilase (tolerân- cia a benzonitrila). A lista acima de genes de tolerância a herbicida não se destina a ser limitante. Quaisquer genes de tolerância a herbicida são abrangidos pela presente descrição.

3. Traços Agronômicos

[00171] Vários genes de traços agronômicos podem ser ainda em- pilhados com o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo. O cassete de expressão gênica que codifica o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo pode ser ligado de maneira funcional a pe- lo menos um outro cassete de expressão gênica contendo um gene de traços agronômicos. As sequências ligadas operacionalmente podem, então, ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir identifica- ção e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). As se- quências de codificação de traço agronômico exemplificativas são co- nhecidas na técnica. Como modalidades de sequências de codificação de traço agronômico que podem ser ligadas operacionalmente aos elementos reguladores da presente descrição, são fornecidos os tra- ços a seguir. O amolecimento atrasado de fruta, como fornecido pelos genes pg inibe a produção de enzima poligalacturonase responsável pela ruptura de moléculas de pectina na parede celular e, desse modo, ocasiona amolecimento atrasado da fruta. Ademais, amadurecimen- to/senescência de fruta atrasados de genes acc atuam para suprimir a expressão normal do gene nativo acc sintase, resultando em produção de etileno reduzida e amadurecimento de fruta atrasado. Enquanto os genes accd metabolizam o precursor do etileno de hormônio de ama- durecimento de fruta, resultando em amadurecimento de fruta atrasa- do. De modo alternativo, os genes sam-k ocasionam amadurecimento atrasado reduzindo-se S-adenosilmetionina (SAM), um substrato para produção de etileno. Fenótipos de tolerância ao estresse por falta de água, como fornecido por genes cspB, mantêm funções celulares normais mediante condições de estresse por água preservando-se es- tabilidade e tradução de RNA. Outro exemplo inclui os genes EcBetA que catalisam a produção da glicina betaína de composto osmoprote- tor que confere tolerância ao estresse por água. Além disso, os genes RmBetA catalisam a produção da glicina betaína de composto osmo- protetor que confere tolerância a estresse por água. A fotossíntese e o aperfeiçoamento de rendimento são fornecidos com o gene bbx32 que expressa uma proteína que interage com um ou mais fatores endóge- nos de transcrição para regular os processos fisiológicos diur- nos/noturnos da planta. A produção etanol pode ser aumentada por expressão dos genes amy797E que codificam uma enzima de alfa- amilase termoestável que aperfeiçoa produção de bioetanol aumen- tando-se a termoestabilidade de amilase usada em amido de degrada- ção. Finalmente, composições de aminoácido modificadas podem re- sultar pela expressão dos genes cordapA que codificam uma enzima de sintase de di-hidrodipicolinato que aumenta a produção de lisina de aminoácido. A lista acima de sequências de codificação de traço agronômico não se destina a ser limitante. Qualquer sequência de co- dificação de traço agronômico é abrangida pela presente descrição.

4. Proteínas de Ligação de DNA

[00172] Vários genes de transgene de ligação de DNA/sequência de codificação heteróloga/sequências de codificação heterólogas po- dem ser ainda empilhados com o polinucleotídeo que codifica o poli- peptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. O cassete de ex- pressão gênica que codifica o polinucleotídeo que codifica o polipeptí- deo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo pode ser ligado de ma- neira funcional a pelo menos um outro cassete de expressão gênica contendo um gene de ligação de DNA. As sequências ligadas opera- cionalmente podem, então, ser incorporadas a um vetor escolhido para permitir identificação e seleção de plantas transformadas ("transfor- mantes"). As sequências de codificação de proteína de ligação de DNA exemplificativas são conhecidas na técnica. Como modalidades de sequências de codificação de proteína de ligação de DNA que po- dem ser ligadas operacionalmente aos elementos reguladores da pre- sente descrição, os tipos a seguir de proteínas de ligação de DNA po- dem incluir; Dedos de Zinco, TALENS, CRISPRS e meganucleases. A lista acima de sequências de codificação de proteína de ligação de DNA não se destina a ser limitante. Quaisquer sequências de codifica- ção de proteína de ligação de DNA são abrangidas pela presente des- crição.

5. RNA Pequeno

[00173] Várias sequências de RNA pequenos podem ser ainda em- pilhadas com o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo. O cassete de expressão gênica que codifica o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo pode ser ligado de maneira funcional a pe- lo menos um outro cassete de expressão gênica contendo um gene de RNA pequeno. As sequências ligadas operacionalmente podem, en- tão, ser incorporadas em um vetor escolhido para permitir identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Os traços de RNA pequeno exemplificativos são conhecidos na técnica. Como mo- dalidades de sequências de codificação de RNA pequeno que podem ser ligadas operacionalmente aos elementos reguladores da presente descrição, os traços a seguir são fornecidos. Por exemplo, amadure- cimento/senescência de fruta atrasados do RNA pequeno anti-efe atrasa o amadurecimento suprimindo-se a produção de etileno por meio de silenciamento do gene ACO que codifica uma enzima de for-

mação de etileno. A produção de lignina alterada de RNA pequeno ccomt reduz teor de guanacil (G) lignina por inibição da S-adenosil-L- metionina endógena: trans-cafeoil CoA 3-O-metiltransferase (gene CCOMT). Ademais, a Tolerância a Ferimento de Mancha Preta em So- lanum verrucosum pode ser reduzida pelo RNA pequeno Ppo5 que aciona a degradação de transcrições de Ppo5 para bloquear desen- volvimento de ferimento de mancha preta. Também é incluído o RNA pequeno dvsnf7 que inibe Lagarta da Raiz do Milho Ocidental com dsRNA que contém um fragmento de 240 pb do gene Lagarta da Raiz do Milho Ocidental Snf7. O amido/carboidratos modificados podem re- sultar de RNA pequeno, como o RNA pequeno pPhL (degrada trans- crições de PhL para limitar a formação de açúcares de redução atra- vés de degradação de amido) e RNA pequeno pR1 (degrada transcri- ções de R1 para limitar a formação de açúcares de redução através de degradação de amido). Ainda, benefícios como acrilamida reduzida que resulta do RNA pequeno asn1 que aciona degradação de Asn1 para prejudicar formação de asparagina e reduzir poliacrilamida. Fi- nalmente, o fenótipo de não escurecimento de RNA pequeno pgas de supressão de ppo resulta em supressão de PPO para produzir maçãs com um fenótipo de não escurecimento. A lista acima de RNA peque- nos não se destina a ser limitante. Quaisquer sequências de codifica- ção de RNA pequeno são abrangidas pela presente descrição.

6. Marcadores Selecionáveis

[00174] Vários marcadores selecionáveis também descritos como genes-repórter podem ser ainda empilhados com o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. O cassete de expressão gênica que codifica o polinucleotídeo que codifi- ca o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo pode ser ligado de maneira funcional a pelo menos um outro cassete de ex- pressão gênica contendo um gene-repórter. As sequências ligadas operacionalmente podem, então, ser incorporadas a um vetor escolhi- do para permitir identificação e seleção de plantas transformadas ("transformantes"). Muitos métodos estão disponíveis para confirmar expressão de marcadores selecionáveis em plantas transformadas, incluindo, por exemplo, sequenciamento de DNA e PCR (reação de cadeia de polimerase), Southern blotting, blotting de RNA, métodos imunológicos para detecção de uma proteína expressa do vetor. Mas, normalmente os genes repórter são observados através de observa- ção visual de proteínas que, quando expressas, produzem um produto colorido. Genes repórter exemplificativos são conhecidos na técnica e codificam β-glucuronidase (GUS), luciferase, proteína verde fluores- cente (GFP), proteína amarelo fluorescente (YFP, Phi-YFP), proteína vermelho fluorescente (DsRFP, RFP, etc.), β-galactosidase, e simila- res (Consultar Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Ma- nual, Terceira Edição, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001, cujo con- teúdo do mesmo é incorporado ao presente documento a título de re- ferência em sua totalidade).

[00175] Genes de marcador selecionável são utilizados para a sele- ção de células ou tecidos transformados. Genes de marcador selecio- nável incluem genes que codificam resistência a antibiótico, como aqueles que codificam neomicina fosfotransferase II (NEO), resistência a espectinomicina/estreptionomicina (AAD), e higromicina fosfotransfe- rase (HPT ou HGR), assim como genes que conferem resistência a compostos herbicidas. Os genes de resistência a herbicida geralmente codificam para uma proteína alvo modificada insensível ao herbicida ou para uma enzima que degrada ou desintoxica o herbicida na planta antes de o mesmo poder atuar. Por exemplo, resistência a glifosato foi obtida usando-se codificação de genes para enzimas alvo mutantes, sintase de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato (EPSPS). Genes e mutan- tes para EPSPS são bem conhecidos, e ainda descritos abaixo. Resis-

tência a glufosinato de amônio, bromoxinil, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D) foram obtidos usando-se genes bacterianos que codificam PAT ou DSM-2, uma nitrilase, um AAD-1, ou um AAD-12, em que cada um dos quais são exemplos de proteínas que desintoxicam seus respecti- vos herbicidas.

[00176] Em uma modalidade, herbicidas podem inibir o ponto de crescimento ou meristema, incluindo imidazolinona ou sulfonilureia, e genes para resistência/tolerância de sintase de aceto-hidroxiácido (AHAS) e sintase de acetolactato (ALS) para esses herbicidas são bem conhecidos. Os genes de resistência de glifosato incluem sintase de 5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato mutante (EPSP) e genes dgt-28 (por meio da introdução de ácidos nucleicos recombinantes e/ou diver- sas formas de mutagênese in vivo de genes EPSP nativos), genes aroA e genes de glifosato acetil transferase (GAT), respectivamente). Os genes de resistência para outros compostos de fosfono incluem genes bar e pat de espécie Streptomyces, incluindo Streptomyces hygroscopicus e Streptomyces viridichromogenes, e piridinóxi ou áci- dos fenóxi propiônicos e ciclo-hexonas (genes de codificação de inibi- dor de ACCase). Genes exemplificativos que conferem resistência a ciclo-hexanodionas e/ou ácido ariloxifenoxipropanoico (incluindo ha- loxifop, diclofop, fenoxiprop, fluazifop, quizalofop) incluem genes de carboxilase de coenzima de acetila A (ACCase); Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3. Em uma modalidade, herbicidas podem inibir fotossíntese, incluindo triazina (genes psbA e 1s+) ou benzonitrila (gene nitrilase). Além disso, tais marcadores selecionáveis podem incluir marcadores de seleção positiva como enzima fosfomanose isomerase (PMI).

[00177] Em uma modalidade, genes de marcador selecionável in- cluem, porém sem limitação, genes que codificam: 2,4-D; neomicina fosfotransferase II; cianamida hidratase; aspartato quinase; sintase de di-hidrodipicolinato; triptofano descarboxilase; sintase de di-

hidrodipicolinato e aspartato quinase dessensibilizada; gene bar; tripto- fano descarboxilase; neomicina fosfotransferase (NEO); higromicina fosfotransferase (HPT ou HYG); di-hidrofolato redutase (DHFR); fosfi- notricina acetiltransferase; ácido 2,2-dicloropropiônico de-halogenase; sintase de aceto-hidroxiácido; sintase de 5-enolpiruvil-shiquimate- fosfato (aroA); haloarilnitrilase; carboxilase de acetil-coenzima A; sin- tase de di-hidropteroato (sul I); e polipeptídeo de fotossistema II 32 kD (psbA). Uma modalidade também inclui genes de marcador selecioná- vel que codificam resistência a: cloranfenicol; metotrexato; higromicina; espectinomicina; bromoxinil; glifosato; e fosfinotricina. A lista acima de genes de marcador selecionável não é destinada a ser limitante. Qual- quer gene de marcador selecionável ou repórter é abrangido pela pre- sente descrição.

[00178] Em algumas modalidades, as sequências de codificação são sintetizadas para expressão ideal em uma planta. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência de codificação de um gene foi modificada por otimização de códon para aperfeiçoar expressão em plantas. Um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, uma eficiência de uso de transgene de nitrogê- nio, uma eficiência de uso de transgene de água, um transgene de qualidade nutricional, um transgene de ligação de DNA ou um trans- gene de marcador selecionável/sequência de codificação heteróloga pode ser otimizado para expressão em uma espécie de planta especí- fica ou, de modo alternativo, pode ser modificado para expressão ideal em plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Códons preferenciais de planta podem ser determinados a partir dos códons de frequência mais alta nas proteínas expressas na maior quantidade na espécie de planta particular de interesse. Em uma modalidade, uma sequência de codificação, gene, sequência de codificação heteróloga ou transge- ne/sequência de codificação heteróloga é projetada para ser expressa em plantas em um nível mais alto, resultando em maior eficiência de transformação. Os métodos para otimização de planta de genes são bem conhecidos. Orientação relacionada à otimização e produção de sequências de DNA sintético pode ser constatada, por exemplo, nos documentos WO2013016546, WO2011146524, WO1997013402, Pa- tente dos EUA n.º 6166302, e Patente dos EUA n.º 5380831, incorpo- rados ao presente documento a título de referência. Transformação

[00179] Os métodos adequados para transformação de plantas in- cluem qualquer método pelo qual DNA pode ser introduzido em uma célula, por exemplo e sem limitação: eletroporação (consulte, por exemplo, Patente dos EUA 5.384.253); bombardeamento de micropro- jétil (consulte, por exemplo, Patentes dos EUA 5.015.580, 5.550.318,

5.538.880, 6.160.208, 6.399.861 e 6.403.865); transformação mediada por Agrobacterium (consulte, por exemplo, Patentes dos EUA

5.635.055, 5.824.877, 5.591.616; 5.981.840, e 6.384.301); e transfor- mação de protoplasto (consulte, por exemplo, Patente dos EUA

5.508.184).

[00180] Um construto de DNA pode ser introduzido diretamente no DNA genômico da célula vegetal com o uso de técnicas, como agita- ção com fibras de carbeto de silício (consulte, por exemplo, Patentes dos EUA 5.302.523 e 5.464.765), ou os construtos de DNA podem ser introduzidos diretamente no tecido vegetal com o uso de métodos bio- lísticos, como bombardeamento de partícula de DNA (consultar, por exemplo, Klein et al. (1987) Nature 327:70 a 73). De modo alternativo, o construto de DNA pode ser introduzido na célula vegetal por meio de transformação de nanopartícula (consultar, por exemplo, Pedido de Patente dos EUA n.º 20090104700, que é incorporado ao presente documento a título de referência em sua totalidade).

[00181] Além disso, transferência de gene pode ser alcançada com o uso de bactérias ou vírus não Agrobacterium, como Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, vírus X de bata- ta, vírus mosaico de couve-flor e vírus do mosaico da veia da mandio- ca e/ou vírus mosaico de tabaco, consultar, por exemplo, Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1 a 4.

[00182] Através da aplicação de técnicas de transformação, células de praticamente qualquer espécie de planta podem ser transformadas de modo estável, e estas células podem ser desenvolvidas em plantas transgênicas por técnicas bem conhecidas. Por exemplo, técnicas que podem ser particularmente úteis no contexto de transformação de al- godão são descritas na Patente dos EUA n.º 5.846.797, 5.159.135,

5.004.863 e 6.624.344; técnicas para transformar plantas Brassica, em particular, são descritas, por exemplo, na Patente dos EUA 5.750.871; técnicas para transformar grãos de soja são descritas, por exemplo, na Patente dos EUA 6,384,301; e técnicas para transformar Zea mays são descritas, por exemplo, nas Patentes dos EUA 7.060.876 e

5.591.616, e Pedido Internacional PCT WO 95/06722.

[00183] Após entrega eficaz de um ácido nucleico exógeno para uma célula receptora, uma célula transformada é geralmente identifi- cada para cultura adicional e regeneração de planta. A fim de aprimo- rar a capacidade de identificar transformantes, pode ser desejado em- pregar um gene de marcador selecionável com o vetor de transforma- ção usado para gerar a transformação. Em uma modalidade ilustrativa, uma população de célula transformada pode ser examinada expondo- se as células a um agente ou agentes seletivos, ou as células podem ser analisadas para o traço de gene de marcador desejado.

[00184] As células que sobrevivem à exposição a um agente seleti- vo, ou células que foram classificadas como positivas em um ensaio de análise, podem ser cultivadas em meios que suportam regeneração de plantas. Em uma modalidade, qualquer meio de cultura de tecido vegetal adequado pode ser modificado incluindo-se substâncias adici- onais, como reguladores de crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até tecido sufici- ente estar disponível para iniciar esforços de regeneração de planta, ou após ciclos repetidos de seleção manual, até a morfologia do tecido ser adequada para regeneração (por exemplo, pelo menos 2 sema- nas), depois transferido para meios condutores para formação de bro- tos. As culturas são transferidas periodicamente até formação de bro- tos suficiente ter ocorrido. Uma vez que os brotos são formados, os mesmos são transferidos para meio condutor para formação de raiz. Uma vez que raízes suficientes são formadas, plantas podem ser transferidas para o solo para crescimento e maturação adicional. Confirmação Molecular

[00185] Uma célula vegetal, calo, tecido ou planta transformados podem ser identificados e isolados selecionando-se ou analisando-se o material de planta geneticamente modificado para traços codificados pelos genes de marcador presentes na transformação de DNA. Por exemplo, a seleção pode ser realizada cultivando-se o material vegetal geneticamente modificado em meios que contêm uma quantidade ini- bidora do antibiótico ou herbicida ao qual o construto de gene de trans- formação confere resistência. Ademais, plantas transformadas e célu- las vegetais também podem ser identificadas analisando-se as ativida- des de quaisquer genes de marcador visíveis (por exemplo, a β- glucuronidase, luciferase, ou proteína genes verde fluorescente) que podem estar presentes nos construtos de ácido nucleico recombinan- te. Tal seleção e metodologias de análise são bem conhecidas por aqueles versados na técnica. Os métodos de confirmação molecular que podem ser usados para identificar plantas transgênicas são co- nhecidos por aqueles com habilidade na técnica. Plantas Transgênicas

[00186] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal, semente de planta, ou célula vegetal compreende um polinucleotídeo que codi- fica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo.

Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma va- riante do mesmo de uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal, semente da planta ou célula vegetal compreende um cassete de expressão gênica que compreen- de o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 de uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identi- dade de sequência com uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal ou célula vegetal compreende o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo.

Em uma modalidade, uma planta, tecido ve- getal, semente da planta ou célula vegetal compreende o polipeptídeo IRDIG37126, em que o polipeptídeo IRDIG37126 compreende um po- lipeptídeo que tem pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal, se- mente da planta ou célula vegetal compreende um cassete de expres- são gênica que compreende um polinucleotídeo que expressa o poli- peptídeo IRDIG37126, em que o polipeptídeo IRDIG37126 compreen- de uma sequência de polinucleotídeos que tem pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Em uma moda- lidade ilustrativa, uma planta, tecido vegetal, semente da planta ou cé- lula vegetal compreende um cassete de expressão gênica que com- preende o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 que compreende ainda pelo menos um outro transgene or sequência de codificação heteróloga, em que o transgene ou sequência de codifica- ção heteróloga pode ser um transgene de resistência a inseticida, um transgene de tolerância a herbicida, um transgene de eficiência de uso de nitrogênio, um transgene de eficiência de uso de água, um transge- ne de qualidade nutricional, um transgene de ligação a DNA, um transgene de marcador selecionável ou combinação dos mesmos. Em alguns casos, mais de um transgene/sequência de codificação heteró- loga pode ser incorporado no genoma da célula de planta hospedeira transformada. Esse é o caso quando mais de um segmento de DNA de codificação de proteína é incorporado no genoma de tal planta. Em determinadas situações, pode ser desejável ter uma, duas, três, qua- tro, ou ainda mais proteínas inseticidas ou outras proteínas IRDIG in- seticidas ou ácidos nucleicos incorporados e expressos de maneira estável na planta transgênica transformada.

[00187] Em uma outra modalidade, a planta, tecido vegetal, semen- te da planta ou célula vegetal que compreende o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea, semente, célula ou tecido derivado de uma planta dicotiledônea ou monocotiledônea. Em uma modalidade, a planta é selecionada dentre o grupo que consiste em Zea mays, trigo, arroz, sorgo, aveia, centeio, bananas, cana de açúcar, soja, algodão, girassol e canola. Em uma modalidade, a planta é Zea mays. Em uma outra modalidade, a planta é soja (por exemplo, Glyci- ne max).

[00188] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal de acordo com os métodos descritos no presente documento pode ser uma planta dicotiledônea. A planta dicotiledônea, tecido ve- getal ou célula vegetal pode ser, porém sem limitação, alfafa, colza, canola, mostarda indiana, mostarda da Etiópica, soja, girassol, algo- dão, feijões, brócolis, repolho, couve-flor, aipo, pepino, berinjela, alfa- ce; melão, ervilha, pimenta, amendoim, batata, abóbora, rabanete, es- pinafre, beterraba, girassol, tabaco, tomate e melancia.

[00189] Em uma modalidade, uma planta, tecido vegetal, ou célula vegetal de acordo com os métodos descritos no presente documento pode ser uma planta monocotiledônea. A planta monocotiledônea, te- cido vegetal ou célula vegetal pode ser, porém sem limitação, vários relvados de turfa, trigo, milho, arroz, cevada, aveia e espécies do gê- nero brachypodium.

[00190] De acordo com uma modalidade, o cassete de expressão gênica que compreende o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é incorporado no genoma da planta, tecido vegetal, semente da planta ou célula vegetal. Um indiví- duo versado na técnica reconhecerá que, após a sequência exógena ser incorporada de modo estável em plantas transgênicas e confirma- da como sendo operável, a mesma pode ser introduzida em outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer uma dentre um número de técnicas de reprodução padrão pode ser usada, dependendo das es- pécies a serem cruzadas. Por exemplo, duas plantas transgênicas di- ferentes podem ser cruzadas para produzir descendentes que contêm dois transgene/sequências de codificação heterólogas independente- mente segregados. A autofertilização da progênie adequada pode pro- duzir plantas que são homozigotas para os transgenes/sequências de codificação heterólogas que codificam um polipeptídeo de interesse. O retrocruzamento para uma planta parental e o cruzamento exogâmico com uma planta não transgênica são também contemplados. O resul-

tado do retrocruzamento produz uma planta de progênie transgênica que é homozigota para transgenes/sequências de codificação heteró- logas. Uma planta transgênica homozigota pode ser obtida por cruza- mento sexual (autofertilização) de uma planta transgênica segregante independente que contém um único gene adicionado, germinando al- gumas das sementes produzidas e analisando as plantas resultantes produzidas para aumentar a atividade inseticida em relação a uma planta controle (nativa, não transgênica) ou transgênica segregante independente.

[00191] A presente descrição também abrange as sementes das plantas transgênicas descritas acima, em que a semente tem o trans- gene/sequência de codificação heteróloga do polinucleotídeo que codi- fica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo fornecido na presente descrição. A presente descrição abrange ainda a progê- nie, clones, culturas calosas, linhagens celulares ou células das plan- tas transgênicas descritas acima, em que a dita progênie, clone, cultu- ras calosas, linhagem celular ou célula tem o transgene/sequência de codificação heteróloga ou construto de gene que contém os polinu- cleotídeos da presente descrição.

[00192] A presente descrição também abrange a regeneração, de- senvolvimento e produção de plantas a partir de transformantes ou de vários explantes transformados. Tal metodologia é bem conhecida na técnica. Esse processo de regeneração e crescimento inclui, tipica- mente, as etapas de seleção de células transformadas, cultivar aque- las células individualizadas através dos estágios normais de desenvol- vimento embriônico através do estágio de plântula enraizada. Embri- ões transgênicos e sementes são similarmente regenerados. Os bro- tos transgênicos com raiz resultantes são, depois disso, plantados em um meio de crescimento de planta adequado, tal como o solo.

[00193] O desenvolvimento ou regeneração de plantas que contêm o transgene/sequência de codificação heteróloga do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo pode ser obtido por métodos bem conhecidos na técnica. Nesse pro- cedimento, os transformantes são cultivados na presença de um agen- te de seleção e em um meio que induz a regeneração de brotos na cepa vegetal que é transformada, conforme descrito. Esse procedi- mento produz, tipicamente, brotos dentro de dois a quatro meses e esses brotos são, então, transferidos para um meio que induz raiz adequado que contém o agente seletivo e um antibiótico para prevenir o crescimento bacteriano. Os brotos enraizados na presença do agen- te seletivo para formar plântulas são, então, transplantados para o solo ou outros meios para permitir a produção de raízes. Esses procedi- mentos variam dependendo da cepa vegetal específica empregue, sendo que tais variações são bem conhecidas na técnica.

[00194] Em alguns casos, as plantas regeneradas são autopoliniza- das para fornecer plantas transgênicas homozigotas, conforme discu- tido anteriormente. De outra forma, pólen obtido a partir das plantas regeneradas é cruzado com plantas cultivadas de semente de linha- gens agronomicamente importantes, como linhagens endogâmicas. Por outro lado, pólen a partir de plantas dessas linhagens importantes é usado para polinizar plantas regeneradas. Uma planta transgênica da presente descrição que contém o transgene/sequência de codifica- ção heteróloga do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo é produzido utilizando métodos bem conhecidos por um versado na técnica.

[00195] Uma planta transgênica da presente descrição contém um transgene/sequência de codificação heteróloga integrado de maneira estável que codifica o transgene/sequência de codificação heteróloga do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. Em uma modalidade, a planta transgênica é um segregante independente e pode transmitir esse gene e sua atividade à sua progênie. Em modalidades adicionais, a planta transgênica é homozigota para aquele gene, e transmite esse gene a todos os seus descendentes através de cruzamento sexual. As sementes de uma planta transgênica podem ser cultivadas no campo de cultura ou em estufa, e as plantas transgênicas sexualmente maduras resultantes são autopolinizadas para gerar plantas de linhagem pura. A progênie dessas plantas se transforma em linhagens puras que são avaliadas em relação ao, a título de exemplo, aumento da capacidade inseticida contra insetos, por exemplo no campo de cultura, sob uma gama de condições ambientais. Tal metodologia encontrará utilidade específica na criação de plantas transgênicas de interesse comercial.

[00196] A presente descrição também abrange o cultivo de plantas transgênicas descritas acima, em que a planta transgênica tem o transgene/sequência de codificação heteróloga do polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo forne- cido na presente descrição. Consequentemente, tais plantas transgê- nicas podem ser geneticamente modificadas para, inter alia, ter um ou mais traços ou eventos transgênicos desejados que contêm os ele- mentos reguladores de gene da presente descrição, ao serem trans- formadas com moléculas de ácido nucleico de acordo com a descri- ção, e podem ser colhidas ou cultivadas por qualquer método conheci- do por aqueles versados na técnica. Em uma Célula Microbiana

[00197] Em uma modalidade, uma célula microbiana compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. Em uma modalidade, uma célula microbiana com- preende o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 de uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36. Em uma modalidade, uma célula microbiana compreende um cassete de expressão gênica que com- preende o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 de uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36. Em uma modalidade, uma célula microbiana compreende o polipeptídeo IRDIG37126. Em uma modali- dade, a célula microbiana compreende o polipeptídeo IRDIG37126, em que o polipeptídeo IRDIG37126 compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Em uma modalidade, uma célula microbiana compreende um cassete de expressão gênica que compreende um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126, em que o polipeptídeo IRDIG37126 com- preende uma sequência de polipeptídeos que tem pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Em modalida- des adicionais, a célula microbiana pode ser uma célula de bactérias, baculovírus, algas, levedura ou fungos. Exemplos não limitadores de células bacterianas incluem Pseudomonas, Bacillus (incluindo B. me- gaterium, B. subtilis e B. thuringiensis), Agrobacterium, Escherichia, ou outras espécies de Enterobacteraceae.

[00198] A presente descrição também abrange células hospedeiras microbianas que expressam um polinucleotídeo que codifica o polipep- tídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo, na fração solúvel, cor- pos ou cristais de inclusão, sobrenadante da cultura, células rompidas,

extratos celulares, lisados, homogenatos e similares. As células hos- pedeiras bacterianas podem estar sob a forma aquosa, ou alternati- vamente, sob formas secas, semi-úmidas ou similares, como pasta de células, péletes de células ou, alternativamente, secas por congela- mento, em pó, liofilizadas, evaporadas ou, de outro modo, preparadas de modo similar sob a forma seca. Tais meios para preparar o polipep- tídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo são bem conhecidos pelos versados na técnica de isolamento e purificação de proteínas microbianas. Em determinadas modalidades, as proteínas podem ser purificadas, concentradas, misturadas com outros reagentes ou pro- cessadas até à forma final desejada. Em algumas modalidades, a composição compreenderá de cerca de 1% a cerca de 90% em peso da proteína, e em algumas modalidades de cerca de 5%, a cerca de 50% em peso.

[00199] A presente descrição também abrange composições de proteínas que são preparadas por um processo que compreende as etapas de cultivar uma célula microbiana. As células microbianas são geneticamente manipuladas para expressar um polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo sob condições eficazes para produzir tal proteína e, então, obter a proteína a partir da célula. A obtenção de tal proteína pode incluir ainda purifi- car, concentrar, processar ou misturar a proteína com um ou mais rea- gentes. Em algumas modalidades, o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é obtido em uma quantidade de entre cerca de 1% a cerca de 90% em peso e, em outras modalidades, de cerca de 5% a cerca de 50% em peso. Composição

[00200] Em uma modalidade, a presente descrição inclui uma com- posição que compreende o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. Em uma modalidade, uma composição compreende o poli-

nucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 de uma sequên- cia selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36. Em uma modalidade, uma composição compreende um cassete de expressão gênica que compreende o polinucleotídeo que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo de uma sequên- cia selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36 ou uma sequência que tem 80%, 85%, 90%, 95% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36. Em uma modalidade, uma composição compre- ende o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. Em uma modalidade, a composição compreende o polipeptídeo IRDIG37126, em que o polipeptídeo IRDIG37126 compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a

24.

[00201] Em determinadas modalidades, a presente descrição refe- re-se a um método para preparar uma composição que compreende o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. Em geral, tal método envolve as etapas de cultivar uma célula microbiana que ex- pressa o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo sob condições eficazes para produzir a proteína e, então, obter a proteína assim produzida. As células hospedeiras procarióticas incluindo célu- las Gram-negativas como E. coli, Pseudomonas fluorescens e Entero- bacteraceae relacionadas ou células Gram-positivas como Bacillus spp. (Incluindo B. megaterium, B. subtilis e B. thuringiensis) e similares são contempladas como úteis na preparação do polipeptídeo IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo da presente descrição.

[00202] Alternativamente, as composições podem ser preparadas por sistemas de expressão bacteriana nativa ou recombinante in vitro e isoladas para aplicação em campo de cultura subsequente. Tal pro- teína pode estar em lisados celulares brutos, suspensões, coloides, etc., ou alternativamente pode ser purificada, refinada, tamponada e/ou ainda processada, antes da formulação em uma formulação bio- cida ativa. De modo similar, em determinadas circunstâncias, pode ser desejável isolar cristais e/ou esporos de culturas bacterianas que ex- pressam a proteína e aplicar soluções, suspensões ou preparações coloidais de tais cristais e/ou esporos como a composição bioinseticida ativa.

[00203] A composição que compreende o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo descrita pode ser produzida formulando a célula bacteriana, suspensão de cristal e/ou esporo ou componente de proteína isolada com o veículo agricolamente aceitável desejado. A composição que compreende o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma vari- ante do mesmo pode ser formulada antes da administração em meios apropriados, como liofilizadas, secas a frio, dessecadas ou em um transportador, meio ou diluente aquoso adequado, como salino ou ou- tro tampão. As composições formuladas podem estar na forma de uma poeira ou material granular ou uma suspensão em óleo (vegetal ou mineral) ou água ou emulsões de óleo/água ou como um pó umectan- te ou em combinação com qualquer outro material transportador ade- quado para aplicação agrícola. Os veículos agrícolas adequados po- dem ser sólidos ou líquidos e são bem conhecidos na técnica. O termo "veículo agricolamente aceitável" abrange todos os adjuvantes, por exemplo, componentes inertes, dispersantes, tensoativos, aprimorado- res de pegajosidade, aglutinantes, etc. que são usados de modo co- mum na tecnologia da formulação de inseticidas; esses são bem co- nhecidos por aqueles versados na técnica da formulação de insetici-

das. As formulações podem ser misturadas com um ou mais adjuvan- tes sólidos ou líquidos e preparadas por vários meios, por exemplo, por mistura de modo homogêneo, mescla e/ou trituração da composi- ção inseticida com adjuvantes adequados com o uso de técnicas de formulação convencionais. De modo similar, a formulação pode ser misturada com vários materiais inertes, como minerais inorgânicos (fi- lossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, e similares) ou materiais botânicos (sabugos de milho em pó, cascas de arroz, cascas de no- zes, e similares). As formulações podem incluir adjuvantes espalhan- tes-adesivos, agentes estabilizantes, outros aditivos pesticidas ou ten- soativos. As formulações líquidas podem ser de base aquosa ou não aquosa e empregues como espumas, suspensões, concentrados emulsionáveis, ou similares. Os ingredientes podem incluir agentes reológicos, tensoativos, emulsificantes, dispersantes ou polímeros.

[00204] Em algumas modalidades, a composição que compreende o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo pode ser apli- cada na forma de composições e pode ser aplicada ao campo de cul- tura ou planta a ser tratada, simultaneamente ou em sucessão, com outros compostos. Esses compostos podem ser fertilizantes, extermi- nadores de gramíneas, crioprotetores, tensoativos, detergentes, sabo- netes pesticidas, óleos inativos, polímeros e/ou formulações de trans- portador de liberação por tempo ou biodegradável que permite a dosa- gem a longo prazo de uma área de direcionamento após uma aplica- ção única da formulação. Os mesmos também podem ser herbicidas seletivos, inseticidas químicos, virucidas, microbiocidas, amebicidas, pesticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscicidas ou mis- turas de diversas de essas preparações, se desejado, junto com transportadores adicionais agricolamente aceitáveis, tensoativos ou adjuvantes de promoção de aplicação empregues de modo costumeiro na técnica da formulação. Os transportadores e adjuvantes adequados podem ser sólidos ou líquidos e correspondem às substâncias empre- gues de modo comum na tecnologia da formulação, por exemplo, substâncias minerais naturais ou regeneradas, solventes, dispersan- tes, agentes umectantes, aprimoradores de pegajosidade, aglutinantes ou fertilizantes. De modo similar, as formulações podem ser prepara- das em "iscas" comestíveis ou fabricadas em "armadilhas" para praga para permitir alimentação ou ingestão da formulação pesticida por uma praga alvo.

[00205] Os métodos de aplicação da composição que compreende o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo incluem apli- cação a folhas, revestimento de sementes e aplicação ao solo. Outras técnicas de aplicação, por exemplo, pulverização, salpicamento de pó, imersão, injeção de solo, revestimento de sementes, revestimento de mudas, aspersão, aeração, nebulização, atomização, e similares, tam- bém são viáveis e podem ser necessárias sob determinadas circuns- tâncias, como, por exemplo, insetos que causam infestação de raízes ou caules ou para aplicação em vegetação delicada ou plantas orna- mentais. Os procedimentos de aplicação também são bem conhecidos pelos versados na técnica. As composições da presente descrição são aplicadas ao ambiente do inseto alvo, tipicamente à folhagem e à ri- zosfera (o solo que circunda as raízes das plantas) da planta ou cultu- ra a ser protegida, por métodos convencionais, por exemplo, por as- persão.

[00206] Em modalidades adicionais da presente descrição, as com- posições que compreendem o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma vari- ante do mesmo da presente descrição encontrarão utilidade específica como inseticidas para aplicação tópica ou sistêmica a culturas, gramí- neas, frutas e vegetais e plantas ornamentais. Em uma modalidade, a composição compreende uma suspensão fluxível de células bacteria- nas que expressa uma proteína inovadora descrita no presente docu-

mento. Por exemplo, a célula hospedeira bacteriana expressa os seg- mentos de ácidos nucleicos inovadores descritos no presente docu- mento e produz uma proteína.

[00207] Em uma outra modalidade, a composição compreende o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é fornecida co- mo um grânulo dispersível em água. Este grânulo compreende células bacterianas que expressam uma proteína inovadora como revelado no presente documento. As células bacterianas exemplificadoras incluem células de B. thurigiensis, B. megaterium, B. subtilis, E. coli ou Pseu- domonas spp. que foram transformadas com um segmento de DNA revelado no presente documento e expressam a proteína e também são contempladas como úteis.

[00208] Em uma modalidade adicional, a composição compreende o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é fornecida como um pó, poeira, pélete ou concentrado coloidal. Esta forma de composição compreende células bacterianas que expressam uma pro- teína inovadora como descrita no presente documento. Tais formas secas das composições inseticidas podem ser formuladas para disso- lução imediata sob umedecimento, ou alternativamente, dissolução sob a forma de liberação controlada, liberação sustentada ou depen- dente do tempo. As células bacterianas exemplificadoras incluem célu- las de B. thurigiensis, B. megaterium, B. subtilis, E. coli ou Pseudomo- nas spp. que foram transformadas com um segmento de DNA revela- do no presente documento e expressam a proteína e também são con- templadas como úteis.

[00209] Em ainda outra modalidade, a composição que compreen- de o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é fornecida como uma suspensão aquosa de células bacterianas como aquelas descritas acima que expressam a proteína. Tais suspensões aquosas podem ser fornecidas como uma solução estoque concentrada que é diluída antes da aplicação, ou alternativamente, como uma solução diluída pronta a ser aplicada.

[00210] A composição da presente descrição pode ser empregue no método da descrição individualmente ou em combinação com ou- tros compostos, incluindo e sem limitação, outros pesticidas. Esses métodos também podem ser usados em conjunto com outros trata- mentos como tensoativos, detergentes, polímeros ou formulações de liberação temporizada. As composições inseticidas da presente des- crição podem ser formuladas para uso sistêmico ou tópico.

[00211] Em outras modalidades da presente descrição, as plantas também podem ser tratadas pelo polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo com uma ou mais composições químicas, incluindo um ou mais herbicidas, inseticidas ou fungicidas.

[00212] Independentemente do método de aplicação ou do teor da composição, a quantidade do(s) componente(s) ativo(s) é aplicada em uma quantidade eficaz como inseticida, que irá variar dependendo de tais fatores como, por exemplo, os insetos específicos que serão con- trolados, a planta ou cultura específica que será tratada, as condições ambientais, e o método, taxa e quantidade de aplicação da composi- ção eficaz como inseticida. O número de aplicações e a taxa de apli- cação dependem da intensidade da infestação pela praga correspon- dente. De modo similar, a resistência e duração da aplicação inseticida serão definidas em relação a condições específicas da(s) praga(s), cultura(s) específica(s) que serão tratadas e condições ambientais es- pecíficas. A razão proporcional de ingrediente ativo para veículo natu- ralmente dependerá da natureza química, solubilidade e estabilidade da composição, bem como a formulação específica contemplada.

[00213] A concentração de composição que é usada para aplicação ambiental, sistêmica ou do solo variará amplamente, dependendo da natureza da formulação específica, meios de aplicação, condições ambientais e grau de atividade biocida. Tipicamente, a composição estará presente na formulação aplicada a uma concentração de pelo menos cerca de 1% em peso e pode ser até e incluindo cerca de 99% em peso. As formulações secas das composições podem ser de cerca de 1% a cerca de 99% ou mais em peso da composição, enquanto as formulações líquidas geralmente podem compreender de cerca de 1% a cerca de 99% ou mais do ingrediente ativo em peso. Em outro caso, a composição pode ser administrada a uma planta específica ou área alvo em uma ou mais aplicações, conforme necessário, com uma taxa de aplicação de campo de cultura típica por hectare na faixa da ordem de cerca de 50 g a cerca de 500 g de ingrediente ativo, ou de cerca de 500 g a cerca de 1000 g, ou de cerca de 1000 g a cerca de 5000 g ou mais de ingrediente ativo. Produto de Consumo

[00214] Em uma modalidade, a presente descrição inclui um produ- to de consumo. Em determinados aspectos, o produto de consumo é produzido dentro da planta transgênica da presente descrição. Produ- tos de consumo exemplificativos incluem concentrado de proteína, iso- lado de proteína, grãos, sêmola, farinha, óleo ou fibra. Em outros exemplos, tais produtos de consumo podem incluir sementes inteiras ou processadas, ração animal contendo plantas transgênicas da pre- sente descrição ou planta transgênica por subprodutos, óleo, sêmola, farinha, amido, flocos, farelo, biomassa e restolho e produtos combus- tíveis e subprodutos combustíveis, quando fabricados a partir de plan- tas ou partes de plantas transgênicas.

[00215] Além disso, os produtos de consumo podem ser vendidos a consumidores e podem ser viáveis ou não viáveis. Os produtos de consumo não viáveis incluem, porém sem limitação, sementes não vi- áveis; sementes processadas, partes de sementes e partes de plantas; sementes e partes de plantas processadas para ração ou alimento,

óleo, sêmola, farinha, flocos, farelo, biomassas e produtos combustí- veis. Os produtos de consumo viáveis incluem, porém sem limitação, sementes, plantas e células vegetais. Dessa forma, as plantas que compreendem os polinucleotídeos e polipeptídeos da presente descri- ção podem ser usadas para fabricar qualquer produto de consumo ti- picamente adquirido a partir de tal planta de cultura transgênica. Método de Expressão de um Transgene

[00216] Em uma modalidade, um método de expressão da sequên- cia de polinucleotídeos de interesse dentro de uma planta compreende desenvolver uma planta que contém um gene que codifica o polipeptí- deo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo ligado de maneira funci- onal a pelo menos um elemento regulador ou uma sequência de polili- gantes. Em uma modalidade, o gene que codifica o polipeptídeo IR- DIG37126 consiste em uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36 ou uma sequência que tem 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36. Em uma outra modali- dade, o gene que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ou 100% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Em uma modalidade, um método para expressar pelo menos uma sequência de polinucleotídeos de interesse em um tecido vegetal ou célula vegetal compreendendo cultivar um tecido vegetal ou célula vegetal que contém um gene que codifica o polipeptídeo IR- DIG37126 ligado de maneira funcional a pelo menos um transgene. Em uma modalidade adicional, um método para expressar um gene que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo contido no interior de uma planta resulta na proteção da planta contra uma praga de insetos.

[00217] Em uma modalidade, um método de expressão da sequên- cia de polinucleotídeos de interesse dentro de uma planta compreende desenvolver uma planta que contém um cassete de expressão gênica que compreende um gene que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo ligado de maneira funcional a pelo menos um elemento regulador ou uma sequência de poliligantes. Em uma moda- lidade, o cassete de expressão gênica que compreende um gene que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 consiste em uma sequência sele- cionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36 ou uma se- quência que tem 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequên- cia com uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36. Em uma outra modalidade, o cassete de expressão gêni- ca que compreende um gene que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99% ou 100% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Em uma modalidade, um mé- todo para expressar pelo menos uma sequência de polinucleotídeos de interesse em um tecido vegetal ou célula vegetal compreende culti- var um tecido vegetal ou célula vegetal que contém um cassete de ex- pressão gênica que compreende um gene que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo ligado de maneira funcional a pelo menos um transgene. Em uma modalidade adicional, o método para expressar um gene que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 a partir de um cassete de expressão gênica contido no interior de uma planta resulta na proteção da planta contra uma praga de insetos.

[00218] Em uma modalidade, um método de expressão da sequên- cia de polinucleotídeos de interesse dentro de um micro-organismo compreende desenvolver um micro-organismo que contém um cassete de expressão gênica que compreende um gene que codifica o polipep- tídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo ligado de maneira fun- cional a pelo menos um elemento regulador ou uma sequência de poli- ligantes. Em uma modalidade, o cassete de expressão gênica que compreende um gene que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 consis- te em uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36 ou uma sequência que tem 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 99,5% de identidade de sequência com uma sequência selecionada dentre a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:25 a 36. Em uma outra modalidade, o cassete de expressão gênica que compreende um gene que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 compreende um polipeptídeo que tem pelo menos 80%, 82,5%, 85%, 87,5%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99% ou 100% de identidade com a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:13 a 24. Em uma modalidade, um método para expressar pelo menos uma se- quência de polinucleotídeos de interesse em um micro-organismo compreende cultivar um tecido vegetal ou célula vegetal que contém um cassete de expressão gênica que compreende um gene que codi- fica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo ligado de maneira funcional a pelo menos um transgene. Em uma modalidade adicional, o método para expressar um gene que codifica o polipeptí- deo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo a partir de um cassete de expressão gênica contido no interior de um micro-organismo resulta na produção de uma proteína com atividade inseticida.

[00219] Em algumas modalidades, o gene que codifica o polipeptí- deo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é expresso na planta, célula vegetal, parte da planta, ou semente da planta de uma maneira constitutiva. Em um aspecto de uma tal modalidade, a expressão constitutiva dirige a transcrição em todos ou quase todos os tecidos o tempo todo. Consequentemente, a expressão constitutiva está mais ou menos em um nível de estado estacionário ao longo do desenvolvi- mento. Em outras modalidades, o gene que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo é expresso na planta, célula vegetal, parte da planta, ou semente da planta de uma maneira prefe- rencial do tecido. Em um aspecto de uma tal modalidade, a expressão preferencial do tecido é expressa apenas em determinados tipos de tecidos ou em determinados momentos durante o desenvolvimento.

ATIVIDADE INSETICIDA

[00220] Em uma modalidade, a presente descrição fornece o poli- peptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo que confere ativida- de inseticida. Também são fornecidas as sequências de polinucleotí- deos que codificam o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo. A proteína de IRDIG37126 resultante da tradução dessas se- quências de polinucleotídeos permite o controle ou extermínio de pra- gas de insetos que ingerem o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma vari- ante do mesmo. Em um aspecto desta modalidade, o polipeptídeo IR- DIG37126 ou variante do mesmo é oralmente ativo no fornecimento de atividade inseticida. Em aspectos adicionais, o polipeptídeo IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo pode ser usado para fornecer atividade inseticida contra pragas de insetos, em agronômicos econo- micamente importantes, florestas, estufas, plantas ornamentais para viveiros, alimentos e fibras, saúde pública e animal, estrutura domésti- ca e comercial, pragas domésticas e de produtos armazenados. Em outros aspectos, o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mes- mo fornece atividade inseticida tóxica contra uma ou mais pragas de insetos. Exemplos de tais pragas de insetos incluem, porém sem limi- tação, membros das ordens Lepidoptera, Diptera, Hemiptera e Coleop- tera ou do filo Nematoda ou uma proteína que tem homologia com tal proteína.

[00221] Em algumas modalidades, a atividade inseticida é fornecida contra pragas de Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros, Nemátodos, Hemípteros ou Coleópteros. Em aspectos adicionais desta modalida- de, as pragas de Lepidópteros, Dípteros, Heterópteros, Nemátodos, Hemípteros ou Coleópteros podem ser exterminadas ou reduzidas em número pelos métodos da descrição. Em modalidades adicionais, a atividade inseticida é fornecida contra Lagarta falsa-medideira de mo- do que a Lagarta falsa-medideira possa ser exterminada ou reduzida em número pelos métodos da descrição. Em outras modalidades, a atividade inseticida é fornecida contra percevejo de modo que a praga de percevejo possa ser exterminada ou reduzida em número pelos métodos da descrição.

[00222] Em outras modalidades da presente descrição, são forneci- dos métodos para produzir os polipeptídeos e para utilizar o polipeptí- deo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo para controlar, inibir o crescimento ou exterminar uma praga de Lepidópteros, Coleópteros, Nemátodos, Hemípteros e/ou Dípteros. Em algumas modalidades, as plantas transgênicas da presente descrição são manipuladas para ex- pressar um ou mais polinucleotídeos que codificam o polipeptídeo IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo como revelado no presente do- cumento. Em várias modalidades, as plantas transgênicas compreen- dem ainda um ou mais genes adicionais para resistência a inseto, por exemplo, um ou mais genes adicionais para controlar pragas de Co- leópteros, Lepidópteros, Hemípteros, Dípteros e/ou Nematódeos.

[00223] O polipeptídeo IRDIG37126 exemplificador ou uma variante do mesmo encontra uso para controlar, inibir o crescimento ou exter- minar populações de pragas de Lepidópteros e Hemípteros e para produzir composições com atividade inseticida contra tais insetos. In- cluídos como pragas de insetos de interesse estão adultos e ninfas. As pragas de insetos de interesse incluem, porém sem limitação, a super- família de percevejos e outros insetos relacionados, incluindo, porém sem limitação, espécies que pertencem à família Pentatomidae (Neza- ra viridula, Halyomorpha halys, Piezodorus guildini, Euschistus servus, Acrosternum hilare, Euschistus heros, Euschistus tristigmus, Acroster- num hilare, Dichelops furcatus, Dichelops melacanthus e Bagrada hila- ris (besouro Bagrada)), à família Plataspidae (Megacopta cribraria - plataspidae de feijão) e à família Cydnidae (Scaptocoris castanea - percevejo da raiz) e espécies de Lepidoptera, incluindo, porém, sem limitação: Lagarta falsa-medideira, por exemplo, Pseudoplusia inclu- dens ou Chrysodeixis includens.

[00224] Espécies agronomicamente importantes de interesse da ordem Hemiptera incluem, porém sem limitação: Acrosternum hilare Say (percevejo verde); Anasa tristis De Geer (escaravelho da abóbo- ra); Blissus leucopterus leucopterus Say (escaravelho das gramíneas); Corythuca gossypii Fabricius (escaravelho da renda de algodão); Cyr- topeltis modesta Distant (escaravelho do tomate); Dysdercus suturellus Herrich-Schäffer (percevejo manchador de algodão); Euschistus ser- vus Say (percevejo marrom); E. variolarius Palisot de Beauvois (perce- vejo manchado); Graptostethus spp. (complexo de escaravelhos de semente); Leptoglossus corculus Say (escaravelho de semente de pi- nheiro de pé em folha); Lygus lineolaris Palisot de Beauvois (escarave- lho manchado da planta); L. Hesperus Knight (escaravelho ocidental manchado da planta); L. pratensis Linnaeus (escaravelho comum de prado); L. rugulipennis Poppius (escaravelho europeu manchado da planta); Lygocoris pabulinus Linnaeus (capsídeo verde comum); Neza- ra viridula Linnaeus (percevejo verde do sul); Oebalus pugnax Fabri- cius (percevejo do arroz); Oncopeltus fasciatus Dallas (escaravelho grande da asclépia); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do al- godão).

[00225] Além disso, as modalidades podem ser eficazes contra Hemiptera, como Calocoris norvegicus Gmelin (percevejo do moran- go); Orthops campestris Linnaeus; Plesiocoris rugicollis Fallen (capsí- deo da maçã); Cyrtopeltis modestus Distant (percevejo do tomate); Cyrtopeltis notatus Distant (mosca sugadora); Spanagonicus albofas- ciatus Reuter (pulga com marca branca); Diaphnocoris chlorionis Say (percevejo de espinheiro-da-virgínia); Labopidicola allii Knight (perce- vejo da cebola); Pseudatomoscelis seriatus Reuter (pulga do algodão); Adelphocoris rapidus Say (percevejo de planta rápida); Poecilocapsus lineatus Fabricius (percevejo de planta de quatro linhas); Nysius ericae Schilling (percevejo das gramíneas falso); Nysius raphanus Howard (percevejo das gramíneas falso); Nezara viridula Linnaeus (capsídeo verde comum); Eurygaster spp.; Coreidae spp.; Pyrrhocoridae spp.; Tinidae spp.; Blostomatidae spp.; Reduviidae spp. e Cimicidae spp.

[00226] Os métodos para medir a atividade inseticida são bem co- nhecidos na técnica. Consultar, por exemplo, Czapla e Lang, (1990) J. Econ. Entomol. 83:2.480-2.485; Andrews, et al., (1988) Biochem. J. 252:199-206; Marrone, et al., (1985) J. of Economic Entomology 78:290-293 e a Patente U.S. n.º 5.743.477, todos os quais estão incor- porados no presente documento a título de referência em sua totalida- de. Geralmente, a proteína é misturada e usada em ensaios de ali- mentação. Consultar, por exemplo, Marrone, et al., (1985) J. of Eco- nomic Entomology 78:290-293. Tais ensaios podem incluir colocar plantas em contato com uma ou mais pragas e determinar a habilidade da planta para sobreviver e/ou causar o extermínio das pragas. Para cada substância ou organismo, a quantidade eficaz como inseticida é determinada empiricamente para cada praga afetada em um ambiente específico. Métodos de Inibição de Crescimento ou Extermínio de uma Praga de Insetos e Controle de uma População de Insetos

[00227] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de insetos compreen- dendo colocar a praga de insetos em contato com uma quantidade efi- caz em termos inseticidas de um polipeptídeo recombinante IR- DIG37126. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de insetos, compreen- dendo colocar a praga de insetos em contato com uma quantidade efi- caz em termos inseticidas de uma proteína pesticida recombinante da SEQ ID NO:2 ou uma variante do mesmo.

[00228] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de pragas de insetos que compreendem co- locar a população de praga de insetos em contato com uma quantida- de eficaz em termos inseticidas de um polipeptídeo IRDIG37126 re- combinante ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de pragas de inseto que compreendem colocar a população de pragas de inseto em contato com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de um pro- teína pesticida recombinante da SEQ ID NO:2 ou uma variante da mesma.

[00229] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de pragas de insetos resistente a uma prote- ína pesticida, que compreendem colocar a população de praga de in- setos em contato com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de um polipeptídeo IRDIG37126 recombinante ou uma variante do mes- mo. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para controlar uma população de pragas de inseto resistente a uma proteína pestici- da que compreendem colocar a população de pragas de inseto em contato com uma quantidade eficaz em termos inseticidas de uma pro- teína pesticida recombinante da SEQ ID NO:2 ou uma variante da mesma.

[00230] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para proteger uma planta de uma praga de insetos, que compreendem ex- pressar na planta ou célula da mesma um polinucleotídeo IRDIG37126 recombinante ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para proteger uma planta de uma praga de insetos que compreendem expressar na planta ou célula da mesma uma proteína pesticida recombinante da SEQ ID NO:2 ou variantes da mesma. Estratégias de Gerenciamento de Resistência a Insetos (IRM)

[00231] Uma maneira para aumentar a eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir ao mesmo tempo o desen- volvimento de pragas resistentes a inseticidas é fornecer refúgios (uma seção de culturas/milho não inseticidas) não transgênicos (isto é, pro- teínas não inseticidas) para uso com culturas transgênicas que produ- zem uma proteína inseticida única ativa contra pragas-alvo. A United States Environmental Protection Agency (epa.gov/oppbppdl/biopesticides/pips/bt_corn_refuge—2006.htm, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) publica as exigências para o uso com culturas transgênicas que produzem uma única proteí- na Bt ativa contra pragas-alvo. Além disso, a National Corn Growers Association, em seu site da web: (ncga.com/insect-resistance- management-fact-sheet-bt-corn, que pode ser acessado com o uso do prefixo www) também fornece orientação similar em relação a exigên- cias de refúgio. Devido a perdas para insetos dentro da área de refú- gio, refúgios maiores podem reduzir o rendimento geral.

[00232] Outra maneira para aumentar a eficácia dos inseticidas transgênicos contra pragas-alvo e reduzir ao mesmo tempo o desen- volvimento de pragas resistentes a inseticidas consistiria em ter um depósito de genes inseticidas que são eficazes contra grupos de pra- gas de insetos e que manifestam seus efeitos através de modos de ação diferentes.

[00233] A expressão em uma planta de duas ou mais composições inseticidas tóxicas para a mesma espécie de inseto, em que cada inse- ticida é expresso em níveis eficazes, seria outra maneira para alcançar o controle do desenvolvimento de resistência. Isso baseia-se no prin- cípio de que a evolução de resistência contra dois modos de ação se- parados é muito mais improvável do que contra apenas um. Roush, por exemplo, destaca estratégias com duas toxinas, também chama- das de "formação de pirâmide" ou "empilhamento" para o gerencia- mento de culturas transgênicas inseticidas. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353:777 a 1786). O empilhamento ou formação de pirâmide de duas proteínas diferentes, cada uma eficaz contra as pragas-alvo e com pouca ou nenhuma resistência cruzada, pode permitir uso de um refúgio menor. A U.S. Environmental Protec- tion Agency exige significativamente menos refúgio estruturado (ge- ralmente 5%) de milho não Bt a ser plantado em relação aos produtos de traço único (geralmente 20%). Há várias maneiras para fornecer os efeitos de IRM de um refúgio, incluindo vários padrões de plantio geo- métricos nos campos de cultura e misturas de sementes em bolsas, conforme discutido ainda por Roush.

[00234] Em algumas modalidades, o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo da descrição são úteis como uma estratégia de gerenciamento de resistência a inseto em combinação (isto é, em pirâmide) com outras proteínas pesticidas incluem, mas sem limitação, toxinas Bt, proteínas inseticidas de Xenorhabdus sp. ou Photorhabdus sp. e similares.

[00235] São fornecidos métodos para controlar infestação (ou infes- tações) de insetos Lepidoptera e/ou Hemiptera em uma planta trans- gênica que promovem gerenciamento de resistência a inseto que compreendem expressar na planta pelo menos duas proteínas inseti-

cidas diferentes que têm diferentes modos de ação.

[00236] Em algumas modalidades, nos métodos de controle de in- festação de insetos Lepidoptera e/ou Hemiptera em uma planta trans- gênica e promoção de gerenciamento de resistência a insetos, a pelo menos uma dentre as proteínas inseticidas compreende um polipeptí- deo de IRDIG37126 ou uma variante do mesmo inseticida para insetos na ordem Lepidoptera e/ou Hemiptera.

[00237] Em algumas modalidades, os métodos para controlar a in- festação de insetos Lepidoptera e/ou Hemiptera em uma planta trans- gênica e promover o gerenciamento de resistência a insetos, a pelo menos uma das proteínas inseticidas compreende uma proteína da SEQ ID NO:2 variantes do mesmo, inseticidas para insetos na ordem Lepidoptera e/ou Hemiptera.

[00238] Em algumas modalidades, os métodos de controle de infes- tação de insetos Lepidoptera e/ou Hemiptera em uma planta transgê- nica e de promoção de gerenciamento de resistência a insetos com- preendem expressar na planta transgênica um polipeptídeo de IR- DIG37126 ou uma variante do mesmo e uma proteína Cry inseticida para insetos na ordem Lepidoptera e/ou Hemiptera que têm diferentes modos de ação.

[00239] Em algumas modalidades, os métodos de controle de infes- tação de insetos Lepidoptera e/ou Hemiptera em uma planta transgê- nica e de promoção de gerenciamento de resistência a insetos com- preendem na planta transgênica uma proteína da SEQ ID NO:2 ou va- riantes da mesma e uma proteína Cry inseticida para insetos na ordem Lepidoptera e/ou Hemiptera que têm diferentes modos de ação.

[00240] Também são fornecidos métodos de redução da probabili- dade de emergência de resistência de insetos Lepidoptera e/ou Hemi- ptera a plantas transgênicas que expressam nas plantas proteínas inseticidas para controlar as espécies de inseto, compreendendo a ex-

pressão de um polipeptídeo IRDIG37126 ou variante do mesmo inseti- cida para as espécies de inseto em combinação com uma segunda proteína inseticida para as espécies de inseto que têm diferentes mo- dos de ação.

[00241] Também são fornecidos métodos de redução da probabili- dade de emergência de resistência de insetos Lepidoptera e/ou Hemi- ptera a plantas transgênicas que expressam nas plantas proteínas inseticidas para controlar as espécies de inseto,compreendendo a ex- pressão de uma proteína da SEQ ID NO:2 ou variantes da mesma, inseticida para as espécies de inseto em combinação com uma se- gunda proteína inseticida para as espécies de inseto que têm diferen- tes modos de ação.

[00242] Também são fornecidos meios para o gerenciamento de resistência a insetos Lepidoptera e/ou Hemiptera eficaz de plantas transgênicas que compreendem coexpressar em altos níveis nas plan- tas duas ou mais proteínas inseticidas tóxicas para insetos Lepidopte- ra e/ou Hemiptera, sendo que cada uma exibe um modo diferente de efetuar sua inibição de crescimento ou atividade de extermínio, em que as duas ou mais proteínas inseticidas compreendem um polipeptí- deo de IRDIG37126 ou variante do mesmo e uma proteína Cry. Tam- bém são fornecidos meios para o gerenciamento eficaz de resistência a insetos Lepidoptera e/ou Hemiptera de plantas transgênicas com- preendendo coexpressar em altos níveis nas plantas duas ou mais proteínas inseticidas tóxicas para insetos Lepidoptera e/ou Hemiptera, mas cada uma exibe um modo diferente de efetuar sua inibição de crescimento ou atividade, em que as duas ou mais proteínas insetici- das compreendem uma proteína da SEQ ID NO:2 ou variantes da mesma e uma proteína Cry.

[00243] Além disso, são fornecidos métodos para obter aprovação regulamentadora para plantio ou comercialização de plantas que ex-

pressam proteínas inseticidas para insetos da ordem Lepidoptera e/ou Hemiptera que compreendem a etapa de etapa de se referir, submeter ou depender dos dados de ligação de ensaios de insetos que mostram que o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo não com- pete com sítios de ligação para proteínas Cry em tais insetos. Além disso, são fornecidos métodos para obter aprovação regulamentadora para plantio ou comercialização de plantas que expressam proteínas inseticidas para insetos da ordem Lepidoptera e/ou Hemiptera que compreendem a etapa de etapa de se referir, submeter ou depender dos dados de ligação de ensaios de insetos que mostram que a prote- ína da SEQ ID NO:2 ou uma variante da mesma não compete com sí- tios de aglutinação para proteínas Cry em tais insetos.

[00244] O uso de proteínas Cry como traços de planta transgênica é bem conhecido por um indivíduo versado na técnica e plantas trans- gênicas Cry incluindo, mas sem limitação, Cry1Ac, Cry1Ac+Cry2Ab, Cry1Ab, Cry1A.105, Cry1F, Cry1Fa2, Cry1F+Cry1Ac, Cry2Ab, Cry3A, mCry3A, Cry3Bb1, Cry34Ab1, Cry35Ab1, Vip3A, mCry3A, Cry9c e CBI-Bt receberam a aprovação regulatória (consultar Sanahuja, (2011) Plant Biotech Journal 9:283-300 e CERA (2010) GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment (CERA), ILSI Research Foundation, Washington D.C. em cera- gmc.org/index.php?action=gm_crop_database, que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). Mais de uma proteína pesticida bem conhecida por um indivíduo ver- sado na técnica também pode ser expressa em plantas como Vip3Ab e Cry1Fa (US2012/0317682), Cry1BE e Cry1F (US2012/0311746), Cry1CA e Cry1AB (US2012/0311745), Cry1F e CryCa (US2012/0317681), Cry1DA e Cry1BE (US2012/0331590), Cry1DA e Cry1Fa (US2012/0331589), Cry1AB e Cry1BE (US2012/0324606) e Cry1Fa e Cry2Aa, Cry1I ou Cry1E (US2012/0324605). As proteínas pesticidas também incluem lipases inseticidas incluindo acil hidrolases lipídicas da Patente n.º U.S. 7.491.869, e colesterol oxidases como de Streptomyces (Purcell et al. (1993) Biochem Biophys Res Commun 15:1406-1413). As proteínas pesticidas também incluem toxinas VIP (proteínas inseticidas vegetativas) da Patente n.º U.S. 5.877.012,

6.107.279, 6.137.033, 7.244.820, 7.615.686 e 8.237.020, e similares. Outras proteínas VIP são bem conhecidas por um versado na técnica (consultar lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html que pode ser acessado pela rede mundial de computadores com o uso do prefixo "www"). As proteínas pesticidas também incluem proteínas de complexo de toxina (TC), obteníveis a partir de organismos, como Xe- norhabdus, Photorhabdus e Paenibacillus (consultar as Patentes nú- meros U.S. 7.491.698 e 8.084.418). Algumas proteínas TC têm ativi- dade inseticida "autônoma" e outras proteínas TC melhoram a ativida- de das toxinas autônomas produzidas pelo mesmo dado organismo. A toxicidade de uma proteína TC "independente" (de Photorhabdus, Xe- norhabdus ou Paenibacillus, por exemplo) pode ser aumentada por um ou mais "potenciadores" de proteína TC derivados de um organismo- fonte de um gênero diferente. Há três tipos principais de proteínas TC. Conforme referido no presente documento, as proteínas de Classe A ("Proteína A") são toxinas autônomas. As proteínas de Classe B ("Pro- teína B") e as proteínas de Classe C ("Proteína C") melhoram a toxici- dade das proteínas de Classe A. Os exemplos de proteínas de Classe A são TcbA, TcdA, XptA1 e XptA2. Os exemplos de proteínas de Clas- se B são TcaC, TcdB, XptB1Xb e XptC1Wi. Os exemplos de proteínas de Classe C são TccC, XptC1Xb e XptB1Wi. As proteínas pesticidas também incluem proteínas de veneno de aranha, cobra e escorpião. Os exemplos de peptídeos de veneno de aranha incluem, mas sem limitação, peptídeos de licotoxina-1 e mutantes dos mesmos (Patente n.o US 8.334.366).

[00245] Em uma modalidade adicional, um método para expressar um gene que codifica o polipeptídeo IRDIG37126 ou uma variante do mesmo no interior de uma planta resulta na proteção da planta contra uma praga de insetos.

[00246] Os exemplos a seguir são fornecidos para ilustrar determi- nados recursos e/ou modalidades específicos. Os exemplos não de- vem ser interpretados como limitando a descrição aos recursos ou modalidades específicos exemplificados.

EXEMPLOS Exemplo 1: Métodos para o enriquecimento de espécies microbianas que contêm proteínas ativas de hemípteros de espécimes de insetos

[00247] Aquisição e armazenamento de insetos: Micro-organismos foram isolados de insetos capturados em um campo de cultivo de soja no Mississippi e insetos capturados em uma armadilha luminosa Dyna- trap™ no Indiana. Os insetos do Mississippi foram capturados vivos e imediatamente congelados em gelo seco, enquanto os insetos do Indi- ana estavam quase mortos e em decomposição após serem captura- dos no Dynatrap™ por um período de 4 a 6 semanas. Os insetos no Dynatrap™ eram insetos predominantemente voadores como moscas, mariposas, mosquitos e besouros. Os insetos do Mississippi incluíam um grande número de gafanhotos, percevejos e lagartas. Todos os insetos foram armazenados a -80C até imediatamente antes do enri- quecimento.

[00248] Preparações de meios: Três tipos diferentes de meios fo- ram usados para o enriquecimento microbiano. Para o enriquecimento de espécie Pseudomonas, o suplemento Agar Pseudomonas Oxoid + CFC (ThermoFisher, St. Louis, MO) foi preparado de acordo com as instruções do fabricante. Para o enriquecimento de espécie do grupo Bacillus cereus, o agar base Bacillus Cereus Oxoid Brilliance (Ther- moFisher, St. Louis, MO) foi usado de acordo com as instruções do fabricante com a exceção que trimetoprim e sulfato de polimixina B foram adquiridos individualmente e adicionados aos meios esteriliza- dos a uma concentração final de 10 mg/l e 100.000 unidades/l, respec- tivamente. Além disso, o pó de agar miller LB não seletivo também foi preparado sem suplementos adicionais. Aproximadamente 250 ml de meios esterilizados que contêm os suplementos indicados foram der- ramados em bandejas de 240 mm x 240 mm e deixados solidificar.

[00249] Preparação de amostra para plaqueamento: Cerca de 1 a 5 gramas de insetos obtidos do Mississippi e Indiana foram transferidos para tubos cônicos de 50 ml contendo esferas de aço de 3/16 polega- das e homogeneizados por agitação vigorosa até um pó (para insetos obtidos em Indiana) ou um homogenato viscoso (insetos obtidos no Mississippi). Aos insetos homogeneizados foram adicionados aproxi- madamente 25 ml de solução de cloreto de sódio a 1% p/v. A solução foi brevemente submetida a vórtice e, então, as esferas de aço e mate- rial de inseto residual foram removidos por filtragem em gaze. Uma solução de cloreto de sódio adicional a 1% p/v foi adicionada a 50 ml, brevemente submetida a vórtice e, então, centrifugada a 5000 RPM por 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e o pélete foi ressus- penso por pipetagem para cima e para baixo em ~5 ml de solução sa- lina. Esse material foi, então, imediatamente colocado em placas (para enriquecimento de Pseudomonas) ou pasteurizado por calor para enri- quecimento de esporulados. A pasteurização por calor foi realizada em tubos de microcentrífuga de 2 ml contendo 1 ml do pélete ressuspen- so. Os tubos foram aquecidos durante 12 minutos a 80C e 900 RPM em um termomisturador e, então, plaqueados o mais rápido possível (tipicamente entre 2 a 4 minutos após a remoção do termomisturador).

[00250] Plaqueamento Tipicamente, 0,5 a 1 ml de amostra de inse- to adequadamente diluída foi plaqueado sobre a bandeja de meio de cultura solidificado. Essas condições foram otimizadas para obter o maior número possível de colônias bacterianas, sem formar um gra- mado bacteriano na placa. As placas foram incubadas a 28 a 30C du- rante 16 a 24 horas antes da coleta.

[00251] Extração de DNA: As células foram coletadas por raspagem das colônias diretamente da superfície das placas de ágar em tubos cônicos de 50 ml. O DNA foi extraído das células usando um kit de iso- lamento Power Lyzer Power Soil DNA™ (Mo Bio Laboratories, Carls- bad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O sistema de preparação de amostra fastprep foi usado para lise celular com uma velocidade de 6 m/s durante 45 segundos. A qualidade de DNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose. A amostra de DNA obtida foi submetida a sequenciamento em um Illumina NextSeq 500™ usan- do reagentes de sequenciamento de extremidade emparelhada de 2x150 de acordo com as instruções do fabricante. Exemplo 2: Sequenciamento e identificação de supostas proteínas inseticidas ativas de hemípteros inovadoras

[00252] Análise de dados: Uma biblioteca de sequenciamento Illu- mina foi preparada a partir de cada amostra de DNA metagenômico seguindo os procedimentos padrão no NGS COE. As bibliotecas foram agrupadas e sequenciadas usando um kit de sequenciamento Mid- output de extremidade emparelhada de 2x150 em um sequenciador NextSeq500™. Aproximadamente 10 a 20 milhões de leituras de ex- tremidade emparelhada foram geradas por biblioteca e analisadas quanto à presença de potenciais proteínas inseticidas ativas de hemíp- teros usando um algoritmo TBLASTN interno. Com base nessa pes- quisa, quatro leituras de 18 milhões foram identificadas como perten- centes a uma provável monalisina ativa de hemípteros. Mais sequen- ciamento foi realizado nos enriquecimentos com evidência da provável monalisina ativa de hemípteros para acumular leituras suficientes para determinar a sequência completa do gene que foi identificado como

IRDIG37126. A sequência de polinucleotídeos (SEQ ID NO:1) da pro- vável monalisina ativa de hemípteros foi obtida e traduzida para uma sequência de polipeptídeos (SEQ ID NO:2).

[00253] IRDIG37126 foi comparado com outras sequências de pro- teínas monalisina conhecidas. Verificou-se que IRDIG37126 tinha 79,7% de identidade com PIP-1 (número de listagem de sequência de polinucleotídeos 2 da Patente U.S. n.º 9688730, fornecido no presente documento como a SEQ ID NO:3) e 74,2% de identidade com a mona- lisina prototípica de IRDIG22274 (n.º de acesso no GenBank WP_011534324, fornecido no presente documento como a SEQ ID NO:4). Consultar a Figura 1 para um alinhamento de proteína que foi concluído usando o programa AlignX do pacote Vector NTI Advance v11 (Invitrogen; Carlsbad, CA). Além disso, uma árvore filogenética da sequências de proteínas de IRDIG37126 foi concluída para comparar a proteína inovadora com outras sequências de proteínas monalisina conhecidas como mencionado na Tabela 1. Consultar a Figura 2 para uma árvore filogenética que foi concluída usando o programa Genei- ous versão n.º 11 (Kearse, M., et al., (2012). Geneious Basic: an inte- grated and extendable desktop software platform for the organization and analysis of sequence data. Bioinformatics, 28(12), 1647-1649.). A partir desta análise bioinformática, determinou-se que a sequência de proteínas inovadora de IRDIG37126 (SEQ ID NO:2) compartilhava no máximo 80,8% de identidade de sequência com uma sequência de proteínas monalisina conhecida (Tabela 1).

Tabela 1: Porcentagem de identidade de sequência de IRDIG37126 (SEQ ID NO:2) em comparação com outras sequências de proteínas conhecidas.

Nome e descrição de amostra Porcentagem de identida- de com IRDIG37126 (SEQ ID NO:2) O número de listagem de sequência de 80,6% polinucleotídeos 4 da Patente U.S. n.º 9688730, fornecido no presente docu- mento como a SEQ ID NO:5 n.º de acesso no GenBank 80,1% WP_078473056.1, fornecido no presente documento como a SEQ ID NO:6 n.º de acesso no GenBank 80,8% WP_020294695.1, fornecido no presente documento como a SEQ ID NO:7 e des- crito como IRDIG31502 PIP-1, fornecido no presente documento 79,7% como a SEQ ID NO:3 O número de listagem de sequência de 79,9% polinucleotídeos 9 do Pedido de Patente U.S. n.º 20170175134, fornecido no pre- sente documento como a SEQ ID NO:8 O número de listagem de sequência de 76,0% polinucleotídeos 332 da Patente U.S. n.º 9688730, fornecido no presente docu- mento como a SEQ ID NO:9 O número de listagem de sequência de 77,1% polinucleotídeos 82 do Pedido de Patente U.S. n.º 20170175134, fornecido no pre- sente documento como a SEQ ID NO:10 IRDIG22274, fornecido no presente do- 74,2% cumento como a SEQ ID NO:4 Exemplo 3: Avaliação de IRDIG37126 (SEQ ID NO:2) quanto à ativi- dade inseticida contra percevejo marrom neotropical.

[00254] Expressão de proteína e bioensaios de insetos: A sequên- cia de codificação de IRDIG37126 (SEQ ID NO:1) foi clonada no vetor pMAL c5x com uma etiqueta de expressão de proteína de ligação à maltose N-terminal. A proteína foi superexpressa em Escherichia coli e purificada de acordo com as instruções do fabricante usando resina de amilose (New England Biolabs, Ipswich, MA). A proteína isolada foi, então, utilizada em bioensaio baseado em dieta para avaliar a ativida- de inseticida da proteína contra pragas de insetos específicas.

[00255] A proteína de IRDIG37126 eluída foi testada contra as es- pécies de insetos hemípteros, Euschistus servus que é comumente conhecido como o percevejo marrom (BSB), a uma alta dose e consi- derada ativa (Figura 3, Tabela 2). Um bioensaio de alimentação à alta dose foi concluído, em que 2500 ppm da proteína purificada foram aplicados à dieta de BSB em uma placa de 24 poços ajustada. Ninfas de segundo ínstar foram colocadas em cada poço para alimentação durante 6 dias. Após esse período de tempo, as larvas BSB foram ava- liadas quanto à mortalidade e comparadas com controles negativos e positivos. Esses resultados indicaram que a proteína de IRDIG37126 da SEQ ID NO:2 forneceu níveis significativos de mortalidade contra BSB. Pela primeira vez, a proteína de IRDIG37126 revelou conferir atividade inseticida controlando ou exterminando pragas de insetos que ingeriram a proteína de IRDIG37126. Tabela 2: Atividade de IRDIG37126 (SEQ ID NO:2) contra praga de insetos Hemípteros em um bioensaio de alimentação à alta dose. Amostra N.º de Inse- N.º de Inse- Porcentagem tos Vivos tos Mortos de Mortalidade IRDIG37126 0 68 100,0 Controle de Tampão 28 3 9,7 Água (Controle Negativo) 33 2 5,7 IRDIG31502 (Controle 3 40 93,0 Positivo)

[00256] Em seguida, a proteína de IRDIG37126 eluída foi submeti- da a um bioensaio para gerar uma curva de resposta à dose (Tabela 3, Figura 4 e Figura 5). Em um experimento, a proteína estava ativa em todas as doses testadas (dose mais baixa de 125 ppm). Nesses expe- rimentos, as doses da proteína de IRDIG37126 foram testadas a 125 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm e 2000 ppm.

Cada uma dessas concentrações resultou em 100% de mortalidade em BSB.

Em um segundo experimento, a proteína de IRDIG37126 eluída mostrou mais de 50% de mortalidade de BSB quando aplicada à dieta de bio- ensaio a 250 ppm.

Além disso, a proteína de IRDIG37126 eluída resul- tou em atividade de BSB mais elevada que IRDIG31502 (a proteína de controle positivo) em todas as concentrações que foram testadas.

Es- ses resultados indicam ainda que a proteína de IRDIG37126 da SEQ ID NO:2 forneceu níveis significativos de mortalidade contra BSB.

No- vamente, a proteína de IRDIG37126 revelou conferir atividade insetici- da controlando ou exterminando pragas de insetos que ingeriram a proteína de IRDIG37126. Tabela 3: Atividade de IRDIG37126 (SEQ ID NO:2) contra praga de insetos hemípteros em um bioensaio de alimentação de curva de res- posta à dose.

Proteína Dose N.º de In- N.º de In- Porcentagem (ppm) setos Vi- setos Mor- de Mortalidade vos tos Apenas Dieta 0 7 0 0,00 Apenas Dieta 0 7 3 0,30 IRDIG31502 1000 2 4 0,67 IRDIG31502 167 10 0 0,00 IRDIG31502 333 8 1 0,11 IRDIG31502 88 8 0 0,00 IRDIG37126 1000 0 10 1,00 IRDIG37126 1000 0 10 1,00

Proteína Dose N.º de In- N.º de In- Porcentagem (ppm) setos Vi- setos Mor- de Mortalidade vos tos IRDIG37126 1000 0 8 1,00 IRDIG37126 500 1 7 0,88 IRDIG37126 500 1 8 0,89 IRDIG37126 500 2 7 0,78 IRDIG37126 250 6 1 0,14 IRDIG37126 250 2 4 0,67 IRDIG37126 250 1 5 0,83 IRDIG37126 125 5 1 0,17 IRDIG37126 125 7 1 0,13 IRDIG37126 125 7 1 0,13 IRDIG37126 63 5 1 0,17 IRDIG37126 63 5 4 0,44 IRDIG37126 63 8 1 0,11 IRDIG37126 31 7 0 0,00 IRDIG37126 31 5 1 0,17 IRDIG37126 31 9 0 0,00 Exemplo 4: Avaliação de IRDIG37126 (SEQ ID NO:2) quanto à ativi- dade inseticida contra espécies de Lepidópteros.

[00257] O IRDIG37126 foi ainda testado contra espécies de Lepi- dópteros em um experimento de alimentação de bioensaio. Um painel das seguintes pragas Lepidópteras foi usado no bioensaio: lagarta fal- sa-medideira (SBL); broca europeia do milho (ECB); lagarta da espiga (CEW); lagarta militar (FAW); e gorgulho do algodão (CBW) foram tes- tados. Um bioensaio de alimentação em alta dose foi concluído, em que 9 ug/cm2 da proteína purificada foram aplicados à dieta de BSB em uma placa de 96 poços ajustada. Larvas neonatais foram coloca- das em cada poço para alimentação durante 5 dias. Após esse perío- do de tempo, as larvas de insetos foram avaliadas quanto à mortalida- de e comparadas com controles negativos e positivos. Esses resulta-

dos indicaram que embora a proteína de IRDIG37126 da SEQ ID NO:2 não tivesse atividade inseticida contra a maioria das espécies de Lepi- dópteros testadas, a proteína de IRDIG37126 da SEQ ID NO:2 forne- ceu níveis significativos de mortalidade contra lagarta falsa-medideira (SBL) conforme mostrado na Tabela 4. Tabela 4: Atividade de IRDIG37126 (SEQ ID NO:2) contra várias pra- gas lepidópteras em 9 ug/cm2 no bioensaio baseado em dieta.

Inseto Nome de Poços Mos- N.º Total Taxa de Apro- Testa- Amostra trando Ati- de Po- Acertos vado do vidade Inse- ços Tes- ticida tados SBL IRDIG37126 16 16 1,000 SIM SBL Cry1Ca 16 16 1,000 SIM SBL Tampão Caps 3 16 0,188 NÃO SBL BSA 4 16 0,250 NÃO ECB IRDIG37126 0 16 0,000 NÃO ECB Cry1Ca 2 16 0,125 NÃO ECB Tampão Caps 0 16 0,000 NÃO ECB BSA 2 16 0,125 NÃO CEW IRDIG37126 1 16 0,063 NÃO CEW Cry1Ca 0 16 0,000 NÃO CEW Tampão Caps 0 16 0,000 NÃO CEW BSA 0 16 0,000 NÃO FAW IRDIG37126 0 16 0,000 NÃO FAW Cry1Ca 0 16 0,000 NÃO FAW Tampão Caps 0 16 0,000 NÃO FAW BSA 0 16 0,000 NÃO CBW IRDIG37126 0 16 0,000 NÃO CBW Cry1Ca 0 16 0,000 NÃO CBW Tampão Caps 0 16 0,000 NÃO CBW BSA 1 16 0,063 NÃO Exemplo 5: Transformação mediada por Agrobacterium de um cassete de expressão gênica heteróloga que compreende a sequência de ge-

nes de IRDIG37126

[00258] Soja pode ser transformada com um cassete de expressão gênica heteróloga que compreende a sequência de genes de IR- DIG37126 que codifica a SEQ ID NO:2 utilizando as mesmas técnicas anteriormente descritas no Exemplo n.o 11 ou no Exemplo n.o 13 do pedido de patente WO 2007/053482.

[00259] Algodão pode ser transformado com um cassete de ex- pressão gênica heteróloga que compreende a sequência de genes de IRDIG37126 que codifica a SEQ ID NO:2 utilizando as mesmas técni- cas anteriormente descritas no Exemplo n.o 14 da Patente n.o U.S.

7.838.733 ou no Exemplo n.o 12 do pedido de patente WO 2007/053482 (Wright et al.).

[00260] Canola pode ser transformada com um cassete de expres- são gênica heteróloga que compreende a sequência de genes de IR- DIG37126 que codifica a SEQ ID NO:2 utilizando as mesmas técnicas anteriormente descritas no Exemplo n.o 26 da Patente n.o U.S.

7.838.733 ou no Exemplo n.o 22 do pedido de patente WO 2007/053482 (Wright et al.).

[00261] Milho pode ser transformado com um cassete de expressão gênica heteróloga que compreende a sequência de genes de IR- DIG37126 que codifica a SEQ ID NO:2 utilizando-se as mesmas técni- cas anteriormente descritas no Exemplo n.º 7 da Patente de n.º U.S.

7.838.733 ou no Exemplo n.º8 do pedido de patente WO 2007/053482 (Wright et al.).

[00262] Trigo pode ser transformado com um cassete de expressão gênica heteróloga que compreende a sequência de genes de IR- DIG37126 que codifica a SEQ ID NO:2 utilizando as mesmas técnicas anteriormente descritas no Exemplo n.o 23 do pedido de patente WO 2013/116700A1 (Lira et al.).

[00263] Arroz pode ser transformado com um cassete de expressão gênica heteróloga que compreende a sequência de genes de IR- DIG37126 que codifica a SEQ ID NO:2 utilizando as mesmas técnicas anteriormente descritas no Exemplo n.o 19 do pedido de patente WO 2013/116700A1 (Lira et al.). Exemplo 6: Transformação mediada por Agrobacterium de um casse- te de expressão gênica heteróloga que compreende a sequência de genes de IRDIG37126

[00264] À luz da presente descrição, culturas adicionais podem ser transformadas de acordo com as modalidades da presente descrição com o uso de técnicas que são conhecidas na técnica. Para transfor- mação mediada por Agrobacterium de centeio, consultar, por exemplo, Popelka JC, Xu J, Altpeter F., "Generation of rye with low transgene copy number after biolistic gene transfer and production of (Secale ce- reale L.) plants instantly marker-free transgenic rye," Transgenic Res., outubro de 2003;12(5):587 a 596.). Para transformação mediada por Agrobacterium de sorgo, consultar, por exemplo, Zhao et al., "Agrobac- terium-mediated sorghum transformation," Plant Mol Biol., dezembro de 2000;44(6):789 a 798. Para transformação mediada por Agrobacte- rium de cevada, consultar, por exemplo, Tingay et al., "Agrobacterium tumefaciens-mediated barley transformation," The Plant Journal, (1997) 11: 1.369 a 1.376. Para transformação mediada por Agrobacte- rium de trigo, consultar, por exemplo, Cheng et al., "Genetic Transfor- mation of Wheat Mediated by Agrobacterium tumefaciens," Plant Physiol., novembro de 1997;115(3):971 a 980. Para transformação mediada por Agrobacterium de arroz, consultar, por exemplo, Hiei et al., "Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens," Plant Mol. Biol., setembro de 1997;35(1-2):205 a 218.

[00265] Os nomes em latim para essas e outras plantas são deter- minados abaixo. Deve ficar claro que outras técnicas de transformação (não Agrobacterium) podem ser usadas para transformar um cassete de expressão gênica heteróloga que compreende a sequência de ge- nes de IRDIG37126 que codifica a SEQ ID NO:2, por exemplo, nessas e em outras plantas. Os exemplos incluem, porém sem limitação; Maís (Zea mays), Trigo (Triticum spp.), Arroz (Oryza spp. e Zizania spp.), Cevada (Hordeum spp.), Algodão (Abroma augusta e Gossypium spp.), Soja (Glycine max), Beterraba sacarina e de mesa (Beta spp.), Cana de açúcar (Arenga pinnata), Tomate (Lycopersicon esculentum e outras spp., Physalis ixocarpa, Solanum incanum e outras spp., e Cyphomandra betacea), Batata (Solanum tuberosum), Batata-doce (Ipomoea batatas), Centeio (Secale spp.), Pimentas (Capsicum an- nuum, chinense e frutescens), Alface (Lactuca sativa, perennis e pul- chella), Repolho (Brassica spp.), Aipo (Apium graveolens), Berinjela (Solanum melongena), Amendoim (Arachis hypogea), Sorgo (Sorghum spp.), Alfafa (Medicago sativa), Cenoura (Daucus carota), Feijão (Phaseolus spp. e outros gêneros), Aveias (Avena sativa e strigosa), Ervilhas (Pisum, Vigna e Tetragonolobus spp.), Girassol (Helianthus annuus), Abóbora (Cucurbita spp.), Pepino (Cucumis sativa), Tabaco (Nicotiana spp.), Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Gramado (Lolium, Agrostis, Poa, Cynodon, e outros gêneros), Trevo (Trifolium), Ervilhaca (Vicia). A transformação de tais plantas, com genes ligados de manei- ra funcional ao promotor de óvulo de Glycine max, ao terminador de óvulo de Glycine max 5’ UTR, ao terminador de óvulo de Glycine max 3’ UTR e/ou ao terminador de óvulo de Glycine max, por exemplo, é contemplada nas modalidades da presente descrição.

[00266] O uso de um cassete de expressão gênica heteróloga que compreende a sequência de genes de IRDIG37126 que codifica a SEQ ID NO:2 pode ser implantado em muitas espécies de madeira decídua e perene. Tais aplicações estão também dentro do escopo das modalidades desta descrição. Essas espécies incluem, porém sem limitação: amieiro (Alnus spp.), freixo (Fraxinus spp.), espécies de choupo tremedor e álamo (Populus spp.), faia (Fagus spp.), bétula (Betula spp.), cereja (Prunus spp.), eucalipto (Eucalyptus spp.), no- gueira (Carya spp.), bordo (Acer spp.), carvalho (Quercus spp.) e pi- nheiro (Pinus spp.).

[00267] O uso de um cassete de expressão gênica heteróloga que compreende a sequência de genes de IRDIG37126 que codifica a SEQ ID NO:2 pode ser implantado em espécies ornamentais e frutífe- ras. Tais aplicações estão também dentro do escopo das modalidades desta descrição. Os exemplos incluem, porém sem limitação: rosa (Rosa spp.), sarça ardente (Euonymus spp.), petúnia (Petunia spp.), begônia (Begonia spp.), rododendro (Rhododendron spp.), maçã sil- vestre ou maçã (Malus spp.), pera (Pyrus spp.), pêssego (Prunus spp.) e calêndulas (Tagetes spp.). Exemplo 7: Análise molecular de plantas transgênicas que contêm cassete de expressão gênica heteróloga integrado de maneira estável que compreende a sequência de genes de IRDIG37126

[00268] A análise molecular de tecidos vegetais transformados é realizada em amostras obtidas a partir de materiais vegetais transfor- mados com cassetes de expressão gênica que contêm o cassete de expressão gênica heteróloga que compreende a sequência de genes de IRDIG37126 para confirmar a presença e o número de cópias de um cassete de expressão gênica heteróloga integrado de maneira es- tável que compreende a sequência de genes de IRDIG37126 e para quantificar a quantidade expressa da proteína de IRDIG37126 que é produzida na célula vegetal. Vários ensaios são conhecidos na técnica e podem ser utilizados para análise molecular do cassete de expres- são gênica heteróloga que compreende a sequência de genes de IR- DIG37126 dentro do material vegetal. Exemplo 8: Análise de bioensaio de insetos de plantas transgênicas que contêm cassete de expressão gênica heteróloga integrado de ma-

neira estável que compreende a sequência de genes de IRDIG37126

[00269] A bioatividade de material vegetal transgênico que expres- sa o cassete de expressão gênica heteróloga que compreende a se- quência de genes de IRDIG37126 da presente descrição é demons- trada por métodos de bioensaio conhecidos. Consultar, por exemplo, Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-1326. A conclusão destes ensaios permite demonstrar a eficácia da proteína de IR- DIG37126, por exemplo, alimentando vários tecidos vegetais ou partes de tecidos derivados de uma planta que produzem um shRNA insetici- da para alvejar insetos em um ambiente de alimentação controlada. Alternativamente, os extratos são preparados a partir de vários tecidos vegetais de uma planta que produzem a proteína inseticida IR- DIG37126, e os ácidos nucleicos extraídos são dispensados sobre die- tas artificiais para bioensaios. Os resultados de tais ensaios de alimen- tação devem ser comparados com bioensaios conduzidos similarmen- te que empregam tecidos de controle apropriados de plantas hospe- deiras que não produzem um cassete de expressão gênica heteróloga que compreende a sequência de genes de IRDIG37126, ou com ou- tras amostras de controle. O crescimento e sobrevivência de insetos alvo no material vegetal transgênico que expressa a proteína de IR- DIG37126 são reduzidos em comparação com aqueles do grupo de controle. Exemplo 9: Avaliação de sequências variantes de IRDIG37126 para atividade inseticida contra insetos

[00270] Produção de variantes de IRDIG37126: As variantes de se- quência de IRDIG37126 (SEQ ID NO:13 a 24) foram geradas para avaliar a importância de vários resíduos de aminoácidos na atividade inseticida. As Figuras 6A, 6B e 6C fornecem um alinhamento de se- quências das sequências variantes em comparação com a proteína de IRDIG37126 da SEQ ID NO:2. De modo similar, as Figuras 7A, 7B e

7C fornecem as identidades de sequência para as variantes em com- paração com a proteína de IRDIG37126 da SEQ ID NO:2 e umas com as outras. O gênero de sequências variantes de IRDIG37126 comparti- lham pelo menos 97,8% de identidade de sequência umas com as ou- tras a partir das várias mutações feitas em seis locais diferentes da sequência de proteínas (Figuras 6A, 6B e 6C). Para mutações de pon- to único, a sequência de codificação foi modificada para fazer a altera- ção desejada e os fragmentos de genes que codificam as proteínas variantes (SEQ ID NO: 25 a 36) foram adquiridos junto à Integrated DNA Technologies, Inc. (Skokie, IL). Os fragmentos de genes foram clonados no vetor pMAL C5x com uma etiqueta de expressão de pro- teína de ligação à maltose N-terminal. Para avaliar os mutantes du- plos, uma biblioteca de duas posições, D18 e D75, foi selecionada e o códon do tipo selvagem foi substituído usando um iniciador degenera- do que continha a sequência VNN nas posições D18 e D75. O caracte- re V corresponde a uma mistura igual de bases G, A e C na posição, enquanto N se refere a uma mistura igual de G, A, C e T na posição. Uma biblioteca de clones de ~450 colônias foi selecionada e avaliada quanto à expressão e eficácia no bioensaio da dieta do percevejo mar- rom. As variantes que mostram propriedades aprimoradas no bioen- saio de percevejo foram sequenciadas para determinar a mutação.

[00271] Expressão de proteína e bioensaios de insetos: A proteína foi superexpressa em E. coli e purificada de acordo com as instruções do fabricante usando resina de amilose. A proteína eluída foi avaliada por SDS-PAGE. As variantes D18A e D75A mostraram um alto peso molecular e espécies resistentes a SDS no experimento SDS-PAGE. As proteínas purificadas foram, então, incorporadas no bioensaio de dieta e fornecidas a ninfas de percevejo marrom a uma alta dose (1000 PPM). Todas as variantes mutantes individuais mostraram ativi- dade sobre o percevejo marrom (Tabela 8). Devido aos complexos de alto peso molecular inesperados exibidos nos mutantes D18 e D75, essas posições foram selecionadas para mutagênese adicional em uma biblioteca combinatória de saturação de sítios.

Aproximadamente 450 clones foram selecionados dentre a biblioteca D18/D75 para ava- liação no bioensaio de percevejo marrom.

As variantes que tiveram bom desempenho no bioensaio foram sequenciadas (Tabela 8). Esses resultados indicaram que a proteína de IRDIG37126 da SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO:13 a 24 forneceu níveis significativos de mortalidade contra BSB.

Pela primeira vez, as sequências variantes de proteína de IRDIG37126 revelaram conferir atividade inseticida controlando ou ex- terminando pragas de insetos que ingeriram as variantes de proteína de IRDIG37126. Tabela 8: Atividade de sequências variantes de IRDIG37126 contra pragas de percevejos marrons no bioensaio baseado em dieta.

Sequência Variante % de Atividade de Mortali- Resistência a dade Insetos IRDIG37126_D6A (SEQ ID NO:13) 89 Ativo IRDIG37126_D18A (SEQ ID NO:15) 66 Ativo IRDIG37126_D18S (SEQ ID NO:17) 100 Ativo IRDIG37126_D18P (SEQ ID NO:16) 100 Ativo IRDIG37126_G23E (SEQ ID NO:18) 58 Ativo IRDIG37126_R28K (SEQ ID NO:19) 42 Ativo IRDIG37126_R28M (SEQ ID NO:20) 51 Ativo IRDIG37126_H13A (SEQ ID NO:14) 53 Ativo IRDIG37126_D75A (SEQ ID NO:21) 61 Ativo IRDIG37126_D18R_D75E (SEQ ID NO:22) 97 Ativo IRDIG37126_D18L_D75E (SEQ ID NO:23) 94 Ativo IRDIG37126_D18Q_D75E (SEQ ID NO:24) 100 Ativo Controle Negativo (água) 18 Inativo IRDIG37126 Tipo Selvagem 92 Ativo

Exemplo 10: Identificação de um motivo de proteína exclusivo na pro- teína de IRDIG37126

[00272] A região N-terminal de IRDIG37126 é divergente de se- quências ativas de hemípteros anteriormente analisadas (Figura 7). Esta região da proteína pode estar envolvida na maturação de toxina e a sequência foi analisada quanto a motivos específicos para IR- DIG37126. Os resíduos 19 a 25, "QLHVGEV" (SEQ ID NO:37), for- mam um motivo indicativo de IRDIG37126, não encontrado em mona- lisinas ativas de hemípteros anteriormente descritas.

[00273] Embora diversos aspectos e modalidades exemplificativos tenham sido discutidos acima, aqueles versados na técnica reconhe- cerão certas modificações, permutações, adições e subcombinações dos mesmos. É pretendido, portanto, que as seguintes reivindicações anexas e reivindicações introduzidas doravante sejam interpretadas como incluindo todas tais modificações, permutações, adições e sub- combinações conforme estejam dentro de seu espírito e escopo ver- dadeiros.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucleico recombinante que codifica um polipeptídeo, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo com- partilha pelo menos 97,8% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2.

2. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico recombinante está ligada de maneira funcional a uma ou mais sequências reguladoras que dirigem a expressão da molécula de ácido nucleico recombinante.

3. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico recombinante compreende ainda um ou mais traços transgênicos adicionais.

4. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o um ou mais traços transgênicos adicionais codificam uma sequência de codifica- ção de um marcador selecionável ou uma sequência de codificação que confere resistência a inseticidas, tolerância a herbicidas, eficiência de uso de nitrogênio, expressão de RNA pequeno, nuclease sítio- específica, eficiência de uso de água ou qualidade nutricional.

5. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico recombinante compreende a sequência de motivos de proteína da SEQ ID NO:37.

6. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a molécula de ácido nucleico recombinante é expressa como uma composição que compreende uma quantidade eficaz como inseticida do polipeptídeo.

7. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma ou mais proteínas pesticidas selecionadas dentre uma pro- teína Cry1, uma proteína Cry2, uma proteína Cry3, uma proteína Cry4, uma proteína Cry5, uma proteína Cry6 , uma proteína Cry7, uma pro- teína Cry8, uma proteína Cry9, uma proteína Cry15, proteína Cry22, uma proteína Cry23, uma proteína Cry32, uma proteína Cry34, uma proteína Cry35, uma proteína Cry36, uma proteína Cry37, uma proteí- na Cry43, uma proteína Cry46, uma proteína Cry51, uma proteína Cry55, uma toxina binária Cry, uma proteína Cyt , uma toxina VIP, uma proteína SIP, uma lipase inseticida, uma quitinase inseticida e uma proteína do veneno de cobra.

8. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma ou mais moléculas pesticidas de RNA pequeno.

9. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo é oralmente ativo.

10. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tem atividade inseticida contra uma praga de insetos na ordem Hemip- tera.

11. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tem atividade inseticida contra uma praga de insetos na família Penta- tomidae.

12. Molécula de ácido nucleico recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo compreende ainda qualquer uma ou mais modificações de aminoácido como representado pela posição 6 da SEQ ID NO:2, posição 13 da SEQ ID NO:2, posição 18 da SEQ ID NO:2, posição 23 da SEQ ID

NO:2, posição 28 da SEQ ID NO:2, ou posição 75 da SEQ ID NO:2.

13. Método para controlar uma população de praga de inse- tos, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a população de pragas de insetos em contato com uma quantidade eficaz como inseticida do polipeptídeo recombinante, como definido na reivindica- ção 1.

14. Método para inibir o crescimento ou exterminar uma praga de insetos, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a praga de insetos em contato com uma quantidade eficaz como inseti- cida de polipeptídeo recombinante, como definido na reivindicação 1.

15. Método para controlar uma população de pragas de in- seto resistente a uma proteína pesticida, caracterizado pelo fato de que compreende colocar a população de pragas de inseto resistente em contato com uma quantidade eficaz como inseticida do polipeptí- deo recombinante, como definido na reivindicação 1.