BRPI0611681A2 - moléculas de ácido nucléico isolada, métodos para proteger uma planta de uma praga de inseto, plantas transformadas, protoxina para inseto isolada, composição, método para impactar uma praga de inseto, polipeptìdeo isolado apresentando atividade proteolìtica - Google Patents

Abstract

MOLéCULAS DE áCIDO NUCLéICO ISOLADA, MéTODOS PARA PROTEGER UMA PLANTA DE UMA PRAGA DE INSETO, MéTODO PARA OBTENçãO DE PLANTAS TRANSFORMADAS, PROTOXINA PARA INSETO ISOLADA, COMPOSIçãO, MéTODO PARA IMPACTAR UMA PRAGA DE INSETO, POLIPEPTìDEO ISOLADO APRESENTANDO ATIVIDADE PROTEOLìTICA. São fornecidas composições e métodos para proteger uma planta de uma praga de inseto. São apresentadas moléculas de ácidos nucléicos codificando protoxinas para insetos ou toxinas para insetos modificadas de modo a compreender pelo menos um sítio de ativação proteolítica que é sensível a uma protease digestiva de inseto. A clivagem de uma protoxina para inseto, modificada no sítio de ativação proteolítica por uma protease digestiva de inseto produz uma toxina ativa contra inseto no sistema digestivo do inseto-praga. A clivagem de uma toxina para inseto modificada da invenção em um sítio de ativação proteolítica resulta na produção de uma toxina contra inseto, ativa no sistema digestivo do inseto, que apresenta atividade pesticida relativa aumentada em relação à toxina para inseto que não contém o sítio de ativação proteolítica. São fornecidos métodos de uso de seqUências de ácidos nucléicos da protoxina para inseto modificada e da toxina para inseto modificada e dos polipeptídeos por estas codificados, para proteger uma planta de uma praga de inseto. Concretizações particulares da invenção fornecem, ainda,' composições e formulações de protoxina modificada para inseto e toxina modificada para inseto, cassetes de expressão, plantas, células vegetais e sementes transformadas. São também aqui reveladas proteases digestivas de inseto e moléculas de ácidos nucléicos que as codificam. Adicionalmente, é provido ainda um método para obtenção de planta transformada compreendendo a transformação de maneira estável de uma célula vegetal com pelo menos um construto de polinucleotideo, o cultivo da referida célula vegetal transformada sob condições de crescimento vegetal e a regeneração de uma planta transformada.

Description

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA, MÉTODOS PARA PROTEGERUMA PLANTA DE UMA PRAGA DE INSETO, MÉTODO PARA OBTENÇÃO DEPLANTAS TRANSFORMADAS, PROTOXINA PARA INSETO ISOLADA,COMPOSIÇÃO, MÉTODO PARA IMPACTAR UMA PRAGA DE INSETO,POLIPEPTÍDEO ISOLADO APRESENTANDO ATIVIDADE PROTEOLÍTICA

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção está relacionada aos campos dabiologia molecular vegetal e controle de pragas vegetais.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Pestes entomológicas são um importante fator na perdados cultivos agrícolas do mundo. Por exemplo, danos poralimentação de larva da raiz do milho ou dano por gorgulhodo algodão podem ser economicamente devastadores aprodutores agrícolas. Perdas relacionadas a pestes deinsetos oriundas . apenas de larva da raiz do milhoalcançaram um bilhão de dólares por ano.

Tradicionalmente, os métodos primários para causarimpacto em populações de insetos peste, tais comopopulações de larva da raiz do milho, são rotação deculturas e a aplicação de pesticidas químicos sintéticos deamplo espectro. Contudo, consumidores e reguladoresgovernamentais estão se tornando cada vez mais preocupadoscom os riscos ambientais associados com a produção e uso depesticidas químicos sintéticos. Por causa de taispreocupações, os reguladores têm banido ou limitado o usode alguns dos pesticidas mais perigosos. Assim, existesubstancial interesse em desenvolver pesticidasalternativos.

O controle de pestes entomológicas de significânciaagrícola usando um agente microbiano, tal como fungos,bactérias, ou outras espécies de insetos, propicia umaalternativa ambientalmente amistosa e comercialmenteatrativa. Falando de um modo geral, o uso de biopesticidasapresenta um risco menor de poluição e impactos ambientais,e provê maior especificidade de alvo do que écaracterístico de inseticidas químicos de amplo espectro.Além disso, biopesticidas freqüentemente custam menos parase produzir e, assim, melhoram o rendimento econômico parauma larga variedade de culturas.

Certas espécies de microorganismos do gênero Bacillussão conhecidas por possuir atividade pesticida contra umaampla gama de pestes entomológicas incluindo Lepidoptera,Diptera, Coleoptera, Hemiptera, e outros. Bacillusthuringiensis e Bacillus papilliae estão entre os agentesbiológicos de controle de maior sucesso descobertos até omomento. A patogenicidade entomológica foi atribuída alinhagens de: B. Iarvae, B. Ientimorbus, B. papilliae, B.sphaericus, B. thuringiensis (Harwook, ed. (1989) Bacillus(Plenum Press), p. 306) e B. cereus (WO 96/10083). Aatividade pesticida parece estar concentrada em inclusõescristalinas parasporais de proteínas, apesar de proteínasespecificas terem sido também isoladas a partir do estágiode crescimento vegetativo de Bacillus. Diversos genescodificando essas proteínas pesticidas foram isolados ecaracterizados (ver, por exemplo, U.S. Patent Nos.5.366.892 e 5.840.868).

Pesticidas microbianos, particularmente aquelesobtidos a partir de linhagens de Bacillus, desempenharam umpapel importante na agricultura como alternativas aocontrole químico de pestes. Recentemente, cientistasagrônomos desenvolveram plantas de cultivo com resistênciaa insetos intensificada por plantas de cultivogeneticamente modificadas para produzir proteínaspesticidas de Bacillus. Por exemplo, plantas de milho ealgodão geneticamente modificadas para produzir proteínaspesticidas isoladas de linhagens de B. thuringiensis,conhecidas como δ-endotoxinas ou toxinas Cry (ver, e.g.,Aronson (2002) Cell Mol. Life Sei. 59 (3) : 417-425; Schnepfet al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (3) : 775-806)são, agora, amplamente usadas na agricultura americana eproveram o fazendeiro com uma alternativa ambientalmenteamistosa a métodos de controle de insetos tradicionais.

Além disso, batatas geneticamente modificadas para contertoxinas Cry pesticidas foram vendidas para os fazendeirosamericanos. Contudo, enquanto ficou provado que eramcomercialmente muito bem-sucedidas, essas plantas decultivo resistentes a insetos geneticamente modificadasproveram resistência a apenas uma restrita variedade deinsetos peste economicamente importantes. Alguns insetos,tais como larva da raiz do milho variedade western,mostraram-se recalcitrantes.

Conseqüentemente, esforços foram feitos para entendero mecanismo de ação de toxinas Bt e de construir toxinascom propriedades melhoradas. Foi mostrado que as proteasesdo trato digestivo daquele inseto podem afetar o impacto deproteínas Cry de Bacillus thuringiensis Cry e outrasproteínas pesticidas no inseto. Algumas proteases ativamproteínas Cry processando-as a partir de uma forma"protoxina" em uma forma tóxica, ou "toxina". Ver, Oppert(1999) Arch. Insect Biochem. Phys. 42:1-12 e Carroll et al.(1997) J. Invertebrate Pathology 70:41-49. Essa ativaçãoda toxina pode incluir a remoção de peptídeos N- e C-terminais da proteína e podem, também, incluir clivageminterna da proteína. Outras proteases podem degradarproteínas pesticidas. Ver Oppert, ibid.; ver também U.S.Patent Nos. 6.057.491 e 6.339.491.

Pesquisadores determinaram que plantas expressam umavariedade de proteases, incluindo proteases serina ecisteína. Ver, por exemplo, Goodfellow et al. (1993) PlantPhysiol. 101:415-419; Pechan et al. (1999) Plant Mol. Biol.40:111-119; Lid et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sei. USA99:54 60-54 65. Pesquisas também mostraram que proteases detrato digestivo de insetos incluem catepsinas, tais comocatepsina B- e proteinases tipo L. Ver, Shiba et al.(2001) Arch. Biochem. Biophys. 390:28-34; ver também,Purcell et al. (1992) Insect Biochem. Mol. Biol. 22:41-47.Por exemplo, proteinases cisteina de catepsinas tipo Ldigestivas são encontradas na porção mediana do trato delarva da raiz do milho variedade western. Ver, Koiwa etal. (2000) FEBS Letters 471:67-70; ver também, Koiwa et al.(2000) Analytical Biochemistry 282:153-155. Os sitios desubstrato proteolitico preferenciais dessas proteases foraminvestigados usando substratos sintéticos. Ver, Alves etal. (2001) Eur. J. Biochem. 268:1206-1212 e Melo et al.(2001) Anal. Biochem. 293:71-77.

Enquanto previamente os investigadores construíramgeneticamente plantas, particularmente plantas de cultivo,para conter toxinas Cry biologicamente ativas (i.e.,pesticidas), pesquisadores, até o momento, não utilizaramefetivamente as formas protoxinas de polipeptídeospesticidas em conjunção com proteases de trato digestivo deinsetos para controlar pestes vegetais. Além do mais,essas proteína estrangeiras podem ser degradadas einativadas por proteases presentes nessas plantastransgênicas. Assim, são desejáveis novas estratégias paramodificar toxinas de insetos e utilizar essas toxinas deinsetos modificadas no em estratégias de manejo de pestes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Composições e métodos para proteger uma planta de uminseto peste são providos. Composições incluem moléculasde ácidos nucléicos compreendendo seqüências denucleotídeos codificando protoxinas de insetos ou toxinasde insetos, que compreendem pelo menos um sitio de ativaçãoproteolitica, que foi construído para compreender um sítiode clivagem, que é sensitivo a um protease de tratodigestivo de inseto. 0 sítio de ativação proteolitica étipicamente construído em uma região de ativação daprotoxina ou toxina de inseto. A clivagem proteolitica deuma protoxina de inseto modificada por uma protease detrato digestivo de inseto libera a toxina de inseto ativadano trato digestivo do inseto. A clivagem de uma toxina deinseto modificada pela protease de trato digestivo deinseto produz uma toxina de inseto ativa com atividadepesticida melhorada no trato digestivo do inseto relativa àtoxina de inseto correspondente que não possui o sítio deativação proteolitica. As moléculas de ácidos nucléicos dainvenção podem ser operacionalmente ligadas a qualquerpromotor de interesse para dirigir a expressão dasprotoxinas ou toxinas de inseto modificadas na planta oucélula vegetal. Cassetes de expressão e plantas, célulasvegetais, e sementes transgênicas compreendendo essas novasmoléculas de ácidos nucléicos são também providas.Composições compreendendo protoxinas de inseto modificadasou toxinas de insetos modificadas e métodos de seu uso emcontrolar pestes vegetais são ainda providos.

As composições de ácidos nucléicos da presenteinvenção são úteis em métodos direcionados para protegerplantas de pestes entomológicas. Os métodos compreendemintroduzir em uma planta um construto de polinucleotídeocompreendendo uma seqüência de nucleotídeos que codificauma protoxina de inseto modificada, operacionalmente ligadaa um promotor que dirige a expressão em uma planta. Aprotoxina de inseto modificada compreende um sitio deativação proteolitica, que é construido para compreender umsitio de clivagem, que é sensível a uma protease de tratodigestivo de inseto. A expressão de um construtopolinucleotídico codificando a protoxina de insetomodificada resulta na produção de uma protoxina de insetomodificada nas células da planta transgênica. Quando uminseto peste suscetível se alimenta na planta transgênicae, assim, também ingere a protoxina modificada que foiexpressada na planta, a protoxina de inseto modificada éclivada por uma protease de trato digestivo de inseto paragerar a toxina ativa no trato digestivo do inseto, causandoimpacto, dessa forma, no inseto peste.

Métodos para proteger plantas de um inseto pestecompreendem, ainda, introduzir em uma planta um construtopolinucleotídico compreendendo uma seqüência denucleotídeos que codifica uma toxina de inseto modificadaoperacionalmente ligada a um promotor que dirige aexpressão em uma planta. A toxina de inseto modificadacompreende um sítio de ativação proteolitica que éconstruído para compreender um sítio de clivagem que ésensível a uma protease de trato digestivo de inseto. Aexpressão do construto polinucleotídico codificando atoxina de inseto modificada resulta na produção da toxinade inseto modificada nas células da planta transgênica.

Quando um inseto peste suscetível se alimenta na plantatransgênica e, assim, também ingere a toxina de inseto modificada quefoi expressada na planta, a toxina de inseto modificada é clivada poruma protease de trato digestivo de inseto para gerar uma toxina ativano trato digestivo do inseto que tem atividade pesticida melhoradarelativa á toxina de inseto correspondente que não possui o sítio deativação proteolítica, causando, dessa forma, impacto no inseto peste.A presente invenção provê ainda moléculas de ácido nucléico codificandoproteases de trato digestivo de inseto e variantes e fragmentos dessasbiologicamente ativos. As proteases são úteis, por exemplo, em métodosdirecionados para a identificação de sítios de clivagem proteolíticapreferenciais para essas proteases de trato digestivo de inseto. Tendoidentificado esses sítios de clivagem proteolítica preferenciais,protoxinas e toxinas de inseto de interesse podem ser modificadas paracompreender os sítios de clivagem proteolítica preferenciais em pelomenos um sítio de ativação proteolítica para melhorar a ativação dapxotoxina ou toxina de inseto no trato digestivo do inseto.Adicionalmente, é provido ainda um método para obtenção de plantatransformada compreendendo a transformação de maneira estável de umacélula vegetal com pelo menos um construto de polinucleotídeo quecompreende a seqüência de nucleotídeo operacionalmente ligada a umpromotor que conduz a expressão na referida planta, o cultivo dareferida célula vegetal transformada sob condições de crescimentovegetal e a regeneração de uma planta transformada. Inclui üm métodopara obtenção de planta transformada compreendendo a transformação, demaneira estável, de uma célula vegetal com pelo menos uma construção depolinucleotídeo que operacionalmente ligada a um promotor que conduz aexpressão na referida planta em que a toxina para inseto ter pelo menosum sítio de ativação proteolítica construído para compreender um sítiode clivagem que é sensível à uma protease digestiva de inseto, e onde aclivagem da referida toxina para inseto pela protease digestiva deinseto produz uma toxina para inseto com atividade pesticida alimentadaem relação a toxina para inseto que não apresenta o sítio de ativaçãoproteolítica; cultivo da referida célula vegetal transformada sobcondições de crescimento vegetal e regeneração da planta transformada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção é direcionada para composições e métodos queprovêm proteção de uma planta de um inseto peste, e que pode serutilizada para causar impacto nesses insetos peste.

Aá composições incluem novas moléculas deácidos nucléicos compreendendo seqüências de nucleotideoscodificando protoxinas de inseto modificadas que provêm oprocessamento eficiente em toxinas ativas no tratodiqestivo do inseto peste que se alimenta em um hospedeirovegetal expressando uma protoxina de inseto modificada. Emalguns avanços, as moléculas de ácidos nucléicos dainvenção compreendem seqüências de nucleotideos quecodificam protoxinas de inseto modificadas que possuem pelomenos um sitio de ativação proteolitica que foi construídopara compreender um sítio de clivagem que é sensível a umaprotease de trato digestivo de inseto. A clivagem de umaprotoxina de inseto modificada por uma protease de tratodigestivo de inseto produz uma toxina de inseto ativa notrato digestivo do inseto. Em outros avanços, as moléculasde ácidos nucléicos da invenção compreendem seqüências denucleotideos que codificam toxinas de inseto modificadasque possuem pelo menos um sítio de ativação proteoliticaque foi construído para compreender um sítio de clivagemque é sensível a uma protease de trato digestivo de inseto.

A clivagem da toxina de inseto modificada por uma proteasede trato digestivo de inseto produz toxina de inseto ativano trato digestivo do inseto que apresenta atividadepesticida melhorada relativa à toxina de inseto que nãopossui o sítio de ativação proteolitica. Os ácidosnucléicos aqui descritos são úteis em métodos para protegeruma planta de um inseto peste. "Protoxina de insetomodificada" ou "toxina de inseto modificada" devesignificar uma protoxina de inseto ou toxina de inseto quecompreende pelo menos um sítio de ativação proteolitica quenão é naturalmente ocorrente na protoxina de inseto outoxina de inseto, e que foi construído para compreender umsítio de clivagem que é sensível a clivagem por umaprotease de trato digestivo de inseto. "Sensível aclivagem" deve significar que a protease reconhece o sítiode clivagem e, assim, é capaz de clivar a protoxina outoxina naquele sítio de clivagem. O sítio de ativaçãoproteolítica não ocorrente naturalmente é, geralmente,construído em uma região de ativação da protoxina de insetoou toxina de inseto. "Região de ativação", no contexto deuma protoxina de inseto, deve significar uma região naprotoxina de inseto caracterizada pelo fato de que aclivagem proteolítica no sítio de ativação resulta naprodução de uma toxina de inseto biologicamente ativa. A"região de ativação", no contexto de uma toxina de inseto,refere-se a uma região na toxina de inseto caracterizadapelo fato de que a clivagem proteolítica no sítio deativação construído resulta na produção de uma toxina deinseto com atividade pesticida melhorada, como aquidefinido. Para propósitos da presente invenção, a toxinade inseto biologicamente ativa é também referida como uma"toxina", um "toxina de inseto", "toxina de inseto ativa",a "toxina de inseto ativada", ou a "forma ativada" de umaprotoxina de inseto.

As composições da invenção também incluem construtosde polinucleotídeos compreendendo essas moléculas de ácidosnucléicos de protoxina e toxina de inseto modificada.Esses construtos incluem, mas não se limitam a, cassetes deexpressão, caracterizados pelo fato de que a seqüências denucleotídeos codificando as protoxinas de insetomodificadas ou toxinas de inseto modificadas estãooperacionalmente ligadas a um promotor que dirige aexpressão em uma célula vegetal. A invenção provê, ainda,células vegetais, plantas, e sementes compreendendo umconstruto de polinucleotideos aqui descrito. Ascomposições da invenção são úteis protegendo uma planta deinsetos peste e podem ser utilizadas para causar impacto eminsetos peste que interagem com uma planta durante uma oumais fases do ciclo de vida do inseto.

Em alguns avanços, as novas moléculas de ácidosnucléicos da invenção compreendem seqüências denucleotídeos codificando uma protoxina de inseto ou toxinade inseto modificada que compreende pelo menos um sítio deativação proteolítica que foi construído para compreenderum sítio de clivagem que é sensível a clivagem por umaprotease que reside em um trato digestivo de inseto. Emavanços em particular, o sítio de ativação proteolítica éconstruído para compreender um sítio de clivagem que osítio de clivagem preferencial para uma nova protease detrato digestivo de inseto aqui descrita abaixo.

As moléculas de ácidos nucléicos codificandoprotoxinas de inseto modificadas ou toxinas de insetomodificadas podem ser utilizadas nos métodos da invençãopara proteger uma planta de um inseto peste. "Proteger umaplanta de um inseto peste" deve significar limitar oueliminar dano a uma planta relacionado a pestesentomológicas, por exemplo, inibindo a habilidade do insetopeste crescer, se alimentar, e/ou se reproduzir matando oinseto peste. Em alguns avanços, um construto depolinucleotideos, compreendendo uma seqüência codificadorade protoxina de inseto modificada operacionalmente ligada aum promotor que dirige a expressão em uma célula vegetal,pode ser introduzido em uma planta. A expressão desseconstruto de polinucleotideos, em células dessa planta,produz uma protoxina de inseto modificada naquelas célulasvegetais. Quando um inseto peste susceptível se alimentaem células da planta que estão expressando essa protoxinade inseto modificada, a protoxina de inseto modificadaingerida é clivada pela protease de trato digestivo deinseto, produzindo, dessa forma, uma toxina de inseto ativano trato digestivo do inseto e causando impacto no instopeste. Similarmente, quando um construto depolinucleotideos, compreendendo uma seqüência denucleotídeos codificando uma toxina de inseto modificadaoperacionalmente ligada a um promotor que dirige aexpressão em uma célula vegetal, é introduzido em umaplanta, a toxina de inseto modificada é expressada. Quandoum inseto peste se alimente em uma planta expressando atoxina de inseto modificada, a toxina de inseto modificadaingerida é clivada por uma protease de trato digestivo deinseto, produzindo, dessa forma, uma toxina de inseto ativano trato digestivo do inseto que apresenta atividadepesticida melhorada relativa à toxina de inseto sem o sítiode ativação proteolítica construído. A presença da toxinade inseto com atividade pesticida melhorada no tratodigestivo do inseto causa impacto no inseto peste.

Em outros avanços, a invenção é desenhada para asprotoxinas de inseto modificadas e toxinas de insetomodificadas codificadas pelas moléculas de ácidos nucléicosda presente invenção e para métodos para usar essespolipeptideos. São ainda providas composições e

formulações compreendendo uma protoxina de insetomodificada ou toxina de inseto modificada, ou variantes oufragmentos dessas, que compreendem pelo menos um sitio deativação proteolitica não ocorrente naturalmente que foiconstruído para compreender um sítio de clivagem que ésensível a clivagem por uma protease de trato digestivo deinseto. A protoxina de inseto modificada e a toxina deinseto modificada composições da invenção são úteis emmétodos direcionados para causar impacto em insetos peste.Dessa maneira, a invenção provê, ainda, um método paracausar impacto em um inseto peste de uma plantacompreendendo aplicar, por exemplo, ao ambiente do insetopeste, uma composição ou formulação compreendendo umaprotoxina de inseto modificada ou toxina de insetomodificada. Como aqui usado, "causar impacto em um insetopeste de uma planta" inclui, mas não se limita a, impedir oinseto peste de se alimentar na planta, prejudicar o insetopeste, por exemplo, inibindo a habilidade do insetocrescer, se alimentar, e/ou se reproduzir, ou matando oinseto peste. Em um avanço, a protoxina de insetomodificada ou toxina de inseto modificada é combinada comum carregador para subseqüente aplicação ao ambiente doinseto peste. Enquanto a invenção não está ligada aqualquer teoria de operação, em um avanço, um inseto pesteingere uma composição protoxina de inseto modificada. Aprotoxina de inseto modificada é, então, clivada por umaprotease de trato digestivo de inseto para produzir umatoxina biologicamente ativa no trato digestivo do insetopeste, causando, dessa forma, impacto no inseto peste.

Alternativamente, um inseto peste pode ingerir umacomposição de toxina de inseto modificada de forma que atoxina de inseto é, então, clivada por uma protease detrato digestivo de inseto para produzir uma toxina deinseto ativa no trato digestivo do inseto com atividademelhorada relativa à toxina de inseto que não possui ositio de ativação proteolitica. A presença de uma toxinade inseto com atividade pesticida melhorada no tratodigestivo do inseto causa impacto no inseto, como aquidefinido.

Um especialista na arte reconheceria que ascomposições e métodos da invenção podem ser usados sozinhosou em combinação com outras composições e métodos paracontrolar pestes entomológicas que causam impacto emplantas. Por exemplo, a presente invenção pode ser usadaem conjunção com outras proteínas pesticidas ou pesticidasquímicos tradicionais.

Enquanto a invenção não depende de mecanismo biológicoem particular para proteger uma planta de um inseto peste,a expressão das seqüências de nucleotídeos da invenção emuma planta e ingestão dessa planta por um inseto peste poderesultar na produção de toxinas de inseto ativas, outoxinas de inseto ativas com atividade pesticida melhoradano trato digestivo do inseto, resultando em resistênciaaumentada da planta a insetos peste. As plantastransgênicas da invenção são úteis na agricultura emmétodos para proteger plantas de insetos peste e paracausar impacto em insetos peste. Certos avanços dainvenção provêm plantas de cultivo transformadas, taiscomo, por exemplo, plantas de milho, que são úteis emmétodos para causar impacto em insetos peste da planta,tais como, por exemplo, as variedades de larva da raiz domilho western, northern, southern, e Mexican. Outrosavanços da invenção provêm plantas de batata transformadas,as quais são úteis em métodos para causar impacto nobesouro da batata do Colorado, plantas de algodãotransformadas, as quais são úteis em métodos para causarimpacto em gorgulhos de algodão, e gramineas de gramadotransformadas, as quais são úteis em métodos para causarimpacto no gorgulho crisomelideo, Sphenophorous parvulus.

"Protoxina de inseto" ou "protoxina" deve significarum polipeptideo biologicamente inativo que é convertido emuma toxina de inseto ativa por clivagem em um sitio deativação proteolitica por uma protease. Em alguns avanços,a ativação da toxina prossegue por remoção de um peptideoC-terminal, um peptideo N-terminal, ou peptideos de ambasregiões N-terminal e C-terminal da protoxina. "Toxina deinseto" refere-se a um polipeptideo que apresenta atividadepesticida, tal como, por exemplo, a forma ativada de umaprotoxina de inseto (i.e., o polipeptideo clivado quepossui atividade pesticida). Toxinas de inseto da invençãoincluem, por exemplo, qualquer polipeptideo que apresentaatividade pesticida, tal como, por exemplo, toxinas deBacillus thuringiensis, pentina-1, e variantes e fragmentosdessas. Como aqui usado, o termo "atividade pesticida"refere-se à atividade de uma substância, tal como, porexemplo, uma proteína, que pode ser medida por testes derotina conhecidos na arte. Tais testes incluem, mas não selimitam a, mortalidade de peste, perda de peso da peste,repulsão à peste, atração à peste, e outras mudançascomportamentais e físicas de uma peste após alimentação eexposição à substância por uma extensão de tempoapropriada. Procedimentos gerais incluem adição docomposto ou organismo experimental à fonte de dieta emrecipiente selado. Testes para avaliar a atividadepesticida são bem conhecidos na arte. Ver, e.g., U.S.Patent Nos. 6.570.005 e 6.339.144; aqui incorporadas porreferência em sua integridade.

Em alguns avanços, a toxina de inseto modificada éclivada por uma protease de trato digestivo de inseto paraproduzir uma toxina de inseto com atividade pesticidamelhorada relativa à toxina de inseto correspondente quenão possui o sítio de ativação proteolítica. Como aquiusado o termo "atividade pesticida melhorada" caracterizauma toxina de inseto da invenção que tem atividadepesticida intensificada relativa à atividade da toxina deinseto correspondente não modificada (i.e., a toxina deinseto que não possui o sitio de ativação proteoliticaconstruído). Atividade pesticida melhorada refere-se aqualquer aumento na atividade pesticida da toxina de insetoclivada quando comparada com a atividade pesticida datoxina de inseto sem o sítio de ativação proteolitica. Emalguns avanços, um achado de atividade pesticida melhoradaou intensificada requer uma demonstração de um aumento detoxicidade de pelo menos 10%, contra o inseto alvo, e maispreferencialmente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%,70%, 100%, 200%, ou aumento maior de toxicidade relativa àatividade pesticida da toxina de inseto sem o sítio deativação proteolitica construído, determinada contra omesmo inseto. Qualquer teste padrão para medir a atividadepesticida pode ser usado para avaliar aumentos em atividadepesticida.

O estágio de desenvolvimento preferencial para testara atividade pesticida é o de formas larvais ou imaturas deum inseto de interesse. Os insetos podem ser criados noescuro total a partir de cerca de 20°C a cerca de 30°C e decerca de 30% a cerca de 70% de umidade relativa. Testesbiológicos podem ser efetuados como descrito em Czapla andLang (1990) J. Econ. Entomol. 83 (6) : 2480-2485. Métodos decriar larvas de insetos e realizar testes biológicos sãobem conhecidos de alguém de conhecimento ordinário na arte.Em alguns avanços da invenção, a toxina de inseto éuma toxina de Bacillus thuringiensis (Bt) . Toxina de nBt"ou "Bacillus thuringiensis" deve significar uma classe maisampla de toxinas em várias linhagens de Bacillusthuringiensis, o que inclui tais toxinas como, por exemplo,as proteínas vegetativas inseticidas e as δ-endotoxinas.Ver, por exemplo, Crickmore et al. (2004) BacillusThuringiensis Toxin Nomenelature emlifesci.sussex.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt e Crickmore etal. (1998) Mierobiol. Molee. Biol. Rev. 62:807-813, ambossão aqui incorporados por referência em sua integridade.

As proteínas vegetativas inseticidas (por exemplo, membrosdas classes VIP1, VIP2, ou VIP3) são proteína inseticidassecretadas que passam por processamento proteolítico porfluídos do trato digestivo mediano de insetos. Elaspossuem atividade pesticida contra um amplo espectro deinsetos lepidópteros. Ver, por exemplo, U.S. Patent No.5.877.012, aqui incorporada por referência em suaintegridade. As δ-endotoxinas Bt são tóxicas a larvas deum número de insetos peste, incluindo membros das ordensLepidoptera, Diptera, e Coleoptera. Essas protoxinas deinsetos incluem, mas não se limitam a, as toxinas Cry,incluindo, por exemplo, Cryl, Cry 2, Cry3, Cry4, Cry5,Cry6, Cry7, Cry8, e Cry9. De particular interesse são asδ-endotoxinas tipo Cry8. Toxinas "tipo Cry8" incluem aseqüência de nucleotídeos ou aminoácidos que compartilhamum alto grau de identidade ou similaridade de seqüência comseqüências previamente descritas categorizadas como Cry8,as quais incluem tais toxinas como, por exemplo, Cry8Bbl(ver Genbank Accession No. CAD57542; SEQ ID NOrlO(seqüência de nucleotideos); SEQ ID N0:11 (seqüência deaminoácidos)) e Cry8Bcl (ver Genbank Accession No.CAD57543; SEQ ID N0:12 (seqüência de nucleotideos); SEQ IDNO:13 (seqüência de aminoácidos)). Ver U.S. PatentApplication No. 10/606,320 pendente, intitulada, "GenesEncoding Proteins with Pesticidal Activity," preenchida em25 de junho de 2003, aqui incorporada por referência."Protoxina de inseto tipo Cry8" deve significar opolipeptideo biologicamente inativo que é convertido para atoxina de inseto tipo Cry8 ativada por clivagem em um sitiode ativação proteolitica por uma protease. É a toxina deinseto tipo Cry8 ativada que possui atividade pesticida.Como aqui usado, "toxina de inseto tipo Cry8" refere-se aum polipeptideo pesticida biologicamente ativo quecompartilha um alto grau de identidade de seqüência ousimilaridade com a toxina Cry8 de seqüências de insetos.

Como toxinas Bt são uma família de proteínasinseticidas que são sintetizadas como protoxinas e secristalizam como inclusões parasporais. Quando ingeridaspor um inseto peste, a estrutura micro-cristal é dissolvidapelo pH alcalino da porção média do trato digestivo doinseto, e a protoxina é clivada por protease do tratodigestivo do inseto para gerar a toxina ativa. A toxina Btativada se liga a receptores no epitélio do trato digestivodo inseto, causando lesões de membrana e inchaço associadoe Iise do trato digestivo do inseto. A morte do insetoresulta da fome e de septicemia. Ver, e.g., Li et al.(1991) Nature 353:815-821.

A forma de protoxina das toxinas Cry contém umsegmento cristalino em formação. Uma comparação dasseqüências de aminoácidos de toxinas Cry ativas dediferentes especificidades revela, ainda, cinco blocos deseqüência altamente conservados. Estruturalmente, astoxinas Cry compreendem três domínios distintos, que são,dos terminais N- a C-: um agrupamento de sete alfa-hélicesimplicadas em formação de poro (referido como "domínio 1"),três folhas-beta antiparalelas implicadas na ligaçãocelular (referido como "domínio 2") , e um sanduíche beta(referido como "domínio 3"). A localização e propriedadesdesses domínios são conhecidas daqueles especialistas naarte. Ver, por exemplo, Li et al. (1991) supra e Morse etal. (2001) Structure 9:409-417.

Outros exemplos de toxinas de inseto incluem, porexemplo, pentina-1 e proteínas tipo pentina (ver U.S.Patent Nos. 6.057.491 e 6.339.144, ambas são aquiincorporadas por referência em sua integridade). "TipoPentina-1" deve significar que a seqüência de nucleotídeosou aminoácidos compartilha um alto grau de identidade deseqüência ou similaridade com seqüências pentina-1previamente descritas.

As protoxinas de inseto modificadas ou toxinas deinseto modificadas da invenção podem ser derivadas dequalquer protoxina de inseto ou toxina de inseto nativaadequada (i.e., naturalmente ocorrente) , tal como as δ-endotoxinas Bt nativas descritas acima, por construção dositio de ativação proteolitica de interesse na seqüêncianativa de protoxina de inseto ou toxina de inseto. Dessamaneira, uma seqüência de nucleotideos codificando aprotoxina de inseto ou toxina de inseto nativa de interessepode ser alterada, por exemplo, por mutagênese sitiodirecionada, para compreender os códons para o sitio deativação proteolitica de interesse, i.e., um sitio sensívelpara proteases de trato digestivo de inseto. Como notadoacima, os códons para o(s) sitio(s) de ativaçãoproteolitica de interesse são construídos na região de umaseqüência codificadora nativa que corresponde a uma regiãode ativação da protoxina de inseto ou toxina de insetonativa, de forma que a clivagem proteolitica da protoxinade inseto modificada ou toxina de inseto modificadacodificada pela protease de interesse resulte em produçãoda toxina de inseto ativa ou uma toxina de inseto ativa comatividade pesticida melhorada.

Alternativamente, as protoxinas de inseto modificadasou toxinas de inseto modificadas da invenção podem serderivadas de fragmentos ou variantes de protoxinas outoxinas de inseto nativas, como aqui definido abaixo,contanto que o fragmento ou variante da protoxina de insetoou toxina de inseto nativo produza uma toxina de insetoativada (i.e., tendo atividade pesticida), ou uma toxinatendo atividade pesticida melhorada no caso de uma toxinade inseto modificada, em clivagem proteolitica pelaprotease de trato digestivo de inseto de interesse. Dessamaneira, as seqüências codificadoras para tais fragmentos evariantes da proteína protoxina de inseto ou toxina deinseto nativa servem como o material de início paraconstrução de códons para o(s) sítio(s) de ativaçãoproteolitica de interesse. Em essência, uma protoxina deinseto modificada ou toxina de inseto modificada projetadadessa maneira representa um fragmento ou variante daprotoxina de inseto ou toxina de inseto nativa que tenhasido construído para compreender o sítio de ativaçãoproteolitica de interesse na região de ativação dorespectivo polipeptídeo. Exemplos de variantes efragmentos de protoxinas e toxinas de insetos são providosna U.S. Patent Application No. 10/606,320 pendente,intitulada "Genes Encoding Proteins with PesticidalActivityf" preenchida em 25 de junho de 2003 e U.S. PatentApplication No. 10/746,914, intitulada "Genes EncodingProteins with Pestieidal Aetivity, " preenchida em 24 dedezembro de 2003, ambas são aqui incorporadas porreferência em sua integridade.

É reconhecido que variações em uma protoxina de insetomodificada ou toxina de inseto modificada aqui descritapodem ser introduzidas no nível da molécula de ácidonucléico que codifica uma forma modificada de uma protoxinade inseto ou toxina de inseto nativa para produzir umvariante da protoxina de inseto modificada ou toxina deinseto modificada codificada. Isto é, tendo revelado umaseqüência de nucleotídeos codificando uma protoxina deinseto ou toxina de inseto nativa com pelo menos um sitiode ativação proteolitica de interesse construído naseqüência nativa, um especialista na arte podesubseqüentemente introduzir variações na seqüência denucleotídeos da invenção revelada, de forma que a protoxinade inseto modificada ou toxina de inseto modificadacodificada é uma variante da protoxina modificada nativa deinseto ou toxina modificada nativa de inseto. Taisvariações incluem deleções, substituições, e adições de umou mais resíduos, e incluem variações que resultam emformas truncadas da protoxina de inseto modificada.Quaisquer tais variações podem ser introduzidas naseqüência de nucleotídeos codificando a protoxina de insetomodificada ou toxina de inseto modificada nativa, contantoque o variante codificado da protoxina de inseto modificadaou toxina de inseto modificada nativa possa ser clivadopara produzir uma toxina de inseto biologicamente ativa,i.e., uma toxina de inseto que possui atividade pesticidacomo aqui notado em outra parte, ou, no caso de uma toxinade inseto modificada, uma toxina com atividade pesticidamelhorada relativa à toxina de inseto que não possui osítio de ativação proteolitica. Tais variantes efragmentos são bem conhecidos na arte. Ver, e.g., U.S.Patent Application No. 10/606,320 pendente, preenchida em25 de junho de 2003; e U.S. Patent No. 5.877.012; aquiincorporadas por referência em sua integridade.Uma "protease" deve significar uma enzima que clivapolipeptideos hidrolizando ligações peptídicas. Como aquiusado, "protease de trato digestivo de inseto" refere-se auma protease que é naturalmente encontrada no tratodigestivo de um inseto peste. Pesquisadores estabeleceramque um amplo arranjo de proteases é expressado no tratodigestivo do inseto, incluindo cisteina e serina proteases.Ver, e.g., Shiba et al. (2001) Arch. Biochem. Biophys.390:28-34; ver também, Purcell et al. (1992) InsectBiochem. Mol. Biol. 22:1-47; Koiwa et al. (2 000) FEBSLetters 471:67-70; Koiwa et al. (2000) Anal. Biochem.282:153-155. Qualquer protease de trato digestivo deinseto pode ser usada na presente invenção. Em algunsavanços, a protease de trato digestivo de inseto é umaprotease cisteina, por exemplo, uma protease catepsina tipoL. Em avanços em particular, a protease de trato digestivode inseto é uma protease catepsina tipo L aqui descritaabaixo.

Um "sitio proteolítico" deve significar uma seqüênciade aminoácidos que confere sensitividade a uma classe deproteases ou a uma protease em particular, de forma que umpolipeptideo compreendendo a seqüência de aminoácidos éclivado naquele sitio por membros da classe de proteases oupela protease em particular. Como aqui usado, um "sitio deativação proteolítica" é um sitio proteolítico que foiconstruído em uma região de ativação de uma protoxina deinseto ou uma toxina de inseto. Como aqui usado nocontexto de uma protoxina de inseto, uma "região deativação" é uma região de uma protoxina de inseto de formaque a clivagem proteolitica no sitio de ativaçãoproteolitica na região de ativação gera uma toxina deinseto biologicamente ativa. Uma "região de ativação" emuma toxina de inseto refere-se a uma região de uma toxinade inseto tal que a clivagem proteolitica no sitio deativação proteolitica na região de ativação gere uma toxinade inseto que apresenta atividade pesticida melhoradarelativa à toxina de inseto correspondente sem o sitio deativação proteolitica construído. Um sítio proteolítico édito por ser "sensível" à(s) protease(s) que reconheceaquele sítio. É reconhecido que a eficiência de digestãoproteolitica irá variar, e que um decréscimo em eficiênciade digestão proteolitica pode levar a um aumento emestabilidade ou longevidade do polipeptídeo em uma célulavegetal ou em um trato digestivo de inseto. Assim, umsítio proteolítico pode conferir sensitividade a mais deuma protease ou classe de proteases, mas a eficiência dedigestão naquele sítio por várias proteases pode variar.

Sítios proteolíticos incluem, por exemplo, sítios paratripsina, sítios para quimotripsina, sítios para papaina,sítios para catepsina, e sítios tipo catepsina. Sítiosproteolíticos para proteases em particular freqüentementecompreender "motivos", ou padrões de seqüência, que sãoconhecidos por conferir sensitividade a uma protease emparticular. Assim, por exemplo, motivos de sítio paracatepsina incluem FRR, um sítio de clivagem de proteasecatepsina L; RR, um sítio de clivagem de tripsina ecatepsina B sitio de clivagem; LKM, um sitio paraquimotripsina; e FF, um sitio de catepsina D. Um sitioproteolitico putativo é uma seqüência que compreende ummotivo ou compreende uma seqüência similar a um motivo, masa qual não se apresentou sujeita a digestão pela proteasecorrespondente. Em um avanço, as protoxinas de insetomodificadas ou toxinas de inseto modificadas da invençãopossuem um sitio de ativação proteolitica que compreende omotivo LXQS (SEQ ID N0:1), mais particularmente, LSQS (SEQID N0:2). Em outros avanços, o sitio de ativaçãoproteolitica compreende LXQSLXQS (SEQ ID N0:3), maisparticularmente LSQSLSQS (SEQ ID N0:4).

0 sitio de ativação proteolitica construído podesubstituir um sítio naturalmente ocorrente na protoxina deinseto ou toxina de inseto. Por exemplo, em um avanço, aseqüência NGSR (SEQ ID NO: 5) localizada entre o Ioop dealfa-hélices 3 e 4 no domínio I da protoxina Cry8 de insetoé substituída com LSQS (SEQ ID N0:2) ou LSQSLSQS (SEQ IDNO:4). Em outros avanços da invenção, o sítio de ativaçãoproteolitica é introduzido na porção C-terminal daprotoxina, a porção N-terminal da protoxina, ou em ambasregiões N-terminal e C-terminal. Igualmente, em algunsavanços, a clivagem da protoxina resultará na remoção de umpeptídeo N-terminal, um peptídeo C-terminal, ou peptídeosde ambas regiões N-terminal e C-terminal da proteína. Emum avanço em particular, o sítio de ativação proteolitica éintroduzido na junção entre o segmento N-terminalcristalino em formação da protoxina e a porção C-terminalda protoxina que compreende a toxina de inseto ativa comclivagem.

É ainda reconhecido que protoxinas de inseto outoxinas de inseto expressadas em uma planta podem sersusceptíveis a clivagem adicional por proteases vegetais.Uma "protease vegetal" deve significar uma protease que énaturalmente encontrada em qualquer planta da invenção.Pesquisa prévia mostrou que plantas expressam uma variedadede proteases, incluindo proteases serina e cisteína. Ver,e. g. , Goodfellow et al. (1993) Plant Physiol. 101:415-419;Pechan et al. (1999) Plant Mol. Biol. 40:111-119; Lid etal. (2002) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 99:54 60-54 65. Emalguns avanços, a protease vegetal é uma protease cisteína,por exemplo, uma protease catepsina ou tipo catepsina. Emum avanço, a protease cisteína é uma protease catepsinatipo Β. A clivagem da protoxina de inseto ou toxina deinseto por uma protease vegetal em um sítio proteolíticonaturalmente ocorrente pode levar a, por exemplo,processamento prematuro, degradação, ou ativação daprotoxina ou toxina na planta, ao invés de no tratodigestivo do inseto onde será mais efetiva. Em avanços emparticular, a incorporação de um sítio de ativaçãoproteolítica, que foi construído para compreender um sítiode clivagem que é sensível a uma protease de tratodigestivo de inseto, também estabiliza a protoxina outoxina de inseto na planta. Como aqui usado, "estabiliza atoxina de inseto na planta" significa que a incorporação dosítio de ativação proteolítica construído protege aprotoxina de inseto ou toxina de inseto do, por exemplo,processamento prematuro, degradação (completa ou parcial),ou ativação na planta. A clivagem da protoxina de insetoou toxina de inseto em um sitio proteolitico naturalmenteocorrente por uma protease vegetal pode levar, também, ainativação proteolitica da toxina. Como aqui usado,"inativação proteolitica" implica em clivagem da protoxinade inseto ou toxina de inseto em um sitio proteoliticonaturalmente ocorrente por uma protease vegetal,caracterizado pelo fato de que a clivagem naquele sitioreduz ou elimina a atividade pesticida da toxina de insetoresultante. Em um avanço, a protoxina de inseto ou toxinade inseto é construída para substituir um sítioproteolitico naturalmente ocorrente que é sensível aclivagem por uma protease vegetal com um sítio de proteçãoproteolitica. Um "sítio de proteção proteolitica" devesignificar um sítio que não é sensível a clivagem por umaprotease vegetal endógena. A substituição de um sítioproteolitico naturalmente ocorrente sensível a clivagem poruma protease vegetal, com um sítio de proteçãoproteolitica, protege a protoxina de inseto ou toxina deinseto de inativação proteolitica pela planta. Ver, porexemplo, U.S. Patent Application No. 10/746,914 pendente,intitulada "Genes Encoding Proteins with PesticidalActivity," preenchida em 24 de dezembro de 2003, aquiincorporada por referência em sua integridade. A proteçãode um protoxina de inseto ou uma toxina de inseto deprocessamento prematuro, degradação, ou inativação porqualquer protease vegetal é englobada pela presenteinvenção.

Em alguns avanços, uma protoxina de inseto ou toxinade inseto é construída para compreender um sítio deativação proteolítica que é reconhecido por uma protease detrato digestivo de inseto. A invenção provê moléculas deácidos nucléicos, e variantes e fragmentos dessas, quecodificam proteases de trato digestivo de insetos.

Especificamente, a invenção provê moléculas de ácidosnucléicos codificando proteases identificadas na porçãomédia do trato digestivo de Diabrotica virgifera virgifera(i.e., larva da raiz do milho variedade western, WCRW daquiem diante). As seqüências de nucleotídeos relatadas nasSEQ ID NOs:6 e 8 codificam proteases cisteína que pertencemà subfamília de proteases catepsina tipo L. As seqüênciasde nucleotídeos relatadas nas SEQ ID NOs:6 e 8 codificam asseqüências polipeptídicas (i.e., proteases) das SEQ IDNOs: 7 e 9, respectivamente. A protease compreendendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:7 é 100% idêntica auma protease recentemente isolada da larva da raiz domilho. Ver Brown et al. (2004) Insect Biochem. Mol. Biol.34:305-320. A protease compreendendo a seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:9 é 79% idêntica a outra proteaseisolada por Brown et al. A invenção engloba, ainda,variantes e fragmentos dessas seqüências polipeptídicas quepossuem atividade proteolítica, como aqui definido abaixo.

Testes para medir atividade proteolíticas são bemconhecidos na arte.Estudos indicam que as proteases catepsina tipo L dainvenção representam as duas formas mais abundantes deproteases do tipo catepsina expressadas na porção média dotrato digestivo de WCRW e, portanto, espera-se que sejamsignificativamente envolvidas no processo digestivo. VerExemplo 1. Pesquisa prévia demonstrou que proteasescatepsina tipo L de mamíferos possuem uma preferência geralpor F-R-(A/S/K/N/Q) com clivagem C-terminal para a posiçãoda arginina. Pouco é conhecido sobre o(s) sítio (s) declivagem proteolítica para proteases catepsina tipo L deinsetos peste. Assim, as proteases da porção média detrato digestivo de WCRW da invenção são úteis, por exemplo,identificando sítio(s) de clivagem proteolíticapreferencial(is) para essas proteases. Em outro avanço, asproteases de trato digestivo de inseto são usadas paraidentificar sítios de clivagem proteolítica empolipeptídeos pesticidas, por exemplo, toxinas tipo Cry8,tais como Cry8Bbl e Cry8Bcl, que são susceptíveis a essasproteases.

Conhecimento acerca dos sítios proteolíticospreferenciais para proteases de trato digestivo de insetoda invenção pode levar a melhoramentos na ativação eestabilidade de toxinas de inseto. Por exemplo, um sítiode ativação proteolítica, que é sensível a clivagem por umaprotease de trato digestivo de inseto da invenção, pode serintroduzido em uma região de ativação de uma protoxina deinseto ou toxina de inseto. Quando essa protoxina deinseto ou toxina de inseto modificada é expressada em umaplanta e um inseto peste, tal como WCRW, se alimenta naplanta transgênica, a protoxina ou toxina é clivada por umaprotease catepsina tipo L da invenção no trato digestivo doinseto, produzindo, dessa forma, a toxina ativa ou umatoxina de inseto com atividade pesticida melhorada ecausando impacto no inseto peste. Em um avanço, o sitio deativação proteolitica construído é sensível a clivagem pelaprotease catepsina tipo L de SEQ ID NO: 7 ou 9. Em algunsavanços, a protoxina de inseto é uma protoxina tipo Cry8.

É ainda reconhecido que protoxinas ou toxinas deinsetos expressadas em uma planta podem ser susceptíveis aclivagem por proteases de trato digestivo de inseto pelaingestão por um inseto peste. A clivagem de uma toxina deinseto ativa por uma protease de trato digestivo de insetopode levar a inativação proteolitica da toxina. Nessecontexto, "inativação proteolitica" refere-se a clivagem deuma protoxina de inseto ou toxina de inseto em um sítioproteolítico por uma protease de trato digestivo de inseto,caracterizado pelo fato de que a clivagem naquele sítioreduz ou elimina a atividade pesticida da toxinaresultante. Em um avanço, uma protoxina ou toxina deinseto é construída para substituir um sítio proteolíticoque é sensível a clivagem por uma protease de tratodigestivo de inseto com um sítio de proteção proteolitica.Nesse contexto, "sítio de proteção proteolitica" refere-sea um sítio que não é sensível a clivagem por uma proteasede trato digestivo de inseto. A substituição de um sítioproteolítico sensível a clivagem por uma protease de tratodigestivo de inseto, com um sítio de proteção proteolítica,protege a protoxina de inseto ou toxina de inseto deinativação proteolítica no trato digestivo do inseto.

Eliminar sítios sensíveis a protease pode prevenir aprotoxina de inseto ou toxina de inseto de rápidadegradação da porção média do trato digestivo do insetoapós ingestão, permitindo a toxina alcançar seu alvointacta e alcançar, mais rapidamente, uma dose inseticidano inseto peste. Em um avanço, o sítio de proteçãoproteolítica é construído para ser insensível a clivagempor uma protease catepsina tipo L da invenção, i.e., opolipeptídeo de SEQ ID NO:7 ou 9.

Os ácidos nucléicos da invenção codificando proteases

ctepsina tipo L de trato digestivo de inseto (SEQ ID NOs:6e 8) e os polipeptídeos que codificam (SEQ ID NOs: 7 e 9)são, ainda, úteis identificando e projetando inibidoresdessas proteases. Agentes químicos e biológicos que inibemessas proteases poderiam exibir fortes efeitos pesticidaspela alimentação do inseto. Por exemplo, tais inibidorespodem resultar na inabilidade do inseto peste digeriralimento e fornecer os fatores de dieta necessários parasuportar o crescimento e desenvolvimento. Em algunsavanços, os inibidores das proteases catepsina tipo L dainvenção são polipeptídeos. Em um avanço em particular,moléculas de ácidos nucléicos codificando os inibidores depolipeptídeos de proteases de trato digestivo de inseto dainvenção são usados para gerar plantas transgênicas. Essasplantas são úteis controlando um inseto peste de umaplanta. Em outros avanços, inibidores de polipeptideos dasproteases catepsina tipo L da invenção são usados paracontrolar pestes aplicando a composição inibidora aoambiente de pestes.

Como aqui usado, "ácido nucléico" inclui referência aum polímero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeotanto na forma de fita simples ou dupla, e, a menos quelimitado de outra forma, engloba análogos conhecidos (e.g.,ácidos nucléicos peptídicos) tendo a natureza essência denucleotídeos naturais que hibridizam a ácidos nucléicos defita simples em uma maneira similar a de nucleotídeosnaturalmente ocorrentes.

O uso dos termos "construtos de polinucleotídeos" ou"construtos de nucleotídeos", aqui, não pretende limitar apresente invenção a construtos de nucleotídeoscompreendendo DNA. Aqueles de conhecimento ordinário naarte reconhecerão que construtos de nucleotídeos,particularmente polinucleotídeos e oligonucleotídeoscompostos de ribonucleotídeos e combinações deribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos, podem sertambém empregados nos métodos aqui descritos. Osconstrutos de nucleotídeos, ácidos nucléicos, e seqüênciasde nucleotídeos da invenção englobam, adicionalmente, todasformas complementares de tais construtos, moléculas, eseqüências. Adicionalmente, os construtos de nucleotídeos,moléculas de nucleotídeos, e seqüências de nucleotídeos dapresente invenção englobam todos construtos denucleotideos, moléculas, e seqüências que podem serempregadas nos métodos da presente invenção paratransformar plantas incluindo, mas não limitados a, aquelescompreendidos de desoxirribonucleotideos, ribonucleotideos,e combinações desses. Tais desoxirribonucleotideos eribonucleotideos incluem ambas moléculas naturalmenteocorrentes e análogos sintéticos. Os construtos denucleotideos, ácidos nucléicos, e seqüências denucleotideos da invenção também englobam todas as formas deconstrutos de nucleotideos incluindo, mas não limitados a,formas de fita simples, formas de fita dupla, hairpins,estruturas stem-e-loop, e similares.

Como aqui usado, os termos "codificando" ou"codificado", quando usados no contexto de um ácidonucléico especificado, significam que o ácido nucléicocompreende a informação requisito para tradução direta daseqüência de nucleotideos em uma proteína especificada. Ainformação pela qual uma proteína é codificada éespecificada pelo uso de códons. Um ácido nucléicocodificando uma proteína podem compreender seqüências nãotraduzidas (e.g., íntrons) em regiões traduzidas do ácidonucléico ou pode não possuir tais seqüências intervenientesnão traduzidas (e.g., como em DNAc).

Como aqui usado, o termo "construído de formarecombinante" ou "construído" ou "modificado" implica nautilização de tecnologia de DNA recombinante paraintroduzir (e.g., construir) uma mudança na estruturaprotéica baseado em um entendimento do mecanismo de ação daproteína e uma consideração dos aminoácidos sendointroduzidos, deletados, ou substituídos. Por exemplo, umamolécula de ácido nucléico codificando uma protoxina deinseto pode ser construída para compreender uma seqüênciacodificadora para um sítio de ativação proteolítica comoaqui descrito em outra parte.

Como aqui usado, "seqüência de comprimento total" emreferência a um polinucleotídeo especificado ou suaproteína codificada significa ter toda seqüência de ácidosnucléicos ou toda seqüência de aminoácidos de uma seqüêncianativa. Por "seqüência nativa" pretende-se uma seqüênciaendógena, i.e., uma seqüência não construída encontrada nogenoma de um organismo. Um polinucleotídeo de comprimentototal codifica uma forma de comprimento total da proteínaespecificada.

Como aqui usado, O termo "anti-senso" usado nocontexto de orientação de uma seqüência de nucleotídeosrefere-se a uma seqüência de polinucleotídeos duplex que éoperacionalmente ligada a um promotor em uma orientaçãoonde a fita anti-senso é transcrita. A fita anti-senso ésuficientemente complementar a um produto de transcriçãoendógeno, de forma que a tradução do produto de transcriçãoendógeno é freqüentemente inibida. Assim, onde o termo"anti-senso" é usado, no contexto de uma seqüência denucleotídeos em particular, ou termo refere-se à fitacomplementar do produto de transcrição referência.

Os termos "polipeptideo", "peptídeo" e "proteína" sãoaqui usados, intercambiavelmente, para referir-se a umpolímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicama polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos deaminoácidos são um análogo químico artificial de umaminoácido correspondente naturalmente ocorrente, assimcomo para polímeros de aminoácidos naturalmente ocorrentes.

Os termos "resíduo", ou "resíduo de aminoácido", ou"aminoácido", são aqui usados intercambiavelmente parareferir-se a um aminoácido que é incorporado em umaproteína, polipeptideo, ou peptídeo (coletivamente"proteína"). 0 aminoácido pode ser um aminoácidonaturalmente ocorrente e, a menos que limitado de outraforma, pode englobar análogos conhecidos de aminoácidosnaturais que podem funcionar de uma maneira similar comoaminoácidos naturalmente ocorrentes.

Polipeptídeos da invenção podem ser produzidos tanto apartir de um ácido nucléico aqui descrito, ou pelo uso detécnicas padrão de biologia molecular. Por exemplo, umaproteína truncada da invenção pode ser produzida porexpressão de um ácido nucléico recombinante da invenção emuma célula hospedeira apropriada, ou, alternativamente, poruma combinação de procedimentos ex vivo, tais como digestãoe purificação de protease.A invenção engloba composições de polinucleotideos ouproteínas isoladas ou substancialmente purificadas. Umpolinucleotídeo "isolado" ou "purificado " ou proteína, ouporção biologicamente ativa desse, é substancialmente ouessencialmente livre de componentes que normalmenteacompanham ou interagem com o polinucleotídeo ou proteínacomo encontrado em seu ambiente naturalmente ocorrente.Assim, um polinucleotídeo ou proteína isolado ou purificadoé substancialmente livre se outro material celular, ou meiode cultura quando produzido por técnicas recombinantes, ousubstancialmente livre de precursores químicos ou outrosquímico quando quimicamente sintetizado. De forma ótima,um polinucleotídeo "isolado" é livre se seqüências(seqüências codificando proteínas de forma ótima) quenaturalmente flaqueiam o polinucleotídeo (i.e., seqüênciaslocalizadas nas extremidades 5' e 3' do polinucleotídeo) noDNA genômico do organismo do qual o polinucleotídeo éderivado. Por exemplo, em vários avanços, opolinucleotídeo isolado pode conter menos do que cerca de 5kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ou 0,1 kb de seqüênciasde nucleotídeos que naturalmente flaqueiam opolinucleotídeo no DNA genômico da célula que opolinucleotídeo é derivado. Uma proteína que ésubstancialmente livre de material celular incluipreparações de proteína tendo menos do que cerca de 30%,20%, 10%, 5%, ou 1% (por peso seco) de proteínacontaminante. Quando a proteína da invenção ou porçãobiologicamente ativa dessa é produzida de formarecombinante, meio de cultura ótimo representa menos do quecerca de 30%, 20%, 10%, 5%, ou 1% (por peso seco) deprecursores químicos ou químicos que não são da proteína deinteresse.

Fragmentos e variantes dos polinucleotídeos eproteínas descritos, codificados dessa forma, são tambémenglobados pela presente invenção. Por "fragmento"pretende-se uma porção do polinucleotídeo ou uma porção daseqüência de aminoácidos e, assim, proteína codificadadessa forma. Fragmentos de um polinucleotídeo podecodificar fragmentos de proteína que retêm atividadebiológica da proteína nativa. Dessa foram, fragmentos deuma seqüência de nucleotídeos de protoxina de inseto podemcodificar fragmentos de proteína que se tornam toxinas deinseto ativas (i.e., possuem atividade pesticida) porclivagem por uma protease. Fragmentos de uma toxina deinseto pode codificar fragmentos de proteína que se tornamtoxinas de inseto com atividade pesticida melhorada porclivagem por uma protease de trato digestivo de inseto. Emcontraste, fragmentos de uma seqüência de nucleotídeos deprotease de trato digestivo de inseto da invenção podemcodificar fragmentos de proteína que possuem atividadeproteolítica, como aqui descrito, e reconhece o sítio declivagem proteolítica preferencial da protease nativa.

Alternativamente, fragmentos de um polinucleotídeo, que sãoúteis como sondas de hibridização, geralmente não codificamproteínas fragmento que retêm atividade biológica. Assim,fragmentos de um seqüência de nucleotídeos podem variar depelo menos cerca de 20 nucleotideos, cerca de 50nucleotideos, cerca de 100 nucleotideos, e até opolinucleotideo de comprimento total codificando ospolipeptideos da invenção.

Uma fragmento de um polinucleotideo da invenção quecodifica uma porção biologicamente ativa de uma proteína dainvenção codificará pelo menos 15, 25, 30, 50, 100, 150,200, ou 250 aminoácidos contíguos, ou até o número total deaminoácidos presentes em uma proteína de comprimento totalda invenção. Fragmentos de uma seqüência de nucleotideosque são úteis como sondas de hibridização, ou primers dePCR, geralmente não necessitam codificar uma porçãobiologicamente ativa de uma proteína da invenção.

Assim, um fragmento de um polinucleotideo aquidescrito pode codificar uma porção biologicamente ativa deuma protoxina de inseto, uma toxina de inseto, ou umaprotease de trato digestivo de inseto, ou pode ser umfragmento que pode ser usado como uma sonda de hibridizaçãoou primer de PCR usando métodos descritos abaixo. Umaporção biologicamente ativa de uma protease de tratodigestivo de inseto pode ser preparada isolando-se umaporção de um dos polinucleotídeos de protease de tratodigestivo de inseto da invenção, expressando a porçãocodificada da protease (e.g., por expressão recombinante invitro), e avaliando a atividade da porção codificada daprotease de trato digestivo de inseto. Polinucleotídeosque são fragmentos de uma seqüência de nucleotideos dainvenção compreendem pelo menos 16, 20, 50, 75, 100, 150,200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800,900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300, ou 1.400 nucleotideoscontíguos, ou até o número de nucleotideos presentes em umpolinucleotideo de comprimento total aqui descrito.

"Variantes" deve significar seqüênciassubstancialmente similares. Para polinucleotídeos, umvariante compreende uma deleção e/ou adição de um ou maisnucleotideos em um ou mais sítios internos nopolinucleotideo nativo e/ou uma substituição de um ou maisnucleotideos em um ou mais sítios no polinucleotideonativo. Como aqui usado, um polinucleotideo oupolipeptídeo "nativo" compreende uma seqüência denucleotideos ou seqüência de aminoácidos naturalmenteocorrente, respectivamente. Para polinucleotídeos,variantes conservativos incluem aquelas seqüências que, porcausa da degeneração do código genético, codificam aseqüência de aminoácidos de uma ou mais protoxinas deinseto ou proteases de trato digestivo de inseto.Variantes alélicos naturalmente ocorrentes, tais comoesses, podem ser identificados com o uso de técnicas debiologia molecular bem conhecidas, como, por exemplo, comreação de cadeia de polimerase (PCR) e técnicas dehibridização como destacadas abaixo. Polinucleotídeosvariantes também incluem polinucleotídeos sinteticamentederivados, tais como aqueles gerados, por exemplo, usandomutagênese sítio-direcionada, mas que ainda codifica umaproteína da invenção. Geralmente, variantes de umpolinucleotídeo da invenção em particular terão pelo menoscerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%,90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais deidentidade de seqüência àquele polinucleotídeo emparticular, como determinado por programas de alinhamentode seqüências e parâmetros aqui descritos em outra parte.

Variantes de um polinucleotídeo da invenção emparticular (i.e., o polinucleotídeo referência) podem sertambém avaliados por comparação da identidade de seqüênciapercentual entre o polipeptídeo codificado por umpolinucleotídeo variante e o polipeptídeo codificado pelopolinucleotídeo referência. Assim, por exemplo, é descritoum polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo comuma dada identidade de seqüência percentual ao polipeptídeode SEQ ID NO:9. A identidade de seqüência percentualentre quaisquer dois polipeptídeos pode ser calculadausando programas de alinhamento de seqüência e parâmetrosaqui descritos em outra parte. Onde qualquer dado para depolinucleotídeos da invenção é avaliado por comparação daidentidade de seqüência percentual compartilhada pelospolipeptídeos que codificam, a identidade de seqüênciapercentual entre os dois polipeptídeos codificados é depelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%,80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%ou mais de identidade de seqüência.

Proteína "variante" deve significar uma proteínaderivada da proteína nativa por deleção ou adição de um oumais aminoácidos, em um ou mais sítios internos na proteínanativa, e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em umou mais sítios na proteína nativa. Proteínas variantesenglobadas pela presente invenção são biologicamenteativas, de forma que continuam a possuir a atividadebiológica desejada da proteína nativa, isto é, por exemplo,atividade de protease como aqui descrito. Tais variantespodem resultar de, por exemplo, polimorfismo genético ou demanipulação humana. Variantes biologicamente ativos de umaprotoxina de inseto nativa ou protease de trato digestivode inseto da invenção terão pelo menos cerca de 40%, 45%,50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%,93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade deseqüência em relação à seqüência de aminoácidos para aproteína nativa, como determinado por programas dealinhamento de seqüência e parâmetros aqui descritos emoutra parte. Um variante biologicamente ativo de umaproteína da invenção pode diferir daquela proteína por tãopouco quanto 1-15 resíduos de aminoácidos, tão pouco quanto1-10, tal como 6-10, tão pouco quanto 5, tão pouco quanto4, 3, 2, ou até 1 resíduo de aminoácidos.

As proteínas da invenção podem ser alteradas de váriosmeios, incluindo substituições de aminoácidos, deleções,truncações e inserções. Métodos para tais manipulações sãogeralmente conhecidos na arte. Por exemplo, variantes efragmentos de seqüências de aminoácidos das proteínasprotoxinas ou proteases podem ser preparados por mutaçõesno DNA. Métodos para mutagênese e alterações depolinucleotídeos são bem conhecidos na arte. Ver, porexemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154:367-382;U.S. Patent No. 4.873.192; Walker and Gaastra, eds. (1983)Techniques in Molecular Biology (MacMillan PublishingCompany, New York) e referências ai citadas. Instruçõespara substituições de aminoácidos apropriadas que nãoafetam a atividade biológica da proteína de interesse podemser encontradas no modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas ofProtein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found.,Washington, D.C.), aqui incorporado por referência.

Substituições conservativas, tais como trocar um aminoácidopor outro tendo propriedades similares, podem ser ótimas.

Assim, os genes e polinucleotídeos da invenção incluemambas seqüências naturalmente ocorrentes, assim como formasmutantes. Igualmente, as proteínas da invenção englobamambas proteínas naturalmente ocorrentes, assim comovariações e formas modificadas dessas. Tais variantescontinuarão a possuir a atividade desejada. Obviamente, asmutações que serão feitas no DNA codificando o variantepodem não posicionar a seqüência for a do quadro de leiturae, de forma ótima, não criar regiões complementares quepoderiam produzir estruturas de RNAm secundário. Ver, EPPatent Application Publication No. 75,444.

Não espera-se que as deleções, inserções, esubstituições das seqüências de proteína aqui englobadasproduzam mudanças radicais nas características da proteína.Contudo, quando é difícil prever o efeito exato dasubstituição, deleção, ou inserção antes de fazê-la, umespecialista na arte irá ponderar que o efeito seráavaliado por testes de rastreamento de rotina. Isto é, aatividade de uma protoxina ou toxina de inseto pode seravaliada, por exemplo, por testes de alimentação de inseto.Ver, e.g., Marrone et al. (1985) J. Econ. Entomol. 78:290-293 e Czapla and Lang (1990) supra, aqui incorporados porreferência. Testes para avaliar a atividade proteoliticade uma protease de trato digestivo de inseto da invençãosão bem conhecidos na arte.

Polinucleotideos e proteínas variantes também englobamseqüências e proteínas derivadas de um procedimentomutagênico e recombinogênico, tal como embaralhamento deDNA. Com tal procedimento, uma ou mais seqüênciascodificadoras diferentes podem ser manipuladas para criaruma nova protoxina, toxina, ou proteína protease possuindoas propriedades desejadas. Dessa maneira, bibliotecas depolinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de umapopulação de seqüências de polinucleotídeos relacionadascompreendendo regiões de seqüência que têm identidade deseqüência substancia e podem ser homologamente recombinadasin vitro ou in vivo. Por exemplo, usando essa abordagem,motivos de seqüência codificando um domínio de interessepodem ser embaralhados entre o gene da invenção e outrosgenes conhecidos para obter um novo gene codificando umaproteína com uma propriedade de interesse melhorada, talcomo Km aumentado no caso de uma protease de tratodigestivo de inseto. Estratégias para tal embaralhamentode DNA são conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Stemmer(1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-10751; Stemmer(1994) Nature 370:389-391; Crameri et al. (1997) NatureBiotech. 15:436-438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol.272:336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA94:4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291; eU.S. Patent Nos. 5.605.793 e 5.837.458.

Os polinucleotideos da invenção podem ser usados paraisolar seqüências correspondentes de outros organismos,particularmente outras plantas ou insetos. Dessa maneira,métodos, tais como PCR, hibridização, e similares podem serusados para identificar tais seqüências baseadas em suahomologia de seqüência a seqüências aqui relatadas.Seqüências isoladas baseadas em sua identidade de seqüênciaem relação a seqüências completas de protoxina de inseto,toxina, ou protease de trato digestivo de inseto, aquirelatadas ou a variantes e fragmentos dessas são englobadospela presente invenção. Tais seqüências incluem seqüênciasque são ortólogas das seqüências descritas. "Ortólogos"deve significar genes derivados de um gene ancestral comume que são encontrados em diferentes espécies como resultadode especiação. Genes encontrados em diferentes espéciessão considerados ortólogos quando suas seqüências denucleotideos e/ou suas seqüências de proteína codificadacompartilham pelo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%,92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais deidentidade de seqüência. As funções dos ortólogos sãofreqüentemente altamente conservadas dentre espécies.Assim, polinucleotídeos isolados que codificam umaprotoxina de inseto, toxina de inseto, ou uma protease detrato digestivo de inseto, e que hibridiza sob condiçõesrigorosas às seqüências aqui descritas, ou a variantes oufragmentos dessas, são englobados pela presente invenção.

Em uma abordagem de PCR, primers de oligonucleotideospodem ser projetados para uso em reações de PCR paraamplificar seqüências de DNA correspondentes de DNAc ou DNAgenômico extraído de qualquer organismo de interesse.Métodos para projetar primers de PCR e clonagem de PCR sãogeralmente conhecidos na arte e estão descritos em Sambrooket al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ded., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NewYork). Ver também Innis et al., eds. (1990) PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications (Academic Press, NewYork); Innis and Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies(Academic Press, New York); e Innis and Gelfand, eds.(1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York).Métodos conhecidos de PCR incluem, mas não se limitam a,métodos usando primers pareados, primers de refúgio,primers únicos específicos, primers degenerados, primersgene-específicos, primers vetor-específicos, primersparcialmente sem correspondência, e similares.

Em técnicas de hibridização, todo ou parte de umpolinucleotídeo conhecido é usado como uma sonda quehibridiza seletivamente a outros polinucleotídeoscorrespondentes presentes em uma população de fragmentos deDNA genômico clonados ou fragmentos de DNA (i.e.,bibliotecas genômicas ou de DNAc) de um organismoescolhido. As sondas de hibridização podem ser fragmentosde DNA genômico, fragmentos de DNAc, fragmentos de RNA, ououtros oligonucleotideos, e podem ser rotulados com umgrupo detectável, tal como 32P, ou qualquer outro marcadordetectável. Assim, por exemplo, sondas para hibridizaçãopodem ser feitas rotulando oligonucleotideos sintéticosbaseado nos polinucleotideos da invenção. Métodos parapreparação de sondas para hibridização e para construção debibliotecas de DNAc e de DNA genômico são geralmenteconhecidos na arte e estão descritos em Sambrook et al.(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., ColdSpring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Por exemplo, um polinucleotideo inteiro de protease detrato digestivo de inseto aqui descrito, ou uma ou maisporções desse, podem ser usados como uma sonda capaz dehibridizar especificamente a polinucleotideos e RNAsmensageiros correspondentes de protease de trato digestivode inseto. Para alcançar hibridização especifica sob umavariedade de condições, tais sondas incluem seqüências quesão únicas dentre seqüências de polinucleotideos deprotease de trato digestivo de inseto e são, de formaótima, de pelo menos cerca de 10 nucleotideos emcomprimento, e mais otimamente pelo menos cerca de 20nucleotideos em comprimento. Tais sondas podem ser usadaspara amplificar polinucleotideos de protease de tratodigestivo de inseto correspondentes de um organismoescolhido, por PCR. Essa técnica pode ser usada paraisolar seqüências codificadoras adicionais de um organismodesejado ou como um teste diagnóstico para determinar apresença de seqüências codificadoras em um organismo.Técnicas de hibridização incluem rastreamento dehibridização de bibliotecas de DNA em placa (tanto placasou colônias; ver, por exemplo, Sambrook et al. (1989)Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press, Plainview, New York).

A hibridização de tais seqüências pode ser conduzidasob condições rigorosas. Por "condições rigorosas" ou"condições de hibridização rigorosas" pretende-se condiçõessob as quais uma sonda hibridizará a sua seqüência alvo aum grau detectavelmente maior do que a outras seqüências(e.g., pelo menos 2 dobras sobre a base). Condiçõesrigorosas são dependentes de seqüência e serão diferentesem diferentes circunstâncias. Controlando o rigor dascondições de hibridização e/ou lavagem, seqüências alvo quesão 100% complementares à sonda podem ser identificadas(sondagem homóloga). Alternativamente, condições rigorosaspodem ser ajustadas para permitir alguma falta decorrespondência em seqüências, de forma que menores grausde similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga).Geralmente, uma sonda é de menos do que cerca de 1000nucleotideos em comprimento, otimamente, menos do que cercade 500 nucleotideos em comprimento.Tipicamente, condições rigorosas serão aquelas nasquais a concentração de sais é menos do que cerca de 1,5 Mde ions Na, tipicamente cerca de 0,01 a 1,0 M deconcentração de ions Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 ea temperatura está em pelo menos cerca de 30°C para sondascurtas (e.g., 10 a 50 nucleotideos) e a pelo menos cerca de60°C para sondas longas (e.g., maiores que 50nucleotideos). Condições rigorosas podem ser alcançadascom a adição de agentes desestabilizantes, tais comoformamida. Condições exemplares de baixo rigor incluemhibridização com uma solução tampão de formamida 30 a 35%,NaCl a 1 M, 1% SDS (dodecil sulfato de sódio) a 37°C, e umalavagem em IX a 2X SSC (20X SSC = 3,0 M NaCl/0,3 M citratode trissódio) a 50 a 55°C. Condições exemplares de rigormoderado incluem hibridização em formamida 40 a 45%, NaCl a1,0 M, 1% SDS a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a IX SSC a 55 a60°C. Condições exemplares de rigor elevado incluemhibridização em formamida 50%, NaCl a 1 M, 1% SDS a 37°C, euma lavagem em 0,1X SSC a 60 a 65°C. Opcionalmente,tampões de lavagem podem compreender cerca de 0,1% a cercade 1% SDS. A duração de hibridização é de geralmente menosdo que cerca de 24 horas, usualmente cerca de 4 a cerca de12 horas. A duração do tempo de lavagem será de pelo menosuma extensão de tempo suficiente para alcançar oequilíbrio.

A especificidade é tipicamente a função de lavagenspós-hibridização, os fatores críticos sendo a força iônicae temperatura da solução de lavagem final. Para híbridosDNA-DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação deMeinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm =81,50C + 16,6 (Iog M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L;onde M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é aporcentagem de nucleotideos guanosina e citosina no DNA, %form é a porcentagem de formamida na solução dehibridização, e L é o comprimento do híbrido em pares debase. A Tm é a temperatura (sob definida força iônica epH) na qual 50% de uma seqüência alvo complementarhibridiza a uma sonda perfeitamente correspondente. A Tm éreduzida a cerca de 1°C para cada 1% de falta decorrespondência; assim, Tm, hibridização, e/ou condições delavagem podem ser ajustadas para hibridizar seqüências daidentidade desejada. Por exemplo, se seqüências com >90%de identidade são procuradas, a Tm pode ser diminuída em10°C. Geralmente, condições rigorosas são selecionadaspara serem cerca de 5 0C menor do que o ponto térmico dederretimento (Tm) para a seqüência específica e seucomplemento em uma definida força iônica e pH. Contudo,condições severamente rigorosas podem utilizar umahibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4°C menor do que oponto térmico de derretimento (Tm) ; condições moderadamenterigorosas podem utilizar um hibridização e/ou lavagem a 6,7, 8, 9, or IO0C menor do que o ponto térmico dederretimento (Tm) ; condições de baixo rigor podem utilizaruma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15, or 20°Cmenor do que o ponto térmico de derretimento (Tm) . usandoa equação, composições de hibridização e lavagem, e Tmdesejada, aqueles de conhecimento ordinário entenderão quevariações no rigor de soluções de hibridização e/ou lavagemsão inerentemente descritas. Se o grau desejado de faltade correspondência resulta em uma Tm de menos do que 45°C(solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), será ótimoaumentar a concentração de SSC de forma que uma maiortemperatura possa ser usada. Um guia extensivo para ahibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I,Chapter 2 (Elsevier, New York); e Ausubel et al.r eds.(1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2(Greene Publishing and Wiley-Intérscience, New York). VerSambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A LaboratoryManual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview, New York).

Os seguintes termos são usados para descrever arelação de seqüência entre dois ou mais polinucleotideos oupolipeptideos: (a) "seqüência referência", (b) "janela decomparação", (c) "identidade de seqüência", e, (d)"porcentagem de identidade de seqüência".

Como aqui usado, "seqüência referência" é umaseqüência definida como uma base para comparação deseqüência. Uma seqüência referência pode ser um subgrupoou a totalidade de uma seqüência especificada; por exemplo,como um segmento de um DNAc de comprimento total ouseqüência gênica, ou o DNA completo ou seqüência gênica.Como aqui usado, "janela de comparação" faz referênciaa um segmento contíguo e especificado de uma seqüência depolinucleotideos, caracterizado pelo fato da seqüência depolinucleotídeos na janela de comparação poder compreenderadições ou deleções (i.e., espaços) comparada à seqüênciareferência (que não compreende adições ou deleções) paraalinhamento ótimo dos dois polinucleotídeos. Geralmente, ajanela de comparação é de pelo menos 20 nucleotídeoscontíguos em comprimento, e opcionalmente pode ser de 30,40, 50, 100, ou mais longa. Aqueles especialistas na arteentendem que evitar uma alta similaridade a uma seqüênciareferência devido à inclusão de espaços na seqüência depolinucleotídeos uma penalidade por espaço é tipicamenteintroduzida e subtraída do número de correspondências.

Métodos de alinhamento de seqüências para comparaçãosão bem conhecidos na arte. Assim, a determinação deidentidade de seqüência percentual entre quaisquer duasseqüências pode ser conseguida usando um algoritmomatemático. Exemplos não limitantes de tais algoritmosmatemáticos são o algoritmo de Myers and Miller (1988)CABIOS 4:11-17; o algoritmo de alinhamento local de Smithet al. (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; o algoritmo dealinhamento global de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol.Biol. 48:443-453; o método de alinhamento de busca porlocal de Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei.85:2444-2448; o algoritmo de Karlin and Altschul (1990)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 872264, modificado como emKarlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA90:5873-5877.

Implementações computacionais desses algoritmosmatemáticos podem ser utilizadas para comparação deseqüências para determina a identidade de seqüência. Taisimplementações incluem, mas não se limitam a: CLUSTAL noprograma PC/Gene (disponível pela Intelligenetics, MountainView, Califórnia); o programa ALIGN (Version 2.0) e GAP,BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no pacote de software GCGWisconsin Genetics Software Package, Version 10 (disponívelpela Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego,Califórnia, USA). Alinhamentos usando esses programaspodem ser efetuados usando os parâmetros padrão. 0programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins et al. (1988)Gene 73:237-244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90;Huang et al. (1992) CABIOS 8:155-65; e Pearson et al.(1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. 0 programa ALIGN ébaseado no algoritmo de Myers and Miller (1988) supra. Umatabela de peso de resíduo PAM120, uma penalidade porcomprimento de espaço de 12, e uma penalidade por espaço de4 podem ser usadas com o programa ALIGN quando comparandoseqüências de aminoácidos. Os programas BLAST de Altschulet al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 são baseados noalgoritmo de Karlin and Altschul (1990) supra. BLASTbuscas por nucleotídeos podem ser efetuadas com o programaBLASTN, pontuação = 100, tamanho de palavra = 12, paraobter seqüências de nucleotídeos homólogas à seqüência denucleotideos codificando uma proteína da invenção. BuscasBLAST por proteínas podem ser efetuadas com o programaBLASTX, pontuação = 50, comprimento de palavra = 3, paraobter seqüências de aminoácidos homólogas à proteína oupolipeptídeo da invenção. Para obter alinhamentosespaçados para propósitos de comparação, Gapped BLAST (inBLAST 2.0) pode ser utilizado como descrito em Altschul etal. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente,PSI-BLAST (in BLAST 2.0) pode ser utilizado para efetuar umbusca iterada que detecte relações distantes entremoléculas. Ver Altschul et al. (1997) supra. Quandoutilizando BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, os parâmetrospadrão dos respectivos programas (e.g., BLASTN paraseqüências de nucleotideos, BLASTX para proteínas) podemser usados. Ver www.ncbi.nlm.nih.gov. 0 alinhamento podeser efetuado manualmente por inspeção.

A menos que declarado ao contrário, os valores deidentidade/similaridade de seqüência aqui providos referem-se ao valor obtido usando GAP Version 10 usando osseguintes parâmetros: % identidade e % similaridade parauma seqüência de nucleotideos usando GAP Weight de 50 eLength Weight de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp;% identidade e % similaridade para uma seqüência deaminoácidos usando GAP Weight de 8 e Length Weight de 2, ea matriz de pontuação BLOSUM62; ou qualquer programaequivalente desse. Por "programa equivalente" pretende-sequalquer programa de comparação de seqüências que, paraquaisquer duas seqüências em questão, gere um alinhamentotendo correspondências de nucleotídeos ou resíduos deaminoácidos idênticas e uma identidade de seqüênciapercentual idêntica quando comparada ao alinhamentocorrespondente gerado por GAP Version 10.

GAP usa o algoritmo Needleman and Wunsch (1970) J.Mol. Biol. 48:443-453, para encontrar o alinhamento de duasseqüências completas que maximiza o número decorrespondências e minimiza o número de espaços. GAPconsidera todas posições de alinhamento e espaços possíveise cria o alinhamento com o maior número de bases comcorrespondência e o menor número de espaços. Isto permitea provisão de uma penalidade de criação de espaço e umapenalidade de extensão de espaço em unidades de bases comcorrespondência. GAP deve fazer um saldo de número depenalidade de criação de espaços de correspondências paracada espaço que insere. Se uma penalidade por extensão deespaço maior que zero é escolhida, GAP deve,adicionalmente, fazer um saldo para cada espaço inserido docomprimento do espaço vezes a penalidade por extensão deespaço. Valores padrão de penalidade de criação de espaçose valores de penalidade de extensão de espaços na Versão 10do pacote de software Wisconsin Genetics Software Packagepara seqüências de proteínas são 8 e 2, respectivamente.

Para seqüências de nucleotídeos a penalidade padrão paracriação de espaço é de 50, enquanto a penalidade padrão porextensão de espaço é de 3. As penalidades de criação eextensão de espaços podem ser expressas como um númerointeiro selecionado do grupo de números inteirosconsistindo de 0 a 200. Assim, por exemplo, as penalidadesde criação e extensão de espaços podem ser 0, 1, 2, 3, 4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60,65 ou maiores.

GAP apresenta um membro da família de alinhamentosótimos. Podem existir vários membros dessa família, masnenhum outro membro possui uma melhor qualidade. GAPapresenta quatro figuras de mérito para alinhamentos:

Quality, Ratio, Identity, e Similarity. A Quality é amétrica maximizada para alinhar as seqüências. Ratio é aquality divida pelo número de bases no segmento mais curto.

Percent Identity é a porcentagem dos símbolos que de fatose correspondem. Percent Similarity é a porcentagem dossímbolos que são similares. Os símbolos que estão atravésdos espaços são ignorados. Uma similaridade é pontuadaquando o valor da matriz de pontuação para um par desímbolos é maior ou igual a 0,50, o limite de similaridade.

A matriz de pontuação usada na Versão 10 do pacote desoftware GCG Wisconsin Genetics Software Package é BLOSUM62(ver Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei.USA 89:10915).

Como aqui usado, "identidade de seqüência", ou"identidade", no contexto de duas seqüências denucleotídeos ou polipeptídicas, faz referência aos resíduosnas duas seqüências que são a mesma quando alinhadas paracorrespondência máxima sobre uma janela de comparaçãoespecífica. Quando a porcentagem de identidade de seqüênciaé usada em referência a proteínas, é reconhecido queposições de resíduos que não são idênticos, freqüentementediferem por substituições de aminoácidos conservativas,onde os resíduos de aminoácidos são substituídos por outrosresíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares(e.g., carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não mudam aspropriedades funcionais da molécula. Quando seqüênciasdiferem em substituições conservativas, a identidade deseqüência percentual pode ser ajustada para cima paracorrigir a natureza conservativa da substituição.Seqüências que diferem por tais substituições conservativassão ditas tendo "similaridade de seqüência" ou"similaridade". Meios de fazer esse ajuste são bemconhecidos daqueles especialistas na arte. Tipicamente,isso envolve pontuar uma substituição conservativa como umaparcial, ao invés de uma falta de correspondência completa,aumentando, dessa foram, a porcentagem de identidade deseqüência. Assim, por exemplo, onde um aminoácido idênticorecebe uma pontuação de 1 e uma substituição nãoconservativa recebe uma pontuação de zero, uma substituiçãoconservativa recebe uma pontuação entre zero e 1. Apontuação de substituições conservativas é calculada, e.g.,como implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics,Mountain View, Califórnia).

Como aqui usado, "porcentagem de identidade deseqüência" significa o valor determinado comparando-se duasseqüências otimamente alinhadas por uma janela decomparação, caracterizado pelo fato de que a porção daseqüência de polinucleotideos na janela de comparação podecompreender adições ou deleções (i.e., espaços), secomparada à seqüência referência (que não compreendeadições ou deleções) para alinhamento ótimo das duasseqüências. A porcentagem é calculada determinando-se onúmero de posições nas quais a base de ácido nucléico ouresíduo de aminoácido ocorre em ambas seqüências parapermitir o número de posições com correspondência,dividindo o número de posições com correspondência pelonúmero total de posições na janela de comparação, emultiplicando o resultado por 100 para produzir aporcentagem de identidade de seqüência.

O uso do termo "polinucleotídeo" não pretende limitara presente invenção para polinucleotideos compreendendoDNA. Aqueles de conhecimento ordinário na artereconhecerão que polinucleotideos, podem compreenderribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos edesoxirribonucleotideos. Tais desoxirribonucleotídeos eribonucleotídeos incluem ambas moléculas naturalmenteocorrentes e análogos sintéticos. Os polinucleotideos dainvenção também englobam todas formas de seqüênciasincluindo, mas não limitado a, formas de fita simples,formas de fita dupla, hairpins, estruturas stem-and-loop, esimilares.

A protoxina de inseto, toxina de inseto, e seqüênciasde polinucleotideos de protease de trato digestivo deinseto da invenção podem ser providas em cassetes deexpressão para expressão na planta de interesse. 0 casseteincluirá seqüências reguladoras 5' e 3' operacionalmenteligadas a um polinucleotideo da invenção.

"Operacionalmente ligado" deve significar uma ligaçãofuncional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, umaligação operacional entre um polinucleotideo de interesse euma seqüência reguladora (i.e., um promotor) é uma ligaçãoque permite a expressão do polinucleotideo de interesse.Elementos operacionalmente ligados podem ser contíguos ounão contíguos. Quando usados para referir-se à junção deduas regiões codificadoras de proteína, poroperacionalmente ligado pretende-se que as regiõescodificadoras estejam no mesmo quadro de leitura. 0cassete pode conter adicionalmente pelo menos um geneadicional a ser co-transformado no organismo.Alternativamente, o(s) gene(s) adicional(is) pode serprovido em múltiplos cassetes de expressão. Tal cassete deexpressão é provido com uma pluralidade de sítios derestrição e/ou sítios de recombinação para inserção dopolinucleotideo de protoxina ou protease de trato digestivode inseto para estar sob regulação transcricional dasregiões reguladoras. 0 cassete de expressão pode conter,adicionalmente, genes marcadores de seleção.

O cassete de expressão incluirá na direção 5'-3' detranscrição, uma região de iniciação transcricional e detradução (i.e., um promotor), um polinucleotideo dainvenção, e uma região de terminação transcricional e detradução (i.e., região de terminação) funcional em plantas.As regiões reguladoras (i.e., promotores, regiõesreguladoras de transcrição, e regiões de terminação detradução) e/ou o polinucleotideo da invenção, podem sernativas/análogas à célula hospedeira ou uma à outra.

Alternativamente, as regiões reguladoras, e/ou opolinucleotideo da invenção, podem ser heterólogas à célulahospedeira ou uma à outra. Como aqui usado, "heterólogo"em referência a uma seqüência é uma seqüência que seorigina de uma espécie estrangeira, ou, se da mesmaespécie, é substancialmente modificada de sua forma nativaem composição e/ou lócus genômico por intervenção humanadeliberada. Por exemplo, um promotor operacionalmenteligado a um polinucleotideo heterólogo é de uma espéciediferente da espécie da qual o polinucleotideo foiderivado, ou, se da mesma/análoga espécie, um ou ambos sãosubstancialmente modificados de sua forma original e/oulócus genômico, ou o promotor não é o promotor nativo parao polinucleotideo operacionalmente ligado. Como aqui usado,um gene quimérico compreende uma seqüência codificadoraoperacionalmente ligada a uma região de iniciação detranscrição que é heteróloga à seqüência codificadora.

Enquanto pode ser ótimo expressar as seqüências usandopromotores heterólogos, as seqüências promotoras nativaspodem ser usadas.

A região de terminação pode ser nativa com a região deiniciação transcricional, pode ser nativa com opolinucleotideo de interesse operacionalmente ligado, podeser nativa com o hospedeiro vegetal, ou pode ser derivadade outra fonte (i.e., estrangeira ou heteróloga aopromotor, o polinucleotideo de interesse, o hospedeirovegetal, ou qualquer combinação desses). Regiões determinação convenientes estão disponíveis a partir deplasmídios Ti de A. tumefaeiens, tais como as regiões determinação de octopina sintase e nopalina sintase. Vertambém Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al.(1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Bailaset al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7 8 91-7 903; e Joshi etal. (1987) Nucleic Aeids Res. 15:9627-9639.

Quando apropriado, os polinucleotídeos podem serotimizados para expressão aumentada na planta transformada.Isto é, os polinucleotídeos podem ser sintetizados usandocódons preferenciais de planta para expressão melhorada.Ver, por exemplo, Campbell and Gowri (1990) Plant Physiol.92:1-11 para uma discussão de uso de códons preferenciaisde hospedeiro. Métodos estão disponíveis na arte parasintetizar genes preferenciais de planta. Ver, porexemplo, U.S. Patent Nos. 5.380.831, e 5.436.391, e Murrayet al. (1989) Nueleie Aeids Res. 17:477-498, aquiincorporados por referência.

Modificações de seqüência adicionais são conhecidaspor intensificar a expressão gênica em um hospedeirocelular. Essas incluem a eliminação de seqüênciascodificando sinais de poliadenilação espuriosos, sinais desítio de splice éxon-intron, repetições tipo transposon, eoutras tais seqüências bem caracterizadas que podem serdeletérias a expressão gênica. 0 conteúdo G-C da seqüênciade nucleotídeos heteróloga pode ser ajustado a níveismédios para um dado hospedeiro celular, como calculado porreferência para genes conhecidos expressados na célulahospedeira. Quando possível, a seqüência é modificada paraevitar estruturas hairpin secundárias de RNAm previstas.

Os cassetes de expressão podem conter, adicionalmente,seqüências líder 5'. Tais seqüências líder podem atuarpara intensificar a tradução. Líderes de tradução sãoconhecidos na arte e incluem: líderes de picornavírus, porexemplo, líder EMCV (região não codificadora 5' deencefalomiocardite) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Nat.Acad. Sei. USA 86:6126-6130); lideres de potivírus, porexemplo, líder TEV (Vírus Etch de Tabaco) (Gallie et al.(1995) Gene 165(2):233-238), líder MDMV (Vírus de Mosaicodo Milho Anão) (Virology 154:9-20), proteína ligante deimunoglobulina humana de cadeia pesada (BiP) (Macejak etal. (1991) Nature 353:90-94); líder não traduzido deproteína de capa de RNAm de vírus de mosaico de alfafa (AMVRNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325:622-625); líderse vírus de mosaico de tabaco (TMV) (Gallie et al. (1989)in Molecular Biology of RNAr ed. Cech (Liss, New York), pp.237-256); e líder de vírus clorótico de milho (MCMV)(Lommel et al. (1991) Virology 01:382-385). Ver, também,Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiology 84:965-968.Na preparação do cassete de expressão, os váriosfragmentos de DNA podem ser manipulados, de forma a proviras seqüências de DNA na orientação correta e, seapropriado, no quadro de leitura correto. Nesse sentido,adaptadores ou ligantes podem ser empregados para juntar osfragmentos de DNA ou outras manipulações podem serenvolvidas para provir sítios de restrição convenientes,remoção de DNA supérfluo, remoção de sítios de restrição,ou similares. Para esse propósito, mutagênese in vitro,reparo de primer, restrição, anelamento, re-substituições,e.g., transições e transversões, podem ser envolvidos.

Geralmente, o cassete de expressão compreenderá um genemarcador de seleção para a seleção de células transformadas.Genes marcadores de seleção são utilizados para a seleção decélulas ou tecidos transformados. Genes marcadores incluemgenes codificando resistência antibiótica, tais como aquelescodificando neomicina fosfotransferase II (NEO) ehigromicina fosfotransferase (HPT), assim como genesconferindo resistência a compostos herbicidas, tais comoglufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Marcadores de seleçãoadicionais incluem marcadores fenotípicos, tais como β-galactosidase e proteínas fluorescentes, tais como proteínaverde fluorescente (GFP) (Su et al. (2004) Biotechnol.Bioeng. 85:610-9 e Fetter et al. (2004) Plant Cell 16:215-28), proteína ciano fluorescente (CYP) (Bolte et al. (2004)J. Cell Science 117:943-54 e Kato et al. (2002) PlantPhysiol 129:913-42), e proteína amarela fluorescente(PhiYFP™ from Evrogen, ver, Bolte et al. (2004) J. CellScience 117:943-54). Para marcadores de seleçãoadicionais, ver, em geral, Yarranton (1992) Curr. Opin.Biotech. 3:506-511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 8 9:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley etal. (1980) in The Operonf pp. 177-220; Hu et al. (1987) Cell48:555-566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge etal. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle et al. (1989) Proc.Natl. Acad. Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst et al. (1989)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:2549-2553; Deuschle et al.(1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis,University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 90:1917-1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell.Biol. 10:3343-3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl.Acad. Sei. USA 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991) NucleicAcids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) TopicsMol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb et al. (1991)Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt etal. (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D.Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 8 9:5547-5551; Oliva et al. (1992)Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al.(1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 7 8 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334:721-724. Tais descrições são aqui incorporadas por referência.A lista acima de genes marcadores de seleção não deveser limitante. Qualquer gene marcador de seleção pode serusado na presente invenção.

Um número de promotores pode ser usado na prática dainvenção. Os promotores podem ser selecionados baseado noresultado desejado. Isto é, os ácidos nucléicos podem sercombinados com promotores constitutivos, tecido-preferenciais, ou outros promotores para expressão emplantas. Tais promotores constitutivos incluem, porexemplo, o promotor núcleo do promotor Rsyn7 e outrospromotores constitutivos descritos em WO 99/43838 e U.S.Patent No. 6.072.050; o promotor núcleo de CaMV 35S (Odellet al. (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroyet al. (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina(Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 eChristensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689);pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588);MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730) ; promotorALS (U.S. Patent No. 5,659,026), e similares. Outrospromotores constitutivos incluem, por exemplo, U.S. PatentNos. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785;5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; e 6.177.611.

Geralmente, será benéfico expressar o gene de umpromotor induzido, particularmente de um promotor induzidopor patógeno. Tais promotores incluem aqueles de proteínasrelacionadas a patogêneses (PR proteínas) , as quais sãoinduzidas em seguida de infecção por um patógeno; e.g.,proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanase, quitinase,etc. Ver, por exemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. J.Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell4:645-656; e Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116.Ver também WO 99/43819, aqui incorporados por referência.

De interesse, são promotores que são expressadoslocalmente no próprio local ou próximo do local da infecçãodo patógeno. Ver, por exemplo, Marineau et al. (1987)Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton et al. (1989) MolecularPlant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch et al.(1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:2427-2430; Somsisch etal. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; e Yang (1996) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 93:14972-14977. Ver também, Chen etal. (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang et al. (1994) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993)Plant J. 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell1:961-968; U.S. Patent No. 5.750.386 (induzido pornematódeo); e as referências aí citadas. De particularinteresse é o promotor induzido para o gene PRms de milho,cuja expressão é induzida pelo patógeno Fusariummoniliforme (ver, por exemplo, Cordero et al. (1992)Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200).

Adicionalmente, como patógenos encontram uma entradaem plantas através de ferimentos ou dano causado porinsetos, um promotor induzido por ferimento pode ser usadonas construções da invenção. Tais promotores induzidos porferimento incluem o gene inibidor de proteinase de batata(pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duanet al. (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wunl ewun2, U.S. Patent No. 5.428.148; winl e win2 (Stanford etal. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); systemin (McGurlet al. (1992) Science 225:1570-1573); WIPl (Rohmeier et al.(1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp et al. (1993)FEBS Letters 323:73-76); gene MPI (Corderok et al. (1994)Plant J. 6(2):141-150); e similares, aqui incorporados porreferência.

Promotores regulados quimicamente podem ser usadospara modular a expressão de um gene em uma planta atravésda aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendodo objetivo, o promotor pode ser um promotor induzidoquimicamente, onde a aplicação de químicos induz aexpressão gênica, ou um promotor reprimido quimicamente,onde a aplicação de químicos reprime a expressão gênica.Promotores induzidos quimicamente são conhecidos na arte eincluem, mas não se limitam a, o promotor In2-2 de milho,que é ativado por defensores herbicidas benzenosulfonamida,o promotor GST de milho, que é ativado por compostoshidrofóbicos eletrofílicos que são usados como herbicidaspré-emergentes, e o promotor PR-Ia de tabaco, que é ativadopor ácido salicílico. Outros promotores reguladosquimicamente de interesse incluem promotores de resposta aesteróides (ver, por exemplo, o promotor induzido porglucocorticóide em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad.Sei. USA 88:10421-10425 e McNellis et al. (1998) Plant J.14(2):247-257) e promotores induzidos por tetraciclina ereprimidos por tetraciclina (ver, por exemplo, Gatz et al.(1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, e U.S. Patent Nos.5.814.618 e 5.789.156), aqui incorporados por referência.

Promotores tecido-preferenciais podem ser utilizadospara direcionar a expressão intensificada de protoxina deinseto modificada em um tecido vegetal em particular.Promotores tecido-preferenciais incluem Yamamoto et al.(1997) Plant J. 12 (2) :255-265; Kawamata et al. (1997) PlantCell Physiol. 38 (7) :792-803; Hansen et al. (1997) Mol. GenGenet. 254 (3) : 337-343; Russell et al. (1997) TransgenicRes. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol.112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol.112 (2) :525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol.112 (2) :513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol.35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ.20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol.23(6) : 1129-1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad.Sei. USA 90(20):9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993)Plant J. 4(3):495-505. Tais promotores podem sermodificados, se necessário, para fraca expressão.

Promotores preferenciais de folhas são conhecidos naarte. Ver, por exemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J.12 (2) :255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5) :773-778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al.(1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; e Matsuoka et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90(20) :9586-9590.Em avanços em particular, protoxinas de ^insetomodificadas ou toxinas de inseto modificadas sãoseletivamente expressadas em raízes vegetais, onde danorelacionado a insetos é provável de ocorrer. Promotorespreferenciais de raiz são conhecidos e podem serselecionados a partir de vários disponíveis na literaturaou isolados novamente de várias espécies compatíveis. Ver,por exemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gene glutamina sintetase de soja específico de raiz);Keller and Baumgartner (1991) Plant Cell 3 (10):1051-1061(elemento de controle específico de raiz no gene GRP 1.8 defeijão francês); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol.14(3):433-443 (promotor específico de raiz do gene demanopina sintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); eMiao et al. (1991) Plant Cell 3(1): 11-22 (clone de DNAc decomprimento total codificando glutamina sintetase decitosol (GS) , que é expressada em raízes e nódulos de raizde soja). Ver também Bogusz et al. (1990) Plant Cell2(7):633-641, onde são descritos dois promotoresespecíficos de raiz isolados de genes de hemoglobina daplanta fixadora de nitrogênio não leguminosa Parasponiaandersonii e a não leguminosa não fixadora de nitrogêniorelacionada Trema tomentosa. Os promotores desses genesforam ligados a um gene repórter de β-glucuronidase eintroduzidos em ambas plantas não leguminosas Nicotianatabacum e leguminosa Lotus corniculatus, e, em ambasinstâncias, a atividade promotora específica de raiz foipreservada. Leach and Aoyagi (1991) descrevem sua análisedos promotores de genes indutores de raiz rolC e rolDaltamente expressados de Agrobacterium rhizogenes (verPlant Science (Limerick) 79(1):69-76). Eles concluem quedeterminantes de DNA intensificadores e tecido-preferenciais são dissociados naqueles promotores. Teeriet al. (1989) usaram fusão gênica a IacZ para mostrar que ogene de T-DNA de Agrobacterium codificando octopina sintaseé especialmente ativo na epiderme da ponta de raiz, e que ogene TR2' é especifico de raiz na planta intacta eestimulado por ferimento no tecido foliar, uma combinaçãoespecialmente desejável de características para uso em umgene inseticida ou larvicida (ver EMBO J. 8(2) :34 3-350) . Ogene TRl', fusionado a nptll (neomicina fosfotransferaseII) apresentou características similares. Promotorespreferenciais de raiz adicionais incluem o gene promotorVfENOD-GRP3 (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol.29(4):759-772); e promotor rolB (Capana et al. (1994) PlantMol. Biol. 25(4):681-691. Ver também U.S. Patent Nos.5.837.87 6; 5.7 50.38 6; 5.633.363; 5.4 5 9.252; 5.4 01.836;5.110.732; e 5.023.179. Outros promotores preferenciais deraiz de interesse são descritos em U.S. Patent ApplicationNo. 11/022.111, intitulada "Maize MetallothioneinPromoter," preenchida em 22 de dezembro de 2004, e U.S.Patent Application No. 11/022.449, intitulada "MaizeMetallothionein 2 Promoter and Methods of Use," preenchidaem 22 de dezembro de 2004, ambas são aqui incorporadas porreferência em sua integridade.Promotores "preferenciais de semente" incluem ambospromotores "especifico de semente" (aqueles promotoresativos durante o desenvolvimento da semente, tais comopromotores de proteínas de armazenamento de sementes) assimcomo promotores de "germinação de sementes" (aquelespromotores ativos durante a germinação da semente). VerThompson et al. (1989) BioEssays 10:108, aqui incorporadopor referência. Tais promotores preferenciais de sementeincluem, mas não se limitam a, Ciml (mensagem induzida porcitocinina); cZ19Bl (zeina de 19 kDa de milho); milps (mio-inositol-l-fosfato sintase) (ver WO 00/11177 e U.S. PatentNo. 6.225.529; aqui incorporada por referência). Gama-zeina é um promotor específico de endosperma. Globulina 1(Glb-I) é um promotor específico de embrião representativo.Para dicotiledôneas, promotores específicos de sementeincluem, mas não se limitam a, β-faseolina de feijão,napina, β-conglicinina, lectina de soja, cruciferina, esimilares. Para monocotiledôneas, promotores específicosde semente incluem, mas não se limitam a, zeina de 15 kDade milho, zeina de 22 kDa, zeina de 27 kDa, gama-zeina,waxy, shrunken 1, shrunken 2, Globulina 1, etc. Ver tambémWO 00/12733, onde promotores preferenciais de semente dosgenes endl end2 são descritos; aqui incorporada por referência.

Onde um baixo nível de expressão é desejado,promotores fracos serão usados. Geralmente, por "promotorfraco" pretende-se um promotor que dirige a expressão deuma seqüência codificadora em um nível baixo. Por nívelbaixo pretende-se em níveis de cerca de 1/1000 transcritosa cerca de 1/100.000 transcritos a cerca de 1/500.000transcritos. Alternativamente, é reconhecido quepromotores fracos também englobam promotores que sãoexpressado em apenas poucas células, e não em outras, paradar um baixo nível de expressão total. Onde um promotor éexpressado em níveis altos inaceitáveis, porções daseqüência promotora podem ser selecionadas ou modificadaspara diminuir os níveis de expressão.

Tais promotores constitutivos fracos incluem, porexemplo, o promotor núcleo de Rsyn7 (WO 99/43838 e U.S.Patent No. 6.072.050), o promotor núcleo de 35S CaMV, esimilares. Outors promotores constitutivos incluem, porexemplo, U.S. Patent Nos. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121;5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; e 5.608.142.Ver também, U.S. Patent No. 6.177.611, aqui incorporada porreferência.

Os métodos da invenção envolvem introduzir umpolipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta."Introduzir" deve significar apresentar à plante opolinucleotídeo ou polipeptídeo de tal maneira que aseqüência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta.Os métodos da invenção não dependem de um método emparticular para introduzir uma seqüência em uma planta,somente para que o polinucleotídeo ou polipeptídeos ganhemacesso ao interior de pelo menos uma célula da planta.Métodos para introduzir polinucleotídeo ou polipeptídeos emplantas são conhecidos na arte incluindo, mas não limitadoa, métodos de transformação estável, métodos detransformação transiente, e métodos mediados por virus.

"Transformação estável" deve significar que oconstruto de nucleotideo introduzido em uma planta seintegra no genoma da planta e é capaz de ser herdado pelaprogênie dessa. "Transformação transiente" deve significarque um polinucleotideo é introduzido na planta não seintegra no genoma da planta ou um polipeptideo éintroduzido em uma planta.

Protocolos de transformação, assim como protocolospara introduzir polipeptideos ou seqüências depolinucleotideos em plantas podem variar dependendo do tipode planta ou célula vegetal, i.e., monocotiledônea oudicotiledônea, visadas para transformação. Métodosadequados de introduzir polipeptideos e polinucleotideos emcélulas vegetais incluem micro-injeção (Crossway et al.(1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs etal. (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606,transformação mediada por Agrobacterium (U.S. Patent No.5.563.055 e U.S. Patent No. 5.981.840), transferência degene direta (Paszkowski et al. (1984) EMBO J.3:2717-2722), e aceleração balística de partícula (ver, porexemplo, U.S. Patent Nos. 4.945.050; 5.879.918;5.886.244; 5.932.782; Tomes et al. (1995) in Plant CellfTissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed.Gamborg and Phillips (Springer-Verlag, Berlin); e McCabe etal. (1988) Biotechnology 6:923-926); e transformação Lecl(WO 00/28058) . Ver, também, Weissinger et al. (1988) An η.Rev. Genet. 22:421-477; Sanford et al. (1987) ParticulateScience and Technology 5:27-37 (cebola); Christou et al.(1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe et al.(1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer and McMullen(1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singhet al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96:319-324 (soja); Dattaet al. (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein et al.(1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4305-4309 (milho);Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); U.S.Patent Nos. 5.240.855; 5.322.783; e, 5.324.646; Klein etal. (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (milho); Fromm et al.(1990) Biotechnology 8:833-839 (milho); Hooykaas-VanSlogteren et al. (1984) Nature (London) 311:763-764; U.S.Patent No. 5.736.369 (cereais); Bytebier et al. (1987)Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wetet al. (1985) in The Experimental Manipulation of OvuleTissues, ed. Chapman et al. (Longman, New York), pp. 197-209 (pólen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports9:415-418 e Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet.84:560-566 (transformação mediada por fios de carboneto desilício); D1Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505(eletroporação); Li et al. (1993) Plant Cell Reports12:250-255 e Christou and Ford (1995) Annals of Botany75:407-413 (arroz); Osjoda et al. (1996) NatureBiotechnology 14:745-750 (milho via Agrobacteriumtumefaciens); todas as quais são aqui incorporadas porreferência.Em avanços específicos, a seqüências de protoxina deinseto ou toxina de inseto da invenção podem ser providaspara uma planta usando uma variedade de métodos detransformação transiente. Tais métodos de transformaçãotransiente incluem, mas não se limitam a, a introdução daproteína protoxina de inseto ou toxina de inseto, ouvariantes e fragmentos dessa, diretamente na planta ou aintrodução de um transcrito de proteína na planta. Taismétodos incluem, por exemplo, micro-injeção oubombardeamento de partículas. Ver, por exemplo, Crosswayet al. (1986) Mol Gen. Genet. 202:179-185; Nomura et al.(1986) Plant Sei. 44:53-58; Hepler et al. (1994) Proc.Natl. Acad. Sei. USA 91:2176-2180 e Hush et al. (1994) J.Cell Science 107:775-784, todas as quais são aquiincorporadas por referência. Alternativamente, a protoxinade inseto ou toxina de inseto polinucleotídeo pode sertransientemente transformada na planta usando técnicasconhecidas na arte. Tais técnicas incluem sistema de vetorviral e a precipitação do polinucleotídeo em uma maneiraque impeça a subseqüente liberação do DNA. Assim, atranscrição a partir do DNA ligado a partículas podeocorrer, mas a freqüência com a qual é liberado paratornar-se integrado ao genoma é bastante reduzida. Taismétodos incluem o uso de partículas encapadas compolietilimina (PEI; Sigma #P3143).

Em outros avanços, o polinucleotídeo da invenção podeser introduzido em plantas promovendo o contato de plantascom um virus ou ácidos nucléicos virais. Geralmente, taismétodos envolvem incorporar um construto de nucleotideos dainvenção com um DNA viral o molécula de RNA. É reconhecidoque a protoxina de inseto modificada ou toxina de insetomodificada da invenção pode ser inicialmente sintetizadacomo parte de um poliproteina viral, a qual, mais tarde,pode ser processada por proteólise in vivo ou in vitro paraproduzir a proteína recombinante desejada. Ainda, éreconhecido que promotores da invenção também englobampromotores utilizados para transcrição por RNA polimerasesvirais. Métodos para introduzir polinucleotídeos emplantas e expressar a proteína aí codificada, envolvendoDNA viral ou moléculas de RNA, são conhecidos na arte.Ver, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5.889.191, 5.889.190,5.866.785, 5.589.367, 5.316.931, e Porta et al. (1996)Molecular Biotechnology 5:209-221; aqui incorporados porreferência.

Métodos são conhecidos na arte para a inserçãodirecionada de um polinucleotídeo em uma localizaçãoespecífica no genoma vegetal. Em um avanço, a inserção dopolinucleotídeo em uma localidade genômica desejada éconseguida usando um sistema de recombinação sítio-específico. Ver, por exemplo, W099/25821, W099/25854,W099/2 5840, W099/25855, e W099/25853, todas as quais sãoaqui incorporadas por referência. Resumidamente, opolinucleotídeo da invenção pode estar contido em umcassete de transferência por dois sítios de recombinaçãonão recombinogênicos. O cassete de transferência éintroduzido em uma planta tendo incorporado, estavelmenteem seu genoma, um sitio alvo que é flanqueado por doissítios de recombinação não recombinogênicos quecorrespondem aos sítios do cassete de transferência. Umarecombinase apropriada é provida e o cassete detransferência é integrado no sítio alvo. 0 polinucleotídeode interesse é, dessa forma, integrado em uma posiçãocromossômica específica no genoma vegetal.

As células que foram transformadas podem sercultivadas em plantas de acordo com meios convencionais.Ver, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant CellReports 5:81-84. Essas plantas podem, então, sercultivadas e tanto polinizadas com a mesma linhagemtransformada ou linhagens diferentes, e a progênieresultante tendo expressão constitutiva da característicafenotípica desejada identificada. Duas ou mais geraçõespodem ser cultivadas para assegurar que a expressão dacaracterística fenotípica desejada seja estavelmentemantida e, então, sementes colhidas para assegurar que aexpressão da característica fenotípica desejada foialcançada. Dessa maneira, a presente invenção provêsementes transformadas (também referidas como "sementestransgênicas") tendo um polinucleotídeo da invenção, porexemplo, um cassete de expressão da invenção, estavelmenteincorporado em seu genoma.

Em certos avanços, os polinucleotídeos da presenteinvenção podem ser arranjados com qualquer combinação deseqüências de polinucleotideos de interesse para criarplantas com um traço desejado. Um traço, como aqui usado,refere-se ao fenótipo derivado de uma seqüência emparticular ou grupos de seqüências. Por exemplo, ospolinucleotideos da presente invenção podem ser arranjadoscom quaisquer outros polinucleotideos codificandopolipeptideos tendo atividade pesticida e/ou insecticida,tais como outras proteínas tóxicas de Bacillusthuringiensis (descrito em U.S. Patent Nos. 5.366.892;5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser et al.(1986) Gene 48:109), lectinas (Van Damme et al. (1994)Plant Mol. Biol. 24:825, pentina (descrito em U.S. PatentNo. 5.981.722), e similares. As combinações geradas podemincluir, também, cópias múltiplas de qualquer um dospolinucleotideos de interesse. Os polinucleotideos dapresente invenção podem ser também arranjados com qualqueroutro gene ou combinação de genes para produzir plantas comuma variedade de combinações de traços desejados incluindo,mas não limitado a, traços desejáveis para alimentaçãoanimal, tais como genes de alta produção de óleos (e.g.,U.S. Patent No. 6.232.529); aminoácidos balanceados (e.g.,hordotioninas (U.S. Patent Nos. 5.990.389; 5.885.801;5.885.802; e 5.703.409); cevada com muita lisina(Williamson et al. (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; e WO98/20122) e proteínas com muita metionina (Pedersen et al.(1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al. (1988) Gene71:359; e Musumura et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123));digestibilidade aumentada (e.g., proteínas de armazenamentomodificadas (U.S. Application Serial No. 10/053,410,preenchida em 7 de novembro de 2001); e tioredoxinas (U.S.Application Serial No. 10/005,429, preenchida em 3 dedezembro de 2001)); as revelações das quais são aquiincorporadas por referência.

Os polinucleotideos da presente invenção podem sertambém arranjados com traços desejáveis para resistência adoenças ou herbicidas (e.g., genes de desintoxicação porfumonisina (U.S. Patent No. 5.792.931); genes deavirulência e resistência a doenças (Jones et al. (1994)Science 266:789; Martin et al. (1993) Science 262:1432;Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); mutantes deacetolactato sintase (ALS) que levam a resistência aherbicidas, tais como as mutações S4 e/ou Hra; inibidoresde glutamina sintase, tais como fosfinotricina ou basta(e.g., gene bar); e resistência a glifosato (gene EPSPS));e traços desejáveis para processar produtos, tais como altaconcentração de óleo (e.g., U.S. Patent No. 6.232.529);óleos modificados (e.g., genes de dessaturação de ácidosgraxos (U.S. Patent No. 5.952.544; WO 94/11516)); amidosmodificados (e.g., ADPG pirofosforilases (AGPase), sintasesde amido (SS), enzimas de ramificação amido (SBE), eenzimas de quebra de ramificação amido (SDBE)); e polímerosou bioplásticos (e.g., U.S. Patent No. 5.602.321; beta-quetotiolase, polihidroxibutirato sintase, e acetoacetil-CoA redutase (Schubert et al. (1988) J. Bacteriol.170:5837-5847) facilitar a expressão depolihidroxialcanoatos(PHAs)); as revelações das quais sãoaqui incorporadas por referência. Poderia-se combinar,também, os polinucleotideos da presente invenção compolinucleotídeos provendo traços agronômicos, tais comoesterilidade de machos (e.g., ver U.S. Patent No.5.583.210), força de espiga, tempo de florada, ou traços detecnologia de transformação, tais como regulação de ciclocelular ou direcionamento de gene (e.g., WO 99/61619, WO00/17364, e WO 99/25821); as revelações das quais são aquiincorporadas por referência.

Essas combinações arranjadas podem ser criadas porquaisquer métodos incluindo, mas não limitado a, reproduçãocruzada de plantas por qualquer metodologia convencional oupor TopCross, ou transformação genética. Se as seqüênciassão arranjadas transformado-se geneticamente as plantas, asseqüências de polinucleotideos de interesse podem sercombinadas em qualquer tempo e qualquer ordem. Porexemplo, uma planta transgênica compreendendo um ou maistraços desejados pode ser usada como o alvo para introduzirtraços adicionais por transformação subseqüente. Os traçospodem ser introduzidos simultaneamente em um protocolo deco-transformação com os polinucleotideos de interesseprovidos por qualquer combinação de cassetes detransformação. Por exemplo, se duas seqüências serãointroduzidas, as duas seqüências podem estar contidas emcassetes de transformação separados (trans) ou contidas nomesmo cassete de transformação (eis). A expressão dasseqüências pode ser dirigida pelo mesmo promoter ou porpromotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejávelintroduzir um cassete de transformação que suprimirá aexpressão do polinucleotídeo de interesse. Isso pode sercombinado com qualquer combinação de outros cassettes desupressão, ou cassetes de sobre-expressão, para gerar acombinação desejada de traços na planta. É aindareconhecido que seqüências de polinucleotideos podem serarranjadas em uma localidade genômica desejada usando umsistema de recombinação sitio-especifico. Ver, porexemplo, W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855, eW099/25853, todas as quais são aqui incorporadas porreferência.

O cruzamento Pedigree inicia com o cruzamento de doisgenótipos, tal como uma linha de elite de interesse e umaoutra linha de elite inter-cruzada tendo uma ou maiscaracterísticas desejáveis (i.e., tendo incorporadoestavelmente um polinucleotídeo da invenção, tendoatividade modulada e/ou nível do polipeptídeo da invenção,etc) que complementa a linha de elite de interesse. Se osdois pais originais não provêm todas as característicasdesejadas, outras fontes podem ser incluídas na populaçãoem cruzamento. Nos métodos de pedigree, plantas superioressão cortadas e selecionadas em gerações filhas sucessivas.Nas gerações filhas que se sucedem, a condição heterozigotadá caminho a linhas homogêneas como um resultado de autopolinização e seleção. Tipicamente nos métodos pedigree decruzamento, cinco ou mais gerações filhas sucessivas deauto-polinização e seleção é praticadas: Fl -» F2; F2—» F3;F3 —> F4; F4 —> F5; etc. Após uma quantidade suficiente deintercruzamentos, gerações filhas sucessivas servirão paraaumentar as sementes do intercruzado desenvolvido. Emavanços específicos, a linha intercruzada compreende aleloshomozigotos a cerca de 95% ou mais de seus Ioci.

Além de ser usado para criar uma conversão reversa,cruzamento reverso pode ser usado, também, em combinaçãocom cruzamento pedigree para modificar uma linha de elitede interesse e um híbrido que é feito usando a linha deelite modificada. Como discutido previamente, cruzamentoreverso pode ser usado para transferir um ou mais traçosdesejáveis de uma linha, o pai doador, a um intercruzadochamado pai recorrente, que possui boas característicasagronômicas gerais, mas não possui o traço ou traçosdesejáveis. Contudo, o mesmo procedimento pode ser usadopara mover a progênie em direção ao genótipo do pairecorrente, mas, ao mesmo tempo, retém vários componentesdo pai não recorrente parando o cruzamento reverso em umestágio inicial e prosseguindo com auto-polinização eseleção. Por exemplo, um Fl, tal como um híbridocomercial, é criado. Esse híbrido comercial pode sercruzado de volta para uma de suas linhas parentais paracriar um BCl ou BC2. Os descendentes são auto-polinizadose selecionados de forma que o intercruzado recémdesenvolvido possua vários dos atributos do pai recorrentee, ainda, vários dos atributos desejados do pai nãorecorrente. Essa abordagem alavanca o valor e força do pairecorrente para uso em novos híbridos e cruzamentos.Portanto, uma avanço desta invenção é um método defazer uma conversão reversa de linha intercruzada de milhode interesse, compreendendo as etapas de cruzar uma plantade linha intercruzada de milho de interesse com uma plantadoadora compreendendo um gene mutante ou transgeneconferindo um traço desejado (i.e., a expressão de umaprotoxina de inseto modificada ou toxina de insetomodificada), selecionar uma planta de progênie Flcompreendendo o gene mutante ou transgene conferindo otraço desejado, e cruzar de volta a planta de progênie Flselecionada à planta de linha intercruzada de milho deinteresse. Esse método pode compreender, ainda, a etapa deobter um perfil de marcador molecular de linha de milhointercruzada de interesse e usar o perfil de marcadormolecular para selecionar uma planta descendente com otraço desejado e o perfil de marcador molecular da linhaintercruzada de interesse. Da mesma maneira, esse métodopode ser usado para produzir uma semente de híbrido Fl,adicionando uma etapa final de cruzar a conversão do traçodesejado de linha de milho intercruzada de interesse comuma planta de milho diferente para fazer sementes de milhohíbrido Fl compreendendo um gene mutante ou transgeneconferindo o traço desejado.

Seleção recorrente é um método usado em um programa decruzamento de plantas para melhorar uma população deplantas. O método acarreta necessariamente em cruzamentode plantas individuais polinizando uma a outra para formara progênie. Os descendentes são cultivados e a progêniesuperior selecionada por qualquer número de métodos deseleção, os quais incluem plantas individuais, progênie demeio parentesco, progênie de parentesco completo, progênieauto-polinizada e topcrossing. Os descendentesselecionados são para cruzar por polinização, um com ooutro, para formar a progênie de outra população. Essapopulação é plantada e, novamente, e plantas superiores sãoselecionadas para cruzar por polinização uma com a outra.A seleção recorrente é um processo cíclico e, portanto,pode ser repetido quantas vezes como desejado. 0 objetivode seleção recorrente é melhorar os traços de umapopulação. A população melhorada pode ser, então, usadacomo uma fonte material de cruzamento para obter linhasintercruzadas para serem usadas em híbridos ou usadas comopais para um cultivar sintético. Um cultivar sintético é aprogênie resultante formada pelo intercruzamento dediversos intercruzados selecionados.

Seleção em massa é uma técnica útil quando usada emconjunto com seleção intensificada de marcador molecular.Na seleção em massa, sementes de indivíduos sãoselecionadas baseadas no fenótipo e/ou genótipo. Essassementes selecionadas são, então, avolumadas e usadas paracultivar a próxima geração. Seleção por volume requercultivar uma população de plantas em um lote de volume,permitindo que as plantas se auto-polinizem, colhendo asemente a granel e, então, usando uma amostra das sementescolhidas a granel para plantar a próxima geração. Ao invésde auto-polinização, polinização direcionada poderia serusada como parte do programa de melhoramento.

Melhoramento por mutação é um de vários métodos quepoderiam ser usados para introduzir novos traços em umalinha de elite. Mutações que ocorrem espontaneamente ousão artificialmente induzidas podem ser fontes úteis devariabilidade para um melhorista vegetal. A meta demutagênese artificial é aumentar a taxa de mutação para umacaracterística desejada. Taxas de mutação podem seraumentadas por vários meios diferentes incluindotemperatura, armazenamento de semente por longo período,condições de cultura de tecidos, radiação; tal como raios-X, raios Gama (e.g., cobalto 60 ou césio 137), neutrôns,(produto de fissão nuclear por urânio 235 em um reatoratômico), radiação Beta (emitida de radioisótopos, taiscomo fósforo 32 ou carbono 14), ou radiação ultravioleta(preferncialmente de 2500 a 2900 nm) , ou químicosmutagênicos (tais como análogos base (5-bromo-uracil),composotos relacionados (8-etoxi cafeína), antibióticos(estreptonigrina) , agentes alquilantes (mostardassulfurosas, mostardas nitrogenosas, epóxidos, etilenaminas,sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida,hidroxilamina, ácido nitroso, ou acridinas. Uma vez umtraço desejado é observado através de mutagênese, o traçopode ser, então, incorporado em germplasma existente portécnicas tradicionais de cruzamento, tais como cruzamentoreverso. Detalhes de melhoramento por mutação podem serencontrados em Fehr (1993) Principais of CultivarDevelopment (Macmillan Publishing Company) cuja revelação éaqui incorporada por referência. Além disso, mutaçõescriadas em outras linhas podem ser usadas para produzir umaconversão reversa de linhas de elite que compreende taismutações.

Como aqui usado, o termo planta inclui célulasvegetais, protoplastos vegetais, culturas de tecidos decélulas vegetais das quais plantas podem ser regeneradas,calos vegetais, moitas, e células vegetais que estãointactas em plantas ou partes de plantas, tais comoembriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, galhos,frutos, grãos, espigas, sabugos, cascas, caules, raízes,pontas de raízes, anteras, e similares. Grão devesignificar a semente madura produzida por cultivadorescomerciais para outros propósitos que não cultivar oureproduzir a espécie. Progênie, variantes, e mutantes dasplantas regeneradas estão também incluídas no escopo dainvenção, visto que essas partes compreendem ospolinucleotídeos introduzidos.

A invenção também engloba plantas transformadas outransgênicas compreendendo pelo menos uma seqüência denucleotídeos da invenção. Otimamente, a planta éestavelmente transformada com um construto de nucleotídeoscompreendendo pelo menos uma seqüência de nucleotídeos dainvenção operacionalmente ligada a um promotor que dirige aexpressão em uma célula vegetal. Como aqui usado, ostermos "planta transformada" e "planta transgênica"referem-se a uma planta que compreende, em seu genoma, umpolinucleotideo heterólogo. Geralmente, o polinucleotideoheterólogo está estavelmente integrado no genoma de umaplanta transgênica ou transformada, de forma que opolinucleotideo é passado para sucessivas gerações. 0polinucleotideo heterólogo pode estar integrado no genomasozinho ou como parte de um cassete de expressãorecombinante.

É para ser entendido que, como aqui usado, o termo"transgênico" inclui qualquer célula, linha de células,calos, tecido, parte de planta, ou planta, cujo genótipofoi alterado pela presença de ácido nucléico heterólogoincluindo aqueles transgênicos inicialmente alterados dessaforma, assim como aqueles criados por cruzamentos sexuadosou propagação assexuada a partir do transgênico inicial. Otermo "transgênico", como aqui usado, não engloba aalteração do genoma (cromossômico ou extra-cromossômico)por métodos convencionais de cruzamento de plantas ou poreventos naturalmente ocorrentes, tais como fertilizaçãocruzada aleatória, infecção viral não recombinante,transformação bacteriana não recombinante, transposição nãorecombinante, ou mutação espontânea.

A presente invenção pode ser usada para transformação eproteção de qualquer espécie de planta, incluindo, mas nãolimitado a, monocotiledôneas e dicotiledôneas. Exemplos deespécies de planta de interesse incluem, mas não se limitama, milho {Zea mays), Brassica sp. (e.g., B. napus, B. rapa,Β. juncea), particularmente aquelas espécies de Brassicaúteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicagosativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale),sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milhete (e.g.,milheto (Pennisetum glaucum), painço (Panicum miliaceum),painço português (Setaria italica), capim (Eleusinecoracana)), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamustinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max) ,tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum),amendoins (Araehis hypogaea) , algodão (Gossypium barbadense,Gossypium hirsutum), batata doce (Ipomoea batatus) , mandioca(Manihot eseulenta), café (Cofea spp.), coco (Cocosnueifera), abacaxi (Ananas eomosus), árvores citricas(Citrus spp.), cacau (Theobroma eaeao), chá (Camelliasinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana),figo (Fieus easiea), goiaba (Psidium guajava), manga(Mangifera indica), azeitona (Olea europaea), mamão-papaia(Carica papaya), caju (Anacardium occidentale) , macadâmia(Macadamia integrifolia) , amêndoa (Prunus amygdalus),beterraba (Beta vulgaris), cana-de-açúcar (Saeeharum spp.),aveia, cevada, verduras, ornamentais, e coniferas.

Verduras incluem tomates (Lyeopersieon eseulentum),alface (e.g., Laetuea sativa), feijões (Phaseolus vulgarise Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus spp.), e membrosdo gênero Cueumis, tais como pepino (C. sativus) , cantalupo(C. eantalupensis), e melão (C. melo). Ornamentais incluemazaléia (Rhododendron spp.), hortênsia (Maerophyllahydrangea), hibisco (Hibiseus rosasanensis) , rosas (Rosaspp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.),petúnias (Petunia hybrida), cravo (Dianthus caryophyllus) ,bico-de-papagaio (Euphorbia pulcherrima), e crisântemo.

Coniferas que podem ser empregadas na prática dosavanços incluem, por exemplo, pinheiros tais como pinheiroda variedade loblolly (Pinus taeda), pinheiro slash (Pinuselliotii), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheirolodgepole (Pinus contorta), e pinheiro de Monterey (Pinusradiata); Pseudotsuga (Pseudotsuga menziesii); cicuta dooeste (Tsuga canadensis); espruce Sitka (Picea glauca);sequóia (Sequoia sempervirens); abetos verdadeiros, taiscomo abeto prateado (Abies amabilis) e balsamo (Abiesbalsamea); e cedros, tais como cedro vermelho (Thujaplicata) e cedro-amarelo do Alasca (Chamaecyparisnootkatensis) . Em avanços específicos, plants da presenteinvenção são plantas de cultivo (por exemplo, milho,alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo,amendoim, sorgo, trigo, milhete, tabaco, etc.) . Em outrosavanços, plantas de milho e soja são ótimas, e ainda emoutros avanços plantas de milho são ótimas.

Outras plantas de interesse incluem plantas de grãosque provêm sementes de interesse, plnatas de sementesoleaginosas, e plantas leguminosas. Sementes de interesseincluem grãos, tais como milho, trigo, cevada, arroz,sorgo, centeio, etc. Plantas de sementes oleaginosasincluem algodão, soja, cártamo, girassol, Brassica, milho,alfafa, palmeiras, coco, etc. Plantas leguminosas incluemfeijões e ervilhas. Feijões incluem guar, alfarrobeira,feno grego, soja, feijões de jardim, caupi, feijão mungo,feijão manteiga, fava, lentilhas, grão-de-bico, etc.

São ainda providas composições compreendendo umaprotoxina de inseto isolada ou uma toxina de inseto isoladaque possua pelo menos um sitio de ativação proteolitica quefoi construído para compreender um sítio de clivagem que ésensível a uma protease de trato digestivo de inseto. Napresente invenção, uma proteína isolada de protoxina deinseto modificada ou de toxina de inseto modificada podeser formulada com um carregador aceitável em uma composiçãode protoxina ou toxina ou formulação que é, por exemplo,uma suspensão, uma solução, uma emulsão, um pó depulverizar, um grânulo dispersável, um pó molhável, e umconcentrado emulsificável, um aerosol, um grânuloimpregnado, um adjuvante, uma pasta encapável, e tambémencapsulações em, por exemplo, substâncias polímeras.

Tais composições descritas acima podem ser obtidaspela adição de um agente ativo em superfície, um carregadorinerte, um preservativo, um umectante, um estimulante dealimentação, um atrator, um agente encapsulador, umligante, um emulsificador, uma tintura, um protetor de UV,um tampão, um agente de fluxo ou fertilizantes, doadores demicronutrientes, ou outras preparações que influenciam ocrescimento vegetal. Um ou mais agroquímicos incluindo,mas não limitado a, herbicidas, inseticidas, fungicidas,bactericidas, nematicidas, moluscicidas, acaricidas,reguladores de crescimento vegetal, auxílios de colheita, efertilizantes, podem ser combinados com carregadores,surfactantes ou adjuvantes costumeiramente empregados naarte de formulação ou outros componentes para facilitar omanuseio do produto e aplicação para pestes alvo emparticular. Carregadores e adjuvantes adequados podem sersólidos líquidos e correspondem às substânciasordinariamente empregadas em tecnologia de formulação,e.g., substâncias naturais ou minerais regeneradas,solventes, dispersantes, agentes umidificadores, adesivos,ligantes, ou fertilizantes. Os ingredientes ativos dapresente invenção são normalmente aplicados na forma decomposições e podem ser aplicados à área de cultivo,planta, ou semente a ser tratada. Por exemplo, ascomposições da presente invenção podem ser aplicadas agrãos em preparação para ou durante armazenamento em umdepósito de grãos ou silo, etc. As composições da presenteinvenção podem ser aplicadas simultaneamente ou em sucessãocom outros compostos. Métodos de aplicar um ingredienteativo da presente invenção, ou composição agroquímica dapresente invenção que contenha pelo menos uma proteínamodificada de protoxina ou toxina da presente invenção,incluem, mas não se limitam a, aplicação foliar, coberturade sementes, aplicação de solo. 0 número de aplicações e ataxa de aplicação dependem da intensidade de infestaçãopela peste correspondente.

Agentes ativos em superfície adequados incluem, masnão se limitam a, compostos aniônicos, tais como umcarboxilato de, por exemplo, um metal; carboxilato de umácido graxo de cadeia longa; um N-acilsarcosinato; mono oudi-ésteres de ácido fosfórico com álcoois graxos etoxiladosou sais de tais ésteres; sulfatos de álcool graxo, taiscomo dodecil sulfato de sódio, acetil sulfato de sódio oucetil sulfato de sódio; sulfatos de álcool graxo etolixado;sulfatos de alquilfenol etoxilado; sulfonatos de lignina;sulfonatos petróleo; alquil aril sulfonatos, tais comosulfonatos de alquil-benzeno ou sulfonatos dealquilnaftaleno menores, e.g., butil-naftaleno sulfonato;sais de condensados naftaleno-formaldeido sulfonado; saisde condensados de fenol-formaldeido sulfonado; sulfonatosmais complexos, tais como, sulfonatos de amida, e.g., oproduto de condensação sulfonado de ácido oléico e N-metiltaurina; ou os dialquil sulfosuccinatos, e.g., o sulfonatode sódio ou dioctil succinato. Agentes não iônicos incluemprodutos de condensação de ésteres de ácidos graxos,álcoois graxos, amidas de ácido graxo ou alquil- oualquenil- fenóis graxos substituídos com óxido de etileno,ésteres graxos de álcool éter polihídrico, e.g., ésteres deácido graxo sorbitan, produtos de condensação de taisésteres com óxido de etileno, e.g., ésteres de ácido graxopolioxietileno sorbitar, co-polímeros de bloqueio de óxidode etileno e óxido de propileno, glicóis acetilênicos, taiscomo 2,4,7,9-tetraetil-5-decin-4,7-diol, ou glicóisacetilênicos etoxilados. Exemplos de um agente catiônicoativo em superfície incluem, por exemplo, um alifáticomono-, di-, ou poliamina, tais como um acetato, naftenatoou oleato; ou amina contedo oxigênio, tal como um óxido deamina de polioxietileno alquilamina; uma amina ligada aamida preparada pela condensação de um ácido carboxilicocom uma di- ou poliamina; ou um sal de amônio quaternário.

Exemplos de materiais inertes incluem mas não selimitam a minerais inorgânicos, tais como caulim,filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, oumateriais botânicos, tais como cortiça, espigas de milhopulverizadas, cascas de amendoim, cascas de arroz, e cascasde noz.

As composições da presente invenção podem estar em umaforma adequada para aplicação direta ou como um concentradode composição primária que requer diluição com umaquantidade de água adequada ou outro diluente antes daaplicação. A concentração de protoxina de insetomodificada ou toxina de inseto modificada irá variardependendo da natureza da formulação em particular,especificamente, seja um concentrado ou para ser usadadiretamente. A composição contém de 1 a 98% de umcarregador inerte sólido ou liquido, e de 0 a 50%,preferencialmente de 0,1 a 50% de um surfactante. Essascomposições serão administradas na taxa rotulada para oproduto comercial, preferencialmente cerca de 0,01 lb. -5,0 Ib. por acre, quando na forma seca e a cerca de 0,01pts. - 10 pts. por acre quando na forma liquida.

Em um avanço adicional, as composições da invençãopodem ser tratadas antes da formulação para prolongar aatividade pesticida quando aplicadas ao ambiente de umapeste alvo, contanto que o pré-tratamento não sejadeletério à atividade. Tal tratamento pode ser químicoe/ou físico, contanto que o tratamento não afetedeleteriamente as propriedades da(s) composição(ões).

Exemplos de reagentes químicos incluem mas não se limitam aagentes halogenados; aldeídos, tais cmo formaldeído eglutaraldeído; anti-infecciosos, tais como cloreto dezefiran; álcoois, tais como isopropanol e etanol; efixadores histológicos, tais como fixador de Bouin efixador de Helly (ver, por exemplo, Humason (1967) AnimalTissue Techniques (W.H. Freeman and Co.).

As composições e formulações de protoxina e toxinamodificadas da invenção podem ser aplicadas ao ambiente deum inseto peste, por exemplo, borrifando-se, atomizando,empoeirando, espalhando, cobrindo ou pulverizando,introduzindo dentro ou sobre o solo, introduzindo na águade irrigação, por tratamento de sementes ou aplicação geralou empoeirando no momento em que peste tenha começado aaparecer, ou antes do aparecimento de pestes como umamedida protetora. Por exemplo, uma proteína de protoxinade inseto modificada ou de toxina de inseto modificada dainvenção pode ser misturada com grãos para proteger o grãodurante o armazenamento. É geralmente importante obter bomcontrole de pestes nos estágios iniciais do crescimentovegetal, nesse tempo em que a planta pode ser maisseveramente danificada. As composições da invenção podemconter, convenientemente, outro inseticida, caso se achenecessário. Em um avanço da invenção, a composição éaplicada diretamente no solo, no momento do plantio, naforma granular de uma composição de um carregador. Outroavanço é uma forma granular de uma composição compreendendoum agroquímico, tal como, por exemplo, um herbicida, uminseticida, um fertilizante, ou um carregador inerte.

Composições da invenção são úteis protegendo plantas,sementes, e produtos vegetais, em uma variedade de meios.Por exemplo, as composições podem ser usadas em um métodoque envolve colocar uma quantidade efetiva de umacomposição de protoxina de inseto modificada ou de toxinade inseto modificada no ambiente da peste por umprocedimento selecionado do grupo consistindo de borrifar,empoeirar, transmitir, ou cobrir sementes. Enquanto nãopretendendo estar limitado a um mecanismo em particular, emum avanço, um inseto peste ingere uma composição deprotoxina de inseto modificada, e a protoxina de inseto éentão clivada por uma protease presente no trato digestivodo inseto. A clivagem da protoxina de inseto produz umatoxina de inseto ativa no trato digestivo do inseto, o que,por isso, causa impacto no inseto peste. Em outrosavanços, uma composição de toxina de inseto modificada éaplicada ao ambiente de um inseto peste e ésubseqüentemente ingerida por um inseto peste. A toxina deinseto modificada é, então, clivada por uma protease detrato digestivo de inseto para produzir uma toxina deinseto ativa no trato digestivo de inseto que apresentaatividade pesticida melhorada relativa à toxina de insetocorrespondente que não possui o sitio de ativaçãoproteolitica construído.

Antes, o material de propagação vegetal (fruto,tubérculo, bulbo, cormo, grão, semente), mas especialmentesementes, ser vendido como um produto comercial, ele écostumeiramente tratado com uma cobertura protetoracompreendendo herbicidas, inseticidas, fungicidas,bactericidas, nematicidas, moluscicidas, ou misturas dediversas dessas preparações, se desejado, junto comcarregadores, surfactantes, ou adjuvantes promotores deaplicação adicionais costumeiramente empregados na arte deformulação para proves proteção contra danos causados porpestes bacterianas, fúngicas, ou animais. Para tratas asemente, a cobertura protetora pode ser aplicada àssementes tanto impregnando os tubérculos ou grãos com umaformulação líquida ou cobrindo-os com uma formulaçãocombinada molhada ou seca. Além disso, em casos especiais,outros métodos de aplicação a plantas são possíveis, e.g.,tratamento direcionado a botões ou ao fruto.

A semente vegetal da invenção compreendendo umamolécula de DNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeoscodificando uma proteína de protoxina modificada ou toxinamodificada da invenção pode ser tratada com uma coberturaprotetora de sementes compreendendo um composto detratamento de sementes, tal como, por exemplo, captan,carboxim, thiram, metalaxil, pirimifos-metil, e outros quesão comumente usados em tratamento de sementes. Em umavanço dentro do escopo da invenção, uma coberturaprotetora de sementes compreendendo uma composiçãopesticida da invenção é usada sozinha ou combinação com umadas uma coberturas protetoras de sementes costumeiramenteusadas em tratamento de sementes.

Os métodos e composições da presente invenção podemser efetivos contra uma variedade de pestes. Parapropósitos da presente invenção, pestes incluem, mas não selimitam a, insetos, fungos, bactérias, nematódeos, ácaros,protozoários patógenos, parasitos animais de fígado, esimilares. Pestes de particular interesse são insetospeste, particularmente insetos peste que causam danosignificativo a plantas de agricultura.

Insetos peste incluem insetos selecionado das ordensColeoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga,Homoptera, Hemiptera, Orthoptera, Thysanoptera, Dermaptera,Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc.,particularmente Coleoptera e Lepidoptera. Insetos peste dainvenção para os principais cultivos incluem: Milho:Ostrinia nubilalis, broca européia; Agrotis ipsilon, larvade besouro noctuídeo; Helicoverpa zea, larva da espiga demilho; Spodoptera frugiperda, larva de traça do outono;Diatraea grandiosella, broca do milho; Elasmopalpuslignosellus, broca do colo do milho; Diatraea saccharalis,broca do colmo; Diabrotica virgifera, larva da raiz domilho variedade western; Diabrotica longicornis barberi,larva da raiz do milho variedade northern; Diabroticaundecimpunctata howardi, larva da raiz do milho variedadesouthern; Melanotus spp., larvas de besouros elaterídeos;Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, besourosescarabeideos; Popillia japonica, besouro japonês;Chaetocnema pulicaria, pulguinha do milho; Sphenophorusmaidis, gorgulho do milho; Rhopalosiphum maidis, pulgão dafolha do milho; Anuraphis maidiradicis, pulgão da raiz domilho; Blissus leucopterus leucopterus, percevejo;Melanoplus femurrubrum, gafanhoto da pata vermelha;Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migrador; Hylemyaplatura, vareja; Agromyza parvicornis, inseto minador;Anaphothrips obscrurus, tisanóptero da grama; Solenopsismilesta, formiga ladra; Tetranychus urticae, ácaro-aranhade duas manchas; Sorgo; Chilo partellus, mariposa dosorgo; Spodoptera frugiperda, larva de traça do outono;Helicoverpa zea, larva da espiga de milho; Elasmopalpuslignosellus, broca do colo do milho; Feltia subterranea,lagartas-rosca; Phyllophaga crinita, escaravelho; Eleodes,Conoderus, e Aeolus spp., larvas de besouros noctuídeos;Oulema melanopus, larva-lesma da cevada; Chaetocnemapulicaria, pulguinha do milho; Sphenophorus maidis,gorgulho do milho; Rhopalosiphum maidis; pulgão da folha domilho; Sipha fiava, pulgão amarelo; Blissus leucopterusleucopterus, percevejo; Contarinia sorghicola, mosca dosorgo; Tetranychus cinnabarinus, ácaro-aranha; Tetranychusurticae, ácaro-aranha de duas manchas; Trigo: Pseudaletiaunipunctata, lagarta de traça; Spodoptera frugiperda, larvade traça do outono; Elasmopalpus lignosellus, broca do colodo milho; Agrotis orthogonia, larva de besouro noctuídeo;Elasmopalpus lignosellus, broca do colo do milho; Oulemamelanopus, larva-lesma da cevada; Hypera punctata, gorgulhodo trevo; Diabrotica undecímpunctata howardi, larva da raizdo milho variedade southern; Pulgão do milho russo;Schizaphis graminum, pulgão; Macrosiphum avenae, Pulgãoinglês; Melanoplus femurrubrum, gafanhoto da pata vermelha;Melanoplus differentialis, gafanhoto diferencial;Melanoplus sanguinipes, gafanhoto migrador; Mayetioladestructor, mosca hesseana; Sitodiplosis mosellana, moscado milho; Meromyza americana, lagarta do colmo; Hylemyacoarctata, mosca do bulbo do trigo; Frankliniella fusca,tripés do tabaco; Cephus cinctus, mosca da serra; Aceriatulipae, ácaro eriofídeo; Girassol: Suleima helianthana,traça do girassol; Homoeosoma electellum, traça dogirassol; zygogramma exclamationis, besouro do girassol;Bothyrus gibbosus, besouro da cenoura; Neolasiopteramurtfeldtiana, mosca da semente de girassol; Algodão:Heliothis virescens, traça do algodão; Helicoverpa zea,larva da espiga de milho; Spodoptera exígua, lagarta detraça da beterraba; Peetinophora gossypiella, lagarta-rosada; Anthonomus grandis, gorgulho do algodão; Aphisgossypii, pulgão do algodão; Pseudatomoscelis seriatus,pulguinha do algodão; Trialeurodes abutilonea, cigarrinha;Lygus lineolaris, percevejo; Melanoplus femurrubrum,gafanhoto da pata vermelha; Melanoplus differentialis,gafanhoto diferencial; Thrips tabaei, tripés da cebola;Franklinkiella fusca, tripés do tabaco; Tetranychuscinnabarinus, ácaro-aranha; Tetranychus urtieae, ácaro-aranha de duas manchas; Arroz: Diatraea saceharalis, brocado colmo; Spodoptera frugiperda, larva de traça do outono;Helicoverpa zea, larva da espiga de milho; Colaspisbrunnea, vaquinha da uva; Lissorhoptrus oryzophilus,gorgulho do arroz; Sitophilus oryzae, gorgulho do arroz;Nephotettix nigropictus, pulguinha do arroz; Blissusleucopterus leucopterus, percevejo; Acrosternum hilare,percevejo-verde; Soj a: Pseudoplusia incluemns, lagartamede-palmo da soja; Anticarsia gemmatalis, lagarta damucuna; Plathypena scabra, larva do trevo verde; Ostrinianubilalis, broca européia; Agrotis ipsilon, larva debesouro noctuídeo; Spodoptera exígua, lagarta de traça dabeterraba; Heliothis virescens, traça do algodão;Helicoverpa zea, larva da espiga de milho; Epilachnavarivestis, besouro mexicano; Myzus persicae, pulgão verdedo pêssego; Empoasea fabae, gafanhoto da batata;Aerosternum hilare, percevejo-verde; Melanoplus

femurrubrum, gafanhoto da pata vermelha; Melanoplusdifferentialis, gafanhoto diferencial; Hylemya platura,vareja; Serieothrips variabilis, tripés da soja; Thripstabaei, tripés da cebola; Tetranyehus turkestani, ácaro-aranha do morango; Tetranyehus urtieae, ácaro-aranha deduas manchas; Cevada; Ostrinia nubilalis, broca européia;Agrotis ipsilon, larva de besouro noctuídeo; Schizaphisgraminum, pulgão; Blissus leucopterus leucopterus,percevejo; Acrosternum hilare, percevejo-verde; Euschistusservus, percevejo-marrom; Delia platura, vareja; Mayetioladestructor, mosca hesseana; Petrobia latens, ácaro marromdo trigo; Canola: Brevicoryne brassicae, pulgão dorepolho; Phyllotreta erueiferae, besouro-pulga; Mamestraconfigurata, lagarta de traça; Plutella xylostella, traçadiamante negra; Delia ssp., varejas de raiz.

Nematódeos incluem nematódeos parasitas, tais como nóde raiz, cisto, e nematódeos de lesão, incluindo Heteroderaspp., Meloidogyne spp., e Globodera spp.; particularmentemembros dos nematódeos de cisto, incluindo, mas nãolimitado a, Heterodera glycines (soybean cyst nematode);

Heterodera schachtii (nematódeo de cisto de beterraba);

Heterodera avenae (nematódeo de cisto de cereal); eGlobodera rostochiensis e Globodera pailida (nematódeo decisto de batata). Nematódeos de lesão incluem Pratylenchusspp.

Os artigos "um" e "uma" são aqui usados para referir-se a um ou mais do que um (i.e., a pelo menos um) do objetogramatical do artigo. Por meio de exemplo, "um elemento"significa um elemento ou mais.

Os seguintes exemplos são apresentados por meio deilustração, não por meio de limitação.

EXPERIMENTAL

Exemplo 1: Preparação e seqüenciamento de bibliotecasde DNAc de porção média de tratos digestivos de larva daraiz do milho variedade westernA porção média de tratos digestivos de 50 larvas deraiz do milho variedade western no 3o instar (WCRW)(Diabrotica virgifera virgifera) foram dissecadas eamostradas diretamente em nitrogênio liquido. RNA total foipreparado por homogeneização de tecido em nitrogênioliquido usando dois pilões e seguido por Iise celular napresença de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Para a construção de bibliotecas de DNAc, RNA poliA(+)foi purificado a partir do RNA total em uma coluna deafinidade de oligo(dT)-celulose usando o kit de purificaçãode RNAm mRNA Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway, NJ), de acordo com o protocolo do kit. Asíntese da primeira banda de DNAc usando Superscript II(Invitrogen) e subseqüente síntese da segunda banda, adiçãode ligante, e clonagem direcional nos sítios EcoRI e Xholde pBlueScript SK+ (Stratagene, La Jolla, CA) foramefetuadas em concordância com instruções providas no kitStratagene cDNA kit (Stratagene) . 0 DNAc foi purificadousando uma coluna de DNAc (Invitrogen) imediatamente antesda ligação no vetor.

O seqüenciamento de clones da biblioteca de DNAc foiconseguido usando o kit de reação ABI PRISM Big DyeTerminator Cycle Sequencing Ready reaction kit compolimerase FS AmpliTaq DNA (Perkin Elmer, Boston, MA) eanalisado em um seqüenciador ABI Model 373 Automated DNASequencer.As seqüências resultantes de aproximadamente 7000clones foram comparadas a seqüências de nucleotideos oupeptidicas conhecidas no GenBank e bases de dados deseqüências peptidicas usando os programas BLASTN ou BLASTP.

A análise de seqüência dessas ESTs indicou que asproteases de porção média de trato digestivo predominantesem WCRW foram proteases de cisteina pertencendo à famíliacatepsina (Tabela 1). Em termos de abundância relativa,catepsina L foi a protease catepsina mais importanteseguida pela catepsina B e catepsina D. Membros deCatepsina L foram responsáveis por mais de 83% dasseqüências de catepsina encontradas nos clonesseqüenciados. Análise de agrupamento revelou que doismembros dessa família, iwm2s.pk017.hlO (daqui em diante"hlO"; SEQ ID NO:6 (seqüência de nucleotideos); SEQ ID NO:7(seqüência de aminoácidos)) e iwm2s.pk015.c9 (daqui emdiante "c9"; SEQ ID NO: 8 (seqüência de nucleotideos); SEQID NO: 9 (seqüência de aminoácidos), juntos, perfizeram 80%das seqüências de catepsina L e 46% de todas seqüências decatepsina encontradas nas seqüência da biblioteca. Tripsinafoi também identificada a partir de seqüências de porçãomédia de trato digestivo, mas representadas por menos de 2%das proteases de porção média de trato digestivo.

TABELA 1: Distribuição de proteases em ESTs de porção médiade trato digestivo de WCR.<table>table see original document page 105</column></row><table>

Exemplo 2: Expressão Recombinante de proteases hlO(SEQ ID NO:7 e c9 (SEQ ID N0:9)

As duas catepsinas mais abundantes, representadas porhlO (SEQ ID NO: 7) e c9 (SEQ ID N0:9), foram totalmenteseqüenciadas para obter genes de comprimento total. Aseqüência de aminoácidos prevista indicou que essasproteínas foram de 315 e 314 aminoácidos em comprimento,respectivamente. hlO é 100% idêntica a uma protease decisteína recentemente isolada de CRW (Brown et al. (2004)Insect Biochem. Mol. Biol. 34(4):305-320), e c9 é 79%indêntica a outra protease de cisteína de CRW isolada porBrown et al. Como esperado, hlO e c9 contêm um peptídeosinal em uma região propeptídica imediatamente acima daprotease madura.

Para caracterizar os sítios de clivagem reconhecidospelas duas proteases tipo catepsina L, ambas c9 e hlO foramexpressadas usando o kit EasySelectm Pichia Expression Kit(Invitrogen). As seqüências codificadoras de hlO e c9 foramamplificadas por PCR com polimerase de platina de altafidelidade (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando primers:

h10 fwd: CGACTCGAGAAAAGAAATCTAGGTGCCTTCGAAAAATGG (SEQ IDNO:14)

h10 rev: CCATTATATGCGGCCGCCTACAATTTAGGGTAAGAGTTCATG (SEQ IDNO:15)

C9 fwd: CGACTCGAGAAAGAAATTTATCTGCCTTTGAGCAATGG (SEQ IDNO:16)

c 9 rev: CCTATATTAGCGGCCGCCTACAACTTGGGGTAAGAGTTC (SEQ IDNO:17)

Os primers forward (fwd) foram projetados paracorresponder à seqüência codificando o inicio da regiãopropeptidica prevista e incluíram uma seqüência sinal defator de pareamento α parcial e um sítio de clivagem Kex2acima da seqüência propeptidica. Essa combinaçãoasseguraria que, uma vez clonado no vetor de expressãoPichia pPICZaA (Invitrogen) a seqüência sinal de fator depareamento α completa seria reconstituída e catepsinarecombinante seria secretada no meio de crescimento e,então, subseqüentemente removida pela protease Kex2.Sítios de restrição adicionais para XhoI e NotI foramincluídos nos primers fwd e rev (sublinhados nas seqüênciasacima) para facilitar etapas de clonagem subseqüente. Osfragmentos amplificados foram digeridos com XhoI e NotI eclonados em pBluescript SK (Stratagene, La Jolla, CA) paraconfirmação de seqüência antes de subclonar nos mesmossítios de restrição em pPICZaA para expressão.

Os plasmídios resultantes, pPICZa-c9 e pPICZa-hlO,foram transformados em células X-33 de Pichia pastorisquimicamente competentes usando o kit Pichia EasyComp™Transformation kit (Invitrogen) seguindo as instruções dokit. Transformantes foram selecionados em placas de ágarYPDS contendo Zeocin™ (100 μς/πιΐ) (1% extrato de levedura,2% peptona, 2% dextrose, 1 M sorbitol, 2% ágar). 0 teste deexpressão de pequena escala de transformantes resistentesde 5 a 10 Zeocin™- foi efetuado para avaliar a produção decatepsina c9 e hlO recombinante. Transformantes individuaisforam inoculados e cultivados de um dia para o outro a 30°Ce 25 ml meio BMGY (1% extrato de levedura, 2% peptona, 100mM fosfato de potássio pH 6, 1,34% base nitrogenada delevedura (YNB), 4xl0"5% Biotina, 1% glicerol). A expressãofoi induzida colhendo-se as células por centrifugação a3000xg por 5 minutos em temperatura ambiente, decantando osobrenadante e ressuspendendo a pelota de células no meioBMMY (BMGY - 1% glicerol + 0,5% metanol) para um OD60O de1,0. As culturas resultantes foram incubadas a 30°C em umincubador agitador. A indução foi mantida por um período de96 hr por adição de 100% metanol a uma concentração finalde 0,5% a cada 24 h.

0 sobrenadante de cada cultura foi coletadoempelotando-se as células e transferindo o sobrenadantepara um tubo novo e armazenando a -80°C. A expressão deproteína c9 e hlO foi analisada por Coomasie-stained SDS-PAGE. SDS-PAGE indicou que c9 e hlO estavam sendoexpressadas e secretadas no meio de cultura em sua formapropeptídica baseado em seus tamanhos de peso molecularprevistos de 33 kDa. A análise de seqüência de aminoácidosN-terminal confirmou que as bandas de 33 kDa corresponderamaos propeptideos. Reduzir o pH de neutral para ácido (pH4,5) resultou em auto-processamento do propeptídeo em suaforma madura de 22 kDa, demonstrando que c9 e hlO foramfuncionalmente expressadas por Pichia pastoris. A análisede seqüência de aminoácidos N-terminal confirmou que abanda de 22 kDa representou a forma madura. Algum auto-processamento diferencial entre o peptídeo pro- e madurofoi observado pela análise de seqüência.

Exemplo 3: Caracterização Funcional de Catepsinas c9 eh10 em Substratos Peptídicos Sintéticos

A caracterização funcional adicional de c9 e hlO foiefetuada comparando atividades contra substratos peptídicoscromogênicos Pir-Fen-Leu-pNA e Bz-L-Arg-pNA (PeptidesInternational, Louisville, KY) . Foram realizados testes deacordo com Kouzuma et al., (1996) J. Biochem 119:1106-1113em fosfato de sódio a 100 mM (pH 6,5), KCl a 0,3 M, EDTA a0,1 M e DMSO 100% a 1 mM com 500 μΜ do substrato peptídico.1 μl de pro-c9 ou pro-hlO crus e 1 μΐ de c9 e hlO crusforam adicionados a 100 μΐ de solução de reação contendotanto Pir-Fen-Leu-pNA ou Bz-L-Arg-pNA para ver aespecificidade de substrato. Sobrenadantes de uma amostranão induzida foram usados como controles para eliminarpotenciais efeitos de contaminação por protease de Pichia.Foi permitido que as reações progredissem por 1 hr a 37°C,após o que, foi medida a absorbância a 410 nm. Essesestudos demonstraram que ambas formas (pro e madura) deambas enzimas possuem uma especificidade para Pir-Fen-Leu-pNA. Em contraste, o substrato Bz-L-Arg-pNA que ésusceptível a clivagem por catepsina B e catepsina H nãofoi hidrolisado tanto pela c9 como hlO. Essa clivagemdiferencial confirma que ambas c9 e hlO são proteasescatepsina tipo L. Nenhuma atividade foi observada comsobrenadante de amostras não induzidas. A habilidade dasprocatepsinas de hidrolisar Pir-Fen-Leu-pNA foisubseqüentemente descoberta por ser o resultado de auto-processamento na protease madura como um resultado do pHlevemente ácido (pH 6,5) do tampão de reação. Ambas c9 eh10 foram completamente inibidas por E64, um inibidor geralde proteases catepsina.

Exemplo 4: Purificação de c9 e hlO de sobrenadantes deCultura de Pichia

Meios oriundos de sobrenadantes de cultura em pequenaescala de c9 ou hlO expressando transformantes (ver Exemplo2) foram diluídos 1:4 com carbonato de sódio tampão a 50 mM(pH 10). HPLC foi efetuado na amostra usando um Agilent1100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) com um cartuchoHiTrap Q XL Cartridge (Amersham Biosciences, Piscataway,NJ). Um gradiente de etapa foi corrido com Tampão (TrisHCl a 50 mM, pH 8,0) e Tampão B (Tris HCL a50 mM, pH 8,0,NaCl a 1 M) em condições de carregamento (0% Tampão Β), 10%B, 20% B, 30% B, 40% B e 100% B em uma taxa de fluxo de 0,7ml/min. Material de fluxo (FT) e cada etapa foram coletadosà medida que é eluido na coluna, baseado na absorbância deUV. O FT e cada etapa foram testados para atividade usandoo substrato cromogênico Pir-Fen-Leu-pNA (see Exemplo 3)para identificar c9 e hlO contendo frações. A partir dahabilidade de frações de hidrolisarem o substrato peptideosintético, hlO eluido no carregamento, amostras 10% e 20% Be c9 eluido no carregamento, amostras 20% e 30% B. SDS-PAGEfoi usado para visualizar c9 e hlO em cada das amostras.

2,5 ml de cada etapa ativa foi concentrado a 50 dobrascarregando-se as amostras em um filtro Millipore Centricon3 kD MWCO (corte de peso molecular) (Millipore Corporation,Billerica, MA) e centrifugando a 7500xg por 2h a 4°C. Issoresultou em concentrar o volume restante no topo do filtroa cerca de 200 μΐ. 200 μΐ de H2O foi, então, adicionado ea Centricon foi centrifugado até que restasse um volumefinal de ~50 μΐ. A presença de c9 e hlO nas etapas ativasfoi confirmada por sua habilidade de hidrolisar Pir-Fen-Leu-pNA e análise de seqüência de aminoácidos N-terminal.Exemplo 5; Digestão de Proteínas Por ProteasesCatepsina c9 e h10 Purificadas

β-caseina e κ-caseina (Sigma Chemical Co., St. Louis,MO) e Angiogenina (Bachem, 3700 Horizon Drive, King ofPrússia, PA, USA) foram digeridas com c9 e hlO puriuficadaspara identificar sítios de reconhecimento de clivagempotenciais para essas duas catepsinas de larva da raiz domilho variedade western. O tempo de duração de clivagemfoi efetuado em tampão de proteólise (fosfato de sódio a100 mM (pH 6,5), Kcl a 0,3 M, EDTA a 0,1 M e DMSO a 100% 1mM) a 25°C, e as reações foram interrompidas pela adiçãodo inibidor E-64 (3 μΐ IOmM E-64 e volume de reação de 100μl). Produtos de digestão foram tanto separados por SDS-PAGE ou usados para espectrometria de massa LC paraidentificar sítios de clivagem nos substratosprotéicos/peptídicos teste. No caso de SDS-PAGE, digestõesforam corridas em géis de poliacrilamida 12% NuPage(Invitrogen) e produtos de digestão transferidos a membranaPVDF de acordo com as instruções fornecidas por membranasProBlott™ (Applied Biosystems Inc.). Bandas de proteínavisualizadas por colorindo-se a membrana de transferênciacom Ponceau S e bandas visíveis foram excisadas paraanálise de seqüência N-terminal. Quando espectrometria demassa LC foi usada, 20 μΐ de 100 μΐ de volume de reação foiinjetado no Magic 2002 Microbore HPLC (Michrom BioresourcesInc., Auburn, CA) com uma coluna Magic C18 (150mm χ lmm;200 Ângstrom, malha de 5 μπι) ligado a um especrômetro demassa Micromass (Micromass, Beverly, MA) para obterinformações de massa nos fragmentos de digestão. Os 80 μΐde material restantes foram injetados no Magic 2002Microbore HPLCr e os picos foram coletados paraseqüenciamento N-terminal.

O tempo de duração de digestão de β-caseina por c9mostrou um produto de digestão principal de ~19 kD(indicado por seta preta) por 2 minutos após a adição deenzima. Após 10 minutos, dois produtos de digestãoprincipais foram observados correspondendo ao fragmento de19 kD (de 2 minutos) e um novo fragmento de 16 kD.Fragmentos menores adicionais foram também observados a 10min e foram mais abundantes pelos 30 min, indicando umaclivagem progressiva dos fragmentos de 19 kD e 16 kD emfragmentos menores (indicados por setas cinza). A análisede seqüência N-terminal dos fragmentos 19kD e 16 kDcorrespondeu ao terminal N conhecido de β-caseina (e.g.,RELEELNVP; SEQ ID NO:18) indicando uma clivagem C-terminalpor c9. Isolamento baseado em HPLC dos produtos dedigestão e subseqüente análise de seqüência N-terminalidentificaram os sítios de clivagem primários e secundáriospor serem após Serl66 (LS/QS; SEQ ID N0:2) e Leul40 (LL/QS;SEQ ID NO:19) respectivamente. Sítios de clivagemadicionais foram observados para β-caseina. A preferênciapor um resíduo hidrofóbicos na posição P2' é consistentecom sítios de clivagem conhecidos de proteases catepsina Le, nesse caso, foi tendenciado em direção a Leu (L) (i.e.,5 de 6 ocorrências) . Em todos os casos, uma preferênciapor um resíduo polar foi observada na posição Pi' com Gln(Q) sendo o mais prevalecente (e.g. 4 de 6 ocorrências).

κ-caseina foi também digerida com c9 e hlO eespecificidade de sítio de reconhecimento determinada pelosmesmos métodos usados para β-caseina. No caso de κ-caseina, sítios de clivagem principais detectáveis foramobservados após Ser54, Asp62, Serl25, e Metl27. Novamente,uma preferência por um resíduo hidrofóbico na posição P2'foi observado, sendo predominantemente Leu (3 de 4ocorrências). Baseado na disponibilidade de informações desítio de clivagem de β. e κ caseina, parece existir umaforte tendência em direção a Leu na posição P2' e umresíduo Gln na posição Pi' . Como ambos sítios de clivagemprimário e secundário em β caseina continham Gln-Ser nasposições Pi' e P2' era provável que Ser fosse uma boacandidata para a posição P3. Assim, a seqüência Leu-X-Gln-Ser (LXQS; X= qualquer aminoácido; SEQ ID N0:1) foiescolhida como uma seqüência de clivagem reconhecida porcatepsinas c 9 e hlO de larva da raiz do milho variedadewestern.

Um peptídeo, angiogenina, disponível pela Bachem (3700Horizon Drive, King of Prússia, PA) foi encontrado paraobter uma seqüência, LDQS (SEQ ID N0:20), que se conformouao motivo LXQS (SEQ ID N0:1) definido acima. Angiogeninafoi sujeita a clivagem por c9 em tampão de proteólise (veracima) por 30 ou 60 min a 25°C e a reação foi interrompidapela adição de E64. A identidade de produtos de clivagemfoi elucidada por LC-MS baseado em pesos molecularesprevistos a partir da seqüência de angiogenina conhecida.Análise de seqüência N-terminal foi efetuada paraconfirmação dos dados LC-MS. Os resultados demonstraramque após 30 min dois pares distintos de produtos declivagem foram detectados e corresponderam a clivagemimediatamente N-terminal a Leu8 ou a GlnlO. Os tamanhosrelativos dos picos indicaram que a clivagem a GlnlO(LD/QS; SEQ ID NO:20) foi o sitio de clivagem primáriopreferencial. Após a digestão por 60 min, os tamanhos dospicos correspondendo a ambos produtos de clivagem aumentoucom LD/QS sendo a seqüência de reconhecimento de clivagempreferencial. Isso demonstrou que c9 de fato, reconhece,efetivamente o sitio de clivagem LXQS (SEQ ID N0:1).

Exemplo 6. Incorporação de LXQS no Sitio de Ativaçãode Cry8 e Demonstração de que Cry8 é Ativada e InseticidaApós a Ingestão por Larva da Raiz do Milho variedade western

Sabe-se que diversas proteínas Bt Cry requerem umaetapa de "ativação" para atividade inseticida emcoleópteros. Essa etapa de ativação está na forma de umcorte entre hélice 3 e hélice 4 no domínio 1 que resulta emuma mudança conformacional levando a inserção de domínio 1(liderado por hélice 4) na membrana. Os dois polipeptídeoscriados pela clivagem, contudo, permanecem associados sobcondições não desnaturantes. Como demonstrado em U.S.Patent Application No. 10/606,320, intitulada "GenesEncoding Proteins with Pesticidal Activity, " preenchida em25 de junho de 2003, aqui incorporada por referência, umaproteína Cry8 modificada com a seqüência FRRG (SEQ IDNO: 21) ou FRSRG (SEQ ID NO:22) inserida no aminoácido 162na seqüência de proteína Cry8 nativa rende a proteínainseticida sem o requisito para ativação por tripsina antesda ingestão pelo inseto. A funcionalidade do motivo LXQS(SEQ ID N0:1) foi testada substituindo-se um motivo LXQSduplo (e.g., LXQSLXQS; SEQ ID NO:3) no lugar de FRRGFRRG(SEQ ID NO:23) no mutante Cry8Bbl K05 (SEQ ID NO:24(seqüência de nucleotídeos); SEQ ID NO:25 (seqüência deaminoácidos)) . Nesse caso, Ser foi escolhida para oresíduo X (e.g., LSQS; SEQ ID N0:2) já que o sítio declivagem primário em β-caseina continha uma Ser na posiçãoPi' . A protoxina Cry8Bbl modificada resultante foi chamadade ISC-I (SEQ ID NO:26 (seqüência de nucleotídeos); SEQ IDNO:27 (seqüência de aminoácidos)).

Resultados de biotestes em larvas neonatais de larvada raiz do milho variedade western foram obtidos com1 mg/ml de mutantes Cry8Bbl K04 (SEQ ID NO:28) e ISC-I paracomparar sua atividade inseticida. Cry8Bbl-K04 contémFRRGFRRG (SEQ ID NO:23) no aminoácido 162 e foi previamentedemonstrada sendo ativa a 1 mg/ml sem a necessidade de umaetapa para uma "pré-tripsinização" para ativar Cry8. Osresultados dos biotestes apresentados na Tabela 2 indicamque a seqüência LSQSLSQS (SEQ ID NO:4) é reconhecida porproteases digestivas de larva da raiz do milho variedadewestern. Atividade inseticida é comparável àquela deCry8Bbl-K04. Além do mais, os sobreviventes de larvastratadas com ISC-I foram severamente abalados, comparadoaos sobreviventes de Cry8Bbl-K04.

<table>table see original document page 116</column></row><table>

*sobreviventes moderadamente abalados

** sobreviventes severamente abalados

Exemplo 7: Resistência de Motivo LSQSLSQS a Clivagempor Proteases Serina

Digestibilidade

Para confirmar que o motivo LSQSLSQS tipo catepsina(SEQ ID N0:4) não foi susceptível a proteases serina (e.g.,tripsina e quimotripsina), polipeptídeos de 88 kDa deCry8Bbl-K05 (SEQ ID NO:25) e Cry8Bbl-ISC-l (SEQ ID NO:27)foram produzidos. Cry8Bbl-K05 possui o motivo FRRGFRRG(SEQ ID NO: 23) no Ioop de ativação que foi previamentedemonstrado por ser clivado por ambas proteases serina.Cry8Bbl-K05 foi demonstrado por ser ativa em biotestescontra WCRW, SCRW e CPB sem ativação prévia por tripsina.Cry8Bbl-ISC-l possui o novo motivo LSQSLSQS (SEQ ID NO: 4)de protease tipo catepsina. Cinco microgramas de proteínade cada polipeptídeo foram incubadas com 1/50 (W/W) comtripsina e quimotripsina em temperatura ambiente por 72horas. Análise SDS-PAGE foi, então, efetuada. Comoesperado, os resultados mostram que Cry8Bbl-K05 foi clivadano loop entre hélice 3 e 4 de domínio I da molécula detoxina para gerar um polipeptídeo de 55 kDa. A clivagem doloop de ativação entre hélice 3 e 4 foi confirmada porseqüenciamento N-terminal. Em contraste, o polipeptídeoCry8Bbl-ISC-l de 88 kDa não foi clivado no Ioop de ativaçãopara gerar o polipeptídeo de 55 kDa.

O mesmo experimento foi repetido usando suco de porçãomédia de trato digestivo de WCRW no lugar de proteasespurificadas. Os dados indicaram que ambas moléculastoxinas foram clivadas por uma protease presente no suco deporção média de trato digestivo de WCRW para produzir ofragmento de 55kDa.

Biotestes

Os polipeptídeos de 88 KDa de Cry8Bbl-K05 e Cry8Bbl-ISC-I foram, então, testados para atividade contra WCRW,SCRW e CPB. Ambas toxinas possuíam atividade significativacontra todos os três insetos. Esses biotestes confirmamque o polipeptídeo de 88 kDA de Cry8Bbl-ISC-l foi ativocomo polipeptídeo de 88 kDA de Cry8Bbl-K05.

Em resumo, a ativação de Ioop é crítica para atividadede toxina. Os experimentos acima demonstram que opolipeptídeo Cry8Bbl-ISC-l de 88kDa é resistente a proteaseserina, mas é ainda ativado por suco de porção média detrato digestivo de um inseto coleóptero. 0 novo motivoLSQSLSQS (SEQ ID NO: 4) é, portanto, especifico de inseto.

Exemplo 8: Transformação e Regeneração de PlantasTransgênicas

Embriões de milho imaturos de plantas de estufasdoadoras são bombardeadas com um plasmidio contendo umaseqüência de nucleotideos codificando a protoxina ISC-Imodificada de Cry8Bbl aqui descrita acima no Exemplo 6 (SEQID NO:26) operacionalmente ligada ao promotor ubiquitina eao gene marcador de seleção PAT (Wohlleben et al. (1988)Gene 70:25-37), que confere resistência ao herbicidaBialaphos. Alternativamente, o gene marcador de seleção éprovido em um plasmidio separado. A transformação éefetuada como se segue. As receitas de meio seguem abaixo.

Preparação do Tecido Alvo

As espigas são descascadas e a superfície esterilizadaem alvejante Clorox 30% mais 0,5% de Micro detergente por20 minutos, e enxaguadas duas vezes com água estéril. Osembriões imaturos são excisados e colocados com eixo doembrião para baixo (lado do escutelo para cima), 25embriões por placa, em meio 560Y por 4 horas e, então,alinhados na zona alvo de 2,5cm em preparação para obombardeamento.É feito um vetor plasmidio compreendendo a seqüênciade nucleotideos de protoxina Cry8 modifica operacionalmenteligada ao promotor ubiquitina. Esse DNA de plasmidio maisDNA de plasmidio contendo um marcador de seleção PAT é isprecipitado em pelotas de tungstênio de 1,1 pm (diâmetromédio) usando um procedimento de precipitação de CaCl2 comose segue: 100 μΐ partículas de tungstênio preparadas emágua; 10 μΐ (1 μς) de DNA em tampão Tris EDTA (1 μg DNAtotal); 100 μΐ de CaCl2 a 2,5 M; e, 10 μΐ de espermidina a0,1 M.

Cada reagente é adicionado seqüencialmente á suspensãode partículas de tungstênio, enquanto mantido em um vórtexmultitubo. A mistura final é sonicada brevemente e deixadaincubando sob constante agitação por 10 minutos. Após operíodo de precipitação, os tubos são centrifugadosbrevemente, o líquido removido, lavados com 500 ml deetanol 100%, e centrifugados por 30 segundos. Novamente, olíquido é removido, e 105 μΐ de etanol 100% é adicionado àpelota de partícula de tungstênio final. Parabombardeamento de pistola de partículas, as partículastungstênio/DNA são brevemente sonicadas e 10 μΐ colocadosno centro de cada macrocarregador e deixados secar porcerca de 2 minutos antes do bombardeamento.

As placas de amostra são bombardeadas no nível #4 emuma pistola de partículas. Todas as amostras recebem umúnico tiro a 650 PSI, com um total de dez alíquotas tiradasde cada tubo de preparado particulas/DNA.

Seguindo o bombardeamento, os embriões são mantidos emmeio 560Y por 2 dias, então transferidos a meio de seleção560R contendo Bialaphos a 3 mg/litro, e subcultivados acada 2 semanas. Após aproximadamente 10 semanas deseleção, clones de calos resistentes a seleção sãotransferidos para meio 288J para iniciar a regeneraçãovegetal. Seguindo o amadurecimento do embrião somático (2-4 semanas), embriões somáticos bem desenvolvidos sãotransferidos para meio para germinação e transferidos àsala de cultura iluminada. Aproximadamente 7-10 dias maistarde, as plântulas em desenvolvimento são transferidaspara meio 272V sem hormônio em tubos por 7-10 dias até queas plântulas estejam bem estabelecidas. As plantas são,então, transferidas para inserções em recipientes(equivalentes a potes de 2,5") contendo solo de pote ecultivado por 1 semana em uma câmara de cultura,subseqüentemente cultivadas por 1-2 semanas adicionais naestufa, então transferidas a potes 600 clássicos (1,6galões) e cultivadas até a maturidade. As plantas sãomonitoradas e pontuadas para expressão da protoxina Cry8modificada testes conhecidos na arte, tais como, porexemplo, testes imuno e western blotting.

Análise de Plantas de Milho TransgênicasPlantas de milho transgênicas positivas para expressãoda protoxina Cry8Bbl modificada são testadas pararesistência a WCRW usando biotestes padrão conhecidos naarte. Tais métodos incluem, por exemplo, biotestes deexcisão de raiz e biotestes de planta inteir. Ver, e.g.,U.S. Patent Publication No. US 2003/0120054 e InternationalPublication No. WO 03/018810.

Meio de bombardeamento (560Y) compreende sais basaisN6 a 4,0 g/l (SIGMA C-1416), Mistura de VitaminasEriksson's a 1,0 ml/l (1000X SIGMA-1511), HCl tiamina a 0,5mg/1, sacarose a 120,0 g/l, 2,4-D a 1,0 mg/l, e L-prolina a2,88 g/l (levados ao volume com D-I H2O seguindo ajuste apH 5,8 com KOH) ; Gelrite a 2,0 g/L (adicionado após levarao volume com H2O dl); e nitrato de prata a 8,5 mg/L(adicionado após esterilizar o meio e resfriar atemperatura ambiente). Meio de seleção (560R) compreendesais basais N6 a 4,0 g/L (SIGMA C-1416), Eriksson's VitaminMix a 1,0 mL/L (lOOOx SIGMA-1511), HCl tiamina a 0,5 mg/L,sacarose a 30,0 g/l, e 2,4-D a 2,0 mg/l (levados ao volumecom H2O dl, seguindo o ajuste de pH 5,8 com KOH); Gelrite a3,0 g/l (adicionado após levar ao volume com H2O dl); enitrato de prata a 0.85 mg/l e bialaphos a (ambosadicionados após esterilizar o meio e resfriar atemperatura ambiente).

Meio de regeneração vegetal (288J) compreende sais MSa 4,3 g/L (GIBCO 11117-074), solução de estoque devitaminas MS a 5,0 ml/l (0,100 g ácido nicotinico, tiaminaHCl a 0,02 g/L, piridoxina HCl a 0,10 g/L, e glicina a 0,40g/L, levados ao volume com H2O D-I polida) (Murashige andSkoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), mio-inositol a 100mg/L, zeatina a 0,5 mg/L, sacarose a 60 g/l, e ácidoabscisico 0,1 mM a 1,0 ml/l (levados ao volume com H2O D-Ipolida após ajuste a pH 5,6); Gelrite a 3,0 g/l (adicionadoapós levar ao volume com H2O dl); e ácido indoleacético a1,0 mg/l e bialaphos a 3,0 mg/l (adicionados apósesterilizar o meio e resfriar a 60°C) . Meio sem hormônios(272V) compreende sais MS a 4,3 g/L (GIBCO 11117-074),solução de estoque de vitaminas MS a 5,0 mL/L (0,100 gácido nicotinico, tiamina HCl a 0,02 g/L, piridoxina HCl a0,10 g/L, e glicina a 0,40 g/L, levados ao volume com H2OD-I polida), mio-inositol a 0,1 g/L, e sacarose a 40,0 g/L(levados ao volume com H2O D-I polida após ajuste a pH5,6); e Bacto-ágar a 6 g/L (adicionado após levar ao volumecom H2O dl polida), esterilizado e resfriado a 60 °C.

Exemplo 9:_Transformação de milho mediada porAgrobacterium

Para transformação de milho mediada por Agrobacteriumcom a protoxina Cry8 modificada do Exemplo 7, o método deZhao é empregado (U.S. Patent No. 5.981.840, e InternationalPatent Publication No. WO 98/32326; os conteúdos dos quaissão, por meio deste, incorporados por referência).Resumidamente, embriões imaturos são isolados de milho e osembriões contatados com uma suspensão de Agrobacterium,onde as bactérias são capazes de transferir a protoxinaCry8 modificada para pelo menos uma célula de pelo menos umdos embriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção).Nessa etapa, os embriões imaturos são imersos em umasuspensão de Agrobacterium para a iniciação da inoculação.Os embriões são co-cultivados por um tempo com asAgrobacterium (etapa 2: a etapa de co-cultivo). Osembriões imaturos são cultivados em meio sólido seguindo aetapa de infecção. Seguindo esse período de co-cultivo,uma etapa opcional de "descanso" é contemplada. Nessaetapa de descanso, os embriões são incubados na presença depelo menos um antibiótico conhecido por inibir ocrescimento de Agrobacterium sem a adição de um agenteseletivo para transformantes vegetais (etapa 3: etapa dedescanso). Os embriões imaturos são cultivados em meiosólido com antibiótico, mas sem um agente de seleção, paraeliminação de Agrobacterium e para a fase de descanso paraas células infectadas. A seguir, embriões inoculados sãocultivados em meio contendo um agente seletivo e o calotransformado em crescimento é recuperado (etapa 4: a etapade seleção). Os embriões imaturos são cultivados em meiosólido com um agente seletivo resultando no crescimentoseletivo de células transformadas. 0 calo é, então,regenerado em plantas (etapa 5: a etapa de regeneração), ecalos em crescimento em meio seletivo são cultivados emmeio sólido para regenerar as plantas. Plantas de milhotransgênicas positivas para expressão da protoxina Cry8Bblmodificada são testadas para resistência a WCRW, comodescrito no Exemplo 7.Exemplo 10: Transformação de Embrião de Soja

Embriões de soja são bombardeados com um plasmidiocontendo a protoxina Cry8 modificada do Exemplo 7operacionalmente ligada ao promotor ubiquitina, como sesegue. Para induzir embriões somáticos, cotilédones,3-5 mm em comprimento dissecados de sementes imaturas comsuperfície esterilizada de cultivar de soja A2872, sãocultivados no claro ou escuro a 26°C em um meio de ágarapropriado para seis a dez semanas. Embriões somáticosproduzindo embriões secundários são, então, excisados ecolocados em um meio líquido adequado. Após repetida aseleção para agrupamentos de embriões somáticos quemultiplicaram como antes, embriões de estágio globular, assuspensões são mantidas como descrito abaixo.

Culturas em suspensão embriogênicas de soja podem sermantidas em 35 ml de meio líquido em um agitador derotação, 150 rpm, e 26°C com luzes fluorescentes em umhorário de 16:8 horas dia/noite. Culturas são sub-cultivadas a cada duas semanas inoculando-seaproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml de meio líquido.

Culturas em suspensão embriogênicas de soja podem ser,então, transformadas pelos métodos de bombardeamento departículas com pistola (Klein et al. (1987) Nature (London)327:70-73, U.S. Patent No. 4.945.050).Um gene marcador de seleção que pode ser usado parafacilitar a transformação de soja é um transgene compostodo promotor 35S de vírus de mosaico de couve-flor (Odell etal. (1985) Nature 313:810-812), o gene de higromicinafosfotransferase de plasmidio pJR225 (de E. coli; Gritz etal. (1983) Gene 25:179-188), e a região 3' do gene denopalina sintase do T-DNA do plasmidio Ti de Agrobacteriumtumefaciens. O cassete de expressão compreendendo aprotoxina Cry8 modificada operacionalmente ligada aopromotor ubiquitina pode ser isolada como um fragmento derestrição. Esse fragmento pode ser, então, inserido em umsítio de restrição particular do vetor carregando o genemarcador.

Para 50 μl de uma suspensão de partículas de ouro de1 μm a 60 mg/ml, é adicionado (em ordem) : 5 μΐ DNA(1 μg/μl) , 20 μl espermidina (0,1 Μ), e 50 μΐ CaCl2(2,5 Μ). A preparação de partículas é, então, agitada portrês minutos, giradas em um microfuge por 10 segundos e osobrenadante removido. As partículas de DNA cobertas são,então, lavadas uma vez em 400 μΐ etanol 70% e re-suspendidas em 40 μΐ de etanol anidro. A suspensãoDNA/partículas pode ser sonicada três vezes por um segundocada. Cinco microlitros do DNA coberto por partículas deoutro são, então, carregados em cada disco de macrocarregador.

Aproximadamente 300-400 mg de uma cultura de suspensãode duas semanas de idade é colocado em uma placa de Petrivazia de 60x15 mm e o líquido residual removido do tecidocom uma pipeta. Para cada experimento de transformação,aproximadamente 5-10 placas de tecido são normalmentebombardeadas. A pressão de ruptura de membrana édeterminada em 1100 psi, e a câmara é evacuada a um vácuode 28 polegadas de mercúrio. O tecido é colocado aaproximadamente 3,5 polegadas da tela de retenção ebombardeado três vezes. Seguindo o bombardeamento, otecido pode ser divido ao meio e colocado de volta emlíquido e cultivado como descrito acima.

Cinco a sete dias pós bombardeamento, o meio líquidopode ser trocado por meio fresco, e onze a doze dias pósbombardeamento com meio fresco contendo higromicina a50 mg/ml. Esse meio seletivo pode ser renovadosemanalmente. Sete a oito semanas pós bombardeamento,tecido verde transformado pode ser observado crescendo apartir de agrupamentos necróticos embriogênicos nãotransformados. Tecido verde isolado é removido e inoculadoem frascos individuais para gerar novas culturas desuspensão embriogênicas transformadas, propagadas porclones. Cada nova linha pode ser tratada como um evento detransformação independente. Essas suspensões podem ser,então, sub-cultivadas e mantidas como agrupamentos deembriões imaturos ou regeneradas em plantas inteiras poramadurecimento germinação de embriões somáticosindividuais.Exemplo 11: Transformação de Embrião de Soja

Condições de Cultura

Culturas em suspensão embriogênicas de soja (cv. Jack)são mantidas em 35 ml de meio liquido SB196 (ver receitasabaixo) em um agitador de rotação, 150 rpm, 26°C com luzesfrias brancas fluorescentes em fotoperiodo de 16:8 hrdia/noite com intensidade de luz de 60-85 μΕ/ιη2/3.Culturas são sub-cultivadas a cada 7 dias a duas semanasinoculando-se aproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml deliquido fresco SB196 (o intervalo de sub-cultura preferidoé a cada 7 dias).

Culturas em suspensão embriogênicas de soja sãotransformadas com os plasmidios e fragmentos de DNAdescritos nos seguintes exemplos pelos métodos debombardeamento de partículas com pistola (Klein et al.(1987) Naturef 327:70).

Iniciação de Cultura em suspensão embriogênicas deCulturas de soja são iniciadas duas vezes cada mês com5-7 dias entre cada iniciação.

Vagens com sementes imaturas de plantas de sojadisponíveis 45-55 dias após o plantio ser pego, removido desuas cascas e colocado em uma caixa magenta esterilizada.As sementes de soja são esterilizadas agitando-as por15 minutos em uma solução de Clorox 5% com 1 gota de sabãode marfim (95 ml de água destilada autoclavada mais 5 ml deClorox e 1 gota de sabão). Misturar bem. As sementes sãoenxaguadas usando 2 garrafas de 1 litro de água destiladaestéril e aquelas de menos de 4 mm são colocadas em slidesmicroscópicos individuais. A extremidade pequena dassementes é cortada e os cotilédones prensados para fora dacasca da semente. Cotilédones são transferidos a placascontendo meio SBl (25-30 cotilédones por placa). Placassão embaladas com fita de fibra e armazenadas por8 semanas. Após esse tempo, os embriões secundários sãocortados e colocados em meio liquido SB196 por 7 dias.

Preparação de DNA para Bombardeamento

Tanto plasmidio intacto ou um fragmento de DNA deplasmidio contendo os genes de interesse e o gene marcadorde seleção são usados para bombardeamento. DNA deplasmidio para bombardeamento são rotineiramente preparadose purificados usando os métodos descritos no guia Promega™Protocols and Applications Guide, Second Edition (page106). Fragmentos dos plasmidios contendo a protoxina Cry8modificada do Exemplo 7 operacionalmente ligada ao promotorubiquitina são obtidos por isolamento por gel de plasmidiosduplamente digeridos. Em cada caso, 100 ug de DNA deplasmidio é digerido em 0,5 ml da mistura de enzimaespecifica que é apropriada para o plasmidio de interesse.

Os fragmentos de DNA resultantes são separados poreletroforese de gel em 1% SeaPlaque GTG agarose(BioWhitaker Molecular Applications) e os fragmentos deDNA, contendo a protoxina Cry8 modificada do Exemplo 7, sãocortados do gel de agarose. DNA é purificado da agaroseusando a enzima de digestão GELase, seguindo o protocolo dofabricante.

Uma aliquota de 50 μΐ de água destilada estérilcontendo 3 mg de partículas de ouro (3 mg de ouro) éadicionada a 5 μΐ de uma solução de DNA a 1 ug/μΐ (tanto oplasmídio intacto ou fragmento de DNA preparado comodescrito acima), 50 μΐ CaCl2 a 2,5M e 20 μΐ de espermidinaa 0,1 Μ. A mistura é agitada por 3 min em nível 3 de umagitador vórtex e girada por 10 seg em um banco microfuge.

Após uma lavagem com 400 μΐ de etanol 100%, a pelota ésuspendida por sonicação em 40 μΐ de etanol 100%. Cinco μΐde suspensão de DNA são dispensados a cada disco do discoinstrumental Biolistic PDS1000/HE. Cada alíquota de 5 μΐcontém, aproximadamente, 0,375 mg de ouro porbombardeamento (i.e. por disco).

Preparação de Tecido e Bombardeamento com DNA

Aproximadamente 150-200 mg de culturas em suspensãoembriogênicas de 7 dias de idade são colocadas em uma placade Petri vazia estéril de 60 χ 15 mm e a placa coberta comuma malha plástica. Tecido é bombardeado com 1 ou 2 tirospor placa com pressão de ruptura de membrana estabelecidaem 1100 PSI e a câmara evacuada a um vácuo de27-28 polegadas de mercúrio. O tecido é colocado aaproximadamente 3,5 polegadas da tela de retenção / parada.Seleção de Embriões Transformados

Embriões transformados foram selecionados usando tantohigromicina (quando o gene de higromicina fosfotransferase,HPT, foi usado como o marcador de seleção) ou clorsulfuron(quando o gene de acetolactato sintase, ALS, foi usado comoo marcador de seleção).

Seleção por Higromicina (HPT)

Seguindo o bombardeamento, o tecido é colocado em meiofresco SB196 e cultivado como descrito acima. Seis diaspós bombardeamento, o SB196 é trocado por SB196 frescocontendo um agente de seleção de 30 mg/L higromicina. Omeio de seleção é renovado semanalmente. De quarto a seissemanas pós seleção, tecido transformado verde pode serobservado crescendo de agrupamentos embriogênicosnecróticos não transformados. Tecido verde isolado éremovido e inoculado em placas multi-poço para gerar novasculturas em suspensão embriogênicas transformadas,propagadas por clonagem.

Seleção por Clorsulfuron (ALS)

Seguindo o bombardeamento, o tecido é dividido entre2 frascos com meio fresco SB196 e cultivados como descritoacima. De seis a sete dias pós bombardeamento, o SB196 étrocado por SB196 fresco contendo um agente de seleção de100 ng/ml Clorsulfuron. O meio de seleção é renovadosemanalmente. De quarto a seis semanas pós seleção, tecidotransformado verde pode ser observado crescendo deagrupamentos embriogênicos necróticos não transformados.Tecido verde isolado é removido e inoculado em placasmulti-poço contendo SB196 para gerar novas culturas emsuspensão embriogênicas transformadas, propagadas porclonagem.

Regeneração de Embriões Somáticos de Soja em Plantas

Para obter plantas inteiras de culturas em suspensãoembriogênicas, o tecido deve ser regenerado.

Amadurecimento de Embrião

Embriões são cultivado por 4-6 semanas a 26°C em SB196sob lâmpadas frias brancas fluorescentes (Phillips coolwhite Econowatt F40/CW/RS/EW) e Agro (Phillips F40 Agro)(40 watt) em um fotoperiodo de 16:8 hr com intensidade deluz de 90-120 uE/m2s. Após esse tempo, agrupamentos deembriões são removidos para um meio de ágar sólido, SB166,por 1-2 semanas. Agrupamentos são, então, sub-cultivadospara meio SB103 por 3 semanas. Durante esse período,embriões individuais podem ser removidos dos agrupamentos erastreados para o fenótipo desejado. Deveria ser notadoque qualquer fenótipo detectável, resultando da expressãodos genes de interesse, poderia ser rastreado nesteestágio.Dessecação e Germinação de Embrião

Embriões individuais amadurecidos são dessecadoscolocando-os em uma placa de Petri pequena vazia dish (35 χ10 mm) por aproximadamente 4-7 dias. As placas são seladascom fita de fibra (criando uma câmara de pouca umidade).Embriões dessecados são plantados em meio SB71-4 onde foramdeixados para germinar sob as mesmas condições de culturadescritas acima. Plântulas germinadas são removidas domeio de germinação em enxaguadas cuidadosamente com água e,então, plantadas em Redi-Earth em bandeja de empacotamentode 24 células, cobertas com uma redoma plásticatransparente. Após 2 semanas, a redoma é removida eplantas endurecidas por uma semana adicional. Se asplântulas aparentaram estarem duras, elas sãotransplantadas para pote de 10" de Redi-Earth com até3 plântulas por pote. Após 10 a 16 semanas, sementesmaduras são colhidas, lascadas e analisadas para proteínas.

Receitas de Meio

SB 196 - FN Meio líquido de proliferação leve (porlitro) -

<table>table see original document page 132</column></row><table><table>table see original document page 133</column></row><table>

* Adicionar primeiro, dissolver emgarrafa escura enquanto agita

2) Estoque MS Sulfato IOOx

<table>table see original document page 133</column></row><table>

3) Estoque FN Halóides Leves IOOx

<table>table see original document page 133</column></row><table>4) Estoque FN Ρ,Β,Mo Leve IOOx

<table>table see original document page 134</column></row><table>

Meio sólido SBl (por litro) compreende: 1 pacote deSais MS (Gibco/ BRL - Cat# 11117-066) ; 1 ml de estoque devitaminas B5 1000X; 31,5 g de sacarose; 2 ml 2,4-D(concentração final 20mg/L); pH 5,7; e, 8 g de ágar TC.

Meio sólido SB 166 (por litro) compreende: 1 pacote desais MS (Gibco/ BRL - Cat# 11117-066) ; 1 ml de estoque devitaminas B5 1000X; 60 g de maltose; 750 mg de MgC12hexahidrato; 5 g de carvão ativado; pH 5,7; e, 2 g degelrite.

Meio sólido SB 103 (por litro) compreende: 1 pacote desais MS [Gibco/ BRL - Cat# 11117-066) ; 1 ml de estoque devitaminas B5 1000X; 60 g de maltose; 750 mg de MgC12hexahidrato; pH 5,7; e, 2 g de gelrite.

Meio sólido SB 71-4 (por litro) compreende: 1 garrafade sais de Gamborg B5 c/ sacarose (Gibco/BRL - Cati 21153-036); pH 5,7; e, 5 g de ágar TC.

Estoque 2,4-D é obtido pré-fabricado da Phytotech cat#D 295 - concentração é 1 mg/ml.

Estoque de Vitaminas B5 (por 100 ml) enquanto éarmazenado em alíquotas a -20C compreende: 10 g de mio-inositol; 100 mg de ácido nicotínico; 100 mg de piridoxinaHCl; e, 1 g de tiamina. Se a solução não dissolverrapidamente suficiente, aplicar um pequeno nivel de calorvia a placa de agitação quente. Estoque de Clorsulfuroncompreende Img / ml em Hidróxido de Amônio a 0,01 N.

Todas publicações e aplicações de patentesmencionadas na especificação são indicativas do niveldaqueles especialistas na arte a qual a invenção pertence.

Todas publicações e aplicações de patentes são aquiincorporadas por referência na mesma extensão como se cadapublicação e aplicação de patentes individual fossemespecificamente e individualmente indicadas a seremincorporadas por referência.

Apesar da invenção precedente ser descrita em algumdetalhe por meio de ilustração e exemplo para propósitos declaridade de entendimento, será óbvio que certas mudanças emodificações podem ser praticadas no escopo dasreivindicações no apêndice.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Requerente: Pioneer Hi-Bred International, Inc.E.I. DuPont de Nemours & Co.

<120> Titulo: Moléculas de ácido nucléico isolada, métodos para proteger umaplanta de uma praga de inseto, plantas transformadas, protoxina parainseto isolada, composição, método para impactar uma praga de inseto,polipeptideo isolado apresentando atividade proteolitica

<130> Referência do documento: 1993-PCT

<150> No. do pedido de prioridade: 60/688,635

<151> Data de depósito do pedido de prioridade: 08/06/2005

<150> No. do pedido de prioridade: 60/722,787

<151> Data de depósito do pedido de prioridade: 30/09/2005

<160> Quantidade de SEQ ID Nos.: 28

<170> Software: FastSEQ for Windows Version 4.0

<210> SEQ ID No: 1<211> Comprimento: 4<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio proteolítico

<221> Nome/chave: VARIANTE<222> Localização: 2

<223> Outras informações: Xaa = Qualquer aminoácido

<400> Seqüência: 1

Leu Xaa Gln Ser1

<210> SEQ ID No:2<211> Comprimento: 4<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio proteolítico

<400> Seqüência: 2

Leu Ser Gln Ser1

<210> SEQ ID No: 3<211> Comprimento: 8<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência Artificial

<220> Características:<223> Outras informações: Sítio Proteolitico

<221> Nome/chave: VARIANTE<222> Localização: 2,6

<223> Outras informações: Xaa = Qualquer aminoácído

<400> Seqüência: 3Leu Xaa Gln Ser Leu Xaa Gln Ser1 5

<210> SEQ ID No: 4<211> Comprimento: 8<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio Proteolitico

<400> Seqüência: 4

Leu Ser Gln Ser Leu Ser Gln Ser1 5

<210> SEQ ID No: 5<211> Comprimento: 4<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Seqüência de aminoácído localizada entre alfa-hélices3 e 4 do domínio 1 da toxina Cry8Bbl.

<400> Seqüência: 5

Asn Gly Ser Arg1

<210> SEQ ID No: 6<211> Comprimento: 1035<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Diabrotica virgifera virgifera<400> Seqüência: 6

gaaaaatcag aatgaagctg ttcatccttg ccgctgccct tattgtggccatctaggtgc cttcgaaaaa tggaccagtt ttaaggcaac ccataacaaattattgaaga caaacttcgt ttcgctgttt tccaagacaa cctcaaaaaaacaatgctaa atacgaaagt ggagaagaaa cctactactt ggctgttaacattggtccag cgctgaattc caagctatgt tggcccgtca gatggctaacaatcctttat tgcaaaacac gtagccgatc ccaatgtcca agctgtagaaggagagatag tgccgttttg ggagtcaaag atcaaggaca gtgtggatcatcagtaccac cggatccctc gaaggtcaac tcgccatcca caaaaatcaatcagtgaaca agaattggta gactgtgaca catcaagaaa tgctggttgttgatgacaga tgcctttaac tatgttaaac gccatggtct ctcttccgaacatacaccgg cagagatgat cgctgcaaga atgttgagaa caaaccactcgtggctacgt agaacttgaa acaactgaag atgcactcgc gtccgctgttgtccagtttc catcgctgtt gatgctgata catggcaatt atacggaggt

acaagtgcca 60tcttacaacg 120atcgaggaac 180aaattcgccg 240aagcccaaac 300gaagttgatt 360tgctgggctt 420cgtgttcctc 480aacggaggtt 540tctcaatatg 600tcttccatta 660gctagcgtag 720ggacttttca 780acaacaaaaa ctgtagaacc aacctcaatc acggtgttct tgctgttgga tacactaaag 840atgcattcat tgtcaagaac tcatggggaa ctagctgggg tgaacaaggt tacatcagag 900ttgcccgtgg tgaaaacttg tgtggtatta acctcatgaa ctcttaccct aaattgtaaa 960tgatttaatg caaatgaaac accaaataga attcaaaaat aaagataaat aaaaaactaa 1020aaaaaaaaaa aaaaa 1035

<210> SEQ ID No: 7<211> Comprimento: 315<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Diabrotica virgifera virgifera<400> Seqüência: 7

Met Lys Leu Phe Ile Leu Ala Ala Ala Leu Ile Val Ala Thr Ser Ala

15 10 15

Asn Leu Gly Ala Phe Glu Lys Trp Thr Ser Phe Lys Ala Thr His Asn

20 25 30

Lys Ser Tyr Asn Val Ile Glu Asp Lys Leu Arg Phe Ala Val Phe Gln

35 40 45

Asp Asn Leu Lys Lys Ile Glu Glu His Asn Ala Lys Tyr Glu Ser Gly

50 55 60

Glu Glu Thr Tyr Tyr Leu Ala Val Asn Lys Phe Ala Asp Trp Ser Ser65 70 75 80

Ala Glu Phe Gln Ala Met Leu Ala Arg Gln Met Ala Asn Lys Pro Lys

85 90 95

Gln Ser Phe Ile Ala Lys His Val Ala Asp Pro Asn Val Gln Ala Val

100 105 110

Glu Glu Val Asp Trp Arg Asp Ser Ala Val Leu Gly Val Lys Asp Gln

115 120 125

Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Thr Thr Gly Ser Leu Glu

130 135 140

Gly Gln Leu Ala Ile His Lys Asn Gln Arg Val Pro Leu Ser Glu Gln145 150 155 160

Glu Leu Val Asp Cys Asp Thr Ser Arg Asn Ala Gly Cys Asn Gly Gly

165 170 175

Leu Met Thr Asp Ala Phe Asn Tyr Val Lys Arg His Gly Leu Ser Ser

180 185 190

Glu Ser Gln Tyr Ala Tyr Thr Gly Arg Asp Asp Arg Cys Lys Asn Val

195 200 205

Glu Asn Lys Pro Leu Ser Ser Ile Ser Gly Tyr Val Glu Leu Glu Thr

210 215 220

Thr Glu Asp Ala Leu Ala Ser Ala Val Ala Ser Val Gly Pro Val Ser225 230 235 240

Ile Ala Val Asp Ala Asp Thr Trp Gln Leu Tyr Gly Gly Gly Leu Phe

245 250 255

Asn Asn Lys Asn Cys Arg Thr Asn Leu Asn His Gly Val Leu Ala Val

260 265 270

Gly Tyr Thr Lys Asp Ala Phe Ile Val Lys Asn Ser Trp Gly Thr Ser

275 280 285

Trp Gly Glu Gln Gly Tyr Ile Arg Val Ala Arg Gly Glu Asn Leu Cys

290 295 300

Gly Ile Asn Leu Met Asn Ser Tyr Pro Lys Leu305 310 315

<210> SEQ ID No: 8<211> Comprimento: 1034<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Diabrotica virgifera virgifera<400> Seqüência: 8

ttttagtgagcataaatgccattttacaacaatcgacgcacaaattcgcccaagccaaaaagaagttgatatgctgggctacgtgttcctcggaggtttgacaataccccttcgatcagttaatgttggtagttttcaaccactaaagatcatcagagttgttgtagataaaaaaaaaaa

agaaaactcaaatttatctggttattgaggcacaatgctagattggtccacaatccttcatggagagaaattcagtaccactcagtgaacatgacagatgtatacaggcgggttacgtcgccagtgtcaaaataaaaattgtcttcatcggcccgtggtaacagttaatgaaaa

aaatgaagctcctttgagcaacaaacttcgaatacgaaaagcgcagaattttgcaaaacagtgctgttttccggatccctaagaattggtccttcttttatagatggtcaaacttgatgatagctgtcgagtggagacgcttaaaaactcgcaacttatgaaaagtgata

gttaattctaatggaccagtttttgctgttgggagaagaaccaagccatgcgtagtcgatgggagtcaaacgaaggtcaaagactgtgattattgaacatttgcaatcataactgaaagtagctgatacatcttaaccacatggggaacatggtattaactatttataat

gccgccaccctttaaggcaattccaagagaacctactacattggaccgtccccaatgtccgatcaaggacctcgccatccaaggtaaacgcatggtctttgtaaaagacagctctagctgtggcaattctggtgttcttgggctggggtgctcatgaactaataaatgat

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6012018024030036042048054060066072078084090096010201034

<210> SEQ ID No: 9<211> Comprimento: 314<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: ; Diabrotica virgifera virgifera <400> Seqüência: ; 9 Met Lys Leu Leu Ile Leu Ala Ala Thr Leu Ile Val Ala Ile Asn Ala1 5 10 15 Asn Leu Ser Ala Phe Glu Gln Trp Thr Ser Phe Lys Ala Thr His Asn 20 25 30 Lys Phe Tyr Asn Val Ile Glu Asp Lys Leu Arg Phe Ala Val Phe Gln 35 40 45 Glu Asn Leu Arg Lys Ile Asp Ala His Asn Ala Lys Tyr Glu Lys Gly 50 55 60 Glu Glu Thr Tyr Tyr Met Ala Val Asn Lys Phe Ala Asp Trp Ser Ser65 70 75 80Ala Glu Phe Gln Ala Met Leu Asp Arg Gln Met Ala Asn Lys Pro Lys 85 90 95 Gln Ser Phe Ile Ala Lys His Val Val Asp Pro Asn Val Gln Ala Val 100 105 110 Glu Glu Val Asp Trp Arg Glu Ser Ala Val Leu Gly Val Lys Asp Gln 115 120 125 Gly Gln Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Thr Thr Gly Ser Leu Glu 130 135 140 Gly Gln Leu Ala Ile His Lys Asn Gln Arg Val Pro Leu Ser Glu Gln145 150 155 160Glu Leu Val Asp Cys Asp Lys Val Asn Asp Gly Cys Asp Gly Gly Leu 165 170 175 Met Thr Asp Ala Phe Phe Tyr Ile Glu His His Gly Leu Ser Ser Glu 180 185 190 Glu Gln Tyr Pro Tyr Thr Gly Val Asp Gly His Cys Asn His Val Lys 195 200 205 Asp Lys Gln Val Ser Ser Ile Ser Gly Tyr Val Glu Leu Asp Glu Thr 210 215 220 Glu Ser Ala Leu Ala Asp Ala Leu Ala Asn Val Gly Pro Val Ser Ile225 230 235 240Ala Val Glu Ala Asp Thr Trp Gln Phe Tyr Ser Gly Gly Val Phe Asn 245 250 255Asn Lys Asn Cys Gly Asp Ala Leu Asn His Gly Val Leu Ala Val Gly

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Tyr Thr Lys Asp Val Phe Ile Val Lys Asn Ser Trp Gly Thr Gly Trp

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Gly Glu Gln Gly Tyr Ile Arg Val Ala Arg Gly Ser Asn Leu Cys Gly

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Ile Asn Leu Met Asn Ser Tyr Pro Lys Leu305 310

<210> SEQ ID No: 10<211> Comprimento: 3621<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Bacillus thuringiensis<400> Seqüência: 10

atgagtccaa ataatcaaaa tgaatatgaa attatagatg cgacaccttc tacttctgta 60tccaatgatt ctaacagata cccttttgcg aatgagccaa caaatgcgct acaaaatatg 120gattataaag attatttaaa aatgtctgcg ggaaatgcta gtgaataccc tggttcacct 180gaagtacttg ttagcggaca agatgcagct aaggccgcaa ttgatatagt aggtaaatta 240ctatcaggtt taggggtccc atttgttggg ccgatagtga gtctttatac tcaacttatt 300gatattctgt ggccttcagg ggaaaagagt caatgggaaa tttttatgga acaagtagaa 360gaactcatta atcaaaaaat agcagaatat gcaaggaata aagcgctttc ggaattagaa 420ggattaggta ataattacca attatatcta actgcgcttg aagaatggga agaaaatcca 480aatggttcaa gagccttacg agatgtgcga aatcgatttg aaatcctgga tagtttattt 540acgcaatata tgccatcttt tagagtgaca aattttgaag taccattcct tactgtatat 600gcaatggcag ccaaccttca tttactgtta ttaaaggacg cgtcaatttt tggagaagaa 660tggggatggt caacaactac tattaataac tattatgatc gtcaaatgaa acttactgca 720gaatattctg atcactgtgt aaagtggtat gaaactggtt tagcaaaatt aaaaggcacg 780agcgctaaac aatgggttga ctataaccaa ttccgtagag aaatgacact ggcggtttta 840gatgttgttg cattattccc aaattatgac acacgcacgt acccaatgga aacgaaagca 900caactaacaa gggaagtata tacagatcca ctgggcgcgg taaacgtgtc ttcaattggt 960tcctggtatg acaaagcacc ttctttcgga gtgatagaat catccgttat tcgaccaccc 1020catgtatttg attatataac gggactcaca gtgtatacac aatcaagaag catttcttcc 1080gctcgctata taagacattg ggctggtcat caaataagct accatcgtgt cagtaggggt 1140agtaatcttc aacaaatgta tggaactaat caaaatctac acagcactag tacctttgat 1200tttacgaatt atgatattta caagactcta tcaaaggatg cagtactcct tgatattgtt 1260taccctggtt atacgtatat attttttgga atgccagaag tcgagttttt catggtaaac 1320caattgaata ataccagaaa gacgttaaag tataatccag tttccaaaga tattatagcg 1380agtacaagag attcggaatt agaattacct ccagaaactt cagatcaacc aaattatgag 1440tcatatagcc atagattatg tcatatcaca agtattcccg cgacgggtaa cactaccgga 1500ttagtacctg tattttcttg gacacatcga agtgcagatt taaacaatac aatatattca 1560gataaaatca ctcaaattcc ggccgttaaa tgttgggata atttaccgtt tgttccagtg 1620gtaaaaggac caggacatac aggaggggat ttattacagt ataatagaag tactggttct 1680gtaggaacct tatttctagc tcgatatggc ctagcattag aaaaagcagg gaaatatcgt 1740gtaagactga gatatgctac tgatgcagat attgtattgc atgtaaacga tgctcagatt 1800cagatgccaa aaacaatgaa cccaggtgag gatctgacat ctaaaacttt taaagttgca 1860gatgctatca caacattaaa tttagcaaca gatagttcgc tagcattgaa acataattta 1920ggtgaagacc ctaattcaac attatctggt atagtttacg ttgaccgaat cgaattcatc 1980ccagtagatg agacatatga agcggaacaa gatttagaag cagcgaagaa agcagtgaat 2040gccttgttta cgaatacaaa agatggctta cgaccaggcg taacggatta tgaagtgaat 2100caagcggcaa acttagtgga atgcctatcg gatgatttgt atccaaatga aaaacgattg 2160ttatttgatg cagtgagaga ggcaaaacgc ctcagtgagg cacgtaattt gcttcaagat 2220ccagatttcc aagagataaa tggagaaaat ggctggacgg caagtacggg aattgaggtt 2280atagaagggg atgctttatt caaagggcgt tatctacgcc taccaggtgc gagagaaata 2340gatacggaaa cgtatccaac gtatctgtat caaaaagtag aggaaggtgt attaaaacca 2400tacacaagat atagattgag agggtttgtc ggaagcagtc aaggattgga aattttcaca 2460attcgtcatc aaacgaaccg aattgtaaaa aatgtaccgg atgatttgct gccagatgta 2520tctcctgtta actcggatgg tagtatcaat cgatgcagcg aacaaaagta tgtgaatagc 2580cgtttagaag tagaaaaccg ttctggtgaa gcgcatgagt tctctattcc tattgataca 2640ggtgaaatcggagggatatggcattagaacgaagaaacagtatcaggatcctgatacagttatacgaagtcgaaatgccaggcgtagaagcaagtttcgcagaaaagaagacgcttacttaatacaaatgtataacgcaaagtgtgtacagatcaaatgtttgattgtag

attacaatgacaacactcgggcttgcaaagatagaaggtaagcaactgaaccattccttattacagaatttaccaaatggtacaacaaataacagtttacgggtaggaaattagtgcaaggatataacacataatatgtaatgatcaaacggattgagatacgtagagta

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gatttaagatagggacctttttcaaatgactagatcgtttatcttactgccagaaatacccgtggagtttgtaattggaatgattccaaaatgtgttacgatggtggaaatgtataatacaagcatcgagcaaacggatatgacattcattctatataga

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<210> SEQ ID No: 11<211> Comprimento: 1206<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Bacillus thuringiensis<400> Seqüência: 11

Met Ser Pro Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Thr Pro1 5 10 15 Ser Thr Ser Val Ser Asn Asp Ser Asn Arg Tyr Pro Phe Ala Asn Glu 20 25 30 Pro Thr Asn Ala Leu Gln Asn Met Asp Tyr Lys Asp Tyr Leu Lys Met 35 40 45 Ser Ala Gly Asn Ala Ser Glu Tyr Pro Gly Ser Pro Glu Val Leu Val 50 55 60 Ser Gly Gln Asp Ala Ala Lys Ala Ala Ile Asp Ile Val Gly Lys Leu65 70 75 80Leu Ser Gly Leu Gly Val Pro Phe Val Gly Pro Ile Val Ser Leu Tyr 85 90 95 Thr Gln Leu Ile Asp Ile Leu Trp Pro Ser Gly Glu Lys Ser Gln Trp 100 105 110 Glu Ile Phe Met Glu Gln Val Glu Glu Leu Ile Asn Gln Lys Ile Ala 115 120 125 Glu Tyr Ala Arg Asn Lys Ala Leu Ser Glu Leu Glu Gly Leu Gly Asn 130 135 140 Asn Tyr Gln Leu Tyr Leu Thr Ala Leu Glu Glu Trp Glu Glu Asn Pro145 150 155 160Asn Gly Ser Arg Ala Leu Arg Asp Val Arg Asn Arg Phe Glu Ile Leu 165 170 175 Asp Ser Leu Phe Thr Gln Tyr Met Pro Ser Phe Arg Val Thr Asn Phe 180 185 190 Glu Val Pro Phe Leu Thr Val Tyr Ala Met Ala Ala Asn Leu His Leu 195 200 205 Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Ile Phe Gly Glu Glu Trp Gly Trp Ser 210 215 220 Thr Thr Thr Ile Asn Asn Tyr Tyr Asp Arg Gln Met Lys Leu Thr Ala225 230 235 240Glu Tyr Ser Asp His Cys Val Lys Trp Tyr Glu Thr Gly Leu Ala Lys 245 250 255 Leu Lys Gly Thr Ser Ala Lys Gln Trp Val Asp Tyr Asn Gln Phe Arg 260 265 270 Arg Glu Met Thr Leu Ala Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Asn275 280 285

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Ile Arg Pro Pro His Val Phe Asp Tyr Ile Thr Gly Leu Thr Val Tyr

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Gly Leu Arg Pro Gly Val Thr Asp Tyr Glu Val Asn Gln Ala Ala Asn

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Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Asp Leu Tyr Pro Asn Glu Lys Arg Leu705 710 715 720

Leu Phe Asp Ala Val Arg Glu Ala Lys Arg Leu Ser Glu Ala Arg Asn

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Thr Ala Ser Thr Gly Ile Glu Val Ile Glu Gly Asp Ala Leu Phe Lys755 760 765Gly Arg Tyr Leu Arg Leu Pro Gly Ala Arg Glu Ile Asp Thr Glu Thr

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Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Val Glu Glu Gly Val Leu Lys Pro785 790 795 800

Tyr Thr Arg Tyr Arg Leu Arg Gly Phe Val Gly Ser Ser Gln Gly Leu

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850 855 860

Glu Asn Arg Ser Gly Glu Ala His Glu Phe Ser Ile Pro Ile Asp Thr865 870 875 880

Gly Glu Ile Asp Tyr Asn Glu Asn Ala Gly Ile Trp Val Gly Phe Lys

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Glu Glu Gly Pro Leu Ser Gly Asp Ala Leu Glu Arg Leu Gln Arg Glu

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Glu Gln Gln Trp Lys Ile Gln Met Thr Arg Arg Arg Glu Glu Thr Asp

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Arg Arg Tyr Met Ala Ser Lys Gln Ala Val Asp Arg Leu Tyr Ala Asp945 950 955 960

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Phe Pro Glu Ile Pro Gly Met Asn Tyr Thr Lys Phe Thr Glu Leu Thr

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Pro Asn Gly Asp Phe Arg Asn Gly Leu Ser Asn Trp Asn Ala Thr Pro1025 1030 1035 1040

Gly Val Glu Val Gln Gln Ile Asn His Thr Ser Val Leu Val Ile Pro

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Asn Trp Asp Glu Gln Val Ser Gln Gln Phe Thr Val Gln Pro Asn Gln

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Arg Tyr Val Leu Arg Val Thr Ala Arg Lys Glu Gly Val Gly Asn Gly

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Tyr Val Ser Ile Arg Asp Gly Gly Asn Gln Thr Glu Thr Leu Thr Phe

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Ser Ala Ser Asp Tyr Asp Thr Asn Gly Met Tyr Asn Thr Gln Val Ser1105 1110 1115 1120

Asn Thr Asn Gly Tyr Asn Thr Asn Asn Ala Tyr Asn Thr Gln Ala Ser

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Ser Thr Asn Gly Tyr Asn Ala Asn Asn Met Tyr Asn Thr Gln Ala Ser

1140 1145 1150

Asn Thr Asn Gly Tyr Asn Thr Asn Ser Val Tyr Asn Asp Gln Thr Gly

1155 1160 1165

Tyr Ile Thr Lys Thr Val Thr Phe Ile Pro Tyr Thr Asp Gln Met Trp

1170 1175 1180

Ile Glu Met Ser Glu Thr Glu Gly Thr Phe Tyr Ile Glu Ser Val Glu1185 1190 1195 1200

Leu Ile Val Asp Val Glu1205

<210> SEQ ID No: 12<211> Comprimento: 3633<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Bacillus thuringiensis

<400> Seqüência: 12

atgagtccaa ataatcaaaa tgaatatgaatccaatgatt ctaacagata cccttttgcggattataaag attatttaaa aatgtctgcggaagtacttg ttagcggaca agatgcagctctatcaggtt taggggtccc atttgttggggatattctgt ggccttcagg gcaaaagagtgaactcataa atcaaaaaat agcagaatatggattaggta ataattacca attatatctaaatggttcaa gagccttacg agatgtgcgaacgcaataca tgccatcttt tcgagtgacaacacaggcag ccaaccttca tttactgttatggggatggt ctacaaccac tattaataacgaatattctg atcactgtgt aaagtggtatagcgctaaac aatgggtcga ctataaccaagatgttgttg cattattccc aaattatgaccaactaacaa gggaagtata tacagatccatcctggtatg acaaagcacc ttctttcggacatgtatttg attatataac gggactcacagctcgctata taagacattg ggctggtcataatattataa aacagatgta tggaactaattttacgaatt atgatattta caagacgttatttcctggtt atacgtatat attttttggacaattgaata ataccagaaa gacgttaaaggggacaagag attcggaatt agaattaccttcatatagcc atagattatg tcatatcacattagtacctg tattttcttg gacacatcgggataaaatta ctcagattcc ggtcgtaaaggggccaaata ataccgttgt atcgggtcctataagaaatg gagtaattat atcacatatgtatagtatga ggattcggta tgcttccgctgaagaaaacg ttaaatctca cgctcaaaaaaataaattta attatgcgac tttgccccctactctagggg ctatatttga agcggaagacatcgaattta tcccagtaga tgagacatataaagcagtga atgccttgtt tacgaatacatatgaagtga atcaagcggc aaacttagtggaaaaacgat tgttatttga tgcagtgagattgcttcaag atccagattt ccaagagataggaattgagg ttatagaagg ggatgctttagcgagagaaa tagatacgga aacgtatccagtattaaaac catacacaag atatagattggaaattttca caattcgtca tcaaacgaacctgccagatg tatctcctgt taactcggattatgtgaata gccgtttaga agtagaaaaccctattgata caggtgaaat cgattacaatattacggacc cagagggata tgcaacactcttatcaggag acgcattaga acgcttgcaaacaagaagac gtgaagaaac agatagaaggttatatgccg attatcagga tcagcaactggcggcccaag atctgataca gtccattcctccagggatga actatacgaa gtttacagaattgtatgatc agcgaaatgc cataccaaataatgcaacgc ctggcgtaga agtacaacaaaactgggatg agcaagtttc gcaacagtttcgagttactg cgagaaaaga aggggtaggaaatcaaacag aaacgcttac ttttagtgcaacgcaagtgt ccaatacaaa tggatataac

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gaaagtgtag aattgattgt agacgtagag taa 3633

<210> SEQ ID No: 13<211> Comprimento: 1210<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Bacillus thuringiensis<400> Seqüência: 13

Met Ser Pro Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Thr Pro1 5 10 15 Ser Thr Ser Val Ser Asn Asp Ser Asn Arg Tyr Pro Phe Ala Asn Glu 20 25 30 Pro Thr Asn Ala Leu Gln Asn Met Asp Tyr Lys Asp Tyr Leu Lys Met 35 40 45 Ser Ala Gly Asn Ala Ser Glu Tyr Pro Gly Ser Pro Glu Val Leu Val 50 55 60 Ser Gly Gln Asp Ala Ala Lys Ala Ala Ile Asp Ile Val Gly Lys Leu65 70 75 80Leu Ser Gly Leu Gly Val Pro Phe Val Gly Pro Ile Val Ser Leu Tyr 85 90 95 Thr Gln Leu Ile Asp Ile Leu Trp Pro Ser Gly Gln Lys Ser Gln Trp 100 105 110 Glu Ile Phe Met Glu Gln Val Glu Glu Leu Ile Asn Gln Lys Ile Ala 115 120 125 Glu Tyr Ala Arg Asn Lys Ala Leu Ser Glu Leu Glu Gly Leu Gly Asn 130 135 140 Asn Tyr Gln Leu Tyr Leu Thr Ala Leu Glu Glu Trp Lys Glu Asn Pro145 150 155 160Asn Gly Ser Arg Ala Leu Arg Asp Val Arg Asn Arg Phe Glu Ile Leu 165 170 175 Asp Ser Leu Phe Thr Gln Tyr Met Pro Ser Phe Arg Val Thr Asn Phe 180 185 190 Glu Val Pro Phe Leu Thr Val Tyr Thr Gln Ala Ala Asn Leu His Leu 195 200 205 Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Ile Phe Gly Glu Glu Trp Gly Trp Ser 210 215 220 Thr Thr Thr Ile Asn Asn Tyr Tyr Asp Arg Gln Met Lys Leu Thr Ala225 230 235 240Glu Tyr Ser Asp His Cys Val Lys Trp Tyr Glu Thr Gly Leu Ala Lys 245 250 255 Leu Lys Gly Thr Ser Ala Lys Gln Trp Val Asp Tyr Asn Gln Phe Arg 260 265 270 Arg Glu Met Thr Leu Thr Val Leu Asp Val Val Ala Leu Phe Pro Asn 275 280 285 Tyr Asp Thr Arg Thr Tyr Pro Met Glu Thr Lys Ala Gln Leu Thr Arg 290 295 300 Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Gly Ala Val Asn Val Ser Ser Ile Gly305 310 315 320Ser Trp Tyr Asp Lys Ala Pro Ser Phe Gly Val Ile Glu Ser Ser Val 325 330 335 Ile Arg Pro Pro His Val Phe Asp Tyr Ile Thr Gly Leu Thr Val Tyr 340 345 350 Thr Gln Ser Arg Ser Ile Ser Ser Ala Arg Tyr Ile Arg His Trp Ala 355 360 365 Gly His Gln Ile Ser Tyr His Arg Ile Phe Ser Asp Asn Ile Ile Lys 370 375 380Gln Met Tyr Gly Thr Asn Gln Asn Leu His Ser Thr Ser Thr Phe Asp385 390 395 400

Phe Thr Asn Tyr Asp Ile Tyr Lys Thr Leu Ser Lys Asp Ala Val Leu

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Leu Asp Ile Val Phe Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Phe Phe Gly Met Pro

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Glu Val Glu Phe Phe Met Val Asn Gln Leu Asn Asn Thr Arg Lys Thr

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500 505 510

Asp Leu Ile Asn Ala Val His Ser Asp Lys Ile Thr Gln Ile Pro Val

515 520 525

Val Lys Val Ser Asp Leu Ala Pro Ser Ile Thr Gly Gly Pro Asn Asn

530 535 540

Thr Val Val Ser Gly Pro Gly Phe Thr Gly Gly Gly Ile Ile Lys Val545 550 555 560

Ile Arg Asn Gly Val Ile Ile Ser His Met Arg Val Lys Ile Ser Asp

565 570 575

Ile Asn Lys Glu Tyr Ser Met Arg Ile Arg Tyr Ala Ser Ala Asn Asn

580 585 590

Thr Glu Phe Tyr Ile Asn Pro Ser Glu Glu Asn Val Lys Ser His Ala

595 600 605

Gln Lys Thr Met Asn Arg Gly Glu Ala Leu Thr Tyr Asn Lys Phe Asn

610 615 620

Tyr Ala Thr Leu Pro Pro Ile Lys Phe Thr Thr Thr Glu Pro Phe Ile625 630 635 640

Thr Leu Gly Ala Ile Phe Glu Ala Glu Asp Phe Leu Gly Ile Glu Ala

645 650 655

Tyr Ile Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Asp Glu Thr Tyr Glu Ala

660 665 670

Glu Gln Asp Leu Glu Ala Ala Lys Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr

675 680 685

Asn Thr Lys Asp Gly Leu Arg Pro Gly Val Thr Asp Tyr Glu Val Asn

690 695 700

Gln Ala Ala Asn Leu Val Glu Cys Leu Ser Asp Asp Leu Tyr Pro Asn705 710 715 720

Glu Lys Arg Leu Leu Phe Asp Ala Val Arg Glu Ala Lys Arg Leu Ser

725 730 735

Glu Ala Arg Asn Leu Leu Gln Asp Pro Asp Phe Gln Glu Ile Asn Gly

740 745 750

Glu Asn Gly Trp Thr Ala Ser Thr Gly Ile Glu Val Ile Glu Gly Asp

755 760 765

Ala Leu Phe Lys Gly Arg Tyr Leu Arg Leu Pro Gly Ala Arg Glu Ile

770 775 780

Asp Thr Glu Thr Tyr Pro Thr Tyr Leu Tyr Gln Lys Val Glu Glu Gly785 790 795 800

Val Leu Lys Pro Tyr Thr Arg Tyr Arg Leu Arg Gly Phe Val Gly Ser

805 810 815

Ser Gln Gly Leu Glu Ile Phe Thr Ile Arg His Gln Thr Asn Arg Ile

820 825 830

Val Lys Asn Val Pro Asp Asp Leu Leu Pro Asp Val Ser Pro Val Asn

835 840 845

Ser Asp Gly Ser Ile Asn Arg Cys Ser Glu Gln Lys Tyr Val Asn Ser

850 855 860

Arg Leu Glu Val Glu Asn Arg Ser Gly Glu Ala His Glu Phe Ser Ile865 870 875 880

Pro Ile Asp Thr Gly Glu Ile Asp Tyr Asn Glu Asn Ala Gly Ile Trp

885 890 895

Val Gly Phe Lys Ile Thr Asp Pro Glu Gly Tyr Ala Thr Leu Gly Asn

900 905 910

Leu Glu Leu Val Glu Glu Gly Pro Leu Ser Gly Asp Ala Leu Glu Arg

915 920 925

Leu Gln Arg Glu Glu Gln Gln Trp Lys Ile Gln Met Thr Arg Arg Arg

930 935 940

Glu Glu Thr Asp Arg Arg Tyr Met Ala Ser Lys Gln Ala Val Asp Arg945 950 955 960

Leu Tyr Ala Asp Tyr Gln Asp Gln Gln Leu Asn Pro Asp Val Glu Ile

965 970 975

Thr Asp Leu Thr Ala Ala Gln Asp Leu Ile Gln Ser Ile Pro Tyr Val

980 985 990

Tyr Asn Glu Met Phe Pro Glu Ile Pro Gly Met Asn Tyr Thr Lys Phe

995 1000 1005

Thr Glu Leu Thr Asp Arg Leu Gln Gln Ala Trp Ser Leu Tyr Asp Gln

1010 1015 1020

Arg Asn Ala Ile Pro Asn Gly Asp Phe Arg Asn Gly Leu Ser Asn Trp1025 1030 1035 1040

Asn Ala Thr Pro Gly Val Glu Val Gln Gln Ile Asn His Thr Ser Val

1045 1050 1055

Leu Val Ile Pro Asn Trp Asp Glu Gln Val Ser Gln Gln Phe Thr Val

1060 1065 1070

Gln Pro Asn Gln Arg Tyr Val Leu Arg Val Thr Ala Arg Lys Glu Gly

1075 1080 1085

Val Gly Asn Gly Tyr Val Ser Ile Arg Asp Gly Gly Asn Gln Thr Glu

1090 1095 1100

Thr Leu Thr Phe Ser Ala Ser Asp Tyr Asp Thr Asn Gly Met Tyr Asn1105 1110 1115 1120

Thr Gln Val Ser Asn Thr Asn Gly Tyr Asn Thr Asn Asn Ala Tyr Asn

1125 1130 1135

Thr Gln Ala Ser Ser Thr Asn Gly Tyr Asn Ala Asn Asn Met Tyr Asn

1140 1145 1150

Thr Gln Ala Ser Asn Thr Asn Gly Tyr Asn Thr Asn Ser Val Tyr Asn

1155 1160 1165

Asp Gln Thr Gly Tyr Ile Thr Lys Thr Val Thr Phe Ile Pro Tyr Thr

1170 1175 1180

Asp Gln Met Trp Ile Glu Met Ser Glu Thr Glu Gly Thr Phe Tyr Ile1185 1190 1195 1200

Glu Ser Val Glu Leu Ile Val Asp Val Glu1205 1210

<210> SEQ ID No: 14<211> Comprimento: 39<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Oligo iniciador para protease hlO<400> Seqüência: 14

cgactcgaga aaagaaatct aggtgccttc gaaaaatgg

<210> SEQ ID No: 15<211> Comprimento: 42<212> Tipo: DNA<213> Organismo: Seqüência Artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Oligo iniciador reverso para protease hlO<400> Seqüência: 15

ccattatatg cggccgccta caatttaggg taagagttca tg 42

<210> SEQ ID No: 16<211> Comprimento: 38<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Oligo iniciador para protease c9<400> Seqüência: 16

cgactcgaga aagaaattta tctgcctttg agcaatgg 38

<210> SEQ ID No: 17<211> Comprimento: 39<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Oligo iniciador reverso para protease c9<400> Seqüência: 17

cctatattag cggccgccta caacttgggg taagagttc 39

<210> SEQ ID No: 18<211> Comprimento: 9<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência artificial s<220> Características:

<223> Outras informações: fragmento N-terminal da beta-caseina<400> Seqüência: 18

Arg Glu Leu Glu Glu Leu Asn Val Pro1 5

<210> SEQ ID No: 19<211> Comprimento: 4<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio Proteolítico<400> Seqüência: 19

Leu Leu Gln Ser<210> SEQ ID No: 20<211> Comprimento: 4<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Sitio Proteolitico

<400> Seqüência: 20

Leu Asp Gln Ser1

<210> SEQ ID No: 21<211> Comprimento:4<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio Proteolítico

<400> Seqüência: 21

Phe Arg Arg Gly1

<210> SEQ ID No: 22<211> Comprimento: 5<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio Proteolítico

<400> Seqüência: 22

Phe Arg Ser Arg Gly1 5

<210> SEQ ID No: 23<211> Comprimento: 8<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: Sítio Proteolítico

<400> Seqüência: 23

Phe Arg Arg Gly Phe Arg Arg Gly1 5

<210> SEQ ID No: 24<211> Comprimento: 2433<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: gene Cry8Bbl modificado (Cry8Bbl-K05)<400> Seqüência: 24

atgagtccaa ataatcaaaa tgaatatgaa attatagatg cgacaccttc tacttctgta 60

tccaatgatt ctaacagata cccttttgcg aatgagccaa caaatgcgct acaaaatatg 120

gattataaag attatttaaa aatgtctgcg ggaaatgcta gtgaataccc tggttcacct 180

gaagtacttg ttagcggaca agatgcagct aaggccgcaa ttgatatagt aggtaaatta 240

ctatcaggtt taggggtccc atttgttggg ccgatagtga gtctttatac tcaacttatt 300

gatattctgt ggccttcagg ggaaaagagt caatgggaaa tttttatgga acaagtagaa 360

gaactcatta atcaaaaaat agcagaatat gcaaggaata aagcgctttc ggaattagaa 420

ggattaggta ataattacca attatatcta actgcgcttg aagaatggga agaaaatcca 480

tttcgacgag gttttcgacg aggtgcctta cgagatgtgc gaaatcgatt tgaaatcctg 540

gatagtttat ttacgcaata tatgccatct tttagagtga caaattttga agtaccattc 600

cttactgtat atgcaatggc agccaacctt catttactgt tattaaagga cgcgtcaatt 660

tttggagaag aatggggatg gtcaacaact actattaata actattatga tcgtcaaatg 720

aaacttactg cagaatattc tgatcactgt gtaaagtggt atgaaactgg tttagcaaaa 780

ttaaaaggca cgagcgctaa acaatgggtt gactataacc aattccgtag agaaatgaca 840

ctggcggttt tagatgttgt tgcattattc ccaaattatg acacacgcac gtacccaatg 900

gaaacgaaag cacaactaac aagggaagta tatacagatc cactgggcgc ggtaaacgtg 960

tcttcaattg gttcctggta tgacaaagca ccttctttcg gagtgataga atcatccgtt 1020

attcgaccac cccatgtatt tgattatata acgggactca cagtgtatac acaatcaaga 1080

agcatttctt ccgctcgcta tataagacat tgggctggtc atcaaataag ctaccatcgt 1140

gtcagtaggg gtagtaatct tcaacaaatg tatggaacta atcaaaatct acacagcact 1200

agtacctttg attttacgaa ttatgatatt tacaagactc tatcaaagga tgcagtactc 1260

cttgatattg tttaccctgg ttatacgtat atattttttg gaatgccaga agtcgagttt 1320

ttcatggtaa accaattgaa taataccaga aagacgttaa agtataatcc agtttccaaa 1380

gatattatag cgagtacaag agattcggaa ttagaattac ctccagaaac ttcagatcaa 1440

ccaaattatg agtcatatag ccatagatta tgtcatatca caagtattcc cgcgacgggt 1500

aacactaccg gattagtacc tgtattttct tggacacatc gaagtgcaga tttaaacaat 1560

acaatatatt cagataaaat cactcaaatt ccggccgtta aatgttggga taatttaccg 1620

tttgttccag tggtaaaagg accaggacat acaggagggg atttattaca gtataataga 1680

agtactggtt ctgtaggaac cttatttcta gctcgatatg gcctagcatt agaaaaagca 1740

gggaaatatc gtgtaagact gagatatgct actgatgcag atattgtatt gcatgtaaac 1800gatgctcaga ttcagatgcc aaaaacaatg aacccaggtg aggatctgac atctaaaact 1860

tttaaagttg cagatgctat cacaacagta aatttagcaa cagatagttc ggtagcagtg 1920

aaacataatg taggtgaaga ccctaattca acagtatctg gtatagttta cgttgaccga 1980

atcgaattca tcccagtaga tgagacatat gaagcggaag cagcgaagtt tcgacgtggt 2040

tttcgacgtg gtaaagcagt gaatgccttg tttacgaata caaaagatgg cttacgacca 2100ggcgtaacgg attatgaagt gaatcaagcg gcaaacttag tggaatgcct atcggatgat 2160

ttgtatccaa atgaaaaacg attgttattt gatgcagtga gagaggcaaa acgcctcagt 2220

gaggcacgta atttgcttca agatccagat ttccaagaga taaatggaga aaatggctgg 2280acggcaagta cgggaattga ggttatagaa ggggatgctt tattcaaagg gcgttatcta 2340cgcctaccag gtgcgagaga aatagatacg gaaacgtatc caacgtatct gtatcaaaaa 2400gtagaggaag gtgtattaaa accatagctc gag 2433

<210> SEQ ID No: 25<211> Comprimento: 786<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: polipeptídeo Cry8Bbl modificado (Cry8Bbl-K05)

<400> Seqüência: 25Met Ser Pro Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Thr Pro

1 5 10 15

Ser Thr Ser Val Ser Asn Asp Ser Asn Arg Tyr Pro Phe Ala Asn Glu

20 25 30

Pro Thr Asn Ala Leu Gln Asn Met Asp Tyr Lys Asp Tyr Leu Lys Met

35 40 45

Ser Ala Gly Asn Ala Ser Glu Tyr Pro Gly Ser Pro Glu Val Leu Val

50 55 60

Ser Gly Gln Asp Ala Ala Lys Ala Ala Ile Asp Ile Val Gly Lys Leu65 70 75 80

Leu Ser Gly Leu Gly Val Pro Phe Val Gly Pro Ile Val Ser Leu Tyr

85 90 95

Thr Gln Leu Ile Asp Ile Leu Trp Pro Ser Gly Glu Lys Ser Gln Trp

100 105 110

Glu Ile Phe Met Glu Gln Val Glu Glu Leu Ile Asn Gln Lys Ile Ala

115 120 125

Glu Tyr Ala Arg Asn Lys Ala Leu Ser Glu Leu Glu Gly Leu Gly Asn

130 135 140

Asn Tyr Gln Leu Tyr Leu Thr Ala Leu Glu Glu Trp Glu Glu Asn Pro145 150 155 160

Phe Arg Arg Gly Phe Arg Arg Gly Ala Leu Arg Asp Val Arg Asn Arg

165 170 175

Phe Glu Ile Leu Asp Ser Leu Phe Thr Gln Tyr Met Pro Ser Phe Arg

180 185 190

Val Thr Asn Phe Glu Val Pro Phe Leu Thr Val Tyr Ala Met Ala Ala

195 200 205

Asn Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Ile Phe Gly Glu Glu

210 215 220

Trp Gly Trp Ser Thr Thr Thr Ile Asn Asn Tyr Tyr Asp Arg Gln Met225 230 235 240

Lys Leu Thr Ala Glu Tyr Ser Asp His Cys Val Lys Trp Tyr Glu Thr

245 250 255

Gly Leu Ala Lys Leu Lys Gly Thr Ser Ala Lys Gln Trp Val Asp Tyr

260 265 270

Asn Gln Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu Ala Val Leu Asp Val Val Ala

275 280 285

Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Thr Arg Thr Tyr Pro Met Glu Thr Lys Ala

290 295 300

Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Gly Ala Val Asn Val305 310 315 320

Ser Ser Ile Gly Ser Trp Tyr Asp Lys Ala Pro Ser Phe Gly Val Ile

325 330 335

Glu Ser Ser Val Ile Arg Pro Pro His Val Phe Asp Tyr Ile Thr Gly

340 345 350

Leu Thr Val Tyr Thr Gln Ser Arg Ser Ile Ser Ser Ala Arg Tyr Ile

355 360 365

Arg His Trp Ala Gly His Gln Ile Ser Tyr His Arg Val Ser Arg Gly

370 375 380

Ser Asn Leu Gln Gln Met Tyr Gly Thr Asn Gln Asn Leu His Ser Thr385 390 395 400

Ser Thr Phe Asp Phe Thr Asn Tyr Asp Ile Tyr Lys Thr Leu Ser Lys

405 410 415

Asp Ala Val Leu Leu Asp Ile Val Tyr Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Phe

420 425 430

Phe Gly Met Pro Glu Val Glu Phe Phe Met Val Asn Gln Leu Asn Asn

435 440 445

Thr Arg Lys Thr Leu Lys Tyr Asn Pro Val Ser Lys Asp Ile Ile Ala

450 455 460

Ser Thr Arg Asp Ser Glu Leu Glu Leu Pro Pro Glu Thr Ser Asp Gln465 470 475 480

Pro Asn Tyr Glu Ser Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ile Thr Ser Ile485 490 495 Pro Ala Thr Gly Asn Thr Thr Gly Leu Val Pro Val Phe Ser Trp Thr 500 505 510 His Arg Ser Ala Asp Leu Asn Asn Thr Ile Tyr Ser Asp Lys Ile Thr 515 520 525 Gln Ile Pro Ala Val Lys Cys Trp Asp Asn Leu Pro Phe Val Pro Val 530 535 540 Val Lys Gly Pro Gly His Thr Gly Gly Asp Leu Leu Gln Tyr Asn Arg545 550 555 560Ser Thr Gly Ser Val Gly Thr Leu Phe Leu Ala Arg Tyr Gly Leu Ala 565 570 575 Leu Glu Lys Ala Gly Lys Tyr Arg Val Arg Leu Arg Tyr Ala Thr Asp 580 585 590 Ala Asp Ile Val Leu His Val Asn Asp Ala Gln Ile Gln Met Pro Lys 595 600 605 Thr Met Asn Pro Gly Glu Asp Leu Thr Ser Lys Thr Phe Lys Val Ala 610 615 620 Asp Ala Ile Thr Thr Val Asn Leu Ala Thr Asp Ser Ser Val Ala Val625 630 635 640Lys His Asn Val Gly Glu Asp Pro Asn Ser Thr Val Ser Gly Ile Val 645 650 655 Tyr Val Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Asp Glu Thr Tyr Glu Ala 660 665 670 Glu Gln Asp Leu Glu Ala Ala Lys Phe Arg Arg Gly Phe Arg Arg Gly 675 680 685 Lys Ala Val Asn Ala Leu Phe Thr Asn Thr Lys Asp Gly Leu Arg Pro 690 695 700 Gly Val Thr Asp Tyr Glu Val Asn Gln Ala Ala Asn Leu Val Glu Cys705 710 715 720Leu Ser Asp Asp Leu Tyr Pro Asn Glu Lys Arg Leu Leu Phe Asp Ala 725 730 735 Val Arg Glu Ala Lys Arg Leu Ser Glu Ala Arg Asn Leu Leu Gln Asp 740 745 750 Pro Asp Phe Gln Glu Ile Asn Gly Glu Asn Gly Trp Thr Ala Ser Thr 755 760 765 Gly Ile Glu Val Ile Glu Gly Asp Ala Leu Phe Lys Gly Arg Tyr Leu 770 775 780 Arg Leu 785

<210> SEQ ID No: 26<211> Comprimento: 2399<212> Tipo: DNA

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: gene Cry8Bbl modificado (Cry8Bbl-ISC-l)<400> Seqüência: 26

ccggatccgc catggccccg aacaaccaga acgagtacga gatcatcgac gccaccccga 60gcaccagcgt gagcaacgac agcaaccgct acccgttcgc caacgagccg accaacgccc 120tgcagaacat ggactacaag gactacctca agatgagcgc cggcaacgcc agcgagtacc 180cgggcagccc ggaggtgctg gtgagcggcc aggacgccgc caaggccgcc atcgacatcg 240tgggcaagct cctgagcggc ctcggcgtgc cgttcgtggg cccgatcgtg agcctgtaca 300cccagctcat cgacatcctg tggccgagcg gcgagaagag ccagtgggag atcttcatgg 360agcaggtgga ggaactgatc aaccagaaga tcgcggaata cgcgcgcaat aaggcgctgt 420cggaactgga aggcctgggc aataattacc agctgtacct gaccgcgctg gaagagtggg 480aagagaatcc gctgtcgcag tcgctgtcgc agagcgcgct ggtggacgtg cgcaatcgct 540tcgaaatcct ggactcgctg ttcacccagt acatgccctc cttccgcgtg accaatttcg 600aagtgccgttacgcgtctataccgccagatgcctggccaagcgaaatgaccctatccgatccgttaatgtagtcgtccgtcccaatctcgcgtatcatcgtgcactcaacacgccgtcctaagtcgagttctgtctcgaacctcagatcactgccacaggatctgaacaaataacctgccagtacaaccgtagagaaagctccacgtaaacgtcgaagacctgtcgcggtacgtcgaccgaggcggctaaacacgaaggatcgtggagtgttcgggaggcagatcaacggctctgttcaa

cctgacggtgcttcggcgaagaagctgacggctgaagggcgctcgccgtgggaaacgaaacagcagcatctattcgcccgctcaattagtcgtctcccggcagtaccttcgctcgatatacttcatggtcagatattataaccaaactaccaacactacccacaatctacattcgtgcctgagtacgggccggcaagtaccgacgcacagattcaaggtccaagcacaaccatcgagttcgttccggaggcgggctgcgacttgtcggaccaagaggttgtgagaacggcgggtagatac

tatgcgatgggaatggggctgcggaatataacgagcgcgactggatgtgggcccaactgaggcagctggtccgcatgtctagcgcccggtggctctaatcgacttcaccagtctaccccgaatcagctgagcctccactcgagagttacaggcttagtcctcagataagagtggtgaaggagcgtcgggaagagtgcgtcattcagatgcgccgacgcgagtgggggaggatcccggtggggtttcagaccccggagtaagacctttacctccgaggcgatggactgcttcttagacttt

cggcgaatctggtcaacgacgtgaccactgaacagtgggttggccttgttcccgcgaagtatgataaagctcgattatatatatacggcatgcaacaaatattacgatatgctacacctaataacacgcggcgattctgagccatcgcctcggtcttctctcactcagatgcccggggcacattgtttcttgcgatacgcccaagaccatttactaccgtaccctaactcacgagacttagtggcaaggccagactacgacaaacgagaagaaaccttctctactgggataggtcatgag

gcacctgctggacgatcaatcgtgaagtggggattataatcccgaattatttataccgatcccgagcttctaccggcttgttgggccggcgtatgggaccctacaagacccatcttcttccaagacactggctcgagcttatgccacatcctggacgcactcccgccgtccaccggaggttgcccgctacgactgatgctgaacccaggccaaccttgctaacagttagccgaggccgagagtcaacgccggtcaaccaggcgcctgctcgcaggaccctcgaggtaatctcatgagtca

ctgctgaaggaattattatgtatgaaacggcaattccgccgatacgcgcaccgctcggcgggcgtgatcgaccgtctatacatcaaatataatcagaatcctgagcaaaggggatgccagaaatacaatcccgcccgagaacgtcgatcccgctctgccgaaatgttggggacctgctccggactagcctgacattgttcgaggacttgaacggactcctggaattgtatcaggacctagttattcaccagcggctaaccttcgacgcaggacttccagggagggagatggttaactag

660720780840900960102010801140120012601320138014401500156016201680174018001860192019802040210021602220228023402399

<210> SEQ ID No: 27<211> Comprimento: 786<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: polipeptídeo Cry8Bbl modificado (Cry8Bbl-ISC-<400> Seqüência: 27

Met Ser Pro Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Thr Pro1 5 10 15 Ser Thr Ser Val Ser Asn Asp Ser Asn Arg Tyr Pro Phe Ala Asn Glu 20 25 30 Pro Thr Asn Ala Leu Gln Asn Met Asp Tyr Lys Asp Tyr Leu Lys Met 35 40 45 Ser Ala Gly Asn Ala Ser Glu Tyr Pro Gly Ser Pro Glu Val Leu Val 50 55 60 Ser Gly Gln Asp Ala Ala Lys Ala Ala Ile Asp Ile Val Gly Lys Leu65 70 75 80Leu Ser Gly Leu Gly Val Pro Phe Val Gly Pro Ile Val Ser Leu Tyr 85 90 95 Thr Gln Leu Ile Asp Ile Leu Trp Pro Ser Gly Glu Lys Ser Gln Trp 100 105 110 Glu Ile Phe Met Glu Gln Val Glu Glu Leu Ile Asn Gln Lys Ile Ala 115 120 125 Glu Tyr Ala Arg Asn Lys Ala Leu Ser Glu Leu Glu Gly Leu Gly Asn 130 135 140 Asn Tyr Gln Leu Tyr Leu Thr Ala Leu Glu Glu Trp Glu Glu Asn Pro145 150 155 160

Leu Ser Gln Ser Leu Ser Gln Ser Ala Leu Arg Asp Val Arg Asn Arg

165 170 175

Phe Glu Ile Leu Asp Ser Leu Phe Thr Gln Tyr Met Pro Ser Phe Arg

180 185 190

Val Thr Asn Phe Glu Val Pro Phe Leu Thr Val Tyr Ala Met Ala Ala

195 200 205

Asn Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Ile Phe Gly Glu Glu

210 215 220

Trp Gly Trp Ser Thr Thr Thr Ile Asn Asn Tyr Tyr Asp Arg Gln Met225 230 235 240

Lys Leu Thr Ala Glu Tyr Ser Asp His Cys Val Lys Trp Tyr Glu Thr

245 250 255

Gly Leu Ala Lys Leu Lys Gly Thr Ser Ala Lys Gln Trp Val Asp Tyr

260 265 270

Asn Gln Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu Ala Val Leu Asp Val Val Ala

275 280 285

Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Thr Arg Thr Tyr Pro Met Glu Thr Lys Ala

290 295 300

Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Gly Ala Val Asn Val305 310 315 320

Ser Ser Ile Gly Ser Trp Tyr Asp Lys Ala Pro Ser Phe Gly Val Ile

325 330 335

Glu Ser Ser Val Ile Arg Pro Pro His Val Phe Asp Tyr Ile Thr Gly

340 345 350

Leu Thr Val Tyr Thr Gln Ser Arg Ser Ile Ser Ser Ala Arg Tyr Ile

355 360 365

Arg His Trp Ala Gly His Gln Ile Ser Tyr His Arg Val Ser Arg Gly

370 375 380

Ser Asn Leu Gln Gln Met Tyr Gly Thr Asn Gln Asn Leu His Ser Thr385 390 395 400

Ser Thr Phe Asp Phe Thr Asn Tyr Asp Ile Tyr Lys Thr Leu Ser Lys

405 410 415

Asp Ala Val Leu Leu Asp Ile Val Tyr Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Phe

420 425 430

Phe Gly Met Pro Glu Val Glu Phe Phe Met Val Asn Gln Leu Asn Asn

435 440 445

Thr Arg Lys Thr Leu Lys Tyr Asn Pro Val Ser Lys Asp Ile Ile Ala

450 455 460

Ser Thr Arg Asp Ser Glu Leu Glu Leu Pro Pro Glu Thr Ser Asp Gln465 470 475 480

Pro Asn Tyr Glu Ser Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ile Thr Ser Ile

485 490 495

Pro Ala Thr Gly Asn Thr Thr Gly Leu Val Pro Val Phe Ser Trp Thr

500 505 510

His Arg Ser Ala Asp Leu Asn Asn Thr Ile Tyr Ser Asp Lys Ile Thr

515 520 525

Gln Ile Pro Ala Val Lys Cys Trp Asp Asn Leu Pro Phe Val Pro Val

530 535 540

Val Lys Gly Pro Gly His Thr Gly Gly Asp Leu Leu Gln Tyr Asn Arg545 550 " 555 560

Ser Thr Gly Ser Val Gly Thr Leu Phe Leu Ala Arg Tyr Gly Leu Ala

565 570 575

Leu Glu Lys Ala Gly Lys Tyr Arg Val Arg Leu Arg Tyr Ala Thr Asp

580 585 590

Ala Asp Ile Val Leu His Val Asn Asp Ala Gln Ile Gln Met Pro Lys

595 600 605

Thr Met Asn Pro Gly Glu Asp Leu Thr Ser Lys Thr Phe Lys Val Ala

610 615 620

Asp Ala Ile Thr Thr Val Asn Leu Ala Thr Asp Ser Ser Val Ala Val625 630 635 640Lys His Asn Val Gly 645 Glu Asp Pro Asn Ser 650 Thr Val Ser Gly Ile 655 ValTyr Val Asp Arg 660 Ile Glu Phe Ile Pro 665 Val Asp Glu Thr Tyr 670 Glu AlaGlu Gln Asp 675 Leu Glu Ala Ala Lys 680 Phe Arg Arg Gly Phe 685 Arg Arg GlyLys Ala 690 Val Asn Ala Leu Phe 695 Thr Asn Thr Lys Asp 700 Gly Leu Arg ProGly Val Thr Asp Tyr Glu Val Asn Gln Ala Ala Asn Leu Val Glu Cys705 710 715 720Leu Ser Asp Asp Leu 725 Tyr Pro Asn Glu Lys 730 Arg Leu Leu Phe Asp 735 AlaVal Arg Glu Ala 740 Lys Arg Leu Ser Glu 745 Ala Arg Asn Leu Leu 750 Gln AspPro Asp Phe 755 Gln Glu Ile Asn Gly 760 Glu Asn Gly Trp Thr 765 Ala Ser ThrGly Ile 770 Glu Val Ile Glu Gly 775 Asp Ala Leu Phe Lys 780 Gly Arg Tyr LeuArg Leu 785

<210> SEQ ID No: 28<211> Comprimento: 673<212> Tipo: PRT

<213> Organismo: Seqüência artificial<220> Características:

<223> Outras informações: gene Cry8Bbl modificado (Cry8Bbl-K04)<400> Seqüência: 28

Met Ser Pro Asn Asn Gln Asn Glu Tyr Glu Ile Ile Asp Ala Thr Pro1 5 10 15 Ser Thr Ser Val Ser Asn Asp Ser Asn Arg Tyr Pro Phe Ala Asn Glu 20 25 30 Pro Thr Asn Ala Leu Gln Asn Met Asp Tyr Lys Asp Tyr Leu Lys Met 35 40 45 Ser Ala Gly Asn Ala Ser Glu Tyr Pro Gly Ser Pro Glu Val Leu Val 50 55 60 Ser Gly Gln Asp Ala Ala Lys Ala Ala Ile Asp Ile Val Gly Lys Leu65 70 75 80Leu Ser Gly Leu Gly Val Pro Phe Val Gly Pro Ile Val Ser Leu Tyr 85 90 95 Thr Gln Leu Ile Asp Ile Leu Trp Pro Ser Gly Glu Lys Ser Gln Trp 100 105 110 Glu Ile Phe Met Glu Gln Val Glu Glu Leu Ile Asn Gln Lys Ile Ala 115 120 125 Glu Tyr Ala Arg Asn Lys Ala Leu Ser Glu Leu Glu Gly Leu Gly Asn 130 135 140 Asn Tyr Gln Leu Tyr Leu Thr Ala Leu Glu Glu Trp Glu Glu Asn Pro145 150 155 160Phe Arg Arg Gly Phe Arg Arg Gly Ala Leu Arg Asp Val Arg Asn Arg 165 170 175 Phe Glu Ile Leu Asp Ser Leu Phe Thr Gln Tyr Met Pro Ser Phe Arg 180 185 190 Val Thr Asn Phe Glu Val Pro Phe Leu Thr Val Tyr Ala Met Ala Ala 195 200 205 Asn Leu His Leu Leu Leu Leu Lys Asp Ala Ser Ile Phe Gly Glu Glu 210 215 220 Trp Gly Trp Ser Thr Thr Thr Ile Asn Asn Tyr Tyr Asp Arg Gln Met225 230 235 240

Lys Leu Thr Ala Glu Tyr Ser Asp His Cys Val Lys Trp Tyr Glu Thr

245 250 255

Gly Leu Ala Lys Leu Lys Gly Thr Ser Ala Lys Gln Trp Val Asp Tyr

260 265 270

Asn Gln Phe Arg Arg Glu Met Thr Leu Ala Val Leu Asp Val Val Ala

275 280 285

Leu Phe Pro Asn Tyr Asp Thr Arg Thr Tyr Pro Met Glu Thr Lys Ala

290 295 300

Gln Leu Thr Arg Glu Val Tyr Thr Asp Pro Leu Gly Ala Val Asn Val305 310 315 320

Ser Ser Ile Gly Ser Trp Tyr Asp Lys Ala Pro Ser Phe Gly Val Ile

325 330 335

Glu Ser Ser Val Ile Arg Pro Pro His Val Phe Asp Tyr Ile Thr Gly

340 345 350

Leu Thr Val Tyr Thr Gln Ser Arg Ser Ile Ser Ser Ala Arg Tyr Ile

355 360 365

Arg His Trp Ala Gly His Gln Ile Ser Tyr His Arg Val Ser Arg Gly

370 375 380

Ser Asn Leu Gln Gln Met Tyr Gly Thr Asn Gln Asn Leu His Ser Thr385 390 395 400

Ser Thr Phe Asp Phe Thr Asn Tyr Asp Ile Tyr Lys Thr Leu Ser Lys

405 410 415

Asp Ala Val Leu Leu Asp Ile Val Tyr Pro Gly Tyr Thr Tyr Ile Phe

420 425 430

Phe Gly Met Pro Glu Val Glu Phe Phe Met Val Asn Gln Leu Asn Asn

435 440 445

Thr Arg Lys Thr Leu Lys Tyr Asn Pro Val Ser Lys Asp Ile Ile Ala

450 455 460

Ser Thr Arg Asp Ser Glu Leu Glu Leu Pro Pro Glu Thr Ser Asp Gln465 470 475 480

Pro Asn Tyr Glu Ser Tyr Ser His Arg Leu Cys His Ile Thr Ser Ile

485 490 495

Pro Ala Thr Gly Asn Thr Thr Gly Leu Val Pro Val Phe Ser Trp Thr

500 505 510

His Arg Ser Ala Asp Leu Asn Asn Thr Ile Tyr Ser Asp Lys Ile Thr

515 520 525

Gln Ile Pro Ala Val Lys Cys Trp Asp Asn Leu Pro Phe Val Pro Val

530 535 540

Val Lys Gly Pro Gly His Thr Gly Gly Asp Leu Leu Gln Tyr Asn Arg545 550 555 560

Ser Thr Gly Ser Val Gly Thr Leu Phe Leu Ala Arg Tyr Gly Leu Ala

565 570 575

Leu Glu Lys Ala Gly Lys Tyr Arg Val Arg Leu Arg Tyr Ala Thr Asp

580 585 590

Ala Asp Ile Val Leu His Val Asn Asp Ala Gln Ile Gln Met Pro Lys

595 600 605

Thr Met Asn Pro Gly Glu Asp Leu Thr Ser Lys Thr Phe Lys Val Ala

610 615 620

Asp Ala Ile Thr Thr Val Asn Leu Ala Thr Asp Ser Ser Val Ala Val625 630 635 640

Lys His Asn Val Gly Glu Asp Pro Asn Ser Thr Leu Ser Gly Ile Val

645 650 655

Tyr Val Asp Arg Ile Glu Phe Ile Pro Val Asp Glu Thr Tyr Glu Ala660 665 670

Glu

Claims (26)

1. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelofato de que compreende uma seqüência de nucleotídeos quecodifica uma protoxina para inseto, onde a referidaprotoxina para inseto apresenta pelo menos um sitio deativação proteolitica que foi construída para compreenderum sítio de clivagem que é sensível a uma proteasedigestiva de inseto, e no qual a clivagem da referidaprotoxina para inseto pela protease digestiva do insetoproduz uma toxina ativa para inseto.

2. Molécula de ácido nucléico de acordo com areivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a referidatoxina ativa para inseto é uma toxina de Bacillusthuringiensis ou um fragmento desta, onde a referidavariante e o referido fragmento apresentam atividadepesticida e a referida variante tem pelo menos 80% deidentidade e. seqüência com a seqüência de aminoácido dareferida toxina de Bacillus thuringiensis.

3. Molécula de ácido nucléico de acordo com areivindicação 2, caracterizada pelo fato de que a referidatoxina de Bacillus thuringiensis é uma toxina Cry8 ou umavariante ou fragmento desta, onde a referida variante e oreferido fragmento têm atividade pesticida e a referidavariante apresenta pelo menos 80% de identidade deseqüência com uma seqüência de aminoácido para a referidatoxina, Cry8.

4. Cassete de expressão caracterizado por compreender umaseqüência de nucleotídeo de acordo com a reivindicação 1operacionalmente ligada a um promotor que conduz aexpressão em uma planta.

5. Método para proteger uma planta de uma praga deinseto, caracterizado pelo fato de que compreendeintroduzir na referida planta pelo menos uma construção depolinücleotídeo que compreende uma seqüência de nucleotídeoda reivindicação 1 operacionalmente ligada a um promotorque conduz a expressão na referida planta, na qual areferida praga de inseto ingere a referida planta e areferida protoxina para inseto, e onde a clivagem dareferida protoxina para inseto pela referida proteasedigestiva de inseto produz uma toxina ativa contra insetono sistema digestivo da referida praga de inseto.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que a referida protoxina para inseto tematividade pesticida aumentada em relação a uma protoxinapara inseto que não apresenta pelo menos um referido sítiode ativação proteolítico.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o referido sítio de ativação proteolíticaainda estabiliza a referida protoxina para inseto naplanta.

8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que a referida praga de inseto é selecionada apartir do grupo consistindo de besouro da batata doColorado, larva do milho do oeste, larva do milho do sul,larva do milho do norte, e bicudo do algodoeiro.

9. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que a referida planta é uma monocotiledônea.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que a referida monocotiledônea é milho.

11. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que a referida planta é uma dicotiledônea.

12. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que o referido promotor é um promotor raiz-preferencial.

13. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo fato de que a referida protease digestiva de inseto éuma protease cisteína.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizadopelo fato de que a referida protease cisteína é umaprotease do tipo catepsina L.

15. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizadopelo ^fato de que a referida protoxina para insetocompreende pelo menos um sítio de ativação proteolíticaconstruído, compreendendo uma seqüência de aminoácidoselecionada a partir do grupo consistindo de LXQS (SEQ IDNO:1), LSQS (SEQ ID NO:2), LXQSLXQS(SEQ ID NO:3), eLSQSLSQS (SEQ ID NO:4).

16. Método para obtenção de uma planta transformadacaracterizado por compreender:- transformar, de maneira estável, uma célula vegetalcom pelo menos um construto de polinucleotídeo quecompreende a seqüência de nucleotídeo da reivindicação 1 operacionalmente ligada a um promotor'que conduz aexpressão na referida planta;- cultivar a referida célula vegetal transformada sobcondições de crescimento vegetal; e- regenerar uma planta transformada.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizadopelo fato de que a referida construção de polinucleotídeo éestavelmente incorporada ao genoma da planta.

18. Protoxina para inseto isolada, caracterizada pelo fatode que compreende uma seqüência de aminoácido codificadapela molécula de ácido nucléico da reivindicação 1.

19. Composição, caracterizada pelo fato de que compreendepelo menos uma protoxina para inseto de acordo com areivindicação 18 em combinação com um veículo.

20. Método para impactar uma praga de inseto,caracterizado pelo fato de que compreende aplicar acomposição de acordo com a reivindicação 19 no ambienteda referida praga de inseto através de um procedimentoselecionado de um grupo consistindo de vaporizar,pulverizar, difundir e encobrir semente.

21. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizadapelo fato de que compreende uma seqüência de nucleotídeocodificando uma toxina para inseto, onde a referidatoxina para inseto tem pelo menos um sítio de ativaçãoproteolítica que foi construído para compreender umsítio de clivagem que é sensível a uma proteasedigestiva de inseto, e onde a clivagem da referidatoxina para inseto pela referida protease digestiva deinseto produz uma toxina de inseto com atividadepesticida aumentada em relação a toxina de inseto quenão apresenta o referido sítio de ativação proteolítica.

22. Método para proteger uma planta de uma praga deinseto, caracterizado pelo fato de que o referido métodocompreende introduzir na referida planta pelo menos umaconstrução de polinucleotídeo que compreende umaseqüência de nucleotídeo da reivindicação 21operacionalmente ligada a um promotor que conduz aexpressão na referida planta, no qual a referida toxinapara -inseto modificada tem pelo menos um sítio deativação proteolítica que foi construído paracompreender um sítio de clivagem que é sensível aprotease digestiva de inseto que está presente dentro dosistema digestivo de uma praga de inseto, no qual aexpressão da construção do referido polinucleotídeoproduz a referida toxina de inseto na referida planta,onde a referida praga de inseto ingere a referida plantae a referida toxina para inseto, e onde a clivagem dareferida toxina para inseto pela referida proteasedigestiva de inseto produz uma toxina de inseto nosistema digestivo da referida praga de inseto comatividade pesticida aumentada em relação a toxina deinseto que não apresenta o referido sítio de ativaçãoproteolítica.

23. Método para obtenção de uma planta transformadacaracterizado por compreender:transformar, de maneira estável, uma célulavegetal com pelo menos uma construção depolinucleotídeo que compreende a seqüência denucleotídeo da reivindicação 21 operacionalmenteligada a um promotor que conduz a expressão nareferida planta em que a toxina para inseto terpelo menos um sítio de ativação proteolíticaconstruído para compreender um sítio de clivagemque é sensível à uma protease digestiva de inseto,e onde a clivagem da referida toxina para insetopela protease digestiva de inseto produz uma toxinapara inseto com atividade pesticida aumentada emrelação a toxina para inseto que não apresenta osítio de ativação proteolítica;- cultivar a referida célula vegetal transformada sobcondições de crescimento vegetal; e- regenerar uma planta transformada.

24. Protoxina para inseto isolada, caracterizada porcompreender uma seqüência de aminoácido codificada pelamolécula de ácido nucléico da reivindicação 21.

25. Molécula de ácido nucléico isolada, caracterizada pelofato de que compreende uma seqüência de nucleotídeo quecodifica um polipeptideo tendo atividade proteolítica, naqual a referida seqüência de nucleotídeo é selecionada deum grupo consistindo de:i) Uma seqüência de nucleotídeo definida em SEQ IDNO: 8 ;ii) Uma seqüência de nucleotídeo apresentando pelomenos 80% de identidade de seqüência com SEQ IDNO: 8 ;iii) Uma seqüência de aminoácido codificando aseqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 9;iv) Uma seqüência de nucleotídeo codificando aseqüência de aminoácido de um peptídeoapresentando pelo menos 80% de identidade deseqüência com SEQ ID NO: 9;v) uma seqüência de nucleotídeo compreendendo pelomenos 2 5 nucleotídeos contíguos da seqüência denucleotídeo definido em SEQ ID NO:8;vi) Uma seqüência de nucleotídeo complementar parapelo menos uma seqüência de nucleotídeo definidaem (i) até (v).

26. polipeptídeo isolado apresentando atividadeproteolítica, caracterizado pelo fato de que o referidopolipeptídeo tem uma seqüência de aminoácido selecionada apartir do grupo consistindo de:i) Seqüência de aminoácido definida em SEQ ID NO: 9;ii) Uma seqüência de aminoácido apresentando pelomenos 80% de identidade de seqüência comseqüência de aminoácido definida em SEQ ID NO: 9;iii) Uma seqüência de aminoácido tendo pelo menos 25aminoácidos contíguos da seqüência de aminoácidodefinida em SEQ ID NO:9;iv) Uma seqüência de aminoácido codificada por umaseqüência de nucleotídeo de acordo com areivindicação 25.