MX2007015538A

MX2007015538A - Secuencias de reconocimiento de proteasas especificas para insectos.

Info

Publication number: MX2007015538A
Application number: MX2007015538A
Authority: MX
Inventors: Billy F Mccutchen; Rafael Herrmann; Albert L Lu; Andre R Abad; Ronald D Flannagan; Gary C Chun; Janet A Rice; Eric J Schepers
Original assignee: Pionner Hi Bred International
Priority date: 2005-06-08
Filing date: 2006-06-06
Publication date: 2008-03-06
Also published as: CA2611539A1; AR053403A1; EP1893638A2; US20060288448A1; WO2006133182A2; WO2006133182A3; BRPI0611681B1; US7473821B2; BRPI0611681A2; EP1893638B1; CA2611539C; ATE519778T1

Abstract

Composiciones y metodos para proteger a una planta contra una plaga de insecto. Se proveen moleculas de acido nucleico que codifican protoxinas de insecto o toxinas de insecto modificadas para comprender al menos un sitio de activacion proteolitico que es sensible a una proteasa de intestino de insecto. El clivaje de la protoxina de insecto modificada en el sitio de activacion proteolitico por una proteasa de intestino de insecto produce una toxina de insecto activa en el intestino de la plaga de insecto. El clivaje de la toxina de insecto modificada de la invencion en un sitio de activacion proteolitico da como resultado la produccion de una toxina de insecto activa en el intestino del insecto que presenta una mayor actividad. pesticida con relacion a la toxina de insecto que no contiene al sitio de activacion proteolitico. Se proveen metodos para usar las secuencias de acidos nucleicos y los polipeptidos codificados por las mismas de la protoxina de insecto modificada y toxina de insecto modificada para proteger a una planta contra una plaga de insecto. Realizaciones particulares de la invencion proveen ademas composiciones y formulaciones, casetes de expresion y plantas transformadas, celulas vegetales y semillas con la protoxina de insecto modificada y la toxina de insecto modificada. Tambien se describen en la presente proteasas intestinales de insectos y las moleculas de acido nucleico que codifican a las mismas.

Description

SECUENCIAS DE RECONOCIMIENTO DE PROTEASAS ESPECÍFICAS PARA INSECTOS REFERENCIA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 60/688.635, presentada el 8 de junio, 2005 y la Solicitud Provisional de Patente de EE.UU. N°: 60/722.787, presentada el 30 de septiembre, 2005, cuyos contenidos se incorporan por completo en la presente a modo de referencia. CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con los campos de la biología molecular vegetal y el control de plagas en plantas. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las plagas de insectos constituyen un factor importante en la pérdida de los cultivos principales de todo el mundo. Por ejemplo, los daños ocasionados por los gusanos de la raíz de maíz alimentándose o los daños por picudo del algodón pueden ser económicamente devastadores para los productores agronómicos. La pérdida de cultivos relacionada con insectos debida solamente a los gusanos de la raíz de maíz ha alcanzado los mil millones de dólares estadounidenses por año. Tradicionalmente, los métodos primarios para afectar las poblaciones de plagas de insectos, tales como poblaciones de gusanos de la raíz de maíz, comprenden rotación de cultivos y la aplicación de pesticidas químicos sintéticos de amplio espectro. Sin embargo, los consumidores y las regulaciones gubernamentales están cada vez más preocupados por los peligros ambientales asociados con la producción y el uso de pesticidas químicos sintéticos. Debido a estas preocupaciones, los encargados de las regulaciones han prohibido o limitado el uso de la mayor parte de las sustancias químicas más peligrosas. Por lo tanto, existe un interés sustancial por el desarrollo de pesticidas alternativos. El control biológico de plagas de insectos de importancia agronómica por medio de agentes microbiológicos, tal como hongos, bacterias u otras especies de insectos, permite una alternativa aceptable para el medio ambiente y atractivo desde un punto de vista comercial. En términos generales, el uso de biopestícidas presenta un menor riesgo de contaminación y peligros para el medio ambiente, a la vez que provee una mayor especificidad para el blanco que es característica de los insecticidas químicos de amplio espectro tradicionales. Además, a menudo la producción de los biopesticidas es menos costoso y por lo tanto aumenta el rendimiento económico para una amplia variedad de cultivos. Determinadas especies de microorganismos del género Bacillus son conocidas por su actividad pesticida contra un amplio rango de plagas de insectos incluyendo Lepidóptera, Díptera, Coleóptera, Hemíptera y otros. Las especies Bacillus thuringiensis y Bacillus papilliae se encuentran entre los agentes biológicos más exitosos descubiertos hasta la fecha. Se ha atribuido patogenicídad para insectos a las cepas de: B. larvae, B. lentimorbus, B. papilliae, B. sphaericus, B. thuringiensis (Harwook, ed. (1989) Bacillus (Plenum Press), p. 306) y B. cereus (WO 96/10083). La actividad pesticida parece concentrarse en las inclusiones de las proteínas cristalinas parasporales, si bien también se han aislado proteínas pesticidas de la etapa de crecimiento vegetativo de Bacillus. Se han aislado y caracterizado diversos genes que codifican estas proteínas pesticidas (véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N°: 5.366.892 y 5.840.868). Los pesticidas microbianos, en particular los que se obtienen de las cepas de Bacillus, han cumplido un rol importante en la agricultura como alternativas para el control químico de las plagas. Recientemente, científicos agronómicos han desarrollado plantas de cultivo con mayor resistencia a insectos mediante la manipulación por ingeniería genética de plantas de cultivo para producir proteínas pestícidas de Bacillus. Por ejemplo, las plantas de maíz y algodón manipuladas mediante ingeniería genética para producir proteínas pesticidas aisladas de cepas de B. thuringiensis, conocidas como ¿-endotoxinas o toxinas Cry (véase, por ejemplo, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59(3):417-425; Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62(3):775-806) son actualmente de uso generalizado en la agricultura en EE.UU. y le han proporcionado al agricultor una alternativa aceptable para el medio ambiente a los métodos tradicionales de control de insectos. Además, los agricultores de EE.UU. han podido adquirir comercialmente papas manipuladas mediante ingeniería genética para contener las toxinas pesticidas Cry. Sin embargo, aunque han demostrado ser muy exitosos desde un punto de vista comercial, estas plantas de cultivo manipuladas mediante ingeniería genética, resistentes a insectos solamente proveen resistencia contra un rango estrecho de las plagas de insectos de importancia económica. Algunos insectos, tales como los gusanos de la raíz de maíz del oeste, han demostrado ser recalcitrantes. Por consiguiente, se ha intentado comprender el mecanismo de acción de las toxinas Bt y manipular toxinas con propiedades mejoradas. Se ha demostrado que las proteasas intestinales de los insectos pueden afectar el impacto de las proteínas Cry de Bacillus thuringiensis y otras proteínas pesticidas sobre el insecto. Algunas proteasas activan a las proteínas Cry mediante un procesamiento de una forma de "protoxina" a una forma tóxica, o "toxina". Véase, Oppert (1999) Arch. Insect Biochem. Phys. 42:1-12 y Carroll et al. (1997) J. Invertebrate Pathology 70:41-49. Esta activación de la toxina puede incluir la eliminación de los péptidos N- y C-termínales de la proteína y también puede incluir el clivaje interno de la proteína. Otras proteasas degradan las proteínas pesticidas. Véase Oppert, ibid.; véase también las Patentes de EE.UU. N°: 6.057.491 y 6.339.491. Los investigadores han determinado que las plantas expresan una variedad de proteasas, incluyendo serina y cisteína proteasas. Véase, por ejemplo, Smith et al. (1993) Plant Physiol. 101 :415-419; Pechan et al. (1999) Plant Mol. Biol. 40:111-119; Eckelkamp et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 99:5460-5465. La investigación también ha demostrado que las proteasas intestinales de los insectos incluyen catepsinas, tal como las proteinasas tipo catepsina B y L. Véase, Shiba et al. (2001 ) Arch. Biochem. Biophys. 390:28-34; véase también, Purcell et al. (1992) Insect Biochem. Mol. Biol. 22:41-47. Por ejemplo, se han encontrado cisteína proteinasas digestivas tipo catepsina L en el mesenterón o intestino medio de larvas de gusanos de la raíz de maíz del oeste. Véase, Koiwa et al. (2000) FEBS Letters 471 :67-70; véase también, Koiwa et al. (2000) Analytical Biochemistry 282:153-155. Los sitios de sustrato proteolíticos preferidos de estas proteasas fueron investigados usando sustratos sintéticos. Véase, Alves et al. (2001) Eur. J. Biochem. 268:1206-1212 y Meló et al. (2001 ) Anal. Biochem. 293:71-77. Aunque los investigadores han manipulado plantas mediante ingeniería genética, en particular plantas de cultivo, para que contengan toxinas Cry biológicamente activas (es decir, pesticidas), hasta la fecha los investigadores no han utilizado eficazmente las formas de protoxina de los polipéptidos pesticidas junto .con las proteasas intestinales de los insectos para controlar plagas en plantas. Más aún, estas proteínas extrañas pueden ser degradadas e ¡nactivadas por las proteasas presentes en estas plantas transgénicas. Por lo tanto, se desea encontrar nuevas estrategias para modificar toxinas de insectos y utilizar estas toxinas de insecto modificadas en las estrategias de manejo de plagas. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se proveen composiciones y métodos para proteger a una planta contra plagas de insectos. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican protoxinas de insectos o toxinas de insectos que comprenden al menos un sitio de activación proteolítico que ha sido manipulado para comprender un sitio de clivaje que es sensible a una proteasa de intestino de insecto. El sitio de activación proteolítíco típicamente es manipulado dentro de una región de activación de la protoxina de insecto o de la toxina de insecto. El clivaje proteolítico de una protoxina de insecto modificada por la proteasa de intestino de insecto libera la toxina de insecto activada dentro del intestino del insecto. El clivaje de la toxina de insecto modificada por la proteasa de intestino de insecto produce una toxina de insecto activa con mayor actividad pesticida en el intestino del insecto con relación a la correspondiente toxina de insecto que no contiene al sitio de activación proteolítico. Las moléculas de ácido nucleico de la invención se pueden ligar operativamente a cualquier promotor de interés para dirigir la expresión de las protoxinas de insectos o toxinas de insectos modificadas en una planta o célula vegetal. También se proveen los casetes de expresión y las plantas, células vegetales y semillas transgénicas que comprenden estas nuevas moléculas de ácido nucleico. Se proveen asimismo composiciones que comprenden protoxinas de insectos modificadas o toxinas de insectos modificadas y los métodos de su uso en el control de plagas de plantas. Las composiciones de ácidos nucleicos de la presente invención son de utilidad en los métodos destinados a la protección de plantas contra plagas de insectos. Los métodos comprenden introducir en una planta una construcción de polinucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una protoxina de insecto modificada ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en una planta. La protoxina de insecto modificada comprende un sitio de activación proteolítico que es manipulado para comprender un sitio de clivaje que es sensible a una proteasa de intestino de insecto. La expresión de la construcción de polinucleótidos que codifica la protoxina de insecto modificada da como resultado la producción de la protoxína de insecto modificada dentro de las células de la planta transgénica. Cuando las plagas de insectos susceptibles se alimentan de la planta transgénica y, por lo tanto, también ingieren la protoxina modificada que se ha expresado en la planta, la protoxina de insecto modificada es clivada por una proteasa de intestino de insecto generando la toxina activa en el intestino de dicho insecto, afectando de esa manera la plaga de insecto. Los métodos para proteger plantas de una plaga de insectos comprenden además introducir en una planta una construcción de polinucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina de insecto modificada ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en una planta. La toxina de insecto modificada comprende un sitio de activación proteolítico que es manipulada para comprender un sitio de clivaje sensible a una proteasa de intestino de insecto. La expresión de la construcción de polinucleótidos que codifica la toxina de insecto modificada da como resultado la producción de dicha toxina de insecto modificada dentro de las células de la planta transgénica. Cuando una plaga de insectos susceptible se alimenta de la planta transgénica y, por lo tanto, también ingiere la toxina de insecto modificada que se ha expresado en la planta, dicha toxina de insecto modificada es clivada por una proteasa de intestino de insecto generando una toxina activa en el intestino de dicho insecto que tiene mayor actividad pesticida con relación a la correspondiente toxina de insecto que no contiene al sitio de activación proteolítico, afectando así la plaga de insectos.

La presente invención provee además moléculas de ácido nucleico que codifican proteasas intestinales de insectos y variantes y fragmentos biológicamente activos de las mismas. Las proteasas son de utilidad, por ejemplo, en métodos destinados a la identificación de los sitios de clivaje proteolítico preferidos para estas proteasas intestinales de insectos. Una vez identificados estos sitios de clivaje proteolítíco preferidos, las protoxinas de insectos y las toxinas de los insectos de interés pueden ser modificadas para comprender los sitios de clivaje proteolítico preferidos dentro de al menos un sitio de activación proteolítico para mejorar la activación de la protoxina o toxina de insecto dentro del intestino de dicho insecto. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención está dirigida a composiciones y métodos que proveen protección a una planta contra una plaga de insectos y que se pueden utilizar para afectar estas plagas de insecto. Las composiciones ¡ncluyen nuevas moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos codificadoras de protoxinas de insectos modificadas que proveen un procesamiento eficaz en toxinas activas dentro del intestino de las plagas de insectos que se alimentan de una planta huésped que expresa dicha protoxina de insecto modificada. En algunas realizaciones, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden secuencias de nucleótidos que codifican protoxinas de insectos modificadas que contienen al menos un sitio de activación proteolítico que ha sido manipulado para comprender un sitio de clivaje que es sensible a una proteasa de intestino de insecto. El clivaje de la protoxina de insecto modificada por una proteasa de intestino de insecto produce una toxina de insecto activa en el intestino de dicho insecto. En otras realizaciones, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden secuencias de nucleótidos que codifican toxinas de insectos modificadas que contienen al menos un sitio de activación proteolítico que ha sido manipulado para comprender un sitio de clivaje que es sensible a una proteasa de intestino de insecto. El clivaje de la toxina de insecto modificada por una proteasa de intestino de insecto produce una toxina en el intestino de dicho insecto que presenta una mayor actividad pesticida con relación a la toxina de insecto que no contiene al sitio de activación proteolítico. Los ácidos nucleicos descritos en la presente son de utilidad en métodos para proteger a una planta contra plagas de insectos. Una "protoxína de insecto modificada" o "toxina de insecto modificada" se refiere a una protoxina de insecto o toxina de insecto que comprende al menos un sitio de activación proteolítico que no es natural dentro de dicha protoxina de insecto o toxina de insecto, y que ha sido manipulada para comprender un sitio de clivaje que es sensible al clivaje por una proteasa de intestino de insecto. El término "sensible al clivaje" significa que la proteasa reconoce al sitio de clivaje y, por lo tanto, tiene capacidad para clivar la protoxina o toxina en dicho sitio de clivaje. El sitio de activación proteolítico no natural generalmente es manipulado dentro de la región de activación de la protoxina de insecto o toxina de insecto. Una "región de activación" en el contexto de una protoxina de insecto significa una región dentro de la protoxina de insecto en donde el clivaje proteolítico en el sitio de activación manipulado da como resultado la producción de una toxina de insecto biológicamente activa. La "región de activación" en el contexto de una toxina de insecto se refiere a una región dentro de la toxina de insecto en donde el clivaje proteolítíco en dicho sitio de activación manipulado da como resultado la producción de una toxina de insecto con mayor actividad pesticida, según se define en la presente. A los efectos de la presente invención, una toxina de insecto biológicamente activa también se denomina "toxina", una "toxina de insecto", "toxina de insecto activa", la "toxina de insecto activada" o la "forma activada" de una protoxina de insecto. Las composiciones de la invención también incluyen construcciones de polinucleótidos que comprenden estas moléculas de ácido nucleico de protoxina y toxina de insecto modificada. Estas construcciones incluyen, en un sentido no limitativo, casetes de expresión, en donde las secuencias de nucleótidos que codifican las protoxinas de insectos modificadas o toxinas de insectos modificadas están ligadas operativamente a un promotor que dirige la expresión en una célula vegetal. La invención provee además células vegetales, plantas y semillas que comprenden una construcción de polinucleótidos descrita en la presente. Las composiciones de la invención son de utilidad en la protección de una planta contra plagas dé insectos y se pueden utilizar para afectar las plagas de insectos que interactúan con la planta durante una o más fases del ciclo de vida del insecto. En algunas realizaciones, las nuevas moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden secuencias de nucleótidos que codifican una protoxina de insecto o toxina de insecto modificada que comprenden al menos un sitio de activación proteolítico que ha sido manipulado para comprender un sitio de clivaje sensible al clivaje por una proteasa localizada dentro del intestino de insecto. En realizaciones particulares, el sitio de activación proteolítico es manipulado para comprender un sitio de clivaje que es el sitio de clivaje preferido para la nueva proteasa de intestino de insecto descrito más adelante en la presente. Las moléculas de ácido nucleico que codifican protoxinas de insectos modificadas o toxinas de insectos modificadas se pueden utilizar en los métodos de la invención para proteger a una planta contra una plaga de insectos. El término "proteger a una planta contra una plaga de insectos" significa limitar o eliminar los daños relacionados con la plaga de insectos en una planta, por ejemplo, inhibiendo la capacidad de las plagas de insectos para crecer, alimentarse y/o reproducirse o matando a dicha plaga de insectos. En algunas realizaciones, puede introducirse en una planta la construcción de polinucleótidos que comprende una secuencia de codificación de una protoxina de insecto modificada, ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en una célula vegetal. La expresión de esta construcción de polinucleótidos dentro de las células de esta planta produce la protoxina de insecto modificada en dichas células vegetales. Cuando una plaga de insectos susceptible se alimenta de las células de la planta que expresa esta protoxina de insecto modificada, dicha protoxina de insecto modificada ingerida es clivada por la proteasa de intestino de insecto, con lo cual se produce una toxina de insecto activa en el intestino del insecto y se afecta a la plaga de insectos. De manera similar, cuando se introduce una construcción de polínucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una toxina de insecto modificada ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en una célula vegetal en una planta, se expresa la toxina de insecto modificada. Cuando una plaga de insectos se alimenta de una planta que expresa la toxina de insecto modificada, la toxina de insecto modificada ingerida es clivada por una proteasa de intestino de insecto, produciendo de esa manera una toxina de insecto activa en el intestino del insecto que presenta una mayor actividad pesticida con relación a la toxina de insecto que no contiene al sitio de activación proteolítico manipulado. La presencia de la toxina de insecto con mayor actividad pesticida en el intestino del insecto afecta a la plaga de insectos. En otras realizaciones, la invención está dirigida a las protoxinas de insectos modificadas y toxinas de insectos modificadas codificadas por las moléculas de ácido nucleico de la presente invención y a métodos para usar estos polipéptidos. Se proveen además composiciones y formulaciones que comprenden una protoxína de insecto modificada o toxina de insecto modificada, o variantes o fragmentos de la misma, que comprenden al menos un sitio de activación proteolítico no natural que ha sido manipulado para comprender un sitio de clivaje sensible a clivaje por una proteasa de intestino de insecto. Las composiciones de protoxina de insecto modificada y toxina de insecto modificada de la invención son de utilidad en métodos destinados a afectar a las plagas de insectos. De esta manera, la invención provee además un método para afectar a una plaga de insectos de una planta que comprende aplicar, por ejemplo, una composición o formulación que comprende una protoxina de insecto modificada o toxina de insecto" modificada al entorno de la plaga de insectos. Tal como se utiliza en la presente, el "efecto sobre la plaga de insectos de una planta" incluye, pero en un sentido no limitativo, impedir que las plagas de insectos continúen alimentándose de la planta, dañar a las plagas de insectos, por ejemplo, inhibiendo la capacidad del insecto para crecer, alimentarse y/o reproducirse, o matar a las plagas de insectos. En una realización, la protoxina de insecto modificada o toxina de insecto modificada se combina con un vehículo para su posterior aplicación al entorno de las plagas de insectos. Aunque la invención no está restringida a ninguna teoría de operación, en una realización, la plaga de insectos ingiere una composición de protoxina de insecto modificada. La protoxina de insecto modificada es clivada luego por una proteasa de intestino de insecto para producir una toxina biológicamente activa en el intestino de la plaga de insectos, afectando así a dicha plaga de insectos. Como alternativa, la plaga de insectos puede ingerir la composición de toxina de insecto modificada de modo tal que dicha toxina de insecto sea clivada luego por una proteasa de intestino de insecto para producir una toxina activa en el intestino de dicho insecto con una mayor actividad con relación a la toxina de insecto que no contiene al sitio de activación proteolítico. La presencia de una toxina de insecto con mayor actividad pesticida en el intestino del insecto afecta a dicho insecto, según se define en la presente. El especialista en la técnica comprenderá que las composiciones y métodos de la invención pueden usarse solas o en combinación con otras composiciones y métodos para controlar plagas de insectos que afectan a plantas. Por ejemplo, la presente invención se puede usar junto con otras proteínas pesticidas o pesticidas químicos tradicionales. Aunque la invención no depende de un mecanismo biológico particular para proteger a una planta contra una plaga de insectos, la expresión de las secuencias de nucleótidos de la invención en una planta y la ingestión de esta planta por una plaga de insectos puede dar como resultado la producción de toxinas activas de insectos, o toxinas activas de insectos con una mayor actividad pesticida, en el intestino del insecto, dando como resultado una mayor resistencia de la planta a la plaga de insectos. Las plantas transgénicas de la invención son de utilidad en la agricultura en los métodos para proteger a las plantas contra plagas de insectos y para afectar a las plagas de insectos. En determinadas realizaciones de la invención se proveen plantas cultivables transformables, tales como, por ejemplo, plantas de maíz, que son utilizadas en métodos para afectar a los insectos que son plagas de las plantas tales como por ejemplo, gusanos de la raíz del maíz del Oeste, Norte, Sur o mejicano. Otras realizaciones de la invención proveen plantas de papa transformadas que son útiles en métodos para afectar al escarabajo de la papa de Colorado, las plantas de algodón transformadas que son útiles en los métodos para afectar al picudo del algodón y césped transformado que es útil en métodos para afectar al escarabajo picudo del pasto azul de Kentucky, Sphenophorous parvulus. Una "protoxina de insecto" o "protoxina" significa un polipéptido biológicamente inactivo que es convertido en una toxina de insecto activa luego de clivaje en un sitio de activación proteolítico por una proteasa. En algunas realizaciones, la activación de la toxina comprende eliminar un péptido C-terminal, un péptido N-terminal o péptidos de ambas regiones N-terminal y C-terminal de la protoxina. Una "toxina de insecto" se refiere a un polipéptido que presenta actividad pesticida, tal como, por ejemplo, la forma activada de una protoxina de insecto (es decir, el polipéptido olivado que posee actividad pesticida). Las toxinas de insectos de la invención incluyen, por ejemplo, cualquier polipéptido con actividad pesticidá, tal como, por ejemplo, las toxinas de Bacillus thuringiensis, pentina-1 y variantes y fragmentos de las mismas. Tal como se utiliza en la presente, el término "actividad pesticida" se refiere a la actividad de una sustancia, tal como, por ejemplo, una proteína, que se pueda medir con los ensayos de rutina conocidos en la técnica. Dichos ensayos ¡ncluyen, en un sentido no limitativo, mortalidad de la plaga, pérdida de peso de la plaga, repelencia de la plaga, atracción de la plaga y otros cambios físicos y del comportamiento de una plaga luego de su alimentación y exposición a la sustancia por un período de tiempo apropiado. Los procedimientos generales ¡ncluyen la adición del compuesto u organismo experimental a la fuente de la dieta en un recipiente cerrado. Los ensayos para evaluar la actividad pesticída son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N°: 6.570.005 y 6.339.144; incorporada en la presente en su totalidad a modo de referencia. En algunas realizaciones, la toxina de insecto modificada es clivada por una proteasa de intestino de insecto para producir una toxina de insecto con una mayor actividad pesticida con relación a la correspondiente toxina de insecto que no contiene al sitio de activación proteolítico. Tal como se utiliza en la presente, el término "mayor actividad pesticida" caracteriza una toxina de insecto de la invención que tiene una mayor actividad pesticida con relación a la actividad de la correspondiente toxina de insecto no modificada (es decir, la toxina de insecto que no contiene al sitio de activación proteolítico manipulado). Una mayor actividad pesticida se refiere a cualquier incremento en la actividad pesticida de la toxina de insecto clivada cuando se compara con la actividad pesticida de la toxina de insecto que no contiene al sitio de activación proteolítico. En algunas realizaciones, el hallazgo de una mayor o mejor actividad pesticida comprende la demostración de un incremento de la toxicidad de al menos 10%, contra el insecto blanco, y más preferentemente un incremento del 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 100%, 200% o más de la toxicidad con relación a la actividad pesticida de la toxina de insecto que no contiene al sitio de activación proteolítico manipulado, determinado contra el mismo insecto. También se puede usar cualquier ensayo estándar de medición de actividad pesticida para evaluar los incrementos en la actividad pesticida. La etapa del desarrollo preferida para evaluar la actividad pesticida comprende las formas larvales o inmaduras del insecto de interés. Los insectos se pueden criar en total oscuridad, a una temperatura entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 30°C, y entre aproximadamente un 30% y aproximadamente un 70% de humedad relativa. Los bioensayos se pueden llevar a cabo como se describe en Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entorno!. 83(6):2480-2485. Los métodos para criar las larvas de insecto y efectuar los bioensayos son bien conocidos por los especialistas en la técnica. En algunas realizaciones de la invención, la toxina de insecto es una toxina de Bacillus thuringiensis (Bt). Una toxina "Bt" o "Bacillus thuringiensis" se refiere a la clase general de toxinas presente en diversas cepas de Bacillus thuringiensis, que incluye toxinas tales como, por ejemplo, las proteínas insecticidas vegetativas y las ¿-endotoxinas. Véase, por ejemplo, Crickmore et al. (2004) Bacillus Thuringiensis Toxin Nomenclature en lifesci.sussex.ac.uk Home/Neil_Crickmore/Bt y Crickmore et al. (1998) Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:807-813, cuyos contenidos se incorporan por completo en la presente a modo de referencia. Las proteínas insecticidas vegetativas (por ejemplo, los miembros de las clases VIP1 , VIP2 o VIP3) son proteínas insecticidas secretadas que sufren un procesamiento proteolítico por los líquidos del mesenterón de insecto. Tienen actividad pesticida contra un amplio espectro de insectos lepidópteros. Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N°: 5.877.012, incorporada en este la presente en su totalidad a modo de referencia. Las Bt d-endotoxínas son tóxicas para las larvas de numerosas plagas de insectos, incluyendo los miembros de las órdenes Lepidóptera, Díptera y Coleóptera. Estas protoxinas de insectos incluyen, en un sentido no limitativo, las toxinas Cry, incluyendo, por ejemplo, Cryl , Cry 2, Cry3, Cry4, Cry5, Cry6, Cry7, Cry8 y Cry9. De particular interés son las ¿-endotoxinas tipo Cryd. Las toxinas "tipo Cry8" ¡ncluyen la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos que comparten un alto grado de identidad o similitud de secuencia con las secuencias descritas previamente clasificadas como Cryd, que incluye toxinas tales como, por ejemplo, Cry8Bb1 (véase Genbank, N° Acceso CAD57542; SEQ ID N°: 10 (secuencia de nucleótidos); SEQ ID N°: 11 (secuencia de aminoácidos)) y CrydBd (véase Genbank, N° Acceso CAD57543; SEQ ID N°: 12 (secuencia de nucleótidos); SEQ ID N°: 13 (secuencia de aminoácidos)). Véase la Solicitud Copendiente de Patente de EE.UU. N°: 10/606,320, con el título, "Genes Encoding Proteins with Pesticidal Activity", presentada el 25 de junio, 2003, incorporada en la presente a modo de referencia. Una "protoxina de insecto tipo Cryd" se refiere a un polipéptido biológicamente inactivo que es convertido en la toxina de insecto tipo Cryd activada luego del clivaje en un sitio de activación proteolítico por una proteasa. Es la toxina de insecto tipo Cryd activada que tiene actividad pesticida. Tal como se utiliza en la presente, una "toxina de insecto de tipo Cryd" se refiere a un polipéptido pesticída biológicamente activo que comparte un alto grado de identidad o similitud de secuencia con las secuencias de toxina de insecto Cryd. Las toxinas Bt comprenden una familia de proteínas insecticidas que son sintetizadas como protoxinas y que se cristalizan como inclusiones parasporales. Cuando es ingerida por una plaga de insecto, la estructura mícrocristalina es disuelta por el pH alcalino en el mesenterón del insecto y la protoxi?a es clivada por las proteasas intestinales de los insectos para generar la toxina activa. La toxina Bt activada se une a los receptores en el epitelio intestinal del insecto, causando lesiones en la membrana e hinchamiento asociado, así como lísis del intestino del insecto. El insecto muere como resultado de inanición y septicemia. Véase, por ejemplo, Li et al. (1991), Nature, 353:d15-d21 ). La forma protoxina de las toxinas Cry contiene un segmento formador de cristales. La comparación de la secuencia de aminoácidos de las toxinas Cry de diferentes especificidades reveló cinco bloques de secuencias altamente conservadas. Estructuralmente, las toxinas Cry comprenden tres dominios distintos que son, desde el extremo N terminal al extremo C-terminal: un grupo de siete alfa-hélices relacionadas con la formación de poros (denominado "dominio 1 "), tres láminas beta antiparalelas relacionadas con la unión a células (denominadas "dominio 2") y un beta-sándwich (denominado "dominio 3"). La localización y las propiedades de estos dominios son bien conocidas por los especialistas en la técnica. Véase por ejemplo, Li et al. (1991 ) supra y Morse et al. (2001 ) Structure, 9:409-417. Otros ejemplos de toxinas de insectos incluyen, por ejemplo, pentina-1 y proteínas tipo pentina (véase las Patentes de EE.UU. N°: 6.057.491 y 6.339.144, ambas incorporadas por completo en la presente a modo de referencia. El término "tipo pentina-1" significa que la secuencia de nucleótidos o de aminoácidos comparte un alto grado de identidad o similitud de secuencia con las secuencias de pentina-1 descritas previamente. Las protoxinas de insectos modificadas o toxinas de insectos modificadas de la invención pueden derivar de cualquier protoxina de insecto o toxina de insecto nativa (es decir, natural) adecuada, tal como las Bt ¿-endotoxinas nativas descritas previamente, mediante manipulación del sitio de activación proteolítíco de interés dentro de la secuencia nativa de la protoxina de insecto o la toxina de insecto. De esta manera, se puede alterar la secuencia de nucleótidos que codifica la protoxina de insecto o toxina de insecto nativa de interés, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, para que comprenda los codones del sitio de activación proteolítico de interés, es decir, un sitio sensible a las proteasas intestinales de los insectos. Como se indicara previamente, los codones del o de los sitios de activación proteolíticos de interés son manipulados dentro de la región de la secuencia de codificación nativa que corresponde a la región de activación de la protoxina de insecto o toxina de insecto nativa, de modo que el clivaje proteolítico de la protoxina de insecto modificada o toxina de insecto modificada codificada por la proteasa de interés da como resultado la producción de la toxina de insecto activa o una toxina de insecto activa con una mayor actividad pesticida.

Como alternativa, las protoxinas de insectos modificadas o toxinas de insectos modificadas de la invención pueden derivar de fragmentos o variantes de protoxinas de insecto nativas o toxinas de insecto nativas, según se define más adelante en la presente, siempre y cuando el fragmento o la variante de la protoxina de insecto o toxina de insecto nativa permita obtener una toxina de insecto activada (es decir, que tiene actividad pesticida) o una toxina que tiene una mayor actividad pesticida en el caso de una toxina de insecto modificada, con el clivaje proteolítico por la proteasa de intestino de insecto de interés. De esta manera, las secuencias de codificación de dichos fragmentos y variantes de la proteína nativa de la protoxina de insecto o toxina de insecto sirven como material de partida para manipular los codones del o de los sitios de activación proteolíticos de interés. En esencia, la protoxina de insecto modificada o toxina de insecto modificada diseñada de esta manera representa un fragmento o variante de la protoxina de insecto o toxina de insecto nativa que ha sido manipulada para comprender el sitio de activación proteolítico de interés dentro de la región de activación del polipéptido respectivo. Los ejemplos de variantes y fragmentos de protoxinas y toxinas de insectos se proveen en la Solicitud Copendiente de Patente de EE.UU. N°: 10/606.320, con el título "Genes Encoding Proteins with Pesticidal Activity', presentada el 25 de junio, 2003 y en la Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/746,914, con el título "Genes Encoding Proteins with Pesticidal Activity", presentada el 24 de diciembre, 2003, cuyos contenidos se incorporan por completo en la presente a modo de referencia. Se considera que se pueden introducir variaciones en una protoxina de insecto modificada o toxina de insecto modificada descrita en la presente a nivel de la molécula de ácido nucleico que codifica una forma modificada de la protoxina de insecto o toxina de insecto nativa con el fin de producir una variante de la protoxina de insecto modificada o toxina de insecto modificada codificada por la misma. Es decir, habiendo descrito la secuencia de nucleótidos que codifica la protoxina de insecto o toxina de insecto nativa con al menos un sitio de activación proteolítico de interés manipulado dentro de la secuencia nativa, el especialista en la técnica podrá introducir después variaciones en la secuencia de nucleótidos descrita de la invención, de modo tal que la protoxina de insecto modificada o toxina de insecto modificada codificada será una variante de la protoxina de insecto nativa modificada o toxina de insecto nativa modificada.

Dichas variaciones incluyen supresiones, sustituciones y adiciones de uno o más residuos, e ¡ncluyen variaciones que dan como resultado formas truncadas de la protoxina de insecto modificada. Se puede introducir cualquiera de dichas variaciones en la secuencia de nucleótidos que codifica la protoxina de insecto modificada o la toxina de insecto modificada nativa siempre y cuando la variante codificada de la prótoxina de insecto modificada o de la toxina de insecto modificada nativa pueda ser clivada para producir una toxina de insecto biológicamente activa, es decir, una toxina de insecto con actividad pesticida como se indicara en otra parte en la presente, o, en el caso de una toxina de insecto modificada, una toxina con mayor actividad pesticida con relación a la toxina de insecto que no contiene al sitio de activación proteolítico. Dichas variantes y fragmentos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Solicitud Copendiente de Patente de EE.UU. N°: 10/606.320, presentada el 25 de junio, 2003; y la Patente de EE.UU. N°: 5.877.012; incorporadas por completo en la presente a modo de referencia. Una "proteasa" significa una enzima que diva a los polipéptidos por hidrólisis de los enlaces peptídicos. Tal como se utiliza en la presente, una "proteasa de intestino de insecto" se refiere a una proteasa naturalmente presente en el tracto digestivo de una plaga de insectos. Los investigadores han establecido que hay un gran número de proteasas que se expresan en el intestino del insecto, incluyendo cisteína y serina proteasas. Véase, por ejemplo, Shiba et al. (2001 ) Arch. Biochem. Biophys. 390:2d-34; véase también, Purcell et al. (1992) Insect Biochem. Mol. Biol. 22:1-47; Koiwa et al. (2000) FEBS Letters 471 :67-70; Koiwa et al. (2000) Anal. Biochem. 262:153-155. Se puede usar cualquier proteasa de intestino de insecto en la presente invención. En algunas realizaciones, la proteasa de intestino de insecto es una cisteína proteasa, por ejemplo, una proteasa tipo catepsina L. En realizaciones particulares, la proteasa de intestino de insecto es una proteasa tipo catepsina L que se describirá más adelante en la presente. Un "sitio proteolítico" se refiere a una secuencia de aminoácidos que confiere sensibilidad a una clase de proteasas o proteasa particular de modo que el polipéptído que comprende la secuencia de aminoácidos es clivado en dicho sitio por miembros de la clase de proteasas o por la proteasa particular. Tal como se utiliza en la presente, un "sitio de activación proteolítico" es un sitio proteolítíco que ha sido manipulado en una región de activación de una protoxina de insecto o una toxina de insecto. Tal como se utiliza en la presente en el contexto de una protoxina de insecto, una "región de activación" es una región de una protoxina de insecto tal que el clivaje proteolítico en el sitio de activación proteolítíco dentro de la región de activación genera una toxina de insecto biológicamente activa. Una "región de activación" en una toxina de insecto se refiere a una región de una toxina de insecto tal que el clivaje proteolítico en el sitio de activación proteolítico dentro de la región de activación genera una toxina de insecto que presenta una mayor actividad pesticida con relación a la correspondiente toxina de insecto que no contiene al sitio de activación proteolítico manipulado. Se dice que un sitio proteolítico es "sensible" a la o las proteasas que reconocen a dicho sitio. Se considera que la eficacia de la digestión proteolítica puede variar y que una disminución en la eficacia de la digestión proteolítica puede conducir a un incremento en la estabilidad o longevidad del polipéptido dentro de una célula vegetal o dentro del intestino del insecto. Así, un sitio proteolítico puede conferir sensibilidad a más de una proteasa o clase de proteasas, pero la eficacia de digestión por diversas proteasas puede variar en dicho sitio. Los sitios proteolíticos incluyen, por ejemplo, sitios para tripsina, sitios para quimotripsina, sitios para papaína, sitios para catepsina y sitios de tipo catepsina. Los sitios proteolíticos para una proteasa en particular comprenden frecuentemente "motivos" o patrones de secuencias, que son conocidos porque confieren sensibilidad a una proteasa en particular. Así, por ejemplo, los motivos de sitio de catepsina incluyen FRR, un sitio de clivaje por proteasas de la catepsina L; RR, una'tripsina y el sitio de clivaje de la catepsina B; LKM, un sitio de quimiotripsina; y FF, un sitio de la catepsina D. Un sitio proteolítico putativo es una secuencia que comprende un motivo o comprende una secuencia similar a un motivo pero que no ha sido objeto de digestión por la correspondiente proteasa. En una realización, las protoxinas de insecto modificadas o toxinas de insecto modificadas de la invención contienen un sitio de activación proteolítíco que comprende al motivo LXQS (SEQ ID N°: 1 ), más particularmente, LSQS (SEQ ID N°: 2). En otras realizaciones, el sitio de activación proteolítico comprende LXQSLXQS (SEQ ID N°: 3), más particularmente LSQSLSQS (SEQ ID N°: 4). El sitio de activación proteolítico manipulado puede reemplazar a un sitio natural dentro de la protoxina de insecto o toxina de insecto. Por ejemplo, en una realización, la secuencia NGSR (SEQ ID N°: 5) ubicada entre el bucle de las alfa- hélices 3 y 4 en el dominio I de la protoxina de insecto Cryd es sustituida por LSQS (SEQ ID N°: 2) o LSQSLSQS (SEQ ID N°: 4). En otras realizaciones de la invención, el sitio de activación proteolítico se introduce en la porción C-terminal de la protoxina, la porción N-terminal de la protoxina o en ambas regiones N terminal y C-terminal. Asimismo, en algunas realizaciones, el clivaje de la protoxina dará como resultado la eliminación de un péptido N-terminal, un péptido C-terminal o péptidos de ambas regiones N-terminal y C-terminal de la proteína. En una realización particular, el sitio de activación proteolítico se introduce en la unión entre el segmento formador de cristales N-terminal de la protoxina y la porción de la protoxina que comprende la toxina de insecto activa luego del clivaje.

Se considera además que las protoxinas de insectos o las toxinas de insectos expresadas en una planta pueden ser susceptibles de un clivaje adicional por proteasas vegetales. Una "proteasa vegetal" significa una proteasa que está presente naturalmente en cualquier planta de la invención. La investigación realizada hasta la fecha ha demostrado que las plantas expresan una variedad de proteasas, incluyendo serina y cisteína proteasas. Véase, por ejemplo, Goodfellow et al. (1993) Plant Physiol. 101 :415-419; Pechan ef al. (1999) Plant Mol. Biol. 40:111-119; Lid et al. (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. EE.UU. 99:5460-5465. En algunas realizaciones, la proteasa vegetal es una cisteína proteasa, por ejemplo, una catepsína o proteasa tipo catepsina. En una realización, la cisteína proteasa es una proteasa de tipo catepsina B. El clivaje de la protoxina de insecto o toxina de insecto por una proteasa vegetal en un sitio proteolítico natural puede conducir, por ejemplo, a un procesamiento, degradación o activación prematura de la protoxina o toxina en la planta, en lugar de en el intestino del insecto donde será más eficaz. En realizaciones particulares, la incorporación de un sitio de activación proteolítíco que ha sido manipulado para comprender un sitio de clivaje sensible a una proteasa de intestino de insecto también estabiliza la protoxina o toxina de insecto en la planta. Tal como se utiliza en la presente, el término "estabiliza la toxina de insecto en la planta" significa que la incorporación del sitio de activación proteolítíco manipulado protege a la protoxina de insecto o toxina de insecto, por ejemplo, de un procesamiento, degradación (completa o parcial) o activación prematuro en la planta. El clivaje de la protoxina de insecto o toxina de insecto en un sitio proteolítico natural por una proteasa vegetal también puede conducir a una inactivación proteolítica de la toxina. Tal como se utiliza en la presente, una "inactivación proteolítica" connota el clivaje de la protoxina de insecto o toxina de insecto en un sitio proteolítico natural por una proteasa vegetal, en donde el clivaje en dicho sitio reduce o elimina la actividad pesticida de la toxina de insecto resultante. En una realización, la protoxina de insecto o toxina de insecto es manipulada para reemplazar un sitio proteolítico natural que es sensible al clivaje por una proteasa vegetal con un sitio proteolítico protector. Un "sitio proteolítico protector" se refiere a un sitio que no es sensible al clivaje por una proteasa vegetal endógena. La sustitución de un sitio proteolítico natural sensible al clivaje por una proteasa vegetal por un sitio proteolítico protector protege a la protoxina de insecto o toxina de insecto de una inactivación proteolítica por la planta. Véase, por ejemplo, la Solicitud Copendiente de Patente de EE.UU. N°: 10/746.914, con el título "Genes Encoding Proteins with Pesticidal Activity", presentada el 24 de diciembre, 2003, incorporada por completo en la presente a modo de referencia. La protección de una protoxina de insecto o de una toxina de insecto contra un procesamiento, degradación o inactivación prematuro por cualquier proteasa vegetal está comprendida por la presente invención. En algunas realizaciones, se manipula la protoxina de insecto o toxina de insecto para que comprenda un sitio de activación proteolítíco que pueda ser reconocido por una proteasa de intestino de insecto. La invención provee moléculas de ácido nucleico, y variantes y fragmentos de las mismas, que codifican proteasas intestinales de insectos. Específicamente, la invención provee moléculas de ácido nucleico que codifican proteasas identificadas en el mesenterón de Diabrotica virgifera virgifera (es decir, gusanos de la raíz de maíz del oeste, de aquí en adelante WCRW). Las secuencias de nucleótidos que se muestran en las SEQ ID N°: 6 y d codifican cisteína proteasas que pertenecen a la subfamilia de proteasas de tipo catepsina L. Las secuencias de nucleótidos que se muestran en las SEQ ID N°: 6 y d codifican las secuencias de polipéptidos (es decir, proteasas) de las SEQ ID N°: 7 y 9, respectivamente. La proteasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 7 es un 100% idéntico a la proteasa recientemente aislada de gusanos de la raíz de maíz. Véase Brown et al. (2004) Insect Biochem. Mol. Biol. 34:305-320. La proteasa que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 9 es un 79% idéntica a otra proteasa aislada por Brown et al. La invención abarca además variantes y fragmentos de estas secuencias de polipéptidos que poseen actividad proteolítica según se define más adelante en la presente. Los ensayos para medir la actividad proteolítica son bien conocidos en la técnica. Los estudios indican que las proteasas tipo catepsina L de la invención representan las dos formas más abundantes de proteasas de tipo catepsina expresadas en el mesenterón de WCRW y, por ello, se espera que participen significativamente en el proceso digestivo. Véase el Ejemplo 1. La investigación llevada a cabo hasta la fecha ha demostrado que las proteasas de mamíferos de tipo catepsina L tienen una preferencia general por F-R-(A/S/K/N/Q) con clivaje C- terminal en la posición de la arginína. Se sabe poco acerca del o de los sitios de clivaje proteolítico de las proteasas de tipo catepsina L de las plagas de insectos. Por lo tanto, las proteasas de intestino de WCRW de la invención son de utilidad, por ejemplo, para identificar uno o más sitios de clivaje proteolíticos preferidos para estas proteasas. En otra realización, las proteasas intestinales de insectos se usan para identificar sitios de clivaje proteolítico dentro de polipéptídos pestícidas, por ejemplo, de toxinas tipo Cryd, tal como CrydBbl y CrydBd , que son susceptibles para estas proteasas. El conocimiento acerca de los sitios proteolíticos preferidos para las proteasas intestinales de insectos de la invención puede conducir a mejoras en la activación y estabilidad de las toxinas de insectos. Por ejemplo, se puede introducir un sitio de activación proteolítico que es sensible a clivaje por una proteasa de intestino de insecto de la invención en una región de activación de una protoxina de insecto o toxina de insecto. Cuando esta protoxina de insecto o toxina de insecto modificada es expresada en una planta y una plaga de insecto, tal como WCRW, se alimenta de la planta transgénica, la protoxina o toxina es clivada por la proteasa de tipo catepsina L de la invención en el intestino del insecto, produciendo así la toxina activa o una toxina de insecto con mayor actividad pesticida y afectando de esa manera a la plaga de insectos. En una realización, el sitio de activación proteolítico manipulado es sensible al clivaje por la proteasa de tipo catepsina L de la SEQ ID N°: 7 ó 9. En algunas realizaciones, la protoxina de insecto es una protoxina de tipo Cryd. Se considera además que las protoxinas o toxinas de insectos que se expresan en una planta pueden ser susceptibles al clivaje por proteasas intestinales de insectos luego de ser ingeridas por una plaga de insecto. El clivaje de una toxina de insecto activa por una proteasa intestinal de insecto puede conducir a la inactivación proteolítica de la toxina. En este contexto, una "inactivación proteolítica" se refiere al clivaje de una protoxina de insecto o toxina de insecto en un sitio proteolítico por una proteasa de intestino de insecto, en donde el clivaje en dicho sitio reduce o elimina la actividad pesticida de la toxina resultante. En una realización, se manipula la protoxina o toxina de insecto para sustituir un sitio proteolítico que es sensible a clivaje por una proteasa de intestino de insecto por un sitio proteolítico protector. En este contexto, "sitio proteolítico protector", se refiere a un sitio que no es sensible al clivaje por una proteasa de intestino de insecto. El reemplazo de un sitio proteolítico sensible al clivaje por una proteasa de intestino de insecto con un sitio proteolítico protector protege a la protoxina de insecto o toxina de insecto de una inactivación proteolítica en el intestino del insecto. La eliminación de sitios sensibles a proteasas puede impedir una rápida degradación de la protoxina de insecto o toxina de insecto en el mesenterón de insecto luego de su ingestión, lo que permite que la toxina llegue al blanco en un estado intacto y que alcance más rápidamente una dosis insecticida dentro de la plaga de insecto. En una realización, el sitio proteolítico protector es manipulado para que no sea sensible al clivaje por una proteasa tipo catepsina L de la invención, es decir, el polipéptido de la SEQ ID N°: 7 ó 9. Los ácidos nucleicos de la invención que codifican proteasas intestinales de insecto de tipo catepsina L (SEQ ID N°: 6 y d) y los polipéptidos codificados por los mismos (SEQ ID N°: 7 y 9) además son de utilidad en la identificación y el diseño de inhibidores de estas proteasas. Los agentes químicos y biológicos que inhiben estas proteasas podrían exhibir fuertes efectos pesticidas luego de ser ingeridos por insectos. Por ejemplo, dichos inhibidores pueden dar como resultado la incapacidad de las plagas de insectos para digerir alimentos y suministrar los factores dietéticos necesarios para sustentar su crecimiento y desarrollo. En algunas realizaciones, los inhibidores de las proteasas de tipo catepsina L de la invención son polipéptidos. En una realización particular, las moléculas de ácido nucleico que codifican a los inhibidores polipeptídicos de las proteasas intestinales de los insectos de la invención se usan para generar plantas transgénicas. Estas plantas son de utilidad para controlar una plaga de insectos de una planta. En otras realizaciones, los inhibidores polipeptídicos de las proteasas de tipo catepsina L de la invención se usan para controlar plagas por aplicación de la composición inhibidora al entorno de las plagas. Tal como se utiliza en la presente, un "ácido nucleico" ¡ncluye a un polímero de desoxirribonucleótídos o ribonucleóíidos, íanto en su forma de cadena simple como de cadena doble y, a menos que se lo limite de otra manera, abarca análogos conocidos (ácidos nucleicos, péptidos) que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales y que ellos se hibridizan con ácidos nucleicos de cadena simple en una forma similar a la de los nucleótidos naturales. El uso de los términos "construcciones de polínucleótidos" o "construcciones de nucleótidos" en la presente no pretende limitar la presente invención a construcciones de nucleótidos que comprendan ADN. Los especialisías en la técnica comprenderán que las construcciones de nucleótidos, particularmente polínucleótidos y oligonucleótidos, se componen de ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleóíidos y de desoxirribonucleótidos, y que íambién se pueden emplear en los mélodos descrifos en la présenle. Las construcciones de nucleótidos, ácidos nucleicos y secuencias de nucleótidos de la invención abarcan además todas las formas complementarias de dichas construcciones, moléculas y secuencias. Además, las construcciones de nucleótidos, moléculas de nucleótidos y secuencias de nucleótidos de la presente invención abarcan la totalidad de las construcciones de nucleótidos, moléculas y secuencias que pueden ser empleadas en los métodos de la presente invención para transformar plantas que incluyen, en un sentido no limitativo, a aquellas comprendidas por desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y combinaciones de los mismos. Dichos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas naturales como análogos sintéticos. Las construcciones de nucleótidos, ácidos nucleicos y 2d secuencias de nucleólidos de la invención también abarcan la tolalidad de las formas de construcciones de nucleótidos que incluyen, en un sentido no limitativo, formas de cadena simple, formas de cadena doble, horquillas, estructuras de tallo y bucle y semejantes. Tal como se utiliza en la presente, los términos "que codifica" o "codificantes" cuando se utilizan en el contexto de un ácido nucleico específico significa que el ácido nucleico comprende el requisito de información para dirigir la traducción de la secuencia de ácido nucleico en una proteína específica. La información por la cual está codificada una proteína está especificada por el uso de codones. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico o puede carecer tales secuencias intervinieníes no íraducidas (por ejemplo, como en el ADNc). Tal como se uíiliza en la presente, el término "modificado de forma recombinante" o "modificado por ingeniería genética" o "modificado" se refiere a la utilización de la tecnología de ADN recombinante para introducir (por ejemplo, por ingeniería genética) un cambio en la estrucíura de la proíeína en base al conocimienlo de los mecanismos de acción de la proíeína y las consideraciones de los aminoácidos que son inlroducidos, eliminados o susíiíuidos. Por ejemplo, se puede manipular una molécula de ácido nucleico que codifica una proíoxina de insecío para que comprenda una secuencia de codificación de un siíio de acíivación proíeolííico según se describe en oíra parte en la preseníe. Tal como se uíiliza en la presenie, una "secuencia de longiíud compleía" se refiere a un polinucleóíido específico o su proíeína codificada, y significa que íiene la secuencia de ácido nucleico eníera o la secuencia de aminoácidos íoíal de una secuencia naíiva. Una "secuencia naíiva" se refiere a una secuencia endógena, como por ejemplo una secuencia no modificada por ingeniería genélica hallada en el genoma de un organismo. Un polinucleóíido de longilud compleía codifica la forma de longitud completa de la proteína especificada. Tal como se utiliza en la presente, el término "antisentido" utilizado en el coníexlo de la orieníación de una secuencia de nucleótidos se refiere a una secuencia de polinucleótidos en dupla que está ligada operativameníe a un promoíor en una orienlación donde la cadena anliseníido se íranscribe. La cadena anliseníido es suficieníemeníe complemenlaria con un producío de íranscripción endógeno como para que a menudo se inhiba la íraducción del producío de íranscripción endógeno. Por lo tanto, cuando se utiliza el término "antisentido" en el contexío de una secuencia de nucleólidos en particular, el término se refiere a una cadena complementaria del producto de transcripción de referencia. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistiníameníe en la preseníe para designar polímeros de residuos de aminoácidos. Los íérmínos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido nalural correspondienle y también a polímeros de aminoácidos naturales. Los términos "residuo", "residuo de aminoácido" o "aminoácido" se usan indistintamente en la presente para designar un aminoácido que está incorporado en una proteína, un polipéplido o un péplido (denominados colectivamente "proteínas"). El aminoácido puede ser un aminoácido natural y, a menos que se limite de otra manera, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar de manera similar a como funcionan los aminoácidos naturales. Los polipéptidos de la invención pueden producirse tanto a partir de los ácidos nucleicos descritos en la presente, como mediante el uso de técnicas esíándar de biología molecular. Por ejemplo, se puede producir una proleína íruncada de la invención por expresión de un ácido nucleico recombinante de la invención en una célula huésped apropiada o, como alternativa, mediante la combinación de procedimientos ex vivo, tal como digestión con proteasas y purificación. La invención abarca composiciones de polinucleótidos o proteínas aisladas o sustancialmente purificadas. Un polinucleótido o proteína "aislado" o "purificado", o una porción biológicamente activa del mismo, está suslancialmenle o esencialmente libre de los componentes que habitualmente acompañan o interacíúan con el polinucleólido o la proleína tal como se halla en su entorno natural. Por consiguiente, un polinucleótido o proteína aislado o purificado está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo, cuando es producido mediante técnicas recombínantes, o está sustancialmenle libre de precursores químicos u oirás suslancias químicas cuando es sintetizado químicamente. Preferentemente, un polinucleótido "aislado" está libre de las secuencias (preferentemente las secuencias que codifican proteínas) que habitualmente flanquean a los polinucleótidos (es decir, secuencias ubicadas en los extremos 5' y 3' del polinucleótido) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, el polinucleótido aislado puede contener menos que 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb aproximadamente de las secuencias de nucleótidos que habitualmeníe flanquean al polinucleótido en el ADN genómico de la célula de la cual deriva el polinucleótido. La proteína que está substancíalmeníe libre de maierial celular incluye preparaciones de proíeínas que poseen menos que un 30%, 20%, 10%, 5% o 1 % (en peso seco) de proleínas contaminantes. Cuando la proteína de la invención o una porción biológicamente activa de la misma es producida de forma recombinante, el medio de cultivo representa preferentemente menos que un 30%, 20%, 10%, 5% o 1 % (en peso seco) aproximadamente de precursores químicos o de sustancias químicas que no son las proteínas de interés. Los fragmentos y las variantes de los polinucleótidos y las proíeínas descriías codificadas por los mismos íambién esíán comprendidos por la presenie invención. El lérmino "fragmento" significa una porción de la secuencia del polinucleótido o una porción de la secuencia de aminoácidos y por ende de la proteína codificada por el mismo. Los fragmentos de un polinucleótido pueden codificar fragmentos de proteínas que retienen la actividad biológica de la proteína nativa. Por ende, los fragmentos de la secuencia de nucleótidos de una protoxina de insecto pueden codificar fragmentos de proteína que se convierten en toxinas activas de insectos (es decir, poseen actividad pesticida) luego de ser olivados por una proteasa. Los fragmentos de una toxina de insecto pueden codificar fragmentos de proíeína que se convierten en íoxinas de insecío con mayor acíividad pesíicída luego de ser olivados por una proíeasa de iníeslino de insecío. Por el conlrario, los fragmeníos de la secuencia de nucleóíidos de una proleasa de iníesíino de insecío de la invención pueden codificar fragmeníos de proíeína que íienen acíividad proíeolílica según se describe en la presenie y que reconocen el silio de clivaje proteolítico preferido de la proteasa nativa. Como alternativa, los fragmentos de polinucleótido que son de utilidad como sondas de hibridación generalmente no codifican fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica. Por consiguiente, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar en un rango entre al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos y hasta el polinucleótido de longitud completa que codifica los polipéptidos de la invención. El fragmento de un polinucleótido de la invención que codifica una porción biológicameníe acíiva de una proleína de la invención codificará al menos 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200 ó 250 aminoácidos conliguos o hasta el número total de aminoácidos presentes en una proteína de longitud completa de la invención. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos que son útiles como sondas de hibridación o cebadores para PCR generalmente no necesitan codificar una porción biológicamente acliva de una proleína de la invención. Por lo lanto, un fragmento de un polinucleótido descrito en la presente puede codificar una porción biológicamente activa de una protoxina de insecto, de una toxina de insecto o de una proteasa de ¡níesíino de ¡nsecío, o puede ser un fragmenío que se puede usar como sonda de hibridación o cebador para PCR usando los méíodos que se describen más adelante. Una porción biológicameníe acíiva de una proíeasa de intesíino de insecto se puede preparar aislando una porción de polinucleótidos de una de las proteasas de intestino de insecto de la invención, expresando la porción de proteasa codificada (por ejemplo, mediante expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la porción codificada de la proíeasa de intesíino de insecío. Los polinucleóíidos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de la invención comprenden al menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1.000, 1.100, 1.200, 1.300 ó 1.400 nucleótidos contiguos o hasta el número total de nucleótidos presente en un polinucleótido de longitud completa descrito en la presente. El término "variantes" significa secuencias susíancialmeníe similares. Para polinucleóíidos, una varianíe comprende la supresión y/o adición de uno o más nucleóíidos en uno o más siíios infernos deniro del polinucleóíido nalivo y/o la susíilución de uno o más nucleóíidos en uno o más siíios en dicho polinucleóíído nafivo. Tal como se uíiliza en la preseníe, un polinucleólido o polipéplido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos o secuencia de aminoácidos nalural, respectivamente. Para los polinucleótidos, las variantes conservadoras ¡ncluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos de una de las protoxinas de insectos o proleasas intestinales de insecto. Las variantes alélicas naturales como las recién mencionadas pueden ser identificadas utilizando técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, las lécnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y de hibridación que se describirán más adelante. Las variantes de polinucleótidos también ¡ncluyen secuencias de polinucleótidos derivadas sintéticamente, tal como las que se generan, por ejemplo, utilizando mutagénesis dirigida al sitio pero que aún codifican una proteína de la invención. En general, las variantes de un polinucleótido particular de la invención tendrán por lo menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% aproximadamente o más identidad de secuencia con dicho polinucleótido particular deíerminada mediante los programas de alineación de secuencia que se describen en la presente utilizando los parámetros predeterminados. Las variantes de un polinucleótido particular de la invención (es decir, el polinucleótido de referencia) también puede evaluarse por comparación del porcentaje de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por una variante de polinucleótido y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Así, por ejemplo, se describe un polinucleótído aislado que codifica un polipépíido con un porcentaje dado de identidad de secuencia con el polípéptido de la SEQ ID N°: 9. El porcentaje de identidad de secuencia entre cualesquiera dos polipéptidos se puede calcular usando los programas de alineación de secuencia y los parámetros descritos en otra parte en la presente. Cuando se evalúa cualquier par de polinucleólidos dado de la invención por comparación del porcentaje de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos codificados por el mismo, dicho porcentaje de idenlidad de secuencia eníre los dos polipépíidos codificados es de al menos aproximadameníe 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idenlidad de secuencia. El lérmino "variante" de proteína significa una proteína derivada de la proteína nativa por supresión o adición de uno o varios aminoácidos en uno o más sitios internos en la proteína nativa y/o la suslilución de uno o más aminoácidos en uno o más silios en la proleína naliva. Las variantes de proteína comprendidas por la presente invención son biológicamente activas, es decir continúan teniendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, o sea, por ejemplo, la actividad pesticida descrita en la presente. Dichas variantes pueden ser el resultado de, por ejemplo, polimorfismos genéticos o de la intervención humana. Las variantes con actividad biológica de una protoxina de insecto o una proíeasa de iníesíino de inseclo de la invención íendrán aproximadameníe al menos un 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de ideníidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la proleína nativa, determinada empleando los programas de alineación de secuencias y los parámetros descritos en otra parte de la presente. Una variante biológicamente activa de una proteína de la invención puede diferir de dicha proteína por tan poco como 1-15 residuos de aminoácidos, tan poco como 1-10, tal como 6-10, tan poco como 5, tan poco como 4, 3, 2 o aún 1 residuo de aminoácido. Las proteínas de la invención se pueden alterar de diversas maneras, incluyendo substiíuciones, supresiones, íruncamieníos e inserciones de aminoácidos. Los méíodos para realizar dichas manipulaciones son conocidos en general en la lécnica. Por ejemplo, se pueden preparar variantes y fragmentos de secuencias de aminoácidos de las protoxinas o proteínas proteasa mediante mutaciones en el ADN. Los métodos para llevar a cabo la mutagénesis y las alteraciones de los polinucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 82: 4dd-492; Kunkel ef al. (1987) Enzymol. 154: 367-382; Patenle de EE.UU. N°: 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York) y las referencias ciíadas en las mismas. Los lineamientos para efectuar las sustiíuciones de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se pueden consultar en el modelo de Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), incorporada en la presente a modo de referencia. Las sustiíuciones conservadoras, íal como el intercambio de un aminoácido por oíro de propiedades similares, son ópíimas. Por consiguieníe, los genes y polinucleófidos de la invención incluyen íanío las secuencias naíurales como las formas mulantes. De la misma manera, las proteínas de la invención abarcan tanlo las proteínas naturales como las variaciones y formas modificadas de las mismas. Dichas variantes continúan reteniendo la actividad deseada. Evidentemeníe, las mutaciones que se efectuarán en el ADN que codifica las variantes no deben colocar la secuencia fuera del marco de lectura y, con preferencia, no van a crear regiones complementarias que podrían producir una estrucíura de ARNm secundaria. Véase, la Publicación de la Soliciíud de Paíeníe EP N°:75.444 No se espera que las supresiones, inserciones y susíiíuciones de las secuencias de proíeínas comprendidas en la preseníe produzcan cambios radicales en las caracteríslicas de las proíeínas. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efeclo exaclo de la sustitución, supresión o inserción antes de producirla, el especialista en la técnica comprenderá que el efecto será evaluado por medio de ensayos de monitoreo de rutina. Es decir, la actividad de una protoxina o toxina de insecto puede evaluarse, por ejemplo, mediante ensayos de alimentación de insectos. Véase, por ejemplo, Marrone ef al. (1985) J. Econ. Entomol. 78:290-293 y Czapla y Lang (1990) supra, incorporada en la presente a modo de referencia. Los ensayos para evaluar la actividad proteolííica de una proleasa de iníeslino de insecto de la invención son bien conocidos en la íécníca. Las varianles de polinucleólidos y proteínas también abarcan secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico, tal como recombinacíón de ADN. Con dicho procedimiento se pueden manipular una o más secuencias codificantes diferentes para crear una nueva proteína pesticida que posea las propiedades deseadas. De esta manera, se generan bibliotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de secuencias de polinucleólidos relacionadas que comprenden regiones de secuencia con una idenlidad de secuencia sustancial y que pueden ser recombinadas de forma homologa in vitro o in vivo. Por ejemplo, utilizando este enfoque, se pueden recombinar motivos de secuencia que codifican un dominio de interés entre el gen de la invención y otros genes conocidos con el fin de obtener un gen nuevo que codifique una proteína con mejoras en la propiedad de interés, tal como una mayor Km en el caso de una proteasa de intestino de insecto. Las estrategias para dichas recombinaciones de ADN son conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91 : 10747-10751 ; Stemmer (1994) Nature 370: 389-391 ; Crameri ef al. (1997) Nature Biotech. 436-438; Moore ef al. (1997) J. Mol. Biol. 272: 336-347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci.

EE.UU. 94: 4504-4509; Crameri et al. (1998) Nature 391 : 286-291 ; y las Patentes de EE.UU. N°: 5.605J93 y 5.837.456. Los polinucleótidos de la invención se pueden utilizar para aislar las secuencias correspondientes de otros organismos, en particular de oirás plantas o insectos. De esta manera, se pueden utilizar métodos tales como PCR, hibridación y semejantes para identificar dichas secuencias sobre la base de su homología de secuencia con las secuencias que se describen en la presente. Las secuencias aisladas sobre la base de su identidad de secuencia con las secuencias completas de proloxina de insecto, toxina de insecío o proleasa de intestino de insecío que se deíallan en la preseníe, o las variantes y los fragmentos de las mismas, eslán comprendidas por la presenie invención. Dichas secuencias ¡ncluyen secuencias que son ortólogas de las secuencias descriptas. El término "ortólogos" se refiere a genes derivados de un gen anceslral común que se encuentra en diferentes especies como resultado de la especiación. Los genes presentes en diferentes especies son considerados ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o las secuencias de proteínas codificadas por las mismas comparte al menos un 60%, 70%, 75%, 80%, 65%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de ¡deníidad de secuencia. Las funciones de los ortólogos a menudo están muy conservadas enlre las especies. Por lo íanío, los polinucleóíidos aislados que codifican una proloxina de insecto, toxina de insecto o una proleasa de intestino de insecto y que se hibridizan bajo condiciones severas con las secuencias descritas en la presente, o con variantes o fragmentos de las mismas, están comprendidas por la presente invención. En un enfoque por PCR los cebadores de oligonucleótidos pueden ser diseñados para utilizarse en reacciones de PCR para amplificar la secuencia de ADN correspondiente a partir de ADNc o ADN genómico extraído de cualquier organismo de interés. Los métodos para diseñar cebadores para PCR y clonación por PCR son conocidos en general en la técnica y se describen en Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York). Véase también Innis ef al., eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Nueva York); Innis y Gelfand, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, Nueva York); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, Nueva York). Los métodos de PCR conocidos ¡ncluyen, a modo de ejemplo, los métodos que emplean cebadores apareados, cebadores anidados, cebadores individuales específicos, cebadores degenerados, cebadores específicos de genes, cebadores específicos de vectores, cebadores parcialmente no coincidentes y semejantes. En las técnicas de hibridación, se utiliza toda o parte de un polinucleótido conocido como una sonda que se hibridice selectivamente con otros polinucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de ADN genómico clonado o fragmentos de ADNc (es decir, bibliotecas de ADN genómico o ADNc) de un organismo elegido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de ADN genómico, fragmentos de ADNc, fragmeníos de ARN u oíros oligonucleótidos y se pueden marcar con un grupo detectable, tal como 32P o cualquier otro marcador detecíable. Así, por ejemplo, las sondas de hibridación se pueden preparar medianíe el marcado de oligonucleóíidos sinlélicos en base a los polinucleóíidos de la invención. Los méíodos de preparación de sondas para la hibridación y para la consírucción de bibliotecas de ADNc y genómicas son conocidos en general en la íécnica y se describen en Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboraíory Press, Plainview, Nueva York).

Por ejemplo, se puede usar el polinucleóíido completo de una proleasa de intestino de insecto que se describe en la presente, o una o más porciones del mismo, como una sonda capaz de hibridizarse específicamente con los polinucleótidos y los ARNm mensajeros correspondientes de proleasa de intestino de insecto. Para lograr una hibridación específica bajo una variedad de condiciones, dichas sondas incluyen secuencias que son únicas eníre las secuencias de polinucleólidos de proleasas de intestino de insecto y que preferentemente son de al menos aproximadamente 10 nucleótidos de longitud y más preferentemente son de al menos aproximadamente 20 nucleótidos de longitud. Estas sondas se pueden usar para amplificar los polinucleófidos correspondientes de proteasa de inteslíno de insecto a partir de un organismo seleccionado medianíe PCR. Esíe procedimiento se puede usar para aislar secuencias codificantes adicionales a partir de un organismo deseado, o como un ensayo de diagnósíico para determinar la presencia de secuencias codificantes en un organismo. Las íécnicas de hibridación incluyen búsqueda y examen con hibridación de bibliotecas de ADN plaqueadas (ya sean placas o colonias; véase, por ejemplo, Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboraíory Press, Plainview, Nueva York). La hibridación de dichas secuencias se puede llevar a cabo bajo condiciones severas. Las "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" comprenden condiciones bajo las cuales una sonda hibridiza con su secuencia blanco, con un grado deíecíablemeníe mayor que con oirás secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces respecío del nivel basal). Las condiciones severas dependen de la secuencia y serán difereníes bajo disíinías circunsíancias. El conírol de la severidad de las condiciones de hibridación y/o de lavado, permite identificar secuencias blanco que son un 100% complementarias de la sonda (sonda homologas). Como alternativa, es posible ajustar las condiciones de severidad para permitir alguna falta de coincidencia en las secuencias de modo que se deteclan grados más bajos de similiíud (sondas heíerólogas). En general, una sonda íiene menos que aproximadamente 1000 nucleóíidos de longiíud, a menudo menos que 500 nucleólidos de longílud. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sales es menor que aproximadamente 1 ,5 M del ion de Na, íípicameníe eníre 0,01 y 1 ,0 M aproximadamenle de concenlración del ¡on de Na (u otras sales) a pH entre 7,0 y 8,3 y la temperaíura es de al menos 30 °C aproximadameníe para sondas cortas (por ejemplo, enlre 10 y 50 nucleóíidos) y al menos 60 °C aproximadameníe para sondas largas (por ejemplo, más de 50 nucleóíidos). Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizaníes, íal como formamida. Los ejemplos de condiciones de baja severidad incluyen hibridación con una solución amortiguadora de formamida al 30 a 35%, NaCI 1 M, SDS 1 % (dodecílsulfalo de sodio) a 37 °C y un lavado en SSC 1X a 2X (SSC 20X = NaCI 3,0 M / ciírato írisódico 0,3 M) a 50-55 °C. Los ejemplos de condiciones de severidad moderada incluyen hibridación en formamida 50 a 45%, NaCI 1 M, SDS 1 % a 37 °C y un lavado en SSC 0,5X a 1X a 55-60 °C. Los ejemplos de condiciones de severidad alia incluyen hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1 % a 37 °C y un lavado en SSC 0,1 X a 60-65 °C. Oplaíivamenle, las soluciones amortiguadoras de lavado pueden comprender SDS eníre aproximadameníe 0,1% y aproximadamente 1%. La duración de la hibridación es en general menor que 24 horas aproximadamente, habitualmente entre aproximadamente 4 y aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será suficiente como para alcanzar el equilibrio. La especificidad depende típicamente de los lavados de post-hibridacíón, siendo los factores crííicos la fuerza iónica y la temperalura de la solución final de lavado. Para los híbridos ADN-ADN, la Tm se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984), Anal. Biochem., 138:267-264: Tm = 81 ,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de guanosina y nucleótidos de citosína en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperalura (bajo fuerza iónica y pH definidos) a la cual un 50% de una secuencia blanco complemeníaria se hibridiza con una sonda perfectamente coincídente. La Tm se reduce en aproximadameníe 1 °C por cada 1 % de falla de coincidencia; por lo lanto, es posible ajustar la Tm, las condiciones de hibridación y/o de lavado para hibridizar las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >90% de identidad, la Tm se puede disminuir en 10°C. En general, las condiciones severas se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones muy severas pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 1 , 2, 3 ó 4°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 ó 10°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja severidad pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 11 , 12, 13, 14, 15 ó 20aC menos que el punto de fusión térmica (Tm). Usando la ecuación, las composiciones de hibridación y lavado y la Tm deseada, los especialislas comprenderán que se describen inherentemente variaciones en la severidad de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de falía de coincidencia deseado da como resulíado una Tm menor que 45 °C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida) se prefiere incremeníar la conceníración de SSC para que se pueda usar una íemperalura más alta. Una extensa guía para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology— Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, capítulo 2 (Elsevier, Nueva York); y Ausubel et al., eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York). Véase Sambrook ef al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboraíory Press, Plainview, Nueva York). Los siguientes términos se uíilizan para describir las relaciones de secuencias enlre dos o más polinucleólidos o polipéplidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia". (a) Como se lo usa en la presente, una "secuencia de referencia" es una secuencia definida, usada como la base para realizar una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la toíalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, un segmenío de una secuencia genéíica o de ADNc de longiíud compleía o la secuencia complete del gen o del ADNc. (b) Tal como se utiliza en la presente, una "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleófidos, donde la secuencia de polinucleóíidos en la veníana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia o huecos) al compararla con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para una alineación óptima de los dos polinucleótidos. En general, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos de longitud y, optaíivameníe, puede ser de 30, 40, 50, 100 o más de longiíud. Los especialisías en la técnica comprenderán que a fin de eviíar una gran similitud con la secuencia de referencia debido a la inclusión de faifas de coincidencia en la secuencia de polinucleóíidos, se inlroduce típicamente una penalización por falta de coincidencia y se resta de la cantidad de coincidencias. Los métodos de alineación de secuencias para una comparación son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, la determinación del porcentaje de identidad enlre dos secuencias cualesquiera se puede llevar a cabo usando un algoriímo malemáíico. Los ejemplos no limiíafivos de dichos algoritmos matemálicos son: el algoriímo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4: 11-17; el algoriímo de homología local de Smiíh et al. (1981 ) Adv. Appl. Math. 2: 482; el algorilmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453; el méíodo de alineación de búsqueda local de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-2448; el algoriímo de Karlin y Alíschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:5873-5677. Se pueden ufilizar las implemeníaciones compuíarizadas de eslos algorilmos matemáticos para la comparación de secuencias con el fin de determinar la identidad de secuencia. Dichas implementaciones incluyen, a modo de ejemplo: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligeneíics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software Wisconsin Geneiics, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranlon Road, San Diego, California, EE.UU.). Las alineaciones que emplean esíos programas se pueden efecíuar uíilizando los parámeíros predeíerminados. El programa CLUSTAL esíá muy bien descrípío por Higgins eí al., (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins ef al. (1989) CABIOS 5:151-153; Corpeí ef al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang ef al. (1992) CABIOS: 8:155-65; y Pearson ef al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algorilmo de Myers y Miller (1988) supra. Se puede usar una labia de peso de residuos PAM 120, una resíricción para la falta de coincidencia de 12 y una restricción por falta de coincidencia de 4 con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Allschul ef al (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algorilmo de Karlin y Alfschul (1990) supra. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden efectuar con el programa BLASTN, calificación = 100, longiíud de palabra = 12, para obtener las secuencias de nucleóíidos homologas de una secuencia de nucleóíidos codificadora de una proíeína de la invención. Las búsquedas de proíeínas BLAST se pueden efecíuar con el programa BLASTX, calificación = 50, longiíud de palabra = 3, para obíener las secuencias de aminoácidos homologas de una proíeína o polípépíido de la invención. Con el fin de obíener alineaciones con faltes de coincidencia para efecíuar una comparación, se puede emplear Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Allschul eí al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Como alternativa, se puede utilizar PSI- BLAST (en BLAST 2.0) para efectuar una búsqueda iterada que permite detectar relaciones distantes entre las moléculas. Véase, Altschul et al. (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden usar los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Véase www.ncbi.nlm.nih.gov. Las alineaciones también se pueden realizar manualmente por inspección. A menos que se indique lo contrario, los valores de identidad/similiíud de secuencia provisíos en la preseníe se refieren a los valores obtenidos ulilizando GAP Versión 10 con los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando un Peso GAP de 50 y un Peso de Longitud de 3; y la malriz de calificación de nwsgapdna.cmp; % de idenlidad y % similitud para una secuencia de aminoácidos usando un Peso GAP de 8 y un Peso de Longitud de 2, y la matriz de calificación BLOSUM62; o cualquier programa equivalente de los mismos. El término "programa equivalente" significa cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, genera una alineación que presenta coincidencias de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos y una identidad de secuencia porcenlual idéníica cuando se compara con la alineación correspondienle generada por el programa GAP Versión 10. GAP emplea el algorilmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443-453, para hallar la alineación de dos secuencias completas que maximice la cantidad de coincidencias y minimice la cantidad de faltas de coincidencias. GAP tiene en cuenta todas las alineaciones y posiciones posibles de las faltas de coincidencia y crea una alineación con la mayor cantidad de bases coincidentes y la menor cantidad de faltas de coincidencias. Permite la provisión de un límite de creación de faltas de coincidencias y un límite de la extensión de las faltas de coincidencias, expresados en unidades de bases coincidentes. GAP debe obtener una ganancia con el límite de creación de faltas de coincidencias en cantidades de coincidencias por cada falta de coincidencia que inserta. Si se elige un límite de la extensión de las fallas de coincidencias mayor que cero, GAP debe, además, proveer una ganancia por cada falta de coincidencia insertada, cuya longitud es la cantidad de faltas de coincidencia, con respecto al límite de extensión de las fallas de coincidencias. Los valores predeterminados para la penalidad por creación de faltas de coincidencias y para la penalidad por la extensión de las faltas de coincidencias en las secuencias de proteínas en la Versión 10 del paquete de software de Wisconsín Genetics GCG son de 8 y 2,. respetivamente. Para las secuencias de nucleólidos el límite de creación de falta de coincidencia predeterminado es de 50, en tanto el límite de falta de coincidencia predeterminado es de 3. Los límites de creación de faltes de coincidencia y de extensión de las faltes de coincidencia se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros de 0 a 200. Así, por ejemplo, los valores de los límites de creación de fallas de coincidencia y de extensión de las faltas de coincidencia pueden ser de 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o mayor. GAP representa un miembro de la familia de mejores alineaciones. Esta familia puede tener muchos miembros, pero ningún otro miembro íiene una mejor calidad. GAP muesíra cualro valores de calificación para las alineaciones: Calidad, Relación, Idenlidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada para alinear las secuencias. La Relación es la calidad dividida por la cantidad de bases en el segmento más corto. La Identidad porcentual es el porcentaje de los símbolos que coinciden realmente. La Similitud porceníual es el porcenlaje de los símbolos que son similares. No se lienen en cuenta los símbolos que son cruzados con respecto a las faltas de coincidencia. Se califica una similitud cuando el valor de la matriz de calificación para un par de símbolos es mayor o igual que 0,50, como el umbral de similitud. La matriz de calificación usada en la Versión 10 del paquete de sofíware de Wisconsin Geneíics GCG es BLOSUM62 (véase, Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:10915 (c) Tal como se uíiliza en la presente, la "idenlidad de secuencia" o "idenlidad" en el contexto de dos secuencias de polinucleótidos o de polipépíidos se refiere a los residuos en las dos secuencias que son ¡guales cuando se alinean por correspondencia máxima en la veníana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencias se utiliza con referencia a proteínas se comprenderá que las posiciones de los residuos que no son idénticos a menudo difieren por sustituciones conservadoras de aminoácidos, donde los residuos aminoacídicos son sustiíuidos por otros residuos aminoacídicos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por ello no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren por sustiíuciones conservadoras, el porceníaje de idenlidad de secuencia se puede ajustar hacia arriba con el fin de corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren por dichas sustiíuciones conservadoras poseen "similitud de secuencia" 'o "similitud". Los medios para efectuar este ajuste son bien conocidos por los especialistas en la técnica. Típicamente, comprende la calificación de una sustiíución conservadora como una falla de coincidencia parcial en lugar de complete, con lo cual aumenta el porcentaje de identidad de secuencias. Así, por ejemplo, cuando un aminoácido idéntico recibe una calificación de 1 y una sustitución no conservadora recibe una calificación de cero, la sustiíución conservadora recibe una calificación eníre cero y 1. La calificación de susíiíuciones conservadoras se calcula, por ejemplo, como se implemenía en el programa PC/GENE (Iníelligeneíics, Mountain View. California). (d) Como se lo usa en la presente, el "porcentaje de identidad de secuencia" designa el valor determinado por medio de la comparación de dos secuencias alineadas en forma óptima a lo largo de una veníana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleólidos en la veníana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltes de coincidencia), en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones), para una alineación ópíima de las dos secuencias. El porceníaje se calcula determinando la caníidad de posiciones en las cuales aparece la base de ácido o residuo aminoacídico en ambas secuencias para obíener la caníidad de posiciones coincidenles, dividiendo la caníidad de posiciones coincidentes por la cantidad toíal de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. El uso del término "polinucleóíido" no preíende limiíar la presente invención a los polinucleólidos que comprenden ADN. Los especialislas en la técnica comprenderán que los polinucleótidos puede comprender ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos. Dichos desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen lanío moléculas nalurales como análogos sintéticos. Los polinucleótídos de la invención también abarcan todas las formas de secuencias incluyendo, a modo de ejemplo, formas de cadena simple, formas de cadena doble, horquillas, estructuras de tallo-y-bucle y semejantes. Las secuencias de polinucleótidos de la protoxina de insecto, toxina de insecto y proteasa de ¡nteslino de insecto de la invención se pueden proveer en casetos de expresión para su expresión en la plañía de interés. El cásele incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' ligadas operaíivamente a un polinucleófido de la invención. El término "ligado operativamente" se refiere a un ligamiento funcional entre dos o más elementos. Por ejemplo, un ligamiento operativo entre un polinucleótido de interés y una secuencia reguladora (es decir, un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido de interés. Los elementos ligados operativamente pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se usan con referencia a la unión de dos regiones de codificación de proteínas, el término ligado operativamente significa que las regiones de codificación están en el mismo marco de lectura. El cásete puede contener además al menos un gen adicional que será coíransformado en el organismo. Como alíemaíiva, el o los genes adicionales pueden iníroducirse en múlííples casetes de expresión. Dicho cásete de expresión se provee con una pluralidad de silios de reslricción y/o silios de recombinación para insertar el polinucleóíido de la proíoxina de insecío o proíeasa de inlesíino de insecto bajo la regulación de íranscripción de las regiones reguladoras. El cásele de expresión puede conlener además genes marcadores seleccionables. El cásete de expresión incluirá en la dirección de transcripción 5'-3\ una región de inicio de la transcripción y traducción (es decir, un promoíor), un polinucleólido de la invención y una región de terminación de la transcripción y traducción (es decir, región de terminación) funcional en plañías. Las regiones reguladoras (es decir, promotores, regiones reguladoras de la transcripción y regiones de terminación de la traducción) y/o el polinucleótido de la invención pueden ser naíivas/análogas para la célula huésped o enlre sí. Como allemaíiva, las regiones reguladoras y/o el polinucleóíido de la invención pueden ser heíerólogas de la célula huésped o eníre sí. Tal como se uíiliza en la presente, el término "heterólogas" con referencia a una secuencia es una secuencia originaria de una especie extraña o, si es de la misma especie, está modificada susíancialmeníe con respeclo a su forma naliva en cuanto a composición y/o locus genómico por intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor ligado operativamente a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de la especie de la cual deriva el polinucleótido o, si es de la misma especie o una especie análoga, uno o ambos están sustancialmeníe modificadas con respecto a su forma y/o locus genómico original, o el promotor no es el promotor nativo para el polinucleótido ligado operativamente. Tal como se utiliza en la presente, un gen quimérico comprende una secuencia de codificación ligada operalivamenle a una región de inicio de la íranscripción que es heíeróloga con respeclo a la secuencia de codificación. Aunque puede ser óplimo expresar las secuencias usando promotores heterólogos, se pueden usar las secuencias del promotor nativo. La región de terminación puede ser nativa con respecto a la región de inicio de la transcripción, puede ser nativa con respecto al polinucleótido de interés ligado operativamente, puede ser nativa con respecto a la planta huésped o puede derivar de otra fuente (es decir, puede ser extraña o heteróloga con respecto al promotor, al polinucleótido de interés, al huésped o cualquier combinación de los mismos). Las regiones de terminación adecuadas se encueníran disponibles en el plásmido Ti de A. tumefaciens, lal como las regiones de terminación de la octopina sintetasa y nopalina sinteíasa. Véase lambién Guerineau ef al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfool (1991 ) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991 ) Genes Dev. 5:141-149; Mogen ef al. (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe et al. (1990) Gene 91 :151-158; Bailas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi ef al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639. Cuando corresponda, los polinucleótidos pueden ser optimizados para una mayor expresión en la planta transformada. Es decir, los polinucleótidos se pueden sinteíizar uíilizando los codones vegeíales preferidos para una mejor expresión. Véase, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 por una descripción de la utilización de codones preferida para el huésped. Existen métodos disponibles en la lécnica para siníeíizar los genes con preferencia por plantas. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N°: 5.3d0.831 y 5.436.391 , y Murray ef al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498, incorporada en la presente a modo de referencia.

Se conocen oirás modificaciones de secuencia que mejoran la expresión del gen en una célula huésped. Dichas modificaciones incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espúreas, señales de silios de procesamiento de exón-intrón, repeticiones tipo transposón y otras secuencias del tipo bien caracterizadas que pueden resultar nocivas para la expresión del gen. El contenido de G-C de la secuencia puede ser ajusfado en niveles promedio para una célula huésped dada, calculado con referencia a genes conocidos que se expresan en dicha célula huésped. Cuando fuera posible, la secuencia será modificada a fin de evitar las estrucluras de ARNm secundarias en horquilla predichas. Los caseíes de expresión pueden, además, contener secuencias directrices 5'. Dichas secuencias directrices pueden actuar mejorando la traducción. Las direcírices de la íraducción son conocidas en la técnica e incluyen: las directrices de picornavirus, por ejemplo, directriz EMCV (región no codificadora 5' de encefalomiocarditis) (EIroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 86: 6126-6130); directrices potivirus, por ejemplo, directriz TEV (virus del etch de tabaco) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2):233-236), el líder MDMV (el virus del mosaico del maíz enano)( Virology 154: 9-20), y las proteínas de unión a la cadena pesada de las inmunoglobulinas humanas (BiP)(Macejak et al. (1991 ) Nature, 353: directriz no íraducida del ARNm de la proíeína de la cubierta del virus en mosaico de alfalfa (AMV ARN 4). (Jobling eí al., (1987) Nature, 325: 622-625); directriz del virus en mosaico de íabaco (TMV), (Gallie eí al. (1989) en Molecular Biology de RNA, ed. Cech (Liss, Nueva York), págs. 237-256); y direcíriz del virus moteado cloróíico de maíz (MCMV) (Lommel eí al. (1991 ) Virology 81 :382-385). Véase también, Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Cuando se prepara el cásete de expresión, se pueden manipular los diversos fragmentos de ADN con el fin de proveer las secuencias de ADN en la orieníacíón apropiada y, según corresponda, en el marco de lectora adecuado. Con esíe fin se pueden emplear adapladores o ligadores para unir los fragmeníos de ADN o se pueden utilizar otras manipulaciones para proveer sitios de reslricción convenientes, eliminar ADN superfluo, eliminar siíios de reslricción o semejantes. Con este propósito, se puede utilizar mutagénesis in vitro, reparación de cebadores, digestiones de reslricción, alineamiento, resusíiíuciones, por ejemplo íransiciones y íransversiones. Generalmeníe, el cásete de expresión comprenderá íambién un gen marcador seleccionable para la selección de las células íransformadas. Los genes marcadores seleccionables se uíilizan para la selección de células o tejidos íransformados. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resislencia a anlibióticos, tal como aquellos que codifican la neomicina fosfoíransferasa II (NEO) y la higromicina fosfoíransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuesíos herbicidas, íal como glufosinaío de amonio, bromoxinilo, imídazolinonas y 2,4-diclorofenoxiaceíaío (2,4-D). Oíros marcadores de selección incluyen marcadores fenoíípicos, íal como ß-galacíosidasa y proíeínas fluorescentes tal como la proteína fluorescente verde (GFP) (Su et al. (2004) Biotechnol Bioeng 85: 610-9 y Fetler et al. (2004) Plant Cell 16: 215-28), proíeína ciano fluorescente (CYP) (Bolle ef al. (2004) J. Cell Science 117: 943-54 y Kalo et al. (2002) Plant Physiol 129: 913-42) y la proteína fluorescente amarilla (PhiYFP™ de Evrogen, véase, Bolte et al. (2004) J. Cell Science 117:943-54). Por otros marcadores de selección adicionales, véase en general, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511 ; Chrislopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 69:6314-6318; Yao et al. (1992) Cell 71 :63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley ef al. (1980) en The Operon, págs. 177-220; Hu ef al. (1987) Cell 48:555- 566; Brown et al. (1987) Cell 49:603-612; Figge ef al. (1988) Cell 52:713-722; Deuschle ef a/. (1989) Proc. A/af/. Acad. Sci. EE.UU. 86:5400-5404; Fuersí et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 86:2549-2553; Deuschle ef al. (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Tesis Ph.D., Universidad de Heidelberg; Reines ef al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90:1917-1921 ; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambrelíi ef al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:3952-3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88:5072-5076; Wyborski et al. (1991 ) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10:143-162; Degenkolb ef al. (1991 ) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidí et al. (198d) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Tesis Ph.D., Universidad de Heidelberg; Gossen ef ai. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 89:5547-5551 ; Oliva ef al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 76 (Springer-Verlag, Berlín); Gilí ef al. (1988) Nature 334:721-724. Esías descripciones se incorporan en la preseníe a modo de referencia. La lisia anterior de genes marcadores seleccionables no se ofreció en un senlido limiíativo. Se puede uíilizar cualquier gen marcador seleccionable en la presenie invención. Se puede utilizar en la práctica de la invención una cantidad de promotores. Los promotores se pueden seleccionar sobre la base del resultado deseado. Es decir, los ácidos nucleicos se pueden combinar con promotores consíilutivos, con preferencia por tejidos u otros promotores para su expresión en plantas. Dichos promotores constilulivos incluyen, por ejemplo, el promoíor nuclear de Rsyn7 y oíros promoíores consíítuíivos como se describe en WO 99/43838 y en la Paíeníe de EE.UU. N°: 6.072.050; el promoíor nuclear CaMV 35S (Odell ef al. (1985) Nature 313:810-812); el promoíor de acíina de arroz (McEIroy ef al. (1990) Plant Cell 2:163-171 ); ubiquilina (Chrisíensen ef al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Chrisíensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 16:675-689); pEMU (Lasí et al. (1991 ) Theor. Appl. Genet. 81 :581-588); MAS (Velten ef al. (1984) EMBO J. 3:2723-2730); el promoíor ALS (Patente de EE.UU. N°: 5.659.026) y semejantes. Otros promotores constiíuíivos incluyen, por ejemplo, las que se describen en las Patentes de EE.UU. N°: 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121 ; 5.569.597; 5.466J85; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; y 6.177.611. En general, será beneficioso expresar el gen a paríir de un promotor inducíble, en particular, a partir de un promotor inducible por patógenos. Dichos promotores incluyen los de las proteínas relacionadas con la patogénesis (prtíteínas PR), que son inducidas después de una infección con un patógeno, por ejemplo, las proteínas PR, las proteínas SAR, la beta-1 ,3-glucanasa, la quitinasa, etcétera. Véase, por ejemplo, Redolfi ef al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Véase también WO 99/43819, incorporadas en la presente a modo de referencia. Son de interés los promotores que se expresan localmente o cerca del sitio de infección del patógeno. Véase, por ejemplo, Marineau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matíon ef al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325- 331 ; Somsisch et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 83:2427-2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; y Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 93:14972-14977. Véase lambién, Chen ef al. (1996) Plant J. 10:955- 966; Zhang ef al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91 :2507-2511 ; Warner ef al. (1993) Plant J. 3:191-201 ; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1 : 961-968; Patente de EE.UU. N°: 5J50.386 (inducible por nematodes) y las referencias citadas allí. Es particularmente de interés el promotor inducible del gen PRms del maíz, cuya expresión es inducida por el patógeno Fusarium moniliforme (véase, por ejemplo, Cordero ef al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41 :189-200). Además, debido a que los patógenos entran en las plantas a través de lesiones o daños provocados por insectos, puede usarse un promotor inducible por lesiones en las construcciones de la invención. Dichos promoíores inducibles por lesiones incluyen el promoíor del gen del inhibidor de la proíeinasa de papa (pin II) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan ef al. (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wunl y wun2, Patente de EE.UU. N°: 5.428.148; winl y win2 (Síanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sislemina (McGurl ef al. (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier ef al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp ef al. (1993) FEBS Letters 323:73-76); el gen MPl (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2):141-150); y semejantes incorporados en la preseníe a modo de referencia. Se pueden utilizar promotores regulados por compuestos químicos para modular la expresión de un gen en una planta a través de la aplicación de un regulador químico exógeno. Dependiendo del objetivo a alcanzar, el promotor puede ser un promotor inducible por sustancias químicas, cuando la aplicación de la sustancia química induce la expresión del gen, o un promotor reprimible por compuestos químicos cuando la aplicación del compuesto químico reprime la expresión del gen. Los promotores inducibles por compuestos químicos son bien conocidos en la técnica e incluyen, en un sentido no limitaíivo, promotor ln2-2 del maíz, que es activado por el herbicida bencensulfonamida, el promoíor GST del maíz que es acíivado por compuesíos elecírofílicos hidrofóbicos que son utilizados como herbicidas pre-emergentes, y el promotor PR-1 a del labaco, que es aclivado por ácido salicílíco. Otros promotores regulados por compuestos químicos de interés incluyen promotores que responden a esteroides (véase, por ejemplo, promotores inducibles por glucocorticoides en Schena et al. (1991 ) Proc. Natl. Acad Sci. EE.UU. 88:10421-10425 y McNellis ef al. (1998) Plant J. 14(2): 247-257) y promotores inducibles por íelracíclina y reprimíbles por íelracíclina (véase, por ejemplo, Gaíz ef al. (1991 ) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, y las Patentes de EE.UU. N°: 5.814.618 y 5J89.156), incorporadas en la presenie a modo de referencia. Se pueden utilizar promotores con preferencia por tejidos para obtener una mayor expresión de la protoxina de insecto dentro de un tejido vegetal en particular. Los promoíores con preferencia por lejidos incluyen aquellos que se describen en Yamamolo et al. (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157-168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341 ; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco ef al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129- 1138; Matsuoka ef al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90(20):9586-9590; y Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3):495-505. Si fuera necesario, es posible modificar dichos promotores para obtener una expresión débil. Los promotores con preferencia por hojas son conocidos en la íécnica.

Véase, por ejemplo, Yamamoto ef al. (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-77d; Gotor ef al. (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; y Maísuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90(20):9586-9590. En realizaciones particulares, las proíoxínas de insecto modificadas o las toxinas de insecío modificadas se expresan selecíivameníe en las raíces de las plañías donde es probable que tengan lugar los daños relacionados con los insectos. Los promoíores específicos de raíz son conocidos y se pueden seleccionar eníre iodos los que se encuenlran disponibles de la literatura o se pueden aislar de novo a partir de diversas especies compaíibles. Véase, por ejemplo, Hire el al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gen de la glulamina sintetasa específico de la raíz de soja); Keller y Baumgartner (1991 ) Plant Cell 3(10): 1051-1061 (elemento de control específico de raíz en el gen GRP 1.8 de las judías Francesas); Sanger ef al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 433-443 (promotor específico de raíz del gen de la manopina sintetasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); y Miao ef al. (1991 ) Plant Cell 3(1 )11-22 (clon de ADNc de longitud toíal que codifica la gluíamina sinleíasa cilosólica (GS), que se expresa en las raíces y en los nodulos de las raíces de la soja). Véase íambién, Bogusz eí al. (1990) Plant Cell 2(7): 633-641 , en donde se aislaron dos promotores específicos de raíces de los genes de hemoglobina de la no leguminosa que fija nitrógeno Parasponia andersonii y la no leguminosa que no fija nitrógeno relacionada Trema tomentosa. Los promotores de estos genes se ligaron al gen informante ß- glucuronidasa y se introdujeron en la especie no leguminosa Nicotiana tabacum y en la especie leguminosa Lotus corniculatus y en ambos casos se conservó la actividad promotora específica de raíz. Leach y Aoyagi (1991 ) describen su análisis de los promotores de los genes inductores de raíz de gran expresión rolC y rolD de Agrobacterium rhizogenes (véase Plant Science (Limerick) 79(1 ):69-76). Ellos concluyeron que los determinantes del ADN de poíenciadores y con preferencia por tejidos esíán disociados en dichos promoíores. Teeri eí al. (1989) uíilizaron fusión de genes con lacZ para demosfrar que el gen de ADN-T de Agrobacterium codificador de una ocíopina siníeíasa es especialmente acíiva en la epidermis de la punía de la raíz y que el gen TR2' es específico de raíces en la planta intacla y esíimulada por lesiones en el tejido foliar, una combinación de caracíerísíicas especialmente deseable para su uso con un gen insecíicida o larvicida (véase EMBO J 8(2):343-350) El gen TR1 ', fusionado a nptll (neomicína fosfoíransferasa II) presentó caraclerísíicas similares. Oíros promotores con preferencia por raíces incluyen al promoíor del gen VÍENOD-GRP3 (Kusíer et al (1995) Plant Mol. Biol. 29(4): 759-772); y el promotor rolB (Capana ef al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691 ). Véase íambién las Patentes de EE.UU. N°: 5.837.876; 5J50.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732; y 5.023.179. Oíros promotores con preferencia por raíces que son de interés se describen en la Solicitud de Pateníe de EE.UU. N°: 11/022.111 , con el tííulo "Maize Metallothionein Promoter", preseníada el 22 de diciembre, 2004, y en la Soliciíud de Paíeníe de EE.UU. N°: 11/022.449, con el título "Maize Metallothionein 2 Promoter and Methods of Use", presentada el 22 de diciembre, 2004, cuyos contenidos se incorporan por completo en la preseníe a modo de referencia. Los promoíores "con preferencia por semillas" incluyen tanto a los promotores "específicos de semillas" (aquellos promotores que se activan durante el desarrollo de la semilla, tal como los promotores de las proteínas de almacenamienlo de semillas) como lambién a los promotores de "semillas en germinación" (aquellos promotores que se activan durante la germinación de las semillas). Véase Thompson ef al. (1969) BioEssays 10: 108, incorporada en la presente a modo de referencia. Dichos promotores con preferencia por semillas incluyen, en un sentido no limitativo, Cim1 (mensajero que induce citoquinina); CZ19B1 (zeína de 19 kDa del maíz); milps (mio-inositol-1 -fosfaío siníeíasa); (véase, WO 00/11177 y Patente de EE.UU. N°: 6.225.529, incorporadas en la preseníe a modo de referencia). La gamma-zeína es un promoíor específico del endosperma. La globulinal (Glb-1 ) es un promoíor específico de embriones represeníaíivo. Para dicoíiledóneas, los promotores específicos de semillas ¡ncluyen, a modo de ejemplo, ?-faseolina de haba, napina, /?-conglicínina, leclina de soja, cruciferina y semejantes. Para las monocofiledóneas, los promotores específicos de semilla incluyen en un sentido no limitativo, zeína de 15 kDa del maíz, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, gamma-zeína, waxy, shrunken 1 , shrunken 2, globulina 1 , etc. Véase también, WO 00/12733, en donde se divulgan promotores preferidos de semilla de los genes end 1 y end 2; incorporados en la presente a modo de referencia. Cuando se desean bajos niveles de expresión, se podrán utilizar promotores débiles. En general, un "promotor débil" es'un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante con un nivel bajo. Se propone como bajo nivel a niveles entre aproximadamente 1/1.000 transcriptos y aproximadamente 1/100.000 transcriptos, y aproximadamente de 1/500.000 transcriptos. Como alternaíiva, se reconoce que los "promotores débiles" también abarcan a los promoíores que se expresan sólo en unas pocas células y no en oirás dando un nivel de expresión total bajo. Cuando un promotor se expresa a niveles inaceptablemente altos, se pueden eliminar porciones de la secuencia del promotor, se lo puede modificar para disminuir los niveles de expresión. Tales promotores constituíivos débiles incluyen, por ejemplo, el nuclear del promotor de Rsyn7 (WO 99/4383d y Patente de EE.UU. N°: 6.072.050), el promotor nuclear de 35S CaMV y semejantes. Otros promotores constiíulivos incluyen, por ejemplo, las que se describen en las Patentes de EE.UU. N°: 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121 ; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; y 5,608,142. Véase íambién, Patenle de EE.UU. N°: 6,177,611 , incorporada en la preseníe a modo de referencia.

Los métodos de la invención comprenden la introducción de un polipéptido o de un polinucleótido en una planta. El término "introducir" significa presentar a la planta el polinucleótido o polipéptido de tal manera que la secuencia logra acceder al interior de una célula de la planta. Los métodos de la invención no dependen de un método particular para introducir la secuencia en una planta, solamente que el polinucleótido o polipéptido pueda acceder al interior de al menos una célula de la planta. En la técnica se conocen métodos para introducir polinucleótidos o polipépíidos en plañías, incluyendo, sin limiíacíones, métodos de íransformación esíable, méíodos de Iransformación íransiloria y méíodos mediados por virus. Por "Iransformación eslable", se interprete que se iníroduce la construcción de nucleólidos en una plañía, de modo que se integra en el genoma de la planta y puede ser heredada por la progenie de ésta. La "transformación transitoria" o "expresión transitoria", significa que se introduce un polinucleótido en la planta que no se integra en el genoma o bien, que se ¡níroduce un polipépíido en una planta.

Los protocolos de transformación, así como los protocolos para introducir secuencias de polipéplidos o polinucleólidos en plantas, pueden variar según el tipo de planta o célula vegetal, es decir monocotiledóneas o dicotiledóneas, pretendido para la transformación. Los métodos para introducir polipéptidos o polinucleótidos en células vegetales adecuados incluyen microinyección Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320-334; electroporación, Riggs et al. (1986) Proc.

Natl. Acad. Sci. EE.UU. 83: 5602-5606; transformación mediada por Agrobacterium, (Patenle de EE.UU. N°: 5.563.055; y Patente de EE.UU. N°: 5.981 ,840); transferencia directa de genes, Paszkowski et al., (1984) EMBO J. 3:2717-2722) y aceleración balística de partículas (véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N°: 4.945.050; la Patente de EE.UU. N°: 5.879.918; las Patentes de EE.UU. N°: 5.886.244; y 5.932.782; Tomes ef al. (1995) en Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); y McCabe ef al. (1988) Biotechnology 6: 923-926; y transformación de Lec1 (WO 00/28058). También véase Weissinger ef al. (1988) Ann Rev. Genet. 22: 421-477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27-37 (cebolla); Christou ef al. (1988) Plant Physiol. 671-674 (soja); McCabe ef al. (1988) BioíTechnology 6: 923-926 (soja); Finer y McMullen (1991 ) In vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175-182 (soja); Singh ef al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (soja); Datía et al. (1990) Biotechnology 8: 736-740 (arroz); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 85: 4305-4309 (maíz); Klein et al. (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Patentes de EE.UU. N*: 5.240.855; 5.322J83 y 5.324.646; Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91 :440-444 (maíz); Fromm ef al. (1990) Biotechnology 8: 833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogíeren ef al. (1984) Nature (Londres) 311 : 763-764; Patente de EE.UU. N°: 5J36.369 (cereales); Bylebier ef al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 84: 5345-5349 (Liliaceae); De Weí ef al. (1985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman ef al. (Longman, Nueva York), págs. 197-209 (polen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415-416; y Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560-566 (íransformación mediada por fibras); D.Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495-1505 (elecíroporación); Li ef al. (1993; Plant Cell Reports 12: 250-255 y . Chrislou y Ford (1995) Annals of Botany 75: 407-413 (arroz); Osjoda ef al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745-750 (maíz medianíe Agrobacterium tumefaciens); cuyos contenidos se incorporan en la presenie a modo de referencia. En realizaciones específicas, las secuencias de proloxina de insecto o de toxina de insecto de la invención pueden proveerse a una planta usando una variedad de métodos de transformación transitorios. Dichos métodos de íransformación transitorios incluyen, en un sentido no limitativo, la introducción de la proteína de protoxina de insecto o de toxina de insecto, o de variantes y fragmentos de la misma, directamente en la planta o la introducción de un transcripto de proteína en la planta. Dichos mélodos incluyen, por ejemplo, microinyección o bombardeo de partículas. Véase, por ejemplo, Crossway ef al. (1986) Mol Gen. Genet. 202:179-185; Nomura ef al. (1986) Plant Sci. 44:53-58; Hepler ef al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 91 :2176-2180 y Hush ef al. (1994) J. Cell Science 107:775-784, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Como alternaíiva, el polinucleóíido de la protoxina de insecío o toxina de insecío puede ser transformado transitoriamente en la planta usando técnicas conocidas en la técnica. Dichas técnicas incluyen un sislema de vecíores virales y la precipitación del polinucleótido de una manera que impida la posterior liberación del ADN. Por consiguiente, puede tener lugar una transcripción del ADN unido a partículas, pero la frecuencia con que es liberado para integrarse en el genoma es muy reducida. Dichos méíodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polieíilimina (PEÍ; Sigma N° P3143). En oirás realizaciones, el polinucleóíído de la invención puede ser introducido en plantas por contacto de dichas plantas con un virus o con ácidos nucleicos virales. En general, dichos métodos comprenden la incorporación de una construcción de nucleótidos de la invención en una molécula de ADN o ARN viral. Se considera que la protoxina de insecto modificada o toxina de insecto modificada de la invención puede ser sinteíizada inicialmeníe como parte de una poliproíeína viral, que luego puede ser procesada por proíeólisis in vivo o in vitro para producir la proíeína recombinaníe deseada. Además, se considera que los promoíores de la invención íambién abarcan los promotores utilizados para la transcripción por las ARN polimerasas virales. Los métodos para introducir polinucleólidos en plantas y expresar una proteína codificada en las mismas, que comprende moléculas de ADN o ARN virales, son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N°: Véanse, por ejemplo, las Patentes de los EEUU N° 5869191 , 5889190, 5866785, 5589367, 5316931 y Porta et al. (1996) Molecular Biotechnology 5: 209-221 ; incorporada en la presente a modo de referencia. Son conocidos en la técnica los métodos para una inserción dirigida de un polinucleótido en una ubicación específica en el genoma de la planta. En una realización, la inserción del polinucleótido en una ubicación genómica deseada se logra usando un sistema de recombinación específico del siíio. Véase, por ejemplo, W099/25821 , W099/25854, WO99/25840, W099/25855 y WO99/25853; cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Brevemente, el polinucleótido de la invención puede estar contenido en un cásete de transferencia rodeado por dos sitios de recombinación no recombinogénicos. El cásete de transferencia es introducido en una planta que ha incorporado de forma estable en su genoma un sitio blanco que está flanqueado por dos siíios de recombinación no idénticos que se corresponden con los sitios del cásete de transferencia. Se provee una recombinasa apropiada y el cásete de íransferencia es integrado en el sitio blanco. El polinucleótido de interés es integrado así en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta. Las células que fueron transformadas, se pueden cultivar hasta obtener plantas según las maneras convencionales. Véase, por ejemplo, McCormick et al. -.(1986) Plant-Cell Reports 5:81-84. Estas plantas pueden cultivarse entonces y polinizarse con la misma cepa transformada o con distintas cepas, y se puede identificar el híbrido resultaníe que presente una expresión consíiluíiva de la característica fenotipica deseada. Pueden cultivarse dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica se mantenga y se herede en forma estable, y luego pueden cosecharse las semillas para asegurar que se haya obtenido la expresión de la característica fenotípica deseada. De este modo, en la presente invención se provee una semilla transformada (también conocida como una "semilla transgénica") que coníiene un polinucleólido de la invención, por ejemplo, un cásete de expresión de la invención, incorporada en forma estable en su genoma. En determinadas realizaciones, se pueden agrupar las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención con cualquier combinación de secuencias de polinucleótidos de interés, con el fin de crear plantas con un fenotipo deseado. Una caracterísfica o rasgo, lal como se utiliza en la presente, se refiere al fenotipo derivado de una secuencia particular o de grupos de secuencias. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención se pueden apilar con cualquier otro polinucleótido que codifica polipéptidos con actividad pesticida y/o insecticida, tal como otras proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (descritas en las Patentes de EE.UU. N°: 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881 ; y Geiser et al. (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme ef al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:d25, pentina (descrita en la Patente de EE.UU. N°: 5.981.722) y semejantes. Las combinaciones generadas pueden también incluir múltiples copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la presente invención pueden lambién combinarse con cualquier gen o combinación de genes para producir plañías con una variedad de combinaciones de caracteres, incluyendo, sin limitaciones, caracteres deseables para alimentos para animales, tales genes que confieren un contenido elevado de aceite (por ejemplo, Pateníe de los EEUU N° 6.232.529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordolioninas (Patentes de los EEUU N° 5.990.3d9; 5.8d5.d01 ; 5.dd5.d02; y 5.703.409); cebada rica en lisina (Williamson eí al. (19d7) Eur. J. Biochem. 165: 99-106; y WO 96/20122); y proteínas ricas en metionina (Pedersen et al. (1966) J. Biol. Chem. 261 : 6279; Kiríhara eí al. (198d) Gene 71 : 359; y Musumura eí al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); mayor digeslibilidad (por ejemplo, proteínas de almacenamienío modificadas (Solicííud de los EEUU con N° de Orden 10/053410, preseníada el 7 de Noviembre de 2001); y tiorredoxinas (Solicitud de los EEUU con N° de Orden 10/005429, preseníada el 3 de diciembre de 2001 )), cuyas descripciones se incorporan en la presente a modo de referencia. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden apilar con caracíerísíicas deseables para una resisíencia a enfermedades o herbicidas (por ejemplo, genes de deíoxificación de fumonisina (Patente de EE.UU. N°: 5.792.931 ); avírulencia y genes de resistencia a enfermedades (Jones et al. (1994) Science 266: 789; Martin eí al. (1993) Science 262: 1432; Mindrinos eí al. (1994) Cell 78: 1089); mulantes de acetolactato sinteíasa (ALS) que conduce a resistencia a herbicidas, tal como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sínteíasa tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar); y resisíencia a glifosato (gen EPSPS)); y características deseables para productos de procesamientos o procesos tal como un alto contenido de aceites (por ejemplo, Pateníe de EE.UU. N°: 6.232.529); aceites modificados (por ejemplo, genes de ácidos grasos desaturasas (Pateníe de EE.UU. N°: 5.952.544; WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa), almidón sinlelasa SS), enzimas ramificadoras de almidón (SBE) y enzimas desramificadoras de almidón (SDBE)); y polímeros o bioplásíicos (por ejemplo, Paíeníe de EE.UU. N°: 5.602.321 ; beía-ceíoíiolasa, polihidroxibuíiraío siníetasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert eí al. (1988) J. Bacteriol. 170: 5837-5847) facilitan la expresión de políhidroxialcanoatos (PHA)), cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. También se podrían combinar los polinucleótidos de la presente invención con los polinucleótídos que proveen características agronómicas, tal como esterilidad masculina (por ejemplo, véase la Patente de EE.UU. N°: 5.583.210), longitud de tallos, momento de floración o caracterísíicas de tecnología de transformación tal como regulación del ciclo celular o direccionamiento de genes (por ejemplo, WO 99/61619; WO 00/17364 y WO 99/25621 ), cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Estas combinaciones apiladas pueden ser creadas mediante cualquier méíodo, incluyendo por ejemplo, cruzamiento dé plantas con cualquier metodología convencional o TopCross o transformación genética. Si las secuencias se apilaron por transformación genética de las plantas, se pueden combinar las secuencias de polinucleótidos de interés en cualquier momento y en cualquier orden. Por ejemplo, se puede usar una planta íransgénica que comprende una o más de las características deseadas como blanco para introducir otras características mediante una posterior íransformación. Las caracíerísíícas se pueden introducir simultáneamente en un protocolo de cotransformación con los polinucleótidos de interés provistos por cualquier combinación de casetes de íransformación. Por ejemplo, si se inlroducirán dos - secuencias, las dos secuencias pueden estar contenidas en casetes transformación separadas (trans) o pueden estar contenidas en el mismo cásete - de transformación (cis). La expresión de las secuencias de interés puede ser dirigida por el mismo promotor o por promotores diferentes. En determinados casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Esto se puede acompañar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o cáseles de sobreexpresión para generar la combinación deseada de características en la planta. Se considera además, que es posible agrupar las secuencias de polinucleótidos en una localización genómica deseada usando un sistema de recombinación específico del sitio. Véase, por ejemplo, W099/25821 , W099/25d54, WO99/25840, W099/25855 y W099/25853; cuyos contenidos se incorporan en la preseníe a modo de referencia. El cruzamiento de pedigrí comienza con el cruzamiento de dos genolipos, tales como una línea élite de interés y una de las líneas élite endocriadas con una o más características deseables (es decir, líneas que han incorporado de forma estable un polinucleótido de la invención, que presentan una actividad y/o un nivel del polipéptido de la invención modulado, etcétera), que se complementa con la línea élite de interés. Si los dos progenitores originales no proveen íodas las características deseadas, se pueden incluir otras fuentes en la población de cría. En el método del pedigrí, se autocruzan plañías superiores y se seleccionan en sucesivas generaciones filiales. En las subsiguientes generaciones filiales la condición heíerocigoía da lugar a líneas homogéneas como resulíado de auío- polinización y selección. Típicamente, en el méíodo de cría de pedigrí, se practica autocruzamiento y selección en cinco o más generaciones filiales sucesivas: F1 -> F2; F2- F3, F3 ? F4; F4 ? F5, eíc. Después de una endogamia suficieníe, las sucesivas generaciones filiales servirán para ¡ncrementar las semillas del endogámico desarrollado. En realizaciones específicas, la línea endogámíca comprende alelos homocigotas en un 95% aproximadamenle o más de sus loci. Además de usarse para crear una conversión por retrocruza, la retrocruza también se puede usar en combinación con el cruzamiento de pedigrí para modificar una línea élite de interés y crear un híbrido usando la línea élite modificada. Como se describió previamente, se puede usar retrocruza para transferir uno o más caracteres específicamente deseables, desde una línea, el progenitor donante, hacia el progenitor recurrente, que presenta características agrícolas toíales óptimas, pero aún carece de las características deseables. Sin embargo, se puede emplear el mismo procedimiento para mover la progenie hacia el genotipo del progenitor recurrente y retener al mismo tiempo muchos componentes del progenitor no recurrente, deteniendo la retrocruza en una etapa temprana y avanzando con la autocruza y selección. Por ejemplo, se crea una F1 , íal como un híbrido comercial. Esíe híbrido comercial se puede reírocruzar con una de sus líneas progeniíoras para crear una BC1 o BC2. La progenie se autocruza y selecciona de modo tal que el endogámico'recién desarrollado posea muchos de los atributos del progenitor recurrente y además varios de los atribuios deseados del progenitor no recurrente. Este enfoque permite relevar el valor y la fuerza del progenitor recurrente para su uso en nuevos híbridos y cría. Por consiguiente, una realización de esta invención es un método para realizar la conversión por retrocruza de líneas endocriadas de maíz de interés, que comprende los pasos de cruzar una plañía de una línea endocriada de maíz iníerés con una plañía donante, que comprende un gen muíante o un íransgen que confiere un carácter deseado (es decir, mayor resistencia a patógenos), seleccionar una planta de la progenie F1 que comprende el gen mutante o el transgen que confiere el carácter deseado y retrocru'zar la planta de la progenie F1 con la planta de línea endocriada de maíz de interés. Este méíodo puede comprender además el paso de obtener un perfil marcador molecular de la línea endogámica de maíz de iníerés y usar dicho perfil marcador molecular para seleccionar una plañía de progenie con la característica deseada y el perfil marcador molecular de la línea endogámica de interés. Del mismo modo, este mélodo se puede usar para producir una semilla híbrida F1 agregando un paso final, que comprende cruzar la conversión de caracteres deseada de la línea endocriada de maíz de interés con una planta de maíz diferente, con el fin de producir semillas híbridas de maíz F1 que comprenden un gen mutaníe o un íransgen que confiere el carácter deseado. La selección recurrente es un método utilizado en un programa de cría de plantas para mejorar una población de plantas. El método comprende la polinización cruzada entre plantas individuales entre sí para formar la progenie. Se cultiva la progenie y se selecciona una progenie superior utilizando numerosos métodos de selección, que incluyen plantas individuales, progenie de medio hermahas, progenie de hermanas completes, progenie auíocruzada y cruzamiento superior. La progenie seleccionada es someíída a polinización cruzada eníre sí para formar la progenie de oíra población. Esía población se plañía y nuevamente se seleccionan plantas superiores para volver a someterlas a una polinización cruzada entre sí. La selección recurrente es un proceso cíclico y por ello se puede repetir cuantas veces se desee. El objetivo de la selección recurrente es el de mejorar las caracterísíicas de una población. La población mejorada se puede usar luego como fuente de maíerial de cría para obíener líneas endogámicas que se usarán híbridos o como progenitores para un culíivar sintético. Un cullivar siníéíico es la progenie resullanle formada por el entrecruzamiento de varios endogámicos seleccionados. La selección en masa es una técnica útil cuando se usa junto con una ,. selección mejorada por marcadores moleculares. En la selección en masa, las semillas individuales se seleccionan sobre la base del fenotipo y/o genotipo. Estas semillas seleccionadas se agrupan luego y se usan para obtener la siguiente generación. La selección en masa requiere del cultivo de una población de plantas en una parcela de cultivo, la autopolinización de las plantas, la cosecha de las semillas en masa y el posterior uso de una muestra de las semillas cosechadas en masa para plantar la generación siguiente. En lugar de autopolinización, se podría usar una polinización dirigida como parte del programa de cría. La cría por mutación es uno de los numerosos métodos que se podría usar para introducir características nuevas en una línea de élite. Las mutaciones que íienen lugar esponláneamente o que son inducidas artificialmente pueden ser fuentes útiles de variabilidad para un criador de plañías. La mela de la mulagénesis artificial es la de incremenlar el índice de muíación para la caracleríslica deseada. Los índices de muíación se pueden incremeníar con muchos medios difereníes incluyendo íemperaíura, almacenamienío de semillas a largo plazo, condiciones del culíivo íisular, radiación (íal como rayos X, rayos Gamma (por ejemplo, cobalto 60 o cesio 137), neulrones, (producto de la fisión nuclear del uranio 235 en un reacíor atómico), radiación Beía (emilida de radioisótopos tales como fósforo 32 o carbono 14) o radiación ultravioleta (preferentemente entre 2500 y 2900 nm)) o mutágenos químicos (tal como análogos de las bases (5-bromo-uracilo), compuestos relacionados (8-etoxi- cafeína), antibióticos (estreptonigrina), agentes alquilantes (mostazas de azufre, mostazas de nitrógeno, epóxidos, etilenaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, .lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso o acridinas. Una vez observada la característica deseada a través de mutagénesis, se puede incorporar dicha caracterísfica en un germoplasma existente mediante técnicas de • cría tradicionales, tal como relrocruza. Los deíalles sobre la cría por mulacíón se pueden consultor en la publicación de Fehr "Principies of Cullivar Developmenl", 1993, Macmillan Publishing Company, cuyo contenido se incorpora en la preseníe a modo de referencia. Además, se pueden usar las mutaciones creadas en otras líneas para producir una conversión por retrocruza de líneas de élite que comprende dichas mutaciones. Tal como se utiliza en la presente, el término planta incluye células vegeíales, proíoplasíos vegeíales, cultivos tisulares de células vegetales a partir de los cuales es posible regenerar plantas, callos vegetales, masas vegetales y células vegetales que están intacías en las plañías o en partes de las plantas tal como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, granos, espigas, marlos, chalas, fallos, raíces, punías de raíces, anteras y semejantes. Los granos se refieren a las semillas maduras producidas por los cultivadores comerciales con el propósito de cultivar o reproducir la especie. La progenie, las variantes y los mutantes de las plantas regeneradas también están incluidos dentro del alcance de la invención, siempre que estas partes comprendan las secuencias de polinucleóíidos. La invención íambién abarca plantas transgénicas o transformadas que comprenden al menos una secuencia de nucleótidos de la invención. De manera óptima, la planta está establemente transformada con una consíruccíón de nucleóíidos que comprende al menos una secuencia de nucleóíidos de la invención unida operaíivameníe a un promoíor que conduce la expresión en las células vegeíales. Tal como se uíiliza en la presente, los términos "planta transformada" y "pl nta transgénica" se refieren a una planta que coníiene dentro de su genoma un polinucleólido heterólogo. Generalmente, los polinucleótidos heterólogos están establemente integrados dentro del genoma de- una planta transgénica o transformada tal que el polinucleótido se pasa a las sucesivas generaciones. El polinucleótido heterólogo puede estar integrado en el genoma solo o como parte de un cásete de expresión recombinante.

Se deberá entender que íal como se utiliza en la presente el término "transgénico" incluye cualquier célula, línea celular, callo, íejido, parte de plañía o plañía de un genoíipo que ha sido alterado por la presencia de ácidos nucleicos helerólogos que incluyen a aquellos inícialmenle transgénicos así alterados y también a aquellos creados por cruzamiento sexual o propagación asexual a partir de los íransgénicos iniciales. El término "íransgénico", como se lo usa en la presente, no comprende la alteración del genoma (cromosómico o e?tracromosómico) por métodos convencionales de cruzamiento de plantas o sucesos de ocurrencia natural, tales como fertilización cruzada al azar, infección por virus no recombinaníes, Iransformación con bacterias no recombinantes, transposición no recombinanle o muíacíón espontánea. La presente invención se puede utilizar para la transformación y protección de cualquier especie vegetal, incluyendo, pero sin limitaciones, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Los ejemplos de especies vegetales de interés incluyen, a modo de ejemplo, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), en particular aquellas especies de Brassica que son de uíilidad como fueníes de aceiíe de semillas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), ceníeno (Sécale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perlado (Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorro (Setaria itálica), mijo dedo (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), alazor (Carthamus tinctorius), írigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), papa (Solanum tuberosum), maní (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), bataía (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucífera), ananá (Ananas comosus), árboles cííricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banana (Musa spp), palta (Percea americana), higo (Ficus casica), guayava (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea), papaya (Carica papaya), cajú (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha (Befa vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, verduras, ornamentales, pastos y coniferas. Las verduras incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), habas verdes (Phaseolus vulgaris), frijol de media luna (Phaseolus limensis), arvejas (Lathyrus spp.) y miembros del género Curcumis tal como pepino (C. sativus), melón cantalupa (C. cantalupensis) y melón amarillo (C. meló). Las plañías ornaménteles ¡ncluyen azaleas (Rhododendron spp.), hidrangea (Macropñylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), íulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), pelunias (Petunia hybrida), claveles (Dianthus caryophyllus), pastora (Euphorbia pulcherrima) y crisantemos. Las coniferas que pueden ser empleadas en la preseníe invención ¡ncluyen, por ejemplo, pinos tales como el pino loblolly, (Pinus taedá), pino del incienso (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino lodgepole (Pinus contorta), y pino de Monterrey (Pinus radiata); abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii); Tsuga del Oeste (Tsuga canadensis); abeto Sitka (Picea glauca); secoia (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos, íales como, abeto de oro (Abies amabilis); y abeto balsámico (Abies balsamea); y cedros, tales como el cedro rojo del Oeste (Thuja plicata) y el cedro amarillo de ' Alaska (Chamaecyparis nootkatensis). En realizaciones específicas, las plantas de la preseníe invención son plantas de cultivos (por .ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, alazor, maní, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.). En otras realizaciones, se prefieren las plantas de maíz y soja y en otras realizaciones las plantas preferidas son de maíz. Otras plantas de interés incluyen plantas con granos que proveen semillas de iníerés, plañías de semillas oleaginosas y plañías leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de granos, íal como maíz, írigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas de semillas oleaginosas incluyen algodón, soja, alazor, girasol, Brassica, maíz, alfalfa, palmera, coco, etc. Las plantas leguminosas incluyen habas y arvejas. Las habas incluyen guar, semilla de algarroba, fenogreco, soja, habas de jardín, caupí, habichuela, poroto pallar, haba común, lentejas, garbanzos, etc. Se proveen además composiciones que comprenden una proíoxina de insecío aislada o una íoxina de insecío aislada que coníiene al menos un sitio de activación proteolítico que ha sido manipulado para comprender un sitio de clivaje que es sensible a una proteasa de intesíino de insecto. Eri la preseníe invención, la proíeína aislada de la proíoxina de insecto modificada o de la íoxina de insecío modificada se puede formular con un vehículo acepíable en una composición o formulación de proíoxina o íoxina que es, por ejemplo, una suspensión, una solución, una emulsión, un polvo espolvoreare, un granulo dispersable, un polvo humecíable y un concenírado emulsionable, un aerosol, un granulo impregnado, un adyuvanle, una paste de recubrimiento y también encapsulamientos, por ejemplo, en sustancias poliméricas. Las composiciones que se describieron previamente pueden obtenerse por el agregado de un agente con acíividad íensioacíiva, un íransporíador inerte, un conservante, un humectante, un estimulante de alimentación, una sustancia atractiva, un agente encapsulante, un ligante, un emulsionante, un colorante, un protector de UV, un solución amortiguadora, un ageníe de fluidez o fertilizantes, dadores de micronutrieníes u oirás preparaciones que pudieran afecíar el crecimiento de las plantas. Uno o más de los agroquímicos incluyen, a modo de ejemplo, herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematocidas, moluscocidas, acaricidas, reguladores del crecimiento vegeíal, colaboradores de cosecha y fertilizantes que pueden esíar combinados con íransportadores, agentes tensioaclivos o adyuvantes comúnmente empleados en la técnica de las formulaciones, u otros componentes para facilitar la manipulación y aplicación del producto para una plaga que es un blanco en particular. Los transportadores y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos, y pueden corresponder a sustancias comúnmente empleadas en la tecnología de las formulaciones, por ejemplo, sustancias minerales, naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes humectantes, agentes pegajosos, ligantes o fertilizantes. Los ingredientes activos de la presente invención se aplican normalmente en la forma de una composición, y se pueden aplicar al área de cultivo, las plantas o las semillas a ser traíadas. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención se pueden aplicar a los granos en preparación para o duranle el almacenamiento en un recipiente de granos o silo, etc. Las composiciones de la preseníe invención se pueden aplicar simultáneamente o sucesivamente con oíros compueslos. Los mélodos de aplicación de los ingredientes activos de la presente invención o de una composición agroquímíca de la presente invención que contiene al menos una de las proteínas de proíoxina o toxina modificada de la presente invención ¡ncluyen, a modo de ejemplo, aplicaciones foliares, recubrimiento de semillas y aplicaciones en el suelo. La cantidad de aplicaciones y la frecuencia de las aplicaciones depende de la intensidad de la infestación con la correspondiente plaga. - Los agentes tensioactívos adecuados incluyen, en un sentido no limitaíívo, compuesíos aniónicos íales como un carboxilato de, por ejemplo, un melal; carboxilato de un ácido graso de cadena larga; un N-acilsarcosinato; mono o diesteres de ácido fosfórico con alcoholes grasos etoxilados o sales de tales ésíeres; sulfaíos de alcoholes grasos lales como, dodeciisulfato de sodio, octadecilsulfato de sodio o cetilsulfato de sodio; sulfato de alcoholes grasos etoxilados; sulfatos de alquilfenol etoxilados; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; alquilarilsulfonatos íales como alquilbencensulfonatos o alquilnaftalensulfonatos inferiores, por ejemplo, sulfonato de butil-nafíaleno; sales de naftalen-formaldehído sulfonadas condensadas; sales de fenol-formaldehído sulfonadas condensadas; sulfonalos más complejos íales como, sulfonatos de amida, por ejemplo, producto de la condensación sulfonda de ácido oleico y N-metiltaurino; o los dialquil sulfosuccinatos, por ejemplo, sulfonato de sodio o succinato de dioctílo. Los agentes no iónicos incluyen producios de condensación de esteres de ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas de ácidos grasos o alquil fenoles grasos o alquenilos sustiíuidos con óxido de etileno, esteres grasos de éteres de alcohol polihídrico por ejemplo, esteres de ácido graso de sorbitán, productos de condensación de tales esteres con óxidos de etileno, por ejemplo, esteres de ácido graso de sorbitán polioxietileno, bloques de copolímeros de óxido de etileno y óxido de propileno, glicoles acetilénicos, tales como 2, 4, 7, 9-tetraetil- 5-decin-4,7-diol, o glicoles acetilénicos etoxilados. Los ejemplos de agentes catiónicos tensioacíivos incluyen, por ejemplo, un mono-di-alifático, o poliaminas íales como un acelato, naftenaío u oleato; o aminas que coníienen oxígeno íales como, un óxido de amina de polioxieíilenalquilamina; una amina unida a una amida preparada por la condensación de un ácido carboxílico con una di-o poliamina; o una sal de amonio cuaternaria. . Los ejemplos de materiales inertes incluyen, en un sentido no limiíaíivo, minerales inorgánicos tales como caolina, filosilicatos, carbonalos, sulfatos, fosfatos, o materiales botánicos tales como corcho, elote, hollejo de maní, hollejo de arroz, y cascara de nuez de nogal.

Las composiciones de la presente invención pueden estar en una forma adecuada para su aplicación directa o como un concentrado de una composición primaria que requiere la dilución antes de su aplicación con una cantidad adecuada de agua u otro diluyente. La concentración de la protoxina de insecto modificada o de la toxina de insecto modificada varía dependiendo de la naluraleza de la formulación particular, específicamente, si es un concenírado o si se usará direclameníe. La composición conliene eníre 1 y 98% de un íransportador inerte sólido o líquido, y entre 0 y 50%, preferentemente, entre 0,1 y 50% de un agente tensioactivo. Estas composiciones podrán ser administradas a un valor establecido para el producto comercial, prefereníemenle alrededor de 0,01 lb-2,27 kg por acre cuando están en la forma seca y alrededor de 0,01 pts. - 10 pts. por acre cuando están en la forma líquida. En una realización adicional, las composiciones de la invención pueden ser tratadas antes de su formulación para prolongar la actividad pesticida cuando son aplicadas al entorno de una plaga de interés siempre y cuando el pretralamienío no sea nocivo para la acíividad. Tales íratamientos pueden ser realizados por medios químicos y/o físicos con tal que el íraíamiento no afecte las propiedades de la composición. Los ejemplos de reacíivos químicos incluyen en un seníldo no limiíaíivo agentes halogenantes, aldehidos, tales como formaldehído y glutaraldehído; anti-infecciosos, tales como cloruro de zefirán; alcoholes tales como isopropanol y etanol; y fijadores histológicos, tales como el fiajdor de Bouin y el fijador de Helly (véase, por ejemplo, Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W.H.Preeman y Co.) Las composiciones y formulaciones de protoxina modificada y toxina modificada de la invención se pueden aplicar al entorno de un insecto que es plaga mediante, por ejemplo, rociado, atomizado, espolvoreado, dispersión, recubrimienlo o aplicaciones copiosas, inlroduciéndolas dentro o sobre el suelo, introduciéndolas en el agua de irrigación, mediante el tratamiento de las semillas o en aplicaciones generales espolvoreado en el momento en que la plaga ha aparecido o antes de la aparición de la plaga como un íraíamienío protector. Por ejemplo, la proleína de proíoxina de insecto modificada o toxina de insecto modificada de la invención se puede mezclar con los granos para protegerlos durante el almacenamiento. Es importante obtener un buen control de las plagas en los estadios tempranos del crecimiento vegetal dado que este es el momento en que la planta puede ser más severamente dañada. Si se considera que es necesario, las composiciones de la invención pueden contener convenieníemeníe oíros ¡nsecíicidas. En una realización de la invención, la composición se aplica directamente al suelo, en el momento de la siembra, en la forma de granulos de una composición de vehículo. Otra realización es una forma granulada de una composición que comprende un agroquímico tal como, por ejemplo, un herbicida, un inseclícida, un fertilizante o un vehículo inerte. Las composiciones de la invención se pueden uíilizar en la protección de plantas, semillas y producios vegeíales en una gran variedad de formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden uíilizar en un méíodo que comprende colocar una canlidad eficaz de la composición pesticida en el entorno de dicha plaga medíanle un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de rociado, espolvoreado, dispersión o por recubrimiento de semillas. Sin limitaciones a un mecanismo particular, en una realización la plaga de insectos ingiere una composición de protoxina de insecto modificada y la protoxina de insecto es clivada luego por una proteasa presente en el intestino del insecto. El clivaje de la protoxina de insecto produce una íoxina de insecto activa en el iníesíino del mismo, lo que a su vez afecía a la plaga de insecto. En otras realizaciones, la composición de la toxina de insecto modificada se aplica al entorno de la plaga de insectos y a continuación es ingerida por dicha plaga de insecto. La loxina de insecío modificada es clivada luego por una proíeasa de intestino de insecto para producir una toxina de insecto acíiva en el iníesíino del insecío que 5 presente una mayor acíividad pesticida con relación a la correspondieníe íoxina de insecío que no coníiene al siíío de acíivación proteolííico manipulado. Antes de la venía del material de propagación vegetal (fruta, tubérculo, bulbo, tallo bulboso, grano, semilla), pero especialmente de las semillas, como un producto comercial ésías serán traíadas con un recubrimienío proíecíor que 0 comprende herbicidas, insecíicidas, fungicidas, bactericidas, nemaíocidas, moluscocidás, o mezclas de estes preparaciones, si se desea conjuníamente con transportadores, agentes tensioactivos o adyuvantes que promueven la aplicación y que son comúnmente empleados en la íécnica de las formulaciones para proveer protección coníra los daños provocados por bacíerias, hongos o animales 15 plaga. En función de íraíar a las semillas, el recubrimienío proíecíor puede ser aplicado a las semillas íanlo por impregnación de los iubérculos o los granos como en formulaciones líquidas, o mediante el recubrimienlo de los mismos en una combinación de formulaciones secas y húmedas. Además, en algunos casos especiales, son posibles de usar en las plantas otros métodos de aplicación, por 20 ejemplo, traíamieníos dirigidos a las yemas o los frutos. Las semillas de las plañías de la invención que comprenden una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleóíidos que codifica una proíeína - _ .de -proíoxina modificada o íoxina modificada de la invención pueden ser íraíadas con un recubrimienlo prolector de semillas que comprende un compuesto de 25 tratamiento de semillas tal como, por ejemplo, captano, carboxino, tiram, metalaxílo, pirimifos-metilo y otros que son de uso común en el tratamiento de semillas. En una realización deníro del alcance de la invención, se utiliza un recubrimienío protector de semillas que comprende una composición pesticida de la invención sólo o en combinación con uno de los recubrimientos protectores de semillas comúnmente utilizados en los traíamieníos de las semillas. Los méíodos y las composiciones de la preseníe invención son eficaces conlra una gran variedad de plagas. A los efectos de la preseníe invención las plagas incluyen, pero en un seníido no limiíaíivo, insectos, hongos, bacterias, nemaíodos, ácaros, protozoos patógenos, parásitos hepáíicos que parasilan animales y semejantes. Las plagas de iníerés particular son las plagas de insectos, particularmente plagas de insectos que provocan daños significalívos en las plantes agronómicas. Las plagas de insectos incluyen insecíos seleccionados eníre las órdenes Coleóptera, Díptera, Himenópíera, Lepidópíera, Malofaga, Homópíera, Hemípíera, Ortóptera, Tisanópíera, Dermápíera, Isópíera, Anoplura, Sifonápíera, Tricópíera, ele, en particular Coleóptera y Lepidóptera. Las plagas de insectos de la invención para los cultivos más importantes incluyen: Maíz: Ostrinia nubilalis, taladro europeo del maíz; Agrotis ípsilon, gusano cortador negro; Helicoverpa zea, gusano de la mazorca del maíz; Spodoptera frugiperda, oruga mililar tardía; Diatraea grandiosella, taladrador del maíz del sudoesíe; Elasmopalpus lignosellus, gusano sallarín; Diatraea saccharalis, barrenador del fallo del maíz; gusano de la raíz del maíz, por ejemplo, Diabrotica virgifera virgifera; gusanos de la raíz del maíz del Norte, por ejemplo, Diabrotica longicornis barberi; gusanos de la raíz del maíz del Sur, por ejemplo, Diabrotica undecimpunctata howardi; Melanotus spp., gusano alambre; Cyclocephala borealis, gusano blanco boreal (gusano blanco); Cyclocephala immaculata, gusano blanco del Sur (gusano blanco); Popillia japónica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, escarabajo picudo del maíz; Rhopalosiphum maidis, pulgón del maíz; Anuraphis maidiradicis, pulgón de la raíz del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche; Melanoplus femurrubrum, salíamoníes de paías rojas; Melanoplus sanguinipes, salíamoníes migratorio; Hylemya platura, mosca de la semilla del maíz; Agromyza parvicornis, gorgojo del maíz; Anaphothrips obscrurus, pulgón de pastos; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, arañuela roja; Sorgo: Chilo partellus, laladarador del sorgo; Spodoptera frugiperda, oruga miliíar íardía; Helicoverpa zea, gusano de la mazorca del maíz; Elasmopalpus lignosellus, gusano sallarín; Feltia subterránea, gusano del piel granulada; Phyllophaga crinita, gusano blanco; Eleodes, Conoderus, y Aeolus spp., gusano alambre; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja de cereal; Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, picudo del maíz; Rhopalosiphum maidis; pulgón del maíz; Sipha flava, pulgón amarillo de la caña de azúcar; chinche, por ejemplo, Blissus leucopterus leucopterus; Contarinia sorghicola, mosquiía del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, arañuela carmín; Tetranychus urticae, arañuela roja; Trigo: Pseudaletia unipunctata, oruga militar; Spodoptera frugiperda, oruga miliíar tardía; Elasmopalpus lignosellus, gusano saltarín; Agrotis orthogonia, gusano pálido del oeste; Elasmopalpus lignosellus, gusano saltarín; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja de cereal; Hypera punctata, picudo de las hojas; gusano de la raíz del maíz del Sur, por ejemplo, Diabrotica undecimpunctata howardi; pulgón del írigo Ruso; Schizaphis graminum, pulgón verde de los cereales; Macrosiphum avenae, pulgón de la espiga; Melanoplus femurrubrum, sallamontes de patas rojas; Melanoplus differentialis, saltamoníes diferencial; Melanoplus sanguinipes, salíamoníes migratorio; Mayetiola destructor, mosca Hessian; Sitodiplosis mosellana, mosquiía del írigo; Meromyza americana, larva del tallo del trigo; Hylemya coarctata, mosca del írigo; Frankliniella fusca, írips del tabaco; Cephus cinctus, larva de la mosca del tallo del trigo; Acería tulipae, acaro del trigo; Girasol: Suleima helianthana, polilla del capullo de girasol; Homoeosoma electellum, polilla de girasol; zygogramma exclamationis, escarabajo de girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquita de la semilla de girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano cogollero del algodón; Helicoverpa zea, gusano cogollero del algodón; Spodoptera exigua, oruga militar de la remolacha; Pectinophora gossypiella, lagarta rosada; picudo, por ejemplo, Anthonomus grandis; Aphis gossypii, picudo del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, sallamonles del algodón; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca; Lygus lineolaris, chinche de las plañías; Melanoplus femurrubrum, salíamontes de palas rojas; Melanoplus differentialis, salíamontes diferencial; Thrips tabaci, tríps de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, arañuela carmín; Tetranychus urticae, arañuela roja; Arroz: Diatraea saccharalis, barrenador del tallo del maíz; Spodoptera frugiperda, oruga militar íardía; Helicoverpa zea, gusano cogollero del maíz; Colaspis brunnea, vaquiía de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, picudo del arroz de agua; Sitophilus oryzae, picudo del arroz; Nephotettix nigropictus, chinche defoliadora; Blissus leucopterus leucopterus; chinche, Acrosternum hilare, chinche verde; Soja: Pseudoplusia includens, falso medidor de la soja; Anticarsia gemmatalis, oruga de las leguminosas Aníicarsia; Plathypena scabra, gusano verde de la soja; Ostrinia nubilalis, íaladrador europeo del maíz; Agrotis ípsilon, gusano grasienío; Spodoptera exigua, oruga miliíar de la remolacha; Heliothis virescens, gusano cogollero del algodón; Helicoverpa zea, picudo del algodón; Epilachna varivestis, escarabajo del poroío Mejicano; Myzus persicae, pulgón verde del durazno; Empoasca fabae, colorrila; Acrosternum hilare, chinche verde; Melanoplus femurrubrum, sallamoníes de palas rojas; Melanoplus differentialis, salfamontes diferencial; Hylemya platura, mosca de la semilla del maíz; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, arañuela de la frutilla; Tetranychus urticae, arañuela roja; Cebada: Ostrinia nubilalis, taladrador europeo del maíz; Agrotis Ípsilon, gusano grasiento; Schizaphis graminum, chinche verde, chinche por ejemplo, Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare, chinche verde; Euschistus servus, chinche marrón; Delia platura, mosca de la semilla de maíz; Mayetiola destructor, mosca Hessian; Petrobia latens, acaro marrón del trigo; Aceite de seíraíla de colza: Brevicoryne brassicae, áfido de la col; Phyllotreta cruciferae, pulguilla de las cruciferas; Mamestra configurata,' gusano militar Bertha; Plutella xylostella, polilla diamantina; Delia ssp., larvas de raíz. Los nematodes incluyen nemaíodes parásitos, íales como nemalodes de nudos radiculares, quísíicos y de lesiones, incluyendo Heterodera spp., Meloidogyne spp. y Globodera spp.; en particular miembros de los nemaíodes quísíicos, incluyendo, a modo de ejemplo, Heterodera glycines (nemaíode quísíico de soja); Heterodera schachtii (nemalode quíslico de la remolacha); Heterodera avenae (nemaíode quíslico de los cereales); y Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nemaíode quíslico de las papas). Los nematodes de lesiones incluyen Pratylenchus spp. El artículo "un" y "una" se usan en la presente para hacer referencia a uno o más de uno (es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A modo de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos. Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo ilustrativo y no deben ser interpretados en un sentido limitativo. EXPERIMENTOS Eiemplo 1 Preparación y secuenciación de bibliotecas de ADNc de meseníerón de gusanos de la raíz de maíz del oeste Se disecaron y cosecharon direclameníe en nilrógeno líquido los mesenlerones de 50 gusanos de la raíz de maíz del oeste (WCRW) (Diabrotica virgifera virgifera) del 3er insíar. Se preparó ARN lolal mediante homogeneízación del tejido en nitrógeno líquido usando un mortero seguido de lísis celular en presencia de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Para construir la biblioteca de ADNc, se purificó poliA(+) ARN a partir del ARN total con una columna de afinidad de oligo(dT)-celulosa usando el conjunto de elementos para purificación de ARNm (Amersham Pharmacia Biotech, Piscalaway, NJ), de acuerdo con el protocolo provisto con el conjunto de elementos. La síntesis de la primera cadena de ADNc usando Superscript II (Invitrogen) y subsiguiente síntesis de la segunda cadena, adición de ligador y clonación dirigida a los sitios EcoRI y Xhol del pBlueScript SK+ (Straíagene, La Jolla, CA) se efecíuaron de acuerdo con las inslrucciones provisías con el conjunto de elemeníos para ADNc de Síraíagene (Síraíagene). El ADNc se purificó usando una columna para ADNc (Invilrogen) inmediaíameníe antes de la ligación en el vector. La secuenciación de los clones de la biblioteca de ADNc se realizó usando el conjunto de elemeníos de reacción ABl PRISM™ Big Dye Terminaíor Cycle Sequencing Ready de ABl PRISM con la ADN polimerasa FS AmpliTaq (Perkin Elmer, Boston, MA) y se analizó con un secuenciador aulomáíico de ADN ABl Modelo 373. Se compararon las secuencias de aproximadamenle 7000 clones con secuencias de nucleóíidos o pépíidos conocidas en las bases de dalos GenBank y Peptide Sequence usando los programas BLASTN o BLASTP.

El análisis de secuencia de estas EST indicó que las proteasas de mesenterón predominantes en WCRW eran cisteína proteasas que pertenecen a la familia de las caíepsinas (Tabla 1 ). En lérminos de abundancia relaíiva, la caíepsina L era la principal calepsina proleasa seguido de la calepsina B y calepsina D. Los miembros de catepsina L representaron más del 83% de las secuencias de catepsina encontradas entre los clones secuenciados. El análisis Cluster reveló que dos miembros de esta familia, iwm2s.pk017.h10 (de aquí en adelante "h10"; SEQ ID N°: 6 (secuencia de nucleótidos); SEQ ID N°: 7 (secuencia de aminoácidos)) e ¡wm2s.pk015.c9 (de aquí en adelante "c9"; SEQ ID N°: 8 (secuencia de nucleótidos); SEQ ID N°: 9 (secuencia de aminoácidos), constituyen hasta un 80% de las secuencias dé catepsina L y el 46% de todas las secuencias de catepsina halladas en la biblioteca de secuencias. También se identificó tripsina entre las secuencias del mesenterón pero representaban menos que un 2% de las proleasas de meseníerón. Tabla 1 : Disíribución de roíeasas en las EST de meseníerón de WCR Eiemplo 2 Expresión recombinante de las proíeasas h10 (SEQ ID N°: 7) y c9 (SEQ ID N°: 9) Las dos catepsinas más abundantes, representadas por h10 (SEQ ID N°: 7) y c9 (SEQ ID N°: 9) fueron completamente secuenciadas para obtener genes de longitud completa. La secuencia de aminoácidos predicha indicaba que estas proteínas eran de 315 y 314 aminoácidos de longitud, respectivamente. h10 es un 100% idénlica a la cisleína proleasa recientemente aislada de CRW (Brown ef al. (2004) Insect Biochem. Mol. Biol. 34(4):305-320) y c9 es un 79% idéntica a otra cisteína proíeasa de CRW aislada por Brown ef al. Según se esperaba, h10 y c9 coníienen un pépíido señal y una región de propéplido inmediatamente 5' con respecto a la proteasa madura. Para caracterizar los siíios de clivaje reconocidos por las dos proíeasas de lipo calepsina L, se expresaron ambas c9 y h10 usando el conjunto de elementos para expresión EasySelect™ en Pichia (Invitrogen). Las secuencias de codificación de h10 y c9 fueron amplificadas por PCR con la polimerasa Platinum High Fidelity (Invitrogen, Carlsbad, CA) usando los siguientes cebadores: h10 directo: CGACTCGAGAAAAGAAATCTAGGTGCCTTCGAAAAATGG (SEQ ID N°: 14) h10 inverso: CCATTATATGCGGCCGCCTACAATTTAGGGTAAGAGTTCATG (SEQ ID N0: 15) c9 directo: CGACTCGAGAAAGAAATTTATCTGCCTTTGAGCAATGG (SEQ ID N°: 16) c9 inverso: CCTATATTAGCGGCCGCCTACAACTTGGGGTAAGAGTTC (SEQ ID N°: 17) Los cebadores directos (dir) fueron diseñados para corresponder a la secuencia que codifica el comienzo de la región del propéptido predicha e incluían una secuencia de señal del factor de apareamiento a parcial y un sitio de clivaje Kex2 5' con respecto a la secuencia del propéptido. Esta combinación asegura que una vez clonado en el vector de expresión de Pichia pPICZaA (Invitrogen) se reconstituye la secuencia completa de señal del factor de apareamiento a parcial y que la catepsina recombinante será secretada hacia el medio de crecimiento y luego eliminada por la Kex2 proteasa. Se incluyeron sitios de restricción adicionales para Xhol y Notl en los cebadores directos e inversos (subrayados en las secuencias anteriores) para facilitar los subsiguientes pasos de clonación. Los fragmentos amplificados fueron digeridos con Xhol y Notl y se clonaron en el pBluescript SK (Straíagene, La Jolla, CA) para confirmar la secuencia antes de la subclonación en los mismos siíios de resíricción en el pPICZaA para su expresión. Los plásmidos resulíaníes, pPICZs-c9 y pPICZs-h10, fueron íransformados en células X-33 de Pichia pastoris químicamente competentes usando el conjunío de elemeníos para íransformación de Pichia de EasyComp™ (Inviírogen) según las inslrucciones provistas con el conjunto de elementos. Los transformantes fueron seleccionados sobre placas con Zeocin™ (100 µg/ml) que contenía agar YPDS (extracío de levadura 1%, pepíona 2%, dexírosa 2%, sorbiíol 1 M, agar 2%). Se efecluaron pruebas de expresión a escala pequeña con 5 a 10 íransformanles resistentes a Zeocin™-para evaluar la producción de las calepsinas recombinaníes c9 y h10. Los íransformantes individuales fueron inoculados y se cullivaron duraníe la noche a 30°C en 25 ml de medio BMGY (exlracío de levadura 1%, peptona 2%, fosfato de potasio 100 mM pH 6, base nitrogenada de levadura (YNB) 1 ,34%, Biotina 4x10"5%, glicerol 1 %). La expresión se indujo cosechando células por cenírifugación a 3000xg duraníe 5 minutos a íemperaíura ambieníe, decaníando el sobrenadante y resuspendiendo el peleí de células en medio BMMY (BMGY-glicerol 1% + meíanol 0,5%) hasía una D06oo de 1 ,0. Los culíivos resulíanles fueron incubados a 30°C en un agilador con agiíación. La inducción se maníuvo sobre un período de 96 hs por adición de meíanol 100% hasía una conceníración final de 0,5% cada 24 hs. Se recolectó el sobrenadante de cada cultivo agrupando las células en pelets y el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y se guardó a -80°C. La dd expresión de las proteínas c9 y h10 fue analizada medianíe SDS-PAGE y coloración con Coomasie. El SDS-PAGE indicó que c9 y h10 eran expresadas y secreladas hacia el medio de culíivo en la forma de sus propéplidos basados en los tamaños predichos de peso molecular de 33 kDa. El análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal confirmó que las bandas de 33 kDa correspondían a los propéptidos. La reducción del pH desde valores neutros a valores ácidos (pH 4,5) dio como resultado el autoprocesamienlo del propéptido en su forma madura de 22 kDa, lo que demuestra que c9 y h10 eran funcionalmente expresadas por Pichia pastoris. El análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal confirmó que la banda de 22 kDa representaba la forma madura. Se observó algún autoprocesamienío diferencial entre el propéptido y el pépíido maduro con el análisis de secuencia. Eiemplo 3 Caracterización funcional de las caíepsinas c9 y h10 sobre susíraíos de péptidos siníéíicos Se realizó una caracterización funcional adicional de c9 y h10 comparando las actividades contra los sustratos de péptidos cromogénicos Pyr-Phe-Leu-pNA y Bz-L-Arg-pNA (Peptides International, Louísville, KY). Se llevaron a cabo ensayos de acuerdo con Kouzuma et al., (1996) J. Biochem 119:1106-1113 en fosfato de sodio 100 mM (pH 6,5), KCl 0,3 M, EDTA 0,1 M y DMSO 1 mM 100% con 500 µM de sustrato de péptidos. Se agregó 1 µl de pro-c9 o pro-h10 crudo y 1 µl de c9 y h10 activado crudo a 100 µl de solución de reacción que contiene ya sea Pyr-Phe- Leu-pNA o Bz-L-Arg-pNA para observar la especificidad de sustrato. Se usaron los sobrenadantes de una muestra no inducida como controles para eliminar potenciales efectos de contaminación con proteasa de Pichia. Se dejó que las reacciones progresaran durante 1 hs a 37°C, después de lo cual se midió la absorbancia a 410 nm. Estos estudios demostraron que ambas formas (pro y madura) de las dos enzimas lienen especificidad por Pyr-Phe-Leu-pNA. Por el conlrario, el sustrato Bz-L-Arg-pNA que es susceptible a clivaje por la catepsina B y la catepsina H no era hidrolizado por c9 ni por h10. Este clivaje diferencial confirma que ambas c9 y h10 son proteasas de lipo caíepsina L. No se observó actividad con el sobrenadante de la muestra no inducida. Se descubrió luego que la capacidad de las procatepsinas para hidrolizar Pyr-Phe-Leu-pNA era el resultado del autoprocesamiento en la proteasa madura debido al pH ligeramente ácido (pH 6,5) de la solución amortiguadora de reacción. Ambas c9 y h10 eran complelamente inhibidas por E64, un inhibidor general de catepsina proteasas. Eiemplo 4 Purificación de c9 y h10 a partir de sobrenadantes de cultivo de Pichia Se diluyeron los medios de sobrenadantes de cultivo a pequeña escala de transformantes que expresan c9 o h10 (véase el Ejemplo 2) 1:4 con solución amortiguadora de carbonato de sodio 50 mM (pH 10). Se efectuó una HPLC con la muestra usando Agilent 1100 (Agilení Technologies, Palo Alio, CA) con un cartucho HiTrap Q XL (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Se corrió un gradiente por pasos con solución amortiguadora A (Tris HCl 50 mM, pH 8,0) y solución amortiguadora B (Tris HCL 50 mM, pH 8,0, NaCI 1 M) bajo condiciones de carga (solución amortiguadora B 0%), 10% B, 20% B, 30% B, 40% B y 100% B con una velocidad de flujo de 0,7 ml/min. El material que fluye a través de la columna (FT) y cada paso se recolectaba a medida que eluía de la columna basado en la absorbancia UV. Se evaluó el FT y cada paso por su actividad usando el sustrato cromogénico Pyr-Phe-Leu-pNA (véase el Ejemplo 3) para identificar las fracciones que contenían c9 y h10. A partir de la capacidad de las fracciones para hidrolizar el sustrato de pépíidos sintéticos, h10 eluyó en las muestras de carga, 10% y 20% B y c9 eluyó en las muestras de carga, 20% y 30% B. Se usó SDS-PAGE para visualizar c9 y h10 en cada una de las muestras.

Se concenlraron 2,5 ml de cada paso activo 50 veces cargando las muestras sobre un filtro Millipore Centricon 3 kD MWCO (corte de peso molecular) (Millipore Corporation, Billerica, MA) y centrifugando a 7500xg durante 2 hs a 4°C. Esto permitió concentrar el volumen remanente sobre la paríe superior del filíro hasla 200 yl aproximadamente. Luego se agregaron 200 µl de H20 y se centrifugó el Centricon hasta un volumen final de ~50 µl. La presencia de c9 y h10 en los pasos activos se confirmó por su capacidad para hidrolizar Pyr-Phe-Leu-pNA y por análisis de la secuencia de aminoácidos N-terminal. Eiemplo 5 Digestión de proteínas por las catepsina proteasas c9 y h10 purificadas Se digirieron /?-caseína y e-caseína (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y Angiogenina (Bachem, 3700 Horizon Drive, Kin'g of Prussia, PA, EE.UU.) con las c9 y h10 purificadas para ¡deníifícar los potenciales siíios de reconocimiento de clivaje para estes dos catepsinas del gusano de la raíz de maíz del oeste. Los clívajes se realizaron en solución amortiguadora de proíeólisis (fosfato de sodio 100 mM (pH 6,5), KCl 0,3 M, EDTA 0,1 M y DMSO 1 mM 100%) a 25°C, y las reacciones se deíuvieron por adición del inhibidor E-64 (3 µl de E-64 10 mM en 100 µl de volumen de reacción). Los producios de digestión fueron separados por SDS-PAGE o bien, se usaron en una espectrometría de masa LC para identificar los sitios de clivaje dentro de los sustratos de proteína/péptidos. En el caso de SDS-PAGE, las digestiones se corrieron sobre geles de poliacrilamida NuPage 12% (Invitrogen) y luego se transfirieron los productos de la digestión a una membrana PVDF de acuerdo con las instrucciones suministradas con las membranas ProBlotí™ (Applied Biosystems Inc.). Las bandas de proteína se visualizaron por coloración de la membrana de transferencia con Ponceau S y se recortaron las bandas visibles para el análisis de la secuencia N-lerminal. Cuando se empleaba espectromeíría de masa LC, se inyecíaron 20 µl del volumen de reacción de digesfión de 100 µl en el equipo para HPLC Magic 2002 Microbore (Michrom Bioresources Inc., Aubum, CA) con una columna C18 Magic (150 mm x 1 mm; 200 Angslrom, esfera de 5 µm) conecíado a espectrómetro de masa Micromass (Micromass, Beverly, MA) para obtener información de masa de los fragmentos de digesíión. Los réstenles 80 µl de maierial se inyecíaron en el equipo de HPLC Magic 2002 Microbore y se reunieron los picos para la secuenciacíón del exlremo N-terminal. El transcurso de la digestión de ^-caseína por c9 mostró un producto de digestión principal de -19 kD (indicado por la flecha negra) a los 2 minutos después de agregar la enzima. Después de 10 minutos se observaron dos • productos de digestión principales correspondientes al fragmento de 19 kD (de los 2 min) y un fragmento nuevo de 16 kD. También se observaron fragmentos menores adicionales a los 10 min que no eran más abundantes a los 30 min, lo que indicaba un clivaje progresivo de los fragmentos de 19 kD y 16 kD en fragmentos menores (indicados por las flechas grises). El análisis de la secuencia N-terminal de los fragmentos de 19kD y 16 kD correspondía al extremo N-terminal de ß-caseína (por ejemplo, RELEELNVP; SEQ ID N°: 1d) indicativo de un clivaje C-terminal por c9. El aislamiento basado en HPLC de los productos de digestión y el subsiguiente análisis de la secuencia N-íerminal permitieron ideníificar que los silios de clivaje primario y secundario eran después de Ser166 (LS/QS; SEQ ID N°: 2) y Leu 140 (LL/QS; SEQ ID N°: 19), respectivamente. Se observaron sitios de cliváje adicionales para la ß-caseína. La preferencia por un residuo hidrofóbico en la posición P2' es coherente con los sitios de clivaje conocidos de las proteasas catepsina L y en este caso desviado hacia Leu (L) (es decir, 5 de 6 veces). En todos los casos, se observó una preferencia por un residuo polar en la posición P siendo Gln (Q) el más prevalente (por ejemplo 4 de 6 veces).

La =caseína lambién era digerida con c9 y h10 y la especificidad del silio de reconocimiento se determinó con los mismos métodos que se usaron para ?°caseína. En el caso de la ß=caseína los principales sitios de clivaje detectable se observaron después de Ser54, Asp62, Ser125 y Metí 27. Nuevamente, se observó una preferencia por un residuo hidrofóbico en la posición P2' que era predominantemente Leu (3 de 4 veces). Sobre la base de la información disponible sobre el sitio de clivaje de ß- y /c-caseína, aparentemente había una tendencia fuerte hacia un residuo Leu en la posición P2' y un residuo Gln en la posición P-.'. Dado que ambos sitios de clivaje primario y secundario en la ß caseína contenía Gln-Ser en las posiciones Pi' y P2' era probable que el residuo Ser fuera un buen candidato para la posición P3. Por lo tanto, se eligió la secuencia Leu-X-GIn-Ser (LXQS; X = cualquier amino ácido; SEQ ID N°: 1 ) como la secuencia de clivaje reconocida por las catepsinas c9 y h10 de los gusanos de la raíz de maíz del oeste. Se encontró que un péptído, la angiogenina, disponible de Bachem (3700 Horizon Drive, King of Prussia, PA) contenía una secuencia, LDQS (SEQ ID N°: 20), que se ajustaba al motivo LXQS (SEQ ID N°: 1) definido previamente. La angiogenina fue sometida a clivaje por c9 en solución amortiguadora de proteólisis (véase precedemente) durante 30 ó 60 min a 25°C y la reacción se terminó con la adición de E64. La identidad de los productos de clivaje fue dilucidada por LC-MS basado en los pesos moleculares predichos de la secuencia conocida de angiogenina. Se efectuó un análisis de la secuencia N-terminal para confirmar los datos de LC-MS. Los . resultados demostraron que después de 30 min se detectaban dos pares distintos de productos de clivaje que correspondían al clivaje ¡nmedialamenle N-íerminal con respecío a Leud o a Gln10. Los famaños relaíivos de los picos indicaron que el clivaje en Gln10 (LD/QS; SEQ ID N°: 20) era el silio de clivaje primario preferido. Después de una digestión duraníe 60 min, los lámanos de los picos correspondientes a ambos productos de clivaje incrementaron, siendo LD/QS la secuencia de reconocimiento de clivaje preferencial. Esto demostró que c9 reconoce eficazmente el sitio de clivaje LXQS (SEQ ID N0: 1 ). Eiemplo 6. Incorporación de LXQS en el sitio de activación de Cryd y demostración que Cryd es activado e insecticida después de ser ingerida por los gusanos de la raíz de maíz del oeste • Se sabe que numerosas proteínas Bt Cry requieren de un paso de "activación" para su aclividad insecticida en coleópteros. Este paso de activación •toma la forma de un nick entre la hélice 3 y la hélice 4 en el dominio 1 lo que da como resultado un cambio de conformación que conduce a la inserción del dominio 1 (conducido por la hélice 4) en la membrana. Sin embargo, los dos pólípéptidos creados por el clivaje permanecen asociados bajo condiciones no desnaturalizantes. Como se demuestra en la Solicitud de Patente de EE.UU. N°: 10/606.320, con el título "Genes Encoding Proteins with Pesticidal Activitf, presentada el 25 de junio, 2003, incorporada en la presente a modo de referencia, una proteína Cryd modificada con la secuencia FRRG (SEQ ID N°: 21 ) o FRSRG (SEQ ID N°: 22) insertada en el aminoácido 162 en la secuencia de la proteína Cryd nativa vuelve a la proteína insecticida sin el requerimiento de activación por tripsina antes de ser ingerida por el insecto. Se evaluó la funcionalidad del motivo LXQS (SEQ ID N°: 1 ) sustituyendo un motivo LXQS doble (por ejemplo, LXQSLXQS; SEQ ID N°: 3) .ep .lugar de FRRGFRRG . (SEQ ID N°: 23) en el mutante de CrydBbl , K05 (SEQ ID N°: 24 (secuencia de nucleótidos); SEQ ID N°: 25 (secuencia de aminoácidos)). En este caso se eligió Ser para el residuo X (por ejemplo, LSQS; SEQ ID N°: 2) ya que el sitio de clivaje primario en la ß=caseína contenía una Ser en la posición P-?'. La protoxina CrydBbl modificada resultante se denominó ISC-1 (SEQ ID N°: 26 (secuencia de nucleótidos); SEQ ID N°: 27 (secuencia de aminoácidos)). Los resultados del bioensayo con larvas neonatas de gusanos de la raíz de maíz del oeste se obtuvieron con una concentración de 1 mg/ml de los muíanles de CrydBbl , K04 (SEQ ID N°: 2d) y ISC-1 , para comparar su actividad insecticida. El mutante CrydBb1-K04 contiene FRRGFRRG (SEQ ID N°: 23) en el aminoácido 162 y se ha demostrado con anterioridad que es activo a 1 mg/ml sin necesidad de un paso de pretripsinazación para activar a Cryd. Los resultados de los bioensayos que se muestran en la Tabla 2 indican que la secuencia LSQSLSQS (SEQ ID N°: 4) es reconocida por las proteasas 'digestivas de los gusanos de la raíz de maíz del oeste. La actividad insecticida es comparable a la de CrydBbl - K04. Más aún, las larvas que sobrevivieron al tratamiento con ISC-1 estaban severamente afectadas en su desarrollo en comparación con las que sobrevivieron a CrydBb1-K04. Tabla 2. Resultados del bioensayo con CrydBbl -K04 en comparación con ISC-1. *sobrevivientes moderadamente afecfadas en su desarrollo "sobrevivientes severamente afectados en su desarrollo ,_ Eiemplo 7 Resistencia del moíivo LSQSLSQS al clivaje por serina proíeasas Digestibilidad Con el fin de confirmar que el motivo tipo Catepsina, LSQSLSQS (SEQ ID N°: 4), no era suscepíible a las serina proteasas (por ejemplo, tripsina y quimioíripsina), se produjeron polipépíidos de dd kDa de CrydBbl -K05 (SEQ ID N°: 25) y CrydBbl -ISC-1 (SEQ ID N°: 27). CrydBbl -K05 coníiene al molivo FRRGFRRG (SEQ ID N°: 23) en el bucle de acíivación, cuyo clivaje por ambas serina proteasas ya había sido demostrado previamente. Se demosíró que CrydBbl -K05 era acíivo en bioensayos coníra WCRW, SCRW y CPB sin una activación previa por tripsina. CrydBb1-ISC-1 contiene al nuevo moíivo lipo Calepsina proteasa LSQSLSQS (SEQ ID N°: 4). Se incubaron cinco microgramos de proteína de cada polipéptido con 1/50 (p/p) con tripsina y quimiotripsina a temperatura ambiente durante 72 horas. A continuación se efectuó un análisis por SDS-PAGE. Según lo esperado, los resultados mostraron que CrydBbl -K05 era olivado dentro del bucle entre las hélices 3 y 4 del dominio I de la molécula de toxina para generar un polipéptído de 55 kDa. El clivaje del bucle de activación entre las hélices 3 y 4 fue confirmado por secuenciación del exíremo N-íerminal.

Por el conírario, el polipépíido CrydBbl -ISC-1 de dd kDa no era clivado deníro del bucle de acíivación para generar el polipépíido de 55 kDa. Se repiíió el mismo experimento usando los jugos de mesenterón de WCRW en lugar de las proteasas purificadas. Los datos indican que ambas moléculas de toxina eran olivadas por una proteasa presente en los jugos de mesenterón de WCRW para producir el fragmenío de 55kDa. Bioensayos Los polipépíidos de dd KDa de CrydBbl -K05 y CrydBbl -ISC-1 fueron evaluados luego por su actividad contra WCRW, SCRW y CPB. Ambas toxinas mostraron una actividad significativa contra los tres insectos. Esíos bioensayos confirman que el polipéptido de dd kDA de CrydBbl -ISC-1 era tan activo como el polipéptido de dd kDa de CrydBbl -K05. En resumen, la activación del bucle es crítica para la actividad de la toxina.

Los experimentos anteriores demuestran que el polipéptido CrydBbl -ISC-1 de 88 kDa es resistente a la serina proteasa pero aún es activado por los jugos de mesenterón de un insecto coleóptero. El nuevo motivo LSQSLSQS (SEQ ID N°: 4) es entonces específico del insecío. Eiemplo 8 Transformación y regeneración de las plantas transqenicas Se bombardearon embriones inmaduros de maíz de plantas donantes de invernadero con un plásmido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica la protoxina CrydBbl modificada, ISC-1 , descrita en la presente en el Ejemplo 6 (SEQ ID N°: 26) ligada operativamente al promotor de ubiquitina y al gen marcador seleccionable PAT (Wohlleben et al. (19dd) Gene 70:25-37), que confiere resistencia al herbicida Bialafos. Como' alíernaíiva, el gen marcador seleccionable se provee en un plásmido separado. La íransformación se llevó a cabo como se describe a coníinuación. Más adelante se describen las recetes de los medios. Preparación del Tejido Blanco Las espigas son despinochadas y luego se esterilizaron las superficies con blanqueador Clorox 30% además de detergente Micro 0,5% durante 20 minutos y se lavaron dos veces con agua estéril. Se recortaron los embriones inmaduros y se colocaron con el eje embrionario hacia abajo (el escutelo hacia arriba), a razón de 25 embriones por placa, sobre medio 560Y durante 4 horas y luego se alinearon dentro de la zona blanco de 2,5 cm como preparación para el bombardeo. „.Se elabora un vector plásmido que . comprende a la secuencia - de nucleótidos de la protoxina Cryd modificada ligada operativamente al promoíor de ubiquiíina. Este ADN plásmido y el ADN plásmido que contenía el marcador seleccionable PAT se hicieron precipiíar sobre partículas de tungsteno de 1 ,1 µm (diámeíro promedio) ulilizando el siguiente procedimiento de precipitación por CaCI2: 100 µl de un preparado de partículas de íungsíeno en agua; 10 µl (1 µg) de ADN en solución amortiguadora Tris EDTA (1 µg total de ADN); 100 µl de CaCI2 2,5 M; y 10 µl de espermidina 0,1 M. Cada reactivo se agregó sucesivamente a la suspensión de partículas de tungsteno, manteniendo el vortexeo sobre un agilador para múlíiples íubos. Las mezcla final fue brevemente sonicada y se la incubó bajo agitación con vortexeo durante 10 minutos. Después del periodo de precipitación, los íubos fueron brevemeníe centrifugados, se eliminó el líquido, se lavaron con 500ml de etanol al 100%, y se centrifugaron durante 30 segundos. Nuevamente se retiró el líquido y se agregaron 105 µl de etanol 100% al peleí final de partículas de íungsíeno. Para el bombardeo con la pistola de partículas, las partículas de íungsíeno/ADN se sonicaron brevemeníe y se sembraron 10 µl en forma de manchas sobre el ceníro de cada macrolransportador y se dejó secar durante aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. Las placas de muestra son bombardeadas en el nivel N° 4 de la pistola de partículas. Todas las muesíras recibieron un solo disparo a 650 psi, tomando un total de diez alícuotas de cada tubo de ADN/partículas preparadas. Luego del bombardeo, se maníuvieron los embriones en un medio 560Y duraníe 2 días, y luego se íransfirieron a un medio de selección 560R que contenía 3 mg/liíro de Bialafos, y se subcultivaron cada dos semanas. Después de aproximadamente 10 días de selección, los clones de los cayos resisteníes a la selección se íransfirieron a un medio 2ddJ para iniciar la regeneración de la plañía. Luego de la maduración de los embriones somáficos (2-4 semanas), los embriones somáficos que se desarrollaron bien se íransfirieron a un medio para germinación y se los ubicó en un cuarto de cultivo iluminado. Aproximadamente 7-10 días mas larde, las plántelas desarrolladas se transfirieron a un medio libre de hormona 272V en tubos durante 7-10 días hasla que las plántelas se esíablecieron correcíamenle. Las plantas fueron luego transferidas a injertos en planos (equivalentes a maceías de 2,5") que contenían suelo para macetas y se hicieron crecer duraníe una semana en una cámara de crecimiento, haciéndolas crecer después durante 1-2 semanas adicionales en invernadero, y luego se las transfirió a macetas clásicas de 600 (1 ,6 galones) y se las hizo crecer hasta alcanzar la madurez. Las plantas son monitoreadas y calificadas por la expresión de la protoxina Cryd modificada mediante ensayos conocidos en la técnica, tal como, por ejemplo, inmunoensayos y transferencia Western. Análisis de las plantas de maíz íransqénicas Se estudiaron plantas de maíz transgénicas positivas para la expresión de la protoxina CrydBbl modificada por su resistencia a WCRW usando los bioensayos estándar conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, bioensayos con escisión de raíces y bioensayos en plantas completas. Véase, por ejemplo, la publicación de Patente de EE.UU. N°: US 2003/0120054 y la publicación de Patente Internacional N°: WO 03/01 dd10. El medio de bombardeo (560Y) comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C-1416), mezcla de vitaminas de Eriksson 1 ,0 ml/l (1000X SIGMA-1511 ), tiamina HCl 0,5 mg/l, sacarosa 120,0 g/l, 2,4-D 1 ,0 mg/l y L-prolina 2,88 g/l (llevado a volumen con H2O D-l después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); Gelrite 2,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con H20 D-l); y nitrato de plata 8,5 mg/l (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a íemperalura ambieníe). El medio de selección (560R) comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C- 1416), mezcla de vitaminas de Eriksson 1 ,0 ml/l (1000X SIGMA-1511 ), tiamina HCl 0,5 mg/l, sacarosa 30,0 g/i y 2,4-D 2,0 mg/l (llevado a volumen con H2O D-l después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); Gelrite 3,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con D-l H20); y nitrato de plata 0,d5 mg/l y Bialaphos 3,0 mg/l (ambos se agregaron después de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente). El medio de regeneración (2ddJ) comprende sales MS 4,3 g/l (GIBCO 11117-074), solución madre de vitaminas MS 5,0 ml/l (0,100 g de ácido nicotínico, tiamina HCl 0,02 g/l, piridoxina HCl 0,10 g/l y glicina 0,40 g/l llevado a volumen con H20 D-l pulida) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15: 473), mio-inositol 100 mg/l, zeatina 0,5 mg/l, sacarosa 60 g/l y ácido abscísíco 1 ,0 ml/l de 0,1 mM (llevado a volumen con H20 D-l pulida después de ajusfar el pH en 5,6); 3,0 g/l Gelrite (se agregó después de llevar a volumen con H20 D-l); y ácido indolacéííco 1 ,0 mg/l y Bialaphos 3,0 mg/l (se agregó después de esterilizar el medio y enfriar a 60 °C). El medio libre de hormonas (272V) comprende sales MS 4,3 g/l (GIBCO 11117-074), solución madre de vilaminas MS 5,0 ml/l (ácido nicotínico 0,100 g/l, tiamina HCl 0,02 g/l, piridoxina HCl 0,10 g/l y glicina 0,40 g/l llevado a volumen con H20 D-l pulida), mio-inositol 0,1 g/l y sacarosa 40,0 g/l (llevado a volumen con H2O D-l pulida después de ajustar el pH en 5,6); y Bactoagar 6 g/l (se agregó después de llevar a volumen con H20 D-l pulida), esterilizado y enfriado a 60 °C. Eiemplo 9 Transformación mediada por Aqrobacterium de maíz Para la transformación mediada por Agrobacterium de maíz con la protoxina Cryd modificada del Ejemplo 7, se emplea el método de Zhao (Patente de EE.UU. N°: 5.9d1.d40 y publicación de Pateníe Internacional N°: WO 9d/32326; cuyos _ contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia). - Brevemente, se aislan embriones inmaduros de maíz y los embriones toman contacto con una suspensión de Agrobacterium, donde las bacterias tienen la capacidad de transferir la protoxina Cry8 modificada a por lo menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (paso 1 : etapa de infección). En este paso los embriones inmaduros se sumergen preferentemente en una suspensión de Agrobacterium para iniciar la inoculación. Los embriones fueron co-cultivados durante un tiempo con Agrobacterium (etapa 2: la etapa de co-cultivo). Preferentemente, los embriones inmaduros se cultivan sobre un medio sólido después del paso de infección. Luego de esíe periodo de co-cultivo se contempló una etapa opcional de "reposo". En esta etapa de reposo, los embriones fueron incubados en presencia de al menos un antibiólico que se sabe que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin el agregado de un ageníe selecíivo para la plañías íransformanles (etapa 3: etapa de reposo). Los embriones inmaduros se cultivan sobre medio sólido con anlibióíico, pero sin un ageníe de selección, para eliminar el Agrobacterium y para la fase de reposo de las células infectadas. Luego, los embriones inoculados fueron cultivados en un medio que contenía un agente de selección y se hicieron crecer y se recuperaron los callos transformados (etapa 4: etapa de selección). Los embriones inmaduros se cultivan sobre medio sólido con un agente selectivo dando como resultado el crecimiento selecíivo de las células transformadas. Luego los callos se regeneraron en plantas (etapa 5: el paso de regeneración) y los callos que crecen sobre el medio selectivo se cultivan sobre medio sólido para regenerar las plantas. Las plantas de maíz íransgénicas posiíivas para la expresión de la protoxina CrydBbl modificada son evaluadas por su resistencia a WCRW, como se describe en el Ejemplo 7. Ejemplo 10 Transformación de embriones de soja Se bombardean embriones de soja con un plásmido que contiene a la protoxína Cryd modificada del Ejemplo 7 ligada operaíivameníe al promotor de ubiquitina de la siguiente manera. Con el fin de inducir la formación de embriones somáticos, se cultivan coíiledones de 3-5 mm de longitud disecados de semillas inmaduras, de superficie esterilizada del cultivar de soja A2d72, con luz u oscuridad, a 26 °C sobre un medio de agar apropiado durante seis a diez semanas. Luego se recortan los embriones somáíicos productores de embriones secundarios y se colocan en un medio líquido adecuado. Después de una selección repeíida de las masas de embriones somáficos que se multiplicaron como embriones en eíapa globular temprana, las suspensiones se maníienen como se describe más adelante. Los cultivos embriogénicos de soja en suspensión se pueden mantener en 35 ml de medio líquido sobre un agitador rotatorio, 150 rpm, a 26 °C con luz fluorescente con uh programa de luz oscuridad de 16:d horas. Los cultivos se sub'cultivan cada dos semanas por inoculación de aproximadamenle 35 mg de íejido en 35 ml de medio líquido. Los cullivos embriogénicos de soja en suspensión pueden ser transformados entonces con el método de bombardeo de partículas (Klein et. al. • (1987) Nature (Londres) 327:70-73, Patente de EE.UU. N°: 4.945.050). El gen marcador seleccionable que se puede usar para facilitar la transformación de soja es un transgen compuesto del promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor (Odell et al. (1985) Nature 313:810-d12), el gen de la higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli; Gritz ef al. (1983) Gene 25:179-188) y la región 3' del gen de la nopalina sintetasa del ADN-T del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens. El cásete de expresión que comprende a la protoxina Cryd modificada ligada operativamente al promotor de ubiquitina puede ser aislado como un fragmento de restricción. Este fragmento se puede insertar entonces en un sitio de restricción único del vector que contiene al gen marcador. A 50 µl de una suspensión 60 mg/ml de partículas de oro de 1 µm se agrega (en el orden dado): 5 µl de ADN (1 µg/µl), 20 µl de espermídina (0,1 M) y 50 µl de CaCI2 (2,5 M). La preparación de partículas se agiía luego durante íres minutos, se cenírífuga en mícrocentrífuga duraníe 10 segundos y se elimina el sobrenadante. Las partículas recubiertas con ADN se lavan luego una vez en 400 µl de elanol 70% y se vuelven a suspender en 40 µl de eíanol anhidro. La suspensión de ADN/partículas se puede sonicar tres veces durante un segundo por vez. Después se cargan cinco microlitros de partículas recubiertas con ADN sobre cada disco macrotransportador. Se colocan aproximadamente 300-400 mg de un culíivo en suspensión de dos semanas en una caja de Peíri de 60x15 mm vacía y el líquido residual del íejido se reííra con la ayuda de una pipete. Para cada experimento de íransformación, habiíualmente se bombardean 5-10 placas de íejido. La presión de rupíura de la membrana se define en 1100 psi y la cámara es evacuada hasta un vacío de 2d pulgadas de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente a 3,5 pulgadas de la pantalla de retención y luego es bombardeado tres veces. Después del bombardeo, se puede dividir al tejido por la mitad y volver a colocarlo en el líquido y cultivarlo como se describiera previamente. Cinco a siete días después del bombardeo, se cambia el medio líquido por medio líquido fresco y once a doce días después del bombardeo con medio fresco que contiene higromicina 50 mg/ml. Este medio selecíivo se puede cambiar una vez por semana. Siete a ocho semanas después del bombardeo, se puede observar íejido íransformado, verde, creciendo desde las masas embriogénicas .?ecróticas, no íransformadas. El tejido verde aislado se reíira y se inocula en frascos individuales para generar nuevos cultivos en suspensión embriogénicos transformados, propagados por clonación. Cada línea nueva puede ser tratada como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones se pueden subcullivar y mantener como masas de embriones inmaduros o se pueden regenerar hasta obtener plantas completas por maduración y germinación de embriones somáticos individuales. Eiemplo 11 Transformación de embriones de soja Condiciones de cultivo Se mantienen cultivos embriogénicos de soja en suspensión (cv Jack) en 35 ml de medio líquido SB196 (véase las recetas más adelante) sobre un agitador rotatorio, 150 rpm, 26°C con luz fluorescente blanca fría con un foíoperíodo de luz/oscuridad de 16:8 hs con una intensidad lumínica de 60-85 µE/m2/s. Los culíivos se subcullivan cada 7 días a dos semanas por inoculación de aproximadamente 35 mg de tejido en 35 ml de líquido SB196 fresco (el intervalo de subcultivo preferido es cada 7 días). Se transforman cultivos embriogénicos de soja en suspensión con los plásmidos y fragmentos de ADN descritos en los siguientes ejemplos con el método de bombardeo con pistola de partículas (Klein ef al. (1987) Nature, 327:70). Inicio de los culíivos embrioqénicos de soja en suspensión Los cultivos de soja se inician dos veces por mes con 5-7 días entre cada inicio. Se toman vainas con semillas inmaduras de plantas de soja disponibles 45-55 días después de plantarlas, se retiran de sús recubrimientos y se colocan en una caja magenta esterilizada. Las semillas de soja se esterilizan agitándolas durante 15 minutos en una solución de Clorox al 5% con .1 gota de jabón blanco (95 ml de agua destilada esterilizada en autoclave más 5 ml de Clorox y 1 goía de jabón). Mezclar bien. Las semillas se enjuagan usando 2 boíellas de 1 liíro de agua destilada estéril y las que son de menos de 4 mm se colocan sobre portaobjetos para microscopio individuales. Se corta el extremo pequeño de las semillas y los cotiledones se extraen a presión del recubrimiento de semilla. Los cotiledones se transfieren a placas que contienen medio SB1 (25-30 cotiledones por placa). Las placas se envuelven con cinta y se guardan durante 8 semanas. Una vez transcurrido este liempo se recortan los embriones secundarios y se colocan en medio líquido SB196 durante 7 días. Preparación del ADN para el bombardeo Para el bombardeo se usa ya sea un plásmido intacto o un fragmento de ADN de plásmído que contiene a los genes de interés y al gen marcador seleccionable. El ADN de plásmido para el bombardeo se prepara de forma rutinaria y se purifica usando el método descrito e? la Guía de Protocolos y Aplicaciones Promega™, Segunda Edición (página 106). Los fragmentos de los plásmídos que contienen a la protoxina Cry8 modificada del Ejemplo 7 ligada operativamente al promotor de ubiquitina se obtienen por aislamiento de plásmidos digeridos dos veces. En cada caso, se digieren 100 µg de ADN de plásmido en 0,5 ml de la mezcla de enzimas específica que sea apropiada para el plásmido de interés. Los fragmentos de ADN resultantes se separan mediante electroforesis sobre gel con agarosa GTG SeaPlaque 1 % (BioWhitaker Molecular Applicaíions) y los fragmentos de ADN que contienen a la proíoxina Cryd modificada del Ejemplo 7 se recortan del gel de agarosa. El ADN se purifica de la agarosa usando la enzima de digestión GELase según el protocolo del proveedor.

Se toma una alícuota de 50 µ\ de agua destilada estéril que contiene 3 mg de partículas de oro (3 mg de oro) y se agrega a 5 µl de una solución de ADN 1 µg/µl (ya sea el plásmido intacto o fragmento de ADN preparado como se describió previamente), 50 µl de CaCl2 2,5 M y 20 µl de espermidina 0,1 M. La mezcla se agiía duraníe 3 min en el nivel 3 de un agitador con vortexeo y se cenírífuga durante 10 seg en una microcentrífuga de mesada. Después de un lavado con 400 µl de eíanol 100% el pelel se suspende por sonicación en 40 µl de eíanol 100%. Se disponen cinco µl de suspensión de ADN a cada disco volador del instrumento de discos Biolistíc PDS1000/HE. Cada 5 µl de alícuota contiene aproximadamente 0,375 mg de oro por bombardeo (es decir por disco). Preparación del tejido y bombardeo con el ADN Se colocan aproximadamenle 150-200 mg de cultivos embrionarios en suspensión de 7 días en una caja de Petri de 60 x 15 mm vacía, estéril, y la caja se cubre con una malla de plástico. El tejido es bombardeado con 1 o 2 disparos por placa con la presión de ruptura de membrana definida en 1100 psi y la cámara evacuada hasta un vacío de 27-28 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente a 3,5 pulgadas de la malla de retención/detención. Selección de los embriones transformados Los embriones íransformados fueron seleccionados usando ya sea higromicina (cuando se usaba el gen de la higromicina fosfotransferasa, HPT, como marcador seleccionable) o clorsulfurón (cuando se usaba el gen de la acetolactato sintetasa, ALS, como marcador seleccionable). Selección con higromicina (HPT) Después del bombardeo, el tejido se coloca en medio SB196 fresco y se cultiva como se describió previamente. Seis días después del bombardeo, se cambio el medio SB196 por medio SB196 fresco que contiene al agente de selección higromicina 30 mg/l. El medio de selección se cambia una vez por semana. Cuatro a seis semanas después de la selección, se puede observar tejido verde, transformado creciendo desde las masas embriogénicas necróticas no transformadas. El tejido verde aislado se retira y se inocula en placas de múltiples cavidades para generar nuevos cultivos en suspensión embriogénicos transformados, propagados por clonación. Selección sobre clorsulfurón (ALS) Después del bombardeo, el tejido se divide en 2 frascos con medio SB196 fresco y se cultiva como se describió previamente. Seis a siete días después del bombardeo, se cambio el medio SB196 por medio SB196 fresco que contiene al agente de selección clorsulfurón 100 ng/ml. El medio de selección se cambia una vez por semana. Cuatro a seis semanas después de la selección, se puede observar tejido verde, transformado creciendo desde las masas embriogénicas necróticas no transformadas. El tejido verde aislado se retira y se inocula en placas de múltiples cavidades que contienen medio SB196 para generar nuevos cultivos en suspensión embriogénicos transformados, propagados por clonación. Regeneración de embriones somáticos de soja en plantes Con el fin de obtener plantas completas a partir de los culíívos embriogéríicos en suspensión, es necesario regenerar el íejido. Maduración de los embriones Los embriones se culíivan duraníe 4-6 semanas a 26°C en SB196 bajo luz fluorescente blanca fría (Phillips Cool Whiíe Econowaíí F40/CW/RS/EW) y bulbos Agro (Phillips F40 Agro) (40 vaíios) con un foloperíodo de 16:8 hs con una intensidad lumínica de 90-120 uE/m2.s. Una vez transcurrido este período, las masas de embriones se llevan a un medio de agar sólido, SB166, durante 1-2 semanas. Las masas se subcultivan luego en medio SB103 durante 3 semanas.

Duraníe esíe período, se pueden reíirar embriones individuales de las masas y examinar si íienen el fenoíipo deseado. Se debe íener en cuente que cualquier fenoíipo deíecíable, que sea el resultado de la expresión de los genes de interés, puede ser examinado en esía eíapa. Disección y germinación de los embriones Se disecan embriones individuales maduros colocándolos en una pequeña caja de Petri vacía (35 x 10 mm) durante aproximadameníe 4-7 días.

Las placas se sellan con cinta (creando así una pequeña cámara húmeda). Los embriones disecados se plantan en medio SB71-4 donde se dejan para que germinen bajo las mismas condiciones de cultivo que se describieron previamente.

Las plántelas germinadas se reliran del medio de germinación y se enjuagan exhauslivamente con agua y luego se plantan en tierra Redi-Earth en una bandeja de 24 celdas, cubierta con un domo de plástico traslúcido. Después de 2 semanas, se reíira el domo y se deja que las plantes maduren duraníe olra semana más. Si las plántelas tenían un aspecto maduro se íransplantaban a maceías 10" de tierra Redi-Earth con hasta 3 plántulas por maceta. Después de 10 a 16 semanas, se cosecharon las semillas maduras, se cortaron y se analizaron por su contenido de proteínas. Recetas de los medios Medio de proliferación líquido SB 196 = FN Lite (por litro): MS FeEDTA: Solución madre 1 100x 10 ml MS Sulfato: Solución madre 2 10Ox 10 ml Haluros FN Lite: Solución madre 3 100x 10 ml FN Lite P,B,Mo: Solución madre 4 10Ox 10 ml Vitaminas B5 (1 ml/l) 1 ,0 ml 2,4-D (concentración final 10 mg/l) 1 ,0 ml - KN03 2,83 g (NH4)2S04 0,463 g Asparagina 1 ,0 g Sacarosa (1%) 10 g PH 5.8 Soluciones madre FN Lite N° solución madre 1.000 ml 500 ml 1) Solución madre MS Fe EDTA 100x 3,724 g 1 ,862 g Na2EDTA" FeS04-7H20 2,784 g 1 ,392 g * Agregar primero, disolver en botella oscura bajo agitación 2) Solución madre de MS Sulfato 100x 37,0 g 18,5 g MgS04-7H20 MnS04-H20 1 ,69 g 0,645 g ZnS04-7H20 0,86 g 0,43 g CuS04-5H20 0,0025 g 0,00125 g 3) Solución madre de haluros FN Lite 100x 30,0 g 15,0 g CaCI2-2H20 Kl 0,083 g 0,0715 g CoCI2-6H20 0,0025 g 0,00125 g 4) Solución madre FN Lite P,B,Mo 100x 18.5 g 9,25 g KH2P04 Na2Mo04-2H2O 0,025 g 0,0125 g El medio sólido SB1 comprende (por litro): 1 paq. sales MS (Gibco/ BRL - N° Cat. 11117-066); 1 ml de solución madre de vitaminas B5 1000X; 31 ,5 g sacarosa; 2 ml de 2,4-D (concentración final 20 mg/l); pH 5,7; y d g de agar TC. El medio sólido SB 166 comprende (por litro): 1 paq. sales MS (Gibco/ BRL - N° Cat. 11117-066); 1 ml de solución madre de vitaminas B5 1000X; 60 g de maltosa; 750 mg de MgCI2 hexahidrato; 5 g de carbón activado; pH 5,7; y 2 g de Gelrite.

El medio sólido SB 103 comprende (por liíro): 1 paq. sales MS (Gibco/BRL, N° Caí. 11117-066); 1 ml de solución madre de vitaminas B5 1000X; 60 g de maltosa; 750 mg de MgCI2 hexahidrato; pH 5J; y 2 g de Gelrite. El medio sólido SB 71-4 comprende (por litro): 1 botella de sales B5 de Gamborg c/ sacarosa (Gibco/BRL - N° Cat. 21153-036); pH 5,7; y 5 g de agar TC. La solución madre de 2,4-D se obtiene lista para usar de Phytotech N° Caí. D 295; la concentración es de 1 mg/ml. La solución madre de vitaminas B5 (por cada 100 ml) que se guarda en alícuotas a -20 °C comprende: 10 g de mio-inositol; 100 mg de ácido nicotínico; 100 mg de piridoxina HCl; y 1 g de tiamina. Si la solución no se disuelve con suficiente rapidez, se puede aplicar un bajo nivel de calor con la placa de agilación caliente. La solución madre de clorsulfurón comprende 1 mg/ml en hidróxido de amonio 0,01 N Todas las publicaciones y solicitudes de patentes mencionadas en la memoria son indicativas del nivel de conocimiento en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones y soliciíudes de patente se incorporan en la presente a modo de referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual se incorporara específicamente e individualmente en la presente a modo de referencia. Aunque la invención precedente se ha descrito con cierto detalle a modo ilustraíivo y de ejemplo a efectos de ofrecer una mayor claridad para su comprensión, resulía evidente que es posible efectuar determinados cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES: 1. Una molécula aislada de ácido nucleico, CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de nucleólidos que codifica una protoxina de insecto, en donde dicha protoxina de insecto contiene al menos un sitio de activación proteolítico que ha sido manipulado para comprender un sitio de clivaje que es sensible a una proteasa de intestino de insecto, y en donde el clivaje de dicha protoxina de insecto por dicha proteasa de intestino de insecto produce una toxina de insecto activa. 2. La molécula de ácido nucleico de la cláusula 1 , CARACTERIZADA PORQUE dicha toxina de insecto acíiva es una toxina de Bacillus thuringiensis o una variante o fragmenío de la misma, en donde dicha variante y dicho fragmenío íiene acíividad pesíicída y dicha variante presente al menos un d0% de idenlidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos de dicha íoxina de Bacillus thuringiensis. 3. La molécula de ácido nucleico de la cláusula 2, CARACTERIZADA PORQUE dicha toxina de Bacillus thuringiensis es una toxina Cryd o una variante o fragmento de la misma, en donde dicha variante y dicho fragmento tiene actividad pesticida y dicha variante presenta al menos un 80% identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos para dicha toxina Cry8. 4. Un cásete de expresión, CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de nucleótidos de la cláusula 1 ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en plantes. 5. Un mélodo para proteger a una planta contra una plaga de insecto, CARACTERIZADO PORQUE dicho método comprende introducir en dicha planta al menos una construcción de polinucleótidos que comprende la secuencia de nucleótidos de la cláusula 1 ligada operativamente a un promotor que dirige expresión en dicha planta, en donde la expresión de dicha construcción de polinucleótidos produce dicha protoxina de insecto en dicha planta, donde dicha plaga de insectos ingiere dicha planta y dicha protoxina de insecto y en donde el clivaje de dicha proíoxina de insecto por dicha proteasa de intestino de insecto produce una íoxina de insecto activa en el intestino de dicha plaga de insecto. 6. El método de la cláusula 5, CARACTERIZADO PORQUE dicha protoxina de insecto presenta una mayor actividad pesticida con relación a una protoxina de insecto que no contiene a dicho al menos un sitio de activación proteolítico manipulado. 7. El método de la cláusula 5, CARACTERIZADO PORQUE dicho sitio de activación proteolítico demás estabiliza dicha protoxina de insecto en la planta, d. El método de la cláusula 5, CARACTERIZADO PORQUE dicha plaga de insectos se selecciona del grupo formado por escarabajo de papa de Colorado, gusanos de la raíz de maíz del oeste, gusanos de la raíz de maíz del sur, gusanos de la raíz de maíz del norte y picudo del algodón. 9. El método de la cláusula 5, CARACTERIZADO PORQUE dicha planta es una monocotiledónea. 10. El méíodo de la cláusula 9, CARACTERIZADO PORQUE dicha monocotiledónea es maíz. 11. El método de la cláusula 5, CARACTERIZADO PORQUE dicha plante es una dicotiledónea. 12. El método de la cláusula 5, CARACTERIZADO PORQUE dicho promotor es un promotor con preferencia por raíces. 13. El método de la cláusula 5, CARACTERIZADO PORQUE dicha proteasa de intesíino de insecío es una cisíeína proíeasa. 14. El método de la cláusula 13, CARACTERIZADO PORQUE dicha cisteína proteasa es una proteasa de íipo caíepsina L. 15. El méíodo de la cláusula 5, CARACTERIZADO PORQUE dicha proíoxina de insecío comprende al menos un sílio de activación proteolítico manipulado que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por LXQS (SEQ ID N°: 1 ), LSQS (SEQ ID N°: 2), LXQSLXQS (SEQ ID N°: 3) y LSQSLSQS (SEQ ID N°: 4). 16. Una planta transformada, CARACTERIZADA PORQUE comprende al menos una construcción de polinucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos de la cláusula 1 ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en dicha planta. 17. La plañía de la cláusula 16, CARACTERIZADA PORQUE dicha construcción de polinucleótidos se ha incorporado de forma estable en el genoma de la planta. 1d. Una semilla transgénica de la planta de la cláusula 16, CARACTERIZADA PORQUE dicha semilla comprende dicha construcción de polinucleótidos. 19. Una protoxina de insecto aislada, CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico de la cláusula 1. 20. Una composición, CARACTERIZADA PORQUE comprende al menos una proíoxina de insecto de acuerdo con la cláusula 19 en combinación con un vehículo. 21. Un méíodo para afecíar a una plaga de insectos, CARACTERIZADO PORQUE comprende aplicar la composición de acuerdo con la cláusula 20 al entorno de dicha plaga de insectos mediante un procedimiento seleccionado del grupo formado por rociado, espolvoreado, dispersión y recubrimiento de semillas. 22. Una molécula aislada de ácido nucleico, CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de nucleólidos que codifica una toxina de insecto, en donde dicha toxina de insecto contiene al menos un sitio de activación proteolífico que ha sido manipulado para comprender un siíio de clivaje que es sensible a una proíeasa de inlesíino de insecío y en donde el clivaje de dicha toxina de insecío por dicha proteasa de intestino de insecto produce una toxina de insecto con mayor actividad pesticida con relación a la íoxina de insecto que no conliene a dicho silio de activación proteolítico. 23. Un método para proteger a una planta contra una plaga de insecto, CARACTERIZADO PORQUE dicho método comprende introducir en dicha planta al menos una construcción de polinucleótidos que comprende una secuencia de nucleótídos de la cláusula 22 ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en dicha planta, en donde dicha toxina de insecto modificada contiene al menos un sitio de activación proteolítico que ha sido manipulado para comprender un sitio de clivaje que es sensible a una proteasa de intestino de insecto que está presente en el intesíino de una plaga de insecto, donde la expresión de dicha construcción de polinucleótidos produce dicha toxina de insecto en dicha planta, donde dicha plaga de insectos ingiere dicha planta y dicha toxina de insecto y en donde el clivaje de dicha toxina de insecto por dicha proteasa de intestino de insecto produce una toxina de insecto en el intestino de dicha plaga de insectos con mayor actividad pesticida con relación a la toxina de insecto que no coníiene a dicho siíio de acíivación profeolííico. 24. Una plañía íransformada, CARACTERIZADA PORQUE comprende al menos una construcción de polinucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos de la cláusula 22 ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en dicha planta, en donde dicha toxina de insecto contiene al menos un sitio de activación proteolííico que ha sido manipulado para comprender un siíio de clivaje que es sensible a una proteasa de inteslino de insecío y en donde el clivaje de dicha toxina de insecío por dicha proleasa de intestino de insecío produce una toxina de insecto con mayor aclividad pesticida con relación a la toxina de insecto que no contiene a dicho sitio de activación proteolílico. 25. Una protoxina de insecto aislada, CARACTERIZADA PORQUE comprende una secuencia de aminoácidos codificada por la molécula de ácido nucleico de la cláusula 22. 26. Una molécula aislada de ácido nucleico, CARACTERIZADA PORQUE comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptído que presenta actividad proteolítica, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona del grupo formado por: a) la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: d; b) una secuencia de nucleótidos que presenta al menos un d0% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 8; c) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 9; d) una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que presenta al menos un 80% de identidad de secuencia con la SEQ ID N°: 9; e) una secuencia de nucleótidos que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos de la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID N°: 8; y, f) una secuencia de nucleótidos complementaria de por lo menos una secuencia de nucleótidos de (a)-(e). 27. Un polipépfido aislado que liene acíividad proteolítica, CARACTERIZADO PORQUE dicho polipéptido presenta una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo formado por: a) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 9; b) una secuencia de aminoácidos que presenía al menos un 80% de idenlidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 9; c) una secuencia de aminoácidos que íiene al menos 25 aminoácidos conliguos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N°: 9; y, d) una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la cláusula 26.