ES2271098T3

ES2271098T3 - Proteinas de bacillus thuringiensis y variantes de las mismas con actividad pesticida contra coleopteros.

Info

Publication number: ES2271098T3
Application number: ES01988728T
Authority: ES
Inventors: Andre R. Abad; Nicholas B. Duck; Xiang Feng; Ronald D. Flannagan; Theodore W. Kahn; Lynne E. Sims
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2000-10-24
Filing date: 2001-10-24
Publication date: 2007-04-16
Anticipated expiration: 2021-10-24
Also published as: DE60122931D1; US7696412B2; US20030177528A1; BR0114891A; WO2002034774A3; US20020151709A1; EP1356054A2; EP1356054B1; WO2002034774A2; HU228699B1; MXPA03003666A; DE60122931T2; HUP0302523A3; HUP0302523A2; US7605304B2; US8188036B2; US20090291896A1; CA2426793C; AU2002228705A1; CA2426793A1

Abstract

Un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que tiene actividad pesticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona entre: (a) una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 15 ó 17; (b) una secuencia de nucleótidos que codifica a la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 16 ó 18; (c) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 88% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en (a); y (d) una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en (b).

Description

Proteínas de Bacillus thuringiensis y variantes de las mismas con actividad pesticida contra coleópteros.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con ácidos nucleicos recombinantes y de ocurrencia natural, obtenidos a partir de genes como el Cry-8 del Bacillus thuringiensis que codifican \delta-endotoxinas caracterizadas por su actividad pesticida contra plagas del orden de los Coleópteros. Las composiciones y los métodos de la invención utilizan a los ácidos nucleicos divulgados, y a sus polipéptidos pesticidas codificados, para controlar plagas de las plantas.

Antecedentes de la invención

Las plagas de insectos son uno de los principales factores en la perdida de cultivos agrícolas en el mundo. La pérdida de cultivos relacionada con las plagas de insectos como el gusano de la raíz del maíz por si sola ha alcanzado un billón de dólares al año. Por ejemplo, la alimentación del gusano de la raíz del maíz puede ser económicamente devastadora para los productores agrícolas. El gusano de la raíz del maíz occidental es una de las principales plagas de insectos del maíz en muchas regiones el mundo. Aunque no tan importante como la plaga del gusano de la raíz del maíz occidental, el gusano austral de la raíz del maíz puede ocasionalmente causar un daño económicamente significativo al maíz. El daño causado por el gusano de la raíz del maíz occidental y por el gusano de la raíz del maíz austral pueden resultar en el encamado, una menor tolerancia a la sequía y finalmente en la reducción en la productividad de la cosecha.

Tradicionalmente, los métodos primarios para impactar a las poblaciones de gusano de la raíz del maíz son la rotación de los cultivos y la aplicación de insecticidas químicos de amplio espectro. Infortunadamente, algunas especies de plagas han desarrollado resistencia a los insecticidas químicos. Además, los consumidores y los entes reguladores estatales por igual están cada vez más preocupados con los peligros ambientales asociados con la producción y el uso de pesticidas químicos sintéticos. Debido a esta preocupación, los organismos reguladores han prohibido o limitado el uso de algunos de los pesticidas más peligrosos. Por lo tanto, existe un interés sustancial en el desarrollo de pesticidas alternativos.

El control biológico de las plagas de insectos con significado agrícola que utiliza un agente microbiano, tal como hongos, bacterias, u otras especies de insectos, brinda una alternativa ambientalmente amigable y comercialmente atractiva. Generalmente hablando, el uso de biopesticidas presenta un riesgo menor de contaminación y de riesgos para el medio ambiente, y ellos suministran una mayor especificidad por el objetivo que es característica de los insecticidas químicos tradicionales de amplio espectro. Además, los biopesticidas frecuentemente son más económicos de producir y por lo tanto mejoran el rendimiento económico de una gran variedad de cultivos.

Ciertas especies de microorganismos del genero Bacillus son conocidas por poseer actividad pesticida contra un amplio rango de plagas de insectos incluidas la Lepidóptera, la Díptera, la Coleóptera, la Hemíptera, y otras. El Bacillus thuringiensis y el Bacillus papilliae están entre los agentes de biocontrol más exitosos descubiertos hasta la fecha. La patogenicidad en insectos también ha sido atribuida a las cepas de: B. larvae, B. lentimorbus, B. papilliae, B. sphaericus, B. thuringiensis (Harwook, ed., ((1989) Bacillus Plenum Press), 306) y B. cereus (WO 96/10083). La actividad pesticida parece estar concentrada en inclusiones de proteína cristalina parasporal, y se han aislado y caracterizado diferentes genes que codifican estas proteínas pesticidas (ver, por ejemplo la patente estadounidense No. 5.366.892).

Los insecticidas microbianos, particularmente aquellos obtenidos de las cepas de Bacillus, han jugado un papel importante en la agricultura como alternativas al control químico de las plagas. Recientemente, los científicos agrícolas han desarrollado plantas de cultivo con resistencia mejorada a los insectos por medio de plantas de cultivo modificadas genéticamente para producir proteínas pesticidas a partir de Bacillus (ver la patente estadounidense No. 5.554.534 y WO93/15206 relacionadas con el control de pestes de escarabajo de esta forma). Las plantas de maíz y de algodón genéticamente modificadas para producir proteínas pesticidas aisladas de cepas de B. thuringiensis, conocidas como \delta-endotoxinas o toxinas Cry, son hoy en día ampliamente utilizadas en la agricultura norteamericana y han proveído a los agricultores con una alternativa ambientalmente amigable a los métodos de tradicionales de control de insectos. Además, las patatas genéticamente modificadas para contener toxinas pesticidas Cry han sido vendidas a los agricultores norteamericanos. Sin embargo, mientras ellas han probado ser muy exitosas comercialmente, estas plantas de cultivo genéticamente modificadas resistentes a los insectos proporcionan resistencia solamente para un estrecho rango de las plagas de insectos económicamente importantes. Algunos insectos, tales como el gusano de la raíz del maíz occidental, han probado ser recalcitrantes, y el nivel de resistencia a las toxinas de Bt se incrementa en poblaciones anteriormente susceptibles de algunas plagas importantes de insectos.

Aunque numerosos investigadores han intentado elaborar proteínas endotoxinas mutantes con actividad insecticida mejorada, pocas han ido exitosas. En realidad, la mayoría de las toxinas de B. thuringiensis genéticamente modificadas que han sido reportadas en la literatura reportan que la actividad de la endotoxina no es mejor que aquella de la proteína natural, y en muchos casos, la actividad disminuye o se destruye totalmente. Por lo tanto, se desea el uso de nuevos insecticidas microbianos que tengan especificidad alterada y/o actividad pesticida mejorada para el uso en estrategias de manejo de pesticidas.

Resumen de la invención

Se proveen composiciones y métodos para impactar a las plagas de las plantas, particularmente a las plagas de insectos Coleópteros. Más específicamente, la invención se relaciona con métodos para impactar insectos utilizando ácidos nucleicos derivados de los genes de la \delta-endotoxina para producir microorganismos transformados y plantas que expresen a un polipéptido pesticida de la invención. Las composiciones y los métodos de la invención encuentran uso en agricultura para el control de plagas de plantas de cultivo.

La invención provee ácidos nucleicos, y fragmentos y variantes de los mismos, que codifican polipéptidos que poseen actividad pesticida contra plagas del orden de los Coleópteros. Las secuencias silvestres (por ejemplo, las de ocurrencia natural) de nucleótidos de la invención, que se obtuvieron de las cepas de Bacillus thuringiensis, codifican a las \delta-endotoxinas como las de Cry-8.

La invención provee además fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos como las de Cry-8 que codifican polipéptidos biológicamente activos (por ejemplo, pesticidas). En modalidades particulares, las secuencias divulgadas de nucleótidos codifican polipéptidos que son pesticidas al menos para un insecto que pertenezca al orden de los Coleópteros (por ejemplo, el escarabajo de la patata, el gusano de la raíz del maíz sureño, y el gusano de la raíz del maíz occidental).

Otras modalidades de la invención proveen ácido nucleico que codifica versiones truncadas de una endotoxina Cry8 que se caracterizan por una actividad pesticida que o bien es equivalente a, o mejorada, con relación a la actividad de la correspondiente endotoxina de tamaño natural. Algunos de los ácidos nucleicos truncados de la invención pueden ser mencionados ya sea como fragmentos o como variantes. En modalidades particulares, algunos de los fragmentos/variantes de ácido nucleico de la invención están truncados en el extreme 3' de una secuencia de codificación de tipo natural; en modalidades alternativas, otros ácidos nucleicos de la invención contienen una secuencia contigua de residuos de ácido nucleico, derivada de otra secuencia de codificación de la invención, que ha sido truncada en ambos extremos 5' y 3'.

La invención también provee ácidos nucleicos recombinantes como los de Cry8 que contienen variantes de la secuencia de ácido nucleico mutagenizada que codifican endotoxinas de B. thuringiensis que han sido modificadas genéticamente para tener actividad pesticida mejorada y/o alterada. Más específicamente, la invención provee ácidos nucleicos mutagenizados que codifican polipéptidos pesticidas que contienen un sitio adicional, o uno alternativo, sensible a la proteasa localizada en el dominio 1 de la variante del polipéptido en una región que se localiza entre las hélices alfa 3 y 4 del polipéptido codificado.

Como se demuestra aquí, la presencia de un sitio adicional, y/o alternativo, sensible a la proteasa en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado puede mejorar la actividad pesticida y/o la especificidad de la variante del polipéptido codificada por las variantes de ácido nucleico de la invención. Por lo tanto, las secuencias de nucleótidos de Cry8 de la invención pueden ser modificadas genéticamente en forma recombinante o manipuladas para producir endotoxinas que tienen actividad mejorada o alterada y/o especificidad en comparación con aquella de una \delta-endotoxina no modificada de tipo natural.

Por ejemplo, un tipo de variante de ácido nucleico (por ejemplo, una secuencia mutagenizada de nucleótidos como los de Cry8) divulgada aquí provee mutantes adicionales que contienen codones adicionales que introducen una segunda secuencia de aminoácidos sensible a la tripsina (además del sitio de ocurrencia natural para la tripsina) dentro de su polipéptido codificado. Una variante alternativa adicional de la invención contiene codones adicionales diseñados para introducir un sitio sensible a la quimotripsina localizado inmediatamente 5' del sitio de ocurrencia natural para la tripsina.

Un segundo tipo alternativo de variante de ácido nucleico de la invención provee mutantes por substitución en los cuales al menos un codón del ácido nucleico que codifica al sitio de ocurrencia natural sensible a la proteasa se destruye, y se introducen codones alternativos dentro de la secuencia de la variante de ácido nucleico con el propósito de introducir un sitio diferente sensible a la proteasa (por ejemplo, un substituto) en su lugar. En una modalidad particular de esta variante del polinucleótido, se divulga un mutante de reemplazo en el cual se destruye el sitio de ocurrencia natural de escisión por la tripsina presente en el polipéptido codificado y se introduce un sitio de escisión por la quimiotripsina en su lugar.

Se reconoce que cualquiera de las mutaciones reveladas puede ser modificada genéticamente en cualquier secuencia de polinucleótidos de la invención que comprende a los residuos aminoácidos que proveen al sitio de escisión por la tripsina que s el objetivo para la modificación. Por lo tanto, las variantes ya sea de las endotoxinas de tamaño natural o de los fragmentos de las mismas, se pueden modificar para contener sitios adicionales o alternativos de escisión.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar para producir casetes de expresión que se pueden usar para producir microorganismos transformados que contienen un ácido nucleico de la invención. Los transformantes resultantes se pueden utilizar en la preparación de composiciones pesticidas que comprenden un microorganismo transformado, o para la producción y el aislamiento de proteínas pesticidas. Por lo tanto, la invención provee además composiciones pesticidas, que contienen ya sea polipéptidos pesticidas o microorganismos transformados, y métodos para producir tales composiciones. Las composiciones pesticidas de la invención encuentran uso en métodos agrícolas para impactar a las plagas. Por ejemplo, las composiciones se pueden utilizar en un método que involucre colocar una cantidad efectiva de la composición pesticida en el medio ambiente de la plaga por medio de un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de aspersión, espolvoreo, siembra al voleo, o recubrimiento de la semilla.

La invención provee además polipéptidos pesticidas aislados (por ejemplo, insecticidas) codificados ya sea por un ácido nucleico de ocurrencia natural, o uno modificado (por ejemplo, mutado o manipulado) de la invención. En ejemplos particulares, las proteínas pesticidas de la invención incluyen proteínas \delta-endotoxinas de tamaño natural, fragmentos de \delta-endotoxinas de tamaño natural, y variantes de polipéptidos que se producen a partir de ácidos nucleicos mutados diseñados para introducir secuencias particulares de aminoácidos dentro de los polipéptidos de la invención. En modalidades particulares, los fragmentos de polipéptido y las variantes de polipéptido de la invención tienen actividad pesticida mejorada con relación a la actividad de la \delta-endotoxina de ocurrencia natural a partir de la cual se derivan ellos. Los polipéptidos de la invención se pueden producir ya sea a partir del ácido nucleico divulgado aquí, o por medio del uso de técnicas estándar de biología molecular. Por ejemplo, una proteína truncada de la invención se puede producir por medio de la expresión de un ácido nucleico recombinante de la invención en una célula huésped apropiada, o alternativamente por medio de una combinación de procedimientos ex vivo, tales como digestión y purificación por la proteasa.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden utilizar también para producir plantas transgénicas (por ejemplo, transformadas) que se caracterizan por genomas que comprenden al menos una construcción de nucleótidos incorporada en forma estable que contiene secuencia de codificación de la invención operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión del polipéptido pesticida codificado. Por lo tanto, también se proveen las células transformadas de la planta, los tejidos de la planta, plantas, y las semillas de la misma.

En una modalidad particular, se puede producir una planta transformada de la invención utilizando un ácido nucleico que ha sido optimizado para una expresión mayor en una planta huésped. Por ejemplo, se puede traducir nuevamente uno de los polipéptidos pesticidas de la invención para producir un ácido nucleico que contiene codones optimizados para la expresión en un huésped particular, por ejemplo una planta, más específicamente para la expresión en una planta Zea mays. La expresión de una secuencia de codificación por medio de una planta así transformada (por ejemplo, dicotiledónea o monocotiledónea) resultará en la producción de un polipéptido pesticida y le conferirá a la planta una resistencia mayor a los insectos. En una modalidad particular, la invención provee plantas transgénicas que expresan polipéptidos pesticidas que encuentran uso en métodos para impactar al escarabajo de la patata, el gusano de la raíz del maíz sureño, y el gusano de la raíz del maíz occidental.

Por lo tanto, la invención provee ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que tiene actividad pesticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona de:

(a): una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9,15, ó 17;

(b): una secuencia de nucleótidos que codifican a la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 16, o 18;

(c): una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 88% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en (a); y

(d): una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en (b).

La invención también provee un polipéptido pesticida aislado que tiene actividad pesticida contra gusano de la raíz del maíz occidental, en donde dicho polipéptido se selecciona de:

(a): un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 16, ó 18; y

(b): un polipéptido que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de (a).

La invención también provee una planta transformada que contiene en su genoma al menos una construcción de nucleótidos incorporada en forma estable que contiene una secuencia de codificación operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión de un polipéptido que es pesticida para el gusano de la raíz del maíz occidental, en donde dicha secuencia de codificación selecciona de:

(a): una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 15, ó 17;

(b): una secuencia de nucleótidos que codifica a la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 16, ó 18;

(c): una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 88% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en (a);

(d): una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en (b); y

(e): una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de las secuencias de (a) a (d) que contiene codones optimizados para expresión en una planta.

La invención también provee microorganismo transformado que contiene en su genoma al menos un casete de expresión incorporado en forma estable que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que tiene actividad pesticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona de:

(a): una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 15, 17, 27, ó 28;

(b): una secuencia de nucleótidos que codifica a la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 16, ó 18;

(d): una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 85% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos expuesta en (b).

La invención también provee un método para impactar a una plaga de una planta que comprende introducir dentro de dicha planta o célula de la misma, al menos una construcción de nucleótidos que contiene una secuencia de codificación operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión de un polipéptido pesticida en células de plantas, en donde dicho polipéptido tiene actividad pesticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental y en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona de:

La invención también provee una variante del ácido nucleico expuesto en la SEQ ID NO: 19 en donde la variante comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un codón adicional no presente en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 19, en donde al menos uno de los codones adicionales introduce un sitio adicional sensible a la proteasa en la región del bucle entre las hélices alfa 3 y 4 del dominio 1 del polipéptido codificado, y además en donde el polipéptido codificado por la variante se caracteriza por una actividad pesticida mejorada contra una plaga perteneciente a la orden de los Coleópteros con relación a la actividad del polipéptido expuesta en la SEQ ID NO: 2.

La invención también provee un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de:

(a): una secuencia de nucleótidos expuesta en una cualquiera de las SEQ ID NOS: 5, 11, 15, 21, 23, 39, y 43;

(b): una secuencia de nucleótidos que codifica a una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOS: 6, 12, 16, 22, 24, 40, y 44;

(c): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en donde el polipéptido contiene un sitio de escisión adicional sensible a la proteasa insertado entre los residuos aminoácidos 164 y 165 de la SEQ ID NO: 16;

(d): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en donde la variante del polipéptido contiene una secuencia adicional de aminoácidos diseñada para introducir un sitio de escisión por la tripsina entre los residuos aminoácidos 164 y 165 de la SEQ ID NO: 16;

(e): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en donde el polipéptido contiene una secuencia adicional de aminoácidos diseñada para introducir un sitio de escisión por la quimotripsina entre los residuos aminoácidos 160 y 161 de la SEQ ID NO: 16; y

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(f): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en donde el polipéptido contiene una secuencia adicional de aminoácidos en la cual los residuos correspondientes a las posiciones 161 hasta 163 de la SEQ ID NO: 16 se remueven y los aminoácidos adicionales que contienen un sitio de escisión por la quimotripsina se introducen en su lugar.

La invención también provee una variante del ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 15, en donde la variante contiene una secuencia de nucleótidos que incluye al menos un codón adicional que introduce un sitio adicional sensible a la proteasa en la región del bucle entre las hélices alfa 3 y 4 del dominio 1 del polipéptido codificado por la variante del ácido nucleico, y además en donde el polipéptido codificado se caracteriza por una actividad pesticida mejorada contra una plaga que pertenece al orden de los Coleópteros, con relación a la actividad del polipéptido expuesta en la SEQ ID NO: 2.

La invención también provee un casete de expresión que contiene un ácido nucleico de la invención, en donde dicha secuencia de nucleótidos se enlaza operativamente a un promotor que dirige la expresión en un microorganismo o en una célula de una planta.

La invención también provee un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de ácido nucleico seleccionada de:

(a): una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOS: 19, 29, 31, 33, 41, ó 45;

(b): una secuencia de nucleótidos que codifica a las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOS: 20, 30, 32, 34, 42, ó 46;

(c): una secuencia de nucleótidos que contiene a una variante de la SEQ ID NO: 19, en donde la variante codifica a un polipéptido caracterizado por un sitio de escisión adicional sensible a la proteasa insertado inmediatamente 5' al aminoácido 114 de la SEQ ID NO: 20;

(d): una secuencia de nucleótidos que contiene a una variante de la SEQ ID NO: 19, en donde la variante codifica a un polipéptido caracterizado por una secuencia adicional de aminoácidos diseñada para introducir un sitio de escisión por la tripsina entre los residuos aminoácidos 113 y 114 de la SEQ ID NO: 20;

(e): una secuencia de nucleótidos que contiene a una variante de la SEQ ID NO:19, en donde la variante codifica a un polipéptido caracterizado por una secuencia adicional de aminoácidos diseñada para introducir un sitio de escisión por la tripsina entre los residuos aminoácidos 113 y 114 de la SEQ ID NO: 20; y

(f): una secuencia de nucleótidos que contiene a una variante de la SEQ ID NO: 19, en donde la variante codifica a un polipéptido caracterizado por una secuencia de aminoácidos en la cual los aminoácidos localizados en las posiciones 114 hasta 116 de la SEQ ID NO: 20 se remueven y los aminoácidos adicionales que contienen un sitio por la quimotripsina se insertan en su lugar.

La invención también provee una variante del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 16, en donde la variante contiene una secuencia de aminoácidos que incluye al menos un residuo aminoácido adicional que introduce un sitio adicional sensible a la proteasa en la región del bucle entre las hélices alfa 3 y 4 del dominio 1 del polipéptido, y además en donde el polipéptido codificado se caracteriza por una actividad pesticida mejorada contra una plaga que pertenece al orden de los Coleópteros con relación a la actividad del polipéptido expuesta en la SEQ ID NO: 2.

La invención también provee un polipéptido pesticida aislado que contiene una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOS: 6, 12, 16, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44, ó 46. La invención también provee una planta transformada que contiene en su genoma al menos una construcción de nucleótidos incorporada en forma estable que contiene una secuencia de codificación operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión de un polipéptido pesticida en las células de una planta transformada, en donde dicho polipéptido tiene actividad pesticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental y en donde dicha secuencia de codificación se selecciona de:

(a): una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOS: 11, 19, 21, 23, 29, 31, 33, 39, 41, 43, ó 45;

(b): una secuencia de nucleótidos que codifica a la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOS: 12, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44, ó 46;

(c): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en donde la variante contiene un sitio adicional de escisión sensible a la proteasa insertado entre los residuos aminoácidos 164 y 165 de la SEQ ID NO: 16;

(d): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en donde la variante contiene una secuencia adicional de aminoácidos diseñada para introducir un sitio de escisión por la tripsina entre los residuos aminoácidos 164 y 165 de la SEQ ID NO: 16;

\newpage

(e): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en donde la variante contiene una secuencia adicional de aminoácidos diseñada para introducir un sitio de escisión por la quimotripsina entre los residuos aminoácidos 160 y 161 de la SEQ ID NO: 16;

(f): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO:16, en donde los residuos aminoácidos que corresponden a los aminoácidos 161 hasta 163 de la SEQ ID NO: 16 se remueven y se introducen los aminoácidos que contienen un sitio de escisión por la quimotripsina en su lugar;

(g): una secuencia de nucleótidos que contiene una variante de la SEQ ID NO: 19, en donde la variante codifica a un polipéptido caracterizado por un sitio adicional de escisión sensible a la proteasa inmediatamente 5' al aminoácido 114 de la SEQ ID NO: 20;

(h): una secuencia de nucleótidos que contiene una variante de la SEQ ID NO: 19, en donde la variante codifica a un polipéptido caracterizado por un aminoácido adicional seleccionado para introducir un sitio de escisión por la tripsina inmediatamente 5' al aminoácido 114 de la SEQ ID NO: 20;

(i): una secuencia de nucleótidos que contiene una variante de la SEQ ID NO: 19, en donde la variante contiene residuos adicionales de ácido nucleico diseñados para introducir un sitio de escisión por la quimotripsina entre los residuos aminoácidos 113 y 114 de la SEQ ID NO: 20;

(j): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 20, en donde los residuos aminoácidos localizados en las posiciones 114 hasta 116 de la SEQ ID NO: 20 se remueven y los aminoácidos adicionales que contienen un sitio por la quimotripsina están en su lugar; y

(k): una secuencia de nucleótidos de acuerdo a una cualquiera de las secuencias de (a) hasta (j) que contiene codones optimizados para la expresión en una planta.

La invención también provee la semilla transformada de la planta de la invención.

La invención también provee un microorganismo transformado que contiene un ácido nucleico seleccionado de:

(c): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de la SEQ ID NO: 19, en donde la variante contiene a un inserto de ácido nucleico diseñado para introducir un sitio adicional sensible a la proteasa entre los residuos aminoácidos 117 y 118 de la SEQ ID NO: 20;

(d): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en donde la variante contiene un sitio adicional sensible a la proteasa insertado entre los residuos aminoácidos 164 y 165 de la SEQ ID NO: 16; y

(e): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante del polipéptido de la SEQ ID NO: 20, en donde la variante contiene un sitio adicional sensible a la proteasa insertado entre los residuos aminoácidos 117 y 118 de la SEQ ID NO: 20.

Descripción detallada de la invención

La invención está dirigida a composiciones y métodos para impactar plagas, particularmente plagas de plantas, más específicamente plagas de insectos del orden de los Coleópteros. Más específicamente, los ácidos nucleicos aislados de la invención, y fragmentos y variantes de los mismos, que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos pesticidas (por ejemplo, proteínas). Las proteínas pesticidas divulgadas son biológicamente activas (por ejemplo, pesticidas) contra plagas de insectos, particularmente el escarabajo de la patata (Leptinotarsa decemlineata), el gusano de la raíz del maíz occidental (Diabrotica virgifera virgifera), y el gusano de la raíz del maíz sureño (Diabrotica undecimpunctata howardi).

Las composiciones de la invención contienen ácidos nucleicos aislados, y fragmentos y variantes de los mismos, que codifican polipéptidos pesticidas, casetes de expresión que contienen secuencias de nucleótidos de la invención, proteínas pesticidas aisladas, y composiciones pesticidas. En algunas modalidades, la invención provee proteínas modificadas de \delta-endotoxina como las de Cry8 caracterizadas por una actividad insecticida mejorada contra Coleópteros con relación a la actividad pesticida de la correspondiente proteína parental natural. La invención provee además plantas y microorganismos transformados con estos nuevos ácidos nucleicos, y métodos que involucran el uso de tales ácidos nucleicos, composiciones pesticidas, y organismos transformados en el impacto de plagas de insectos.

En la descripción que viene a continuación, se utilizan mucho una cantidad de términos. Se proveen las siguientes definiciones para facilitar la comprensión de la invención.

Como se lo utiliza aquí, "ácido nucleico" incluye una referencia a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido ya sea en forma monocatenaria o bicatenaria, y a menos que se lo limite de alguna manera, abarca análogos conocidos (por ejemplo, ácidos nucleicos para el péptido) que tiene la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales en que ellos hibridan hasta ácidos nucleicos monocatenarios en forma similar a los nucleótidos de ocurrencia natural.

Como se los utiliza aquí, los términos "que codifica" o "codificado", cuando se los utiliza en el contexto de un ácido nucleico especificado, significa que el ácido nucleico comprende el requisito de información para dirigir la traducción de la secuencia de nucleótidos dentro de una proteína especificada. La información por medio de la cual una proteína es codificada se especifica por medio del uso de codones. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede contener secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de regiones traducidas del ácido nucleico, o puede carecer de tales secuencias no traducidas de intrones (por ejemplo, como en el ADNc).

Como se utiliza aquí "secuencia natural" en referencia a un polinucleótido especificado o su proteína codificada significa que tiene la secuencia entera de ácido nucleico o la secuencia entera de aminoácidos de, una secuencia endógena nativa (no sintética). Un polinucleótido de tamaño natural codifica a la forma catalíticamente activa de tamaño natural de la proteína especificada.

Como se lo utiliza aquí, el término "antisentido" utilizado en el contexto de la orientación de una secuencia de nucleótidos se refiere a una secuencia doble de polinucleótidos que se enlaza operativamente a un promotor en una orientación donde se transcribe la cadena antisentido. La cadena antisentido es suficientemente complementaria con un producto endógeno de transcripción de tal manera que la traducción del producto endógeno de transcripción es a menudo inhibida.

Los términos "polipéptido," "péptido," y "proteína" se utilizan aquí en forma intercambiable para referirse a un polímero de residuos aminoácidos. Los términos aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido correspondiente de ocurrencia natural, así como a polímeros de aminoácidos de ocurrencia natural.

Los términos "residuo" o "residuo aminoácido" o "aminoácido" se utilizan en forma intercambiable aquí para referirse a un aminoácido que se incorpora dentro de una proteína, polipéptido, o péptido (colectivamente "proteína"). El aminoácido puede ser un aminoácido de ocurrencia natural y, a menos que se lo limite de otra manera, puede abarcar análogos conocidos de aminoácidos naturales que pueden funcionar en forma similar a los aminoácidos de ocurrencia natural.

Como se utiliza aquí los términos "aislado" y "purificado" se usan en forma intercambiable para referirse a ácidos nucleicos, o polipéptidos, o porciones biológicamente activas de los mismos, que están substancialmente o esencialmente libres de componentes que normalmente acompañan o interactúan con el ácido nucleico o polipéptido como se encuentra en su ambiente natural. Por lo tanto, un ácido nucleico o polipéptido aislado o purificado está substancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se lo produce por medio de técnicas recombinantes, o substancialmente libre de precursores químicos o de otros químicos cuando se lo sintetiza químicamente.

Como se utiliza aquí el término "impactar las plagas de insectos" se refiere a efectuar cambios en la alimentación de los insectos, el desarrollo, y/o el comportamiento en cualquier etapa del desarrollo, incluyendo, pero sin limitarse a, matar al insecto, retardar su desarrollo, evitar su capacidad para reproducirse, y similares.

Como se utilizan aquí los términos "actividad pesticida" y "actividad insecticida" se usan como sinónimos para referirse a la actividad de un organismo o una sustancia, tal como, por ejemplo, una proteína, que se puede medir para, pero no se limita a, mortalidad de la plaga, perdida de peso de la plaga, atracción de la plaga, repelencia de la plaga, y otros cambios físicos y de comportamiento de una plaga después de alimentarla y exponerla durante un período de tiempo apropiado. Por ejemplo las "proteínas pesticidas" son proteínas que muestran actividad pesticida por si mismas o en combinación con otras proteínas.

El término "cantidad pesticida efectiva" tiene la connotación de una cantidad de una sustancia u organismo que tiene actividad pesticida cuando está presente en el medio ambiente de una plaga. Para cada substancia u organismo, la cantidad pesticida efectiva se determina empíricamente para cada plaga afectada en un medio ambiente específico. En forma similar, una "cantidad efectiva de insecticida" se la puede utilizar para referirse a una "cantidad efectiva de pesticida" cuando la plaga es una plaga de insectos.

Como se utiliza aquí el término "modificado genéticamente en forma recombinante" tiene la connotación de la utilización de tecnología de ADN recombinante para introducir (por ejemplo, por medio de ingeniería genética) un cambio en la estructura de la proteína con base en la comprensión del mecanismo de acción de la proteína y una consideración de los aminoácidos que son introducidos, suprimidos o substituidos.

Como se utiliza aquí el término "secuencia mutada de nucleótidos" tiene la connotación de una secuencia de nucleótidos que ha sido mutada o alterada para contener uno o más residuos de nucleótidos (por ejemplo, pares de bases) que no están presentes en la correspondiente secuencia natural, y que codifica a una \delta-endotoxina mutante que muestra actividad insecticida mejorada.

Como se utiliza aquí el término "actividad insecticida mejorada" caracteriza a una \delta-endotoxina de la invención que o bien tiene actividad pesticida anti-coleóptera con relación a la actividad de su correspondiente proteína natural, y/o una endotoxina que es efectiva ya sea contra un rango más amplio de insectos, o adquiere una especificidad para un insecto que no es susceptible a la toxicidad de la proteína natural. Un hallazgo de actividad pesticida mejorada requiere de una demostración del incremento en la toxicidad de al menos 30% contra el insecto objetivo, y más preferiblemente 35%, 40%, 45%, ó 50% con relación a la actividad insecticida de la endotoxina natural determinada contra el mismo insecto.

Unidades, prefijos, y símbolos pueden ser designados en sus formas SI aceptadas. A menos que se indique otra cosa, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en orientación amino hacia carboxi, respectivamente. Los rangos numéricos incluyen a los números que definen el rango. Los aminoácidos se pueden mencionar aquí ya sea por medio de sus símbolos conocidos de tres letras o por medio de lo símbolos de una sola letra recomendados por la IUPACIUB Biochemical Nomenclature Commission. Los nucleótidos, igualmente, se pueden mencionar por medio de sus códigos comúnmente aceptados de una sola letra. Los términos anteriormente definidos se definen más completamente con referencia a la especificación como un todo.

Se pueden utilizar las secuencias de nucleótidos de la invención para transformar cualquier organismo para producir las proteínas pesticidas codificadas. Se proveen métodos que involucran el uso de tales organismos transformados para impactar o controlar plagas de plantas. La invención se relaciona además con la identificación de fragmentos y variantes de la secuencia de codificación de ocurrencia natural que codifica a las proteínas pesticidas biológicamente activas. Todas las secuencias de nucleótidos de la invención encuentran uso directo en los métodos para impactar plagas, particularmente plagas de insectos, más particularmente plagas del orden de los Coleópteros, incluidos, por ejemplo, el escarabajo de la patata, el gusano de la raíz del maíz occidental, y el gusano de la raíz del maíz sureño. Por lo tanto, la presente invención provee nuevas aproximaciones para impactar plagas de insectos que no dependan del uso de insecticidas químicos sintéticos o tradicionales. La invención involucra el descubrimiento de pesticidas biodegradables de ocurrencia natural y los genes que los codifican.

La invención provee además fragmentos y variantes de las secuencias de codificación de ocurrencia natural que también codifican polipéptidos biológicamente activos (por ejemplo, pesticidas). Los ácidos nucleicos de la invención abarcan secuencias de ácido nucleico que han sido optimizadas para expresión por las células de un organismo particular, por ejemplo secuencias de ácido nucleico que han sido traducidas nuevamente utilizando codones preferidos por la planta con base en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido que tiene actividad pesticida
mejorada.

Las secuencias de nucleótidos de la invención se aislaron de cepas de la bacteria, Bacillus thuringiensis. Se descubrió que los lisados crudos preparados a partir de cultivos de las cepas tienen actividad pesticida contra el escarabajo de la patata, el gusano de la raíz del maíz occidental, y el gusano de la raíz del maíz sureño. Se aislaron proteínas cristal de los cultivos de las cepas. Las proteínas cristal aisladas fueron analizadas por su actividad pesticida en ensayos de alimentación de insectos. Los resultados de los análisis revelan que las proteínas cristal aisladas poseen actividad pesticida contra los Coleópteros. Se emprendió un esfuerzo para identificar las secuencias de nucleótidos que codifican a las proteínas cristal a partir de las cepas, y las secuencias de codificación de ocurrencia natural y se descubrieron los ácidos nucleicos genómicos de la invención.

Se demostró que las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos aislados codifican proteínas pesticidas por medio de la transformación de Escherichia coli con tales secuencias de nucleótidos. Los lisados preparados a partir de E. coli transformado tenían actividad pesticida contra los gusanos de la raíz del maíz y los escarabajos de la patata en ensayos de alimentación, demostrando que las secuencias aisladas de nucleótidos de la invención codifican proteínas pesticidas. Dependiendo de las características de una preparación dada de lisado, se reconoció que la demostración de la actividad pesticida requiere algunas veces de un tratamiento previo con tripsina para activar a las proteínas pesticidas.

Posteriormente, se identificaron las variantes y los fragmentos de ácido nucleico que codifican a los polipéptidos pesticidas biológicamente activos. Algunas de las proteínas pesticidas codificadas requieren de activación por proteasa (por ejemplo, tripsina) y se observó que otras proteínas eran biológicamente activas (por ejemplo, pesticidas) en ausencia de activación. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica una versión truncada del polipéptido de ocurrencia natural y como tal, se puede clasificar ya sea como una variante o como un fragmento. Además, se modificaron genéticamente una segunda generación de secuencias de ácido nucleico para incluir a las secuencias de nucleótidos que codifican a los polipéptidos como los de Cry8 caracterizados por actividad pesticida mejorada o alterada con relación a la actividad pesticida del polipéptido de ocurrencia natural.

Los ácidos nucleicos de la invención contienen polinucleótidos aislados, y variantes y fragmentos de los mismos, que codifican polipéptidos biológicamente activos (por ejemplo, pesticidas), incluyendo, pero no limitándose a, las secuencias de nucleótidos como los de Cry8 expuestas en las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 28, 29, 31, 33, 39, 41, 43, y 45. Las secuencias de nucleótidos divulgadas aquí proveen dos secuencias de fondo mencionadas aquí como 1218-1 y 49PVD dentro de las cuales se introducen las mutaciones. En algunos casos, las secuencias también proveen variantes de dos clones distintos mencionados aquí como 1218-1 y 1218-2. Más específicamente, SEQ ID NO: 15 (1218-1A) representa una variante de la SEQ ID NO: 5, cada una de las cuales representa modalidades alternativas del clon 1218-1. Además, SEQ ID NO: 17 (1218-2A) representa una variante de la SEQ ID NO: 7; cada una de las cuales representa modalidades alternativas del clon 1218-2.

Los polinucleótidos de la invención también incluyen a cualquier secuencia sintética o recombinante de nucleótidos que codifican a un polipéptido pesticida que contiene las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44, y 46.

Un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias (preferiblemente de secuencias que codifican proteína) que flanquean naturalmente al ácido nucleico (esto es, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo a partir del cual se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diferentes modalidades, los ácidos nucleicos aislados pueden contener aproximadamente menos de 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb, ó 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean en forma natural a los ácidos nucleicos en el ADN genómico de la célula a partir de la cual se deriva el ácido nucleico.

La presente invención provee ácidos nucleicos aislados que contienen secuencias de nucleótidos que codifican a las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32, 34,40, 42, 44, y 46. En modalidades particulares, la invención provee ácidos nucleicos que contienen a las secuencias de nucleótidos expuestas en las SEQ ID NOS: 1 (Cry1218-1 CDS) y 3 (Cry1218-2 CDS), el ácido nucleico optimizado de maíz expuesto en la SEQ ID NO: 9 (mo1218-1), y las secuencias genómicas nativas expuestas en la SEQ ID NO: 27 (Cry1218-1 genómico) y en la SEQ ID NO: 28 (Cry 1218-2 genómico). La secuencia que codifica (CDS) para la SEQ ID NO: 27 corre desde los pares de bases 731-4348. La CDS para la SEQ ID NO: 28 corre desde los pares de bases 1254-4883. Los plásmidos que contienen a cada uno de estos cinco ácidos nucleicos fueron depositados en mayo 5 de 2000 y octubre 20 de 2000 en la Patent Depository of the American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia, y consignados con los números de depósito de patente PTA-1821 (correspondiente a la SEQ ID NO: 1); PTA-1817 (correspondiente a la SEQ ID NO: 3); PTA-2G35 (correspondiente a la SEQ ID NO: 9); PTA-2634 (que contiene la SEQ ID NO: 27); y PTA-2636 (que contiene la SEQ ID NO: 28).

Los depósitos de patente PTA-1821 y PTA-1817 comprenden una mezcla de 2 clones, cada uno de los cuales contiene una parte de la secuencia entera de codificación. Más específicamente, los plásmidos depositados codifican a las moléculas de ácido nucleico clonado dentro de un vector TA (Invitrogen, Carlsbad, CA) que codifica dos fragmentos que se superponen de la secuencia de codificación. La secuencia de codificación de tamaño natural puede ser producida utilizando una estrategia de superposición por PCR. Una primera reacción por PCR debe contener iniciadores hacia adelante y hacia atrás diseñados para corresponder con los extremos 5' y 3' de la secuencia de codificación de tamaño natural. Los iniciadores adecuados para ser usados en reacciones PCR se exponen en las SEQ ID NOS: 35 hasta 38. Más específicamente, las SEQ ID NOS: 35 y 36 proveen un primer juego iniciador "(a)" que contiene un iniciador hacia delante con la SEQ ID NO: 35 (5'-ATGAGTCCAAATAATCAAAATG) y un iniciador inverso con la SEQ ID NO: 36 (5'-CCGCTTCTAAATCTTGTTCC) para el extremo 5' de la secuencia de codificación. Las SEQ ID NOS: 37 y 38 proveen un segundo juego iniciador "(b)" que contiene un iniciador hacia delante con la SEQ ID NO: 37 (5'-GGAACAAGATTTAGAGG) y un iniciador inverso con la SEQ ID NO: 38 (5'-CTCATCGTCTACAATCAATTCATC) para el extremo 3' de la secuencia de codificación. Las dos bandas de ADN generadas por la primera reacción PCR llevada a cabo con los juegos de iniciadores anteriormente identificados se deben purificar y se debe llevar a cabo una segunda vuelta de PCR, ajustada para 7 ciclos, que debe llevarse a cabo utilizando el ADN purificado aislado a partir de la primera reacción por PCR en ausencia de alguno de los iniciadores. El extremo 3' del ácido nucleico generado por medio del juego del iniciador (a) y el extremo 5' del ácido nucleico generado por medio del juego del iniciador (b) se superpondrán y preparará la generación de la secuencia de codificación de tamaño natural. Una tercera reacción y final por PCR se lleva a cabo para generar la secuencia de codificación de tamaño natural. Esta reacción se lleva cabo utilizando 1 \mul del producto de la segunda reacción por PCR y un juego de iniciador que contiene la SEQ ID NO: 35 (iniciador hacia adelante del juego (a)) y la SEQ ID NO: 39 (iniciador inverso del juego (b)).

Los depósitos anteriormente referenciados (por ejemplo, PTA-1821; PTA-1817; PTA-2635; PTA-2634; y PTA-2636) se mantendrán bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos del Procedimiento de Patente. Estos depósitos se hicieron simplemente por conveniencia para aquellos entrenados en la técnica y no es una admisión de que se requiere un depósito bajo 35 U.S.C. \NAK112.

De interés particular son las secuencias optimizadas de nucleótidos que codifican a las proteínas pesticidas de la invención. Como se utiliza aquí la frase "secuencias optimizadas de nucleótidos" se refiere a ácidos nucleicos que se optimizan para la expresión en un organismo particular, por ejemplo una planta. Las secuencias optimizadas de nucleótidos se pueden preparar por medio de cualquiera de los organismos de interés utilizando métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 9 revela una secuencia optimizada de ácido nucleico que codifica a la proteína pesticida expuesta en la SEQ ID NO: 16 (1218-1A truncada). Más específicamente, la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 9 que contiene a los codones preferidos para el maíz de la SEQ ID NO: 9 se preparó por medio de la traducción inversa de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16 para contener a los codones preferidos para el maíz como lo describen Murray y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498. La secuencia optimizada de nucleótidos encuentra uso en la expresión creciente de una proteína pesticida en una planta, particularmente una planta monocotiledónea, más particularmente una planta de la familia de las Gramíneas (Poaceae), más particularmente una planta de maíz.

La invención provee además polipéptidos pesticidas aislados (por ejemplo, insecticidas) codificados ya sea por un ácido nucleico de ocurrencia natural, o uno modificado (por ejemplo, mutado o truncado) de la invención. Más específicamente, la invención provee polipéptidos que contienen una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16,18, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44, y 46 y los polipéptidos codificados por los ácidos nucleicos descritos aquí, por ejemplo aquellos expuestos en las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 28, 29, 31, 33, 39, 41, 43, y 45, y fragmentos y variantes de los mismos.

En modalidades particulares, las proteínas pesticidas de la invención proveen proteínas \delta-endotoxinas de tamaño natural, fragmentos de \delta-endotoxinas de tamaño natural, y polipéptidos variables que se producen a partir de ácidos nucleicos mutados diseñados para introducir secuencias particulares de aminoácidos dentro de polipéptidos de la invención. En modalidades particulares, las secuencias de aminoácidos que se introducen dentro de los polipéptidos contienen una secuencia que provee un sitio de escisión para una enzima o proteasa.

Algunos de los polipéptidos de la invención, por ejemplo de las SEQ ID NOS: 2 y 4 contienen \delta-endotoxinas de tamaño natural; otros polipéptidos tales como los de las SEQ ID NOS: 6, 8, 10, 16, 18, y 20 incluyen fragmentos de una \delta-endotoxina de tamaño natural; y las SEQ ID NOS: 12, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44, y 46 proveen variantes de polipéptido. Algunos de los fragmentos y variantes del polipéptido de la invención tienen actividad pesticida mejorada con relación a la actividad de la \delta-endotoxina de tamaño natural a partir de la cual ellos se derivan, particularmente en ausencia de activación in vitro de la endotoxina con una proteasa antes de la evaluación selectiva por actividad. Por ejemplo, los datos presentados aquí en la Tabla 1 del Ejemplo 6 indican que el mutante para la adición al NGRS (SEQ ID NO: 12) de la SEQ ID NO: 16 (endotoxina 1218-1A truncada) se caracteriza por la mayor actividad pesticida contra el escarabajo de la patata.

Las SEQ ID NOS: 6, 10, 16 y 20 proveen polipéptidos que incluyen versiones del polipéptido 1218-1 expuesto en la SEQ ID NO: 2. La SEQ ID NO: 16 provee una variante, mencionada aquí como 1218-1A del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 6 y mencionada aquí como 1218-1. Tres de las secuencias anteriormente mencionadas, las SEQ ID NOS: 6, 10 y 16, representan un polipéptido que está acortado (truncado) en el extremo 3' de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2. En contraste, la cuarta variante del polipéptido expuesta en la SEQ ID NO: 20 provee una variante que está truncada en ambos extremos 5' y 3' de la proteína de tamaño natural expuesta en la SEQ ID NO: 2. Las SEQ ID NOS: 8 y 18 (1218-2 y 1218-2A, respectivamente) proveen polipéptidos que incluyen versiones truncadas de los polipéptidos expuestos en la SEQ ID NO: 4. Cada uno de estos dos polipéptidos provee una proteína que está truncada en el extremo 3' del polipéptido 1218-2 de tamaño natural expuesto en la SEQ ID NO: 4.

Las SEQ ID NOS: 12, 22, 24, 40, y 44 proveen una familia de polipéptidos que incluyen variantes de los polipéptidos truncados 1218-1A expuestos en la SEQ ID NO: 16, por lo tanto las SEQ ID NOS: 12, 22, 24,40, y 44 proveen variantes (o mutantes) del fragmento biológicamente activo del polipéptido como el de Cry8 expuesto en la SEQ ID NO: 2. Más específicamente, la SEQ ID NO: 12 provee un mutante, mencionado aquí como NGSR.N1218-1, que contiene un sitio de escisión adicional sensible a la tripsina; la SEQ ID NO: 22 provee un segundo mutante, mencionado aquí como LKMS.N1218-1, que contiene un sitio de escisión sensible a la quimotripsina que no está presente en los polipéptidos 1218-1 ó 1218-1A de tamaño natural; y la SEQ ID NO:24 provee un mutante de reemplazo, mencionado aquí como LKMS.R1218-1, en el cual se destruye un sitio de escisión existente por la tripsina y se introduce en su lugar un sitio por la quimotripsina. La SEQ lD NO: 40 provee un segundo mutante para la adición de quimotripsina, mencionado aquí como LRMS.N1218-1, que contiene al sitio alternativo de escisión por la quimotripsina LRMS (SEQ ID NO: 48). La SEQ ID NO: 44 provee un segundo mutante para el reemplazo o la substitución, mencionado aquí como LRMS.R1218-1, en el cual el sitio nativo para la tripsina se reemplaza con el sitio de escisión por la quimotripsina LRMS.

Las SEQ ID NOS: 30, 32, 34, 42, y 46 proveen una segunda familia de polipéptidos que incluyen variantes o mutantes del polipéptido truncado expuesto en la SEQ ID NO: 20. Por lo tanto, las SEQ ID NOS: 30, 32, 34, 42, y 46 proveen variantes del fragmento pesticida de la SEQ ID NO: 2 que está expuesta en la SEQ ID NO: 20. Más específicamente, la SEQ ID NO: 30 provee un mutante, mencionado aquí como NGSR.N49PVD, que contiene un sitio de escisión adicional sensible a la tripsina; la SEQ ID NO: 32 provee un segundo mutante, mencionado aquí como LKMS.N49PVD, que contiene un sitio de escisión sensible a la quimotripsina que no está presente en los polipéptido naturales 1218-1 ó 1218-1A; y la SEQ ID NO: 34 provee un mutante de reemplazo, mencionado aquí como LKMS.R49PVD, en el cual se destruye un sitio de escisión existente por la tripsina y se introduce un sitio por la quimotripsina en su lugar. La SEQ ID NO: 42 provee una segunda quimotripsina mutante adicional, mencionada aquí como LRMS.N49PVD, que contiene al sitio alternativo de escisión por la quimotripsina LRMS (SEQ ID NO: 48). La SEQ ID NO: 46 (LRMS.R49PVD) provee un segundo mutante para reemplazo o substitución en el cual el sitio nativo para la tripsina se reemplaza con el sitio de escisión por la quimotripsina LRMS.

Se entiende que los polipéptidos de la invención se pueden producir ya sea por medio de la expresión de un ácido nucleico divulgado aquí, o por medio del uso de técnicas estándar de biología molecular. Por ejemplo, una proteína truncada de la invención se puede producir por medio de la expresión de un ácido nucleico recombinante de la invención en una célula huésped apropiada, o alternativamente por medio de una combinación de procedimientos ex vivo, tales como digestión y purificación por medio de proteasa de una proteína natural purificada.

Como se utiliza aquí el término "aislado" o "purificado" tal como se lo utiliza para referirse a un polipéptido de la invención significa que la proteína aislada está sustancialmente libre de material celular e incluye preparaciones de proteína que tiene aproximadamente menos de 30%, 20%, 10%, ó 5% (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la invención o la porción biológicamente activa de la misma es producida en forma recombinante, preferiblemente el medio de cultivo representa aproximadamente menos de 30%, 20%, 10%, ó 5% (en peso seco) de precursores químicos o de químicos de interés sin proteína.

Se reconoce que las proteínas pesticidas pueden ser oligoméricas y variarán en peso molecular, en el número de residuos, de péptidos componentes, en la actividad contra plagas particulares, y en otras características. Sin embargo, por medio de los métodos expuestos aquí, se pueden aislar y caracterizar proteínas activas contra una variedad de plagas. Las proteínas pesticidas de la invención se pueden utilizar en combinación con endotoxinas de Bt u otras proteínas insecticidas para incrementar el rango de insectos objetivo. Además, el uso de proteínas pesticidas de la presente invención en combinación con \delta-endotoxinas de Bt u otros principios insecticidas de una naturaleza distinta tiene particular utilidad para la prevención y/o el manejo de resistencia a los insectos. Otros principios insecticidas incluyen inhibidores de proteasa (ambos del tipo de la serina y de la cisteína), lectinas, \alpha-amilasa, y peroxidasa.

Fragmentos y variantes de las secuencias de aminoácidos y nucleótidos y de los polipéptidos codificados así son también abarcados por la presente invención. Como se usa aquí el término "fragmento" se refiere a una porción de una secuencia de nucleótidos de un polinucleótido o una porción de una secuencia de aminoácidos de un polipéptido de la invención. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína nativa y por tanto poseen actividad pesticida. Por lo tanto, se puede reconocer que algunos de los polinucleótidos y secuencias de aminoácidos de la invención pueden ser correctamente mencionadas ya sea como fragmentos o como variantes. Esto es particularmente cierto de las secuencias truncadas que son biológicamente activas.

Se entiende que el término "fragmento", como se lo utiliza para referirse a secuencias de ácido nucleico de la invención, también abarca secuencias que son útiles como sondas de hibridación. Esta clase de secuencias de nucleótidos generalmente no codifican fragmentos de proteínas que retengan actividad biológica. Por lo tanto, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden estar en el rango desde al menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta la secuencia de nucleótidos de tamaño natural que codifica a las proteínas de la invención.

Un fragmento de una secuencia de nucleótidos como los de Cry8 que codifica a una porción biológicamente activa de una proteína pesticida de la invención codificará al menos 15, 25, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, ó 1,200 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido pesticida de la invención (por ejemplo, 1.206, 1.210, 667, 667, y 669 aminoácidos para la SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, y 10, respectivamente). Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos como los de un Cry8 que son útiles como sondas de hibridación o iniciadores PCR generalmente no necesitan codificar una porción biológicamente activa de una proteína pesticida.

Por lo tanto, un fragmento de un ácido nucleico como el de un Cry 8 puede codificar a una porción biológicamente activa de una proteína pesticida, o puede ser un fragmento que puede ser utilizado como una sonda de hibridación o un iniciador PCR utilizando los métodos divulgados más adelante. Una porción biológicamente activa de una proteína pesticida se puede preparar por medio del aislamiento de una porción de una de las secuencias de nucleótidos como las de Cry8 de la invención, que expresan a la porción codificada de la proteína pesticida (por ejemplo, por medio de expresión recombinante in vitro), y evaluar la actividad de la porción codificada de la proteína pesticida.

Los ácidos nucleicos que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos como la de Cry8 contienen al menos 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 1,000, 1,200, 1,400, 1,600, 1,800, 2,000, 2,200, 2,400, 2,600, 2,800, 3,000, 3,200, 3,400, ó 3,600 nucleótidos, o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos como la de Cry8 divulgada aquí (por ejemplo, 3,621, 3,633, 2,003, 2,003, 2,010, y 2010 y 2022 nucleótidos para las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 15 y 17 respectivamente).

Por ejemplo, las SEQ ID NOS: 5, 9, 15, y 19 representan fragmentos de la SEQ ID NO: 1 y las SEQ ID NOS: 7 y 17 representan fragmentos de la SEQ ID NO: 3. Más específicamente, modalidades particulares de los ácidos nucleicos de la invención divulgan fragmentos derivados de (por ejemplo, producidos a partir de) un primer ácido nucleico de la invención, en donde el fragmento codifica una endotoxina truncada como la de Cry8 caracterizada por actividad pesticida. El polipéptido truncado codificado por los fragmentos de polinucleótido de la invención se caracterizan por una actividad pesticida que es o bien equivalente a, o mejorada, con relación a la actividad del correspondiente polipéptido de tamaño natural codificado por el primer ácido nucleico a partir del cual se deriva el fragmento.

En modalidades específicas, algunos de los fragmentos de ácido nucleico de la invención están truncados en el extremo 3' de la secuencia natural de codificación. Por ejemplo, las SEQ ID NOS: 5 y 15 representan fragmentos de la SEQ ID NO: 1 que están truncados en el extremo 3'. En una modalidad alternativa, uno de los polinucleótidos de la invención, la SEQ ID NO: 19, contiene una secuencia de ácido nucleico que está truncada en ambos extremos 5' y 3' del dominio truncado de la toxina 1218-1 y de la 1218-1A codificadas por las SEQ ID NOS: 5 y 15, respectivamente.

Por "variantes" se entienden secuencias substancialmente similares. Para las secuencias de nucleótidos, las variantes conservadas incluyen a aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican a la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos pesticidas de la invención. Las variantes alélicas de ocurrencia natural tales como éstas se pueden identificar con el uso de técnicas conocidas de biología molecular, como, por ejemplo, con técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) e hibridación como se reseña más adelante.

Las variantes de las secuencias de nucleótidos también incluyen secuencias de nucleótidos derivadas en forma sintética, tal como aquellas generadas, por ejemplo, por medio del uso de mutagénesis dirigida al sitio pero la cual aún codifica una proteína pesticida de la invención. Generalmente, las variantes de una secuencia particular de nucleótidos de la invención tendrá al menos aproximadamente 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, generalmente al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 98%, 99%, o más identidad de secuencia con aquella secuencia particular de nucleótidos como la determinada por medio de los programas de alineación de secuencia descritos aquí en otra parte utilizando parámetros por defecto.

Como se utiliza aquí el término "variante de proteína" abarca a los polipéptidos que se derivan de una proteína nativa por medio de supresión (llamada truncamiento) o de la adición de uno o más aminoácidos al extremo N-terminal y/o C-terminal de la proteína nativa; la supresión o la adición de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa; o substitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios en la proteína nativa. Por lo tanto, el término variante de proteína abarca a los fragmentos biológicamente activos de una proteína nativa que contiene un número suficiente de residuos aminoácidos contiguos para retener la actividad biológica de la proteína nativa.

Las variantes de proteínas incluidas en la presente invención son biológicamente activas, esto es que ellas siguen poseyendo la actividad biológica deseada de la proteína nativa, esto es, actividad pesticida como la descrita aquí. Tales variantes pueden resultar de, por ejemplo, polimorfismo genético o de manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína pesticida nativa de la invención tendrán al menos aproximadamente 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, generalmente al menos aproximadamente 75%, 80%, 85%, preferiblemente al menos aproximadamente 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, y más preferiblemente al menos aproximadamente 98%, 99%, o más de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos para la proteína nativa como se determina por medio de los programas de alineación de secuencia descritos aquí en otra parte utilizando parámetros por defecto. Una variante biológicamente activa de una proteína de la invención puede diferir de aquella proteína por tan pocos residuos aminoácidos como 1-15, tan pocos como 1-10, tal como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o incluso 1 residuo aminoácido.

Se reconoce que la secuencia de ácido nucleico de cualquiera de los polinucleótidos de la invención se puede alterar o mutar para alterar (por ejemplo, mejorar) la actividad biológica y/o la especificidad de su polipéptido pesticida codificado. Por ejemplo, la SEQ ID NO: 11 representa una secuencia de nucleótidos como la de Cry8 que ha sido mutada para contener 12 nucleótidos adicionales (SEQ ID NO: 13) que no están presentes en la secuencia de ácido nucleico natural (SEQ ID NO: 15) que está siendo alterada. La secuencia de nucleótidos insertada dentro de la región de codificación de la SEQ ID NO: 15 se diseñó para codificar un mutante para la adición del NGRS que contiene un sitio adicional de escisión por la tripsina (NGSR) (SEQ ID NO: 14) en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado.

Más específicamente, la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 14 se introdujo entre los aminoácidos 164 y 165 de la \delta-endotoxina de Cry8 expuesta en la SEQ ID N0: 16. Se escogió esta secuencia particular de aminoácidos porque duplica la secuencia endógena presente en la proteína de tamaño natural de ocurrencia natural (SEQ ID NO: 2), y crea un segundo sitio sensible a la proteasa. Más específicamente, la modificación introduce un segundo sitio como para la tripsina. Aquellos entrenados en la técnica saben que la tripsina escinde enlaces inmediatamente C-terminales a la arginina y a la lisina. Como se demuestra aquí la proteína modificada genéticamente en forma recombinante (SEQ ID NO: 12) codificada por la SEQ ID NO: 11 se caracteriza por una actividad mejorada contra Coleópteros, particularmente contra el escarabajo de la patata (ver el Ejemplo 6, Tabla 1), el gusano de la raíz del maíz sureño (ver el Ejemplo 7, Tablas 2 hasta 4 y 6), y el gusano de la raíz del maíz occidental (ver el Ejemplo 7, Tabla 5).

La SEQ ID NO: 21 representa a una secuencia de nucleótidos como la de Cry8 que ha sido mutada para contener 12 nucleótidos adicionales (SEQ ID NO: 25) que no están presentes en la endotoxina natural. La secuencia insertada de nucleótidos se diseñó para codificar a un mutante para la adición de LKMS que contiene un sitio de escisión por la quimotripsina (LKMS) (SEQ ID NO: 26) en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Más específicamente, el mutante para la adición de LKMS (LKMS.N1218-1) contiene un inserto de una secuencia de nucleótidos que introduce la secuencia de aminoácidos LKMS entre los aminoácidos 160 y 161 de la SEQ ID NO: 6. El mutante de LKMS para el reemplazo de LKMS.R1218-1 contiene un polipéptido en el cual la secuencia de aminoácidos de LKMS se introduce entre los aminoácidos 160 y 161 de la SEQ ID NO: 16 y los aminoácidos del NGS se remueven desde las posiciones de los aminoácidos 161-163 de la SEQ ID NO: 16. Esta modificación remueve un sitio de una tripsina e introduce un sitio de una quimotripsina. La quimotripsina escinde los enlaces inmediatamente C-terminales a la Metionina.

El mutante para la adición de LRMSt (LRMS.N1218-1) y el mutante para el reemplazo (LRMS.R1218-1) proveen modalidades alternativas de polipéptidos que contienen un sitio adicional o alternativo para la escisión por la quimotripsina, pero los mutantes de LRMS difieren en la secuencia específica de aminoácidos (SEQ ID NO: 48) y en la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 47) que se usan para introducir el sitio de escisión por la quimotripsina dentro de la secuencia del ácido nucleico que codifica a los polipéptidos mutantes.

SEQ ID NO: 30 (NGSR.N49PVD), SEQ ID NO: 32 (LKMS.N49PVD), SEQ ID NO: 34 (LKMS.R49PVD), SEQ ID NO: 42 (LRMS.N49PVD), y SEQ ID NO: 46 (LRMS.R49PVD) proveen mutantes del polipéptido pesticida truncado 49PVD. La secuencia de aminoácidos de 49PVD es proveída en la SEQ ID NO: 20. El diseño básico de estos polipéptidos y su nomenclatura siguen el mismo patrón discutido más arriba para el polipéptido truncado 1218-1, y se explican más completamente aquí en otra parte.

Se reconoce que se pueden utilizar cualquiera de las secuencias de nucleótidos que codifican a las secuencias de aminoácidos de NGSR, LKMS, o LRMS y que la identidad exacta de los codones utilizados para introducir a cualquiera de estos sitios de escisión dentro de una variante de polipéptido puede variar dependiendo sobre el uso, esto es, la expresión en especies particulares de plantas. También se reconoce que se puede introducir cualquiera de las mutaciones divulgadas dentro de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos de la invención que contienen a los codones para residuos aminoácidos que proveen al sitio nativo para escisión por la tripsina que es objetivo para la modificación. Por lo tanto, las variantes o bien de las endotoxinas de tamaño natural o de los fragmentos de las mismas, se pueden modificar para contener sitios adicionales o alternativos de escisión, y estas modalidades tienen por objeto estar abarcadas dentro del alcance de la invención divulgada y reivindicada aquí.

La invención incluye además a un microorganismo que se transforma al menos con un ácido nucleico de la invención, con un casete de expresión que contiene al ácido nucleico, o con un vector que contiene al casete de expresión. Preferiblemente, el microorganismo es uno que se multiplica sobre las plantas. Más preferiblemente, el microorganismo es una bacteria que coloniza a la raíz. Una modalidad de la invención se relaciona con una proteína pesticida encap-
sulada, que contiene un microorganismo transformado que contiene al menos una proteína pesticida de la invención.

La invención provee composiciones pesticidas que contienen un organismo transformado de la invención. Preferiblemente, el microorganismo transformado está presente en la composición pesticida en una cantidad pesticida efectiva, junto con un excipiente adecuado. La invención también abarca composiciones pesticidas que contienen una proteína aislada de la invención, sola o en combinación con un organismo transformado de la invención y/o una proteína pesticida encapsulada de la invención, en una cantidad insecticida efectiva, junto con un excipiente adecuado.

La invención provee además un método para incrementar el rango de insectos objetivo por medio del uso de una proteína pesticida de la invención en una combinación con al menos una segunda proteína pesticida que es diferente de la proteína pesticida de la invención. Cualquier proteína pesticida conocida en el arte se puede emplear en los métodos de la presente invención. Tales proteínas pesticidas incluyen, pero no se limitan a, \delta-endotoxinas de Bt, inhibidores de proteasa, lectinas, \alpha-amilasas, y peroxidasas.

La invención también incluye plantas transgénicas transformadas o plantas transgénicas que contienen al menos una secuencia de nucleótidos de la invención. Preferiblemente, la planta se transforma en forma estable con una construcción de nucleótidos que contiene al menos una secuencia de nucleótidos de la invención operativamente enlazada para un promotor que dirige la expresión en una célula de una planta. Como se los utiliza aquí, los términos "planta transformada" y "planta transgénica" se refieren a una planta que contiene dentro de su genoma a un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo se integra en forma estable dentro del genoma de una planta transgénica o transformada de tal manera que el polinucleótido pasa en generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo se puede integrar dentro del genoma solo o como parte de un casete de expresión recombinante.

Se entiende que como se lo utiliza aquí, el término "transgénico" incluye a cualquier célula, línea celular, callo, tejido, parte de una planta, o planta, cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia de ácido nucleico heterólogo que incluye a aquellos transgénicos inicialmente alterados así, al igual que como aquellos creados por medio de cruces sexuales o una propagación asexual a partir del transgénico adicional. El término "transgénico" como se lo utiliza aquí no incluye la alteración del genoma (cromosomal o extra cromosomal) por medio de métodos convencionales para multiplicar plantas o por medio de eventos de ocurrencia natural tales como la fertilización cruzada aleatoria, la infección viral no recombinante, la transformación bacterial no recombinante, la transposición no recombinante, o la mutación espontánea.

Como se lo utiliza aquí, el término "planta" incluye la referencia a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas, y células de plantas, y progenie de la misma. Se entiende que partes de plantas transgénicas que están dentro del alcance de la invención que contienen, por ejemplo, células de plantas, protoplastos, tejidos, callo, embriones así como flores, tallo, frutos, hojas, raíces que se originan en plantas transgénicas o sus progenies previamente transformadas con una molécula de ADN de la invención y por lo tanto consisten al menos en parte de células transgénicas, también son un objetivo de la presente invención.

Como se lo utiliza aquí, el término "célula de una planta" incluye, sin limitación, cultivos de semillas en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raíces, vástagos, gametofitos, esporofitos, polen, y microsporas. La clase de plantas que se pueden utilizar en los métodos de la invención es generalmente tan amplia como la clase de plantas superiores sujetas a las técnicas de transformación, incluidas tanto las plantas monocotiledóneas como las dicotiledóneas. Una planta preferida es la Solanum tuberosum. Una planta particularmente preferida es la Zea mays.

Mientras que la invención no depende de un mecanismo biológico particular para incrementar la resistencia de una planta a una plaga para la misma, la expresión de las secuencias de nucleótidos de la invención en una planta puede resultar en la producción de las proteínas pesticidas de la invención y en un incremento en la resistencia de la planta a una plaga para la misma. Las plantas de la invención encuentran uso en agricultura en métodos para impactar plagas de insectos. Ciertas modalidades de la invención proveen plantas de maíz transformadas, que encuentran uso en métodos para impactar a los gusanos de la raíz del maíz sureños y occidentales. Otra modalidad de la invención provee plantas transformadas de patata, que encuentran uso en métodos para impactar al escarabajo de la patata.

Alguien entrenado en el arte reconocerá fácilmente que los avances en el campo de la biología molecular tal como la mutagénesis aleatoria y específica para el sitio, la metodologías de reacción en cadena de la polimerasa, y las técnicas de ingeniería de proteínas proveen una extensa colección de herramientas y protocolos adecuados para ser usadas en la alteración o modificación genética tanto de la secuencia de aminoácidos como de las secuencias genéticas fundamentales, de las proteínas de interés en agricultura. Por lo tanto, proteínas como las de Cry8 de la invención se pueden alterar en diferentes formas incluidas las sustituciones de aminoácidos, supresiones, truncamientos, e inserciones. Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en el arte.

Por ejemplo, las variantes de las secuencias de aminoácidos de las proteínas pesticidas se pueden preparar por medio de mutaciones que se introducen dentro de un ácido nucleico sintético (por ejemplo, molécula de ADN). Los métodos para mutagénesis y alteraciones del ácido nucleico son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, los cambios diseñados se pueden introducir utilizando una técnica de mutagénesis dirigida al sitio y mediada por oligonucleótidos. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel y colaboradores, (1987), Methods in Enzymol. 154:367-382; patente estadounidense No. 4.873.192; Walker y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York), y las referencias citadas allí.

Las secuencias naturales de nucleótidos (por ejemplo, de ocurrencia natural) de la invención se obtuvieron a partir de cepas de Bacillus thuringiensis que codifican \delta-endotoxinas como las de Cry8. Se sabe que las \delta-endotoxinas de ocurrencia natural las sintetizan las células esporulantes de B. thuringiensis como una protoxina proteinacea cristalina de inclusión. Después de ser ingerida por una larva susceptible de un insecto, los microcristales se disuelven en intestino medio, y la protoxina se transforma en una fracción biológicamente activa por medio de proteasas características de las enzimas digestivas localizadas en el intestino del insecto. La \delta-endotoxina activada se enlaza con gran afinidad a receptores de proteína sobre vesículas de membrana con reborde de cepillo. Las células epiteliales que revisten el intestino medio son el objetivo primario de la endotoxina y se destruyen rápidamente como consecuencia de la perforación de la membrana que resulta de la formación de canales selectivos a los cationes que permiten la entrada de la toxina.

Una comparación de las secuencias de aminoácidos de las toxinas de Cry de diferentes especifidades revela cinco bloques de secuencias altamente conservados. Estructuralmente, las \delta-endotoxinas contienen tres dominios distintos, que son, desde el N- hasta el C-terminal: una agrupación de siete hélices alfa implicadas en la formación de poros, tres láminas beta antiparalelas implicadas en el enlazamiento celular, y un sándwich beta.

Los polipéptidos mutantes de Cry8 de la presente invención se prepararon generalmente por medio de un proceso que involucra las etapas de: obtener una secuencia de ácido nucleico que codifica a un polipéptido de Cry8; analizar la estructura del polipéptido para identificar sitios "objetivo" para mutagénesis de la secuencia génica fundamental, con base en una consideración de la función propuesta del dominio objetivo en el modo de acción de la endotoxina; introducir una o más mutaciones dentro de la secuencia de ácido nucleico para producir un cambio deseado en uno o más de los residuos aminoácidos de la secuencia codificada del polipéptido, en donde el cambio se diseña para añadir un sitio de escisión sensible a la proteasa para la región objetivo o para remover el sitio original sensible a la proteasa y para añadir un sitio sensible a la proteasa que sea sensible a la actividad de una proteasa diferente; y expresar la secuencia mutada de ácido nucleico que codifica a la proteína de la invención modificada genéticamente en forma recombinante en una célula huésped transformada bajo condiciones efectivas para obtener la expresión del polipéptido modificado de Cry8.

Muchas de las \delta-endotoxinas están relacionadas en diferentes grados por similitudes en sus secuencias de aminoácidos y estructura terciaria, y los medios para obtener las estructuras cristalinas de las endotoxinas B. thuringiensis son conocidas. Ejemplos de soluciones de estructuras cristalinas de alta resolución tanto de los polipéptidos de Cry3A como de Cry3B se encuentran disponibles en la literatura. Los inventores de la presente invención usaron la estructura esclarecida del gen Cry3A (Li y colaboradores, (1991) Nature 353:815-821) para producir un modelo homólogo de la \delta-endotoxina de Cry8 divulgada y reivindicada aquí como la SEQ ID NO: 2 para adquirir una nueva percepción de la relación entre la estructure y la función de la endotoxina, y para diseñar las proteínas modificadas genéticamente en forma recombinante como se divulgan y se revelan aquí. Una consideración combinada de los análisis estructurales publicados de las endotoxinas de B. thuringiensis y la función reportada asociada con estructuras particulares, motivos, y similares indica que las regiones específicas de la endotoxina se correlacionan con funciones particulares y las etapas discretas del modo de acción de la proteína. Por ejemplo, las \delta-endotoxinas aisladas de B. thuringiensis son descritas generalmente como conteniendo tres dominios, un haz de siete hélices que está involucrado en la formación de poros, un dominio de tres láminas que ha sido implicado en el enlazamiento del receptor, y un motivo en sándwich beta (Li y colaboradores, (1991) Nature, 305:815-821).

Los inventores razonaron que la toxicidad de proteínas como las de Cry8, y específicamente la toxicidad de la proteína de Cry8, podría ser mejorada dirigiendo la región localizada entre las hélices alfa 3 y 4 del dominio 1 de la proteína endotoxina. Esta teoría se basó tanto en el conocimiento de que se había reportado que las hélices alfa 4 y 5 del dominio 1 de las \delta-endotoxinas de Cry3A se insertaban dentro de la bicapa lipídica de células que recubre el intestino medio de insectos susceptibles (Gazit y colaboradores, (1998) PNAS USA 95:12289-12294); el conocimiento de los inventores de la localización de los sitios de escisión de la tripsina y de la quimotripsina dentro de la secuencia de aminoácidos de la proteína natural; y la observación reportada aquí de que la proteína codificada por 1218-1 (esto es, la SEQ ID NO: 2) fue más activa contra ciertos Coleópteros después de la activación in vitro por medio del tratamiento con tripsina o quimotripsina. Por lo tanto, los inventores modificaron genéticamente una proteína mutante como la de Cry8 que contendría al menos un sitio adicional de escisión por la tripsina en la región localizada entre las hélices 3 y 4 del dominio 1.

Más específicamente, los inventores produjeron secuencias mutadas de nucleótidos como las de Cry8 que codifican endotoxinas mutantes de Cry8 (por ejemplo, polipéptidos) que contienen ya sea sitios adicionales, o alternativos sensibles a la proteasa. La invención provee polipéptidos mutantes que han sido construidos ya sea en un ambiente de 1218-1 (SEQ ID NOS: 6 ó 16), o de 49PVD (SEQ ID NO: 20). Se debe entender que la designación 1218-1 como se la utiliza aquí incluye dos modalidades por ejemplo, 1218-1 y 1218-1 A) del nucleótido 1218-1 y de las secuencias de aminoácidos presentadas aquí. Esto es particularmente cierto en el contexto de los mutantes divulgados de adición y de reemplazo que han sido creados ya sea en el ambiente de 1218-1 o de 49PVD. Se entiende que la nomenclatura utilizada aquí para referirse a nomenclatura utilizada aquí para referirse a un mutante tal como, por ejemplo el mutante NGSR.N1218-1 descrito contempla a los mutantes creados ya sea en el ambiente de 1218-1 y de 1218-1A. Por el bien de la coherencia, las secuencias presentadas en la secuencia que enlista a los mutantes 1218-1 incluye a los mutantes creados en las secuencias 1218-1A (SEQ ID NOS: 15 y 16).

Generalmente hablando, todos los polipéptidos mutantes descritos aquí se diseñan para contener al menos un sitio de escisión proteolítico localizado entre las hélices 3 y 4 del dominio 1 que no está presente polipéptido natural. Todos los mutantes divulgados aquí se clonaron dentro del sistema de expresión pET, expresado en E. coli, y analizado para la actividad pesticida primero contra el gusano de la raíz del maíz sureño (SCRW) y luego contra el gusano de la raíz del maíz occidental (WCRW). Adicionalmente, la variante 49PVD (SEQ ID NO: 20) y el mutante NGSR.N1218-1 (SEQ ID NO: 12) fueron analizados por la actividad pesticida contra el escarabajo de la patata (CPB).

En resumen, los mutantes proveídos aquí incluyen: mutantes que contienen un segundo sitio de escisión por la tripsina (esto es, NGSR (SEQ ID NO: 14)) introducido dentro de la secuencia de aminoácidos del fragmento presentado ya sea en la SEQ ID NO: 6 (1218-1) o en la SEQ ID NO: 16 (1218-1A) o el fragmento presentado en la SEQ ID NO: 20 (49PVD). Los mutantes que contienen un sitio de escisión por la quimotripsina contienen ya sea la secuencia de aminoácidos LKMS (SEQ ID NO: 26) o LRMS (SEQ ID NO: 48) introducida en frente del (por ejemplo, directamente 5' de) sitio de escisión por la tripsina que está naturalmente presente en la secuencia modificada del polipéptido; y los mutantes de reemplazo en los cuales el sitio de la tripsina nativa que se encuentra en el dominio de la toxina del polipéptido modificado se destruye y se introduce en su lugar un sitio para la quimotripsina (por ejemplo, LKMS o LRMS).

La serie de mutantes 1218-1 revelados aquí se mencionan como NGSR.N 1218-1, LKMS.N1218-1, LKMS.R1218-1, LRMS.N1218-1, y LRMS.R1218-1. Las secuencias de aminoácidos de estos polipéptidos mutantes se exponen en las SEQ ID NOS: 12, 22, 24, 42, y 44 respectivamente. La invención también provee una segunda serie de polipéptidos mutantes (SEQ ID NOS: 30, 32, 34, 42, y 46) en la cual se introducen los mutantes de adición (sitio de escisión por la tripsina o la quimotripsina) y de reemplazo (un sitio de escisión por la quimotripsina en vez de el sitio para la tripsina) anteriormente descritos dentro del polipéptido truncado (por ejemplo, 49PVD) expuesto en la SEQ ID NO: 20. Esta serie de mutantes se mencionan como NGSR.N49PVD, LKMS.N49PVD, LKMS.R49PVD, LRMS.N49PVD, y LRMS.R49PVD. Las secuencias de aminoácidos de cada uno de los polipéptidos mutantes 49PVD se exponen en las SEQ ID NOS: 30, 32, 34, 42, y 46 respectivamente.

Los mutantes NGSR divulgados aquí contienen un sitio adicional de proteasa sensible a la tripsina en una región de la secuencia de aminoácidos que codifica al dominio 1 del polipéptido. Por ejemplo, el mutante NGSR.N1218-1 contiene una secuencia NGSR introducida entre los residuos aminoácidos 164 y 165 de la proteína natural. Esta secuencia de aminoácidos provee un segundo sitio de escisión sensible a la tripsina dentro de la endotoxina mutante codificada por la SEQ ID NO: 11. Más específicamente, la secuencia de NGSR (por ejemplo, de la SEQ ID NO:14) duplica al sitio endógeno para escisión por la tripsina que está presente en la ubicación objetivo, introduciendo por lo tanto una segunda perspectiva sensible a la proteasa dentro de la región del bucle localizada entre las hélices alfa 3 y 4 del dominio 1. Por lo tanto, la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14, que comienza en el residuo 160, lee NGSRNGSR. En contraste, las posiciones de los aminoácidos 160-164 de la proteína natural contienen a la secuencia de NGSR.

Mientras no esté atado por la teoría, se cree que la presencia de un segundo sitio sensible a la proteasa (por ejemplo, tripsina o quimotripsina) facilita la escisión proteolítica intramolecular mejorando la capacidad de las hélices 4 y 5 para separarse del resto de la toxina. Los efectos de mejorar la habilidad de las hélices 4 y 5 para separarse del resto de la toxina se manifestarían como un proceso más eficiente para la formación de poros y por lo tanto confieren un incremento en la actividad insecticida de la toxina. En realidad, los mutantes de Cry8 descritos aquí muestran una toxicidad mejorada para diferentes plagas de Coleópteros. Los datos sugieren además que la presencia de un segundo sitio sensible a la proteasa produce un polipéptido que es más responsable por la activación por medio del proceso digestivo de insectos susceptibles.

Las secuencias mutadas de nucleótidos de Cry8 de la invención se pueden modificar para cambiar aproximadamente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 o más de los aminoácidos presentes en la secuencia primaria del polipéptido codificado. Alternativamente se pueden introducir aún más cambios de la secuencia nativa, de tal manera que la proteína codificada pueda tener al menos aproximadamente 1% ó 2%, o alternativamente aproximadamente 3% o aproximadamente 4%, o inclusive aproximadamente 5% o más de los codones alterados, o bien modificados. Debe entenderse que las secuencias mutadas de nucleótidos como los de Cry8 de la presente invención tienen por objeto abarcar péptidos equivalentes biológicamente funcionales. Tales secuencias pueden surgir como una consecuencia de la redundancia y equivalencia funcional del codón que se sabe que son de ocurrencia natural dentro de las secuencias de ácido nucleico y de las proteínas así codificadas.

Alguien entrenado en el arte reconocería que las adiciones y/o substituciones de aminoácidos se basan generalmente en la similitud relativa de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, en su hidrofobicidad, carga, tamaño, y similares. Los ejemplos de sustituciones que toman en consideración varias de las anteriores son bien conocidos por aquellos entrenados en el arte e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina, e isoleucina.

La guía para una apropiada sustitución de aminoácidos que no afecte la actividad biológica de la proteína de interés se puede encontrar en el modelo de Dayhoff y colaboradores, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.), que se incorpora aquí por referencia. Pueden ser preferibles las sustituciones conservadoras, tales como el intercambio de un aminoácido con otro que tenga propiedades similares.

Por lo tanto, los genes y secuencias de nucleótidos de la invención incluyen tanto secuencias de ocurrencia natural como formas mutantes. Además, las proteínas de la invención incluyen tanto proteínas de ocurrencia natural como formas variantes (por ejemplo, polipéptidos truncados) y modificadas (por ejemplo, mutantes) de las mismas. Tales variantes continuarán poseyendo la actividad pesticida deseada. Obviamente, las mutaciones que se hagan en el AND que codifica a la variante no colocará a la secuencia por fuera del marco de lectura y preferiblemente no creará regiones complementarias que producirían una estructura secundaria de ARNm. Ver, la publicación de la solicitud europea de patente No. 75.444.

No se espera que las supresiones, inserciones, y substituciones de las secuencias de la proteína incluidas aquí produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil de predecir el efecto exacto de la sustitución, supresión, o inserción antes de hacer eso, alguien entrenado en el arte apreciará que el efecto será evaluado por medio de ensayos rutinarios de evaluación selectiva, tal como el ensayo de alimentación del insecto. Ver, por ejemplo, Marrone y colaboradores, (1985) J. Econ. Entomol. 78:290-293 y Czapla y Lang (1990) J. Econ. Eutomol. 83:2480-2485.

Las variantes de secuencias de nucleótidos y proteínas también incluyen secuencias y proteínas derivadas de un procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como la mezcla de ADN. Con un procedimiento así, se pueden manipular una o más secuencias diferentes de codificación como las de Cry8 para crear una nueva proteína pesticida que posea las propiedades deseadas. De esta forma, se generan genotecas de polinucleótidos recombinantes a partir de una población de polinucleótidos de secuencia recombinante que contiene regiones de secuencia que tienen identidad de secuencia sustancial y que pueden ser recombinados en forma homóloga in vitro o in vivo. Por ejemplo, utilizando esta aproximación, las secuencias naturales de codificación, los motivos de secuencia que codifican un dominio de interés, o cualquier fragmento de secuencias de nucleótido de la invención se pueden mezclar entre las secuencias de nucleótido como las de Cry8 de la invención y las correspondientes porciones de otras secuencias conocidas de nucleótidos de Cry para obtener un nuevo gen que codifica para una proteína con una propiedad mejorada de interés.

Las propiedades de interés incluyen, pero no se limitan a, actividad pesticida por unidad de proteína pesticida, estabilidad de la proteína, y toxicidad para especies que no son objetivo particularmente la humana, ganadería, y plantas y microbios que expresan a los polipéptidos pesticidas de la invención. La invención no está enlazada por una estrategia particular de mezcla, solo que al menos una secuencia de nucleótidos de la invención, o parte de la misma, esté involucrada en tal estrategia de mezcla. La mezcla puede involucrar únicamente las secuencias de nucleótidos divulgadas aquí o puede involucrar adicionalmente la mezcla de cualquier otra de las secuencias de nucleótidos conocidas en el arte que incluyen, pero no se limitan a, los Accesos al Banco de Genes Nos. U04364, U04365, y U04366. Las estrategias para mezcla de ADN son conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751; Stemmer (1994) Nature 370:389-391; Crameri y colaboradores, (1997) Nature Biotech. 15:436-438; Moore y colaboradores, (1997) J. Mol. Biol. 272:336-347; Zhang y colaboradores, (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4504-4509; Crameri y colaboradores, (1998) Nature 391: 288-291; y las patentes estadounidenses Nos. 5.605.793 y 5.837.458.

Las secuencias de nucleótidos de la invención también se pueden utilizar para aislar a las correspondientes secuencias de otros organismos, particularmente otras bacterias, y más particularmente otras cepas de Bacilos. De esta forma, se pueden utilizar métodos tale como PCR, hibridación, y similares para identificar a tales secuencias con base en su homología de secuencia para las secuencias expuestas aquí. Las secuencias aisladas con base en su identidad de secuencia para las secuencias enteras como las de Cry8 expuestas aquí o para fragmentos de la misma abarcadas por la presente invención. Tales secuencias incluyen secuencias que son ortólogas de las secuencias divulgadas. Por "ortólogas" se quiere decir los genes derivados de un gen común ancestral y que se encuentran en diferentes especies como resultado de la evolución de las especies. Los genes encontrados en diferentes especies se consideran ortólogas cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias codificadas de proteína comparten identidad sustancial como se define aquí en otra parte. Las funciones de los ortólogos se encuentran a menudo altamente conservadas entre las especies.

En una aproximación PCR, se pueden diseñar iniciadores oligonucleótidos para ser usados en reacciones PCR para amplificar las correspondientes secuencias de ADN a partir del ADNc o del ADN genómico extraído de cualquier organismo de interés. Los métodos para diseñar iniciadores para PCR y clonación PCR son generalmente conocidos en el arte en el arte y se divulgan en Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Ver también Innis y colaboradores, eds. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods y Applications (Academic Press, New York); Innis y Gelfy, eds. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); e Innis y Gelfy, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero no se limitan a, métodos que utilizan iniciadores pareados, iniciadores anidados, iniciadores específicos sencillos, iniciadores degenerados, iniciadores específicos para el gen, iniciadores específicos para el vector, iniciadores parcialmente apareados en forma errónea, y similares.

En las técnicas de hibridación, se utiliza toda o parte de una secuencia conocida de nucleótidos como una sonda que hibrida selectivamente a otras secuencias correspondientes de nucleótidos presentes en una población de fragmentos genómicos clonados de ADN o fragmentos de ADNc (esto es, bibliotecas genómicas de ADNc) a partir de un organismo escogido. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos genómicos de ADN, fragmentos, fragmentos de ARN, u otros oligonucleótidos, y se pueden marcar con un grupo detectable tal como ^{32}P, o cualquier otro marcador detectable. Así, por ejemplo, las sondas para hibridación se pueden elaborar por medio de marcación sintética de oligonucleótidos con base en secuencias de la invención como las de Cry8. Los métodos para la preparación de sondas para hibridación y para la construcción de ADNc y de bibliotecas genómicas son generalmente conocidos en el arte y se divulgan en Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

Por ejemplo, una secuencia entera como la de Cry8 divulgada aquí, o una o más porciones de la misma, puede ser utilizada como sonda capaz de hibridar específicamente a secuencias correspondientes como las de Cry8 y a los ARN mensajeros. Para lograr una hibridación específica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas entre secuencias como las de Cry8 y son preferiblemente al menos aproximadamente de 10 nucleótidos de longitud, y más preferiblemente al menos aproximadamente de 20 nucleótidos de longitud. Tales sondas pueden ser usadas para amplificar a las secuencias correspondientes como las de Cry8 a partir de un organismo escogido por PCR. Esta técnica puede ser utilizada para aislar secuencias adicionales de codificación a partir de un organismo deseado o como un ensayo diagnóstico para determinar la presencia de secuencias de codificación en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen evaluación selectiva por hibridación de bibliotecas de ADN sembradas en placa (ya sean placas o colonias; ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York).

La hibridación de tales secuencias puede llevarse a cabo bajo condiciones restrictivas. Por "condiciones restrictivas" o "condiciones de hibridación restrictivas" se quiere decir condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia objetivo hasta un grado de detección mayor que para otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces sobre el ambiente). Las condiciones restrictivas dependen de la secuencia y serán diferentes en circunstancias diferentes. Por medio del control de las condiciones restrictivas de la hibridación y/o condiciones de lavado, se pueden identificar las secuencias objetivo que son 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo). Alternativamente, se pueden ajustar las condiciones restrictivas para permitir algún apareamiento erróneo en las secuencias de tal manera que se detecten grados menores de similitud (sondeo heterólogo). Generalmente, una sonda es aproximadamente menor de 1000 nucleótidos de longitud, preferiblemente menor a 500 nucleótidos de longitud.

Típicamente, las condiciones restrictivas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es aproximadamente menor a 1.5 M del ión Na, típicamente aproximadamente de 0,01 a 1,0 M de ión Na de concentración (o de otras sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es al menos aproximadamente de 30ºC para las sondas cortas (por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente de 60ºC para sondas largas (por ejemplo, mayores a 50 nucleótidos). Las condiciones restrictivas se pueden lograr con la adición de agentes de desestabilización tales como formamida. Ejemplos de bajas condiciones restrictivas incluyen hibridación con una solución amortiguadora de 30 a 35% de formamida, 1 M, SDS al 1% (dodecil sulfato de sodio) a 37ºC, y un lavado en 1X hasta 2X de SSC (20X de SSC = NaCl 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) de 50 a 55ºC. Ejemplos de condiciones restrictivas moderadas incluyen hibridación en 40 a 45% de formamida, NaCl 1,0 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 0,5X a 1X de SSC de 55 a 60ºC. Ejemplos de condiciones de restrictivas altas incluyen hibridación en formamida al 50%, NaCl 1 M, SDS al 1% a 37ºC, y un lavado en 0,1X de SSC de 60 a 65ºC. La duración de la hibridación es generalmente aproximadamente menor a 24 horas, usualmente aproximadamente desde 4 hasta aproximadamente 12 horas.

La especificidad es típicamente la función de lavados de posthibridación, siendo los factores críticos la fuerza iónica y la temperatura de la solución final de lavado. Para híbridos ADN-ADN, la Tm se puede aproximar a partir de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5ºC + 16,6 (log M) + 0.41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de los nucleótidos guanosina y citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo un pH y una fuerza iónica definidas) a la cual 50% de una secuencia complementaria objetivo hibrida a una sonda perfectamente apareada. Tm se reduce aproximadamente en 1ºC por cada 1% de apareamiento erróneo; por lo tanto, Tm, la hibridación, y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar hasta secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con \geq90% de identidad, la Tm se puede disminuir en 10ºC. Generalmente, se seleccionan las condiciones restrictivas para ser aproximadamente 5ºC menores al punto térmico de fusión (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones severamente restrictivas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 1, 2, 3, ó 4ºC por debajo del punto térmico de fusión (Tm); las condiciones moderadamente restrictivas pueden utilizar una hibridación y/o lavado a 6, 7, 8, 9, ó 10ºC por debajo del punto térmico de fusión (Tm); las condiciones restrictivas bajas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15, ó 20ºC por debajo del punto térmico de fusión (Tm). Utilizando la ecuación, hibridación y las composiciones de lavado, y Tm deseada, aquellos ordinariamente entrenados entenderán que las variaciones en las condiciones restrictivas de hibridación y/o las soluciones de lavado están descritas en forma inherente. Si el grado deseado de apareamiento erróneo resulta en una Tm menor a 45ºC (solución acuosa) o 32ºC (solución de formamida), se prefiere incrementar la concentración de SSC para poder utilizar una temperatura más alta. Se encuentra una guía importante para la hibridación of ácidos nucleicos en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- Hybridization with Nucleic Acid Probes, Parte 1, Capítulo 2 (Elsevier, New York); y Ausubel y colaboradores, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Capítulo 2 (Greene Publishing y Wiley-Interscience, New York). Ver Sambrook y colaboradores. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York). Por lo tanto, las secuencias aisladas que codifican a una proteína como la de Cry8 de la invención y que hibridan bajo condiciones restrictivas a las secuencias como las de Cry8 divulgadas aquí, o a fragmentos de la misma, están incluidas en la presente invención.

Los siguientes términos son utilizados para describir las relaciones de las secuencias entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia", y (e) "identidad substancial".

(a): Como se la utiliza aquí, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como base para comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especificada; por ejemplo, como un segmento de ADNc de tamaño natural o secuencia génica, o el ADNc completo o secuencia génica.

(b): Como se la utiliza aquí, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especificado de una secuencia de polinucleótidos, en donde la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede incluir adiciones o supresiones (esto es, vacíos) comparado con la secuencia de referencia (que no contiene adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es de al menos 20 nucleótidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100, o más larga. Aquellos entrenados en el arte entienden que evitar una alta similitud con una secuencia de referencia debida a la inclusión de vacíos en la secuencia de polinucleótidos, se introduce típicamente un vacío de penalización y se sustrae del número de apareamientos.

Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en el arte. Por lo tanto, la determinación del porcentaje de entre cualquiera de las dos secuencias se puede lograr utilizando un algoritmo matemático. Ejemplos no limitantes de tales algoritmos matemáticos son los algoritmos de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de homología local de Smith y colaboradores, (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453; el método de búsqueda de similitudes de Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877.

Las implementaciones por computador de estos algoritmos matemáticos se pueden utilizar para la comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Tales implementaciones incluyen, pero no se limitan a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible con Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Versión 8 (disponible con Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA). Las alineaciones que utilizan estos programas se pueden llevar a cabo utilizando los parámetros por defecto. El programa CLUSTAL es bien descrito por Higgins y colaboradores, (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins y colaboradores, (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet y colaboradores, (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang y colaboradores, (1992) CABIOS 8: 155-65; y Pearson y colaboradores, (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-331. El programa ALIGN se basa en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Se puede utilizar una tabla de residuo de peso PAM120, una penalización de la longitud del vacío de 12, y una penalización de vacío de 4 se pueden utilizar con el programa ALIGN cuando se comparan las secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul y colaboradores, (1990) J. Mol. Biol. 215:403 se basan en el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) supra. Las búsquedas de nucleótidos con BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTN, puntuación =100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias homólogas de nucleótidos para una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína de la invención. Las búsquedas de proteína por BLAST se pueden llevar a cabo con el programa BLASTX, puntuación = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias homólogas de aminoácidos para una proteína o polipéptido de la invención. Para obtener alineamientos gapped para propósitos de comparación, se puede utilizar Gapped BLAST (en BLAST 2.0) como se describe en Altschul y colaboradores, (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389. Alternativamente, se puede utilizar PSI-BLAST (en BLAST 2.0) para llevar a cabo una búsqueda iterativa que detecta relaciones distantes entre moléculas. Ver Altschul y colaboradores, (1997) supra. Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST, se pueden utilizar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para las secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas). Ver http://www.ncbi-him.nih.gov. La alineación también se puede llevar a cabo manualmente por medio de inspección.

A menos que se establezca otra cosa, los valores de identidad/similitud de secuencia de nucleótidos proveídos aquí se refieren al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 usando los siguientes parámetros: % de identidad utilizando GAP Weight de 50 y Length Weight de 3; % de similitud utilizando Gap Weight de 12 y Length Weight de 4, o cualquier programa equivalente. Para las secuencias de aminoácidos, los valores de identidad de secuencia de aminoácidos proveídos aquí se refieren al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 usando los siguientes parámetros: % de identidad usando GAP Weight de 8 y Length Weight de 2, o cualquier programa equivalente. Por "programa equivalente" se quiere decir cualquier programa de comparación de secuencia que, para cualquiera de las dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene apareamientos idénticos de nucleótidos o residuos de aminoácidos y un porcentaje idéntico de identidad de secuencia cuando se lo compara con el alineamiento correspondiente generado por el programa preferido.

GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximizan el número de apareamientos y minimiza el número de vacíos. GAP considera todos los posibles alineamientos y posiciones de vacíos y crea la alineación con el número más grande de bases apareadas y los más pocos vacíos. Permite el suministro de una penalización por la creación de un vacío y una penalización por la extensión de un vacío en unidades de bases apareadas. GAP debe obtener un beneficio del número de penalizaciones por la creación de vacíos de apareamientos por cada vacío que inserte. Si se escoge una penalización de una extensión de un vacío mayor a cero, GAP debe, además, obtener un beneficio por cada vacío insertado de la longitud del vacío las veces de la penalización por la extensión del vacío. Los valores de la penalización por defecto por la creación del vacío y los valores de la penalización por la extensión del vacío en la Versión 10 de Wisconsin Genetics Software Package para las secuencias de proteína son 8 y 2, respectivamente. Para las secuencias de nucleótidos la penalización por defecto por la creación de un vacío es 50 mientras que la penalización por defecto por la extensión del vacío es 3. Las penalizaciones por la creación del vacío y por la extensión del vacío se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consiste de 0 a 200. Así, por ejemplo, las penalizaciones por la creación del vacío y por la extensión del vacío pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o superiores.

GAP representa a un miembro de la familia de las mejores alineaciones. Pueden existir muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP muestra cuatro datos de mérito para las alineaciones: Calidad, Proporción, Identidad, y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada con el propósito de alinear las secuencias. La Proporción es la calidad dividida por el número de las bases en el segmento más corto. El porcentaje de Identidad es el porcentaje de los símbolos que realmente se aparean. El porcentaje de Similitud es el porcentaje de los símbolos que son similares. Los símbolos que están a través de los vacíos se ignoran. Una similitud se consigue cuando el valor de la matriz de marcación para un par de símbolos es mayor o igual a 0,50, el umbral de la similitud. La matriz de marcación utilizada en la Versión 10 del Wisconsin Genetics Software Package es BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915).

Para los propósitos de la presente invención, la comparación de las secuencias de nucleótidos o de proteínas para la determinación del porcentaje de identidad de secuencia para las secuencias como las de Cry8 divulgadas aquí se hace preferiblemente utilizando el programa GAP en el Wisconsin Genetics Software Package (Versión 8 o posterior) o cualquier programa equivalente. Para los análisis GAP de las secuencias de nucleótidos, se utilizó un GAP Weight de 50 y un Length de 3.

(c): Como se lo utiliza aquí, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o de polipéptido hacen referencia a los residuos en las dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para máxima correspondencia sobre una ventana especificada de comparación. Cuando se utiliza el porcentaje de identidad de secuencia en referencia con las proteínas se reconoce que las posiciones del residuo que no son idénticas a menudo difieren por las sustituciones conservadoras de los aminoácidos, donde los residuos de aminoácido se sustituyen por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en las sustituciones conservadoras, el porcentaje de identidad de secuencia se puede ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservadora de la substitución. Las secuencias que difieren en tales substituciones conservadoras se dice que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para hacer este ajuste son conocidos por aquellos entrenados en el arte. Típicamente esto implica conseguir una sustitución conservadora como un apareamiento erróneo parcial en vez de un apareamiento erróneo completo, incrementando así el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, en donde un aminoácido idéntico da un puntaje de 1 y una sustitución no conservadora da un puntaje de cero, una sustitución conservadora da un puntaje entre cero y 1. La puntuación de las substituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, como implementada en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California).

(d): Como se lo utiliza aquí, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado por medio de la comparación de dos secuencias lineadas en forma óptima durante una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (esto es, vacíos) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para una alineación óptima de las dos secuencias: El porcentaje se calcula por medio de la determinación del número de posiciones para las cuales ocurre en ambas secuencias una base idéntica de ácido nucleico o de residuos de aminoácidos en ambas secuencias para producir el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación, y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.

(e) \; (i): El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótido significa que un polinucleótido contiene una secuencia que tiene al menos 70% de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferible al menos 95%, comparado con una secuencia de referencia que utiliza uno de los programas de alineación descrito usando parámetros estándar. Alguien capacitado en el arte reconocerá que esos valores pueden ser apropiadamente ajustados para determinar la correspondiente identidad de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos teniendo en cuenta la degeneración del codón, la similitud de los aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura, y similares. Una identidad sustancial de las secuencias de aminoácidos para estos propósitos normalmente significa una identidad de secuencia de al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, 80%, 90%, y lo más preferible al menos 95%.

Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son substancialmente idénticas es si dos moléculas hibridan entre sí bajo condiciones restrictivas. Generalmente, las condiciones restrictivas se seleccionan para que sean aproximadamente 5ºC inferiores al punto térmico de fusión (Tm) para la secuencia específica con una fuerza iónica y un pH definidos. Sin embargo, las condiciones restrictivas abarcan temperaturas en el rango aproximadamente de 1ºC hasta aproximadamente 20ºC, dependiendo del grado deseado de condiciones restrictivas de otro modo calificadas aquí. Los ácidos nucleicos que no hibridan entre sí bajo condiciones de restricción son aún sustancialmente idénticos si los polipéptidos que ellos codifican son sustancialmente idénticos. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando se crea una copia de a ácido nucleico utilizando la máxima degeneración permitida del codón por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son substancialmente idénticas es cuando el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico es inmunológicamente reactivo en forma cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico.

(e) \; (ii): El término "identidad substancial" en el contexto de un péptido indica que un péptido contiene una secuencia al menos con 70% de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, preferiblemente 80%, más preferiblemente 85%, lo más preferible al menos 90% ó 95% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia durante una ventana de comparación especificada. Preferiblemente, la alineación óptima se realiza utilizando el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453. Una indicación de que dos secuencias de péptidos son sustancialmente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos surgidos contra el segundo péptido. Por lo tanto, un péptido es substancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren únicamente en una sustitución conservadora. Los péptidos que son "substancialmente similares" comparten secuencias como se observó anteriormente excepto porque las posiciones de los residuos que no son idénticos puede diferir por los cambios conservadores de aminoácidos.

El uso del término "construcciones de nucleótidos" no pretende limitar aquí a la presente invención para construcciones de nucleótidos que contienen ADN. Aquellos ordinariamente capacitados en el arte reconocerán que las construcciones de nucleótidos, particularmente de polinucleótidos y de oligonucleótidos, que contienen ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos se pueden emplear también en los métodos divulgados aquí. Las construcciones de nucleótidos, las secuencias de ácido nucleico, y de nucleótidos de la invención abarcan adicionalmente todas las formas complementarias de tales construcciones, moléculas, y secuencias. Además, las construcciones de nucleótidos, de moléculas de nucleótidos, y de secuencias de nucleótidos de la presente invención incluyen a todas las construcciones de nucleótidos, moléculas, y secuencias que pueden ser empleadas en los métodos de la presente invención para transformar plantas incluyendo, pero sin limitarse a, aquellas que contienen desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, y combinaciones de las mismas. Tales desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos incluyen tanto moléculas de ocurrencia natural como análogos sintéticos. Las construcciones de nucleótidos, secuencias de ácidos nucleicos, y de nucleótidos de la invención también incluyen todas las formas de construcciones de nucleótidos incluyendo, pero sin limitarse a, formas monocatenarias, formas bicatenarias, horquillas, estructuras tallo y en forma de bucle, y similares.

Una modalidad adicional de la invención se relaciona con un organismo transformado, preferiblemente un organismo transformado seleccionado del grupo que consiste de células de plantas e insectos, bacterias, levaduras, baculovirus, protozoarios, nemátodos, y algas, que contienen una molécula de ADN de la invención, un casete de expresión que contiene a dicha molécula de ADN , o un vector que contiene a dicho casete de expresión, preferiblemente incorporado en forma estable dentro del genoma del organismo transformado.

Las secuencias como las de Cry8 de la invención se suministran en casetes de expresión para la expresión en el organismo de interés. El casete incluirá secuencias reguladoras 5' y 3' operativamente enlazadas a una secuencia como la de Cry8 de la invención. Por "operativamente enlazado" se quiere decir un enlace funcional entre un promotor y una segunda secuencia, en donde la secuencia promotora inicia y media la transcripción de la secuencia de ADN correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, operativamente enlazado significa que las secuencias de ácido nucleico que están enlazadas son contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones que codifican proteínas, son adyacentes y en el mismo marco de lectura. El casete puede contener adicionalmente al menos un gen adicional que se cotransforma dentro del organismo. Alternativamente, el(los) gen(es) adicional(es) pueden ser proveídos sobre múltiples casetes de expresión.

Tal casete de expresión se provee con una pluralidad de sitios de restricción para la inserción de una secuencia como la de Cry8 que está bajo la regulación transcripcional de las regiones reguladoras. El casete de expresión puede adicionalmente contener genes marcadores seleccionables.

El casete de expresión incluirá en la dirección de transcripción 5'-3', una región de iniciación transcripcional y de traducción, una secuencia de ADN como la de Cry8 de la invención, y una región funcional de terminación transcripcional y de traducción en el organismo que sirve como huésped. La región de iniciación transcripcional, el promotor, puede ser nativa o análoga o foránea o heteróloga para el organismo huésped. Adicionalmente, el promotor puede ser la secuencia natural o alternativamente una secuencia sintética. Por "foránea" quiere decir que la región de iniciación transcripcional no se encuentra en el organismo nativo dentro del cual se introduce la región de iniciación transcripcional. Como se lo utiliza aquí, un gen quimérico contiene una secuencia de codificación operativamente enlazada a una región de iniciación de la transcripción que es heterólogo a la secuencia de codificación.

La región de terminación puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con la secuencia operativamente enlazada a la secuencia de ADN de interés, o se puede derivar de otra fuente. Las regiones convenientes de terminación están disponibles a partir del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de la octopina sintasa y nopalina sintasa. Ver también Guerineau y colaboradores, (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y colaboradores, (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen y colaboradores, (1990) Plan Cell 2:1261-1272; Munroe y colaboradores, (1990) Gene 91:151-158; Ballas y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; y Joshi y colaboradores, (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.

Cuando sea apropiado, se puede optimizar un ácido nucleico para una expresión mayor en el organismo huésped. Por lo tanto, cuando el organismo huésped es una planta, los ácidos nucleicos sintéticos se pueden sintetizar utilizando codones preferidos por la planta para mejorar la expresión. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physiol. 92:1-11 para una discusión del uso del codón preferido por el huésped. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se pueden expresar tanto en especies de plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias se pueden modificar para dar cuenta de las preferencias específicas del codón y las preferencias en el contenido de GC de monocotiledóneas o dicotiledóneas ya que se ha mostrado que estas preferencias difieren (Murray y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498). Así, el codón preferido para el maíz para un aminoácido particular se puede derivar de las secuencias génicas conocidas del maíz. El uso del codón del maíz por 28 genes de plantas de maíz se enlista en la Tabla 4 de Murray y colaboradores, supra. Los métodos están disponibles en el arte para la síntesis de los genes preferidos por la planta. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 5.380.831, y 5.436.391, y Murray y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-498.

Se conocen modificaciones adicionales a la secuencia para mejorar la expresión génica en un huésped celular. Estas incluyen eliminación de las secuencias que codifican señales espureas de poliadenilación, señales en el sitio de empalme exón-intrón, repeticiones como los transposones, y otras de tales secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales para la expresión génica. El contenido de G-C de la secuencia se puede ajustar hasta niveles promedio para un huésped celular dado, como el calculado por referencia a genes conocidos expresados en la célula huésped. Por "célula huésped" se entiende una célula que contiene un vector y que soporta la replicación y/o la expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procariotas tales como las de E. coli, o células eucariotas tales como células de levadura, de insecto, de anfibio, o de mamífero. Preferiblemente, las células huésped son células de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas. Una célula huésped particularmente preferida de monocotiledónea es una célula huésped de maíz. Cuando es posible, se modifica la secuencia para evitar estructuras secundarias predichas de ARNm de horquilla.

Los casetes de expresión pueden adicionalmente contener secuencias líder 5' en la construcción del casete de expresión. Tales secuencias líderes pueden actuar para mejorar la traducción. Los líderes de traducción se conocen en el arte e incluyen: líderes picomavirus, por ejemplo, el líder EMCV (región no codificadora 5' para encefalomiocarditis) (Elroy-Stein y colaboradores, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6126-6130); líderes potivirus, por ejemplo, el líder TEV (Virus Etch del tabaco) (Gallie y colaboradores, (1995) Gene 165(2):233-238), el líder MDMV (Virus Dwarf del Mosaico del Maíz) (Virology 154:9-20), y la proteína de enlazamiento a la cadena pesada de la inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak y colaboradores, (1991) Nature 353:90-94); el líder no traducido del ARNm de la proteína de recubrimiento del virus del mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling y colaboradores, (1987) Nature 325:622-625); el líder del virus del mosaico del tabaco (TMV) (Gallie y colaboradores, (1989) en Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), páginas 237-256); y el líder del virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel y colaboradores, (1991) Virology 81:382-385). Ver también, Della-Cioppa y colaboradores, (1987) Plant Physiol. 84:965-968. Se pueden utilizar otros métodos conocidos para mejorar la traducción, por ejemplo, intrones, y similares.

En la preparación del casete de expresión, se pueden manipular los diferentes fragmentos de ADN para suministrar secuencias de ADN en la orientación adecuada y, según sea apropiado, en el propio marco de lectura. Con este fin, se pueden emplear adaptadores o enlazadores para unir los fragmentos de ADN o se pueden involucrar otras manipulaciones para suministrar los sitios de restricción convenientes, remoción de ADN superfluo, remoción de sitios de restricción, o similares. Para este propósito, se pueden involucrar mutagénesis in vitro, reparación del iniciador, restricción, apareamiento, resubstituciones, por ejemplo, transiciones y transversiones.

Se pueden utilizar un cierto número de promotores en la práctica de la invención. Los promotores se pueden seleccionar con base en el resultado deseado. Los ácidos nucleicos se pueden combinar con promotores constitutivos, preferidos por los tejidos, inducibles, u otros promotores para expresión en el organismo huésped. Los promotores constitutivos adecuados para el uso en una célula huésped de una planta incluyen, por ejemplo, al promotor central del promotor Rsyn7 y otros promotores constitutivos descritos en WO 99/43838 y en la patente estadounidense No. 6.072.050; el promotor central CaMV 35S promotor (Odell y colaboradores (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy y colaboradores (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen y colaboradores (1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632 y Christensen y colaboradores (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last y colaboradores (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten y colaboradores (1984) EMBO J. 3: 2723-2730); promotor ALS (patente estadounidense No. 5.659.026), y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, aquellos divulgados en las patentes estadounidenses Nos. 5.608.149; 5. 608. 144; 5.604.121.; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; y 6.177.611.

Dependiendo del resultado deseado, puede ser beneficioso expresar al gen a partir de un promotor inducible. De interés particular para regular la expresión de las secuencias de nucleótidos de la presente invención en plantas son los promotores inducibles por heridas. Tales promotores inducibles por heridas, pueden responder al daño causado por la alimentación de insectos, e incluyen al gen inhibidor de la patata proteinasa (pin 11) (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28:425-449; Duan y colaboradores (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wun1 y wun2, la patente estadounidense No. 5.428.148; win1 y win2 (Stanford y colaboradores (1989) Mol. Gen. Genet. 215:200-208); sistemina (McGurl y colaboradores (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier y colaboradores (1993) Plant Mol. Biol. 22:783-792; Eckelkamp y colaboradores (1993) FEBS Letters 323:73-76); MPI gene (Corderok y colaboradores (1994) Plant J. 6(2): 141-150); y similares.

Adicionalmente, se pueden emplear los promotores inducibles por patógenos en los métodos y construcciones de nucleótidos de la presente invención. Tales promotores inducibles por patógenos incluyen a aquellas proteínas relacionadas con patogénesis (proteínas PR), que se inducen después de la infección por un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1,3-glucanasa, quitinasa, etc. Ver, por ejemplo, Redolfi y colaboradores (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes y colaboradores (1992) Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4:111-116. Ver también WO 99/43819.

De interés son los promotores que se expresan localmente en o cerca del sitio de infección del patógeno. Ver, por ejemplo, Marineau y colaboradores (1987) Plant Mol. Biol. 9:335-342; Matton y colaboradores (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch y colaboradores (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:2427-2430; Somsisch y colaboradores (1988) Mol. Gen. Genet. 2:93-98; y Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:14972-14977. Ver también, Chen y colaboradores (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang y colaboradores (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2507-2511; Warner y colaboradores (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz y colaboradores (1989) Plant Cell 1:961-968; patente estadounidense No. 5.750.386 (inducible por nemátodos); y las referencias citadas allí. De particular interés es el promotor inducible por el gen PRms del maíz, cuya expresión se induce por medio del patógeno Fusarium moniliforme (ver, por ejemplo, Cordero y colaboradores (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41:189-200).

Se pueden utilizar los promotores químicamente regulados para modular la expresión de un gen en una planta a través de la aplicación de un regulador químico exógeno. Dependiendo del objetivo, el promotor puede ser un promotor químicamente inducible, donde la aplicación del químico induce expresión génica, o a un promotor químicamente reprimible, donde la aplicación del químico reprime la expresión génica. Los promotores químicamente inducibles son conocidos en el arte e incluyen, pero no se limitan a, el promotor In2-2 del maíz, que se activa por medio de aseguradores herbicidas de bencenosulfonamida, el promotor GST del maíz, que se activa por medio de compuestos electrofílicos hidrófobos que se utilizan como herbicidas preemergentes, y el promotor PR-1a del tabaco, que se activa por medio del ácido salicílico. Otros promotores químicamente regulados de interés incluyen promotores que responden a esteroides (ver, por ejemplo, al promotor inducible por glucocorticoides en Schena y colaboradores (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10421-10425 y McNellis y colaboradores (1998) Plant J. 14(2):247-257) y promotores inducibles por tetraciclina y promotores reprimibles por tetraciclina (ver, por ejemplo, Gatz y colaboradores (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, y patentes estadounidenses Nos. 5.814.618 y 5.789.156).

Los promotores preferidos de tejido se pueden utilizar para dirigir la expresión mejorada de proteína pesticida dentro de un tejido particular de una planta. Los promotores preferidos de tejido incluyen a aquellos discutidos en Yamamoto y colaboradores (1997) Plant J. 12(2)255-265; Kawamata y colaboradores (1997) Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen y colaboradores (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell y colaboradores (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart y colaboradores (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp y colaboradores (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini y colaboradores (1996) Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto y colaboradores, (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco y colaboradores (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka y colaboradores, (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; y Guevara-Garcia y colaboradores (1993) Plant J. 4(3):495-505. Tales promotores pueden ser modificados, si es necesario, para expresión débil.

Los promotores específicos de hojas son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Yamamoto y colaboradores (1997) Plant J. 12(2):255-265; Kwon y colaboradores (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto y colaboradores (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor y colaboradores (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco y colaboradores (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; y Matsuoka y colaboradores (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590.

Se conocen promotores específicos para la raíz y se pueden seleccionar entre los muchos disponibles en la literatura o aislarlos de nuevo de diferentes especies compatibles. Ver, por ejemplo, Hire y colaboradores (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gen específico para la glutamina sintetasa de la raíz de la soja); Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10):1051-1061 (elemento de control específico para la raíz en el gen GRP 1.8 gene de la judía francesa); Sanger y colaboradores (1990) Plant Mol. Biol. 14(3):433-443 (promotor específico para la raíz del gen de la manopina sintetasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens); y Miao y colaboradores (1991) Plant Cell 3 (1):11-22 (clon con ADNc de tamaño natural que codifica a la glutamina sintetasa citosólica (GS), que se expresa en las raíces y en los nódulos de la raíz de la soja). Ver también Bogusz y colaboradores (1990) Plant Cell 2(7):633-641, donde se describen dos promotores específicos para la raíz aislados de los genes para la hemoglobina de andersonni no leguminosa para fijación de nitrógeno y la Trema tomentosa no leguminosa relacionada no fijadora de nitrógeno. Los promotores de estos genes se enlazaron a un gen reportero de la \beta-glucuronidasa y se introdujeron tanto en la Nicotiana tabacum no leguminosa como en la leguminosa Lotus corniculatus, y en ambos casos se preservó la actividad del promotor específico para la raíz. Leach y Aoyagi (1991) describen sus análisis de los promotores de los genes altamente expresados rolC y rolD que inducen la raíz de Agrobacterium rhizogenes (ver Plant Science (Limerick) 79(1):69-76). Ellos concluyeron que el reforzador y los determinantes de AND preferidos del tejido se disocian en esos promotores. Teeri y colaboradores (1989) utilizaron fusión génica para lacZ para mostrar que el gen de AND-T de Agrobacterium que codifica a la octopina sintasa es especialmente activo en la epidermis de la punta de la raíz y que el gen TR2' es específico para la raíz en la planta intacta y estimulado por medio de lesiones en el tejido de la hoja, una combinación específicamente deseable de características para el uso con un gen insecticida o larvicida (ver EMBO J. 8(2):343-350). El gen TR1', fusionado a nptII (neomicina fosfotransferasa II) mostró características similares. Los promotores adicionales preferidos por la raíz incluyen al promotor génico VfENOD-GRP3 (Kuster y colaboradores (1995) Plant Mol. Biol. 29 (4):759-772); y al promotor rolB (Capana y colaboradores (1994) Plant Mol. Biol. 25(4):681-691. Ver también las patentes estadounidenses Nos. 5.837.876; 5.750.386; 5.633.363; 5.459.252; 5.401.836; 5.110.732; y 5.023.179.

Los promotores "preferidos para semilla" incluyen tanto a los promotores "específicos para semilla" (aquellos promotores activos durante el desarrollo de la semilla tales como los promotores de las proteínas almacenadas en la semilla) así como a los promotores para la "germinación de la semilla" (aquellos promotores activos durante la germinación de la semilla). Ver Thompson y colaboradores (1989) BioEssays 10:108, incorporado aquí por referencia. Tales promotores preferidos para la semilla incluyen, pero no se limitan a, Cim 1 (mensaje inducido por la citoquinina); cZ19B1 (ceína del maíz de 19 kDa); milps (mio-inositol-1-fosfato sintasa); y celA (celulosa sintasa) (ver WO 00/11177, incorporada aquí como referencia). La ceína gama es un promotor preferido específico para endospermas. Glob-1 es un promotor preferido específico para embriones. Para dicotiledóneas, los promotores específicos para semilla incluyen, pero no se limitan a, \beta-faseolina de judía, napina, \beta-conglicinina, lecitina de soja, cruciferina, y similares. Para monocotiledóneas, los promotores específicos para semilla incluyen, pero no se limitan a, ceína de maíz de 15 kDa, ceína de 22 kDa, ceína de 27 kDa, g-ceína, cérea, encogido 1, encogido 2, globulina 1, etc. Ver también WO 00/12733, donde se divulgan los promotores preferidos por la semilla a partir de los genes end1 y end2.

Cuando se desea expresión de bajo nivel, se utilizarán promotores débiles. Generalmente, por "promotor débil" se piensa en un promotor que dirige la expresión de una secuencia de codificación en un nivel bajo. Por nivel bajo se piensa en niveles aproximadamente de 1/1000 de transcritos hasta aproximadamente 1/100.000 de transcritos hasta aproximadamente 1/500.000 de transcritos. Alternativamente, se reconoce que los promotores débiles también incluye promotores que se expresan solamente en unas pocas células y no en otras para dar un nivel de expresión total bajo. Cuando un promotor se expresa en niveles inaceptablemente altos, se pueden suprimir porciones de la secuencia del promotor o modificarla para disminuir los niveles de expresión.

Tales promotores constitutivos débiles incluyen, por ejemplo al promotor central del promotor Rsyn7 (WO 99/
43838 y patente estadounidense No. 6.072.050), al promotor central 35S CaMV, y similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, a las patentes estadounidenses Nos. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; 5.608.142; y 6. 177.611.

Generalmente, el casete de expresión comprenderá un gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores seleccionables se utilizan para la selección de células transformadas o de tejido. Los genes marcadores incluyen genes que codifican resistencia a los antibióticos, tal como aquellos que codifican a la neomicina fosfotransferasa II (NEO) y a la higromicina fosfotransferasa (HPT), así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato de amonio, bromoxinilo, imidazolinonas, y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Ver generalmente, Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506-511; Christopherson y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314-6318; Yao y colaboradores (1992) Cell 71: 63-72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6:2419-2422; Barkley y colaboradores (1980) en The Operon, páginas 177-220; Hu y colaboradores (1987) Cell 48:555-566; Brown y colaboradores (1987) Cell 49:603-612; Figge y colaboradores (1988) Cell 52:713-722; Deuschle y colaboradores (1989) Proc. Natl. Acad Aci. USA 86:5400-5404; Fuerst y colaboradores, (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549-2553; Deuschle y colaboradores (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines y colaboradores (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1917-1921; Labow y colaboradores (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343-3356; Zambretti y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952-3956; Baim y colaboradores (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072-5076; Wyborski y colaboradores (1991) Nucleic Acids Res. 19:4647-4653; Hilleny-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 1.0:143-162; Degenkolb y colaboradores (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt y colaboradores (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen y colaboradores (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551; Oliva y colaboradores (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka y colaboradores (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); Gill y colaboradores (1988) Nature 334:721-724.

La lista anterior de genes marcadores seleccionables no pretende ser limitante. Cualquier gen marcador seleccionable puede ser utilizado en la presente invención.

Los protocolos de transformación así como los protocolos para la introducción de secuencias de nucleótidos dentro de las plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula de planta, esto es, monocotiledóneas o dicotiledóneas, que son blanco de la transformación. Los métodos adecuados para la introducción de secuencias de nucleótidos dentro de las células de una planta y posterior inserción dentro del genoma de la planta incluyen microinyección (Crossway y colaboradores (1986) Biotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs y colaboradores (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (Townsend y colaboradores, patente estadounidense No. 5.563.055; Zhao y colaboradores, patente estadounidense No. 5.981.840), transferencia génica directa (Paszkowski y colaboradores (1984) EMBO J. 3:2717-2722), y aceleración balística de partículas (ver, por ejemplo, Sanford y colaboradores, patente estadounidense No. 4.945.050; Tomes y colaboradores, patente estadounidense No. 5.879.918; Tomes y colaboradores, patente estadounidense No. 5.886.244; Bidney y colaboradores, patente estadounidense No. 5.932.782; Tomes y colaboradores (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Planta Células via Microprojectile Bombardment", en Plant Cell, Tissue, y Organ Culture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Springer-Verlag, Berlín); y McCabe y colaboradores (1988) Biotechnology 6:923-926); y transformación de Lecl (WO 00/28058). Para la transformación de patatas ver Tu y colaboradores (1998) Plant Molecular Biology 37:829-838 y Chong y colaboradores (2000) Transgenic Research 9:71-78. Procedimientos adicionales de transformación se pueden encontrar en Weissinger y colaboradores (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford y colaboradores (1987) Particulate Science y Technology 5:27-37 (cebolla); Christou y colaboradores (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe y colaboradores (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soja); Finer y McMullen (1991) In Vitro Célula Dev. Biol. 27P:175-182 (soja); Singh y colaboradores (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319-324 (soja); Datta y colaboradores (1990) Biotechnology 8:736-740 (rice); Klein y colaboradores (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305-4309 (maíz); Klein y colaboradores (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); Tomes, patente estadounidense No. 5.240.855; Buising y colaboradores, patentes estadounidenses Nos. 5.322.783 y 5.324.646; Tomes y colaboradores (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Planta Células via Microprojectile Bombardment," en Plant Cell, Tissue, y Organ Culture Fundamental Methods, ed. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (maíz); Klein y colaboradores (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm y colaboradores (1990) Biotechnology 8: 833-839 (maíz); Hooykaas-Van Slogteren y colaboradores (1984) Nature (London) 311:763-764; Bowen y colaboradores, patente estadounidense No. 5.736.369 (cereales); Bytebier y colaboradores (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:5345-5349 (Liliaceae); De Wet y colaboradores (1.985) en The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman y colaboradores (Longman, New York), páginas 197-209 (polen); Kaeppler y colaboradores (1990) Plant Cell Reports 9:415-418 y Kaeppler y colaboradores (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por bigote de gato); D'Halluin y colaboradores (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li y colaboradores (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda y colaboradores (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz a través de Agrobacterium tumefaciens).

Las células que han sido transformadas pueden desarrollarse dentro de plantas de acuerdo con formas convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick y colaboradores (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas se pueden desarrollar entonces, y ser polinizadas con la misma cepa transformada o cepas diferentes, y el híbrido resultante tener expresión constitutiva o inducible de la característica fenotípica deseada identificada. Se pueden cultivar dos o más generaciones para asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada se mantenga en forma estable y se herede y luego se cosechan las semillas para asegurar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada.

Las secuencias de nucleótidos de la invención pueden ser proveídas a la planta poniendo en contacto a ésta con un virus o con ácidos nucleicos virales. Generalmente, tales métodos involucran la incorporación de la construcción de nucleótidos de interés con una molécula de ADN o de ARN viral. Se reconoce que las proteínas recombinantes de la invención pueden ser inicialmente sintetizadas as como parte de una poliproteína viral, que después puede ser procesada por medio de proteólisis in vivo o in vitro para producir la proteína pesticida deseada. También se reconoce que tal poliproteína viral, que contiene al menos una porción de la secuencia de aminoácidos de una proteína pesticida de la invención, puede tener la actividad pesticida deseada. Tales poliproteínas virales y las secuencias de nucleótidos que las codifican son abarcadas por la presente invención. Los métodos para proveer plantas con construcciones de nucleótidos y producir las proteínas codificadas en las plantas, que involucran moléculas de ADN o de ARN viral son conocidas en el arte. Ver, Por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367 y 5.316.931.

La invención se relaciona además con material de propagación de plantas de una planta transformada de la invención que incluye, pero no se limita a, semillas, tubérculos, bulbos, hojas, y estacas de raíz y vástagos.

La presente invención puede ser utilizada para la transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero sin limitarse a, monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de plantas de interés incluyen, pero no están limitadas a, maíz (Zea mays), especies crucíferas (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), particularmente aquellas especies crucíferas útiles como fuentes de semillas oleaginosas, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza saliva), centeno (Secate cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum), mijomayor (Panicum miliaceum), panizo (Setaria italica), mijo africano (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuete (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), patata dulce (Ipomoea batalus), mandioca (Manihol esculenta), café (Coffea spp.), coco (Cocos mucifera), piña (Ananas comosus), árboles de cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), banano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), aceituna (Olea europaea), papaya (Carica papaya), marañón (Anacardium occidentale), macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, hortalizas, ornamentales, y coníferas.

Las hortalizas incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), alubias verdes (Phaseolus vulgaris), alubia de lima (Phaseolus limensis), guisante (Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumis tales como pepino (C. sativus), cantalupe (C. cantalupensis), y melón (C. melo). Los ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), claveles (Dianthus caryophyllus), poinsetia (Euphorbia pulcherrima), y crisantemos. Las coníferas que se pueden emplear en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tales como el pino rígido (Pinus taeda), pino tea (Pinus elliotii), pino ponderosa (Pinus ponderosa), pino torcido (Pinis contorta), y pino Monterrey (Pinus radiata); abeto Douglas (Pseudotsuga menziesii); abeto hemlock occidental (Tsuga canadensis); picea Sitka (Picea glauca); madera roja (Sequoia sempervirens); los abetos verdaderos tales como el abeto plateado (Abies amabilis) y abeto del Colorado (Abies balsamea); y cedros tales como el cedro rojo Occidental (Thuja plicata) y el cedro amarillo de Alasca (Chamaecyparis nootkatensis). Preferiblemente, las plantas de la presente invención son las plantas de producción (Por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, crucíferas, soja, algodón, cártamo, cacahuate, sorgo, trigo, mijo, tabaco, etc.), más preferiblemente plantas de maíz y soja, aún más preferiblemente plantas de maíz.

Las plantas de interés particular incluyen plantas de grano que proveen semillas de interés, plantas de semillas oleaginosas, y plantas leguminosas. Las semillas de interés incluyen semillas de grano, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, mijo, etc. Las plantas de semillas oleaginosas incluyen algodón, soja, cártamo, girasol, crucíferas, maíz, alfalfa, palma, coco, lino, ricino, olivo etc. Las plantas leguminosas incluyen alubias y guisantes. Las alubias incluyen guar, semillas de algarroba, alholva, soja, alubias de jardín, fríjol, alubia mung, alubia de lima, alubia fava, lenteja, garbanzo, etc.

Antes de que el material de propagación de la planta (fruta, tubérculo, bulbo, granos, semilla), pero especialmente semilla, se venda como un producto comercial, se trata ordinariamente con un recubrimiento protector que contiene herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas, o mezclas de estas preparaciones, si se desea junto con excipientes, tensoactivos, o adyuvantes que promueven la aplicación ordinariamente empleados en el arte de la formulación para suministrar protección contra el daño causado por plagas bacteriales, de hongos, o de animales. Con el propósito de tratar la semilla, se puede aplicar el recubrimiento protector a las semillas ya sea por medio de la impregnación de los tubérculos o de los granos con una formulación líquida o por medio del recubrimiento de ellos con una formulación combinada húmeda o seca. Además, en casos especiales, son posibles otros métodos de aplicación a las plantas, por ejemplo, tratamiento dirigido a los bulbos o las frutas.

Las semillas de la planta de la invención contienen una molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a una proteína pesticida de la invención puede ser tratada con un recubrimiento protector para la semilla que contiene un compuesto de tratamiento para la semilla, tal como, por ejemplo, captano, carboxina, tiramo, metalaxil, pirimifos-metilo, y otros que son comúnmente utilizados en tratamiento de semillas. En una modalidad dentro del alcance de la invención, un recubrimiento protector para la semilla que contiene una composición pesticida de la invención se usa sola o en combinación con uno de los recubrimientos protectores para la semilla ordinariamente utilizados en el tratamiento de la semilla.

Se reconoce que los genes que codifican a las proteínas pesticidas pueden ser utilizados para transformar a los organismos patógenos de los insectos. Tales organismos incluyen baculovirus, hongos, protozoarios, bacterias, y nemátodos.

Un gen que codifica a una proteína pesticida de la invención puede ser introducido a través de un vector adecuado dentro de un huésped microbiano, y dicho huésped aplicado al medio ambiente, o a plantas o animales. El término "introducido" en el contexto de insertar un ácido nucleico dentro de una célula, significa "transfección" o "transformación" o "transducción" e incluye una referencia a la incorporación de un ácido nucleico dentro de una célula eucariota o procariota donde al ácido nucleico puede ser incorporado dentro del genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástido, o ADN mitocondrial), convertido en un replicón autónomo, o expresado en forma transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado).

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Se pueden seleccionar microorganismos huéspedes que son conocidos por ocupar la "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera, y/o la rizoplana) de uno o más cultivos de interés. Estos microorganismos se seleccionan por ser capaces de competir exitosamente en el ambiente particular con los microorganismos de tipo natural, proveen una protección estable y de expresión del gen que expresa a la proteína pesticida, y en forma deseable, proveen una protección mejorada del pesticida de la degradación ambiental y la inactivación.

Tales microorganismos incluyen bacterias, algas, y hongos. De particular interés son microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, Pseudomonas, Erwinia, Serralia, Klebsiella, Xanthomonas. Streptomyces. Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes, hongos, particularmente levaduras, por ejemplo, Saccharomyces, Cryptococcus. Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, y Aureobasidium. De particular interés son las especies de bacterias de la fitosfera tales como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens. Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli y Azotobacter vinlyir y especies de levadura de la fitósfera tales como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae, y Aureobasidium pollulans. De particular interés son los microorganismos pigmentados.

Existen varias formas de introducir un gen que exprese la proteína pesticida dentro del microorganismo huésped bajo condiciones que permitan una protección estable y de expresión del gen. Por ejemplo, se pueden construir casetes de expresión que incluyan las construcciones de nucleótidos de interés operativamente enlazadas con las señales reguladoras transcripcionales y de traducción para la expresión de las construcciones de nucleótidos, y una secuencia de nucleótidos homóloga con una secuencia en el organismo huésped, por lo cual ocurrirá la integración, y/o un sistema de replicación que es funcional en el huésped, con lo cual ocurrirá la integración o una protección estable.

Las señales reguladoras de la transcripción y de la traducción incluyen, pero no se limitan a, promotores, sitios de partida para la iniciación de la transcripción, operadores, activadores, reforzadores, otros elementos reguladores, sitios de enlazamiento ribosomal, un codón de iniciación, señales de terminación, y similares. Ver, por ejemplo, las patentes estadounidenses Nos. 5.039.523 y 4.853.331; EPO 0480762A2; Sambrook y colaboradores (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ed. Maniatis y colaboradores (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Davis y colaboradores, eds. (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cold Spring Harbor, New York; y las referencias citadas allí.

Las células huésped adecuadas, en donde las células que contienen a la proteína pesticida serán tratadas para prolongar la actividad de las proteínas pesticidas en la célula cuando se aplica la célula tratada al medio ambiente de la(s) plaga(s) objetivo, pueden incluir o bien procariotas o eucariotas, estando normalmente limitado a aquellas células que no producen substancias tóxicas a organismos superiores, tales como mamíferos. Sin embargo, los organismos que producen substancias tóxicas para los organismos superiores podrían utilizarse, cuando la toxina es inestable o el nivel de aplicación es lo suficientemente bajo como para evitar cualquier posibilidad de toxicidad a un huésped mamífero. Como huéspedes, de interés particular estarán los procariotas y los eucariotas inferiores, tal como los hongos. Los procariotas ilustrativos, tanto Gram negativos como Gram positivos, incluyen Enterobacterias, teles como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella, y Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tales como Rhizobium; Spirillaceae, tales como fotobacterias, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tales como Pseudomonas y Acetobacter; Azotobacteraceae y Nitrobacteraceae. Entre los eucariotas se encuentran los hongos, tales como Phycomycetes y Ascomycetes, que incluyen levaduras, tales como Saccharomyces y Schizosaccharomyces; y levaduras Basidiomycetes, tales como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, y similares.

Las características de interés particular en la selección de una célula huésped para propósitos de la producción de proteína pesticida incluyen la introducción fácil del gen de la proteína pesticida dentro del huésped, la disponibilidad de sistemas de expresión, eficiencia de expresión, estabilidad de la proteína en el huésped, y la presencia de capacidades genéticas auxiliares. Las características de interés para uso como una microcápsula pesticida incluyen cualidades protectoras para el pesticida, tales como paredes celulares gruesas, pigmentación, y empaquetamiento intracelular o la formación de cuerpos de inclusión; afinidad de la hoja; carencia de toxicidad para los mamíferos; atractivo a las plagas para ingestión; facilidad para matar y fijación sin daño para la toxina; y similares. Otras consideraciones incluyen facilidad de formulación y de manejo, economía, estabilidad en almacenamiento, y similares.

Los organismos huésped de particular interés incluyen levaduras, tales como Rhodotorula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp., y Sporobolomyces sp., organismos filóplanos tales como Pseudomonas sp., Erwinia Sp., y Flavobacterium sp., y otros organismos tales, que incluyen Pseudomonas aeurginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis, y similares.

Los genes que codifican a las proteínas pesticidas de la invención se pueden introducir dentro de los microorganismos que se multiplican sobre las plantas (epifitas) para suministrar proteínas pesticidas a las plagas potenciales objetivo. Las epifitas, por ejemplo, pueden ser bacterias gram positivas o gram negativas.

Las bacterias que colonizan la raíz, por ejemplo, pueden aislarse a partir de la planta de interés por medio de métodos conocidos en el arte. Específicamente, una cepa Bacillus cereus que coloniza raíces se puede aislar de las raíces de una planta (ver, por ejemplo, Hyelsman y colaboradores (1991) Appl. Environ. Microbiol. 56:713-718). Los genes que codifican a las proteínas pesticidas de la invención pueden ser introducidos en Bacillus cereus que colonizan raíces por medio de métodos estándar conocidos en el arte.

Se pueden introducir genes que codifican proteínas pesticidas, por ejemplo, dentro de los bacilos que colonizan raíces por medio de electrotransformación. Específicamente, los genes que codifican a las proteínas pesticidas se pueden clonar dentro de un vector lanzadera, por ejemplo, pHT3101 (Lerecius y colaboradores (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218. El vector lanzadera pHT3101 que contiene la secuencia de codificación del gen para la proteína pesticida particular puede, por ejemplo, ser transformado dentro del bacilo que coloniza a la raíz por medio de electroporación (Lerecius y colaboradores (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60:211-218).

Los sistemas de expresión se pueden diseñar para que las proteínas pesticidas sean secretadas fuera del citoplasma de las bacterias gram negativas, E. coli, por ejemplo. Las ventajas de tener proteínas pesticidas secretadas son: (1) evitar potenciales efectos citotóxicos de la proteína pesticida expresada, y (2) el mejoramiento en la eficiencia de la purificación de la proteína pesticida, incluyendo, pero no limitándose a, una mayor eficiencia en la recuperación y purificación de la proteína por volumen de caldo celular y disminución del tiempo y/o de los costos de recuperación y purificación por unidad de proteína.

Se puede hacer que las proteínas pesticidas sean secretadas en E. coli, por ejemplo, por medio de fusión de un péptido señal apropiado de E. coli al extremo amino terminal la proteína pesticida. Los péptidos señal reconocidos por E. coli se pueden encontrar en proteínas que se sabe que son secretadas en E. coli, por ejemplo la proteína OmpA (Ghrayeb y colaboradores (1984) EMBO J, 3:2437-2442). OmpA es una proteína principal de la membrana exterior de E. coli, y por lo tanto se piensa que su péptido señal es eficiente en el proceso de transposición. El péptido señal OmpA tampoco necesita ser modificado antes del procesamiento como puede ser el caso para otros péptidos señal, por ejemplo el péptido señal de lipoproteína (Duffaud y colaboradores (1987) Meth. Enzymol. 153:492).

Las proteínas pesticidas de la invención se pueden fermentar en un huésped bacterial y la bacteria resultante ser procesada y utilizada como un rociador microbiano en la misma forma en que las cepas de Bacillus thuringiensis han sido utilizadas como rociadores insecticidas. En el caso de una(s) proteína(s) pesticida(s) que sea(n) secretadas por bacilos, la señal de secreción es removida o mutada utilizando procedimientos conocidos en el arte. Tales mutaciones y/o supresiones evitan la secreción de la(s) proteína(s) pesticida(s) dentro del caldo de cultivo durante el proceso de fermentación. Las proteínas pesticidas se retienen dentro de la célula, y las células son procesadas entonces para producir a las proteínas pesticidas encapsuladas. Se puede utilizar cualquier microorganismo apropiado para este propósito. Las Pseudomonas han sido utilizadas para expresar endotoxinas de Bacillus thuringiensis como proteínas encapsuladas y las células resultantes procesadas y rociadas como insecticida (Gaertner y colaboradores, (1993), en: Advanced Engineered pesticidas, ed. Kim).

Alternativamente, las proteínas pesticidas se producen por medio de la introducción de un gen heterólogo dentro de un huésped celular. La expresión del gen heterólogo resulta, directa o indirectamente, en la producción intracelular y la protección del pesticida. Estas células son tratadas entonces bajo condiciones que prolongan la actividad de la toxina producida en la célula cuando se aplica la célula al medio ambiente de la(s) plaga(s) objetivo. El producto resultante retiene la toxicidad de la toxina. Estas proteínas pesticidas encapsuladas en forma natural pueden ser formuladas entonces de acuerdo con técnicas convencionales para su aplicación al medio ambiente que hospeda a una plaga objetivo, por ejemplo, suelo, agua, y follaje de las plantas. Ver, por ejemplo EPA 0192319, y las referencias citadas allí.

En la presente invención, un microorganismo transformado, que incluye organismos completos, células, espora(s), proteína(s) pesticida(s), componente(s) pesticidas, componente(s) que impactan a la plaga, mutante(s); preferiblemente células vivas o muertas y componentes de la célula, incluyendo mezclas de células vivas y muertas y componentes celulares, y que incluyen células rotas y componentes de la célula, o una proteína pesticida aislada, pueden ser formuladas con un portador aceptable dentro de una composición(es) pesticidas(s) que es, por ejemplo, una suspensión, una solución, una emulsión, un polvo que se espolvorea, un gránulo dispersable, un polvo que puede humedecerse, y un concentrado emulsificable, un aerosol, un gránulo impregnado, un adyuvante, a una pasta que puede esparcirse, y también encapsulaciones en, por ejemplo, substancias poliméricas.

Tales composiciones divulgadas anteriormente se pueden obtener por medio de la adición de un agente activo de superficie, un excipiente inerte, un preservante, un humectante, un estimulante de alimentación, un atrayente, un agente de encapsulado, un aglutinante, un emulsificante, un colorante, un protector UV, un amortiguador, un agente de flujo o fertilizantes, donantes de micronutrientes, u otras preparaciones que influyan sobre el crecimiento de la planta. Uno o más agroquímicos que incluyen, pero no se limitan a, herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas, acaracidas, reguladores del crecimiento de la planta, auxiliares de cosecha, y fertilizantes, se pueden combinar con excipientes, tensoactivos o adyuvantes empleados normalmente en el arte de la formulación u otros componentes para facilitar el manejo del producto y la aplicación para plagas objetivo particulares. Los excipientes y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponder a las substancias ordinariamente empleadas en tecnología de formulación, por ejemplo, substancias minerales naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes de humectación, agentes de pegajosidad, aglutinantes, o fertilizantes. Los ingredientes activos de la presente invención se aplican normalmente en la forma de composiciones y se pueden aplicar al área del cultivo o a la planta que va a ser tratada, simultáneamente o sucesivamente, con otros compuestos. Los métodos de aplicación de un ingrediente activo de la presente invención o de una composición agroquímica de la presente invención que contiene al menos una de las proteínas pesticidas producidas por medio de cepas bacterianas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, aplicación foliar, recubrimiento de la semilla, y aplicación en el suelo. El número de aplicaciones y la velocidad de aplicación dependen de la intensidad de la infestación por la plaga correspondiente.

Los agentes activos de superficie adecuados incluyen, pero no se limitan a, compuestos aniónicos tales como un carboxilato de, por ejemplo, un metal; carboxilato de una cadena larga de ácido graso; un N-acilsarcosinato; mono o diésteres de ácido fosfórico con etoxilatos de alcohol graso o las sales de tales ésteres; sulfatos de alcohol graso tales como dodecil sulfato de sodio, octadecil sulfato de sodio o cetil sulfato de sodio; sulfatos de alcohol graso etoxilado; sulfatos de alquilfenol etoxilado; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; alquil aril sulfonatos tales como alquil-benceno sulfonatos o alquilnaftaleno sulfonatos inferiores, por ejemplo, butil-naftaleno sulfonato; sales de condensados naftaleno-formaldehído sulfonatos; sales de condensados fenolformaldehído sulfonados; sulfonatos más complejos tales como los sulfonatos de amida, por ejemplo, el producto sulfonado de condensación del ácido oleico y N-metil taurina; o los dialquil sulfosuccinatos, por ejemplo, el sulfonato de sodio o el dioctil succinato. Los agentes no iónicos incluyen productos de condensación de ésteres de ácido graso, alcoholes grasos, amidas de ácido graso o fenoles alquenilo sustituidos o con alquilo graso con óxido de etileno, ésteres grasos de éteres de alcohol polihídrico, por ejemplo, éteres de ácido graso de sorbitán, productos de condensación de tales ésteres con óxido de etileno, por ejemplo, ésteres de ácido graso de polioxietilén sorbitán, copolímero bloque de óxido de etileno y óxido de propileno, glicoles acetilénicos tales como el glicol 2,4,7,9-tetraetil-5-decin-4,7-diol, o el glicol acetilénico etoxilado. Ejemplos de un agente activo de superficie catiónico incluyen, por ejemplo, una mono, di o poliamina alifática tal como un acetato, naftenato u oleato; o una amina que contiene oxigeno tal como un óxido de amina de polioxietilén alquilamina; una amina enlazada a amida preparada por medio de la condensación de un ácido carboxílico con una di o poliamina; o una sal cuaternaria de amonio.

Los ejemplos de materiales inertes incluyen, pero no se limitan a, minerales inorgánicos tales como caolín, filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, o materiales botánicos tales como corcho, tusas de maíz en polvo, vainas de cacahuate, vainas de arroz, y cáscaras de nuez.

Las composiciones de la presente invención pueden estar en una forma apropiada para aplicación directa o como un concentrado de una composición primaria que requiere de dilución con una cantidad adecuada de agua o de otro diluyente antes de su aplicación. La concentración del pesticida variará dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, específicamente, ya sea que se trate de un concentrado o que se lo utilice directamente. La composición contiene de 1 a 98% de un excipiente inerte sólido o líquido, y de 0 a 50%, preferiblemente de 0,1 a 50% de un tensoactivo. Estas composiciones se administrarán en la proporción indicada para el producto comercial, preferiblemente aproximadamente 0,01 lb - 5,0 lb por acre cuando está en forma seca y aproximadamente 0.01 pts. - 10 pts. por acre cuando está en forma líquida.

En una modalidad adicional, las composiciones, así como los microorganismos transformados y las proteínas pesticidas de la invención pueden ser tratados antes de la formulación para prolongar la actividad pesticida cuando se aplica al medio ambiente de una plaga objetivo mientras que el pretratamiento no sea perjudicial para la actividad. Tal tratamiento puede ser por medios químicos y/o físicos en tanto que el tratamiento no afecte en forma nociva las propiedades de la(s) composición(es). Los ejemplos de reactivos químicos incluyen, pero no se limitan a, agentes de halogenación; aldehídos tales como formaldehído y glutaraldehído; antiinfecciosos, tales como el cloruro de zefirán; alcoholes, tales como isopropanol y etanol; y fijadores histológicos, tales como el fijador de Bouin y el fijador de Helly (ver, por ejemplo, Humason, (1967) Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman y Co.).

En otras modalidades de la invención, puede ser conveniente tratar a polipéptidos como los de Cry8 con una proteasa, por ejemplo tripsina, para activar a la proteína antes de la aplicación de la composición de la proteína pesticida de la invención al medio ambiente de la plaga objetivo. Los métodos para la activación de la protoxina por medio de una serina proteasas son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Cooksey (1968) Biochem. J. 6:445-454 y Carroll y Ellar (1989) Biochem. J. 261:99-105, cuyas enseñanzas se incorporan aquí por referencia. Por ejemplo, un protocolo adecuado de activación incluye, pero no se limita a, combinar un polipéptido que va a ser activado, por ejemplo un polipéptido 1218-1purificado, y tripsina en una proporción en peso de 1/100 de proteína 1218-1 proteína/tripsina en NaHCO_{3} 20 nM, pH 8 y digestión de la muestra a 36ºC durante 3 horas.

Las composiciones, así como los microorganismos transformados y las proteínas pesticidas de la invención pueden ser aplicados al medio ambiente de una plaga de insectos por medio, por ejemplo, de rocío, atomización, espolvoreo, siembra al voleo, recubrimiento, o vertimiento, introduciéndolos en el suelo, introduciéndolos en el agua de irrigación, por tratamiento de la semilla o por aplicación general o espolvoreo en el momento cuando la plaga ha comenzado a aparecer o antes de la aparición de plagas como medida de protección. Es generalmente importante obtener un buen control of las plagas en las primeras etapas del desarrollo de la planta, ya que este es el momento cuando la planta puede ser más severamente dañada. Las composiciones de la invención pueden contener convenientemente otros insecticidas si se piensa que es necesario. En una modalidad de la invención, se aplica la composición directamente al suelo, al momento de plantar, en la forma granulada de una composición de un excipiente y células muertas de una cepa de Bacillus o de microorganismos transformados de la invención. Otra modalidad es una forma granulada de una composición que contiene un agroquímico tal como, por ejemplo, un herbicida, un insecticida, un fertilizante, un excipiente inerte, y células muertas de una cepa de Bacillus o de microorganismos transformados de la invención.

Las modalidades de la presente invención pueden ser efectivas contra una variedad de plagas. Para los propósitos de la presente invención, las plagas incluyen, pero no se limitan a, insectos, hongos, bacterias, nemátodos, acáridos, patógenos protozoarios, trematodos del hígado que parasitan animales, y similares. Las plagas preferidas son las plagas de insectos, particularmente las plagas de insectos que causan daño significativo, más particularmente las plagas de insecto que causan daño significativo a las plantas agrícolas. Por "plagas de insectos" se entienden insectos y otras plagas similares tales como, por ejemplo, aquellas del orden Acari que incluyen, pero no se limitan a, ácaros y garrapatas. Las plagas de la presente invención incluyen, pero no se limitan a, insectos del orden Lepidóptera, por ejemplo Achoroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella. Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia feneralis, Diaphania hyalinata, Diaphallia nitidalis, Diatraea gryiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Esphestia elutella, Erannis tilaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola. Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis cluysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta. Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantia cunea, Keiferia lycopersicélulaa, Lambdina fiscélulaaria fiscélulaaria, Lambdina fiscélulaaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Myuca quinquemaculata, Myuca sexta, Maruca lestulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplasia includens, sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonta océlulaana, Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa. Tinsola bisselliella, Trichoplusia hi, Udea rubigalis, Xylomyges curiails, y Yponomeuta padella.

También, las modalidades de la presente invención pueden ser efectivas contra plagas de insectos que incluyen insectos seleccionados de los órdenes Díptera, Himenóptera, Lepidóptera, Malófaga, Homóptera, Hemíptera, Ortróptera, Tisanóptera, Dermáptera, Isóptera, Anóplura, Sifonáptera, Tricóptera, etc., particularmente Coleóptera, especialmente Diabroica virgifera y Lepidóptera. Las plagas de insectos de la invención para la mayoría de los cultivos incluyen: Maíz: Ostrinia nubilalis, gusano barrenador europeo del maíz; Agrotis ipsilon, gusano cortador negro; Helicoverpa zea, gusano del elote del maíz; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Diatraea gryiosella, gusano barredor sur occidental del maíz; Elasmopalpus lignosellus, gusano barrenador menor; Diatraea saccharalis, gusano barrenador de la caña de azúcar; Diabrotica virgifera, gusano de la raíz del maíz occidental; Diabrotica longicornis barberi, gusano norteño de la raíz del maíz; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz sureño; Melanotus spp., gusanos de alambre; Cyclocephala borealis, gusano blanco norteño enmascarado (gorgojo blanco); Cyclocephala immaculata, gusano blanco sureño enmascarado (gorgojo blanco); Popillia japonica, escarabajo japonés; Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, gorgojo del grano; Rhopalosiphum maidis, pulgón áfido de la hoja del maíz; Anuraphis maidiradicis, pulgón áfido de la raíz del maíz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Melanoplus femurrubrum, langosta de pata roja; Melanoplus sanguinipes, langosta migratoria; Hylemya platura, mosca de la semilla; Agromyza parvicornis, minador de las hojas de maíz; Anaphothrips obscrurus, trips del pasto; Solenopsis milesta, hormiga ladrona; Tetranychus urticae, ácaro rojo; Sorgo: Chilo partellus, gusano barrenador del sorgo; Spodoplera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano del elote del maíz; Elasmopalpus lignosellus, gusano barrenador menor; Feltia subterranea, gusano trozador; Phyllophaga crinita, gorgojo blanco; Eleodes, Conoderus, y Aeolus spp., gusanos de alambre; Oulema melanopus, escarabajo de la hoja de cereal; Chaetocnema pulicaria, pulguilla del maíz; Sphenophorus maidis, gorgojo el grano; Rhopalosiphum maidis; pulgón áfido de la hoja del maíz; Sipha flava, áfido amarillo de la caña de azúcar; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Contarinia sorghicola, mosquito del sorgo; Tetranychus cinnabarinus, araña roja del clavel; Tetranychus urticae, ácaro rojo; Trigo: Pseudaletia unipunctata, gusano soldado; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Elasmopalpus lignosellus, gusano barrenador menor; Agrotis orthogonia, agrotis occidental; Elasmopalpus lignosellus, gusano barrenador menor; Oulema melanopus, criocero de los cereales; Hypera punctata, fitónomo del trébol; Diabrotica undecimpunctata howardi, gusano de la raíz del maíz sureño; Áfido ruso del trigo; Schizaphis graminum, pulgón del trigo; Macrosiphum avenae, pulgón de la espiga; Melanoplus femurrubrum, langosta de pata roja; Melanoplus differelitialis, langosta; Melanoplus sanguinipes, langosta migratoria; Mayetiola destmetor, mosca de Hesse; Sitodiplosis mosellana, mosquito del trigo; Meromyza americana, gusanillo del raspón de trigo; Hylemya coarctata, mosca del trigo; Frankliniella fusca, piojillo del tabaco; Cephus cinctus, cefo del trigo; Aceria tulipae, ácaro blanco del bulbo; Girasol: Cylindrocupturus adspersus, ceutorrinco del girasol; Smicronyx fulus, gorgojo rojo de la semilla de girasol; Smicronyx sordidus, gorgojo gris de la semilla de girasol; Suleima helianthana, polilla del cogollo de girasol; Homoeosoma electellum, polilla de girasol; Zygograma exclamationis, escarabajo del girasol; Bothyrus gibbosus, escarabajo de la zanahoria; Neolasioptera murtfeldtiana, mosquilla de la semilla de girasol; Algodón: Heliothis virescens, gusano de la yema del tabaco; Helicoverpa zea, gusano bellotero del algodón; Spodoptera exigua, gusano soldado de la remolacha; Pectinophora gossypiella, gusano rosado del algodonero; Anthonomus grandis grandis, picudo del algodonero; Aphis gossypii, áfido del algodón; Pseudatomoscelis seriatus, altica del algodón; Trialeurodes abutilonea, mosca blanca alada bandeada; Lygus lineolaris, chinche; Melanoplus femurrubrum, langosta de pata roja; Melanoplus differentialis, langosta; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Franklinkiella fusca, trips del tabaco; Tetranychus cinnabarinus, araña roja del clavel; Tetranychus urticae, acaro rojo; Arroz: Diatraea saccharalis, gusano minador de la caña de azúcar; Spodoptera frugiperda, gusano cogollero; Helicoverpa zea, gusano del elote del maíz; Colaspis brunnea, colaseis de la uva; Lissorhoptrus oryzophilus, picudo acuático; Sitophilus oryzae, gorgojo del arroz; Nephotettix nigropictus, insecto saltador de la hoja del arroz; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Acrosternum hilare, chinche verde; Soja: Pseudoplusia includens, oruga de la soja; Anticarsia gemmatalis, langosta del maní; Plathypena scabra, gusano verde del trébol; Ostrinia mibilalis, gusano barrenador europeo; Agrotis ipsilon, oruga negra podadora; Spodoptera exigua, gusano soldado cogollero; Heliothis virescens, gusano de la yema del tabaco; Helicoverpa zea, gusano bellotero del algodón; Epilachna varivestis, tortuguilla del fríjol; Myzus persicae, pulgón gris del melocotón; Empoasca fabae, saltamontes de la patata; Acrosternum hilare, chinche hedionda verde; Melanoplus femurrubrum, langosta pata roja; Melanoplus differentialis, langosta; Hylemya platura, mosca de la semilla; Sericothrips variabilis, trips de la soja; Thrips tabaci, trips de la cebolla; Tetranychus turkestani, ácaro de la fresa; Tetranychus urticae, ácaro rojo; Cebada: Ostrinia nubilalis, gusano barrenador europeo; Agrotis ipsilon, oruga podadora negra; Schizaphis graminum, pulgón de las gramíneas; Blissus leucopterus leucopterus, chinche de los cereales; Acrosternum hilare, chinche hedionda verde; Euschistus servus, chinche marrón; Jylemya platura, mosca de la semilla; Mayetiola destructor, mosca de Hesse; Petrobia latens, ácaro pardo del trigo; Planta de colza: Vrevicoryne brassicae, pulgón de la col; Phyllotreta cruciferae, escarabajo pulgón; Patata: Leptinolarsa decemlineata, escarabajo de
la patata.

Además, las modalidades de la presente invención pueden ser efectivas contra Hemíptera tales como Lygus hesperus, Lygus lineolaris, Lygus pratensis, Lygus rugulipennis Popp, Lygus pabulinus, Calocoris norvegicus, Orthops compestris. Plesiocoris rugicollis. Cyrtopeltis modestus, Cyrtopeltis notatus, Spanagonicus albofasciatus, Diaphnocoris chlorinonis, Labopidicola allii, Pseudatomoscelis seriatus, Adelphocoris rapidus, Poecilocapsus lineatus, Blissus leucopterus, Nysius ericae, Nysiusraphanus, Euschistus servus, Nezara viridula, Eurygaster, Coreidae, Pyrrhocoridae, Tinidae, Blostomatidae, Reduviidae, y Cimicidae.

Los nemátodos incluyen a nemátodos que parasitan a la planta tales como nematodo de la raíz, quistes, y nematodo de los prados, incluidos Heterodera y Globodera spp; particularmente Globodera rostochiensis y Globodera pailida (nemátodos de quiste de la patata); Helerodera glycines (nemátodos de quiste de soja); Heterodera schachtii (nematodo de quiste de remolacha); y Heterodera avenae (nematodo de quiste de cereal).

La etapa preferida de desarrollo para analizar la actividad pesticida es la de larvas o las formas inmaduras de estas plagas de insectos anteriormente mencionadas. Los insectos pueden ser criados en total oscuridad aproximadamente desde 20ºC hasta aproximadamente 30ºC y aproximadamente desde 30% hasta aproximadamente 70% de humedad relativa. Los bioensayos se pueden llevar a cabo como se describe en Czapla y Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83(6): 2480-2485. Los métodos para criar larvas de insectos y llevar a cabo bioensayos son conocidos por aquellos ordinariamente entrenados en el arte.

Las personas capacitadas en el arte conocen una amplia variedad de técnicas de bioensayo. Los procedimientos generales incluyen la adición del compuesto experimental u organismo a la fuente de dieta en un contenedor cerrado. La actividad pesticida puede medirse por medio de, pero sin limitarse a, mortalidad, pérdida de peso, atracción, repelencia y otros cambios físicos y de comportamiento después del suministro de alimento y la exposición durante un período de tiempo apropiado. Los bioensayos descritos aquí se pueden utilizar con cualquier plaga de insectos en alimentación en la etapa de larva o adulta.

Los siguientes ejemplos se presentan a manera de ilustración, no como una limitante.

Parte experimental Ejemplo 1 Bioensayo para Analizar la Actividad Pesticida de las cepas B. thuringiensis contra el Gusano de la raíz del maíz occidental y Gusano de la raíz del maíz sureño

Las dietas para las larvas de los insectos escarabajo de la patata (CPB), gusano de la raíz del maíz sureño (SCRW), y gusano de la raíz del maíz occidental (WCRW) son conocidas en el estado del arte. Ver, por ejemplo, Rose y McCabe (1973) J. Econ. Entomology 66:393, incorporado aquí por referencia. La dieta de los insectos se prepara y se vierte sobre una bandeja de Pittman. Generalmente se dispensan 1,5 mL de la dieta dentro de cada célula con 150 \muL adicionales de preparación de muestra aplicada a la superficie de la dieta.

Las colonias de bacterias de una placa original de transformantes que expresan a las proteínas pesticidas de interés se marcan sobre las placas de las réplicas y se las inocula en 5 mL 2x de caldo YT con 500 \muL/1000 mL del antibiótico kanamicina. Los tubos se desarrollan durante la noche. Si no está presente ningún crecimiento, se incuban los tubos durante 24 horas adicionales. Después de la incubación, se centrifugan los tubos a 3500 rpm durante 5-8 minutos. Se descarta el sobrenadante y se resuspende el precipitado en 1000 \muL de PBS. Se transfiere entonces la mezcla a tubos eppendorf de 1,5 mL y se incuban sobre hielo hasta que la temperatura es de 3 a 4ºC, seguido por sonicación durante 12-15 segundos.

Los caldos de cultivo microbiano (150 \muL) o de otras muestras (150 \muL) se superponen sobre dietas artificiales de 1,5 mL con un área superficial de 2,54 cm^{2}. Para la evaluación selectiva de la actividad pesticida contra los gusanos de la raíz, se aplican 25 \muL de una solución de agar de huevo al 0,8% a las tapas de las bandejas. A las bandejas y a las tapas se les permite secarse bajo una campana. Después del secado, se colocan las tapas en las bandejas y se incuban durante 4-7 días a una temperatura de 26ºC. El resultado de los bioensayos se lleva a cabo por medio del recuento de las larvas "vivas" versus las larvas "muertas". La mortalidad se calcula como un porcentaje de las larvas muertas entre el total de las larvas analizadas.

Ejemplo 2 Actividad Pesticida de los Lisados de la Cepa 1218 de B. thuringiensis

Las muestras preparadas a partir de los cultivos de las cepas 1218 de B. thuringiensis fueron analizadas por la presencia de actividad pesticida contra CPB, WCRW, y SCRW como se describe en el Ejemplo 1. Como control, la dieta fue tratada con suero fisiológico amortiguado con fosfato (PBS).

Para preparar cada muestra, se selecciona una colonia individual de una cepa que se desarrolla sobre una placa LB y se la usa para inocular un tubo que contiene 50 mL de medio TB. Se incubó el tubo durante la noche a 28ºC y 250 rpm. Después de la incubación, se centrifugó el tubo a 4300 x g durante 15 minutos. Se descartó el sobrenadante y se resuspendió el precipitado en 50 mL de medio de esporulación. Se centrifugó el tubo nuevamente a 4300 x g durante 15 minutos. Se descartó el segundo sobrenadante, y se resuspendió el segundo precipitado en 50 mL de medio de esporulación. Se incubó entonces el tubo durante 48 horas a 28ºC y 250 rpm. Después de esta incubación, se centrifugó el tubo a 4300 x g durante 15 minutos. Se descartó el sobrenadante, y se resuspendió el precipitado en 10 mL de medio 1X M9. Se transfirió entonces la muestra a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, se la incubó sobre hielo hasta que la temperatura era aproximadamente de 3 a 4ºC, y luego se la sonicó durante 12-15 segundos. Para los bioensayos, se utilizaron 150 \muL de una muestra sonicada.

El medio de esporulación contiene 200 mL de una solución de sales 5X M9, 5 mL de solución de sales, 5 mL de solución de CaCl_{2}, y dH_{2}O hasta un volumen final de 1 L. La solución de sales 5X M9 contiene: 64 g, Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O; 15 g, KH_{2}PO_{4}; 2.5 g, NaCl; 5 g, NH_{4}Cl; y dH_{2}O hasta un volumen final de 1,0 L. La solución de sales contiene: 2.46 g, MgSO_{4}\cdot7H_{2}O; 0,04 g, MnSO_{4}\cdotH_{2}O; 0,28 g, ZnSO_{4}\cdot7H_{2}O; 0,40 g, FeSO_{4}\cdot7H_{2}O; y dH_{2}O hasta un volumen final de 1,0 L. La solución de CaCl_{2} contiene 3,66 g CaCl_{2}\cdot2H_{2}O y dH_{2}O hasta un volumen final de 100 ml.

Las muestras fueron analizadas con y sin calentamiento para determinar si el(los) componente(s) responsable(s) por la actividad pesticida es (son) estable(s) con calor. Para el tratamiento con calor, las muestras se sometieron a ebullición durante 15 minutos antes de su uso en el bioensayo. Las muestras no calentadas preparadas a partir de la cepa 1218 exhibieron actividad pesticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental, con una actividad pesticida menor contra el gusano de la raíz del maíz sureño. Las muestras preparadas a partir de lisados de la cepa 1218 causaron un moderado impedimento en el crecimiento de las larvas del gusano de la raíz del maíz sureño. Después del calentamiento, las muestras habían reducido grandemente la actividad pesticida contra ambas especies del gusano de la raíz.

La reducción en la actividad pesticida después del calentamiento indica que uno o más de los componentes de la muestra a partir de la cepa 1218 que es responsable por la actividad pesticida es lábil al calor. Tal reducción es consistente con uno o más de los componentes que son una proteína.

Ejemplo 3 Actividad Pesticida de Proteínas Cristal Aisladas a partir de la Cepa 1218 de B. thuringiensis

Utilizando muestras de cultivos esporulados de la cepa 1218 de B. thuningiensis preparadas como se describe en el Ejemplo 2, se aislaron proteínas cristal y luego tratadas con tripsina utilizando métodos conocidos en el arte. En resumen, después de la purificación (centrifugación en gradiente zonal, Renografin-76), los cristales purificados se disolvieron en amortiguador alcalino (Na_{2}CO_{3} 50 mM, ditiotreitol 10 mM, pH 10). Antes de usarlas en los ensayos, se concentraron las proteínas cristal disueltas por medio de filtración con unidades de filtros para centrifugación Centriprep® (Millipore Corp.) con un corte de PM de 10.000.

Se reconoce que bajo algunas condiciones experimentales, puede ser conveniente tratar a péptidos como los de Cry8 con una proteasa, por ejemplo tripsina, para activar a la proteína antes de determinar la actividad pesticida de una muestra particular. Los métodos para la activación de protoxina por medio de una serina proteasa son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, Cooksey (1968) Biochem J. 6:445-454 y Carroll y Ellar (1989) Biochem J. 261:99-105, incorporados aquí por referencia. Las proteínas cristal aisladas fueron seleccionadas por la actividad pesticida contra las larvas del gusano de la raíz del maíz occidental como se describe en el Ejemplo 1. Tanto la nueva preparación de la proteína cristal como la preparación elaborada previamente ("preparación antigua") de la cepa 1218 poseían actividad pesticida sustancial contra el gusano de la raíz del maíz occidental. Las proteínas cristal disueltas fueron almacenadas a -80ºC durante 20 días antes de usarlas en los ensayos.

Una persona calificada reconocerá que existen numerosos indicadores de actividad pesticida y que variables tales como el número de insectos muertos, o el peso promedio de los insectos tratados pueden ser monitoreados. Por ejemplo, la actividad pesticida puede ser convenientemente expresada como % de mortalidad, que es el porcentaje de larvas de gusano de la raíz muertas sobre el número total de larvas.

Ejemplo 4 Secuencias de Nucleótidos Aisladas a partir de la Cepa 1218 de B. thuringiensis

Se ha emprendido un esfuerzo para aislar las secuencias de nucleótidos que codifican a las proteínas cristal de la cepa 1218 de B. thuringiensis. Se aislaron dos secuencias de nucleótidos a partir de 1218 que tiene homología de secuencia de nucleótidos y de secuencia de aminoácidos con Cry8Bal (Acceso al GenBank No. U04365). Las dos secuencias que codifican como Cry8 aisladas a partir de la cepa 1218 han sido designadas como Cry1218-1 (SEQ ID NO: 1) y Cry1218-2 (SEQ ID NO: 3). Las SEQ ID NO: 27 y SEQ ID NO: 28 proveen las secuencias de ácido nucleico de los clones genómicos nativos de Cry1218-1 y de Cry1218-2, respectivamente.

Para determinar si las proteínas codificadas por polinucleótidos variantes o mutantes de la invención codifican proteínas con actividad pesticida, cada una de las secuencia de ácido nucleico se expresó en Escherichia coli. Por ejemplo, para determinar si las secuencias de polinucleótidos 1218-1 ó 1218-2 proveídas aquí codifican polipéptidos con actividad pesticida, se prepararon secuencias truncadas de nucleótidos. La SEQ ID NO: 15 corresponde a los nucleótidos 1 hasta 2007 de la secuencia de nucleótidos de Cry1218-1 (SEQ ID NO: 1). La SEQ ID NO: 17 corresponde a los nucleótidos 1 hasta 2019 de la secuencia de nucleótidos de Cry1218-2 (SEQ ID NO: 3).

Las SEQ ID NOS: 15 y 17 que codifican a polipéptidos truncados como los de Cry8 tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NO: 16 y 18, respectivamente. Cada una de las secuencias truncadas de nucleótidos (las SEQ ID NOs: 15 y 17) fue clonada en forma separada dentro de un vector de expresión pET28a y luego utilizada para transformar a E. coli. Se seleccionaron las colonias transformadas y se las cultivo en medio de cultivo líquido como se describe en el Ejemplo 1. Se aislaron proteínas truncadas expresadas como las de Cry8 marcadas con His N-terminal a partir de lisados de E. coli por medio de cromatografía de afinidad utilizando una columna de afinidad de Níquel. Se dializaron extensivamente las fracciones de la columna con la proteína de interés contra Tris-HCl 10 mM (pH 8.5) y luego se las concentró utilizando unidades de filtración para centrifugación Centriprep® (Millipore Corp.) con un corte de PM de 10.000 de acuerdo con las instrucciones el fabricante. Las muestras concentradas de proteína como las de Cry8 fueron analizadas por la presencia de actividad pesticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental como se describe en el Ejemplo 1.

Los bioensayos que evalúan la actividad pesticida de proteínas recombinantes como las de Cry8 purificadas a partir de preparaciones expresadas por E. coli fueron realizados como se describe en el Ejemplo 1 con las muestras acuosas de proteína que se extienden sobre la superficie de la dieta del gusano de la raíz. La actividad pesticida de la endotoxina de tipo natural (por ejemplo, nativa) y la mutante fueron evaluadas contra el gusano de la raíz del maíz sureño. Como se esperaba, se observó que la actividad pesticida disminuyó al mismo tiempo que disminuyó en la dieta la concentración aplicada de proteínas truncadas como las de Cry8.

La actividad pesticida fue evaluada también por medio de la incorporación de las proteínas pesticidas dentro de la dieta del gusano de la raíz, en forma opuesta al método descrito anteriormente, que involucró la incorporación de una solución que contiene proteína dentro de la mezcla de la dieta. Por ejemplo, se evaluaron las dietas con la muestra que contienen 1000, 500, 400, 300, 200, ó 100 ppm de un polipéptido pesticida incorporado dentro de la dieta.

Ejemplo 5 Preparación de una Secuencia de Nucleótidos Preferida para la Planta que Codifica una Proteína Pesticida

Debido a que la utilización del codón es diferente entre plantas y bacterias, la expresión en una planta de una proteína codificada por una secuencia de nucleótidos de origen bacterial puede ser limitada debido a ineficiencia de traducción en la planta. Se conoce en el arte que la expresión puede ser incrementada en una planta por medio de la alteración de la secuencia de codificación de la proteína para contener codones preferidos por la planta. Para la expresión óptima de una proteína en una planta, se puede preparar una secuencia sintética de nucleótidos utilizando la secuencia de aminoácidos de la proteína y traducción inversa de la secuencia utilizando codones preferidos para la planta.

Utilizando una aproximación así, se tradujo en forma inversa una porción de la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por Cry1218-1 (SEQ ID NO: 2) usando codones preferidos para el maíz. La secuencia de nucleótidos preferida para la planta está expuesta en la SEQ 1D NO: 9. La secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 9 codifica a un polipéptido (SEQ ID NO: 10) que contiene los primeros 669 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 2. Por lo tanto, las SEQ ID NOS: 10 y 16 codifican polipéptidos que contienen la misma secuencia de aminoácidos, y la SEQ ID NO: 15 provee un segundo polinucleótido que codifica las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 10.

Ejemplo 6 Bioensayo para Analizar la Actividad Pesticida de Polipéptidos Mutantes como los de Cry8 Contra el Escarabajo de la Patata (Leptinotarsa decemlineata) Protocolo

En resumen, los parámetros del bioensayo fueron los siguientes: la dieta Bio-Serv (catálogo número F9800B, de: BIOSERV, Entomology Division, One 8th Street, Suite 1, Frenchtown, New Jersey 08825) fue dispensada en bandejas Pitman de 128 pozos (catálogo número BIO-BA-128 de CD International, Pitman, New Jersey 08071) que tienen un área superficial de 2,4 cm^{2}. Se aplicaron muestras como las de Cry 8 (1218-1A, 49PVD, y NGSR1218-1) en forma tópica a la superficie de la dieta en una proporción de 50 \mul/pozo. Se suministró suficiente material de muestra para contar con 4 observaciones/muestra. Después de secar la muestra, se añadieron 2 neonatos del escarabajo de la patata en cada pozo. Por lo tanto, había un total de 8 larvas/muestra. Se colocó una tapa sobre cada bandeja (catálogo número BIO-CV-16, CD International, Pitman, New Jersey, 08071) y se colocaron las bandejas en una incubadora a 25ºC.

Las bandejas del ensayo no mostraron contaminación presente en la superficie en los controles con amortiguador o en los pozos que contenían muestras como las de Cry8. Se hizo un recuento de mortalidad en la prueba al cuarto día después de la infestación de vida.

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TABLA 1 Actividad Pesticida de Polipéptidos Truncados 1218-1 y de un Mutante por la Adición de Tripsina contra el Escarabajo de la Patata

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Resultados

La muestra marcada como "A" en la Tabla 1 es una muestra de control que consiste de amortiguador de carbonato 10 mM a un pH 10. Todas las muestras de proteína truncada y mutante 1218-1A (b-d), 49PVD (f-h), y NGSR1218-1 (1-n) fueron solubilizadas en amortiguador de carbonato 10 mM a un pH 10.

Las muestras 1218-1A, b-d, contienen una secuencia de polipéptido truncado que contiene la secuencia de aminoácido expuesta en la SEQ ID NO: 16. Más específicamente, las muestras 1.218-1A contienen al dominio truncado de la toxina representado por medio del residuo aminoácido (aa) 1 hasta el aa 669 (desde M hasta E) de las secuencias de aminoácidos expuestas en la SEQ ID NO: 2.

Las muestras 49PVD, f-h, contienen a la secuencia mutante del polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que está expuesta en la SEQ ID NO: 20. La 49PVD se generó por medio de la secuencia de ajuste tanto del N-terminal como del C-terminal de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 16. Más específicamente, el N-terminal del mutante 49PVD fue ajustado por medio de 47 residuos; por lo tanto, el polipéptido arranca en el residuo aa 48(M) y el C-terminal se ajustó por medio de los 6 residuos hasta el aa 663 (D). Por lo tanto el mutante de 49PVD es 1218-1A (SEQ ID NO: 16) desde el residuo aa 48 hasta el aa 663.

Las muestras NGSR, 1-m, contienen una secuencia del polipéptido mutante 1218-1 que está expuesta en la SEQ ID NO: 12. NGSR1218-1 se generó por medio de la adición de un motivo NGSR para la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 16 después del aa 164. Más específicamente, el mutante NGSR provee un mutante 1218-1ª que incluye la secuencia de aminoácidos de NGSR entre el aa 164 y el aa 165 de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 16. La adición de 4 residuos de 1218-1A generó una proteína con 673 aa. Los bioensayos de 1218-1 A, 49PVD, y NGSR1218-1 indicaron que las tres muestras de proteína son eficaces contra el escarabajo de la patata (CPB). Se encontró que el mutante NGSR1218-1 es más potente que el mutante original 1218-1A y 49PVD. Los polipéptidos modificados (por ejemplo, el truncado o el mutante) 1218-1 (49PVD, NGSR1218-1) fueron al menos tan activos como la muestra relevante de control 1218-1 o la 1218-1A.

Ejemplo 7 Bioensayo para Probar la Actividad Pesticida de Polipéptidos Mutantes como los de Cry8 Contra el Gusano de la raíz del maíz sureño y el Gusano de la raíz del maíz occidental Protocolo

En resumen, los parámetros del ensayo descritos anteriormente en el Ejemplo 6 fueron modificados para permitir la evaluación de la actividad pesticida de los mutantes adicionales 1218-1,1218-1A ó 49PVD contra gusano de la raíz del maíz occidental (WCRW) y el gusano de la raíz del maíz sureño (SCRW). En resumen, la dieta Bio-Serv (catálogo número F9800B, de: BIOSERV, Entomology Division, One 8^{th} Street, Suite 1, Frenchtown, New Jersey 08825) se dispensó en bandejas Pitman de 128 pozos (catálogo número BIO-BA-128 de CD International, Pitman, New Jersey 08071) que tienen un área superficial de 2,4 cm^{2}.

Se aplicaron en forma tópica muestras como las de Cry 8 a la superficie de la dieta en un volumen de 50 \mul/pozo. Se suministró suficiente material de la muestra para proveer duplicados de las observaciones/muestra. Para la evaluación selectiva de la actividad pesticida contra el gusano de la raíz, se aplicaron 25 \muL de una solución de agar huevo al 0,8% a las tapas de las bandejas. A las bandejas y a las tapas se les permite secarse bajo un extractor. Después del secado, se colocaron las tapas sobre las bandejas y se incubó durante 4-7 días a temperatura de 26ºC. Se colocó una tapa sobre cada bandeja (catálogo número BIO-CV-16, CD International, Pitman, New Jersey, 08071), y se colocaron las bandejas en una incubadora a 25ºC.

Para la evaluación de la actividad pesticida contra SCRW, los insectos fueron expuestos a una solución que contiene o bien amortiguador (amortiguador de carbonato 50 mM (pH 10) o un polipéptido mutante 1218-1 ó 1218-1A (por ejemplo, 1218-1 A), LKMS.N1218-1, LKMS.R1218-1, NGSR.N1218-1, LKMS.N49PVD, LKMS.R49PVD, o NGSR.N49PVD) en dosis o bien de 36 o de 3,6 \mug/cm^{2}.

Los insectos fueron expuestos a una solución que contiene o bien amortiguador (amortiguador de carbonato 50 mM (pH 10) o un número limitado de los polipéptidos del mutante 1218-1 (LKMS.R1218-1, NGSR.N1218-1, LKMS.N49PVD, LKMS.R49PVD, o NGSR.N49PVD) en dosis de 88 \mug/cm^{2}. El resultado de los bioensayos se lleva a cabo por medio del recuento de las larvas "vivas" versus las larvas "muertas". La mortalidad se calcula como un porcentaje de las larvas muertas entre el total de las larvas analizadas.

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TABLA 2 Actividad Pesticida de los Polipéptidos del Mutante Cry1218-1 Contra el Gusano de la raíz del maíz sureño-Duplicado 1

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TABLA 2 (continuación)

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TABLA 3 Actividad Pesticida de los Polipéptidos del Mutante Cry1218-1 Contra el Gusano de la raíz del maíz sureño-Duplicado 2

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TABLA 4 Actividad Pesticida de los Polipéptidos del Mutante Cry1218-1 Contra el Gusano de la raíz del maíz sureño-Duplicado 2

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TABLA 5 Actividad Pesticida de los Polipéptidos del Mutante Cry1218-1 Contra el Gusano de la raíz del maíz occidental

8

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Ejemplo 8 Transformación del Maíz por medio Bombardeo de Partículas y Regeneración de Plantas Transgénicas

Los embriones inmaduros de maíz de plantas donantes de invernadero se bombardean con un plásmido que contiene la secuencia optimizada de nucleótidos de Cry1218-1 de la planta (SEQ ID NO: 9) operativamente enlazada a un promotor de ubiquitina y el gen marcador seleccionable PAT (Wohlleben y colaboradores (1988) Gene 70: 25-37), que confiere resistencia al Bialaphos herbicida. Alternativamente, se provee el gen marcador seleccionable sobre un plásmido separado. La transformación se realiza como sigue. A continuación se presentan las recetas para la preparación de los medios.

Preparación del Tejido Objetivo

Se desgranan las mazorcas y se esteriliza la superficie en 30% de blanqueador Clorox más Micro detergente al 0,5% durante 20 minutos, y se enjuaga dos veces con agua estéril. Se cortan los embriones inmaduros y se coloca el eje del embrión hacia abajo (escutelo hacia arriba), 25 embriones por placa, sobre medio 560Y durante 4 horas y luego se alinea dentro de la zona objetivo de 2,5 cm en preparación para el bombardeo.

Preparación del ADN

Se elabora un vector plásmido que contiene la secuencia optimizada de nucleótidos de Cry 1218-1 (SEQ ID NO: 9) operativamente enlazado a un promotor de ubiquitina. Por ejemplo, un vector adecuado para transformación contiene a un promotor UBI1 de Zea mays, un UTR 5' de UBT1 y un intrón UBI1, en combinación con un terminador PinII. Se precipita un AND de plásmido que contiene a la secuencia de nucleótidos optimizada de la planta y un segundo ADN de plásmido que contiene un marcador seleccionable PAT (por ejemplo, al promotor CAMV35S (ACK) que dirige a PAT con un terminador CAMV35S) sobre aglomerados de tungsteno de 1,1 \mum (diámetro promedio) utilizando un procedimiento de precipitación en CaCl_{2} como sigue:

: 100 \mul de partículas de tungsteno preparadas en agua

: 10 \mul (1 \mug) de ADN en amortiguador Tris EDTA (1 \mug de ADN total)

: 100 \mul de CaCl_{2} 2,5 M

: 10 \mul de espermidina 0,1 M

Cada reactivo es añadido en forma secuencial a una suspensión de partículas de tungsteno, mientras se la mantiene sobre un agitador de vórtice para múltiples tubos. La mezcla final se sonica brevemente y se le permite incubarse bajo agitación constante en vórtice durante 10 minutos. Después del período de precipitación, se centrifugan los tubos brevemente, se remueve el líquido, se lava con 500 ml de etanol al 100%, y se centrifuga durante 30 segundos. Se remueve nuevamente el líquido, y se añaden 105 \mul de etanol al 100% al precipitado final de partículas de tungsteno. Para el bombardeo con pistola de partículas, se sonican brevemente las partículas de tungsteno/ADN y se marcan 10 \mul sobre el centro de cada macroportador y se les permite secarse aproximadamente por 2 minutos antes del bombardeo.

Tratamiento con la Pistola de Partículas

Las placas con la muestra se bombardean con el nivel #4 en la pistola de partículas #HE34-1 o #HE34-2. Todas las muestras reciben un solo disparo a 650 PSI, tomando un total de diez alícuotas de cada tubo de partículas preparadas/DNA.

Tratamiento Posterior

Después del bombardeo, se mantienen los embriones en medio 560Y durante 2 días, luego se los transfiere a un medio de selección 560R que contiene 3 mg/litro de Bialaphos, y se cultiva en nuevo medio cada 2 semanas. Aproximadamente después de 10 semanas de selección, se transfieren los clones de callos resistentes a la selección a medio 288J para la regeneración de la planta. Después de la maduración somática del embrión (2-4 semanas), se transfieren los embriones somáticos bien desarrollados a un medio para germinación y se los lleva hasta una habitación iluminada para el cultivo. Aproximadamente 7-10 días después, se transfieren las plántulas en desarrollo a un medio libre de hormonas 272V en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas están bien establecidas. Las plantas se transfieren entonces para insertarlas en semilleros de cajón (equivalentes a una maceta de 2,5') que contienen tierra para maceta y se desarrollan durante 1 semana en una cámara de crecimiento, para desarrollarse posteriormente durante 1-2 semanas adicionales en el invernadero, para luego transferirlas a 600 macetas clásicas (1,6 galones) y desarrollarse hasta la madurez. Las plantas se monitorean y se evalúa la expresión de la proteína Cry1218-1 por medio de ensayos conocidos en el arte, tales como, por ejemplo, inmunoensayo y técnica de Western Blot con un anticuerpo que se enlaza a la proteína Cry1218-1.

Bombardeo y Medio de Cultivo

El medio para el bombardeo (560Y) contiene 4,0 g/l de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de la Mezcla de Vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l de clorhidrato de tiamina, 120,0 g/l de sacarosa, 1,0 mg/l de 2,4-D, y 2,88 g/l de L-prolina (llevado a volumen con H_{2}O D-I seguido por el ajuste a pH 5,8 con KOH); 2.0 g/l de Gelrita (añadida después de llevar a volumen con H_{2}O D-1); y 8,5 mg/l de nitrato de plata (añadidos después de la esterilización del medio y enfriamiento hasta temperatura ambiente). El medio de selección (560R) contiene 4,0 g/l de sales basales N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l de Mezcla de Vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l de clorhidrato de tiamina, 30,0 g/l de sacarosa, y 2,0 mg/l de 2,4-D (llevado a volumen con H_{2}O D-I seguido por el ajuste a pH 5,8 con KOH); 3,0 g/l de Gelrita (añadidos después de llevar a volumen con H_{2}O D-1); y 0,85 mg/l de nitrato de plata y 3,0 mg/l de Bialaphos (ambos añadidos después de esterilizar el medio y enfriar hasta temperatura ambiente).

El medio para la regeneración de la planta (288J) contiene 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de solución patrón de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/l de clorhidrato de tiamina, 0,10 g/l de clorhidrato de piridoxina, y 0,40 g/l de Glicina llevado a volumen con H_{2}O D-I refinada) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/l de mio-inositol, 0,5 mg/l de zeatina, 60 g/l de sacarosa, y 1,0 ml/l de ácido absícico 0,1 mM (llevado a volumen con H_{2}O D-I refinada después de ajustar hasta pH 5,6); 3,0 g/l de Gelrita (añadida después de llevar a volumen con H_{2}O D-I); y 1,0 mg/l de ácido indolacético y 3,0 mg/l de Bialaphos (añadido después de esterilizar el medio y enfriar hasta 60ºC). El medio libre de hormonas (272V) contiene 4,3 g/l de sales MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l de solución patrón de vitaminas MS (0,100 g/l de ácido nicotínico, 0,02 g/l de clorhidrato de tiamina, 0,10 g/l de clorhidrato de piridoxina, y 0,40 g/l de Glicina llevada a volumen con H_{2}O D-I refinada), 0,1 g/l de mio-inositol, y 40,0 g/l de sacarosa (llevado a volumen con H_{2}O D-I refinada después de ajustar hasta pH 5,6); y 6 g/l de agar bacto (añadido después de llevar a volumen con H_{2}O D-I refinada), esterilizado y enfriado hasta 60ºC.

Ejemplo 9 Transformación del Maíz Mediada por Agrobacterium y Regeneración de Plantas Transgénicas

Para la transformación del maíz mediada por Agrobacterium con una secuencia optimizada de nucleótidos Cry1218-1 optimizada para la planta (SEQ ID NO: 9), se emplea preferiblemente el método de Zhao (patentes estadounidense No. 5.981.840, y la publicación de la patente PCT WO98/32326, los contenidos de las cuales se incorporan aquí como referencia). En resumen, los embriones inmaduros se aíslan del maíz y los embriones en contacto con una suspensión de Agrobacterium, bajo condiciones por medio de la cuales las bacterias son capaces de transferir la secuencia de nucleótidos Cry1218-1 optimizada para la planta (SEQ ID NO: 9) a al menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1: la etapa de infección). En esta etapa los embriones inmaduros están sumergidos preferiblemente en una suspensión de Agrobacterium para la iniciación de la incubación. Los embriones se cultivan en conjunto durante un tiempo con el Agrobacterium (etapa 2: la etapa de cultivo conjunto). Preferiblemente, los embriones inmaduros se cultivan sobre medio sólido después de la etapa de infección. Después de este período de cultivo conjunto, se contempla una etapa opcional de "reposo". En esta etapa de reposo, se incuban los embriones en presencia de al menos un antibiótico que se sabe que inhibe el crecimiento del Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para los transformantes de la planta (etapa 3: etapa de reposo). Preferiblemente, los embriones inmaduros se cultivan sobre medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección, para la eliminación del Agrobacterium y para una fase de reposo para las células infectadas. A continuación, se cultivan los embriones inoculados sobre medio que contiene un agente selectivo y se recupera el callo transformado de crecimiento (etapa 4: la etapa de selección). Preferiblemente, se cultivan los embriones inmaduros sobre medio sólido con un agente selectivo resultando en el crecimiento selectivo de las células transformadas. Se regenera luego el callo dentro de las plantas (etapa 5: la etapa de regeneración), y preferiblemente, los callos que se desarrollan sobre medio selectivo se cultivan sobre medio sólido para regenerar a las plantas.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la descripción son indicativas del nivel de aquellos capacitados en la técnica a quienes les incumbe esta invención.

Aunque la anterior invención ha sido descrita con algún detalle como medio de ilustración y ejemplo para los propósitos de claridad en la comprensión, será obvio que pueden practicarse ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las modalidades anexas.

10

11

12

13

14

<110> Andre R. Abad

\hskip1cm

Nicholas B. Duck

\hskip1cm

Xiang Feng

\hskip1cm

Ronald D. Flannagan

\hskip1cm

Theodore W. Kahn

\hskip1cm

Lynn E. Sims

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<120> Genes que Codifican Nuevas Proteínas con Actividad Pesticida Contra Coleópteros

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<130> 35718/238414

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<150> 60/242,838

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<151> 2000-10-24

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<160> 48

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 3621

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<212> ADN

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<213> Bacillus thuringiensis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(3621)

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<221> misc_feature

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<222> (0)...(0)

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<223> Cry1218-1

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<400> 1

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<210> 2

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<211> 1206

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

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<400> 2

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21

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<210> 3

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<211> 3633

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<212> ADN

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<213> Bacillus thuringiensis

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(3633)

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<221> misc_feature

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<222> (0) ... (0)

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<223> Cry1218-2

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<400> 3

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25

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<210> 4

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<211> 1210

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis

\newpage

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<400> 4

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30

31

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<210> 5

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<211> 2003

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<212> ADN

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<223> Bacillus thuringiensis (truncado)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(2001)

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<221> misc_feature

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<222> (0)...(0)

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<223> 1218-1

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<400> 5

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33

34

35

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<210> 6

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<211> 667

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis (truncado)

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<400> 6

36

37

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<210> 7

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<211> 2003

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<212> ADN

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<213> Bacillus thuringiensis (truncado)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(2001)

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<221> misc_feature

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<222> (0)...(0)

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<223> 1218-2

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<400> 7

38

39

40

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<210> 8

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<211> 667

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis (truncado)

\newpage

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<400> 8

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42

43

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<210> 9

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<211> 2010

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(2010)

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<223> Cry1218-1 optimizado de maíz

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<221> misc_feature

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<222> (0)...(0)

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<223> mo1218-1

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<400> 9

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46

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<210> 10

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<211> 669

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Cry1218-1 optimizado de maíz

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<400> 10

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47

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<210> 11

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<211> 2022

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<212> ADN

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<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(2022)

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<221> misc_feature

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<222> (0)...(0)

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<223> NGSR.N1218-1

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<400> 11

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49

50

51

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<210> 12

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<211> 673

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

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<400> 12

53

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<210> 13

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<211> 12

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<212> ADN

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Inserto NGSR

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<400> 13

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\hskip-.1em\dddseqskip

aatggttccc gg

\hfill

12

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<210> 14

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<211> 4

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<212> PRT

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<213> Secuencia Artificial

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<220>

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<223> Inserto NGSR

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<400> 14

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\sa{Asn Gly Ser Arg}

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<210> 15

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<211> 2010

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<212> ADN

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<213> Bacillus thuringiensis (truncado)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(2010)

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<221> misc_feature

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<222> (0)...(0)

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<223> 1218-1A

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<400> 15

55

56

57

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<210> 16

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<211> 669

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis (truncado)

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<400> 16

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60

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<210> 17

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<211> 2022

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<212> ADN

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<213> Bacillus thuringiensis (truncado)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (1)...(2022)

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<221> misc_feature

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<222> (0)...(0)

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<223> 1218-2A

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<400> 17

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63

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<210> 18

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<211> 673

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis (truncado)

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<400> 18

65

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<210> 19

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<211> 1860

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<212> ADN

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<213> Bacillus thuringiensis (truncado)

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<220>

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<221> CDS

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<222> (10)...(1860)

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<221> misc_feature

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<222> (0)...(0)

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<223> 49PVD

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<400> 19

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<210> 20

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<211> 616

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<212> PRT

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<213> Bacillus thuringiensis (truncado)

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

71

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2022

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(2022)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LKMS.N1218-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

73

74

75

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 673

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

77

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2013

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(2013)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LKMS.R1218-1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

79

80

81

82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 670

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

83

84

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Inserto LKMS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tta aaa atg tct

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Inserto LKMS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Lys Met Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4874

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> ADN Genómico de 1218-1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

85

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6613

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cry1218-2 genómico

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

87

88

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1863

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1863)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> NGSR.N49PVD

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

90

91

92

\vskip1.000000\baselineskip

93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 620

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

94

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1863

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1863)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LKMS.N49PVD

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

96

97

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 620

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

99

100

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1854

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1854)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LKMS.R49PVD

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

101

102

103

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 617

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

104

105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador hacia adelante 5'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgagtccaa ataatcaaaa tg

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador hacia atrás 5'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgcttctaa atcttgttcc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador hacia adelante 3'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ggaacaagat ttagagg

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> iniciador hacia atrás 3'

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ctcatcgtct acaatcaatt catc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2022

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(2022)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LRNS.N1218-1

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

106

107

108

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 673

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

109

110

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1863

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1863)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LRMS.N49PVD

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

112

113

114

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 620

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

115

116

117

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2013

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(2013)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc- feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LRMS.R1218-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

118

119

120

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 670

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

121

122

123

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1854

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1854)

\vskip0.400000\baselineskip

<221> misc_feature

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (0)...(0)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> LRMS.R49PVD

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

124

125

126

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 617

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bacillus thuringiensis (mutado)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

127

128

129

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Inserto LRMS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttaagaatgt ct

\hfill

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia Artificial

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Inserto LRMS

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Met Ser}

Claims

1. Un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que tiene actividad pesticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona entre:

(a): una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 15 ó 17;

(b): una secuencia de nucleótidos que codifica a la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 16 ó 18;

2. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 15 ó 17.

3. El ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de nucleótidos se optimiza para la expresión en una planta.

4. Un casete de expresión que contiene un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión en un microorganismo o en una célula de una planta.

5. Un polipéptido pesticida aislado que tiene actividad pesticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental, en donde en dicho polipéptido se selecciona entre:

(a): un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 16 ó 18; y

6. El polipéptido de acuerdo a la reivindicación 5, en donde dicho polipéptido tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8, 16 ó 18.

7. Una composición pesticida que contiene al menos un polipéptido de acuerdo a la reivindicación 5 en combinación con un excipiente.

8. Un método para impactar a una plaga de insectos de una planta que comprende aplicar la composición pesticida de acuerdo a la reivindicación 7 al medio ambiente de la plaga de insectos por medio de un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de rociado, espolvoreo, siembra al voleo y recubrimiento de la semilla.

9. El método de acuerdo a la reivindicación 8, en donde dicha plaga de insectos de una planta se selecciona de el escarabajo de la patata, el gusano de la raíz del maíz occidental, y el gusano de la raíz del maíz sureño.

10. Una planta transformada que contiene en su genoma al menos una construcción de nucleótidos incorporada en forma estable que comprende una secuencia de codificación operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión o un polipéptido que es pesticida para el gusano de la raíz del maíz occidental, en donde dicha secuencia de codificación se selecciona entre:

(e): una secuencia de nucleótidos de acuerdo con cualquiera de (a) a (d) que contiene codones optimizados para la expresión en una planta.

11. La planta de acuerdo a la reivindicación 10, en donde dicha secuencia de nucleótidos tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 15 ó 17.

12. La planta de acuerdo a la reivindicación 10, en donde la planta es una monocotiledónea.

13. La planta de acuerdo a la reivindicación 10, en donde dicha planta es una dicotiledónea.

14. Una semilla transformada de la planta de acuerdo a la reivindicación 10.

15. Un microorganismo transformado que contiene en su genoma al menos un casete de expresión incorporado en forma estable que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que tiene actividad pesticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental, en donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona entre:

(a): una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 15, 17, 27 ó 28;

16. El microorganismo transformado de acuerdo a la reivindicación 15, en donde dicha secuencia de nucleótidos tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 15, 17, 27 ó 28.

17. El microorganismo transformado de acuerdo a la reivindicación 15, en donde la secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión en dicho microorganismo.

18. Una composición pesticida que contiene un microorganismo transformado de acuerdo a la reivindicación 15 y un excipiente, en donde dicha composición ha sido tratada para prolongar la actividad pesticida.

19. Un método de impactar a una plaga de una planta que comprende aplicar la composición pesticida de acuerdo a la reivindicación 18 al medio ambiente de la plaga por medio de un procedimiento seleccionado de rociado, espolvoreo, siembra al voleo y recubrimiento de la semilla.

20. Un método para impactar a una plaga de una planta que comprende introducir dentro de dicha planta o célula de la misma al menos una construcción de nucleótidos que contiene una secuencia de codificación operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión de un polipéptido pesticida en células de la planta, en donde dicho polipéptido tiene actividad pesticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental y donde dicha secuencia de nucleótidos se selecciona entre:

21. El método de acuerdo la reivindicación 20, en donde dicha secuencia de nucleótidos tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos expuesta el las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, 9, 15 ó 17.

22. Una variante del ácido nucleico expuesto en la SEQ ID NO: 19 en donde la variante contiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos un codón adicional no presente en la secuencia de nucleótidos expuesta en la SEQ ID NO: 19, en donde al menos el codón adicional introduce un sitio adicional sensible a la proteasa en la región bucle entre las hélices alfa 3 y 4 del dominio 1 del polipéptido codificado, y además en donde el polipéptido codificado por la variante se caracteriza por una actividad pesticida mejorada contra una plaga que pertenece al orden Coleóptera con relación a la actividad del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 2.

23. El ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 22, en donde la secuencia de nucleótidos se optimiza para la expresión en una planta.

24. Un casete de expresión que contiene un ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 22, en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión en un microorganismo o en una célula de una planta.

25. Un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:

(a): una secuencia de nucleótidos expuesta en cualquiera de las SEQ ID NOS: 5, 11, 15, 21, 23, 39 y 43;

(b): una secuencia de nucleótidos que codifica a una cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOS: 6, 12, 16, 22, 24, 40 y 44;

(c): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en donde el polipéptido contiene un sitio adicional de escisión sensible a la proteasa insertado entre los residuos aminoácidos 164 y 165 de la SEQ ID NO: 16;

(d): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en done la variante de polipéptido contiene una secuencia adicional de aminoácidos diseñada para introducir un sitio de escisión para la tripsina entre los residuos aminoácidos 164 y 165 de la SEQ ID NO: 16;

(e): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en done el polipéptido contiene una secuencia adicional de aminoácidos diseñada para introducir un sitio de escisión para la quimotripsina entre los residuos aminoácidos 160 y 161 de la SEQ ID NO: 16; y

(f): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en donde el polipéptido contiene una secuencia de aminoácidos en la cual los residuos correspondientes a las posiciones 161 hasta 163 de la SEQ ID NO: 16 se remueven y se introducen en su lugar aminoácidos adicionales que contienen un sitio de escisión para la quimotripsina.

26. El ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 25, en donde la secuencia de nucleótidos se optimiza par la expresión en una planta.

27. Una variante del ácido nucleico expuesto en la SEQ ID NO: 15, en donde la variante contiene una secuencia de nucleótidos que incluye al menos un codón adicional que introduce un sitio adicional sensible a la proteasa en la región bucle entre las hélices alfa 3 y 4 del dominio 1 del polipéptido codificado por la variante de ácido nucleico, y además en donde el polipéptido codificado se caracteriza por una actividad pesticida mejorada contra una plaga que pertenece al orden Coleóptera con relación a la actividad del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 2.

28. Un casete de expresión que contiene un ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 27, en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión en un microorganismo o en una célula de una planta.

29. Un ácido nucleico aislado que contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada entre:

(a): una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOS: 19, 29, 31, 33, 41 ó 45;

(b): una secuencia de nucleótidos que codifica a la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOS: 20, 30, 32, 34, 42 ó 46;

(c): una secuencia de nucleótidos que contiene a una variante de la SEQ ID NO: 19, en donde la variante codifica a un polipéptido caracterizado por un sitio adicional de escisión sensible a la proteasa insertado inmediatamente 5' al aminoácido 114 de la SEQ ID NO: 20;

(d): una secuencia de nucleótidos que contiene a una variante de la SEQ ID NO: 19, en done la variante codifica a un polipéptido caracterizado por una secuencia adicional de aminoácidos diseñada para introducir un sitio de escisión para la tripsina entre los residuos aminoácidos 113 y 114 de la SEQ ID NO: 20;

(e): una secuencia de nucleótidos que contiene a una variante de la SEQ ID NO: 19, en done la variante codifica a un polipéptido caracterizado por una secuencia adicional de aminoácidos diseñada para introducir un sitio de escisión para la quimotripsina entre los residuos aminoácidos 113 y 114 de la SEQ ID NO: 20; y

(f): una secuencia de nucleótidos que contiene a una variante de la SEQ ID NO: 19, en donde la variante codifica a un polipéptido caracterizado por una secuencia de aminoácidos en la cual los aminoácidos localizados en las posiciones 114 hasta 116 de la SEQ ID NO: 20 se remueven y se introducen en su lugar aminoácidos adicionales que contienen un sitio de escisión para la quimotripsina.

30. El ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 29, en donde la secuencia de nucleótidos se optimiza para la expresión en una planta.

31. Una variante del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 16, en donde la variante contiene una secuencia de aminoácidos que incluye al menos un residuo aminoácido adicional que introduce un sitio adicional sensible a la proteasa en la región bucle entre las hélices alfa 3 y 4 del dominio 1 del polipéptido, y además en donde el polipéptido codificado se caracteriza por una actividad pesticida mejorada contra una plaga que pertenece al orden Coleóptera con relación a la actividad del polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 2.

32. Un polipéptido pesticida aislado que contiene una secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOS: 6, 12, 16, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40 42, 44 ó 46.

33. Una planta trasformada que contiene en su genoma al menos una construcción de nucleótidos incorporada en forma estable que comprende una secuencia de codificación operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión de un polipéptido pesticida en células de plantas transformadas, en donde dicho polipéptido tiene actividad pesticida contra el gusano de la raíz del maíz occidental y en donde dicha secuencia de codificación se selecciona entre:

(a): una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID NOS: 11, 19, 21, 23, 29, 31, 33, 39, 41, 43 ó 45;

(b): una secuencia de nucleótidos que codifica a la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NOS: 12, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 ó 46;

(d): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en done la variante contiene una secuencia adicional de aminoácidos diseñada para introducir un sitio de escisión para la tripsina entre los residuos aminoácidos 164 y 165 de la SEQ ID NO: 16;

(e): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en done la variante contiene una secuencia adicional de aminoácidos diseñada para introducir un sitio de escisión para la quimotripsina entre los residuos aminoácidos 160 y 161 de la SEQ ID NO: 16;

(f): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en donde los residuos aminoácidos correspondientes a los aminoácidos 161 hasta 163 de la SEQ ID NO: 16 se remueven y se introducen en su lugar aminoácidos que contienen un sitio de escisión para la quimotripsina;

(g): una secuencia de nucleótidos que contiene a una variante de la SEQ ID NO: 19, en donde la variante codifica a un polipéptido caracterizado por un sitio adicional de escisión sensible a la proteasa insertado inmediatamente 5' al aminoácido 114 de la SEQ ID NO: 20;

(h): una secuencia de nucleótidos que contiene a una variante de la SEQ ID NO: 19, en donde la variante codifica a un polipéptido caracterizado por un aminoácido adicional seleccionado para introducir un sitio de escisión para la tripsina inmediatamente 5' del aminoácido 114 de la SEQ ID NO: 20;

(i): una secuencia de nucleótidos que contiene a una variante de la SEQ ID NO: 19, en done la variante contiene residuos adicionales de ácido nucleico diseñados para introducir un sitio de escisión para la quimotripsina entre los residuos aminoácidos 113 y 114 de la SEQ ID NO: 20;

(j): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 20, en donde los residuos aminoácidos localizados en las posiciones 114 hasta 116 de la SEQ ID NO: 20 se remueven y se introducen en su lugar aminoácidos adicionales que contienen un sitio para la quimotripsina; y

(k): una secuencia de nucleótidos de acuerdo a cualquiera de (a) a (j) que contiene codones optimizados para la expresión en una planta.

34. La planta de acuerdo a la reivindicación 33, en donde dicha planta es una monocotiledónea.

35. La planta de acuerdo a la reivindicación 33, en donde dicha planta es una dicotiledónea.

36. Una semilla transformada de la planta de acuerdo a la reivindicación 33.

37. Un microorganismo transformado que contiene un ácido nucleico seleccionado entre:

(c): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de la SEQ ID NO: 19, en donde la variante contiene un inserto de ácido nucleico diseñado para introducir sitio adicional sensible a la proteasa entre los residuos aminoácidos 117 y 118 de la SEQ ID NO: 20;

(d): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 16, en done la variante contiene un sitio adicional sensible a la proteasa insertado entre los residuos aminoácidos 164 y 165 de la SEQ ID NO: 16; y

(e): una secuencia de nucleótidos que codifica a una variante de polipéptido de la SEQ ID NO: 20, en done la variante contiene un sitio adicional sensible a la proteasa insertado entre los residuos aminoácidos 117 y 118 de la SEQ ID NO: 20.