DE60122931T2

DE60122931T2 - Proteine von bacillus thuringiensis und varianten davon mit pestizider aktivität gegen schädlinge der art coleopteran

Info

Publication number: DE60122931T2
Application number: DE60122931T
Authority: DE
Inventors: R. Andre West Des Moines ABAD; B. Nicholas Apex DUCK; Xiang West Des Moines FENG; D. Ronald Grimes FLANNAGAN; W. Theodore Johnston KAHN; E. Lynne Polk City SIMS
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: EIDP Inc
Priority date: 2000-10-24
Filing date: 2001-10-24
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2021-10-25
Also published as: DE60122931D1; US7696412B2; US20030177528A1; BR0114891A; ES2271098T3; WO2002034774A3; US20020151709A1; EP1356054A2; EP1356054B1; WO2002034774A2; HU228699B1; MXPA03003666A; HUP0302523A3; HUP0302523A2; US7605304B2; US8188036B2; US20090291896A1; CA2426793C; AU2002228705A1; CA2426793A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf natürlich vorkommende und rekombinante Nucleinsäuren, die von Bacillus thuringiensis Cry8-artigen Genen erhalten werden, die für δ-Endotoxine codieren, die durch pestizide Aktivität gegen Schädlinge der Art Coleopteran gekennzeichnet sind. Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung verwenden die offenbarte Nucleinsäuren und ihre codierten pestiziden Polypeptide, um Pflanzenschädlinge zu bekämpfen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Insektenschädlinge sind ein Hauptfaktor beim Verlust der landwirtschaftlichen Nutzpflanzen in der Welt. Ein mit Insektenschädlingen in Verbindung stehender Nutzpflanzenverlust hat allein durch Corn Rootworm (Maiswurzelbohrer) eine Milliarde Dollar pro Jahr erreicht. Beispielsweise kann Corn Rootworm-Fraß für landwirtschaftliche Erzeuger wirtschaftlich vernichtend sein. Der Western Corn Rootworm (Diabrotica virgifera) ist ein Hauptinsektenschädling von Korn oder Mais in vielen Regionen der Welt. Während der Southern Corn Rootworm ein weniger wichtiger Schädling als der Western Corn Rootworm ist, kann er gelegentlich beachtliche wirtschaftliche Schäden an Mais verursachen. Eine Schädigung durch Western und Southern Corn Rootworm kann in einem verstärkten Niederlegen, einer verringerten Trockentoleranz und schließlich in Verringerungen des Nutzpflanzenertrags resultieren.
Traditionell sind die primären Verfahren zur Bekämpfung von Corn Rootworm-Populationen Fruchtfolge und die Anwendung von chemischen Breitbandinsektidizen. Einige Species von Schädlingen haben unglücklicherweise Resistenz gegen die chemischen Insektizide entwickelt. Darüber hinaus befassen sich Verbraucher wie auch Regulierungsbehörden zunehmend mit den Umweltgefahren, die mit der Produktion und Verwendung von synthetischen chemischen Pestiziden verbunden sind. Wegen solcher Probleme haben Regulierungsbehörden die Verwendung von einigen der gefährlicheren Pestizide verboten oder begrenzt. Somit besteht ein wesentliches Interesse an der Entwicklung alternativer Pestizide.
Die biologische Bekämpfung bzw. Kontrolle von Insektenschädlingen mit landwirtschaftlicher Bedeutung unter Verwendung eines mikrobiellen Agenses, z.B. Fungi, Bakterien oder andere Insektenspecies, bietet eine umweltfreundliche und wirtschaftlich attraktive Alternative. Allgemein gesprochen, die Verwendung von Biopestiziden weist ein niedrigeres Belastungsrisiko und geringere Umweltgefahren auf, und sie stellen größere Targetspezifität bereit als es für traditionelle chemische Breitbandinsektizide charakteristisch ist. Außerdem sind Biopestizide oft mit geringeren Kosten zu produzieren und verbessern demnach den wirtschaftlichen Ertrag für eine weite Vielzahl von Nutzpflanzen.
Von bestimmten Mikroorganismusspecies der Gattung Bacillus ist bekannt, dass sie pestizide Aktivität gegen einen weiten Bereich von Insektenschädlingen, einschließlich Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera und andere, aufweisen. Bacillus thuringiensis und Bacillus papilliae gehören zu den erfolgreichsten Biokontrollagenzien, die bis heute entdeckt wurden. Insektenpathogenität wurde auch Stämmen von: B. larvae, B. lentimorbus, B. papilliae, B. sphaericus, B. thuringiensis zugeschrieben (Harwook, Hrsg. ((1989) Bacillus Plenum Press), 306) und B. cereus (WO 96/10083). Pestizide Aktivität scheint in parasporalen kristallinen Proteineinschlüssen konzentriert zu sein, und es wurden mehrere Gene, die für diese pestiziden Proteine codieren, isoliert und charakterisiert (siehe z.B. US-Patent Nr. 5,366,892).
Mikrobielle Insektizide, insbesondere solche, die von Bacillus-Stämmen erhalten wurden, spielten in der Landwirtschaft als Alternative zur chemischen Schädlingsbekämpfung eine wichtige Rolle. Vor kurzem haben landwirtschaftliche Wissenschaftlicher Nutzpflanzen mit erhöhter Insektenresistenz entwickelt, indem sie Nutzpflanzen gentechnisch veränderten, so dass sie pestizide Proteine aus Bacillus produzieren (siehe US-Patent Nr. 5,554,534 und WO 93/15206, die sich auf die Bekämpfung von Scarab-Schädlingen auf diese Weise beziehen). Mais- und Baumwollpflanzen, die genetisch verändert wurden, um pestizide Proteine zu produzieren, die aus Stämmen von B. thuringiensis isoliert wurden, bekannt als δ-Endotoxine oder Cry-Toxine, werden jetzt in der amerikanischen Landwirtschaft in großem Umfang verwendet und haben die Landwirte mit einer umweltfreundlichen Alternative zu traditionellen Insektenbekämpfungsverfahren ausgestattet. Außerdem wurden Kartoffeln, die genetisch verändert wurden, so dass sie pestizide Cry-Toxine enthalten, an den amerikanischen Landwirt verkauft. Obgleich sich diese genetisch veränderten, Insekten-resistenten Nutzpflanzen als wirtschaftlich sehr erfolgreich erwiesen haben, stellen sie nur gegen einen engen Bereich der wirtschaftlich wichtigen Insektenschädlinge Resistenz bereit. Einige Insekten, z.B. Western Corn Rootworm (Diaprotica virgifera, Westlicher Maiswurzelbohrer), haben sich als gegen über einer Behandlung resistent erwiesen und der Level der Bt-Toxinresistenz ist bei früher empfindlichen Populationen einiger wichtiger Insektenschädlinge im Ansteigen begriffen.
Obgleich zahlreiche Forscher versucht haben, mutante Endotoxinproteine mit verbesserter insektizider Aktivität herzustellen, waren nur wenige erfolgreich. In der Tat wird von den meisten der genetisch veränderten B. thuringiensis-Toxine, die in der Literatur beschrieben wurden, eine Endotoxinaktivität beschrieben, die nicht besser ist als die des Wildtyp-Proteins, und in vielen Fällen ist die Aktivität vermindert oder sogar zerstört. Demnach werden neue mikrobielle Insektizide, die eine veränderte Spezifität und/oder verbesserte pestizide Aktivität haben, zur Verwendung in Schädlingsregulierungstrategien gewünscht.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es werden Zusammensetzungen und Verfahren zur Bekämpfung von Pflanzenschädlingen, insbesondere von Coleopteran-Insektenschädlingen, bereitgestellt. Spezifischer bezieht sich die Erfindung auf Verfahren der Bekämpfung von Insekten, wobei Nucleinsäuren verwendet werden, die von δ-Endotoxingenen stammen, um transformierte Mikroorganismen und Pflanzen zu produzieren, die ein pestizides Polypeptid der Erfindung exprimieren. Die Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung finden in der Landwirtschaft zur Bekämpfung von Schädlingen von Nutzpflanzen Verwendung.
Die Erfindung stellt Nucleinsäuren und Fragmente und Varianten davon bereit, die für Polypeptide codieren, die pestizide Aktivität gegen Schädlinge der Art Coleoptera besitzen. Die Wildtyp- (z.B. natürlich vorkommende) Nucleotidsequenzen der Erfindung, die aus Stämmen von Bacillus thuringiensis erhalten werden, codieren für Cry-8-artige δ-Endotoxine.
Die Erfindung stellt ferner Fragmente und Varianten von Cry-8-artigen Nucleotidsequenzen bereit, die für biologisch aktive (z.B. pestizide) Polypeptide codieren. In besonderen Ausführungsformen codieren die offenbarten Nucleotidsequenzen für Polypeptide, die für wenigstens ein Insektizid, das zu der Art Coleopteran gehört (z.B. Kartoffelkäfer, Southern Corn Rootworm und Western Corn Rootworm), pestizid sind.
Andere Ausführungsformen der Erfindung stellen eine Nucleinsäure bereit, die für verkürzte Versionen eines Cry8-Endotoxins codiert, die durch pestizide Aktivität gekennzeichnet sind, die entweder der Aktivität des entsprechenden Volllängenendotoxins äquivalent oder gegenüber dieser verbessert ist. Einige der verkürzten Nucleinsäuren der Erfindung können als Fragmente oder Varianten bezeichnet werden. In bestimmten Ausführungsformen sind einige der Nucleinsäure-Fragmente/Varianten der Erfindung am 3'-Ende einer codierenden Wildtypsequenz verkürzt; in alternativen Ausführungsformen umfassen andere Nucleinsäuren der Erfindung eine fortlaufende Sequenz von Nucleinsäureresten, die von einer anderen codierenden Sequenz der Erfindung stammen, die sowohl am 5'-Ende als auch am 3'-Ende verkürzt wurden.
Die Erfindung stellt auch rekombinante Cry8-artige Nucleinsäuren bereit, die mutagenisierte Nucleinsäuresequenz-Varianten umfassen, die für B. thuringiensis-Endotoxine codieren, die gentechnisch so modifiziert wurden, dass sie verbesserte und/oder veränderte pestizide Aktivitäten haben. Spezifischer ausgedrückt, die Erfindung stellt mutagenisierte Nucleinsäuren bereit, die für pestizide Polypeptide codieren, die eine zusätzliche oder eine alternative Protease-empfindliche Stelle umfassen, die in Domäne 1 der Polypeptidvariante in einer Region lokalisiert ist, die zwischen α-Helices 3 und 4 des codierten Polypeptids lokalisiert ist.
Wie hierin demonstriert wurde, kann das Vorliegen einer zusätzlichen und/oder alternativen Protease-empfindlichen Stelle in der Aminosäuresequenz des codierten Polypeptids die pestizide Aktivität und/oder Spezifität des varianten Polypeptids verbessern, das durch die Nucleinsäure-Varianten der Erfindung codiert wird. Dementsprechend können die Cry8-Nucleotidsequenzen der Erfindung rekombinant verändert oder manipuliert werden, um Endotoxine zu produzieren, die eine verbesserte oder veränderte Aktivität und/oder Spezifität im Vergleich zu der eines unmodifizierten Wildtyp-δ-Endotoxins haben.
Beispielsweise stellt ein Typ einer varianten Nucleinsäure (z.B. mutagenisierte Cry8-artige Nucleotidsequenz), die hierin offenbart ist, zusätzliche Mutanten bereit, die zusätzliche Codons umfassen, welche eine zweite Trypsin-empfindliche Aminosäuresequenz (zusätzlich zu der natürlich vorkommenden Trypsinstelle) in ihr codiertes Polypeptid einführen. Eine alternative Additionsvariante der Erfindung umfasst zusätzliche Codons, die so konzipiert sind, dass sie eine Chymotrypsin-empfindliche Stelle einführen, die unmittelbar 5' der natürlich vorkommenden Trypsinstelle lokalisiert ist.
Ein zweiter alternativer Typ an varianter Nucleinsäure der Erfindung stellt Substitutionsmutanten bereit, in denen wenigstens ein Codon der Nucleinsäure, die für die natürlich auftretende Protease-empfindliche Stelle codiert, zerstört wird, und alternative Codons werden in die Varianten-Nucleinsäuresequenz eingeführt, um eine andere (z.B. Ersatz-)Protease-empfindliche Stelle an ihre Stelle einzuführen. In einer bestimmten Ausführungsform dieses varianten Polypeptids wird eine Ersatzmutante offenbart, in der die natürlich auftretende Trypsinspaltstelle, die in dem codierten Polypeptid vorliegt, zerstört ist und eine Chymotrypsinspaltstelle an ihrer Stelle eingeführt ist.
Es ist zu erkennen, dass eine der offenbarten Mutationen in einer beliebigen Polynucleotidsequenz der Erfindung durchgeführt werden kann, die die Aminosäurereste umfasst, die die Trypsinspaltstelle bereitstellen, die Ziel für die Modifikation ist. Dementsprechend können Varianten entweder von Volllängenendotoxinen oder Fragmenten davon so modifiziert werden, dass sie zusätzliche oder alternative Spaltstellen enthalten.
Die Nucleinsäuren der Erfindung können eingesetzt werden, um Expressionskassetten zu produzieren, die eingesetzt werden können, um transformierte Mikroorganismen zu produzieren, die eine Nucleinsäure der Erfindung umfassen. Die resultierenden Transformanten können in der Herstellung von pestiziden Zusammensetzungen eingesetzt werden, die einen transformierten Mikroorganismus umfassen, oder für die Produktion oder Isolierung von pestiziden Proteinen eingesetzt werden. Somit stellt die Erfindung außerdem pestizide Zusammensetzungen bereit, die entweder pestizide Polypeptide oder transformierte Mikroorganismen umfassen; sie stellt außerdem Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen bereit. Die pestiziden Zusammensetzungen der Erfindung finden in landwirtschaftlichen Methoden zur Bekämpfung von Schädlingen Verwendung. Beispielsweise können die Zusammensetzungen in einem Verfahren eingesetzt werden, das Platzieren einer wirksamen Menge der pestiziden Zusammensetzung in der Umgebung des Schädlings involviert, und zwar durch eine Vorgehensweise, die aus der Gruppe, bestehend aus Besprühen, Bestäuben, Breitwurf und Samenbeschichtung ausgewählt ist.
Die Erfindung stellt außerdem isolierte pestizide (z.B. insektizide) Polypeptide bereit, die entweder durch eine natürlich vorkommende oder eine modifizierte (z.B. mutagenisierte oder manipulierte) Nucleinsäure der Erfindung codiert werden. In bestimmten Beispielen umfassen pestizide Proteine der Erfindung Volllängen-δ-Endotoxinproteine, Fragmente von Volllängen-δ-Endotoxinen und variante Polypeptide, die aus mutagenisierten Nucleinsäuren produziert werden, welche so entwickelt sind, dass sie bestimmte Aminosäuresequenzen in die Polypeptide der Erfindung einführen. In bestimmten Ausführungsformen haben die Polypeptidfragmente und Polypeptidvarianten der Erfindung im Vergleich zu der Aktivität des natürlich auftretenden δ-Endotoxins, von dem sie abgeleitet sind, erhöhte pestizide Aktivität. Polypeptide der Erfindung können entweder aus einer hierin offenbarten Nucleinsäure oder durch die Verwendung von Standardmolekularbiologie-Techniken produziert werden. Bei spielsweise kann ein verkürztes Protein der Erfindung durch Expression einer rekombinanten Nucleinsäure der Erfindung in einer geeigneten Wirtszelle oder alternativ durch eine Kombination von ex vivo-Verfahren, z.B. Proteaseverdau und Reinigung, produziert werden.
Die Nucleinsäuren der Erfindung können auch eingesetzt werden, um transgene (z.B. transformierte) Pflanzen zu produzieren, die durch Genome gekennzeichnet sind, die wenigstens ein stabil eingebautes Nucleotidkonstrukt umfassen, welches eine codierende Sequenz der Erfindung funktionell mit einem Promotor verknüpft, umfasst, der die Expression des codierten pestiziden Polypeptids steuert. Dementsprechend werden auch transformierte Pflanzenzellen, Pflanzengewebe, Pflanzen und Samen davon bereitgestellt.
In einer bestimmten Ausführungsform kann eine transformierte Pflanze der Erfindung produziert werden, indem eine Nucleinsäure, die für eine verstärkte Expression in einer Wirtspflanze optimiert wurde, verwendet wird. Beispielsweise kann eines der pestiziden Polypeptide der Erfindung zurücktranslatiert werden, um eine Nucleinsäure zu produzieren, welche Codons umfasst, die für eine Expression in einem bestimmten Wirt, z.B. einer Pflanze, spezifischer zur Expression in einer Zea mays-Pflanze, optimiert sind. Die Expression einer codierenden Sequenz durch eine solche transformierte Pflanze (z.B. Dikotyle oder Monokotyle) wird in der Produktion eines pestiziden Polypeptids resultieren und der Pflanze eine erhöhte Insektenresistenz verleihen. In einer bestimmten Ausführungsform stellt die Erfindung transgene Pflanzen bereit, die pestizide Polypeptide exprimieren, welche in Verfahren zur Bekämpfung des Colorado-Kartoffelkäfers, Western Corn Rootworm (Westlicher Maiswurzelbohrer) und des Southern Corn Rootwoorm (Südlicher Maiswurzelwurm) Verwendung finden.
Dementsprechend stellt die Erfindung eine isolierte Nucleinsäure bereit, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid mit pestizider Aktivität gegen Western Corn Rootworm (Diabrotica virgifera) codiert, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus:

(a) einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15 oder 17 angegeben ist;
(b) einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 16 oder 18 angegebene Aminosäuresequenz codiert;
(c) einer Nucleotidsequenz, die wenigstens 88% Sequenzidentität zu der in (a) angegebenen Nucleotidsequenz hat; und
(d) einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 85% Sequenzidentität zu der in (b) angegebenen Aminosäuresequenz hat.

Die Erfindung stellt auch ein isoliertes pestizides Polypeptid bereit, das pestizide Aktivität gegen Western Corn Rootworm (Diabrotica virgifera) hat, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus:

(a) einem Polypeptid, das eine in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 16 oder 18 angegebene Aminosäuresequenz hat; und
(b) einem Polypeptid, das wenigstens 85% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von (a) hat.

Die Erfindung stellt auch eine transformierte Pflanze bereit, die in ihrem Genom wenigstens ein stabil eingebautes Nucleotidkonstrukt umfasst, das eine codierende Sequenz funktionell mit einem Promotor verknüpft umfasst, der eine Expression eines Polypeptids steuert, das für Western Corn Rootworm bzw. Diabrotica virgifera pestizid ist, wobei die codierende Sequenz ausgewählt ist aus:

(a) einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15 oder 17 angegeben ist;
(b) einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 16 oder 18 angegebene Aminosäuresequenz codiert;
(c) einer Nucleotidsequenz, die wenigstens 88% Sequenzidentität zu der in (a) angegebenen Nucleotidsequenz hat;
(d) einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 85% Sequenzidentität zu der in (b) angegebenen Aminosäuresequenz hat; und
(e) einer Nucleotidsequenz nach einem von (a) bis (d), die Codons umfasst, die für eine Expression in einer Pflanze optimiert sind.

Die Erfindung stellt auch einen transformierten Mikroorganismus bereit, der in seinem Genom wenigstens eine stabil eingebaute Expressionskassette umfasst, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid codiert, das pestizide Aktivität gegen Diabrotica virgifera bzw. Western Corn Rootworm hat, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus:

(a) einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15, 17, 27 oder 28 angegeben ist;
(b) einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 16 oder 18 angegebene Aminosäuresequenz codiert;
(c) einer Nucleotidsequenz, die wenigstens 88% Sequenzidentität zu der in (a) angegebenen Nucleotidsequenz hat; und
(d) einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 85% Sequenzidentität zu der in (b) angegebenen Aminosäuresequenz hat.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bekämpfung eines Pflanzenschädlings, umfassend Einführung in die Pflanze oder Zelle derselben wenigstens ein Nucleotidkonstrukt, das eine codierende Sequenz funktionell verknüpft mit einem Promotor umfasst, der eine Expression eines pestiziden Polypeptids in Pflanzenzellen steuert, wobei das Polypeptid pestizide Aktivität gegenüber Western Corn Rootworm hat und wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus:

Die Erfindung stellt auch eine Variante der Nucleinsäure, die in SEQ ID NO: 19 angegeben ist, bereit, wobei die Variante eine Nucleotidsequenz umfasst, die wenigstens ein zusätzliches Codon hat, das in der in SEQ ID NO: 19 angegebenen Nucleotidsequenz nicht vorhanden ist, wobei das wenigstens eine zusätzliche Codon eine zusätzliche Protease-empfindliche Stelle in die Schleifenregion zwischen α-Helices 3 und 4 der Domäne 1 des codierten Polypeptids einführt, und wobei außerdem das durch die Variante codierte Polypeptid durch verbesserte pestizide Aktivität gegen einen Schädling, der zu der Art Coleoptera gehört, im Vergleich zu der Aktivität des in SEQ ID NO: 2 angegebenen Polypeptids gekennzeichnet ist.
Die Erfindung stellt auch eine isolierte Nucleinsäure bereit, die eine Nucleotidsequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus:

(a) einer Nucleotidsequenz, die in einer von SEQ ID NO: 5, 11, 15, 21, 23, 39 und 43 angegeben ist;
(b) einer Nucleotidsequenz, die für eine der Aminosäuresequenzen codiert, die in SEQ ID NO: 6, 12, 16, 22, 24, 40 und 44 angegeben sind;
(c) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptidvariante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei das Polypeptid eine zusätzliche Protease-empfindliche Spaltstelle, insertiert zwischen den Aminosäureresten 164 und 165 von SEQ ID NO: 16, umfasst;
(d) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptidvariante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Polypeptidvariante eine zusätzliche Aminosäuresequenz, die zur Einführung einer Trypsin-Spaltstelle zwischen Aminosäureresten 164 und 165 von SEQ ID NO: 16 konzipiert ist, umfasst;
(e) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptidvariante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei das Polypeptid eine zusätzliche Aminosäuresequenz umfasst, die so konzipiert ist, dass sie eine Chymotrypsin-Spaltstelle zwischen Aminosäureresten 160 und 161 von SEQ ID NO: 16 einführt; und
(f) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptidvariante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, in welcher Reste, die den Positionen 161 bis 163 von SEQ ID NO: 16 entsprechen, entfernt sind und zusätzliche Aminosäuren, die einer Chymotrypsin-Spaltstelle umfassen, an ihrer Stelle eingeführt sind.

Die Erfindung stellt auch eine Variante der Nucleinsäure, die in SEQ ID NO: 15 angegeben ist, bereit, wobei die Variante eine Nucleotidsequenz umfasst, die wenigstens ein zusätzliches Codon enthält, das eine zusätzliche Protease-empfindliche Stelle in der Schleifenregion zwischen α-Helices 3 und 4 von Domäne 1 des Polypeptids, das durch die Varianten-Nucleinsäure codiert wird, einführt, und wobei außerdem das codierte Polypeptid durch verbesserte Pestizideaktivität gegen einen Schädling, der zu der Art Coleoptera gehört, im Vergleich zu der Aktivität des in SEQ ID NO: 2 angegebenen Polypeptids gekennzeichnet ist.
Die Erfindung stellt auch eine Expressionskassette bereit, die eine Nucleinsäure der Erfindung umfasst, wobei die Nucleotidsequenz funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der eine Expression in einem Mikroorganismus oder in einer Pflanzenzelle steuert.
Die Erfindung stellt auch eine isolierte Nucleinsäure bereit, die eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus:

(a) einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 19, 29, 31, 33, 41 oder 45 angegeben ist;
(b) einer Nucleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NO: 20, 30, 32, 34, 42 oder 46 angegeben ist;
(c) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO: 19 umfasst, wobei die Variante für ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Protease-empfindliche Spaltstelle gekennzeichnet ist, die unmittelbar 5' zur Aminosäure 114 von SEQ ID NO: 20 insertiert ist;
(d) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO: 19 umfasst, wobei die Variante für ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Aminosäuresequenz gekennzeichnet ist, die so konzipiert ist, dass sie eine Trypsin-Spaltstelle zwischen den Aminosäureresten 113 und 114 von SEQ ID NO: 20 einführt;
(e) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO: 19 umfasst, wobei die Variante für ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Aminosäuresequenz gekennzeichnet ist, die so konzipiert ist, dass sie eine Chymotrypsin-Spaltstelle zwischen den Aminosäureresten 113 und 114 von SEQ ID NO: 20 einführt; und
(f) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO: 19 umfasst, wobei die Variante für ein Polypeptid codiert, das durch eine Aminosäuresequenz gekennzeichnet ist, in der die Aminosäuren, die in Positionen 114 bis 116 von SEQ ID NO: 20 lokalisiert sind, entfernt sind und zusätzliche Aminosäuren, die eine Chymotrypsin-Stelle umfassen, an ihrer Stelle insertiert sind.

Die Erfindung stellt auch eine Variante des in SEQ ID NO: 16 angegebenen Polypeptids bereit, wobei die Variante eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens einen zusätzlichen Aminosäurerest enthält, der eine zusätzliche Protease-empfindliche Stelle in der Schleifenregion zwischen α-Helices 3 und 4 von Domäne 1 des Polypeptids einführt, und wobei außerdem das codierte Polypeptid durch eine verbesserte pestizide Aktivität gegen einen Schädling, der zur Art Coleoptera gehört, im Vergleich zu der Aktivität des in SEQ ID NO: 2 angegebenen Polypeptids gekennzeichnet ist.
Die Erfindung stellt auch ein isoliertes pestizides Polypeptid bereit, das eine in SEQ ID NO: 6, 12, 16, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 oder 46 angegebene Aminosäuresequenz umfasst.
Die Erfindung stellt auch eine transformierte Pflanze bereit, die in ihrem Genom wenigstens ein stabil eingebautes Nucleotidkonstrukt umfasst, das eine codierende Sequenz funktionell mit einem Promotor verknüpft umfasst, welcher eine Expression eines pestiziden Polypeptids in Zellen der transformierten Pflanze steuert, wobei das Polypeptid pestizide Aktivität gegen Diabrotica virgifera bzw. Western Corn Rootworm hat und wobei die codierende Sequenz ausgewählt ist aus:

(a) einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 11, 19, 21, 23, 29, 31, 33, 39, 41, 43 oder 45 angegeben ist;
(b) einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 12, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 oder 46 angegebene Aminosäuresequenz codiert;
(c) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche Protease-empfindliche Spaltstelle, insertiert zwischen den Aminosäureresten 164 und 165 von SEQ ID NO: 16, umfasst;
(d) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche Aminosäuresequenz umfasst, die so konzipiert ist, dass sie eine Trypsin-Spaltstelle zwischen den Aminosäureresten 164 und 165 von SEQ ID NO: 16 einführt;
(e) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche Aminosäuresequenz umfasst, die so konzipiert ist, dass sie eine Chymotrypsin-Spaltstelle zwischen den Aminosäureresten 160 und 161 von SEQ ID NO: 16 einführt;
(f) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Aminosäurereste, die den Aminosäuren 161 bis 163 von SEQ ID NO: 16 entsprechen, entfernt sind und Aminosäuren, die eine Chymotrypsin-Spaltstelle umfassen, an ihrer Stelle eingeführt sind;
(g) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO: 19 umfasst, wobei die Variante für ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Protease-empfind liche Spaltstelle unmittelbar 5' zu der Aminosäure 114 von SEQ ID NO: 20 gekennzeichnet ist;
(h) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO: 19 umfasst, wobei die Variante für ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Aminosäure gekennzeichnet ist, die so gewählt ist, dass eine Trypsin-Spaltstelle unmittelbar 5' der Aminosäure 114 von SEQ ID NO: 20 eingeführt wird;
(i) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO: 19 umfasst, wobei die Variante zusätzliche Nucleinsäurereste umfasst, die so konzipiert sind, dass sie eine Chymotrypsin-Spaltstelle zwischen den Aminosäureresten 113 und 114 von SEQ ID NO: 20 einführen;
(j) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante von SEQ ID NO: 20 codiert, wobei die Aminosäurereste, die in den Positionen 114 bis 116 von SEQ ID NO: 20 lokalisiert sind, entfernt sind und zusätzliche Aminosäuren, die eine Chymotrypsin-Stelle umfassen, an ihrer Stelle sind; und
(k) einer Nucleotidsequenz nach einem von (a) bis (j), die Codons umfasst, die für eine Expression in einer Pflanze optimiert sind.

Die Erfindung stellt auch transformierten Samen der Pflanze der Erfindung bereit.
Die Erfindung stellt auch einen transformierten Mikroorganismus bereit, umfassend eine Nucleinsäure, die ausgewählt ist aus:

(a) einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 11, 19, 21, 23, 29, 31, 33, 39, 41, 43 oder 45 angegeben ist;
(b) einer Nucleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NO: 12, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 oder 46 angegeben ist;
(c) einer Nucleotidsequenz, die für eine Variante von SEQ ID NO: 19 codiert, wobei die Variante ein Nucleinsäureinsert umfasst, das so konzipiert ist, dass es eine zusätzliche Protease-empfindliche Stelle zwischen den Aminosäureresten 117 und 118 von SEQ ID NO: 20 einführt;
(d) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche Protease-empfindliche Stelle, insertiert zwischen den Aminosäureresten 164 und 165 von SEQ ID NO: 16, umfasst; und
(e) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante von SEQ ID NO: 20 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche Protease-empfindliche Stelle, insertiert zwischen den Aminosäureresten 117 und 118 von SEQ ID NO: 20, umfasst.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Bekämpfung von Schädlingen, insbesondere Pflanzenschädlingen, spezifischer Insektenschädlinge der Art Coleopteran. Spezifischer umfassen die isolierten Nucleinsäuren der Erfindung und Fragmente und Varianten davon Nucleotidsequenzen, die für pestizide Polypeptide (z.B. Proteine) codieren. Die offenbarten pestiziden Proteine sind biologisch aktiv (z.B. pestizid) gegen Insektenschädlinge, insbesondere gegen den Colorado-Kartoffelkäfer (Leptinotarsa decemlineata), den Western Corn Rootworm (Diabrotica virgifera virgifera) und den Southern Corn Rootworm (Diabrotica undecimpunctata howardi).
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen isolierte Nucleinsäuren und Fragmente und Varianten davon, die für pestizide Polypeptide codieren, Expressionskassetten, die Nucleotidsequenzen der Erfindung umfassen, isolierte pestizide Proteine und pestizide Zusammensetzungen. In einigen Ausführungsformen stellt die Erfindung modifizierte Cry8-artige δ-Endotoxinproteine bereit, die durch eine verbesserte insektizide Aktivität gegen Coleopterane, verglichen mit der pestiziden Aktivität des entsprechenden parentalen Wildtyp-Proteins gekennzeichnet sind. Die Erfindung stellt ferner Pflanzen und Mikroorganismen bereit, die mit diesen neuen Nucleinsäuren transformiert sind, und stellt Verfahren bereit, die die Verwendung von solchen Nucleinsäuren, pestiziden Zusammensetzungen und transformierten Organismen bei der Bekämpfung von Insektenschädlingen involvieren.
In der Beschreibung, die folgt, wird eine Reihe von Ausdrücken ausgiebig eingesetzt. Die folgenden Definitionen werden zur Erleichterung des Verständnisses der Erfindung bereitgestellt.
Wie hierin verwendet, beinhaltet "Nucleinsäure" die Bezugnahme auf ein Desoxyribonucleotid- oder Ribonucleotidpolymer, entweder in einzelsträngiger oder doppelsträngiger Form, und wenn der Ausdruck nicht in anderer Weise begrenzt ist, umfasst er bekannte Analoga (z.B. Peptidnucleinsäuren), die die essentielle Natur von natürlichen Nucleotiden dahingehend haben, dass sie an einzelsträngige Nucleinsäuren in einer ähnlichen Form wie natürlich auftretende Nucleotide hybridisieren.
Die Ausdrücke "codierend für" bzw. "codierend" oder "codiert", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten, wenn sie im Kontext mit einer spezifizierten Nucleinsäure verwendet werden, dass die Nucleinsäure die erforderliche Information umfasst, um eine direkte Translation der Nucleotidsequenz in ein spezifiziertes Protein zu steuern. Die Information, durch welche ein Protein codiert wird, ist durch die Verwendung von Codons spezifiziert. Eine Nucleinsäure, die für ein Protein codiert, kann nicht-translatierte Sequenzen (z.B. Introns) innerhalb translatierter Regionen der Nucleinsäure umfassen, oder es können ihr solche intervenierenden nicht-translatierte Sequenzen fehlen (z.B. wie in cDNA).
Der Ausdruck "Volllängensequenz", wie er hier für ein spezifiziertes Polynucleotid oder sein codiertes Protein verwendet wird, bedeutet die gesamte Nucleinsäuresequenz oder die gesamte Aminosäuresequenz einer nativen (nicht-synthetischen) endogenen Sequenz aufweisend. Ein Volllängen-Polynucleotid codiert für die katalytisch aktive Volllängenform des spezifizierten Proteins.
Der Ausdruck "Antisense", der im Kontext einer Orientierung einer Nucleotidsequenz verwendet wird, bezieht sich, so wie er hierin verwendet wird, auf eine Doppelstrang-Polynucleotidsequenz, die funktionell mit einem Promotor in einer Orientierung verknüpft ist, in der der Antisense-Strang transkribiert wird. Der Antisense-Strang ist zu einem endogenen Transkriptionsprodukt ausreichend komplementär, so dass eine Translation des endogenen Transkriptionsprodukts oft inhibiert wird.
Die Ausdrücke "Polypeptid", "Peptid" und "Protein" werden hierin austauschbar verwendet, um ein Polymer aus Aminosäureresten zu bezeichnen. Die Ausdrücke finden auf Aminosäurepolymere Anwendung, in denen ein Aminosäurerest oder mehrere Aminosäurereste ein künstliches chemisches Analogon einer entsprechenden natürlich auftretenden Aminosäure ist/sind, wie auch auf natürlich vorkommende Aminosäurepolymere.
Die Ausdrücke "Rest" oder "Aminosäurerest" oder "Aminosäure" werden hierin austauschbar verwendet, um eine Aminosäure zu bezeichnen, die in ein Protein, Polypeptid oder Peptid (zusammengefasst "Protein") eingebaut wird. Die Aminosäure kann eine natürlich vorkommende Aminosäure sein und, wenn keine anderen Beschränkungen bestehen, können bekannte Analoga von natürlichen Aminosäuren, die in ähnlicher Weise fungieren, wie natürlich vorkommende Aminosäuren, mit umfasst werden.
Die Ausdrücke "isoliert" und "gereinigt", wie sie hier verwendet werden, werden austauschbar verwendet, um Nucleinsäuren oder Polypeptide oder einen biologisch aktiven Teil davon zu bezeichnen, die substantiell oder im Wesentlichen frei von Komponenten sind, die normalerweise mit der Nucleinsäure oder dem Polypeptid, wie es in seiner natürlich vorkommenden Umgebung gefunden wird, in Verbindung stehen oder wechselwirken. Somit ist eine isolierte oder gereinigte Nucleinsäure oder ein isoliertes oder gereinigtes Polypeptid im Wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder von Kulturmedium, wenn sie/es durch Rekombinationstechniken produziert wird, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn sie/es chemisch synthetisiert wird.
Der Ausdruck "Bekämpfung von Insektenschädlingen" bzw. "Bekämpfen von Insektenschädlingen", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf die Bewirkung von Veränderungen beim Insektenfraß, -wachstum und/oder -verhalten in einer beliebigen Entwicklungsstufe, einschließlich, aber nicht beschränkt, auf ein Abtöten des Insekts, Verzögern des Wachstums, Verhindern seiner Vermehrungsfähigkeit und dergleichen.
Die Ausdrücke "pestizide Aktivität" und "insektizide Aktivität", wie sie hierin verwendet werden, werden synonym eingesetzt, um die Aktivität eines Organismus oder einer Substanz, z.B. eines Proteins, zu bezeichnen, die durch Schädlingsmortalität, Schädlingsgewichtsverlust, Schädlingsanziehung, Schädlingsabstoßung und andere Verhaltensänderungen und physikalischen Änderungen eines Schädlings nach Fraß und Behandlung für einen angemessenen Zeitraum, gemessen werden können, allerdings besteht keine Beschränkung darauf. Beispielsweise sind "pestizide Proteine" Proteine, die pestizide Aktivität an sich oder in Kombination mit anderen Proteinen zeigen.
Der Ausdruck "pestizid wirksame Menge" suggeriert eine Menge einer Substanz oder eines Organismus, die/der pestizide Aktivität hat, wenn sie/er in der Umgebung eines Schädlings ist. Für jede Substanz oder jeden Organismus wird die pestizid wirksame Menge empirisch für jeden Schädling, der in einer spezifischen Umgebung geschädigt wird, bestimmt. Ähnlich kann der Ausdruck "insektizid wirksame Menge" verwendet werden, um eine "pestizid wirksame Menge" zu bezeichnen, wenn der Schädling ein Insektenschädling ist.
Der Ausdruck "rekombinant genetisch verändert", wie er hierin verwendet wird, legt die Verwendung der DNA-Rekombinationstechnologie nahe, um eine Änderung in der Proteinstruktur einzuführen (z.B. gentechnisch einzuführen), die auf dem Verständnis des Wirkmechanismus und der Betrachtung der Aminosäuren, die eingeführt, deletiert oder substituiert werden, basiert.
Der Ausdruck "mutagenisierte Nucleotidsequenz", wie er hier verwendet wird, bezeichnet eine Nucleotidsequenz, die so mutagenisiert oder verändert wurde, dass sie einen Nucleotidrest oder mehrere Nucleotidreste (z.B. Basenpaar) enthält, der/die in der entsprechenden Wildtyp-Sequenz nicht vorliegen, und der/die für ein mutantes δ-Endotoxin codiert, das verbesserte insektizide Aktivität zeigt.
Der Ausdruck "verbesserte insektizide Aktivität", wie er hierin verwendet wird, charakterisiert ein δ-Endotoxin der Erfindung, das im Vergleich zu der Aktivität seines entsprechenden Wildtyp-Proteins verstärkte pestizide Aktivität gegen Coleopteran hat, und/oder ein Endotoxin, das entweder gegen einen breiteren Bereich von Insekten wirksam ist oder eine Spezifität für ein Insekt erwirbt, das gegenüber der Toxizität des Wildtyp-Proteins nicht empfindlich ist. Die Feststellung einer erhöhten pestiziden Aktivität erfordert einen Beweis einer Erhöhung der Toxizität von wenigstens 30% gegen das Zielinsekt und bevorzugter von 35%, 40%, 45% oder 50% im Vergleich zur insektiziden Aktivität des Wildtyp-Endotoxins, die gegen dasselbe Insekt bestimmt wird.
Einheiten, Präfixe und Symbole können in ihrer SI-akzeptierten Form angegeben werden.
Wenn nichts Anderes angegeben wird, werden Nucleinsäuren von links nach rechts in 5'- zu 3'-Orientierung angegeben; Aminosäuresequenzen werden von links nach rechts in Amino-zu-Carboxy-Orientierung geschrieben. Numerische Bereiche sind einschließlich der Zahlen, die den Bereich definieren. Aminosäuren können hierin entweder durch ihre allgemein bekannten Drei-Buchstaben-Symbole oder durch die Ein-Buchstaben-Symbole, die von der IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission empfohlen sind, bezeichnet werden. Nucleotide können entsprechend durch ihre allgemein anerkannten Ein-Buchstaben-Codes angegeben werden. Die oben definierten Ausdrücke werden anhand der Beschreibung als Ganzes vollständiger definiert.
Die Nucleotidsequenzen der Erfindung können verwendet werden, um einen Organismus zu transformieren, damit er die codierten pestiziden Proteine produziert. Es werden Verfahren bereitgestellt, die die Verwendung von solchen transformierten Organismen involvieren, um Pflanzenschädlinge zu bekämpfen oder zu kontrollieren. Die Erfindung bezieht sich außerdem auf die Identifizierung von Fragmenten und Varianten der natürlich auftretenden codierenden Sequenz, die für biologisch aktive pestizide Proteine codieren. Alle Nucleotidsequenzen der Erfindung finden direkte Verwendung in Verfahren zur Bekämpfung von Schäd lingen, insbesondere Insektenschädlingen, in noch besonderer Weise von Schädlingen der Art Coleopteran, einschließlich z.B. des Colorado-Kartoffelkäfers, des Western Corn Rootworms und des Southern Corn Rootworms. Dementsprechend stellt die Erfindung neue Ansätze zur Bekämpfung von Insektenschädlingen bereit, die nicht von der Verwendung traditioneller, synthetischer, chemischer Insektizide abhängen. Die Erfindung involviert die Entdeckung natürlich vorkommender, biologisch abbaubarer Pestizide und der Gene, die sie codieren.
Die Erfindung stellt ferner Fragmente und Varianten der natürlich vorkommenden codierenden Sequenzen bereit, die auch biologisch aktive (z.B. pestizide) Polypeptide codieren. Die Nucleinsäuren der Erfindung umfassen Nucleinsäuresequenzen, die zur Expression durch die Zellen eines bestimmten Organismus optimiert wurden, z.B. Nucleinsäuresequenzen, die unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter Codons auf der Basis der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das verstärkte pestizide Aktivität hat, zurück translatiert wurden.
Die Nucleotidsequenzen der Erfindung wurden aus Stämmen des Bakteriums Bacillus thuringiensis isoliert. Es wurde entdeckt, dass rohe Lysate, die aus Kulturen der Stämme hergestellt worden waren, pestizide Aktivität gegen Colorado-Kartoffelkäfer, Western Corn Rootworm und Southern Corn Rootworm haben. Kristallproteine wurden aus Kulturen der Stämme isoliert. Die isolierten Kristallproteine wurden in Insektenfütterungsassays auf pestizide Aktivität getestet. Die Resultate dieser Assays zeigten, dass die isolierten Kristallproteine pestizide Aktivität gegen Coleopteran besaßen. Es wurden Anstrengungen unternommen, um Nucleotidsequenzen, die Kristallproteine codieren, aus den Stämmen zu identifizieren, und es wurden die natürlich auftretenden codierenden Sequenzen und genomischen Nucleinsäuren der Erfindung entdeckt.
Es wurde bewiesen, dass die Nucleotidsequenzen der isolierten Nucleinsäuren für pestizide Proteine codieren, indem Escherichia coli mit solchen Nucleotidsequenzen transformiert wurde. Lysate, die aus dem transformierten E. coli hergestellt worden waren, hatten in Fütterungsassays pestizide Aktivität gegen Corn Rootworms (Maiswurzelbohrer) und Colorado-Kartoffelkäfer, was beweist, dass die isolierten Nucleotidsequenzen der Erfindung für pestizide Proteine codieren. In Abhängigkeit von den Charakteristika einer gegebenen Lysatpräparation wurde erkannt, dass der Beweis einer pestiziden Aktivität manchmal eine Trypsinvorbehandlung erforderte, um die pestiziden Proteine zu aktivieren.
Anschließend wurden Nucleinsäure-Varianten und -Fragmente, die für biologisch aktive pestizide Polypeptide codieren, identifiziert. Einige der codierten pestiziden Proteine erfordern eine Protease-Aktivierung (z.B. Trypsin), und es wurde beobachtet, dass andere Proteine bei Fehlen einer Aktivierung biologisch aktiv sind (z.B. pestizid). In einigen Ausführungsformen codiert die Nucleinsäure für eine trunkierte Version des natürlich auftretenden Polypeptids und als solche kann sie entweder als Variante oder Fragment klassifiziert werden. Außerdem wurde eine zweite Generation an Nucleinsäuresequenzen gentechnisch verändert, damit sie Nucleotidsequenzen umfassen, die für Cry8-artige Polypeptide codieren, die durch verbesserte oder veränderte pestizide Aktivität im Vergleich zu der pestiziden Aktivität der natürlich vorkommenden Polypeptide gekennzeichnet sind.
Die Nucleinsäuren der Erfindung umfassen isolierte Polynucleotide und Varianten und Fragmente davon, die biologisch aktive (z.B. pestizide) Polypeptide codieren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, die Cry8-artige Nucleotidsequenzen, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 28, 29, 31, 33, 39, 41, 43 und 45 angegeben sind. Die hierin offenbarten Nucleotidsequenzen stellen zwei Hintergrundsequenzen bereit, die hierin als 1218-1 und 49PVD bezeichnet sind, in die Mutationen eingeführt sind. In einigen Fällen stellen die Sequenzen auch Varianten von zwei unterschiedlichen Klonen bereit, die als 1218-1 und 1218-2 bezeichnet werden. Spezifischer stellt SEQ ID NO: 15 (1218-1A) eine Variante von SEQ ID NO: 5 dar, wobei jede von diesen alternative Ausführungsformen des 1218-1-Klons darstellen. Außerdem stellt SEQ ID NO: 17 (1218-2A) eine Variante von SEQ ID NO: 7 dar, von denen jede alternative Ausführungsformen des 1218-2-Klons darstellt.
Die Polynucleotide der Erfindung umfassen auch eine synthetische oder rekombinante Nucleotidsequenz, die für ein pestizides Polypeptid codiert, das die in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 und 46 angegebene Aminosäuresequenzen umfasst.
Eine "isolierte" Nucleinsäure ist frei von Sequenzen (vorzugsweise Proteincodierenden Sequenzen), die natürlicher Weise die Nucleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nucleinsäure stammt, flankieren (d.h. Sequenzen, die an den 5'- und 3'-Enden der Nucleinsäure lokalisiert sind). In verschiedenen Ausführungsformen können die isolierten Nucleinsäuren z.B. weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nucleotidsequenzen enthalten, die natürlicher Weise die Nucleinsäuren in der genomischen DNA der Zelle flankieren, aus welcher die Nucleinsäure stammt.
Die vorliegende Erfindung stellt isolierte Nucleinsäuren bereit, die Nucleotidsequenzen umfassen, die für die Aminosäuresequenzen codieren, welche in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 und 46 codieren. In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung Nucleinsäuren bereit, wie die Nucleotidsequenzen umfassen, die in SEQ ID NO: 1 (Cry1218-1 CDS) und 3 (Cry1218-2 CDS) angegeben sind, die Mais-optimierte Nucleinsäure, die in SEQ ID NO: 9 (mo1218-1) angegeben ist und die nativen genomischen Sequenzen, die in SEQ ID NO: 27 (genomisches Cry1218-1) und SEQ ID NO: 28 (genomisches Cry1218-2) angegeben sind. Die codierende Sequenz (CDS) für SEQ ID NO: 27 läuft ab Basenpaar 731–4348. Die CDS für SEQ ID NO: 28 läuft ab Basenpaar 1254–4883. Plasmide, die jede dieser fünf Nucleinsäuren umfassen, wurden am 05. Mai 2000 und am 20. Oktober 2000 bei der Patent Depository of the American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginia hinterlegt und den Patent-Hinterlegungsnummern PTA-1821 (entspricht SEQ ID NO: 1); PTA-1817 (entspricht SEQ ID NO: 3); PTA-2635 (entspricht SEQ ID NO: 9); PTA-2634 (umfasst SEQ ID NO: 27) und PTA-2636 (umfasst SEQ ID NO: 28) zugeordnet.
Die Patent-Hinterlegungen PTA-1821 und PTA-1817 umfassen ein Gemisch aus zwei Klonen, von denen jeder ein Teil der gesamten codierenden Sequenz enthält. Spezifischer ausgedrückt, die hinterlegten Plasmide codieren für Nucleinsäuremoleküle, die in einen TA-Vektor kloniert waren (Invitrogen, Carlsbad, CA), die für zwei überlappende Fragmente der codierenden Sequenz codieren. Die codierende Volllängensequenz kann unter Verwendung einer überlappenden PCR-Strategie produziert werden. Eine erste PCR-Reaktion sollte Vorwärts- und Rückwärtsprimer umfassen, die so konzipiert sind, dass sie den 5'- und den 3'-Enden der codierenden Volllängensequenz entsprechen. Geeignete Primer zur Verwendung in PCR-Reaktionen sind in SEQ ID NO: 35 bis 38 angegeben. Spezifischer ausgedrückt, SEQ ID NO: 35 und 36 stellen einen ersten Primersatz "(a)" bereit, der einen Vorwärtsprimer SEQ ID NO: 35 (5'-ATGAGTCCAAATAATCAAAATG) und einen Rückwärtsprimer SEQ ID NO: 36 (5'-CCGCTTCTAAATCTTGTTCC) für das 5'-Ende der codierenden Sequenz umfasst. SEQ ID NO: 37 und 38 stellen einen zweiten Primersatz "(b)" bereit, der einen Vorwärtsprimer SEQ ID NO: 37 (5'-GGAACAAGATTTAGAGG) und einen Rückwärtsprimer SEQ ID NO: 38 (5'-CTCATCGTCTACAATCAATTCATC) für das 3'-Ende der codierenden Sequenz umfasst. Die zwei DNA-Banden, die durch die erste PCR-Reaktion erzeugt werden, welche mit den oben identifizierten Primersätzen durchgeführt wird, sollten gereinigt werden, und es sollte eine zweite PCR-Runde, ein Satz für sieben Zyklen, durchgeführt werden, wobei die gereinigte DNA, die aus der ersten PCR-Reaktion isoliert wurde, in Abwesenheit von Primern verwendet wird. Das 3'-Ende der Nucleinsäure, die durch Primersatz (a) erzeugt wurde, und das 5'-Ende der Nucleinsäure, die durch Primersatz (b) erzeugt wurde, werden überlappen und die Erzeugung einer codierenden Volllängensequenz auslösen. Eine dritte und abschließende PCR-Reaktion wird durchgeführt, um die codierende Volllängensequenz zu erzeugen. Diese Reaktion wird unter Verwendung von 1 μl des zweiten PCR-Reaktionsproduktes, und eines Primersatz, der SEQ ID NO: 35 (Vorwärtsprimer von Satz (a)) und SEQ ID NO: 39 (Rückwärtsprimer von Satz (b)) umfasst, durchgeführt.
Die oben genannten Hinterlegungen (z.B. PTA-1821; PTA-1817; PTA-2635; PTA-2634 und PTA-2636) werden unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zu Zwecken des Patentverfahrens gehalten. Diese Hinterlegungen wurden lediglich aus praktischen Erwägungen für Fachleute auf diesem Gebiet durchgeführt und sind kein Zugeständnis, dass eine Hinterlegung gemäß 35 U.S.C. § 112 erforderlich ist.
Von besonderem Interesse sind optimierte Nucleotidsequenzen, die für die pestiziden Proteine der Erfindung codieren. Der Ausdruck "optimierte Nucleotidsequenzen", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Nucleinsäuren, die zur Expression in einem bestimmten Organismus, z.B. einer Pflanze, optimiert sind. Optimierte Nucleotidsequenzen können für einen beliebigen Organismus von Interesse unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, hergestellt werden. Beispielsweise offenbart SEQ ID NO: 9 eine optimierte Nucleinsäuresequenz, die für das pestizide Protein, das in SEQ ID NO: 16 angegeben wird (trunkiertes 1218-1A), codiert. Spezifischer wurde die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 9, die die meist bevorzugten Codons SEQ ID NO: 9 umfasst, durch Umkehrtranslatieren der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 16 angegeben ist, hergestellt, so dass sie meist bevorzugte Codons umfasst, wie es von Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477–498 beschrieben ist. Eine optimierte Nucleotidsequenz findet bei der Verstärkung der Expression eines pestiziden Proteins in einer Pflanze, insbesondere in einer monokotylen Pflanze, bevorzugter einer Pflanze der Familie der Gramineae (Poaceae), am bevorzugtesten einer Mais- oder Kornpflanze, Verwendung.
Die Erfindung stellt ferner isolierte pestizide (z.B. insektizide) Polypeptide bereit, die entweder durch eine natürlich vorkommende oder modifizierte (z.B. mutagenisierte oder trunkierte) Nucleinsäure der Erfindung codiert werden. Spezifischer stellt die Erfindung Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 und 46 angegeben ist, und die Polypeptide, die durch Nucleinsäuren codiert werden, die hierin beschrieben werden, z.B. solche, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 15, 17, 19, 21, 23, 27, 28, 29, 31, 33, 39, 41, 43 und 45 angegeben sind, und Fragmente und Varianten davon bereit.
In bestimmten Ausführungsformen stellen pestizide Proteine der Erfindung Volllängen-δ-Endotoxinproteine, Fragmente von Volllängen-δ-Endotoxinen und Varianten-Polypeptide bereit, die aus mutagenisierten Nucleinsäuren produziert werden, die so konzipiert sind, dass sie bestimmte Aminosäuresequenzen in Polypeptide der Erfindung einführen. In bestimmten Ausführungsformen umfassen die Aminosäuresequenzen, die in die Polypeptide eingeführt werden, eine Sequenz, die eine Spaltungsstelle für ein Enzym oder eine Protease bereitstellt.
Einige der Polypeptide der Erfindung, z.B. SEQ ID NO: 2 und 4, umfassen Volllängen-δ-Endotoxine; andere Polypeptide, z.B. SEQ ID NO: 6, 8, 10, 16, 18 und 20 stellen Fragmente eines Volllängen-δ-Endotoxins dar; und SEQ ID NO: 12, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 und 46 stellen Polypeptidvarianten bereit. Einige der Polypeptidfragmente und -Varianten der Erfindung haben im Vergleich zu der Aktivität des natürlich vorkommenden δ-Endotoxins, von dem sie abgeleitet sind, eine verstärkte pestizide Aktivität, insbesondere in Abwesenheit einer in vitro-Aktivierung des Endotoxins mit einer Protease vor einem Screening auf Aktivität. Insbesondere zeigen die hierin in Tabelle 1 von Beispiel 6 angegebenen Daten, dass die NGRS-Additionsmutante (SEQ ID NO: 12) von SEQ ID NO: 16 (trunkiertes 1218-1A-Endotoxin) durch erhöhte pestizide Aktivität gegen den Colorado-Kartoffelkäfer gekennzeichnet ist.
SEQ ID NO: 6, 10, 16 und 20 stellen Polypeptide bereit, die trunkierte Versionen des 1218-1-Polypeptids, das in SEQ ID NO: 2 angegeben ist, darstellen. SEQ ID NO: 16 stellt eine Variante, die hierin als 1218-1A bezeichnet wird, des Polypeptids bereit, das in SEQ ID NO: 6 angegeben ist und hierin als 1218-1 bezeichnet wird. Drei der oben erwähnten Sequenzen, SEQ ID NO: 6, 10 und 16, stellen ein Polypeptid dar, das am 3'-Ende der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 2 angegeben ist, verkürzt (trunkiert) ist. Im Gegensatz dazu stellt die vierte Polypeptidvariante, die in SEQ ID NO: 20 angegeben ist, eine Variante bereit, die sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende des Volllängenproteins, das in SEQ ID NO: 2 angegeben ist, trunkiert ist. SEQ ID NO: 8 und 18 (1218-2 bzw. 1218-2A) stellen Polypeptide bereit, die trunkierte Versionen der in SEQ ID NO: 4 angegebenen Polypeptide darstellen. Jedes dieser zwei Polypeptide stellt ein Protein bereit, das am 3'-Ende des 1218-2-Volllängenpolypeptids, das in SEQ ID NO: 4 angegeben ist, trunkiert ist.
SEQ ID NO: 12, 22, 24, 40 und 44 stellen eine Familie von Polypeptiden bereit, die Varianten der trunkierten 1218-1A-Polypeptide, die in SEQ ID NO: 16 angegeben sind, verkörpern, somit stellen SEQ ID NO: 12, 22, 24, 40 und 44 Varianten (oder Mutanten) des biologisch aktiven Fragments des Cry8-artigen Polypeptids, das in SEQ ID NO: 2 angegeben ist, bereit. Spezifischer ausgedrückt, SEQ ID NO: 12 stellt eine Mutante bereit, die hierin als NGSR.N1218-1 bezeichnet wird, die eine zusätzliche Trypsin-empfindliche Spaltungsstelle umfasst; SEQ ID NO: 22 stellt eine zweite Mutante bereit, die hierin als LKMS.N1218-1 bezeichnet wird, die eine Chymotrypsin-empfindliche Spaltungsstelle umfasst, die im 1218-1- oder 1218-1A-Wildtyp-Polypeptid nicht vorliegt; und SEQ ID NO: 24 stellt eine Ersatzmutante bereit, die hierin als LKMS.R1218-1 bezeichnet wird, in der eine existierende Trypsinspaltstelle zerstört ist und eine Chymotrypsinstelle an ihrer Stelle eingeführt ist. SEQ ID NO: 40 stellt eine zweite Chymotrypsin-Additionsmutante bereit, die hierin als LRMS.N1218-1 bezeichnet wird, die die alternative Chymotrypsinspaltungsstelle LRMS umfasst (SEQ ID NO: 48). SEQ ID NO: 44 stellt eine zweite Ersatz- oder Substitutionsmutante bereit, die hierin als LRMS.R1218-1 bezeichnet wird, in der die native Trypsinstelle durch die Chymotrypsinspaltstelle LRMS ersetzt ist.
SEQ ID NO: 30, 32, 34, 42 und 46 stellen eine zweite Familie von Polypeptiden bereit, die Varianten oder Mutanten des trunkierten Polypeptids, das in SEQ ID NO: 20 angegeben ist, verkörpern. Somit stellen SEQ ID NO: 30, 32, 34, 42 und 46 Varianten des pestiziden Fragments von SEQ ID NO: 2, das in SEQ ID NO: 20 angegeben ist, bereit. Spezifischer, SEQ ID NO: 30 stellt eine Mutante bereit, die hierin als NGSR.N49PVD bezeichnet wird, die eine zusätzliche Trypsin-empfindliche Spaltstelle umfasst; SEQ ID NO: 32 stellt eine zweite Mutante bereit, die hierin als LKMS.N49PVD bezeichnet wird, die eine Chymotrypsin-empfindliche Spaltungsstelle umfasst, die im Wildtyp-1218-1- oder -1218-1A-Polypeptid nicht vorhanden ist; und SEQ ID NO: 34 stellt eine Ersatzmutante bereit, die hierin als LKMS.R49PVD bezeichnet wird, in der eine existierende Trypsin-Spaltstelle zerstört ist und eine Chymotrypsinstelle an ihrer Stelle eingeführt ist. SEQ ID NO: 42 stellt eine zweite Chymotrypsin-Additionsmutante bereit, die hierin als LRMS.N49PVD bezeichnet wird, welche eine alternative Chymotrypsin-Spaltstelle LRMS (SEQ ID NO: 48) umfasst. SEQ ID NO: 46 (LRMS.R49PVD) stellt eine zweite Ersatz- oder Substitutionsmutante bereit, in der die native Trypsinstelle durch die Chymotrypsin-Spaltstelle LRMS ersetzt ist.
Es ist einzusehen, dass die Polypeptide der Erfindung entweder durch Expression einer hierin offenbarten Nucleinsäure oder durch die Verwendung von Standardmolekularbiologie-Techniken produziert werden können. Beispielsweise kann ein trunkiertes Protein der Erfindung durch Expression einer rekombinanten Nucleinsäure der Erfindung in einer geeigneten Wirtszelle oder alternativ durch eine Kombination von ex vivo-Verfahren, z.B. Proteaseverdau und Reinigung eines gereinigten Wildtyp-Proteins produziert werden.
Der Ausdruck "isoliert" oder "gereinigt", wie er hier unter Bezugnahme auf ein Polypeptid der Erfindung verwendet wird, bedeutet, dass das isolierte Protein im Wesentlichen frei von zellulärem Material ist und beinhaltet Proteinpräparationen, die weniger als etwa 30%, 20%, 10% oder 5% (als Trockengewicht) an kontaminierendem Protein haben. Wenn das Protein der Erfindung oder ein biologischer Teil davon rekombinant produziert wird, stellt das Kulturmedium weniger als etwa 30%, 20%, 10% oder 5% (als Trockengewicht) an chemischen Vorläufern und Chemikalien, die nicht das Protein von Interesse sind, dar.
Es wird erkannt, dass die pestiziden Proteine oligomer sein können und bezüglich Molekulargewicht, Anzahl der Reste, Peptidkomponenten, Aktivität gegen bestimmte Schädlinge und in anderen Charakteristika variieren werden. Allerdings können durch die hierin ausgeführten Verfahren Proteine, die gegen eine Vielzahl von Schädlingen aktiv sind, isoliert und charakterisiert werden. Die pestiziden Proteine der Erfindung können in Kombination mit Bt-Endotoxinen oder anderen insektiziden Proteinen eingesetzt werden, um den Insektenzielbereich zu erhöhen. Darüber hinaus hat die Verwendung der pestiziden Proteine der Erfindung in Kombination mit Bt-δ-Endotoxinen oder anderen insektiziden Wirkstoffen einer unterschiedlichen Natur besondere Nützlichkeit für die Prävention und/oder Behandlung von Insektenresistenz. Andere insektizide Wirkstoffe umfassen Proteaseinhibitoren (sowohl Serin- als auch Cystein-Typ), Lectine, α-Amylase und Peroxidase.
Fragmente und Varianten der Nucleotid- und Aminosäuresequenzen und der Polypeptide, die dadurch codiert werden, werden von der vorliegenden Erfindung mit umfasst. Der Ausdruck "Fragment", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf einen Teil einer Nucleotidsequenz eines Polynucleotids oder einen Teil einer Aminosäuresequenz eines Polypeptids der Erfindung. Fragmente einer Nucleotidsequenz können für Proteinfragmente codieren, die die biologische Aktivität des nativen Proteins beibehalten und daher pestizide Aktivität besit zen. Demnach ist es anerkannt, dass einige der Polynucleotid- und Aminosäuresequenzen der Erfindung korrekt als Fragmente und Varianten bezeichnet werden. Dies gilt insbesondere für trunkierte Sequenzen, die biologisch aktiv sind.
Es ist einzusehen, dass der Ausdruck "Fragment", wie er hier verwendet wird, um Nucleinsäuresequenzen der Erfindung zu bezeichnen, auch Sequenzen umfasst, die als Hybridisierungssonden nützlich sind. Diese Klasse von Nucleotidsequenzen codiert im Allgemeinen keine Fragmentproteine, die biologische Aktivität beibehalten. Somit können Fragmente einer Nucleotidsequenz von wenigstens etwa 20 Nucleotiden, etwa 50 Nucleotiden, etwa 100 Nucleotiden bis zur Volllängennucleotidsequenz, die die Proteine der Erfindung codiert, reichen.
Ein Fragment einer Cry8-artigen Nucleotidsequenz, die für einen biologisch aktiven Teil eines pestiziden Proteins der Erfindung codiert, wird für wenigstens 15, 20, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1.000, 1.100 oder 1.200 fortlaufender Aminosäuren oder bis zur Gesamtzahl der Aminosäuren, die in einem pestiziden Polypeptid der Erfindung vorliegen, codieren (z.B. 1.206, 1.210, 667, 667 und 669 Aminosäuren für SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8 bzw. 10). Fragmente einer Cry8-artigen Nucleotidsequenz, die als Hybridisierungssonden oder PCR-Primer einsetzbar sind, brauchen im Allgemeinen nicht für einen biologisch aktiven Teil eines Pestizidproteins zu codieren.
Somit kann ein Fragment einer Cry8-artigen Nucleinsäure für einen biologisch aktiven Teil eines pestiziden Proteins codieren oder kann ein Fragment sein, das als Hybridisierungssonde oder PCR-Primer unter Verwendung der unten offenbarten Verfahren eingesetzt werden kann. Ein biologisch aktiver Teil eines pestiziden Proteins kann hergestellt werden, indem ein Teil einer der Cry8-artigen Nucleotidsequenzen der Erfindung isoliert wird, der codierte Teil des pestiziden Proteins (z.B. durch rekombinante Expression in vitro) exprimiert wird und die Aktivität des codierten Teils des pestiziden Proteins beurteilt wird.
Nucleinsäuren, die Fragmente einer Cry8-artigen Nucleotidsequenz sind, umfassen wenigstens 16, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, 1.000, 1.204, 1.400, 1.600, 1.800, 2.000, 2.200, 2.400, 2.600, 2.800, 3.000, 3.200, 3.400. oder 3.600 Nucleotide oder bis zu der Anzahl der Nucleotide, die in einer Cry8-artigen Nucleotidsequenz, die hierin offenbart ist, vorliegen (z.B. 3.621, 3.633, 2.003, 2.003, 2.010 und 2.010 und 2.022 Nucleotide für SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15 bzw. 17).
Beispielsweise stellen SEQ ID NO: 5, 9, 15 und 19 Fragmente von SEQ ID NO: 1 dar, und SEQ ID NO: 7 und 17 stellen Fragmente von SEQ ID NO: 3 dar. Spezifischer ausgedrückt, bestimmte Ausführungsformen der Nucleinsäuren der Erfindung offenbaren Fragmente, die von einer ersten Nucleinsäure der Erfindung abgeleitet sind (z.B. daraus produziert sind), worin das Fragment für ein trunkiertes Cry8-artiges Endotoxin codiert, das durch pestizide Aktivität gekennzeichnet ist. Das trunkierte Polypeptid, das durch die Polynucleotidfragmente der Erfindung codiert wird, ist durch pestizide Aktivität gekennzeichnet, die im Vergleich zu der Aktivität des entsprechenden Volllängenpolypeptids, das durch die erste Nucleinsäure, aus der das Fragment stammt, codiert wird, entweder gleich oder verbessert.
In spezifischen Ausführungsformen sind einige der Nucleinsäurefragmente der Erfindung am 3'-Ende der Wildtyp-codierenden Sequenz trunkiert. Beispielsweise stellen SEQ ID NO: 5 und 15 Fragmente von SEQ ID NO: 1 dar, die am 3'-Ende trunkiert sind. In einer alternativen Ausführungsform umfasst eines der Polynucleotide der Erfindung, SEQ ID NO: 19, eine Nucleinsäuresequenz, die sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende der trunkierten 1218-1- und 1218-1A-Toxindomäne, die durch SEQ ID NO: 5 bzw. 15 codiert wird, trunkiert ist.
Als "Varianten" sind im Wesentlichen ähnliche Sequenzen gemeint. Für Nucleotidsequenzen umfassen konservative Varianten solche Sequenzen, die wegen der Degeneriertheit des genetischen Codes die Aminosäuresequenz eines der pestiziden Polypeptide der Erfindung codieren. Natürlich auftretende Allelvarianten wie diese können durch die Verwendung gut bekannter Techniken der Molekularbiologie, wie z.B. durch Polymerasekettenreaktion (PCR) und Hybridisierungstechniken, wie es unten ausgeführt wird, identifiziert werden.
Varianten-Nucleotidsequenzen umfassen auch synthetisch abgeleitete Nucleotidsequenzen, z.B. solche, die beispielsweise unter Verwendung einer ortsspezifischen Mutagenese erzeugt werden, die aber noch für ein pestizides Protein der Erfindung codieren. Im Allgemeinen werden Varianten einer bestimmten Nucleotidsequenz der Erfindung wenigstens etwa 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, im Allgemeinen wenigstens 75%, 80%, 85%, vorzugsweise wenigstens etwa 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% und bevorzugter wenigstens etwa 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität zu der bestimmten Nucleotidsequenz haben, wie es durch Sequenzanordnungsprogramme bestimmt wird, die an anderer Stelle hierin beschrieben werden, wobei Defaut-Parameter eingesetzt werden.
Der hierin verwendete Ausdruck "variantes Protein" bzw. "Varianten-Protein" umfasst Polypeptide, die von einem nativen Protein durch Deletion (sogenannte Trunkation) oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren am N-terminalen und/oder C-terminalen Ende des nativen Proteins; durch Deletion oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen im nativen Protein; oder durch Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren an einer oder mehreren Stellen im nativen Protein abgeleitet sind. Dementsprechend umfasst der Ausdruck Varianten-Protein bzw. variantes Protein biologisch aktive Fragmente eines nativen Proteins, das eine ausreichende Anzahl von fortlautenden Aminosäureresten umfasst, um die biologische Aktivität des nativen Proteins beizubehalten.
Varianten-Proteine, die von der vorliegenden Erfindung umfasst werden, sind dadurch biologisch aktiv, dass sie die gewünschte biologische Aktivität des nativen Proteins weiterhin besitzen, d.h. die pestizide Aktivität, wie sie hierin beschrieben ist. Solche Varianten können z.B. aus genetischem Polymorphismus oder aus menschlicher Manipulation resultieren. Biologisch aktive Varianten eines nativen pestiziden Proteins der Erfindung werden wenigstens etwa 40%, 50%, 60%, 65%, 70%, im Allgemeinen wenigstens etwa 75%, 80%, 85%, vorzugsweise wenigstens etwa 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% und bevorzugter wenigstens etwa 98%, 99% oder mehr Sequenzidentität mit der Aminosäuresequenz für das native Protein haben, wie es durch Sequenzanordnungsprogramme unter Verwendung von Defaut-Parametern bestimmt wird, was hier noch an anderer Stelle beschrieben wird. Eine biologisch aktive Variante eines Proteins der Erfindung kann sich von diesem Protein um so wenige wie 1 bis 15 Aminosäurereste, so wenige wie 1 bis 10, z.B. 6 bis 10, so wenige wie 5, so wenige wie 4, 3, 2 Aminosäurereste oder sogar nur um einen Aminosäurerest unterscheiden.
Es ist anerkannt, dass die Nucleinsäuresequenz irgendeines der Polynucleotide der Erfindung verändert oder mutagenisiert werden kann, um die biologische Aktivität und/oder Spezifität seines codierten pestiziden Polypeptids zu verändern (z.B. zu verbessern). Zum Beispiel stellt SEQ ID NO: 11 eine Cry8-artige Nucleotidsequenz bereit, die mutagenisiert wurde, um 12 zusätzliche Nucleotide zu umfassen (SEQ ID NO: 13), die in der Wildtyp-Nucleinsäuresequenz (SEQ ID NO: 15), die verändert wurde, nicht vorliegen. Die Nucleotidsequenz, die in die codierende Region von SEQ ID NO: 15 insertiert wurde, war so konzipiert, dass sie für eine NGRS-Additionsmutante codiert, die eine zusätzliche Trypsin-Spalt stelle (NGSR) (SEQ ID NO: 14) in der Aminosäuresequenz des codierten Polypeptids umfasst.
Spezifischer ausgedrückt, die in SEQ ID NO: 14 angegebene Aminosäuresequenz wurde zwischen Aminosäure 164 und 165 des Cry8-δ-Endotoxins, das in SEQ ID NO: 16 angegeben ist, eingeführt. Diese bestimmte Aminosäuresequenz wurde ausgewählt, da sie die endogene Sequenz, die im natürlich vorkommenden Volllängenprotein (SEQ ID NO: 2) vorliegt, verdoppelt und eine zweite Protease-empfindliche Stelle schafft. Spezifischer ausgedrückt, die Modifikation führt eine zweite Trypsin-artige Stelle ein. Es ist dem Fachmann gut bekannt, dass Trypsin-Bindungen unmittelbar C-terminal zu Aginin und Lysin spaltet. Wie hierin bewiesen wird, wird das rekombinant gentechnisch veränderte Protein (SEQ ID NO: 12), das durch SEQ ID NO: 11 codiert wird, durch eine verbesserte Aktivität gegen Coleopterans, insbesondere gegen Colorado-Kartoffelkäfer (siehe Beispiel 6, Tabelle 1), Southern Corn Rootworm (siehe Beispiel 7, Tabellen 2 bis 4 und 6) und Western Corn Rootworm (siehe Beispiel 7, Tabelle 5), gekennzeichnet.
SEQ ID NO: 21 stellt eine Cry8-artige Nucleotidsequenz dar, die mutagenisiert wurde, so dass sie 12 zusätzliche Nucleotide umfasste (SEQ ID NO: 25), die im Wildtyp-Endotoxin nicht vorhanden sind. Die insertierte Nucleotidsequenz war so konzipiert, dass sie eine LKMS-Additionsmutante codierte, die eine Chymotrypsin-Spaltstelle (LKMS) (SEQ ID NO: 26) in der Aminosäuresequenz des codierten Polypeptids umfasst. Spezifischer ausgedrückt, die LKMS-Additionsmutante (LKMS.N1218-1) umfasst ein Nucleotidsequenz-Insert, das die Aminosäuresequenz LKMS zwischen die Aminosäure 160 und 161 von SEQ ID NO: 6 einführt. Die LKMS-Ersatzmutante LKMS.R1218-1 umfasst ein Polypeptid, in dem die Aminosäuresequenz LKMS zwischen Aminosäure 160 und 161 von SEQ ID NO: 16 eingeführt ist und die Aminosäuren NGS aus den Aminosäurepositionen 161–163 von SEQ ID NO: 16 entfernt sind. Diese Modifikation entfernt eine Trypsinstelle und führt eine Chymotrypsinstelle ein. Chymotrypsin spaltet Bindungen unmittelbar dem C-Terminus zu Methionin.
Die LRMS-Additionsmutante (LRMS.N1218-1) und die Ersatzmutante (LRMS.R1218-1) stellen alternative Ausführungsformen von Peptiden bereit, die eine zusätzliche oder alternative Chymotrypsin-Spaltstelle umfassen, allerdings unterscheiden sich die LRMS-Mutanten in der spezifischen Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 48) und der Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 47), die verwendet wird, um die Chymotrypsin-Spaltstelle in die Nucleinsäuresequenz einzuführen, die für die mutanten Polypeptide codiert.
SEQ ID NO: 30 (NGSR.N49PVD), SEQ ID NO: 32 (LKMS.N49PVD), SEQ ID NO: 34 (LKMS.R49PVD), SEQ ID NO: 42 (LRMS.N49PVD) und SEQ ID NO: 46 (LRMS.R49PVD) stellen Mutanten des trunkierten pestiziden Polypeptids 49PVD bereit. Die Aminosäuresequenz von 49PVD wird in SEQ ID NO: 20 bereitgestellt. Das Grundkonzept dieser Polypeptide und ihre Nomenklatur folgen demselben Muster, das oben für das trunkierte 1218-1-Polypeptid diskutiert wird, und sie werden an anderer Stelle hierin vollständiger erläutert.
Es ist anerkannt, dass eine beliebige Nucleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenzen NGSR, LKMS oder LRMS codiert, verwendet werden kann und dass die genaue Identität der Codons, die verwendet werden, um eine beliebige dieser Spaltstellen in einen Varianten-Polypeptid einzuführen, in Abhängigkeit von der Verwendung variieren kann, d.h. von der Expression in einer bestimmten Pflanzenspecies. Es wird auch erkannt, dass eine beliebige der offenbarten Mutationen in eine beliebige Polynucleotidsequenz der Erfindung eingeführt werden kann, die die Codons für Aminosäurereste umfasst, die die native Trypsin-Spaltstelle bereitstellen, die zur Modifikation targetiert wird. Dementsprechend können Varianten entweder der Volllängenendotoxine oder von Fragmenten davon modifiziert werden, um zusätzliche oder alternative Spaltstellen zu enthalten; diese Ausführungsformen sollen vom Rahmen der Erfindung, die hierin offenbart und beansprucht wird, umfasst werden.
Die Erfindung umfasst außerdem einen Mikroorganismus, der mit wenigstens einer Nucleinsäure der Erfindung, mit einer Expressionskassette, die die Nucleinsäure umfasst, oder mit einem Vektor, der die Expressionskassette umfasst, transformiert ist. Vorzugsweise ist der Mikroorganismus einer, der sich auf Pflanzen vermehrt. Bevorzugter ist der Mikroorganismus ein Wurzeln besiedelndes Bakterium. Eine Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf ein verkapseltes pestizides Protein, das einen transformierten Mikroorganismus umfasst, der wenigstens ein pestizides Protein der Erfindung umfasst.
Die Erfindung stellt pestizide Zusammensetzungen bereit, die einen transformierten Organismus der Erfindung umfassen. Vorzugsweise ist der transformierte Mikroorganismus in der pestiziden Zusammensetzung in einer pestizid wirksamen Menge zusammen mit einem geeigneten Träger vorhanden. Die Erfindung umfasst auch pestizide Zusammensetzungen, die ein isoliertes Protein der Erfindung allein oder in Kombination mit einem transformierten Organismus der Erfindung und/oder ein eingekapseltes pestizides Protein der Erfindung in einer insektizid wirksamen Menge zusammen mit einem geeigneten Träger umfassen.
Die Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Erhöhung des Insektenzielbereichs bereit, in dem ein pestizides Protein der Erfindung in Kombination mit wenigstens einem zweiten pestiziden Protein, das sich vom pestiziden Protein der Erfindung unterscheidet, verwendet wird. Es kann ein beliebiges pestizides Protein, das auf dem Fachgebiet bekannt ist, in den Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche pestiziden Proteine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Bt-δ-Endotoxine, Proteaseinhibitoren, Lectine, α-Amylasen und Peroxidasen.
Die Erfindung umfasst transformierte oder transgene Pflanzen, die wenigstens eine Nucleotidsequenz der Erfindung umfassen. Vorzugsweise ist die Pflanze stabil mit einem Nucleotidkonstrukt transformiert, das wenigstens eine Nucleotidsequenz der Erfindung funktionell mit einem Promotor verknüpft, umfasst, der eine Expression in einer Pflanzenzelle steuert.
Die Ausdrücke "transformierte Pflanze" und "transgene Pflanze", wie sie hierin verwendet werden, beziehen sich auf eine Pflanze, die in ihrem Genom ein heterologes Polynucleotid umfasst. Im Allgemeinen ist das heterologe Polynucleotid stabil innerhalb des Genoms einer transgenen oder transformierten Pflanze integriert, so dass das Polynucleotid an nachfolgende Generationen übertragen wird. Das heterologe Polynucleotid kann allein oder als Teil einer rekombinanten Expressionkassette in das Genom integriert werden.
Es ist einzusehen, dass der Ausdruck "transgen", wie er hier verwendet wird, eine beliebige Zelle, Zelllinie, Callus, ein beliebiges Gewebe, einen beliebigen Pflanzenteil oder eine beliebige Pflanze beinhaltet, wobei der Genotyp davon durch Vorliegen von heterologer Nucleinsäure verändert wurde, einschließlich solcher transgenen Produkte, die anfänglich verändert wurden, wie auch solche, die durch sexuelle Kreuzungen oder asexuelle Vermehrung aus dem anfänglichen transgenen Produkt erzeugt wurden. Der Ausdruck "transgen", wie er hier verwendet wird, umfasst nicht die Veränderung des Genoms (chromosomales oder extrachromosomales) durch herkömmliche Pflanzenzüchtungsverfahren oder durch natürlich auftretende Ereignisse, z.B. zufällige Fremdbefruchtung, nicht-rekombinante Virus-Infektion, nicht-rekombinante Bakterien-Transformation, nicht-rekombinante Transposition oder spontane Mutation.
Der Ausdruck "Pflanze", wie er hierin verwendet wird, umfasst die Bezugnahme auf ganze Pflanzen, Pflanzenorgane (z.B. Blätter, Stengel, Wurzeln usw.), Samen und Pflanzenzellen und die Nachkommenschaft derselben. Teile von transgenen Pflanzen werden im Rah men der vorliegenden Erfindung so verstanden, dass sie z.B. Pflanzenzellen, Protoplasten, Gewebe, Callus, Embryos wie auch Blüten, Stengel, Früchte, Blätter, Wurzeln, die von transgenen Pflanzen oder deren Nachkommenschaft stammen, welche vorher mit einem DNA-Molekül der Erfindung transformiert wurden, und daher wenigstens teilweise aus transgenen Zellen bestehen, sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Der Ausdruck "Pflanzenzelle", wie er hierin verwendet wird, umfasst ohne Beschränkung Samensuspensionskulturen, Embryos, Meristembereiche, Callusgewebe, Blätter, Wurzeln, Schößlinge, Gametophyten, Sporophyten, Pollen und Mikrosporen. Die Klasse von Pflanzen, die in den Verfahren der Erfindung eingesetzt werden kann, ist im Allgemeinen so breit wie die Klasse höherer Pflanzen, die Transformationstechniken zugänglich ist, einschließlich monokotyler und dikotyler Pflanzen. Eine bevorzugte Pflanze ist Solanum tuberosum. Eine besonders bevorzugte Pflanze ist Zea mays.
Obgleich die Erfindung nicht von einem bestimmten geologischen Mechanismus zur Erhöhung der Resistenz einer Pflanze gegenüber einem Pflanzenschädling abhängt, kann eine Expression der Nucleotidsequenzen der Erfindung in einer Pflanze zur Produktion von pestiziden Proteinen der Erfindung und in einer Erhöhung der Resistenz der Pflanze gegenüber einem Pflanzenschädling resultieren. Die Pflanzen der Erfindung finden in der Landwirtschaft bei Verfahren zur Bekämpfung von Insektenschädlingen Verwendung. Bestimmte Ausführungsformen der Erfindung stellen transformierte Maispflanzen bereit, die in Verfahren zur Bekämpfung von Western und Southern Corn Rootworms Verwendung finden. Eine andere Ausführungsform der Erfindung stellt transformierte Kartoffelpflanzen bereit, die in Verfahren zur Bekämpfung des Colorado-Kartoffelkäfers Anwendung finden.
Ein Fachmann auf diesem Gebiet wird leicht erkennen, dass Fortschritte auf dem Gebiet der Molekularbiologie, z.B. ortsspezifische und statistische Mutagenese, Polymerasekettenreaktions-Methodologien und Proteingentechniken eine ausgedehnte Sammlung von Werkzeugen und Protokollen bereitstellen, die zur Verwendung zur Veränderung oder gentechnischen Manipulation sowohl der Aminosäuresequenz als auch dieser zugrundeliegenden genetischen Sequenzen von Proteinen von landwirtschaftlichem Interesse geeignet sind. Somit können Cry8-artige Proteine der Erfindung auf verschiedenen Wegen, einschließlich Aminosäuresubstitutionen, -deletionen, -verkürzungen und -insertionen, verändert werden. Verfahren für solche Manipulationen sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt.
Beispielsweise können Aminosäuresequenz-Varianten der pestiziden Proteine durch Einführung von Mutationen in eine synthetische Nucleinsäure (z.B. DNA-Molekül) hergestellt werden. Verfahren zur Mutagenese und Nucleinsäure-Veränderungen sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Beispielsweise können konzipierte Änderungen unter Verwendung einer Oligonucleotid-vermittelten, ortsspezifischen Mutagenesetechnik eingeführt werden. Siehe z.B. Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488–492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154: 367–382; US-Patent 4,873,192; Walker und Gaastra, Herausg. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) und darin zitierte Referenzen.
Die Wildtyp- (z.B. natürlich vorkommenden) Nucleotidsequenzen der Erfindung wurden aus Stämmen von Bacillus thuringiensis erhalten, die für Cry8-artige δ-Endotoxine codieren. Es ist gut bekannt, dass natürlich vorkommende δ-Endotoxine durch sporulierende Zellen von B. thuringiensis als proteinartiges kristallines Einschlussprotoxin synthetisiert werden. Bei Aufnahme durch empfindliche Insektenlarven lösen sich die Mikrokristalle im Mitteldarm, und das Protoxin wird durch Proteasen, die charakteristische Verdauungsenzyme sind, die im Insektendarm lokalisiert sind, in eine biologisch aktive Gruppierung transformiert. Das aktivierte δ-Endotoxin bindet mit hoher Affinität an Proteinrezeptoren an Bürstensaummembranvesikel. Die Epitelzellen, die den Mitteldarm auskleiden, sind das primäre Ziel des Endotoxins und werden als Folge der Membranperforation, die aus der Bildung von kontrollierten Kationen-selektiven Kanälen resultiert, rasch durch das Toxin zerstört.
Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen von Cry-Toxinen verschiedener Spezifität zeigt fünf hoch konservierte Sequenzblöcke. Strukturell umfassen die δ-Endotoxine drei unterschiedliche Domänen, die vom N- zum C-Terminus sind: ein Cluster von sieben α-Helices, die bei der Porenbildung beteiligt sind, drei anti-parallele β-Faltblätter, die bei der Zellbindung impliziert sind, und ein β-Sandwich.
Die mutanten Cry8-Polypeptide der vorliegenden Erfindung wurden im Allgemeinen durch ein Verfahren hergestellt, das die folgenden Schritte involvierte: Erhalt einer Nucleinsäuresequenz, die für ein Cry8-Polypeptid codiert; Analysieren der Struktur des Polypeptids, um bestimmte "Target"-Stellen zur Mutagenese der zugrundeliegenden Gensequenz zu identifizieren, und zwar auf der Basis der Betrachtung der vorgeschlagenen Funktion der Targetdomäne im Wirkmodus des Endotoxins; Einführen einer oder mehrerer Mutationen in die Nucleinsäuresequenz, um eine gewünschte Änderung in einem oder mehreren Aminosäure rest(en) der codierten Polypeptidsequenz zu erzeugen, wobei die Änderung so konzipiert ist, dass sie eine Protease-empfindliche Spaltstelle an die Targetregion addiert oder die ursprüngliche Protease-empfindliche Stelle entfernt und eine Protease-empfindliche Stelle addiert, die gegenüber der Aktivität einer anderen Protease empfindlich ist; und Exprimieren der mutagenisierten Nucleinsäuresequenz, die für das rekombinant manipulierte Protein der Erfindung codiert, in einer transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, die zur Erzielung der Expression des modifizierten Cry8-Polypeptids wirksam sind.
Viele der δ-Endotoxine sind durch Ähnlichkeiten in ihren Aminosäuresequenzen und ihrer Tertiärstruktur zu gewissen Graden verwandt, und Mittel zum Erhalten der Kristallstrukturen von B. thuringiensis-Endotoxinen sind gut bekannt. Beispiele für eine Hochauflösungs-Kristallstruktur-Lösung der beiden Polypeptide Cry3A und Cry3B sind in der Literatur verfügbar. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung verwendeten die aufgelöste Struktur des Cry3A-Gens (Li et al. (1991) Nature 353: 815–821), um ein Homologiemodell des Cry8-δ-Endotoxins, das hierin als SEQ ID NO: 2 offenbart und beansprucht wird, zu erzeugen, um Einsicht in die Beziehung zwischen Struktur und Funktion des Endotoxins zu erlangen und um die rekombinant manipulierten Proteine zu entwickeln, die hierin offenbart und beansprucht werden. Eine kombinierte Betrachtung der veröffentlichten Strukturanalysen von B. thuringiensis-Endotoxinen und die beschriebene Funktion, die mit bestimmten Strukturen, Motiven und dergleichen verbunden ist, zeigt, dass spezifische Regionen des Endotoxins mit bestimmten Funktionen und getrennten Schritten des Wirkmodus des Proteins in Korrelation stehen. Beispielsweise werden δ-Endotoxine, die aus B. thuringiensis isoliert wurden, allgemein so beschrieben, dass sie drei Domänen, ein Sieben-Helix-Bündel, das in der Porenbildung involviert ist, eine Drei-Faltblatt-Domäne, die bei der Rezeptorbindung impliziert ist, und ein β-Sandwich-Motiv umfassen (Li et al. (1991) Nature, 305: 815–821).
Die Erfinder zogen den Schluss, dass die Toxizität von Cry8-artigen Proteinen und speziell die Toxizität des Cry8-Proteins durch Targetieren der Region, die zwischen den α-Helices 3 und 4 von Domäne 1 des Endotoxinproteins lokalisiert ist, verbessert werden könnte. Diese Theorie wurde auf der Basis des Wissens, das beschrieben wurde, dass die α-Helices 4 und 5 von Domäne 1 von Cry3A-δ-Endotoxinen in die Lipid-Bilayer von Zellen insertiert werden, welche den Mitteldarm von empfindlichen Insekten auskleiden (Gazit et al., (1998) PNAS USA 95: 12289–12294); auf der Basis der Kenntnis der Erfinder der Lage von Trypsin- und Chymotrypsin-Spaltstellen innerhalb der Aminosäuresequenz des Wildtyp-Proteins und der hierin beschriebenen Beobachtung, dass das Protein, das durch 1218-1 codiert wird (d.h. SEQ ID NO: 2), gegen bestimmte Coleopterane nach in vitro-Aktivierung durch Trypsin- oder Chymotrypsin-Behandlung aktiver war, postuliert. Dementsprechend konstruierten die Erfinder ein mutantes Cry8-artiges Protein, das wenigstens eine zusätzliche Trypsin-Spaltstelle in der Region, die zwischen den Helices 3 und 4 von Domäne 1 lokalisiert ist, umfasst.
Spezifischer ausgedrückt, die Erfinder produzierten mutagenisierte Cry8-artige Nucleotidsequenzen, die für mutante Cry8-Endotoxine (z.B. Polypeptide) codieren, die entweder zusätzliche oder alternative Protease-empfindliche Stellen umfassen. Die Erfindung stellt mutante Polypeptide zur Verfügung, die entweder in einem 1218-1- (SEQ ID NO: 6 oder 16) oder einem 49PVD (SEQ ID NO: 20)-Hintergrund konstruiert wurden. Es sollte klar sein, dass die Bezeichnung 1218-1, wie sie hier verwendet wird, zwei Ausführungsformen (z.B. 1218-1 und 1218-1A) der 1218-1-Nucleotid- und -Aminosäuresequenzen, die hier gezeigt sind, umfasst. Dies gilt insbesondere im Kontext der offenbarten Additions- und Ersatzmutanten, die entweder im 1218-1- oder 49PVD-Hintergrund erzeugt wurden. Es ist einzusehen, dass die Nomenklatur, die hierin verwendet wird, um eine Mutante zu bezeichnen, z.B. die NGSR.N1218-1-Mutante, Mutanten in Betracht zieht, die im 1218-1- und im 1218-1A-Hintergrund geschaffen wurden. Zum Zwecke der Konsistenz verkörpern die Sequenzen, die im Sequenzprotokoll für die 1218-1-Mutanten angegeben sind, Mutanten, die in den 1218-1A-Sequenzen (SEQ ID NO: 15 und 16) erzeugt wurden.
Allgemein ausgedrückt, alle hierin beschriebenen mutanten Polypeptide sind so konzipiert, dass sie wenigstens eine proteolytische Spaltstelle umfassen, die sich zwischen Helix 3 und 4 von Domäne 1 befindet und die im Wildtyp-Polypeptid nicht vorliegt. Alle hier offenbarten Mutanten wurden in das pET-Expressionssystem cloniert, in E. coli exprimiert und auf pestizide Aktivität zuerst gegen Southern Corn Rootworm (SCRW) und dann Western Corn Rootworm (WCRW) (Diaprotica virgifera) getestet. Zusätzlich wurden die 49PVD-Variante (SEQ ID NO: 20) und die NGSR.N1218-1-Mutante (SEQ ID NO: 12) auf pestizide Aktivität gegen den Colorado-Kartoffelkäfer (CPB) getestet.
Kurz ausgedrückt, die hierin bereitgestellten Mutanten umfassen: Mutanten, die eine zweite Trypsin-Spaltstelle (d.h. NGSR (SEQ ID NO: 14)) in die Aminosäuresequenz des Fragments, das in SEQ ID NO: 6 (1218-1) oder SEQ ID NO: 16 (1218-1A) dargestellt ist, oder des Fragments, das in SEQ ID NO: 20 (49PVD) dargestellt ist, eingeführt umfassen; Mutanten, die eine Chymotrypsin-Spaltstelle umfassen, die entweder die Aminosäuresequenz LKMS (SEQ ID NO: 26) oder LRMS (SEQ ID NO: 48) eingeführt vor der (z.B. direkt 5' der) Trypsin-Spaltstelle, die natürlicher Weise in der modifizierten Polypeptidsequenz vorliegt, eingeführt umfasst; und Ersatzmutanten, in denen die native Trypsinstelle, die in der Toxindomäne des modifizierten Polypeptids auftritt, zerstört ist und an ihrer Stelle eine Chymotrypsinstelle (z.B. LKMS oder LRMS) eingeführt ist.
Die 1218-1-Reihe von Mutanten, die hierin offenbart sind, werden als NGSR.N1218-1, LKMS.N1218-1, LKMS.R1218-1, LRMS.N1218-1 und LRMS.R1218-1 bezeichnet. Die Aminosäuresequenzen dieser mutanten Polypeptide sind in SEQ ID NO: 12, 22, 24, 42 bzw. 44 angegeben. Die Erfindung stellt auch eine zweite Reihe von mutanten Polypeptiden bereit (SEQ ID NO: 30, 32, 34, 42 und 46), in die die oben beschriebenen Additions- (Trypsin- oder Chymotrypsin-Spaltstellen) und Ersatz- (eine Chymotrypsin-Spaltstelle anstelle der Trypsinstelle) Mutationen in das trunkierte Polypeptid (z.B. 49PVD), das in SEQ ID NO: 20 angegeben ist, eingeführt wurden. Diese Reihe von Mutanten werden als NGSR.N49PVD, LKMS.N49PVD, LKMS.R49PVD, LRMS.N49PVD und LRMS.R49PVD bezeichnet. Die Aminosäuresequenzen jedes der 49PVD-Mutanten-Polypeptide sind in SEQ ID NO: 30, 32, 34, 42 bzw. 46 angegeben.
Die hierin offenbarten NGSR-Mutanten umfassen eine zusätzliche Trypsin-empfindliche Proteasestelle in einer Region der Aminosäuresequenz, die für Domäne 1 des Polypeptids codiert. Beispielsweise umfasst die NGSR.N1218-1-Mutante eine NGSR-Sequenz, die zwischen die Aminosäurereste 164 und 165 des Wildtyp-Proteins eingeführt ist. Diese Aminosäuresequenz stellt eine zweite Trypsin-empfindliche Spaltstelle in dem mutanten Endotoxin, das durch SEQ ID NO: 11 codiert wird, bereit. Spezifischer ausgedrückt, die NGSR-Sequenz (z.B. SEQ ID NO: 14) verdoppelt die endogene Trypsin-Spaltstelle, die am Zielort vorliegt, wodurch eine zweite Protease-empfindliche Stelle in der Schleifenregion eingeführt wird, welche zwischen den α-Helices 3 und 4 von Domäne 1 lokalisiert ist. Demnach liest sich die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 14, beginnend am Rest 160, als NGSRNGSR. Dagegen umfassen die Aminosäurepositionen 160–164 des Wildtyp-Proteins die Sequenz NGSR.
Obgleich keine Bindung an eine Theorie gewünscht wird, wird angenommen, dass das Vorliegen einer zweiten Protease-empfindlichen (z.B. Trypsin- oder Chymotrypsin-)Stelle die intramolekulare proteolytische Spaltung durch Erhöhung der Fähigkeit der Helices 4 und 5, sich vom Rest des Toxins abzutrennen, erleichtert wird. Die Effekte einer Verstärkung der Fähigkeit der Helices 4 und 5, sich vom Rest des Toxins abzuspalten, würde als effizienterer Porenbildungsprozess gezeigt werden und verleiht daher eine Erhöhung der insektiziden Aktivität des Toxins. In der Tat zeigen die Cry8-Mutanten, die hierin beschrieben werden, eine verbesserte Toxizität gegenüber verschiedenen Coleopteran-Schädlingen. Die Daten legen außerdem nahe, dass das Vorliegen der zweiten Protease-empfindlichen Stelle ein Polypeptid produziert, das für eine Aktivierung durch die Verdauungsprozesse von empfindlichen Insekten zugänglicher ist.
Die mutagenisierten Cry8-artigen Nucleotidsequenzen der Erfindung können so modifiziert werden, dass etwa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12 oder mehr der Aminosäuren, die in der Primärsequenz des codierten Polypeptids vorliegen, verändert werden. Alternativ können sogar noch mehr Änderungen bezüglich der nativen Sequenz eingeführt werden, so dass das codierte Protein wenigstens etwa 1% oder 2% oder alternativ etwa 3% oder etwa 4% oder sogar etwa 5% oder mehr der Codons verändert oder in anderer Weise modifiziert haben kann. Es sollte einzusehen sein, dass die mutagenisierten Cry8-artigen Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung dazu bestimmt sind, biologisch funktionelle äquivalente Peptide zu umfassen. Solche Sequenzen können als Folge der Codon-Redundanz und der funktionellen Äquivalenz, die bekanntermaßen innerhalb von Nucleinsäuresequenzen und den dadurch codierten Sequenzen natürlicher Weise auftreten, entstehen.
Ein Fachmann wird erkennen, dass Aminosäureadditionen und/oder -substitutionen im Allgemeinen auf der relativen Ähnlichkeit der Aminosäure-Seitenkettensubstituenten, z.B. ihrer Hydrophobie, Ladung, Größe und dergleichen, basieren. Beispielhafte Substitutionen, die verschiedene der vorangehenden Charakteristika in Betracht ziehen, sind dem Fachmann gut bekannt und umfassen: Arginin und Lysin; Glutamat und Aspartat; Serin und Threonin; Glutamin und Asparagin; und Valin, Leucin und Isoleucin.
Eine Anleitung für geeignete Aminosäuresubstitutionen, die die biologische Aktivität des Proteins von Interesse nicht beeinträchtigen, können im Modell von Dayhoff et al. (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res. Found., Washington, D.C.) gefunden werden, das hierin durch Referenz aufgenommen wird. Konservative Substitutionen, z.B. Austausch einer Aminosäure mit einer anderen, die ähnliche Eigenschaften hat, können bevorzugt sein.
Somit umfassen die Gene und Nucleotidsequenzen der Erfindung sowohl die natürlich vorkommenden Sequenzen wie auch mutante Formen. Entsprechend umfassen die Proteine der Erfindung sowohl natürlich vorkommende Proteine wie auch Variationen (z.B. trunkierte Polypeptide) und modifizierte (z.B. mutante) Formen davon. Solche Varianten werden weiterhin die gewünschte pestizide Aktivität besitzen. Offensichtlich dürfen die Mutationen, die in der DNA, die für die Variante codiert, die Sequenz nicht außerhalb des Leserasters platzieren und werden vorzugsweise keine komplementären Regionen schaffen, die eine sekundäre mRNA-Struktur produzieren könnten. Siehe EP-Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer 0 075 444.
Es wird nicht erwartet, dass die hierin umfassten Deletionen, Insertionen und Substitutionen der Proteinsequenzen radikale Veränderungen in den Charakteristika des Proteins erzeugen. Wenn es allerdings schwierig ist, den exakten Effekt der Substitution, Deletion oder Insertion im voraus vorauszusagen, wird ein Fachmann erkennen, dass der Effekt durch Routine-Screeningassays, z.B. Insektenfraßassays, beurteilt werden wird. Siehe z.B. Marrone et al. (1985) J. Econ. Entomol., 78: 290–293 und Czapla and Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83: 2480–2485.
Varianten-Nucleotidsequenzen und Proteine umfassen auch Sequenzen und Proteine, die aus einem mutagenen und rekombinogenen Verfahren, z.B. DNA-Shuffling, stammen. Mit einem solchen Verfahren können eine oder mehrere verschiedene Cry8-artige codierende Sequenzen so manipuliert werden, dass sie ein neues pestizides Protein erzeugen, das die gewünschten Eigenschaften besitzt. Auf diese Weise werden Bibliotheken rekombinanter Polynucleotide aus einer Population sequenzverwandter Polynucleotide erzeugt, die Sequenzregionen umfassen, die eine wesentliche Sequenzidentität haben, und die in vitro oder in vivo homolog rekombiniert werden können. Unter Verwendung dieses Ansatzes können z.B. codierende Volllängen-Sequenzen, Sequenzmotive, die für eine Domäne von Interesse codieren, oder ein beliebiges Fragment einer Nucleotidsequenz der Erfindung zwischen den Cry8-artigen Nucleotidsequenzen der Erfindung und entsprechenden Teilen anderer bekannter Cry-Nucleotidsequenzen hin- und hergeschoben werden, um ein neues Gen zu erhalten, das für ein Protein mit einer verbesserten Eigenschaft von Interesse codiert.
Eigenschaften von Interesse umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, pestizide Aktivität pro Einheit an pestizidem Protein, Proteinstabilität und Toxizität gegenüber Nicht-Zielspecies, insbesondere Menschen, Viehbestand und Pflanzen und Mikroben, die das pestizide Polypeptid der Erfindung exprimieren. Die Erfindung ist nicht durch eine bestimmte Shuffling-Strategie gebunden, nur dadurch, dass wenigstens eine Nucleotidsequenz der Erfindung oder ein Teil davon in einer solchen Shuffling-Strategie involviert ist. Shuffling kann nur Nucleotidsequenzen, die hierin offenbart sind, involvieren oder kann zusätzlich ein Shuffling von anderen Nucleotidsequenzen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, involvieren; diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, GenBank-Zugangsnummern U04364, U04365 und U04366. Strategien zum DNA-Shuffling sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Stemmer (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747–10751; Stemmer (1994) Nature 370: 389–391; Crameri et al. (1997) Nature Biotech. 15: 436–438; Moore et al. (1997) J. Mol. Biol. 272: 336–347; Zhang et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4504–4509; Crameri et al. (1998) Nature 391: 288–291 und US-Patente Nrn. 5,605,793 und 5,837,458.
Die Nucleotidsequenzen der Erfindung können auch verwendet werden, um entsprechende Sequenzen aus anderen Organismen, insbesondere anderen Bakterien, und speziell anderen Bacillus-Stämmen zu isolieren. Auf diese Weise können Verfahren, z.B. PCR, Hybridisierung und dergleichen, eingesetzt werden, um solche Sequenzen auf der Basis ihrer Sequenzhomologie zu den Sequenzen, die hierin angegeben sind, zu identifizieren. Sequenzen, die auf der Basis ihrer Sequenzidentität zu den ganzen Cry8-artigen Sequenzen, die hierin angegeben sind, oder zu Fragmenten davon isoliert wurden, werden durch die vorliegende Erfindung umfasst. Solche Sequenzen umfassen Sequenzen, die Orthologe der offenbarten Sequenzen sind. Mit "Orthologen" sind Gene gemeint, die von einem gemeinsamen Stammgen abgeleitet sind, und die als Speziationsresultat in verschiedenen Species gefunden werden. Gene, die in verschiedenen Species gefunden werden, werden als Orthologe angesehen, wenn ihre Nucleotidsequenzen und/oder ihre codierten Proteinsequenzen wesentliche Identität teilen, wie sie an anderer Stelle hier definiert ist. Funktionen von Orthologen werden unter Species oft in hohem Maße konserviert.
In einem PCR-Ansatz können Oligonucleotidprimer zur Verwendung in PCR-Reaktionen entwickelt werden, um entsprechende DNA-Sequenzen aus cDNA oder genomischer DNA, die aus einem Organismus von Interesse extrahiert wurde, zu amplifizieren. Verfahren zur Entwicklung von PCR-Primern und zur PCR-Klonierung sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und sind bei Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.), offenbart. Siehe auch Innis et al., Hrsg. (1990) PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Aca demic Press, New York); Innis und Gelfand, Hrsg. (1995) PCR Strategies (Academic Press, New York); und Innis und Gelfand, Hrsg. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York). Bekannte PCR-Verfahren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Verfahren unter Verwendung von gepaarten Primern, verschachtelten Primern, einzelnen spezifischen Primern, degenerierten Primern, genspezifischen Primern, vektorspezifischen Primern, teilweise fehlgepaarten Primern und dergleichen.
In Hybridisierungstechniken wird die gesamte bekannte Nucleotidsequenz oder ein Teil davon als Sonde verwendet, die selektiv an andere entsprechende Nucleotidsequenzen hybridisiert, die in einer Gruppe von klonierten genomischen DNA-Fragmenten oder cDNA-Fragmenten (d.h. genomischer oder cDNA-Bibliotheken) aus einem ausgewählten Organismus vorliegen. Die Hybridisierungssonden können genomische DNA-Fragmente, cDNA-Fragmente, RNA-Fragmente oder andere Oligonucleotide sein und können mit einer detektierbaren Gruppe, z.B. ³²P, oder einem anderen detektierbaren Marker markiert sein. So können z.B. Sonden zur Hybridisierung durch Markierung synthetischer Oligonucleotide basierend auf Cry8-artigen Sequenzen der Erfindung hergestellt werden. Verfahren zur Herstellung von Sonden zur Hybridisierung und zur Konstruktion von cDNA- und genomischen Bibliotheken sind auf dem Fachgebiet allgemein bekannt und sind in Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.) offenbart.
Beispielsweise kann eine ganze Cry8-artige Sequenz, die hierin offenbart ist, oder es kann ein Teil oder es können mehrere Teile davon als Sonde verwendet werden, die fähig ist, spezifisch an entsprechende Cry8-artige Sequenzen und Messenger-RNAs zu hybridisieren. Um eine spezifische Hybridisierung unter einer Vielzahl von Bedingungen zu erreichen, umfassen solche Sonden Sequenzen, die unter Cry8-artigen Sequenzen einzigartig sind und die vorzugsweise wenigstens etwa 10 Nucleotide lang sind und am bevorzugtesten wenigstens etwa 20 Nucleotide lang sind. Solche Sonden können verwendet werden, um entsprechende Cry8-artige Sequenzen aus einem gewählten Organismus durch PCR zu amplifizieren. Diese Technik kann verwendet werden, um zusätzliche codierende Sequenzen aus einem gewünschten Organismus zu isolieren, oder als diagnostischer Assay eingesetzt werden, um das Vorliegen von codierenden Sequenzen in einem Organismus zu bestimmen. Hybridisierungstechniken umfassen Hybridisierungsscreenings von plattierten DNA-Bibliotheken (entweder Pla ques oder Kolonien, siehe z.B. Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.)).
Eine Hybridisierung von solchen Sequenzen kann unter stringenten Bedingungen durchgeführt werden. Mit "stringenten Bedingungen" oder "stringenten Hybridisierungsbedingungen" sind Bedingungen gemeint, unter welchen eine Sonde an ihre Zielsequenz zu einem detektierbar höheren Grad als an andere Sequenzen hybrisieren wird (z.B. wenigstens 2-fach gegenüber dem Hintergrund). Stringente Bedingungen sind sequenzabhängig und werden unter unterschiedlichen Umständen verschieden sein. Indem die Stringenz der Hybridisierung und/oder der Waschbedingungen kontrolliert wird, können Targetsequenzen, die zu 100% komplementär zu der Sonde sind, identifiziert werden (homologe Sondierung). Alternativ können Stringenzbedingungen so eingestellt werden, dass sie eine gewisse Fehlpaarung in Sequenzen zulassen, so dass niedrigere Ähnlichkeitsgrade detektiert werden (heterologe Sondierung). Im Allgemeinen ist eine Sonde weniger als etwa 1.000 Nucleotide lang, vorzugsweise weniger als 500 Nucleotide lang.
Typischerweise werden stringente Bedingungen solche sein, unter denen die Salzkonzentration weniger als etwa 1,5 M Na-Ion-, typischerweise etwa 0,01 bis 1,0 M Na-Ion-Konzentration (oder andere Salze) bei pH 7,0 bis 8,3 ist und die Temperatur wenigstens etwa 30°C ist, und zwar für kurze Sonden (z.B. 10 bis 50 Nucleotide) und wenigstens etwa 60°C für lange Sonden ist (z.B. größer als 50 Nucleotide). Stringente Bedingungen können auch mit Zusatz von destabilisierenden Mitteln, z.B. Formamid, erreicht werden. Beispielhafte Bedingungen niedriger Stringenz umfassen eine Hybridisierung mit einer Pufferlösung von 30 bis 35% Formamid, 1 M NaCl, 1% SDS (Natriumdodecylsulfat) bei 37°C und einen Waschgang in 1 × bis 2 × SSC (20 × SSC = 3,09 M NaCl/0,3 M Trinatriumcitrat) bei 50 bis 55°C. Beispielhafte Bedingungen moderater Stringenz umfassen eine Hybridisierung in 40 bis 45% Formamid, 1,0 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einen Waschgang in 0,5 × bis 1 × SSC bei 55 bis 60°C. Beispielhafte Bedingungen hoher Stringenz umfassen eine Hybridisierung in 50% Formamid, 1,0 M NaCl, 1% SDS bei 37°C und einen Waschgang in 0,1 × SSC bei 60 bis 65°C. Die Hybridisierungsdauer ist im Allgemeinen weniger als etwa 24 Stunden, üblicherweise etwa 4 bis etwa 12 Stunden.
Spezifität ist typischerweise die Funktion von Nachhybridisierungswaschgängen, wobei die kritischen Faktoren die Ionenstärke und die Temperatur der Endwaschlösung sind. Für DNA-DNA-Hybride kann die T_m aus der Gleichung von Meinkoth und Wahl (1984) Anal. Biochem. 138: 267–284 genähert werden: T_m = 81,5°C + 16,6(logM) + 0,41 (% GC) – 0,61 (% Form) – 500/L, worin M die Molarität von einwertigen Kationen ist, % GC der %-Wert an Guanosin- und Cytosinnucleotiden in der DNA ist, % Form der %-Gehalt an Formamid in der Hybridisierungslösung ist und L die Länge des Hybrids in Basenpaaren ist. T_m ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und definiertem pH), bei der 50% einer komplementären Zielsequenz an eine perfekt übereinstimmende Sonde hybridisiert. T_m wird für jedes 1% Fehlpaarung um etwa 1°C verringert; somit können T_m, Hybridisierungs- und/oder Waschbedingungen eingestellt werden, um an Sequenzen der gewünschten Identität zu hybridisieren. Wenn z.B. Sequenzen mit ≥ 90% Identität gesucht werden, kann die T_m 10°C verringert werden. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie etwa 5°C niedriger sind als der thermische Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz und ihr Komplement bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH. Allerdings können stark stringente Bedingungen eine Hybridisierung und/oder eine Waschung bei 1, 2, 3 oder 4°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) nutzen; moderat stringente Bedingungen können eine Hybridisierung und/oder Waschung bei 6, 7, 8, 9 oder 10°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) nutzen. Bedingungen niedriger Stringenz können eine Hybridisierung und/oder ein Waschen bei 11, 12, 13, 14, 15 oder 20°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) nutzen. Unter Verwendung der Gleichung, der Hybridisierung und der Waschlösungszusammensetzungen und der gewünschten T_m werden Fachleute verstehen, dass Veränderungen in der Hybridisierungsstringenz und/oder der Waschlösungen inhärent beschrieben sind. Wenn der gewünschte Grad der Fehlpaarung in einer T_m von weniger als 45°C (wässrige Lösung) oder 32°C (Formamidlösung) resultiert, ist es bevorzugt, die SSC-Konzentration so zu erhöhen, dass eine höhere Temperatur verwendet werden kann. Eine umfangreiche Anleitung zur Hybridisierung von Nucleinsäuren wird in Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Moleculax Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Teil I, Kapitel 2 (Elsevier, New York); und Ausubel et al., Hrsg. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Kapitel 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York) gefunden. Siehe Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, N.Y.). Demnach werden von der vorliegenden Erfindung isolierte Sequenzen, die für ein Cry8-artiges Protein der Erfindung codieren und unter stringenten Bedingungen an die hierin offenbarten Cry8-artigen Sequenzen oder Fragmente davon hybridisieren, umfasst.
Die folgenden Ausdrücke werden verwendet, um die Sequenzbeziehungen zwischen zwei oder mehr Nucleinsäuren oder Polynucleotiden zu beschreiben: (a) "Referenzsequenz", (b) "Vergleichsfenster", (c) "Sequenzidentität", (d) "Prozentwert der Sequenzidentität" und (e) "wesentliche Identität".

(a) "Referenzsequenz", wie der Ausdruck hierin verwendet wird, ist eine definierte Sequenz, die als Basis für einen Sequenzvergleich verwendet wird. Eine Referenzsequenz kann ein Untersatz oder eine Gesamtheit einer spezifizierten Sequenz sein, z.B. ein Segment einer Volllängen-cDNA oder einer Gensequenz oder die vollständige cDNA oder Gensequenz.
(b) "Vergleichsfenster", wie der Ausdruck hierin verwendet wird, bezieht er sich auf ein fortlaufendes und spezifiziertes Segment einer Polynucleotidsequenz, wobei die Polynucleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Lücken bzw. Gaps) im Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) zur optimalen Anordnung der zwei Sequenzen umfassen kann. Im Allgemeinen ist das Vergleichsfenster wenigstens 20 fortlaufende Nucleotide lang und kann gegebenenfalls 30, 40, 50, 100 oder länger sein. Der Fachmann wird erkennen, dass zur Vermeidung einer hohen Similarität mit einer Referenzsequenz durch Einschluss von Lücken in die Polynucleotidsequenz typischer Weise ein "Gap Penalty" eingeführt wird und von der Anzahl der Übereinstimmungen subtrahiert wird.

Verfahren der Anordnung von Sequenzen zum Vergleich sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. So kann die Bestimmung der prozentualen Identität zwischen zwei Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus erreicht werden. Nicht-beschränkende Beispiele für solche mathematischen Algorithmen sind der Algorithmus von Myers und Miller (1988) CABIOS 4: 11–17; der lokale Homologiealgorithmus von Smith et al. (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; der Homologieanordnungsalgorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453; das Suche-nach-Similarität-Verfahren von Pearson und Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444–2448; der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264, modifiziert wie bei Karlin und Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5877 beschrieben.
Computer-Implementierungen dieser mathematischen Algorithmen können zum Vergleich von Sequenzen unter Bestimmung der Sequenzidentität verwendet werden. Solche Implementierungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: CLUSTAL im PC/Gene- Programm (verfügbar von Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien); das ALIGN-Programm (Version 2.0) und GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Version 8 (verfügbar von Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA). Anordnungen unter Verwendung dieser Programme können unter Verwendung der Defaut-Parameter durchgeführt werden. Das CLUSTAL-Programm ist von Higgins et al. (1988) Gene 73: 237–244 (1988); Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151–153; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10881–90; Huang et al. (1992) CABIOS 8: 155–65; und Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24: 307–331 gut beschrieben. Das ALIGN-Programm basiert auf dem Algorithmus von Myers und Miller (1988) oben. Eine PAM120-Gewichtsrest-Tabelle, ein Gap-Length-Penalty von 12 und ein Gap-Penalty von 4 können beim Vergleich von Aminosäuresequenzen mit dem ALIGN-Programm verwendet werden. Die BLAST-Programme von Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 basieren auf dem Algorithmus von Karlin und Altschul (1990) oben. BLAST-Nucleotidsuchen können mit dem BLASTN-Programm, Score = 100, Wortlänge = 12, durchgeführt werden, um Nucleotidsequenzen zu erhalten, die zu einer Nucleotidsequenz homolog sind, die für ein Protein der Erfindung codiert. BLAST-Proteinsuchen können mit dem BASTX-Programm, Score = 50, Wortlänge = 3, durchgeführt werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die zu einem Protein oder Polypeptid der Erfindung homolog sind. Um zu Vergleichszwecken Anordnungen mit Gaps zu erhalten, kann Gapped BLAST (in BLAST 2.0) verwendet werden, wie es bei Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 beschrieben ist. Alternativ kann PSI-BLAST (in BLAST 2.0) verwendet werden, um eine wiederholte Suche durchzuführen, die entfernte Beziehungen zwischen Molekülen detektiert. Siehe Altschul et al. (1997) oben. Wenn BLAST, Gapped BLAST, PSI-BLAST verwendet werden, können die Defaut-Parameter der jeweiligen Programme (z.B. BLASTN für Nucleotidsequenzen, BLASTX für Proteine) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.hlm.nih.gov. Eine Anordnung kann auch manuell durch Inspektion durchgeführt werden.
Wenn nichts Anderes angegeben ist, beziehen sich die hierin angegebenen Nucleotidsequenz-Identität/Similarität-Werte auf den Wert, der unter Verwendung von GAP Version 10 bei Verwendung der folgenden Parameter erhalten wird: %-Identität unter Verwendung von GAP-Gewicht von 50 und ein Längengewicht von 3; %-Similarität unter Verwendung eines Gap-Gewichts von 12 und eines Längengewichts von 4 oder ein äquivalentes Programm. Für Aminosäuresequenzen beziehen sich die Werte für Aminosäuresequenz-Identität hierin auf den Wert, der unter Verwendung von GAP Version 10 unter Verwendung der folgenden Parameter erhalten wird: %-Identität unter Verwendung von GAP-Gewicht von 8 und Längengewicht von 2 oder ein äquivalentes Programm. Mit "äquivalentes Programm" ist ein beliebiges Sequenzvergleichsprogramm gemeint, das für beliebige zwei in Frage kommenden Sequenzen eine Anordnung erzeugt, die identische Nucleotid- oder Aminosäurerest-Übereinstimmungen und eine identische Prozentwert-Sequenzidentität hat, wenn sie mit der entsprechenden Anordnung verglichen wird, die durch das bevorzugte Programm erzeugt wird.
GAP verwendet den Algorithmus von Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453, um die Anordnung von zwei vollständigen Sequenzen zu finden, die die Anzahl der Übereinstimmungen maximiert und die Anzahl von Gaps bzw. Lücken miniert. GAP betrachtet alle möglichen Anordnungen und Gap-Positionen und schafft die Anordnung mit der größten Zahl von übereinstimmenden Basen und den wenigsten Gaps bzw. Lücken. Es sorgt für die Bereitstellung eines Gap-Creation-Penalty und eines Gap-Extension-Penalty in Einheiten von übereinstimmenden Basen. GAP muss einen Profit der Gap-Creation-Penalty-Zahl an Übereinstimmungen für jede Lücke, die es insertiert, machen. Wenn eine Gap-Extension-Penalty von größer als Null gewählt wird, muss GAP zusätzlich einen Profit für jede insertierte Lücke der Länge für die Gap-Male des Gap-Extension-Penalty machen. Defaut-Gap-Creation-Penalty-Werte und Gap-Extension-Penalty-Werte in Version 10 des Wisconsin Genetics Software Package für Proteinsequenzen sind 8 bzw. 2. Für Nucleotidsequenzen ist die Defaut-Gap-Creation-Penalty 50, während die Defaut-Gap-Extension-Penalty 3 ist. Die Gap-Creation- und die Gap-Extension-Penalties können als ganze Zahlen ausgedrückt werden, ausgewählt aus der Gruppe von ganzen Zahlen, die von 0 bis 200 reichen. So können beispielsweise die Gap-Creation- und Gap-Extension-Penalties 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 oder größer sein.
GAP stellt ein Glied der Familie der besten Anordnungen dar. Es kann viele Glieder dieser Familie geben, aber kein anderes Glied hat eine bessere Qualität. GAP zeigt vier Verdienstmerkmale für Anordnungen: Qualität, Ratio, Identität und Similarität. Die Qualität ist die Metrik, die maximiert wird, um die Sequenzen anzuordnen. Ratio ist die Qualität, dividiert durch die Anzahl von Basen in dem kürzeren Segment. Der Prozentwert der Identität bzw. die prozentuale Identität ist der Prozentgehalt der Symbole, die tatsächlich übereinstimmen. Der Prozentwert der Similarität bzw. die prozentuale Similarität ist der Prozentgehalt der Symbole, die ähnlich sind. Symbole, die jenseits von Lücken sind, werden ignoriert. Eine Similarität wird bewertet, wenn der Scoring-Matrix-Wert für ein Symbolpaar größer oder gleich 0,50, dem Similaritätsschwellenwert, ist. Die in Version 10 des Wisconsin Genetics Software Package verwendete Scoring-Matrix ist BLOSUM62 (siehe Henikoff und Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915).
Für Zwecke der vorliegenden Erfindung wird ein Vergleich von Nucleotid- oder Proteinsequenzen zur Bestimmung des Prozentwertes der Sequenzidentität bzw. der prozentualen Sequenzidentität mit den Cry8-artigen Sequenzen, die hierin offenbart sind, vorzugsweise unter Verwendung des GAP-Programms im Wisconsin Genetics Software Package (Version 8 oder später) oder eines äquivalenten Programms durchgeführt. Für GAP-Analysen von Nucleotidsequenzen wurden ein GAP-Gewicht von 50 und eine Länge von 3 verwendet.

(c) "Sequenzidentität" oder "Identität", wie die Ausdrücke hierin verwendet werden, beziehen sich im Kontext von zwei Nucleinsäure- oder Polypeptidsequenzen auf Reste in den zwei Sequenzen, die bei Anordnung für maximale Übereinstimmung über ein spezifiziertes Vergleichsfenster die gleichen sind. Wenn der Prozentwert der Sequenzidentität bzw. die prozentuale Sequenzidentität unter Bezugnahme auf Proteine verwendet wird, wird erkannt, dass Restpositionen, die nicht identisch sind, sich oft durch konservative Aminosäuresubstitutionen unterscheiden, wobei Aminosäurereste für andere Aminosäurereste mit ähnlichen chemischen Eigenschaften (z.B. Ladung oder Hydrophobie) eingesetzt sind und daher die funktionellen Eigenschaften des Moleküls nicht verändern. Wenn Sequenzen sich in konservativen Substitutionen unterscheiden, kann der Prozentwert der Sequenzidentität bzw. die prozentuale Sequenzidentität nach oben eingestellt werden, um eine Korrektur bezüglich der konservativen Natur der Substitution vorzunehmen. Sequenzen, die sich durch solche konservativen Substitutionen unterscheiden, werden als mit "Sequenzsimilarität" oder "Similarität" bzw. "Ähnlichkeit" bezeichnet. Mittel zur Durchführung dieser Einstellung sind dem Fachmann gut bekannt. Typischerweise involviert diese ein Scoring einer konservativen Substitution als partielle anstatt als vollständige Fehlpaarung, wodurch der Prozentwert der Sequenzidentität erhöht wird. Wenn einer identischen Aminosäure beispielsweise eine Score von 1 gegeben wird und einer nicht-konservativen Substitution ein Score von 0 gegeben wird, so wird beispielsweise einer konservativen Substitution ein Score zwischen 0 und 1 gegeben. Die Bewertung bzw. das Scoring von konservativen Substitutionen wird z.B. errechnet, wie es im Programm PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Kalifornien) implementiert ist.
(d) Der Ausdruck "Prozentwert der Sequenzidentität", wie er hierin verwendet wird, meint den Wert, der durch Vergleichen von zwei optimal angeordneten Sequenzen über ein Vergleichsfenster bestimmt wird, wobei der Teil der Polynucleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Gaps bzw. Lücken) im Vergleich zur Referenzsequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) zur optimalen Anordnung der zwei Sequenzen umfassen kann. Der Prozentwert wird durch Bestimmung der Zahl von Positionen, in denen der identische Nucleinsäurebasen- oder -Aminosäurerest in beiden Sequenzen auftritt, um die Anzahl von übereinstimmenden Positionen zu erhalten, Dividieren der Anzahl übereinstimmender Positionen durch die Gesamtzahl an Positionen im Vergleichsfenster und Multiplizieren des Resultats mit 100, um den Prozentwert der Sequenzidentität zu erhalten, errechnet.
(e)(i) Der Ausdruck "wesentliche Identität" von Polynucleotidsequenzen bedeutet, dass ein Polynucleotid eine Sequenz umfasst, die wenigstens 70% Sequenzidentität, vorzugsweise wenigstens 80%, bevorzugter wenigstens 90% und am bevorzugtesten wenigstens 95% Sequenzidentität mit einer Referenzsequenz hat, wobei eines der Anordnungsprogramme verwendet wird, das oben beschrieben wurde und Standardparameter verwendet. Ein Fachmann wird erkennen, dass diese Werte geeigneter Weise eingestellt werden können, um eine entsprechende Identität von Proteinen zu bestimmen, die durch zwei Nucleotidsequenzen codiert werden, wobei Codondegeneriertheit, Aminosäuresimilarität, Leserasterpositionierung und dergleichen berücksichtigt werden. Wesentliche Identität von Aminosäuresequenzen bedeutet für diese Zwecke normalerweise Sequenzidentität von wenigstens 60%, bevorzugter wenigstens 70%, 80%, 90% und am bevorzugtesten wenigstens 95%. Ein anderer Hinweis, dass Nucleotidsequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, wenn zwei Moleküle unter stringenten Bedingungen aneinander hybridisieren. Im Allgemeinen werden stringente Bedingungen so gewählt, dass sie bei etwa 5°C unter dem thermischen Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH liegen. Allerdings umfassen stringente Bedingungen Temperaturen im Bereich von etwa 1°C bis etwa 20°C, was von dem gewünschten Stringenzgrad abhängt, wie er an anderer Stelle hierin qualifiziert ist. Nucleinsäuren, die unter stringenten Bedingungen nicht aneinander hybridisieren, werden noch im Wesentlichen identisch sein, wenn die Polypeptide, die sie codieren, im Wesentlichen identisch sind. Dies kann auftreten, z.B. wenn eine Kopie einer Nucleinsäure unter Verwendung der maximalen Codondegeneriertheit, die durch den genetischen Code zugelassen wird, geschaffen wird. Ein Hinweis, dass zwei Nucleinsäuresequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist, wenn das durch die erste Nucleinsäure codierte Polypeptid mit dem Polypeptid, das durch die zweite Nucleinsäure codiert wird, immunologisch kreuzreaktiv ist.
(e)(ii) Der Ausdruck "wesentliche Identität" bedeutet im Kontext eines Peptids, dass ein Peptid eine Sequenz mit wenigstens 70% Sequenzidentität zu einer Referenzsequenz, vorzugsweise 80%, bevorzugter 85%, am bevorzugtesten wenigstens 90% oder 95% Sequenzidentität zu der Referenzsequenz über ein spezifiziertes Vergleichsfenster umfasst. Vorzugsweise wird eine optimale Anordnung unter Verwendung des Homologie-Anordnungsalgorithmus von Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443–453 durchgeführt. Ein Hinweis, dass zwei Peptidsequenzen im Wesentlichen identisch sind, ist der, dass ein Peptid mit Antikörpern, die gegen das zweite Peptid entwickelt wurden, immunologisch reaktiv ist. Somit ist ein Peptid im Wesentlichen identisch zu einem zweiten Peptid, z.B. wenn die zwei Peptide sich nur durch eine konservative Substitution unterscheiden. Peptide, die "im Wesentlichen ähnlich sind", teilen Sequenzen, wie sie oben angegeben wurden, außer dass Restpositionen, die nicht identisch sind, sich durch konservativen Aminosäureaustausch unterscheiden können.

Die Verwendung des Ausdrucks "Nucleotidkonstrukte" ist hierin nicht dazu bestimmt, die vorliegende Erfindung auf Nucleotidkonstrukte, die DNA umfassen, zu beschränken. Der Fachmann wird erkennen, dass Nucleotidkonstrukte, insbesondere Polynucleotide und Oligonucleotide, die aus Ribonucleotiden und Kombinationen von Ribonucleotiden und Desoxyribonucleotiden bestehen, auch in den hierin offenbarten Verfahren verwendet werden können. Die Nucleotidkonstrukte, Nucleinsäuren und Nucleotidsequenzen der Erfindung umfassen zusätzlich alle komplementären Formen solcher Konstrukte, Moleküle und Sequenzen. Ferner umfassen die Nucleotidkonstrukte, Nucleotidmoleküle und Nucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung alle Nucleotidkonstrukte, -moleküle und -sequenzen, die in den Verfahren der Erfindung zur Transformation von Pflanzen verwendet werden können, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, jene, die aus Desoxyribonucleotiden, Ribonucleotiden und Kombinationen davon bestehen. Solche Desoxyribonucleotide und Ribonucleotide umfassen sowohl natürlich vorkommende Moleküle als auch synthetische Analoga. Die Nucleotidkonstrukte, Nucleinsäuren und Nucleotidsequenzen der Erfindung umfassen auch alle Formen von Nuc leotidkonstrukten, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, einzelsträngige Formen, doppelsträngige Formen, Haarnadelstrukturen, "stem-and-loop"-Strukturen und dergleichen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung bezieht sich auf einen transformierten Organismus, vorzugsweise einen transformierten Organismus, der aus der Gruppe, bestehend aus Pflanzen- und Insektenzellen, Bakterien, Hefe, Baculoviren, Protozoen, Nematoden und Algen ausgewählt ist, der ein DNA-Molekül der Erfindung, eine Expressionskassette, die das DNA-Molekül umfasst, oder einen Vektor, der die Expressionskassette umfasst, vorzugsweise stabil in das Genom des transformierten Organismus eingebaut umfasst.
Die Cry8-artigen Sequenzen der Erfindung werden in Expressionskassetten zur Expression in dem Organismus von Interesse bereitgestellt. Die Kassette wird 5'- und 3'-regulatorische Sequenzen funktionell verknüpft mit einer Cry8-artigen Sequenz der Erfindung umfassen. Mit "funktionell verknüpft" ist eine funktionelle Verknüpfung zwischen einem Promotor und einer zweiten Sequenz gemeint, wobei die Promotorsequenz die Transkription der DNA-Sequenz, die der zweiten Sequenz entspricht, initiiert und vermittelt. Im Allgemeinen bedeutet funktionell verknüpft, dass die Nucleinsäuresequenzen, die verknüpft sind, fortlautend sind und, wenn es erforderlich ist, zwei Protein-codierende Regionen zu verknüpfen, fortlaufend und im selben Leseraster sind. Die Kassette kann zusätzlich wenigstens ein zusätzliches Gen, das in den Organismus co-transformiert werden soll, enthalten. Alternativ kann das zusätzliche Gen/können die zusätzlichen Gene an mehreren Expressionskassetten bereitgestellt werden.
Eine derartige Expressionskassette wird mit einer Vielzahl von Restriktionsstellen zur Insertion der Cry8-artigen Sequenz, die unter der Transkriptionsregulierung der regulatorischen Regionen sein soll, ausgestattet. Die Expressionskassette kann zusätzlich selektierbare Markergene enthalten.
Die Expressionskassette wird in der 5'-3'-Richtung der Transkription eine transkriptionale und translationale Initiationsregion, eine Cry8-artige DNA-Sequenz der Erfindung und eine transkriptionale und translationale Terminierungsregion, die in dem Organismus, der als Wirt dient, funktionell ist, enthalten. Die transkriptionale Initiationsregion, der Promotor, kann nativ oder analog oder fremd oder heterolog zu dem Wirtsorganismus sein. Zusätzlich kann der Promotor die natürliche Sequenz oder alternativ eine synthetische Sequenz sein. Mit "fremd" ist gemeint, dass die transkriptionale Initiationsregion in dem nativen Organismus, in den die transkriptionale Initiationsregion eingeführt wird, nicht gefunden wird. Der Ausdruck "chimäres Gen", wie er hierin verwendet wird, umfasst eine codierende Sequenz funktionell mit einer Transkriptionsinitiationsregion verknüpft, die für die codierende Sequenz heterolog ist.
Die Terminierungsregion kann mit der transkriptionalen Initiationsregion nativ sein, kann mit der funktionell verknüpften DNA-Sequenz von Interesse nativ sein oder kann aus einer anderen Quelle stammen. Zweckdienliche Terminationsregionen sind aus dem Ti-Plasmid von A. tumefaciens verfügbar, z.B. die Octopinsynthase- und Nopalinsynthase-Terminationsregionen. Siehe auch Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262: 141–144; Proudfoot (1991) Cell 64: 671–674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5: 141–149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2: 1261–1272; Munroe et al. (1990) Gene 91: 151–158; Ballas et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7891–7903; und Joshi et al. (1987) Nucleic Acid Res. 15: 9627–9639.
Wo es geeignet ist, kann eine Nucleinsäure für eine verstärkte Expression im Wirtsorganismus optimiert werden. Wenn der Wirtsorganismus eine Pflanze ist, können die synthetischen Nucleinsäuren demnach unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter Codons für eine verbesserte Expression synthetisiert werden. Siehe z.B. Campbell und Gowri (1990) Plant Physiol. 92: 1–11 für eine Diskussion der Verwendung Wirts-bevorzugter Codons. Obgleich Nucleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung beispielsweise sowohl in monokotylen wie auch dikotylen Pflanzenspecies exprimiert werden können, können Sequenzen im Hinblick auf spezifische Codonpräferenzen und GC-Gehalts-Präferenzen von Monokotylen oder Dikotylen modifiziert werden, da gezeigt wurde, dass sich diese Präferenzen unterscheiden (Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477–498). Somit kann das in Mais bevorzugte Codon für eine bestimmte Aminosäure von bekannten Gensequenzen aus Mais abgeleitet werden. Eine Maiscodonverwendung für 28 Gene aus Maispflanzen ist in Tabelle 4 von Murray et al., supra, aufgelistet. Auf dem Fachgebiet sind Verfahren zur Synthese von Pflanzen-bevorzugter Gene verfügbar. Siehe z.B. US-Patente Nrn. 5,380,831 und 5,436,391 und Murray et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 477–498.
Von zusätzlichen Sequenzmodifikationen ist bekannt, dass sie die Genexpression in einem zellulären Wirt verstärken. Diese umfassen Eliminierungen von Sequenzen, die für falsche Polyadenylierungssignale, Exon-Intron-Spleißstellensignale, Transposon-artige Wiederholungen und andere derartige gut charakterisierte Sequenzen codieren, die für eine Genexpression schädlich sein können. Der G-C-Gehalt der Sequenz kann auf Level eingestellt werden, die für einen gegebenen Zellwirt durchschnittlich sind, wie es durch Bezugnahme auf bekannte Gene, die in der Wirtszelle exprimiert werden, errechnet wird. Mit "Wirtszelle" ist eine Zelle gemeint, die einen Vektor enthält und die Replikation und/oder Expression des Expressionsvektors unterstützt. Wirtszellen können prokaryotische Zellen, z.B. E. coli, oder eukaryotische Zellen, z.B. Hefe-, Insekten-, Amphibien- oder Säugerzellen, sein. Vorzugsweise sind Wirtszellen monokotyle oder dikotyle Pflanzenzellen. Eine besonders bevorzugte monokotyle Wirtszelle ist eine Maiswirtszelle. Wenn möglich, wird die Sequenz modifiziert, um vorausgesagte Haarnadel-Sekundär-mRNA-Strukturen zu vermeiden.
Die Expressionskassetten können zusätzlich 5'-Leadersequenzen in dem Expressionskassettenkonstrukt enthalten. Solche Leadersequenzen können zur Verstärkung der Translation wirken. Translationsleader sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen: Picornavirus-Leader z.B. EMCV-Leader (Encephalomyocarditis, 5'-nicht-codierende Region) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6126–6130); Potyvirus-Leader z.B. TEV-Leader (Tabakätzvirus) (Gallie et al. (1995) Gene 165(2): 233–238), MDMV-Leader (Maisverzwergungsmosaikvirus) (Virology 154: 9–20), und humanes Immunglobulin-schwere Kette-bindendes Protein (BiP) (Macejak et al. (1991) Nature 353: 90–94); nicht-translatierter Leader aus der Hüllprotein-mRNA von Alfalfamosaikvirus (AMV RNA 4) (Jobling et al. (1987) Nature 325: 622–625); Tabakmosaikvirus-Leader (TMV) (Gallie et al. (1989) in Molecular Biology of RNA, Herausg. Cech (Liss, New York), S. 237–256); und chlorotisches Maisscheckungsvirus (MCMV) (Lommel et al. (1991) Virology 81: 382–385). Siehe auch Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965–968. Andere Verfahren, von denen bekannt ist, dass sie die Translation verstärken, können ebenfalls verwendet werden, z.B. Introns und dergleichen.
Bei der Herstellung der Expressionskassette können die verschiedenen DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass sie dafür sorgen, dass die DNA-Sequenzen in der richtigen Orientierung und, wenn zutreffend, im richtigen Leseraster sind. Zu diesem Zweck können Adapter oder Linker verwendet werden, um die DNA-Fragmente zu verknüpfen, oder es können andere Manipulationen involviert sein, um für zweckmäßige Restriktionsstellen, Entfernung von überflüssiger DNA, Entfernung von Restriktionsstellen oder dergleichen zu sorgen. Zu diesem Zweck können eine in vitro-Mutagenese, Primerreparatur, Restriktion, Annealing, Resubstitutionen, z.B. Transitionen und Transversionen, involviert sein.
In der Durchführung der Erfindung kann eine Reihe von Promotoren verwendet werden. Die Promotoren können auf der Basis des gewünschten Resultats ausgewählt werden. Die Nucleinsäuren können mit konstitutiven, Gewebe-bevorzugten, induzierbaren oder ande ren Promotoren zur Expression im Wirtsorganismus kombiniert werden. Geeignete konstitutive Promotoren zur Verwendung in einer Pflanzenwirtszelle umfassen z.B. den Kernpromotor des Rsyn7-Promotors und andere konstitutive Promotoren, die in WO 99/43838 und im US-Patent Nr. 6,072,050 offenbart sind; den Kern-CaMV 35S-Promotor (Odell et al. (1985) Nature 313: 810–812); Reisactin (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163–171); Ubiquitin (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12: 619–632 und Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675–689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl. Genet. 81: 581–588); MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3: 2723–2730); ALS-Promotor (US-Patent Nr. 5,659,026) und dergleichen. Andere konstitutive Promotoren umfassen z.B. solche, die in den US-Patenten Nrn. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 und 6,177,611 diskutiert werden.
In Abhängigkeit von dem gewünschten Ergebnis kann es günstig sein, das Gen aus einem induzierbaren Promotor zu exprimieren. Zur Regulierung der Expression der Nucleotidsequenzen der Erfindung in Pflanzen sind Wund-induzierbare Promotoren von besonderem Interesse. Solche durch Wunden induzierbare Promotoren können auf eine Schädigung reagieren, die durch Insektenfraß verursacht wird, und umfassen Kartoffelproteinaseinhibitor (Pin II)-Gen (Ryan (1990) Ann. Rev. Phytopath. 28: 425–449; Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 494–498); wun1 und wun2, US-Patent Nr. 5,428,148; win1 und win2 (Stanford et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215: 200–208); Systemin (McGurl et al. (1992) Science 225: 1570–1573); WIP1 (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 783–792; Eckelkamp et al. (1993) FEBS Letters 323: 73–76); MPI-Gen (Corderok et al. (1994) Plant J. 6(2): 141–150) und dergleichen.
Zusätzlich können durch Pathogene induzierbare Promotoren in den Verfahren und Nucleotidkonstrukten der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Solche durch Pathogene induzierbaren Promotoren umfassen solche aus mit Pathogenese in Verbindung stehenden Proteinen (PR-Proteinen), die nach Infektion durch ein Pathogen induziert werden; z.B. PR-Proteine, SAR-Proteine, β-1,3-Glucanase, Chitinase usw. Siehe z.B. Redolfi et al. (1983) Neth. J. Plant Pathol. 89: 245–254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645–656; und Van Loon (1985) Plant Mol. Virol. 4: 111–116. Siehe auch WO 99/43819.
Von Interesse sind Promotoren, die lokal an der Stelle oder nahe der Stelle der Pathogeninfektion exprimiert werden. Siehe z.B. Marineau et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9: 335–342; Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2: 325–331; Somsisch et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2427–2430; Somsisch et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 2: 93–98; und Yang (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 14972–14977. Siehe auch Chen et al. (1996) Plant J. 10: 955–966; Zhang et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2507–2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3: 191–201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1: 961–968; US-Patent Nr. 5,750,386 (Nematoden-induzierbar); und die darin angegebenen Referenzen. Von besonderem Interesse ist der induzierbare Promotor für das Mais-PRms-Gen, dessen Expression durch das Pathogen Fusarium moniliforme induziert wird (siehe z.B. Cordero et al. (1992) Physiol. Mol. Plant Path. 41: 189–200).
Chemikalien-regulierte Promotoren können eingesetzt werden, um die Expression eines Gens in einer Pflanze durch die Anwendung eines exogenen chemischen Regulators zu modulieren. In Abhängigkeit von der Aufgabe kann der Promotor ein Chemikalien-induzierbarer Promotor sein, wenn die Anwendung der Chemikalie eine Genexpression induziert, oder ein durch Chemikalien unterdrückbarer Promotor sein, wenn die Anwendung der Chemikalie die Genexpression unterdrückt. Durch Chemikalien-induzierbare Promotoren sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, den Mais-In2-2-Promotor, der durch Benzolsulfonamidherbizid-Safener aktiviert wird, der Mais-GST-Promotor, der durch hydrophobe elektrophile Verbindungen aktiviert wird, die als Vorlaufherbizide eingesetzt werden, und der Tabak-PR-1a-Promotor, der durch Salicylsäure aktiviert wird. Andere durch Chemikalien regulierte Promotoren von Interesse umfassen auf Steroid reagierende Promotoren (siehe z.B. den Glucokortikoid-induzierbaren Promotor gemäß Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10421–10425 und McNellis et al. (1998) Plant J. 14(2): 247–257) und Tetracyclin-induzierbare und Tetracylin-reprimierbare Promotoren (siehe z.B. Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227: 229–237, und US-Patente Nrn. 5,814,618 und 5,789,156).
Gewebe-bevorzugte Promotoren können verwendet werden, um eine verstärkte pestizide Proteinexpression innerhalb eines bestimmten Pflanzengewebes zu targetieren. Gewebe-bevorzugte Promotoren umfassen solche, die bei Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2) 255–265; Kawamata et al. (1997) Plant Cell Physiol. 38(7): 792–803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3): 337–343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2): 157–168; Rinehart et al. (1996) Plant Physiol. 112(3): 1331–1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2): 525–535; Canevascini et al. (1996) Plant Physiol. 112(2): 513–524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773–778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 181–196; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129–1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20): 9586–9590; und Guevara-Garcia et al. (1993) Plant J. 4(3): 495–505 diskutiert sind. Solche Promotoren können, wenn es notwendig ist, für eine schwache Expression modifiziert werden.
Blatt-spezifische Promotoren sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2): 255–265; Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105: 357–67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5): 773–778; Gotor et al. (1993) Plant J. 3: 509–18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6): 1129–1138; und Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90(20): 9586–9590.
Wurzel-spezifische Promotoren sind bekannt und können aus den vielen aus der Literatur verfügbaren ausgewählt werden oder neu aus verschiedenen kompatiblen Species isoliert werden. Siehe z.B. Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2): 207–218 (Gen für Sojabohnenwurzel-spezifische Glutaminsynthetase); Keller und Baumgartner (1991) Plant Cell 3(10): 1051–1061 (Wurzel-spezifisches Kontrollelement im GRP 1.8-Gen der Gartenbohne); Sanger et al. (1990) Plant Mol. Biol. 14(3): 433–443 (Wurzel-spezifischer Promotor des Mannopinsynthase (MAS)-Gens von Agrobacterium tumefaciens); und Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1): 11–22 (Volllängen-cDNA-Klon, der für cytosolische Glutaminsynthetase (GS) codiert, die in Wurzeln und Wurzelknoten von Sojabohnen exprimiert wird). Siehe auch Bogusz et al. (1990) Plant Cell 2(7): 633–641, worin zwei Wurzel-spezifische Promotoren beschrieben werden, die aus Hämoglobingenen aus Stickstoff-fixierenden Nicht-Legumen Andersonii und der verwandten Nicht-Stickstoff-fixierenden Nicht-Legume Trema tomentosa isoliert werden. Die Promotoren dieser Gene waren an ein β-Glucuronidase-Reportergen gebunden und wurden sowohl in die Nicht-Legume Nicotiana tabacum als auch in die Legume Lotus corniculatus eingeführt, und in beiden Fällen wurde Wurzel-spezifische Promotoraktivität konserviert. Leach und Aoyagi (1991) beschreiben ihre Analyse der Promotoren der stark exprimierten Wurzel-induzierenden rolC- und rolD-Gene von Agrobacterium rhizogenes (siehe Plant Science (Limerick) 79(1): 69–76). Sie zogen den Schluss, dass Enhancer und Gewebe-bevorzugte DNA-Determinanten in diesen Promotoren dissoziiert sind. Teeri et al. (1989) verwendeten eine Genfusion an lacZ, um zu zeigen, dass das Agrobacterium-T-DNA-Gen, das für Octopinsynthase codiert, speziell in der Epidermis der Wurzelspitzen aktiv ist, und dass das TR2'-Gen in der intakten Pflanze Wurzel-spezifisch ist und durch Wundbildung im Blattgewebe stimuliert wird, eine zur Verwendung mit einem insektiziden oder larviziden Gen besonders wünschenswerte Kombination von Merkmalen (siehe EMBO J. 8(2): 343–350). Das TR1'-Gen, fusioniert an nptII (Neomycinphosphotransferase II), zeigte ähnliche Merkmale. Zusätzliche Wurzel-bevorzugende Promotoren umfassen den VfENOD-GRP3-Gen-Promotor (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29(4): 759–772); und den rolB-Promotor (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25(4): 681–691. Siehe auch die US-Patente Nrn. 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732 und 5,023,179.
"Samen-bevorzugte" Promotoren umfassen sowohl "Samen-spezifische" Promotoren (solche Promotoren, die während der Samenentwicklung aktiv sind, z.B. Promotoren von Samenspeicherproteinen), wie auch "Samen-keimende" Promotoren (solche Promotoren, die während der Samenkeimung aktiv sind). Siehe Thompson et al. (1989) BioEssays 10: 108, die hier durch Referenz aufgenommen wird. Solche bevorzugt in Samen auftretenden Promotoren umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Cim1 (Cytokinin-induzierte Message); cZ19B1 (Mais-19 kDa-Zein), Milps (Myo-Inositol-1-Phosphat-Synthase) und celA (Cellulosesynthase) (siehe WO 00/11177, hierin durch Referenz aufgenommen). Gama-Zein ist ein bevorzugter Endosperm-spezifischer Promotor. Glob-1 ist ein bevorzugter Embryo-spezifischer Promotor. Für Dikotyle umfassen Samen-spezifische Promotoren, sind aber nicht auf diese beschränkt, Bohnen-β-Phaseolin, Napin, β-Conglycinin, Sojabohnenlectin, Cruciferin und dergleichen. Für Monokotyle umfassen Samen-spezifische Promotoren Mais-15 kDa-Zein, -22 kDa-Zein, -27 kDa-Zein, g-Zein, Waxy, Shrunken 1, Shrunken 2, Globulin 1 usw., sind aber nicht auf diese beschränkt. Siehe auch WO 00/12733, wo Samen-bevorzugte Promotoren von end1- und end2-Genen offenbart sind.
Wenn eine Expression auf niedrigem Level gewünscht wird, werden schwache Promotoren verwendet werden. Im Allgemeinen ist mit "schwacher Promotor" ein Promotor gemeint, der die Expression einer codierenden Sequenz auf niedrigem Level steuert. Mit niedrigem Level sind Level von etwa 1/1000 Transkripten bis etwa 1/100.000 Transkripte bis etwa 1/500.000 Transkripte gemeint. Alternativ wird anerkannt, dass schwache Promotoren auch Promotoren umfassen, die in nur wenigen Zellen und nicht in anderen exprimiert werden, so dass insgesamt ein niedriger Expressionslevel erhalten wird. Wo ein Promotor bei inakzeptabel hohen Leveln exprimiert wird, können Teile der Promotorsequenz deletiert oder modifiziert werden, um die Expressionslevel zu senken.
Solche schwachen konstitutiven Promotoren umfassen z.B. den Kernpromotor des Rsyn7-Promotors (WO 99/43838 und US-Patent Nr. 6,072,050), den Kern-35S-CaMV- Promotor und dergleichen. Andere konstitutive Promotoren umfassen z.B. US-Patente Nrn. 5,608,149; 5,608,144; 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 und 6,177,611.
Im allgemeinen wird die Expressionskassette ein selektierbares Markergen für die Selektion von transformierten Zellen umfassen. Selektierbare Markergene werden für die Selektion von transformierten Zellen oder Geweben genutzt. Markergene umfassen Gene, die für Antibiotikumresistenz codieren, z.B. solche, die für Neomycinphosphotransferase II (NEO) und Hygromycinphosphotransferase (HPT) codieren, wie auch Gene, die Resistenz gegenüber herbiziden Verbindungen, z.B. Glufosinatammonium, Bromoxynil, Imidazolinone und 2,4-Dichlorphenoxyacetat (2,4-D), verleihen. Siehe allgemein Yarranton (1992) Curr. Opin. Biotech. 3: 506–511; Christopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6314–6318; Yao et al. (1992) Cell 71: 63–72; Reznikoff (1992) Mol. Microbiol. 6: 2419–2422; Barkley et al. (1980) in The Operon, S. 177–220; Hu et al. (1987) Cell 48: 555–566; Brown et al. (1987) Cell 49: 603–612; Figge et al. (1988) Cell 52: 713–722; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Aci. USA 86: 5400–5404; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2549–2553; Deuschle et al. (1990) Science 248: 480–483; Gossen (1993) Ph. D. Thesis, University of Heidelberg; Reines et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 1917–1921; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3343–3356; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3952–3956; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 5072–5076; Wyborski et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4647–4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol. Struc. Biol. 10: 143–162; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35: 1591–1595; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27: 1094–1104; Bonin (1993) Ph. D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5547–5551; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36: 913–919; Hlavka et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Band 78 (Springer-Verlag, Berlin); Gill et al. (1988) Nature 334: 721–724.
Die obige Liste selektierbarer Markergene ist nicht limitierend gemeint. In der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiges selektierbares Markergen verwendet werden.
Transformationsprotokolle sowie Protokolle zur Einführung von Nucleotidsequenzen in Pflanzen können in Abhängigkeit vom Typ der Pflanze oder der Pflanzenzelle, d.h. Monokotyle oder Dikotyle, die zur Transformation targetiert wird, variieren. Geeignete Verfahren zur Einführung von Nucleotidsequenzen in Pflanzenzellen und anschließende Insertion in das Pflanzengenom umfassen Mikroinjektion (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4: 320–334), Elektroporation (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 5602–5606, Agrobacterium-vermittelte Transformation (Townsend et al., US-Patent Nr. 5,563,055; Zhao et al., US-Patent Nr. 5,981,840), direkten Gentransfer (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3: 2717–2722), und ballistische Partikelbeschleunigung (siehe z.B. Sanford et al., US-Patent Nr. 4,945,050; Tomes et al., US-Patent Nr. 5,879,918; Tomes et al., US-Patent Nr. 5,886,244; Bidney et al., US-Patent Nr. 5,932,782; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, und Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg und Phillips (Springer-Verlag, Berlin); und McCabe et al. (1988) Biotechnology 6: 923–926); und Lec1-Transformation (WO 00/28058). Für eine Kartoffeltransformation siehe Tu et al. (1998) Plant Molecular Biology 37: 829–838 und Chong et al. (2000) Transgenic Research 9: 71–78. Weitere Tranformationsverfahren können in Weissinger et al. (1988) Ann. Rev. Genet. 22: 421–477; Sanford et al. (1987) Particulate Science and Technology 5: 27–37 (Zwiebel); Christou et al. (1988) Plant Physiol. 87: 671–674 (Sojabohne); McCabe et al. (1988) Bio/Technology 6: 923–926 (Sojabohne); Finer und McMullen (1991) In Vitro Cell Dev. Biol. 27P: 175–182 (Sojabohne); Singh et al. (1998) Theor. Appl. Genet. 96: 319–324 (Sojabohne); Datta et al. (1990) Biotechnology 8: 736–740 (Reis); Klein et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4305–4309 (Mais); Klein et al. (1988) Biotechnology 6: 559–563 (Mais); Tomes, US-Patent Nr. 5,240,855; Buising et al., US-Patente Nrn. 5,322,783 und 5,324,646; Tomes et al. (1995) "Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells via Microprojectile Bombardment," in Plant Cell, Tissue, und Organ Culture: Fundamental Methods, Hrsg. Gamborg (Springer-Verlag, Berlin) (Mais); Klein et al. (1988) Plant Physiol. 91: 440–444 (Mais); Fromm et al. (1990) Biotechnology 8: 833–839 (Mais); Hooykaas-Van Slogteren et al. (1984) Nature (London) 311: 763–764; Bowen et al., US-Patent Nr. 5,736,369 (Getreide); Bytebier et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 5345–5349 (Liliaceae); De Wet et al. (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, Hersg. Chapman et al. (Longman, New York), S. 197–209 (Pollen); Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reports 9: 415–418 und Kaeppler et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 84: 560–566 (Whisker-vermittelte Transformation); D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4: 1495–1505 (Elektroporation); Li et al. (1993) Plant Cell Reports 12: 250–255 und Christou und Ford (1995) Annals of Botany 75: 407–413 (Reis); Osjoda et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 745–750 (Mais via Agrobacterium tumefaciens) gefunden werden.
Die Zellen, die transformiert wurden, können auf herkömmlichen Wegen zu Pflanzen wachsen gelassen werden. Siehe z.B. McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81–84. Diese Pflanzen können dann wachsen gelassen werden und entweder mit demselben transformierten Stamm oder unterschiedlichen Stämmen bestäubt werden und die resultierenden Hybride, die eine konstitutive oder induzierbare Expression des gewünschten Phänotyp-Merkmals hat, identifiziert werden. Es können zwei oder mehr Generationen wachsen gelassen werden, um sicherzustellen, dass eine Expression des phänotypischen Merkmals stabil gehalten wird und vererbt wird, und dann werden Samen geerntet, um sicherzustellen, dass die Expression des gewünschten phänotypischen Merkmals erreicht wurde.
Die Nucleotidsequenzen der Erfindung können der Pflanze bereitgestellt werden, indem die Pflanze mit einem Virus oder mit viralen Nucleinsäuren in Kontakt gebracht wird. Im Allgemeinen involvieren solche Verfahren den Einbau des Nucleotidkonstrukts von Interesse in ein virales DNA- oder RNA-Molekül. Es ist einzusehen, dass die rekombinanten Proteine der Erfindung zunächst als Teil eines viralen Polyproteins synthetisiert werden können, welches später durch in vivo- oder in vitro-Proteolyse prozessiert wird, um das gewünschte pestizide Protein zu produzieren. Es wird auch erkannt, dass ein solches virales Polyprotein, das wenigstens einen Teil der Aminosäuresequenz eines pestiziden Proteins der Erfindung umfasst, die gewünschte pestizide Aktivität haben kann. Solche viralen Polyproteine und die Nucleotidsequenzen, die für sie codieren, werden von der vorliegenden Erfindung umfasst. Verfahren zur Bereitstellung von Pflanzen mit Nucleotidkonstrukten und zur Herstellung der codierten Proteine in der Pflanze, die virale DNA- oder RNA-Moleküle involvieren, sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. US-Patente Nrn. 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367 und 5,316,931.
Die Erfindung bezieht sich außerdem auf Pflanzen-vermehrendes Material einer transformierten Pflanze der Erfindung, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Samen, Knollen, Cormus, Zwiebeln, Blätter und Ableger von Wurzeln und Schößlingen.
Die vorliegende Erfindung kann zur Transformation beliebiger Pflanzenspecies, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Monokotylen und Dikotylen, eingesetzt werden. Beispiele für Pflanzen von Interesse umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Mais (Zea mays), Brassica sp. (z.B. B. napus, B. rapa, B. juncea), insbesondere solche Brassica-Species, die als Quellen für Samenöl nützlich sind, Alfalfa (Medicago saliva), Reis (Oryza sativa), Roggen (Secale cereale), Sorghum (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), Hirse (z.B. Perlhirse (Penni setum glaucum), Rispenhirse (Panicum miliaceum), Kolbenhirse (Setaria italica), Fingerhirse (Eleusine coracana)), Sonnenblume (Helianthus annuus), Saflor (Carthamus tinctorius), Weizen (Triticum aestivum), Sojabohne (Glycine max), Tabak (Nicotiana tabacum), Kartoffel (Solanum tuberosum), Erdnüsse (Arachis hypogaea), Baumwolle (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), Süßkartoffel (Ipomoea batatus), Manihot (Manihot esculenta), Kaffee (Coffea spp.), Kokosnuss (Cocos nucifera), Ananas (Ananas comosus), Citrusbäume (Citrus spp.), Kakao (Theobroma cacao), Tee (Camellia sinensis), Banane (Musa spp.), Avocado (Persea americana), Feige (Ficus casica), Guava (Psidium guajava), Mango (Mangifera indica), Olive (Olea europaea), Papaya (Carica papaya), Cashew (Anacardium occidentale), Macadamia (Macadamia integrifolia), Mandel (Prunus amygdalus), Zuckerrüben (Beta vulgaris), Zuckerrohr (Saccharum spp.), Hafer, Gerste, Gemüse, Zierpflanzen und Coniferen.
Gemüse umfassen Tomaten (Lycopersicon esculentum), Salat (z.B. Lactuca sativa), grüne Bohnen (Phaseolus vulgaris), Limabohnen (Phaseolus limensis), Erbsen (Lathyrus spp.), und Mitglieder der Gattung Cucumis, z.B. Gurke (C. sativus), Melone (C. cantalupensis), und Zuckermelone (C. melo). Zierpflanzen umfassen Azaleen (Rhododendron spp.), Hortensie (Macrophylla hydrangea), Hibiscus (Hibiscus rosasanensis), Rosen (Rosa spp.), Tulpen (Tulipa spp.), Narzissen (Narcissus spp.), Petunien (Petunia hybrida), Gartennelke (Dianthus caryophyllus), Weihnachtsstern (Euphorbia pulcherrima), und Chrysanthemen. Coniferen, die in der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen z.B. Kiefern, z.B. Weihrauchkiefer (Pinus taeda), Karibische Kiefer (Pinus elliotii), Gelbkiefer (Pinus ponderosa), Rehkiefer (Pinus contorta), und Monterey-Kiefer (Pinus radiata); Douglasien (Pseudotsuga menziesii); Westeramerikanische Hemlocktanne (Tsuga canadensis); Sitka-Fichte (Picea glauca); Redwood (Sequoia sempervirens); echte Tannen, z.B. Silbertanne (Abies amabilis) und Balsamtanne (Abies balsamea); und Zedern, z.B. Rote Zeder (Thuja plicata) und Alaska-Scheinzypresse (Chamaecyparis nootkatensis). Pflanzen der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise Nutzpflanzen bzw. Kulturpflanzen (z.B. Mais, Alfalfa, Sonnenblume, Brassica, Sojabohne, Baumwolle, Saflor, Erdnuss, Sorghum, Weizen, Hirse, Tabak usw.) und sind bevorzugter Mais- und Sojapflanzen, noch bevorzugter Maispflanzen.
Pflanzen von besonderem Interesse umfassen Kornpflanzen, die Samen von Interesse liefern, Ölsamenpflanzen und leguminosen Pflanzen. Samen von Interesse umfassen Körnersamen bzw. Getreidesamen, z.B. Mais, Weizen, Gerste, Reis, Sorghum, Roggen, Hirse usw. Ölsamenpflanzen umfassen Baumwolle, Sojabohne, Safflor, Sonnenblume, Brassica, Mais, Alfalfa, Palme, Kokosnuss, Flachs, Rizinus, Olive usw. Leguminosenartige Pflanzen umfassen Bohnen und Erbsen. Bohnen umfassen Guar, Johannisbrotkerne, Boxhornklee, Sojabohne, Gartenbohnen, Kuherbse, Mungbohne, Limabohne, Puffbohne, Linsen, Kichererbse usw.
Bevor Pflanzenvermehrungsmaterial (Früchte, Knollen, Zwiebeln, Cormus, Körner, Samen), aber speziell Samen, als kommerzielles Produkt verkauft wird, wird es üblicherweise mit einer Schutzbeschichtung, die Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematizide, Molluscizide oder Gemische von verschiedenen dieser Präparationen, wenn gewünscht, zusammen mit Trägern, oberflächenaktiven Mitteln oder die Ausbringung begünstigenden Andjuvanzien, umfassen, behandelt. Dabei werden die eingesetzt, die üblicherweise auf dem Gebiet der Formulierung verwendet werden, um Schutz gegen eine von Bakterien, Pilzen oder Tierschädlingen verursachter Schädigung zu verleihen. Um die Samen zu behandeln, kann die Schutzbeschichtung entweder durch Imprägnieren der Knollen oder Körner mit einer flüssigen Formulierung oder durch Beschichten mit einer kombinierten nassen oder trockenen Formulierung aufgetragen werden. Außerdem sind in speziellen Fällen andere Aufbringungsverfahren auf Pflanzen, z.B. eine Behandlung, die auf Knospen oder Früchte gerichtet ist, möglich.
Der Pflanzensamen der Erfindung, der ein DNA-Molekül umfasst, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein pestizides Protein der Erfindung codiert, kann mit einer Samenschutzbeschichtung behandelt werden, die eine Samenbehandlungsverbindung, z.B. Captan, Carboxin, Thiram, Methalaxyl, Pirimiphos-Methyl und andere, die üblicherweise in der Samenbehandlung eingesetzt werden, umfasst, behandelt werden. In einer Ausführungsform im Rahmen der Erfindung wird eine Samenschutzbeschichtung, die eine pestizide Zusammensetzung der Erfindung umfasst, allein oder in Kombination mit einer der Samenschutzbeschichtungen, die üblicherweise in der Samenbehandlung eingesetzt werden, verwendet.
Es ist einzusehen, dass die Gene, die für die pestiziden Proteine codieren, eingesetzt werden können, um pathogene Insektenorganismen zu transformieren. Solche Organismen umfassen Baculoviren, Fungi, Protozoen, Bakterien und Nematoden.
Ein Gen, das für ein pestizides Protein der Erfindung codiert, kann über einen geeigneten Vektor in einen mikrobiellen Wirt eingeführt werden und dieser Wirt kann auf die Umgebung oder auf Pflanzen oder Tiere angewendet werden. Der Ausdruck "eingeführt" im Kon text mit Insertieren einer Nucleinsäure in eine Zelle bedeutet "Transfektion" oder "Transformation" oder "Transduktion" und beinhaltet eine Bezugnahme auf den Einbau einer Nucleinsäure in eine eukaryotische oder prokaryotische Zelle, wobei die Nucleinsäure in das Genom der Zelle (z.B. Chromosom, Plasmid, Pastid oder mitochondriale DNA) eingebaut werden kann, in ein autonomes Replikon umgewandelt werden kann oder transient exprimiert werden kann (z.B. transfizierte mRNA).
Mikroorganismenwirte, von denen bekannt ist, dass sie die "Phytosphäre" (Blattfläche, Phyllosphäre, Rhizosphäre und/oder Rhizoplan) einer oder mehrerer Nutzpflanzen von Interesse besetzen, können ausgewählt werden. Diese Mikroorganismen werden so ausgewählt, dass sie fähig sind, in der besonderen Umgebung mit den Wildtyp-Mikroorganismen erfolgreich zu konkurrieren, für eine stabile Haltung und Expression des Gens, das das pestizide Protein exprimiert, sorgen und wünschenswerter Weise für einen verbesserten Schutz des Pestizids vor einem Umweltabbau und einer Umweltinaktivierung sorgen. Solche Mikroorganismen umfassen Bakterien, Algen und Fungi. Von besonderem Interesse sind Mikroorganismen, z.B. Bakterien wie beispielsweise Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc und Alcaligenes, Fungi, insbesondere Hefen, z.B. Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula und Aureobasidium. Von besonderem Interesse sind solche Phytosphären-Bakterienspecies wie Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacter xyli und Azotobacter vinlandir und Phytosphären-Hefespecies, z.B. Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae und Aureobasidium pollulans. Von besonderem Interesse sind die pigmentierten Mikroorganismen.
Es ist eine Reihe von Wegen zur Einführung eines Gens, das das pestizide Protein exprimiert, in den Mikroorganismenwirt unter Bedingungen, die für eine stabile Aufrechterhaltung und Expression des Gens sorgen, verfügbar. Beispielsweise können Expressionskassetten konstruiert werden, welche die Nucleotidkonstrukte von Interesse funktionell mit den transkriptionalen und translationalen regulatorischen Signalen zur Expression der Nucleotidkonstrukte und eine Nucleotidsequenz, welche mit einer Sequenz im Wirtsorganismus ho molog ist, wodurch eine Integration erfolgen wird, und/oder ein Replicationssystem, das in dem Wirt funktionell ist, wodurch eine Integration oder eine stabile Aufrechterhaltung erfolgen wird, enthalten.
Transkriptionale und translationale regulatorische Signale umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Promotoren, Transkriptioninitiationsstartstellen, Operatoren, Aktivatoren, Enhancer, andere regulatorische Elemente, ribosomale Bindungsstellen, ein Initiationscodon, Terminationssignale und dergleichen. Siehe z.B. US-Patente Nrn. 5,039,523 und 4,853,331; EPO 0 480 762 A2; Sambrook et al. (1992) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Hrsg. Maniatis et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York); Davis et al., Hrsg. (1980) Advanced Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory Press), Cold Spring Harbor, New York; und die darin zitierten Referenzen.
Geeignete Wirtszellen, in denen pestizides Protein-enthaltende Zellen behandelt werden, um die Aktivität der pestiziden Proteine in der Zelle zu verlängern, wenn die behandelte Zelle auf die Umgebung des Zielschädlings (der Zielschädlinge) ausgebracht wird, können entweder Prokaryoten oder Eurkaryoten umfassen, die normalerweise auf solche Zellen beschränkt sind, die keine Substanzen produzieren, die für höhere Organismen, z.B. Säuger, toxisch sind. Allerdings könnten Organismen, die Substanzen produzieren, die für höhere Organismen toxisch sind, verwendet werden, wobei das Toxin instabil ist oder der Ausbringungslevel ausreichend niedrig ist, um eine Toxizitätsmöglichkeit für einen Säugerwirt zu vermeiden. Als Wirte von besonderem Interesse werden die Prokaryoten und die niederen Eukaryoten, z.B. Pilze, sein. Typische Prokaryoten, sowohl Gram-negative als auch Gram-positive, umfassen Enterobacteriaceae, z.B. Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella und Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, z.B. Rhizobium; Spirillaceae, z.B. Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, z.B. Pseudomonas und Acetobacter; Azotobacteraceae und Nitrobacteraceae. Unter Eukaryoten sind Fungi, z.B. Phycomycetes und Ascomycetes, die Hefe umfassen, z.B. Saccharomyces und Schizosaccharomyces; und Basidiomycetes-Hefe, z.B. Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces und dergleichen.
Charakteristika von besonderem Interesse bei der Auswahl einer Wirtszelle zu Zwecken der Produktion von pestizidem Protein umfassen die Einfachheit der Einführung des pestiziden Proteingens in den Wirt, die Verfügbarkeit von Expressionssystemen, die Effizienz der Expression, die Stabilität des Proteins in dem Wirt und das Vorliegen von unterstützenden genetischen Möglichkeiten. Charakteristika von Interesse zur Verwendung als Pestizid-Mikrokapseln umfassen schützende Qualitäten für das Pestizid, z.B. dicke Zellwände, Pigmentierung und intrazelluläre Verpackung oder Bildung von Einschlusskörpern; Blattaffinität; Fehlen von Säugertoxizität; Anziehungsvermögen für Schädlinge zur Aufnahme; Einfachheit des Abtötens und der Fixierung ohne Schädigung des Toxins und dergleichen. Weitere Betrachtungen umfassen die Einfachheit der Formulierung und Handhabung, wirtschaftliche Aspekte, Lagerungsstabilität und dergleichen.
Wirtsorganismen von besonderem Interesse umfassen Hefe, z.B. Rhodotorula sp., Aureobasidium sp., Saccharomyces sp. und Sporobolomyces sp., phylloplane Organismen, z.B. Pseudomonas sp., Erwinia Sp. und Flavobacterium sp., und andere derartige Organismen, einschließlich Pseudomonas aeurginosa, Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis und dergleichen.
Gene, die für die pestiziden Proteine der Erfindung codieren, können in Mikroorganismen eingeführt werden, die sich auf Pflanzen (Epiphyten) unter Abgabe pestizider Proteine an potentielle Zielschädlinge vermehren. Epiphyten können z.B. Gram-positive oder Gramnegative Bakterien sein.
Wurzeln-besiedelnde Bakterien beispielsweise können von der Pflanze von Interesse durch fachbekannte Verfahren isoliert werden. Spezifischer ausgedrückt, ein Bacillus cereus-Stamm, der Wurzeln besiedelt, kann von den Wurzeln einer Pflanze isoliert werden (siehe z.B. Handelsman et al. (1991) Appl. Environ. Microbiol. 56: 713–718). Gene, die für die pestiziden Proteine der Erfindung codieren, können durch Standardverfahren, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, in ein Wurzel-besiedelndes Bacillus cereus eingeführt werden.
Gene, die für pestizide Proteine codieren, können z.B. in das Wurzeln-besiedelnde Bacillus mittels Elektrotransformation eingeführt werden. Spezifischer ausgedrückt, Gene, die für die pestiziden Proteine codieren, können einen Shuttle-Vektor, z.B. pHT3101 kloniert werden (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 211–218). Der Shuttle-Vektor pHT3101, der die codierende Sequenz für das bestimmte pestizide Proteingen enthält, kann z.B. in das Wurzeln-besiedelnde Bacillus durch Elektroporation transformiert werden (Lerecius et al. (1989) FEMS Microbiol. Letts. 60: 211–218).
Expressionssysteme können so konzipiert sein, dass pestizide Proteine aus dem Cytoplasma von Gram-negativen Bakterien, z.B. E. coli, sekretiert werden. Vorteile einer Sekretion von pestiziden Proteinen sind: (1) Vermeiden potentieller cytotoxischer Wirkungen des exprimierten pestiziden Proteins und (2) Verbesserung in der Reinigungswirksamkeit des pestiziden Proteins, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, erhöhte Wirksamkeit bei der Gewinnung und Reinigung des Proteins pro Volumen Zellbrühe und verminderte Zeit und/oder Kosten der Gewinnung und Reinigung pro Einheit Protein.
Es kann erreicht werden, dass pestizide Proteine in E. coli sezerniert werden, indem z.B. ein geeignetes E. coli-Signalpeptid an das Amino-terminale Ende des pestiziden Proteins fusioniert wird. Signalpeptide, die durch E. coli erkannt werden, können in Proteinen gefunden werden, von denen bereits bekannt ist, dass sie in E. coli sezerniert werden, z.B. das OmpA-Protein (Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3: 2437–2442). OmpA ist ein Hauptprotein der E. coli-Außenmembran und somit ihr Signalpeptid, von dem angenommen wird, dass es im Translokationsprozess effizient ist. Das OmpA-Signalpeptid braucht vor einem Prozessieren nicht modifiziert zu werden, wie es bei anderen Signalpeptiden der Fall sein kann, z.B. beim Lipoproteinsignalpeptid (Duffaud et al. (1987) Meth. Enzymol. 153: 492).
Pestizide Proteine der Erfindung können in einem Bakterienwirt fermentiert werden und die resultierenden Bakterien prozessiert und als mikrobielles Spray in derselben Art wie Bacillus thuringienses-Stämme verwendet werden, welche als insektizide Sprays verwendet wurden. Im Fall eines pestiziden Proteins (von pestiziden Proteinen), das/die von Bacillus sezerniert wird/werden, wird das Sekretionssignal entfernt oder mutiert, indem Verfahren verwendet werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Solche Mutationen und/oder Deletionen verhindern eine Sekretion des pestiziden Proteins (der pestiziden Proteine) in das Wachstumsmedium während des Fermentationsprozesses. Die pestiziden Proteine werden in der Zelle zurückgehalten und die Zellen werden dann prozessiert, um die verkapselten pestiziden Proteine zu erhalten. Zu diesem Zweck kann ein beliebiger geeigneter Mikroorganismus verwendet werden. Pseudomonas wurde verwendet, um Bacillus thuringiensis-Endotoxine als eingekapselte Proteine zu exprimieren, und die resultierenden Zellen wurden prozessiert und als Insektizid versprüht (Gaertner et al. (1993), in: Advanced Engineered Pesticides, Hrsg. Kim).
Alternativ werden die pestiziden Proteine produziert, indem ein heterologes Gen in einen zellulären Wirt eingeführt wird. Eine Expression des heterologen Gens resultiert direkt oder indirekt in der intrazellulären Produktion und Aufrechterhaltung des Pestizids. Diese Zellen werden dann unter Bedingungen behandelt, die die Aktivität des Toxins verlängern, das in der Zelle produziert wird, wenn die Zelle auf die Umgebung eines Zielschädlings (von Zielschädlingen) ausgetragen wird. Das resultierende Produkt behält die Toxizität des Toxins bei. Diese natürlich verkapselten pestiziden Proteine können dann gemäß herkömmlicher Techniken zur Ausbringung auf die Umgebung, die einen Zielschädling beherbergt, z.B. Boden, Wasser und Blattwerk von Pflanzen, formuliert werden. Siehe z.B. EP-A 0 192 319 und die darin zitierten Referenzen.
In der vorliegenden Erfindung können ein transformierter Mikroorganismus, welcher ganze Organismen, Zellen, Spore(n), pestizides Protein (pestizide Proteine), pestizide Komponente(n), Schädlinge-bekämpfende Komponente(n), Mutante(n) umfasst; vorzugsweise lebende oder tote Zellen und Zellkomponenten, einschließlich Gemische lebender und toter Zellen und Zellkomponenten und einschließlich gebrochener Zellen und Zellkomponenten, oder ein isoliertes pestizides Protein mit einem annehmbaren Träger zu einer pestiziden Zusammensetzung (zu pestiziden Zusammensetzungen), d.h. z.B. eine Suspension, eine Lösung, eine Emulsion, ein Stäubungspulver, ein dispergierbares Granulat, ein Spritzpulver und ein emulgierbares Konzentrat, ein Aerosol, imprägnierte Körner, ein Adjuvans, eine auftragbare Paste und auch Verkapselungen, in z.B. Polymersubstanzen, formuliert werden.
Derartige Zusammensetzungen, die oben offenbart sind, können durch Zusatz eines oberflächenaktiven Mittels, eines inerten Trägers, eines Konservierungsmittels, eines Feuchthaltemittels, eines Freßstimulans, eines Lockstoffs, eines Einkapselungsmittels, eines Bindemittels, eines Emulgators, eines Farbstoffs, eines UV-Schutzmittels, eines Puffers, eines Fließmittels oder Düngers, Mikronährstoff-Donoren oder anderer Präparationen, die das Pflanzenwachstum beeinflussen, erhalten werden. Eine Agrochemikalie oder mehrere Agrochemikalien, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Herbizide, Insektizide, Fungizide, Bakterizide, Nematozide, Molluscizide, Acarazide, Pflanzenwachstumsregulatoren, Erntehilfsmittel und Dünger können mit Trägerstoffen, oberflächenaktiven Mitteln oder Adjuvanzien, die üblicherweise auf dem Gebiet der Formulierung verwendet werden, oder mit anderen Komponenten zur Erleichterung der Produkthandhabung und der Anwendung für besondere Zielschädlinge kombiniert werden. Geeignete Träger und Hilfsstoffe können fest oder flüssig sein und entsprechen den Substanzen, die üblicherweise in der Formulierungstechnologie verwendet werden, z.B. natürliche oder regenerierte mineralische Substanzen, Lösungsmittel, Dispergiermittel, Netzmittel, Klebrigmacher, Bindemittel oder Dünger. Die aktiven Ingredienzien der vorliegenden Erfindung werden normalerweise in Form von Zusammensetzungen angewendet und können auf die Nutzpflanzenfläche oder die Pflanze, die zu behandeln ist, gleichzeitig oder nacheinander mit anderen Verbindungen angewendet werden. Verfahren zur Anwendung bzw. Ausbringung eines aktiven Ingrediens der vorliegenden Erfindung oder einer agrochemischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die wenigstens eines der pestiziden Proteine enthält, die durch die Bakterienstämme der vorliegenden Erfindung produziert werden, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Ausbringung auf Blätter, Samenbeschichtung und Ausbringung auf den Boden. Die Anzahl der Anwendungen bzw. Ausbringungen und die Anwendungsrate hängen von der Intensität des Befalls durch den entsprechenden Schädling ab.
Geeignete oberflächenaktive Mittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, anionische Verbindungen, z.B. ein Carboxylat von beispielsweise einem Metall; ein Carboxylat einer langkettigen Fettsäure; ein N-Acylsarcosinat; Mono- oder Diester von Phosphorsäure mit Fettalkoholethoxylaten oder Salze solcher Ester; Fettalkoholsulfate, z.B. Natriumdodecylsulfat, Natriumoctadecylsulfat oder Natriumcetylsulfat; ethoxylierte Fettalkoholsulfate; ethoxylierte Alkylphenylsulfate; Ligninsulfonate; Petroleumsulfonate; Alkylarylsulfonate, z.B. Alkylbenzolsulfonate oder Niederalkylnaphthalinsulfonate, z.B. Butylnaphthalinsulfonat; Salze von sulfonierten Naphthalin-Formaldehyd-Kondensaten; Salze von sulfonierten Phenol-Formaldehyd-Kondensaten; komplexere Sulfonate, z.B. die Amidsulfonate, z.B. das sulfonierte Kondensationsprodukt von Ölsäure und N-Methyltaurin oder die Dialkylsulfosuccinate, z.B. Natriumsulfonat oder Dioctylsuccinat. Nicht-ionische Agenzien umfassen Kondensationsprodukte von Fettsäureestern, Fettalkoholen, Fettsäureamiden oder Fettalkyl- oder Alkenyl-substituierten Phenolen mit Ethylenoxid, Fettsäureester von mehrwertigen Alkoholethern, z.B. Sorbitanfettsäureester, Kondensationsprodukte solcher Ester mit Ethylenoxid, z.B. Polyoxyethylensorbitanfettsäureester, Blockcopolymere von Ethylenoxid und Propylenoxid, Acetylenglykole, z.B. 2,4,7,9-Tetraethyl-5-decin-4,7-diol oder ethoxylierte acetylenische Glykole. Beispiele für ein kationisches oberflächenaktives Mittel umfassen z.B. ein aliphatisches Mono-, Di- oder Polyamin, z.B. ein Acetat, Naphthenat oder Oleat; oder ein sauerstoffhaltiges Amin, z.B. ein Aminoxid von Polyoxyethylenalkylamin; ein Amid-verknüpftes Amin, hergestellt durch Kondensation einer Carbonsäure mit einem Di- oder Polyamin, oder ein quaternäres Ammoniumsalz.
Beispiele für inerte Materialien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, anorganische Materialien wie Kaolin, Phyllosilicate, Carbonate, Sulfate, Phosphate oder botanische Materialien wie Kork, gepufferte Maiskolben, Erdnussschalen, Reishüllen und Walnussschalen.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer geeigneten Form zur direkten Anwendung bzw. Ausbringung oder als Konzentrat einer Primärzusammensetzung, die eine Verdünnung mit einer geeigneten Menge an Wasser oder einem anderen Verdünnungsmittel vor der Anwendung erfordert, sein. Die pestizide Konzentration wird in Abhängigkeit von der Natur der bestimmten Formulierung, spezifischerweise, ob sie ein Konzentrat ist oder direkt zu verwenden ist, abhängen. Die Zusammensetzung enthält 1 bis 98% eines festen oder flüssigen inerten Trägers und 0 bis 50%, vorzugsweise 0,1 bis 50% eines oberflächenaktiven Mittels. Diese Zusammensetzungen werden in der auf dem Etikett angegebenen Rate für das kommerzielle Produkt, vorzugsweise 0,01 lb bis 5,0 lb pro acre, wenn sie in trockner Form vorliegen, und mit etwa 0,01 pts. bis 10 pts. pro acre, wenn sie in flüssiger Form vorliegen, verabreicht werden.
In einer weiteren Ausführungsform können die Zusammensetzungen wie auch die transformierten Mikroorganismen und pestiziden Proteine der Erfindung vor einer Formulierung behandelt werden, um die pestizide Aktivität zu verlängern, wenn sie auf die Umgebung eines Zielschädlings angewendet werden, solange wie die Vorbehandlung für die Aktivität nicht schädlich ist. Eine solche Behandlung kann durch chemische und/oder physikalische Mittel erfolgen, solange die Behandlung die Eigenschaften der Zusammensetzung(en) nicht nachteilig beeinflusst. Beispiele für chemische Reagenzien umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Halogenierungsmittel; Aldehyde, z.B. Formaldehyd und Glutaraldehyd; Anti-Infektiva, z.B. Zephiranchlorid; Alkohole, z.B. Isopropanol und Ethanol; und histologische Fixativa, z.B. Bouin's Fixativ und Helly's Fixativ (siehe z.B. Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W. H. Freeman und Co.)).
In anderen Ausführungsformen der Erfindung kann es vorteilhaft sein, die Cry8-artigen Polypeptide mit einer Protease, z.B. Trypsin, zu behandeln, um das Protein vor der Anwendung einer pestiziden Proteinzusammensetzung der Erfindung auf die Umgebung des Zielschädlings zu aktivieren. Verfahren zur Aktivierung von Protoxin durch eine Serinprotease sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z.B. Cooksey (1968) Biochem. J. 6: 445–454 and Carroll und Ellar (1989) Biochem. J. 261: 99–105, deren Lehren hier durch Referenz aufgenommen werden. Beispielsweise umfasst ein geeignetes Aktivierungsprotokoll, ist aber nicht darauf beschränkt, ein Kombinieren eines zu aktivierenden Polypeptids, z.B. eines gereinigten 1218-1-Polypeptids, mit Trypsin in einem Gewichtsverhältnis 1218-1-Pro tein/Trypsin von 1/100 in 20 nM NaHCO₃, pH 8, und Verdau der Probe bei 36°C für 3 Stunden.
Die Zusammensetzungen wie auch die transformierten Mikroorganismen und pestiziden Proteine der Erfindung können auf die Umgebung eines Insektenschädlings z.B. durch Sprühen, Atomisieren, Stäuben, Verstreuen, Beschichten oder Gießen, Einführen in oder auf den Boden, Einführen in Berieselungswasser, durch Samenbehandlung oder durch allgemeine Applizierung oder Stäuben zu der Zeit, zu der der Schädling aufzutreten beginnt oder vor dem Auftreten von Schädlingen als Schutzmaßnahme angewendet werden. Es ist im Allgemeinen wichtig, eine gute Schädlingsbekämpfung in den früheren Stadien des Pflanzenwachstums zu erreichen, da dies die Zeit ist, zu der die Pflanze am schwersten geschädigt werden kann. Die Zusammensetzungen der Erfindung können zweckmäßigerweise andere Insektizide enthalten, wenn dies als notwendig erachtet wird. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Zusammensetzung direkt auf den Boden ausgebracht, und zwar zur Pflanzzeit in körniger Form einer Zusammensetzung aus einem Träger und toten Zellen eines Bacillus-Stamms oder eines transformierten Mikroorganismus der Erfindung. Eine andere Ausführungsform ist eine körnige Form einer Zusammensetzung, die eine Agrochemikalie, z.B. ein Herbizid, ein Insektizid, einen Dünger, einen inerten Träger und tote Zellen eines Bacillus-Stamms oder eines transformierten Mikroorganismus der Erfindung umfasst.
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können gegen eine Vielzahl von Schädlingen wirksam sein. Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung umfassen Schädlinge, sind aber nicht beschränkt auf, Insekten, Pilze, Bakterien, Nematoden, Acaride, Protozoen-Pathogene, Tier-parasitäre Leberegel und dergleichen. Bevorzugte Schädlinge sind Insektenschädlinge, insbesondere Insektenschädlinge, die eine deutliche Schädigung verursachen, am bevorzugtesten Insektenschädlinge, die eine beachtliche Schädigung an landwirtschaftlichen Pflanzen verursachten. Mit "Insektenschädlinge" sind Insekten und andere ähnliche Schädlinge gemeint, z.B. solche der Ordnung Acari, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Milben und Zecken. Insektenschädlinge der vorliegenden Erfindung umfassen, sind aber nicht beschränkte auf, Insekten der Ordnung Lepidoptera, z.B. Achoroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon, Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia feneralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella, Diatraea saccharalis, Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Esphestia elutella, Erannis tilaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea, Heliothis virescens, Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantia cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis, Paleacrita vernata, Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella, Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta, Pseudoplasia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonta ocellana, Spodoptera sp., Thaurnstopoea pityocampa, Tinsola bisselliella, Trichoplusia hi, Udea rubigalis, Xylomyges curiails und Yponomeuta padella.
Die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auch gegen Insektenschädlinge wirksam sein, welche Insekten umfassen, die aus den Ordnungen Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera, Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera usw., insbesondere Coleoptera, speziell Diabrotica virgifera and Lepidoptera ausgewählt sind. Insektenschädlinge der Erfindung für die Hauptnutzpflanzen umfassen: Mais: Ostrinia nubilalis, Europäischer Maiszünsler; Agrotis ipsilon, "black cutworm"; Helicoverpa zea, Baumwolleule, Spodoptera frugiperda, "fall armyworm"; Diatraea grandiosella, "southwestern corn borer"; Elasmopalpus lignosellus, "lesser cornstalk borer"; Diatraea saccharalis, Zuckerrohrbohrer; Diabrotica virgifera, Western Corn Rootworm; Diabrotica longicornis barberi, Northern Corn Rootworm; Diabrotica undecimpunctata howardi, Southern Corn Rootworm; Melanotus spp., Drahtwürmer; Cyclocephala borealis, "Northern masked chafer" (Engerling); Cyclocephala immaculata, "Southern masked chafer" (Engerling); Popillia japonica, Japankäfer; Chaetocnema pulicaria, Korn-Flohkäfer; Sphenophorus maidis, "maize billbug"; Rhopalosiphum maidis, Maisblattlaus; Anuraphis maidiradicis, Maiswurzellaus; Blissus leucopterus leucopterus, Lang wanze; Melanoplus femurrubrum, rotbeiniger Grashüpfer; Melanoplus sanguinipes, Wanderheuschrecke; Hylemya platura, Saatfliegenlarve; Agromyza parvicornis, Maisminierfliege; Anaphothrips obscrurus, Gräserblasenfuß; Solenopsis milesta, "thief ant"; Tetranychus urticae, Spinnmilbe; Sorghum bzw. Hirse: Chilo partellus, Sorghumbohrer; Spodoptera frugiperda, "fall armyworm"; Helicoverpa zea, Maisährenwurm; Elasmopalpus lignosellus, "leser cornstalk borer"; Feltia subterranea, "granulate cutworm"; Phyllophaga crinita, Engerling; Eleodes, Conoderus und Aeolus spp., Drahtwürmer; Oulema melanopus, Getreidehähnchen; Chaetocnema pulicaria, Maisflohkäfer; Sphenophorus maidis, "maize billbug"; Rhopalosiphum maidis; Maisblattlaus; Sipha flava, gelbe Zuckerrohrlaus; Blissus leucopterus leucopterus, Langwanze; Contarinia sorghicola, Sorghum-Mücke; Tetranychus cinnabarinus, Karminspinnmilbe; Tetranychus urticae, Spinnmilbe; Weizen: Pseudaletia unipunctata, "army worm"; Spodoptera frugiperda, "fall armyworm"; Elasmopalpus lignosellus, "lesser cornstalk borer"; Agrotis orthogonia, "pale western cutworm"; Elasmopalpus lignosellus, "lesser cornstalk borer"; Oulema melanopus, Getreidehähnchen; Hypera punctata, Kleeblattkäfer; Diabrotica undecimpunctata howardi, Southern Corn Rootworm; Russische Getreidelaus; Schizaphis graminum, grüne Schildlaus; Macrosiphum avenae, Englische Getreidelaus; Melanoplus femurrubrum, rotbeiniger Grashüpfer; Melanoplus differentialis, "differential grasshopper"; Melanoplus sanguinipes, Wanderheuschrecke; Mayetiola destructor, Hessenfliege; Sitodiplosis mosellana, gelbe Weizengallmücke; Meromyza americana, "wheat stem maggot"; Hylemya coarctata, Brachfliege; Frankliniella fusca, Tabakblasenfuß; Cephus cinctus, Weizenstengelsägewespe; Aceria tulipae, Tulpengallmilbe; Sonnenblume: Cylindrocupturus adspersus, Sonnenblumenstengelkäfer; Smicronyx fulus, roter Sonnenblumensamenkäfer; Smicronyx sordidus, grauer Sonnenblumensamenkäfer; Suleima helianthana, Sonnenblumenknospenmotte; Homoeosoma electellum, Sonnenblumenmotte; Zygogramma exclamationis, Sonnenblumenkäfer; Bothyrus gibbosus, Karottenkäfer; Neolasioptera murtfeldtiana, Sonnenblumensamenmücke; Baumwolle: Heliothis virescens, Tabak-Wicklerlarve; Helicoverpa zea, Baumwollkapselwurm; Spodoptera exigua, Rüben-Heerwurm bzw. Armyworm; Pectinophora gossypiella, roter Baumwollkapselwurm; Anthonomus grandis grandis, Baumwollkapselkäfer; Aphis gossypii, Baumwollblattlaus; Pseudatomoscelis seriatus, Baumwollfloh; Trialeurodes abutilonea, gestreiftflügelige Weiße Fliege; Lygus lineolaris, Grüne Blattwanze; Melanoplus femurrubrum, rotbeiniger Grashüpfer; Melanoplus differentialis, "differential grasshopper"; Thrips tabaci, Zwiebel-Thrips; Franklinkiella fusca, Tabak-Thrips; Tetrany chus cinnabarinus, Karminspinnmilbe; Tetranychus urticae, Spinnmilbe; Reis: Diatraea saccharalis, Zuckerrohrbohrer; Spodoptera frugiperda, "fall armyworm"; Helicoverpa zea, Maisährenwurm; Calaspis brunnea, "grape colaspis"; Lissorhoptrus oryzophilus, Reiswasserkäfer; Sitophilus oryzae, Reiskäfer; Nephotettix nigropictus, Reisblatthüpfer; Blissus leucopterus leucopterus, Langwanze; Acrosternum hilare, Grüne Reiswanze; Sojabohne: Pseudoplusia includens, Sojabohnen-Spannerraupe; Anticarsia gemmatalis, "velvetbean caterpillar"; Plathypena scabra, grüner Kleewurm; Ostrinia nubilalis, Europäischer Maiszünsler; Agrotis ipsilon, schwarze Erdraupe; Spodoptera exigua, Heerwurm; Heliothis virescens, Tabak-Wicklerlarve; Helicoverpa zea, Baumwollkapselkäfer; Epilachna varivestis, Mexikanischer Bohnenkäfer; Myzus persicae, Grüne Pfirsichblattlaus; Empoasca fabae, hellgrüne Zwergzikade; Acrosternum hilare, Grüne Reiswanze; Melanoplus femurrubrum, rotbeiniger Grashüpfer; Melanoplus differentialis, "differential grasshopper"; Hylemya platura, Saatfliegenlarve; Sericothrips variabilis, Sojabohnen-Thrips; Thrips tabaci, Zwiebel-Thrips; Tetranychus turkestani, Erdbeer-Spinnmilbe; Tetranychus urticae, Spinnmilbe; Gerste: Ostrinia nubilalis, Europäischer Maiszünsler; Agrotis ipsilon, schwarze Erdraupe; Schizaphis graminum, Grüne Schildlaus; Blissus leucopterus leucopterus, Langwanze; Acrosternum hilare, Grüne Reiswanze; Euschistus servus, Braune Reiswanze; Jylemya platura, Saatfliegenlarve; Mayetiola destructor, Hessenfliege; Petrobia latens, Braune Weizenmilbe; Ölraps: Vrevicoryne brassicae, Kohlblattlaus; Phyllotreta cruciferae, Kreuzblütler-Flohkäfer; Kartoffel: Leptinotarsa decemlineata, Colorado-Kartoffelkäfer.
Darüber hinaus können Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gegen Folgende wirksam sein: Hemiptera, z.B Lygus hesperus, Lygus lineolaris, Lygus pratensis, Lygus rugulipennis Popp, Lygus pabulinus, Calocoris norvegicus, Orthops compestris, Plesiocoris rugicollis, Cyrtopeltis modestus, Cyrtopeltis notatus, Spanagonicus albofasciatus, Diaphnocoris chlorinonis, Labopidicola allii, Pseudatomoscelis seriatus, Adelphocoris rapidus, Poecilocapsus lineatus, Blissus leucopterus, Nysius ericae, Nysiusraphanus, Euschistus servus, Nezara viridula, Eurygaster, Coreidae, Pyrrhocoridae, Tinidae, Blostomatidae, Reduviidae und Cimicidae.
Nematoden schließen Pflanzen-parasitäre Nematoden, z.B. Wurzelgallen-, Zysten- und Läsionsnematoden, einschließlich Heterodera und Globodera spp; insbesondere Globodera rostochiensis und Globodera pailida (Kartoffelzystennematode); Heterodera glycines (Sojabohnenzystennematode); Heterodera schachtii (Rübenzystennematode); und Heterodera avenae (Getreidezystennematode), ein.
Die bevorzugte Entwicklungsstufe zum Testen auf pestizide Aktivität ist die der Larven oder unreifen Formen dieser oben genannten Insektenschädlinge. Die Insekten können in vollständiger Dunkelheit bei etwa 20°C bis etwa 30°C und mit einer relativen Feuchtigkeit von etwa 30% bis etwa 70% gezüchtet werden. Bioassays können durchgeführt werden, wie es bei Czapla und Lang (1990) J. Econ. Entomol. 83(6): 2480–2485 beschrieben ist. Verfahren zum Aufziehen von Insektenlarven und zur Durchführung von Bioassays sind dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt.
Dem Fachmann ist eine weite Vielzahl von Bioassaytechniken bekannt. Allgemeine Verfahren umfassen die Zugabe der experimentellen Verbindung oder des Organismus zu der Nahrungsquelle in einem verschlossenen Behälter. Pestizide Aktivität kann gemessen werden durch, allerdings ohne Beschränkung darauf, Mortalität, Gewichtsverlust, Anziehung, Abstoßung und andere Verhaltensänderungen und physische Änderungen nach Fütterung und Exposition für eine geeignete Zeitlänge. Bioassays, die hierin beschrieben werden, können mit einer beliebigen Fütterung von Insektenschädlingen im Larven- oder Erwachsenenstadium eingesetzt werden.
Die folgenden Beispiele werden zur Erläuterung, keineswegs zur Beschränkung, präsentiert.
EXPERIMENTELLER TEIL
Beispiel 1: Bioassay zum Testen der pestiziden Aktivität von B. thuringiensis-Stämmen
Gegen Western Corn Rootworm und Southern Corn Rootworm
Insektennahrungen für Colorado-Kartoffelkäfer (CPB)-, Southern Corn Rootworm (SCRW)- und Western Corn Rootworm (WCRW)-Larven sind auf dem Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Rose und McCabe (1973) J. Econ. Entomology 66: 393, die hier durch Referenz aufgenommen wird. Die Insektennahrung wird hergestellt und in eine Pittman-Schale gegossen. Im Allgemeinen werden 1,5 ml Nahrung in jede Zelle mit zusätzlichen 150 μl Probenpräparation, die auf die Nahrungsoberfläche aufgetragen wird, verteilt.
Bakterienkolonien von einer ursprünglichen Platte von Transformanten, die die pestiziden Proteine von Interesse exprimieren, werden auf Replica-Platten aufgetüpfelt und in 5 ml 2 × YT-Brühe mit 500 μl/1000 ml Kanamycin-Antibiotikum inokuliert. Die Röhrchen werden über Nacht wachsen gelassen. Wenn kein Wachstum vorliegt, werden die Röhrchen für weitere 24 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation werden die Röhrchen mit 3500 U/min für 5 bis 8 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Pellet wird in 1000 μl PBS resuspendiert. Die Probe wird dann in 1,5 ml-Eppendorfröhrchen transferiert und auf Eis inkubiert, bis die Temperatur 3 bis 4°C ist, danach folgt eine Ultraschallbehandlung für 12 bis 15 Sekunden.
Mikrobielle Kulturbrühen (150 μl) oder andere Proben (150 μl) wurden auf 1,5 ml künstliche Nahrungen mit einem Oberflächenbereich von 2,54 cm² geschichtet. Für das Screening auf pestizide Aktivität gegen Rootworms werden 25 μl einer 0,8%igen Eiagar-Lösung auf die Deckel der Schalen aufgetragen. Die Schalen und die Deckel werden unter einem Abzug trocknen gelassen. Nach der Trocknung werden die Deckel auf die Schalen gelegt und für 4 bis 7 Tage bei einer Temperatur von 26°C inkubiert. Die Bioassays werden dann bewertet, indem "lebende" versus "tote" Larven gezählt werden. Die Mortalität wird als Prozentwert der toten Larven aus den getesteten gesamten Larven errechnet.
Beispiel 2: Pestizide Aktivität von B. thuringiensis-Stamm-1218-Lysaten
Proben, die aus Kulturen von B. thuringiensis-Stämmen 1218 hergestellt worden waren, wurden auf das Vorliegen von pestizider Aktivität gegen CPB, WCRW und SCRW, wie in Beispiel 1 beschrieben, getestet. Als Kontrolle wurde die Nahrung mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) behandelt.
Zur Herstellung jeder Probe wurde eine einzelne Kolonie eines Stamms, der auf einer LB-Platte gewachsen war, selektiert und verwendet, um das Röhrchen, das 50 ml TB-Medium enthielt, zu beimpfen. Das Röhrchen wurde über Nacht bei 28°C und 250 U/min inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Röhrchen mit 4300 × g für 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 50 ml Sporulationsmedium resuspendiert. Das Röhrchen wurde erneut mit 4300 × g für 15 Minuten zentrifugiert. Der zweite Überstand wurde verworfen und das zweite Pellet wurde in 50 ml Sporulationsmedium resuspendiert. Das Röhrchen wurde dann für 48 Stunden bei 28°C und 250 U/min inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde das Röhrchen mit 4300 × g für 15 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde in 10 ml 1 × M9-Medium resuspendiert. Die Probe wurde dann in ein 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen transferiert, auf Eis inkubiert, bis die Temperatur etwa 3 bis 4°C war, und dann für 12 bis 15 Sekunden mit Ultraschall behandelt. Für Bioassays wurden 150 μl einer ultraschallbehandelten Probe verwendet.
Sporulationsmedium umfasst 200 ml 5 × M9-Salzlösung, 5 ml Salzlösung, 5 ml CaCl₂-Lösung und dH₂O zu einem Endvolumen von 1 Liter. Die Lösung von 5 × M9-Salzen umfasst: 64 g, Na₂HPO₄·7H₂O; 15 g, KH₂PO₄; 2,5 g, NaCl; 5 g, NH₄Cl und dH₂O zu einem Endvolumen von 1,0 Liter. Salzlösung umfasst: 2,46 g, MgSO₄·7H₂O; 0,04 g, MnSO₄·H₂O; 0,28 g, ZnSO₄·7H₂O; 0,40 g, FeSO₄·7H₂O; und dH₂O zu einem Endvolumen von 1,0 Liter. CaCl₂-Lösung umfasst 3,66 g CaCl₂·2H₂O und dH₂O zu einem Endvolumen von 100 ml.
Proben wurden mit und ohne Erwärmen getestet, um zu bestimmen, ob die Komponente (die Komponenten), die für die pestizide Aktivität verantwortlich ist (sind), hitzestabil ist (sind). Für die Wärmebehandlung wurden die Proben für 1 S Minuten vor Verwendung im Bioassay gekocht. Nicht-erhitzte Proben, die aus Stamm 1218 hergestellt worden waren, wiesen pestizide Aktivität gegen Western Corn Rootworm auf und eine geringere pestizide Aktivität gegen Southern Corn Rootworm auf. Die Proben, die aus Stamm 1218-Lysaten hergestellt worden waren, verursachten eine moderate Wuchshemmung bei den Southern Corn Rootworm-Larven. Nach dem Erhitzen hatten die Proben eine stark verringerte pestizide Aktivität gegen beide Rootworm-Species.
Die Verringerung bei der pestiziden Aktivität nach Erhitzen zeigte, dass die eine Komponente oder mehrere Komponenten der Probe aus Stamm 1218, die für die pestizide Aktivität verantwortlich ist (sind), wärmelabil ist (sind). Eine solche Verringerung stimmt damit überein, dass eine oder mehrere der Komponenten ein Protein sind.
Beispiel 3: Pestizide Aktivität von Kristallproteinen, die aus B. thuringiensis-Stamm 1218 isoliert wurden
Unter Verwendung von Proben sporulierter Kulturen von B. thuringiensis-Stamm 1218, die wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt worden waren, wurden Kristallproteine isoliert und dann unter Verwendung von fachbekannten Verfahren mit Trypsin behandelt. Kurz ausgedrückt, nach Reinigung (Zonengradientenzentrifugation, Renografin-76) wurden die gereinigten Kristalle in alkalischem Puffer (50 mM Na₂CO₃, 10 mM Dithiothreitol, pH 10) gelöst. Vor Verwendung in dem Assay wurden die gelösten Kristallproteine durch Filtration mit Centriprep^® (Millipore Corp.)-Zentrifugationsfiltereinheiten mit einem Molekulargewichts-Cutoff von 10.000 konzentriert.
Es ist einzusehen, dass es unter bestimmten experimentellen Bedingungen vorteilhaft sein kann, die Cry8-artigen Polypeptide mit einer Protease, z.B. Trypsin, zu behandeln, um das Protein zu aktivieren, bevor die pestizide Aktivität einer bestimmten Probe bestimmt wird. Verfahren für die Aktivierung von Protoxin durch eine Serinprotease sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Siehe z.B. Cooksey (1968) Biochem J. 6: 445–454 und Carroll und Ellar (1989) Biochem J. 261: 99–105; die hier durch Referenz aufgenommen werden. Isolierte Kristallproteine wurden auf pestizide Aktivität gegen Western Corn Rootworm-Larven durchgemustert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Sowohl eine neue Kristallproteinpräparation als auch eine früher hergestellte Präparation ("alte Präparation") von Stamm 1218 besaß deutliche pestizide Aktivität gegen Western Corn Rootworm. Gelöste Kristallproteine wurden bei –80°C für 20 Tage vor Verwendung in den Assays gelagert.
Ein Fachmann wird wissen, dass es zahlreiche Indikatoren der pestiziden Aktivität gibt und dass Variable, z.B. Anzahl der toten Insekten oder durchschnittliches Gewicht der behandelten Insekten, überwacht werden können. Beispielsweise kann die pestizide Aktivität zweckdienlicherweise als % Mortalität ausgedrückt werden, wobei dieser Ausdruck den prozentualen Anteil bzw. den Prozentwert toter Rootworm-Larven aus der Gesamtzahl der Larven ist.
Beispiel 4: Nucleotidsequenzen, isoliert aus B. thuringiensis-Stamm 1218
Es wurden Anstrengungen unternommen, um die Nucleotidsequenzen zu isolieren, die für die Kristallproteine von B. thuringiensis-Stamm 1218 codieren. Aus 1218 wurden zwei Nucleotidsequenzen isoliert, die Nucleotidsequenz- und Aminosäuresequenz-Homologie zu Cry8Bal (GenBank-Eingangs-Nr. U04365) haben. Die zwei Cry8-artigen codierenden Sequenzen, die aus Stamm 1218 isoliert wurden, wurden Cry1218-1 (SEQ ID NO: 1) und Cry1218-2 (SEQ ID NO: 3) genannt. SEQ ID NO: 27 und SEQ ID NO: 28 stellen die Nucleinsäuresequenzen von nativen genomischen Klonen Cry1218-1 und Cry1218-2 bereit.
Um zu bestimmen, ob die Proteine, die durch variante oder mutante Polynucleotide der Erfindung codiert werden, für Proteine mit pestizider Aktivität codieren, für jede Nucleinsäuresequenz in Escherichia coli exprimiert. Um beispielsweise zu bestimmen, ob die 1218-1- oder 1218-2-Polynucleotidsequenzen, die hierin bereitgestellt werden, für Polypeptide mit pestizider Aktivität codieren, wurden trunkierte Nucleotidsequenzen hergestellt. SEQ ID NO: 15 entspricht den Nucleotiden 1 bis 2007 der Nucleotidsequenz Cry1218-1 (SEQ ID NO: 1). SEQ ID NO: 17 entspricht den Nucleotiden 1 bis 2019 der Nucleotidsequenz von Cry1218-2 (SEQ ID NO: 3).
SEQ ID NO: 15 und 17 codieren für trunkierte Cry8-artige Polypeptide, die die in SEQ ID NO: 16 bzw. 18 angegebenen Aminosäuresequenzen haben. Jede der trunkierten Nucleotidsequenzen (SEQ ID NO: 15 und 17) wurde getrennt in einen pET28a-Expressionsvektor kloniert und dann verwendet, um E. coli zu transformieren. Transformierte Kolonien wurden ausgewählt und in flüssiger Kultur wachsen gelassen, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Die exprimierten, am N-Terminus His-markierten, trunkierten Cry8-artigen Proteine wurden aus E. coli-Lysaten durch Affinitätschromatographie unter Verwendung einer Nickel-Affinitätssäule isoliert. Die Säulenfraktionen mit dem Protein von Interesse wurden gegen 10 mM Tris-HCl (pH 8,5) dialysiert und dann unter Verwendung von Centriprep^® (Millipore Corp.)-Zentrifugationsfiltereinheiten mit einem Molekulargewichts-Cut-off von 10.000 nach Anweisung des Herstellers konzentriert. Die konzentrierten Cry8-artigen Proteinproben wurden auf das Vorliegen von pestizider Aktivität gegen Western Corn Rootworm getestet, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Bioassays, die die pestizide Aktivität von rekombinanten Cry8-artigen Proteinen, die aus E. coli-exprimierten Präprationen gereinigt wurden, bewerten, wurden wie in Beispiel 1 durchgeführt, wobei die wässrigen Proteinproben auf die Oberfläche der Rootworm-Nahrung geschichtet wurden. Die pestizide Aktivität von Wildtyp- (z.B. nativem) und mutantem Endotoxin wurden gegen Southern Corn Rootworm bestimmt. Wie erwartet, wurde beobachtet, dass die pestizide Aktivität abnahm, wenn die Konzentration der trunkierten Cry8-artigen Proteine, die auf die Nahrung aufgetragen wurden, abnahm.
Die pestizide Aktivität wurde auch bestimmt, indem die pestiziden Proteine in die Rootworm-Nahrung eingearbeitet wurden, was zu dem oben beschriebenen Verfahren im Gegensatz steht, das eine Einarbeitung einer proteinhaltigen Lösung in das Nahrungsgemisch involvierte. Beispielsweise wurden Probennahrungen, die 1000, 500, 400, 300, 200 oder 100 ppm eines pestiziden Polypeptids in die Nahrung eingearbeitet haben, analysiert.
Beispiel 5: Herstellung einer Pflanzen-bevorzugten Nucleotidsequenz, die für ein pestizides Protein codiert
Weil die Codonverwendung zwischen Pflanzen und Bakterien unterschiedlich ist, kann die Expression eines Proteins, das durch eine Nucleotidsequenz bakteriellen Ursprungs codiert wird, durch translationale Unwirksamkeit in der Pflanze limitiert werden. Auf dem Fachgebiet ist bekannt, dass die Expression in einer Pflanze verstärkt werden kann, indem die codierende Sequenz des Proteins so verändert wird, dass sie Pflanzen-bevorzugte Codons enthält. Für eine optimale Expression eines Proteins in einer Pflanze kann eine synthetische Nucleotidsequenz hergestellt werden, indem die Aminosäuresequenz des Proteins verwendet wird und die Sequenz unter Verwendung Pflanzen-bevorzugter Codons zurücktranslatiert wird.
Unter Verwendung eines solchen Ansatzes wurde ein Teil der Aminosäuresequenz des Proteins, das durch Cry1218-1 (SEQ ID NO: 2) codiert wird, unter Verwendung Mais-bevorzugter Codons zurücktranslatiert. Die resultierende Pflanzen-bevorzugte Nucleotidsequenz ist in SEQ NO: 9 angegeben. Die in SEQ ID NO: 9 angegebene Nucleotidsequenz codiert für ein Polypeptid (SEQ ID NO: 10), das die ersten 669 Aminosäuren der in SEQ ID NO: 2 angegebenen Aminosäuresequenz umfasst. Somit codieren SEQ ID NO: 10 und 16 für Polypeptide, die dieselbe Aminosäuresequenz umfassen, und SEQ ID NO: 15 stellt ein zweites Polynucleotid bereit, das in SEQ ID NO: 10 angegebenen Aminosäuren codiert.
Beispiel 6: Bioassay zur Untersuchung der pestiziden Aktivität von mutanten Cry8-artigen Polypeptiden gegen Colorado-Kartoffelkäfer (Leptinotarsa decemlineata)
Protokoll
Kurz ausgedrückt, die Bioassayparameter waren wie folgt: Bio-Serv-Nahrung (Katalog-Nr. F9800B von BIOSERV, Entomology Division, 8. Straße, Suite 1, Frenchtown, New Jersey 08825) wurde in Pitman-Schalen mit 128 Wells (Katalog-Nr. BIO-BA-128 von CD International, Pitman, New Jersey 08071) mit einer Oberfläche von 2,4 cm² verteilt. Cry8-artige Proben (1218-1A, 49PVD und NGSR1218-1) wurden mit einer Rate von 50 μl/Well auf die Nahrungsoberfläche topisch aufgebracht. Es wurde ausreichend Probenmaterial geliefert, um vier Beobachtungen/Probe bereitzustellen. Nachdem die Probe getrocknet war, wurden zwei Colorado-Kartoffelkäfer-Neugeborene in jedes Well gegeben. Damit waren es insgesamt acht Larven/Probe. Auf jede Schale wurde ein Deckel (Katalog-Nr. BIO-CV-16, CD International, Pitman, New Jersey, 08071) gelegt und die Schalen wurden in einen Inkubator mit 25°C gestellt.
Die Assayschalen zeigten keine Oberflächenkontamination, die in den Pufferkontrollen oder den Wells, die Cry8-artige Proben enthielten, vorhanden war. Der Test wurde am 4. Tag dem Lebendbefall einem Scoring auf Mortalität unterzogen.
TABELLE 1. Pestizide Aktivität von trunkierten 1218-1-Polypeptiden und einer Trypsin-Additions-Mutante gegen Colorado-Kartoffelkäfer
Resultate
Die Probe, die in Tabelle mit "A" markiert ist, ist eine Kontrollprobe, die aus 10 mM Carbonatpuffer mit pH 10 besteht. Alle trunkierten und mutierten Proteinproben 1218-1A (b–d), 49PVD (f–h) und NGSR1218-1 (l–n) wurden in 10 mM Carbonatpuffer mit pH 10 solubilisiert.
Die 1218-1A-Proben, b–d, umfassen eine trunkierte Polypeptidsequenz, die die Aminosäuresequenz umfasst, die in SEQ ID NO: 16 angegeben ist. Spezifischer ausgedrückt, die 1218-1A-Proben umfassen die trunkierte Toxindomäne, die durch Aminosäure (aa)-Reste 1 bis aa 669 (von M bis E) der Aminosäuresequenzen, die in SEQ ID NO: 2 angegeben sind, dargestellt wird.
Die 49PVD-Proben, f–h, umfassen eine mutante Polypeptidsequenz, die eine Aminosäuresequenz hat, die in SEQ ID NO: 20 angegeben ist. 49PVD wurde durch ein Trimmen der Sequenz sowohl vom N-Terminus als auch vom C-Terminus der in SEQ ID NO: 16 angegebenen Sequenz erzeugt. Spezifischer ausgedrückt, der N-Terminus der 49PVD-Mutante wurde um 47 Reste getrimmt; auf diese Weise beginnt das Polypeptid am aa-Rest 48(M), und der C-Terminus wurde um 6 Reste bis zu aa 663(D) getrimmt. Daher ist mutantes 49PVD 1218-1A (SEQ ID NO: 16) vom aa-Rest 48 bis aa 663.
Die NGSR-Proben, l–m, umfassen eine 1218-1 Mutantenpolypeptidsequenz, die in SEQ ID NO: 12 angegeben ist. NGSR1218-1 wurde durch die Addition eines NGSR-Motivs an die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 16 angegeben ist, nach aa 164 erzeugt. Spezifischer ausgedrückt, die NGSR-Mutante stellt eine 1218-1A-Mutante bereit, die die Aminosäuresequenz NGSR zwischen aa 164 und aa 165 der in SEQ ID NO: 16 angegebenen Sequenz enthält. Die Addition von vier Resten an 1218-1A erzeugte ein Protein mit 673 aa. Bioassays von 1218-1A, 49PVD und NGSR1218-1 zeigten, dass alle drei Proteinproben gegen den Colorado-Kartoffelkäfer (CPB) wirksam waren. Es wurde festgestellt, dass die Mutante NGSR1218-1 wirksamer war als das Eltern-1218-1A und die 49PVD-Mutante. Die modifizierten (z.B. trunkierten oder mutierten) 1218-1-Polypeptide (49PVD, NGSR1218-1) waren wenigstens so aktiv wie die relevante 1218-1- oder 1218-1A-Kontrollprobe.
Beispiel 7: Bioassay zum Testen der pestiziden Aktivität von mutanten Cry8-artigen Polypeptiden gegen Southern Corn Rootworm und Western Corn Rootworm
Protokoll
Kurz ausgedrückt, die oben in Beispiel 6 beschriebenen Assayparameter wurden so modifiziert, dass sie für die Beurteilung der pestiziden Aktivität von zusätzlichen 1218-1-, 1218-1A- oder 49PVD-Mutanten gegen Western Corn Rootworm (WCRW) und Southern Corn Rootworm (SCRW) sorgten. Kurz ausgedrückt, Bio-Serv-Nahrung (Katalog-Nr. F9800B von: BIOSERV, Entomology Division, 8. Straße, Suite 1, Frenchtown, New Jersey 08825) wurde in Pitman-Schalen mit 128 Vertiefungen (Katalog-Nr. BIO-BA-128 von CD International, Pitman, New Jersey 08071) mit einer Oberfläche von 2,4 cm² verteilt.
Cry8-artige Proben wurden topisch auf die Nahrungsoberfläche mit einem Volumen von 50 μl/Well aufgetragen. Es wurde ausreichend Probenmaterial zugeführt, um für Replicat-Beobachtungen/Probe zu sorgen. Zum Screening der pestiziden Aktivität gegen Rootworm wurden 25 μl einer 0,8% Ei-Agar-Lösung auf die Deckel der Schalen aufgebracht. Die Schalen und die Deckel wurden unter einem Abzug trocknen gelassen. Nach dem Trocknen wurden die Deckel auf die Schalen gelegt, und es wurde für 4 bis 7 Tage bei einer Temperatur von 26°C inkubiert. Ein Deckel wurde auf jede Schale (Katalog Nr. BIO-CV-16, CD International, Pitman, New Jersey, 08071) gelegt und die Schalen wurden in einen Inkubator mit 25°C gestellt.
Für die Beurteilung der pestiziden Aktivität gegen SCRW wurden Insekten einer Lösung ausgesetzt, die entweder Puffer (50 mM Carbonatpuffer (pH 10) oder ein mutantes 1218-1- oder 1218-1A-Polypeptid (z.B. 1218-1A, LKMS.N1218-1, LKMS.R1218-1, NGSR.N1218-1, LKMS.N49PVD, LKMS.R49PVD oder NGSR.N49PVD) in Dosen von entweder 36 oder 3,6 μg/cm² enthielt, ausgesetzt.
Für die Beurteilung der pestiziden Aktivität gegen WCRW wurden Insekten einer Lösung, die entweder Puffer (50 mM Carbonatpuffer (pH 10)) umfasst, oder einer begrenzten Anzahl der Mutanten 1218-1-Polypeptide (LKMS.R1218-1, NGSR.N1218-1, LKMS.N49PVD, LKMS.R49PVD oder NGSR.N49PVD) mit 88 μg/cm² ausgesetzt.
Die Bioassay wurden dann durch Zählen "lebende" gegenüber "toten" Larven einem Scoring unterworfen. Die Mortalität wird als Prozentwert toter Larven aus den gesamten getesteten Larven berechnet.
TABELLE 2. Pestizide Aktivität von mutanten Cry1218-1-Polypeptiden gegen Southern Corn Rootworm-Replicat 1.
TABELLE 3. Pestizide Aktivität von mutanten Cry1218-1-Polypeptiden gegen Southern Corn Rootworm-Replicat 2
TABELLE 4. Pestizide Aktivität von mutanten Cry1218-1-Polypeptiden gegen Southern Corn Rootworm-Replicat 3
TABELLE 5. Pestizide Aktivität von mutanten Cry1218-1-Polypeptiden gegen Western Corn Rootworm
Beispiel 8: Transformation von Mais durch Partikelbeschuss und Regeneration von transgenen Pflanzen
Unreife Maisembryos aus Gewächshaus-Donorpflanzen wurden mit einem Plasmid, das die planzenoptimierte Cry1218-1-Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 9) funktionell mit einem Ubiquitinpromotor verknüpft und das selektierbare Markergen PAT (Wohlleben et al. (1988) Gene 70: 25–37), das Resistenz gegen das Herbizid Bialaphos verleiht, enthielt, beschossen. Alternativ wird das selektierbare Markergen auf einem getrennten Plasmid bereitgestellt. Die Transformation wurde wie folgt durchgeführt. Rezeütoren für Medien folgen unten.
Vorbereitung von Zielgewebe
Die Ähren werden von Hüllen befreit und in 30% Clorox-Bleiche plus 0,5% Mikro-Detergens für 20 Minuten oberflächensterilisiert und zweimal mit sterilem Wasser gespült. Die unreifen Embryos werden ausgeschnitten und mit der Embryoachsenseite nach unten (Scutellumseite nach oben), 25 Embryos pro Platte auf 560Y-Medium für 4 Stunden gelegt und dann innerhalb der 2,5 cm-Targetzone in Vorbereitung zum Beschuss ausgerichtet.
Herstellung bzw. Vorbereitung der DNA
Ein Plasmidvektor, der die Pflanzen-optimiere Cry1218-1-Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 9) funktionell an einen Ubiquitinpromotor verknüpft, umfasst, wird hergestellt. Beispielsweise umfasst ein geeigneter Transformationsvektor einen UBI1-Promotor aus Zea mays, eine 5'-UTR aus UBI1 und ein UBI1-Intron in Kombination mit einem PinII-Terminator. Eine Plasmid-DNA, die die Pflanzen-optimiere Nucleotidsequenz umfasst, und eine zweite Plasmid-DNA, die einen PAT-selektierbaren Marker enthält (z.B. CAMV35S(ACK)-Promotor, der PAT steuert, mit einem CAMV35S-Terminator), wird auf ein 1,1 μm (durchschnittlicher Durchmesser) Wolframpellets präzipitiert, wobei ein CaCl₂-Präzipitationsverfahren wie folgt verwendet wird:
100 μl präparierte Wolframpartikel in Wasser,
10 μl (1 μg) DNA in Tris-EDTA-Puffer (1 μg Gesamt-DNA)
100 μl 2,5 M CaCl₂
10 μl 0,1 M Spermidin
Jedes Reagens wird sequenziell zu einer Wolframpartikelsuspension gegeben, während diese auf einem Mehrröhrchen-Vortexer gehalten wurde. Das Endgemisch wurde kurz mit Ultraschall behandelt und unter konstanter Vortexbehandlung für 10 Minuten inkubiert. Nach dem Präzipitationszeitraum wurden die Röhrchen kurz zentrifugiert, Flüssigkeit wurde entfernt, es wurde mit 500 ml 100% Ethanol gewaschen und für 30 Sekunden zentrifugiert. Wiederum wurde die Flüssigkeit entfernt und 105 μl 100% Ethanol wurden zu dem fertigen Wolframpartikelpellet gegeben. Zum Beschuss mit einer Partikelkanone wurden die Wolfram/DNA-Partikel kurz ultraschallbehandelt und 10 μl wurden auf die Mitte jedes Makroträgers aufgetüpfelt und vor einem Beschuss etwa 2 Minuten trocknen gelassen.
Behandlung mit einer Partikelkanone
Die Probenplatten werden bei Stufe #4 mit einer Partikelkanone #HE34-1 oder #HE34-2 bombadiert. Alle Proben erhalten einen einzelnen Schuss mit 650 PSI, wobei insbesamt 10 Aliquots aus jedem Röhrchen hergestellter Partikel/DNA genommen werden.
Anschließende Behandlung
Nach dem Beschuss werden die Embryos für 2 Tage auf 560Y-Medium gehalten, dann auf 560R-Selektionsmedium, das 3 mg/l Bialaphos enthält, transferiert und alle 2 Wochen subkultiviert. Nach etwa 10 Wochen Selektion werden selektionsresistente Callusklone auf 288J-Medium transferiert, um eine Pflanzenregeneration zu initiieren. Nach somatischer Embryoreifung (2–4 Wochen) werden gut entwickelte somatische Embryos auf ein Medium zur Keimung transferiert und in den beleuchteten Kulturraum transferiert. Etwa 7–10 Tage später werden sich entwickelnde Schößlinge auf 272V-Hormon-freies Medium in Röhrchen für 7–10 Tage transferiert, bis die Pflänzchen gut entwickelt sind. Pflanzen werden dann in Einsätze in Flachpaletten (entspricht 2,5'-Topf), die Topferde enthalten, transferiert und für eine Woche in einer Wachstumskammer wachsen gelassen, anschließend weitere 1–2 Wochen im Gewächshaus wachsen gelassen, dann auf klassische 600-Töpfe (1,6 Gallonen) transferiert und zur Reife wachsen gelassen. Pflanzen werden überwacht und bezüglich der Expression des Cry1218-1-Proteins durch fachbekannte Assays, z.B. Immunoassays und Western-Blotting mit einem Antikörper, der an das Cry1218-1-Protein bindet, einem Scoring unterzogen.
Beschuss und Kulturmedien
Beschussmedium (560Y) umfasst 4,0 g/l N6-Grundsalze (SIGMA C-1416), 1,0 ml/l Eriksson-Vitaminmischung (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l Thiamin·HCl, 120,0 g/l Saccharose, 1,0 mg/l 2,4-D und 2,88 g/l L-Prolin (mit D-I H₂O nach Einstellung auf pH 5,8 mit KOH auf ein Volumen eingestellt); 2,0 g/l Gelrite (zugesetzt nach Volumeneinstellung mit D-I H₂O) und 8,5 mg/l Silbernitrat (zugesetzt nach Sterilisation des Medium und Abkühlen auf Raumtemperatur). Selektionsmedium (560R) umfasst 4,0 g/l N6-Grundsalze (SIGMA C- 1416), 1,0 ml/l Eriksson-Vitaminmischung (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/l Thiamin·HCl, 30,0 g/l Saccharose und 2,0 mg/l 2,4-D 8 mit D-I H₂O nach pH-Einstellung auf 5,8 mit KOH auf ein bestimmtes Volumen gebracht); 3,0 g/l Gelrite (zugesetzt nach Einstellung des Volumens mit D-I H₂O) und 0,85 mg/l Silbernitrat und 3,0 mg/l Bialaphos (beide nach Sterilisieren des Mediums und Abkühlen auf Raumtemperatur zugesetzt).
Pflanzenregenerationsmedium (288J) umfasst 4,3 g/l MS-Salze (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l MS-Vitaminstammlösung (0,100 g Nicotinsäure, 0,02 g/l Thiamin·HCl, 0,10 g/l Pyridoxin·HCl und 0,40 g/l Glyin, Volumeneinstellung mit gereinigtem D-I H₂O) (Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 15: 473), 100 mg/l Myo-Inositol, 0,5 mg/l Zeatin, 60 g/l Saccharose und 1,0 ml/l 0,1 mM Abscisinsäure (mit gereinigtem D-I H₂O nach Einstellung des pH auf 5,6 im Volumen eingestellt); 3,0 g/l Gelrite (zugegeben nach Volumeneinstellung mit D-I H₂O); und 1,0 mg/l Indolessigsäure und 3,0 mg/l Bialaphos (zugesetzt nach Sterilisieren des Mediums und Kühlen auf 60°C). Hormonfreies Medium (272V) umfasst 4,3 g/l MS-Salze (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/l MS-Vitaminstammlösung (0,100 g/l Nicotinsäure, 0,02 g/l Thiamin·HCl, 0,10 g/l Pyridoxin·HCl und 0,40 g/l Glycin, mit gereinigtem D-I H₂O im Volumen eingestellt), 0,1 g/l Myo-Inositol und 40,0 g/l Saccharode (nach Einstellung des pH auf 5,6 mit gerinigtem D-I H₂O im Volumen eingestellt); und 6 g/l Bacto-Agar (zugesetzt nach Einstellung des Volumens mit gereinigtem D-I H₂O, sterilisiert und gekühlt auf 60°C.
Beispiel 9: Agrobacterium-vermittelte Transformation von Mais und Regeneration von transgenen Pflanzen
Für eine Agrobacterium-vermittelte Transformation von Mais mit einer Pflanzen-optimierten Cry1218-1-Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 9) wird vorzugsweise das Verfahren von Zhao verwendet (US-Patent Nr. 5,981,840 und PCT-Patentpublikation WO 98/32326; deren Inhalte durch Referenz hier aufgenommen werden). Kurz ausgedrückt, unreife Embryos werden aus Mais isoliert, und die Embryos werden mit einer Agrobacterium-Suspension unter Bedingungen in Kontakt gebracht, unter denen die Bakterien fähig sind, die Pflanzen-optimierter Cry1218-1-Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 9) auf wenigstens eine Zelle wenigstens eines der unreifen Embryos zu übertragen (Schritt 1: der Infektionsschritt). In diesem Schritt werden die unreifen Embryos für die Initiierung der Inokulation vorzugsweise in einer Agrobacterium-Suspension eingetaucht. Die Embryos werden für eine Zeit mit dem Agrobacterium co-kultiviert (Schritt 2: der Co-Kultivierungsschritt). Vorzugsweise werden die unreifen Embryos nach dem Infektionsschritt auf festem Medium kultiviert. Nach diesem Co- Kultivierungszeitraum wird ein optionaler "Ruhe"-Schritt in Betracht gezogen. In diesem Ruheschritt werden die Embryos in Gegenwart wenigstens eines Antibiotikums, von dem bekannt ist, dass es das Wachstum von Agrobacterium inhibiert, ohne Zusatz eines selektiven Agenses für Pflanzentransformanten inkubiert (Schritt 3: Ruheschritt). Die unreifen Embryos werden vorzugsweise auf festem Medium mit Antibiotikum, aber ohne ein selektierendes Mittel, zur Eliminierung von Agrobacterium und für eine Ruhephase für die infizierten Zellen kultiviert. Als Nächstes werden nicht-okulierte Embryos auf Medium, das ein selektives Mittel enthält, kultiviert und wachsender transformierter Callus wird gewonnen (Schritt 4: der Selektionsschritt). Vorzugsweise werden die unreifen Embryos auf festem Medium mit einem selektiven Agens kultiviert, was im selektiven Wachstum von transformierten Zellen resultiert. Der Callus wird dann zu Pflanzen regeneriert (Schritt 5: der Regenerationsschritt) und vorzugsweise werden Calli, die auf selektivem Medium gewachsen sind, auf festem Medium kultiviert, um die Pflanzen zu regenerieren.
Alle in der Beschreibung genannten Publikationen und Patentanmeldungen sind Hinweise für den Level des Fachwissens eines Fachmanns auf diesem Gebiet.
Obgleich die vorstehende Erfindung durch Erläuterung und Beispiele zu Zwecken der Klarheit des Verständnisses in gewissem Detail beschrieben wurde, wird es klar sein, dass bestimmte Änderungen und Modifikationen innerhalb des Rahmens der angegebenen Ausführungsformen durchgeführt werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isolierte Nucleinsäure, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid mit pestizider Aktivität gegen Diabrotica virgifera codiert, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus: (a) einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15 oder 17 angegeben ist; (b) einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 16 oder 18 angegebene Aminosäuresequenz codiert; (c) einer Nucleotidsequenz, die wenigstens 88% Sequenzidentität zu der in (a) angegebenen Nucleotidsequenz hat; und (d) einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 85% Sequenzidentität zu der in (b) angegebenen Aminosäuresequenz hat.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz wenigstens 90% Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15 oder 17 angegebenen Nucleotidsequenz hat.
Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz zur Expression in einer Pflanze optimiert ist.
Expressionskassette, umfassend eine Nucleinsäure nach Anspruch 1, wobei die Nucleotidsequenz funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der eine Expression in einem Mikroorganismus oder in einer Pflanzenzelle steuert.
Isoliertes pestizides Polypeptid, das pestizide Aktivität gegen Diabrotica virgifera hat, wobei das Polypeptid ausgewählt ist aus: (a) einem Polypeptid, das eine in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 16 oder 18 angegebene Aminosäuresequenz hat; und (b) einem Polypeptid, das wenigstens 85% Sequenzidentität zu der Aminosäuresequenz von (a) hat.
Polypeptid nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid wenigstens 90% Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 16 oder 18 angegebenen Nucleotidsequenz hat.
Pestizide Zusammensetzung, die wenigstens ein Polypeptid nach Anspruch 5 in Kombination mit einem Träger umfasst.
Verfahren zur Bekämpfung eines Insekten-Pflanzenschädlings, umfassend Ausbringen der pestiziden Zusammensetzung nach Anspruch 7 auf die Umgebung des Insektenschädlings durch ein Verfahren, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Sprühen, Stäuben, Breitwurf und Samenbeschichtung.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Insekten-Pflanzenschädling ausgewählt ist aus Kartoffelkäfer, Diabrotica virgifera und Diabrotica undecimpunctata.
Transformierte Pflanze, die in ihrem Genom wenigstens ein stabil eingebautes Nucleotidkonstrukt umfasst, das eine codierende Sequenz funktionell mit einem Promotor verknüpft umfasst, der eine Expression eines Polypeptids steuert, das für Diabrotica virgifera pestizid ist, wobei die codierende Sequenz ausgewählt ist aus: (a) einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15 oder 17 angegeben ist; (b) einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 16 oder 18 angegebene Aminosäuresequenz codiert; (c) einer Nucleotidsequenz, die wenigstens 88% Sequenzidentität zu der in (a) angegebenen Nucleotidsequenz hat; (d) einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 85% Sequenzidentität zu der in (b) angegebenen Aminosäuresequenz hat; und (e) einer Nucleotidsequenz nach einem von (a) bis (d), die Codons umfasst, die für eine Expression in einer Pflanze optimiert sind.
Pflanze nach Anspruch 10, wobei die Nucleotidsequenz wenigstens 90% Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15 oder 17 angegebenen Nucleotidsequenz hat.
Pflanze nach Anspruch 10, wobei die Pflanze eine Monokotyle ist.
Pflanze nach Anspruch 10, wobei die Pflanze eine Dikotyle ist.
Transformierter Samen der Pflanze nach Anspruch 10.
Transformierter Mikroorganismus, der in seinem Genom wenigstens eine stabil eingebaute Expressionskassette umfasst, die eine Nucleotidsequenz umfasst, die für ein Polypeptid codiert, das pestizide Aktivität gegen Diabrotica virgifera hat, wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus: (a) einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15, 17, 27 oder 28 angegeben ist; (b) einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 16 oder 18 angegebene Aminosäuresequenz codiert; (c) einer Nucleotidsequenz, die wenigstens 88% Sequenzidentität zu der in (a) angegebenen Nucleotidsequenz hat; und (d) einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 85% Sequenzidentität zu der in (b) angegebenen Aminosäuresequenz hat.
Transformierter Mikroorganismus nach Anspruch 15, wobei die Nucleotidsequenz wenigstens 90% Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15, 17, 27 oder 28 angegebenen Nucleotidsequenz hat.
Transformierter Mikroorganismus nach Anspruch 15, wobei die Nucleotidsequenz funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der eine Expression in dem genannten Mikroorganismus steuert.
Pestizide Zusammensetzung, umfassend einen transformierten Mikroorganismus nach Anspruch 15 und einen Träger, wobei die genannte Zusammensetzung behandelt worden ist, um die pestizide Aktivität zu verlängern.
Verfahren zur Bekämpfung eines Pflanzenschädlings, umfassend Ausbringen der pestiziden Zusammensetzung nach Anspruch 18 auf die Umgebung des Schädlings durch ein Verfahren, das aus Sprühen, Stäuben, Breitwurf und Samenbeschichtung ausgewählt ist.
Verfahren zur Bekämpfung eines Pflanzenschädlings, umfassend Einführung in die Pflanze oder Zelle derselben wenigstens ein Nucleotidkonstrukt, das eine codierende Sequenz funktionell verknüpft mit einem Promotor umfasst, der eine Expression eines pestiziden Polypeptids in Pflanzenzellen steuert, wobei das Polypeptid pestizide Aktivität gegen Diabrotica virgifera hat und wobei die Nucleotidsequenz ausgewählt ist aus: (a) einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15 oder 17 angegeben ist; (b) einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 16 oder 18 angegebene Aminosäuresequenz codiert; (c) einer Nucleotidsequenz, die wenigstens 88% Sequenzidentität zu der in (a) angegebenen Nucleotidsequenz hat; und (d) einer Nucleotidsequenz, die für ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens 85% Sequenzidentität zu der in (b) angegebenen Aminosäuresequenz hat.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Nucleotidsequenz wenigstens 90% Sequenzidentität zu der in SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 15 oder 17 angegebenen Nucleotidsequenz hat.
Variante der Nucleinsäure, die in SEQ ID NO: 19 angegeben ist, wobei die Variante eine Nucleotidsequenz umfasst, die wenigstens ein zusätzliches Codon hat, das in der in SEQ ID NO: 19 angegebenen Nucleotidsequenz nicht vorhanden ist, wobei das wenigstens eine zusätzliche Codon eine zusätzliche Protease-empfindliche Stelle in die Schleifenregion zwischen alpha-Helices 3 und 4 der Domäne 1 des codierten Polypeptids einführt, und wobei außerdem das durch die Variante codierte Polypeptid durch verbesserte pestizide Aktivität gegen einen Schädling, der zu der Art Coleoptera gehört, im Vergleich zu der Aktivität des in SEQ ID NO: 2 angegebenen Polypeptids gekennzeichnet ist.
Nucleinsäure nach Anspruch 22, wobei die Nucleotidsequenz für eine Expression in einer Pflanze optimiert ist.
Expressionskassette, die eine Nucleinsäure nach Anspruch 22 umfasst, wobei die Nucleotidsequenz funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der eine Expression in einem Mikroorganismus oder in einer Pflanzenzelle steuert.
Isolierte Nucleinsäure, die eine Nucleotidsequenz umfasst, welche ausgewählt ist aus: (a) einer Nucleotidsequenz, die in einer von SEQ ID NO: 5, 11, 15, 21, 23, 39 und 43 angegeben ist; (b) einer Nucleotidsequenz, die für eine der Aminosäuresequenzen codiert die in SEQ ID NO: 6, 12, 16, 22, 24, 40 und 44 angegeben sind; (c) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptidvariante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei das Polypeptid eine zusätzliche Protease-empfindliche Spaltstelle, insertiert zischen den Aminosäureresten 164 und 165 von SEQ ID NO: 16, umfasst; (d) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptidvariante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Polypeptidvariante eine zusätzliche Aminosäuresequenz, die zur Einführung einer Trypsin-Spaltstelle zwischen Aminosäureresten 164 und 165 von SEQ ID NO: 16 konzipiert ist, umfasst; (e) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptidvariante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei das Polypeptid eine zusätzliche Aminosäuresequenz umfasst, die so konzipiert ist, dass sie eine Chymotrypsin-Spaltstelle zwischen Aminosäureresten 160 und 161 von SEQ ID NO: 16 einführt; und (f) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptidvariante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, in welcher Reste, die den Positionen 161 bis 163 von SEQ ID NO: 16 entsprechen, entfernt sind und zusätzliche Aminosäuren, die einer Chymotrypsin-Spaltstelle entsprechen, an ihrer Stelle eingeführt sind.
Nucleinsäure nach Anspruch 25, wobei die Nucleotidsequenz zur Expression in einer Pflanze optimiert ist.
Variante der Nucleinsäure, die in SEQ ID NO: 15 angegeben ist, wobei die Variante eine Nucleotidsequenz umfasst, die wenigstens ein zusätzliches Codon enthält, das eine zusätzliche Protease-empfindliche Stelle in der Schleifenregion zwischen alpha-Helices 3 und 4 von Domäne 1 des Polypeptids, das durch die Varianten-Nucleinsäure codiert wird, einführt, und wobei außerdem das codierte Polypeptid durch verbesserte pestizide Aktivität gegen einen Schädling, der zu der Art Coleoptera gehört, im Vergleich zu der Aktivität des in SEQ ID NO: 2 angegebenen Polypeptids gekennzeichnet ist.
Expressionskassette, die eine Nucleinsäure nach Anspruch 27 umfasst, wobei die Nucleotidsequenz funktionell mit einem Promotor verknüpft ist, der eine Expression in einem Mikroorganismus oder in einer Pflanzenzelle steuert.
Isolierte Nucleinsäure, die eine Nucleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus: (a) einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 19, 29, 31, 33, 41 oder 45 angegeben ist; (b) einer Nucleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NO: 20, 30, 32, 34, 42 oder 46 angegeben ist; (c) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO: 19 umfasst, wobei die Variante für ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Protease-empfindliche Spaltstelle gekennzeichnet ist, die unmittelbar 5' zur Aminosäure 114 von SEQ ID NO: 20 insertiert ist; (d) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO: 19 umfasst, wobei die Variante für ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Aminosäuresequenz gekennzeichnet ist, die so konzipiert ist, dass sie eine Trypsin-Spaltstelle zwischen den Aminosäureresten 113 und 114 von SEQ ID NO: 20 einführt; (e) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO: 19 umfasst, wobei die Variante für ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Aminosäuresequenz gekennzeichnet ist, die so konzipiert ist, dass sie eine Chymotrypsin-Spaltstelle zwischen den Aminosäureresten 113 und 114 von SEQ ID NO: 20 einführt; und (f) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO: 19 umfasst, wobei die Variante für ein Polypeptid codiert, das durch eine Aminosäuresequenz gekennzeichnet ist, in der die Aminosäuren, die in Positionen 114 bis 116 von SEQ ID NO: 20 lokalisiert sind, entfernt sind und zusätzliche Aminosäuren, die eine Chymotrypsin-Stelle umfassen, an ihrer Stelle insertiert sind.
Nucleinsäure nach Anspruch 29, wobei die Nucleotidsequenz für eine Expression in einer Pflanze optimiert ist.
Variante des in SEQ ID NO: 16 angegebenen Polypeptids, wobei die Variante eine Aminosäuresequenz umfasst, die wenigstens einen zusätzlichen Aminosäurerest enthält, der eine zusätzliche Protease-empfindliche Stelle in der Schleifenregion zwischen alpha-Helices 3 und 4 von Domäne 1 des Polypeptids einführt, und wobei außerdem das codierte Polypeptid durch eine verbesserte pestizide Aktivität gegen einen Schädling, der zur Art Coleoptera gehört, im Vergleich zu der Aktivität des in SEQ ID NO: 2 angegebenen Polypeptids gekennzeichnet ist.
Isoliertes pestizides Polypeptid, das eine in SEQ ID NO: 6, 12, 16, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 oder 46 angegebene Aminosäuresequenz umfasst.
Transformierte Pflanze, die in ihrem Genom wenigstens ein stabil eingebautes Nucleotidkonstrukt umfasst, das eine codierende Sequenz funktionell mit einem Promotor verknüpft umfasst, welche eine Expression eines pestiziden Polypeptids in Zellen der transformierten Pflanze steuert, wobei das Polypeptid pestizide Aktivität gegen Diabrotica virgifera hat und wobei die codierende Sequenz ausgewählt ist aus: (a) einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 11, 19, 21, 23, 29, 31, 33, 39, 41, 43 oder 45 angegeben ist; (b) einer Nucleotidsequenz, die für die in SEQ ID NO: 12, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 oder 46 angegebene Aminosäuresequenz codiert; (c) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche Protease-empfindliche Spaltstelle, insertiert zwischen den Aminosäureresten 164 und 165 von SEQ ID NO: 16, umfasst; (d) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche Aminosäuresequenz umfasst, die so konzipiert ist, dass sie eine Trypsin-Spaltstelle zwischen den Aminosäureresten 164 und 165 von SEQ ID NO: 16 einführt; (e) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche Aminosäuresequenz umfasst, die so konzipiert ist, dass sie eine Chymotrypsin-Spaltstelle zwischen den Aminosäureresten 160 und 161 von SEQ ID NO: 16 einführt; (f) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Aminosäurereste, die den Aminosäuren 161 bis 163 von SEQ ID NO: 16 entsprechen, entfernt sind und Aminosäuren, die eine Chymotrypsin-Spaltstelle umfassen, an ihrer Stelle eingeführt sind; (g) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO: 19 umfasst, wobei die Variante für ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Protease-empfindliche Spaltstelle unmittelbar 5' zu der Aminosäure 114 von SEQ ID NO: 20 gekennzeichnet ist; (h) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO: 19 umfasst, wobei die Variante für ein Polypeptid codiert, das durch eine zusätzliche Aminosäure gekennzeichnet ist, die so gewählt ist, dass eine Trypsin-Spaltstelle unmittelbar 5' der Aminosäure 114 von SEQ ID NO: 20 eingeführt wird; (i) einer Nucleotidsequenz, die eine Variante von SEQ ID NO: 19 umfasst, wobei die Variante zusätzliche Nucleinsäurereste umfasst, die so konzipiert sind, dass sie eine Chymotrypsin-Spaltstelle zwischen den Aminosäureresten 113 und 114 von SEQ ID NO: 20 einführen; (j) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante von SEQ ID NO: 20 codiert, wobei die Aminosäurereste, die in den Positionen 114 bis 116 von SEQ ID NO: 20 lokalisiert sind, entfernt sind und zusätzliche Aminosäuren, die eine Chymotrypsin-Stelle umfassen, an ihrer Stelle sind; und (k) einer Nucleotidsequenz nach einem von (a) bis (j), die Codons umfasst, die für eine Expression in einer Pflanze optimiert sind.
Pflanze nach Anspruch 33, wobei die Pflanze eine Monokotyle ist.
Pflanze nach Anspruch 33, wobei die Pflanze eine Dikotyle ist.
Transformierter Samen der Pflanze nach Anspruch 33.
Transformierter Mikroorganismus, umfassend eine Nucleinsäure, die ausgewählt ist aus: (a) einer Nucleotidsequenz, die in SEQ ID NO: 11, 19, 21, 23, 29, 31, 33, 39, 41, 43 oder 45 angegeben ist; (b) einer Nucleotidsequenz, die für die Aminosäuresequenz codiert, die in SEQ ID NO: 12, 20, 22, 24, 30, 32, 34, 40, 42, 44 oder 46 angegeben ist; (c) einer Nucleotidsequenz, die für eine Variante von SEQ ID NO: 19 codiert, wobei die Variante ein Nucleinsäureinsert umfasst, das so konzipiert ist, dass es eine zusätzliche Protease-empfindliche Stelle zwischen den Aminosäureresten 117 und 118 von SEQ ID NO: 20 einführt; (d) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante von SEQ ID NO: 16 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche Protease-empfindliche Stelle, insertiert zwischen den Aminosäureresten 164 und 165 von SEQ ID NO: 16, umfasst; und (e) einer Nucleotidsequenz, die für eine Polypeptid-Variante von SEQ ID NO: 20 codiert, wobei die Variante eine zusätzliche Protease-empfindliche Stelle, insertiert zwischen den Aminosäureresten 117 und 118 von SEQ ID NO: 20, umfasst.