CN1240484A - 用过氧化物酶编码序列赋予单子叶植物昆虫抗性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明大体上涉及在单子叶植物(单子叶植物),尤其是玉米中,控制昆虫的方法和组合物。更精确地,本发明涉及(1)控制昆虫的方法,包括使昆虫摄入或接触杀虫剂量的含有包含编码过氧化物酶的编码序列的重组DNA的转基因单子叶植物细胞;和(2)含有包含编码过氧化物酶的编码序列的重组DNA的可育转基因单子叶植物。

Description

用过氧化物酶编码序列赋予 单子叶植物昆虫抗性的方法

本发明大体上涉及在单子叶植物，尤其是玉米中，控制昆虫的方法和组合物。更精确地，本发明涉及(1)控制昆虫的方法，包括使昆虫摄入或接触杀虫剂量的含有包含编码过氧化物酶的编码序列的重组DNA的转基因单子叶植物细胞；和(2)含有包含编码过氧化物酶的编码序列的重组DNA的可育转基因单子叶植物。

虫害是导致世界重要商业农作物损失的主要因素。广谱化学杀虫剂已广泛用于控制或根除具有重要农业意义的害虫。尽管杀虫剂对于控制大多数害虫有效，仍存在与这些复合物的使用相关的很多问题。杀虫剂昂贵使用成本高。经常性的重复使用对于有效控制是必需的。也担心昆虫已经或将要对用于控制它们的化学药品产生抗性。杀虫剂时常杀死传粉者或捕食食草昆虫的益虫。另外，存在与化学杀虫剂长期使用相关的环境危害。

引入了可降低化学杀虫剂使用的害虫控制方案。这些方案包括通过育种改良作物，使用生物防制剂和昆虫捕食者，通过育种方案和遗传工程引入昆虫抗性基因。最广泛用于遗传工程的基因是来自细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus Thuringiensis)的晶体蛋白基因。见例如Rice等，Ep-A-292435和Koziel等，WO 93/07278。由芽孢杆菌合成的大多数晶体蛋白对鳞翅目，双翅目和鞘翅目昆虫幼虫有毒性。大体上，当杀虫性晶体蛋白被易感昆虫吞食时，晶体溶解并作用为毒性成分。为了避免发展出对这些毒素有抗性的昆虫，需要具有加性或协同作用的附加毒素。

过氧化物酶是用过氧化物如H₂O₂作底物的氧化还原酶的亚类。过氧化物酶是能够与二价阳离子(主要是Ca²⁺，也包括Mn²⁺)结合的含血红素的单体糖蛋白(Maranon和Van Huystee，植物化学37：1217-1225(1994))。过氧化物酶的辅基具有不同的作用。血红素基参与催化作用，二价阳离子稳定血红素部分，糖基可能降低其代谢率从而有助于稳定过氧化物酶(Maranon和Van Huystee，植物化学37：1217-1225(1994))。

根据过氧化物酶在等电聚焦凝胶上的移动，通常将过氧化物酶分为阴离子、阳离子和中性形式。尽管作为酶它们被认为具有广泛底物特异性，但是对于不同的同功酶，的确表现出底物“偏爱性”(VanHuystee植物生理学年鉴205-219(1987))。有几类过氧化物酶和相关酶，包括愈创木酚过氧化物酶、NADH过氧化物酶、细胞色素C过氧化物酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、L-抗坏血酸盐过氧化物酶和锰过氧化物酶。

在植物中，过氧化物酶是单体蛋白，是活性受植物严格调控的高度复杂的酶。过氧化物酶对于植物细胞壁的生物合成至关重要。过氧化物酶促进单体松柏醇，γ-香豆醇和芥子醇过氧化聚合作用成为木质素(Greisbach，在：植物生物化学，Ed.Conn，Academic，New York第457-489页(1991)。不同植物种类具有以半随机形式装配的不同单体比率(Hwang等，糖类高分子14：77-88(1991))。木质化作用加固细胞壁。整体效果是植物组织更坚韧。

烟草阴离子过氧化物酶被用来转化烟草和N.sylvestris(Lagrimini，植物细胞2：7-18(1990)；Lagrimini，植物生理学96：577-583(1991))。这些转基因植物从35S启动子开始组成型地过量表达烟草阴离子过氧化物酶。过氧化物酶过量表达最显著的表型是大约在开花期开始的慢性萎蔫。另外，植物生长受阻，具有小而致密的细胞并且受伤时迅速变成褐色。

同一构建体也用于转化蕃茄(Lagrimini等，美国园艺科学学会杂志117：1012-1016(1992)；Lagrimini等，园艺科学28：218-221(1993))。这些植物在开花后严重萎蔫，表现过分褐色和果实变小。

最初研究表明表达烟草阴离子过氧化物酶基因的转基因烟草和蕃茄的某些组织对某些昆虫有抗性(Dowd等，在美国昆虫学会全国会议上的报告，Indianapolis，1993年12月)。烟草和蕃茄属于同一科茄科的关系相近的双子叶植物。相反，与双子叶植物相比，本发明的转基因单子叶植物有与其很大不同的生理学、生物化学、解剖学和代谢。例如，单子叶植物有不同的密码子用法，用C₄而不是C₃代谢，有不同的脂肪酸含量、不完全花等。因此不知道通过过氧化物酶用于控制昆虫的物质是否存在于单子叶植物。

另外，过氧化物酶是糖蛋白，它必须经过特异的转录后修饰并掺入含血红素的基团以变得稳定并有酶活性。过氧化物酶参与次级代射物和木质素的合成，其性质依赖于可在特定植物中得到的底物。

另外，对棉铃虫的抗性与丝变成褐色呈负相关，表明过氧化物酶的增加将降低抗性(Byrne等，Environ.Entomol 18：356-360(1989))。这种说法阻止在单子叶植物中用过氧化物酶控制昆虫。

另外，玉米中改变的木质素产量(在bm突变体中)导致对昆虫易感性升高(Baniere和Argillier，Agronomie 13：865-876(1993))。因此，改变木质作用的外源过氧化物酶将不会降低对昆虫的易感性。另外，从Borgvinson等，加拿大昆虫学家127：111-122，1995的学说意外发现，在生长早期由于过氧化物酶引起的组织坚韧使植物产生昆虫抗性。

所以，在本发明之前，无法预测在单子叶植物中表达重组过氧化物酶的效果。

本发明提供了控制昆虫的方法和昆虫抗性单子叶植物。

更精确地，本发明提供了控制昆虫的方法，包括使昆虫摄入或接触杀虫剂量的含有包含编码过氧化物酶的编码序列的重组DNA的转基因单子叶植物细胞，其中过氧化物酶的表达赋予转基因单子叶植物细胞具昆虫抗性。

本发明也提供了可育的转基因单子叶植物，至少它的一部分含有包含编码过氧化物酶的编码序列的重组DNA的细胞，其中过氧化物酶的表达赋予此单子叶植物表型特征。

本发明也提供了从上述植物中获得的转基因植物细胞，组织或种子。

本发明进一步提供了上述植物的转基因后代。

本发明也提供了从上述后代获得的转基因植物细胞，组织或种子。

本发明进一步目的和优点可通过下文描述一目了然。

图1表示质粒pJS20293，含有插在(1)与缩小的内含子连接的CaMV35S启动子和(2)CaMV35S终止子之间的烟草阴离子过氧化物酶。

图2表示质粒pUBIAc。

下面的定义将有助于对本发明的理解。

植物细胞：是植物的结构和生理单位，由原生质体和细胞壁组成。术语“植物细胞”指植物部分的细胞或源自植物的细胞。细胞的某些例子包括是存活植物的一部分的分化细胞；培养的分化细胞；培养的非分化细胞，非分化组织如愈伤组织或肿瘤的细胞；种子，胚，无性芽和花粉的分化细胞。

植物组织：组成结构和功能单位的植物细胞群体，包括植株和培养物中的植物的任何组织。术语包括但不限于植物整体，植物器官，植物种子，组织培养物和组成结构和/或功能单位的任何植物细胞群体。此术语与上述列举的或由此定义另外包括的任何特定类型植物组织联合或独立使用并不排除任何其它植物组织类型。

原生质体：没有细胞壁的植物细胞。

后代植物：有性或无性方式产生的未来世代植物，包括但不限于子代植物。

转基因植物：在基因组中含有稳定整合的重组DNA的植物。

重组DNA：用重组DNA技术将不同来源的DNA片段连接形成的任何DNA分子。

重组DNA技术：体外制备重组DNA并将重组DNA转入它能够表达或繁殖的细胞的技术(见生物医学和分子生物学精选词典，Juo编，CRC Press，Boca，Raton(1996))，例如，将各种形式的DNA转入原生质体或细胞，包括例如(1)环形、线形或超螺旋的裸DNA，(2)包含在核小体或染色体或细胞核或其部分中结合的DNA；(3)与其它分子复合或结合的DNA，(4)包含在脂质体、原生质球、细胞或原生质体内的DNA或(5)从宿主生物以外的生物中转来的DNA(如根瘤土壤杆菌)。这些和其它将重组DNA导入细胞的多种方法在本领域内众所周知并可用于制备本发明的转基因细胞或转基因植物。

重组DNA技术也包括Treco等，WO 94/12650和Treco等，WO 95/3156中描述的同源重组方法，它们可用于提高单子叶植物中过氧化物酶活性。特别地，可将调控区(如启动子)导入植物基因组以提高外源过氧化物酶的表达。

重组DNA技术也包括将缺乏选择表达信号的过氧化物酶编码序列插入单子叶植物并分析转基因单子叶植物由于单子叶植物中的外源控制序列导致的过氧化物酶表达的升高。这样导致植物中过氧化物酶编码序列拷贝数增加。

将重组DNA最初插入R⁰植物的基因组并不被传统的植物育种方法而是被此处描述的技术方法定义为完成。最初插入后，用基本上传统的育种方法繁殖转基因后代。

嵌合基因：包含至少两个异源部分的DNA分子，如来自预先存在但在预先存在状态不相关的部分，优选地，这些序列已通过重组DNA技术得到制备。

表达盒：包含启动子和终止子并且在两者之间可插入编码序列的DNA分子。

编码序列：转录和翻译时，导致多肽或蛋白形成的DNA分子。

基因：不连续的染色体区，包括负责控制表达即转录和翻译的调控DNA序列和可转录和翻译成特定多肽或蛋白的编码序列。

表型特征：由于一个或多个基因表达产生的可观察到的特征。

本发明涉及控制昆虫如鞘翅目，双翅目，膜翅目，鳞翅目，食毛目，同翅目，半翅目，直翅目，缨翅目，革翅目，等翅目，虱目，蚤目和毛翅目昆虫的方法。这样昆虫虫害的特定例子为欧洲玉米螟，茎玉米螟(stalkcorn borer)，小地老虎，棉铃虫，草地夜蛾，西南玉米杆草螟，南美玉米苗斑螟，小蔗杆草螟，玉米根叶甲，长角叶甲，黄瓜十一星叶甲食根亚种，狭体叩头虫，北方圆头犀金甲，南方圆头犀金甲，日本弧丽蛂，玉米铜色兆甲，玉米长喙象，玉米蚜，玉米根蚜，美洲谷长蝽，赤胫黑蝗，墨西哥黑蝗，灰地种蝇，玉米斑潜蝇，针缺翅蓟马，窃蚁和棉叶螨。其中表达过氧化物酶赋予单子叶植物细胞昆虫抗性的任何方法都包含于本发明内。

在一个优选实施方案中，本发明涉及通过使昆虫摄入或接触杀虫剂量的转基因单子叶植物细胞来控制昆虫的方法，其中所述的植物细胞的基因组编码具过氧化物酶活性的酶。过氧化物酶一旦表达就赋予转基因植物细胞昆虫抗性。编码过氧化物酶的转基因是插入天然不编码该过氧化物酶的祖先植物基因组中的附加基因。

在进一步优选的实施方案中，使用Treco等WO 94/12650和Treco等，WO 95/31560中描述的同源重组方法以提高单子叶植物中过氧化物酶活性并由此提高昆虫抗性。具体地，将调控区域(如启动子)导入植物基因组以提高增加植物昆虫抗性的外源过氧化物酶的表达。

在另一优选实施方案中，本发明涉及将缺乏选择表达信号的过氧化物酶编码序列插入单子叶植物并分析转基因单子叶植物由于单子叶植物中的外源控制序列导致的过氧化物酶表达的升高。这将导致植物中过氧化物酶编码序列拷贝数增加。

在进一步优选的实施方案中，本发明提供了提高赋予单子叶植物昆虫抗性的外源过氧化物酶拷贝数的方法。这样的方法优选地用传统的育种方法或用组织培养技术完成。

昆虫抗性植物包括由于过氧化物酶水平升高而使昆虫抗性超过天然的未经操作的植物。

本发明进一步涉及包含用含有编码过氧化物酶的编码序列的重组DNA转化的单子叶植物的种子的商品包，其中过氧化物酶的表达赋予该植物表型特征。本发明优选的商品包含有其中过氧化物酶的表达赋予该植物昆虫抗性的转基因植物的种子。本发明进一步优选的目的是带有使用包含其内的种子的说明的商品包。昆虫抗性

优选地，本发明的转基因单子叶植物对包括但不限于鞘翅目，双翅目，膜翅目，鳞翅目，食毛目，同翅目，半翅目，直翅目，缨翅目，革翅目，等翅目，尤其是鞘翅目和膜翅目的昆虫有抗性。就本发明目的而言，本发明的转基因植物不仅对昆虫有抗性，对真菌，细菌，线虫，螨等也有抗性。

本发明的玉米植物优选地对选自包括但不限于下列昆虫的群体的昆虫有抗性：Ostrinia nubilalis(玉米螟)，Sesemia nonegrioides(茎米米螟)，Agrotis ipsilon(小地老虎)，Helicoverpa zea(棉铃虫)，Spodopterafrugiperda(草地夜蛾)，Diatraea grandiosella(西南玉米杆草螟)，Elasmopalpus lignosellus(南美玉米苗斑螟)，Diatraea saccharalis(小蔗杆草螟)，Diabrotica virgifera virgifera(玉米根叶甲)，Diabroticalongicornis barberi(长角叶甲)，Diabrotica undecimpunctata howardi(黄瓜十一星叶甲食根亚种)，Melanotus属种类(狭体叩头虫)，Cyclocephalaborealis，(北方圆头犀金甲，白色幼虫)；Cyclocephala immaculata(南方圆头犀金甲，白色幼虫)，Popillia Japonica(日本弧丽蛂，幼虫和成虫形式)，Chaetocnema pulicaria(玉米铜色兆甲)，Sphenophorusmaidis(玉米长喙象)，Rhopalosiphum maidis(玉米蚜)，Anuraphismaidiradicis(玉米根蚜)，blissus Leucopterus Leucopterus(美洲谷长蝽)，Melanoplus femurrubrum(赤胫黑蝗)，Melanoplus sanguinipes(墨西哥黑蝗)，Hylemyaplatura(灰地种蝇)，Agromyza parvicornis(玉米斑潜蝇)，Anaphothrips obscurus(针缺翅蓟马)，thief ant(窃蚁)和Tetranychus urticae(棉叶螨)。

本发明的高粱植物优选地对选自包括但不限于下列昆虫的群体的昆虫有抗性：Chilo partellus(高粱螟)，Spodoptera frugiperda(草地夜蛾)，Helicoverpa zea(棉铃虫)，Elasmopalpus lignosellus(南美玉米苗斑螟)，Feltia Subterranean(粒肤地虎)，Phyllophaga crinita(白色幼虫)；Eleodes、Conoderus和Aeolus属种类狭体叩头虫，Oulema melanopus(黑角负泥虫)，Chaetocnema pulicaria(玉米铜色跳甲)，Sphenophorusmaidis(玉米隐喙象)，Rhopalosiphum maidis(玉米蚜)，Sipha flara(美甘蔗伪毛蚜)，Blissus leucopterus leucopterus(美洲谷长蝽)，ContariniaSorghicola(高粱瘿蚊)，Tetranychus cinnabarinus(红叶螨)和Tetranychus urticae(棉叶螨)。

本发明的小麦植物优选地对选自一个群体的一种或多种昆虫有抗性，这个群体包括但不限于Pseudaletia unipunctata(粘虫)，Spodopterafrugiperda(草地夜蛾)，Elasmopalpus lignosellus(南美玉米苗斑螟)，Agrotis orthogonia(西方灰地老虎)，Oulema melanopus(黑角负泥虫)，Hypera punctata(三叶草叶象)，Diabrotica undercimpunctatahowardi(黄瓜十一星叶甲食根亚种)，Russian Wheat aphia；Schizaphisgraminum(麦二叉蚜)，Macrosiphum avenae(麦长管蚜)，Melanoplusfemurrubrum(赤胫黑蝗)，Melanoplus differntialis(异黑蝗)；Melanoplussangninipes(血黑蝗)，Mayetiola destructor(小麦瘿纹)，Sitodiplosismosellana(麦红吸浆虫)，Meromyza americana(美洲杆蝇)，HylemyaCoarctata(麦瘦种蝇)，Frankliniella fusca(烟褐花蓟马)，CephusCinctus(麦茎蜂)和Aceria tulipae(麦瘿螨)。

本发明的水稻优选地对选自包括但不限于下列昆虫的群体的昆虫有抗性：Diatraea Saccharalis(小蔗杆草螟)，Spodoptera frugiperda(草地夜蛾)，Helicoverpa zea(棉铃虫)，Colaspis brunnea(葡萄肖叶甲)，Lissorhoptrus oryzophilus(稻根象)，Sitophilus oryzae(米象)；Nephotettix nigropictus(二点黑尾叶蝉)，Blissus LeucopterusLeucopterus(美洲谷长蝽)和Acrosternum hilare(拟缘蝽)。

本发明的大麦优选地对选自包括但不限于下列昆虫的群体的昆虫有抗性：Ostrinia nubilalis(玉米螟)，Agrotis ipsilon(小地老虎)，Schizaphis gramimum(麦二叉蚜)，Blissus leucopterus leucopterus(美洲谷长蝽)，Acrosternum hilare(拟缘蝽)，Euschitus servos(烟草蝽)，Hylemya platura(玉米种蝇)，Mayetiola destructor(小麦瘿蚊)，Thysanoptera(缨翅目)和Petrobia latens(潜岩螨)。

在一个实施例中，本发明涉及可育的包含含有编码过氧化物酶的编码序列的重组DNA的转基因单子叶植物(单子叶植物)。

单子叶植物是胚胎有一片子叶的植物。单子叶植物是被子植物纲两大类之一(双子叶植物是另一大纲)。

单子叶植物纲内优选的科包括禾本科[禾本科优选的成员包括饲料草(如羊茅属(羊茅草))，大麦属(大麦)，燕麦属(燕麦)，玉米属(玉米)，小麦属(小麦)，黑麦属(黑麦)，幼高粱属(高粱)和稻属(水稻)]；百合科[优选地葱属(洋葱)和天冬属]和薯蓣科，它们都包含于本发明内。本发明也包含但不限于单子叶种类，例如，优选的玉米株系包括Funk5N984，Funk5N986，Funk2717，Funk211D，Funk2N217A，B73，A632，CM105，B37，B84，B14，Mo17，A188，CG00526，CG00615和CG00714。

导入上述转基因种子和植物中的遗传特征通过有性繁殖和植物生长传递，由此能够在后代植物中保持和繁殖。总的来说，所述的保持和繁殖使用已知的适合特定目的的农业方法如分蘖、播种或收获。也可使用特殊方法如水培或温室技术。因为正在生长的作物易于受到昆虫或侵染的攻击和破坏以及野生植物的竞争，需采取措施控制杂草、植物疾病、昆虫、线虫和其它不利条件以提高产量。这些措施包括机械措施如耕地、去除杂草和已侵染的植物和使用农用化学品如除虫剂、杀真菌剂、杀配子剂、杀线虫剂、生长调节剂、催熟剂和杀虫剂。

根据本发明所述的转基因植物和种子的优势遗传特征的用途可在植物育种中进一步实现，其目的是培育具有改良特征如对害虫、除草剂或逆境的耐受性，营养价值提高，产量提高或结构改良减少由于倒伏导致的损失的植物。育种的多个步骤由于人的介入优化如选择杂交品系，亲本品系的直接授粉或选择合适的后代植物。根据希望的特征采取不同的育种措施。相关技术在本领域众所周知，包括但不限于杂交、近交、反交、多品系育种、品种混合、种间杂交和非整倍体技术等。杂交技术也包括用机械、化学或生物化学手段使植物不育化以产生雄性或雌性不育植株。雄性不育植株与不同品系花粉的交叉授粉保证雄性不育而不是雌性不育植株基因组将一律包含双方亲本株系的特征，这样，本发明的转基因种子和植物可用于培育改良的植物株系，例如提高传统方法如除虫剂或杀虫剂处理的有效性或由于其改良的遗传特性可用该方法施用。可获得具有改良的逆境耐受性的新作物，由于其优化的遗传“装置”，它产生的收获物比不能耐受相同不利发育条件的作物的质量更好。

在种子生产中，发芽质量和种子的均匀性是基本的产品特征，而农场主收获出售的种子的发芽质量和种子均匀性并不重要。因为难以使作物不与其它作物和杂草种子相混、控制种子病以及生产具有好的发芽力的种子，在纯种的生产、调节和销售领域富有经验的种子生产者发展了相当广泛成熟的种子生产方法，。因此，农场主购买符合特定质量标准的经过证实的种子而不是使用从他自己的作物中收获的种子是很普遍的做法。用作种子的繁殖材料通常用包含除草剂，杀虫剂，杀真菌剂，杀细菌剂，杀线虫剂，杀软体动物剂或其混合物的保护剂包被物处理。常规使用的保护剂包被物包括诸如环己烯亚胺，Carboxin，双硫胺甲酰(TMTD^)，methalaxyl(Apron^)和Pirimiphos-methyl(Actellic^)的化合物。如果需要，将这些化合物与配制技术常规使用的其它载体、表面活性剂或利用促进佐剂一起配制剂以提供针对由细菌、真菌或动物虫害引起的破坏的保护。通过用液体制剂浸泡繁殖材料或用混合的湿或干制剂包被繁殖材料来使用保护剂包被物。

本发明的另一方面是提供新的农业方法如上文阐释的方法，其特征是使用本发明的转基因植物、转基因植物材料或转基因种子。

在另一实施方案中，本发明涉及从转基因植物获得的转基因植物细胞、组织、器官、种子或植物部分。本发明不仅包括从后代获得的转基因植物细胞、组织、器官、种子或植物部分，也包括转基因的植物后代。

正如在此所述的，本发明涉及用过氧化物酶编码序列转化的可育转基因单子叶植物。优选地，过氧化物酶编码序列赋予单子叶植物在缺乏过氧化物酶编码序列或其过量表达的亲本植株中未发现的表型特征。可得到的表型特征包括昆虫抗性和提高的抗倒伏性。

更优选地，转基因植物中的过氧化物酶编码序列经有性传播。在一个优选实施方案中，过氧化物酶编码序列通过完全正常的生殖周期从R₀植物传到R₁代。另外优选地，表达过氧化物酶以使过氧化物酶在细胞、组织、种子或植物中的水平比差别只在于缺乏过氧化物酶编码序列的单子叶植物的细胞、组织、种子或植物中的水平更高。

在一个优选实施方案中，过氧化物酶编码序列是阴离子、阳离子或中性过氧化物酶编码序列。在另一优选实施方案中，过氧化物酶是愈伤木酚过氧化物酶，NADH过氧化物酶，细胞色素C过氧化物酶，过氧化氢酶，谷胱甘肽过氧化物酶，L-抗坏血酸盐过氧化物酶，锰过氧化物酶，产过氧化氢过氧化物酶和/或木质素形成过氧化物酶。

多种过氧化物酶可在本领域内得到并且可用于本发明。例如已从下列植物中克隆到过氧化物酶：烟草(Lagrimini M.等，美国国家科学院院报84：7542-7546(1987)，土豆(Roberts等，植物分子生物学11：5-26(1988))，辣根(Fujiyama等，欧洲生物化学杂志，173，681-687(1988)；Fujiyama等，基因89：163-169(1990)和Welinder K.G.欧洲生物化学杂志96：483-502(1979))；蕃茄(Roberts，E.和KolattukudyP.E.分子基因和遗传学217：223-232(1989))，花生(Buffard等，美国国家科学院院报87：8874-8878(1990))；黄瓜(Morgens等，植物分子生物学14：715-725(1990))，拟南芥(Intapruk等，基因98：237-241(1991))，小麦(Hertig等，植物分子生物学16：171-174(1991)和Rebmann等，植物分子生物学16：329-331(1991))，大麦(Rasmussen等，植物分子生物学16：317-327(1991)；和TheiladeiB和Rasmussen，S.K.基因118：261-266(1992))，水稻(Reimman等，植物生理学100：1611-1612(1992))，玉米(Hwang，ph.D论文，俄亥俄州立大学)和芜菁(Mazza和Welinder，欧洲生物化学杂志108：481-489(1980))。

用于本发明的过氧化物酶编码序列并不限于已知的过氧化物酶编码序列。可通过与已知过氧化物酶的相同性或相似性分离用于本发明的新型过氧化物酶编码序列。蕃茄阴离子过氧化物酶与辣根阳离子过氧化物酶和芜菁阳离子过氧化物酶的氨基酸序列具有相同性或相似性。烟草和辣根的总相同性或相似性为52％；对于烟草和芜菁，过氧化物酶具有46％相同性或相似性。而且，在过氧化物酶编码序列的某些区域相同性或相似性接近100％。四个保守区域对应于总的过氧化物酶活性的关键结构域。相应地，利用本领域熟知的技术，可使用保守区的DNA序列从任何植物中克隆过氧化物酶编码序列(见例如，现代分子生物学技术，Ausubel等编辑，John Wiley&Sons，Inc，New York，NY(Spring 1996))。

同样，可用针对一种过氧化物酶的抗体分离其它的过氧化物酶以分离新型过氧化物酶编码序列。用针对烟草阴离子过氧化物酶的抗体已显示了各种过氧化物酶同功酶之间的同源性。通过免疫印迹分析，这些抗体可与辣根和芜菁同功酶发生强的交叉反应，也能够与大部分的其它烟草同功酶发生交叉反应。见LagriminiM等，美国国家科学院院报84：7542-7546(1987)。用本领域熟知的方法可对新型过氧化物酶进行测序并且其相应的编码序列可通过本领域熟知的方法分离(见例如，Sambrook等，分子克隆-实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，NY，USA(1988))。

来自除了宿主植物以外的来源(如来自细菌)的过氧化物酶编码序列在植物中的转基因表达需要编码序列的修饰以获得并优化其在宿主植物中的表达。在某些情况下，不必修饰编码序列和相邻序列。分离含有目的编码序列的片段并将其插入到植物启动子的下游是足够的。例如见Gaffney等，科学261：754-756(1993)。优选地，只剩下极少的相邻微生物序列结合在ATG上游和终止密码子下游。

可以优化过氧化物酶编码序列以提高它在宿主单子叶植物中的表达。例如，因为宿主植物中偏爱的密码子用法和密码子频率与目的过氧化物酶编码序列不同，比较克隆的编码序列与植物编码序列(特别是来自靶植物的编码序列)的密码子用法和频率以确定可优选替换的编码序列内的密码子。可根据植物中表达量最高的蛋白中使用频率最高的密码子确定优选的密码子。见例如，Adang等，EP-A-359472；Fischhoff等，EP-A-385962；Cornellissen等，WO 91/16432；Koziel等，WO 93/07278；Perlak等，美国国家科学院院报88：3324-3328(1991)；和Murray等，核酸研究17：477-498(1989)。

以这种方式，核苷酸序列可在特定的目的植物中优化表达。可以认识到编码序列的全部或任何部分可被优化或合成。也就是说，可以使用合成或部分优化的序列。

植物与微生物的区别在于它们的信使不具有确定的核糖体结合位点。情况是核糖体结合到信使的5′端并寻找第一个可用的ATG以起始翻译。在植物中，对与ATG相邻的某些核苷酸有偏爱性，因此，在ATG处包含真核生物共有的翻译起始子可提高微生物基因的表达。Clontech(1993/1994目录，第210页)已提出了作为大肠杆菌uidA基因在植物中表达的保守翻译起始子的序列。另外，Joshi，核酸研究15：6643-6653(1987)比较了多种植物与ATG相邻的序列并且也提出了保守序列。当微生物编码序列在植物中表达遇到困难时，优选地在起始ATG处包含一个这样的序列。

从非植物来源克隆的编码序列也可包含在植物中识别为5′或3′剪接位点的基序，于是产生截短或缺失的信使。利用本领域熟知的技术可去掉这些位点(见例如，现代分子生物学方法，Ausubel等编辑，JohnWiley&Sons Inc.，New York，NY(Spring 1996))。

含有编码过氧化物酶的编码序列的重组DNA可用于制备转基因的植物组织。优选地，用至少一个进一步包含与过氧化物酶编码序列可控连接的转录起始区和启动子的重组DNA转化植物。

转录起始区可以是宿主固有的或外源的。外源的是指转录起始区导入其中的野生型宿主中不存在这个转录起始区。

终止区域可来自(1)得到转录起始区的同一基因，(2)所用的过氧化物酶基因或(3)其它来源。

优选地，过氧化物酶编码序列与植物可表达启动子可调控地融合，优选的启动子包括组成型的、可诱导的、时序调控的、发育调控的、化学调控、组织偏爱和/或组织特异型启动子。在一个优选实施方案中，过氧化物酶编码序列与其天然存在的启动子和/或多腺苷酸化信号序列可调控地连接。

优选的组成型启动子包括CaMV355和19S启动子(Fraley等，美国专利5,352,605)。另一优选的启动子来自任一已知在大多数细胞类型中表达的肌动蛋白基因，McElroy等.Mol.Gen.Genet.231：150-160(1991)描述的启动子表达盒可以容易地经修饰以表达过氧化物酶编码序列并特别适用于单子叶植物宿主。

另一优选的组成型启动子来自另一已知其产物在多种细胞类型中积累的遍在蛋白基因。已从几个物种中克隆了遍在蛋白启动子以用于转基因植物(如向日葵-Binet等，植物科学79：87-94(1991)，玉米-Christensen等，植物分子生物学12：619-632(1989))。单子叶植物转基因系统中已开发了玉米遍在蛋白启动子，其序列和用于单子叶植物转化的载体构建公开于Christiansen等，EP-A-342,926。遍在蛋白启动子适于在转基因植物，特别是单子叶植物中表达过氧化物酶编码序列。

对于在植物，尤其是玉米中表达过氧化物酶编码序列有用的组织特异型或组织偏爱启动子是在根、髓、叶或花粉中指导表达的启动子。这样的启动子公开于Koziel等，WO 93/07278。用于在植物中指导过氧化物酶编码序列表达的化学诱导型启动子也是优选的(见Alexander等，WO 95/19443)。

除了启动子，也有多种转录终止可以用于过氧化物酶编码序列嵌合基因构建。转录终止子负责在转基因以外区域终止转录及其正确的聚腺苷酸化作用。合适的转录终止子及已知那些在植物中作用的转录终止子包括CaMV35S终止子，tml终止子，豌豆rbcS E9终止子及其它本领域已知的终止子。方便的终止区可从根瘤土壤杆菌的Ti质粒中得到，如章鱼氨酸合酶和胭脂氨酸合酶终止区。见Rosenberg等，基因56：125(1987)；Guerineau等，Mol.Gen.Genet.262 141-144(1991)；Proudfoot，细胞，64：671-674(1991)；Sanfacon等Genes Dev.5：141-149；Mogen等，植物细胞2：1261-1272(1990)；Munroe等，基因，91：151-158(1990A)；Ballas等，核酸研究17：7891-7903(1989)；Joshi等核酸研究15.9627-9639(1987))。

已从转录单位内发现许多可增强基因表达的序列，并且这些序列可与过氧化物酶编码序列结合以提高转基因植物中的表达。已证明多种内含子序列能增强表达，尤其是在单子叶细胞中。例如，已发现玉米Adhl基因的内含子导入玉米细胞时会在其同源启动子作用下显著增强野生型基因表达(Callis等，Genes Develop.1：1183-1200(1987))。内含子已被常规性地掺入植物转化载体，通常位于非编码的前导区内。

此构建体也包含与适当核苷酸序列可调控连接的调节子如核定位信号(Kalderon等，细胞39：499-509(1984)和Lassner等，植物分子生物学17：229～234(1991))，植物翻译保守序列(Joshi，C.P.核酸研究15：6643-6653(1987)，内含子(Luehrsen和Walbot，Mol.Gen.Genet.225：81-93(1991))等，。

优选地，

前导序列包含于表达盒构建体中。这样的前导序列可增强翻译。翻译前导序列在本领域为人熟知，包括：细小核糖核酸病毒前导序列如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒

非编码区)(Elroy-Stein，O.，Fuerst，T.R.和Moss，美国国家科学院院报86：6126-6130(1989))；马铃薯Y病毒组前导序列如TEV前导序列(烟草缺刻病毒)(Allison等，MDMV前导序列(玉米矮缩条纹病毒)；病毒学；154：9-20(1986))和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak，D.G.和Samow，P.自然353：90-94(1991)；来自苜蓿花叶病毒外壳蛋白mRNA(AMVRNA4)的非翻译前导序列(Jobling，S.A.和Gebrke L.自然.325：622-625(1987))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie，D.R.等，RNA的分子生物学，第237-256页(1989))；和玉米褪绿条纹病毒前导序列(MCMV)(Lommel，S.A.等，病毒学91：382-385(1991))。见Della-Cioppa等，植物生理学，84：965-968(1987)。

在制备重组DNA时，可操作多个DNA片段以提供以正确方向并在正确读码框架中的DNA序列。为此目的，可采用衍接物或接头将DNA片段连接起来，或采用其它操作以提供方便的限制性位点、去除多余DNA、去掉限制性位点等。为此目的，优选地在涉及插入、删除或替换如转换和颠换时采用体外诱变、引物修补、限制性酶切、退火、切除或连接等。

多种转化载体可用于植物转化，过氧化物氧化酶可与任何这样的载体结合使用。载体的选择取决于优选的转化技术和用于转化的靶物种。对于某些靶物种而言，优选地使用不同的抗生素或除草剂选择标记。转化中常用的选择标记包括赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因(Messing&Vierra，基因19：259-268(1982)；Bevan等，自然304：184-187(1983))，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因(White等，核酸研究18：1062(1990)，Spencer等，Theor Appl.Genet.79：625-631(1990))，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因(Blochinger&Diggelmann，分子细胞生物学4：2929-2931)和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Bourouis等，EMROJ 2：1099-1104(1983))。

可得到很多用于根瘤土壤杆菌转化的载体。它们通常具有至少一个T-DNA边界序列，包括诸如pBIN19的载体(Bevan；核酸研究12(22)：8711-8721(1984))。在一个优选实施方案中，将过氧化物酶编码序列插入双元载体pCIB200和pCIB2001之一用于农杆菌。这些用于农杆菌介导转化的载体表达盒可以下述方式构建。用NarI消化pTJS75(Schmidhauser&Helinski，细菌学杂志164：446-455(1985))切除四环素抗性基因产生pTJS75kan，然后插入来自pUC4K携带NPTII的AccI片段(Messing&Vierra，基因19：259-268(1982)；Bevan等，自然304：184-187(1993)；McBride等，植物分子生物学14：266-276(1990))。将XhoI接头连入含有T-DNA左右边界序列、植物可选择的nos/nptII嵌合基因和pUC多接头的pCIBT的EcoRV片段(Rothstein等，基因53：153-161(1987))并将XhoI消化片段被插入经SalI消化的pJJS75Kan以制备pCIB200(也见EP-A-332104，实施例19)。pCIB200含有下列单多接头限制性位点：EcoRI，SstI，KpnI，BglII，XbaI和SaII。pCIB2001是通过插入另外的限制性位点多接头从pCIB200衍生的。pCIB2001多接头中的单一限制性位点为EcoRI，SstI，KpnI，BglII，XbaI，SalI，MluI，BclI，AvrII，ApaI，HpaI和StuI。pCIB2001除了含有这些单一限制性位点，还有植物和细菌卡那霉素选择，用于农杆菌介导的转化的T-DNA左右边界，trfA的用于大肠杆菌和其它宿主间移动的RKZ衍生的功能和来自RK2的OriT和OriV功能。pCIB2001多聚头适用于包含它们自身的调控信号的植物表达盒克隆。

用于农杆菌介导的转化的另一载体是双元载体pCIB10，它包含编码用于植物中选择的卡那霉素抗性基因、T-DNA左右边界序列并掺入了来自广谱宿主范围质粒pRK252的序列以使它在大肠杆菌和农杆菌中都能复制。它的构建由Rothstein等，基因53：153-161(1987)描述。构建了多种pCIB10的衍生物，它们掺入了由Gritz等，基因25：179-188(1983)所述的编码潮霉B磷酸转移酶的基因。这些衍生物使得只用潮霉素选择转基因植物(pCIB743)或用潮霉素和卡地霉素共同选择(pCIB715，pCIB717)。

用于直接基因转移技术并用除草剂Basta(或膦丝菌素)筛选的载体是pCIB3064。此载体的基础是质粒pCIB246，它包含与大肠杆菌GUS基因可操作融合的CaMV35S启动子和CaMV35S转录终止子并在Koziel等，WO 93/07298中描述。提供膦丝菌素抗性的基因是来自吸水链霉素的bar基因(Thompson等，EMBOJ.6：2519-2523(1987))。此载体适用于包含它们自身调控信号的植物表达盒克隆。

另一载体是pSOG35，它利用赋予氨甲喋呤抗性的大肠杆菌基因二氢叶酸还原酶(DHFR)作为选择标记。用pCR扩增35S启动子(约800bp)，来自玉米Adhl基因的内含子6(约550bp；见Dennis等，核酸研究12：3983-4000(1984)和18bp的GUS非翻译前导序列(见Jefferson等，美国国家科学院院报83：8447-8451(1986))。编码大肠杆菌二氢叶酸还原酶II型基因的250bp片段也通过PCR扩增得到，这两个PCR片段通过来自包含pUC19载体骨架和胭脂氨酸合成酶终止子的pBI221(Clontech)的SacI-pstI片段装配在一起。这些片段的装配产生了pSOG19，它包括与内含子6序列融合的35S启动子、GUS前导序列、DHFR基因和胭脂氨酸合成酶终止子。用来自玉米褪绿条纹病毒(MCMV)前导序列替代pSOG19中的GUS前导序列产生了载体pSOG35。pSOG19和pSOG35携带氨苄青霉素抗性pUC基因；并且可用HindIII，SphI，PstI和EcoRI位点克隆外源序列。

上述重组DNA可用本领域认可的多种方法导入植物细胞。本领域的技术人员应当理解，方法的选择取决于要转化的靶植物类型。适用于转化植物细胞的方法包括微注射(Crossway等，生物技术4：320-334(1986)，电穿孔(Riggs等，美国国家科学院院报83：5602-5606(1986)，农杆菌介导的转化(Hinchee等，生物技术6：915-921(1988)；也见Ishida等，自然生物技术14：745-750(1996年6月)，用于玉米转化)，直接基因转移(Paszkowski等，EMBO J.3：2717-2722(1984)；Hayashimoto等，植物生理学93：857-863(1990)(水稻))和用来自Agracetus，Inc.Madison；Wisconsin和Dupont Inc.，Wilmington，Delaware的仪器进行弹粒加速(见例如Sanford等，美国专利4,945,050和McCabe等，生物技术6：923-926(1988))。也见Weissinger等，遗传学年鉴22：421-477(1988)；Sanford等，颗粒科学和技术5：27-37(1987)(洋葱)；Svab等，美国国家科学院院报87：8526-8530(1990)(烟草叶绿体)；Christou等，植物生理学87：671-674(1988)(大豆)；McCabe等，生物/技术6：923-926(1988)(大豆)；Klein等，美国国家科学院院报85：4305-4309(1988)(玉米)；Klein等，生物/技术6：559-563(1988)(玉米)；Klein等，植物生理学91：440-444(1988)(玉米)；Fromm等，生物/技术8：833-839(1990)；和Gordon-Kamm等，植物细胞2：603-618(1990)(玉米)；Koziel等，生物技术11：194-200(1993)(玉米)；Shimamoto等，自然338：274-277(1989)(水稻)；christou等，生物技术9：957-962(1991)(水稻)；Datta等，生物/技术8：736-740(1990)(水稻)；欧洲专利申请EP-A-332581(果园草和其它Pooideae)；Vasil等，生物技术11：1553-1558(1993)(小麦)；Weeks等，植物生理学102：1077-1084(1993)(小麦)；Wan等，植物生理学104：37-48(1994)(大麦)；Jahne等；Theor.Appl.Genet.89：525-533(1994)(大麦)；Umbeck等，生物/技术5：263-266(1987)(棉花)；Casas等，美国国家科学院院报90：11212-11216(1993年12月)(高粱)；Somers等，生物/技术10：1589-1594(1992年12月)(燕麦)；Torbert等，Plant Cell Reports 14：635-640(1995)(燕麦)；Weeks等，植物生理学102：1077-1084(1993)(小麦)；Chang等，WO 94/13822(小麦)和Nebra等，植物杂志5：285-297(1994)(小麦)。

一套特别优选的通过微粒轰击将重组DNA分子导入玉米的实施方案见于Koziel等，生物技术11：194-200(1993)，Hill等，Euphytica85：119-123(1995)和Koziel等，纽约科学院年鉴792：164-171(1996)。另一优选的实施方案是Shillito等EP-A-292 435公开的用于玉米的原质体转化。

植物转化可以一种DNA或多种DNA(即共转化)进行，这两种技术都适用于过氧化物酶编码序列。

使用直接基因转移方法、粒子枪技术或农杆菌介导的转移通常但不必须与提供对抗生素(如卡那霉素，潮霉素或氨甲喋呤)或除草剂抗性(如，膦丝菌素)的可选择或可筛选标记同时使用。标记的例子有新霉素磷酸转移酶，潮霉素磷酸转移酶，二氢叶酸还原酶，膦丝菌素乙酰转移酶，2，2′-二氯丙酸脱卤素酶，乙酰羟酸合成酶，5-烯醇酮酰-莽草酸-磷酸合成酶，卤芳腈水解酶，乙酰辅酶A羧化酶，二氢喋酸盐合成酶，氯霉素乙酰转移酶和β-葡糖醛酸酶。用于植物转化的可选择或可筛选标记的选择对本发明并不关键。

优选地，过氧化物酶编码序列单独或结合应用。也就是说，可将一个或多个过氧化物酶编码序列插入一种植物以控制不同的虫害。这可通过下述步骤完成：(1)用包含一个或多个过氧化物酶编码序列的DNA序列转化宿主细胞，(2)将包含单一过氧化物酶编码序列的DNA序列转化宿主植物并鉴定此DNA序列向宿主基因组的多拷贝插入，或(3)用过氧化物酶编码序列重复转化宿主植物直到宿主植物包含希望数量的过氧化物酶编码序列。

过氧化物酶编码序列与其它编码能够控制昆虫的蛋白的编码序列联合使用将会提高植物针对给定昆虫的保护水平和/或其杀虫活性范围。

细菌苏云金芽孢杆菌(Bt)是格兰氏阳性产芽孢杆菌，它在芽孢形成过程中产生伴孢晶体(综述见Koziel等，生物技术和基因工程评论11：171-228(1993))。这些晶体主要是由一个或多个称为δ-内毒素或杀虫晶体蛋白组成，当被某些昆虫吞食时具有杀虫活性。已了解Bt的很多菌株。每一菌株产生不同杀虫活性不同数量的δ内毒素。可与过氧化物酶联合使用的Bt内毒素的例子包括但不限于CrylA(b)(Koziel等，生物/技术11：194-200(1993))，CryA(c)(美国专利5,530,197)，CrylH(也称Cry9C)(Lambert等，应用环境微生物学62：80-86(1996))和CryIIIA(Adang等，植物分子生物学21：1131-1145(1993)。

芽孢杆菌菌株在营养生长时产生的杀虫蛋白(营养杀虫蛋白，VIPS)也可与过氧化物酶联合使用。VIP的例子见Warren等，WO 94/21795；Warren等，WO 96/10083和Estruch等，美国国家科学院院报93：5389-5394(1996)。

可与过氧化物酶联合使用的带杀虫化合物的蛋白的例子包括但不限于胆固醇氧化酶(美国专利5,518,908)，蛋白酶抑制剂，凝集素，α-淀粉酶。

可用本领域熟知的任何方法制备表达一种以上昆虫抗性编码序列的单子叶植物。例如，过氧化物酶可与另一昆虫主要基因(insectprinciple gene)同时转化单子叶植物(共转化)，可以将第二个昆虫主要基因导入已用过氧化物酶编码序列转化的植物，或反过来或选择性地将一株表达过氧化物酶编码序列的转基因植物与一株表现第二个昆虫主要基因的植物杂交以将两个编码序列导入同一植物。

在下文非限制性实施例中对本发明进一步做了详细描述。在实施例中，制备、操作和分析核酸的方法按照Sambrook等，分子克隆-实验室手册；第2段，冷泉港实验室出版社，NY，USA(1988)中的标准方法进行。实施例实施例1：含有过氧化物酶编码序列的转基因玉米植物载体构建

pPOD3.5(Lagrimini等，美国国家科学院院报84：438-442(1987))含有包含全部过氧化物酶编码序列的1256bp烟草阴离子过氧化物酶cDNA和有助于分泌至细胞壁腔内的22个氨基酸的信号肽。用BamHI消化pPOD3.5并将它克隆到pCIB710的BamHI位点(Rothstein等，基因53：153-161(1987))。用EcoRI消化新的构建体并将它亚克隆至Bluescript SK+(Stratagene目录，1994)-将形成的构建体命名为pJS20293(图1)，于1996年9月27日将它以NRRLB-21626贮存于农业研究机构保藏中心(NRRL)，International Depositary Authority，1815N，University Street，Peoria IL 61604，美国。pJS20293在BlueScript(Stratagene)质粒中包含位于CaMV35S启动子和缩小的内含子(Werr等，EMBOJ，4：1373-1380(1985))之后的1200bp过氧化物酶cDNA克隆，然后是CaMV 35S终止子(图1)。pJS20293与含有编码膦丝菌素抗性的嵌合bar基因的质粒pUBI/Ac(图2)共转化。用未成熟合子胚转化

在两个独立的实验中，用无菌操作将Lancaster型近交系CG00526的600个未成熟胚从授粉12-13天后的表面无菌的、温室中生长的谷穗上切下。1.5至2.0mm大小的胚盖片向上接种于愈伤组织初始培养基2DG4+5mg/ml Chloramben。2DG4培养基是Duncan′s(Duncan等，Planta 165：322-332(1985))“D”培养基，它经修饰后含20mg/L葡萄糖。

按Dupont Biolistic手册描述的方法，将pJS20293 DNA沉淀成1mm的金微载体。制备DNA/金混合物以使每次轰击运送约1mgpJS20293 DNA。为了进行未成熟胚转化，每50ml微载体中用6.34mgpJS20293和7.21mg pUBI/Ac。都用85ml乙醇将两种沉淀物的体积分别补充至85ml，每种的10ml在微载体上干燥。

在轰击前4小时，将胚转移至12DG4+5mg/ml Chloramben进行渗透压处理。根据厂商说明(Dupont)，用PDS-100He Biolistics装置轰击靶平板上的36个胚胎。在靶平板的中心将胚胎围绕直径为2cm的圆排放，盾片的胚根鞘端朝向一个方向。将靶平板放成向上的30°角以使胚根鞘根首先被颗粒喷雾击中。用Biolistic厂商提供的24×24mm标准筛目，用于轰击的破裂圆盘为1550psi值。轰击后3小时将胚胎放回2DG4+5mg/L Chloramben培养基并在黑暗中于25℃培养。

轰击后14天，将胚胎发生反应转移到愈伤组织维持培养基2DM4+0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2.4-D)中。M4培养基为不含酪蛋白氨基酸的G4。培养基中所含的Basta^从5mg/L逐渐提高至20mg/L。

12周后用Basta^选择开始再生。I型愈伤组织放在修饰的Murashige和Skoog培养基(MS)上，(Murashige和Skoog，physiologiaPlantarum 15：473-497(1962)，此培养基含3％蔗糖，0.25mg/L 2，4-D，5mg/L benzylzminopurine和5mg/L Basta^，于25℃在光照下培养16小时(50mE/m-2/s-1)，避光培养8小时。两周后，将组织转至含3％蔗糖和5mg/L Basta^的MS培养基中。在含1/2盐浓度和3％蔗糖的MS修饰培养基上于GA7容器中培养再生植物。用I型胚胎发生愈伤组织转化

为了用I型胚胎发生愈伤组织转化玉米，用标准培养技术从未成熟合子胚中获得愈伤组织。为了进行基因转移，先通过用手术刀片切割约300mg I型愈伤组织或在基因转移前再培养3-5天。基因转移前，将制备的愈伤组织放在含12％蔗糖的半固体培养基上。约4小时后，用BioRad公司的PDS-1000/He Biolistic装置以pJS20293轰击组织。用基本上是BioRad标准方法的方法将2mg pJS20293沉淀在1mm金颗粒。基因运送后约16个小时，将愈伤组织转移至含2％蔗糖和1mg/L膦丝菌素的标准培养中。将愈伤组织选择传代培养8周，然后将存活和生长的愈伤组织转至标准再生培养基以生产植物。分析再生植物对玉米螟的抗性。获得了抗性植物。

得到的转基因植物用于常规的植物育种程序以产生更多具有相似杀虫特征的转基因植物。此转基因植物也与相同植物的其它品系杂交。转基因植物也产生含有稳定插入其基因组的嵌合过氧化物酶基因的种子。

用Southern印迹分析证实了含有过氧化物酶编码序列的转基因玉米植物。当用EcoRI限制性酶切割转基因植物基因DNA，用过氧化物酶基因作为特异的探针可检测到一条约1.3Kb的带，表明了完整过氧化物酶基因的存在。

也用Northern印迹分析证实了含有过氧化物酶编码序列的转基因玉米植物。当与过氧化物酶特异探针杂交时，RNA印迹中可观察到一条大小约1.2Kb的带。昆虫生物分析

最初评估了总共46株转基因玉米植物对玉米螟(ECB)的杀虫活性。将10个第一龄期ECB幼虫放在叶插上进行第一组生物分析，叶插被放在具有防止叶插干燥的湿润滤纸巾的Gelman培养皿中。让幼虫自由进食两天。第一次分析的554个事件中得到两株阳性植物。这两株植物样品不表现昆虫进食的迹象，幼虫死掉了。在那个事件和其它事件中剩余的植物有健康进食的昆虫。

注意到这个活性，在下批ECB生物分析中进行了更多的重复。每次重复用5个幼虫；共进行了4次重复。两天后读取死亡率百分数。因为植物仍表现杀虫活性，决定检测它们对其它靶昆虫的杀虫活性。

用昆虫生物分析的方法分析表达过氧化物酶转基因玉米的杀虫活性。此方法与任何检测具有任一杀虫基因的玉米的方法相似，只是这儿描述的过氧化物酶编码序列的例子。从转基因玉米延伸的叶子上切1-4cm的薄片。每个叶片放在50×9mm培养皿的湿润滤纸盘上。靶昆虫的5个新生卵(玉米螟，草地夜蛾，棉铃虫，甜菜夜蛾和小地老虎)被放在每个叶片上。因为每株植物多次采样，这样每株植物检测了5-20个幼虫。将培养皿于30℃培养，在24，48和72小时记录叶子吞食损坏和死亡率数据。毒性数据列于表1。

表1.当与表达过氧化物酶的玉米叶接触时，不同昆虫的死亡率

	554-1	554-3
			玉米螟(ECB)	100％	100％
草地夜蛾(FAW)	15％	15％
			甜菜夜蛾(BAW)	0％	5％
谷实夜蛾(CEW)	100％	100％
			小地老虎(BCW)	0％	0％

^*叶子对稻夜蛾有很强的抗吞食作用。转基因后代

将来自事件号554和755(体外生物分析表明对玉米螟有杀虫特性)的转基因玉米植物进行田间试验。当田间植物达到约40cm伸展叶高时，开始用ECB幼虫感染。约300新生幼虫与玉米芯石细胞团混合，并将混合物放在每个植物的轮内。感染继续进行，每周一次共进行了4周以刺激第一代玉米螟(ECB1)。从首次感染后两周开始每周记录植物损伤级别，得到了平均ECB1损伤率(见图II和III)，当玉米达到开花期时，将300新生幼虫/植物/周施用于植物，连接4周以刺激第二代感染(ECB2)。首次ECB2刺激感染后约50天，劈开茎，测量管道的破坏(见表II和III)。实验条件由Koziel等，生物/技术11：194-200(1993)进一步详细说明。

表2

植物杂交植物号码	ECB1叶损伤级别1	ECB2叶损伤管道长度2(cm)
			(CG00526×554-3)5自身10号植物15号植物22号植物	111	58158
(CG00526×554-3)6自身4号植物5号植物9号植物14号植物19号植物20号植物25号植物28号植物29号植物32号植物	1212111111	0575430970
			评估的阳性数总管道平均数标准差		131219.315
(非转化的CG00526)123		死植物，被ECB杀死死植物，被ECB杀死死植物，被ECB杀死
			评估的阴性数总管道平均数标准差		3---

¹按下列确定叶损伤，级别：

1.无可见的叶损伤。

2.细的“窗玻璃”损坏的证据只存在于幼虫与玉米芯石细胞进入轮的伸展叶上。没有叶的针孔穿透。

3.细的“窗玻璃”损坏的证据只存在于两片幼虫与玉米芯石细胞进入轮的伸展叶上。没有叶的针孔穿透。

4.在从轮上出现的两个或多个叶片上存在有穿透叶片的针孔或射孔进食损伤(长度＜0.25″的病灶)。

5.从轮上出现的3个以上叶片上有明显的延长的病灶和/或中脉进食。长度＜1.0＂的病灶。

6.n个叶子有延长的病灶(长度为0.75＂至1.5＂)和/或中脉折断的叶子不超过一片。

7.大约1半的叶片有长的病灶(＞1.0″)和2或3片叶子的中脉折断了。

8.大约2/3叶片有长的病灶(＞1.0″)和/或3片以上的叶子中脉折断。

9.大多数叶子有长的病灶。n片叶子的中脉折断。也可产生由ECB进食引起的矮化植物。²   在92cm的转基因和对照植物的茎切片上，测量了初生谷穗节上46cm的内部ECB管道损伤的程度。能够达到的最大损伤为92cm。在实验结束时，对照植物完全被破坏因而不可能进行测量。

表3

植物杂交植物号码	ECB1叶子损伤级别1	ECB2损伤管道长度2(cm)
			(CG00714×755-9)阳性分离体6号植物12号植物16号植物20号植物24号植物25号植物	333431	153119241826
(CG00714×755-9)阴性分离体7号植物8号植物9号植物10号植物11号植物	7死植物779	死植物死植物死植物死植物死植物
			评估的阳性数目总隧道平均数标准差		613322.175.91
评估的阴性数目总隧道平均数标准差		5---

¹   叶子损伤级别按表II描述的进行测定

1.无可见的叶损伤。

2.细的“窗玻璃”损坏的证据只存在于幼虫与玉米芯石细胞进入轮的伸展叶上。没有叶的针孔穿透。

3.细的“窗玻璃”损坏的证据只存在于两片幼虫与玉米芯石细胞进入轮的伸展叶上。没有叶的针孔穿透。

4.在从轮上出现的两个或多个叶片上存在有穿透叶片的针孔或射孔进食损伤(长度＜0.25＂的病灶)。

5.从轮上出现的3个以上叶片上有明显的延长的病灶和/或中脉进食。长度＜1.0＂的病灶。

6.n个叶子有延长的病灶(长度为0.75＂至1.5＂)和/或中脉折断的叶子不超过一片。

7.大约1半的叶片有长的病灶(＞1.0″)和2或3片叶子的中脉折断了。

8.大约2/3叶片有长的病灶(＞1.0″)和/或3片以上的叶子中脉折断。

9.大多数叶子有长的病灶。n片叶子的中脉折断。也可产生由ECB进食引起的矮化植物。²   在92cm的转基因和对照植物的茎切片上，测量了初生谷穗节上46cm的内部ECB管道损伤的程度。能够达到的最大损伤为92cm。在实验结束时，对照植物完全被破坏因而不可能进行测量。实施例2：包含过氧化物酶编码序列的转基因小麦

用Chang等，WO 94/13822，Weeks等，植物生理学102：1077-1084(1993)或Nehra等，植物杂志5(2)：285-297(1994)的方法以pJS20293(图1)和pUBIAc(图2)转化小麦。

转化小麦用的Chang等，WO 94/13822方法之一如下所述(也用Chang等描述的其它方法)：基因型UC703的小麦愈伤组织的制备

基因型UC703的小麦生长至开花期自花授粉。从植物上取1-2.5mm长的含胚胎的穗状花序并用10％Clorox溶液灭菌10分钟。从未成熟种子中取出胚胎并将胚胎轴朝下放在Murashige和Skoog培养基上，此培养基含5或10mg/l 2，4-D，13.7％W/V麦芽糖，100mg/l脯氨酸和100mg/l肌醇，用0.7-0.8％V/V phytagar或0.1-0.2％脱乙酰吉兰糖胶固化(初始培养基)。于27℃避光培养3周后，体细胞胚(M型愈伤组织)在某些外植体盾片上发育成很多地球形的愈伤组织为优选的球形愈伤组织。将愈伤组织取下置于含有1.0-5.0mg/L 2，4-D和2-3％蔗糖的MS培养基上或放在蔗糖培养基上之前先放在含有低麦芽糖(5％)水平的培养基上。然后每周用含3％蔗糖的新鲜MS培养基传代培养材料。用于轰击的细胞的制备

轰击前后对用于轰击的细胞进行质壁分离处理。测量收集细胞体积并用含有渗透剂的1MS液体培养基稀释细胞：0.4M山梨糖醇处理悬浮细胞，0.6M山梨糖醇处理愈伤组织细胞。细胞被稀释使悬浮液收集细胞体积每个目标为1/30ml，愈伤组织的为1/10ml。将经稀释的细胞置于含搅拌棒的250ml三角瓶中并搅动30分钟至几个小时。为了往平板上接种细胞，从三角瓶中取出2ml移入放有Whatman 2.5cm GFA滤纸的真空三角瓶的顶部。运用真空直到细胞干燥的滤纸上。将此滤纸放在含有5ml固体轰击后质壁分离培养基的60×15mm培养皿平板上，此培养基为1MS，含有用于悬浮细胞的0.2M山梨糖醇或用于愈伤组织细胞的0.4M山梨糖醇。每个平皿上放两张滤纸。用于轰击的载体

下列插入有包含过氧化物酶表达盒的质粒可用于微粒轰击(使用相同量的DNA进行pJS20293(图1)和pUBIAc(图2)共转化)：

pSOG30购自Clontech实验室，Palo Alto，Califonia，是来自质粒pBI121的b-葡糖醛酸糖苷酶(Gus)表达载体。玉米Adhl基因的内含子6通过PCR从质粒pB428扩增而来，描述于Bennetzen等，美国国家科学院院报81：4125-4128(1987)，连入pBI121的BamHI位点，它位于CaMV35S启动子和Gus基因之间。17bp的玉米褪绿条纹病毒(MCMV)前导序列，描述于Lommel等，病毒学181：382-385(1991)被插入到35S-Gus基因非翻译前导序列内。最后的基因融合物包括结构：35S启动子-Adhl内含子6-MCMV前导序列-Gus-Nos终止子，皆位于pUC19载体主链内。

pSOG35是二氢叶酸还原酶(dhrf)表达载体。通过将上述的35S启动子，Adhl内含子6和MCMC融合到来自质粒pHCO的dhfr基因内衍生出的载体，Bourouis和Jany，EMBOJ 2：1099-1104(1983)中做了描述。最终的基因融合物包括结构：35S启动子-Adhl内含子6-MCMC前导序列-dhfr-Nos终止子；皆位于pUC19载体的主链内。

pTG48在pUC19主链内包括了在另一特异的ant43D启动子控制下的Gus基因和dhfr基因。它是4个不同DNA片段联合的结果。片段1经HindIII和EcoRI限制性切割pSOG35得到的。包含有dhfr基因的分离片段的EcoRI末端与SalI限制性末端相连。图2是经HindIII和XbaI限制性切割质粒pCIB3178后分离到的另一特异的ant43D启动子。质粒pCIB3178在EP-578,611中有详细描述，EP-578611的相关部分在此引用作为参考并以录入号NRRL.B-18978贮存。经XbaI和EcoRI限制性切割质粒pSOG30得到包含Gus基因基因的片段了，片段4与用SalI和EcoRI切割可商业上得到的载体pUC产生的片段一致。粒子制备

将金颗粒(1.0微米；来自Bio-Rad)等分别微量离心管中microfuge中，加入约1ml 100％乙醇，震荡，旋转甩下，移掉上清，用灭菌水重复两次，以洗涤金颗粒。最后一次洗涤后，吸走尽可能多的水；加入聚赖氨酸溶液(0.02％聚赖氨酸+15mM乙酸胺)以完全浸没颗粒。震荡颗粒，旋转，移走上清，将颗粒放在层流罩超净台过夜干燥或用轻柔的氮气流吹动30分钟干燥颗粒。

为了制备“完全”粒子，称取10mg粒子放入无菌的含搅拌棒的微量离心管中。加入100ml(1mg/ml)每种DNA(或者50ml(1mg/ml)每种DNA)，然后震荡。然后加入10ml 10mM Na₂HPO₄，然后震荡。加入10ml 100nM Cacl₂，然后震荡。最后，加入380ml 100％乙醇，然后震荡。当剧烈搅拌的同时，取3ml到塑料flier(发射物)上。轰击前令粒子在滤纸上干燥至少15分钟。轰击细胞培养物

将含有细胞滤纸的培养皿平板倒置在最高层的平台上，通过粒子飞行孔将它放在中央。将透明的盖子放在平台的顶上。将微发射物放在炮尾后关闭炮尾。按动“臂”按扭使合适量的氦气充满库(1800-1900psi)。将小室上的真空拉到约27mm。关闭真空，按动“臂”和“火”按扭。然后将“臂”按扭推到“停止”位置。每张滤纸通常接受两次轰击。轰击后培养和筛选

轰击后，培养物避光过夜。第二天将滤纸以质壁分离培养基中取出放在1MS培养基上。对于悬浮细胞，轰击后1-10天进行筛选，对于愈伤组织细胞；轰击后14天开始筛选。从滤纸上刮下细胞，将它涂布在含有1MS+2mg/l氨甲喋呤(或合适的选择剂)的平板上。将平板避光孵育几周。将几周后出现的抗性克隆转至1MS+4mg/l氨甲喋呤(或合适的选择剂)。继续繁殖克隆约3-4周，然后转到“0.5 MS”维持培养基上，它是MS盐，维生素，铁，3％蔗糖，0.7％琼脂，0.5mg/l 2，4-D的水溶液。将组织用这种培养基两周一次传代培养直至出现胚胎发生结构或组织看上去适于再生。再生

将组织转移至含有3mg/lBAP或1mg/l NAA+5mg/l GA的MS培养基，并将平板移至光下。2-4周后，组织被转移至不含激素的MS培养基上。将出现的芽放在含有无激素的MS培养基或含有0.5mg/lNAAMS培养基的容器内。当有足够的根和芽时，将幼小植物转入土壤中放在人工气候室中。Weeks等；植物生理学102：1077-1084(1993)

用Weeks等，植物生理学102：1077-1084(1993)的方法转化小麦的方法简述如下：小麦植物(小麦)生长，从温室生长的植物(开花后10-18天，取决于在一年中的时期)中切下长为0.5-1mm的未成熟胚胎，盾片边暴露放在含1.5mg/L 2，4-D的愈伤组织维持培养基上。5天后在胚胎的边缘可见繁殖的愈伤组织。在这个阶段，用包被了7mgpJS20293和7mgpUBIAc的金微粒轰击胚胎。微粒轰击

轰击前，用Daines，Biolistic Systems Newsletter l；1-4(1990)的方法以pJS20293和pUBIAc DNA包被1mm金颗粒。金颗粒的贮存悬浮液(Bio-Rad)以60mg/μl悬浮于无水乙醇中。将35μl悬浮液等分到1.5μl微量离心管中，用无菌蒸馏水洗涤，然后将它重悬在含25mg超螺旋质粒DNA的25μl Tris-EDTA中。依次加入下列溶液：220μl无菌水，250μl2.5M CaCl₂和50μl  0.1M亚精胺(自由碱)。在4℃用旋涡混匀器震荡微量离心管10分钟，16000g离心5分钟。去掉上清，用600ml乙醇洗涤沉淀。DNA包被的金颗粒被重悬于36ml乙醇。将10mlDNA金悬浮液放在大发射物的中心进行轰击(aka，carier sheet)。

将约25个胚胎放在含于经0.35％phytagel固化的愈伤组织维持培养基的15×100mm培养皿的中央。培养5天后，在真空条件下，以pJS20293包被的金粒子，用氦驱动的DuPont Biolistic运送系统和Bio-Rad提供的一次性成分轰击来自胚胎的愈伤组织。阻止平板到目标的距离是13cm，破裂盘的力量是1100psi。轰击后立即将愈伤组织转移至MS选择培养基中，培养基中含有可由本领域技术人员确定的合适量的选择剂。小麦植物再生

为了再生，胚胎发生愈伤组织被转移至含0.5mg/l麦草畏的MS培养基中，如Hunsinger和Schanz，植物育种98：119-123(1987)所述。将来自愈伤组织的芽转移至Pyrex培养试管，试管中含由半力无激素MS组成的根培养基。为了进行轰击后筛选，在每一个阶段都要采用含有本领域技术人员确定的合适量选择剂的琼脂培养基。

将小植物从根培养基转移到土壤混合物的花盆中并驯化适应于环境舱中21℃时的较低湿度。两周后将植物转移至温室。这些初级再生体称为T0植物。转基转植物分析

分别用Southern和Northern技术分析转基因组织和植物以证明过氧化物酶编码序列和RNA的存在。

用本领域熟知的方法，评估Southem分析证明包含过氧化物酶编码序列的小麦对昆虫的杀虫活性。这些昆虫有Pseudaletia unipunctata，粘虫；Spodoptera frugiperd，草地夜蛾；Elasmopalpus lignosellus，南美米苗斑螟；Agrotis orthogonia，西方灰地老虎；Oulema melanopus；黑角负泥虫；Hypera punctata；三叶草叶象；Diabrotia Undecimpunctata howardi，黄瓜十一星叶甲食根亚种；Russian Wheat aphid：Schizaphis graminum，麦二叉蚜；Macrosiphum avenae，麦长管蚜；Melanoplus femurrubrum，赤胫黑蝗；Melanoplus differentialis异黑蝗；Melanoplus sanguinipes；墨西哥黑蝗；Mayetiola destructor，小麦瘿蚊；Sitodiplosis mosellana，麦红吸浆虫；Meromyza americana，美洲杆蝇；Hylemya coarctata；麦瘦种蝇；frankliniella fusca，烟褐花蓟马；Cephus cinctus麦茎蜂或Aceria tulipae，麦瘿螨。具有杀虫活性的转基因小麦用于田间试验。实施例3含过氧化物酶编码序列的转基因高粱

用下文简述的Casas等，美国国家科学院院报90：11212-11216(1993年12月)描述的方法，用pJS20293(图1)和pUBIAc(图2)转化高粱。微发射物轰击

用Biolistics PDS 1000/He系统(Sanford等，Technique J.MethodsCell Mol Biol.3：3-16(1991)钨(M-23，直径1.7mm，DuPont no.75056)或金(直径1.5-3.0mm，Aldrich no 32，658-5)微发射物进行实验。用5-10mg质粒，按厂商(Bio-Rad)描述的方法包被在水悬液(50ml)中的金(3mg)或锰(0.75mg)粒子(事先用乙醇洗过)。

在培养基上培养非成熟合子胚；10-15个/塑料培养皿(15×60mm)24至72小时后，进行轰击。胚胎被转移至事先经液体培养基湿润而未湿透的滤纸上(直径为4.50m)。滤纸的功能是吸掉胚胎表面的水分，胚胎在轰击前在滤纸上放置2-3小时。轰击后，将未成熟胚胎从纸上立即转移到半固体培养基上。转基因植物再生和昆虫抗性评估

胚胎发生组织的选择和维持方法以及从有组织的结构中形成芽和根的方法都有描述(Cai&Butler，植物细胞，组织，器官培养20：101。101-110(1990))。合适的选择剂为本领域的技术人员熟知。

分别用Southern和Northern技术分析转基因组织和植物中过氧化物酶编码序列和RNA的存在。

按DeBlock等，EMBO J.6：2513-2518(1987)的方法分析愈伤组织和叶提取物中PAT活性。

用本领域熟知的技术评估Southern分析证明包含编码序列的高粱对昆虫的杀虫活性。这些昆虫包括Chilo partellus，高粱螟；Spodopterafrugiperda；草地夜蛾；Helicoverpa zea，棉铃虫；Elasmopalpuslignosellus；南美玉米苗斑螟；Feltia subtenanean，粒肤地虎；phjyllophaga crintia，white grub；Eleodes，Conoderus和Aeolus spp.狭体叩头虫；Oulema melanopus，黑质负泥虫；Chaetocnema pulicaria，玉米铜色跳甲；Sphenophorus maidis，玉米隐啄象；Rhopalosiphunmmaidis，玉米蚜；Anuraphis maidiradicis，玉米根蚜；Blissus leucopterusleucoptems美洲谷长蝽；Contarinia Sorghicola，高粱瘿蚊；Tetranychuscinnabarinus，红叶螨或Tetrany Ches Urticae，棉叶螨。具有杀虫活性的转基因高粱用于田间试验。实施例4含过氧化物酶编码序列的转基因水稻

用Shimamoto等，自然338：274-277(1989)(水稻)；Christou等，生物技术9：957-962(1991)(水稻)；Datta生物/技术8：736-740(1990)(水稻)和/或Hayashimoto等，植物生理学93：857-863(1990)(水稻)的方法，以pJS20293(图1)和pUBLAc(图2)转化水稻。

用Christou等，生物技术9：957-962(1991)方法转化水稻，简述如下：DNA制备

在100ml缓冲液(150mM氯化钠，10mM Tris-HCl pH8.0)中混合金颗粒(10mg)和DNA溶液(20mg)并轻轻震荡5-10秒以制备DNA包被的金颗粒。边震荡边加入亚精胺(100ml 0.1M溶液)和100ml 25％PEG溶液(MW1300-1600)，然后逐滴加入100ml氯化钙(2.5M)。混合物于室温下静置10分钟然后在微量离心机中旋转。去除上清，以10ml 100％乙醇重悬沉淀的金和DNA复合物。以每Carrier sheet 163ml的速度或计算速度0.05mg/cm²将得到的悬液包被于18×18mm Carrier Sheet上。未成熟胚胎的分离和用于轰击颗粒的制备

从扩张的锥状花序收集12-15天水稻未成熟的胚胎并用2％次氯酸钠处理5分钟灭菌。随后，以无菌去离子水反复洗涤，在解剖显微镜下去除颖叶。无菌条件下取出胚胎，将它放在水-琼脂平板上，近轴端与培养基接触。微粒轰击

将具有珠的Carrier sheet装载于颗粒加速器上，它利用了高压电容器放电通过小水滴作为推动力。在sheet和悬挂于机器之上的靶组织之间放有一个100目的支持屏。排除装置内气体至压力500mm Hg以降体气体动力学阻力。在扩张室内，从2mF电容器中通过10ml水滴可释放10-16Kv。对着支持屏吹动sheet使得金颗粒持续地向悬挂于屏上方的靶组织施加力量。将靶未成熟胚胎放在水-琼脂平板上，这样当平板插在屏的上方时，胚胎的盾片区正好在被加速颗粒的运动轨迹上。植物再生

微粒轰击后，将胚胎放在含有0.5或2mg/l 2.4-D的MS或CC培养基上，用(Hartke，S和Lara，H.，遗传和育种43：205-214(1989)；Datta，S.K.等，植物科学67：85-88(1990))描述的方法，收获胚胎发生愈伤组织和小植物。转化的胚胎发生愈伤组织和植物的收获

在选择和非选择条件下收获转化的愈伤组合和植物。在将选择引入转化/再生方法的实验中，使用本领域技术人员熟知的合适量的选择剂。这样就确定了假定的转化子，进一步进行分子和遗传分析以证实导入基因的稳定整合及其遗传性。转基因植物分析

分别用Southern和Northern技术分析转基因组织和植物中过氧化物酶编码序列和RNA的存在。

按DeBlack等，EMBO J.6：2513-2518(1987)的方法分析愈伤组织和叶提取物中PAT活性。

用本领域熟知的方法，评估Southern分析证明包含过氧化物酶编码序列的水稻用于对昆虫的杀虫活性。这些昆虫包括Diatraeasaccharalis(小蔗杆草螟)；Spodopterafrugiperda(草地夜蛾)；Helicoverpa zea(棉铃虫)；Colaspis brunnea(葡萄肖叶甲)；Lissorhoptrusoryzophilus(稻根象)；Sitophilus oryzae(米象)；Nephotettixnigropictus(二点黑尾叶蝉)；Blissus leucopterus leucoptems(美洲谷长蝽)或Acrosternum hilare(拟缘蝽)。实施例5含过氧化物酶编码序列的转基因燕麦

用Somer等生物/技术10：1589-1594(1992年12月)(燕麦)和/或Torbert等植物细胞报道14：635-640(1995)(燕麦)中的方法，以pJS20293(图1)和pUBIAc(图2)转化燕麦。细胞培养

来自GAF-30/park的燕麦系未成熟胚胎用以制备愈伤组织(Rines，H.W. &Luke，H.H.Thear.Appl.Genet.71：16-21(1985))。易碎的胚胎发生愈生组织可用肉眼选择(Bregitzer，P.等，作物科学29：798-803(1989))并且每两周传代至0.2％脱乙酰吉兰糖胶固化的MSZD培养基上(Murashige，T. &Skoog，F.Physiol，plant 15：473-497(1962))，此培养基含MS盐，150mg/l天冬氨酸，0.5mg/l盐酸硫铵素，20g/l蔗糖和2.0mg/l 2，4-D，pH5.8。将约1g亮碎的胚胎发生愈合组织置于35ml液体MSZD培养基中以开始悬浮培养。悬浮培养用以选择黄色胞浆致密的细胞小集结物的出现，每周传代一次。DNA包被粒子的制备

用与Gordon-Kamm等，植物细胞2：603-618(1990)描述的方法相似的方法以pJS20293(图1)和pUBIAc(图2)DNA包被钨颗粒。在1.5ml Eppendorf管中将预先洗过的钨颗粒(1.25mg)重悬于250ml灭菌水中。将25ml 1mg/ml的每种DNA，250ml 2.5M CaCl₂和50ml 0.1M亚精胺(自由碱)依次加到这个Eppendorf管中。用Voriex Genie2(Scientific Industries，Inc)以最高速度震荡混合物1分钟，在冰上放置5-10分钟，在5415 Eppendorf离心机以14,000rpm离心1分钟。离心后，吸出550ml上清弃掉。反复吹打几次以重悬DNA包被的钨颗粒，1ml DNA包被颗粒悬液被加在颗粒运送系统的macrocarrier上。DNA运送

轰击前，以缺乏天冬氨酸的MSZD培养基洗涤悬浮培养细胞3次。传代培养后3-5天，通过真空抽滤将悬浮培养细胞收集到直径为4.7cm的Millipore AP10，MF支持垫(Millipore Corp.)使约0.5mg解重的组织培养细胞形成均匀伸展的薄层。将垫支持的细胞转移至60×20mm培养皿上。为了对愈伤组织进行轰击，将2周龄的易碎的胚胎发生愈伤组织(0.5mg)均匀分布到60×10mm培养皿中的预先用无天冬氨酸的MSZD培养基浸湿的Millipore支持垫上。将含有悬液或愈伤组织样品的培养皿(Gordonkam等，植物细胞2：603-618(1990)放在离阻止板5cm的位置上并以Biolistic PDS-100(枪粉)颗粒运送系统(DuPont.Co)轰击。转化子的筛选

轰击后，用缺乏天冬氨酸的MSZD液体培养基将每块Millipore支持垫上的细胞洗到60×20mm的培养皿中，然后以石蜡膜封这个平皿于21-23℃避光孵育。在液体培养基中孵育5天后，将经轰击的细胞以薄层铺在直径为7.0cm的Whatman 1号滤纸上，滤纸覆盖在脱乙酰吉兰糖胶固化的缺乏天冬氨酸、含3mg/l膦丝菌素(PPT)(CrescrentChemical Co.Inc.)的MSZD选择培养基上。根据细胞密度，一次轰击的细胞通常分布在两个或多个滤膜上。每隔2-3周将带有细胞的滤纸转移至新鲜的选择培养基上。轰击后7-8周开始出现PPT抗性的克隆，此后，每隔2-3周将克隆直接传代到没有滤纸的新鲜选择培养基上。植物再生

将PPT-抗性的组织培养物接种于含3mg/l PPT的N+B燕麦植物再生培养基(Bregitzer P等，作物科学29：798-803(1989))(MS盐(Murashige，T&Skoog，F.physiol plant 15：473-497(1962))，2mg/l萘乙酸，0.2mg/L benzylaminopurine)。2-6周后，将芽从愈伤组织上取下转移至无激素但含3mg/L PPT的利于根形成的MS培养基中。有根植物被转至花盆土壤混合物中，在生长舱中长至成熟。转基因植物分析

分别用Southern和Northern杂交分析转基因组织和植物中过氧化物酶编码序列和RNA的存在。

按DeBlock等，EMBOJ.6：2513-2518(1987)的方法分析愈伤组织和叶提取物中PAT活性。

用本领域熟知的方法，评估被Southem分析证明包含过氧化物酶编码序列的燕麦的杀虫活性。实施例6含过氧化物酶编码序列的转基因大麦

用Wan等，plant physiol.104：37-48(1994)和/或Jahne等TheorAppl.Genet 89：525-533(1994)的方法以pJS20293(图1)和pUBIAc转化大麦。

用Wan等，plant physiol 104：37-48(1994)的转化大麦的方法简要叙述如下：植物材料

大麦(Hordeum vulgare L.)春季栽培品种Golden Promise生长于生长舱中条件为12℃，16小时光照/8小时避光80％湿度(Hunter，C.P.来自大麦Hordeum vulgare小孢子的植物再生，博士论文，Wye College，伦敦大学，Ashford，Kent(1988))。在头部高度光的水平约为350至400mE。在同样条件下，冬季栽培品种Igri的种子在生物舱的土壤中发芽。当高度约10cm时，幼苗在4℃10小时光照(10-15mE)/14小时避光春化8周(Hunter，C.P.来自大麦，大麦小孢子的植物再生，博士论文，Wye College，伦敦大学，Ashford，Kent(1988))。春化后，它们与Golden Promise植物相同方案下生长。裁种时，给所有的植物施用Osmocote(Sierra，17-6-12加微量元素)然后用两周施用一次0.02％Verdi(Peter′s 20-20-20)。未成熟胚胎和来自未成熟胚胎的愈伤组织

具有未成熟胚胎的栽培品种Golden.Promise的穗状花序大小为1.5-2.5mm。在20％(V/V)漂白剂(5.25％次氯酸钠)中作用5分钟进行表面灭菌，简单冲洗3次，用无菌水洗5分钟。从幼小颖果下切下未成熟胚胎，或进一步进行纵向切割，一分之二。为了诱导愈伤组织用于轰击，胚胎(完整的或两半的)按盾片向下接触愈伤组织诱导培养基的方式被放置，此培养基为Murashige和Skoog培养基(Murashige T&Skoog，F.，physiol plant 15：473-497(1962))，添加有30g/L麦芽糖，1.0mg/L盐酸硫胺素，0.25g/L肌醇，1.0g/L酪蛋白水解酶，0.69g/L脯氨酸和2.5mg/L麦草畏，3.5g/L脱乙酸吉兰糖胶(Scott Carson，CA)或phytagel(Sigma)固化。25℃避光孵育胚胎，2周后选择胚胎发生愈伤组织进行轰击。花药培养和来自小孢子的胚胎(MDES)

当小孢子处于单核中期至双核早期过渡时，人CV Igri植物中收获包裹在flag叶中的穗状花序并用70％乙醇进行简单的表面灭菌。从小稳中分离花药，在每个培养皿(35×10mm)中接种60个花药，培养皿中有3mL 0.3M甘露醇。用石蜡膜封平皿并在25℃避光孵育3或4天。随后花药被转移至含3ml Hunter′s液体FHG培养基的培养皿中(具有低NH₄NO₃高Gln的改良Murashige和Skoog培养基，Kasha，K等，“单倍体在谷物改良中：花药和小孢子培养”J.P.Gustafson编辑，基因操作在植物改良中II，Plenum Press，NY(1990)，第213-235页)，培养基中没有Ficoll-400，补充有1mg/L IAA和0.2mg/L细胞分裂素(被称为FHG+)在所述条件孵育。大约2或3周后可见MDEs，4周后MDEs可用于轰击。轰击平板的制备和微发射物轰击

轰击前一天，来自栽培品种Golden Promise幼小颖果的IEs被纵向切成两半以三种不同方向放置在(盾片侧向上，盾片侧向下或切面向上)含有愈伤组织诱导培养基的培养皿(100×15mm)中心。为了对愈伤组织轰击，约0.5g来自培养IE的胚胎发生愈伤组织被切成小片(约2mm)放置在含有愈伤组织诱导培养基的培养皿(100×15mm)中心。用巴斯德吸管从花药培养平板上收获MDES并将其均匀分布在培养皿(100×15mm)中的由两张7cm滤膜支持的一张5cm 3号Whatman滤纸上。轰击前，移掉滤膜上多余的培养基。

用前述方法(Daines，R.J. Biolistic Particle Delivory SystemsNensletter 1：1，4(1990))使质粒吸附到金颗粒上(1.0mm，Dupont，Wilmingto，DE)。若使用两种质粒，则将两种质粒的等量(mg)DNA混合。用DuPont PDS 1000 He Biolistic运送系统将所有的靶材料轰击一次。靶材料被放置在微发射物阻止平板上约13cm处；采用1100p.s.i破裂盘。筛选转化子IEs和愈伤组织

轰击后一天，将半胚和愈伤组织片单独地转移至含5mg/Lbialaphos的诱导培养基上；不管半胚在轰击过程中方向如何，半胚盾片侧向下培养。组织在第一块筛选平板上保留约10-14天。转移到第二块筛选平板(5mg/L bialaphos)时，用镊子将单个愈伤组织胚或愈伤组织片破碎成几个小片，单独保持。在随后的两至三次筛选传代(每次约10-20天，5mg/L biolaphos)时，将表现生长旺盛迹象的愈伤组织片早一些转移到新的筛选平板上，组织处理方式相同。将最初从片胚胎或愈伤组织发育而来的所有愈伤组织组织定义为系。将Bialaphosk抗性的愈伤组织系通过在含5mg/L bialaphos的愈伤组织诱导培养基上每月一次传代培养。MDE

轰击后，将几滴FHG+培养基加到MDE上。两天或三天后，将＞1.5mm的胚胎被单独转移至含3或5mg/L bialaphos的愈伤组织诱导培养基上。较小的胚胎继续留在滤膜上，当它们约1.5mm时，再转移至选择培养基上。用反复加入和移掉液体FHG⁺培养基的方法每两天或三天洗涤滤膜。MDEs在首次选择培养基上保留10-20天。表现出愈伤组织形成迹象的MDEs被转移至含5mg/L bialaphos的新鲜培养基上。在转移过程中，每一块形成愈伤组织的MDE的分裂成小片。用前一部分所述的方法进行进一步筛选。植物再生和除虫剂应用

通过将胚胎产生愈伤组织转移至含1mg/L bialaphos FHG培养基上，在23℃或25℃时荧光(45-55mE，16小时/天)照射从PAT阳性的愈伤组织再生植物。在约2周后，可观察到小植物。约2cm的绿色小植物被转移至含具1mg/L bialophos的小植物生长培养基(无激素的愈伤组织诱导培养基)的Magenta盒中。当它们长至盒高时，小植物被转移至含Supersoil的6英寸的花盆中，放在温室中(16小时光照期，15°-18℃)。再生体生长成熟并自体受粉。通过喷洒0.5％(V/V)Basta(200g/L PPT，Hoechst AG，Frankfurt，德国)+0.1％吐温20以检测某些植物对Basta的反应。也在无bialaphos的培养基上从野生型愈伤组织再生出了植物。转基因植物分析

分别用Southern和Northern杂交分析转基因组织和植物中过氧化物酶编码序列和RNA的存在。

用本领域熟知的方法，评估Southern分析证明包含过氧化物酶编码序列的大麦其对昆虫的杀虫活性，这些昆虫包括：Ostrinianubilalis，玉米螟；Agrotis ipsilon，小地老虎；Schizaphis graminum，麦二叉蚜；Bliss leucoptems leucoptems，美洲谷长蝽；Euschistusservors，烟草蝽；Hylemya platura，玉米种蝇；Mayetiola destructor，小麦瘿蚊；Thysanoptera；缨翅目或Petrobia latens，潜岩螨。

上文提到的所有发表物在此作为整体引用作为参考。

尽管上述发明已得到细致描述，但目的是为了清晰和理解，本领域任何技术人员阅读此公开应当理解，可以做多种形式和细节改变，但不会脱离本发明和附加权利要求书的真实范围。

Claims (29)

1.一种控制昆虫的方法，包括使昆虫摄入或接触杀虫剂量的转基因单子叶植物细胞，其中所述的植物包含含有编码过氧化物酶的编码序列的重组DNA。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述的方法包括用含有编码过氧化物酶的编码序列的DNA序列转化单子叶植物。

3.权利要求1的方法，其中所述的DNA序列包含与所述编码序列可调控连接的启动子。

4.权利要求3的方法，其中所述的DNA序列包括含有与所述编码序列可调控连接的启动子的嵌合基因。

5.权利要求1的方法，其中所述的过氧化物酶是阴离子过氧化物酶。

6.权利要求1的方法，其中所述的细胞包括可育的转基因植物的部分。

7.权利要求6的方法，其中所述的植物选自由小麦、小稻、燕麦、大麦、高粱和玉米组成的群体。

8.权利要求7的方法，其中所述的植物是玉米植物。

9.权利要求8的方法，其中所述的玉米植物来自由CG00526，CG00615和CG00714组成的玉米株系。

10.权利要求1的方法，其中所述植物用选自微粒轰击，电穿孔和聚乙二醇处理的技术转化。

11.权利要求1的方法，其中所述的DNA序列进一步包含可选择或可筛选的标记基因。

12.权利要求11的方法，其中所述的标记基因编码的酶选自：新霉素磷酸转移酶、潮霉素磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶、膦丝菌素乙酰转移酶、2，2′-二氯丙酸脱卤素酶、乙酰羟酸合成酶、5′-烯醇丙酮酰-莽草酸-磷酸合成酶、卤芳腈水解酶、乙酰辅酶A羧化酶、二氢蝶酸盐合成酶、氯霉素乙酰转移酶和β-葡糖醛酸酶。

13.权利要求1的方法，其中所述的昆虫属于鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目等翅目、虱目、蚤目和毛翅目。

14.权利要求13的方法，其中所述的昆虫选自欧洲玉米螟、茎玉米螟、小地老虎、棉铃虫、草地夜蛾、西南玉米杆草螟、南美玉米苗斑螟、小蔗杆草螟、玉米根叶甲、长角叶甲、黄瓜十一星叶甲食根亚种、狭体叩头虫、北方圆头犀金甲、南方圆斗犀金甲、日本弧丽蛂、玉米铜色兆甲、玉米长喙象、玉米蚜、玉米根蚜、美洲谷长蝽、赤胫黑蝗、墨西哥黑蝗、灰地种蝇、玉米斑潜蝇、针缺翅蓟马、窃蚁和棉叶螨。

15.一种可育的包含含有编码过氧化物酶的编码序列的重组DNA的转基因单子叶植物，其中过氧化物酶的表达赋予所述单子叶植物表型特征。

16.权利要求15的植物，其中所述的表型特征选自由昆虫抗性和耐受性组成的群体。

17.权利要求16的植物，其中所述的表型特征是昆虫抗性。

18.权利要求15的植物，其中所述的过氧化物酶编码序列是阴离子过氧化物酶基因。

19.权利要求15的植物，其中所述的植物选自由小麦、水稻、燕麦、大麦、高粱和玉米组成的群体。

20.权利要求19的植物，其中所述的植物是玉米植物。

21.权利要求20的植物，其中所述的玉米植物来自由CG00526，CG00615和CG00714组成的玉米株系。

22.权利要求15的植物，其中所述的DNA序列进一步包含可选择或可筛选的标记基因。

23.权利要求22的植物，其中所述的标记基因编码的酶选自：新霉素磷酸转移酶、潮霉素磷酸转移酶、二氢叶酸还原酶、膦丝菌素乙酰转移酶、2，2′-二氯丙酸脱卤素酶、乙酰羟酸合成酶、5′-烯醇丙酮酰-莽草酰-磷酸合成酶、卤芳腈水解酶、乙酰辅酶A羧化酶、二氢蝶酸盐合成酶、氯霉素乙酰转移酶和β-葡糖醛酸酶。

24.来自根据权利要求15所述的植物的转基因植物细胞、组织或种子。

25.根据权利要求15所述的植物的转基因后代。

26.来自根据权利要求25所述的后代的转基因细胞、组织或种子。

27.编码过氧化物酶的重组DNA赋予单子叶植物细胞昆虫抗性的用途。

28.包含编码过氧化物酶的重组DNA的植物控制由昆虫攻击引起的植物损伤的用途。

29.一种农业方法，其中利用了包含含有编码过氧化物酶的编码序列的转基因植物材料或植物，其中过氧化物酶的表达赋予该单子叶植物表型特征。

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