KR20010104330A - 표적 유전자의 발현 조절을 위한 조제물의 사용 - Google Patents

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KR20010104330A
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데이빗 커크햄 로담
필립 테일러
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돈 리사 로얄
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Abstract

성분: (a) 휘발성 화학 유도체; (b) 폴리에톡시화된 C10-C20 알콜 또는 트리실록산 폴리에톡실레이트 및 (c) 희석제; 를 포함하는 조제물의 이용으로써 상기 (a)의 식물에의 적용에 의하여 유도되는 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 화학-유도성 식물 유전자 발현 카세트를 갖는 식물에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법.

Description

표적 유전자의 발현 조절을 위한 조제물의 사용{USE OF A FORMULATION FOR CONTROLLING EXPRESSION OF A TARGET GENE}
유전자의 발현은 단백질 인코딩 부분의 5' 상부의 부분, 일반적으로 프로모터로 불리는 부분에 의하여 조절된다. 프로모터는 항상성, 세포-특이성, 발생-프로그램성 또는 유도성일 수 있다.
농업 식물의 특성을 향상시키기 위한 조작은 식물 세포에서 외부 또는 내성 유전자의 발현을 필요로 한다. 이러한 유전적 조작은 따라서 필요한 유전자 발현 조절을 위한 수단의 이용가능성에 의존한다: 예를 들어, 식물에서 효과적인 알맞은 프로모터의 사용 및 이용 가능성에 의존한다. 다양한 종류의 프로모터의 선택을 갖는 것은 특정 유전자, 구조체(construct), 세포, 조직, 식물 또는 환경에 가장 적합한 프로모터를 선택할 수 있어 유리하다. 식물에서 작동 가능한 일련의 프로모터들이 알려져 있다.
"유도성 프로모터"는 화학적으로 유도가능한 프로모터를 포함한다. 특히 유용한 프로모터는 외부 화학 자극의 작용에 의하여 조절되는 프로모터 서열이다. 외부 화학 자극은 농업적으로 수용가능한 화학물일 수 있으며, 이러한 화학물의 사용은 농업적 실행이 가능하고 식물이나 포유동물에 해가 되지 않아야 할 것이다. 이는 식물 성장 또는 발생의 특정 단계에서, 예를 들어 적용 또는 알려진 씨앗 코팅 기술을 이용하는 것과 같은 식물이나 씨앗에 적용이능한 화학물의 존재 또는 부존재에 의하여 유전자 발현의 조절을 가능하게 한다. 이러한 것들은 역시 유전자 "스위치" 프로모터로 알려져 있다.
유도성 프로모터의 조절하의 유전자는 원하는 특성 또는 표현형 자체의 유전자, 또는 표적 유전자의 발형을 억제하는 억제 단백질의 발현의 조절을 하는 유도성 프로모터일 수 있으며, 예를 들어 표적 유전자 상부의 오퍼레이터 서열과 작용하여 유전자의 발현을 막는 것 일 수 있다(예를 들어 박테리아의tet및lac오퍼레이터/리프레서 시스템). 더 나아가 택일적으로, 유도성 프로모터의 조절하의 유전자는 다른 단백질과 작용하여 그 활성을 저해하는 단백질을 발현할 수 있으며, 예를 들면 바스타의 부존재시 세포를 저해하거나 죽이는 바나제의 바나제/바스타(barnase/barstar) 시스템이다.
이러한 종류의 유전자 스위치는 다양한 응용분야에서 알려져 있다. 이는 예를 들어 WO 90/08830에 기술된 것과 같은 하이브리드 식물 제조에서 매우 바람직한 가역적 불임 숫컷의 제조를 포함한다. 이러한 프로모터의 다른 응용분야는 병원균형성 방지, 특정 농작물 식물의 오염, 특히 형질전환된 식물에서의 병균세포질로부터의 보호, 및 자생 식물의 조절필요 및 WO 94/03619에 기술된 것과 같은 수확기-전 발아 방지도 포함한다.
많은 생물체들은 알콜 탈수소효소제조와 같은 알콜 또는 케톤과 같은 화학물을 대사할 수 있는 기작을 가진다. 이러한 시스템의 프로모터는 표적 알콜 또는 케톤의 존재에 의하여 유도되는 프로모터로서 유전자 스위치에 유용할 수 있다.
이러한 예는 다양한 알콜 및 케톤의 존재하에서 성장할 때 유전자alcA에 의해 코딩되는 알콜 탈수소효소I(ADH 1)을 발현하는 균류 생물체아스퍼질러스 니두란스(A nidulans)에서 발견된다. 유도는 항상적으로 발현되는alc R유전자에 의하여 발현되는 조절(regulator) 단백질을 통하여 이뤄진다. 유도체(알콜 또는 케톤)의 존재하에서 조절 단백질은alc A유전자의 발현을 활성화한다. 역시 유도체의 존재시 조절 단백질은 그 자체의 발현도 증가시킨다. 이는 유도 조건(즉 알콜 또는 케톤의 존재시)하에서 ADH 1의 높은 발현 수준을 의미한다. 역으로,alc A유전자 및 그 단백질 ADH 1은 유도체의 부존재시에는 발현되지 않는다.alc A및 효소의 발현은 역시 포도당 존재시에는 억제된다.
따라서,alc A유전자 프로모터는 유도체의 존재시alc R조절 단백질에 의하여 (즉 단백질/알콜 또는 단백질/케톤 조합에 의하여) 활성화되는 유도성 프로모터이다. (각각의 프로모터를 포함하는)alc R및alc A유전자는 동종분리되어 서열이 결정되어 있다(Lockington RA et al, Gene, 33:137-149; Felenbol B et al, 1988, Gene, 73: 385-396; Gwynne et al, 1987, Gene, 51:205-216).
알콜 탈수소효소(adh) 유전자는 특정 식물 종들에서 연구되고 있다. 옥수수 및 다른 곡류에서 이 유전자는 혐기성 조건에 의하여 스위치된다. 옥수수의adh유전자의 프로모터 부분은 혐기성 조건에서의 발현을 위한 300bp의 조절 요소를 포함한다. 그러나,alc R조절 단백질에 상응하는 유전자는 어떠한 식물에서도 발견되지 않았다. 따라서alcR/alcA타잎의 유전자 조절 시스템은 식물에서 알려져 있지 않다. 식물 세포에서alc R의 항상성 발현은 내성adh활성을 활성화하지 못 한다.
WO 93/21334는 유전자 스위치로서 이러한 시스템을 포함하는 형질전환 식물의 제조에 대하여 기술하고 있다. 이 문서는 특히 조절 단백질을 인코딩하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 일차 프로모터, 및 유도체의 적용이 표적 유전자의 발현을 일으키는 효과적인 외부 유도체의 존재하에 조절 단백질에 의하여 활성화되는, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 화학적으로 유도가능한 식물 유전자 발현 카세트에 대하여 기술하고 있다. 특히,alc R/alc A시스템이 구조체에 사용된다. 이 경우 적용되는 외부의 화학 유도체는 Creaser et al., J. Biochem. (1984) 225, 449-454)에 기술된 부탄-2온(에틸 메틸 케톤), 씨클로헥사논, 아세톤, 부탄-2올, 3-옥소부틸산, 프로판-2-올 및 에탄올과 같은 화학물을 포함한다.
농업적 용도에서는 상대적으로 저렴하고 분해성인 단순 알콜의 적용이 바람직할 수 있다. 따라서 환경에 부담을 적게 줄 수 있다. 그러나, 이러한 화학물들은 종종 매우 휘발성이고 적용동안 많은 양의 화학물이 손실되어 농업적 환경에서 다루기가 어려울 수 있다. 알려진 유도체의 사용과 관련된 문제중의 하나는 식물에 의하여 효과적으로 흡수되기 이전에 급속히 증발할 수 있다는 점이다.
따라서 식물에 의하여 알려진 유도체보다 보다 효과적으로 흡수되어 표적 유전자의 발현 보다 나은 조절을 가능케 하는 화학 유도체의 사용이 필요하다.
본 발명은 식물과 같은 생물체에서 표적 유전자의 발현 조절 기작으로 사용되는 조제물뿐만 아니라 이러한 방식으로 유용한 어떤 조제물에 관한 것이다.
도1은 에탄올 단독(2% 중량/중량), 및 에탄올(2% 중량/중량)과 BRIJ 92, 97 및 98TM(0.5% 중량/중량) 조합의 조제물(5반복/처리)를 이용한 잎에의 적용에 의한 CAT 유도를 보여준다.
도2는 온실 잎 적용 시험에서 증가하는 농도의(0.2% 및 0.5% 중량/중량) SILWETT L-77TM아쥬반트와 0.2% 중량/중량 에탄올, 및 에탄올(2% 중량/중량)단독의 CAT 활성 관계를 보여준다.
도3은 5% 중량/중량 에탄올, 및 0.5% 중량/중량 조제물의 오일씨드 평지 윗면 잎에의 적용에 의한 Alc-GUS 유도를 보여준다('T'= 표적 잎, 'A'=동일 식물의 인접한 잎).
도4는 SilwettTM의 구조를 보여준다.
하기 표는 실시예에 기술된 각각의 계면활성제/아쥬반트의 상세한 사항을 보여준다.
계면활성제/아쥬반트 성분 제조업체
BRIJ 92TM 폴리옥시에틸렌-(2)-올레일 알콜 ICI Surfactants
BRIJ 97TM 폴리옥시에틸렌-(10)-올레일 알콜 ICI Surfactants
BRIJ 98TM 폴리옥시에틸렌-(20)-올레일 알콜 ICI Surfactants
SILWETT L-77TM 메틸 말단-캡 트릴실옥산 폴리에톡시레이트(8)-84% 알릴폴리에틸렌글리콜 메틸 에테르-16%(구조는 도4에 있음) Witco
본 발명은 화학 유도체의 제제화에 의하여 종래 기술과 관련된 문제를 극복하기 위한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면에 따르면 다음:
(a) 휘발성 화학 유도체;
(b) 폴리에톡시레이티드(polyethoxylated) C10-C20알콜 또는 트리실록산 폴리에톡실레이트(trisiloxane polyethoxylate) 및
(c)희석제;
을 포함하는 (a)의 생물체에의 적용에 의하여 유도되는, 표적 유전자에 작동 가능하도록 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 화학 유도성 유전자 발현 카세트를 갖는 생물체의 표적 유전자의 발현 조절을 위한 다음의 성분을 포함하는 조제물의 사용을 제공한다.
알맞은 생물체는 농작 식물과 같은 식물이다.
희석제(c)는 예를 들어 물이다.
본 발명의 두 번째 측면에 따르면, 상기의 조제물의 생물체의 적용에 의하여 유도되는, 타겟 유전자에 작동가능하도록 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 화학 유도성 식물 유전자 발현 카세트로써 생물체를 형질전환시키는 것을 포함하는 식물과 같은 생물체에서 표적 유전자의 발현 조절 방법을 제공한다.
알맞은 발현 시스템은 조절 단백질을 이용한다.
따라서 본 발명의 세 번째 측면에 따르면, 조절 단백질을 인코딩하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 일차 프로모터, 상기 정의된 조제물의 존재하에서 조절 단백질에 의하여 활성화되는, 표적 유전자에 작동가능하도록 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 화학-유도성 식물 유전자 발현 카세트로 식물을 형질전환시키는 것을 포함하는 식물에서 표적 유전자 발현을 조절하는 방법에 있어서, 상기 정의된 조제물을 식물에 적용하는 것을 포함하고, 이에 의해 표적 유전자의 발현을 유도하는 방법을 제공한다.
상기 조제물의 성분(a)의 성질은 발현 시스템에 존재하는 유도성 프로모터의 특성에 따른다. 그러나, 성분(a)의 특정예로서 C1-C6알콜 또는 C3-C9케톤, 및 바람직하게 에탄올 또는 프로판-2-올이 있다. 이러한 성분들은 예를 들어 하기 상세하게 기술되는 alc 스위치 시스템의 유도체로서 작용한다.
상기 조제물의 성분(b)는 바람직하게 폴리에톡시레이티드 올레일, 라우릴, 스테아릴 또는 세틸 알콜이다. 더 바람직하게 0 내지 35, 더욱 바람직하게 2 내지 20범위의 평균 몰 에틸렌 옥시드 함량을 갖는 폴리에틸렌-올레일 알콜이다. 가장 바람직히게는 폴리옥시에틸렌-(2)-올레일 알콜, 폴리옥시에틸렌-(10)-올레일 알콜 또는 폴리에틸렌-(20)-올레일 알콜이다. 성분(b)는 바람직하게 폴리옥시에틸렌-(20)-올레일 알콜(괄호의 숫자는 분자당 에틸렌 옥시드의 평균 함량을 나타낸다). 이러한 것들은 BRIJ 92TM, BRIJ 97TM및 BRIJ 98TM으로서 시중에서 구입가능하다.
바람직하게 조제물의 성분(b)의 농도는 약 0.5% 중량/중량 또는 그 이하이다. 바람직하게 0.2% 중량/중량 및 0.5% 중량/중량 사이이다.
택일적인 구체예에서 본 발명의 방법에 사용되는 조제물의 성분(b)로서 수소 또는 메틸 말단-캡(end-capped) 트리실록산 폴리에톡실레이트를 포함한다. 특히, 성분(b)는 메틸 말단-캡 트리실록산 폴리에톡실레이트이다. 메틸 말단-캡 트리실록산 폴리에톡실레이트는 바람직하게 분자당 4 내지 12의 평균 몰 에틸렌 옥시드 함량을 갖고, 가장 바람직하게는 분자당 8이다. 이러한 것들은 SILWETT 77TM(SILWETT는 Witco사의 상표이다)로서 시중에서 구입가능하다.
바람직하게, 메틸 말단-캡의 트리실록산 폴리에톡실레이트는 약 0.5% 중량/중량 또는 그 이하의 농도이다. 바람직하게는 0.2% 내지 0.5% 중량/중량 사이의 농도이다.
상기 방법에 사용되는 조제물의 성분(a)는 바람직하게 5% 중량/중량 또는 그 이하의 농도이다. 바람직하게는 2% 내지 5% 중량/중량의 농도사이다.
본 발명의 세 번째 측면에 따른 바람직한 구체예에 따른 유도성 프로모터는alcA유도성 프로모터 서열 및alcR조절 단백질을 인코딩하는 조절 서열이다.
조제물의 성분(c)는 바람직하게 약 90% 내지 98% 중량/중량 사이의 농도이다.
상기 방법에 알맞게 사용되는 어떤한 조제물은 신규한 것이고 본 발명의 추가 측면을 제공한다.
따라서 본 발명의 네 번째 측면에 따르면 다음의 성분을 포함하는 농업용 조제물을 제공한다.
(a) 유도성 프로모터의 휘발성 화학 유도체
(b) 트리실록산 폴리에톡실레이트; 및
(c) 희석제
상기와 같이, 성분(b)는 알맞도록 수소 또는 메틸 말단-캡 트리실록산 폴리에톡실레이트이고 바람직하게는 메틸 말단-캡 트리실록산 폴리에톡실레이트이다. 알맞게, 메틸 말단-캡 트리실록산 폴리에톡실레이트는 메틸 말단-캡 트리실록산 폴리에톡실레이트는 바람직하게 분자당 4 내지 12의 평균 몰 에틸렌 옥시드 함량을 갖고 가장 바람직하게는 분자당 8이다. 알맞게 성분(a)는 2% 내지 5% 중량/중량 사이의 농도이다.
본 발명의 다섯 번째 측면에 따르면, 다음을 포함하는 농업용 조제물을 제공하낟.
(a) 5% 중량/중량 이하 양의 유도성 프로모터의 C1-C6알콜 유도체;
(b) 폴리에톡시레이티드 C10-C20알콜; 및
(c) 물.
이 경우, 조제물의 성분(b)는 알맞도록 폴리에톡시화된 올레일, 라우릴, 스테아릴, 또는 세틸 알콜이고, 바람직하게 폴리에틸렌-올레일 알콜이다. 알맞게, 폴리에틸렌-올레일 알콜은 폴리옥시에틸렌-(2)-올레일 알콜, 폴리옥시에틸렌-(10)-올레일 알콜 또는 폴리옥시에틸렌-(20)-올레일 알콜과 같은 평균 2 내지 20 범위 몰의 에틸렌 옥시드 함량을 갖는 것이다. 다시 성분(a)는 바람직하게 에탄올 또는 프로판-2올이며, 알맞게 2% 내지 5% 중량/중량 사이의 농도이다. 성분(b)의 농도는 바람직하게 약 0.5% 중량/중량 또는 그 이하이다.
본 발명의 여섯 번째 측면에 따르면, 다음을 포함하는 농업용 조제물을 제공한다.
(a) 유도성 프로모터의 화학 유도체로 작용할 수 있는 C3-C9케톤;
(b) 폴리에톡시화된 C10-C20알콜; 및
(c) 희석제.
바람직하게 이러한 조제물에서 성분(a)는 2% 내지 5% 중량/중량 사이의 농도이다. 앞선 바와 같이, 성분(b)는 2 내지 20 범위 평균 몰 에틸렌 옥시드 함량을 갖는 폴리옥시에톡실레이티드 올레일, 라우릴, 스테아릴, 또는 세틸 알콜이고, 바람직하게 폴리옥시에틸렌-올레일 알콜이다. 성분(b)의 특정 예로 폴리옥시에틸렌-(2)-올레일 알콜, 폴리옥시에틸렌-(10)-올레일 알콜 및 폴리옥시에틸렌-(20)-올레일 알콜이 있다.
본 발명에 따른 바람직한 구체예는 다음을 포함하는 조제물이다: a.에탄올 b.폴리옥시에틸렌-(20)-올레일 알콜 c.희석제이고, 성분a는 2% 중량/중량의 농도이고, 성분b는 0.5% 중량/중량의 농도이다.
본 발명에 더욱 더 바람직한 구체예는 다음을 포함하는 조제물이다: a.에탄올 b.평균 8 몰 에틸렌 옥시드 함량을 갖는 메틸 말단-캡 트리실옥산 폴리에톡실레이트 c.희석제이고, 성분a는 2% 중량/중량의 농도이고, 성분b는 0.5% 중량/중량의 농도이다.
본 발명에 따른 이점은 알려진 유도체 단독으로 사용될 때보다 식물과 같은 생물체에서 보다 효과적으로 흡수 된다는 것이다. 따라서 본 발명에 따른 조제물은alcA/alcR프로모터의 유도체로서 에탄올의 효율성을 증대시킨다.
폴리옥시에틸렌-올레일 알콜 계면 활성제 및/또는 메틸 말단-캡 트리실옥산 폴리에톡실레이트 아쥬반트(adjuvant)가alcA/alcR프로모터의 알려진 화학 유도체와의 조합으로 식물의 조제물 흡수를 상당히 증가시키고, 이에 따른 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 표적 유전자의 강력한 조절을 가능하게 한다는 것은 놀라운 일이다.
항균 화합물, 분산제, 습식 화합물 및 항-휘발제와 같은 다른 첨가제들이 첨가될 수 있다.
본 발명은 특히 다음을 포함하는 식물 유전자 발현 시스템의 실시에 적합하다
(i) 조절 단백질을 인코딩하는 조절 서열에 작동가능하도록 연결된 일차 프로모터; 및
(ⅱ) 유도체의 적용이 표적 유전자의 발현을 유도하는 상기와 같이 정의된 효과적인 외부 유도체의 존재하에서 조절 단백질에 의하여 활성화되는, 표적 유전자에 작동가능하도록 연결된 유도성 프로모터.
이러한 유전자 발현 시스템은 식물 조직뿐만 아니라 식물 세포 또는 상기 정의된 식물 세포를 포함하는 식물 및 식물, 또는 씨앗, 이들로부터 유래한 것에 함유될 수 있다.
"휘발성 화학 유도체"는 유도성 프로모터 시스템을 유도할 수 있는, 식물에 의하여 효과적으로 흡수되기 전에 급격히 휘발할 수 있는 임의의 화학물이다.
"C1-C6알콜"은 메탄올, 에탄올,n-프로파놀, 이소프로파놀,n-부탄올, 이소-부탄올, 이차-부탄올, 삼차-부탄올,n-펜탄올,n-헥산올 및 씨클로헥산올 및 이들의 불포화 유사체를 포함한다.
"C3-C9케톤"은 아세톤, 부타논, 펜타논, 헥사논, 씨크로헥사논, 헵타논, 옥타논, 노나논 및 아세토페논과 같은 아로마틱 케톤을 포함한다.
본 발명과 관련된 "표적 유전자"는 관심의 임의의 유전자이다. 이는 식물의 특성을 변형시키기 위하여 식물에 도입되는 필요한 임의의 유전자를 포함할 수 있다. 표적 유전자는 식물의 내성 유전자 또는 외부 유전자일 수 있고, 단일 유전자 또는 일련의 유전자일 수 있다. 표적 유전자 서열은 적어도 기능성 단백질의 일부 또는 안티센스 서열을 인코딩할 수 있다. 따라서, 유도성 프로모터가 내성 또는 외부 유전자에 연결되어, 형질전환으로 진핵생물에 도입된 때에는 이 유전자의 발현의 외부 조절을 위한 수단을 제공한다.
"발현 카세트"는 "구조체," "하이브리드," 및 "접합체(conjugate)"와 동일한 의미이며, 유도성 프로모터에 직접적 또는 간접적으로 연결된 관심의 유전자를 포함한다. 간접적 부착의 예는 프로모터와 표적 유전자사이의 인트론 서열 중간체와같은 알맞은 스페이서의 제공이다. 본 발명과 관련된 직접적 또는 간접적 부착을 포함하는 "융합(fused)"의 경우에도 마찬가지이다. 이러한 구조체들은 관심의 세포의 형질전환에 알맞은 플라스미드 및 파지를 포함한다. 본 발명의 발현 카세트는 외부 유도체의 존재하의 조절 단백질에 의하여 활성화되는 추가의 유도성 프로모터에 작동가능하게 연결된 조절 서열과 같은 추가의 성분을 역시 포함할 수 있다.
"발현 시스템"은 알맞은 생물체, 조직, 세포 또는 배양액에서 발현될 수 있는 상기에서 정의된 시스템을 의미한다. 이와 관련하여 본 발명의 발현 시스템은 하나 또는 그 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있고, 유도성 프로모터의 사용에 의해 표적 유전자의 발현을 증가시키는 것을 돕는 추가의 성분을 포함할 수 있다.
Ti 재조합 플라스미드를 함유하는아그로박테리움 튜메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 감염법, 전기적투과법, 세포 및 원형질세포에의 미세투입법, 미세투사 충격법, 박테리아 충격법, 특히 "섬유(fiber)" "위스커(whisker)" 방법, 및 화분(pollen) 튜브 형질전환을 포함하는 표적 식물 또는 식물 세포에 알맞은 임의의 형질전환방법이 선택될 수 있다. 형질전환된 세포는 새로운 핵산 물질이 안정적으로 게놈에 도입된 경우에 알맞게 전체 식물로서 재생된다. 형질전환된 외떡잎 및 쌍떡잎 식물 모두 이러한 방식으로 얻을 수 있다. 알려진 방법의 자세한 기술은 참고문헌에 기술되어 있다.
만들어 질 수 있는 유전적으로 변형된 식물의 예는 밭 작물, 곡식, 과일 및 야채: 카놀라, 해바라기, 담배, 근대, 면, 콩, 옥수수, 밀, 보리, 쌀, 수수, 토마토, 복숭아, 사과, 배, 딸기, 바나나, 멜론, 감자, 당근, 상추, 양배추, 양파와 같은 쌍떡잎 및 외떡잎 식물을 포함한다.
본 발명의 다양한 바람직한 특성 및 구체예들은 한정되지 않는 실시예와 이에 따른 도에서 기술된다.
실시예1
성분 양
a. 에탄올 1.99g
b. BRIJ 92TM0.51g
c. 물 97.86g
97.86g의 20% 중량/중량 에탄올 용액(980.56g의 물의 20.01g 에탄올)이 0.51g Brij 92TM과 약병에서 혼합되었다. 샘플은 사용 전에 혼합되었다.
실시예2
성분 양
a. 에탄올 2.00g
b. BRIJ 97TM0.52g
c. 물 98.05g
100.05g의 20% 중량/중량 에탄올 용액(980.56g의 물의 20.01g 에탄올)이 0.52g Brij 97TM과 약병에서 혼합되었다. 샘플은 사용 전에 혼합되었다.
실시예3
성분 양
a. 에탄올 1.99g
b. BRIJ 98TM0.50g
c. 물 97.9g
99.99g의 20% 중량/중량 에탄올 용액(980.56g의 물의 20.01g 에탄올)이 0.50g Brij 97TM과 약병에서 혼합되었다. 샘플은 사용 전에 혼합되었다.
실시예4
성분 양
a. 에탄올 2.02g
b. SILWETT L-77TM0.50g
c. 물 99.27g
101.30g의 20% 중량/중량 에탄올 용액(980.56g의 물의 20.01g 에탄올)이 0.50g SILWETT L-77TM과 약병에서 혼합되었다. 샘플은 사용 전에 혼합되었다.
실시예5
8주된 Alc-CAT('Alc'는 CaMV35S:AlcR, AlcA/CaMV35S:CAT 시스템을 말한다) 담배 식물에서 상기 조제물(도1 및 2 참조)의 효과를 보기 위하여 상기 실시예 1 내지 4의 아쥬반트-(또는 게면활성제) 에탄올 혼합물을 V5 잎상 향축의 잎 표면에흐르도록 손-적용되었다. 식물은 수경의 온실 성장 조건에서 72시간 동안 놓이고, 표적 잎이 채취되고 CAT 일라이저 키트(Boehringer Mannheim)를 이용하여 CAT(클로람페니콜 아세틸 전이효소활성) 활성이 시험되었다. 에탄올만이 단독으로 적용된 식물이 대조군으로 이용되었다. 처리마다 5회 반복하여 사용되었다(에러 막대는 표준 편차를 나타낸다).
폴리옥시에틸렌-(20)-올레일 알콜(BRIJ 98TM) 계면활성제의 사용이 에탄올 단독의 사용보다 CAT 보고 유전자의 발현을 증대시킴을 알 수 있다. 분자당 평균 8 몰 에틸렌 옥시드의 메틸 말단-캡 트리실옥산 폴리에톡실레이트(SILWETT L-77TM)과 에탄올 조합의 사용이 폴리옥시에틸렌-(20)-올레일 알콜(BRIJ 98TM)과 에탄올의 조합의 사용보다 CAT유전자의 발현을 더 증대시킬 수 있다. 특히, 각각 0.2% 중량/중량 및 0.5% 중량/중량의 BRIJ 98TM또는 SILWETT L-77TM의 사용이 잎의 상부 표면에14C-에탄올(1% 내지 5% 중량/중량 사이의 농도) 혼합물이 적용되었을 때 AlcCAT 담배 식물에서의 보고 유전자의 발현 및 흡수를 상당하게 증가시켰다. 포스포이미지를 이용하여14C-에탄올 흡수의 검출하였다.
에탄올 단독으로 사용된 경우 담배 식물에서 2.1%이 흡수됨을 발견하였다. SILWETT L-77TM을 0.2% 부터 0.5% 중량/중량의 농도로 증가시켜 첨가하면, 5% 중량/중량 농도의 에탄올 단독의 경우와 비교하여 61% 내지 78% 증가된다. BRIJ98TM과14C-에탄올 조제물의 경우, 에탄올 단독의 경우와 비교하여 68%의 에탄올 흡수가 증가되었다.
이러한 조제물의 사용은 감자 및 오일씨드 평지에서도 보고 유전자의 상당한 활성화가 관찰되었다.
실시예6
동형접합체인 8주된 토양 성장 형질전환 Alc-GUS(CaMV 35S:AlcR, AlcA/CaMV 35S:CAT 구조체) 오일씨드 평지 식물에 아쥬반트-에탄올 혼합물(5% 중량/중량 에탄올 및 0.5% 중량/중량 아쥬반트)이 5t/h잎상에서 선단으로부터 향축의 잎 표면에 흐르도록 손-적용되었다. 식물은 수경의 온실 성장 조건에서 72시간 동안 놓였다. 표적 잎은 채취되어 GUS(β- 글루쿠로니다제) 활성이 측정되었고, 측정치는 단백질 농도에 대해여 표준화되었다. 조제물 없이 에탄올 만이 적용된 식물이 대조군(에타올 단독)으로 사용되었다. 한 번의 처리당 5회의 반복하였다. 도3에서 보는 바와 같이, 에러 막대는 표준 편차를 나타내며, 'CaMV 35S/10'은 GUS 보고 유전자를 도입하는 콜리플라워 모자이크 바이러스를 함유하는 항상성 대조군 식물에서의 GUS 활성의 10분의 1을 표시하며, 'Silwett'은 Silwett L77TM을 표시하고, 5% 중량/중량의 'EtOH'은 조제물 없이 잎-적용 처리된 것을 표시한다.
본 발명의 다른 변형은 본 발명의 범위내에서 당업자에게 명백할 것이다.

Claims (43)

  1. (a) 휘발성 화학 유도체;
    (b) 폴리에톡시화된 C10-C20알콜 또는 트리실록산 폴리에톡실레이트 및
    (c) 희석제;
    성분을 포함하는 조제물을, 상기 성분(a)를 생물체에 적용에함으로써 유도되는, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 화학-유도성 유전자 발현 카세트를 갖는 생물체에서 표적 유전자 발현 조절을 위해 사용하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 생물체가 식물인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 성분(a)가 C1-C6알콜 또는 C3-C9케톤인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 성분(a)가 에탄올 또는 프로판-2-올인 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 성분(b)가 폴리에톡시화된 올레일, 라우릴, 스테아릴, 또는 세틸 알콜인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 성분(b)가 폴리옥시에틸렌-올레일 알콜인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 성분(b)가 2 내지 20 범위의 평균 몰 에틸렌 옥시드 함량의 폴리옥시에틸렌-올레일 알콜인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 성분(b)가 폴리옥시에틸렌-(2)-올레일 알콜, 폴리옥시에틸렌-(10)-올레일 알콜 또는 폴리옥시에틸렌-(20)-올레일 알콜인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 성분(b)가 약 0.5% 중량/중량 또는 그 이하의 농도인 방법.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 성분(b)가 수소 또는 메틸 말단-캡 트리실옥산 폴리에톡실레이트인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 성분(b)가 메틸 말단-캡 트리실옥산 폴리에톡실레이트인 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 성분(b)가 평균 몰 에틸렌 옥시드 함량이 분자당 4 내지 12인 메틸 말단-캡 트리실옥산 폴리에톡실레이트인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 성분(b)가 분자당 평균 몰 에틸렌 옥시드 함량이 분자당 8인 메틸 말단-캡 트리실옥산 폴리에톡실레이트인 방법.
  14. 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 성분(b)가 약 0.5% 중량/중량 또는 그 이하의 농도인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 성분(a)가 약 2% 내지 5% 중량/중량 농도인 방법.
  16. 생물체에 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에서 정의된 조제물을 생물체에 적용함으로써 유도되는, 표적 유전자에 작동가능하게 연결된 유도성 프로모터를 포함하는 화학-유도성 식물 유전자 발현 카세트로 생물체를 형질전환시키는 것을 포함하는 생물체에서 표적 유전자의 발현을 조절하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 생물체가 식물인 방법.
  18. 조절 단백질을 인코딩하는 조절 서열에 작동가능하게 연결된 일차 프로모터, 및 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에서 정의된 조제물의 존재하에서 조절 단백질에 의하여 활성화되는, 표적 유전자에 작동가능하도록 연결된 유도성 프로모터를포함하는 화학-유도성 식물 유전자 발현 카세트로 식물을 형질전환시키는 것을 포함하는 식물에서 표적 유전자 발현을 조절하는 방법에 있어서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에서 정의된 조제물을 식물에 적용하는 것을 포함하고, 이에 의해 표적 유전자의 발현을 유도하는 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 유도성 프로모터가alcA유도성 프로모터 서열이고, 조절 서열이alcR조절 단백질을 인코딩하는 방법.
  20. 다음의 성분을 포함하는 농업용 조제물:
    (a) 유도성 프로모터의 휘발성 화학 유도체;
    (b) 트리실록산 폴리에톡실레이트; 및
    (c) 희석제.
  21. 제20항에 있어서, 성분(b)가 수소 또는 메틸 말단-캡 트리실록산 폴리에톡실레이트인 조제물.
  22. 제21항에 있어서, 성분(b)가 메틸 말단-캡 트리실록산 폴리에톡실레이트인 조제물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 성분(b)가 평균 몰 에틸렌 옥시드 함량이 분자당 4 내지 12인 메틸 말단-캡 트리실록산 폴리에톡실레이트인 조제물.
  24. 제23항에 있어서, 성분(b)가 평균 몰 에틸렌 옥시드 함량이 분자당 8 몰인 메틸 말단-캡 트리실록산 폴리에톡실레이트인 조제물.
  25. 제20항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 성분(a)아 2% 내지 5% 중량/중량 농도인 조제물.
  26. 다음을 포함하는 농업용 조제물:
    (a) 5% 중량/중량 이하 양의 유도성 프로모터의 C1-C6알콜 유도체;
    (b) 폴리에톡시화된 C10-C20알콜; 및
    (c) 물.
  27. 제26항에 있어서, 성분(b)가 폴리에톡시화된 올레일, 라우릴, 스테아릴, 또는 세틸 알콜인 조제물.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 성분(b)가 폴리옥시에틸렌-올레일 알콜인 조제물.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 성분(b)가 2 내지 20 범위의 평균 몰 에틸렌 옥시드 함량의 폴리에틸렌-올레일 알콜인 조제물.
  30. 제29항에 있어서, 성분(b)가 폴리옥시에틸렌-(2)-올레일 알콜인 조제물.
  31. 제29항에 있어서, 성분(b)가 폴리옥시에틸렌-(10)-올레일 알콜인 조제물.
  32. 제29항에 있어서, 성분(b)가 폴리옥시에틸렌-(20)-올레일 알콜인 조제물.
  33. 제26항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 성분(a)가 약 2% 내지 5% 중량/중량 농도인 조제물.
  34. 제20항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 성분(b)가 약 5% 중량/중량 이하의 농도인 조제물.
  35. 제20항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 성분(a)가 에탄올 또는 프로판-2-올인 조제물.
  36. 다음을 포함하는 농업용 조제물:
    (a) 유도성 프로모터의 화학 유도체로 작용할 수 있는 C3-C9케톤;
    (b) 폴리에톡시화된 C10-C20알콜; 및
    (c) 희석제.
  37. 제36항에 있어서, 성분(a)가 약 2% 내지 5% 중량/중량 농도인 조제물.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 성분(b)가 폴리에톡시화된 올레일, 라우릴, 스테아릴 또는 세틸 알콜인 조제물.
  39. 제38항에 있어서, 성분(b)가 폴리옥시에틸렌 올레일 알콜인 조제물.
  40. 제39항에 있어서, 성분(b)가 2 내지 20 범위의 평균 몰 에틸렌 옥시드 함량인 폴리옥시에틸렌-올레일 알콜인 조제물.
  41. 제40항에 있어서, 성분(b)가 폴리옥시에틸렌-(2)-올레일 알콜인 조제물.
  42. 제40항에 있어서, 성분(b)가 폴리옥시에틸렌-(10)-올레일 알콜인 조제물.
  43. 제40항에 있어서, 성분(b)가 폴리옥시에틸렌-(20)-올레일 알콜인 조제물.
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