MXPA01007474A - Uso de una formulacion para controlar la expresion de un gen objetivo. - Google Patents

Abstract

El uso de una formulacion que comprende los componentes: (a) un inductor quimico volatil; (b) un alcohol de 10 a 20 atomos de carbono polietoxilado o un triloxano polietoxilado y (c) un diluyente; para controlar la expresion de un gen objetivo que tiene un casete de expresion de gen vegetal inducible quimicamente que comprende un promotor inducible unido operativamente a un gen objetivo, en donde el promotor inducible se induce por la aplicacion a la planta de (a) anterior. Tambien se reivindican ciertas formulaciones novedosas.

Description

USO DE UNA FORMULACIÓN PARA CONTROLAR LA EXPRESIÓN DE UN GEN OBJETIVO DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el uso de una formulación como un mecanismo de control para la expresión de un gen objetivo en un organismo tal como una planta, así como para determinar formulaciones útiles de esta manera. La expresión del gen es controlada por regiones hacia el extremo (5') de la región codificante de proteína denominada comúnmente como el "promotor". Un promotor puede ser constitutivo, específico de tejido, programado por el desarrollo o inducible. La manipulación de plantas de cosecha para mejorar las características (tales como productividad o calidad) requiere la expresión de genes extraños o endógenos en tejidos vegetales. Tal manipulación genética por lo tanto se basa en la disponibilidad de un medio para controlar la expresión del gen según se requiere; por ejemplo, en la disponibilidad y uso de los promotores adecuados los cuales son efectivos en plantas . Es ventajoso tener que elegir una variedad de promotores diferentes de manera que se pueda seleccionar el promotor más adecuado para un gen, constructo, célula, tejido, planta o ambiente particular. Se sabe que una gama de promotores son operativos en plantas.

El término "promotor inducible" incluye promotores los cuales pueden ser inducidos químicamente. Los promotores particularmente útiles son secuencias promotoras las cuales son controladas por la aplicación de un estímulo químico externo. El estímul químico externo puede ser una sustancia química agrícolamente aceptable, cuyo uso sea compatible con la práctica agrícola y no sea dañina para plantas o mamíferos. Esto permite que la expresión del gen particular se controle en etapas particulares del crecimiento o desarrollo de la planta, por presencia o ausencia de una sustancia química la cual se puede aplicar a las plantas o semillas, por ejemplo por aspersión o utilizando técnicas conocidas de recubrimiento de semillas. Estas también se conocen como promotores "conmutadores" de genes. Un gen el cual está bajo el control de un promotor inducible puede ser un gen el cual da lugar a la característica deseada o fenotipo mismo, o el promotor inducible puede controlar la expresión de una proteína represora la cual inhibe la expresión de un gen objetivo, por ejemplo al interactuar con una secuencia operadora hacia el extremo 5' del gen objetivo de manera que evita la expresión del gen (por ejemplo, como se conoce en los sistemas de operador/represor tec y lac) . En una alternativa adicional, el gen bajo el control del promotor inducible puede expresar una proteína la cual interactúa con otra proteína para inhibir la actividad de la misma, como por ejemplo en el sistema barnasa/barstar en el cual la barnasa inhibirá o destruirá células en ausencia de barstar. Las conmutaciones de genes de este tipo se conocen en una amplia variedad de aplicaciones. Estas incluyen la producción de esterilidad masculina reversible, una característica la cual es altamente deseable en producción de plantas híbridas como se describe, por ejemplo, en el documento WO 90/08830. Otras aplicaciones de tales promotores incluyen una protección de plasma germinal, en donde el contenido de las plantas particulares de una cosecha, en particular plantas transgénicas, y el control de voluntarios, es necesario y también en la prevención de dispersión o diseminación antes de la cosecha, como se describe en el documento WO 94/03619. Muchos organismos tienen mecanismos los cuales permiten que metabolicen sustancias químicas tales como alcoholes o cetonas, por ejemplo por la producción de enzimas de alcohol deshidrogenasa. Los promotores de estos sistemas pueden ser útiles en conmutaciones de genes puesto que los promotores pueden ser inducibles por la presencia del alcohol o cetona objetivo. Uno de tales ejemplos se puede encontrar en el organismo micótico A . nidulans , el cual expresa la enzima alcohol deshidrogenasa I (ADH1) codificada por el gen alcA únicamente cuando crece en presencia de diversos alcoholes y cetonas. La inducción es activada mediante una proteína reguladora codificada por el gen alcR y se expresa de manera constitutiva. En presencia de inductor (alcohol o cetona) , la proteína reguladora activa la expresión del gen alcA . La proteína reguladora también estimula la expresión de sí misma en presencia de inductor. Esto significa que concentraciones altas de la enzima ADH1 se producen bajo condiciones inductoras (es decir, cuando está presente el alcohol o la cetona) . Inversamente, el gen para alcA y su producto, ADH1, no se expresan en ausencia de inductor. La expresión de alcA y la producción de la enzima también se expresa en presencia de glucosa. Por lo tanto, el promotor del gen para alcA es un promotor inducible, activado por la proteína reguladora alcR en presencia de inductor (es decir, por la proteína/alcohol o la combinación de proteína/cetona) . Los genes alcR y alcA (que incluyen sus promotores respectivos) se han clonado y secuenciado (Lockington RA et al, 1985, Gene, 33:137-149; Felenbok B et al, 1988, Gene, 73:385-396; Gwynne et al, 1987, Gene, 51:205-216). Se han investigado los genes para alcohol deshidrogenasa ( adh) en ciertas especies de plantas. En el maíz y otros cereales se activan por condiciones anaeróbicas . La región promotora de los genes para adh del maíz contienen un elemento regulador de 300 pb necesario para la expresión bajo condiciones anaeróbicas. Sin embargo, no se ha encontrado en ninguna planta un equivalente a la proteína reguladora alcR . Por lo tanto, el tipo de sistema regulador de gen alcR/alcA no se conoce en plantas. La expresión constitutiva de alcR en células vegetales no resulta en la activación de actividad endógena de adh . El documento WO 93/21334 describe la producción de plantas transgénicas las cuales incluyen tal sistema como un conmutador de gen. Este documento describe específicamente un cassette de expresión de gen vegetal inducible químicamente que comprende un primer promotor unido operativamente a una secuencia reguladora la cual codifica para una proteína reguladora, y el promotor inducible unido operablemente a un gen objetivo, el promotor inducible es activado por la proteína reguladora en presencia de un inductor exógeno efectivo por lo que la aplicación del inductor provoca la expresión del gen objetivo. En particular, se utiliza el sistema alcR/alcA en las construcciones (plásmidos recombinantes) . Los inductores químicos exógenos los cuales se aplican en este caso incluyen los que se describen por Creaser et al . , J. Biochem. (1984)225, 449-454) tales como butan-2-ona (etilmetilcetona) , ciciohexanona, acetona, butan-2-ol, ácido 3-oxobutírico, propan-2-ol y etanol. Para propósitos agrícolas, la aplicación de alcoholes sencillos puede preferirse pues tales sustancias químicas son relativamente baratas y es probable que se degraden fácilmente. Por lo tanto presentan menos carga ambiental. Sin embargo, tales sustancias químicas con frecuencia son altamente volátiles y por lo tanto difíciles de manejar en un contexto agrícola, pues grandes volúmenes de sustancias químicas se pueden perder durante la aspersión. Uno de los problemas asociados con el uso de inductores conocidos, por lo tanto, es su capacidad para evaporarse rápidamente antes de que puedan ser captados efectivamente por una planta. Por lo tanto, es deseable utilizar un inductor químico el cual se pueda captar por una planta de manera más efectiva que los inductores conocidos por lo que se permite un mejor control de expresión de un gen objetivo. La presente invención por lo tanto busca resolver los problemas asociados con la técnica anterior al formular el inductor químico. De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona el uso de una formulación que comprende los componentes : (a) un inductor químico volátil; (b) un alcohol de 10 a 20 átomos de carbono polietoxilado o un trisiloxano polietoxilado y (c) un diluyente; para controlar la expresión de un gen objetivo en un organismo que tiene un cásete de expresión de un gen inducible químicamente que comprende un promotor inducible unido operativamente a un gen objetivo en donde el promotor inducible se induce por la aplicación al organismo de (a) anterior. De manera adecuada, el organismo es una planta tal como una planta de cosecha.

El diluyente (c) puede ser, por ejemplo agua. De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un método para controlar la expresión de un gen objetivo en un organismo tal como una planta, que comprende transformar el organismo con un cásete de expresión de un gen vegetal inducible químicamente que comprende un promotor inducible unido operativamente al gen objetivo, en donde el promotor inducible se induce por la aplicación al organismo de una formulación como se describe antes. De manera adecuada, el sistema de expresión utiliza una proteína reguladora. Por lo tanto, de acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporciona un método para controlar la expresión de un gen objetivo en una planta que comprende transformar la planta con un cásete de expresión de gen vegetal inducible químicamente que comprende un primer promotor unido operativamente a una secuencia reguladora la cual codifica para una proteína reguladora, y un promotor inducible unido operativamente al gen objetivo, el promotor inducible es activado por la proteína reguladora en presencia de una formulación como se define en lo anterior, el método comprende aplicar a la planta una formulación como se define en lo anterior, por lo que la aplicación de la formulación inductora provoca la expresión del gen objetivo.

La naturaleza del componente (a) en las formulaciones anteriores depende del carácter del promotor inducible presente en el sistema de expresión. Sin embargo, los ejemplos particulares del componente (a) son un alcohol de 1 a 6 átomos de carbono o una cetona de 3 a 9 átomos de carbono, y de manera preferible, etanol, o propan-2-ol. Estos componentes actúan como inductores, por ejemplo, del sistema conmutador ale como se describe y detalla en lo siguiente. El componente (b) de la formulación utilizada como se describe en lo anterior, preferiblemente es un alcohol oleílico, laurílico, estearílico o cetílico polietoxilado. Es más preferible que el alcohol oleílico de polioxietileno tenga un contenido de óxido de etileno molar medio en el intervalo de 0 a 35 y de manera más preferible en el intervalo de 2 a 20. Es más preferible que el polioxietileno- (2 ) -alcohol oleílico, un polioxietileno- (10) -oleílico o un polioxietileno- (20) -alcohol oleílico. El componente (b) , sin embargo, preferiblemente es un polioxietileno- (20) -alcohol oleílico (el número entre paréntesis indica el contenido de óxido de etileno medio por molécula) . Tales productos están disponibles comercialmente como BRIJ 92MR, BRIJ 97M y BRIJ 98MR. Preferiblemente, el componente (b) de la formulación está a una concentración de aproximadamente 0.5% p/p o menos. Es preferible que esté a una concentración de entre aproximadamente 0.2% p/p y 0.5% p/p.

En una modalidad alternativa, la formulación utilizada en los métodos de la invención incluyen como componente (b) , un trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con hidrógeno o metilo. En particular, el componente (b) es un trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con metilo. El trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con metilo preferiblemente tiene un contenido de óxido de etileno molar medio de entre 4 y 12 por molécula y de manera más preferible 8 por molécula. Tales productos están disponibles comercialmente como SILWET 77MR (SILWET es una marca comercial de Witco) . Preferiblemente, el trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con metilo está a una concentración de aproximadamente 0.5% p/p o menos. Preferiblemente está a una concentración de entre aproximadamente 0.2% y 0.5%, p/p. El componente (a) de la formulación utilizada en los métodos descritos antes preferiblemente está a una concentración de aproximadamente 5% p/p o menos. De manera preferible está a una concentración entre aproximadamente 2% y 5% p/p. El promotor inducible de acuerdo con una modalidad preferida del tercer aspecto de la presente invención es una secuencia de promotor inducible alcA y la secuencia reguladora codifica para la proteína reguladora de al cR . El componente (c) de la formulación preferiblemente está a una concentración entre aproximadamente 90% y 98%, p/p.

Ciertas formulaciones utilizadas de acuerdo con los métodos descritos antes son novedosas y proporcionan un aspecto adicional de la invención. Por lo tanto, de acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona una formulación agrícola que comprende los componentes : (a) un inductor químico volátil de un promotor inducible; (b) un trisiloxano polietoxilado; y (c) un diluyente. Como se menciona antes, el componente (b) es adecuadamente un trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con hidrógeno o metilo, y de manera preferible es un trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con metilo. De manera adecuada el trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con metilo tiene un contenido de óxido de etileno molar medio de entre 4 y 12 por molécula, por ejemplo 8 por molécula. De manera adecuada, el componente (a) está en una concentración entre aproximadamente 2% y 5%, p/p. De acuerdo con un quinto aspecto de la presente invención, se proporciona una formulación agrícola, que comprende : (a) un inductor de alcohol de 1 a 6 átomos de carbono de un promotor inducible en una cantidad menor de 5% p/p. (b) un alcohol de 10 a 20 átomos de carbono, polietoxilado; y ( c ) agua . En este caso, el componente (b) de la formulación de manera adecuada es un alcohol oleílico, laurílico, estearílico, o cetílico polietoxilado y de manera preferible un polioxiet ileno-alcohol oleílico. De manera adecuada, el poloxiletileno-alcohol oleílico tiene un contenido molar medio de óxido de etileno en el intervalo de 2 a 20, tal como polioxietileno- (2) -alcohol oleílico, un polioxietileno- (10) -alcohol oleílico o un polioxietileno- (20) -alcohol oleílico. Nuevamente, el componente (a) , el cual preferiblemente es etanol o propan-2-ol, de manera adecuada está en una concentración entre aproximadamente 2% a menos de 5% p/p. La concentración del componente (B) preferiblemente es de aproximadamente 0.5% p/p o menos . De acuerdo con un sexto aspecto de la presente invención, se proporciona una formulación agrícola que comprende: (a) una cetona de 3 a 9 átomos de carbono la cual es capaz de actuar como un inductor químico de un promotor inducible; (b) un alcohol de 10 a 20 átomos de carbono polietoxilado; y (c) un diluyente.

Preferiblemente, en estas formulaciones, el componente (a) está en una concentración entre aproximadamente 2% y 5% p/p.

Como en lo anterior, el componente (b) puede ser un alcohol oleílico, laurílico, estearílico o cetílico polietoxilado y es preferiblemente un polioxietileno-alcohol oleílico, con un contenido molar medio de óxido de etileno en el intervalo de 2- 20. Los ejemplos particulares del componente (b) son polioxietileno- (2) -alcohol oleílico, polioxietileno- (10) -alcohol-oleílico y polioxietileno- (20) -alcohol oleílico. Una modalidad preferida de la presente invención es una formulación que comprende los componentes: a. etanol; b. polioxietileno- (20) -alcohol oleílico y c. un diluyente en el que el componente a. está en una concentración de 2% p/p y el componente b. está en una concentración de 0.5% p/p. Una modalidad incluso más preferida de la presente invención es una formulación que comprende los componentes: a: etanol; b. trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con metilo que tiene un contenido molar medio de óxido de etileno de 8, y c. un diluyente en donde el componente a. está en una concentración de 2% p/p y el componente b. está en la concentración de 0.5% p/p. Una ventaja de la presente invención es que la formulación se capta por el organismo tal como una planta de manera más efectiva en comparación con los inductores conocidos solos que se han utilizado. La formulación de acuerdo con la presente invención por lo tanto incrementa la efectividad del etanol como inductor del promotor alcA/alcR . Sorprendentemente se ha encontrado que el uso de tensioactivos de polioxietileno-alcohol oleílico o de adyuvantes de trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con metilo en combinación con los inductores químicos conocidos para el promotor alcA/alcR incrementa la captación de la formulación por una planta significativamente, lo que permite un mayor control de un gen objetivo el cual se puede unir operativamente al promotor inducible. Se pueden agregar otros aditivos, tales como compuestos antibacterianos, dispersantes, compuestos humectantes y antievaporantes . La invención es particularmente aplicable en el contexto de un sistema de expresión de genes vegetales que comprende : (i) un primer promotor unido operativamente a una secuencia reguladora la cual codifica para una proteína reguladora; y (ii) un promotor inducible unido operativamente a un gen objetivo, el promotor inducible es activado por la proteína reguladora en presencia de un inductor exógeno efectivo, el cual es la formulación que se define antes, por lo que la aplicación del inductor provoca la expresión del gen objetivo.

Tales sistemas de expresión de genes pueden estar contenidos dentro de una célula vegetal así como un tejido vegetal o una planta que comprende células vegetales como se define en lo anterior y plantas, o semillas derivadas de la misma. El término "inductor químico volátil" significa cualquier sustancia química la cual es capaz de inducir un sistema promotor inducible químicamente y el cual se puede evaporar rápidamente antes de que pueda ser captado efectivamente por una planta. El término "alcohol de 1 a 6 átomos de carbono" incluye metanol, etanol, n-propanol, iso-propanol , n-butanol, isobutanol, sec-butanol, ter-butanol, n-pentanol, n-hexanol y ciciohexanol y análogos saturados del mimo. El término "cetona de 3 a 9 átomos de carbono" incluye acetona, butanona, pentanona, hexanona, ciciohexanona, heptanona, octanona, nonanona y cetonas aromáticas tales acetofenona. El término "gen objetivo" con referencia a la presente invención significa cualquier gen de interés . Puede comprender cualquier gen el cual es necesario para que se introduzca en una planta con el fin de modificar las características del mismo. El gen objetivo puede ser un gen vegetal endógeno o un gen extraño y puede ser un gen único o una serie de genes . La secuencia de gen objetivo puede codificar para por lo menos parte de una proteína funcional o una secuencia antisentido. Por lo tanto, un promotor inducible cuando se une a un gen endógeno o extraño y se introduce en una eucariota por transformación, proporciona un medio para la regulación externa de la expresión de ese gen. El término "cásete de expresión", lo cual es sinónimo a términos tales como "construcción", "híbrido", y "conjugado", incluye un gen de interés unido directa o indirectamente a un promotor inducible. Un ejemplo de una unión indirecta es la provisión de un grupo separador adecuado tal como una secuencia de intrón intermedia al promotor y al gen objetivo. Lo mismo es válido para el término "fusionado" en relación a la presente invención la cual incluye la unión directa o indirecta. Tales construcciones también incluyen plásmidos y fagos los cuales son adecuados para transformar una célula de interés . El cásete de expresión de la presente invención también puede comprender componentes adicionales tales como una secuencia reguladora unida operativamente a un promotor adicional, el promotor inducible es activado por la proteína reguladora en presencia de un inductor exógeno . El término "sistema de expresión" significa que el sistema definido antes se puede expresar en un organismo, tejido, célula o medio apropiado. A este respecto, el sistema de expresión de la presente invención puede comprender uno o más casetes de expresión y también puede comprender componentes adicionales que aseguren una expresión aumentada del gen objetivo mediante el uso del promotor inducible.

Se puede utilizar cualquier método de transformación adecuado para las plantas o células vegetales objetivo, que incluye la infección por Agrobacterium tumefaciens que contiene los plásmidos Ti recombinantes, electroporación, microinyección de células y protoplastos, bombardeo con microproyectiles, bombardeo bacteriano, particularmente el método de "fibra" o "bigote", y la transformación del tubo de polen, las células transformadas después pueden colocarse en recipientes adecuados para regenerarse en plantas completas en las cuales el material nuclear nuevo se incorpora de manera estable en el genoma. Se pueden obtener de esta manera plantas transformadas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Se puede hacer referencia a la literatura para detalles completos de los métodos conocidos. Los ejemplos de plantas modificadas genéticamente las cuales se pueden producir incluyen dicotiledóneas y monocotiledóneas tales como cosechas de campo, cereales, frutas y vegetales tales como ajonjolí, girasol, tabaco, remolacha de azúcar, algodón, soya, maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, tomates, mangos, duraznos, manzanas, peras, fresas, plátanos, melones, papas, zanahorias, lechugas, repollo y cebolla. Varias características y modalidades preferidas de la presente invención se describirán a continuación por medio de ejemplos no limitantes y con referencia a los dibujos anexos en los que: la figura 1 muestra la inducción CAT por aspersión foliar utilizando etanol solo (2% p/p) y etanol (2% p/p) en combinación con BRIJ 92, 97 y 98MR (0.5% p/p) a formulaciones (5 repetidas/tratamiento) ; la figura 2 muestra la relación de incrementar la concentración de adyuvante SILWET L-77MR (0.2% p/p y 0.5% p/p) con etanol 2% p/p y etanol (2% p/p) solo a la actividad CAT en una prueba de aspersión de hojas en invernadero; la figura 3 muestra que la inducción de semilla de maíz de colza Alc-GUS por aplicación de etanol 5% p/p y formulación de 0.5% p/p de la superficie superior de las hojas de las hojas de colza ('T1 = hoja objetivo, 'A' = hoja adyacente de la misma planta) ; y la figura 4 muestra la estructura de Silwett L77MR. La Tabla a continuación proporciona detalles de los componentes de cada tensioactivo/adyuvante descrito en los Ejemplos.

EJEMPLO 1 Componente Cantidad a. Etanol 1.99 g b. BRIJ 92MR 0.51 g c . Agua 97.86 g Se mezclan 99.86 g de una solución de etanol 20% p/p (20.01 g de etanol en 980.56 g de agua) en un frasco con 0.51 g de Brij 92MR. La muestra se agita antes de uso.

EJEMPLO 2 Componente Cantidad a. Etanol 2.00 g b. BRIJ 97MR 0.52 g c. Agua 98.05 g Se mezclan 100.05 g de una solución de etanol 20% p/p (20.01 g de etanol en 980.56 g de agua) en un frasco con 0.52 g de Brij 97MR. La muestra se agita antes de uso.

EJEMPLO 3 Componente Cantidad a. Etanol 1.99 g b. BRIJ 98MR 0.50 g c. Agua 97.9 g Se mezclan 99.90 g de una solución de etanol 20% p/p (20.01 g de etanol en 980.56 g de agua) en un frasco con 0.50 g de Brij 98MR. La muestra se agita antes de uso.

EJEMPLO 4 Componente Cantidad a. Etanol 2.02 g b. SILWET L-77MR 0.50 g c. Agua 99.27 g Se mezclan 101.30 g de una solución de etanol 20% p/p (20.01 g de etanol en 980.56 g de agua) en un frasco con 0.50 g de Silwett L77MR. La muestra se agita antes de uso.

EJEMPLO 5 Con el fin de observar el efecto de las formulaciones anteriores (véanse las figuras 1 y 2) en las plantas de tabaco Alc-Cat ('Ale' se refiere al sistema CaMV35 S : Al cR , AlcA/CaMV35S:CAT) de ocho semanas de edad, las plantas se rocían a mano hasta correr en la superficie de la hoja adaxial en la hoja V5 con una mezcla adyuvante-etanol (o tensioactivo) como se describe en los Ejemplos 1 a 4 anterior. Se deja las plantas durante 72 h bajo condiciones de crecimiento en invernadero con irrigación de agua en la raíz y la hoja objetivo se muestra y se ensaya para determinación de actividad de CAT (cloramfenicoi acetiltransferasa) utilizando un equipo CAT ELISA (Boehringer Mannheim) . Las plantas a las que se les roció con etanol solamente se utilizan como controles. Se utilizan 5 muestras repetidas por tratamiento (las barras de error indican la desviación estándar) . Se puede ver que el uso de polioxietileno- (20) -alcohol oleílico (BRIJ 98MR) como un tensioactivo permite una mayor expresión del gen indicador CAT en comparación con el uso de etanol solo. El uso de trisiloxano etoxilado rematado en el extremo con metilo con un contenido molar medio de óxido de etileno de 8 por molécula (SILWET L-77MR) en combinación con etanol, sin embargo, es capaz de incrementar la expresión del gen CAT incluso en un grado mayor en comparación con polioxietileno- (20) -alcohol oleílico (BRIJ 98MR) en combinación con etanol. En particular, el uso de BRJ 98MR o SILWET L-77MR, cada uno a 0.2% p/p y a 0.5% p/p, incrementa significativamente la expresión del gen indicador y la captación en plantas de tabaco AlcCat cuando se aplica como una mezcla con 14C-etanol (a concentraciones que varían entre aproximadamente 1% y 5% p/p) a la superficie superior de las hojas. Los estudios de fosfoimagen se utilizan para detectar la captación de 14C-etanol. Se ha encontrado que el uso de etanol solo resulta en una captación de 2.1% por las plantas de tabaco. La adición de concentraciones cada vez mayores de SILWET L-77MR de 0.2% a 0.5% p/p resulta en un incremento de 61% a 78% en la expresión de CAT en comparación con etanol solo a una concentración de 5% p/p. En estudios de formulación de 14C-etanol con BRIJ 98MR, se observa un incremento de 68% en la captación de etanol, en comparación con el etanol solo. También se observa activación significativa del gen indicador con estas formulaciones en papa y semillas de colza. 5 EJEMPLO 6 Se rocían a mano hasta corrimiento a plantas de colza transgénicas Alc-GUS (construcción CaMV 35S:AlcR, AlcA/CaMV 10 35S:CAT) que crecen en el suelo de ocho semanas de edad, homocigotas, en la superficie de la hoja adaxial en la quinta hoja desde el vértice con una mezcla de adyuvante-etanol (etanol 5% p/p y adyuvante 0.5% p/p) . Se deja a las plantas durante 72 h bajo condiciones de crecimiento en invernadero con irrigación de 15 agua en la raíz. Las hojas objetivo se muestran y ensayan para determinar la actividad de GUS (ß-Glucuronidasa) y los valores se normalizan contra la concentración de proteína. Las plantas rociadas con etanol sin formulación se utilizan como controles ("etanol solo"). Se utilizan por tratamiento cinco plantas por 20 duplicado. Como se puede ver en la figura 3, las barras de error indican la desviación estándar, 'CaMV 35S/101 significa un décimo de la actividad de GUS en una planta control constitutiva que contiene el virus de mosaico de coliflor activado por el gen indicador GUS. 'Silwett" significa Silwett L77MR, y 'EtOH' significa un tratamiento de aspersión de hojas con etanol 5% p/p, sin formulación. Otras modificaciones de la presente invención serán evidentes para aquéllos expertos en la técnica sin apartarse del alcance de la presente invención.

Claims (43)

REIVINDICACIONES

1 . El uso de una formulación , que comprende los componentes : (a) un inductor químico volátil ; (b) un a l c oho l de 1 0 a 2 0 á t omo s de c a rbono polietoxilado o un trisiloxano polietoxilado y (c) un diluyente ; para controlar la expresión de un gen objetivo en un organismo que tiene un cásete de expresión de gen inducible químicamente que comprende un promotor inducible unido operativamente a un gen objetivo en donde el promotor inducible se induce por la aplicación al organismo de (a) anterior.

2. El uso como se describe en la reivindicación 1, en el que el organismo es un planta.

3. El uso como se describe en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el componente (a) es un alcohol de 1 a 6 átomos de carbono o una cetona de 3 a 9 átomos de carbono.

4. El uso como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el componente (a) es etanol o propan-2-ol .

5. El uso como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el componente (b) es un alcohol oleílico, laurílico, estearílico o cetílico polietoxilado.

6. El uso como se describe en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el componente (b) es un polioxietileno-alcohol oleílico.

7. El uso como se describe en cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que el componente (b) es un polioxietileno-alcohol oleílico con un contenido molar medio de óxido de etileno en el intervalo de 2 a 20.

8. El uso como se describe en la reivindicación 7, en el que el componente (b) es polioxietileno- (2) -alcohol oleílico, un polioxietileno- (10) -alcohol oleílico o un polioxietileno- (20) -alcohol oleílico.

9. El uso como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el componente (b) está a una concentración de aproximadamente 0.5%, p/p, o menos.

10. El uso como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el componente (b) es un trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con hidrógeno o metilo.

11. El uso como se describe en la reivindicación 10, en el que el componente (b) es un trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con metilo.

12. El uso como se describe en la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en el que el componente (b) es un trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con metilo, en el que el contenido molar medio de óxido de etileno está entre 4 y 12 por molécula.

13. El uso como se describe en la reivindicación 12, en el que el componente (b) es trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con metilo, en el que el contenido molar medio de óxido de etileno es 8 por molécula.

14. El uso como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en el que el componente (b) está a una concentración de aproximadamente 0.5% p/p o menos.

15. El uso como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que el componente (a) está en una concentración entre aproximadamente 2% y 5%, p/p. ^^^^£^¿¿¿2^^

16. Un método para controlar la expresión de un gen objetivo en un organismo, que comprende transformar el organismo con un cásete de expresión de gen vegetal inducible químicamente, que comprende un promotor inducible unido operablemente al gen objetivo, en el que el promotor inducible es inducido por la aplicación al organismo de una formulación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

17. Un método como se describe en la reivindicación 16, en el que el organismo es una planta.

18. Un método para controlar la expresión de un gen objetivo en una planta, que comprende transformar la planta con un cásete de expresión del gen vegetal inducible químicamente que comprende un primer promotor unido operativamente a una secuencia reguladora la cual codifica para una proteína reguladora y un promotor inducible unido operablemente al gen objetivo, el promotor inducible es activado por la proteína reguladora en presencia de una formulación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, el método comprende aplicar a la planta una formulación como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, por lo que la aplicación de la formulación inductora provoca la expresión del gen objetivo.

19. El método como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que el promotor inducible es la secuencia promotora inducible alcA y la secuencia reguladora codifica para la proteína reguladora alcR. 5

20. Una formulación agrícola, que consiste esencialmente de los siguientes componentes: (a) un inductor químico volátil de un promotor inducible; 10 (b) un trisiloxano polietoxilado; y (c) un diluyente.

21. La formulación como se describe en la reivindicación 20, en el que el componente (b) es un trisiloxano 15 polietoxilado rematado en el extremo con hidrógeno o metilo.

22. La formulación como se describe en la reivindicación 21, en el que el componente (b) es un trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con metilo. 20

23. La formulación como se describe en la reivindicación 21 o 22, en el que el componente (b) es un trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con metilo en el que el contenido molar medio de óxido de etileno está entre 4 y 25 12 por molécula.

24. La formulación como se describe en la reivindicación 23, en la que el componente (b) es un trisiloxano polietoxilado rematado en el extremo con metilo en el que el contenido molar medio de óxido de etileno es 8 por molécula.

25. La formulación como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 24, en la que el componente (a) está en una concentración entre aproximadamente 2% y 5% p/p.

26. Una formulación agrícola, que comprende: (a) un inductor de alcohol de 1 a 6 átomos de carbono de un promotor inducible en una cantidad menor de 5%, p/p; (b) un alcohol de 10 a 20 átomos de carbono polietoxilado; y (c) agua.

27. La formulación, como se describe en la reivindicación 26, en la que el componente (b) es alcohol oleílico, laurílico, estearílico o cetílico polietoxilado.

28. La formulación, como se describe en la reivindicación 26 ó 27, en la que el componente (b) es polioxietileno-alcohol oleílico.

29. La formulación, como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 26 a 28, en la que el componente (b) es un polioxietileno-alcohol oleílico con un contenido molar medio de óxido de etileno en el intervalo de 2 a 20.

30. La formulación, como se describe en la reivindicación 29, en la que el componente (b) es polioxietileno- (2) -alcohol oleílico.

31. La formulación, como se describe en la reivindicación 29, en la que el componente (b) es un polioxietileno- (10) -alcohol oleílico.

32. La formulación, como se describe en la reivindicación 29, en la que el componente (b) es un polioxietileno- (20) -alcohol oleílico.

33. La formulación, como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 26 a 32, en el que el componente (a) está en una concentración entre aproximadamente 2% a menos de 5%, p/p.

34. La formulación, como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 33, en el que el componente (b) está en una concentración entre aproximadamente 0.5% p/p o menos.

35. La formulación, como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 34, en el que el componente (a) es etanol o propan-2-ol.

36. Una formulación agrícola, que comprende: (a) una cetona de 3 a 9 átomos de carbono, la cual es capaz de actuar como un inductor químico de un promotor inducible; (b) un alcohol de 10 a 20 átomos de carbono polietoxilado; y (c) un diluyente.

37. La formulación como se describe en la reivindicación 36, en la que el componente (a) está en una concentración entre aproximadamente 2% y 5% p/p.

38. La formulación como se describe en la reivindicación 36 o la reivindicación 37, en donde el componente (b) es un alcohol oleílico, laurílico, estearílico o cetílico polietoxilado.

39. La formulación como se describe en la reivindicación 38, en donde el componente (b) es polioxietileno-alcohol oleílico.

40. La formulación como se describe en la reivindicación 39, en donde el componente (b) es polioxietileno-alcohol oleílico con un contenido molar medio de óxido de etileno en el intervalo de 2 a 20.

41. La formulación como se describe en la reivindicación 40, en donde el componente (b) es un polioxietileno- (2) -alcohol oleílico.

42. La formulación como se describe en la reivindicación 40, en donde el componente (b) es un polioxietileno- (10) -alcohol oleílico.

43. La formulación como se describe en la reivindicación 40, en donde el componente (b) es un polioxietileno- (20) -alcohol oleílico.