CN117511963A - KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学育种技术领域，尤其涉及KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，所述非生物胁迫为高温胁迫、低温胁迫和盐胁迫中的至少一种，其中，所述KcHTR4基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，或者其编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用能够积极响应高温、低温、盐和渗透胁迫等的广谱抗逆性花花柴KcHTR4基因，提供了其在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，过表达KcHTR4的转基因生物体在高温、低温和高盐条件下的存活率明显提高，具有增强的对高温、低温和高盐胁迫的耐受性，在低温、高温和高盐频发的自然环境中，对于提高作物产量和有效利用耕地资源意义重大。

Description

KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用
技术领域
本发明涉及分子生物学育种技术领域，特别涉及一种KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用。
背景技术
随着经济、科技的快速发展，以及各个地区所处地理位置的各不相同，生物体通常面临着多种多样的生态环境，在一些恶劣的地理环境(如低温、高温、干旱和高盐)中生存的动植物，常常要遭受来自自然环境的考验，恶劣的环境将影响整个生长周期，严重时将导致生物体的生长发育迟缓、减退，甚至会造成其死亡。因此，探索生物体自身对恶劣环境的响应及适应机理，有着重要的意义。其中，低温冷害、高温热害、盐溃等非生物胁迫是破坏粮食作物在生态环境下的生存和维持基本产量的主要因素，也是制约我国农业健康发展的重要因素。因此，提高抗寒、抗热和/或耐盐性一直是农业和植物抗逆性研究领域的热点之一。
植物逆境胁迫是一个复杂的生理过程，植物对逆境胁迫的适应是一种综合反应，包含信号感受系统、信号传导系统、受体蛋白的激活、抗性基因的激活等一系列过程，是一个涉及多基因参与的过程。例如，高温胁迫可诱导一些热休克蛋白(HSPs)蛋白基因的高表达，以清除或修复变性的蛋白等生物大分子，进而维持细胞稳态；低温胁迫可激活CBF(C-repeat(CRT)-binding factors)基因依赖的信号途径，表达产物CBF可结合到多种寒冷和脱水应答基因，最终使植物获得低温耐受能力；高盐胁迫将诱导Na+/H+逆向转运蛋白(Na+/H+hydrogen exchangers，NHEs)基因的高表达，该蛋白具有调节细胞内pH值和Na+的浓度及维持细胞内离子稳态等多种功能。目前，利用已发现的响应非生物胁迫的特异性基因构建转基因植物是赋予植物抗逆境胁迫的有效手段，然而并非所有的环境响应性基因均能够使转基因植物获得良好的非生物胁迫耐受性，事实上，现如今发现的大多数环境胁迫响应性基因均难以实际应用于抗逆境能力增强的种质资源创新。由此，开发并利用新的耐低温、高温和高盐生境的植物资源及其基因资源是缓解逆境下植物生长发育受阻及产量下降的重要研究方向。
花花柴(Karelinia caspica)是一种生长在戈壁、沙漠、高盐碱草甸等恶劣环境中的菊科荒漠植物(中国植物志，第七十五卷，科学出版社，1979年9月，第一版，P54-55)，常大片群生，在荒漠中极为常见，其叶片扁平且明显肉质化，体内有发达的储水组织，因此保水能力强，并具有较低的萎蔫系数，具有耐极端温度、耐盐碱、耐干旱等广谱抗逆性，是极为宝贵的逆境耐受性强的天然植物资源，因此，花花柴常作为开展植物逆境胁迫研究和抗逆性基因筛选的理想材料。然而，迄今为止，对于花花柴抗逆性基因研究报道较少，虽然已成功克隆到抗盐基因和抗热基因，但未见文献报道从花花柴中分离得到与低温胁迫相关的基因。另外，植物是固着性生物，其生长发育过程中会存在多种限制植物生长发育的胁迫因子，热、冷和盐胁迫均是植物生长而言很重要的影响因素，因此能够同时响应前述多种环境胁迫信号至关重要，然而，目前发现的花花柴抗逆基因均是在单一特定胁迫下诱导的基因，对同时提高植物的多重耐受性的研究还非常有限。因此，开发和寻找新的花花柴非生物胁迫响应相关基因尤其是耐受多重胁迫的基因，在基因水平探讨花花柴对非生物逆境条件下的适应性机理，将为利用基因工程分子育种的方式提高植物逆境生存能力尤其是同时能够提高多重逆境胁迫提供新的策略和遗传资源，具有更广泛的应用价值。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明利用能够积极响应高温、低温、盐和渗透胁迫等的广谱抗逆性花花柴KcHTR4基因，提供了该基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，过表达KcHTR4基因的转基因生物体在高温、低温和高盐条件下的存活率明显提高，具有增强的对高温、低温和高盐胁迫的耐受性，在低温、高温和高盐频发的自然环境中，对于提高作物产量和有效利用耕地资源意义重大。
本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明提供了KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，所述非生物胁迫为高温胁迫、低温胁迫和盐胁迫中的至少一种，其中，所述KcHTR4基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，或者所述KcHTR4基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步地，所述非生物胁迫包括高温胁迫，所述高温胁迫的温度不高于45℃。
进一步地，所述非生物胁迫包括低温胁迫，所述低温胁迫的温度不低于4℃。
进一步地，所述非生物胁迫包括盐胁迫，所述盐胁迫的盐浓度为0-0.2M。
进一步地，所述应用包括以下步骤：构建KcHTR4基因超表达载体，转化野生型生物体，培养获得KcHTR4基因表达量提高的转基因生物体。
更进一步地，构建所述KcHTR4基因超表达载体包括以下步骤：采用SEQ ID NO.7-8所示的引物对扩增KcHTR4基因，将扩增得到的所述KcHTR4基因通过BP-LR反应连接至植物表达载体pK2GW7上，得到KcHTR4基因植物超表达载体；或者，采用SEQ ID NO.3-4所示的引物对扩增KcHTR4基因，通过酶切酶连反应将扩增得到的所述KcHTR4基因连接至原核表达载体pET-28a上，得到KcHTR4基因微生物超表达载体。
再进一步地，所述KcHTR4基因植物超表达载体的构建方法包括：采用SEQ IDNO.7-8所示的引物对扩增KcHTR4基因，通过BP反应将扩增得到的所述KcHTR4基因连接至pDONRTM221载体上，之后通过LR反应将所述pDONRTM221载体上的所述KcHTR4基因产物连接至植物表达载体pK2GW7上，得到所述KcHTR4基因植物超表达载体。
再进一步地，所述KcHTR4基因微生物超表达载体的构建方法包括：采用SEQ IDNO.3-4所示的引物对扩增KcHTR4基因，通过Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶对扩增得到的所述KcHTR4基因和原核表达载体pET-28a进行双酶切反应，之后将双酶切产物利用T4 DNA连接酶连接，得到所述KcHTR4基因微生物超表达载体。
进一步地，将所述KcHTR4基因超表达载体转化所述野生型生物体的方法选自Ti质粒转化法、Ri质粒转化法、病毒载体转化法、基因枪法、显微注射法、电穿孔法或农杆菌介导法。
进一步地，所述生物体为植物或微生物。
更进一步地，所述植物选自拟南芥、棉花、油菜、水稻、小麦、大豆或玉米，所述微生物选自细菌。
本发明的优点及积极效果为：
本发明利用能够积极响应高温、低温、盐和渗透胁迫等的广谱抗逆性花花柴KcHTR4基因，通过在植物如拟南芥和细菌如大肠杆菌等中过表达该基因，得到的转基因生物体在高温、低温和高盐条件下的存活率明显提高，转基因生物体能够通过提高过氧化氢酶和过氧化物酶的活性、超氧化物歧化酶等的活性来减少对丙二醛的积累，进而积极响应逆境胁迫时的自由基信号并减少氧化应激损伤，改善生物体应对高温、低温和/或高盐胁迫的能力，促进逆性环境下生物体的生长发育，为培育抗高温、低温或高盐胁迫尤其是同时抗前述多种非生物胁迫的植物和微生物品种提供了重要的基因资源，具有广阔的应用前景，而且，在低温、高温和高盐频发的自然环境中，对于提高作物产量和有效利用耕地资源意义重大。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例不同非生物胁迫下花花柴KcHTR4基因表达量随时间变化情况图；
图2为本发明实施例KcHTR4基因植物超量表达载体的图谱；
图3为本发明实施例不同株系转基因拟南芥的KcHTR4基因表达水平图，其中，图a为0.8％琼脂糖凝胶电泳检测结果图，图b为转基因拟南芥KcHTR4基因表达量示意图；
图4为本发明实施例野生型拟南芥和转基因拟南芥随高温胁迫时间的延长、其地上部分表型变化图；
图5为本发明实施例野生型拟南芥和转基因拟南芥随高温胁迫时间的延长、其过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性和丙二醛含量变化图；
图6为本发明实施例野生型拟南芥和转基因拟南芥随低温胁迫时间的延长、其地上部分表型变化图；
图7为本发明实施例野生型拟南芥和转基因拟南芥随低温胁迫时间的延长、其过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶活性和丙二醛含量变化图；
图8为本发明实施例不同非生物胁迫48h后转化KcHTR4基因的大肠杆菌和未转化KcHTR4基因的大肠杆菌的菌落形成情况，其中，图a-f分别表示未胁迫、45℃、4℃、0.3mol/LNaCl、0.2mol/L NaCl和0.1mol/L NaCl胁迫处理；
图9为本发明实施例不同非生物胁迫4h后转化KcHTR4基因的大肠杆菌和未转化KcHTR4基因的大肠杆菌的菌落形成率图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。术语“大约”具有其通常的含义，用于表示一个值包括用于确定该值的设备或方法的误差的固有变化，或包含接近所述值的值，例如在所述值(或值的范围)的10％之内。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。
另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。
术语“基因”是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。因此，基因的表达包括转录和衍生自基因的编码RNA(mRNA)或功能RNA的稳定积聚，也可指将mRNA翻译成多肽或蛋白。基因可以包含数种可操作地连接的核酸片段，例如5’非编码区(UntranslatedRegions，UTR)、编码区和包含聚腺苷酸化位点的3’非编码区。一般非编码区是指不能够转录mRNA的区域，具有基因表达的调控功能，如启动子和终止子。编码区是指能够转录成mRNA的部分，包括外显子和内含子，外显子具有必要的密码子或蛋白质合成所需的信息。内含子是基因内的非编码序列，在mRNA成熟期间通过RNA剪接去除。
术语“信使RNA(mRNA)”指可以由生物体翻译成蛋白质的RNA，成熟mRNA的主体序列是编码序列(编码区)，在其上游5’侧和下游3'侧有非编码区。
术语“cDNA”是指经过逆转录后与RNA分子(如mRNA)反向互补的DNA分子(第一链cDNA)或具有与RNA分子相同的序列除了U是T的DNA分子(第二链cDNA)。cDNA没有内含子而只有外显子的序列。
术语“载体”是指将外源目的基因转移至宿主生物体内的一种能自我复制的DNA分子，并且常常是环状双链DNA分子的形式，含有目的基因的载体即为重组载体。典型载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，因此，在本发明的上下文中，质粒和载体可以互换使用。
术语“表达载体”允许插入到载体的外源目的基因在宿主生物体中表达，将表达载体导入适当的宿主生物体中，能够表达插入的目的基因(例如本发明的KcHTR4基因)。
术语“导入”或“转入”指目的基因核酸分子(如含有KcHTR4基因的超表达载体)向宿主生物体内的转移，导致基因稳定的遗传。导入的核酸分子可以是宿主生物体中保留的质粒形式，或者可以被整合进宿主生物体基因组中。含有导入基因的宿主生物体被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体或“工程”生物体。表达载体导入宿主生物体可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。
术语“过量表达”、“过表达”或“超量表达”、“超表达”等类似词语是指基因的表达水平超过正常的表达水平。在较佳的实施方式中，基因的表达水平比正常情况下的表达水平高至少10％、20％、50％、100％(2倍)、200％(3倍)、300％(4倍)，甚至更多倍。在本发明中，过表达或超表达是相对于野生型植株或野生物菌株而言的。
通常情况下，比较Ct值法是研究基因表达产物含量最常用的方法，定量结果由目的基因和内参基因Ct值之间的差值(△Ct)来反映，属于相对定量，计算相对表达量的方法采用公式2-ΔΔCt计算。术语“Ct”或“Ct值”是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。每个样品模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
术语“非生物胁迫”是指显著偏离于生物体适宜生存的环境因素对生物体产生的生存压力，又称为“环境胁迫”，通常包括低温、高温、高盐、干旱等胁迫因子。当环境温度超出了植物等生物体所能适应的温度范围并持续一段时间，表现出对植物产生不利效应，如抑制植物生长活动或威胁植物生存，即对植物形成温度胁迫；温度胁迫包括高温胁迫和低温胁迫，短时间或长时间的高温或低温胁迫都会引起一系列生理生化的改变，包括光合作用、水分代谢、内源激素的水平、初生及次生代谢产物的水平等，从而影响植物的生长发育过程；例如，绝大部分植物的适宜生存温度为15-30℃，植物处于温度超过30℃或低于15℃的环境中一段时间，即会受到温度胁迫的影响，高温胁迫过长植物会遭受热害，低温胁迫过长植物会受到冷害或者冻害，如起源于热带的喜温植物水稻、番茄和黄瓜等在10-12℃就会发生冷害。植物由于生长在高盐度生境下所受到的一种生存压力，称为盐胁迫，盐胁迫的本质是由盐离子的离子毒性和高渗透势引起的；植物受到了高浓度盐分的渗透作用，导致水分的流失，从而引起生理代谢的紊乱和离子平衡的紊乱，继而导致植物凋零、生长不良甚至死亡。在自然条件下，植物主要受到钠盐的胁迫，耐盐植物通常通过体内渗透调节排出或分隔Na+降低其毒性。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
本发明实施例提供了KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，所述非生物胁迫为高温胁迫、低温胁迫和盐胁迫中的至少一种，所述KcHTR4基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，或者所述KcHTR4基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明基于前期研究经验从荒漠植物花花柴的基因组中分离到一种对高温胁迫具有积极响应的KcHTR4基因，之后利用RT-PCR检测该基因的表达量在45℃高温、4℃低温、400mmol/L NaCl、干旱、5％聚乙二醇(PEG)等非生物胁迫下的变化情况，发现KcHTR4基因能够积极响应高温、低温、盐和渗透胁迫的逆境环境，首次证实该基因与花花柴多重逆境胁迫耐受性相关，尤其是对于花花柴应对极端温度和高盐环境具有重要作用。进一步通过在植物如拟南芥和细菌如大肠杆菌等中过表达该基因，得到的转基因生物体在极端温度和高盐条件下的存活率都明显高于对照(未转化KcHTR4基因)组，转基因生物体在高温下主要通过提高过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性、在低温下主要通过提高超氧化物歧化酶(SOD)和POD的活性等来减少对丙二醛(MDA)的积累，进而积极响应温度胁迫时的ROS信号以及减少氧化应激损伤，改善生物体应对高温、低温和/或高盐胁迫的能力，促进逆性环境下生物体的生长发育，为培育同时具有耐多种非生物环境胁迫植物和微生物品种提供了重要的基因资源及相关的种质资源，具有广阔的应用前景，尤其是在低温、高温和高盐频发的环境中，对提高生物体存活情况和作物产量意义重大，同时对拓展作物扩展作物可栽培地域、有效利用可耕地资源意义重大。
可选地，所述生物体为植物或微生物，所述植物包括但不限于：拟南芥、棉花、油菜、水稻、小麦、大豆和玉米，所述微生物为细菌，包括但不限于：大肠杆菌。
可选地，所述高温胁迫的温度不高于45℃(包括本数45℃)，所述低温胁迫的温度不低于4℃(包括本数4℃)，所述盐胁迫的盐浓度为0-0.2M。以拟南芥为例，拟南芥喜湿润的环境，其适宜生长的温度为21-25℃，耐15℃的低温，还能忍受34℃的高温，但是会影响植株的生长，不耐盐，对其而言，低温胁迫的温度可以为4-15℃，高温胁迫的温度可以为34-45℃，盐胁迫的盐浓度可以为0-0.2M。以大肠杆菌为例，大肠杆菌最适生长温度为37℃，低于或者高于该温度均会使其生长速度受限，最适生长盐浓度为0.05-0.1M，高于该浓度大肠杆菌的生长将受到抑制，因此，对其而言，低温胁迫的温度可以为4-37℃，高温胁迫的温度可以为37-45℃，盐胁迫的盐浓度可以为0.1-0.2M。
具体地，上述所述的KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，包括以下步骤：构建KcHTR4基因超表达载体，转化野生型生物体，培养获得KcHTR4基因表达量提高的转基因生物体。由此获得的转基因生物体具有提高的逆境胁迫耐受能力，能够拓宽转基因生物体对高温、低温等极端温度和高浓度盐分的适应范围，增强抗逆性。
构建所述超表达载体的原始载体为本领域常规的各种表达载体，只要其能够容载KcHTR4基因即可。典型载体包括质粒、病毒载体、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，因此，在本发明的上下文中，载体与质粒可互换使用。表达载体包含在指定生物体细胞中表达的调控元件，如启动子，启动子可以为强启动子、特异启动子或诱导型启动子，位于KcHTR4基因的转录起始核苷酸上游，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证KcHTR4基因的翻译。前述的载体和载体所含表达调控元件的选择取决于用于导入KcHTR4基因的宿主生物体的类型。当生物体为植物时，表达载体选择植物表达载体，示例性地，可以选择pK2GW7载体，当生物体为细菌时，表达载体选择细菌表达载体，示例性地，可以选择pET-28a载体。
具体地，构建KcHTR4基因超表达载体包括以下步骤：采用SEQ ID NO.7-8所示的引物对扩增KcHTR4基因，将扩增得到的KcHTR4基因产物通过BP-LR反应连接至植物表达载体pK2GW7上，得到KcHTR4基因植物超表达载体；或者，采用SEQ ID NO.3-4所示的引物对扩增KcHTR4基因，通过酶切酶连反应将扩增得到的所述KcHTR4基因连接至原核表达载体pET-28a上，得到KcHTR4基因微生物超表达载体。
更具体地，KcHTR4基因植物超表达载体的构建方法包括：采用SEQ ID NO.7-8所示的引物对扩增KcHTR4基因，通过BP反应将扩增得到的所述KcHTR4基因连接至pDONRTM221载体上，之后通过LR反应将所述pDONRTM221载体上的所述KcHTR4基因产物连接至植物表达载体pK2GW7上，得到所述KcHTR4基因植物超表达载体。KcHTR4基因微生物超表达载体的构建方法包括：采用SEQ ID NO.3-4所示的引物对扩增KcHTR4基因，通过Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶对扩增得到的所述KcHTR4基因和原核表达载体pET-28a进行双酶切反应，之后将双酶切产物利用T4 DNA连接酶连接，得到所述KcHTR4基因微生物超表达载体。
表达载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为细菌如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法或MgCl2法处理，也可用基因枪法、Ti质粒转化法、Ri质粒转化法、病毒载体转化法、显微注射法、电穿孔法等方法。当宿主是植物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、Ti质粒转染法、Ri质粒转染法、病毒载体转染法、基因枪法、显微注射法、电穿孔法或农杆菌介导法等，具体操作可参见：Weissbach,1998,Method for Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,NewYork,pp.411-463；Geiserson and Corey,1998,Plant Molecular Biology(2ndEdition)。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例
1、花花柴KcHTR4基因的分离克隆
花花柴种质资源来源于塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，2020年10月采自中国新疆阿拉尔市，通过特异性引物KcHTR4-F和KcHTR4-R从花花柴基因组cDNA中克隆到一段EST序列，具体操作如下：
花花柴叶片的总RNA提取及基因组cDNA的获得：从花花柴叶片中提取总RNA，提取方法参见文献“Zhu L F,Tu L L,Zeng F C,et al.An Improved Simple Protocol forIsolation of High Quality RNA from Gossypium spp.Suitable for cDNA LibraryConstruction[J].Acta Agronomica Sinica,2005,31.1657-1659.”，利用反转录酶(购自全式金公司，中国，货号AE311)将总RNA反转录合成cDNA，反应条件为：42℃、30min，之后85℃、5s。
花花柴KcHTR4基因全长序列的获得：根据转录组中KcHTR4序列设计特异性引物KcHTR4-F和KcHTR4-R。PCR条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入pMD-19T载体(购自TAKARA公司，中国，货号3271)，构建成功的质粒命名为pMD-19T-KcHTR4，筛选阳性克隆并测序，KcHTR4基因的CDS为771bp，进一步对测序所得序列通过ORF Finder在线工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对获得的cDNA进行分析，确定包含一个完整的ORF，编码256个氨基酸。本实施例所得KcHTR4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
KcHTR4基因的核苷酸序列如下所示：
ATGGCGGCCTCTGCTGAACGCGAAAACTTCATCTATGTCGCCAAGCTCGCTGAGCAAGCTGAACGCTATGACGAGATGGTGGATGCGATGAAGAAAGTAGCAAAGTTGGATATCGAATTGACTGTTGAAGAGAGAAATTTGCTCTCAGTTGGATACAAGAATGTGGTGGGTTCACGTAGGGCATCATGGAGGATTTTGTCTTCCATTGAGCAAAAAGAGGAGTCAAGGGGCAATGAAGTTAATGTAAAGCGGATTAAGGAATATAGGCAGAAGGTGGAAACAGAGCTGTCTAACATTTGTGGTGATATCATGACCGTGATTGATGAGCATCTGATTCCATCTTCCTCGGCAGGGGAATCCACTGTTTTCTACTACAAGATGAAAGGAGACTATTATAGGTATCTTGCAGAGTTCAAGTCTGGGAATGACAAAAAAGAGGCAGCTGATCAGTCCCTGAAGGCTTATCAATTGGCTTCAACTGCTGCCGAGGATTTATCTCCTACTCACCCCATCAGATTGGGTTTGGCTTTGAACTTCTCTGTTTTCTACTATGAGATCATGAACTCTCCTGAAAGAGCCTGCCACCTGGCTAAACAAGCTTTTGACGAGGCTATCTCAGAGCTTGACTCCTTGAGTGAGGAGTCATACAAAGATAGCACTTTAATTATGCAGCTCCTGAGGGATAATCTCACTTTGTGGACTTCTGACATTCCAGAAGATGGAGAAGACCAAAAGATGGAGATCACCAAATCTGGTGCAGAAGACGAGTAA(见SEQ ID NO.1)。
KcHTR4基因编码的蛋白序列如下所示：
MAASAERENFIYVAKLAEQAERYDEMVDAMKKVAKLDIELTVEERNLLSVGYKNVVGSRRASWRILSSIEQKEESRGNEVNVKRIKEYRQKVETELSNICGDIMTVIDEHLIPSSSAGESTVFYYKMKGDYYRYLAEFKSGNDKKEAADQSLKAYQLASTAAEDLSPTHPIRLGLALNFSVFYYEIMNSPERACHLAKQAFDEAISELDSLSEESYKDSTLIMQLLRDNLTLWTSDIPEDGEDQKMEITKSGAEDE(见SEQ ID NO.2)。
KcHTR4-F和KcHTR4-R引物序列如下所示：
KcHTR4-F：5′-ATGGCGGCCTCTGCTGA-3′(见SEQ ID NO.3)；
KcHTR4-R：5′-TTACTCGTCTTCTGCACCAGATTT-3′(见SEQ ID NO.4)。
通过DNAMAN软件和NCBI在线比对确定该KcHTR4蛋白属于14-3-3蛋白家族，14-3-3蛋白最早是由MOORE等从牛的脑组织中分离得到的一种酸性可溶性蛋白，根据其电泳迁移率将其命名为14-3-3蛋白，现有研究发现14-3-3蛋白可以结合数百种不同的蛋白，主要是磷酸化的蛋白质伙伴，其作为磷酸肽结合枢纽，在真核生物中协调多种细胞过程，包括调节细胞凋亡、细胞周期、离子通道运输、转录、信号转导和激素等生物合成以及应对生物胁迫和非生物胁迫而产生的应激反应。尽管已有研究表明14-3-3家族可以调节植物多种生理生化反应，但是其本身在转录和功能上都受到植物细胞内和细胞外环境的影响，因此后续通过基于14-3-3蛋白在植物调控作用的认识，进一步研究KcHTR4在环境胁迫相应中的实际功能。
2、花花柴KcHTR4基因在不同非生物胁迫下的表达模式分析
花花柴植株的室内种植：营养土和蛭石按照3：1的比例混合均匀浇足水后，将种子均匀的撒在土壤中，将其放置28℃、30％的相对湿度的人工气候室内进行培养。待花花柴生长至三个月后，选取长势相同的花花柴进行不同的非生物胁迫处理。
非生物胁迫包括：1)45℃高温条件下KcHTR4表达模式分析：取长势相同的花花柴植株，进行45℃高温处理，处理时长分别为0h、5min、0.5h、2h、4h，每个处理三个重复。处理完毕后分别取其根、茎、叶用液氮速冻后，放入-80℃冰箱备用。2)4℃低温条件下KcHTR4表达模式分析：取长势相同的花花柴植株，进行4℃低温处理，处理时长分别为0h、5min、0.5h、2h、4h、8h，每个处理三个重复。处理完毕后分别取其根、茎、叶用液氮速冻后，放入-80℃冰箱备用。3)400mmol/L NaCl条件下KcHTR4表达模式分析：取长势相同的花花柴植株，待下一次浇水前进行400mmol/L NaCl处理，处理时长分别为0h、2h、4h、8h、24h、48h，每个处理三个重复。处理完毕后分别取其根、茎、叶用液氮速冻后，放入-80℃冰箱备用。4)干旱条件下KcHTR4表达模式分析：取长势相同的花花柴植株，待下一次浇水前，浇足水分后开始进行干旱处理，处理时长分别为0d、2d、4d、6d、8d，每个处理三个重复。处理完毕后分别取其根、茎、叶用液氮速冻后，放入-80℃冰箱备用。5)15％聚乙二醇(PEG)渗透条件下KcHTR4表达模式分析：取长势相同的花花柴植株，待下一次浇水前，浇入15％ PEG溶液进行渗透胁迫，处理时长分别为0h、3h、6h、10h、24h、36h，每个处理三个重复。处理完毕后分别取其根、茎、叶用液氮速冻后，放入-80℃冰箱备用。
将非生物胁迫处理的根(Root)、茎(Stem)、叶(leaf)样品分别提取RNA，并按照上述操作反转录为cDNA后放入-20℃冰箱备用，通过RT-PCR扩增进行KcHTR4基因表达模式分析。用引物KcHTR4-F和KcHTR4-R对KcHTR4基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长771bp)，同时用拟南芥18s rRNA基因作为内参基因，采用18s-f和18s-r做特异扩增(扩增产物长250bp)。PCR反应体系的总体积为20μL，DNA模板1μL(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mMMgCl2 1.2μL、2mM dNTP 1.5μL、10μM引物0.2μL、0.3单位Taq酶，加ddH2O至20μL。反应程序为：94℃变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，30cycles，72℃延伸5min。获得的PCR产物取10μL以0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
18s rRNA基因的引物序列如下所示：
18s-f：5'-CGGCTACCACATCCAAGGAAGG-3'(见SEQ ID NO.5)；
18s-r：5'-CACCAGACTTGCCCTCCAATGG-3'(见SEQ ID NO.6)；
图1示出了在不同非生物因素胁迫下的KcHTR4基因表达量随时间变化情况。从图中可以看出，在应对高温胁迫时，根器官在处理5min时KcHTR4基因表达量最低，随着处理时长增加，其表达量逐步增加，但仍然低于未处理时的表达量，茎器官中的KcHTR4基因表达量在处理2h时达到最低，但处理时长为4h时表达量增加至最大但仍低于未处理，在叶器官中处理2h时KcHTR4基因表达量最低，处理4h时仅有微量表达，可见KcHTR4基因主要在根器官和茎器官中响应高温胁迫。在应对低温胁迫时，初始KcHTR4基因在根、茎、叶中均有少量的表达，且在处理时间为5min时表达量下降，处理时长延长至0.5h时表达量增加，在根器官和叶器官中处理时长达到8h表达量最高，且均高于未处理时的表达量，但在茎器官冷胁迫处理8h时几乎不表达，故KcHTR4基因在响应冷胁迫时主要在根器官和叶器官中表达。在应对盐胁迫时，KcHTR4基因在根器官处理时间为2h时表达量下降，处理时间至4h时表达量增加，处理时间达到24h时表达量进一步增加，但当处理时间为48h开始下降，在茎器官和叶器官中当处理时长为2h时表达量最低，处理时长为8h表达量最高但仍然低于未处理时的表达量。在响应15％PEG渗透胁迫时，KcHTR4基因主要在根器官和茎器官中表达，根器官在处理时间为36h时KcHTR4基因表达量最高但仍然低于未处理的表达水平，茎器官中在处理3h时表达量最高，在继续处理6h、10h、24h和36h时表达量几乎一致，在叶器官中KcHTR4基因的表达量随着处理时间的增加表达量几乎不变与未处理时的一致。在响应干旱胁迫时，KcHTR4基因在根、茎、叶中均有表达，在根、茎中其表达量随着胁迫时间的增加呈现下降的趋势，但在叶器官中处理时长为2d和4d时其表达量较高，随着处理时长延长到6d和8d时，表达量达到最低，故推测该基因不是花花柴应对干旱胁迫的主要调控基因。
综合前述结果，KcHTR4基因对15％PEG渗透、400mmol/L NaCl高盐、45℃高温和4℃低温胁迫的非生物逆境环境均能够做出积极响应，对花花柴多重环境胁迫耐受性具有重要作用。
3、花花柴KcHTR4基因植物超量表达载体的构建
根据测序得到的KcHTR4基因核苷酸序列(见SEQ ID NO.1)设计引物(KcHTR4BP-F和KcHTR4BP-R)用于构建表达载体，在引物两端分别加上BP-LR反应的接头碱基，以pMD-19T-KcHTR4质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min，经PCR扩增得到包含完整ORF的PCR产物。PCR产物经BP反应连接至pDONRTM221载体上(BP酶和pDONRTM221载体购自Invitrogen公司，美国，货号11789-100)，25℃孵育4h后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α感受态细胞，以KcHTR4基因的特异引物进行PCR检测来挑取阳性克隆，并活化提取质粒。PCR反应条件同前。再用LR反应将KcHTR4基因连接至植物表达载体pK2GW7(华中农业大学惠赠，LR酶购自Invitrogen公司，美国，货号11791-100)，25℃孵育4h后，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆并活化提取质粒，成功插入KcHTR4基因的超表达载体命名为p35s-KcHTR4，其载体图谱见图2。阳性克隆为携带超量表达质粒p35s-KcHTR4的大肠杆菌菌株。上述KcHTR4BP-F和KcHTR4BP-R引物序列如下所示：
KcHTR4BP-F：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcatggcggcctctgctga(见SEQ IDNO.7)；
KcHTR4BP-R：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcttactcgtcttctgcaccagattt(见SEQ ID NO.8)。
将构建的p35s-KcHTR4载体转化农杆菌菌株GV3101，转化方法参见文献“HellensR P,Mullineaux P,Klee H.A guide to Agrobacterium binary Ti vectors[J].Trendsin Plant Science,2000,5(10):446-451.”，挑取单菌落接于含20mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，于200rpm、28℃摇床培养48h，按菌液和甘油体积比为1：1加入1.5mL离心管混匀，-80℃保存，再通过农杆菌介导的转化方法转化拟南芥。
4、KcHTR4基因的遗传转化及超表达KcHTR4基因的转基因植物的筛选鉴定
拟南芥的准备：野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.Columbia ecotype)种子经过春化处理后点播营养土中，并放入人工培养室，按照16h光照、22±2℃条件培养至拟南芥长到4叶左右，之后定苗以控制拟南芥的生长密度。待拟南芥生长6周左右开始开花时即可转化，转化前一天给拟南芥浇足水。
农杆菌的活化：从超低温冰箱内取出保存的含有目标基因的GV3101菌株(购自天津擎科生物技术有限公司，货号TSC-A01)的甘油管在冰上融化，后于含20mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，28℃暗培养36-48h，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在加20mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，28℃、100rpm过夜培养，至OD600＝0.8-1.0时即可用于转化；先将菌液转移到离心管中5000rpm离心5min，弃上清培养基。加入100mL浓度为5％(W/V)的蔗糖溶液，重悬农杆菌GV3101，在28℃摇床中复苏1-2h。加入表面活性剂0.02％(V/V)Silwet L-77，震荡摇混匀。
农杆菌介导转化拟南芥及转基因拟南芥的筛选：农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥的方法参考文献“Xiuren Z,Rossana H,Shih-Shun L,et al.Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method[J].Nature Protocol,2006,2(1):1-6.)。具体步骤如下：(1)将拟南芥花器浸入农杆菌悬液，并轻轻搅动约30s，用纸巾吸掉过多的菌液，并用黑色塑料袋将拟南芥植株包裹起来，保湿避光处理24h；(2)24h之后将塑料袋逐渐揭开透气，正常培养；(3)一个星期之后重复上述(1)的操作；(4)待种子成熟可以停止浇水并收获种子，即T1代种子；(5)将收获的种子消毒：先用70％(V/V)乙醇浸泡1min，在上述处理时要不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次；(6)处理后的种子用0.1％(W/V)琼脂水溶液均匀涂布在含100mg/L卡那霉素的固体MS培养基表面；(7)4℃春化3d，移入培养室培养10d后，共选取具有卡那霉素抗性植株40株；(8)将40株转基因T1代拟南芥植株移栽到土壤培养，待成熟后按单株收取种子，即T2代种子；(9)将收取的T2代种子按操作步骤(5)-(6)重复操作1次；(10)4℃春化3d，正常培养10d后计算具有卡那霉素抗性植株与非抗性植株的分离比，并进行统计分析；(11)符合抗性与非抗性植株的分离比为3：1的株系认为是单拷贝株系，移栽土壤培养，待成熟后按单株收取种子，即T3代种子。
转基因拟南芥植株的纯系检测：将收取的T3代种子采用上述步骤(5)-(6)操作1次；然后4℃春化3d，移入培养室培养10d后查看转基因植株在含100mg/L卡那霉素的固体MS培养基上是否发生抗性分离，不发生抗性分离的株系是转基因纯系T3代种子，用作下一步表型分析和功能鉴定。
5、转基因拟南芥KcHTR4基因的表达水平分析
收集T3代种子生长的拟南芥植株叶片以提取RNA，RNA的抽提方法采用天根RNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号DP201101X)。RNA完整性通过1.2％(w/v)琼脂糖胶电泳检测(5V/cm)。通过Beckman DU800 spectrophotometer(BECKMAN公司，美国)仪器测定RNA浓度，RNA260/280比值在1.9到2.1之间，260/230比值大于2.0的RNA样品用于下一步的分析。利用反转录酶(购自全式金公司，中国，货号AE311)将其反转录合成cDNA，反应条件为：42℃、30min，85℃、5s。每份cDNA稀释到300μL后-20℃保存待用。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物KcHTR4-F和KcHTR4-R对KcHTR4基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长771bp)，同时用拟南芥18s rRNA基因作为内参基因，采用18s-f和18s-r做特异扩增(扩增产物长250bp)；获得的PCR产物取10μL以0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
图3示出了不同株系转基因拟南芥KcHTR4基因的表达水平，其中，图a为0.8％琼脂糖凝胶电泳检测结果图，图b为不同株系转基因拟南芥的KcHTR4基因表达量示意图，图中WT表示未转化KcHTR4基因的野生型拟南芥，OE-1至OE-3表示超表达KcHTR4基因的不同转基因拟南芥株系。结果表明KcHTR4基因在拟南芥中成功表达，在不同转基因株系中的表达量有所差异，后续研究选取表达量相对最高的1号系(OE-1)进行分析。
6、转基因拟南芥对环境胁迫抗性分析
6.1、拟南芥苗期高温处理下抗逆性能力分析
将野生型拟南芥和超表达KcHTR4基因的转基因拟南芥置于40℃高温处理，图4示出了野生型拟南芥和转基因拟南芥随高温处理时间的延长其地上部分表型变化图，同一盆内左侧为野生型拟南芥，右侧为超表达KcHTR4转基因拟南芥。可以看到，野生型拟南芥在面对40℃高温胁迫处理30min时出现了叶器官和茎器官轻微发紫的现象，而超表达KcHTR4转基因拟南芥仍然处于正常生理状态，说明在拟南芥中超表达KcHTR4基因增强了拟南芥的高温耐受性。
进一步取高温处理0-480min的拟南芥植株，测定过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量，其中，MDA鲜重含量的检测采用索莱宝微量法丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(货号BC0025)，SOD活性的检测采用索莱宝微量法超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(货号BC0175)，POD活性的检测采用索莱宝微量法过氧化物酶(POD)检测试剂盒(货号BC0095)，CAT活性的检测采用索莱宝微量法过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(货号BC0205)，结果见图5。在高温胁迫下，机体应激产生大量的自由基，当体内活性氧自由基(ROS)的产生大于消耗，形成脂质过氧化的产物，将导致MDA显著升高，并对植物产生高温氧化损伤；在正常状态下，POD、SOD和CAT等酶具有清除氧自由基，降低机体过氧化物水平的作用。野生型拟南芥与超表达KcHTR4转基因拟南芥在遭受40℃高温胁迫处理前，二者体内CAT、POD、SOD的活性和MDA的含量相近，无显著性差异；随着高温胁迫时间的增加，CAT、POD和SOD的活性总体均呈现增加的趋势，MDA的含量总体呈现下降的趋势，但超表达KcHTR4转基因拟南芥CAT、POD和SOD的活性显著高于野生型拟南芥，MDA的含量显著低于野生型拟南芥，说明超表达KcHTR4基因的转基因拟南芥能够更快地激活机体的氧化防御能力，抵抗高温带来的氧化应激损伤，其耐高温能力优于野生型拟南芥。在处理30min和240min过表达KcHTR4的SOD活性与野生型拟南芥无显著性差异，故推测KcHTR4主要通过提高CAT和POD的活性、减少对MDA的积累来响应高温胁迫时的ROS信号和氧化应激反应。
6.2、拟南芥苗期低温处理下抗逆性能力分析
将野生型拟南芥和超表达KcHTR4基因的转基因拟南芥置于4℃低温处理，图6示出了野生型拟南芥和转基因拟南芥随低温处理时间的延长其地上部分表型变化图，同一盆内左侧为野生型拟南芥，右侧为KcHTR4转基因拟南芥。可以看到，野生型拟南芥在面对4℃低温胁迫处理120min时出现了叶器官和茎器官轻微发紫的现象，仍然处于正常生理状态，说明在拟南芥中超表达KcHTR4基因增强了拟南芥的低温耐受性。
进一步取低温处理0-480min的拟南芥植株，测定POD、SOD、CAT活性和MDA含量，结果见图7。野生型拟南芥与超表达KcHTR4转基因拟南芥在遭受4℃低温胁迫前，植株体内CAT、POD、SOD的活性和MDA的含量几乎一致无显著性差异，随着低温胁迫时间的延长，二者体内的CAT、POD和SOD的活性总体呈现增加的趋势，MDA的含量总体呈现下降的趋势，但超表达KcHTR4转基因拟南芥CAT、POD和SOD的活性显著高于野生型拟南芥，MDA的含量显著低于野生型拟南芥，与高温胁迫趋势相同，说明超表达KcHTR4的转基因拟南芥的耐低温能力同样优于野生型拟南芥。但在处理30min时过表达KcHTR4的CAT活性与野生型拟南芥无显著性差异，故推测KcHTR4主要通过提高SOD和POD的活性、减少对MDA的积累来响应低温胁迫时的ROS信号和氧化应激反应。
以上结果说明花花柴KcHTR4基因具有提高植物耐极端温度的能力，利用超表达该基因还可用于包括棉花、油菜、水稻、小麦、大豆、玉米等植物耐极端温度品系的培育。
上述拟南芥正常生长培养基配方：5mM KNO3、2mM MgSO4、2mM Ca(NO3)2、l mMKH2PO4、1.5mM KCl、70μM H3BO3、14μM MnCl2、1μM ZnSO4、0.5μM CuSO4、10μM NaCl、0.2μMNa2MoO4、40μM Fe-EDTA和10g/L蔗糖，pH5.7，固体培养架添加8g/L Agar。
7、转基因微生物对环境胁迫抗性分析
KcHTR4基因微生物超量表达载体pET28a-KcHTR4的构建：对扩增得到的所述KcHTR4基因和利用质粒提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司，中国)提取pET-28a空载体质粒，将质粒利用Bam HⅠ-HindⅢ进行双酶切，KcHTR4和pET28a双酶切产物利用T4 DNA连接酶37℃定向连接30min后，连接产物热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，然后均匀涂布在含有硫酸卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上，37℃培养16h后，挑取单菌落在含有硫酸卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，37℃、190r/min震荡培养6h，进行菌液PCR筛选阳性菌落，构建成功的KcHTR4基因微生物超量表达载体命名为pET28a-KcHTR4。
转基因大肠杆菌BL21的构建：提取pET28a-KcHTR4质粒后利用热激法转化至大肠杆菌BL21后，然后均匀涂布在含有硫酸卡那霉素(50mg/L)的LB固体培养基上，37℃培养16h后，挑取单菌落在含有硫酸卡那霉素(50mg/L)的LB液体培养基中，37℃、190r/min震荡培养6h，进行菌液PCR筛选阳性菌落。
将成功超表达KcHTR4基因的大肠杆菌分别置于45℃高温、4℃低温和0.1-0.3mol/L的NaCl盐溶液中处理一段时间，具体操作如下：1)耐极端温度分析：在诱导转基因大肠杆菌BL21表达KcHTR4蛋白后，用含有卡那霉素的液体LB培养基分别稀释成10-1、10-2、10-3三个梯度，取各梯度菌液2μL，点在含有硫酸卡那霉素(浓度50mg/L)的LB固体培养基上，将平板分别放置在45℃高温和4℃低温胁迫处理48h，之后放置于37℃正常培养16h，拍照观察菌落生长状态。2)耐盐分析：在诱导转基因大肠杆菌BL21表达KcHTR4蛋白后，用含有卡那霉素的液体LB培养基分别稀释成10-1、10-2、10-3三个梯度，取各梯度菌液2μL，分别点在含有0.1mol/L、0.2mol/L、0.3mol/L的NaCl和硫酸卡那霉素(浓度50mg/L)的LB固体培养基上，后放置于37℃正常培养16h，拍照观察菌落生长状态。前述实验以转化pET28a载体(不携带KcHTR4基因)的大肠杆菌为对照组。
菌落形成率计算：无胁迫处理的野生型大肠杆菌和转基因大肠杆菌于37℃培养4h，稀释涂布计算菌落数(对照)，胁迫处理的2组菌株在胁迫条件下生长4h后，稀释涂布计算菌落数，根据胁迫处理前后的菌落数计算不同菌株的菌落形成率，计算方法如下：菌落形成率％＝胁迫生长菌落数/对照生长菌落数×100。
图8示出了不同环境胁迫处理48h后转化KcHTR4基因的大肠杆菌(用pET28a-KcHTR4表示)和未转化KcHTR4基因的大肠杆菌(用pET28a表示)的菌落形成情况，其中，图a-f分别表示未胁迫、45℃、4℃、0.3mol/L NaCl、0.2mol/L NaCl和0.1mol/L NaCl胁迫处理。图9示出了不同环境胁迫处理4h后转化KcHTR4基因的大肠杆菌(用pET28a-KcHTR4表示)和未转化KcHTR4基因的大肠杆菌(用pET28a表示)的菌落形成率。从图中可以看出，在无胁迫处理时转基因大肠杆菌均能够正常的生长，且生长趋势一致，但转化KcHTR4基因的大肠杆菌在45℃高温胁迫、4℃低温胁迫、0.1mol/L NaCl、0.2mol/L NaCl盐胁迫的生长状态和菌落生长率均优于未转化组，表明超表达KcHTR4基因能够显著提高细菌在逆境下的存活率，增强其耐高温性、耐低温性和耐盐性等耐受逆境胁迫能力。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述非生物胁迫为高温胁迫、低温胁迫和盐胁迫中的至少一种，其中，所述KcHTR4基因的cDNA序列如SEQID NO.1所示，或者所述KcHTR4基因编码的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。
2.如权利要求1所述的KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述非生物胁迫包括高温胁迫，所述高温胁迫的温度不高于45℃。
3.如权利要求1所述的KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述非生物胁迫包括低温胁迫，所述低温胁迫的温度不低于4℃。
4.如权利要求1所述的KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述非生物胁迫包括盐胁迫，所述盐胁迫的盐浓度为0-0.2M。
5.如权利要求1所述的KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：
构建KcHTR4基因超表达载体，转化野生型生物体，培养获得KcHTR4基因表达量提高的转基因生物体。
6.如权利要求5所述的KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，其特征在于，构建所述KcHTR4基因超表达载体包括以下步骤：
构建所述KcHTR4基因超表达载体包括以下步骤：采用SEQ ID NO.7-8所示的引物对扩增KcHTR4基因，将扩增得到的所述KcHTR4基因通过BP-LR反应连接至植物表达载体pK2GW7上，得到KcHTR4基因植物超表达载体；
或者，采用SEQ ID NO.3-4所示的引物对扩增KcHTR4基因，通过酶切酶连反应将扩增得到的所述KcHTR4基因连接至原核表达载体pET-28a上，得到KcHTR4基因微生物超表达载体。
7.如权利要求6所述的KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述KcHTR4基因植物超表达载体的构建方法包括：
采用SEQ ID NO.7-8所示的引物对扩增KcHTR4基因，通过BP反应将扩增得到的所述KcHTR4基因连接至pDONRTM221载体上，之后通过LR反应将所述pDONRTM221载体上的所述KcHTR4基因产物连接至植物表达载体pK2GW7上，得到所述KcHTR4基因植物超表达载体。
8.如权利要求6所述的KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述KcHTR4基因微生物超表达载体的构建方法包括：
采用SEQ ID NO.3-4所示的引物对扩增KcHTR4基因，通过Bam HⅠ和HindⅢ限制性内切酶对扩增得到的所述KcHTR4基因和原核表达载体pET-28a进行双酶切反应，之后将双酶切产物利用T4 DNA连接酶连接，得到所述KcHTR4基因微生物超表达载体。
9.如权利要求5所述的KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述转化方法选自Ti质粒转化法、Ri质粒转化法、病毒载体转化法、基因枪法、显微注射法、电穿孔法或农杆菌介导法。
10.如权利要求1所述的KcHTR4基因在增强生物体非生物胁迫耐受性中的应用，其特征在于，所述生物体为植物或微生物；其中，所述植物选自拟南芥、棉花、油菜、水稻、小麦、大豆或玉米，所述微生物选自细菌。
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