CN117659150A

CN117659150A - 热响应KcRCB蛋白及其编码基因和在增强植物抗高温胁迫中的应用

Info

Publication number: CN117659150A
Application number: CN202311738166.9A
Authority: CN
Inventors: 王彦芹; 黄婉夷; 王鹤萌; 赵沿海; 陆忻子墨; 李文龙
Original assignee: Tarim University
Current assignee: Tarim University
Priority date: 2023-12-18
Filing date: 2023-12-18
Publication date: 2024-03-08

Abstract

本发明属于分子生物学育种技术领域，尤其涉及一种热响应KcRCB蛋白及其编码基因和在增强植物抗高温胁迫中的应用。所述KcRCB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的热响应KcRCB基因及其编码蛋白与花花柴耐高温性能相关，过表达KcRCB基因的转基因植物具有增强的对高温胁迫的耐受性，能够改善和提高植物对高温胁迫和氧化应激损伤应答能力，在高温频发的环境中有利于稳定或提高植物的产量和品质，此外，对拓展作物扩展作物可栽培地域、有效利用可耕地资源价值重大，具有广阔的应用前景和良好的经济效益。

Description

热响应KcRCB蛋白及其编码基因和在增强植物抗高温胁迫中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学育种技术领域，特别涉及一种热响应KcRCB蛋白及其编码基因和在增强植物抗高温胁迫中的应用。

背景技术

植物作为固着生长的生物无法改变自身的生存环境，在其生长、发育过程中，除了受到病虫等生物因素的侵袭外，也常常受到不良环境因素的影响，而使产量和品质受到影响，这种不良影响称为环境胁迫或非生物胁迫。随着全球变暖，全球极端气候出现频率逐渐增大，植物所经受的高温胁迫会越来越频繁。高温胁迫将不同程度地影响着细胞中各种蛋白、膜系统、RNA的种类、细胞骨架结构、酶促反应效率的稳定性等，代谢稳态的打破可能导致毒素如活性氧(reactive oxygen specie，ROS)的积累，继而损伤细胞，干扰其体内正常的分子调节机制，对植物造成不可逆的损伤，并对植物的生长和生产力产生不利影响。此外，研究发现植物在生殖生长阶段对高温更加敏感，而花粉作为植物的雄配子体，比雌配子体更易受到高温影响，通常在高于最适温度5℃的环境中，花粉即会遭受高温胁迫，出现发育异常、育性下降，这是导致粮食作物减产的直接原因。许多重要农作物，如小麦、水稻和玉米，其开花期多集中在夏季，极易受到高温天气影响。因而提高农作物对高温的抗性是生产中亟待解决的重要问题。

植物在长期的进化过程中发展出一系列复杂的防御机制应对外界多变的环境。植物对高温的反应过程以及耐受机制是一个复杂的生物学过程，通常与信号分子和具有保护功能的蛋白有关，在细胞代谢、植物或其他组织中通过重新调整其转录组、蛋白组、代谢组和脂质来对环境温度的改变做出响应进而应对高温对其产生的胁迫，如耐热相关的蛋白可保护植物中其他蛋白免遭损伤，修复已损伤的蛋白；抗氧化酶系统清除活性氧ROS的能力，避免细胞及其膜系统受到伤害。研究植物对高温胁迫的自我适应与抵抗调控机制，明确其对高温胁迫的反馈机制，可为发掘并利用耐高温的植物资源奠定一定的分子基础，是缓解由高温导致的植物生长发育受阻及产量下降的热点研究方向。

目前，针对高温热害，在生产上采取的主要措施是进行抗高温特性的研究，以选育得到耐热品种，但自然条件下筛选的不同耐热品种之间因生长阶段和气候条件的不同，其性能存在很大差异，限制了其推广应用。基于基因工程育种技术，研究植物对高温胁迫响应的机理，鉴定高温胁迫条件下的热响应相关基因，并将其应用到农作物育种中去，是增强农作物抗逆性和选育耐热品种经济而有效的措施。但迄今为止，在基因水平层面对热响应基因的克隆、功能鉴定及表达调控等方面研究较少，开发和寻找新的非生物胁迫下的热响应相关基因，对于高效培育和/或快速筛选耐热植物品种具有重要意义，对耐热优良品种的育种产生的巨大经济效益。

发明内容

针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种热响应KcRCB蛋白及其编码基因，并提供了该基因或蛋白在增强植物抗高温胁迫中的应用，过表达KcRCB基因的转基因植物具有增强的对高温胁迫的耐受性，能够改善和提高植物对高温胁迫和氧化应激损伤应答能力，在高温频发的环境中有利于稳定或提高植物的产量和品质，此外，对拓展作物扩展作物可栽培地域、有效利用可耕地资源价值重大，具有广阔的应用前景和良好的经济效益。

本发明具体通过以下技术方案实现：

本发明第一方面提供了一种热响应KcRCB蛋白，所述KcRCB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明第二方面提供了一种编码基因，所述编码基因编码如上所述的KcRCB蛋白，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明第三方面提供了如上所述的热响应KcRCB蛋白或其编码基因在增强植物抗高温胁迫中的应用。

进一步地，所述应用包括以下步骤：构建KcRCB基因超表达载体，转化野生型植物，培养获得KcRCB基因表达量提高的转基因植物；其中，所述KcRCB基因的核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

进一步地，构建所述KcRCB基因超表达载体包括以下步骤：采用如SEQ ID NO.5-6所示的引物对扩增KcRCB基因，将扩增得到的所述KcRCB基因通过BP-LR反应连接至植物表达载体pK2GW7上，得到所述KcRCB基因超表达载体。

更进一步地，构建所述KcRCB基因超表达载体包括以下步骤：采用如SEQ ID NO.5-6所示的引物对扩增KcRCB基因，通过BP反应将扩增得到的所述KcRCB基因连接至pDONR^TM221载体上，之后通过LR反应将所述pDONR^TM221载体上的所述KcRCB基因连接至植物表达载体pK2GW7上，得到所述KcRCB基因超表达载体。

进一步地，将所述KcRCB基因超表达载体转化所述野生型植物的方法选自磷酸钙共沉淀法、Ti质粒法、Ri质粒法、病毒载体法、基因枪法、显微注射法、电穿孔法或农杆菌介导法。

进一步地，所述高温胁迫的温度不高于45℃。

进一步地，所述植物选自拟南芥、棉花、油菜、水稻、小麦、大豆或玉米。

更进一步地，所述植物选自拟南芥。

本发明的优点及积极效果为：

本发明提供的热响应KcRCB蛋白及其编码基因—KcRCB基因与花花柴耐高温性能相关，将其在模式植物拟南芥中进行过表达，发现该基因能够显著提高植物体内活性氧清除系统中多个酶如过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性，并降低叶片膜损伤和电解质泄漏情况，具有改善和提高植物对高温胁迫和氧化应激损伤应答能力的作用。因此，本发明的KcRCB基因及KcRCB蛋白为高效培育高温胁迫耐受性强的农作物新种质提供了优良的基因资源和新的解决方案，过表达该基因可改善植物的高温胁迫耐受能力，在高温频发的环境中有利于稳定或提高植物的产量和品质，此外，对拓展作物扩展作物可栽培地域、有效利用可耕地资源价值重大，具有广阔的应用前景和良好的经济效益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例KcRCB蛋白的系统发育树；

图2为本发明实施例KcRCB蛋白和其他物种蛋白序列比对图；

图3为本发明实施例花花柴在45℃高温胁迫处理下的KcRCB表达模式分析；

图4为本发明实施例KcRCB基因植物超量表达载体的图谱；

图5为本发明实施例野生型拟南芥和转基因拟南芥在高温胁迫前后其地上部分表型随时间变化图，其中，图a为高温胁迫前，图b为高温胁迫后；

图6为本发明实施例野生型拟南芥和转基因拟南芥在高温胁迫前后、叶片相对电导率随时间变化图；

图7为本发明实施例野生型拟南芥和转基因拟南芥在高温胁迫前后，叶片过氧化氢酶活性随时间变化图；

图8为本发明实施例野生型拟南芥和转基因拟南芥在高温胁迫前后、叶片过氧化物酶活性随时间变化图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。

为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。术语“大约”具有其通常的含义，用于表示一个值包括用于确定该值的设备或方法的误差的固有变化，或包含接近所述值的值，例如在所述值(或值的范围)的10％之内。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。

另外，需要说明的是，除非另外定义，在本发明的上下文中，使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。术语“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为包含以下情形：(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。

术语“基因”是产生一条多肽链或功能RNA所需的全部核苷酸序列。因此，基因的表达包括转录和衍生自基因的编码RNA(mRNA)或功能RNA的稳定积聚，也可指将mRNA翻译成多肽或蛋白。基因可以包含数种可操作地连接的核酸片段，例如5’非编码区(UntranslatedRegions，UTR)、编码区和包含聚腺苷酸化位点的3’非编码区。一般非编码区是指不能够转录mRNA的区域，具有基因表达的调控功能，如启动子和终止子。编码区是指能够转录成mRNA的部分，包括外显子和内含子，外显子具有必要的密码子或蛋白质合成所需的信息。内含子是基因内的非编码序列，在mRNA成熟期间通过RNA剪接去除。

术语“信使RNA(mRNA)”指可以由生物体翻译成蛋白质的RNA，成熟mRNA的主体序列是编码序列(编码区)，在其上游5’侧和下游3'侧有非编码区。

术语“cDNA”是指经过逆转录后与RNA分子(如mRNA)反向互补的DNA分子(第一链cDNA)或具有与RNA分子相同的序列除了U是T的DNA分子(第二链cDNA)。cDNA没有内含子而只有外显子的序列。

术语“载体”是指将外源目的基因转移至宿主生物体内的一种能自我复制的DNA分子，并且常常是环状双链DNA分子的形式，含有目的基因的载体即为重组载体。典型载体包括质粒、病毒、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，因此，在本发明的上下文中，质粒和载体可以互换使用。

术语“表达载体”允许插入到载体的外源目的基因在宿主生物体中表达，将表达载体导入适当的宿主生物体中，能够表达插入的目的基因(例如本发明的KcRCB基因)。

术语“导入”或“转入”指目的基因核酸分子(如含有KcRCB基因的超表达载体)向宿主生物体内的转移，导致基因稳定的遗传。导入的核酸分子可以是宿主生物体中保留的质粒形式，或者可以被整合进宿主生物体基因组中。含有导入基因的宿主生物体被称为“转基因”或“重组”或“转化”生物体或“工程”生物体。表达载体导入宿主生物体可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。

术语“过量表达”、“过表达”或“超量表达”、“超表达”等类似词语是指基因的表达水平超过正常的表达水平。在较佳的实施方式中，基因的表达水平比正常情况下的表达水平高至少10％、20％、50％、100％(2倍)、200％(3倍)、300％(4倍)，甚至更多倍。在本发明中，过表达或超表达是相对于野生型植株或野生物菌株而言的。

通常情况下，比较C_t值法是研究基因表达产物含量最常用的方法，定量结果由目的基因和内参基因C_t值之间的差值(△C_t)来反映，属于相对定量，计算相对表达量的方法采用公式2^-ΔΔC_t计算。术语“C_t”或“C_t值”是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。每个样品模板的C_t值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，C_t值越小。

术语“环境胁迫”或“非生物胁迫”具有相同含义，显著偏离于生物体适宜生存的环境因素统称为环境胁迫，通常包括低温、高温、高盐、干旱等胁迫因子。当环境温度超出了植物等生物体所能适应的温度范围并持续一段时间，表现出对植物产生不利效应，如抑制植物生长活动或威胁植物生存，即对植物形成温度胁迫；温度胁迫包括高温胁迫和低温胁迫，短时间或长时间的高温或低温胁迫都会引起一系列生理生化的改变，包括光合作用、水分代谢、内源激素的水平、初生及次生代谢产物的水平等，从而影响植物的生长发育过程；例如，绝大部分植物的适宜生存温度为15-30℃，植物处于温度超过30℃或低于15℃的环境中一段时间，即会受到温度胁迫的影响，高温胁迫过长植物会遭受热害，低温胁迫过长植物会受到冷害或者冻害，如起源于热带的喜温植物水稻、番茄和黄瓜等在10-12℃就会发生冷害。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。

花花柴(Karelinia caspica)是菊科花花柴属多年生草本植物，多大片群生于戈壁、沙漠、高盐碱草甸等恶劣环境中(中国植物志，第七十五卷，科学出版社，1979年9月，第一版，P54-55)，其叶片扁平且明显肉质化，体内有发达的储水组织，因此保水能力强，并具有较低的萎蔫系数，具有耐极端温度、耐盐碱、耐干旱等广谱抗逆性，是极为宝贵的逆境耐受性强的天然植物资源，因此，花花柴常作为开展植物逆境胁迫研究和抗逆性基因筛选的候选材料。然而，目前对于花花柴抗逆性基因研究报道较少，仅克隆到少量的非生物胁迫相关基因，因此，从花花柴中分离新的耐高温相关的基因并加以功能验证，再应用于有经济价值的作物等仍具有广泛的价值，这不仅可为花花柴对高温响应的分子机理研究提供理论基础，也可为耐高温育种提供新的优良基因资源。

本发明从前期得到的花花柴转录组数据库中发现一个与莴苣MRL7蛋白同源的基因，其在高温胁迫下表达量呈现上调表达，表明该基因积极参与花花柴的高温胁迫应答，与花花柴耐高温性能相关，在其逆境响应中发挥着重要作用。前述基因包含功能蛋白完整编码区段的cDNA片段长度为1005bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，开放阅读框编码334个氨基酸残基的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。对该cDNA片段编码的蛋白序列进行比对和系统发育树分析，显示它与莴苣MRL7类蛋白(NCBI登录号为：XP_023743380.1)具有较高的同源性，相似性达到82.49％，因此命名为KcRCB基因。RCB蛋白为叶绿体生物发生调节因子(regulator of chloro plast biogenesis，RCB)，也称MRL7(一种硫氧还蛋白)，现有研究证实RCB能与HMR(HEMERA)协同作用，通过在白天选择性地稳定PIF4(phytochromeinteracting factor 4，PIF4)来参与植物热形态发生。

通过在模式植物拟南芥中过表达KcRCB基因，显示过表达KcRCB基因的转基因拟南芥的存活率得到提高，检测结果显示，与野生型拟南芥相比，其叶片膜损伤和电解质泄漏情况显著降低，而且显著提高了植株体内活性氧清除系统中多个酶如过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性，这表明该基因具有改善和提高植物对高温胁迫和氧化应激损伤应答能力的作用，能够明显增强植物的耐高温性能。

基于上述发现，本发明一实施例提供了一种热响应KcRCB蛋白，所述KcRCB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明又一实施例提供了一种编码基因，所述编码基因用于编码如上所述的KcRCB蛋白，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明另一实施例提供了一种如上所述的KcRCB蛋白或其编码基因在增强植物抗高温胁迫中的应用。

本发明提供的KcRCB蛋白及其编码基因—KcRCB基因与植物高温耐受能力密切相关，在提高植物高温抗性中发挥关键性作用，为高效培育高温胁迫耐受性强的农作物新种质提供了优良的基因资源和新的解决方案，将其应用于植物基因工程育种中，过表达该基因可改善植物对高温胁迫的抵抗能力，在高温频发的环境中有利于稳定或提高植物的产量和品质，此外，对拓展作物扩展作物可栽培地域、有效利用可耕地资源价值重大，具有广阔的应用前景和良好的经济效益。

可选地，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，包括但不限于：拟南芥、棉花、油菜、水稻、小麦、大豆和玉米；优选为拟南芥。

可选地，所述高温胁迫的温度不高于45℃(包括本数45℃)。以拟南芥为例，拟南芥喜湿润的环境，其适宜生长的温度为21-25℃，能忍受34℃的高温，但是会影响植株的生长，对其而言，高温胁迫的温度可以为34-45℃。

具体地，上述所述的KcRCB蛋白或其编码基因在增强植物抗高温胁迫中的应用，包括以下步骤：构建KcRCB基因超表达载体，转化野生型植物，培养获得KcRCB基因表达量提高的转基因植物。由此获得的转基因植物具有提高的高温胁迫耐受能力，能够拓宽对高温的适应范围，大大增强高温抗逆性。

构建所述超表达载体的原始载体为本领域常规的各种表达载体，只要其能够容载KcRCB基因即可。典型载体包括质粒、病毒载体、噬菌体、黏粒和微型染色体。质粒是最常见的载体形式，因此，在本发明的上下文中，载体与质粒可互换使用。表达载体包含在指定生物体细胞中表达的调控元件，如启动子，启动子可以为强启动子、特异启动子或诱导型启动子，位于KcRCB基因的转录起始核苷酸上游，也可使用增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子和邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证KcRCB基因的翻译。前述的载体和载体所含表达调控元件的选择取决于用于导入KcRCB基因的宿主生物体的类型。当生物体为植物时，表达载体选择植物表达载体，示例性地，可以选择pK2GW7载体。

具体地，构建KcRCB基因超表达载体包括以下步骤：采用SEQ ID NO.5-6所示的引物对扩增KcRCB基因，将扩增得到的KcRCB基因通过BP-LR反应连接至植物表达载体pK2GW7上，得到KcRCB基因超表达载体。

更具体地，构建KcRCB基因超表达载体包括以下步骤：采用SEQ ID NO.5-6所示的引物对扩增KcRCB基因，通过BP反应将扩增得到的KcRCB基因连接至pDONR^TM221载体上，之后通过LR反应将pDONR^TM221载体上的KcRCB基因产物连接至植物表达载体pK2GW7上，得到KcRCB基因超表达载体。

表达载体转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是植物，携带有KcRCB基因的表超达载体可通过使用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、Ti质粒法、Ri质粒法、病毒载体法、基因枪法、显微注射法、电穿孔法或农杆菌介导法等转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株，具体操作可参见：Weissbach,1998,Methodfor Plant Molecular Biology VIII,Academy Press,New York,pp.411-463；Geisersonand Corey,1998,Plant Molecular Biology(2nd Edition)。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。

实施例

1、花花柴KcRCB基因的发现与克隆

本发明基于前期从花花柴转录组数据库中发现与莴苣硫氧还蛋白同源的基因在高温胁迫下呈现上调表达，于是从野生的花花柴中克隆到该基因并命名为KcRCB，通过提取高温45℃处理0min、5min、30min、120min、240min的室内栽培花花柴的cDNA进行表达模式分析，得出该基因在叶片中确实有较强的耐高温能力。该基因积极参与花花柴的高温胁迫应答，与花花柴耐高温性能相关，在其逆境响应中发挥者重要作用。其中，花花柴种质资源来源于塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，2009年10月采自中国新疆阿拉尔市。具体操作如下：

花花柴叶片的总RNA提取及基因组cDNA的获得：采用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号DP441)，利用反转录酶One-Step gDNARem oval and cDNASynthesis SuperMix(购自全氏金公司(北京)，货号AE311-03)将其反转录合成cDNA，反应条件为：45℃、30min，之后85℃、5s。

花花柴KcRCB基因全长序列的获得：根据转录组序列设计特异性扩增引物KcRCB-F和KcRCB-R。以花花柴的cDNA为模板利用PCR技术扩增KcRCB的ORF，PCR条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。将扩增获得的PCR产物连入pMD-19T载体(购自TAKARA公司，中国，货号3271)，构建成功的质粒命名为pMD-19T-KcRCB，筛选阳性克隆并测序，KcRCB基因全长1005bp，进一步对测序所得序列通过ORFFinder在线工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)对获得的cDNA进行分析，确定包含一个完整的ORF，编码334个氨基酸。本实施例所得KcRCB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

KcRCB基因的核苷酸序列如下所示：

atggccttaaaccctaaccttcattttcactcttttccctcgttatccacgcacaacaatacgattagttaccctgtttctatcctaaagattgattacatccctcgtcgtcgaattctacttgcagtttccaaagattccgatgtaagctttgaagatgatagaaagcccagaaaaaatcccaaatctagaagaaaatccgggcatgaaacttctgaaaatttgaatatagaagaagaaaaacccttcccatctacgattcctagaaaacctagacgtggtaggagaagcgaagcagctgcggtcgaagatttcatgcggagttcattagaggagacgtttgcggccattcgcgagcagaatgccgaggttttgaaaggtaaggagaatgtaatgaaggatagaattcatgacgatgaagatggcgatgatgatgatgacgacgatgatgataagaagaagaagggaatggtggtggaagaagaagatccaaattggccggtggatgctgaggtggagtggggaattagggcttctgagtatttcgaaaaacatccaatcaagaatgtaattggggacgatggtgttgagattgattgggaaggtgaattagatgataatttggtgaaggagatcaactgtttggagtgggaaagctttgcttttcatcctagtccactgatcgtgctcgttttcgaaagatacaatcgggcaagtgataattggagggccttaaaggaattagagaaggctgctaaggtgtactggagtgcaaaagatcggctgccacctcggacggtcaaacttgatatgaacattgagacagaccttgcgtatgcacttaaagttcgggaatgcccacagcttttgtttttacgaggaaacagaatcatttatcgggaacaacaaattcgaaaagcagatgagttggtgcagatgatagcacatttttactacaaagccaaaaaaccttcatggatgaaagatgcaaaattgtattcataa(见SEQ ID NO.1)。

KcRCB基因编码的蛋白序列如下所示：

MALNPNLHFHSFPSLSTHNNTISYPVSILKIDYIPRRRILLAVSKDSDVSFEDDRKPRKNPKSRRKSGHETSENLNIEEEKPFPSTIPRKPRRGRRSEAAAVEDFMRSSLEETFAAIREQNAEVLKGKENVMKDRIHDDEDGDDDDDDDDDKKKKGMVVEEEDPNWPVDAEVGWGIRASEYFEKHPIKNVIGDDGVEIDWEGELDDNLVKEINCLEWESFAFHPSPLIVLVFERYNRASDNWRALKELEKAAKVYWSAKDRLPPRTVKLDMNIETDLAYALKVRECPQLLFLRGNRIIYRDQQIRKADELVQMIAHFYYKAKKPSWMKDAKLYS(见SEQ ID NO.2)。

KcRCB-F和KcRCB-R引物序列(5′-3′)如下所示：

KcRCB-F：GGGTTTGAACCCTTGCAA(见SEQ ID NO.3)；

KcRCB-R：AATTCGAAGCAGAAAATATTCTTACTATATAAAATAT(见SEQ ID NO.4)。

通过MEGA11.0软件和NCBI在线比对工具BlastX(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)进行序列分析，图1示出了KcRCB蛋白系统发育进化树，图2示出了KcRCB蛋白和其他物种蛋白序列比对图，最终确定ORF所对应的334个氨基酸的蛋白质序列与莴苣MRL7类蛋白(NCBI登录号为：XP_023743380.1)相似性最高，具有82.49％的同源性，同时与其亲缘关系最近，因此将前述基因命名为KcRCB基因。

2、高温胁迫处理下KcRCB基因在花花柴中的表达模式分析

选择室内培养正常生长的花花柴植株在45℃处理0min、5min、30min、120min、240min，并分别从根(Root)、茎(Steam)和叶(Leaf)中提取RNA，RNA的抽提方法采用天根RNA提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号DP201101X)。RNA完整性通过1.2％(w/v)琼脂糖胶电泳检测(5V/cm)。通过Beckman DU800 spectrophotometer(BECKMAN公司，美国)仪器测定RNA浓度，RNA 260/280比值在1.9到2.1之间，260/230比值大于2.0的RNA样品用于下一步的分析。利用反转录酶(购自全式金公司，中国，货号AE311-03)将其反转录合成cDNA。每份cDNA稀释到300μL后-20℃保存待用。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物KcRCB-F和KcRCB-R对KcRCB基因进行特异的PCR扩增，同时用花花柴18s rRNA基因作为内参基因，采用18s-F和18s-R做特异扩增(扩增产物长250bp)。PCR反应体系的总体积为20μL，DNA模板1μL(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCl₂ 1.2μL、2mM dNTP 1.5μL、10μM引物0.2μL、0.3单位Taq酶，加ddH₂O至20μL。反应程序为：94℃变性5min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，30cycles，72℃延伸5min。获得的PCR产物取10μL以0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3。

18s rRNA基因的引物序列如下所示：

18s-f：5'-CGGCTACCACATCCAAGGAAGG-3'(见SEQ ID NO.7)；

18s-r：5'-CACCAGACTTGCCCTCCAATGG-3'(见SEQ ID NO.8)。

如图3所示，在45℃胁迫处理下，花花柴KcRCB基因在叶中表达量明显比未处理高，表达量整体呈现高低高的趋势，在处理30min时，叶片的表达量最高，这可能是植物对突然升温产生的应激反应，促使该点的表达量升高很快。随后表达量降低再升高，说明了花花柴KcRCB在适应这种高温胁迫环境并做出相应的反应，从而表明KcRCB对高温具有一定的耐受能力，与花花柴耐高温性能相关。

3、KcRCB基因超表达载体的构建

根据测序得到的KcRCB基因核苷酸序列(见SEQ ID NO.1)设计引物(KcRCBBP-F和KcRCBBP-R)用于构建表达载体，在引物两端分别加上BP-LR反应的接头碱基，以pMD-19T-KcRCB质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸10min，经PCR扩增得到包含完整ORF的PCR产物。PCR产物经BP反应连接至pDONR^TM221载体上(BP酶和pDONR^TM221载体购自Invitrogen公司，美国，货号11789-100)，25℃孵育4h后转化大肠杆菌感受态细胞DH5α感受态细胞，以KcRCB基因的特异性引物进行PCR检测来挑取阳性克隆，并活化提取质粒。PCR反应条件同前。再用LR反应将KcRCB基因连接至植物表达载体pK2GW7(华中农业大学惠赠，LR酶购自Invitrogen公司，美国，货号11791-100)，25℃孵育4h后，反应产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取阳性克隆并活化提取质粒，成功插入KcRCB基因的超表达载体命名为p35s-KcRCB，其载体图谱见图3。阳性克隆为携带超量表达质粒p35s-KcRCB的大肠杆菌菌株。

KcRCBBP-F和KcRCBBP-R引物序列(5'-3')如下所示：

KcRCBBP-F：ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttcgggtttgaacccttgcaa(见SEQ IDNO.5)；

KcRCBBP-R：ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcaattcgaagcagaaaatattcttactatataaaatat(见SEQ ID NO.6)。

将构建的p35s-KcRCB载体转化农杆菌菌株GV3101，转化方法参见文献“Hellens RP,Mullineaux P,Klee H.A guide to Agrobacterium binary Ti vectors[J].Trends inPlant Science,2000,5(10):446-451.”，挑取单菌落接于含20mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，于150rpm、26℃摇床培养48h，按菌液和甘油体积比为1：1加入1.5mL离心管混匀，-80℃保存，再通过农杆菌介导的转化方法转化拟南芥。

4、KcRCB基因的遗传转化及超表达KcRCB基因的转基因植物的筛选鉴定

拟南芥的准备：野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana L.Columbia ecotype)种子经过春化处理后点播营养土中，并放入人工培养室，按照16h光照、22±2℃条件培养至拟南芥长到4叶左右，之后定苗以控制拟南芥的生长密度。待拟南芥生长6周左右开始开花时即可转化，转化前一天给拟南芥浇足水。

农杆菌的活化：从超低温冰箱内取出保存的含有目标基因的GV3101菌株(购自天津擎科生物技术有限公司，货号TSC-A01)的甘油管在冰上融化，后于含20mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，28℃暗培养36-48h，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在加20mg/L利福平和50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，28℃、100rpm过夜培养，至OD₆₀₀＝0.8-1.0时即可用于转化；先将菌液转移到离心管中5000rpm离心5min，弃上清培养基。加入100mL浓度为5％(W/V)的蔗糖溶液，重悬农杆菌GV3101，在28℃摇床中复苏1-2h。加入表面活性剂0.02％(V/V)Silwet L-77，震荡摇混匀。

农杆菌介导转化拟南芥及转基因拟南芥的筛选：农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥的方法参考文献“Xiuren Z,Rossana H,Shih-Shun L,et al.Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method[J].Nature Protocol,2006,2(1):1-6.)。具体步骤如下：(1)将拟南芥花器浸入农杆菌悬液，并轻轻搅动约30s，用纸巾吸掉过多的菌液，并用黑色塑料袋将拟南芥植株包裹起来，保湿避光处理24h；(2)24h之后将塑料袋逐渐揭开透气，正常培养；(3)一个星期之后重复上述(1)的操作；(4)待种子成熟可以停止浇水并收获种子，即T₁代种子；(5)将收获的种子消毒：先用70％(V/V)乙醇浸泡1min，在上述处理时要不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次；(6)处理后的种子用0.1％(W/V)琼脂水溶液均匀涂布在含100mg/L卡那霉素的固体MS培养基表面；(7)4℃春化3d，移入培养室培养10d后，共选取具有卡那霉素抗性植株35株；(8)将35株转基因T₁代拟南芥植株移栽到土壤培养，待成熟后按单株收取种子，即T₂代种子；(9)将收取的T₂代种子按操作步骤(5)-(6)重复操作1次；(10)4℃春化3d，正常培养10d后计算具有卡那霉素抗性植株与非抗性植株的分离比，并进行统计分析；(11)符合抗性与非抗性植株的分离比为3：1的株系认为是单拷贝株系，移栽土壤培养，待成熟后按单株收取种子，即T₃代种子。

转基因拟南芥植株的纯系检测：将收取的T₃代种子采用上述步骤(5)-(6)操作1次；然后4℃春化3d，移入培养室培养10d后查看转基因植株在含100mg/L卡那霉素的固体MS培养基上是否发生抗性分离，不发生抗性分离的株系是转基因纯系T₄代种子，用作下一步表型分析和功能鉴定。

5、转基因拟南芥苗期高温胁迫处理下的表型分析

将转基因拟南芥(OE1至OE3)及野生型拟南芥(WT)点播于拟南芥专用营养土，并放入人工气候培养室，16小时光照、22±2℃条件培养，等拟南芥生长4周时于45℃高温处理4h。图5示出了野生型拟南芥和转基因拟南芥随高温处理时间的延长其地上部分表型变化图，图a为高温处理前，图b为高温处理后。可以看到，处理前，野生型植株叶器官小于转基因且野生型拟南芥在面对45℃高温胁迫处理4h时，植株出现了明显的热形态调整，具体表现为下胚轴和叶柄伸长以及茎生长和叶下垂，叶片卷曲，而超表达KcRCB基因的转基因拟南芥处于较为正常生理状态，叶片变化小于野生型，说明在拟南芥中超表达KcRCB基因增强了拟南芥的高温耐受性。

6、转基因拟南芥苗期高温胁迫处理下的生理生化指标分析

取长势相同的花花柴植株，进行45℃高温处理，每个处理三个重复。在45℃高温处理0min、5min、30min、120min、240min的时间点取样测过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的活性以及相对电导率。其中，相对电导率测定方法包括：取各时间点叶片1g放入10mL蒸馏水中静置12h后测定电导率R1，煮沸30min放凉摇匀后测定电导率R2，计算相对电导率(relative conductivity)＝(R1/R2)×100；CAT活性的检测采用索莱宝微量法过氧化氢酶(CAT)检测试剂盒(货号BC0205)；POD活性的检测采用索莱宝微量法过氧化物酶(POD)检测试剂盒(货号BC0095)。

图6-8分别示出了野生型拟南芥和超表达KcRCB的转基因拟南芥在高温胁迫前后，其叶片相对电导率、CAT和POD活性的变化情况。从图6中可以看到，在高温处理(0min)之前，两个转基因株系(OE-1和OE-2)与野生型拟南芥(WT)之间的叶片电解质泄漏(以相对电导率测量)没有显著差异，但随着高温胁迫时间的增加，各组相对电导率在5min时增加，在30min时下降，最后在120和240min时再次增加的趋势，说明叶片出现了一定程度的损伤，其中，两个转基因株系(OE-1和OE-2)的相对电导率含量始终较野生型低且具有统计学意义。由于相对电导率反映了膜损伤和电解质泄漏，值越高表示损伤越严重，可见超表达KcRCB的转基因拟南芥的电解质泄露和叶片损伤情况明显好于野生型拟南芥，更具有高温胁迫抗性。

过氧化氢酶(CAT)是一种抗氧化酶，存在于几乎所有生物中，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网和过氧化物酶体中。它是过氧化物酶体的一种标记酶，它大约占细胞器中所有酶的40％。CAT活性在一定程度上可以作为植物抵抗不同胁迫处理能力的一个指标。过氧化物酶(POD)也广泛存在于动物、植物和微生物中，并可以利用过氧化氢催化酚类和胺类化合物的氧化。由于POD可以消除有毒的过氧化氢、酚类和胺，其活性可以反映植物对各种不利条件的耐受能力。在高温胁迫下，机体应激产生大量的自由基，当体内活性氧自由基(ROS)的产生大于消耗，形成过氧化的产物，并对植物产生高温氧化损伤；在正常状态下，POD和CAT等抗氧化酶具有清除氧自由基，降低机体过氧化物水平的作用。从图7-8中可以看到，在整个热处理期间，各组酶活均整体呈现升高趋势，且上升和下降相似，但过表达KcRCB的转基因株系CAT活性和POD活性在所有时间点总是显著高于野生型，这表明过表达KcRCB基因有利于拟南芥更快激活氧化应激防御能力，这对降低高温造成的氧化损伤至关重要，具有更高的抗氧化能力，其耐高温能力优于野生型拟南芥。

以上结果说明花花柴KcRCB基因具有提高植物耐高温的能力，利用超表达该基因还可用于包括棉花、油菜、水稻、小麦、大豆、玉米等植物耐高温品系的培育。

上述拟南芥正常生长培养基配方：5mM KNO₃、2mM MgSO₄、2mM Ca(NO₃)₂、l mMKH₂PO₄、1.5mM KCl、70μM H₃BO₃、14μM MnCl₂、1μM ZnSO₄、0.5μM CuSO₄、10μM NaCl、0.2μMNa₂MoO₄、40μM Fe-EDTA和10g/L蔗糖，pH5.7，固体培养架添加8g/L Agar。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种热响应KcRCB蛋白，其特征在于，所述KcRCB蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码如权利要求1所述的KcRCB蛋白，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的热响应KcRCB蛋白或其编码基因在增强植物抗高温胁迫中的应用。

4.根据权利要求3所述的热响应KcRCB蛋白或其编码基因在增强植物抗高温胁迫中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：

构建KcRCB基因超表达载体，转化野生型植物，培养获得KcRCB基因表达量提高的转基因植物；其中，所述KcRCB基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.根据权利要求4所述的热响应KcRCB蛋白或其编码基因在增强植物抗高温胁迫中的应用，其特征在于，构建所述KcRCB基因超表达载体包括以下步骤：

采用如SEQ ID NO.5-6所示的引物对扩增KcRCB基因，将扩增得到的所述KcRCB基因通过BP-LR反应连接至植物表达载体pK2GW7上，得到所述KcRCB基因超表达载体。

6.根据权利要求5所述的热响应KcRCB蛋白或其编码基因在增强植物抗高温胁迫中的应用，其特征在于，构建所述KcRCB基因超表达载体包括以下步骤：

采用如SEQ ID NO.5-6所示的引物对扩增KcRCB基因，通过BP反应将扩增得到的所述KcRCB基因连接至pDONR^TM221载体上，之后通过LR反应将所述pDONR^TM221载体上的所述KcRCB基因连接至植物表达载体pK2GW7上，得到所述KcRCB基因超表达载体。

7.根据权利要求4所述的热响应KcRCB蛋白或其编码基因在增强植物抗高温胁迫中的应用，其特征在于，所述转化方法选自磷酸钙共沉淀法、Ti质粒法、Ri质粒法、病毒载体法、基因枪法、显微注射法、电穿孔法或农杆菌介导法。

8.根据权利要求3所述的热响应KcRCB蛋白或其编码基因在增强植物抗高温胁迫中的应用，其特征在于，所述高温胁迫的温度不高于45℃。

9.根据权利要求3所述的热响应KcRCB蛋白或其编码基因在增强植物抗高温胁迫中的应用，其特征在于，所述植物选自拟南芥、棉花、油菜、水稻、小麦、大豆或玉米。

10.根据权利要求9所述的热响应KcRCB蛋白或其编码基因在增强植物抗高温胁迫中的应用，其特征在于，所述植物选自拟南芥。