JPH11501295A - 消耗製品における有毒代謝産物レベルの調節 - Google Patents

消耗製品における有毒代謝産物レベルの調節

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JPH11501295A JP8521176A JP52117696A JPH11501295A JP H11501295 A JPH11501295 A JP H11501295A JP 8521176 A JP8521176 A JP 8521176A JP 52117696 A JP52117696 A JP 52117696A JP H11501295 A JPH11501295 A JP H11501295A
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Abstract

(57)【要約】 収穫及び/または加工の前、間または後の植物において有毒代謝産物レベルを制御する方法及び組成物を提供する。本発明は、毒素産生微生物が定着する物質に関連するマイコトキシンレベルを制御することによって煙草、穀粒飼料、コーンシロップなどの穀物加工品、柑橘類果実、根菜類、果菜類、花菜類、葉菜類及び茎菜類、並びに切り花などの消耗製品に関連する健康危険度を低下させ、また実験動物試験操作を改良するのに有用である。

Description

【発明の詳細な説明】 消耗製品における有毒代謝産物レベルの調節 序論 発明の分野 本発明は、消耗製品(consumable products)に存在する 有毒代謝産物のレベルを制御する方法及び組成物に係わる。用いる組成物はフラ ボノイドアルデヒド及び真菌二次代謝産物を含有する。発明の背景 黴に起因する農業製品(agricultural products)の汚 染及び劣化は経済的損失を招き、かつ健康を脅かす。Aspergillus属 、Alternalia属、Fusarium属及びPenicillium属 の真菌は食用作物とその製品を汚染する恐れが有る。上記真菌が産生するマイコ トキシンには、アフラトキシン類、フモナシン類(fumonasins)、フ ザリン酸、TA/AAL毒素、ゼラレノン、並びにトリコテセン、5−ブチルピ コリン酸及び関連する植物毒性ピリジン誘導体が含まれる。これらのマイコトキ シンはヒトを含めた様々な種に対してきわめて有毒であり、しかも商品とし て製造された食料及び動物飼料中に見出される場合も有る。マイコトキシンを産 生するいずれかの属の真菌で汚染された物質を鳥(fowl)、魚、動物または ヒトが経口摂取すると、健康上重大な問題が生起しかねない。 マイコトキシンは二次代謝産物であり、Aspergillus属の様々な種 が産生するものが最も良く知られている。一例として、Aspergillus flavusは様々な植物性物質において増殖して、ヒト及び他の多くの動物 種に有毒な低分子量マイコトキシンであるアフラトキシンを産生する。この毒素 の実際の、また潜在的な危険性は1960年、真菌によって汚染された魚用飼料 がもたらした商業的魚卵孵化場での大規模なマスの中毒によって劇的に判明した 。フモニシン類(fumonisins)も、ウマ、ブタ、ニワトリ及びシチメ ンチョウを含めた、商業的に有益な家畜の成長及び健康に悪影響を及ぼすことが 判明している。フモニシン類はまた、生物医学的調査及び商品試験に広く使用さ れる動物の飼育に用いられる食料中に同定されてもいる。従って、実験動物がマ イコトキシンで汚染されて変質しかねない食物で飼われている場合、調査結果は そのまま信用できないかもしれない。 フモニシンは、或る種の食用作物製品中に見出される汚染物質である一群のマ イコトキシンの代表例である。また、貯蔵トウモロコシ及びトウモロコシ製品に 定着(colonize)する同じFusarium属真菌がフザリン酸を産生 する。Fusarium属のマイコトキシンは熱安定性で、かなりの加工の後に も残存し、食品工業の主要な甘味剤源であるフルクトーストウモロコシ甘味剤を 含めた多くのトウモロコシ製品、及びグレーンアルコールなどの商品として製造 された発酵産物中に見出される。トウモロコシ物質及び他の植物性物質中に同定 された他のマイコトキシンには、TA/AAL毒素(フモニシンの構造類似体) 、アフラトキシン類、ゼラレノン、トリコテセン、5−ブチルピコリン酸及び関 連する植物毒性ピリジン誘導体が含まれる。 フザリン酸は神経伝達物質を害することが判明しており、従ってフザリン酸及 びフモニシンで汚染された物質及び製品に曝露されれば中枢神経系と末梢神経系 との両方の神経機能及び心機能が損なわれる恐れが有る。即ち、消耗物質からフ ザリン酸、及びなお同定されるべき他のマイコトキシンを排除することは、動物 とヒトとのいずれの健康維持 においても重要な役割を果たし得る。 食物中にマイコトキシンが存在することは、真菌が広範に分布し、かつ汚染さ れた食物及び作物の貯蔵及び取引の間に増殖することが原因であり得る。豆、穀 物、ココヤシ、ラッカセイ、サツマイモ、及び商品として製造された動物飼料を 含めた様々な可食商品中にあらゆる種類のマイコトキシンが高レベルで見出され ている。マイコトキシンはまた、乳及び乳製品中にも同定された。これらの商品 中にマイコトキシンが存在するのを防止したり、存在する場合にはそのレベルを 低下させたりするステップは、化学防腐剤、低温殺菌法、または密閉防除及び乾 燥貯蔵条件を用いる以外は無効であることが判明している。 タバコ製品のマイコトキシン汚染は、煙草消費に関連する疾患の病理と関係付 けることができる。タバコはしばしば、フモニシン及びフザリン酸産生菌を含め た、マイコトキシンを産生する真菌で深刻に汚染される。フモニシンはヒトの、 世界で三番目に頻発する癌である食道癌に関与する。フモニシン産生生物もフザ リン酸産生生物も共にタバコ上に存在し、即ち紙巻き煙草と無煙煙草とのいずれ を消費する者の間でも、煙草消費に関連する口腔癌、咽頭癌及 び肺癌並びに他の疾患において従来認められていなかった重大な役割を果たし得 る。タバコは、アフラトキシンを含めた他のマイコトキシンでも汚染されること が判明している。 化学的には、マイコトキシンは比較的低分子量の熱安定性化合物である。即ち 、食物または他の消耗物質が許容不能に高いレベルのマイコトキシンで汚染され たら、当該製品は通常廃棄しなければならない。従って、消耗物質の汚染を防止 し、また製品中にマイコトキシンが存在することを確認し、毒素で汚染された、 消耗物質でない物質を無毒化してこのような物質への曝露に関連する健康への悪 影響を低減することに用い得る方法を開発することは有益である。そのうえ、消 耗製品が食物連鎖に加わるかもしくはそれ以外で消費される前、間及び/または 後に蓄積する微生物毒素(microbial toxins)のレベル及び有 毒作用を制御することがきわめて望ましい。参考文献 噛み煙草の貯蔵葉にマイコトキシンが存在することが、Varma等,Myc opathologia 113,pp.19−23,1991に記載されてい る。Bow les及びMiller,J.Food Protection 56,pp. 788−794,1993には様々な芳香族及び脂肪族アルデヒドの抗ボツリヌ ス特性が開示されている。桂皮アルデヒドを含有する他の製剤が作物を病原微生 物の攻撃から保護することが報告されている。米国特許第4,978,686号 及び同第5,149,715号並びにフランス特許出願公開第2529755号 を参照されたい。重炭酸ナトリウム及び軽質パラフィン系石油などの膜形成及び /または発散防止被覆ポリマーは真菌定着のレベルを制御することが報告されて いる。Horst等(Plant Disease,p.247,March 1992)、Elad等(Phytoparasitica 17,pp.27 9−288,1989)及びHagiladi等(J.Environ.Hor tic.4,pp.69−71,1986)参照。特願昭56−4965号には 、桂皮アルデヒドの乳濁液を用いて農産物を昆虫、微生物及び細菌から保護し、 それによって当該農産物の物理的損傷を防止することが報告されている。製剤は 即効性で、しかも残留物を残さないと報告されている。 発明の概要 本発明は、毒素産生微生物が定着したかまたは定着し得る様々な消耗製品に存 在する有毒代謝産物のレベルを制御する方法及び組成物に係わる。本発明の方法 は、消耗製品またはその前駆物質を、該消耗製品またはその前駆物質に定着して (1種以上の)毒素を産生する1種以上の微生物の定着を制限し、前記微生物を 殺し、または前記微生物を駆除(displace)する組成物、特にフラボノ イドアルデヒドと接触させるステップを含む。本発明は、植物性物質由来の消耗 製品に存在する有毒代謝産物のレベルを制御すること、及び真菌の毒素及び有毒 代謝産物による食物連鎖の汚染を低減することに有用である。 好ましい具体例の簡単な説明 本発明は、1種以上の毒素産生微生物が定着する恐れの有る消耗製品、特に農 業製品に関連する1種以上の有毒代謝産物のレベルを調節する方法及び組成物を 提供する。本発明の方法は、特に芳香族アルデヒドの桂皮アルデヒド、コニフェ リルアルデヒド及びα−ヘキシル桂皮アルデヒド(HCA)などの天然化合物を 用いて1種以上の毒素産生微生物を殺し、または長期間駆除することを含む。本 発明 は特に、茎、葉、根、果実、種子及び/または花などの植物部分に関連するマイ コトキシンその他の有毒二次代謝産物のレベルを、植物及び/または植物部分が 消費のために収穫及び/または加工される前、間及び/または後に低下させるの に適する。本発明は、試料が汚染されているかどうか、及びどの程度汚染されて いるかを確認するべく試料中に存在する微生物毒素を検出及び定量するアッセイ も提供する。本発明のアッセイは、植物または植物部分を収穫及び/または加工 して消耗製品とする間、または消耗製品とした後に圃場条件下または非圃場条件 下に全植物(whole plants)または他の物質に関連する毒素レベル について試験するのに用いる。加えて、本発明のアッセイを、何らかの真菌種、 例えばFusarium属種が産生する、除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、及び/ま たは薬物として有用であり得る有毒二次代謝産物の同定に用いることも可能であ る。 本発明は、現在使用可能な無毒化技術に優る幾つかの利点を有する。本発明の 利点の一つは、消耗製品としての農業製品の汚染を防止し得、または消費に安全 なレベルまで著しく低下させ得ることである。農業製品は、通常本発明 の組成物をただ1回適用することによって収穫前または収穫後に処理可能である 。そのうえ、マイコトキシン産生菌を殺すかまたは駆除する物質で圃場の植物を 処理すれば収穫物の毒素汚染レベルを著しく低下させることができる。芳香族ア ルデヒドは特に、場合によっては処理された製品の香味及び/または匂いを改善 し得る明確な官能特性及び嗅覚特性を有する。例えば、HCAの匂いは花のよう であるかもしくはジャスミンに似ており、どこか草のようでもあると述べられて いる(Technical Data Sheet)。 ベンズアルデヒド、アセトアルデヒド、シンナムアルデヒド、ピペロナール及 びバニリンなどの、本発明に用い得る幾つかの芳香族及び脂肪族アルデヒドは、 通常安全と看做される(GRASである)合成香味付与剤である(21CFR 9172.515)。HCAは1950年代より前から一般に用いられ、今日で は消耗製剤(石鹸、洗剤、クリーム剤、ローション剤、香水)に広く用いられて いる(香料原料に関する諸論文。Food Cosmet.Toxicol.1 2: SUPPl.,p.915,1974)。HCAは1965年にFEMA (Flavo ring Extract Manufacturers’Associati on;香味付与成分使用レベル調査;No.2569;Fd.Technol. ,Champaign 19(part 2),p.155,1965)によっ てGRAS(「通常安全と認識される」)状態であると認められ、US FDA によって食物への使用を承認されている(21 CFR §121.1164) 。1970年のヨーロッパ会議(Council of Europe;Nat ural and Artificial Flavoring Substa nces;Partial Agreement in the Social and Public Health Field;Strasbourg, ListA(1),Series 1,no.129,p.55,1970)は HCAを、1ppmのレベルにおいて許容可能な人工香味付与物質のリストに加 えた。上記のような化合物のうちの様々なものがC.botulinum胞子の 発芽を抑制する活性を有することが報告されている。Bowles及びMill er,G.FoodProtection 56,pp.788−794, 1993参照。 乳化剤として用い得るTween系(ポリソルベート類)などの界面活性剤も 、(やはりGRAS状態を有する)サポニンなどは既に食品添加物として用いら れている。加えて、本発明で用いる製剤の残効性(formulation r esiduality)は管理可能である。このことは、有害生物(pest) と益虫とを総合的に管理するプログラムのために短期の残効(residual s)が望ましい場合きわめて有益である。そのうえ、上記製剤は他の薬剤に耐性 である有害生物に対して作用し、マイコトキシン産生菌のみでなく昆虫標的も含 めた多様な標的生物に有効である。その結果、問題の消耗物質に多種の薬剤を適 用する必要性は減少する。上記製剤はただ1回の適用で作用が長期間持続し、真 菌の増殖を少なくとも1カ月間、場合によっては全増殖シーズンが終わるまで制 御するのに通常はただ1回の適用で十分である。病原生物を長期間防除すれば、 処理しなかった植物に比べて健康な植物が得られ、宿主植物の収穫量(yiel d of produce)は増す。抗病原薬をより低い濃度で1回だけ適用す ることによって、植物または植物からの収穫物を損傷 する恐れが低減し、また農薬を散布する作業者や、処理された植物の組織または 部分を摂取する動物または鳥に何らかの不利な副作用が及ぶ恐れも低減する。 本発明で用いる製剤の植物毒性は、酸化防止剤を排除した場合にも低下する。 温室への出入り(reentry)の時間も問題とはならない。典型的には、上 記製剤は標的生物に対して急速致死性であり、このことは、出入り時間を要しな い(例えば切り花の在庫に損失が生じない)ことを勘案すれば特に有益な特徴で ある。 ヒトの食料として用いられる物質に関して、またはヒトが消費する食用商品の ための飼料に関して、食物連鎖内の毒素が減少するかまたは排除されるという利 点も存在する。一例として、汚染穀物や汚染干草といった物質で飼育された魚、 鳥及び動物から得られる肉もまた毒素によって汚染されている。フラボノイドア ルデヒドの桂皮アルデヒドが抗真菌特性を示すことは報告されているが、生の果 実や野菜のみでなく、植物から製造される消耗製品である煙草、及び鳥、動物、 魚その他の、ヒトの食物連鎖の要素のための食用穀物のマイコトキシン汚染も回 避されるように植物を長期間保護するべく企図された製剤中に前記アルデヒド を存在させて植物に対し用いることはこれまで行なわれてこなかった。即ち、動 物の餌とする物質を処理すれば食物連鎖内の毒素が減少し、または排除される。 本発明はまた、毒素を産生する真菌を減少させ、または排除する処理によって農 産物を収穫前または収穫後に無毒化することにより、動物及びヒトがその環境に おいて、例えばあらゆる種類の汚染サイレージ物質の消却及び/または処分がも たらす、水及び空気によって運ばれるマイコトキシン源に曝露されることを低減 するという利点も有する。即ち、上記無毒化操作は植物、植物性物質、及びこれ らに由来する食料などの物質の安全な処分を可能にする。 毒素産生生物を殺し、または該生物が定着した植物や植物部分から駆除し、そ れによって当該物質に通常蓄積する毒素の量を制限するのに、天然生成物(na turalproducts)を含有する組成物を用い得る。組成物は収穫前の 植物に適用するか、または収穫及び/または加工後の植物もしくは他の物質に適 用する。最も好ましくは、組成物は収穫前の植物、植物部分または組織に適用す る。組成物は好ましくは生物分解性であり、最も好ましくは水溶液としてか、ま たはTween 80などの生物分解性 である水溶性無水ノニオン界面活性剤を媒質とした乳濁液として、場合によって は成長促進剤、及び植物のYucca shidigeraに由来し得るサポニ ンなどの界面活性剤と共に用いる。組成物に対する特定真菌の感受性はin v itroまたはin vivoで評価し得る。 特に重要であるのは、病原真菌を直接殺し、及び/または様々な病原真菌に対 する植物の全身耐性を誘導するのに用い得る様々なアルデヒド、特に芳香族アル デヒドである。本発明の方法は、病気の植物または病原体の攻撃を受けやすい植 物の一つ以上の部分または組織を標的病原生物の増殖の制御に十分な量の抗病原 薬と接触させ、及び/または前記部分または組織に前記抗病原薬を提供するステ ップを含む。増殖調節化合物は下記の式(1)を有する。 〔式中Rは−CH2OHまたは−CHOであり、nは0〜3の整数であり、各R1 は独立にOHであるか、または1 〜10個の炭素原子及び0〜5個のヘテロ原子を有する有機置換基であり、その 際この化合物の全R1置換基の炭素原子及びヘテロ原子の総数は15以下であり 、R4は水素であるか、または1〜10個の炭素原子を有する有機置換基である 〕。この化合物は、シンナムアルデヒド、コニフェリルアルデヒド及び近接関連 化合物などの天然化合物を包含し、病原体加害(infestations)を バイオコントロールする方法を提供する。「バイオコントロール」という語は、 植物病原体を直接的な抗病原体活性によって、及び/または病原体加害に対して 誘導された宿主植物の耐性によって防除することを意味するものとする。 本発明の方法は、葉、根もしくは花部分といった植物部分、または木部や師部 といった組織の真菌定着面に、活性成分として天然生成物を含有する組成物を提 供することによって実施し、及び/または前記組成物はそこで真菌が増殖してい るか、または増殖しようとしている基質に適用し得る。植物自体または根圏に適 用する抗病原薬の量は加害度と、或る程度は用いる製剤及び特定の配合法とに依 存し、従って最良の成果を得るべく経験的に決定される。「定着」という語は、 微生物または昆虫と、これらの病原体が そこから栄養素、典型的にはアミノ酸、特にメチオニンなどの必須栄養素を得る 植物部分または組織との関連を意味するものとする。「天然生成物」という語は 、或る生物だけのものであるか、または少数の近接関連生物に共通する天然起源 の有機化合物を意味するものとする。前記化合物には真菌の二次代謝産物、及び 植物が産生する化学物質が含まれる。「提供」という語は、植物に内在し、及び /または遺伝子操作によって供給される抗真菌化合物を植物部分に外部から適用 することと、前記抗真菌化合物の植物における合成を誘導することとを意味する ものとする。遺伝子操作は通常の交雑育種法によってか、または組み換えDNA 技術を用いて植物または植物の祖先に移植遺伝子(transgene)を導入 することによって行ない得る。天然生成物は、天然源から単離するか、その全体 もしくは一部を合成するか、または植物自体もしくは別の生物において組み換え 技術により製造することができる。 好ましい−化合物は下記の式(2)を有する。 〔式中R1は−CHOであり、R2は−OHであるか、または1〜10個の炭素原 子を有する有機置換基であり、R3はメトキシ基であるか、または1〜10個の 炭素原子を有する有機置換基であり、R4は水素であるか、または1〜10個の 炭素原子を有する有機置換基である〕。特に重要であるのはフラボノイドアルデ ヒド、特に芳香族アルデヒドである。本発明に有用な芳香族アルデヒドの例に、 桂皮アルデヒド(下記(3)) 及びコニフェリルアルデヒド(下記(4)) が有る。 その他の重要な化合物に、α位においてヘキシル基などのアルキルやアミル基 などの分枝鎖アルキル基で置換された化合物などの、式(1)の化合物の類似体 が含まれる。通常、α位に位置する基は5〜10個の炭素原子を有する。このよ うな化合物にはα−ヘキシルシンナムアルデヒド及びα−アミルシンナムアルデ ヒドが含まれる。α−ヘキシル桂皮アルデヒドの化学構造は(5)(下記)に示 すとおりである。 Chemical Abstracts Service(CAS)名は2−( フェニルメチレン)オクタナールであり、CAS登録番号は[101−86−0 ]である。この化合物は2−ヘキシル−3−フェニル−2−プロペナールの化学 名でも記載されている。この化合物の分子式はC1520Oであり、分子量は216.3である。HCAはFirmenichから 入手可能であり、前記会社の製品は主に(E)−cis異性体(最高93.8% )から成り、(Z)−trans異性体(最高6%)も含有する。微量成分の一 つはオクタナールの自己アルドール縮合物である(1〜1.5%;June B urkhardt,Firmenich,Plainsboro,NewJer seyからの私信)。 化合物は単独で用いても他の活性または不活性物質と組み合わせて用いてもよ く、また該活性化合物を目下の特定目的により良く適するような濃度で含有する 濃縮液、溶液、懸濁液、粉末等の形態で、吹き付け、注ぎ掛け、浸漬により適用 し得る。化合物を、例えば適当な溶媒を用いて製造した稀釈溶液の形態で灌漑ス ケジュールの一環として、または分離適用として根圏に直接適用することも可能 である。 葉面散布剤として用いる場合、アルデヒド単独でも調剤可能であるが、Twe en 80や、界面活性剤特性は有するが製剤の抗真菌特性を甚だしく損なうこ とはないサポニンなどの化合物といった乳化剤を十分な量で含有させることによ って製剤を実体的(substantive)な ものとすることができる。通常、製剤中の洗剤はフラボノイドアルデヒドの抗真 菌特性を低下させず、製剤の実体性を向上させる。例えば米国特許第4,477 ,361号を参照されたい。用い得る他の洗剤に、米国特許第4,978,68 6号に開示されたようなアニオン性洗剤が含まれる。製剤に重炭酸ナトリウム、 硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウムまたは重リン酸ナトリウムといった多塩基酸 塩の水性調製物などの付加的な成分を含有させて製剤の抗真菌特性を高めること も可能である。得られた乳濁液は使用に適した濃度に稀釈する。 好ましい一具体例において、製剤は、乳化剤としてのTween 80または サポニン、及び場合によっては重炭酸ナトリウムを含有する調製物中のα−ヘキ シル桂皮アルデヒド、桂皮アルデヒド及び/またはコニフェリルアルデヒドを包 含する。好ましい製剤は0.5〜10重量%のα−ヘキシル桂皮アルデヒド、桂 皮アルデヒド及び/またはコニフェリルアルデヒドを含有する乳濁液剤であり、 この製剤は8〜12重量%の非プロトン性酸塩及び残量の水を含有し得る。6〜 12%の非プロトン性酸を含有する製剤が好ましい。通常、製剤中に存在させる (1種以上の)ア ルデヒドの総量は5%以下とする。製剤は、酸化防止剤を別途用いなくとも特定 アルデヒド、例えばコニフェリルアルデヒド固有の酸化防止特性のみで有効であ る。 製剤の安定性は、問題の製剤を所定時間にわたって高温に曝露する加速試験を 含めた様々な方法で評価し得る。製剤の試料を一定の時間間隔で採取し、かつ当 業者に知られている方法で化学的に分析して分解の速度及び特徴を調べる。例え ば、HCAは30m長の非極性ポリジメチルシロキサン毛管カラム(例えばHe wlett−PackardのHP−1やSupelcoのSPB−1)及びフ レームイオン化検出器を用いる気−液クロマトグラフィー(GLC)によって分 析できる。担体ガス(8ml/分)としてヘリウムを用い、かつカラム温度を約 240℃とすると、(E)−cis異性体(主成分)の保持時間は約6.0分、 (Z)−trans異性体(微量成分)の保持時間は約6.3分となる。 式(3)及び/または(4)もしくは(5)の化合物を含有する組成物の最も 有効な抗真菌量、及び用い得る他の式(1)の化合物の量は当業者に知られてい るプロトコルを用いて決定し得る。一例として、特定の用途毎に平均抗 病害率(mean disease resistance)を計算し得、有効 な病原体防除のための平均病害防除率(MPDC; %)は通常60%より高く 、好ましくは少なくとも約70%である。このようなプロトコルは、特定病原体 用の各製剤を式(1)が包含する任意の化合物を用いて最適化するのにも用い得 る。MPDCは式 MPDC=[(MDIC−MDIT)/MDIC]×100 によって定義され、その際MDICは処理しなかった対照の平均発病率(%)で あり、MDITは処理した場合の平均発病率(%)である。 製剤は植物毒性についても評価しなければならない。従って、製剤の毒性を少 なくとも1回は生きた宿主品種植物において評価することは重要である。植物毒 性は、毒性の上昇につれて次のように評価し得る。0─植物に症状無し; 1─ 胚軸がごく僅かに褐変(他に症状無し); 2─植物が幾分萎れ、下方の葉が枯 れ、維管束系が幾分褐変; 3─植物全体が萎れ、葉が枯れ、胚軸の外部及び内 部に症状発現; 4─茎が壊死し、植物は枯死。植物毒性 は通常2以下、好ましくは1以下であるべきである。 場合によっては、製剤の特定の特性を変更したい時に製剤に1種以上の付加的 な成分を添加することによって製剤の効力が向上し得る。一例として、用途次第 では、収穫前に用いる際に植物毒性作用を弱めること、もしくは製剤の抗病原作 用を強めること、またはこれらの両方が望ましくなる。上記付加的な成分が、製 剤の植物毒性を最低とする一方でその抗病原作用を強めれば好ましい。特に重要 であるのは、消耗製品に定着しているかまたは定着し得る毒素産生微生物に対す る製剤の平均抗病害率を高める(1種以上の)成分を用いることである。1種以 上の上記付加的な製剤成分の濃度は、製剤の抗病原作用を最適化し、かつその植 物毒性作用を弱めるべく調節し得る。所与の製剤中に存在する1種以上のその他 の成分、特に式(1)によって表わされる成分の濃度の総体的低下を可能にしな がら製剤の総体的な効力は維持する成分を製剤に添加することが特に重要である 。そのような成分と他の成分との組み合わせは、いずれか適当な混合及び/また は適用段階において一つ以上のステップで実施可能である。 好ましい付加的な成分にサポニンが含まれる。サポニン は、いずれもサポゲニン部分と糖質部分とから成る一群の化合物である。サポケ ニンはステロイドまたはトリテルペンであり得、糖質部分はグルコース、ガラク トース、ペントースまたはメチルペントースであり得る。S.Budavari 編,“The Merck Index,”11th ed.,p.1328, Merck & Co.,Inc.,Rahway,N.J.,1990参照。 本発明に用いるサポニンは、サポニンを産生することが知られているイトラン、 セッケンボク、リュウゼツラン、タバコ、カンゾウ、ダイズ、チョウセンニンジ ン及びアスパラガスからジンコウ(aloe woods)までの様々な植物の 果実、葉、種子及び/または根を含めた様々な植物部分その他の様々なソースか ら当業者に知られている手段を用いて製造及び/または単離し得る。本発明に用 いるサポニンは好ましくは、ヒト及び高等動物に無毒である。最も好ましくは、 本発明に用いるサポニンは食用級の無毒性を有し(non−toxic foo dgrade)、そのソースはイトランに由来する。Yucca schidi geraまたはY.valida由来のサポニンとその同等物が特に好ましい。 本発明に用い るサポニンとしてより好ましいものはイトランに由来し、最も好ましいものはY ucca schidigeraまたはY.validaに由来する。 構造的に関連する様々なサポニンが知られており、その際最も変化し得る構造 的特徴はグリコシル化パターンである。サポニンは、ステロイド部分を有するサ ポニンであるサルササポニンのように付加的に改変されている場合も有り、サポ ニン構造は当業者に知られている酵素的、化学的及び/または機械的手段のうち の幾つかによって改変可能である。Yucca schidigera由来のサ ポニンは、主要なサポゲニンがサルササポゲニン及びチゴゲニンであるステロイ ドサポニンに含まれる。サルササポニンを加水分解すると、サルササポゲニン( サルササポケニン5−β、20−βF、22−δF、25−βF;スピロスタン −3−β−オール及びパリケニン(parigenin)としても知られる)、 グルコース及びガラクトースが得られる。サルササポケニンの分子式はC2744 3である。Park S.Nobel,“Agaves,”Oxford U niv.Press,New York,1994参照。 従って、所望の抗病原作用及び/または植物毒性作用を有する製剤をもたらす 上記化合物の誘導体は本発明の均等物と看做される。その構造次第では、所与の サポニンが特定の農薬特性を有し、かつ本発明の製剤と共に用いられるというこ ともあり得る。サポニンの有効量は通常、ブリックス10°のサポニン抽出物の 水溶液の形態で約0.01〜3% v/v、最も好ましくは約0.25% v/ vである。ブリックス度は、溶液中の糖質の重量比率(%)に等しい。Hawl ey編,“(The Condensed Chemical Diction ary,”10th ed.,p.149,Van Nostrand Rei nhold,New York,1981参照。 任意の式(1)の化合物並びにTween 80及び/または重炭酸ナトリウ ムなどのその他の製剤成分を用いて製造した各製剤が特定の毒素産生微生物及び /または宿主植物や植物製品といった収穫前もしくは収穫後の消耗製品に及ぼす 作用を、特定の用途において製剤の毒性を最低としながらその抗病原作用は維持 するかまたは強めるのに適する個々の成分の組み合わせ及び有効量によって評価 する。 個々の成分の有効量は、試験製剤中の当該成分の量を体系的に変更し、試験製剤 で問題の作物を処理し、かつ収穫前及び収穫後並びに貯蔵期間後の宿主植物また は植物製品のマイコトキシンレベルを監視することによって決定し得る。試験成 分の有効量は、植物製品中に残存するマイコトキシンを問題の特定作物にとって 許容可能なレベルに制御する量と看做し得る。製剤を、特定の病原体に対して感 受性である宿主植物を植え付ける土壌または他の生育基質の調製か、既に加害さ れた生育基質への適用か、または収穫物への適用に用いる用途では、本発明の製 剤は根圏、基質または収穫物に直接適用し得、あるいはまた該製剤を固体支持体 に結合させたり、長時間放出(time release)物質に封入したりす ることも可能である。固体支持体を用いる場合、活性アルデヒドを酸化しかねな い物質は回避するべきである。送達系の例には澱粉−デキストラン等が含まれる 。送達系の例に関してはYuan等,Fundamental and App lied Toxicology 20,pp.83−87,1993を参照さ れたい。また、Kawada等,10,pp.385−389,1994も参照 されたい。 式(1)、(2)、(3)、(4)及び(5)の特定化合物並びに場合によっ ては先に示したサポニンに加え、前記化合物のうちのいずれかの誘導体であって 、生物系の作用を受けると先に定義した式の化合物を生成させる誘導体も本発明 の化合物と均等と看做される。即ち、植物部分もしくは組織または収穫物に前駆 化合物を適用することは本発明の実施と均等である。前駆化合物のフラボノイド アルデヒドへの生物変換は、例えば米国特許第5,149,715号及び該特許 中に引用された参考文献に開示されている。Casey及びDobb,Enzy me Microb.Technol.14,pp.739−747,1992 も参照されたい。前駆化合物の例には、アミノ酸アンモニアリアーゼ経路中のも のなど、植物病原体に対する植物耐性に対する獲得及び/または全身耐性に関連 する経路中のものが含まれ、かつ(桂皮酸を生成させる)フェニルアラニンが含 まれる。前駆化合物には外にも、リグニン及びクマリン産生のための生物学的経 路中のもの、例えばp−クマリン酸を生成させるチロシンなどが有る。従って、 式(1)、(2)、(3)、(4)及び(5)の特定化合物の前駆体及び誘導体 であって、所望の抗病原作 用及び毒素減少作用を有する製剤をもたらすものは本発明の均等物と看做される 。 標的生物次第ではアルデヒドを固体支持体と、該固体支持体がセルロース、特 に微晶質セルロースなどの多糖である場合の多糖由来の結合ドメインなどのリン カーを任意に介して結合させ得る。セルロース結合ドメインの調製は、米国特許 第5,340,731号、同第5,202,247号及び同第5,166,31 7号に開示されている。アルデヒドと結合ドメインとの結合は、開裂可能な結合 であってもなくても当業者に良く知られた方法を用いて実現し得る。骨格タンパ ク質由来の結合ドメインを用いることも可能である。Shoseyen等(国際 特許出願第0594/04132号)を参照されたい。 毒素の蓄積を防止し、及び/または1種以上の毒素産生微生物を殺すかもしく は駆除する他の化合物、例えば白色腐朽菌などの特定真菌を殺すことが知られて いるH22を単独で、または本発明の組成物と組み合わせて用い得る。加えて収 穫前使用では、様々な真菌に対する非全身性または全身性の植物耐性を誘導する 化合物を、或る種の真菌の定着を圃場条件下に防除するのに用い得る。植物性物 質が 微生物毒素で甚だしく汚染された、例えば処分されるかまたは堆肥とされる植物 性物質である場合は該物質を、該物質中に存在する毒素を破壊または中和するア ルカリ−過酸化物または類似の化学薬剤を有効量で用いて付加的に処理し得る。 無毒化を促進するべく、機械的な操作を別途、または化学的な操作と組み合わせ て用い得る。機械的無毒化法の例には、毒素を物質から分離するのに用い得る任 意の手段、または高温高圧への曝露など、毒素を破壊する他の手段が含まれる。 物質が毒素で汚染されることが予想される場合、または汚染された物質中の微 生物毒素のレベルがその物質を安全な消費に適さないものとすることが決定的で ある場合、毒素レベルが消費に安全なレベルまで低下するように物質を処理する ことによって毒素レベルを制御し、もしくは低下させ得る。特に、微生物毒素で 汚染された物質の毒性を低下させ、または打ち消すためには、毒素の有毒活性を 打ち消すかまたは先制(preempt)する1種以上の物質を有効量で製品に 添加し得る。有効な物質には、チオールまたはスルフヒドリル基アミノ酸、及び 硫黄アミノ酸、例えばシステイン、メチオニン及びこれらの誘導体を含有す る物質が含まれる。上記のようなアミノ酸の好ましいソースは、ニワトリの羽毛 、毛、皮革、蹄その他のケラチン性動物製品で、関連するアミノ酸を放出するよ うに処理されたものであり得る。前記処理には、アルカリ−過酸化水素(例えば NaOH+H22)環境下でのケラチン基質の可溶化が含まれる。好ましい一具 体例では、アルカリ/過酸化物濃度は約0.5〜2.5%であるが、より高いか または低い濃度も適宜可能である。最も好ましいアルカリ/過酸化物濃度は1〜 2%前後である。食品及び飼料に硫黄アミノ酸を添加するとマイコトキシンの存 在自体が抑制され、それによって前記製品の消費に潜在する、健康を損なう危険 が縮小される。 本発明の方法は、標的病原生物の増殖及び/または生存を損なうのに十分な量 の抗病原薬を標的病原生物に導入することによって実施する。抗病原薬を含有す る製剤を、収穫前または収穫後の植物組織もしくは部分に導入する。例えば、植 物病原体に感染した植物かまたは植物病原体の加害に対して感受性である植物の 葉または他の植物組織もしくは部分の表面及び/または裏面に対して湿潤または 乾燥製剤状の製剤を吹き付け、湿潤製剤を用いた場合は好まし くは流亡するほどに吹き付ける。吹き付けは、加害前または加害後の植物、好ま しくは加害前の植物に対して行ない得る。しかし、宿主植物の損傷を最小限に留 めるためには、可能であれば比較的成長した植物を処理することが好ましく、な ぜなら若い青葉は植物毒性に対する感受性がより高い傾向を有するからである。 場合によっては、サポニンなどの植物成長促進剤を抗病原製剤中に存在させて、 または別個の製剤として収穫前に用い得る。あるいはまた、湿潤または乾燥状態 の製剤を根圏に適用することも可能であり、前記根圏において製剤は根及び根に 定着した関連する病原生物に接触し得る。場合によっては時効性製剤が、特に根 圏または収穫後物質への適用では有用であり得る。 製剤の(1種以上の)活性成分の標的生物への導入は、病原生物に処理した植 物表面から直接摂取させることによって、または標的とする病原生物が定着した 宿主中もしくは該宿主表面に抗病原薬を存在させ、この宿主の栄養素供給表面を 病原生物に摂食させることによって行ない得る。宿主植物の栄養素供給表面に抗 病原薬を存在させることは、抗病原薬を植物部分と直接接触させることによって 可能であり、あるいはまた抗病原薬での植物の前処理に対する二 次的作用としての全身耐性の誘導の結果、もしくは宿主植物の遺伝子調節の結果 として宿主植物に産生させることによっても可能である。 本発明の芳香族及び脂肪族アルデヒドは、当業者に知られている様々な合成法 で製造し得る。例えば、J.March編,“Advanced Organi c Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,”2ndEd.,Appendix B,McGraw −Hill,New York,1977を参照されたい。シンナムアルデヒド は、例えばシンナミルアルコールの酸化(Traynelis等,J.Am.C hem.Soc.86,p.298,1964)かまたはスチレンとホルミルメ チルアニリンとの縮合(英国特許第504,125号)によって合成し得る。本 発明のアルデヒドは天然ソースからの単離によっても取得可能である。例えば、 シンナムアルデヒドは木材腐朽菌のStereumsubpileatumから 単離できる。Birkinshaw等,Biochem.J.66,p.188 ,1957参照。 HCAは、例えば米国特許第5,055,621号に開示されたようにして合 成し得る。実験室規模ではHCAは、窒素雰囲気下にベンズアルデヒドをオクタ ナールと反応させること(アルドール縮合)により合成可能である(Eric Walborsky,Firmenich,Chemical Manufac turing Center,Port Newark,New Jersey からの私信)。上記反応は、フラスコにメタノール、309ppmのジフェニル アミン、水酸化カリウム及びベンズアルデヒドを入れ、これを攪拌することによ って生起させる。オクタナールをゆっくり添加後、反応混合物を酢酸でpH7. 5〜9.5とする。メタノールを蒸発させ、反応混合物を水で洗浄した後、有機 相を蒸留装置に移す。約20〜24%のポットチャージをベンズアルデヒド及び 「軽質分(lights)」として除去した残りの留出物が、α−ヘキシル桂皮 アルデヒドの「ハートカット(heart cut)」である。「ハートカット 」を更に分画し、その際臭気評価次第で1〜5%(重量に基づく)の物質を「軽 質」画分中に取り出し得る。商業的な方法は、ジフェニルアミンを特許触媒2( proprietary catalyst2)によって置き換える点が実験室規模の操作と相違する。最 終生成物は、20℃において0.955〜0.965の比重と、20℃において 1.548〜1.562の屈折率と、1気圧において305℃の沸点と、26℃ の融点とを有する淡黄色の油である。市販製品は、酸化防止剤として機能する0 .04%の2,6−ジ−t−ブチル−p−クレゾール(ブチル化ヒドロキシトル エン即ちBHT)の添加によって安定化されている(Technical Da ta Sheetのヘキシル桂皮アルデヒド907600;Revision 853,Firmenich Inc.,Plainsboro,New Je rsey)。天然産と報告されたHCAにはイネから単離されたものも含まれ得 る(“Givaudan−Roure Index,”p.89,Givaud an−Roure Corporation,Clifton,New Jer sey,1994)。 HCAは、25℃において70×10-5mmHgの蒸気圧を有する、低い揮発 性から中程度の揮発性を具えた化合物である。その親化合物である桂皮アルデヒ ドは約40倍の蒸気圧(25℃において2970×10-5mmH g)を有する。比較例を示すと、昆虫忌避剤のN,N−ジエチル−m−トルアミ ンは僅かに高い蒸気圧(25℃において167×10-5mmHg)を有する(W .G.Reifenrath,Volatile Substances.Co smetics and Toiletries 110,pp.85−93, 1995)。 本発明の製剤の一つ以上の成分は、植物、植物部分、植物細胞、特定の植物組 織において、及び/または植物の成長の特定段階に関連して当該化合物のレベル を制御するのに必要である1種以上の酵素または酵素経路もしくはクラスター( cluster)をコードする1種以上の遺伝子の発現を調節することにより、 問題の植物に産生させ得る。酵素は生合成経路または分解経路中のものであり得 、また調節は内在植物遺伝子の発現を調節するか、それとも植物に外部から供給 した移植遺伝子の発現を調節するかでそれぞれ正または負(up or dow n)の調節となる。自生(indigenous)植物遺伝子は宿主植物のゲノ ムに在来する遺伝子である。内在植物遺伝子は問題の宿主植物の野生型ゲノムに 存在する遺伝子である。この遺伝子は自生遺伝子であっても、植物の感染の結果 として存在 する遺伝子(例えばウイルス遺伝子)かまたは植物ゲノム中へ自然に挿入された 遺伝子であってもよい。宿主植物を組み換え手段または従来の育種法によって改 良し、それによって宿主植物に、1種以上の式(1)、(2)、(3)、(4) または(5)の化合物の合成経路中に存在するような問題の化合物をコードする かまたはそのレベルを制御する1種以上の外来遺伝子を導入することも可能であ る。遺伝子発現の調節は、問題の遺伝子産物の産生を転写、翻訳及び/または翻 訳後段階で制御するべく行なう。問題の化合物のレベルは、該化合物の合成に必 要な1種以上の酵素をコードする1種以上の内在遺伝子または移植遺伝子の発現 を調節することによって制御する。 植物において遺伝子の発現を調節する方法は当業者に知られている。成長条件 を変更したり、植物に化合物を外部から適用したりすることによって遺伝子の発 現に影響を及ぼすことができる。例えば、本発明の製剤を用いて内在遺伝子の発 現を調節し、それによって植物に全身耐性を誘導することが可能である。分子レ ベルでは、遺伝子発現は実質的に、構造遺伝子のコーディング領域の発現を調節 する転写、翻訳及び終結制御領域に依存する。これらの制御領 域を調節する植物シグナルを利用することによって、または前記制御領域を直接 組み換え操作することによって、例えば桂皮アルデヒドのレベルの制御に必要な 酵素をコードする遺伝子の発現を調節できる。宿主植物に外部から供給する移植 遺伝子を用いる場合、移植遺伝子は所望のレベル及び時機の遺伝子発現を実現す るべく選択及び設計された制御領域を含む。前記制御領域は適宜、問題の遺伝子 と相同(在来)または非相同(非在来)であり得る。「相同」という語は、(1 種以上の)制御領域が問題の遺伝子に通常関連する制御領域に由来するか、また は後者の制御領域に実質的に類似することを意味する。「非相同」という語は、 (1種以上の)制御領域が問題の遺伝子に通常関連する(1種以上の)制御領域 とは異なるヌクレオチドソースもしくは配列に由来するか、または後者の制御領 域と実質的に異なることを意味する。例えば、酵素コーディング配列がソースに おいて制御領域と非相同である場合、問題の植物細胞において遺伝子を発現させ るためには、当該植物細胞において機能する転写及び翻訳開始調節領域もしくは プロモーターを前記コーディング配列に機能可能に連結しなければならない。植 物細胞において機能する転写及び翻 訳開始シグナルには、宿主植物または他の植物種に存在し、宿主植物における構 成性発現または選択的発現を導く遺伝子に由来するものが含まれる。 特に重要であるのは、構造遺伝子発現を植物、植物部分、植物細胞、特定の植 物組織において、及び/または植物の成長の特定段階に関連して選択的に調節す る遺伝子制御領域である。当業者に知られている制御領域であって、特に植物、 植物部分、植物細胞、特定の植物組織において、及び/または植物の成長の特定 段階に関連して式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)の化合物及び/また はサポニンのレベルを制御するのに必要な酵素をコードする遺伝子の発現を調節 するのに用い得る転写制御領域もしくはプロモーターが好ましい。例えば、果実 の分化(differential)発現パターンを定めるプロモーターが米国 特許第4,943,674号及び同第5,175,095号に、種子の前記パタ ーンを定めるプロモーターが米国特許第5,315,001号に、急速に発達す る組織及び非耐寒性苗条(tender shoots)の前記パターンを定め るプロモーターが米国特許第5,177,011号に開示されている。 本発明の製剤の所望成分を宿主植物において製造する好ましい一方法は組み換 えDNA手段によって実施し、特に当業者に知られている組み換え技術を用いて トランスジェニック植物を構築することで問題の植物組織中の、式(1)、(2 )、(3)、(4)、(5)の化合物及び/またはサポニンのうちの少なくとも 1種である当該化合物のレベルを調節することによって実施する。上記方法は、 問題の植物細胞を植物細胞において機能する発現カセットで形質転換することを 含み、前記発現カセットは、当該化合物の産生を調節し得、及び/または前記化 合物の産生に必要である1種以上の酵素をコードするDNA配列並びに翻訳及び 転写終結領域に読み取り枠5′末端において結合する転写及び翻訳開始調節領域 を、5′→3′転写方向へ機能可能に連結された構成要素として含む。当該化合 物の産生に必要な酵素の発現は、前記化合物の生合成に関与する酵素の濃度が変 化する結果として前記化合物の産生増加をもたらす。特に重要であるのは、葉、 根、果実及び種子などの植物組織におけるサポニン、桂皮アルデヒド及び/また はコニフェリルアルデヒド産生の選択的制御である。 問題の組織における桂皮アルデヒドの生合成のためには、 前記組織における桂皮アルデヒドの合成に必要であり、かつ前記組織における桂 皮アルデヒドの量の増加を可能にする1種以上の酵素をコードする構造遺伝子を 規定するDNAを含む発現カセットで植物細胞を形質転換する。同様に、問題の 組織におけるサポニンの生合成を選択的に制御するためには、前記組織における サポニンの合成に必要であり、かつ前記組織におけるサポニンの量の増加を可能 にする1種以上の酵素をコードする構造遺伝子を規定するDNAを含む発現カセ ットで植物細胞を形質転換する。特に重要であるのは、植物細胞において通常見 出される基質から問題のサポニン、桂皮アルデヒド及び/またはコニフェリルア ルデヒド化合物の生合成に必要な前駆化合物を代謝し得る1種以上の酵素をコー ドする遺伝子である。式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)の化合物及び サポニンのうちの少なくとも1種の移植遺伝子発現が更に重要である。 問題の遺伝子の発現のために、発現カセットを宿主植物のケノムに挿入するD NA構築物を調製する。前記挿入はAgrobacterium属、エレクトロ ポレーシェンまたは高速微粒子媒介形質転換といった、当業者に知られている形 質転換系を用いて実現し得る。用途次第では、問 題の組織及び/または特定の細胞小器官においてサポニンまたは他のいずれかの 問題の化合物を優先的に発現させ得る。組織特異性は、所望の発現プロフィール を有する転写調節領域の使用によって実現する。特定の細胞小器官への酵素の転 位(translocation)は、適当な転位ペプチドの使用によって実現 する。DNA構築物を組織及び細胞小器官特異的に発現させる方法は既に開示さ れており、当業者に知られている。 問題の遺伝子の調節及び発現の確認のためには、植物細胞内に存在する所望の DNA配列がゲノムに挿入され、かつ転写されているかどうかを確認する様々な 技術が存在する。ノザンブロッティングなどの技術を用いれば、所望の酵素をコ ードするメッセンジャーRNAを検出することができる。更に、酵素活性をアッ セイするか、またはタンパク質産物に関するイムノアッセイを行なうことによっ て発現を検出し得る。最も好ましくは、宿主植物に存在する問題の化合物のレベ ルを、当業者に知られている方法を用いて測定する。望ましい表現型は、例えば 、問題の遺伝子の発現によって、及び/または宿主植物中に存在するサポニンの レベルを対照植物のものと比較することによって測定 される問題の植物組織の高いサポニン及び/またはフラボノイドアルデヒド含量 である。 本発明の製剤の1種以上の成分化合物を標的生物に導入するためには、当該化 合物のレベルの制御に必要な酵素をコードする遺伝子を発現させる宿主植物によ って標的生物を、本発明の抗病原製剤の少なくとも1種の成分に曝露する。別の 具体例では、問題の遺伝子の選択的発現によって宿主植物に、病原体の攻撃また は定着に対する全身耐性を誘導する。本発明の抗病原製剤の少なくとも1種の成 分は宿主植物において発現させることができ、その際場合によっては該製剤のそ の他の成分を外部から宿主植物に適用し、それによってこれらの成分の組み合わ せに、標的生物に直接または間接に導入された時に所望の抗病原作用を発揮させ る。 シンナムアルデヒド及びコニフェリルアルデヒドなどのフラボノイドアルデヒ ドを蓄積する能力が高く、従って植物病原体に対して自衛し、あるいはまた抽出 して後に化学農薬として用いるフラボノイドアルデヒドの天然ソースとして用い られるトランスジェニック植物は次のように作製し得る。 フラボノイドアルデヒドの蓄積は、所望のアルデヒドを更に代謝させるか、ま たは代謝中間体を所望のアルデヒドから逸らす酵素をコードする特定の植物遺伝 子の発現に負の調節を施すことによって実現し得る。例えばシンナムアルデヒド の場合は、シンナメート4−ヒドロキシラーゼ(CA4H)及び桂皮アルコール デヒドロゲナーゼ(CAD)の発現に負の調節を施す。CA4Hは通常、幾分か の桂皮酸をシンナムアルデヒドから逸らし、それ自体代謝中間体であるp−クマ リン酸を生成させる。シンナムアルデヒドの蓄積を惹起するためにはCA4H活 性の低下のみでは不十分であり、なぜならCADはシンナムアルデヒドを急速に シンナミルアルコールに変換し得るからで、生じたシンナミルアルコールはリグ ニンに含まれるようになるか、または配糖体として蓄積する。CA4H活性とC AD活性との両方を同時に低下させると、桂皮酸からシンナムアルデヒドへの代 謝フラックスが増大し、かつシンナムアルデヒドのシンナミルアルコールへの変 換が減少する。幾分かのシンナムアルデヒドはリグニンに含まれるようになるが 、(遊離の、または配糖体としての)シンナムアルデヒドはまた、特に桂皮酸の 生合成が増加する時には通常以上のレ ベルまで蓄積する。桂皮酸の生合成が増加するのはフェニルアラニンアンモニア リアーゼ(PAL;通常のフェニルプロパノイド代謝の、速度制限ステップであ る最初のステップ;Hahlbrock及びScheel,Annu.Rev. Plant Physiol.Plant Mol.Biol.40,pp.3 47−369,1989)活性のレベルが高い場合であり、これは植物において 、真菌病原体による侵襲、並びに損傷及び昆虫の摂食に関連する機械的傷害を含 めた広範な刺激に応答して天然に発生する状況である。 トランスジェニック植物のCAD活性を抑制することは、植物のリグニン合成 を減少させ、それによって飼料作物の消化率を改善する方法として提案されてい る(国際特許出願公開第93/05159号)。この提案の際に行なわれた実験 は、リグニン生合成を定質的には変更できたものの定量的には必ずしも変更でき なかったことを示してはいるが、シンナムアルデヒドの蓄積が病原体からの保護 を増大する方法として望ましいことを証明または認識してはいない。 幾つかの植物CA4H及びCAD遺伝子がクローン化さ れており、それらの配列はGenBankから入手可能である。クローン遺伝子 の、異なる植物種間で保存されるヌクレオチド配列を含む部分を植物発現ベクタ ー(アンチセンスまたはセンス)中に直接用い、それによって対応する内在遺伝 子の発現を抑制することができる(例えばPear等,Antisense R es.and Develop.3,pp.181−190,1993;Nap oli等,The Plant Cell 2,pp.279−289,199 0参照)。更に好ましくは、上記保存遺伝子配列を用いて、改変するべき植物種 のcDNAライブラリーからCA4H及びCAD cDNAクローンを単離する 。次に、得られたcDNAクローンまたはその一部を植物発現ベクター(アンチ センスまたはセンス)に導入し、これを用いて(1種以上の)問題の植物を形質 転換する。本発明によるDNA構築物は好ましくは、内在CA4HまたはCAD 遺伝子と相同である少なくとも50塩基の配列を含む。 組み換え体DNA分子は、ベクターを有用なDNA断片に機能可能に連結し、 それによって植物形質転換に用い得るプラスミドを形成することにより作製し得 る。本明細書 では、遺伝子のクローン化部分に由来するRNAの発現を導き得るベクターを「 発現ベクター」と呼称する。このような発現ベクターは、プロモーターを含めた 発現制御要素を有する。高等植物における遺伝子発現に有用なベクターの典型例 は当業者に良く知られており、その中にはRogers等,Methods i n Enzymology 153,pp.253−277,1987に記載さ れた、Agrobacterium fumefaciensのTiプラスミド から得られるベクターが含まれる。導入遺伝子の強力な構成性発現を実現するべ く用いる通常のプロモーターに、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)3 5Sプロモーター(Pharmacia,Piscataway,NJから入手 可能)が有る。構成性プロモーター(CaMV 35Sなど)も、誘導性もしく は展開調節性(developmentally regulated)プロモ ーター(PAL遺伝子または内在CA4HもしくはCAD遺伝子由来のプロモー ターなど)も使用可能である。構成性プロモーターを用いると植物のあらゆる部 分の機能に影響が及びがちであり、一方誘導性もしくは展開調節性プロモーター を用いることには、必要な 条件下に組織中でアンチセンスまたはセンスRNAのみを生成させるという利点 が有る。本発明の使用では展開調節性プロモーターを用いることが好ましく、な ぜならフェニルプロパノイド生合成の負の調節は、異種PAL遺伝子を有するト ランスジェニック植物の発生の際に望ましくない副作用を生じかねないことが知 られているからである(Elkind等,Proc.Nat.Acad.Sci .87,pp.9057−9061,1990)。 様々な植物種の通常の形質転換に、幾つかの異なる軽質転換法を用い得る。双 子葉植物へのDNA転移に特に有効である一方法は、Agrobacteriu m属を用いることを含む。この方法では、スプライシングを施し、それによって (例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIまたはホスフィノトリシンア セチルトランスフェラーゼをコードする)選択性マーカー遺伝子を含む小型組み 換え体プラスミドとしたT−DNA領域の境界点間に問題の遺伝子を挿入する。 次に、組み換え体プラスミドをAgrobacterium属宿主に、形質転換 または三者(triparental)交配により導入する。(1種以上の)問 題の遺伝子を保持するAgrobacterium 属株を用いて、この細菌を適当な植物組織(例えばディスク形葉片)と共に培養 することにより当該植物組織を形質転換する。組織培養物中で形質転換細胞を、 適当な選択物質を用いて選択し、その後植物を再生させる(Horsch等,S cience 227,pp.1229−1231,1985参照)。植物細胞 、特により扱いにくい作物の形質転換に用いられている他の方法に、遺伝子銃に よる遺伝子撃ち込み(biolistics)及びエレクトロポレーションが含 まれる(プロトコルの詳細については、Sanford等,Methods i n Enzymology 217,pp.483−509,1993及びPo tter,Methods in Enzymology 217,pp.46 1−478,1993参照)。 トランスジェニック植物を作製したら、CA4H及びCADについての通常の 酵素アッセイを用いて、様々な形質転換体において達成された酵素活性抑制レベ ルを測定する。フラボノイドアルデヒドの蓄積を惹起し、しかも植物の発生には 望ましくない副作用を何ら及ぼさない十分に低い残留酵素活性を有するのは、作 製した形質転換体の僅かな部 分のみであると考えられる。そのため、CA4HとCADとの両方が抑制された 所望の形質転換体を作製する好ましい一方法では、2種の遺伝子を異なる形質転 換体に分けて導入し、後に標準的な交雑によって両遺伝子を組み合わせる。この 方法は、遺伝子抑制レベルのより多数の組み合わせを同時に評価することを可能 にする。 トランスジェニック植物においてフラボノイドアルデヒドを過剰生成させる方 法の一変形例では、植物遺伝子を用いて微生物宿主に、特定のフラボノイドアル デヒド及び/またはサポニンを合成する能力を付与する。得られた微生物は、発 酵系においてフラボノイドアルデヒドを生成させるのに用い得、またはフラボノ イドアルデヒドの天然送達系として生存もしくは非生存微生物製剤中に用い得る 。この方法に用いる生物として好ましいのは酵母、特にSachoromyce s cerevisiaeであり、なぜならこれらは既にPALを高レベルで発 現させるべく遺伝子操作されており(Faulkener等,Gene143, p.13020,1994)、また植物のシンナメート4−ヒドロキシラーゼは 酵母において機能することが判明している(Urban等,Eur.J. Biochem.222,pp.843−850,1994)からである。 PALの発現は、フェニルアラニンから桂皮酸を生成させる能力をもたらす。 フェニルアラニンからシンナムアルデヒドを生成させるには更に二つの酵素ステ ップが必要である。植物では、これらのステップは酵素のシンナメート:CoA リガーゼ(CL)及びシンナモイルCoAレダクターゼ(CCoAR)によって 触媒されるが、4−クマレートCoAリガーゼ(4CL)も桂皮酸を基質(su bstance)として用い得るので(Knobloch及びHahlbroc k,Arch.Biochem.Biophys.184,pp.237−24 8,1977)、4CLをCLの替わりに用いることも可能である。20種を越 えるクローン化PAL遺伝子及び6種を越える4CL遺伝子が十分詳細に開示さ れており(GenBank)、その結果これらの遺伝子は本発明の実施に容易に 用いることができる。CCoARをコードする遺伝子は、精製タンパク質のN末 端またはペプチドフラグメントのアミノ酸配列に由来するプローブ配列として用 いるcDNAクローンを単離する標準的な遺伝子クローニング技術 を適用することによって得られる。CCoARは、ダイズ培養物(Wengen mayer等,Eur.J.Biochem.65,pp.529−536,1 976;Luderitz及びGrisebach,Eur.Eur.J.Bi ochem.119,pp.115−124,1981)、トウヒの形成層汁液 (Luderitz及びGrisebach,上掲誌)、ポプラの木部(Sar ni等,Eur.J.Biochem.139,pp.259−265,198 4)、及びEucalyptus gunniiの分化する木部(Goffne r等,Plant Physiol.106,pp.625−632,1994 )から精製され、かつ部分的に特性解明されている。好ましい精製方法はGof fner等(上掲誌)の方法であり、なぜならSDS−ポリアクリルアミドゲル 上に、タンパク質配列決定に用い得るただ一つのタンパク質バンドが生じるから である。 クローン化遺伝子を標準的な発現ベクターに導入し、これを用いて微生物宿主 、好ましくは酵母を、エレクトロポレーションなどの標準的な形質転換技術で形 質転換する (Becker及びGuarante,Methodsin Enzymol. 194,pp.182−187,1991)。標準的な酵素アッセイを用いて、 操作した遺伝子の機能性発現を確認し、またフラボノイドアルデヒドについての アッセイを用いて最多産生株を選択する。フラボノイドアルデヒドは抗微生物特 性を有するので、導入された遺伝子の発現を増殖サイクルの後期にのみ、または 化学的誘導物質に応答して惹起する発現ベクターを用いることが好ましい。また 、遺伝子操作した微生物宿主を固定化全細胞反応容器内で増殖させ(例えばEv ans等,Biotechnology and Bioengineerin g 30,pp.1067−1072,1987)、それによってアルデヒドが 培地中に蓄積するのを防止することが望ましい場合が有る。 そのマイコトキシン含有レベルを制御し得る物質は消耗性であっても非消耗性 であってもよく、また好ましくは植物であるか、または植物に由来するが、微生 物毒素を産生する真菌で汚染されているか、または毒素産生微生物が定着する恐 れの有る、もしくは前記微生物の増殖を扶助し得る他のいかなる物質も処理可能 である。特に重要であるの は、鳥、魚、及びヒトを含めた動物による直接または間接消費用の作物である。 「直接または間接」という語は、作物が例えばヒトによって摂取され得(直接消 費)、または作物を摂取するのはヒト以外の動物や、鳥や魚であり、これらがま たヒトに摂取される(間接消費)ことを意味する。消費用作物には、タバコ、動 物及び鳥用の飼料、アルコールや、コーンシロップなどの食品への加工用である 作物等が含まれる。毒素産生真菌が定着する植物及び植物性物質には、例えばオ オムギその他のイネ科植物、イネ、トウモロコシ、コムギ、エンバク、ホップ、 キャッサバ、豆類、ジャガイモ、ラッカセイ、サツマイモ、トマト、サトウキビ 、ココヤシ、柑橘類、ブドウ、モロコシ、メロン、キュウリ、レタス、ホウレン ソウ、アーティチョーク、タマネギ、トマト、イチゴ及びタバコが含まれる。 加工果汁、高フルクトース濃度コーンシロップ、油、挽き割り、澱粉、アルコ ール、及びこれらその他のトウモロコシ由来成分を含有する製品などのトウモロ コシ製品、並びに葉巻、紙巻き煙草及び無煙煙草などのタバコ製品のような、植 物性物質に由来する製品のマイコトキシンレベルも、これらの製品の原料となる 物質における毒素産生真菌 の増殖を収穫前または収穫後に抑制または防止することによって制御し得る。同 様に、ウシノケグサ、コヌカグサ、アルファルファ、シロツメクサ及び芝土など の茎葉飼料、並びにウシ、ヒツジ、ブタ及びウマ用の飼料;シチメンチョウ及び ニワトリなどの鳥用の飼料;マス、ナマズ及びサケなどの魚用の飼料;ドッグフ ード及びキャットフードを含めたペットフード;及び実験動物用の飼料を含めた 、商品化された動物飼料の微生物毒素レベルも、物質自体もしくは前駆物質の収 穫前または収穫後処理によって制御し得る。 宿主植物の処理に加え、消費用の種子も本発明の製剤を用いて処理し得る。種 子には散剤状製剤を振り掛け得る(製剤を吸着させ得る無機物質の例については 米国特許第4,978,686号参照)。 本発明は様々な「無毒化」微生物も提供し、このような微生物は毒素産生微生 物の増殖を制御するのに用い得るか、または物質中に存在する有毒代謝産物を無 毒化するのに用い得る。例えば、植物や植物製品といった物質に、毒素産生細菌 及び/または真菌の増殖を低減する1種以上の細菌種を接種することによって真 菌の増殖を制御し得る。前記 接種には、毒素を、毒性をより僅かしか、または全く有しない形態へと分解もし くは変換する他の微生物を用いることもできる。接種に適した微生物の例には、 Bacillus megaterium、B.licheniformis、 B.subtilis、Cryptococcosesが含まれる。当然ながら 、他の無毒化細菌を用いて実質的に同じ成果を上げることも可能である。例えば 、毒素産生細菌及び/または真菌を無毒化活性についてスクリーニングするべき 1種以上の他の細菌と共に培養すれば、標準的なスタリーニング法を用いて他の 無毒化細菌を同定し得る。また、先に述べた抗真菌組成物は上記その他の細菌と 別個に用いるか、または組み合わせて用いることができる。 標的病原生物には、真菌であって、当該真菌にとって誘発体(elicito r)である植物の部分の表面に定着するものが含まれる。「誘発体」という語は 、当該植物が真菌に必要な栄養素を提供することを意味する。特に重要であるの は、フモニシン及びフザリン酸とこれらの構造類似体を産生する真菌である。特 定真菌の本発明の組成物に対する感受性を測定するには、実施例に述べたような in vitro及びin vivo試験を用い得、(処理前と処理後とでの)加害率 の変化をMPDCとして計算する。 本発明は、圃場条件下に置いた試料、及び/または圃場から得た物質、及び/ または前記物質に由来する物質中に存在する様々な微生物毒素及び毒素産生微生 物を同定及び定量するのに用いる方法及び組成物も提供する。最も好ましくは、 様々な植物並びに植物に由来する食料及び動物飼料を含めた農業製品を試験する アッセイを用いる。物質が許容不能なレベルの毒素で汚染されている場合は、当 該物質を汚染のレベル及び検出した微生物毒素の毒性に応じて処分及び/または 無毒化し得る。評価するべき試料は、当業者に知られた標準的な技術で所与のア ッセイに適するものを用いて回収及び調製可能である。 本発明は特に、問題の物質に定着し得る1種以上の毒素産生真菌及び/または 細菌の存在または不在をアッセイすることによって試料の微生物毒素汚染レベル を測定するのに用い得るアッセイを提供する。好ましくは、このアッセイは有毒 な代謝産物を産生する微生物、特に植物及び/または動物に有毒な二次代謝産物 を産生する真菌及び細菌の検出に用いる。前記真菌の例には、Ceratucy st is属、Fusicoccum属、Helminthosporium属、Rh ynochosporium属及びStemphyllium属の真菌、最も好 ましくはAspergillus属、Alternaria属、Fusariu m属及びPenicillium属の真菌が含まれる。前記細菌の例には、Co rynebacterium属、Erwinia属、Pseudomonas属 及びXanthomonas属の細菌が含まれる。上記アッセイを用いて、1種 以上の毒素産生微生物の存在または不在を指示する1種以上の非毒素産生微生物 の存在または不在を検出することも可能である。アッセイでの使用に適した非毒 素産生微生物もしくは細菌の例には、Bacillus megaterium 、Bacillus licheniformis、Bacillus sub tilis及びCryptococcosesが含まれる。 微生物の同定に用いるアッセイは当業者に知られている。それらの方法は、ク ロマトグラフィー技術の使用、並びに脂質、タンパク質及び/または核酸同定法 を用いる技術の組み合わせの使用を含む。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応及び/ または検出可能プローブを用いる組み換えDNA技 術を用い得る。核酸プローブ、抗体プローブ及び/または化学的プローブを用い れば、例えば1種以上の問題の微生物を直接または間接に検出できる。その他の 方法に、顕微鏡測定、及び試験植物または物質の表現型評価が含まれる。微生物 学的スクリーニング技術を用いることも可能である。例えば、或る種の試験微生 物が1種以上の標的微生物の存在または不在に対して検出可能に応答し得る場合 、微生物培養に依拠するアッセイを用い得る。 別の具体例において本発明は、1種以上の微生物毒素の存在または不在をアッ セイすることによって微生物毒素汚染レベルを測定するアッセイも提供する。好 ましくは、このアッセイは問題の物質に定着し得る1種以上の微生物が産生する 1種以上の有毒代謝産物の検出に用いる。検出する微生物毒素には細菌毒素、及 び真菌が産生する有毒代謝産物が含まれる。上記アッセイは特に、真菌が産生す る植物及び/または動物に有毒な1種以上の二次代謝産物の検出に用いる。最も 好ましくは、上記アッセイは、アフラトキシン、フザリン酸、フモニシン、TA /AAL毒素、ゼラレノン、トリコテセン、5−ブチルピコリン酸及び関連植物 毒性ピリジン誘導体と呼称される真菌マイコトキシン の存在または不在について試験するのに用いる。 本発明のアッセイは、問題の毒素と反応するか、または1種以上の毒素産生微 生物もしくは非毒素産生微生物が産生する、毒素の存在または不在を指示する他 の何らかの物質と反応する検出可能プローブ、例えば様々な化学的プローブ及び 抗体プローブの使用を含む。プローブは標準的な技術を用いて直接または間接に 検出し得る。最も好ましくは、本発明のアッセイは検出可能な化学的プローブ及 び/または抗体プローブの使用を含む。当業者に良く知られた方法を用いて、1 種以上の微生物毒素、もしくは1種以上の微生物毒素の存在または不在を指示す る無毒物質の存在または不在を試験する微生物感受性試験を行なうことも可能で ある。例えば、標準的なエイムス試験を用いて、微生物毒素の存在に対する微生 物の感受性を測定し得る。 別の具体例では、毒素産生微生物または微生物毒素自体の存在または不在を、 毒素及び/または毒素産生微生物に曝露されると検出可能に応答する試験動物を 用いてアッセイし得る。好ましい一具体例では試験動物を、1種以上の微生物毒 素及び/または毒素産生微生物を様々なレベルで含有する試料に曝露する。動物 は、単独の、または幾つか 組み合わせた毒素物質に曝露し得る。この試験では好ましくは、プラシーボ試料 に曝露した対照動物を用いる。 別の具体例において本発明は、1種以上の微生物毒素または毒素産生微生物が 試験動物に及ぼす有毒作用を試験するのに用いるアッセイも提供する。この方法 は特に、マイコトキシンへの曝露が一因で発生すると疑われる癌、ごく特定的に は口腔癌、食道癌及び肺癌における毒素の役割を評価するのに用い得る。毒性は 、試験動物が摂取した毒素のレベル、試験した動物の種類、及び試験期間の長さ などの要因に左右される。毒素または毒素産生微生物は食物、水、空気の中に存 在させて、または通常の環境への曝露によって試験動物に与え得る。毒性及び許 容量のレベルは動物の体重及び成熟度に左右される。これらのレベルのほとんど は臨床試験後に特異的に設定可能であると考えられる。 様々なマイコトキシンに関する危険曝露レベル(risk exposure level)は、飼料、食物及び煙草のうちのいずれを用いるかに従って様々 となる。異なる動物は異なる許容量を有する。また、毒性の効果が動物またはヒ トの余命を越えてしか現われないと考えられる場合も有る。マイコトキシンとの 接触の悪影響は、圃場での 作業者、研究者及び試験動物の間で最小化される。このように、本発明を用いれ ば、農業製品全般をヒト、動物、魚または鳥の消費により安全であるように改良 することができる。植物及び植物に由来する製品に関連する微生物毒素レベルを 制御することにより、毒素消費に関連する動物及びヒトの健康上の問題を軽減ま たは排除し得る。 本発明は、多くの煙草関連疾患はタバコ製品中にマイコトキシンが存在するこ とに起因するという推論を掲げるものであり、従って本発明は、煙草を噛み、ま た吸うことの悪影響を低減するのにも有用である。即ち、煙草の毒性はマイコト キシンその他の二次代謝産物を減少させる物質の添加によって、特に真菌の代謝 産物産生を抑制するのに十分な量の病原体抑制組成物で煙草を処理することによ って低下させ得る。 同様に、本発明は、常緑樹及び果樹、粗製材(gross lumber)、 ブドウ、観賞植物、牧草のマイコトキシン汚染、並びに果樹の接ぎ木に起因する マイコトキシン汚染の軽減にも用い得る。更に、マイコトキシン汚染を防止する ことにより、植物由来の食料や副産物を、水や空気によって運ばれるようになり かねない形態の毒素を放出 しないようにして処分することが可能となる。即ち、本発明は、イネ、コムギ及 びワタの殻(hulls)並びに通常の植物破片(debris)などの、しば しば焼却処分される農業副産物の安全な処分を促進するべく用い得る。そのうえ 、毒素産生微生物が定着することが知られている植物性物質から製造した製品の 毒素含量は、特定の真菌種、即ち収穫前の物質に定着するFusarium属種 など及び/または収穫後の物質に定着するAspergillus属種などが産 生する二次代謝産物のレベルを測定することによって改善し得る。特に、高フル クトース濃度コーンシロップなどのトウモロコシ製品は、Fusarium属種 が産生する幾つかの毒素のレベルを測定し、その後前記レベルの低下に必要な手 段を講じることによって改良し得る。 Fusarium属種などの生物から同定した有毒二次代謝産物を医薬として 用いることも可能である。この分野では、従来認められていない化学構造が認識 されることによって、その除草剤、殺虫剤、殺真菌剤及び医薬としての特性を調 べ、またその商業的な量での生産方法を探究するべき幾つかの構造が得られると 予想される。 以下に示す実施例は詳細な説明のためのもので、本発明を限定するものではな い。 実施例 実施例1 トウモロコシ上の病原真菌の処理 桂皮アルデヒド製剤及び成分、コニフェリルアルデヒド製剤、並びに桂皮アル デヒド製剤とコニフェリルアルデヒド製剤との組み合わせで三つの処理を行なう 実験を、病原真菌の加害に対して感受性であることが知られている、圃場で成長 させたトウモロコシにおいて評価する。殺真菌薬処理前に植物を変種毎に纏め、 試験植物に関して無作為抽出した。真菌加害に対して感受性である様々な変種を 、桂皮アルデヒド及び/またはコニフェリルアルデヒド単独の作用、並びにTw een 80及び/またはNaHCO3との組み合わせの作用を評価する次のプ ロトコルを用いて試験する。 (Paulus及びNelson,Calif.Agric.42,p.15 ,1988に従い)真菌感染を評価後、各植物に一回葉面散布剤を適用し、前記 散布剤は流亡させる。各植物について記録する応答変数は、 Paulus/Nelson(上掲誌)評点スケールに基づく真菌感染評点であ る。処理の直前及び4日後に、植物を上記スケール上で評価する。 実施例2 ピッチ癌腫病の処理 (Fusarium subglutinans) (a)in vitro試験 真菌のFusarium subglutinansf.sp.piniによ って誘発されるピッチ癌腫病(pitch canker disease)は 、感染樹木の苗条、枝、露出根及び幹の表面への樹脂滲出を特徴とする。ピッチ 癌腫病病原体の宿主及び地理的分布の範囲は、この病原体が1986年にカリフ ォルニアで初めて発見されて以来大幅に拡大している。上記病原体は最近では、 メキシコ及び日本で発見された。ピッチ癌腫菌の媒介者としてのキクイムシ(S colytidae;IPS種)の関与がFox等によって示されている(Pl ant Dis.75,pp.676−682,1991)。 Fusarium subglutinans f.sp.piniの放射状 増殖の抑制に基づくバイオアッセ イを用いて、様々なアルデヒド製剤を試験した。バイオアッセイは滅菌条件下に 二重盲検方式で行なった。示した濃度は総て、寒天で稀釈する前の特定溶液の濃 度である。8mlの試験製剤を200mlの溶融2%ジャガイモデキストロース 寒天(DIFCO)にピペットで加え、得られた混合物を5個のプラスチック製 ペトリ皿(各25ml容)内に分散させた。陽性対照として5ppmのベノミル の試験製剤、陰性対照として滅菌H2Oを用いた。各試験製剤に関して4個のプ レートそれぞれの中央に、Fusarium subglutinans f. sp.pini(分離株SL−1、UCB)の増殖PDA培養物から取り出した 寒天プラグを接種した。5番目のプレートは増殖抑制に関する対照として接種を 行なわずにおいた。 接種プレートと非接種プレートとの総てを18℃で5日間インキュベートし、 その後コロニー直径を測定した。結果を次表に示す。コロニーが大きいほど、試 験製剤の効力は小さい。コロニーが生じないこと(直径=0)は最大の増殖抑制 効果を示す。 上記結果は、(サポニンを添加したかまたは添加しない)賦形剤中の様々な濃 度の桂皮アルデヒドがFusar ium subglutinansの放射状増殖を、2%グルタルアルデヒドが 抑制したのと同様に抑制したことを示している。12,500ppmでは、放射 状増殖は完全に抑制された(表1参照)。サポニンを添加した場合にみられる放 射状増殖の増大は、サポニンに関して報告されている成長促進特性に起因するか もしれない。 (b)モンテレーマツ種子の処理 その半分に10〜1,000ppmの桂皮アルデヒド及び/またはコニフェリ ルアルデヒドを含有する澱粉−デキストラン(dextra)製剤を振り掛けた モンテレーマツ(Monterey Pine)の種子を、10〜1,000p pmの桂皮アルデヒド及び/またはコニフェリルアルデヒドを含有する製剤を混 入したバーミキュライト中に播く。種子を播いた時点でバーミキュライトに、マ ツ癌腫病(pine canker disease)を誘発するFusari um属の接種材(inoculum)を添加する。処理しないバーミキュライト 中の種子を対照として用いる。 実施例3 イチゴ根腐病の治療 (Phytophthora fragariae) イチゴ根腐病(red core disease)は、感染した植え付け物 質、または感染破片の長命な卵胞子で汚染された土壌を介して拡散する真菌のP hytophthora fragariae Hickmanによって誘発さ れる。桂皮アルデヒド及び/またはコニフェリルアルデヒドを含有する様々な製 剤を次のように試験する。Phytophthora fragariaeに感 染したイチゴの根を解離させ、これを汚染コンポストと十分に混合し、かつ4〜 6週間分解させて、十分に腐敗した処理用接種材を製造する。得られた接種材を 1kgロットに分割し、様々な濃度の試験製剤1,500mlと混合する(表2 参照)。10分間処理後、コンポストを25mm篩上で流れる水道水で最低でも 5分間濯ぎ、それによって残存する試験製剤を総て除去する。次に、コンポスト を9cm径のプラスチック製植木鉢に入れ、各鉢に4本のイチゴの苗を植える。 各処理毎に5個の植木鉢を用いる。苗を環境制御室内で、温度15℃、日照18 時間で生育し、その際コンポストを湿潤に維持して感染を促進する。植木鉢は格 子上に配置して、処理試料同士の間での交叉感染(cros s infection)を回避する。 9週間後、イチゴの苗の根を洗浄してコンポストを落とし、根を長手方向に切 断して赤色の中心柱、及び腐敗した、もしくは褐色の根を探すことにより感染の 兆候を調べる。感染は総て、Phytophthora fragariaeの 卵胞子の存在について根の切片を顕微鏡検査することにより確認する。 実施例4 柑橘類果実の収穫後処置 この実験の目的は、桂皮アルデヒドの柑橘類果実用収穫後防腐剤活性を評価す ることである。40個のカリフォルニアオレンジを選果包装施設ロットから、凍 害果を除去した後無作為に選出する。20個の処理用オレンジをタンク内で石鹸 及び試験製剤濃縮物で処理し、その後洗浄し、石鹸及び殺生物剤を刷毛塗りする 。5分後、処理したオレンジを淡水で濯ぐ。対照は淡水で洗浄するのみとする。 処理ロットも非処理ロットも乾燥する(果実表面から水分を排除する)。処理ロ ットに100mlの製剤をタンブラー内噴霧(spray in tumble r)し、このロットを10分間風乾し、カートンに詰め、一時貯蔵倉庫に置く。 対照ロットには100mlの蒸留H2Oをタンブラー内噴霧し、これを10分間 風乾し、カートンに詰め、一時貯蔵倉庫に置く。20日後、両ロットを生理的及 び病理的傷害について評価する。 実施例5 地下野菜(塊根、塊茎及び球茎)の収穫後処置 この実験の目的は、桂皮アルデヒドの地下野菜(und erground vegetable)用防腐剤活性を評価することである。 このグループの野菜の可食部はほとんど地下で発達し、該可食部には幾つかの植 物構造が含まれる。 ●塊根: ビート、ニンジン、根用セロリ、ハツカダイ コン、セイヨウワサビ、パースニップ、サツ マイモ、キャッサバ、ジャイカマ(jica ma)。 ●塊茎: ジャガイモ、キクイモ、ヤマノイモ。 ●球茎: タマネギ、ニンニク、シャロット。方法 40個のジャガイモ塊茎を圃場の貯蔵場(fieldbins)から無作為に 選出する。これらのジャガイモを選果包装施設において6日間熟成させ(cur e)、それによって周皮の形成を確実にする。ジャガイモを熟成場所から取り出 し、試験用に各20個の2グループに分ける。処理グループの20個のジャガイ モを洗浄し、その後それぞれに10mlの製剤を噴霧する。処理しないジャガイ モは清浄なH2Oで洗浄する。処理及び非処理ジャガイモを消費者包装用パッケ ージに別々に詰め、一時貯蔵倉庫に置 く。30日目、60日目、90日目及び120日目にジャガイモを病理的傷害に ついて観察及び評価する。 実施例6 果菜の収穫後処置法 この実験の目的は、桂皮アルデヒドの果菜用防腐剤活性を評価することである 。果菜は通常長期貯蔵に適応しない。例外は硬皮カボチャ(冬カボチャ)及び夏 カボチャ(pumpkin)である。重要な未成熟果菜に、マメ科植物(leg umes)、ウリ科植物(軟皮カボチャ)、ナス科植物(ナス、コショウ等)、 オクラ及び甘味種トウモロコシが有る。重要な成熟果菜はウリ科植物(カンタロ ープ、ハネデューまたは他のマスクメロン;スイカ、硬皮カボチャ及び夏カボチ ャ)である。(ナス科植物:成熟グリーントマト及び完熟(vine ripe )トマト、成熟コショウ。)方法 40個のトマト果(完熟)を選果包装施設のばら積みゴンドラ(bulk g ondola)から無作為に選出する。20個の処理用トマトを澄明な水で濯ぎ 、その後ころコンベヤセクションにおいて100mlの試験製剤を噴霧 して処理する。20個の非処理トマトにはころコンベヤセクションで100ml のH2Oを噴霧する。処理及び非処理トマトを(処理したものとしないものとで )別個のプレイスパック(place pack)に入れ、一時貯蔵倉庫で10 日間貯蔵する。3日目、6日目及び10日目にトマトを病理的傷害について観察 及び評価する。 実施例7 桂皮アルデヒドの防腐剤活性 この実験の目的は、桂皮アルデヒドの花菜、葉菜及び茎菜用防腐剤活性を評価 することである。葉菜、茎菜及び花菜の(非限定的な)代表例は次のとおりであ る。 ●葉菜: レタス、キャベツ、メキャベツ、セロリ、ホ ウレンソウ、ハタマネギ、チコリ、エンダイ ブ。 ●茎菜: アスパラガス、キュウケイカンラン、ウイ キョウ。 ●花菜: アーティチョーク、ブロッコリー、カリフラ ワー。方法(花菜のカリフラワーを収穫後に処置する例) 40房のカリフラワーを選果包装施設ロットから選出す る。選出したカリフラワーから葉を刈り取る。20個の処理用房に各10mlの 試験製剤を噴霧し、その後房をくるむ。処理しない20個の房には10mlのH2 Oを噴霧し、その後房をくるむ。処理した房及び処理しない房を別々の箱に入 れ、一時貯蔵倉庫で10日間貯蔵する。3日目、6日目及び10日目に房を病理 的傷害について観察する。 実施例8 切り花の収穫後処理 バラ水溶液微生物 切り花の長い寿命は、切り花の十分な給水状態が収穫の瞬間から家庭で萎れる まで維持されるかどうかに依存する。良好な給水状態のための二つの決定的要因 は、乾燥処置後の再水和と、茎が水中に有る時は常に花瓶液中細菌(vase solution bacteria)を防除することである。切り花のための 花瓶用防腐剤中には一群の市販殺生物剤が用いられているが、それらのなかに特 に有効であったり効力が持続したりするものは無い。このバイオアッセイは、新 型の花瓶用防腐剤、及び花瓶液中に用いられる殺生物剤としての潜在能力を有す る桂皮アルデヒド製剤を用いることによって花瓶液中の細菌の増殖を防止する 可能性を試験する。方法 20本の新たに摘心したバラ(Hybrid tea)及び20本の新たに摘 心したカーネーション(Dianthus caryophyllus)を、4 cmの茎がプラスチック製育児用哺乳壜の環状頂部を越えて伸長するようにカッ トする。各花を、テープで台に固定し、かつ滅菌哺乳壜ライナーでライニングし た別々の壜に挿す。2種の切り花それぞれの10本を処理グループ、10本を対 照グループとして用いる。いずれのグループの花にも10mlのH2Oを与える 。処理用切り花に20〜50ppmの一連の製剤を適用する。切り花の老化を観 察し、記録する。 実施例9 トランスジェニック植物におけるフラボノイド アルデヒドの過剰産生 20μgのポリA RNAを調製し、cDNAを合成する。得られたcDNA の一部をλ−ZAP IIベクター(市販クローニングベタター)中へクローン化 する。GenBankから入手したクローン化CA4H及びCAD遺伝子の保存 配列から設計したか、または所期の宿主植物か ら得た精製タンパク質のペプチド配列から設計したオリゴヌクレオチドプローブ を用いて少なくとも500,000の組み換え体をスクリーニングする。盛んに ハイブリダイズするクローンを選択し、これをcDNAライブラリーの再スクリ ーニングに用いる。得られたクローンを配列決定し、それによって適当な遺伝子 配列を植物発現カセットにアンチセンスまたはセンスの向きで導入することを可 能にする。アンチセンス及びセンス構築物をAgrobacterium tu mefaciens LBA4404に、公表された操作に従っての直接形質転 換によって導入する。タバコ(N.tabacum var.Samsun)の ディスク形葉片を、十分に確立され、かつ公表された操作(Horsch等,S cience 227,pp.1229−1231,1985)を用いて形質転 換する。CA4HまたはCAD構築物を有する植物をPCRによって同定し、更 に分析するべく選択する。 形質転換した植物と、形質転換しなかった対照植物との両方に由来する植物性 物質を用いてCA4H及びCAD酵素活性を、十分に確立され、かつ公表された アッセイによって測定する。CA4HまたはCADの活性が対照植物 にみられる活性の20%未満に低下した植物を、更に分析するべく選択する。選 択したCA4H活性の低い植物をCAD活性の低い植物と交雑し、両方の遺伝子 構築物を受け継いだ子孫をPCRによって選択する。抑制されたCA4H活性及 び抑制されたCAD活性を有する植物をフラボノイドアルデヒド産生に関して、 公表された標準的操作を用いて分析する。 実施例10 微生物系のフラボノイドアルデヒド産生 6週齢のタバコの茎から抽出したRNAを用いてcDNAライブラリーを生じ させる。20μgのポリA RNAを調製し、cDNAを合成する。得られたc DNAの一部をλ−ZAP IIベクター(市販クローニングベクター)中へクロ ーン化する。Goffner等,PlantPhysiol.106,pp.6 25−632,1994のプロトコルを用いて6週齢のタバコの茎組織から精製 したCCoArタンパク質のペプチド配列から設計したオリゴヌクレオチドプロ ーブを用いて少なくとも500,000の組み換え体をスクリーニングする。盛 んにハイブリダイズするクローンを選択し、これをcDNAライ ブラリーの再スクリーニングに用いる。得られたクローンを配列決定し、それに よって完全長cDNA挿入物の同定と、適当なCCoAR遺伝子配列の酵母発現 ベクターpMTL8110(Faulkner等,Gene 143,pp.1 3−20,1994)への導入とを可能にする。Rhodosporidium toruloidesのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL;Ge nBankローカスはRHDPAL)及びパセリの4−クマレート:CoAlリ ガーゼ(4CL;GenBankローカスはPC4CL1AA)のコーディング 配列も同等の酵母発現ベクターに同様に導入する。PAL、4CL及びCCoA R構築物を用いてSaccharomycescerevisiae株を、確立 され、かつ公表された操作(Becker及びGuarente,Method s in Enzymology 194,pp.182−187,1991; Simon,Methods in Enzymol.217,pp.478− 483,1993)を用いるエレクトロポレーションによって形質転換する。ロ イシンを欠く最小培地上で形質転換体を選択する。上記3種の遺伝子構築物を総 て有する形 質転換株をPCRによって同定し、更に分析するべく選択する。 形質転換した株と、形質転換しなかった対照株との両方から得た抽出物を用い てPAL、4CL及びCCoAR酵素活性を、十分に確立され、かつ公表された アッセイによって測定する。PAL、4CL及びCCoARの活性が対照株にお いて検出されたバックグラウンド活性より著しく高い株を、更に分析するべく選 択する。選択した株をフラボノイドアルデヒド産生に関して、公表された標準的 操作を用いて分析し、有意量のシンナムアルデヒドを産生する株を発酵条件の最 適化のために選択する。 実施例11 疫病の処理 (Phytophthora infestans) 疫病(late blight)はトマト、ジャガイモ、ナス、及びジャガイ モの仲間である他の植物を冒す病気で、温暖な時期に真菌胞子が濡れた植物表面 に付着すると発病する。Phytophthora Infestansの防除 について試験する実験を温室内で、ジャガイモの実生を用いて行なう。温室内で 植物に病原体の単離物を噴霧し、 それによって接種を実現する。接種前または接種後に植物を、表2に示したよう な処理プロトコルであってα−ヘキシル桂皮アルデヒドの試験のための第三のパ ネルを含むプロトコルを用いて病原体で処理する。乳化剤としてTweenの替 わりに十分量のサポニンを用いる付加的な処理操作も試験する。処理後2週間及 び3週間を経た時点で処理の効果を評価する。 ヒト及び動物が消費する食物のほとんどは動物または植物に由来し、かつ微生 物毒素の既知の活性を付与されるので、収穫前及び/または収穫後に蓄積し、か つ加工後にも存続する微生物産生毒素の存在はマイコトキシン汚染と関係付けら れる多数の健康障害の少なくとも一因ではあると考えられる。消耗製品の微生物 毒素レベル、及び環境中に存在する或る種の物質に関連して見出される微生物毒 素レベルを制御することによって、微生物毒素摂取と関係付けられる癌、肝疾患 その他の疾患、特に汚染された穀粒食物及び動物飼料の消費に関連する疾患、並 びにコーンシロップなどの穀物製品に関連する疾患を減少させ得る。加えて、動 物飼料、及びタバコなどの或る種の試験物質に関連するマイコトキシンを制御す ることによって実験動物試験操作 を改善することも可能である。そのうえ、タバコに関連する微生物毒素のレベル を制御することによって、煙草を噛んだり吸ったりすることと関係付けられるヒ トの癌も減少させ得る。 問題の物質に関連する有毒代謝産物には細菌及び/または真菌が産生するもの が含まれ、特に真菌のマイコトキシン、及び類似の特性を有する他の二次代謝産 物が含まれる。本発明の方法及び組成物は、Aspergillus属、Alt ernaria属、Fusarium属及びPenicillium属の真菌、 特にアフラトキシン、フモニシン、フザリン酸、TA/AAL毒素、ゼラレノン 、並びにトリコテセン、5−ブチルピコリン酸及び関連する植物毒性ピリジン誘 導体を含めた1種以上のマイコトキシンを真菌が産生する1種以上のマイコトキ シンのレベルを制御するのに特に適する。 本明細書中に言及した刊行物及び特許出願はいずれも、本発明が属する技術分 野の当業者の技術レベルを示している。これらの刊行物及び特許出願は総て、個 々の刊行物または特許出願が参考として含まれるものであることを特定的かつ個 別に示された場合と同じ程度において本明細書に 参考として含まれる。 このように本発明を詳細に説明したので、添付した請求の範囲各項の思想また は範囲を逸脱することなく本発明に多くの変更及び変形を加え得ることは当業者 には明らかであろう。
【手続補正書】特許法第184条の8第1項 【提出日】1997年1月17日 【補正内容】 消耗製品における有毒代謝産物レベルの調節 序論 発明の分野 本発明は、消耗製晶(consumable products)に存在する 有毒代謝産物のレベルを制御する方法及び組成物に係わる。用いる組成物は芳香 族アルデヒド及び真菌二次代謝産物を含有する。発明の背景 黴に起因する農業製品(agricultural products)の汚 染及び劣化は経済的損失を招き、かつ健康を脅かす。Aspergillus属 、Alternalia属、Fusarium属及びPenicillium属 の真菌は食用作物とその製品を汚染する恐れが有る。上記真菌が産生するマイコ トキシンには、アフラトキシン類、フモナシン類(fumonasins)、フ ザリン酸、TA/AAL毒素、ゼラレノン、並びにトリコテセン、5−ブチルピ コリン酸及び関連する植物毒性ピリジン誘導体が含まれる。これらのマイコトキ シンはヒトを含めた様々な種に対してきわめて有毒であり、しかも商品とし て製造された食料及び動物飼料中に見出される場合も有る。マイコトキシンを産 生するいずれかの属の真菌で汚染された物質を鳥(fowl)、魚、動物または ヒトが経口摂取すると、健康上重大な問題が生起しかねない。 マイコトキシンは二次代謝産物であり、Aspergillus属の様々な種 が産生するものが最も良く知られている。一例として、Aspergillus flavusは様々な植物性物質において増殖して、ヒト及び他の多くの動物 種に有毒な低分子量マイコトキシンであるアフラトキシンを産生する。この毒素 の実際の、また潜在的な危険性は1960年、真菌によって汚染された魚用飼料 がもたらした商業的魚卵孵化場での大規模なマスの中毒によって劇的に判明した 。フモニシン類(fumonisins)も、ウマ、ブタ、ニワトリ及びシチメ ンチョウを含めた、商業的に有益な家畜の成長及び健康に悪影響を及ぼすことが 判明している。フモニシン類はまた、生物医学的調査及び商晶試験に広く使用さ れる動物の飼育に用いられる食料中に同定されてもいる。従って、実験動物がマ イコトキシンで汚染されて変質しかねない食物で飼われている場合、調査結果は そのまま信用できないかもしれない。 フモニシンは、或る種の食用作物製品中に見出される汚染物質である一群のマ イコトキシンの代表例である。 従って、消耗物質の汚染を防止し、また製品中にマイコトキシンが存在すること を確認し、毒素で汚染された、消耗物質でない物質を無毒化してこのような物質 への曝露に関連する健康への悪影響を低減することに用い得る方法を開発するこ とは有益である。そのうえ、消耗製品が食物連鎖に加わるかもしくはそれ以外で 消費される前、間及び/または後に蓄積する微生物毒素(microbial toxins)のレベル及び有毒作用を制御することがきわめて望ましい。参考文献 噛み煙草の貯蔵葉にマイコトキシンが存在することが、Varma等,Myc opathologia 113,pp.19−23,1991に記載されてい る。Bowles及びMiller,J.Food Protection 5 6,pp.788−794,1993には様々な芳香族及び脂肪族アルデヒドの 抗ボツリヌス特性が開示されている。桂皮アルデヒドを含有する他の製剤が作物 を病原微生物の攻撃から保護することが報告されている。米国特許第4,978 ,686号及び同第5,149,715号並びにフランス特許出願公開第252 9755号 を参照されたい。重炭酸ナトリウム及び軽質パラフィン系石油などの膜形成及び /または発散防止被覆ポリマーは真菌定着のレベルを制御することが報告されて いる。Horst等(Plant Disease,p.247,March 1992)、Elad等(Phytoparasitica 17,pp.27 9−288,1989)及びHagiladi等(J.Environ.Hor tic.4,pp.69−71,1986)参照。特願昭56−4965号には 、桂皮アルデヒドの乳濁液を用いて農産物を昆虫、微生物及び細菌から保護し、 それによって当該農産物の物理的損傷を防止することが報告されている。製剤は 即効性で、しかも残留物を残さないと報告されている。 発明の概要 本発明は、毒素産生微生物が定着したかまたは定着し得る様々な消耗製品に存 在する有毒代謝産物のレベルを制御する方法及び組成物に係わる。本発明の方法 は、消耗製品またはその前駆物質を、該消耗製品またはその前駆物質に定着して (1種以上の)毒素を産生する1種以上の微生物の定着を制限し、前記微生物を 殺し、または前記微生物を 駆除(displace)する組成物、特に芳香族アルデヒドと接触させるステ ップを含む。本発明は、植物性物質由来の消耗製品に存在する有毒代謝産物のレ ベルを制御すること、及び真菌の毒素及び有毒代謝産物による食物連鎖の汚染を 低減することに有用である。 生の果実や野菜のみでなく、植物から製造される消耗製品である煙草、及び鳥、 動物、魚その他の、ヒトの食物連鎖の要素のための食用穀物のマイコトキシン汚 染も回避されるように植物を長期間保護するべく企図された製剤中に前記アルデ ヒドを存在させて植物に対し用いることはこれまで行なわれてこなかった。即ち 、動物の餌とする物質を処理すれば食物連鎖内の毒素が減少し、または排除され る。本発明はまた、毒素を産生する真菌を減少させ、または排除する処理によっ て農産物を収穫前または収穫後に無毒化することにより、動物及びヒトがその環 境において、例えばあらゆる種類の汚染サイレージ物質の焼却及び/または処分 がもたらす、水及び空気によって運ばれるマイコトキシン源に曝露されることを 低減するという利点も有する。即ち、上記無毒化操作は植物、植物性物質、及び これらに由来する食料などの物質の安全な処分を可能にする。 毒素産生生物を殺し、または該生物が定着した植物や植物部分から駆除し、そ れによって当該物質に通常蓄積する毒素の量を制限するのに、天然生成物(na turalproducts)を含有する組成物を用い得る。組成物は収穫前の 植物に適用するか、または収穫及び/または加 工後の植物もしくは他の物質に適用する。最も好ましくは、組成物は収穫前の植 物、植物部分または組織に適用する。組成物は好ましくは生物分解性であり、最 も好ましくは水溶液としてか、またはTween 80などの生物分解性である 水溶性無水ノニオン界面活性剤を媒質とした乳濁液として、場合によっては成長 促進剤、及び植物のYucca shidigeraに由来し得るサポニンなど の界面活性剤と共に用いる。組成物に対する特定真菌の感受性はin vitr oまたはin vivoで評価し得る。 特に重要であるのは、病原真菌を直接殺し、及び/または様々な病原真菌に対 する植物の全身耐性を誘導するのに用い得る様々なアルデヒド、特に芳香族アル デヒドである。本発明の方法は、病気の植物または病原体の攻撃を受けやすい植 物の一つ以上の部分または組織を標的病原生物の増殖の制御に十分な量の抗病原 薬と接触させ、及び/または前記部分または組織に前記抗病原薬を提供するステ ップを含む。 〔式中Rは−CH2OHまたは−CHOであり、nは0〜3の整数であり、各R1 は独立にOHであるか、または1〜10個の炭素原子及び0〜5個のヘテロ原子 を有する有機置換基であり、その際この化合物の全R1置換基の炭素原子及びヘ テロ原子の総数は15以下であり、R4は水素であるか、または1〜10個の炭 素原子を有する有機置換基である〕。この化合物は、シンナムアルデヒド、コニ フェリルアルデヒド及び近接関連化合物などの天然化合物を包含し、病原体加害 (infestations)をバイオコントロールする方法を提供する。「バ イオコントロール」という語は、植物病原体を直接的な抗病原体活性によって、 及び/または病原体加害に対して誘導された宿主植物の耐性によって防除するこ とを意味するものとする。 本発明の方法は、葉、根もしくは花部分といった植物部分、または木部や師部 といった組織の真菌定着面に、活性 成分として天然生成物を含有する組成物を提供することによって実施し、及び/ または前記組成物はそこで真菌が増殖しているか、または増殖しようとしている 基質に適用し得る。植物自体または根圏に適用する抗病原薬の量は加害度と、或 る程度は用いる製剤及び特定の配合法とに依存し、従って最良の成果を得るべく 経験的に決定される。「定着」という語は、微生物または昆虫と、これらの病原 体がそこから栄養素、典型的にはアミノ酸、特にメチオニンなどの必須栄養素を 得る植物部分または組織との関連を意味するものとする。「天然生成物」という 語は、或る生物だけのものであるか、または少数の近接関連生物に共通する天然 起源の有機化合物を意味するものとする。前記化合物には真菌の二次代謝産物、 及び植物が産生する化学物質が含まれる。「提供」という語は、植物に内在し、 及び/または遺伝子操作によって供給される抗真菌化合物を植物部分に外部から 適用することと、前記抗真菌化合物の植物における合成を誘導することとを意味 するものとする。遺伝子操作は通常の交雑育種法によってか、または 天然生成物は、天然源から単離するか、その全体もしくは一部を合成するか、ま たは植物自体もしくは別の生物において組み換え技術により製造することができ る。 好ましい一化合物は下記の式(2)を有する。 〔式中R1は−CHOであり、R3は−Hであるか、−OHであるか、または1〜 10個の炭素原子を有する有機置換基であり、R2は−Hであるか、メトキシ基 であるか、または1〜10個の炭素原子を有する有機置換基であり、R4は水素 であるか、または1〜10個の炭素原子を有する有機置換基である〕。特に重要 であるのは芳香族アルデヒドである。本発明に有用な芳香族アルデヒドの例に、 桂皮アルデヒド(下記(3)) 及びコニフェリルアルデヒド(下記(4)) が有る。 通常、α位に位置する基は5〜10個の炭素原子を有する。このような化合物に はα−ヘキシルシンナムアルデヒド及びα−アミルシンナムアルデヒドが含まれ る。α−ヘキシル桂皮アルデヒドの化学構造は(5)(下記)に示すとおりであ る。 Chemical Abstracts Service(CAS)名は2−( フェニルメチレン)オクタナールであり、CAS登録番号は[101−86−0 ]である。この化合物は2−ヘキシル−3−フェニル−2−プロペナールの化学 名でも記載されている。この化合物の分子式はC1520Oであり、分子量は21 6.3である。HCAはFirmenichから入手可能であり、前記会社の製 品は主に(E)−cis異性体(最高93.8%)から成り、(Z)−tran s異性体(最高6%)も含有する。微量成分の一つはオクタナールの自己アルド ール縮合物である (1〜1.5%;June Burkhardt,Firmenich,Pla insboro,NewJerseyからの私信)。 化合物は単独で用いても他の活性または不活性物質と組み合わせて用いてもよ く、また該活性化合物を目下の特定目的により良く適するような濃度で含有する 濃縮液、溶液、懸濁液、粉末等の形態で、吹き付け、注ぎ掛け、浸漬により適用 し得る。化合物を、例えば適当な溶媒を用いて製造した稀釈溶液の形態で灌漑ス ケジュールの一環として、または分離適用として根圏に直接適用することも可能 である。 葉面散布剤として用いる場合、アルデヒド単独でも調剤可能であるが、Twe en 80や、界面活性剤特性は有するが製剤の抗真菌特性を甚だしく損なうこ とはないサポニンなどの化合物といった乳化剤を十分な量で含有させることによ って製剤を実体的(substantive)なものとすることができる。通常 、製剤中の洗剤は芳香族アルデヒドの抗真菌特性を低下させず、製剤の実体性を 向上させる。例えば米国特許第4,477,361号を参照されたい。 試験成分の有効量は、植物製品中に残存するマイコトキシンを問題の特定作物に とって許容可能なレベルに制御する量と看做し得る。製剤を、特定の病原体に対 して感受性である宿主植物を植え付ける土壌または他の生育基質の調製か、既に 加害された生育基質への適用か、または収穫物への適用に用いる用途では、本発 明の製剤は根圏、基質または収穫物に直接適用し得、あるいはまた該製剤を固体 支持体に結合させたり、長時間放出(time release)物質に封入し たりすることも可能である。固体支持体を用いる場合、活性アルデヒドを酸化し かねない物質は回避するべきである。送達系の例には澱粉−デキストラン等が含 まれる。送達系の例に関してはYuan等,Fundamental and Applied Toxicology 20,pp.83−87,1993を 参照されたい。また、Kawada等,10,pp.385−389,1994 も参照されたい。 式(1)、(2)、(3)、(4)及び(5)の特定化合物並びに場合によっ ては先に示したサポニンに加え、前記化合物のうちのいずれかの誘導体であって 、生物系の作用を受けると先に定義した式の化合物を生成させる誘導体 も本発明の化合物と均等と看做される。即ち、植物部分もしくは組織または収穫 物に前駆化合物を適用することは本発明の実施と均等である。前駆化合物の芳香 族アルデヒドへの生物変換は、例えば米国特許第5,149,715号及び該特 許中に引用された参考文献に開示されている。Casey及びDobb,Enz yme Microb.Technol.14,pp.739−747,199 2も参照されたい。前駆化合物の例には、アミノ酸アンモニアリアーゼ経路中の ものなど、植物病原体に対する植物耐性に対する獲得及び/または全身耐性に関 連する経路中のものが含まれ、かつ(桂皮酸を生成させる)フェニルアラニンが 含まれる。前駆化合物には外にも、リグニン及びクマリンのための生物学的経路 中のもの、例えばp−クマリン酸を生成させるチロシンなどが有る。従って、式 (1)、(2)、(3)、(4)及び(5)の特定化合物の前駆体及び誘導体で あって、所望の抗病原作用及び毒素減少作用を有する製剤をもたらすものは本発 明の均等物と看做される。 標的生物次第ではアルデヒドを固体支持体と、該固体支持体がセルロース、特 に微晶質セルロースなどの多糖であ る場合の多糖由来の結合ドメインなどのリンカーを任意に介して結合させ得る。 セルロース結合ドメインの調製は、 問題の組織におけるサポニンの生合成を選択的に制御するためには、前記組織に おけるサポニンの合成に必要であり、かつ前記組織におけるサポニンの量の増加 を可能にする1種以上の酵素をコードする構造遺伝子を規定するDNAを含む発 現カセットで植物細胞を形質転換する。特に重要であるのは、植物細胞において 通常見出される基質から問題のサポニン、桂皮アルデヒド及び/またはコニフェ リルアルデヒド化合物の生合成に必要な前駆化合物を代謝し得る1種以上の酵素 をコードする遺伝子である。式(1)、(2)、(3)、(4)、(5)の化合 物及びサポニンのうちの少なくとも1種の移植遺伝子発現が更に重要である。 問題の遺伝子の発現のために、発現カセットを宿主植物のゲノムに挿入するD NA構築物を調製する。前記挿入はAgrobacterium属、エレクトロ ポレーションまたは高速微粒子媒介形質転換といった、当業者に知られている形 質転換系を用いて実現し得る。用途次第では、問題の組織及び/または特定の細 胞小器官においてサポニンまたは他のいずれかの問題の化合物を優先的に発現さ せ得る。組織特異性は、所望の発現プロフィールを有する転写調節領域の使用に よって実現する。特定の細胞小器官への 酵素の転位(translocation)は、適当な転位ペプチドの使用によ って実現する。DNA構築物を組織及び細胞小器官特異的に発現させる方法は既 に開示されており、当業者に知られている。 問題の遺伝子の調節及び発現の確認のためには、植物細胞内に存在する所望の DNA配列がゲノムに挿入され、かつ転写されているかどうかを確認する様々な 技術が存在する。ノザンブロッティングなどの技術を用いれば、所望の酵素をコ ードするメッセンジャーRNAを検出することができる。更に、酵素活性をアッ セイするか、またはタンパク質産物に関するイムノアッセイを行なうことによっ て発現を検出し得る。最も好ましくは、宿主植物に存在する問題の化合物のレベ ルを、当業者に知られている方法を用いて測定する。望ましい表現型は、例えば 、問題の遺伝子の発現によって、及び/または宿主植物中に存在するサポニンの レベルを対照植物のものと比較することによって測定される問題の植物組織の高 いサポニン及び/または芳香族アルデヒド含量である。 本発明の製剤の1種以上の成分化合物を標的生物に導入するためには、当該化 合物のレベルの制御に必要な酵素を コードする遺伝子を発現させる宿主植物によって標的生物を、本発明の抗病原製 剤の少なくとも1種の成分に曝露する。別の具体例では、 本発明の抗病原製剤の少なくとも1種の成分は宿主植物において発現させること ができ、その際場合によっては該製剤のその他の成分を外部から宿主植物に適用 し、それによってこれらの成分の組み合わせに、標的生物に直接または間接に導 入された時に所望の抗病原作用を発揮させる。 シンナムアルデヒド及びコニフェリルアルデヒドなどの芳香族アルデヒドを蓄 積する能力が高く、従って植物に対して自衛し、あるいはまた抽出して後に化学 農薬として用いる芳香族アルデヒドの天然ソースとして用いられるトランスジェ ニック植物は次のように作製し得る。 芳香族アルデヒドの蓄積は、所望のアルデヒドを更に代謝させるか、または代 謝中間体を所望のアルデヒドから逸らす酵素をコードする特定の植物遺伝子の発 現に負の調節を施すことによって実現し得る。例えばシンナムアルデヒドの場合 は、シンナメート4−ヒドロキシラーゼ(CA4H)及び桂皮アルコールデヒド ロケナーゼ(CAD)の発現に負の調節を施す。CA4Hは通常、幾分かの桂皮 酸をシンナムアルデヒドから逸らし、それ自体代謝中間体であるp−クマリン酸 を生成させる。シンナムアルデヒドの蓄積を惹起するためにはCA4H活性の低 下のみでは不十分 であり、なぜならCADはシンナムアルデヒドを急速にシンナミルアルコールに 変換し得るからで、生じたシンナミルアルコールはリグニンに含まれるようにな るか、または配糖体として蓄積する。CA4H活性とCAD活性との両方を同時 に低下させると、桂皮酸からシンナムアルデヒドへの代謝フラックスが増大し、 かつシンナムアルデヒドのシンナミルアルコールへの変換が減少する。幾分かの シンナムアルデヒドはリグニンに含まれるようになるが、(遊離の、または配糖 体としての)シンナムアルデヒドはまた、特に桂皮酸の生合成が増加する時には 通常以上のレベルまで蓄積する。桂皮酸の生合成が増加するのはフェニルアラニ ンアンモニアリアーゼ(PAL;通常のフェニルプロパノイド代謝の、速度制限 ステップである最初のステップ;Hahlbrock及びScheel,Ann u.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.4 0,pp.347−369,1989)活性のレベルが高い場合であり、これは 植物において、真菌病原体による侵襲、並びに損傷及び昆虫の摂食に関連する機 械的傷害を含めた広範な刺激に応答して天然に発生する状況である。 トランスジェニック植物のCAD活性を抑制することは、植物のリグニン合成 を減少させ、それによって飼料作物の消化率を改善する方法として提案されてい る(国際特許出願公開第93/05159号)。この提案の際に行なわれた実験 は、リグニン生合成を定質的には変更できたものの定量的には必ずしも変更でき なかったことを示してはいるが、 双子葉植物へのDNA転移に特に有効である一方法は、Agrobacteri um属を用いることを含む。この方法では、スプライシングを施し、それによっ て(例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIまたはホスフィノトリシン アセチルトランスフェラーゼをコードする)選択性マーカー遺伝子を含む小型組 み換え体プラスミドとしたT−DNA領域の境界点間に問題の遺伝子を挿入する 。次に、組み換え体プラスミドをAgrobacterium属宿主に、形質転 換または三者(triparental)交配により導入する。(1種以上の) 問題の遺伝子を保持するAgrobacterium属株を用いて、この細菌を 適当な植物組織(例えばディスク形葉片)と共に培養することにより当該植物組 織を形質転換する。組織培養物中で形質転換細胞を、適当な選択物質を用いて選 択し、その後植物を再生させる(Horsch等,Science 227,p p.1229−1231,1985参照)。植物細胞、特により扱いにくい作物 の形質転換に用いられている他の方法に、遺伝子銃による遺伝子撃ち込み(bi olistics)及びエレクトロポレーションが含まれる(プロトコルの詳細 については、Sanfor d等,Methods in Enzymology217,pp.483−5 09,1993及びPotter,Methods in Enzymolog y217, pp.461−478,1993参照)。 トランスジェニック植物を作製したら、CA4H及びCADについての通常の 酵素アッセイを用いて、様々な形質転換体において達成された酵素活性抑制レベ ルを測定する。芳香族アルデヒドの蓄積を惹起し、しかも植物の発生には望まし くない副作用を何ら及ぼさない十分に低い残留酵素活性を有するのは、作製した 形質転換体の僅かな部分のみであると考えられる。そのため、CA4HとCAD との両方が抑制された所望の形質転換体を作製する好ましい一方法では、2種の 遺伝子を異なる形質転換体に分けて導入し、後に標準的な交雑によって両遺伝子 を組み合わせる。この方法は、遺伝子抑制レベルのより多数の組み合わせを同時 に評価することを可能にする。 トランスジェニック植物において芳香族アルデヒドを過剰生成させる方法の一 変形例では、植物遺伝子を用いて微生物宿主に、特定の芳香族アルデヒド及び/ またはサポニンを合成する能力を付与する。得られた微生物は、発酵系 において芳香族アルデヒドを生成させるのに用い得、または芳香族アルデヒドの 天然送達系として生存もしくは非生存微生物製剤中に用い得る。この方法に用い る生物として好ましいのは酵母、特にSachoromyces cerevi siaeであり、なぜならこれらは既にPALを高レベルで発現させるべく遺伝 子操作されており(Faulkener等,Gene 143,p.13020 ,1994)、また植物のシンナメート4−ヒドロキシラーゼは酵母において機 能することが判明している(Urban等,Eur.J.Biochem.22 2,pp.843−850,1994)からである。 フェニルアラニンからシンナムアルデヒドを生成させるには更に二つの酵素ステ ップが必要である。植物では、これらのステップは酵素のシンナメート:CoA リガーゼ(CL)及びシンナモイルCoAレダクターゼ(CCoAR)によって 触媒されるが、4−クマレートCoAリガーゼ(4CL)も桂皮酸を基質(su bstance)として用い得るので(Knobloch及びHahlbroc k,Arch.Biochem.Biophys.184,pp.237−24 8,1977)、4CLをCLの替わりに用いることも可能である。20種を越 えるクローン化PAL遺伝子及び6種を越える4CL遺伝子が十分詳細に開示さ れており(GenBank)、その結果これらの遺伝子は本発明の実施に容易に 用いることができる。CCoARをコードする遺伝子は、精製タンパク質のN末 端またはペプチドフラグメントのアミノ酸配列に由来するプローブ配列として用 いるcDNAクローンを単離する標準的な遺伝子クローニング技術を適用するこ とによって得られる。CCoARは、ダイズ培養物(Wengenmayer等 ,Eur.J.Biochem.65,pp.529−536,1976;Lu deritz 及びGrisebach,Eur.Eur.J.Biochem.119,pp .115−124,1981)、トウヒの形成層汁液(Luderitz及びG risebach,上掲誌)、ポプラの木部(Sarni等,Eur.J.Bi ochem.139,pp.259−265,1984)、及びEucalyp tus gunniiの分化する木部(Goffner等,Plant Phy siol.106,pp.625−632,1994)から精製され、かつ部分 的に特性解明されている。好ましい精製方法はGoffner等(上掲誌)の方 法であり、なぜならSDS−ポリアクリルアミドゲル上に、タンパク質配列決定 に用い得るただ一つのタンパク質バンドが生じるからである。 クローン化遺伝子を標準的な発現ベクターに導入し、これを用いて微生物宿主 、好ましくは酵母を、エレクトロポレーションなどの標準的な形質転換技術で形 質転換する(Becker及びGuarante,Methodsin Enz ymol.194,pp.182−187,1991)。標準的な酵素アッセイ を用いて、操作した遺伝子の機能性発現を確認し、また芳香族アルデヒド についてのアッセイを用いて最多産生株を選択する。芳香族アルデヒドは抗微生 物特性を有するので、導入された遺伝子の発現を増殖サイクルの後期にのみ、ま たは化学的誘導物質に応答して惹起する発現ベクターを用いることが好ましい。 また、遺伝子操作した微生物宿主を固定化全細胞反応容器内で増殖させ(例えば Evans等,Biotechnology and Bioengineer ing 30,pp.1067−1072,1987)、それによってアルデヒ ドが培地中に蓄積するのを防止することが望ましい場合が有る。 そのマイコトキシン含有レベルを制御し得る物質は消耗性であっても非消耗性 であってもよく、また好ましくは植物であるか、または植物に由来するが、微生 物毒素を産生する真菌で汚染されているか、または毒素産生微生物が定着する恐 れの有る、もしくは前記微生物の増殖を扶助し得る他のいかなる物質も処理可能 である。特に重要であるのは、鳥、魚、及びヒトを含めた動物による直接または 間接消費用の作物である。「直接または間接」という語は、 実施例6 果菜の収穫後処置法 この実験の目的は、桂皮アルデヒドの果菜用防腐剤活性を評価することである 。果菜は通常長期貯蔵に適応しない。例外は硬皮カボチャ(冬カボチャ)及び夏 カボチャ(pumpkin)である。重要な未成熟果菜に、マメ科植物(leg umes)、ウリ科植物(軟皮カボチャ)、ナス科植物(ナス、コショウ等)、 オクラ及び甘味種トウモロコシが有る。重要な成熟果菜はウリ科植物(カンタロ ープ、ハネデューまたは他のマスクメロン;スイカ、硬皮カボチャ及び夏カボチ ャ)である。(ナス科植物:成熟グリーントマト及び完熟(vine ripe )トマト、成熟コシヨウ。)方法 40個のトマト果(完熟)を選果包装施設のばら積みゴンドラ(bulk g ondola)から無作為に選出する。20個の処理用トマトを澄明な水で濯ぎ 、その後ころコンベヤセクションにおいて100mlの試験製剤を噴霧して処理 する。20個の非処理トマトにはころコンベヤセクションで100mlのH2O を噴霧する。処理及び非処 理トマトを(処理したものとしないものとで)別個のプレイスパック(plac e pack)に入れ、一時貯蔵倉庫で10日間貯蔵する。3日目、6日目及び 10日目にトマトを病理的傷害について観察及び評価する。 実施例7 桂皮アルデヒドの防腐剤活性 この実験の目的は、桂皮アルデヒドの花菜、葉菜及び茎菜用防腐剤活性を評価 することである。葉菜、茎菜及び花菜の(非限定的な)代表例は次のとおりであ る。 ●葉菜: レタス、キャベツ、メキャベツ、セロリ、ホ ウレンソウ、ハタマネギ、チコリ、エンダイ ブ。 ●茎菜: アスパラガス、キュウケイカンラン、ウイ キョウ。 ●花菜: アーティチョータ、ブロッコリー、カリフラ ワー。方法(花菜のカリフラワーを収穫後に処置する例) 40房のカリフラワーを選果包装施設ロットから選出する。選出したカリフラ ワーから葉を刈り取る。20個の処理用房に各10mlの試験製剤を噴霧し、そ の後房をくる む。処理しない20個の房には10mlのH2Oを噴霧し、その後房をくるむ。 実施例9 トランスジェニック植物における芳香族 アルデヒドの過剰産生 20μgのポリA RNAを調製し、cDNAを合成する。得られたcDNA の一部をλ−ZAP IIベクター(市販クローニングベクター)中へクローン化 する。GenBankから入手したクローン化CA4H及びCAD遺伝子の保存 配列から設計したか、または所期の宿主植物から得た精製タンパク質のペプチド 配列から設計したオリゴヌクレオチドプローブを用いて少なくとも500,00 0の組み換え体をスクリーニングする。盛んにハイブリダイズするクローンを選 択し、これをcDNAライブラリーの再スクリーニングに用いる。得られたクロ ーンを配列決定し、それによって適当な遺伝子配列を植物発現カセットにアンチ センスまたはセンスの向きで導入することを可能にする。アンチセンス及びセン ス構築物をAgrobacterium tumefaciens LBA44 04に、公表された操作に従っての直接形質転換によって導入する。タバコ(N .tabacum var.Samsun)のディスク形葉片を、十分に確立さ れ、かつ公表され た操作(Horsch等,Science 227,pp.1229−1231 ,1985)を用いて形質転換する。CA4HまたはCAD構築物を有する植物 をPCRによって同定し、更に分析するべく選択する。 形質転換した植物と、形質転換しなかった対照植物との両方に由来する植物性 物質を用いてCA4H及びCAD酵素活性を、十分に確立され、かつ公表された アッセイによって測定する。CA4HまたはCADの活性が対照植物にみられる 活性の20%未満に低下した植物を、更に分析するべく選択する。選択したCA 4H活性の低い植物をCAD活性の低い植物と交雑し、両方の遺伝子構築物を受 け継いだ子孫をPCRによって選択する。抑制されたCA4H活性及び抑制され たCAD活性を有する植物を芳香族アルデヒド産生に関して、公表された標準的 操作を用いて分析する。 実施例10 微生物系の芳香族アルデヒド産生 6週齢のタバコの茎から抽出したRNAを用いてcDNAライブラリーを生じ させる。20μgのポリA RNAを調製し、cDNAを合成する。得られたc DNAの一部 をλ−ZAP IIベクター(市販クローニンクベクター)中へクローン化する。 Goffner等,Plant Physiol.106,pp.625−63 2,1994のプロトコルを用いて6週齢のタバコの茎組織から精製したCCo Arタンパク質のペプチド配列から設計したオリゴヌクレオチドプローブを用い て少なくとも500,000の組み換え体をスクリーニングする。盛んにハイブ リダイズするクローンを選択し、これをcDNAライブラリーの再スクリーニン グに用いる。得られたクローンを配列決定し、それによって完全長cDNA挿入 物の同定と、適当なCCoAR遺伝子配列の酵母発現ベクターpMTL8110 (Faulkner等,Gene 143,pp.13−20,1994)への 導入とを可能にする。Rhodosporidium toruloidesの フェニルアラニンアンモニアリアーゼ(PAL;GenBankローカスはRH DPAL)及びパセリの4−クマレート:CoAlリガーゼ(4CL;GenB ankローカスはPC4CL1AA)のコーディング配列も同等の酵母発現ベク ターに同様に導入する。PAL、4CL及びCCoAR構築物を用いてSacc haromyces cerevisiae株を、確立され、かつ公表された操作(Becker及び Guarente,Methods in Enzymology 194,p p.182−187,1991;Simon,Methods in Enzy mol.217,pp.478−483,1993)を用いるエレクトロポレー ションによって形質転換する。ロイシンを欠く最小培地上で形質転換体を選択す る。上記3種の遺伝子構築物を総て有する形質転換株をPCRによって同定し、 更に分析するべく選択する。 形質転換した株と、形質転換しなかった対照株との両方から得た抽出物を用い てPAL、4CL及びCCoAR酵素活性を、十分に確立され、かつ公表された アッセイによって測定する。PAL、4CL及びCCoARの活性が対照株にお いて検出されたバックグラウンド活性より著しく高い株を、更に分析するべく選 択する。選択した株を芳香族アルデヒド産生に関して、公表された標準的操作を 用いて分析し、有意量のシンナムアルデヒドを産生する株を発酵条件の最適化の ために選択する。 実施例11 疫病の処理 (Phytophthora infestans) 疫病(late blight)はトマト、ジャガイモ、ナス、及びジャガイ モの仲間である他の植物を冒す病気で、温暖な時期に真菌胞子が濡れた植物表面 に付着すると発病する。Phytophthora infestansの防除 について試験する実験を温室内で、ジャガイモの実生を用いて行なう。温室内で 植物に病原体の単離物を噴霧し、それによって接種を実現する。接種前または接 種後に植物を、表2に示したような処理プロトコルであってα−ヘキシル桂皮ア ルデヒドの試験のための第三のパネルを含むプロトコルを用いて病原体で処理す る。乳化剤としてTweenの替わりに十分量のサポニンを用いる付加的な処理 操作も試験する。処理後2週間及び3週間を経た時点で処理の効果を評価する。 ヒト及び動物が消費する食物のほとんどは動物または植物に由来し、かつ微生 物毒素の既知の活性を付与されるので、収穫前及び/または収穫後に蓄積し、か つ加工後にも存続する微生物産生毒素の存在はマイコトキシン汚染と関係付けら れる多数の健康障害の少なくとも一因ではあると 考えられる。請求の範囲 1. 収穫した植物部分においてマイコトキシン産生微生物をバイオコントロー ルする方法であって、 植物部分に該植物部分の収穫前または収穫後に、少なくとも1種の式 〔式中R1は−CHOであり、R2は−Hであるか、−OCH3であるか、または 1〜10個の炭素原子を有する有機置換基であり、R3は−Hであるか、−OH であるか、または1〜10個の炭素原子を有する有機置換基であり、R4は−H であるか、または1〜10個の炭素原子を有する有機置換基である〕の化合物を 含有する微生物増殖調節有効量の製剤を提供し、その際前記製剤は前記植物に対 して非植物毒性であり、かつ前記式の酸化防止剤以外の酸化防止剤を含有せず、 前記製剤の提供によって前記植物部分上のマイコトキシン産生微生物をバイオコ ントロールすることを含む方法。 2. 少なくとも1種の化合物が桂皮アルデヒド、コニフェリルアルデヒドまた はα−ヘキシル桂皮アルデヒドであることを特徴とする請求項1に記載の方法。 3. 前記増殖調節量が約70%以上の平均耐病率を達成することを特徴とする 請求項1または2に記載の方法。 4. 前記提供を植物部分の収穫前に実現することを特徴とする請求項1から3 のいずれか1項に記載の方法。 5. マイコトキシン産生微生物の増殖を1カ月より長期にわたって抑制するこ とを特徴とする請求項1から4のいずれか1項に記載の方法。 6. 酸化防止剤を含有しない農業適合性キャリヤ中に存在させた増殖調節量の 1種以上の式 〔式中R1は−CHOであり、R2は−Hであるか、−OCH3であるか、または 1〜10個の炭素原子を有する有機置換基であり、R3は−Hであるか、−OH であるか、または1〜10個の炭素原子を有する有機置換基であり、 R4は−Hであるか、または1〜10個の炭素原子を有する有機置換基である〕 の化合物を含有する組成物であって、マイコトキシン産生菌が定着する1種以上 の収穫した植物部分に該植物部分の収穫前または収穫後に適用された場合に前記 菌に対する平均耐病率を約70%以上とする組成物。 7. 前記増殖調節量が1以下の植物毒性しかもたらさないことを特徴とする請 求項6に記載の組成物。 8. 前記1種以上の化合物が桂皮アルデヒドまたはコニフェリルアルデヒドで あることを特徴とする請求項6または7に記載の組成物。 9. マイコトキシン産生菌に対する平均耐病率を約70%以上とすることへの 請求項6から8のいずれか1項に記載の組成物の使用。 10. 植物毒性が1以下であることを特徴とする請求項9に記載の使用。 11. 請求項1から5のいずれか1項に記載の方法によって得られる、マイコ トキシン産生菌が実質的に定着していない収穫された植物または植物部分。 12. マイコトキシン産生菌に対する植物の耐性を誘導する方法であって、 植物を、酸化防止剤を含有しない農業適合性キャリヤ、及びマイコトキシン産生 菌に対する全身耐性の誘導に十分な量の式 〔式中R1は−CHOであり、R2は−Hであるか、−OCH3であるか、または 1〜10個の炭素原子を有する有機置換基であり、R3は−Hであるか、−OH であるか、または1〜10個の炭素原子を有する有機置換基であり、R4は−H であるか、または1〜10個の炭素原子を有する有機置換基である〕の化合物を 含有する製剤と接触させること を含む方法。 13. 請求項12に記載の方法で用いる組成物であって、酸化防止剤を含有し ない農業適合性キャリヤ、及びマイコトキシン産生菌に対する全身耐性の誘導に 十分な量の式 〔式中R1は−CHOであり、R2は−Hであるか、−OCH3であるか、または 1〜10個の炭素原子を有する有機置換基であり、R3は−Hであるか、−OH であるか、または1〜10個の炭素原子を有する有機置換基であり、R4は−H であるか、または1〜10個の炭素原子を有する有機置換基である〕の化合物を 含有する組成物。 14. キャリヤが界面活性剤を含有することを特徴とする請求項13に記載の 組成物。 15. 界面活性剤がサポニンであることを特徴とする請求項14に記載の組成 物。 16. 植物においてマイコトキシン産生菌に対する全身耐性を誘導することへ の請求項13から15のいずれか1項に記載の組成物の使用。 【手続補正書】 【提出日】1998年1月30日 【補正内容】 (1) 明細書中、第12頁第15行目に「フラボノイドアルデヒド」とあるを「芳香族 アルデヒド」と補正する。 (2) 平成9年6月30日付提出の補正書の翻訳文提出書(特許法第184条の8第1 項)の別紙4中、第1頁下から第11行目に「R4」とあるを「R4」と補正する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE, DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG ,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN, TD,TG),AP(KE,LS,MW,SD,SZ,U G),AL,AM,AT,AU,AZ,BB,BG,B R,BY,CA,CH,CN,CZ,DE,DK,EE ,ES,FI,GB,GE,HU,IS,JP,KE, KG,KP,KR,KZ,LK,LR,LS,LT,L U,LV,MD,MG,MK,MN,MW,MX,NO ,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,SG, SI,SK,TJ,TM,TT,UA,UG,US,U Z,VN

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 1. 植物部分におけるマイコトキシン産生菌の増殖を制御する方法であって、 植物部分を、0.01〜25g/lの1種以上の式 〔式中R1は−CHOであり、R2は−Hであるか、−OHであるか、または1〜 10個の炭素原子を有する有機置換基である〕の化合物を含有する病原生物増殖 抑制有効量の製剤と接触させること を含み、前記製剤は前記式の化合物以外の酸化防止剤を含有せず、該製剤の植物 毒性は1以下である方法。 2. R1が−CHOであり、R2は−OHであるか、または1〜10個の炭素原 子を有する有機置換基であり、R3は−O−CH3であるか、または1〜10個の 炭素原子を有する有機置換基であり、R4は−Hであるか、または1〜10個の 炭素原子を有する有機置換基であることを特徴とする請求項1に記載の方法。 3. 少なくとも1種の化合物が桂皮アルデヒド、コニフェリルアルデヒドまた はα−ヘキシル桂皮アルデヒドであることを特徴とする請求項1に記載の方法。 4. 前記増殖調節量が約70%以上の平均耐病率を達成することを特徴とする 請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。 5. 前記接触を植物部分の収穫前に実現することを特徴とする請求項1から4 のいずれか1項に記載の方法。 6. マイコトキシン産生菌の増殖を1カ月より長期にわたって抑制することを 特徴とする請求項1から5のいずれか1項に記載の方法。 7. 酸化防止剤を含有しない農業適合性キャリヤ中に存在させた増殖調節量の 1種以上の式 〔式中R1は−CHOであり、R2は−Hであるか、−OHであるか、または1〜 10個の炭素原子を有する有機置換基であり、R3は−Hであるか、−OCH3で あるか、 または1〜10個の炭素原子を有する有機置換基であり、R4は−Hであるか、 または1〜10個の炭素原子を有する有機置換基である〕の化合物を含有する組 成物であって、マイコトキシン産生菌が定着する1種以上の植物表面に適用され た場合に前記菌に対する平均耐病率を約7%以上とする組成物。 8. 前記増殖調節量が1以下の植物毒性しかもたらさないことを特徴とする請 求項7に記載の組成物。 9. 1種以上の化合物が桂皮アルデヒドまたはコニフェリルアルデヒドである ことを特徴とする請求項7または8に記載の組成物。 10. マイコトキシン産生菌に対する平均耐病率を約70%以上とすることへ の請求項7から9のいずれか1項に記載の組成物の使用。 11. 植物毒性が1以下であることを特徴とする請求項10に記載の使用。 12. 請求項1から6のいずれか1項に記載の方法によって得られる、マイコ トキシン産生菌が実質的に定着していない植物または植物部分。 13. マイコトキシン産生菌に対する耐性を誘導する方 法であって、 植物を、マイコトキシン産生菌に対する全身耐性の誘導に十分な量の式 〔式中R1は−CHOであり、R2は−OHであるか、または1〜10個の炭素原 子を有する有機置換基であり、R3は−OCH3であるか、または1〜10個の炭 素原子を有する有機置換基であり、R4は−Hであるか、または1〜10個の炭 素原子を有する有機置換基である〕の化合物と接触させること を含む方法。 14. 請求項13に記載の方法で用いる組成物であって、マイコトキシン産生 菌に対する全身耐性の誘導に十分な量の式 〔式中R1は−CHOであり、R2は−OHであるか、または1〜10個の炭素原 子を有する有機置換基であり、R3は−OCH3であるか、または1〜10個の炭 素原子を有する有機置換基であり、R4は−Hであるか、または1〜10個の炭 素原子を有する有機置換基である〕の化合物と、適当なキャリヤとを含有する組 成物。 15. 適当なキャリヤが界面活性剤を含有することを特徴とする請求項14に 記載の組成物。 16. 界面活性剤がサポニンであることを特徴とする請求項15に記載の組成 物。 17. 植物においてマイコトキシン産生菌に対する全身耐性を誘導することへ の請求項14から16のいずれか1項に記載の組成物の使用。
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