JP2002520059A - アミノポリオールアミンオキシダーゼポリヌクレオチド類および関連のポリペプチド類ならびに使用方法 - Google Patents

アミノポリオールアミンオキシダーゼポリヌクレオチド類および関連のポリペプチド類ならびに使用方法

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、Exophiala spinifera および Rhinocladiella atrovirens から単離された酵素ＡＰＡＯのポリヌクレオチドおよび関連したポリペプチドを提供する。さらに、ＡＰＡＯ酵素をコードしているポリヌクレオチドは、Fusarium またはその他の毒性産生かび感染症に普通罹りやすい植物細胞を形質転換するのに使用することができる。質転換された植物細胞から植物を再生することができる。さらに、本発明は形質転換植物でＡＰＡＯおよびフモニシンエステラーゼの両者の発現を提供する。このようにして、フモニシン分解能および分解酵素の生産能を有する形質転換植物が生産される。加えて、本発明は原核生物系および非植物真核生物系の双方でのＡＰＡＯ酵素の生産方法を提供する。穀粒、穀粒加工、サイレージ、食用作物での、また動物飼料およびルーメン微生物での解毒方法も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【技術分野】
本発明は一般に、フモニシン（fumonisin）およびＡＰ１分解酵素の検出およ
び単離、並びにフモニシンまたはその加水分解生成物ＡＰ１の生体内解毒または
分解のための組成物および方法に関する。この方法は農業バイオテクノロジーお
よび農作物農業、並びに食物穀類品質改善において広範に適用される。
【０００２】
【発明の背景】
真菌疾病は農作物農業に共通の問題である。ハイブリッド植物、農薬および改
善された農業実施の使用により例示されるように、植物疾病に対して長足の進歩
がなされてきた。しかし、いずれもの栽培家または家庭園芸家が証明できるよう
に、これらの真菌性植物疾病の問題は植物栽培において諸困難をもたらし続けて
いる。したがって、植物の真菌性疾病により惹起されるこれらの問題を解決する
ために新規方法および新規物質が絶えず要求されている。
【０００３】 これらの問題は種々のアプローチによって対処できる。例えば、感染性生物は
、病原体に対して選択的に殺生性である薬剤を用いることにより抑制することが
できる。別の方法は、病原体が宿主の農作物植物に侵入するメカニズムの妨害に
ある。農作物に損害をもたらす病原体の場合のさらに別の方法は、その病原体が
宿主の農作物植物に害をもたらすメカニズムの妨害にある。農作物植物を常食に
する哺乳類または他の動物にとって望ましくない毒素を産生する病原体の場合の
さらに別の方法は、毒素の産生、貯蔵または活性の妨害にある。本発明は後者二
つの範疇に入る。
【０００４】 １９８８年((Bezuidenhout et al., Journal Chem Soc, Chem Commun 1988: 7
43-745 (1988))におけるそれらの発見および構造解明以来、フモニシン類はトウ
モロコシを餌とする家畜に起こり得る重要な問題として認識されてきた。それら
はロイコエンスファロマラシア（leucoencephalomalacia）を含むいくつかの動
物中毒症(Marasas, et al., Onderstepoort Journal of Veterinary Research 5
5: 197-204 (1988); Wilson, et al., American Association of Veterinary La
boratory Diagnosticians: Abstracts 33rd Annual Meeting, Denver, Colorado
, October 7-9, 1990, Madison, Wisconsin, USA) および豚の肺浮腫(Colvin, e
t al., Mycopathologia 117: 79-82 (1992))に関連している。フモニシン類はま
た、疑いのある発癌性物質でもある(Geary W (1971) Coord Chem Rev 7: 81; Ge
lderblom, et al., Carcinogenesis 12: 1247-1251 (1991); Gelderblom, et al
., Carcinogenesis 13: 433-437 (1992))。リセオラ（Liseola）切片中のフサリ
ウム単離物は培養中、２〜>４００００ppmの量でフモニシン類を生産する(Lesli
e, et al., Phytopathology 82: 341-345 (1992))。トウモロコシ（主として交
配集団Ａ）からの単離物はフモニシンの最大生産者である (上記引用のLeslie e
t al.)。畑で発育したトウモロコシに検出されるフモニシンの量は、場所および
発育時期によって大きく変動したが、しかし畑トウモロコシの収穫前と収穫後の
双方の調査によれば、高レベルのフモニシンが存在する可能性のあることが指摘
されている(Murphy, et al., J Agr Food Chem 41: 263-266 (1993))。食物およ
び飼料製品の調査でもまたフモニシンが検出された(Holcomb, et al., J Agr Fo
od Chem 41: 764-767 (1993); Hopmans, et al., J Agr Food Chem 41: 1655-16
58 (1993); Sydenham, et al., J Agr Food Chem 39: 2014-2018 (1991))。フサ
リウム穂カビ（ Fusarium ear mold）の病因はほとんど理解されていない 。し
かし、穂への物理的損傷およびある種の環境条件がその発症の原因である可能性
がある(Nelson, Mycopathologia 117: 29-36 (1992))。目に見えないカビが存在
する場合でさえ、畑で発育する大抵のトウモロコシからフサリウムを単離するこ
とができる。実生感染とフサリウムにより惹起される茎ないし穂の疾病との間の
関係は明確ではない。目に見える穀粒カビへの遺伝子抵抗が確認されている(Gen
dloff, et al., Phytopathology 76: 684-688 (1986); Holley, et al., Plant
Dis 73: 578-580 (1989))が、しかし、目に見えるカビとフモニシン産生との関
係は依然として解明される必要がある。
【０００５】 フモニシン類は、試験管内での哺乳類細胞の研究において、酵素スフィンゴシ
ンＮ−アセチルトランスフェラーゼの阻害によりスフィンゴ脂質生合成を阻害し
、プレカーサのスフィンガニンの蓄積をもたらすことが示されている (Norred,
et al., Mycopathologia 117: 73-78 (1992); Wang, et al., Biol Chem 266: 1
4486 (1991); Yoo, et al., Toxicol Appl Pharmacol 114: 9-15 (1992); Nelso
n, et al., Annu Rev Phytpathol 31:233-252 (1993))。この経路の阻害がフモ
ニシンの毒性の少なくとも幾らかの原因であるようであり、このことは精製フモ
ニシンを食した動物におけるスフィンガニン：スフィンゴシンの比率の測定から
裏付けられている(Wang, et al., J Nutr 122: 1706-1716 (1992))。フモニシン
類はまた、植物細胞の生長に影響を及ぼす(Abbas, et al., Weed Technol 6: 54
8-552 (1992); Vanasch, et al., Phytopathology 82: 1330-1332 (1992); Veso
nder, et al., Arch Environ Contam Toxicol 23: 464-467 (1992))。Kuti 氏等
(Abstract, Annual Meeting American Phytopathological Society, Memphis,
TN: APS Press 1993)は、外来栄養として加えたフモニシン類がトマトに疾病の
発症を促進しそしてフサリウムモニリフォルメ（Fusarium moniliforme）および
フサリウムオキシスポラム（Fusarium oxysporum）の胞子化を増加させ得る能力
について報告した。
【０００６】 真菌毒素フモニシンをそれの脱エステル化形態（例えばＦＢ１からのＡＰ１
）に分解する酵素は、１９９８年２月１０日発行の米国特許第５,７１６,８２０
、１９９８年８月１１日発行の米国特許第５,７９２,９３１および両方とも１９
９７年7月７日出願の係属している米国出願第０８／８８８，９５０および０８
／８８８,９４９で確認されており、これらは全て参照によりここに組み込まれ
る。ここで使用するＡＰ1は、いずれかのフモニシン、ＦＢ1、ＦＢ２、ＦＢ３、
ＦＢ4の加水分解された形態、またはいずれかその他のＡＰ１様化合物例えば合
成的に製造され、または Ｃ−１アミン基および１個以上の隣接ヒドロキシル基
を含有するＡＰ１様化合物を意味する。フモニシン産生真菌に感染し次いでフモ
ニシンおよびＡＰ１について試験したフモニシンエステラーゼ酵素発現植物では
、低レベルのフモニシンを有する一方、高レベルのＡＰ１を有することが見出さ
れた。植物およびおそらくはまた動物に対してもＡＰ１はフモニシンよりも毒性
が小さいが、しかしＡＰ１での汚染は依然として心配である。より好ましい結果
はフモニシンの無毒性形態への完全解毒である。したがって、フモニシンの更な
る解毒のためにはＡＰ１を分解することができる酵素が必要である。
【０００７】 本発明はＡＰ１を酸化的に脱アミノ化して、ＡＰ１の２−オキソ誘導体または
その環状ケタール型（２−ＯＰとして略記され、以前にはＡＰ１−Ｎ１として知
られており； 前記に引用された米国特許第５,７１６,８２０、米国特許第５,７
９２,９３１、係属の米国出願第０８／８８８，９５０ および０８／８８８,９
４９を参照されたい）として同定される化合物にすることができるアミノポリオ
ールアミンオキシダーゼ(略記ＡＰＡＯ、 以前にはＡＰ１カタボラーゼとして知
られており、前記で引用された米国特許第５,７１６,８２０; 米国特許第５,７
９２,９３１および係属の米国特許出願第０８／８８８,９５０および０８／８８
８,９４９参照、; ｔｒＡＰＡＯは、先端が切断されたが、しかし依然として作
用性であるＡＰＡＯに関する略記である)の新しく発見された、エキソフィアラ
スピニフェラ（Exophiala spinifera）、ＡＴＣＣ７４２６９）から単離される
ポリヌクレオチドおよび関連のポリペプチドを提供する。エキソフィアラスピニ
フェラから部分的に精製されたＡＰＡＯ酵素は、フモニシンの一つの形態である
無傷のＦＢ１に殆どまたは全く活性を有しない。しかし、Ｅ.ｃｏｌｉ中に発現
された、エキソフィアラスピネフェラからの組換えＡＰＡＯ酵素は、無傷のＦＢ
１およびその他のＢ系フモニシン類に対して有意でしかも減少された活性を有す
る。すなわちＡＰＡＯまたはｔｒＡＰＡＯは、そのアミン基が解毒のための主要
標的であるのでフモニシンエステラーゼなしで使用することが可能であろう。あ
るいはまた、フモニシンエステラーゼおよびＡＰＡＯ(またはｔｒＡＰＡＯ)を毒
素分解のために使用することができる。
【０００８】 ＡＰＡＯは、フラビンアミンオキシダーの一つのタイプである(EC 1.4.3.4, e
nzyme class nomeclature, see Enzyme Nomenclature 1992, Recommendations o
f the Nomenclature Committee of the IUBMB on the Nomenclature and Classi
fication of Enzymes, Academic Press, Inc. (1992)参照)。 フラビンアミンオ
キシダーゼは、哺乳類でモノアミンオキシダーゼとして知られており、そこでそ
れらは神経機能に包含されるアミン類の変換に関与する。プトレッシン(putresc
ine)を脱アミノ化する原核生物のフラビンアミンオキシダーゼは記載されている
(Ishizuka et al., J. Gen Microbiol. 139:425-432 (1993))。 アスペルギル
スニガー（Aspergillus niger）由来の単一の真菌遺伝子はクローン化されてい
る(Schilling et al., Mol Gen Genet. 247:430-438 (1995))。それは多種のア
ルキルおよびアリールアミンを脱アミノ化するが、ＡＰ１を酸化するそれの能力
を試験すると、ＡＰ１酸化活性を含有しないことが分かった。
【０００９】 食物および飼料中のフモニシン類および広汎にわたるそれらの潜在的発生の毒
性のために、植物鎖から該化合物を除去するために解毒および排除の戦略を見出
すことが必須となっている。
【００１０】
【本発明の要約】
本発明は新しく発見されたＡＰＡＯのポリヌクレオチド、関連ポリペプチドお
よび保存的に修飾された全ての変異型を提供する。それらのＡＰＡＯのヌクレオ
チド配列はSEQ ID NOS:５、１０および２２に見出される配列を含有する。SEQ I
D NO:５はｔｒＡＰＡＯのヌクレオチド配列を含有し、SEQ ID NO:１０は追加の
リジンと一緒にｔｒＡＰＡＯのヌクレオチド配列を含有し、そしてSEQ ID NO:２
２はＡＰＡＯの十分な長さのヌクレオチド配列を含有する。植物中での発現のた
めに、ＡＰＡＯまたはｔｒＡＰＡＯのヌクレオチド配列は植物シグナル配列に融
合される。好ましい植物シグナル配列は、アポプラストまたはペルオキシソーム
をターゲットするシグナル配列である。また、要求によってはその他のシグナル
配列、例えばミトコンドリアまたはプラスチドのそれを用いることもできる。本
発明の目的は、本発明の核酸を含有するトランスジェニック植物および植物細胞
を提供することである。
【００１１】 すなわち、一つの特徴において、本発明はＡＰＡＯ酵素をコードする単離され
たポリヌクレオチド配列を含有する単離された核酸に関する。さらに別の特徴に
おいて、本発明は（ａ）本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌク
レオチド；（ｂ）本発明のポリヌクレオチドの少なくとも２０個の隣接塩基から
なるポリヌクレオチド；（ｃ）本発明のポリヌクレオチドの少なくとも４０％の
同一性を有するポリヌクレオチド；（ｄ）本発明のポリヌクレオチドに対して低
緊縮条件下にハイブリッド形成する長さが少なくとも２０個のヌクレオチドから
なるポリヌクレオチド；（ｅ）SEQ ID NOS:５、１０、２２および３２から選択
されるポリヌクレオチドからなるポリヌクレオチド；および（ｆ）（ａ）〜（ｅ
）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド、から選択される。
【００１２】 本発明のさらに別のポリヌクレオチドは、フモニシンエステラーゼに融合する
ＡＰＡＯ酵素を包含する。このフモニシンエステラーゼはＥＳＰ１またはＢＥＳ
Ｔ１であるのが好ましい。 別の特徴において、本発明は上記核酸を含有する組換え発現カセットに関する
。さらに、本発明はその組換え発現カッセトを含有するベクターに関する。さら
に、その組換え発現カッセトを含有するベクターは、宿主細胞中の該核酸の転写
および翻訳を容易にすることができる。
【００１３】 さらに別の態様において、本発明は本発明の核酸を含有するトランスジェニッ
ク植物または植物細胞に関する。別の態様において、そのトランスジェニック植
物はトウモロコシの植物または植物細胞である。さらにまた別の態様はトランス
ジェニック由来の種子である。
【００１４】 本発明はまた、（ａ）本発明のポリペプチドの少なくとも２５個の隣接アミノ
酸からなるポリペプチド；（ｂ）本発明のポリペプチドの少なくとも５５％の配
列同一性を有するポリペプチド；（ｃ）本発明の核酸によりコードされるポリペ
プチド；（ｄ）SEQ ID NOS：６、１１、２３および３３から選択されるポリペプ
チドを有することを特徴とするポリペプチド；および（ｅ）本発明のポリペプチ
ドの保存的に修飾された変異型、を含有する単離されたポリペプチドも提供する
。
【００１５】 本発明の別の態様は、本発明の核酸をそれ自体によるか、またはフモニシンエ
ステラーゼをコードする核酸と配合させることによるいずれかで植物に転入させ
ることによって、フモニシンを産生する真菌の病原性を減少させる方法からなる
。さらに、２種の植物、すなわち、その一方は本発明のＡＰＡＯで形質転換され
、そして他方はフモニシンエステラーゼで形質転換される各植物は、交配させて
フモニシンエステラーゼとＡＰＡＯとの両方を発現する植物を産生することがで
きる。
【００１６】 本発明はさらに、フモニシン、フモニシン分解生成物、構造的に類似の真菌毒
または構造的に類似の真菌毒の分解生成物を分解する方法も提供する。その方法
は真菌毒を本発明の分解酵素と反応させる工程からなる。さらに、フモニシン類
はフモニシンエステラーゼ酵素とＡＰＡＯ酵素の両酵素の適用により分解され得
る。真菌毒は収穫された穀類において、例えばサイレージ用植物の使用または噴
霧剤として穀類、果物または野菜に使用中のように動物試料または植物組織で収
穫穀物を処理中に分解され得る。
【００１７】 本発明の別の態様は、上記のポリヌクレオチド構築物により安定に形質転換さ
れた宿主細胞であり、そして下記： ａ）これらの宿主細胞集団を提供し、 ｂ）その細胞集団を、前記発現カセットのコード配列によりそのポリペプチド
が発現される条件下で増殖し、 ｃ）得られたポリペプチドを単離する、 からなる組換え遺伝子のポリペプチドの製造方法である。
【００１８】 例えば、限定されるものではないが、微生物、哺乳類、植物または昆虫のよう
な宿主の細胞を用いた多くの発現系を使用することができるであろう。
【００１９】 本発明のポリヌクレオチドはまた、植物形質転換のための選択可能なマーカー
として使用できる。本発明のポリヌクレオチドを含有する発現カセットで植物細
胞を形質転換し、次いでそれらの植物細胞をＡＰ１または植物毒類似体を含有す
る培地に置くことによって、本発明のポリヌクレオチドを発現する植物細胞のみ
が生き残る。
【００２０】 本発明のさらに別の態様は、フモニシンおよび構造的に関連のある毒素を検出
するための試薬として酵素フモニシンエステラーゼおよびＡＰＡＯをそれら自体
でまたは配合して使用することである。
【００２１】
【発明の詳述】
特記しない限り、ここで用いる全ての技術および科学用語は、本発明における
当業者が普通に理解するのと同じ意味を有する。特記しない限り、ここで用いら
れるか、または考えられる技術は、当業者のよく知っている標準的な方法である
。材料、方法および実施例は単に説明のためであって、限定するものではない。
以下は説明のために提供するものであって、それらは本発明の範囲を限定するも
のではない。
【００２２】 特記しない限り、本発明の実施では植物学、微生物学、組織培養、分子生物学
、化学、生化学および組換えＤＮＡ技術の慣用技法を用いるが、それらは当業者
に自明である。このような技法は文献に十分説明されている（例えばJ. H. Lang
enheim and K. V. Thimann, Botany: Plant Biology and Its Relation to Huma
n Affairs (1982) John Wiley; Cell Culture and Somatic Cell Genetics of P
lants, Vol. 1 (I. K. Vasil, ed. 1984); R. V. Stanier, J. L. Ingraham, M.
L. Wheelis, and P. R. Painter, The Microbial World, (1986) 5th Ed., Pre
ntice-Hall; O. D. Dhringra and J. B. Sinclair, Basic Plant Pathology Met
hods, (1985) CRC Press; Maniatis, Fritsch & Sambrook, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover e
d. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid
Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); and the series Me
thods in Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, In
c.)参照）。
【００２３】 単位、接頭辞および記号はそれらのSIで受け入れられた形態で表示され得る。
特記しない限り、核酸は左から右へ５′から３′の配置で書かれている。アミノ
酸配列は、カルボキシ配置に対してアミノがそれぞれ左から右へ書かれている。
数の範囲はその範囲を定義している数を含む。アミノ酸はここでは、それらの普
通に知られた３文字記号またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissio
nにより推奨された１文字記号のいずれか一方によって表すことができる。ヌク
レオチドも同様に、それらの普通に受容されている単一文字コードで表すことが
できる。下記に定義する用語は、全体として本明細書への参照によりさらに十分
に定義される。
【００２４】 本発明を記載するのに、以下の用語を用い、下記に指摘するように定義する。
【００２５】 “微生物（microbe）”は、いずれかの微生物（真核生物と原核生物の両微生
物を包含する）、例えば真菌、酵母、バクテリア、アクチノミセス属、藻類およ
び原生動物並びに他の単細胞構造を意味する。
【００２６】 “フモニシン産生微生物”は真菌毒のフモニシンまたはそれらの類似体を産生
することができるいずれかの微生物である。このような微生物は、一般的には真
菌属Fusarium並びに組換えで誘導された生物であり、それらはフモニシンまたは
それらの類似体を産生できるように遺伝子変更されている。
【００２７】 “フモニシンを分解すること（degrading fumonisin）”は、フモニシンもし
くはＡＰ１分子のいずれかの修飾を意味し、その修飾はそれの毒性活性の減少ま
たは損失をもたらし、例えば分解の結果、初期毒性の１％、５％、１０％または
５０％より少なく、好ましくは１０％より少なくする。このような変更は、種々
の結合のいずれかの分裂、酸化、還元、化学的部分の付加もしくは削除、または
分子の活性に影響を及ぼすいずれか他の変更からなることが可能である。好まし
い態様において、その修飾は第一工程として分子中のエステル結合の加水分解お
よび次に酸化的脱アミノ化からなる。さらに、化学的に変更されたフモニシンは
、本発明酵素を生産する微生物の培養から単離することができる。例えば放射能
標識付けフモニシン含有の培地に微生物を増殖させ、その標識をトレースし、次
いでさらなる研究のためにその分解された毒素を単離するようにして行うことが
できる。分解したフモニシンは、例えばブタ、ウサギおよびウマのような知られ
た感受性種で、または細胞もしくは組織の培養アッセイで、それの植物毒性また
は哺乳類毒性に関してその活性化合物と比較することができる。そのような毒性
アッセイは本技術分野で知られている。例えば、植物では活性化合物および不活
性化合物の各溶液を感受性植物の葉に適用する全体葉のバイオアッセイを用いる
ことができる。それらの葉はその場で処置してもよいし、または切形葉を用いて
もよい。各化合物の相対毒性は、植物組織の確証された損害を等級化することに
より、または一定期間内に生成した病変の大きさを測定することにより評価する
ことができる。その他の知られたアッセイは、細胞レベルで、標準の組織培養方
法、例えば細胞懸濁培養を用いて行うことができる。
【００２８】 “フモニシンエステラーゼ”は、フモニシンまたは構造的に類似の分子例えば
ＡＡＬ毒素中のエステル結合を加水分解することができるいずれかの酵素を意味
する。そのような酵素の二つの例として、１９９８年２月１０日発行の米国特許
出願第５,７１６,８２０、１９９８年８月１１日発行の米国特許第５,７９２,９
３１および両方とも１９９７年７月７日出願の係属している米国出願第０８／８
８８,９５０および０８／８８８,９４９に見出されるＥＳＰ１およびＢＥＳＴ１
がある。
【００２９】 “構造的に類似の真菌毒”は、フモニシンまたはＡＰ１に関連する化学構造を
有するいずれかの真菌毒、例えばＡＡＬ毒素、フモニシンＢ１、フモニシンＢ２
、フモシニンＢ３、フモニシンＢ４、フモニシンＣ１、フモニシンＡ１およびＡ
２、およびそれらの類似体または加水分解された型、並びに類似の化学構造を有
するその他の真菌毒、例えばＣ−２またはＣ−１アミン基および１個以上の隣接
ヒドロキシル基を含有し、本発明酵素の活性によって分解され得ると思われるよ
うな合成で製造された類似体を意味する。本発明はＣ−１（すなわちＡＰ１のＣ
−２）に存在しない第一級アミンを攻撃し、そしてアルデヒド生成物よりもむし
ろケト生成物を生成することが知られた最初のフラビンアミンオキシダーゼであ
る。
【００３０】 ここで用いる“ＡＰ１”または“アミノポリオール”は、いずれかのフモニシ
ン、ＦＢ１、ＦＢ２、ＦＢ３、ＦＢ４、ＡＡＬまたはいずれか他のＡＰ１様化合
物例えばＣ−２またはＣ−１アミン基および１個以上の隣接ヒドロキシル基を含
有する合成で製造された化合物の加水分解型を意味するものと理解されよう。
【００３１】 “増幅された”は、少なくとも一つ核酸配列を鋳型として用いた、核酸配列の
多コピーまたは核酸配列に相補的である多コピーの構築物を意味する。増幅系は
、ポリメラーゼ鎖反応(PCR) 系、結合鎖反応(LCR)系、核酸配列をベースとする
増幅(NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario)、Q-ベータレプリカーゼ系、転写
をベースとする増幅系(TAS)および鎖置換増幅(SDA)を包含する。例えば Diagnos
tic Molecular Microbiology: Principles and Applications, D. H. Persing e
t al., Ed., American Society for Microbiology, Washington, DC (1993)を参
照されたい。増幅生成物はアンプリコン（amplicon）と称される。
【００３２】 “保存的に修飾された変異型”の用語は、アミノ酸と核酸の両配列に適用され
る。特定のアミノ酸配列に関して、保存的に修飾された変異型はアミノ酸配列の
同一または保存的に修飾された変異型をコードする核酸を意味する。遺伝コード
の同義性のために、機能的に同一の核酸の多くはいずれか所定のたんぱく質をコ
ードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵは全て、アミノ
酸のアラニンをコードする。すなわち、アラニンがあるコドンにより特異化され
るいずれもの位置において、そのコドンはそのコード化されるポリペプチドを変
更せずに記載される対応するコドンのいずれかに変更され得る。このような核酸
変異は、“沈黙変異（silent variations）”であり、保存的に修飾された変異
の１種を示す。ポリペプチドをコードするここでの全ての核酸配列はまた、核酸
のあらゆる可能な沈黙変異を記載する。当業者ならば核酸中のそれぞれのコドン
(ＡＵＧを除く。 それは通常、メチオニンのただ一つのコドンである。一つの例
外は Micrococcus rubensであり、それのためにはＧＴＧがメチオニンコドンで
ある(Ishizuka, et al., J. Gen'l Microbiol, 139:425-432 (1993))が、修飾さ
れて機能的に同一の分子を生成することが分かるであろう。したがって、本発明
のポリペプチドをコードする核酸の各沈黙変異は、それぞれの記載されたポリペ
プチド配列中に内在し、参照によりここに組み込まれる。
【００３３】 アミノ酸配列について、当業者ならばコードされる配列において単一のアミノ
酸または複数のアミノ酸の小さな割合を変更し、加えまたは削除するような核酸
、ペプチド、ポリペプチドまたはたんぱく質の配列へのそれぞれの置換、削除ま
たは付加は、その変更が化学的類似アミノ酸でのアミノ酸の置換をもたらす場合
に“保存的に修飾された変異型”になることが分かるであろう。すなわち、１〜
１５からなる整数の郡より選択されるいずれかの数のアミノ酸残基をそのように
変更させることができる。すなわち、例えば１、２、３、４、５、７または１０
個の変更をなすことができる。保存的に修飾された変異型は典型的には、それら
が誘導される未修飾ポリペプチド配列と同様の生物学的活性を提供する。例えば
、基質特異性、酵素活性またはリガンド／レセプター結合は、一般的に、それの
天然基質に関して天然たんぱく質の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％
、７０％、８０％または９０％、好ましくは６０〜９０％である。機能的に同様
のアミノ酸を提供する保存的置換表は、本技術分野でよく知られている。
【００３４】 互いに保存的置換であるアミノ酸をそれぞれ含有する６つ郡は下記のとおりで
ある： １）アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T); ２）アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E); ３) アスパラギン(N)、グルタミン(Q); ４) アルギニン(R)、リジン(K); ５）イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V); および ６) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
【００３５】 Creighton (1984) Proteins W.H. Freeman and Companyも参照されたい。
【００３６】 ここで用いる“本質的に・・・からなる”は、目的ポリヌクレオチドへの付加
配列の包含を意味し、そこではその付加配列は厳しいハイブリダイゼーション条
件下でそのポリヌクレオチドと同一のｃＤＮＡに選択的にハイブリッド形成しな
いし、そしてそのハイブリダイゼーション条件は０.１X SSC および ０.１％ ド
デシル硫酸ナトリウム中での６５℃における洗浄工程を包含する。
【００３７】 指定された核酸に関する“コードするまたはコードされた”は、指定されたた
んぱく質への翻訳のための情報を包含することを意味する。たんぱく質をコード
する核酸は、その核酸の翻訳された領域内に翻訳されていない配列（例えばイン
トロン）を含有することがあるか、またはそのような翻訳されていない介在配列
（例えばｃＤＮＡ中のような）を欠如することもある。たんぱく質がコードされ
る情報は、コドンの使用により指定される。典型的には、アミノ酸配列は“普遍
の”遺伝コードを用いて核酸によりコードされる。しかし、ある種の植物、動物
および真菌のミトコンドリア、細菌Mycoplasma capricolum (Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA), 82: 2306-2309 (1985))または繊毛虫Macronucleusに存在するよう
な普遍コードの変異型は、その核酸がこれらの生物を用いて発現される場合には
使用してもよい。
【００３８】 核酸を合成的に製造するかまたは変更する場合には、その核酸を発現すべき意
図された宿主の既知コドンの選択が有利であり得る。例えば、本発明の核酸配列
は単子葉および双子葉の両植物種に発現されることがあるけれども、単子葉植物
または双子葉植物の特異的コドンの選択およびＧＣ含量の選択が異なることが分
かっているので、それらの選択を考慮するように配列を修飾することができる (Murray et al. Nucl. Acids Res. 17: 477-498 (1989)参照、これは参照によ
りここに組み込まれる)。すなわち、特定のアミノ酸のためのより好ましいトウ
モロコシコドンは、トウモロコシ由来の既知遺伝子配列から誘導されることがあ
る。トウモロコシ植物由来の２０個の遺伝子用のトウモロコシコドン使用法は上
記引用のMurray氏等の文献の表４に掲げられている。
【００３９】 ここで用いる核酸に関する“異種の（heterologous）”は、異質種から生ずる
核酸であるか、または同一種由来ならば、ヒトによる故意の介在により構成およ
び／またはゲノム座が天然型から実質的に修飾されている核酸である。例えば、
異質構造遺伝子に操作可能に連結されるプロモーターは、その構造遺伝子が誘導
されたものとは異なる種から由来するか、または同一種由来ならば、構成および
／またはゲノム座の一方または両方がそれらの原型から実質的に修飾されている
。異種たんぱく質は異質種から生じることがあるか、または同一種由来ならば、
ヒトによる故意の介在によりその原型から実質的に修飾されている。
【００４０】 “宿主細胞”は、ベクターを含有し、その発現ベクターの複製および／または
発現を支持する細胞を意味する。宿主細胞は原核生物例えばE.coliであるか、ま
たは真核生物例えば酵母、昆虫、植物、両生類または哺乳類の細胞であることが
できる。宿主細胞は単子葉または双子葉植物の細胞であるのが好ましい。それら
は例えばトウモロコシ、モロコシ、ヒマワリ、ダイズ、コムギ、アルファルファ
、イネ、ワタ、カノラ（canola）、オオムギ、キビおよびトマトであるが、これ
らに限定されるものではない。特に好ましい単子葉宿主細胞はトウモロコシ宿主
細胞である。
【００４１】 “ハイブリダイゼーション複合体”の用語は、互いに選択的にハイブリッド形
成された二つの一本鎖核酸配列により形成された複式核酸構造を意味する。 細胞中への核酸の挿入に関する“導入される（introduced）”の用語は、“トラ
ンスフェクション”または“形質転換”または“形質導入”を意味し、核酸が細
胞のゲノム（例えば染色体、プラスミドまたはミトコンドリアDNA）中に混入さ
れ、自立性レプリコンに変換されるか、または一時的に発現され得る（例えば形
質移入されたｍＲＮＡ）真核生物または原核生物中へのその核酸の混入を意味す
る。
【００４２】 “単離される”の用語は、核酸またはたんぱく質のような物質に関し、それの
天然に生ずる環境の下で見出されるように通常はそれを伴うかまたはそれと相互
作用するような諸成分を実質的または本質的に含有しない物質に関する。単離さ
れた物質は場合により、それの天然環境では見出されない物質を含有する。ここ
で定義される“単離される”核酸はまた、“異種”核酸と称されることもある。
【００４３】 特記しない限り、“ＡＰＡＯ核酸”の用語は、ＡＰＡＯポリペプチドをコード
するポリヌクレオチド（“ＡＰＡＯポリヌクレオチド”）を含有する核酸を意味
する。この用語ＡＰＡＯは、特記しない限り、ＡＰＡＯおよびｔｒＡＰＡＯと示
されるＡＰＡＯの機能的な切形バージョンの両方を包含することができる。
【００４４】 ここで使用される“核酸”は、一本鎖または二本鎖の形態のいずれかのデオキ
シリボ核酸またはリボ核酸のポリマーを意味し、そして別に限定されないならば
、天然ヌクレオチドの本質的性質を有する既知の類似体も包含し、そこではそれ
らは天然産ヌクレオチド（例えばペプチド核酸）と同様の手法でハイブリッド形
成して一本鎖核酸になる。 “核酸ライブラリー”は、特定化された生物のゲノムの転写された完全なフラク
ションを含有しそして実質的に表現する単離されたＤＮＡまたはＲＮＡの分子の
収集を意味する。例えばゲノムライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーのよう
な典型的な核酸ライブラリーの構築は、標準的な分子生物学参考書例えばBerger
and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymolog
y, Vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook et a
l., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd ed., Vol. 1-3 (1989); an
d Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., Eds., Cur
rent Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, In
c. and John Wiley & Sons, Inc. (1994 Supplement)に教示されている。
【００４５】 ここで使用する“操作可能に連結された（operably linked）”は、 第一配列
例えばプロモーターと第二配列との機能的連結に関し、そこではそのプロモータ
ー配列が第二配列に対応するＤＮＡの転写を開始しそして仲介する。一般的に、
“操作可能に連結された”は、連結されている核酸配列が隣接しており、そして
二つのたんぱく質コード領域を一緒にする必要がある場合には、隣接しておりか
つ同一のリーディングフレーム中にあることを意味する。
【００４６】 本明細書にて使用する「植物」なる用語は、植物全体、植物器官（例えば葉、
幹、根など）、種子および植物細胞およびその子孫を包含する。ここで使用され
る、植物細胞は限定なしに、種子懸濁培養物、胚、分裂組織部位、カルス組織、
葉、根、苗条、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を包含する。本発明の方法で
使用され得る植物は、一般に形質転換技術に従う高度な植物と同じように広く、
単子葉および双子葉植物の両方を含み、次の属からの種を含む；Cucurbita, Ros
a, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Tri
gonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, B
rassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycope
rsicon, Nicotiana, Solanus, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Hel
ianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis,
Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cu
cumis, Browaalia, Glycine, Pisum, phaseolus, Lolium, Oryza, Avena, Horde
um, Secale, Allium およびTriticum.特に好ましい植物はZea maysである。
【００４７】 本明細書にて使用する「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボポリヌクレオチ
ド、リボポリヌクレオチド、またはそのアナログを含む。そのアナログは天然の
リボヌクレオチドの本質的な性質を有しており、ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション(stringent hybridization)条件下で天然に生じるヌクレオチドの
ように本質的に同じヌクレオチド配列とハイブリダイズし、および/または天然
に生じるヌクレオチドのように同じアミノ酸に翻訳されうる。ポリヌクレオチド
は、天然のまたは外来の構造遺伝子または調節遺伝子の全長またはサブ配列とす
ることができる。他に指示が無ければ、その用語は、それの相補配列と同様に特
定された配列をも含む。故に、安定性または他の理由で修飾されたバックボーン
を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、本明細書では「ポリヌクレオチド」である。さ
らに、イノシンのような特別な塩基またはトリチル化塩基のような修飾された塩
基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、該用語がここで使用されているように、ポリヌ
クレオチドである。非常に多くの修飾がＤＮＡやＲＮＡになされ、それは当該技
術分野でよく知られた多くの有益な目的に役立っている。用語ポリヌクレオチド
は、単一および複合細胞を包含する、ウイルスや細胞に特徴的なＤＮＡおよびＲ
ＮＡの化学的形態と同様に、ポリヌクレオチドの化学的に、酵素的に、または代
謝的に修飾された形態を包含する。
【００４８】 用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基
のポリマーを称するのに互換的に使用されている。この用語は、天然アミノ酸ポ
リマーと、１又はそれ以上のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学的
なアナログであるアミノ酸ポリマーに適用される。
【００４９】 本明細書にて使用する、「プロモーター」なる用語は、転写の開始から上流の
ＤＮＡの領域であって、ＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質が認識して結
合し、そして転写を開始する領域を意味する。「植物プロモーター」は植物細胞
内で転写を開始することが出来るプロモーターである。具体的な植物プロモータ
ーは、限定はされないが、アグロバクテリウムまたはリゾビウムのような植物細
胞内で発現する遺伝子を含む、植物、植物ウイルス、細菌から得られる。葉、根
、種子、繊維、木部導管、仮導管、または厚膜組織のようなある種の組織で転写
が開始されるプロモーターが例示される。そのようなプロモーターは「組織優先
」と称される。「細胞」タイプ特異的プロモーターは、ある種の細胞タイプにお
いて、１またはそれ以上の器官で、例えば、根や葉の導管細胞において主に発現
する。「誘導性」または「調節性」プロモーターは環境の制御下でのプロモータ
ーである。誘導性プロモーターにより転写されうる環境条件の例は、嫌気性条件
または光の存在である。他のタイプのプロモーターは、発生において制御される
プロモーター例えば、花粉発生中に発現するプロモーターである。組織優先プロ
モーター、細胞タイプ特異的プロモーター、発生において制御されるプロモータ
ーおよび誘導性プロモーターは、「非構成的」プロモーターを構成する。「構成
的」プロモーターは、もっと環境的条件で活性なプロモーターである。
【００５０】 「ＡＰＡＯポリペプチド又はｔｒＡＰＡＯポリペプチド」なる用語は、１また
はそれ以上のアミノ酸配列を指している。この用語は、フラグメント、変種、ホ
モローグ、対立遺伝子またはそれらの前駆体（例えば、プレプロタンパク質、又
はプロタンパク質）を含んでいる。「ＡＰＡＯまたはｔｒＡＰＡＯタンパク質」
はＡＰＡＯ又はｔｒＡＰＡＯポリペプチドからなる。
【００５１】 本明細書にて使用する、「組換え」は、異種の核酸の導入によって修飾された
か又は細胞がある細胞から修飾されて誘導された細胞又はベクターを含む。例え
ば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）の型では同じものは見出されない遺
伝子を発現する。そうでなければ異常に発現する、つまり意図的な人の干渉の結
果発現するか又はまったく発現しない、天然の遺伝子を発現する。ここで使用す
る「組換え」なる用語は、故意の人の干渉なしに起こる、自然に生じる現象（例
えば、自然発生的な突然変異、自然の形質転換/変換/転移）による細胞やベクタ
ーの変性を含むものではない。
【００５２】 ここで使用する「組換え発現カッセト」は核酸コンストラクトであり、組換え
でまたは合成で作られ、特定の核酸エレメントを有し、標的細胞で特定の核酸を
転写をさせるものである。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコ
ンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス、核酸フラグメントに組み入れる
ことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は他の配列
のなかで転写されるべき核酸およびプロモーターを包含する。
【００５３】 「残基」又は「アミノ酸残基」又は「アミノ酸」は相互に、タンパク質、ポリ
ペプチド、又はペプチド（集合的にタンパク質）の中に組み入れられたアミノ酸
を称するのに使用される。アミノ酸は特に制限されない限り天然のアミノ酸とす
ることができ、天然のアミノ酸と同様に機能し得る天然アミノ酸の公知の類似体
を含む。
【００５４】 「選択的にハイブリダイズする」なる用語は、ストリンジェントなハイブリダ
イゼーション条件下で、非標的核酸配列へのハイブリダイズよりも検出可能なよ
り大きい等級（例えば、バックグランドの少なくとも２倍）の核酸配列の特定の
核酸標的配列へのハイブリダイズであり、非標的核酸は実質的除去されている。
選択的にハイブリダイズした配列は、典型的には少なくとも４０％配列同一性、
好ましくは６０−９０％配列同一性を有し、もっとも好ましくは１００％配列同
一性（即ち相補性）を相互に有している。
【００５５】 「ストリンジェント条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーショ
ン条件」なる用語は、プローブが他の配列よりも検出可能な大きい程度（例えば
、バックグランドの少なくとも２倍）で標的配列とハイブリダイズする条件を意
味する。ストリンジェント条件は配列依存性であり、異なった状況では異なるで
あろう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび/または洗浄条件
を調節することにより、標的配列をプローブと１００％までの相補性（相同的プ
ロービング）で特定することが可能である。あるいは、ストリンジェント条件は
、低い程度の相似性が検出される（異相的プロービング）ほど配列のミスマッチ
を許すように調節することもできる。最適には、プローブは約５００ヌクレオチ
ドの長さであるが、５００より小さい長さから、標的配列の全長に等しい長さま
で大きく変えることができる。
【００５６】 典型的には、ストリンジェント条件は、塩濃度が約１．５Ｍ Ｎａイオンより
低い濃度であり、典型的には０．０１から１．０Ｍ Ｎａイオン濃度であり（ま
たは他の塩）、短いプローブ（例えば、１０から５０ヌクレオチド）に対してｐ
Ｈ７．０から８．３で温度はすくなくとも３０℃である、そして長いプローブ（
例えば５０より大きいヌクレオチド）に対しては少なくとも６０℃である。スト
リンジェント条件は、ホルムアミドやデンハルト（Denhardt's）のような脱安定
化剤の添加によっても達成されうる。例示的な低いストリンジェント条件は、３
７℃で３０−３５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸
ナトリウム）の緩衝液でのハイブリダイゼ−ション、および５０−５５℃で１Ｘ
−２Ｘ ＳＳＣ（２０Ｘ ＳＳＣ＝３．０Ｍ ＮａＣｌ/0.3Ｍクエン酸３ナトリ
ウム）での洗浄である。例示的な中程度のストリンジェント条件は、３７℃で４
０−４５％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーシ
ョン、および５５−６０℃で０．５Ｘ-１Ｘ ＳＳＣでの洗浄である。例示的な
高いストレンジェンシ条件は、３７℃で５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ，
１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションそして６０−６５℃で０．１ＸＳＳＣで
の洗浄である。典型的には、特異性はハイブリダイゼーション後の洗浄の機能で
あり、重要な要素は最後の洗浄液のイオン強度と温度である。ＤＮＡ―ＤＮＡハ
イブリッドのためには、Ｔmは、Anal. Biochem., 138:267-2841984)、Meinkoth
およびWahlの等式から概算される:Tm=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(%for
m)-500/L；式中、Ｍは１価カチオンの容積モル濃度であり、％ＧＣは、ＤＮＡに
おけるグアノシンとシトシンヌクレオチドの比率であり、％ｆｏｒｍは、ハイブ
リダイゼーション溶液中のホルムアミドの比率であり、Ｌは、塩基対におけるハ
イブリッドの長さである。Ｔmは相補性標的配列の５０％が完全にマッチしたプ
ローブとハイブリダイズした温度（定義されたイオン強度とｐＨ）である。Ｔm
は、ミスマッチング１％に対して約１℃減少する。かくしてＴm，ハイブリダイ
ゼーションおよび／または洗浄条件は、所望の同一性配列にハイブリダイズする
よう調節することができる。例えば、同一性が９０％以上の配列が求められると
きは、Ｔmは１０℃減少されうる。一般にストリンジェント条件は、規定された
イオン強度とｐＨで特定の配列およびその補体に対して熱融点（Ｔm）より約５
℃低く選択される。しかしながら、きびしいストリンジェント条件は、熱融点（
Ｔm）よりも１，２，３、または４℃低い温度でハイブリダイゼーションおよび
／または洗浄を用いることができる；中程度のストリンジェント条件は熱融点（
Ｔm）よりも６，７７，８，９、または１０℃低いハイブリダイゼーションおよ
び／または洗浄を用いることができる；低いストリンジェント条件は、熱融点（
Ｔm）よりも１１，１２，１３，１４，１５、または２０℃低いハイブリダイゼ
ーションおよび／または洗浄を用いることができる。等式、ハイブリダイゼーシ
ョン、洗浄組成物、および所望のＴmを用いて当業者は、ハイブリダイゼーショ
ンおよび／または洗浄液のストリンジェンシーの変化が本質的に記載されている
ことを理解するであろう。もし、所望のミスマッチイングの程度が４５℃（水溶
液）または３２℃（ホルムアミド液）より低いＴmの結果になるならば、より高
い温度を使用できるようにＳＳＣ濃度を増大させるのが好ましい。核酸のハイブ
リダイゼーションへの詳細にわたるガイドは、Tijssen, Laboratory Techniques
in Biochemistry and Molecular Biology−Hybridization with Nucleic Acid
Probes, Part I, Chapter 2 "Overview of principles of hybridization and t
he strategy of nucleic acid probe assays", New York (1993); and Current
Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Ausubel等, Greene Publishing
and Wily-Interscience, New York (1995)に見られる。もしそうでなければ、本
願において、高いストリンジェンシーは、６５℃で４ＸＳＳＣ，５Ｘデンハルト （水５００ｍｌ中、５ｇ フィコール，５ｇポリビニルピロリドン，５ｇ ウ
シ血清アルブミン）、０．１ｍｇ／ｍｌボイルドサーモン精巣ＤＮＡ，そして２
５ｍＭ リン酸Ｎａでのハイブリダイゼーションと、６５℃で０．１Ｘ ＳＳＣ
，０．１％ＳＤＳでの洗浄として定義される。
【００５７】 ここで用いられる“トランスジェニック植物”には、そのゲノム内が異種ポリ
ヌクレオチドを包含する植物についてのものを含む。一般的に異種ポリヌクレオ
チドはこのポリヌクレオチドが次の世代に引き継がれる様にゲノム中に安定的に
組み込まれる。異種ポリヌクレオチドはゲノムだけに、または組替え発現カセッ
トの一部として組み込まれる。ここで用いられる“トランスジェニック”には、
細胞、細胞系、カルス、組織、植物の部分または植物を含み、そのゲノタイプが
最初にトランスジェニック植物として変換されたもの、ならびに最初のトランス
ジェニック植物から有性交配によって作成されたかまたは無性繁殖によって作成
された、異種核酸の存在によって変換されたものを含む。ここで用いられる“ト
ランスジェニック”の用語は、通常の植物繁殖方法またはランダム交叉繁殖、非
−組換え型のウイルス感染、非−組換え型のバクテリアによる形質転換、非−組
換え型の転位などの天然に生じる現象によるゲノム（染色体のまたは染色体外の
）の変異を含むものではない。
【００５８】 ここで用いられる“ベクター”には、宿主細胞のトランスフェクションに用い
られ、宿主細胞中にポリヌクレオチドを挿入することが出来る核酸を含む。ベク
ターはしばしばレプリコンである。発現ベクターはそこに挿入された核酸の転写
を許容する。
【００５９】 つぎの用語、（ａ）“参照配列”（reference sequence)、（ｂ）“比較窓”(c
omparison window)、（ｃ）“配列同一性”(sequence identity)、（ｄ）“配列同
一性パーセント”(percentage of sequence identity)、および（ｅ）“実質同
一”(substantial identity）を、二つまたはそれ以上の核酸またはポリヌクレ
オチドまたはポリペプチドの間の配列関係を記述するために用いた。
【００６０】 (ａ) ここで用いる“参照配列”は、配列比較のための基準として用いた決め
られた配列のことである。参照配列は、特定の配列のサブセットであるかまたは
全体、例えば全体長さのｃＤＮＡまたは遺伝子配列であるか、または完全ｃＤＮ
Ａまたは遺伝子配列である。
【００６１】 (ｂ) ここで用いる“比較窓”は、ポリヌクレオチド配列の隣接する特定的な
セグメントについてのものを意味し、ここでこのポリヌクレオチド配列は参照配
列と、二つの配列の最適のアラインメントについて比較されるが、比較窓中のポ
リヌクレオチド配列の部分は参照配列のものと比較して付加または欠失（すなわ
ちギャップ）を含みうる（なお参照配列は付加または欠失を含まない）。一般的
に比較窓は長さで少なくとも２０個の隣接するヌクレオチドで、場合により３０
、４０、５０、１００またはそれ以上のものである得る。ポリヌクレオチド配列
中のギャップの包含による参照配列との高い相同性を回避するためにギャップペ
ナルティーが典型的には導入され、多くのマッチングを減ずることは、当業者が
よく理解するところである。
【００６２】 比較のためのヌクレオチドおよびアミノ酸配列のアラインメント方法はこの技
術分野で周知である。Smith および Waterman の Adv. Appl. Math によるロー
カルホモロジーアルゴリズム（ベスト・フィット）は比較のための最適の配列の
アラインメントのために行いうる。2: 482 (1981)；Needleman and Wunsch の J
. Mol. Biol. 48: 443 (1970) のホモロジーアラインメントアルゴリズム（GAP)
により、 Pearson and Lipman の Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444 (1988) の
同様の方法のサーチ（Tfasta and Festa) により、Intelligenetics, Mountain
View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, FAST のPC／Geneプログラム中のCLAS
TAL、およびGenetic Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisco
nsin, USA のWisconsin Genetics Software 中の TFASTAを含むがこれには限定
されるものではない、かかるアルゴリズムのコンピューター化された遂行により
行われる。このCLASTALプログラムは、Higgins and Sharp, CABIOS 5: 151-153
(1989); Corpet et al, Nucleic Acids Research 16: 10881-90 (1988); Huang
et al., Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992); およ
びPearson, et al., Methods in Molecular Biology 24: 307-331 (1994) に詳
細に記載されている。 複数の配列の最適グローバルアライメントのために用いる
のに好適したプログラムはPile Up (Feng and Doolittle, Journal of Molecule
Evolution, 25: 351-360 (1989))であって、これは Higgins and Sharp, CABIO
S 5: 151-153 (1989) に記載された方法と同様のもので、ここにこれらの文献を
参照により本明細書に加入する。データベースの類似性のサーチに用いることが
出来るＢＬＡＳＴファミリーのプログラムには、ヌクレオチドの問題配列対ヌク
レオチドのデータベース配列のためのＢＬＡＳＴＮ、ヌクレオチドの問題配列対
タンパク質データベース配列のためのＢＬＡＳＴＸ、 タンパク質の問題配列対タ
ンパク質のデータベース配列のためのＢＬＡＳＴＰ、タンパク質の問題配列対ヌ
クレオチドのデータベース配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ、ヌクレオチドの問題配
列対ヌクレオチドのデータベース配列のためのTBLASTXがある。Current Protoco
les in Molecular Biology, Chapter19, Ausubel et al., Eds., Greene Publis
hing and Wiley-Interscience, New York (1995) を参照されたい。
【００６３】 GAPはNeedleman and Wunsch のアルゴリズム (J.Mol. Biol. 48: 443-453, 19
70) を用いて適合の数を最大化し、そしてギャップの数を最小化する二つの完全
配列のアラインメントを見いだすためのものである。 ＧＡＰは全ての可能なアラ
インメントとギャップ位置を考察し、適合した塩基が最大数でギャップが最小の
アラインメントを作り出す。それは適合した塩基のユニット中でギャップクリエ
ーションペナルティーとギャップエクステンションペナルティーをもたらす。Ｇ
ＡＰはそれが挿入する各々のギャップに適合するギャップクリエーションペナル
ティーの数を利用するものでなければならない。もしもゼロよりも大きいギャッ
プクリエーションペナルティーが選択されたならば、ＧＡＰはさらに、ギャップ
時間の長さの挿入された各々のギャップについてのギャップエクステンションペ
ナルティーを利用しなければならない。Wisconsin Genetics Software のバージ
ョン10 における不足（default）のギャップクリエーションペナルティーとギャ
ップエクステンションペナルティーはそれぞれ８および２である。ギャップクリ
エーションおよびギャップエクステンションペナルティーは０〜１００の整数か
らなる群から選ばれる整数で表現することが出来る。かくして、例えばギャップ
クリエーションおよびギャップエクステンションペナルティーは、０、１、２、
３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０またはそれ
以上であり得る。
【００６４】 ＧＡＰは最良のアラインメントのファミリーの一員を表す。このファミリーに
多くの構成員があるけれども、質のより良い他の構成員はない。ＧＡＰはアライ
ンメントについて四つの価値のある値：質、比率、同一性(identity)、および相
似性（similarity）を表すものである。質は配列をアラインするためにメトリッ
ク（metric）に最大化されたものである。 比率はより短いセグメント中の塩基の
数で質を除したものである。パーセント同一性は実際に適合するシンボルの百分
率である。 パーセント相似性は相似であるシンボルの百分率である。ギャップを
横切るシンボルは無視される。相似性は一対のシンボルについての評点記録マト
リックス値が相似性の閾値の０.５０より大きいかまた等しいときに記録される
。Wisconsin Genetics Software Package のバージョン１０で用いられた評点記
録マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６２である（Henikoff and Henikoff (1989) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 参照)。
【００６５】 他に特記しない限り、ここで得られる配列の同一性／相似性の値については、デ
ホールトパラメーターを用いるＢＬＡＳＴ ２.０の一連のプログラムが参照され
る。Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)。
【００６６】 本技術分野の通常の知識を有す者が容易に理解するように、ＢＬＡＳＴ調査で
はタンパク質はランダム配列としてモデル化され得ると仮定されている。しかし
ながら、多くの実際のタンパク質は非ランダムの配列領域からなり、この領域は
ホモ重合性の区域で、短い周期の繰り返しの、または一つまたはそれ以上のアミ
ノ酸に富む領域である。 このような低−複雑性領域は、このタンパク質の他の領
域が全く同様でないとしても、関連しないタンパク質の間にアラインされている
。このような低−複雑アラインメントを減じる為に多くの低-複雑フィルタープ
ログラムを用いることができる。例えば、SEG (Wooten and Federhen, Comput.
Chem., 17: 149-163 (1993) およびＸＮＵ (Claverie and States, Comput. Che
m. 17: 191-201 (1993) 低−複雑フィルターが単独でまたは組み合わされて用い
ることができる。
【００６７】 (ｃ) ここで用いる“配列同一性”または“同一性”とは、二つの核酸または
ポリペプチド配列についてこの二つの配列中の残基に関してこれを対応する特定
の比較窓において最大の対応が取れるようにアラインした時に、この二つの配列
中の残基が同一であるということを表現するものである。配列同一性の比率がタ
ンパク質に関して用いられるときには、残基位置が同一でなく、しばしば保存さ
れた酸置換体により異なるもので、この場合アミノ酸残基は類似の化学的性質（
たとえば電荷または疎水性）を有しており、それゆえに分子の機能的性質を変え
ないものであると認識されるべきである。配列がそのような保存置換体で異なる
場合には、この置換分の保有された性質に対する補正の為に配列同一性百分率を
上方に修正されうる。かかる保存された置換体によって異なる配列は、“配列類
似性”または“類似性”を有すると呼ばれる。この修正を行う方法は当業者に周
知である。典型的には上記のことは保存された置換体を全体のミスマッチではな
くて部分的ミスマッチと評点することを含み、かくして配列同一性比率を増大さ
せる。かくして、例えば同一のアミノ酸に評点１が与えられ、そして非−保存的
置換に評点０が与えられる場合に、保存的置換には０と１の間の評点が与えられ
る。保存的置換の評点は、例えば、Meyers and Miller, Computer Applic. Biol
. Sci.,4: 11-17 (1988) の例えば ＰＣ／ＧＥＮＥ (Intelligenetics, Mountai
n View, California, USA) 中において実行されたプログラムのアルゴリズムに
従って計算される。
【００６８】 (ｄ) ここで用いる“配列同一性の比率”とは、”二つの最適にアラインされ
た比較窓越しの配列を比較して決定された値を意味するが、ここで比較窓中のポ
リヌクレオチド配列の部分は対照配列（このものには付加または欠失が無い）と
比較してこの二つの配列の最適アラインメントおいて付加または欠失（すなわち
ギャップ）を含んでいる。比率は、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の
配列に存在して合致した（マッチした）位置の数を測定して得られるが、得られ
たこの合致した位置の数を比較窓中の位置の合計の数で除し、その結果に１００
を乗じて配列同一性百分率が得られる。
【００６９】 (ｅ) (ｉ)ポリヌクレオチド配列の“実質的に同一”の用語は、標準パラメー
ターを用いる記載されたアラインメントプログラムの一つを用いる対照配列と比
較してポリヌクレオチドが５０〜１００％の間の配列同一性を有する配列を含む
こと、好ましくは少なくとも５０％の配列同一性、好ましくは少なくとも６０％
の配列同一性、好ましくは少なくとも７０％の配列同一性、より好ましくは少な
くとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、そ
して最も好ましくは９５％の配列同一性を有することを意味する。当業者には、
コドン縮重、アミノ酸類似性、読み取りフレームのポジショニング、などを考慮
して、かかる値が適切に調節されて二つのヌクレオチド配列でコードされたタン
パク質の対応する同一性を決定することが認識されるであろう。かかる目的で、
アミノ酸配列の実質的同一性は通常、４０〜１００％の間の配列同一性、好まし
くは少なくとも５５％、好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくと
も７０％、８０％、９０％そして最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性
を意味する。
【００７０】 ヌクレオチド配列が実質的に同一であることのもう一つ表示は、二つの分子が
ストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズするかどうかと言うことにある
。遺伝コードの縮重は、多くのアミノ酸の置き換えを許容するので、同一のアミ
ノ酸をコードするヌクレオチド配列中に多様性を導き、かくして同一のポリペプ
チドをコードすることが出来るＤＮＡ配列でも、ストリンジェント条件下で互い
にハイブリダイズすることが出来ない。このことは、例えば核酸のコピーを遺伝
コードにより許される最大のコドン縮重を用いて作成する時に起こる。二つの核
酸配列が実質的に同一であることの一つの表示は、第一の核酸でエンコードされ
たポリペプチドが、第二の核酸でエンコードされたポリペプチドと免疫学的に交
差反応性であるということである。
【００７１】 (ｅ) （ii）“実質的に同一”の用語は、ペプチドが５５〜１００％の間の対
照配列に対する配列同一性、好ましくは少なくとも５５％の配列同一性、好まし
くは６０％、好ましくは７０％、より好ましくは８０％、最も好ましくは少なく
とも９０％または９５％の 特定の比較窓中の対照配列に対する配列同一性を有
する配列を含むことを示すものという意味を有する。好ましくは最適アラインメ
ントは Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970) に記載のホモロ
ジーアラインメントアルゴリズムを用いて行われる。二つのペプチド配列が実質
的に同一である表示は、一つのペプチドが第二のペプチドに対して生じた抗体に
対して免疫学的に反応性であることである。かくして一つのペプチドが実質的に
第二のペプチドと同一であること、つまり、二つのポリペプチドは保存的置換体
でのみ異なるのである。加えて、二つのペプチドが非−保存的変異でのみ異なり
そしてもしも抗体を認識するエピトープが実質的に同一であるときに、一つのペ
プチドは第二のペプチドに対して実質的に同一であり得る。“実質的に類似”の
ペプチドは上記した様に同一ではない残基位置の外に保存的アミノ酸変異により
異なる配列を共有する。
【００７２】 フモニシン分解性生物 本発明は、マイコトキシン フモニシン(mycotoxin fumonisin)を分解する能
力を有する生物の発見に基づくものである。フモニシンを解毒する生物学的手段
の探求において、いくつかの褐色の糸状菌類(dematiaceous hyphomycetes)が、
畑生育トウモロコシの穀粒から単離された。これら菌類は、唯一のカーボン・ソ
ースとしてのフモニシンB1またはB2（FB1またはFB2）において成長することがで
き、そして、その過程において部分的にないしは完全にこれを分解する。エキソ
フィアラ・スピニフェラ( Exophiala spinifera)、「黒いイースト」として識別
される1つの種は、米国南東部および南中部の多様な場所から得られたトウモロ
コシの種子から回収された。エキソフィアラ・スピニフェラの酵素活性な菌株（
ATCC 74269）が、寄託された（米国特許出願第5,716,820号、発行日1998年2月10
日；米国特許第5,792,931号、発行日1998年8月11日；ならびに係属中の米国特許
出願第08/888950号および第08/888949号、いずれも1997年7月7日に出願、を参照
のこと）。
【００７３】 核酸 とりわけ、本発明は、 APAOまたはtrAPAOポリヌクレオチドからなる、RNA、DN
A、ならびにこれらのアナログおよび／またはキメラといった単離された核酸を
提供するものである。本発明はまた、異なる生物における発現のために最適化さ
れたポリヌクレオチドを包含するものである。
【００７４】 例えば、あるトウモロコシ植物におけるポリヌクレオチド発現のために、配列
は、特定のコドン選択をなすように変容されることができ、また上記のマレイら
(Murray et al)に従って、GC含量（グアニン-シトシン含有率）を変えるように
変容されることができる。トウモロコシ植物からの28遺伝子のためのトウモロコ
シコドンの使用は、上記のマレイらの表4に列挙されている。
【００７５】 本発明のAPAOまたはtrAPAO核酸は、以下のものを包含する意味での、単離され
たAPAOまたはtrAPAOポリヌクレオチドから成るものである： (a) SEQ ID NO:６および22に示される配列のAPAOまたはtrAPAOポリペプチド
、ならびにこれらを保存的に(conservatively)修飾したおよび多形の変異体、の
うちの１つをコード化しているポリヌクレオチド： (b) (a)または（b）のうちの１つのポリヌクレオチドに選択的にハイブリッ
ド形成するポリヌクレオチド、； (c) (a)または（b）のポリヌクレオチドと少なくとも40%の配列同一性を有
するポリヌクレオチド、； (d) (a)、（b）、または(c)のポリヌクレオチドの相補的配列； および、 (e) (a)、（b）、（c）または、（d）のポリヌクレオチドから、少なくとも
15の近接ヌクレオチドからなるポリヌクレオチド。
【００７６】 さらに、APAOまたはtrAPAOポリヌクレオチドとフモニシン エステラーゼのポ
リヌクレオチドとの融合体であるポリヌクレオチドが、開示される。本発明は、
エキソフィアラからの配列、ならびにこのような配列と配列類似性を有する配列
を包含する。本発明の配列を、他の生物における相当する配列を単離するために
用いることができるということが認識される。PCR、ハイブリダイゼーションな
どのような方法が、本発明の配列に実質的な配列類似性を有する配列を同定する
ために用いられ得る。例えば、 Sambrook, et al., (1989) Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planv
iew, New York) and Innis et al., (1990) PCR Protocols: Guide to Methods
and Applications (Academic Press, New York)を参照のこと。本明細書におい
て述べる完全フモニシン分解化コードン配列(entire fumonisin degrading codi
ng sequence)に対するまたはそのフラグメントに対する配列同一性に基づき単離
されたコーディング配列は、本発明に包含される。
【００７７】 本発明の配列が、他のフモニシン分解性生物から類似配列を単離するために用
いることができることが、認識された。同様に、他のフモニシン分解性生物から
の配列も、本発明の配列との組み合わせにおいて用いることが可能であろう。例
えば、本願と同時に出願した"Compositions and Methods for Fumonisin Detoxi
fication"と題された同時係属中の米国出願一連番号60/092,953を参照のこと。
なお、その内容は、関連により本明細書中に取り込まれる。
【００７８】 本発明のポリヌクレオチド配列を含有するプラスミドは、ヴァージニア州マナ
サス( Manassas, Virginia)所在のアメリカン タイプ カルチャー コレクシ
ョン（ATCC）に寄託され、そして、受託番号98812、98813、98814、98815および
98816を割り当てられた。これらの寄託物は、特許手続上の微生物の寄託の国際
的な承認に関するブダペスト条約の条件下で維持されるであろう。これらの寄託
物は、単に当業者の利便のためのみに行われたものであり、寄託物が35 U.S.C.
112の下に必要であるという自認でない。
【００７９】 核酸の構築 本発明の単離された核酸は、(a) 標準的な組換え方法、（b）合成方法、また
はこれらの組合せによって調製することができる。いくつかの実施態様において
、本発明のポリヌクレオチドは、クローニングされ、増幅される、あるいはまた
、真菌または細菌から構築されるであろう。
【００８０】 核酸は、本発明のポリヌクレオチド以外に、都合良く配列を有することができ
る。例えば、ポリヌクレオチドの単離に役立つように、一つないしそれ以上のエ
ンドヌクレアーゼ制限部位を有する多重クローニング部位が、核酸に挿入される
ことができる。また、翻訳可能な配列は、本発明の翻訳されたポリヌクレオチド
の単離に役立つように、挿入されることができる。例えば、ヘキサヒスチジン
マーカー配列は、本発明のタンパク質を純化するために都合の良い手段を提供す
る。
【００８１】 本発明の核酸（ポリヌクレオチド配列以外）は、任意に、本発明のポリヌクレ
オチドのクローニングおよび／または発現のための、ベクター、アダプタまたは
リンカーであり得る。このようなクローニングおよび／または発現配列に対し、
クローニングおよび／または発現におけるこれらの機能を最適化するため、ポリ
ヌクレオチドの隔離において役立つため、または細胞へのポリヌクレオチドの導
入を改善するために 、付加的な配列が、加えられることができる。代表的には
、本発明のポリヌクレオチドの長さを除く本発明の核酸の長さは、20キロ塩基対
未満であり、しばしば15kb未満、そしてさらに多くの場合、10kb未満である。ク
ローニングベクター、発現ベクター、アダプタおよびリンカーの使用は、当技術
分野に広く知られている。核酸は、例えば、M13, λ ZAP Express, λZAP II,λ
gt10, λ gt11, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II, λ DASH II, λ EMBL 3,
λ EMBL 4, pWE15, SuperCos 1, SurfZap, Uni-ZAP, pBC, pBS+/-, pSG5, pBK,
pCR-Script, pET, pSPUTK, p3'SS, pGEM, pSK+/-, pGEX, pSPORTI and II, pOPR
SVI CAT, pOPI3 CAT, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMC1neo, pOG44, pOG45, pFR
TbGAL, pNEObGAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415,
pRS416, λ MOSSlox, および λ MOSEloxようなベクターを含む。本発明のため
の任意ベクターは、λ ZAP II, および pGEXを含むが、もちろんこれらに限定さ
れるものではない。種々の核酸の開示に関しては、例えば、Stratagene Cloning
Systems, Catalogs 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA);およびAmersham Life S
ciences, Inc, Catalog '97 (Arlington Heights, IL)を参照のこと。
【００８２】 核酸を構築するための合成方法 本発明の単離した核酸は、ナランら(Narang et al., Meth. Enzymol. 68: 90-
99 (1979))の蛍光トリエステル法、ブラウンら(Brown et al., Meth. Enzymol.
68: 109-151 (1979))の蛍光ジエステル法、ビューケージら(Beaucage et al., T
etra. Lett. 22:1859-1862 (1981))のジエチルフォスフォラミダイト(diethylph
osphoramidite)法、また、例えば、Needham-VanDevanter et al., Nucleic Acid
s Res., 12:6159-6168 (1984)に例えば述べられるような自動化シンセサイザー
を用いてのビューケージとカルーサーズ(Beaucage and Caruthers, Tetra. Lett
. 22:1859-1862 (1981))に述べられる固相フォスフォラミダイトトリエステル(s
olid phase phosphoramidite triester)法、および、米国特許第4,458,066号の
固相支持法などのような、方法による直接的化学合成によっても、調製され得る
。化学合成は、一般に一重鎖オリゴヌクレオチドを生成する。これは、相補的な
配列とのハイブリダイゼーションによって、または該一重鎖をテンプレートとし
たDNAポリメラーゼを用いた重合によって、二重鎖DNAに変えられることができる
。当業者は、DNAの化学合成が約100塩基までの配列にとどまるが、より長い配列
が短い配列の連結によって得られることができることを、認識できるであろう。
【００８３】 UTR類およびコドン優先選択 一般に、翻訳効率は、RNAの 5’−非コーディングないし非翻訳領域（5’−UT
R）における特定の配列要素によって制限されることが見出されている。ポジテ
ィブな配列モティーフは、翻訳開始コンセンサス配列（Kozak, Nucleic Acids R
es.15:8125 (1987)）および5<G> 7 メチルGpppG RNAキャップ構造（Drummond e
t al., Nucleic Acids Res. 13:7375 (1985)）を含む。ネガティブな要素は、安
定した分子内5’−UTRステム-ループ構造 (Muesing et al., Cell 48:691 (1987
)) 、およびAUG 配列、または5’−UTR内の適当なAUGによって先行された短い転
写解読枠(Kozak, 上記, Rao et al., Mol. and Cell. Biol. 8:284 (1988))を含
む。
【００８４】 従って、本発明は、異種のコーディング配列の翻訳の変調のための5’および
／または3’UTR領域を提供する。
【００８５】 更に、本発明のポリヌクレオチドのポリペプチド-コード化セグメントは、コ
ドン使用量を変えるために修飾されることができる。変更されたコドン使用量は
、翻訳効率を変える、および／または所望の宿主における発現のためのコーディ
ング配列を最適化するため、または、トウモロコシにおける発現のための異種の
配列においての該コドン使用量を最適化するために、用いられることができる。
本発明のポリヌクレオチドのコーディング領域におけるコドン使用量は、例えば
、ウィスコンシン大学、遺伝学コンピュータグループから入手可能な「コドン優
先選択(Codon Preference)」(Devereaux et al., Nucleic Acids Res. 12: 387-
395 (1984)) or MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.を参照
のこと。)のような市販のソフトウェア・パッケージを用いることにより、統計
学的に分析され得る。したがって、本発明は、本発明のポリヌクレオチドのうち
の少なくとも1つのコーディング領域のコードン使用頻度特性を提供する。コド
ン使用頻度を決定するために用いられ得るポリヌクレオチド（アミノ酸１つにつ
き3つのヌクレオチド）の数は、3から本明細書において示された本発明のポリヌ
クレオチドの数までうちの任意の整数であり得る。選択的に、該ポリヌクレオチ
ドは全長の配列であり得る。統計的分析のための配列の典型的な数は、少なくと
も1、5、10、20、50または100であり得る。
【００８６】 配列シャッフリング 本発明は、本発明のポリヌクレオチドおよびそこから得られる組成を使用する
配列シャッフリングのための方法を提供する。配列シャッフリングは、PCT公報
第96/19256号に記載されている。さらに、Zhang, J.- H., et al. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94:4504-4509 (1997) および Zhao, et al., Nature Biotech 1
6:258-261 (1998)を参照のこと。一般に、配列シャッフリングは、所望の特徴を
有するポリヌクレオチドのライブラリを作成するための手段を提供するものであ
り、そしてそれは、選択されるまたはスクリーニングされることができる。配列
領域から構成された、実質的な配列同一性を有し、かつ試験管内的または生体内
的に相同性をもって組替えられることができる、関連した配列ポリヌクレオチド
の母集団から、組換えポリヌクレオチドのライブラリは、作成される。配列組換
えポリヌクレオチドの母集団は、所望されるあるいは有利な特徴を有しかつ、適
切な選択法またはスクリーニング法によって選ばれることができるポリヌクレオ
チドの部分母集団を有している。特徴は、スクリーニング系で選択されるかある
いは検知され得る任意の特性または属性であり得、そして、コード化タンパク質
；転写エレメント；遺伝子または導入遺伝子の転写、RNAプロセッシング、RNAス
タビリティ、染色体転座、翻訳、あるいはその他の発現特性を制御する配列、複
製エレメント、タンパク質結合エレメントなどのような、選択可能または検知可
能な特性を授ける任意の特徴であり得る。いくつかのの実施態様において、選ば
れた特徴は、本明細書で示されるように、野生型タンパク質以上の変えられたKm
および／またはKcatである。他の実施態様において、配列シャッフリングから生
成されたタンパク質またはポリヌクレオチドは、シャッフリングしていない野生
型ポリヌクレオチドより大きいリガンド結合親和性を有する。さらに他の実施態
様において、配列シャッフリングから生成されたタンパク質またはポリヌクレオ
チドは、シャッフリングしていない野生型ポリヌクレオチドと比較して、変更さ
れたpH最適条件を有している。この種の特性における増加は、野生型の値の少な
くとも110%、120%、130%、140%または150%を超える値であり得る。
【００８７】 組換え発現カセット 本発明は、更に本発明の核酸からなる組換え発現カセットを提供する。本発明
の所望のポリヌクレオチドに関しコーディングする核酸配列、例えば、本発明の
活性なタンパク質に関しコーディングするのに十分な長さのポリペプチドをコー
ド化したcDNAまたはゲノム配列は、所望の宿主細胞に導入されることができる組
換え発現カセットを構築するために用いられることができる。
【００８８】 組換え発現カセットは、代表的には、形質転換植物の組織などのような意図さ
れた宿主細胞における、ポリヌクレオチドの転写を指向する転写開始規制配列へ
と、操作可能に結合された本発明のポリヌクレオチドから構成されるものである
。
【００８９】 例えば、植物発現ベクターは、(1) 5’および3’規制配列の転写制御の下のク
ローン化植物遺伝子、および（2）優性選択可能なマーカーを含有し得る。
【００９０】 このような植物発現ベクターは、また所望により、プロモータ規制領域（例え
ば、誘導性または構成性を付与するもの、環境的または発達的に規制された、ま
たは細胞ないし組織に特異的ないし選択的な発現を付与するもの）、転写開始始
発部位、リボソーム結合部位、RNAプロセッシングシグナル、転写終結部位、お
よび／またはポリアデニレーションシグナルをも、含み得る。再生植物のすべて
の組織における本発明のポリヌクレオチドの発現を導く植物プロモータフラグメ
ントは、用いられることができる。このようなプロモータは、本明細書において
「構成性(constitutive)」プロモータと称され、大部分の環境条件、および発達
または細胞分化の状態で活性である。構成性プロモータの例は、アグロバクテリ
ウム・チューメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens) のT-DNAから誘導さ
れた１’−または2'-プロモータ、Smasプロモータ、桂皮アルコールデヒドロゲ
ナーゼプロモータ(米国特許第 5,683,439号)、Nosプロモータ、リブロース二リ
ン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（rubisco）プロモータ、GRP1-8プロモー
タ、オーデルら(Odell et al., (1985), Nature, 313:810-812)に述べられるよ
うなカリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）からの35Sプロモータ、ライス
アクチン(McElroy et al., (1990), Plant Cell, 163-171)、ユビキチン(Christ
ensen et al., (1992), Plant Mol. Biol. 12:619-632; およびChristensen, et
al., (1992), Plant Mol. Biol. 18:675-689)、pEMU (Last, et al., (1991),
Theor Appl. Genet. 81:581-588)、MAS (Velten et al., (1984), EMBO J. 3:27
23-2730)、トウモロコシH3ヒストン (Lepetit et al., (1992), Mol. Gen. Gene
t. 231:276-285;およびAtanassvoa et al., (1992), Plant Journal 2(3):291-3
00)、PCT出願公報WO96/30530に述べられるようなALSプロモータ、および当業者
に公知である種々の植物遺伝子からのその他の転写開始領域を含む。本発明に関
しては、ユビキチンが、単子葉植物における発現のための好適なプロモータであ
る。
【００９１】 あるいは、植物プロモータは、特定の組織においての本発明のポリヌクレオチ
ドの発現を導くことができるか、またはその他より明確な環境条件下であるか発
達制御条件下であり得る。このようなプロモータは、本明細書において「誘導(i
nducible)」プロモータと呼称される。
【００９２】 誘導プロモータによって有効な転写を行い得る環境条件は、病原体攻撃、嫌気
性条件、または光の存在を含む。誘導プロモータの例としては、低酸素症または
冷いストレスによって誘導されるAdh1プロモータ、熱いストレスによって誘導さ
れるHsp70プロモータ、および光によって誘導されるPPDKプロモータがある。 発達制御条件下のプロモータの例は、転写のみを開始する、あるいは、例えば、
葉、根、果物または花などのような或る組織において優先選択的に開始するプロ
モータを含む。プロモータの動作は、また、ゲノムにおけるそれの配置に依存し
ても変化する。したがって、誘導プロモータは、完全にまたは部分的に或る場所
において構成的となることができる。
【００９３】 ポリペプチド発現が望まれる場合、ポリヌクレオチドコーディング領域の3'末
端でポリアデニレーション領域を含むことが一般に望ましい。ポリアデニレーシ
ョン領域は、いろいろな植物遺伝子から、またはT-DNAから誘導されることがで
きる。加えられる3'末端配列は、ノパリンシンターゼ(nopaline synthase)また
はオクトパインシンターゼ(octopine synthase)遺伝子から、または代わりに他
の植物遺伝子、あるいは、好ましさは劣るが、他のどの真核細胞遺伝子からも誘
導されることができる。このような調節要素の例は、3’末端および／またはポ
リアデニレーション領域、例えば、アグロバクテリウム・チューメファシエンス
(Agrobacterium tumefaciens)ノパリンシンターゼ （nos）遺伝子(Bevan et al.
, (1983), Nucl. Acids Res. 12:369-385)、ジャガイモプロテイナーゼインヒビ
ター II (PINII)遺伝子(Keil, et al., (1986), Nucl.Acids Res. 14:5641-5650
;および An et al., (1989), Plant Cell 1:115-122)、および、CaMV 19S遺伝子
(Mogen et al., (1990), Plant Cell 2:1261-1272)のそれらの部分を包含する
が、もちろん、これらに限定されるものではない。
【００９４】 イントロン配列が、5’未翻訳領域または、細胞質ゾルに蓄積される成熟伝令
の量を増やすための部分コーディング配列のコーディング配列に加えられること
ができる。植物および動物発現構築物における転写単位内でのスプライシング可
能なイントロンの包含は、 mRNAおよび1000倍までのタンパク質レベルの双方で
、遺伝子発現を増加することを示した(Buchman and Berg, Mol. Cell Biol. 8:
4395-4405 (1988); Callis et al., Genes Dev. 1: 1183-1200 (1987))。遺伝子
発現のこのようなイントロン増進は、典型的には、転写単位の 5’末端近傍に位
置するときに、もっとも大きいものである。トウモロコシ イントロンAdh1-Sイ
ントロン1、2および6、またBronze-1イントロンが、従来知られている。一般的
には、The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Spring
er, New York (1994)を参照のこと。
【００９５】 植物シグナル配列は、本発明に有用であり、これには、例えば、植物細胞の細
胞外マトリックスにタンパク質を標的とするシグナル−ペプチドコード化DNA/RN
A配列(Dratewka-Kos, et al., (1989), J. Biol. Chem. 264:4896-4900)、ニコ
チアーナ プラムバギニフォリア(Nicotiana plumbaginifolia)拡張遺伝子(DeLo
ose, et al., (1991), Gene 99:95-100)、あるいはサツマイモsporamin遺伝子(M
atsuka, et al., (1991), PNAS 88:834)および大麦レクチン遺伝子(Wilkins, et
al., (1990), Plant Cell, 2:301-313)のような液胞にタンパク質を標的とする
シグナルペプチド、さらに、タンパク質に分泌することをもたらすシグナルペプ
チド、例えば、PRIbのそれ(Lind, et al., (1992), Plant Mol. Biol. 18:47-53
)、または、大麦α−アミラーゼ（BAA）(Rahmatullah, et al., Plant Mol. Bio
l. 12:119 (1989)、なお関連により本明細書に取り込まれる。)、または本発明
からのESP1またはBEST1遺伝子からのシグナルペプチド、または色素体へタンパ
ク質を標的化するシグナルペプチド、例えば、ナタネenoyl-Acpレダクターゼの
それ(Verwaert, et al., (1994), Plant Mol. Biol.26：189-202）といったも
のが包含されるが、これらに限定されるわけではない。trAPAOポリヌクレオチド
(SEO ID No. 20参照）に融合された大麦α−アミラーゼシグナル配列が、本発明
のためのトウモロコシにおける発現に関して、好適な構築物である。
【００９６】 本発明のポリヌクレオチドからの配列を有するベクターは、植物細胞上に選択
可能な表現型を授けるマーカー遺伝子を、典型的には有している。通常、選択可
能なマーカー遺伝子は、適当な遺伝子によって、抗生物質抵抗性をコード化して
いる。この適当な遺伝子としては、例えば、抗生物質スペクチノマイシンに対す
る抵抗性をコーディングする遺伝子（例えばaada遺伝子）、ストレプトマイシン
抵抗性をコーディングするのストレプトマイシンフォスフォトランスフェラーゼ
（SPT）遺伝子、カナマイシンまたはゲネチシン(geneticin)抵抗性をコーディン
グするネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ（NPTII）遺伝子、ハイグロ
マイシン抵抗性をコーディングするハイグロマイシンフォスフォトランスフェラ
ーゼ（HPT）遺伝子、アセトラクテートシンターゼ（ALS）の作用を阻害するよう
に機能する除草剤、特に、スルホニル尿素タイプの除草剤（例えば、このような
抵抗に導く変異、特にS4および／または Hra 変異を含有するアセトラクテート
シンターゼ（ALS）遺伝子）に対する抵抗性をコーディングする遺伝子、例えば
、フォスフィノスライシン(phosphinothricin)またはバスタ(basta)のような、
グルタミンシンターゼの作用を阻害するように機能する除草剤に対する抵抗性を
コーディングする遺伝子(例えば、bar遺伝子)、あるいは、当分野で公知のその
他の同様な遺伝子が含まれる。bar遺伝子は除草剤バスタに対する抵抗性をコー
ド化しており、そして、ALS遺伝子は除草剤(chlorsulfuron)に対する抵抗性をコ
ード化している。
【００９７】 あるいは、本発明、それ自体が、形質転換株の選択のための方法、換言すれば
、選択可能なマーカーとしてとして使われてもよい。使用可能な状態でプロモー
タに連結され、そして、本出願に記載されている方法のいずれかによって植物細
胞中へと形質転換されAPAOまたはtrAPAOポリヌクレオチドは、崩壊酵素を発現す
る。植物細胞が培地においてAP1か植物毒素類似体の存在下に置かれた際、形質
転換細胞のみが成長し得るであろう。もう一つの実施態様では、植物細胞は、AP
AOに関するポリヌクレオチドおよびフモニシンエステラーゼに関するポリヌクレ
オチドとともに形質転換される。この場合の選択剤は、AP1またはフモニシンま
たは任意の構造上の類似体のいずれでもでもありえた。これゆえ、マイコトキシ
ンの存在下での植物細胞の成長は、本発明の酵素のうちの1つをコーディングす
るコーディング配列を発現するように形質転換された植物細胞の生存を支持し、
毒素を分解する。フモニシンエステラーゼポリヌクレオチドの有無にかかわらな
いAPAOまたはtrAPAOカセットが、関心のある他の遺伝子と共に形質転換され、そ
してAP1または細胞毒素類似体の存在下に置かれた場合、本発明は前記した関心
のある遺伝子を含む植物細胞のみの選択をなすものである。従来、抗生物質抵抗
性遺伝子が、選択可能なマーカーとして使われていた。消費者および環境保護主
義者による抗生物質抵抗性遺伝子の使用およびこの使用のために起こっている抵
抗性微生物の可能性に関する現在の関心事を考えると、本発明のような、非抗生
物質抵抗性の選択可能なマーカーシステムは、非常に重要な必要性を満たす。
【００９８】 より高い植物における遺伝子の発現に役立つ代表的ベクターは、当分野におい
て公知であり、例えば、ロジャーズら(Rogers et al., Meth. In Enzymol., 153
:253-277 (1987)によって記載されているアグロバクテリウム・チューメファシ
エンス(Agrobacterium tumefaciens)の腫瘍誘導（Ti）プラスミドに由来するベ
クターが包含される。これらのベクターは、形質転換に関して、ベクターが宿主
植物のゲノム中にベクターDNAの一部を統合するという、植物組込みベクター(pl
ant integrating vector)である。本発明において有用な代表的ななアグロバク
テリウム・チューメファシエンスベクターは、スカルドルら(Schardl et al., G
ene, 61:1-11 (1987) )およびバーガーら(Berger et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. U.S.A., 86:8402-8406 (1989))の、プラスミドpKYLX6およびpKYLX7である。
【００９９】 本発明において有用なその他のベクターは、クロノテックラボラトリーズ(CLO
NTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA)から入手可能でプラスミドpBI101.2
である。
【０１００】 宿主細胞におけるタンパク質の発現 本発明の核酸を使用することによって、細菌、酵母、昆虫、哺乳類、または好
ましくは、植物細胞のような組換え遺伝子工学を用いてつくられた細胞における
本発明のタンパク質の発現が可能となる。細胞は非天然の条件（例えば、量、組
成、場所および／または時間の）におけるタンパク質を産生する。その理由は、
それらは人間の干渉によって遺伝的に変容されたからである。当業者は、本発明
のタンパク質をコード化する核酸の発現に用いられ得る数多くの発現系を知り得
ることが期待できる。原核生物または真核生物におけるタンパク質の発現に関し
公知の多様な方法を詳細に記載することは試みない。
【０１０１】 簡潔な概要において、本発明のタンパク質をコード化している単離した核酸の
発現は、典型的には、例えば DNAまたはcDNAをプロモータ（それは、構成性また
は誘導性である）に、使用可能な状態で連結させ、次いで、発現ベクター中に取
り込ませることによって、達成され得る。このベクターは、原核生物でもまたは
真核生物のいずれにおいても複製および組込みに適しているものであり得る。 典型的発現ベクターは、転写および翻訳ターミネータ、開始配列および本発明の
タンパク質をコード化するDNAの発現の規制に有用なプロモータを含む。クロー
ン遺伝子の高水準な発現を得るために、最低限で 、例えば、ユビキチンのよう
な、転写を導く強力なプロモータ、翻訳開始のためリボソーム結合部位、および
転写／翻訳ターミネータを含む、発現ベクターの構築が望ましい。構造性プロモ
ータは、構造性発現の範囲を提供するものとしてとして分類される。したがって
、いくつかは弱い構造性プロモータであり、そして、他は強い構造性プロモータ
である。一般に、低レベルでコーディング配列の発現を導くプロモータは、「弱
いプロモータ」によって意味される。「低レベル」によっては、約1/500,000転
写に対し、約1/10,000転写から約1/100,000転写のレベルが意図される。逆に、
「強いプロモータ」は、「高水準である」か、約1/1,000転写に対し、約1/10転
写から約1/100転写で、コーディング配列の発現を導く。
【０１０２】 当業者は、本発明のタンパク質にその生物学的活性を低減させることなしに、
変更態様が作成可能であることを認識できるであろう。若干の変更態様は、クロ
ーニング、表現または融解タンパク質に分子を目標とする編入を容易にするため
に実行されることができる。この種の変更態様は、当業者にとって周知であり、
例えば、開始部位を提供するためにアミノ末端に添加されるメチオニン、または
、都合良く位置した制限部位、終止コドン、あるいは純化配列を形成するために
どちらの末端にでも配置され得る追加のアミノ酸（例えばpoly His）といったも
のを包含する。
【０１０３】 A. 原核生物の発現 クローニング、表現または融解タンパク質に分子を目標とする編入を容易にす
るために原核細胞は、発現のための宿主として用いられ得る。原核生物は、エシ
ェリキア・コリ（大腸菌）の種々の菌株によって最も頻繁に代表されるが、他の
微生物の菌株も、また、用いられ得る。転写開始のためプロモータを含むように
、また選択的にオペレータを有し、リボソーム結合部位配列を伴う、本明細書で
定義される一般的に用いられる原核制御配列は、β−ラクタマーゼ（ペニシリナ
ーゼ）およびラクトース（lac）プロモータシステム(Chang et al., Nature 198
:1056 (1977))、トリプトファン（trp）プロモータシステム(Goeddel et al., N
ucleic Acids Res. 8:4057 (1980)) およびλ誘導P LプロモータおよびN-ジーン
リボソーム結合サイト(Shimatake et al., Nature 292:128 (1981))のような、
汎用のプロモータを包含するものである。エシェリキア・コリにおいてトランス
フェクションされるDNAベクターの選択マーカーの包含は、また、有用である。
このようなマーカーの例は、アンピシリン、テトラサイクリンまたはクロラムフ
ェニコールに対する抵抗を特定している遺伝子を含む。
【０１０４】 ベクターは、適当な宿主細胞に関心の遺伝子の導入をもたらすために選択され
る。代表的な細菌ベクターは、プラスミドまたはバクテリオファージ源である。
適当な細菌細胞は、ファージベクター分子で感染するかまたは裸のファージベク
ターDNAで形質転換される。プラスミドベクターが使われる場合、細菌細胞はプ
ラスミドベクターDNAで形質転換される。本発明のタンパク質を発現するための
発現システムは、バシルス種およびサルモネラ菌を用いて手に入れることができ
る(Palva, et al., Gene 22: 229-235 (1983); Mosbach, et al., Nature 302:
543-545 (1983))。ファルマシア(Pharmacia)からのpGEX-4T-1プラスミドベクタ
ーは、本発明のための好適な大腸菌発現ベクターである。
【０１０５】 B. 真核生物の発現 いろいろな真核発現系、例えば酵母、昆虫細胞系統、植物および哺乳類の細胞
は、当業者にとって公知である。以下に簡潔に説明するように、本発明はこれら
の真核系において発現されることができる。いくつかの実施態様において、以下
に詳述するように、形質転換/トランスフェクションされた植物細胞は、本発明
のタンパク質産生のためのの発現系として使用される。
【０１０６】 酵母における異種タンパク質の合成は、周知である。シャーマン、エフら（Sh
erman, F., et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laborat
ory (1982)）は、酵母においてタンパク質を産生するために利用できる種々の方
法を示している良く知られた研究である。真核タンパク質の製造に広く用いられ
ている２つの酵母は、サッカロミケス・セレヴィシアエ(Saccharomyces cerevis
iae)およびピチア・パストリス(Pichia pastoris)である。ベクター、菌株およ
びサッカロミケスおよびピチアの発現のためのプロトコルは、当分野に公知であ
り、商用の供給元（例えばInvitrogen）から入手可能である。適切なベクターは
、通常、発現制御配列、例えば、そして、3-ホスホグリセリン酸塩キナーゼまた
はアルコールオキシダーゼ、および複製源、末端配列およびその他の望まれるも
のを含む、プロモータを有する。
【０１０７】 一度発現されると、本発明のタンパク質は、細胞を溶解させ、、そして、標準
のタンパク質分離技術を溶解物またはペレットに加えることによって、酵母から
分離されることができる。純化プロセスのモニタリングは、その他の標準的免疫
検定技術であるウェスタンブロッティング法または放射標識免疫検定法を用いて
行うことができる。
【０１０８】 本発明のタンパク質をコード化している配列が、また、種々の発現ベクター、
例えば、哺乳類、昆虫または植物種の形質転換細胞培養において用いられる発現
ベクター、に連結されることができる。哺乳類の細胞系は、細胞の単分子層の形
で良く用いられるが、 哺乳類の細胞懸濁液もまた、用いられ得る。完全タンパ
ク質を発現できるいくつかの適切な宿主細胞系統は、当分野において開発されて
おり、これは、HEK293、BHK21およびCHOセルラインを包含する。これらの細胞の
ための発現ベクターは、発現制御配列、例えば複製源、プロモータ（例えばCMV
プロモータ、HSV tkプロモータまたはpgk（ホスホグリセリン酸塩キナーゼ）プ
ロモータ）、エンハンサ(Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49 (1986))、そし
て、必要なプロセシング情報部位、例えばリボソーム結合部位、RNA組継ぎ部位
、ポリアデニレーション部位（例えばSV40ラージT AgポリＡ付加部位）、および
転写終止配列を含み得る。本発明のタンパク質の産生に役立つ他の動物の細胞は
、例えば、the American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines
and Hybridomas (7th edition, 1992)から入手可能である。
【０１０９】 昆虫細胞において本発明のタンパク質を発現するための適当なベクターは、通
常SF9 バクロウィルスから誘導される。適切な昆虫細胞系統は、ボウフラ、カイ
コ、ヨトウムシ、蛾およびシュナイダーセルラインのようなショウジョウバエ細
胞系統を含む（Schneider, J. Embryol. Exp. Morphol. 27: 353-365 (1987)を
参照のこと。）。
【０１１０】 酵母と同様に、より高度な動物または植物宿主細胞が使用されるときに、ポリ
アデニレーションまたは転写終止配列は典型的にベクターに組み込まれる。終止
配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニレーション配列である。
配列は、また、転写物を正確に継ぐための配列を含むことができる。接合配列の
例は、SV40からのVP1イントロンである(Sprague, et al., J. Virol. 45: 773-7
81 (1983))。加えて、宿主細胞における制御複製に対する遺伝子配列が、ウシ乳
頭腫ウイルス型ベクターにおいて見出されるように、ベクターに組み込まれるこ
とができる(Saveria-Campo, M., Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cl
oning Vector in DNA Cloning Vol. II a Practical Approach, D.M. Glover, E
d., IRL Press, Arlington, Virginia pp. 213-238 (1985))。
【０１１１】 それに加えて、適当な植物発現ベクター中に配置されたにフモニシンエステラ
ーゼまたはAPAOまたはtrAPAOうちの1つは、植物細胞を形質転換するために用い
られ得る。酵素は、次いで、植物癒合組織から分離されることができ、または、
形質転換細胞はトランスジェニック植物を再生させるのに用いられ得る。このよ
うなトランスジェニック植物は収穫されることができ、そして、適当な組織（例
えば、種または葉）は大規模なタンパク質抽出・純化技術にかけることができ、
そして、フモニシン分解酵素またはAPAOは、フモニシンおよびフモニシン加水分
解産物解毒処理のために単離されることができる。
【０１１２】 植物形質転換法 外来遺伝子を植物に導入するための多数の方法は公知で、植物宿主にAPAOまた
はtrAPAOポリヌクレオチドを挿入するために用いることができ、そして、生物学
的および物理的な植物形質転換プロトコルを含んでいる。例えば、「Miki et al
., (1993), "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants", In: Meth
ods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, ed
s., CRC Press, Inc., Boca Raton, pages 67-88を参照のこと。選ばれる方法は
、宿主植物によって変化して、化学的トランスフェクション法、例えばリン酸カ
ルシウム、アグロバクテリウムのような微生物媒介遺伝子転送(Horsch, et al.,
(1985), Science 227:1229-31)、電気泳動、ミクロ注入および生物学者的砲撃
（biolistic bombardment）を含む。
【０１１３】 発現カセット、および、ベクター、そして、植物細胞または組織転換のための
試験管内培地方法および植物の再生は、公知であり、利用できる。例えば、Grub
er, et al., (1993), "Vectors for Plant Transformation" In: Methods in Pl
ant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson, eds. CRC Pr
ess, Inc., Boca Raton, pages 89-119を参照のこと。
【０１１４】 アグロバクテリウム媒介形質転換変換 発現ベクターを植物に導入するために、最も広く利用された方法は、アグロバ
クテリウムの自然な形質転換システムに基づくものである。アグロバクテリウム
・チューメファシエンス(A. tumefaciens)およびアグロバクテリウム・リゾジー
ネス(A. rhizogenes)は植物病原となる土壌バクテリアである。そして、それは
遺伝的に植物細胞を変形させる。A. tumefaciensおよびA. rhizogenesのTiおよ
びRiプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝子の変換に対し応答性のある遺伝子を
担っている。例えば、Kado, (1991), Crit. Rev. Plant Sci. 10:1を参照のこと
。アグロバクテリウムベクター系とアグロバクテリウムによって媒介される遺伝
子移入ための方法との記述は、上記グルーバーら、上記ミキら、およびモロネイ
ら(Moloney et al., (1989), Plant Cell Reports 8:238)において示されている
。
【０１１５】 同様に、遺伝子はA. tumefaciensまたはA. rhizogenesに由来するTiまたはRi
プラスミドのT-DNA領域にそれぞれ、挿入されることができる 。 したがって、発現カセットはこれらのプラスミドを使用して、上記と同様に構築
されることができる。異種のコーディング配列と対をなして、宿主生物中へ形質
転換された際に、本来のコーディング配列の組織/器官特性に関する遺伝子発現
の忠実さをを示す多くの制御配列が公知である。例えば、Benfey, P. N., and C
hua, N. H. (1989) Science 244: 174-181を参照のこと。
【０１１６】 これらのプラスミドに用いられる特に適切な制御配列は、多様な標的植物の遺
伝子の葉特異的発現のためのプロモータである。他の役に立つ制御配列は、ノパ
リンシンセターゼ(nopaline synthase)遺伝子（NOS）からのプロモータおよびタ
ーミネータを包含する。NOSプロモータおよびターミネータは、プラスミドpARC2
に存在し、American Type Culture Collectionから入手可能であり、ATCC 67238
と称される。このような系が使われる場合、T-DNA部分に沿って、またはvir遺伝
子が別々のベクターに存在するバイナリの系を介して、TiまたはRi プラスミド
からの毒性（vir）遺伝子も存在する。このような系、ここで使用されるベクタ
ーおよび植物細胞を変形させる方法は、ロブソンら(Robeson, et al.)に1993年1
1月16日に発せられた米国特許第5,262,306号において参照されるように米国特許
第4,658,082号；1986年10月1日に出願の米国出願一連番号第913,914号に、そし
てSimpson, R. B., et al. (1986) Plant Mol. Biol. 6: 403-415 （これもまた
、306の特許において参照される）に記載されており、これらはすべて、関連に
よりその全部を本願明細書に取り込まれる。
【０１１７】 一旦構築されると、これらのプラスミドはA. rhizogenesまたはA. tumefacien
s中へ配置されるることができ、そして、これらのベクターは、通常フザリウム
属またはアルタナリア感染に感受しやすい植物種の細胞を形質転換させるために
用いられた。いくつかの他のトランスジェニック植物が、本発明によって画策さ
れており、これは、大豆、コーン、モロコシ、アルファルファ、米、クローバ、
キャベツ、バナナ、コーヒー、セロリ、タバコ、ササゲ、綿、メロンおよびコシ
ョウなどを含むが、これらに限定されるわけではない。A. tumefaciensまたはA.
rhizogenesのいずれかの選択は、これらにより形質転換される植物に依存する
。
【０１１８】 一般に、A. tumefaciensは、形質転換のための好適な有機体である。多くの双
子葉植物、いくつかの裸子植物および2、3の単子葉植物（例えばユリ目(Liliale
s)およびサトイモ目（Arales）のある仲間）は、A. tumefaciensの感染を受けや
すい。A. rhizogenesも、大部分の双子葉植物および若干の裸子植物を含む、広
い宿主範囲を有する。そして、それはマメ科(Leguminosae)、キク科(Compositae
)およびアカザ科（Chenopodiaceae）の仲間を含む。単子葉植物は、現在いくつ
かの成功をもって、形質転換され得る。ヒエイら(Hiei et al.)に対する欧州特
許出願公報第604 662号(A1)は、アグロバクテリウムを使用した単子葉植物を形
質転換させるための方法を開示する。サイトウら(Saito et al.)は、未熟な胚の
胚盤を使用してのアグロバクテリウムでの単子葉植物を形質転換するせるための
方法を開示する（欧州特許出願第672752号(A1）)。イシダら(Ishida et al., Na
ture Biotechnology, 1996, 14:745-750)は、未熟な胚をA. tumefaciensに曝す
ことによってトウモロコシをを形質転換するせるための方法を議論している。
【０１１９】 一旦形質転換されると、これらの細胞はフモニシンを分解できる、トランスジ
ェニック植物を再生させることに用いることができる。例えば、全植物は、植物
を傷つけること、そして次に、ベクターを傷部位に導入することによってこれら
のベクターに感染させるすることができる。葉、茎および根を含む、植物のどん
な部位でも傷付けることができる。あるいは、植物組織は 外植片、例えば胎盤
葉組織または葉盤の形で 、これらのベクターを接種されることができ、そして
植物再生を進める条件で培養されることができる。A. rhizogenesまたはA. tume
faciensを有する植物組織の接種によって形質転換された根または苗条は、フモ
ニシン分解酵素のための遺伝子コーディングを含んでおり、フモニシンに抵抗力
があるトランスジェニック植物（身体の胚形成または器官形成を経たどちらでも
）を再生させるための植物組織源として使われることができる。このような植物
組織を再生させるための方法の例は、1993年11月16日にロブソンら(Robeson, et
al.)に発せられた米国特許5,262,306号に参照されるように、シャヒン（Shahin
, E. A. (1985) Theor. Appl. Genet. 69:235-240）、米国特許第4,658,082号、
シンプソン(Simpson, R. B., et al. (1986) Plant Mol. Biol. 6: 403-415)お
よび米国特許出願出願番号第913,913号および第913,914号（共に1986年10月1日
出願）に開示されており、これらの完全な記載は、関連により本明細書中に取り
込まれる。
【０１２０】 直接的遺伝子移入 アグロバクテリウムによって媒介される形質転換のための宿主範囲が広いとい
う事実にもかかわらず、若干の主要な穀類の収穫種および裸子植物は、遺伝子移
入のこのモードに一般に否定的であった。ただ、若干の成功が最近米（Hiei et
al., (1994), The Plant Journal 6:271-282)において達成されてはいるが。植
物形質転換（集合的に直接的遺伝子移入と称する）のいくつかの方法は、アグロ
バクテリウムによって媒介される形質転換に代わるものとして開発された。
【０１２１】 植物形質転換の一般に適用できる方法は、ミクロ投射媒介形質転換(microproj
ectile-mediated transformation）であり、そこにおいて、DNAは、約1〜4マイ
クロメートルを計測するミクロ投射器の表層で運ばれる。発現ベクターは、 植
物細胞壁および膜を通過するのに十分な速度である300〜600m/sの速度にミクロ
投射器を加速する生化学者的装置で、植物組織へと導入される(Sanford et al.,
(1987), Part. Sci. Technol. 5:27; Sanford, 1988, Trends Biotech 6:299;
Sanford, (1990), Physiol. Plant 79:206; Klein et al., (1992), Biotechnol
ogy 10:268)。
【０１２２】 植物に対するDNAの物理的な配給のための他の方法が、ザンら（Zang et al.,
(1991), BioTechnology 9:996.1）において述べられるように、標的細胞の超音
波処理である。あるいはまた、リポソームまたはスフェロプラスト融解が、 発
現ベクターを植物中に導入するために用いられている。例えば、Deshayes et al
., (1985), EMBO J. 4:2731; and Christou et al., (1987), PNAS USA 84:3962
を参照のこと。CaCl2沈降、ポリビニルアルコールまたはpoly-L-オルニチンを使
用する原形質体へのDNAの直接の摂取が、また、報告されている。例えば、Hain
et al., (1985), Mol. Gen. Genet. 199:161; and Draper et al., (1982), Pla
nt Cell Physiol. 23:451を参照のこと。
【０１２３】 原形質体および全細胞および組織のエレクトロポレーションもまた開示されて
いる。例えば、Donn et al., (1990), In:Abstracts of the VIIth Int'l. Cong
ress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, page 53; D'Halluin e
t al., (1992), Plant Cell 4:1495-1505; and Spencer et al., (1994), Plant
Mol. Biol. 24:51-61を参照のこと。
【０１２４】 したがって、フモニシンまたはAP1を機能させなくすることが可能なポリペプ
チドをコード化しているポリヌクレオチドは、単離され、適当なベクターにおい
てクローニングされ、そして通常フザリウム属またはその毒素に敏感な有機体へ
と挿入されることができる。
【０１２５】 さらに、フモニシンまたはAP1 分解的な活性を授けるポリヌクレオチドは、適
切なプラスミドに移入されることができ、そして植物に形質転換される。これゆ
え、フモニシンまたはAP1分解性トランスジェニック植物が産出されることがで
きる。ポリヌクレオチドを発現する生物は、フモニシンまたはAP1を分解するこ
れらの能力によって、簡単に識別されることができる。フモニシンまたはAP1を
分解できるタンパク質は、当分野において公知の技術を用いて、単離されそして
特徴づけされ得る。
【０１２６】 トランスジェニック植物におけるAPAOまたはtrAPAO フモニシンエステラーゼは、フモニシンの毒性を減じるが、消失させるわけで
はない。したがって、更に毒性を減らすかまたは消すための第2の酵素的変更態
様が望まれる。エキソフィアラ・スピニフェラからの部分的に純化されたAPAO酵
素は、完全FB1（フモニシンの形態）に対してほとんどないし全く活性を有しな
い。しかし、エシェリキア・コリにおいて発現された、エキソフィアラ・スピニ
フェラからの組換えAPAO酵素は、完全FB1および他のB-系列フモニシンにおいて
顕著であるが、低減された活性を有する。APAOまたはtrAPAOが、したがって、フ
モニシン・エステラーゼなしで使用される可能性を有している。これは、アミン
基が解毒の主な標的であるゆえである。あるいは、2つの遺伝子、フモニシンエ
ステラーゼおよびAPAO（またはtrAPAO）が、毒素を分解するために一緒に使われ
ることができる。
【０１２７】 APAOは、単独で、または、フモニシン・エステラーゼ（ESP1かBEST1）と共に
、異種の発現系において発現された場合、フモニシンB1からの2−オキソペント
ールl（2OP）の産生という結果を招くことが予測される 酵素である。組換えエ
シェリキア・コリ発現APAOの基質範囲は、フモニシンおよびそれらの加水分解産
物に限られていて、アミノ酸、フィトスフィンゴシンのようなスフィンゴ脂質先
駆体またはスペルミジンのようなポリアミンを含まない。したがって、APAOはフ
モニシン様アミンに高い特異性を有し、そして、これゆえ、他の細胞の代謝物質
にほとんど有害な影響を及ぼさない。それに加えて、それが細胞外的に局在化さ
れる場合、生物学上重要なアミン（これもまた基質であり得る）との任意な接触
に限定される。その結果は、エステラーゼ単独で成し遂げられることができるも
のより、より効果的なフモニシンの解毒である。
【０１２８】 APAOのオキシダーゼ活性は、酸化されたAP1または酸化されたフモニシンと相
関している化学量論的量における過酸化水素の生成という結果を予測されるもの
である。これは、この酵素の追加の利点であることがわかることができる。その
理由は、過酸化水素は抗菌物質であって、かつ植物における防御応答の開始に貢
献するとも考えられているためである(Przemylaw, Biochem J., 322:681-692 (1
997), Lamb, et al., Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Bio 48:251-275 (1997
), and Alverez, et al., Oxidative Stress and the Molecular Biology of An
tioxidant Defenses, Cold Spring Harbor Press, 815-839 (1997))。
【０１２９】 本発明の好適な一実施態様は、１つの植物において存在する、フモニシンエス
テラーゼ ポリヌクレオチドおよびAPAOまたはtrAPAOポリヌクレオチドを有する
ことであるので、植物に複数のポリヌクレオチドを導入するいくつかの方法があ
る。1つの方法は、フモニシンエステラーゼおよびAPAOまたはtrAPAOに対するポ
リヌクレオチドで植物組織を形質転換することである。いくつかの組織培養系に
おいて、1つのポリヌクレオチドで癒合組織を形質転換し、そして、それから最
初のポリヌクレオチドを含む安定した培地系統を確立した後に、二度目に第2の
ポリヌクレオチドで癒合組織を形質転換することが可能である。また、1つのポ
リヌクレオチドで、植物組織を形質転換し、完全植物を再生させ、そして、第2
のポリヌクレオチドを植物組織および再生完全植物に形質転換することも可能で
ある。最後のステップは、最初のポリヌクレオチドを含んでいる植物を、第2の
ポリヌクレオチドを含んでいる植物と交差させ、両方のポリヌクレオチドを含ん
でいる後代を選択するものである。
【０１３０】 他の方法は、エステラーゼとAPAOまたはtrAPAOと間の融合タンパク質を形成す
ることである。好ましくは2つのポリペプチド間に、スペーサ領域を有するもの
とする。両方の酵素は、お互いに係留されているにもかかわらず活性である。 それに加えて、スペーサ領域において設けられた酵素開裂部位は、内因性のある
いは導入されたプロテアーゼにより壁開され得る。
【０１３１】 フモニシンエステラーゼ酵素および／またはAPAO酵素を含んでいる、そして、
これゆえ、 フモニシンまたは構造的に関連するマイコトキシンを分解し得るト
ランスジェニック植物は、植物を感染させるエントリーのモードとして、フモニ
シンまたは構造的に関連するマイコトキシンを使用するどんな微生物の病原性を
も低減ないし除去することができるであろう。菌類病原体は、しばしば傷ついた
植物に対して毒素を使用し、細胞完全性を弱めて、エントリーを得、植物の感染
を広げる。毒素によってもたらされる損害を防ぐことによって、植物は病原体の
創出を防ぎ、そしてこれにより、病原体に耐性であるないしは抵抗するようにな
る。
【０１３２】 フモニシン分解の他の利点は、過酸化水素の製造である。フモニシンが2-OPま
で壊れるときに、過酸化水素が副産物として生じる。過酸化水素産生は、多くの
方法における抵抗反応を強化した。1) 過酸化水素は、直接の抗菌活性を有する
。2) 過酸化水素は、リグニン重合と関連するペルオキシダーゼのための基質と
して作用し、そしてそれゆえ、細胞壁を強化する。3) 未だ解明されていない機
構を介して、過酸化水素は、防御関連遺伝子の発現の活性化のためのシグナルと
して作用し、これはサリチル酸蓄積の刺激をもたらすことを含む。サリチル酸は
、病因に関連したタンパク質のいくつかのクラスに関する遺伝子コーディングの
発現を誘発する内因性シグナル分子として作用すると考えられている。さらに、
サリチル酸は酸化性の爆発を始めることができて、したがって、それ自身の合成
を強化するフィードバック・ループで機能できる。サリチル酸は、また、過酸化
水素を除去する酵素である、カタラーゼの抑制剤として作用することによって、
過敏な細胞死に関係し得る。 4) 過酸化水素は、例えば植物性アレキシン、抗
菌性低分子量化合物などのような、化合物の製造を誘発することができる。酸化
性の爆発およびサリチル酸の役割上の批評に関しては、 Lamb, C. and Dixon, R
.A., Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 48: 251-275 (1997)を参照
のこと。
【０１３３】 収穫された穀物、緑蔵飼料または汚染された食品収穫物の解毒 本発明はまた、動物または人間ののための穀物の処理の間、緑蔵飼料のための
植物材料の処理の間、または毒素産生微生物で汚染された食品収穫物、のエキソ
フィアラ・スピニフェラ、ATCC 74269 によるAPAO酵素を用いてのフモニシンま
たは構造的に関連したマイコトキシンを解毒する方法に関するものである。例え
ば、トマトにおけるものであるが、もちろん、これに限定されるものではない。
コーンの大気中のアンモニア処理が解毒に無効な方法であることが証明された（
例えば、B. Fitch Haumann, INFORM 6:248-257 (1995)を参照のこと。)で、この
ような処理の間における方法論は、トランスジェニックな解毒が適用できない所
で特に重大である。
【０１３４】 本発明の一実施態様において、フモニシン分解性酵素は、穀物、緑蔵飼料のた
めの植物材料または汚染された食品収穫物に、または処理手順の間、手順の適当
な段階で、フモニシンおよび構造的に関連したマイコトキシンの解毒に有効な量
で適用される。酵素、微生物の菌株または設計された微生物による解毒は、この
ような処理だけの間起きるのではなく、また、動物に対する穀物または植物材料
の供給の前あるいは間の任意の時間、あるいはヒト食品産物への穀物または食品
収穫物の取り込み、または食品収穫物の摂取の前あるいは摂取の間にも起きる。
【０１３５】 本発明の他の実施態様は、解毒酵素を発現させ、そして酵素自身よりもむしろ
細菌または真菌を使用するための細菌または真菌の工学である。本発明のポリヌ
クレオチドを発現するために工学操作され得る多くの微生物が存在する。フモニ
シンエステラーゼまたはエキソフィアラのAPAOのための内在的遺伝子を、誘導的
または構成的に活性化させることができた。分解性酵素を過度に発現させ、つい
で、微生物を有する、植物、種または緑蔵飼料を処理することによって、本来的
に、フモニシンを分解することは可能である。
【０１３６】 本発明のポリヌクレオチドは、植物において増殖する微生物（着生菌）に、潜
在的目標収穫物に酵素を搬送させるために、当該微生物に導入されることができ
る。
【０１３７】 着生菌は、例えばグラム陽性であるかグラム陰性なバクテリアであり得る。 分解性ポリヌクレオチドおよび結果として生じるポリペプチドの少なくとも１つ
を含むように遺伝的に変容された微生物が、 農作物および農業製品を保護する
ために用いられ得る。本発明のひとつの態様において、形質転換生物の、完全の
、すなわち溶解されていない細胞は、該細胞が標的植物の環境に適用される場合
、細胞において産生される酵素の活性を延長化する試薬で処理される。分泌リー
ダーが、得られる酵素が標的細胞に対し提示するための宿主細胞の外側に分泌さ
れるように、対象とされる遺伝子と組み合わせて用いられることができる。
【０１３８】 分解性酵素が、細菌性宿主において発酵されることができ、そして得られた細
菌は、プロセッシングされ、微生物のスプレーとして使われることができる。 任意の適切な微生物が、この目的のために使われることができる。例えば、Gaer
tner, et al. (1993) in Advanced Engineered Pesticides, (ed. Kim, Marcel
Dekker, New York)を参照のこと。
【０１３９】 酵素または微生物は、粉化プロセスおよび／または酵素処理が実行される処理
の段階の状態に依存して、適切な方法、例えば洗浄またはスプレーとして、また
は乾燥したか凍結乾燥された形態、または出力をかけられた形態において、処理
の間に導入される。一般的には、Hoseney, R.C., Principles of Cereal Scienc
e and Technology, American Assn. of Cereal Chemists, Inc., 1990 (especia
lly Chapters 5, 6 and 7); Jones, J.M., Food Safety, Eagan Press, St. Pau
l, MN, 1992 (especially Chapters 7 and 9); およびJelen, P., Introduction
to Food Processing, Restan Publ. Co., Reston, VA, 1985を参照のこと。処
理された穀物または動物の供給のために使われる緑蔵飼料は、接種原または共生
添加物の形態の酵素の効果的な量で、あるいは、例えば、当業者によって動物摂
取ために、認識されるどんな形態においても、処理されることができる。本発明
の酵素は、特に処理の間および／またはその使用前の動物摂取における解毒にお
いて役に有用であることが期待される。これは酵素が比較的幅広い範囲のpH活性
を示すためである。エキソフィアラ・スピニフェラ（ATCC 74269）からのエステ
ラーゼが、約pH 3から約pH 6の間の活性範囲を示し、またpH ATCC 55552の細菌
からのエステラーゼは、約pH 3から約pH 9の間の活性範囲を示した（上記米国特
許第5,716,820号）。エキソフィアラ・スピニフェラ（ATCC 74269）からのAPAO
酵素は、pH 6からpH 9まで活性なpH範囲を有する。
【０１４０】 反芻動物微生物の遺伝子工学 反芻動物微生物は、フモニシンエステラーゼ酵素またはエキソフィアラ・スピ
ニフェラATCC 74269から単離されたAPAO、またはこれらの酵素の組合せを含んで
、発現するように遺伝子工学されることができる。微生物の遺伝子工学は、現在
認識された技術であり、そしてこのように遺伝子工学された反芻動物は、任意の
技術的に認識された方法、例えば共生または接種原として、食品に添加され得る
。加えて、バイオリアクターとして機能し得る微生物は、フモニシン・エステラ
ーゼまたはエキソフィアラ・スピニフェラ（ATCC 74269）において見出されるAP
AO酵素のいずれかを生産する集団となり得るように、工学操作され得る。
【０１４１】 フモニシンおよび関連した化合物に関する試薬の検知のためのフモニシン・エス
テラーゼおよびAPAO酵素の使用 本発明の他の実施態様は、フモニシンおよび関連した化合物に関する検知試薬
としての本発明の酵素の使用である。本発明の酵素は、エステラーゼおよびデア
ミナーゼ酵素の高い特異性および、アミン酸化を伴う加水分解が、標準的試薬を
用いた過酸化水素またはアンモニアの検知（ブドウ糖オキシダーゼを使用してい
るブドウ糖発見分析評価に類似している）によって監視できるという事実によっ
て、検知試薬として用いられ得る。過酸化水素は、過酸化水素に依存するペルオ
キシダーゼ反応によって着色される、あるいはその他の検出可能なペルオキシダ
ーゼ製品に結びつけることによって通常測定される（例えばDemmano, et al., E
uropean Journal of iochemistry 238(3): 785-789 (1996))。アンモニアは、イ
オン特異性の電極を使用して計測でき（Fritsche, et al., Analytica Chimica
Acta 244(2): 179-182 (1991); West, et al., Analytical Chemistry 64(5): 5
33-540 (1992)、そしてこれらのすべては関連により本明細書に取り込まれる。
）、またGCまたは他のクロマトグラフ法によって測定され得る。
【０１４２】 例えば、組換え、または非組換えの、活性なフモニシン・エステラーゼ（ESP1
または BEST）およびAPAOタンパク質は、触媒作用の量においてフモニシン（FB1
、FB2、FB3、FB4またはこれらの部分的であるか完全な加水分解製品）の未知の
量を含んでいる試料チューブに加えられる。チューブが、サンプル中の任意のフ
モニシンのAP1への転化、ないし相応するAP1の2-OP、アンモニアおよび過酸化水
素への転化に十分なｐHおよび温度条件下でインキュベートされる。それから、
適切な試薬が、理論的にフモニシンから発生した過酸化水素またはアンモニアの
定量化ために加えられる。エステラーゼまたはAPAO酵素を添加されなかった比較
対照のチューブと比較することによって、存在するフモニシンの量は、検出され
る過酸化水素またはアンモニアに対する直接のモル割合または、標準曲線に相関
して算出されることができる。
【０１４３】 本発明は、以下の非制限的な実施例を参照することで、よりよく理解されるこ
とができる。本発明の他の実施態様は、本明細書中に開示され請求の範囲に記載
される精神および範疇から逸脱することなく、実施可能であることは、当業者で
あれば正しく認識できるであろう。
【０１４４】 本発明は、下記の非限定実施例を参照することによりより理解することができ
る。当業者であれば、本発明の他の態様が本明細書に開示および請求される本発
明の思想および範囲から逸脱することなく実施しうると理解するであろう。
【０１４５】
【実施例】 実施例１ 真菌および細菌分離体． トウモロコシからExophiala分離体を、１９９８年２
月１０日に特許された米国特許第5,716,820号および１９９７年７月７日に出願
された係属中の米国特許出願第08/888,950号と第08/888,949号、引用することに
より本明細書に組み入れる、に記載されるように分離した。 分離法． 種子からの黒酵母の直接的分離は、シクロヘキシミド（500 mg/リッ
トル）およびクロラムフェニコール（50 mg/リットル）を添加したＹＰＤまたは
サブロー寒天培地に１００μｌの種子洗浄液を播種することにより実施した。プ
レートを室温で７〜１４日間インキュベートし、生じた個々の着色コロニーを計
測し、１９９８年２月１０日に特許された米国特許第5,716,820号および１９９
７年７月７日に出願された係属中の米国特許出願第08/888,950号と第08/888,949
号に記載されるように、フモニシン分解能の分析のために培養した。
【０１４６】 フモニシンおよび代謝産物の分析 分析用薄相クロマトグラフィーを、Rottinghausの 刊行された方法（Rottingh
aus等, J Vet Diagn Invest, 4: 326 (1992), 引用することにより本明細書に組
み入れる）の修飾法により１００％シラン化Ｃ１８シリカプレート（Sigma #T-7
020; 10 ×10 cm; 0.1 mm厚）において実施した。
【０１４７】 フモニシンエステラーゼ活性を分析するために、試料レーンを予めメタノール
で湿らせて試料の適用を促進させた。０.１〜２μｌの水性試料の適用後、プレ
ートを風乾して、ＭｅＯＨ：４％ ＫＣｌ（３：２）またはＭｅＯＨ：０．２Ｍ ＫＯＨ（３：２）中において展開させ、次いで０.１Ｍホウ酸ナトリウム（ｐ
Ｈ９.５）とフルオレセイン（アセトニトリル中０.４ｍｇ／ｍｌ）を連続的に噴
霧した。プレートを風乾して、長波長ＵＶ下にて観察した。
【０１４８】 ＡＰＡＯ活性の分析のために、別の方法を用いた。等容量の試料と14Ｃ−ＡＰ
１（１ｍｇ／ｍｌ，ｐＨ８，５０ｍＭリン酸ナトリウム）を室温で１から６日間
インキュベートした。次に分析用薄相クロマトグラフィーをＣ６０ＨＰＫシリカ
ゲルプレート（Whatman #4807-700; 10x10 cm; 0.2 mm 厚）上にて実施した。０
.１〜２μｌの水性試料の適用後、プレートを風乾し、そしてＣＨＣｌ3：ＭｅＯ
Ｈ：ＣＨ3ＣＯＯＨ：Ｈ2Ｏ（５５：３６：８：１）にて展開させた。次にプレー
トを風乾し、PhosphorImagerスクリーン（Molecular Dynamics）またはオートラ
ジオグラフィー用フィルムに露呈した。StormTM PhosphorImager（Molecular Dy
namics）を用いてスキャンしてスクリーン上に画像を形成させた。
【０１４９】 ＦＢ１のＡＰ１へのアルカリ加水分解． ＦＢ１または粗製フモニシンＣ8物質
を１０〜１００ｍｇ／ｍｌにて水中に懸濁させ、スクリューキャップ試験管中の
等量の４Ｎ ＮａＯＨに添加した。試験管をシールして、６０℃にて１時間イン
キュベートした。加水分解物を室温まで冷却し、等量の酢酸エチルと混合し、１
０００ＲＣＦにて５分間遠心分離し、そして有機（上）層を回収した。２回の連
続抽出からのプールした酢酸エチル層をＮ2下にて乾燥し、蒸留水中に懸濁した
。生じた物質（ＦＢ１のアミノペントールまたは“ＡＰ１”）をＴＬＣにより分
析した。
【０１５０】 培養濾過液および菌糸体の酵素活性． Exophiala spiniferaの分離体2141.10を
ＹＰＤ寒天培地上で１週間増殖させ、分生子を採取し、無菌水中に懸濁して、１
ｍｌ当たり１０５分生子にて１ｍｇ／ｍｌの精製ＦＢ１（Sigma Chemical Co）
含有する無菌のフライ[Fries]無機塩培地に播種した。暗室中にて２８℃で２週
間インキュベートした後、培養物を０.４５ミクロン酢酸セルロースフィルター
で濾過し、フライ無機塩培地で濯いた。真菌の菌糸体を１５ｍＬの０.１％ Ｆ
Ｂ１，ｐＨ５.２＋１ｍＭ ＥＤＴＡ＋３(ｇ／ｍＬ ペプスタチンＡ＋１．５(
ｇ／ｍＬ ロイペプチン中に懸濁し、０.１ｍｍのビーズおよび１分間のパルス
を使用して氷冷しながらBead BeaterTMにおいて破 壊した。菌糸片をSpin XTM（０.２２μｍ）で濾過することにより収集し、菌糸
の上清および元の培養濾過液の両方を上述の方法によりフモニシン修飾について
分析した。
【０１５１】 粗製培養濾過液の調製． 上述のように増殖した寒天培養物を用いて、培養液ｍ
ｌ当たり１０５分生子の最終濃度にて三角フラスコ中のＹＰＤブロス培養液（５
００ｍｌ）に播種した。培養液を震盪することなく２８℃で５日間インキュベー
トし、菌糸体を０.４５ミクロンフィルターで吸引濾過することにより収集した
。濾過液を捨て、菌糸体のマットを洗浄し、０.５ｍｇ／ｍｌのアルカリ加水分
解した粗製ＦＢ１を含有する炭素不含の低塩類培地（１ｇ／リットル ＮＨ3Ｎ
Ｏ4；１ｇ／リットル ＮａＨ2ＰＯ4；０．５ ｇ／リットル ＭｇＣｌ2；０.
１ｇ／リットル ＮａＣｌ；０．１３ｇ／リットル ＣａＣｌ2；０．０２ｇ／
リットル；ＦｅＳＯ4・７Ｈ2０，ｐＨ ４.５）中に再懸濁した。震盪すること
なく暗室中にて２８℃で３〜５日間後、培養液をタンパク質低結合性０.４５ミ
クロンフィルターで濾過して、培養濾過液を回収した。フェニルメチルスホニル
フルオリド（ＰＭＳＦ）を２.５ｍＭの濃度まで添加し、AmiconTM YM10膜を使用
して培養濾過液を室温で攪拌細胞中にて濃縮し、１０ｍＭ ＣａＣｌ2を含有す
る５０ｍＭ 酢酸ナトリウム，ｐＨ５.２中に再懸濁した。粗製培養濾過液（約
２００倍に濃縮）を−２０℃で貯蔵した。
【０１５２】 酵素加水分解したフモニシンの分離量を得るために、１０ｍｇのＦＢ１（Sigm
a）を２０ｍＬの５０ｍＭ 酢酸ナトリウム，ｐＨ５.２＋１０ｍＭ ＣａＣｌ2
に溶解し、そして０.２５ｍＬの２００倍濃縮した2141.10の粗製培養濾過液を添
加した。溶液を３７℃に１４時間インキュベートし、次いで室温まで冷却した。
反応混合物は、０.４ｍＬの４Ｎ ＫＯＨの添加によりｐＨ９.５にして、そして
混合物は１０ｍＬの酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層をＮ2下で乾燥
し、ｄＨ2Ｏ中に再懸濁した。２.５ｍｇの有機抽出物質は、Fast Atom Bombardm
ent（ＦＡＢ）質量分析により分析した。得られた質量スペクトルは、M/z (+1)=
406の質量単位の主なイオンを示し、これは酵素的加水分解の主な産物がＡＰ１
であることを示唆するものであり、これは４０５の分子量と算出された。
【０１５３】 実施例２ ＡＰ１誘導および非誘導菌糸体の調製 Exophiala spinifera 分離体2141.10の培養液をＹＰＤ寒天プレート（水１リ
ットル当たり，イーストエクストラスト １０ｇｍ，バクトトリプトン ２０ｇ
ｍ，デキストロース ０．５ｇｍ，およびバクトアガー １５ｇｍ）から調製し
た。ＹＰＤ寒天培地からの細胞の水懸濁物のアリコート（４００〜５００μｌ）
は、４ｍｍの無菌ガラスビーズを用いて１５０×１５ｍｍのＹＰＤ寒天プレート
に均一に塗布した。プレートは室温で６〜７日間インキュベートした。菌糸体／
分生子を寒天プレートから無機塩培地（ＭＳＭ）（蒸留水１リットル当たり，Ｎ
ａ2ＨＰＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．２ｇｍ，ＮＨ4Ｃｌ １．０ｇｍ，ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０．０１ｇｍ，ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．０２ｇｍ，ｐＨ４.５）に移し、５０
００×ｇ、４℃にて２０分間遠心分離して細胞をペレットにした。細胞のペレッ
トを４０ｍＬのＭＳＭで１回濯ぎ、再度遠心分離した。濯いだ細胞ペレットを用
いて、１：１９の圧縮細胞：ＭＳＭの比でＭＳＭに播種した。誘導する培養液に
０.５〜１.０ｍｇ／ｍｌの最終濃度でＡＰ１を補充し、暗室中にて２８℃に、１
００ｒｐｍでインキュベートして触媒酵素を誘導した。非誘導培養はＡＰ１を加
えずに、ＡＰ１と同じ濃度で４−ＡＢＡを含有する培地中に移した。０.４５酢
酸セルロースで濾過することにより上清を取り除いた。残った菌糸体のマットを
無菌のＭＳＭで洗浄し、次いで液体窒素で凍結させて貯蔵した。
【０１５４】 実施例３ トウモロコシ子葉鞘におけるＦＢ１およびＡＰ１の作用 ４日間暗成長させたトウモロコシの発芽からのトウモロコシ子葉鞘を成長点の
上で切除し、水の対照に加えて１．５，０.５，０.１５，０.０５，０.０１５，
０.００５，０.００１５または０.０００５ミリモルの等モル濃度でＦＢ１また
はＡＰ１を含有する６０μｌの無菌蒸留水が入った９６穴マイクロタイタープレ
ート中に移した。２８℃の暗室中で２日後、子葉鞘は光の中に移して、また３日
間インキュベートした。その損傷または欠損を次のように評価した。
【０１５５】
【表１】
【０１５６】 結果は、ＦＢ１とＡＰ１ではこの遺伝子型のトウモロコシ子葉鞘に対する毒性
に少なくとも３０倍の差があることを示唆している。一般的にこれは、２つの化
合物の毒性を植物組織において比較した：組織においてＡＰ１は約４０倍毒性が
低かった（Vesonder等., Arch Environ Contam Toxicol 23: 464-467 (1992)）
という他の研究と一致する。トマトにおいてＡＡＬ毒素とＦＢ１の両方を用いた
研究もまた、加水分解された分子が顕著に低毒性であることを示唆している（Gi
lchrist等, Mycopathologia 117: 57-64 (1992)）。ＡＰ１とＦＢ１とではトマ
トに対して毒性が約１００倍減少することを観察している（Lamprecht等, Phyto
pathology 84: 383391 (1994)）。
【０１５７】 実施例４ トウモロコシの組織培養細胞（Black Mexican Sweet, BMS）におけるＦＢ１およ
びＡＰ１の作用 ９６穴タイタープレート中の液体培地中で増殖するＢＭＳ細胞の懸濁液にＦＢ
１またはＡＰ１を種々の濃度で添加した。１週間後、ウェル中の細胞密度は低倍
率下で観察し、毒素処理したウェルの増殖は水を加えた対照のウェルと比較した
。ＢＭＳ細胞の増殖は、０.４マイクロモルのＦＢ１で顕著に阻害されたが、４
０マイクロモルまでのＡＰ１では阻害が全く観察されなかった。これは、トウモ
ロコシ組織培養細胞に対する毒性に約１００倍の差があることを示している。同
様に、Van Asch等（VanAsch等., Phytopathology 82: 1330-1332 (1992)）は、
固体培地上で増殖したトウモロコシのカルスが１.４マイクロモルのＦＢ１で顕
著に阻害されることを観察している。しかし、この研究ではＡＰ１は試験されな
かった。
【０１５８】 実施例５ ＡＰＡＯ活性 アミンオキシダーゼ活性を含む細胞不含抽出物は、基質誘導Exophiala spinif
era細胞を５０ｍＭ リン酸Ｎａ，ｐＨ８.０中においてを用いて破壊し、そして
細胞不含上清を遠心分離と４５ミクロンの濾過により得た。異化活性は、抽出物
をＡＰ１（加水分解したフモニシンＢ１バックボーン）と、または１４Ｃ−標識
のＡＰ１を抽出物とインキュベートし、そしてＣ１８またはＣ６０シリカにおけ
るＴＬＣによって評価することによりアッセイした。生成物２−ＯＰは、ＡＰ１
よりも低いＲｆを有しており、放射線標識のスキャンまたはＴＬＣプレートのH2 S04スプレー／チャーリング[spray/charring]のいずれかにより検出される。２
−ＯＰは、通常ＴＬＣプレートにおけるＡＰ１の検出に使用されるアミン試薬、
フルオレセインとは反応せず、これはアミン基が失われるかまたは化学的修飾さ
れることを示唆している。活性は室温より３７℃の方が高いが、引き続いて３０
分間６５℃または１００℃に置く（ＡＰ１異化活性は残らない）。活性はｐＨ９
にて最大となる。ｐＨ９において、２−ＯＰへの完全変換は３０分内で起こる。
活性は、３０,０００ダルトンでの分子量遮断膜では保持されるが、１００,００
０ダルトンでの分子量遮断膜では部分的にのみ保持される。他のアミン含有基質
を修飾について粗製抽出物により試験した。トリカルバリル酸を結合させたフモ
ニシンは抽出物により修飾されず、これはエステル加水分解が先ずＦＢ１の修飾
において有効であり得るＡＰＡＯに対して生じることを示唆している。他の長鎖
塩基（スフィンゴシン，スフィンガニンおよびフィトスフィンゴシン）は粗製Ａ
ＰＡＯにより明らかに修飾されず、これは酵素がフモニシンのバックボーンに特
異的であることを示唆している。２−ＯＰという産物の推定量もまた精製され、
そしてＣ１３ｎｍｒにより分析されている。結果は、２−ＯＰが炭素２において
アミンのかわりにケト基を有することを示唆しており、これはアミンオキシダー
ゼによる酸化的脱アミノ反応と矛盾しない。Ｃ１３ｎｍｒのデータはまた、２−
ＯＰがＣ−１とＣ−５の間において内部にヘミケタールを自然に生成し、その結
果Ｃ−２に新たなキラル中心を有する５員環を生じることを示唆している。他の
すべての炭素配置はＡＰ１におけるものと同様であり、故に２−ＯＰは組成C22H 44 O6, FW 404の化合物である。加水分解したフモニシンに作用する酵素の産物は
何ら顕著な毒性を示すと予想されないであろう。
【０１５９】 他の酵素をそのＡＰ１の修飾能について試験した。すべての酵素は、上述のよ
うに、摂氏３７°で、一晩またはそれ以上の至適条件下で放射線標識したＴＬＣ
によりアッセイした。その結果を次に示す：
【０１６０】
【表２】
【０１６１】 結果は、試験した各酵素について陰性であった。従って、American Type Cult
ure Collection（ＡＴＣＣ）からの分離体を収集した。選択したＡＴＣＣの分離
体はアミン修飾酵素として列記したか、またはアミン含有基質にて増殖／利用し
うるものであった。分離体は、これらが唯一の窒素源としてＡＰ１において増殖
するかまたはこれを利用できるか、そしてＡＰ１を新たな化合物に変化させうる
かを試験して決定した。培養液において用いた窒素源は、ＡＰ１ ０．１％（ｗ
／ｖ），ｓ−ブチルアミン ０．１％（ｖ／ｖ），ｎ−ブチルアミン ０．１％
（ｖ／ｖ），および硝酸アンモニウム ０．２％（ｗ／ｖ）である。これらは、
２％ショ糖を含有するVogelの無機培地（NH4NO3を不含）中にて調製した。分離
体は種々の培地中でインキュベートし、２〜３週間にわたり増殖について監視し
た。これらはまた、14Ｃ−放射線標識のＴＬＣアッセイを用いてＡＰ１の修飾に
ついてアッセイした。要約すると、試験した分離体のうちインビボにてＡＰ１の
修飾を示したものはなかった。明らかに、Exophiala spinifera由来のＡＰＡＯ
酵素は特別であり、ＡＰ１毒素の修飾能に特異的である。
【０１６２】 実施例６ ｔｒＡＰＡＯのポリヌクレオチドの単離 ｔｒＡＰＡＯポリヌクレオチドは、２つの試料について転写物のパターンを比
較し、別々に発現した断片のクローニングを可能にする、所有権のある転写物イ
メージ法を使用して特定した。この技術は、CuraGen(R)（New Haven, CT）によ
り開発された（公開されたＰＣＴ特許出願WO 97/15690，１９９７年５月１日公
開を参照、引用することにより組み入れる）。蛍光タグした、発現した転写物を
示すＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ断片は、ゲルトレースにおいてバンドまたはピークとし
て可視化することができ、別々に発現した（誘導または抑制した）バンド由来の
ｃＤＮＡは２重のゲルから回収し、クローン化枝、配列決定することができる。
知られたｃＤＮＡは、クローニングを要することなく、予想されるサイズおよび
トレースにおいて部分的に配列が知られた特異的バンドを照らし合わせることに
より特定することができる。
【０１６３】 本発明において、２つのＲＮＡ試料は、唯一の炭素源としてＡＰ１（誘導条件
）またはγ−アミノ酪酸（ＡＢＡ；非誘導条件）のいずれかを含有する無機塩培
地中で特定期間増殖させたE. spiniferaの培養液から得た。誘導条件下において
、フモニシンエステラーゼおよびＡＰＡＯ酵素活性は検出されるが、非誘導条件
下ではこれらの活性は検出されない。ＡＰＡＯの誘導および活性の検出に使用し
た方法は上述している（実施例２および実施例５を参照）。ＲＮＡは、乳鉢と乳
棒を用いてほとんと溶解するまで組織とTri-Reagentの凍結スラリーを錬磨し、
フェノールで１回、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合物で
２回水相を抽出する相分離させた後に付加的抽出を加える、Tri-Reagent法（Mol
ecular Research Center Inc., Cincinnati, Ohio）により誘導した菌糸体から
抽出した。ＲＮＡは、CuraGenR転写物イメージ法に供して、ＡＰ１の存在下にお
いて特異的に誘導されたｃＤＮＡ断片を検出した。ゲルトレースの結果、いくつ
かのバンドが見出され、ＡＰ１において少なくとも２倍、７９倍までまたは１０
０倍以上の誘導が示された。ゲルトレースの結果、いくつかのバンドが見出され
、ＡＰ１増殖細胞はＡＢＡ中で増殖した細胞と比較して少なくとも１０倍の誘導
が示された。２つの非常に誘導されたバンドの配列を表１に示す。
【０１６４】
【表３】
【０１６５】 ２つの非常に誘導されたバンド、k0n0-395.5および r0c0-182.3は、第１アミ
ンをアルデヒドまたはケトンに酸化して、アンモニアと過酸化水素を放出する酵
素、フラビン含有アミンオキシダーゼ（EC 1.4.3.4）のファミリーと顕著な配列
ホモロジーを示す（表２）。
【０１６６】
【表４】
【０１６７】 ＡＰ１脱アミノ化の主な産物の化学的構造は、炭素２および５とでhemiketal
を環化する、２−ケト化合物と考えられる。従って、この誘導される酵素は、Ａ
Ｐ１の脱アミノ化の原因であると予想される。
【０１６８】 k0n0-395.5由来の配列を使用して、部分的ｃＤＮＡを３′および５′RACE-PCR
（Chenchik等., CLONTECHniques X 1:5-8 (1995); Chenchik等., A new method
for full-length cDNA cloning by PCR. In A Laboratory Guide to RNA: Isola
tion, Analysis, and Synthesis. Ed. Krieg, P.A. (Wiley-Liss, Inc.), 273-3
21 (1996)）により得た。CLONTECHからのRACEキットを使用して、RACE増幅物[am
plicon]を得た。簡単に、ポリＡ＋ＲＮＡが転写されて、“ロック−ドッキング[
lock-docking]”ポリＴ、ｃＤＮＡ合成プライマーを用いて第１ストランドｃＤ
ＮＡを作成し、第２ストランドを合成して、the Marathon ｃＤＮＡアダプター
をｄｓ ｃＤＮＡの領末端に連結した。次いで、希釈した試料をアダプタープラ
イマーと用いて、別の反応において、５′遺伝子特異的プライマー（ＧＳＰ）ま
たは３′ＧＳＰのいずれかを用いて３′または５′RACE増幅物を作製した。RACE
産物の特徴付けおよび配列決定後、全長のｃＤＮＡは、１）５′末および３′末
ＧＳＰをアダプター連結ｄｓ ｃＤＮＡと共に用いる末端−末端ＰＣＲにより作
製し得るか、または２）クローン化５′および３′−RACE断片は、分離され連結
された断片のオーバーラップ領域にて特異的に切断する制限酵素を用いて産生し
得る。続いて、１）および２）からRACEで作製された全長のｃＤＮＡは適するベ
クター中にクローニングされる。
【０１６９】 与えたアダプタープライマーと組み合わせて、次の遺伝子特異的プライマーを
用いた：３′RACEには、オリゴヌクレオチドN21965：5'-TGGTTTCGTTACCGACAACCT
TGTATCCC-3' (SEQ ID NO: 3)、および５′RACEには、オリゴヌクレオチドN21968
：5'-GAGTTGGTCCCAGACAGACTTTTGTCGT-3' (SEQ ID NO: 4)。Exophiala spinifera
由来のｔｒＡＰＡＯポリヌクレオチド、k0n0-395_6.5のヌクレオチド配列は、SE
Q ID NO: 5に示す。ｔｒＡＰＡＯのポリペプチド配列は、SEQ ID NO: 6に示す。
【０１７０】 スプライスされていないイントロンを含むＡＰＡＯの２番目のクローンもまた
見出した。イントロン含有クローンであり、Exophiala spinifera由来のｔｒＡ
ＰＡＯ−Ｉポリヌクレオチド、k0n0-395_5.4のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID
NO: 7に見出すことができる。スプライシングされるイントロを含むｔｒＡＰＡ
Ｏ−Ｉのポリペプチド配列は、SEQ ID NO: 8に示す。スプライシングされるイン
トロを含まないｔｒＡＰＡＯ−Ｉのポリペプチド配列は、SEQ ID NO: 9に示す。
【０１７１】 実施例７ ｔｒＡＰＡＯの異種発現 PileUp (GCG)を用いて作成されるタンパク質のアライメントは、k0n0-395_6.5
(trAPAO)がサイズにおいて他のフラビンアミノオキシダーゼと類似し、そして
そのクラスのタンパク質のアミノ末端について全長が近接していることを示唆し
ている。k0n0-395_6.5配列は、アミノ末端に近接するジヌクレオチド（ＦＡＤ）
の結合に必要である、完全なβ−α−βフォールドを含む。k0n0-395配列は、長
さにおいてラットのモノアミンオキシダーゼＡ＆Ｂについて５アミノ酸から、長
さにおいてAspergillus MAO-Nについては４０アミノ酸が変化している、可変ア
ミノ末端断片のみを欠いているようである。これらアミノ末端の伸長の機能は知
られておらず；これらは分泌シグナルとは認められない。細胞膜の外側のExophi
ala APAOの起こりうる局在化に基づき、k0n0-395は、同じ起源からクローン化さ
れたフモニシンエステラーゼと同様なシグナル配列を有すると予測される（上述
の米国特許第5,716,820号）。GenomeWalker(を用いて、転写物の５′末端と上流
のゲノム制御エレメントをクローニングすることが可能である。しかし、酵素の
機能性に重要であるシグナル配列は期待されない；事実、トウモロコシとPichia
pastorisにおける異種発現に好ましい方法は、内在性のシグナル配列（存在す
る場合）をその生物に最適なシグナル配列、例えばトウモロコシでは大麦のαア
ミラーゼ、Pichia.では酵母のα因子分泌シグナルと弛緩することを包含する。
フモニシンエステラーゼで形質転換したトウモロコシにおいて、大麦のαアミラ
ーゼのシグナル配列は、自然の真菌のシグナルよりもより多い量の機能的タンパ
ク質を与え、故に自然の真菌のシグナル配列の置換は、論理的な至適化工程であ
る。多くのアミンオキシダーゼが、Ｎ−末端およびジヌクレオチド結合部位の上
流の近くに陽性電荷のアミノ酸を有しているため、別の至適化工程は、ｔｒＡＰ
ＡＯクローン（k0n0-395_6.5, SEQ ID NO: 5）のＮ−末端にリジン（Ｋ）に対す
るコドンを添加することを包含する。このクローンはと命名され、SEQ ID NOS:
10およびSEQ ID NOS: 11に見出すことができる。余分のリジンは、アミノ酸１、
そしてヌクレオチド１〜３である。
【０１７２】 実施例８ ｔｒＡＰＡＯのPichiaでの発現 Pichia pastorisにおけるｔｒＡＰＡＯの至適発現のために、α接合因子のシ
グナルペプチドをフレーム内でK:trAPAOコーディング配列と融合しており、SEQ
ID NOS: 16 および SEQ ID NOS: 17において見出すことができる。クローンpPic
ZalphaA:K:trAPAOのヌクレオチド配列は、k0n0-395のオープンリーディングフレ
ームとそのアミノ末端の追加のリジン残基、からなるＰＣＲ増幅挿入物を含み、
フレーム内について５′のEcoRI部位および３′NotIの部位を用いてα因子分泌
ベクターpPicZalphaA中にクローニングする。ヌクレオチド１〜２６７は、酵母
のα接合因子の分泌シグナルを含む。SEQ ID NO: 17に示されるアミノ酸配列は
、Pichia pastorisの形質転換の後にpPicZalphaA:K:trAPAOから産生されるｔｒ
ＡＰＡＯポリペプチドを含む。
【０１７３】 Pichia pastoris由来の発現ベクター中にクローニングするために、２つのク
ローニング法を用いた。ｃＤＮＡ k0n0-395_5.4は、鋳型としてアダプター連結
ｃＤＮＡを用いて５′末端ＧＳＰおよび３′末端ＧＳＰを使用する、末端−末端
ＰＣＲにより作製した。pPicZalphaAの末端オリゴヌクレオチドプライマーは、k
0n0-395のオープンリーディングフレーム中にクローニングするための５′末端
（センス ストランド）と３′末端（アンチセンス ストランド）の重複部分を繋
いだ２３〜２５ｂｐを含む５′制限酵素部位を用いて消化した；３′プライマー
もまた終止コドンを包含した。プライマー配列は、N23256: 5'-ggggaattcAAAGA
CAACGTTGCGGACGTGGTAG-3' (SEQ ID NO: 12) およびN23259: 5'-ggggcggccgcCTAT
GCTGCTGGCACCAGGCTAG-3' (SEQ ID NO: 13)である。２つ目の方法は、k0n0-395_6
.5を作製するために用いた。５′RACEおよび３′RACEの産物は、上述のように必
要な制限酵素部位、停止コドンなどを含む末端プライマーを使用して作製し、そ
して“中間”ＧＳＰと組み合わせた。“３′RACEについては、中間”プライマー
はN21965: 5'-TGGTTTCGTTACCGACAACCTTGTATCCC-3' (SEQ ID NO: 14)であり、５
′RACEについては、オリゴヌクレオチドN21968: 5'-GAGTTGGTCCCAGACAGACTTTTGT
CGT-3' (SEQ ID NO: 15)である。アダプター連結ｃＤＮＡを鋳型として用いた。
単離した５′および３′RACE断片を、オーバーラップの領域にて特異的に切断す
る制限酵素、この場合はＢｇｌ Ｉを用いて消化し、単離し、そして発現ベクタ
ー中に連結した。消化可能な制限酵素は、EcoRI/Nで消化したpPicZalphaA中へフ
レーム内に挿入物をクローニングすることを可能にする。PPicZalphaAは、E. co
li適合性Pichia発現ベクターであり、これは機能的酵母α因子分泌シグナルおよ
びペプチドプロセッシング部位を含み、Pichiaの培養液中での高い効率での分泌
を誘導可能である。得られた１.４ｋｂのバンドは、EcoRI/NotIで消化したpPicZ
alphaAプラスミド中にクローニングされた。
【０１７４】 SEQ ID NO: 16は、クローンpPicZalphaA:K:trAPAO,のポリヌクレオチド配列で
ある、ＰＣＲ増幅挿入物を含み、これはk0n0-395のオープンリーディングフレー
ムとそのアミノ末端の追加のリジン残基、そしてα因子分泌ベクターpPicZalpha
A中へのフレーム内のクローニングのための５′のEcoRI部位および３′のNotI部
位からなる。SEQ ID NO: 17は、Pichia pastoris中への形質転換後にpPicZalpha
A:K:trAPAOから賛成されるｔｒＡＰＡＯポリペプチドのアミノ酸配列を含む。α
因子分泌シグナルおよびリジンが添加される。
【０１７５】 Pichiaは、上述のようにInvitrogen Manual, Easy SelectTM Pichia Expressi
on Kit, Version B, #161219にて、イントロンを含む（ｔｒＡＰＡＯ−１，陰性
対照，Pichiaが高い効率でイントロンをスプライシングしないために活性ｔｒＡ
ＰＡＯを発現しない）またはイントロンを含まない（活性ＡＰＡＯタンパク質を
生成しうる）上述のｔｒＡＰＡＯポリヌクレオチドを用いて形質転換する。
【０１７６】 凍結した６日培養したPichia細胞のペレットのセットは、遺伝子コンストラク
ト中にイントロン（SEQ ID NO: 7）を有する２つの試料、＃１１および＃１４、
並びに、遺伝子コンストラクト中にイントロン（SEQ ID NO: 7）を有さない２つ
の試料、＃６および＃５２を含んでいた。同じ培養からの６日間の培養液は、陽
性対照のための粗製菌糸酵素でスパイクするのに用いた。
【０１７７】 ５０μｌの細胞ペレットは、１５０μｌの冷した５０ｍＭ Ｎａ−リン酸，ｐ
Ｈ８.０中に再懸濁し、新たな２本の５００μｌの試験管に分けた。１本の試験
管はペレット懸濁液を処理することなく氷上で保持し、１本は分解に用いた。同
じ容積の０.１ｍｍジルコニア−シリカビーズを各試験管に添加した。試験管はB
eadBeatTMに１５秒間、次いで氷上で５分間冷却した。これを３回繰り返した。
次に、粗製分解物は、アッセイまたは分解物の懸濁のために別の試験管に移した
。
【０１７８】 ＴＬＣアッセイ発議のように実施する、試料を１）ペレット懸濁液；１０μｌ
；２溶解液懸濁液；１０μｌ；３）５μｌの培地を５μｌの粗製真菌酵素と混合
した培地対照；１０μｌ；４）希釈していない粗製真菌酵素を用いた陽性対照；
１０μｌ；５）５０ｍＭ リン酸Ｎａ，ｐＨ８.０を用いた基質対照；１０μｌ
。１０マイクロリットルの各試料に１０μｌの14Ｃ−ＡＰ１（１ｍｇ／ｍｌ，５
０ｍＭ リン酸Ｎａ，ｐＨ８.０）を足して、これを室温で６日間インキュベー
トした。１μｌの試料をＣ１８ＴＬＣプレートおよびＣ６０ＴＬＣプレートにス
ポットそた。Ｃ１８プレートはＭｅＯＨ：４％ ＫＣｌ（３：２）中で展開させ
た。Ｃ６０プレートは、ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ：ＣＨ3ＣＯＯＨ：Ｈ2Ｏ（５５：
３６：８：１）中で展開させた。次いでプレートを風乾して、次いで２〜３日間
PhosphorScreenTMに露呈した。StormTM PhosphorImagerを用いて画像を現像した
。
【０１７９】 陽性のＴＬＣの結果は、追加の放射活性のスポットがＡＰ１の脱アミノ化産物
である２−ＯＰとしてより早く特定された、生成したＡＰ１修飾のより低いＲｆ
において生じた場合に得られる。試料＃６および＃５２（イントロンを含まない
）において、ＡＰ１修飾酵素活性（ＡＰ１の２−ＯＰへの変換）は、ペレット懸
濁液とペレット溶解液中で検出されたが、主要な活性はペレット懸濁液と関連し
ていた。試料＃１１および＃１４（イントロンを含む）において、ＡＰ１修飾酵
素活性の最小量がペレット溶解液中でのみ検出可能であったが、これはが効率的
にイントロンをスプライシングできないことを示唆している。
【０１８０】 このＡＰＡＯ活性を証明した実験は、において検出することができるが、記載
したｔｒＡＰＡＯはＡＰ１分解について性格に機能することが確かめられる。活
性は、細胞懸濁液と関連し、これはペレット懸濁液よりも高い活性を示す。ペレ
ット懸濁液は、細胞の溶解の間、内在性プロテアーゼの放出のために低い活性が
示される。
【０１８１】 実施例９ E. coliにおけるｔｒＡＰＡＯの発現 E. coliにおいてK:trAPAOを発現するベクターはpGEX-4T-1である。このベクタ
ーは、原核細胞のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ベクター
であり、Schistosoma japonicumのＧＳＴとの融合として、遺伝子または遺伝子
断片の高レベルでの細胞内発現を誘導可能である。ＧＳＴ遺伝子融合ベクターは
、次の特徴を包含する：高レベル発現を誘導可能なｌａｃプロモーター；任意の
E. coli宿主にて使用するための、内部Ｉｑ遺伝子；およびトロンビン因子Ｘａ
または所望のタンパク質を融合産物と開裂させるためのPreScissionプロテアー
ゼ認識部位。目的の挿入物、k0n0-395_6.5 (K:trAPAO)は、５′EcoRI部位および
３′NotI部位中にサブクローン化して、GST:K:trAPAOをフレーム内発現させた。
融合ポリペプチド GST:K:trAPAO融合体のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:
18に見出すことができる。ポリリンカーを有するＧＳＴ融合体は、ヌクレオチ
ド１〜６８７に見出すことができる。K:trAPAOは、ヌクレオチド６８８〜２０７
６に見出すことができる。GST:K:trAPAO 融合体に対してえら得るポリペプチド
は、SEQ ID NO: 19に見出される。アミノ酸１〜２２９はＧＳＴ融合体プラスポ
リリンカーを表し、アミノ酸２３０〜６９２は融合体のK:trAPAO の部分を表し
ている。
【０１８２】 E. coliは、ＢＲＬのカタログ，Life Technologies, Inc. catalogue; Hanaha
n, D., J. Mol. Biol. 166:557 (1983) Jessee, J. Focus 6:4 (1984); King, P
.V. and Blakesley, R., Focus 8:1, 1 (1986)，引用することにより組み入れる
、で記載されるK:trAPAOを含有するpGEX-4T-1で形質転換された。形質転換したE
. coli、ＩＰＴＧ（イソプロピルｂ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）の添加によ
り誘導される。
【０１８３】 可溶性抽出物の４つの試料および不溶性封入体の４つの試料は、実施例９にて
記載したようにｔｒＡＰＡＯ活性について試験した。ＡＰＡＯ活性は、すべての
可溶性試料と２つの不溶性試料中に存在した。最も高い活性は、１０μＭのＩＰ
ＴＧ誘導において見出された。故に、k0n0-395_6.5コンストラクトを含むpGEX-4
T-1ベクターは、E. coliにて活性なＡＰＡＯ酵素を産生することができるのであ
る。
【０１８４】 実施例 10 Exophiala APAO 遺伝子の完全な塩基配列 ゲノム・ウォーカー[Genome Walker]を用いて、Exophiala のＡＰＡＯ遺伝子
の完全な塩基配列を回収した。SEQ ID NO: 5に記載されている塩基配列は、天然
の遺伝子の5'末端の一部が欠失している。天然の遺伝子の5'末端の欠失している
部分は、実施例9および10に示したように、活性なAPAO酵素の発現には必要ない
。ＡＰＡＯ遺伝子の完全な塩基配列は、SEQ ID NO: 22に示している。SEQ ID NO
: 22 の翻訳はSEQ ID NO: 23に示している。
【０１８５】 実施例 11 遺伝子改変トウモロコシのカルスにおけるＡＰＡＯおよびＥＳＰ１の発現 トウモロコシでの発現に適したコンストラクトの一つは、大麦のαアミラーゼ
のシグナル配列にｔｒＡＰＡＯをつないだ塩基配列である。トウモロコシにおけ
る成熟ｔｒＡＰＡＯの発現と分泌のために、大麦のαアミラーゼのシグナル配列
にK:trAPAOを翻訳上融合したものの塩基配列は、SEQ ID NO: 20に示した。ヌク
レオチド１〜７２は大麦のαアミラーゼのシグナル配列に相当し、ヌクレオチド
７３〜７５は付加したリジン残基に相当し、ヌクレオチド76−1464はｔｒＡＰＡ
Ｏ ｃＤＮＡに相当する。SEQ ID NO: 20のアミノ酸配列の翻訳は SEQ ID NO: 2
1に示した。アミノ酸１から２４は大麦のαアミラーゼのシグナル配列に相当し
、アミノ酸２５から４６３はK:trAPAOの配列である。
【０１８６】 トウモロコシの胚芽を、次の３つの転写単位を含むコンストラクトに由来する
直鎖ＤＮＡ（挿入配列、細菌性の抗生物質耐性マーカーを欠失している）を用い
て形質転換した：１）ＰＡＴ選択マーカー遺伝子 (Wohlleben等、 Gene 70, 25-
37 (1988)), 2) 大麦のαアミラーゼのシグナル配列につないだフモニシン エス
テラーゼ、および３）アミノ末端に大麦のαアミラーゼのシグナル配列を持たな
い、あるいは持つ、ＡＰＡＯ全長(P13603は、３５ＳプロモーターにつないだＰ
ＡＴ選択マーカー遺伝子、大麦のαアミラーゼのシグナル配列とユビキチンプロ
モーターにつないだフモニシン エステラーゼ、およびユビキチンプロモーター
につないだＡＰＡＯを含み、P13611は、３５ＳプロモーターにつないだＰＡＴ選
択マーカー遺伝子、大麦のαアミラーゼのシグナル配列とユビキチンプロモータ
ーにつないだフモニシン エステラーゼ、および大麦のαアミラーゼのシグナル
配列とユビキチンプロモーターにつないだＡＰＡＯを含む）。これらのコンスト
ラクトでは、ＥＳＰ１およびＡＰＡＯの両方を、トウモロコシユビキチンのプロ
モーターおよび第一イントロンと連結した。３番目のコンストラクトには、同じ
３つの転写単位をアグロバクテリウムＴ１ベクター（Ｐ１５２５８、このコンス
トラクトは、ＰＡＴ選択マーカー遺伝子、大麦のαアミラーゼのシグナル配列に
つないだフモニシン エステラーゼ、およびＡＰＡＯを含む）にクローン化した
。安定に形質転換されたカルス、あるいはカルスから再生されたＴ０植物は、葉
組織の緩衝抽出液中で、放射標識したＦＢ１とＡＰ１の両方またはいずれか一方
とＣ１８薄相クロマトグラフィーを用いてＥＳＰ１およびＡＰＡＯの活性を検定
した。陽性対照はE.coliで発現させた組換えＥＳＰ１あるいはＡＰＡＯを加えた
形質転換していない組織からなる。その結果、ＥＳＰ１およびＡＰＡＯ の両方
の活性が遺伝子改変トウモロコシのカルスおよび植物から検出されている。
【０１８７】
【表５】
【０１８８】 遺伝子改変植物は、ＥＳＰ１およびＡＰＡＯの両方の活性が陽性の遺伝子改変
カルスから当業界で知られた標準的な方法により再生した。酵素活性は、前述し
た方法に従って検定した。以下に示したように、遺伝子改変トウモロコシでＥＳ
Ｐ１およびＡＰＡＯの両方の酵素をうまく発現することができた。
【０１８９】
【表６】
【０１９０】 植物におけるAPAOの発現のために適した別のコンストラクトは、APAOをペルオ
キシソームにターゲッティングしている。トウモロコシ胚芽に、ユビキチンプロ
モーターとペルオキシソーム・ターゲッティングシグナル(Gould等、 J Cell Bi
ol 108:1657-1664 (1989))に連結することができたＡＰＡＯ；ユビキチンプロモ
ーターと大麦のαアミラーゼのシグナル配列に連結することができたＥＳＰ１；
および３５Ｓプロモーターに連結することができた選択マーカーＰＡＴを含む挿
入配列 (コンストラクト番号 I14952)で衝撃を与えた。。陰性対照は、衝撃を与
えなかった胚芽／カルスとした。陽性対照は衝撃を与えなかった胚芽／カルスに
精製した酵素を加えたものとした。次に、形質転換したカルスは、ＥＳＰ１また
はＡＰＡＯの活性を前述した方法に従って検定した。検定を行った６７例中、１
８例がＥＳＰ１活性とＡＰＡＯ活性の両方を含んでいた。ペルオキシソームにタ
ーゲッティングされたＡＰＡＯとアポプラストにターゲッティングされたフモニ
シン・エステラーゼは、両方、植物細胞においてうまく発現させることができる
。
【０１９１】 植物におけるＡＰＡＯの発現のために適した別のコンストラクトは、ＡＰＡＯ
をミトコンドリアの膜にターゲッティングしている。Ｃ末端の延長部分が、モノ
アミン・オキシダーゼ ＭＡＯ−ＡおよびＭＡＯ−Ｂを哺乳類のミトコンドリア
外膜にターゲッティングするのに必要である。ＭＡＯ−Ａ、ＭＡＯ−Ｂ、あるい
は、機能的に類似したＣ末端の延長部分を、ＡＰＡＯまたはｔｒＡＰＡＯに読み
枠をあわせて融合させ、トウモロコシおよび他の形質転換した種のミトコンドリ
ア外膜へのこの酵素の局在化を促進することができる。
【０１９２】 実施例１２ ＡＰＡＯ配列とその他の配列との比較 ＡＰＡＯ（SEQ ID NO：２２）の Exophiala cDNA は二つのクラスのタンパ
ク質に対して異なった相同性を有する６００アミノ酸ポリペプチド(SEQ ID NO：
２３）をコードしている１８００ｂｐオープンリーディングフレームを含有して
いる。ＡＰＡＯのカルボキシ３／４（アミノ酸１３７〜５９３）はフラビンアミ
ンオキシダーゼ、すなわち炭素１での第一アミンの酸化的脱アミンを触媒する一
群酵素に対して大きな相同性を有している。カルボキシ末端ドメインのアミンオ
キシダーゼ機能は、基質としてＡＰ１を用いて Pichia pastoris および E.col
i の両者での端を切り取ったＡＰＡＯペプチド（１３７〜６００）の発現により
確認した（実施例９を参照）。対照的に、ＡＰＡＯのアミノ末端部分(約５〜１
３４）は、数種の細菌およびラン藻ならびに数種の高等生物物で報告されている
一群の小規模の推論されたオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ)に対して顕
著な相同性を示す。これらのＯＲＦはサイズ１４〜１７ｋＤＡの範囲の未知の機
能の小型タンパク質をコードしている。単独ポリペプチドでのこれらの異なった
相同性が並置されていることはこれまで報告されていなかった。
【０１９３】 フラビンアミンオキシダーゼ（E.C.4.1.4.3）は高等および下等生物の両方に
存在している一群のフラボ酵素であり、異化作用において様々な機能を果してい
る。これらの酵素は様々な基質のＣ−１位に存在する第一アミノ基の酸化的脱ア
ミノ化を触媒して、アルデヒド生成物プラスアンモニアおよび過酸化水素を生じ
る。この報告に記載のＡＰＡＯ酵素は、Ｃ−１（すなわち、ＡＰ１のＣ−２）に
存在していない第一アミンをアタックしてアルデヒド生成物よりもむしろケト生
成物を生じることが知られている最初のフラビンアミンオキシダーゼである。し
かしながら、フラビンアミンオキシダーゼとは密接に関係していないが、アミノ
酸オキシダーゼはＣ−１カルボキシル基に隣接するＣ−２アミンを酸化するフラ
ボ酵素である。
【０１９４】 モノアミンオキシダーゼＭＡＯ ＡおよびＢ（ヒト、ウシおよびマス由来）は
高等生物のミトコンドリア外膜に局在し、そして神経伝達物質のレベルを調節す
る。微生物の例には、アミン異化作用に関連する菌のアミンオキシダーゼ（Aspe
rgilllus niger (niger) ＭＡＯ−Ｎ）およびグラム（＋）細菌（Micrococcus rubens）由来の細菌のプトレッシンオキシダーゼが包含されている。一次ポリ
ペプチドは長さが４７８乃至５２７アミノ酸に変化し、そしてまた５′末端にお
いて、またコーデイング領域を通した様々な個所で高いアミノ酸配列共通領域を
共有している。Pile UP（ＧＣＧ）で発生するタンパク質アライメント(alignmen
t）は、ｔｒＡＰＡＯが５′末端近辺のものをも包含するこのクラスのタンパク
質に存在しているすべての保存ドメインを含有していることを示している。
【０１９５】 ｔｒＡＰＡＯのアミンオキシダーゼドメインはこのクラスの酵素が共有してい
る数種の重要な特徴を含有し、β−αターンの３種の非変異グリシン（Ｇ−Ｘ−
Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｇ）を含むβ−α−βストレッチ(stretch)を特徴とするアミノ末
端ジヌクレオチド（ＡＤＰ）結合領域を包含している。ｔｒＡＰＡＯでは、この
配列は（ＤＶＶＶＶＧＡＧＬＳＧ）である。この領域はＦＡＤ結合に関与してい
る。哺乳動物アミンオキシダーゼに特有のいくつかの特徴〔そのうちの一つ（Ｍ
ＡＯ−ＡのＣｙｓ−４０６）がＦＡＤの共有結合に関与しているいくつかの必須
システイン残基を包含し（Ｗｕ等、Mol pharm 43：888 (1993)〕およびＭＡＯ
をミトコンドリア外膜への輸送および固定に関与することが証明されたカルボキ
シ末端エクステンシヨン（extension）が存在しない。Aspergillus酵素ＭＡＯ−
Ｎは非共有結合ＦＡＤを含有することが証明され、そしてまた保存システインを
欠如している。従って、Exophiala ＡＰＡＯ酵素は非共有結合ＦＡＤを有する可
能性がある。Aspergillus ＭＡＯ−Ｎは、ペルオキシソーム標的化および局在化
に関与するカルボキシ末端トリペプチドAla-Arg-Leuを有し、この配列はExophia
la ＡＰＡＯには欠けている。
【０１９６】 ｔｒＡＰＡＯのアミンオキシダーゼドメインは、Aspergillus酵素の１０個 ま
たMicrococcus酵素の僅か２個に比して、合計７個のシステインを含有している
。哺乳動物ＭＡＯ酵素は変化し得る数のシステイン（少くとも１０個）を包含し
、そのうちのいくつかは保存されている（上述したＦＡＤ結合残基を包含する）
。ｔｒＡＰＡＯ配列はアミノ末端方向の２個の推定グリコシル化部位（ＮＤＳ、
ＮＱＳ）を有している。
【０１９７】 ＡＰＡＯのアミノ末端エクステンションの目的および１４−１７ｋＤａタンパ
ク質の一群に対するその相同性の基礎は明らかではない。Synechocystisでは、
同様なポリペプチドＯＲＦがＮＡＤＰ−依存性グルタミンデヒドロゲナーゼ（ｇ
ｄｈＡ）のすぐ上流に存在し、そしてｇｄｈＡの機能的発現に必要とされること
がわかった（Chavez等、1995）。しかし、ｔｒＡＰＡＯにおいて、ドメインは、
端を切り取ったＡＰＡＯを用いた発現実験の結果が示す如く、酵素活性には明ら
かに必要ではない。興味のある手がかりは、細菌でのオキシドレダクターゼ活性
に関与するか、またはマウスでの熱ストレスで誘起される遺伝子クラスターとこ
の小さいＯＲＦとのひんぱんな会合に由来し、レドクッス保護での可能な役割を
示唆している。アミノオキシダーゼ活性の副産物は過酸化水素である。フラボ酵
素およびその他のレドックス酵素は往々にして過酸化水素による不活性化を受け
やすく（Schrader等、App Micreb Biotechnol 45: 458; Aguiree等、J. Bacteri
ol 171: 6243 (1989) 、そしてこのタンパク質は例えば過酸化水素のような酸化
剤に対する保護の役割を有する可能性がある。
【０１９８】 GCG PileUp を用いる複合配列アラインメントにおいて、ｔｒＡＰＡＯはMicro
coccus rubens. Swirsprot 受託番号Ｐ40974のプトレッシンオキシダーゼに最も
類似している（30％同一アミノ酸、40％類似）。いくつかの哺乳動物モノアミン
オキシダーゼＡおよびＢ、Swirsprot 受託番号Ｐ21397 (Homo Sapiens mao a)
、Ｐ19643 (Rattus norvegicus mao b) 、Ｐ21396 (Rattus norvegicus mao a)
およびＰ21398 (Bos taurus mao a) との相同性は若干より少なく、２５〜２８
％同一性および３６〜４０％類似性の範囲にある。既知のその他の唯一の菌フラ
ビンアミンオキシダーゼ、Aspergillus niger からのＭＡＯ−Ｎ (Swissprot受
託番号Ｐ46882）に対する相同性は若干低い方である（24％同一、34％類似）。
微生物酵素は相互にかなり異なっているが、哺乳動物モノアミンオキシダーゼは
６５〜８７％同一性を共有している。
【０１９９】 ＡＰＡＯのアミノ末端ドメイン（ＡＴＤ）は、インビボ翻訳阻害活性を示すヒ
トおよびラット食細胞由来の１４.５ｋＤタンパク質に対しても相同性を示し（S
wissprot accession # P52758、 P52759)（Schmiedeknecht等、Eur J Biochem 74
2 (2)、 339-351 (1996)）、そしてマウス由来の熱反応性タンパク質を包含して
いる（Samuel等、Hepatology 25 (5)、1213-1222 (1997)）。このことは、この
ファミリーのタンパク質が細胞代謝の調節に関与していることを示唆している。
しかし、このドメインがより大きなタンパク質ドメインと融合してＡＰＡＯを特
有なものとする実例は何も存在していない。理論によって制約されることを企図
してはいないが、これはすべてこのドメインがＡＰＡＯ遺伝子発現に調節的役割
を果し、おそらくは必要でないときにメッセージの翻訳を妨害することを示唆し
ている。このことは、活性酵素がExophiala細胞で必要とされるときに、メッセ
ージの翻訳が如何にして復活するかという課題も生じる。おそらくは、必要でな
いときに、阻害剤ドメインの下流で；または阻害剤ドメインのタンパク質分解、
複合、分解またはリン酸化／脱リン酸化を開始する第二の開始部位が存在してい
る。第一の可能性は左程ないものである。それはＡＰＡＯの予測される開始部位
を構成している。１２２−１２４でのＡＴＧに先行するその他のＡＴＧコドンが
存在しないからである。第二の可能性は試験が容易ではないが、ＡＴＤにカゼイ
ンキナーゼ部位が存在している。ＡＴＤのために第二の役割はＡＰＡＯタンパク
質のオリゴマー化、またはタンパク質を例えば膜のような何らかの細胞内部位に
固定することを包含している。
【０２００】 Ｃ−末端エクステンションによる別のフラボ酵素、すなわちヒトフラビンモノ
オキシゲナーゼ４（ＦＯＭ−４）に対する調節コントロールの平行する実例が報
告されている（Itagaki等、J of Biol Chem 271 (33): 20102-20107 (1966)）。
この場合、８１塩基Ｃ−末端エクステンションに先立つ終止コドンの導入により
、非相同性系での活性酵素の発現が可能となる。しかし、Ｃ−末端部分の役割は
解明されていなかった。別の実例では、別のスプライシングにより、正常にスプ
ライシングされたバージョンの機能と複合、干渉されているより短い遺伝子産物
が導かれていた（Quinet等、J of Biol Chem 268 (23): 16891-16894 (1993)）
。別の事例では、別のタンパク質での別のスプライシング生成挿入断片が細胞増
殖を阻害した（Bhat等、Prontein Engineering 9 (8): 713-718 (1996)）。さら
に別の変法では、Fas／Apolスプライシング変異体が、すべての変異体が共有し
ている４９アミノ酸ドメインを明らかに介して、アポト−シスを阻害している（
Papoff等、J of Immunology 156 (12): 4622-4630 (1996)）。
【０２０１】 実施例１３ フモニシンエステラーゼを含有する融合タンパク質の製造および同一ポリペプチ
ドにおけるＡＰアミンオキシターゼ活性 フモニシンエステラーゼおよびＡＰアミンオキシダーゼ酵素活性を、二つのポ
リペプチドの間のスペーサー領域を伴うかまたは伴うことなく、一緒にオープン
リーディングクレームを用いて、単独ポリペプチドで組合わせることができる。
これにより、アポプラストへの単位として輸出することができ、そして両方の酵
素活性を細胞壁の同一領域に都合よく局在化させることのできる二重酵素活性を
有するハイブリッドタンパク質が創製される。二つのｃＤＮＡはいずれの順序で
も組合わせることができるが、好ましい方法はこれらのものをＮＨ3−エステラ
ーゼ：アミンオキシダーゼ−ＣＯＯＨの順序で連結させることにある。スペーサ
ーは存在するときは例えばＧＧＧＳＧＧＧＳのようなアミノ酸の短いストレッチ
（stretch）またはアポプラストプロテアーゼにより作用され得るプロテアーゼ
開裂部位を包含するアミノ酸のセットからなってよい。これにより、アポプラス
ト中でエステラーゼおよびＡＰＡＯ酵素両方の化学量論量の生産ができる。
【０２０２】 エステラーゼＡＰＡＯ融合タンパク質は、E. spinifera 2141.19 由来のフモ
ニシンエステラーゼ（ＥＳＰ １）または細菌由来のフモニシンエステラーゼ 24
12.1（ＢＥＳＴ １）で製造することができる。ＢＥＳＴ １の最高活性のための
ｐＨ領域はＡＰＡＯのそれと類似しているので（６.０〜８.０の範囲）、これら
のものは融合形態で最も有効な組合わせを提供することができる。先の実施例で
述べた如く、これらの融合配列は適切な発現ベクターに入れ、細菌または植物で
のタンパク質の発現に使用することができる。
【０２０３】 ＥＳＰ １のヌクレオチド配列は係属中の米国特許出願第08／888,950号および
第08／888,949号（共に1997年７月７日付出願）に開示されているＥＳＰ １配列
に対して三つのヌクレオチドの相違および三つの対応するアミノ酸の相違を含有
している。本発明で開示している配列および係属中の米国特許出願で開示されて
いる配列共に機能的フモニシンエステラーゼ遺伝子を含有している。本発明の目
的のためには、原ＥＳＰ １配列または開示されたＥＳＰ １配列をＡＰＡＯ配列
と組合わて、または融合配列で使用することができる。植物発現のためのＢＡＡ
：ＥＳＰ １：Ｋ：ｔｒＡＰＡＯ構築物のヌクレオチド配列は SEQ ID NO：２４
に、また翻訳はSEQ ID NO：２５にみられる。植物発現のためのＢＡＡ：ＢＥＳT １：Ｋ：ｔｒＡＰＡＯ構築物のヌクレオチド配列は SEQ ID NO：２６に、また
翻訳は SEQ ID NO：２９にみられる。ｐＧＥＸ−４Ｔ−Ｌまたは類似のベクター
での細菌発現のためのＧＳＴ：ＥＳＰ １：Ｋ ｔｒＡＰＡＯ融合のヌクレオチド
配列は SEQ ID NO：２８に、また翻訳は SEQ ID NO：２９にみられる。ｐＧＥＸ
−４Ｔ−Ｌまたは類似のベクターでの細菌発現のためのＧＳＴ：ＢＥＳＴ １：
Ｋ ｔｒＡＰＡＯ融合のためのヌクレオチド配列は SEQ ID NO：３０に、また翻
訳は SEQ ID NO：３１にみられる。
【０２０４】 実施例１４ ＡＰＡＯ基質の検討 ＡＰＡＯ酵素の基質特異性を測定するのに以下のアッセイを用いた。反応混合
物：２００mMリン酸Ｎａ ４３６μl、ｐＨ ８.０；基質（10mM）５０μl；Ample
x Red ２μl（200μl DMSO中１mg）；およびペルオキシダーゼ２μl（5000Ｕ／m
l）。ＡＰＡＯ酵素は、E. coliでのＧＳＴ融合として生産され、グルタチオンア
フィニテイカラムで精製し、そしてトロンビンで開裂してＧＳＴを除去した組換
え酵素であった。全成分を室温で混合した。初速度は吸光度単位／秒により１分
間にわたって５７２ｎｍで分光光度計で測定した（BLANK）。７０μl／mlでＡＰ
ＡＯの１０μlを加え、混合した。初速度を同じく吸光度単位／秒により１分間
にわたって５７２ｎｍで測定した（ＳＡＭＰＬＥ）。速度を吸光度単位／分に換
算した。ＢＬＡＮＫ値をＳＡＭＰＬＥ値から差引した。吸光度単位をμM Ｈ2Ｏ2 に換算した。ここで、１μM Ｈ2Ｏ2はｐＨ ８.０で０.１３８吸光度単位に等し
い。
【０２０５】
【表７】
【０２０６】 ＡＰＡＯのための基質でないもの（時間、ｐＨ、温度および基質濃度の同様な
条件下でＡＰ １に関してＡＰＡＯによる過酸化水素への変換率１％未満になる
化合物を定義する）：２−フェニルエチルアミン、スペルミジン、ＥＤＴＡ−Ｎ
ａ2、トリプタミン、プトレッシン、ベンズアミジン、セロトニン、カダベリン
、Ｐｅｆａｂｌｏｃ ＳＣ、チラミン、１,３−ジアミノプロパン、ロイペプチン
、ヒスタミン、ヒドロキシルアミン、アプロチニン、デプレニル、フルモニシン
Ｃ４、イソニアジド、スフィンゴシン、フェネルジン、スフィンガニン、フィト
スフィンゴシン、Ｄ−アラニン、ＤＬ−アラニン、Ｌ−アルギン、Ｌ−アスパラ
ギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｄ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタ
ミン、Ｌ−グルタミン酸、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−
ロイシン、Ｌ−リジン、ＤＬ−リジン、Ｌ−メチオニン、ＤＬ−メチオニン、Ｌ
−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ
−チロシン、Ｌ−バリン。
【０２０７】 実施例１５ ＡＰＡＯからのグリコシル化部位の除去 非相同性シグナルペプチドと融合することにより分泌のために処理すると、い
くつかのサイトゾル酵素は、自然情況下では普通グリコシル化されない一つまた
は二つ以上の潜在的グリコシル化部位でのグリコシル化に因り機能を欠除してい
る（アミノ酸共通配列 N-X-S／T）（Farrell LB, Beachy RN, Plant Mol Biol 1
5 (6): 821-5 (1990)）。ＡＰＡＯは認識可能なシグナル配列を欠除しているの
で、Exophiala spiniferaでの細胞質として局在化することができるが、シグナ
ルペプチドを包含しない何らかのその他の方法による分泌は除外することができ
ない。ＡＰＡＯは二つの潜在的グリコシル化部位を含有し、これらの部位は、Ａ
ＰＡＯが植物またはその他の真核生物細胞中で分泌されるときに、潜在的にグリ
コシル化され得る。これらのグリコシル化部位は標準プロトコール（例えば、CL
ONTECH Laboratories, Inc. Cpalo Alto, CA）から入手可能なキットを用いて部
位特異的突然変異誘発によるタンパク質機能に影響を及ぼすことなく除去するこ
とができる。
【０２０８】 SEQ ID NO：３３は、ＡＰＡＯの二つのアミノ酸を部位特異的突然変異誘発に
よって変化させて二つの潜在的グリコシル化部位を除去したＧＳＴ：ＡＰＡＯア
ミノ酸配列を示す。SEQ ID NO：３３のポリヌクレオチド配列は、SEQ ID NO：３
２にみることができる。最初の変異はＡＰＡＯのアミノ酸２０１でのアスパラギ
ンをセリンに変え、また第二の変更はＡＰＡＯのアミノ酸２０６でのセリンをア
スパラギンに変えるものである。ＡＰＡＯのアミノ酸２００、２０１、２０２、
２０３、２０４、２０５、２０６または２０７のいずれか、またはこれらの組合
わせでのその他の変異もまた処理してグリコシル化シグナルの除去を達成できる
（Mellquist, J. L. Kasturi, L., Spitalnik, S. L. および Shakin-Eshelmon,
S. H., 1988, Asn-X-Ser／Thr配列によるアミノ酸はｎ−連結コアグリコシル化
効率の重要な決定因子である。Biochemistry 37: 6833）。
【０２０９】 ＡＰＡＯに対してその他の修飾を施して植物系でのその発現を改善することが
でき、タンパク質がアポプラストへの送達のために内膜系に分泌されるときに適
切なフォールディング（折りたたみ）に有害となり得る選択されたシステイン残
基を除去するための部位特異的突然変異誘発を包含している。システインは残基
６４、１０９、１６７、２９２、３５１、３５９、３８７、４６１および４８２
に存在し、そして成熟、折りたたみＡＰＡＯでのジスルフィド架橋に関与してい
るか、またはしていない。部位特異的変異誘発の標準方法を用いて、これらの残
基の一つまたは二つ以上をアラニンまたはその他の適当なアミノ酸で置換するこ
とができ、これによってその活性および特異性を保持しているが、細胞外情況下
に一層良好な活性および安定性を示すＡＰＡＯの修飾バージョンが得られる。Ａ
ＰＡＯタンパク質へのＦＡＤ部分の共有結合による結合には一つまたは二つ以上
のシステインが関与する可能性があり、そしてこのシステインの除去が活性を低
減または喪失させることが予期される。
【０２１０】 本明細書中の刊行物および特許出願はいずれも本発明が係る当業者のレベルを
指示しているものである。刊行物および特許出願はいずれもが、それぞれの各々
の刊行物または特許出願が参照により具体的かつ個別に指示されているのと同じ
範囲で、参照により本明細書中に組み入れる。
【０２１１】 本発明を様々な具体的、かつ好適な実施様態および技術に関して記述している
。しかしながら、本発明の精神および範囲に留まっている限り、数多くの変化お
よび変形をなしえることは明らかである。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１３年４月１１日（２００１．４．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 1/21 9/02 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/26 9/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/26 5/00 Ａ Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 オズウァルド・アール・クラースタ アメリカ合衆国コネティカット州06405． ブランフォード．フローレンスロード95− ２シー (72)発明者 ジョン・デューヴィック アメリカ合衆国アイオワ州50310．デモイ ン．サーティエイトスストリート1707 (72)発明者 オットー・フォールカーツ アメリカ合衆国コネティカット州06437． ギルフォード．アロウヘッドドライブ29 (72)発明者 ジェイコブ・ティー・ギリアム アメリカ合衆国アイオワ州50211．ノーウ ォーク．メドウドライブ1004 (72)発明者 ジョイス・アール・マドックス アメリカ合衆国アイオワ州50310．デモイ ン．シャーウッドドライブ2510

Claims (41)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＡＰＡＯ酸素をコードしている単離されたポリヌクレオチド
    配列。
  2. 【請求項２】 （ａ） SEQ ID NO：６、１１、２３および３３から選択さ
    れるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド； （ｂ） SEQ ID NO：５、１０、２２および３２から選択されるポリペプチド
    の少くとも２０の隣接塩基からなるポリヌクレオチド； （ｃ） SEQ ID NO：５、１０、２２および３２から選択されるポリペプチド
    に対して少くとも５０％の配列同一性を有するポリヌクレオチド； （ｄ） SEQ ID NO：５、１０、２２および３２から選択されるポリヌクレオ
    チドに対して低緊縮条件にハイブリッド形成する長さの少くとも２０のヌクレオ
    チドからなるポリヌクレオチド； （ｅ） SEQ ID NO.：５、７、１０、２２および３２から選択されるポリヌク
    レオチドからなるポリヌクレオチド；および （ｆ） （ａ）〜（ｅ）のポリヌクレオチドに相補的なポリヌクレオチド から選択される一員からなる単離された核酸。
  3. 【請求項３】 請求項２記載の一員からなる組換え発現カセット。
  4. 【請求項４】 請求項３記載の組換え発現カセットからなるベクター。
  5. 【請求項５】 請求項３記載の組換え発現カセットからなる宿主細胞。
  6. 【請求項６】 細胞が植物細胞である請求項５記載の宿主細胞。
  7. 【請求項７】 請求項２記載のポリヌクレオチドからなる形質転換植物細胞
    。
  8. 【請求項８】 植物細胞がとうもろこし、きび、小麦、トマト、大豆、むら
    さきうまごやし、ひまわり、カノラ、綿およびイネである請求項７記載の形質転
    換植物。
  9. 【請求項９】 請求項２記載のポリヌクレオチドからなる植物。
  10. 【請求項１０】 請求項９記載の植物からの種子。
  11. 【請求項１１】 （ａ） SEQ ID NO：６、１１、２３および３３から選択
    されるポリペプチドの少くとも２５の隣接アミノ酸からなるポリペプチド； （ｂ） SEQ ID NO：６、１１、２３および３３から選択されるポリペプチド
    に対して少くとも５５％の配列同一性を有するポリペプチド； （ｃ） 請求項２記載の核酸がコードされたポリペプチド； （ｄ） SEQ ID NO：６、１１、２３および３３から選択されるポリペプチド
    を特徴とするポリペプチド；および （ｅ） SEQ ID NO：６、１１、２３および３３から選択されるポリペプチド
    の同類変性変異型 から選択される一員からなる単離ポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 フモニシンエステラーゼ遺伝子に融合された請求項２に記
    載のポリヌクレオチドからなる単離されたポリヌクレオチド。
  13. 【請求項１３】 フモニシンエステラーゼ遺伝子がＥＳＰ １である請求項
    １２記載のポリヌクレオチド。
  14. 【請求項１４】 ポリヌクレオチドがSEQ ID NO：２４に記載されている請
    求項１３記載のポリヌクレオチド。
  15. 【請求項１５】 フモニシンエステラーゼ遺伝子がＢＥＳＴ １である請求
    項１２記載のポリヌクレオチド。
  16. 【請求項１６】 ポリヌクレオチドがSEQ ID NO：２６に記載されている請
    求項１５記載のポリヌクレオチド。
  17. 【請求項１７】 植物シグナル配列に融合された請求項２記載のポリヌクレ
    オチドからなる単離されたポリヌクレオチド。
  18. 【請求項１８】 植物シグナル配列がアポプラストターゲッティング配列で
    ある請求項１７記載のポリヌクレオチド。
  19. 【請求項１９】 植物シグナル配列がペルオキシソームターゲッティング配
    列である請求項１７記載のポリヌクレオチド。
  20. 【請求項２０】 （ａ） プロモーターに使用可能なように結合されたポリ
    ヌクレオチドをコードしているフモニシンエステラーゼおよびプロモーターに使
    用可能なように結合された請求項２記載のポリヌクレオチドからなるベクターで
    植物細胞を形質転換し； （ｂ） 植物成長条件下に植物細胞を増殖させ；そして （ｃ） 前記ポリヌクレオチドの発現をフモニシンエステラーゼおよびＡＰＡ
    Ｏ酵素の量が菌類を抑制し得るレベルに蓄積するのに十分な時間誘発させる ことからなる、フモニシンまたは構造関連マイコトキシン産生菌の病原性を低減
    する方法。
  21. 【請求項２１】 （ａ） プロモーターに使用可能なように結合された請求
    項２記載のポリヌクレオチドからなるベクターで植物細胞を形質転換し； （ｂ） 植物成長条件下に植物細胞を増殖させ；そして （ｃ） 前記ポリヌクレオチドの発現をフモニシンエステラーゼおよびＡＰＡ
    Ｏ酵素の量が菌類を抑制し得るレベルに蓄積するのに十分な時間誘発させる ことからなる、フモニシンまたは構造関連マイコトキシン産生菌の病原性を低減
    する方法。
  22. 【請求項２２】 （ａ） プロモーターに使用可能なように結合されたフモ
    ニシンエステラーゼポリヌクレオチドからなるベクターで植物細胞を形質転換し
    ； （ｂ） プロモーターに使用可能なように結合された請求項２記載のポリヌク
    レオチドからなるベクターで植物細胞を形質転換し； （ｃ） 植物成長条件下に（ａ）および（ｂ）からの植物細胞を増殖させてフ
    モニシンエステラーゼポリヌクレオチドを含有する植物ＡおよびＡＰＡＯポリヌ
    クレオチドを含有する植物Ｂを生産し；そして （ｄ） 植物Ａと植物Ｂとを交雑してフモニシンエステラーゼおよびＡＰＡＯ
    酵素の両者を発現する後代を発生させる ことからなる、フモニシンまたは構造関連マイコトキシン産生菌の病原性を低減
    する方法。
  23. 【請求項２３】 マイコトキシンを請求項１１記載のポリペプチドと反応さ
    せることからなる、フモニシン、フモニシン分解産物、構造関連マイコトキシン
    または構造関連マイコトキシンの分解産物を分解する方法。
  24. 【請求項２４】 フモニシンまたは構造関連マイコトキシンが収穫した穀粒
    中に存在している請求項２３記載の方法。
  25. 【請求項２５】 分解が収穫した穀粒の加工処理中に生じる請求項２３記載
    の方法。
  26. 【請求項２６】 分解が動物飼料として使用する加工処理穀粒で生じる請求
    項２３記載の方法。
  27. 【請求項２７】 分解がサイレージで生じる請求項２３記載の方法。
  28. 【請求項２８】 マイコトキシンを請求項１１記載のポリペプチドおよびフ
    モニシンエステラーズと反応させることからなる、フモニシン、フモニシン分解
    産物、構造関連マイコトキシンまたは構造関連マイコトキシンの分解産物を分解
    する方法。
  29. 【請求項２９】 フモニシンまたは構造関連マイコトキシンが収穫した穀粒
    中に存在している請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 分解が収穫した穀粒の加工処理中に生じる請求項２８記載
    の方法。
  31. 【請求項３１】 分解が動物飼料として使用する加工処理穀粒で生じる請求
    項２８記載の方法。
  32. 【請求項３２】 分解がサイレージで生じる請求項２８記載の方法。
  33. 【請求項３３】 （ａ） 請求項２記載の核酸を組換え処理した細胞で発現
    させ；そして （ｂ） 酵素を精製する 工程からなるＡＰＡＯ酵素の製造方法。
  34. 【請求項３４】 （ａ） 植物中で請求項２記載の核酸を発現させ；そして （ｂ） 植物種子またはその他の植物部分から酵素を精製する 工程からなるＡＰＡＯ酵素の製造方法。
  35. 【請求項３５】 （ａ） 上流転写開始配列および細胞中の酵素の発現を生
    じる下流ポリアデニル化配列に使用可能なように結合された請求項２記載のポリ
    ペプチドを包含する発現カセットの少くとも一つのコピーを培養物中の選択され
    た標的植物の細胞または組織に導入し； （Ｂ） 培土中にＡＰ １または植物毒性類似体を導入し；そして （ｃ） 培養物中の生存細胞として形質転換された細胞を同定する 工程からなる形質転換された植物細胞を同定する方法。
  36. 【請求項３６】 フモニシンまたは構造関連毒素を検出する方法において、 （ａ） フモニシンまたは構造関連毒素を含む試料にＡＰＡＯ酵素を加え； （ｂ） トキシンが２−ＯＰに変換されるまで反応を進行させ；そして （ｃ） 生成した過酸化水素を検出する ことからなる上記の方法。
  37. 【請求項３７】 ＡＰＡＯ酵素がSEQ ID NO：６、１１、２３および３３か
    ら選択される請求項３６記載の方法。
  38. 【請求項３８】 試料にフモニシンエステラーゼをも添加する請求項３６記
    載の方法。
  39. 【請求項３９】 フモニシンまたは構造関連毒素を検出する方法において、 （ａ） フモニシンまたは構造関連毒素を含む試料にＡＰＡＯ酵素を加え； （ｂ） トキシンが２−ＯＰに変換されるまで反応を進行させ；そして （ｃ） 生成したアンモニアを検出する ことからなる上記の方法。
  40. 【請求項４０】 ＡＰＡＯ酵素がSEQ ID NO：６およびSEQ ID NO：２３から
    選択される請求項３９記載の方法。
  41. 【請求項４１】 試料にフモニシンエステラーゼをも添加する請求項３９記
    載の方法。
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