MX2008012443A

MX2008012443A - Genes de maiz para controlar el crecimiento y tamaño de organos en plantas y su uso en la mejora de plantas de cultivo.

Info

Publication number: MX2008012443A
Application number: MX2008012443A
Authority: MX
Inventors: Carl R Simmons; Wesley Bruce; Mei Guo; Rajeev Gupta
Original assignee: Pioneer Hi Bred Int
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2008-10-10
Also published as: US20140041081A1; CN101484465A; BRPI0709801B1; US7550575B2; US8575422B2; US20170037424A1; US20100293670A1; EP2004679A2; WO2007115064A3; US9518266B2; BRPI0709801A2; WO2007115064A2; CA2647718A1; US20070234443A1; AR060217A1; CA2647718C; US20090222954A1; US7834240B2

Abstract

Polinucleótidos y polipéptidos relacionados de la familia de genes ZmARGOS. La invención provee secuencias genómicas para los genes ZmARGOS. ZmARGOS es responsable del control del crecimiento vegetal, del tamaño de los órganos y del rendimiento en plantas de cultivo.

Description

GENES DE MAÍZ PARA CONTROLAR EL CRECIMIENTO Y TAMAÑO DE ÓRGANOS EN PLANTAS Y SU USO EN LA MEJORA DE PLANTAS DE CULTIVO REFERENCIAS Esta solicitud de utilidad reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de los EE.UU. N° 60/788.123, presentada el 31 de marzo, 2006, que se incorpora en la presente a modo de referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona en general con el campo de la biología molecular.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La domesticación de muchas plantas se ha correlacionado con incrementos drásticos en el rendimiento. La mayor parte de las variaciones fenotipicas que se observan en las poblaciones naturales son continuas y se ven afectadas por múltiples influencias genéticas. La identificación de los genes específicos responsables de las diferencias drásticas en el rendimiento de las plantas domesticadas se ha convertido en un objetivo importante de la investigación agrícola.

En Arabidopsis, hay una familia de genes asociados con los cambios en las plantas que se relacionan con un mayor rendimiento de los cultivos, el Gen Regulado por yAuxina relacionado con el Tamaño de Órganos (ARGOS) que es inducible por auxina. Este gen es responsable de regular la proliferación celular y el crecimiento de órganos. El gen ARGOS de Arabidopsis se expresa naturalmente a niveles bajos en diversos tejidos jóvenes incluyendo raíces, tallos de inflorescencia, flores, hojas y hojas de roseta y vainas jóvenes, pero no es detectable en las hojas maduras. Según estudios de Hu, et al. (2003 Plant Cell 15:1951-61) y Hu, et al. (2006 The Plant Journal 47(1):1-9), las plantas transgénicas que sobreexpresan ectópicamente ADNc orientado en el sentido del marco de lectura o antisentido de ARGOS presentan órganos aéreos agrandados o reducidos, respectivamente. Se demuestra que la alteración del tamaño de órganos en estas plantas está asociada con cambios en el número de células y no en el tamaño celular. El mayor número de células es atribuido a la duración del crecimiento de órganos en Arabidopsis.

La presente invención incluye la identificación de genes ARGOS putativos de maíz, ZmARGOS 1-9 (SEQ ID N°: 1, 3, 5, 40-45 y 71) que están relacionados con los genes ARGOS de Arabidopsis (SEQ ID N°: 59, 60 y 61). El ortólogo que tiene la mayor similitud con ARGOS de Arabidopsis (SEQ ID N°: 59), es ZmARGOS 1 (SEQ ID N°: 1). La expresión de ZmARGOSI y 2 (SEQ ID N°:1 y 3) en maíz se observaba primariamente en las raíces, endosperma temprano, mazorcas y brotes inmaduros y meristemas de inflorescencia de espigas. La expresión está asociada con tejidos en crecimiento activo y se observa en menor grado en los tejidos maduros. Este hallazgo es coherente con el efecto positivo observado del gen sobre la regulación del crecimiento y proliferación celular. El gen ZmARGOS 3 (SEQ ID N°: 5) se expresa en un amplio espectro de tejidos y etapas del desarrollo.

Las plantas transgénicas que expresan ZmARGOSI (SEQ ID N°: 1) muestran un impacto positivo sobre la acumulación de biomasa y el índice de crecimiento de plantas de maíz, así como un incremento en el tamaño de los órganos. Estos genes de maíz serán de utilidad para mejorar las características agronómicas en maíz (y otros cultivos).

La presente invención también incluye la identificación de genes ARGOS en otras especies vegetales. La familia de genes de arroz está representada por 8 miembros de la familia. Se encontraron nueve miembros de la familia de genes en Sorghum bicolor. También se encontraron cinco secuencias de genes en Soja (Glycine max). En la presente, se describen tres miembros de la familia de genes ARGOS de Arabidopsis.

BREVE COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Se proveen composiciones y métodos para controlar el crecimiento y el tamaño de órganos en plantas con el fin de incrementar el rendimiento en una planta. Las composiciones incluyen secuencias ARGOS de maíz, soja, Arabidopsis, arroz y sorgo. Las composiciones de la invención comprenden secuencias de aminoácidos y secuencias de nucleótidos seleccionadas entre las SEQ ID N°: 1-37, 40-71, así como variantes y fragmentos de los mismos.

Los polinucleótidos que codifican las secuencias ARGOS se proveen en construcciones de ADN para su expresión en la planta de interés. Asimismo, se proveen casetes de expresión, plantas, células vegetales, partes de plantas y semillas que comprenden las secuencias de la invención. En realizaciones específicas, el polinucleótido está ligado operativamente a un promotor constitutivo.

Se proveen métodos para modular el nivel de una secuencia ARGOS en una planta o parte de una planta. Los métodos comprenden introducir en una planta o parte de planta un polinucleótido heterólogo que comprende una secuencia ARGOS de la invención. Se puede incrementar o disminuir el nivel del polipéptido ARGOS. Dicho método se puede usar para incrementar el rendimiento en plantas; en una realización, el método se usa para incrementar el rendimiento de granos en cereales.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS Figura 1: Dendrograma que ilustra la relación entre los polipéptidos ARGOS de esta invención de diversas especies vegetales: maíz, arroz, soja, sorgo y Arabidopsis.

Figuras 2A a 2D: Alineación de las secuencias de polipéptidos de maíz, arroz, soja, sorgo y Arabidopsis donde se identifican las regiones conservadas. Las proteínas tienen una región rica en prolina bien conservada cerca del extremo C-terminal. En general, hay divergencia en los extremos N-terminales. Las proteínas son bastante cortas, varían en un rango entre 58 y 146, con un promedio de 110, aminoácidos.

Figura 3: Alineación de ZmARGOS 1, 2 y 3, con AtARGOS 1; se resaltan las áreas de consenso y las sustituciones conservadoras.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A menos que se los defina de otro modo, todos los términos científicos y técnicos usados en la presente tienen el mismo significado que le dan los especialistas en la técnica a los que concierne esta invención. A menos que se indique de otra manera, las técnicas empleadas o contempladas en la presente son metodologías estándar bien conocidas por los especialistas en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos se ofrecen solamente con fines ilustrativos y no en un sentido limitativo. La siguiente descripción se ofrece a efectos ilustrativos y no pretende limitar el alcance de la invención.

La presente invención se describirá con mayor detalle a continuación en la presente con referencia a las figuras, en los que se ilustran algunas, pero no todas, las realizaciones de la invención. Más aún, estas invenciones pueden realizarse de formas muy diferentes y no deben interpretarse como limitadas a las realizaciones presentadas en la presente; por el contrario, estas realizaciones se proporcionan con el objeto de que esta descripción cumpla con los requisitos legales aplicables. Los números iguales se refieren a los mismos elementos en todas las figuras.

Los especialistas en la técnica podrán concebir muchas modificaciones y otras realizaciones para la invención descrita en la presente, sobre la base de las enseñanzas presentadas en las descripciones precedentes y las figuras asociadas. Por consiguiente, se comprenderá que la invención no se limita a las realizaciones específicas descritas, y que estas modificaciones y realizaciones adicionales se consideran incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque aquí se emplean términos específicos, se utilizan solamente en un sentido genérico y descriptivo y no en un sentido limitativo.

A menos que se indique lo contrario, la práctica de la presente invención empleará técnicas convencionales de botánica, microbiología, cultivo de tejidos, biología molecular, química, bioquímica y tecnología de ADN recombinante, que son conocidos por los especialistas en la técnica. Estos procedimientos se explican con mayor detalle en la literatura. Véanse, por ejemplo, Langenheim y Thimann, BOTANY: PLANT BIOLOGY AND ITS RELATION TO HUMAN AFFAIRS, John Wiley (1982); CELL CULTURE AND SOMATIC CELL GENETICS OF PLANTAS, vol. 1, Vasil, editor (1984); Stanier et al., THE MICROBIAL WORLD, 5a edición, Prentice-Hall (1986); D ringra y Sinclair, BASIC PLANT PATHOLOGY METHODS, CRC Press (1985); Maniatis et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, vols. I y II, Glover, ed. (1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS, Gait, ed. (1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, Hames y Higgins, eds. (1984); y la serie de METHODS IN ENZYMOLOGY, Colowick y Kaplan, eds, Academic Press, Inc., San Diego, CA.

Las unidades, los prefijos y los símbolos pueden indicarse en su forma aceptada por el SI. A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha y en orientación 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha y en orientación amino a carboxilo, respectivamente. Los rangos numéricos incluyen los números que definen el rango. En la presente, los aminoácidos se indican de acuerdo con los símbolos de tres letras comúnmente conocidos, o de acuerdo con los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de IUPAC-IUB. Del mismo modo, los nucleótidos se pueden indicar de acuerdo con sus códigos de una letra comúnmente conocidos. Los términos definidos más adelante se definen con mayor detalla con referencia a la memoria descriptiva como un todo.

Para describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos y sus definiciones son las que se indican a continuación.

Un "microbio" significa cualquier microorganismo (incluyendo microorganismos procariotas y eucariotas), tales como hongos, levaduras, bacterias, actinomicetes, algas y protozoos, así como otras estructuras unicelulares.

La "amplificación" se refiere a la construcción de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico o de múltiples copias complementarias de la secuencia de ácido nucleico, usando al menos una de las secuencias de ácidos nucleicos como templado. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), el sistema de reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), los sistemas de replicasas Q-Beta, el sistema de amplificación basado en transcripción (TAS) y la amplificación por desplazamiento de cadenas (SDA). Véase, por ejemplo, DIAGNOSTIC MOLECULAR MICROBIOLOGY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Persing et al., editores, American Society for Microbiology, Washington, DC (1993). El producto de la amplificación se denomina amplicón.

El término "variantes modificadas en forma conservadora" se aplica a secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos. Con respecto a secuencias de ácidos nucleicos particulares, las variantes modificadas en forma conservadora indican aquellos ácidos nucleicos que codifican variantes de las secuencias de aminoácidos idénticas o modificadas en forma conservadora. Debido a la degeneración del código genético, una gran cantidad de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos puede codificar cualquier proteína dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU codifican todos el aminoácido alanina. Por consiguiente, en cualquier posición donde un codón especifica una alanina, puede cambiarse dicho codón por cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Estas variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones silenciosas" y representan una especie de variación modificada en forma conservadora. En la presente, cada secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido también describe cualquier variación silenciosa posible del ácido nucleico. Los especialistas en la técnica comprenderán que se puede modificar cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es comúnmente el codón de metionina; una excepción es Micrococcus rubens, para el cual GTG es el codón de metionina (Ishizuka et al., (1993) J. Gen. Microbio!. 139:425-32) para obtener una molécula idéntica desde el punto de vista funcional. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención está implícita en cada secuencia de polipéptido descrita y se incorpora en la presente a modo de referencia.

En lo que respecta a las secuencias de aminoácidos, los especialistas en la técnica comprenderán que las sustituciones, supresiones o adiciones individuales a una secuencia de ácido nucleico, péptido, polipéptido o proteína que alteren, agreguen o eliminen un único aminoácido o un porcentaje pequeño de los aminoácidos en la secuencia codificada serán "variantes modificadas en forma conservadora" cuando la alteración resulte en la sustitución de un aminoácido por un aminoácido químicamente similar. Por lo tanto, de esta manera es posible alterar cualquier número de residuos de aminoácidos seleccionados del grupo de números enteros que comprenden entre 1 y 15. Así, se pueden efectuar, por ejemplo, 1 , 2, 3, 4, 5, 7 ó 10 alteraciones. Las variantes modificadas en forma conservadora presentan típicamente una actividad biológica similar a la de la secuencia de polipéptidos no modificada de la cual derivan. Por ejemplo, la especificidad por el sustrato, la actividad enzimática o la unión a ligandos/receptores es generalmente al menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o 90%, preferentemente 60-90% del valor correspondiente a la proteína nativa por su sustrato nativo. En la técnica son bien conocidas las tablas de sustituciones conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares.

Los siguientes seis grupos contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras entre sí: 1) Alanína (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Usina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

Véase también, Creighton, PROTEINS, W. H. Freeman y Co. (1984).

Tal como se utiliza en la presente, "que consiste esencialmente de" se refiere a la inclusión de secuencias adicionales en un polinucleótido objeto, donde las secuencias adicionales no se hibridizan selectivamente, bajo condiciones de hibridación severas, con el mismo ADNc que el polinucleótido y donde las condiciones de hibridación incluyen un paso de lavado en SSC 0,1X y dodeciisulfato de sodio 0,1% a 65°C.

Los términos "que codifica" o "codificado", respecto de un ácido nucleico específico, indica que éste comprende información para la traducción en una proteína específica. Un ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, ¡ntrones) dentro de regiones traducidas del ácido nucleico, o puede carecer de dichas secuencias no traducidas (por ejemplo, como en el ADNc). La información por la cual está codificada una proteína está especificada por el uso de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos está codificada por el ácido nucleico usando el código genético "universal". Sin embargo, se podrán usar variantes del código genético universal, tales como aquellas presentes en algunas mitocondrias de plantas, animales y fúngicas, la bacteria Mycoplasma capricolum (Yamao et al., (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 82:2306-9) o el ciliado Macronucleus, cuando se desee expresar el ácido nucleico usando estos organismos.

Cuando el ácido nucleico se prepara o se altera por medio de síntesis, se puede aprovechar la preferencia de codones conocida del huésped deseado en el que se desea expresar el ácido nucleico. Por ejemplo, aunque las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención se pueden expresar en especies de plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, es posible modificar las secuencias para adaptarlas a las preferencias de codones y las preferencias de contenido de GC específicas de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, ya que se ha demostrado que estas preferencias son diferentes (Murray et al., ( 989) Nucleic Acids Res. 17:477-98, incorporada en la presente a modo de referencia). Por consiguiente, el codón preferido por maíz para un aminoácido particular puede derivar de secuencias de genes conocidos de maíz. En la Tabla 4 de Murray et al., supra se enumera la utilización de codones de maíz para 28 genes de plantas de maíz.

Tal como se utiliza en la presente, el término "heterólogo", con referencia a un ácido nucleico, es un ácido nucleico que se origina a partir de una especie extraña, o, si es de la misma especie, está sustancialmente modificada en comparación con su forma nativa, en lo referente a su composición y/o locus genómico, merced a la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor ligado operativamente a un gen estructural heterólogo es de una especie diferente de la especie de la que deriva el gen estructural o, si es de la misma especie, uno o ambos están sustancialmente modificados respecto de su forma original. Una proteína heteróloga puede originarse en una especie extraña o, si es de la misma especie, está sustancialmente modificada en comparación con su forma nativa merced a la intervención humana deliberada.

Se entiende por "célula huésped" una célula que contiene un vector y que permite la replicación y/o expresión del vector de expresión. Las células huésped pueden ser células procariotas, tales como de E. coli, o células eucariotas, tales como células de levaduras, insectos, plantas, anfibios o de mamíferos. Preferentemente, las células huésped son células de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, incluyendo, en un sentido no limitativo, células de maíz, sorgo, girasol, soja, trigo, alfalfa, arroz, algodón, cañóla, cebada, mijo y tomate. Una célula huésped de una planta monocotiledónea particularmente preferida es una célula huésped de maíz.

El término "complejo de hibridación" incluye referencia a una estructura de ácido nucleico doble formada por dos secuencias de ácidos nucleicos de cadena simple que se hibrídizan selectivamente entre sí.

El término "introducido", en el contexto de la inserción de un ácido nucleico en una célula, significa "transfección" o "transformación" o "transducción", e incluye referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariota o procariota, donde el ácido nucleico puede incorporarse en el genoma de la célula (por ejemplo, en cromosomas, plásmidos, ADN de plástidos o mitocondrial), puede convertirse en un replicón autónomo o puede expresarse en forma transitoria (por ejemplo, ARNm transfectado).

El término "aislado" hace referencia a un material, tal como un ácido nucleico o una proteína, que está sustancial o esencialmente libre de los componentes que normalmente acompañan o ¡nteractúan con él, tal como se halla en su ambiente natural. El material aislado comprende opcionalmente un material que no está asociado al material en su ambiente natural. Los ácidos nucleicos "aislados", como se los define en la presente, también se conocen como ácidos nucleicos "heterólogos". A menos que se establezca lo contrario, el término "ácido nucleico ARGOS" se refiere a un ácido nucleico que comprende un polinucleotido ("polinucleotido ARGOS") que codifica un polipéptido ARGOS.

Tal como se utiliza en la presente, un "ácido nucleico" incluye referencia a un polímero de desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos con forma de cadena simple o doble y, a menos que se lo limite de otro modo, comprende análogos conocidos que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales, ya que se hibridizan con ácidos nucleicos de cadena simple de forma similar a los nucleótidos naturales (por ejemplo, ácidos nucleicos peptídicos).

Una "biblioteca de ácidos nucleicos" significa una colección de moléculas aisladas de ADN o ARN que comprende y representa sustancialmente la fracción transcripta completa del genoma de un organismo determinado. La construcción de ejemplos de bibliotecas de ácidos nucleicos, tales como bibliotecas genómicas y de ADNc, se describe en las referencias de biología molecular más comunes, tales como Berger y Kimmel, GU IDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, de la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1987); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2a edición, volúmenes 1-3 (1989); y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel et al., editores, Current Protocols, un emprendimiento conjunto entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc. (suplemento de 1994).

Tal como se utiliza en la presente, "ligado operativamente" hace referencia a una unión funcional entre una primera secuencia, tal como un promotor, y una segunda secuencia, donde la secuencia promotora inicia y media en la transcripción de la secuencia de ADN que corresponde a la segunda secuencia. En general, ligado operativamente significa que las secuencias de ácido nucleico ligadas son contiguas y, cuando fuera necesario unir dos regiones codificadoras de proteínas contiguas, están en el mismo marco de lectura.

Tal como se utiliza en la presente, el término "planta" hace referencia a plantas completas, órganos vegetales (por ejemplo, hojas, tallos, raíces, etc.), semillas y células vegetales, y la progenie de éstas. Las células vegetales, como se las usa en la presente, incluyen, en un sentido no limitativo, semillas, cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callos, hojas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas. La clase de plantas, que se puede emplear en los métodos de la invención, generalmente es tan amplia como la clase de plantas superiores que se puede usar en las técnicas de transformación, incluyendo tanto plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas, incluyendo las especies de los siguientes géneros: Cucúrbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifoiium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Avena, Hordeum, Sécale, Allium y Triticum. Una planta particularmente preferida es Zea mays.

Tal como se utiliza en la presente, el término "rendimiento" hace referencia a bushels por acre de granos de cultivo en el momento de la cosecha, ajustado para la humedad de los granos (típicamente un 15%). Se mide la humedad de los granos en el momento de la cosecha. Se determina el peso de prueba ajustado del grano como el peso en libras por bushel, ajustado de acuerdo con el nivel de humedad de los granos en el momento de la cosecha.

Tal como se utiliza en la presente, un "polinucleótido" hace referencia a desoxirribopolinucleótidos, ribopolinucleótidos, o análogos de los mismos que tienen la naturaleza esencial de un ribonucleótido natural, por cuanto se hibridizan, bajo condiciones de hibridación severas, sustancialmente con la misma secuencia de nucleótidos que los nucleótidos naturales y/o permiten la traducción de los mismos aminoácidos que los nucleótidos naturales. Un polinucleótido puede ser de longitud completa o puede ser una subsecuencia de un gen estructural o regulador nativo o heterólogo. A menos que se indique lo contrario, el término hace referencia a la secuencia especificada, así como a la secuencia complementaria de la misma. Por consiguiente, los ADN o los ARN con esqueletos modificados por razones de estabilidad o por otros motivos son "polinucleótidos", de acuerdo con la interpretación que se da al término en la presente. Más aún, los ADN o ARN que comprenden bases poco comunes, tal como inosina, o bases modificadas, tal como bases tritiladas, para nombrar solamente dos ejemplos, son polinucleótidos según el significado de dicho término en la presente. Se apreciará que se ha efectuado una gran variedad de modificaciones al ADN y el ARN para que sirvan para muchos propósitos útiles conocidos por los especialistas en la técnica. El término polinucleótido, tal como se utiliza en la presente, comprende formas de polinucleótidos modificadas por medios químicos, enzimáticos o metabólicos, así como las formas químicas de ADN y ARN características de virus y células, incluyendo, entre otras, células simples y complejas.

Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente en la presente para designar polímeros de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a los polímeros de aminoácidos en que uno o más de los residuos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido natural correspondiente, así como polímeros de aminoácidos naturales.

Tal como se utiliza en la presente, un "promotor" hace referencia a una región de ADN 5' con respecto al inicio de la transcripción y que participa en el reconocimiento y la unión de la ARN polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor vegetal" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células vegetales. Los ejemplos de promotores vegetales incluyen, en un sentido no limitativo, aquellos que pueden obtenerse a partir de plantas, virus de plantas y bacterias que comprenden genes que se expresan en células vegetales, tales como Agrobacterium o Rhizobium . Los ejemplos comprenden promotores que inician la transcripción preferencialmente en determinados tejidos, tales como hojas, raíces, semillas, fibras, vasos del xilemas, traqueidas o esclerénquima. Estos promotores se conocen como promotores "con preferencia por tejidos". Un promotor específico para un "tipo celular" dirige primariamente la expresión en determinados tipos de células en uno o más órganos, por ejemplo, las células vasculares en las raíces o las hojas. Un promotor "inducible" o "regulable" es un promotor que está bajo el control del ambiente. Los ejemplos de condiciones ambientales que pueden efectuar una transcripción por promotores inducibles incluyen condiciones anaeróbicas o la presencia de luz. Otro tipo de promotor es un promotor regulado por el desarrollo, por ejemplo, un promotor que dirige la expresión durante el desarrollo del polen. Los promotores con preferencia por tejidos, específicos para tipos celulares, regulados por el desarrollo e inducibles constituyen la clase de los promotores "no constitutivos". Un promotor "constitutivo" es un promotor que está activo bajo la mayor parte de las condiciones ambientales.

El término "polipéptido ARGOS" hace referencia a una o más secuencias de aminoácidos. El término también incluye fragmentos, variantes, homólogos, alelos o precursores (por ejemplo, preproproteínas o proproteínas) de éstos. Una "proteína ARGOS" comprende un polipéptido ARGOS. A menos que se establezca lo contrario, el término "ácido nucleico ARGOS" se refiere a un ácido nucleico que comprende un polinucleótido ("polinucleótido ARGOS") que codifica un polipéptido ARGOS.

Tal como se utiliza en la presente, "recombinante" hace referencia a una célula o un vector que ha sido modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo, o indica que la célula deriva de una célula modificada de este modo. Entonces, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran de manera idéntica en la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos de una forma anormal, los expresan a niveles inferiores o no los expresan en absoluto, como resultado de la intervención humana deliberada. El término "recombinante", tal como se utiliza en la presente, no comprende la alteración de la célula o el vector por sucesos naturales (por ejemplo, mutación espontánea, transformación/transducción/transposición natural), tales como aquellos que ocurren sin una intervención humana deliberada.

Tal como se utiliza en la presente, un "cásete de expresión recombinante" es una construcción de ácidos nucleicos generada en forma recombinante o sintética con una serie de elementos de ácidos nucleicos específicos, que permite la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula blanco. El cásete de expresión recombinante se puede incorporar en un plásmido, cromosoma, ADN mitocondrial , ADN de plástido, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción del cásete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, un ácido nucleico a transcribir y un promotor.

Los términos "residuo", "residuo de aminoácido" o "aminoácido" se usan indistintamente en la presente para designar un aminoácido que está incorporado en una proteína, un polipéptido o un péptido (denominados colectivamente "proteínas"). El aminoácido puede ser un aminoácido natural, y a menos que se lo limite de otro modo, puede comprender análogos conocidos de aminoácidos naturales que funcionan de forma similar a los aminoácidos naturales.

El término "hibridación selectiva" hace referencia a una hibridación, bajo condiciones de hibridación severas, de una secuencia de ácido nucleico con una secuencia de ácido nucleico blanco específica, con un grado detectablemente mayor (por ejemplo, al menos 2 veces respecto del fondo) que su hibridación con secuencias de ácidos nucleicos distintas del blanco, y con la exclusión sustancial de los ácidos nucleicos distintos del blanco. Las secuencias que se hibridizan en forma selectiva típicamente tienen aproximadamente al menos 40% de identidad de secuencia, preferentemente 60-90% de identidad de secuencia y más preferentemente 100% de identidad de secuencia (es decir, son complementarias) entre sí.

Los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" hacen referencia a condiciones bajo las cuales una sonda se hibridiza con su secuencia blanco, con un grado detectablemente mayor que con otras secuencias (por ejemplo, al menos 2 veces respecto del fondo). Las condiciones severas dependen de la secuencia y difieren bajo distintas circunstancias. El control de la severidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, permite identificar secuencias blanco que son 100% complementarias de la sonda (análisis son sondas homologas). Como alternativa, se pueden ajustar las condiciones de severidad para permitir un cierto grado de falta de coincidencia entre las secuencias, con el fin de detectar grados de similitud menores (análisis con sondas heterólogas). Preferentemente, la sonda tiene aproximadamente 500 nucleótidos de longitud, pero puede presentar una gran variación en su extensión, entre menos de 500 nucleótidos hasta la extensión completa de la secuencia blanco.

Típicamente, las condiciones severas son aquellas en las que la concentración de sal es menor que aproximadamente 1,5 M de iones de Na, típicamente una concentración de entre aproximadamente 0,01 y 1 ,0 M de iones de Na (o de otras sales), a un pH de entre 7,0 y 8,3, donde la temperatura es de al menos aproximadamente 30°C para sondas cortas (por ejemplo, de entre 10 y 50 nucleótidos) y al menos aproximadamente 60°C para sondas largas (por ejemplo, de más de 50 nucleótidos). También se pueden lograr condiciones severas agregando agentes desestabilizantes, tales como formamida o la solución de Denhardt. Los ejemplos de condiciones de severidad baja incluyen una hibridación con una solución amortiguadora de formamida entre 30 y 35%, NaCI 1 M, SDS 1% (dodecilsulfato de sodio) a 37°C y un lavado en SSC entre 1X y 2X (SSC 20X = NaCI 3,0 M/citrato trisódico 0,3 M) a 50-55°C. Los ejemplos de condiciones de severidad moderada incluyen una hibridación en una solución que contiene formamida entre 40 y 45%, NaCI 1,0 M, SDS 1% a 37°C, y un lavado en SSC entre 0,5X y 1X a 55-60°C. Los ejemplos de condiciones de severidad alta incluyen una hibridación en formamida 50%, NaCI 1 M, SDS 1% a 37°C y un lavado final en SSC 0.1X a 60-65°C. La especificidad es típicamente una función de los lavados post-hibrídación , donde los factores críticos son la fuerza iónica y la temperatura de la solución de lavado final. Para híbridos de ADN-ADN, se puede estimar el punto de fusión térmico (Tm) empleando la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal. Biochem. 738:267-84: Tm = 81,5 °C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/I; donde M es la molaridad de los cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de guanosina y nucleotidos de citosina en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación y L es la longitud del híbrido en pares de bases. Tm es la temperatura (a una fuerza iónica y un pH específico) a la que el 50% de una secuencia blanco complementaria se hibridiza con una sonda que coincide perfectamente. La Tm se reduce en aproximadamente 1°C por cada 1% de falta de coincidencia; por lo tanto, es posible ajusfar la Tm, las condiciones de hibridación y/o el lavado para hibridizar las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con >.90% de identidad, la Tm se puede disminuir en 10°C. En general, las condiciones severas se seleccionan para que sean aproximadamente 5°C menores que el punto de fusión térmica (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una fuerza iónica y pH definidos. Sin embargo, las condiciones muy severas pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 1, 2, 3 ó 4°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones moderadamente severas pueden utilizar una hibridación y/o un lavado a 6, 7, 8, 9 ó 10°C menos que el punto de fusión térmica (Tm); las condiciones de baja severidad pueden emplear una hibridación y/o un lavado a 11, 12, 13, 14, 15 ó 20°C menos que el punto de fusión térmica (Tm). Con la ecuación, las condiciones de hibridación y lavado deseadas y la Tm deseada, los especialistas en la técnica comprenderán que se describen inherentemente variaciones en la severidad de las soluciones de hibridación y/o lavado. Si el grado de falta de coincidencia deseado da como resultado una Tm menor que 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida) se prefiere incrementar la concentración de SSC para que se pueda usar una temperatura más alta. Se puede consultar una guía extensa sobre la hibridación de ácidos nucleicos en Tijssen, LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY--HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, parte I, capítulo 2, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probé assays", Elsevier, Nueva York (1993); y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, capítulo 2, Ausubel et al., editores, Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York (1995). A menos que se establezca lo contrario, en la presente solicitud se define la severidad elevada como una hibridación en SSC 4X, solución de Denhardt 5X (5 g de Ficoll, 5 g de polivinipirrolidona, 5 g de albúmina de suero bovino en 500 mi de agua), ADN de esperma de salmón desnaturalizado 0,1 mg/ml y fosfato de Na 25 mM a 65°C, y un lavado en SSC 0.1X, SDS 0,1% a 65°C.

Tal como se utiliza en la presente, una "planta transgénica" hace referencia a una planta que comprende un polinucleótido heterólogo en su genoma. En general, el polinucleótido heterólogo se integra en forma estable en el genoma, de modo que el polinucleótido pasa a las generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede estar integrado en el genoma solo o como parte de un cásete de expresión recombinante. El término "transgénico", como se usa en la presente, abarca todas las células, líneas celulares, callos, tejidos, partes de plantas o plantas cuyo genotipo ha sido alterado por la presencia de un ácido nucleico heterólogo, incluyendo aquellos transgénicos alterados inicialmente, así como aquellos creados por medio de cruzamientos sexuales o propagación asexual a partir del transgénico inicial. El término "transgénico", tal como se utiliza en la presente, no comprende la alteración del genoma (cromosómico o extracromosómico) por métodos convencionales de cruzamiento de plantas o sucesos naturales, tales como fertilización cruzada al azar, infección por virus no recombinantes, transformación con bacterias no recombinantes, transposición no recombinante o mutación espontánea.

Tal como se utiliza en la presente, un "vector" hace referencia a un ácido nucleico usado en la transfección de una célula huésped y en el cual puede insertarse un polinucleótido. Los vectores son comúnmente replicones. Los vectores de expresión permiten la transcripción de un ácido nucleico insertado en mismo.

Se usan los siguientes términos para describir las relaciones de secuencia entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia" y (e) "identidad sustancial".

Tal como se utiliza en la presente, una "secuencia de referencia" es una secuencia definida, usada como base para realizar una comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo, un segmento o la totalidad de la secuencia de un ADNc o un gen, o la secuencia completa del ADNc o del gen.

Tal como se utiliza en la presente, una "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y especifico de una secuencia de polinucleótidos, donde la secuencia de polinucleótidos puede compararse con una secuencia de referencia y donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, faltas de coincidencia) en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para alinear ambas secuencias en forma óptima. En general, la ventana de comparación tiene al menos 20 nucleótidos contiguos de longitud, y opcionalmente puede tener 30, 40, 50, 100 o más. Los especialistas en la técnica comprenden que, para evitar una similitud elevada con una secuencia de referencia debido a la inclusión de faltas de coincidencia en la secuencia de polinucleótidos, típicamente se introduce una penalidad de falta de coincidencia y se la sustrae de la cantidad de coincidencias.

Los métodos para alinear secuencias de nucleótidos y aminoácidos con fines comparativos son bien conocidos en la técnica. Se puede usar el algoritmo de homología local (BESTFIT) de Smith y Waterman, (1981) Adv. Appl. Math 2:482, para efectuar una alineación óptima de secuencias con fines comparativos; se puede usar el algoritmo de alineación por homología (GAP) de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. (1970) 48:443-53; el método de búsqueda por similitud (Tfasta y Fasta) de Pearson y Lipman, (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 85:2444; implementaciones computarizadas de estos algoritmos, incluyendo, en un sentido no limitativo: CLUSTAL en el programa PC/Gene de Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el Paquete de Software de Wisconsin Genetics, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group (programas GCG® (Accelrys, Inc., San Diego, CA)). El programa CLUSTAL está bien descripto por Higgins y Sharp, (1988) Gene 73:237-44; Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang, et al., (1992) Computer Applications in the Biosciences 8:155-65, y Pearson, et al., (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-31. El programa preferido para efectuar una alineación global óptima de múltiples secuencias es PileUp (Feng y Doolittle, (1987) J. Mol. Evol., 25:351-60 que es similar al método descrito por Higgins y Sharp, (1989) CABIOS 5:151-53 y cuyo contenido se incorpora en la presente a modo de referencia). La familia de programas BLAST que pueden usarse para realizar búsquedas por similitud con secuencias en bases de datos incluye: BLASTN para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de nucleótidos; BLASTX para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de proteínas; BLASTP para búsquedas de secuencias de proteínas en bases de datos de secuencias de proteínas; TBLASTN para búsquedas de secuencias de proteínas en bases de datos de secuencias de nucleótidos; y TBLASTX para búsquedas de secuencias de nucleótidos en bases de datos de secuencias de nucleótidos. Véase CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Capítulo 19, Ausubel et al., editores, Greene Publishing y Wiley-lnterscience, Nueva York (1995).

GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch, supra, para hallar la alineación de dos secuencias completas que permita maximizar la cantidad de coincidencias y minimizar la cantidad de faltas de coincidencia. GAP considera todas las alineaciones posibles y todas las posiciones de falta de coincidencia, y crea una alineación con la mayor cantidad de coincidencias de bases y la menor cantidad de faltas de coincidencia. Permite proveer una penalidad por creación de faltas de coincidencia y una penalidad por extensión de faltas de coincidencia en unidades de bases coincidentes. GAP debe crear una ganancia a partir de la cantidad de coincidencias, respecto de la penalidad de creación de faltas de coincidencia, para cada falta de coincidencia que inserta. Si se selecciona una penalidad por extensión de falta de coincidencia mayor que cero, GAP debe crear además una ganancia para cada falta de coincidencia insertada, que abarca la longitud de la falta de coincidencia multiplicada por la penalidad por extensión de falta de coincidencia. Los valores predeterminados de creación de faltas de coincidencia y extensión de faltas de coincidencia en la Versión 10 del Paquete de Software Wisconsin Genetics para secuencias de proteínas son 8 y 2, respectivamente. Las penalidades de creación y extensión de faltas de coincidencia se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que comprende entre 0 y 100. Así, por ejemplo, las penalidades de creación y extensión de faltas de coincidencia pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más.

GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineaciones. Pueden existir muchos miembros de esta familia, pero ningún otro tiene mejor calidad. GAP muestra cuatro cifras de mérito para las alineaciones: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada para la alineación de las secuencias. La Relación es la Calidad dividida por la cantidad de bases en el segmento más corto. El Porcentaje de Identidad es el porcentaje de los símbolos que de hecho coinciden. El Porcentaje de Similitud es el porcentaje de símbolos que son similares. Se omiten los símbolos que están a lo largo de las faltas de coincidencia. Se evalúa una semejanza cuando el valor de la matriz de calificación para un par de símbolos es mayor o igual que 0,50, que es el umbral de semejanza. La matriz de calificación usada en la Versión 10 del paquete de software de Wisconsin Genetics GCG es BLOSUM62 (véase, Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 89:10915).

A menos que se establezca lo contrario, los valores de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente hacen referencia al valor obtenido usando el conjunto de programas BLAST 2.0 con los parámetros predeterminados (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402).

Como lo comprenderán los especialistas en la técnica, las búsquedas BLAST asumen que las proteínas pueden modelarse como secuencias aleatorias. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencia no aleatorias, que pueden ser extensiones homopoliméricas, repeticiones de período corto o regiones enriquecidas en uno o más aminoácidos. Estas regiones de baja complejidad pueden alinearse entre proteínas no relacionadas, aún cuando otras regiones de las proteínas sean muy diferentes. Se pueden emplear numerosos programas de filtro de baja complejidad para reducir estas alineaciones de baja complejidad. Por ejemplo, se puede emplear los filtros de baja complejidad SEG (Wooten y Federhen, (1993) Comput. Chem. 17:149-63) y XNU (Claverie y States, (1993) Comput. Chem. 17:191-201) solos o combinados.

Tal como se usa en la presente, la "identidad de secuencia" o la "identidad", en el contexto de dos secuencias de ácidos nucleicos o polipéptidos, hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son idénticos cuando se efectúa una alineación de correspondencia máxima para una ventana de comparación específica. Cuando se usa el porcentaje de identidad de secuencia con referencia a proteínas, se considera que las posiciones de residuos que no son idénticas comúnmente difieren en sustituciones de aminoácidos conservadoras, donde se sustituyen los residuos de aminoácidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y, por ende, no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservadoras, se puede incrementar el porcentaje de identidad de secuencia para corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Se dice que las secuencias que difieren en dichas sustituciones conservadoras presentan "similitud de secuencia" o "similitud". Los medios para realizar este ajuste son bien conocidos por los especialistas en la técnica. Típicamente, esto comprende evaluar una sustitución conservadora como una falta de coincidencia parcial, en vez de total, lo que incrementa el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, cuando a un aminoácido idéntico se le asigna un valor de 1 y a una sustitución no conservadora se le asigna un valor de cero, a una sustitución conservadora se le asigna un valor entre cero y 1. El valor de las sustituciones conservadoras se calcula, por ejemplo, de acuerdo con el algoritmo de Meyers y Miller, (1988) Computer Applic. Biol. Sci. 4:11-17, por ejemplo, como está implementado en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, EE.UU.).

Tal como se utiliza en la presente, el "porcentaje de identidad de secuencia" indica el valor determinado por medio de la comparación de dos secuencias alineadas en forma óptima a lo largo de una ventana de comparación, donde la porción de la secuencia de polinucleótidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, faltas de coincidencia), en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones), para la alineación óptima de las dos secuencias. Se calcula el porcentaje determinando la cantidad de posiciones en las cuales existe una base de ácido nucleico idéntica en ambas secuencias, de modo de obtener la cantidad de posiciones de coincidencia, dividiendo la cantidad de posiciones de coincidencia por la cantidad total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando la cantidad total de posiciones por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia.

El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene entre 50 y 100% de identidad de secuencia, preferentemente al menos 60% de identidad de secuencia, preferentemente al menos 70% de identidad de secuencia, preferentemente al menos 80%, más preferentemente al menos 90%, y con mayor preferencia al menos 95%, en comparación con una secuencia de referencia, usando uno de los programas de alineación descriptos, con los parámetros convencionales. Los especialistas en la técnica comprenderán que es posible ajustar apropiadamente estos valores para determinar la identidad correspondiente de las proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos, teniendo en cuenta la degeneración de los codones, la similitud de los aminoácidos, la localización en el marco de lectura y semejantes. La identidad sustancial de secuencias de aminoácidos para estos propósitos normalmente comprende una identidad de secuencia de entre 55 y 100%, preferentemente al menos 55%, preferentemente al menos 60%, más preferentemente al menos 70%, 80%, 90% y con mayor preferencia al menos 95%.

Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustancialmente idénticas es cuando las dos moléculas se hibridizan entre sí bajo condiciones severas. La degeneración del código genético permite muchas sustituciones de aminoácidos que conducen a una variedad en la secuencia de nucleótidos que codifica el mismo aminoácido, por lo que es posible que las secuencias de ADN codifiquen el mismo polipéptido pero no se hibridicen entre sí bajo condiciones severas. Esto es así, por ejemplo, cuando se crea una copia de un ácido nucleico usando la máxima degeneración de codones permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácidos nucleicos son sustancialmente idénticas es que el polipéptido codificado por el primer ácido nucleico presenta reactividad inmunológica cruzada con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico.

El término "identidad sustancial", en el contexto de un péptido, indica que un péptido comprende una secuencia con entre 55 y 100% de identidad de secuencia con una secuencia de referencia, preferentemente al menos 55% de identidad de secuencia, preferentemente 60%, preferentemente 70%, más preferentemente 80%, con mayor preferencia al menos 90% o 95% de identidad de secuencia con la secuencia de referencia, en una ventana de comparación específica. Preferentemente, la alineación óptima se efectúa usando el algoritmo de alineación por homología de Needleman y Wunsch, supra. Una indicación de que dos secuencias de péptidos son sustancialmente idénticas es que un péptido presenta reactividad inmunológica cruzada con anticuerpos dirigidos contra el segundo péptido. Por consiguiente, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solamente en una sustitución conservadora. Además, un péptido puede ser sustancialmente idéntico a un segundo péptido cuando difieren en una sustitución no conservadora si el epitope reconocido por el anticuerpo permanece sustancialmente idéntico. Los péptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias como las que se indicó previamente, excepto que las posiciones de los residuos que no son idénticos pueden diferir en cambios de aminoácidos conservadores.

La invención describe polinucleótidos y polipéptidos ARGOS. Los nuevos nucleótidos y proteínas de la invención tienen un patrón de expresión que indica que regulan la cantidad de células y, por consiguiente, tienen una participación importante en el desarrollo de la planta. Los polinucleótidos se expresan en diversos tejidos vegetales. De esta manera, los polinucleótidos y los polipéptidos proporcionan una oportunidad para manipular el desarrollo de la planta para alterar el desarrollo, el cronograma o la composición de las semillas y los tejidos vegetativos. Esto puede usarse para crear una planta estéril, una planta sin semillas o una planta con una composición alterada en el endosperma. Ácidos nucleicos La presente invención provee, entre otros, ácidos nucleicos aislados de ARN, ADN y análogos y/o quimeras de éstos, que comprenden un polinucleótido ARGOS.

La presente invención también incluye polinucleótidos optimizados para expresarse en distintos organismos. Por ejemplo, para expresar el polinucleótido en una planta de maíz, puede alterarse la secuencia para dar cuenta de las preferencias de codones específicas, y puede alterarse el contenido de GC de acuerdo con Murray et al, supra. En la Tabla 4 de Murray et al., supra se enumera la utilización de codones de maíz para 28 genes de plantas de maíz.

Los ácidos nucleicos ARGOS de la presente invención comprenden polinucleotidos ARGOS aislados que incluyen: (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido ARGOS, y variantes modificadas en forma conservadora y polimórficas del mismo; (b) un polinucleótido que tiene al menos 70% de identidad de secuencia con los polinucleotidos de (a) o (b); (c) secuencias complementarias de los polinucleotidos de (a) o (b).

En la siguiente tabla, Tabla 1, se enumeran las identidades específicas de los polinucleotidos y polipéptidos y que se describen en la presente.

TABLA 1 Nombre del Especie Polinucleótido/Polipé SEQ ID N°: gen vegetal ptido ZmARGOSI Zea mays Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 1 Secuencia genómica SEQ ID N°: 2 SEQ ID N°: Nombre del Especie Polinucleótido/Polipé SEQ ID N°: gen vegetal ptido 71 ZmARGOS2 Zea mays Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 3 SEQ ID N°: 4 ZmARGOS3 Zea mays Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 5 SEQ ID N°: 6 ZmARGOS4 Zea mays Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 7 SEQ ID N°: 40 ZmARGOS5 Zea mays Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 8 SEQ ID N°: 41 ZmARGOS6 Zea mays Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 9 SEQ ID N°: 42 ZmARGOS7 Zea mays Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 10 SEQ ID N°: 43 ZmARGOS8 Zea mays Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 11 SEQ ID N°: 44 ZmARGOS9 Zea mays Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 12 SEQ ID N°: 45 OsARGOSI Oryza sativa Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 13 SEQ ID N°: 46 OSARGOS2 Oryza sativa Polinucleótido SEQ ID N°: Nombre del Especie Polinucleótido/Polipé SEQ ID N°: gen vegetal ptido Polipéptido 14 SEQ ID N°: 47 OsARGOS3 Oryza sativa Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 15 SEQ ID N°: 48 OsARGOS4 Oryza sativa Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 16 SEQ ID N°: 49 OSARGOS5 Oryza sativa Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 17 SEQ ID N°: 50 OsARGOS6 Oryza sativa Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 18 SEQ ID N°: 51 OSARGOS7 Oryza sativa Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 19 SEQ ID N°: 52 OsARGOS8 Oryza sativa Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 20 SEQ ID N°: 53 GmARGOS 1 Glycine max Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 21 SEQ ID N°: 54 GmARGOS2 Glycine max Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 22 SEQ ID N°: 55 GmARGOS3 Glycine max Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 23 SEQ ID N°: Nombre del Especie Polinucleótido/Polipé SEQ ID N°: gen vegetal ptido 56 GmARGOS4 Glycine max Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 24 SEQ ID N°: 57 GmARGOS5 Glycine max Polinucleótido SEQ ID N°: Polipéptido 25 SEQ ID N°: 58 SbARGOSI Sorghum Polinucleótido SEQ ID N°: bicolor Polipéptido 29 SEQ ID N°: 62 SbARGOS2 Sorghum Polinucleótido SEQ ID N°: bicolor Polipéptido 30 SEQ ID N°: 63 SbARGOS3 Sorghum Polinucleótido SEQ ID N°: bicolor Polipéptido 31 SEQ ID N°: 64 SbARGOS4 Sorghum Polinucleótido SEQ ID N°: bicolor Polipéptido 32 SEQ ID N°: 65 SbARGOS5 Sorghum Polinucleótido SEQ ID N°: bicolor Polipéptido 33 SEQ ID N°: 66 SbARGOS6 Sorghum Polinucleótido SEQ ID N°: bicolor Polipéptido 34 SEQ ID N°: 67 SbARGOS7 Sorghum Polinucleótido SEQ ID N°: bicolor Polipéptido 35 SEQ ID N°: 68 SbARGOS8 Sorghum Polinucleótido SEQ ID N°: Nombre del Especie Polinucleótido/Polipé SEQ ID N°: gen vegetal ptido bicolor Polipéptido 36 SEQ ID N°: 69 SbARGOS9 Sorghum Polinucleótido SEQ ID N°: bicolor Polipéptido 37 SEQ ID N°: 70 AtARGOS 1 Arabidopsis Polinucleótido SEQ ID N°: th alian a Polipéptido 26 SEQ ID N°: 59 AtARGOS2 Arabidopsis Polinucleótido SEQ ID N°: th a lia na Polipéptido 27 SEQ ID N°: 60 AtARGOS3 Arabidopsis Polinucleótido SEQ ID N°: th alian a Polipéptido 28 SEQ ID N°: 61 Construcción de los ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención pueden prepararse usando (a) métodos recombinantes convencionales, (b) técnicas de síntesis o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, los polinucleótidos de la presente invención se clonarán, amplificarán o construirán de otro modo a partir de un hongo o una bacteria.

Convenientemente, los ácidos nucleicos pueden comprender secuencias adicionales, además de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, se puede insertar un sitio de clonación múltiple, que comprende uno o más sitios para endonucleasas de restricción en el ácido nucleico, para contribuir en el aislamiento del polinucleótido. También se pueden insertar secuencias traducibles para contribuir en el aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexahistidina provee un medio conveniente para purificar las proteínas de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención, excluyendo la secuencia de polinucleótidos, es opcionalmente un vector, un adaptador o un ligador para clonar y/o expresar un polinucleótido de la presente invención. Se pueden agregar secuencias adicionales a dichas secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o la expresión, para contribuir en el aislamiento del polinucleótido o para mejorar la introducción del polinucleótido en una célula. Típicamente, la longitud de un ácido nucleico de la presente invención menos la longitud del polinucleótido de la presente invención es menor que 20 pares de kilobases, comúnmente menor que 15 kb y frecuentemente menor que 10 kb. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores y ligadores es bien conocido en la técnica. Los ejemplos de ácidos nucleicos incluyen vectores tales como M13, lambda ZAP Express, lambda ZAP II, lambda gt 10 , lambda gt11, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II, lambda DASH II, lambda EMBL 3, lambda EMBL 4, pWE15, SuperCos 1, SurfZap, Uni-ZAP, pBC, pBS + /-, pSG5, pBK, pCR-Script, pET, pSPUTK, p3'SS, pGEM, pSK + /-, pGEX, pSPORTI y II, pOPRSVI CAT, pOPI3 CAT, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMCIneo, pOG44, pOG45, pFRT GAL, pNEOpGAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, lambda MOSSIox y lambda MOSEIox. Los vectores opcionales para la presente invención incluyen, en un sentido no limitativo, lambda ZAP II y pGEX. Por una descripción de diversos ácidos nucleicos, véase por ejemplo, Stratagene Cloning Systems, Catálogos 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA); y Amersham Life Sciences, Inc, Catálogo '97 (Arlington Heights, IL).

Métodos de síntesis para construir los ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención también se pueden preparar empleando una síntesis química directa con métodos tales como el método de fosfotriéster de Narang et al., Meth. Enzymol. (1979) 68:90-9; el método de fosfodiéster de Brown et al., Meth. Enzymol. (1979) 68:109-51; el método de dietilfosforamidíta de Beaucage et al., Tetra. Letts. (1981) 22(20):1859-62; el método de triéster de fosforamidita en fase sólida descripto por Beaucage et al., supra, por ejemplo, usando un sintetizador automático, por ejemplo, como se describe en Needham-VanDevanter et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-68; y el método en soporte sólido de la Patente de los EE.UU. N° 4.458.066. La síntesis química generalmente produce un oligonucleótido de cadena simple. Éste puede convertirse en ADN de cadena doble realizando una hibridación con una secuencia complementaria o efectuando una polimerización con una ADN polimerasa, usando la cadena individual como molde. Los especialistas en la técnica reconocerán que, si bien la síntesis química de ADN se limita a secuencias de aproximadamente 100 bases, pueden obtenerse secuencias más largas uniendo secuencias más cortas.

UTR y preferencia de codones En general, se ha descubierto que la eficacia de la traducción está regulada por elementos de secuencia específicos en la región no codificante o no traducida 5' (5' UTR) del ARN. Los motivos de secuencia positivos incluyen secuencias consenso de inicio de la traducción (Kozak, (1987) Nucleic Acids Res.15:8125) y la estructura del ARN 5<G> 7 metil GpppG cap (Drummond et al., (1985) Nucleic Acids Res. 13:7375). Los elementos negativos incluyen las estructuras de tallo-bucle 5' UTR intramoleculares estables (Muesing et al., (1987) Cell 48:691) y las secuencias AUG o los marcos abiertos de lectura cortos precedidos por un AUG apropiado en la 5' UTR (Kozak, supra, Rao et al., (1988) Mol. and Cell. Biol. 8:284). Por consiguiente, la presente invención provee regiones 5' y/o 3' UTR para modular la traducción de secuencias codificantes heterólogas.

Además, pueden modificarse los segmentos que codifican polipéptidos de los polinucleótidos de la presente invención para alterar el uso de codones. Se puede emplear un uso de codones alterado para modificar la eficacia de la traducción y/u optimizar la secuencia codificante para expresarla en un huésped deseado o para optimizar el uso de codones en una secuencia heteróloga para expresarla en maíz. Se puede analizar estadísticamente el uso de codones en las regiones codificantes de los polinucleótidos de la presente invención, usando conjuntos de software disponibles comercialmente, tales como "Codon Preference", disponible del Genetics Computer Group de la Universidad de Wisconsin. Véase, Devereaux, et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:387-395); o MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.). Por consiguiente, la presente invención provee una frecuencia de uso de codones característica de la región codificante de al menos uno de los polinucleótidos de la presente invención. La cantidad de polinucleótidos (3 nucleótidos por aminoácido) que puede usarse para determinar la frecuencia de uso de codones puede ser cualquier número entero entre 3 y la cantidad de polinucleótidos de la presente invención proporcionados en la presente. Opcionalmente, los polinucleótidos serán secuencias de longitud completa. Un ejemplo del número de secuencias para realizar un análisis estadístico puede ser de al menos 1, 5, 10, 20, 50 ó 100.

Entremezclado de secuencias La presente invención provee métodos para entremezclar secuencias usando los polinucleótidos de la presente invención, y composiciones obtenidas de este modo. El entremezclado de secuencias se describe en la publicación de PCT N° 96/19256. Véase también, Zhang, et al., (1997) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 94:4504-9; y Zhao, et al., (1998) Nature Biotech 16:258-61. En general, el entremezclado de secuencias provee un medio para generar bibliotecas de polinucleótidos que presentan características deseadas, que pueden seleccionarse o analizarse. Las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos con secuencias relacionadas, que comprenden regiones de secuencia que tienen una identidad de secuencia sustancial y pueden recombínarse en forma homologa in vitro o in vivo. La población de polinucleótidos con secuencias recombinadas comprende una subpoblación de polinucleótidos que poseen características deseadas o ventajosas, y que pueden seleccionarse empleando un método de selección o análisis apropiado. Las características pueden ser cualquier propiedad o atributo que pueda seleccionarse o detectarse en un sistema de análisis y pueden incluir las propiedades de: una proteína codificada, un elemento de la transcripción, una secuencia que controla la transcripción, el procesamiento del ARN, la estabilidad del ARN, la formación de la cromatina, la traducción u otra propiedad de la expresión de un gen o un transgen, un elemento de replicación, un elemento que une proteínas o semejantes, tal como cualquier característica que confiere una propiedad que puede seleccionarse o detectarse. En algunas realizaciones, la característica seleccionada será una Km y/o una Kcat alterada en la proteína tipo salvaje, tal como se la proporciona en la presente. En otras realizaciones, una proteína o un polinucleótido generado a partir del entremezclado de secuencias tendrá una afinidad de unión a ligando mayor que aquella del polinucleótido tipo salvaje no modificado. En aún otras realizaciones, una proteína o un polinucleótido generado a partir del entremezclado de secuencias tendrá un pH óptimo alterado, en comparación con aquel del polinucleótido tipo salvaje no modificado. El incremento en estas propiedades puede ser de al menos 110%, 120%, 130%, 140% o mayor que 150% respecto del valor tipo salvaje.

Casetes de expresión recombinantes La presente invención también provee casetes de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. Se puede usar una secuencia de ácido nucleico que codifica el polinucleótido deseado de la presente invención, por ejemplo, un ADNc o una secuencia genómíca que codifica un polipéptido suficientemente largo para codificar una proteína activa de la presente invención, para construir un cásete de expresión recombinante que puede introducirse en la célula huésped deseada. Un cásete de expresión recombinante comprenderá típicamente un polinucleótido de la presente invención ligado operativamente a secuencias reguladoras del inicio de la transcripción, que dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula huésped deseada, tal como en los tejidos de una planta transformada.

Por ejemplo, los vectores de expresión vegetales pueden incluir (1) un gen vegetal clonado bajo el control de transcripción de secuencias reguladoras 5' y 3' y (2) un marcador de selección dominante. Estos vectores de expresión para plantas también pueden contener, si se lo desea, una región reguladora promotora (por ejemplo, una que confiera una expresión inducible o constitutiva, regulada por el ambiente o el desarrollo, o específica/selectiva en células o tejidos), un sitio de inicio de la transcripción, un sitio de unión a ribosomas, una señal de procesamiento del ARN, un sitio de terminación de la transcripción y/o una señal de poliadenilación.

Se puede emplear un fragmento promotor vegetal que dirige la expresión de un polinucleótido de la presente invención en todos los tejidos de una planta regenerada. Estos promotores se conocen en la presente como promotores "constitutivos", y están activos bajo la mayoría de las condiciones ambientales y los estados del desarrollo o la diferenciación celular. Los ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor V o 2' derivado del ADN-T de Agrobacterium tumefaciens, el promotor Smas, el promotor de la cinamil alcohol deshidrogenasa (Patente de los EE.UU. N° 5.683.439), el promotor Nos, el promotor de la rubisco, el promotor GRP1-8, el promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor (CaMV), descripto en Odell et al., Nature (1985) 313:810-2; el promotor de actina de arroz (McEIroy et al., (1990) Plant Cell 163-171); ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol. (1992) 12:619-632 y Christensen et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-89); pEMU (Last ef al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-8); MAS (Velten et al., EMBO J.(1984) 3:2723-30); y la histona H3 de maíz (Lepetit ef al., (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-85; y Atanassvoa et al., Plant Journal (1992) 2(3):291-300); el promotor ALS, descripto en la Solicitud PCT N° WO 96/30530; GOS2 (Patente de los EE.UU. N°: 6.504.083) y otras regiones de inicio de la transcripción de diversos genes vegetales conocidos por los especialistas en la técnica. Para la presente invención, el promotor de ubiquitina es el promotor preferido para obtener expresión en plantas monocotiledóneas.

Como alternativa, el promotor vegetal puede dirigir la expresión de un polinucleótido de la presente invención en un tejido específico, o puede presentar un control más específico en términos ambientales o de desarrollo. Estos promotores se conocen en la presente como promotores "inducibles" (Rab17, RAD29). Las condiciones ambientales que pueden provocar la transcripción por promotores inducibles incluyen el ataque de patógenos, las condiciones anaeróbicas o la presencia de luz. Los ejemplos de promotores inducibles son el promotor Adh1, que puede ser inducido por hipoxia o estrés por frío, el promotor Hsp70, que puede ser inducido por estrés por calor, y el promotor PPDK, que puede ser inducido por la luz.

Los ejemplos de promotores controlados por el desarrollo incluyen los promotores que inician la transcripción solamente, o con preferencia, en determinados tejidos, tales como hojas, frutos, semillas o flores. La operación de un promotor también puede variar dependiendo de su localización en el genoma. Por consiguiente, un promotor inducible puede pasar a ser completa o parcialmente constitutivo en determinadas localizaciones.

Si se desea expresar un polipéptido, en general es deseable incluir una señal de poliadenilación en el extremo 3' de la región codificante de un polinucleótido. La región de poliadenilación puede derivar de diversos genes vegetales, o del ADN-T. La secuencia del extremo 3' que se añadirá puede derivar, por ejemplo, de los genes nopalina sintetasa u octopina sintetasa o, como alternativa, de otros genes vegetales o, menos preferentemente, de cualquier otro gen eucariota. Los ejemplos de estos elementos reguladores incluyen, en un sentido no limitativo, las regiones de terminación 3' y/o de poliadenilación, tales como las del gen de la nopalina sintetasa (nos) de Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., (1983) Nucleic Acids Res. 12:369-85); el gen del inhibidor II de la proteinasa de papa (PINII) (Keil et al., (1986) Nucleic Acids Res. 14:5641-50; y An, et al., (1989) Plant Cell 1:115-22); y el gen 19S Ca V ( ogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1261-72).

Se puede introducir una secuencia de un intrón en la región 5' no traducida o en la secuencia codificante de la secuencia codificante parcial para incrementar la cantidad de mensajero maduro acumulado en el citosol. Se ha demostrado que la inclusión de un intrón procesable en la unidad de transcripción de las construcciones de expresión para plantas y animales incrementa la expresión genética a nivel del ARNm y las proteínas hasta 1000 veces (Buchman y Berg, (1988) Mol. Cell Biol. 8:4395-4405; Callis, eí al., (1987) Genes Dev. 1:1183-200). Este mejoramiento intrónico de la expresión genética es típicamente mayor cuando se coloca dicho intrón cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. En la técnica se conoce el uso de los intrones de maíz Adh1-S 1, 2 y 6, y el intrón Bronze-1. Véase en general THE MAIZE HANDBOOK, Capítulo 116, Freeling y Walbot, editores, Springer, Nueva York (1994).

Las secuencias señal para plantas, incluyendo, en un sentido no limitativo, los ADN/ARN que codifican péptidos señal que dirigen las proteínas blanco hacia la matriz extracelular de la célula vegetal (Dratewka-Kos et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:4896-900), tales como el gen de extensión de Nicotiana plumbaginifolia (DeLoose eí al., (1991) Gene 99:95-100); los péptidos señal que dirigen proteínas hacia la vacuola, tales como el gen de esporamina de batata (Matsuka et al., (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 88:834) y el gen de lectina de cebada (Wilkins eí al., (1990) Plant Cell, 2:301-13); los péptidos señal que provocan la secreción de las proteínas, tales como aquellos de PRIb (Lind eí al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:47-53); la alfa amilasa de cebada (BAA) (Rahmatullah et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:119, incorporada en la presente a modo de referencia) o los péptidos señal que dirigen las proteínas hacia los plástidos, tales como aquellos de la reductasa enoil-ACP de colza (Verwaert et al., (1994) Plant Mol. Biol. 26:189-202), son de utilidad en la invención. La secuencia señal de alfa amilasa de cebada fusionada con el polinucleótido ARGOS es la construcción preferida para la expresión en maíz de acuerdo con la presente invención.

El vector que comprende las secuencias de un polinucleótido de la presente invención típicamente comprenderá un gen marcador que conferirá un fenotipo seleccíonable a las células vegetales. Habitualmente, el gen marcador seleccíonable codificará resistencia a antibióticos, donde los genes apropiados incluirán los genes que codifican resistencia al antibiótico espectinomicina (por ejemplo, el gen aada), el gen de estreptomicina fosfotransferasa (SPT), que codifica resistencia a estreptomicina, el gen de neomicina fosfotransferasa (NPTII), que codifica resistencia a kanamicina o geneticina, el gen de higromicina fosfotransferasa (HPT), que codifica resistencia a higromicina, los genes que codifican resistencia a los herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la acetolactato sintetasa (ALS), en particular los herbicidas tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de acetolactato sintetasa (ALS) que contiene mutaciones que permiten obtener dicha resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), los genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la glutamina sintetasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), u otros genes como los mencionados conocidos en la técnica. El gen bar codifica resistencia al herbicida basta y el gen ALS codifica resistencia al herbicida clorsulfurón.

Los vectores típicos de utilidad para la expresión de genes en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido inductor de tumores (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers, et al., (1987) Meth. Enzymol. 153:253-77. Estos vectores son vectores de integración en plantas ya que con la transformación, los vectores integran una porción del ADN del vector en el genoma de la planta huésped. Los ejemplos de vectores de A. tumefaciens de utilidad en la presente son los plásmidos pKYLX6 y pKYLX7 de Schardl, et al., (1987) Gene 61:1-11, y Berger, et al., (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU., 86:8402-6. Otro vector de utilidad en la presente es el plásmido pBI101.2 disponible de CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA).

Expresión de proteínas en células huésped Con los ácidos nucleicos de la presente invención, es posible expresar una proteina de la presente invención en una célula modificada en forma recombinante, tal como una bacteria, una levadura, una célula de insecto o de mamífero o, preferentemente, una célula vegetal. Las células producen la proteína en una condición no natural (por ejemplo, en lo referente a la cantidad, la composición, la localización y/o el momento), ya que han sido modificadas genéticamente merced a la intervención humana para que lo hagan.

Se considera que los especialistas en la técnica tienen conocimiento de los numerosos sistemas de expresión disponibles para expresar un ácido nucleico que codifica una proteína de la presente invención. No se intentará describir en detalle los distintos métodos conocidos para expresar proteínas en procariotas o eucariotas.

En pocas palabras, la expresión de los ácidos nucleicos aislados que codifican una proteína de la presente invención típicamente se efectuará ligando operativamente, por ejemplo, el ADN o el ADNc, con un promotor (que será constitutivo o inducible), después de lo cual se incorporará en un vector de expresión. Los vectores pueden ser apropiados para la replicación y la integración en procariotas o eucariotas. Los vectores de expresión típicos contienen terminadores de la transcripción y la traducción, secuencias de inicio y promotores útiles para regular la expresión del ADN que codifica la proteína de la presente invención. Para obtener un nivel de expresión elevado de un gen clonado, es deseable construir vectores de expresión que contienen, como mínimo, un promotor fuerte, tal como el de la ubiquitina, para dirigir la transcripción, un sitio de unión a ribosoma para iniciar la traducción y un terminador de la transcripción/traducción. Los promotores constitutivos son aquellos que proporcionan un rango de expresión constitutiva. Por consiguiente, algunos son promotores constitutivos débiles y otros son promotores constitutivos fuertes. En general, un "promotor débil" es un promotor que dirige la expresión de una secuencia codificante a un nivel bajo. Un nivel de expresión bajo abarca niveles de expresión de aproximadamente 1/10000 transcriptos, aproximadamente 1/100000 transcriptos y aproximadamente 1/500000 transcriptos. Por otro lado, un "promotor fuerte" dirige la expresión de una secuencia codificante a "niveles elevados", o aproximadamente 1/10 transcriptos, aproximadamente 1/100 transcriptos y aproximadamente 1/1000 transcriptos.

Los especialistas en la técnica comprenderán que es posible efectuar modificaciones a las proteínas de la presente invención sin disminuir su actividad biológica. Se pueden efectuar algunas modificaciones para facilitar la clonación, la expresión o la incorporación de la molécula de direccionamiento en una proteína de fusión. Estas modificaciones son bien conocidas por los especialistas en la técnica e incluyen, por ejemplo, una metionina agregada en el extremo amino terminal para proporcionar un sitio de inicio, o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poli His) introducidos en cualquier extremo para crear sitios de restricción, codones de terminación o secuencias de purificación en ubicaciones convenientes.

Expresión en procariotas Se pueden usar células procariotas como huéspedes para la expresión. Los procariotas están representados con mayor frecuencia por diversas cepas de E. coli; sin embargo, también se pueden emplear otras cepas microbianas. Las secuencias de control procariota de uso común están definidas en la presente como secuencias que incluyen promotores para iniciar la transcripción, opcionalmente con un operador, en combinación con secuencias de sitios de unión a ribosomas, e incluyen promotores de uso común, tales como los sistemas promotores de la beta lactamasa (penicilinasa) y la lactosa (lac) (Chang et al., (1977) Nature 198:1056), el sistema promotor del triptofano (trp) (Goeddel et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) y el promotor P L derivado de lambda con el gen N de unión a ribosomas (Shimatake et al., (1981) Nature 292:128). La inclusión de marcadores de selección en los vectores de ADN transfectados en E coli. también es de utilidad. Los ejemplos de dichos marcadores incluyen genes con resistencia específica a ampicilina, tetraciclina o cloranfenicol .

El vector se selecciona con el objeto de permitir la introducción del gen de interés en la célula huésped apropiada. Los vectores bacterianos son típicamente de origen plasmídico o fago. Las células bacterianas apropiadas son infectadas con partículas del vector fago o transfectadas con el ADN del vector fago desnudo. Si se utiliza un vector plasmídico, las células bacterianas son transfectadas con el ADN del vector plasmídico. Existen sistemas de expresión para expresar una proteína de la presente invención que emplean Bacillus sp. y Salmonella (Palva et al., (1983) Gene 22:229-35; Mosbach et al., (1983) Nature 302:543-5). El plásmido vector pGEX-4T-1 de Pharmacia es el vector de expresión en E. coli preferido para la presente invención.

Expresión en eucariotas Existe una variedad de sistemas de expresión en eucariotas, tales como levaduras, líneas de células de insectos, células vegetales y de mamíferos, conocidos por los especialistas en la técnica. Como se explica brevemente más adelante, la presente invención se puede expresar en estos sistemas eucariotas. En algunas realizaciones, se emplean células vegetales transformadas/transfectadas, como se discutirá infra, como sistemas de expresión para la producción de las proteínas de la presente invención.

La síntesis de proteínas heterólogas en levaduras es bien conocida. El trabajo de Sherman et al., METHODS IN YEAST GENETICS, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) es bien conocido y describe los distintos métodos disponibles para producir proteínas en levaduras. Dos levaduras ampliamente utilizadas para la producción de proteínas eucariontes son Saccharomyces cerevisiae y Pichia pastoris. Los vectores, las cepas y los protocolos para la expresión en Saccharomyces y Pichia son conocidos en la técnica y se encuentran disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Invitrogen). Los vectores adecuados poseen habitualmente secuencias de control de la expresión, tales como promotores, incluyendo la 3-fosfoglicerato quinasa o alcohol oxidasa, y un origen de replicación, secuencias de terminación y semejantes, según convenga.

Una vez expresada, la proteína de la presente invención se puede aislar de la levadura lisando las células y aplicando técnicas convencionales de aislamiento de proteínas a los lisados. El monitoreo del proceso de purificación se puede efectuar usando técnicas de transferencia Western, radioinmunoensayo u otras técnicas de inmunoensayo convencionales.

Las secuencias que codifican las proteínas de la presente invención también pueden unirse a varios vectores de expresión para su uso en la transfección de cultivos celulares, por ejemplo, originarios de mamíferos, insectos o plantas. Los sistemas de células de mamífero a menudo se encuentran en la forma de monocapas de células aunque también se pueden usar suspensiones de células de mamífero. En la técnica se han desarrollado numerosas líneas de células huésped adecuadas capaces de expresar proteínas intactas e incluyen las líneas celulares HEK293, BHK21 y CHO. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias para controlar la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor (por ejemplo, el promotor CMV, un promotor HSV tk o pgk (fosfoglicerato quinasa)), un potenciador (Queen et al., (1986) Immunol. Rev. 89:49), y sitios necesarios para procesar la información, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de procesamiento del ARN, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición de poli A SV40 grande T Ag) y secuencias de terminación de la transcripción. Hay otras células animales útiles para producir las proteínas de la presente invención, por ejemplo, en el Catálogo de Líneas Celulares e Hibridomas de la American Type Culture Collection (7a edición, 1992).

Los vectores apropiados para la expresión de las proteínas de la presente invención en células de insecto derivan habitualmente del baculovirus SF9. Las células de insecto apropiadas incluyen líneas celulares de larvas de mosquito, gusano de seda, oruga militar, polilla y Drosophila , tales como una línea celular de Schneider (véase, por ejemplo, Schneider, (1987) J. Embryol. Exp. Morphol. 27:353-65).

Al igual que con la levadura, cuando se emplean células huésped de animales o plantas superiores, típicamente se incorporan secuencias de poliadenilación o secuencias de terminación de la transcripción en el vector. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilación del gen de la hormona de crecimiento bovina. También se pueden incluir secuencias para un procesamiento preciso del transcripto. Un ejemplo de una secuencia de procesamiento es el intrón VP1 del SV40 (Sprague, et al., (1983) J. Virol, 45:773-81). Además, en el vector se pueden incorporar secuencias genéticas para controlar la replicación en la célula huésped, tales como aquellas halladas en vectores semejantes al virus de papiloma bovino (Saveria-Campo, "Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector", en DNA CLONING: A PRACTICAL APPROACH, vol. II, Glover, editor, IRL Press, Arlington, VA, págs. 213-38 (1985)).

Además, se puede usar el gen ARGOS, localizado en el vector de expresión apropiado para la planta, para transformar células vegetales. Luego puede aislarse el polipéptido a partir de callos, o pueden usarse las células vegetales transformadas para regenerar plantas transgénicas. Estas plantas transgénicas se pueden cosechar y luego se pueden aplicar técnicas de extracción y de purificación de proteínas a gran escala usando los tejidos apropiados (semillas u hojas, por ejemplo).

Métodos para transformar plantas Se conocen numerosos métodos para introducir genes extraños en plantas, y se pueden usar para insertar un polinucleótido ARGOS en una planta huésped, incluyendo protocolos biológicos y físicos de transformación de plantas. Véase, por ejemplo, Miki et al., "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants", en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick y Thompson, editores, CRC Press, Inc., Boca Ratón, págs. 67-88 (1993). Los métodos seleccionados varían con la planta huésped e incluyen métodos de transfección química, tal como el que emplea fosfato de calcio, transferencia de genes mediada por microorganismos, tales como Agrobacterium (Horsch et al., (1985) Science 227:1229-31), electroporación, microinyección y bombardeo biol ístico.

Los casetes y los vectores de expresión, y los métodos de cultivo in vitro para la transformación de células o tejidos vegetales, y para la regeneración plantas, son conocidos y están disponibles. Véase, por ejemplo, Gruber et al., "Vectors for Plant Transformaron", en METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, supra, págs. 89-119.

Los polinucleótidos o los polipéptidos aislados se pueden introducir en la planta empleando una o más técnicas de uso común para efectuar una administración directa en las células. Estos protocolos pueden variar dependiendo del tipo de organismo, célula, planta o célula vegetal, es decir monocotiledónea o dicotiledónea, que se desea modificar. Los métodos adecuados para transformar células vegetales incluyen microinyección (Crossway et al., (1986) Biotechniques 4:320-334; y Patente de los EE.UU. N°: 6.300.543), electroporación (Riggs et al., (1986) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 83:5602-5606, transferencia directa de genes (Paszkowski eí al., (1984) EMBO J. 3:2717-2722) y aceleración balística de partículas (véase, por ejemplo, Sanford et al., Patente de los EE.UU. N°: 4.945.050; WO 91/10725; y McCabe eí al., (1988) Biotechnology 6:923-926). También véase, Tomes, er al., Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment. págs.197-213 en Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods eds. O. L. Gamborg & G.C. Phillips, Springer-Verlag Berlín Heidelberg Nueva York, 1995; Patente de los EE.UU. N°: 5.736.369 (meristema); Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477; Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebolla); Chrístou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); Datta et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein eí al., (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 85:4305-4309 (maíz); Klein et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); WO 91/10725 (maíz); Klein et al., (1988) Plant Physiol. 91:440-444 (maíz); Fromm et al., (1990) Biotechnology 8:833-839; y Gordon-Kamm et al., (1990) Plant Cell 2:603-618 (maíz); Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas (1984) Nature (Londres) 311:763-764; Bytebier et al., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 84:5345-5349 (Líliaceae); De Wet et al., (1985) En The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. G.P. Chapman et al., págs. 197-209; Longman, NY (polen); Kaeppler et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; y Kaeppler eí al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformación mediada por fibras); Patente de los EE.UU.

N°: 5.693.512 (sonicación); D'Halluin et al., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporación); Li et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255; y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda et al., (1996) Nature Biotech. 14:745-750; transformación de maíz mediada por Agrobacterium (Patente de los EE.UU. N°: 5.981.840); métodos con fibras de carburo de silicio (Frame et al., (1994) Plant J. 6:941-948); métodos con láser (Guo et al., (1995) Physiologia Plantarum 93:19-24); métodos con sonicación (Bao et al., (1997) Ultrasound in Medicine & Biology 23:953-959; Finer y Finer (2000) Lett Appl Microbio!. 30:406-10; Amoah et al., (2001) J Exp Bot 52:1135-42); métodos con polietilenglicol (Krens et al., (1982) Nature 296:72-77); los protoplastos de células monocotiledóneas y dicotiledóneas se pueden transformar usando electroporación (Fromm ef al., (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 82:5824-5828) y microinyección (Crossway et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202:179-185); todas las cuales se incorporan en la presente a modo de referencia.

Transformación mediada por Agrobacterium El método más usado para introducir un vector de expresión en plantas se basa en el sistema de transformación natural de Agrobacterium . A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias patogénicas de plantas que habitan en la tierra, que transforman células vegetales por medios genéticos. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, contienen genes responsables de la transformación genética de las plantas. Véase, por ejemplo, Kado, Crit. Rev. Plant Sci. 10:1. Se proporcionan descripciones de los sistemas de vectores de Agrobacterium y los métodos para transferir genes con la mediación de Agrobacterium en Gruber et al., supra; Miki et al., supra; y Moloney et al., (1989) Plant Cell Reports 8:238.

De forma similar, el gen se puede insertar en la región del ADN-T del plásmido Ti o Ri derivado de A. tumefaciens o A. rhizogenes, respectivamente. Por consiguiente, se pueden construir casetes de expresión como se describió previamente, usando estos plásmidos. Se conocen muchas secuencias de control que, cuando se las une a una secuencia codificante heteróloga y se las transforma en un organismo huésped, presentan fidelidad en la expresión genética respecto de la especificidad por tejidos/órganos de la secuencia codificante original. Véase, por ejemplo, Benfey y Chua, (1989) Science 244:174-81. Las secuencias de control particularmente adecuadas para su uso en estos plásmidos son promotores para una expresión constitutiva específica de hojas del gen en las diversas plantas de interés. Otras secuencias de control útiles incluyen un promotor y un terminador del gen de nopalina sintetasa (NOS). El promotor y el terminador NOS están presentes en el plásmido pARC2, disponible en la American Type Culture Collection y denominada ATCC 67238. Si se usa tal sistema, también debe estar presente el gen de virulencia (vir) del plásmido Ti o Ri, en combinación con la porción de ADN-T o a través de un sistema binario, donde el gen vir está presente en un vector separado. Dichos sistemas, los vectores para usar en los mismos y los métodos para transformar células vegetales se describen en la Patente de los EE.UU. N° 4.658.082; la Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: 913.914, presentada el 1o de octubre de 1986, como se menciona en la Patente de los EE.UU. N° 5.262.306, presentada el 16 de Noviembre de 1993; y Simpson et al., Plant Mol. Biol. (1986)6:403- 5 (también mencionada en la patente '306); todos cuyos contenidos se incorporan por completo a modo de referencia.

Una vez construidos, estos plásmidos se pueden introducir en A. rhizogenes o A. Tumefaciens, y estos vectores se pueden usar para transformar células de especies vegetales comúnmente susceptibles de ser infectadas por Fusarium o Alternaría. En la presente invención también se contemplan varias otras plantas transgénicas, incluyendo, en un sentido no limitativo, soja, maíz, sorgo, alfalfa, arroz, trébol, repollo, banana, café, apio, tabaco, garbanzo, algodón, melón y pimiento. La selección de A. tumefaciens o A. rhizogenes dependerá de la planta que se desee transformar. En general, A. tumefaciens es el organismo preferido para la transformación. La mayoría de las plantas dicotiledóneas, algunas gimnospermas y unas pocas plantas monocotiledóneas (por ejemplo, determinados miembros de Liliales y Arales) son susceptibles de una infección con A. tumefaciens. A. rhizogenes también tiene un amplio rango de huéspedes, que abarca a la mayoría de las dicotiledóneas y algunas gimnospermas, que incluyen miembros de las familias Leguminosae, Compositae y Chenopodiaceae . En la actualidad se pueden transformar plantas monocotiledóneas con un cierto grado de éxito. En la Solicitud de Patente Europea N° 604 662 A1 se describe un método para transformar monocotiledóneas usando Agrobacterium . En la Solicitud Europea N° 672 752 A1 se describe un método para transformar monocotiledóneas con Agrobacterium usando el escutelo de embriones inmaduros. Ishida et al. describen un método para transformar maíz por exposición de embriones inmaduros a A. tumefaciens (Nature Biotechnology 14:745-50 (1996)).

Una vez transformadas, estas células se pueden usar para regenerar plantas transgénicas. Por ejemplo, se pueden infectar plantas completas con estos vectores, lesionando la planta y luego introduciendo el vector en el sitio de la lesión. Se puede lesionar cualquier parte de la planta, incluyendo hojas, tallos y raíces. Como alternativa, se puede inocular tejido vegetal, bajo la forma de un explante, tal como tejido de cotiledones o discos de hojas, con estos vectores, y luego puede cultivarse bajo condiciones que promueven la regeneración de plantas. Se pueden usarse raíces o brotes transformados por inoculación del tejido vegetal con A. rhizogenes o A. tumefaciens, que contienen el gen que codifica la enzima degradadora de fumonisina, como fuente de tejido vegetal para regenerar plantas transgénicas resistentes a fumonisina, por embriogénesis somática u organogénesis. Los ejemplos de dichos métodos para regenerar tejidos vegetales se describen en Shahin, Theor. Appl. Genet. 69:235-40 (1985); Patente de los EE.UU. N°: 4.658.082; Simpson, eí al., supra; y las Solicitudes de Patente de los EE.UU. N°: 913.913 y 913.914, ambas presentadas el 1 de octubre, 1986, como se menciona en la Patente de los EE.UU. N°: 5.262.306, presentada el 16 de noviembre, 1993, cuyos contenidos se incorporan por completo en la presente a modo de referencia.

Transferencia directa de genes A pesar del hecho de que el rango de huéspedes para la transformación mediada por Agrobacterium es amplio, algunas especies de los principales cereales de cultivo y gimnospermas han sido recalcitrantes en general a este modo de transferencia de genes, aunque se han obtenido algunos éxitos recientes en arroz (Hiei eí al., (1994) The Plant Journal 6:271-82). Se han desarrollado varios métodos de transformación de plantas, conocidos colectivamente como transferencia directa de genes, como una alternativa a la transformación mediada por Agrobacterium.

Un método que puede aplicarse en general a la transformación de plantas es la transformación mediada por microproyectiles, donde se transporta ADN en la superficie de microproyectiles que miden entre aproximadamente 1 y 4 pm. El vector de expresión se introduce en los tejidos vegetales con un dispositivo biolístico que acelera los microproyectiles hasta velocidades de entre 300 y 600 m/s, lo que es suficiente para penetrar las paredes y las membranas de las células vegetales (Sanford et al., (1987) Part. Sci. Technol. 5:27; Sanford, (1988) Trends Biotech 6:299; Sanford, (1990) Physiol. Plant 79:206; y Klein, et al., (1992) Biotechnology 10:268).

Otro método para administrar ADN por medios físicos a las plantas es la sonicación de las células blanco como se describe en Zang, et al., (1991) BioTechnology 9:996. Como alternativa, se han usado fusiones de liposomas o esferoplastos para introducir vectores de expresión en plantas. Véase, por ejemplo, Deshayes, et al., (1985) EMBO J. 4:2731; y Christou, eí al., (1987) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 84:3962. También se ha descrito la captación directa de ADN en protoplastos usando precipitación por CaCI2, alcohol polivin ílico o poli-L-ornitina. Véanse, por ejemplo, Hain et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 199:161; y Draper et al., (1982) Plant Cell Physiol. 23:451.

También se ha descripto la electroporación de protoplastos y células y tejidos completos. Véase, por ejemplo, Donn, et al., (1990) en Abstracts of the Vllth Int'l. Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, pág. 53; D'Halluin, eí al., (1992) Plant Cell 4:1495-505; y Spencer, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 24:51-6 .

Incremento de la actividad y/o del nivel de un polipéptido ARGOS Se proporcionan métodos para incrementar la actividad y/o el nivel del polipéptido ARGOS de la invención. Se puede obtener un incremento en el nivel y/o la actividad del polipéptido ARGOS de la invención introduciendo en la planta un polipéptido ARGOS. El polipéptido ARGOS se puede proveer introduciendo la secuencia de aminoácidos que codifica el polipéptido ARGOS en la planta, introduciendo en la planta una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido ARGOS o, como alternativa, modificando un locus genómico que codifica el polipéptido ARGOS de la invención.

Como se describió en otra parte de la presente, en la técnica se conocen muchos métodos para introducir un polipéptido en una planta, incluyendo, en un sentido no limitativo, la introducción directa del polipéptido en la planta, la introducción en la planta (en forma transitoria o estable) de una construcción de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad de regulación de la cantidad de células. Se considera también que los métodos de la invención pueden emplear un polinucleótido que no es capaz de dirigir, en la planta transformada, la expresión de una proteína o un ARN. Por consiguiente, se puede incrementar el nivel y/o la actividad de un polipéptido ARGOS alterando el gen que codifica el polipéptido ARGOS o su promotor. Véanse, por ejemplo, Kmiec, Patente de los EE.UU. N° 5.565.350; Zarling et al., PCT/US93/03868. Por ello, se proporcionan plantas mutagenizadas que contienen mutaciones en los genes ARGOS, donde las mutaciones incrementan la expresión del gen ARGOS o incrementan la actividad de regulación del desarrollo de células del polipéptido ARGOS codificado.

Reducción de la actividad y/o el nivel de un polipéptido ARGOS Se proveen métodos para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido ARGOS de la invención por transformación de una célula vegetal con un cásete de expresión que expresa un polinucleótido que inhibe la expresión del polipéptido ARGOS. El polinucleótido puede inhibir la expresión del polipéptido ARGOS directamente, impidiendo la traducción del ARN mensajero de ARGOS, o indirectamente, codificando un polipéptido que inhibe la transcripción o traducción de un gen ARGOS que codifica un polipéptido ARGOS. Los métodos para inhibir o eliminar la expresión de un gen en una planta son bien conocidos en la técnica, y podrá usarse cualquiera de estos métodos en la presente invención para inhibir la expresión de un polipéptido ARGOS.

De acuerdo con la presente invención, se inhibe la expresión de un polipéptido ARGOS si el nivel de proteínas del polipéptido ARGOS es menor que 70el % del nivel de proteínas del mismo polipéptido ARGOS en una planta que no ha sido modificada genéticamente o mutagenizada para inhibir la expresión del polipéptido ARGOS. En realizaciones particulares de la invención, el nivel de proteínas del polipéptido ARGOS en una planta modificada de acuerdo con la invención es menor que 60%, menor que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor que 20%, menor que 10%, menor que 5%, o menor que 2% del nivel de proteínas del mismo polipéptido ARGOS en una planta que no es una muíante o que no ha sido modificada genéticamente para inhibir la expresión de dicho polipéptido ARGOS. El nivel de expresión del polipéptido ARGOS se puede medir directamente, por ejemplo, evaluando el nivel de polipéptido ARGOS expresado en la célula vegetal o planta, o indirectamente, por ejemplo, midiendo en la célula vegetal o planta la actividad del polipéptido ARGOS en el crecimiento y/o desarrollo de órganos de la planta, o midiendo la biomasa de la planta. Los métodos para efectuar dichos ensayos están descritos en otra parte en la presente.

En otras realizaciones de la invención, se reduce o se elimina la actividad de los polipéptidos ARGOS transformando una célula vegetal con un cásete de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido que inhibe la actividad de un polipéptido ARGOS. La actividad del polipéptido ARGOS en el crecimiento y/o desarrollo de órganos en la planta se inhibe de acuerdo con la presente invención si la actividad de dicho polipéptido ARGOS en el crecimiento y/o desarrollo de órganos en la planta es menor que el 70% de la actividad de crecimiento y/o desarrollo de órganos en la planta del mismo polipéptido ARGOS en una planta que no ha sido modificada para inhibir la actividad en el crecimiento y/o desarrollo de órganos de dicho polipéptido ARGOS en la planta. En realizaciones particulares de la invención, la actividad del polipéptido ARGOS en el crecimiento y/o desarrollo de órganos de la planta en una planta modificada de acuerdo con la invención es menor que 60%, menor que 50%, menor que 40%, menor que 30%, menor que 20%, menor que 10% o menor que 5% de la actividad en el crecimiento y/o desarrollo de órganos vegetal del mismo polipéptido ARGOS en una planta que no ha sido modificada para inhibir la expresión de dicho polipéptido ARGOS. La actividad en el crecimiento y/o desarrollo de órganos vegetales de un polipéptido ARGOS es "eliminada" de acuerdo con la invención cuando no es detectable con los métodos de ensayo que se describen en otra parte en la presente. Los métodos para determinar la actividad en el crecimiento y/o desarrollo de órganos vegetal de un polipéptido ARGOS se describen en otra parte en la presente.

En otras realizaciones, se puede reducir o eliminar la actividad de un polipéptido ARGOS alterando el gen que codifica el polipéptido ARGOS. La invención abarca plantas mutadas que contienen mutaciones en los genes ARGOS, donde dichas mutaciones reducen la expresión del gen ARGOS o inhiben la actividad en el crecimiento y/o desarrollo de órganos vegetal del polipéptido ARGOS codificado.

Por consiguiente, se pueden usar muchos métodos para reducir o eliminar la actividad de un polipéptido ARGOS. Además, se puede usar más de un método para reducir la actividad de un solo polipéptido ARGOS. A continuación se proporcionan ejemplos no limitantes de métodos para reducir o eliminar la expresión de polipéptidos ARGOS.

. Métodos basados en polinucleótidos: En algunas realizaciones de la presente invención, se transforma una planta con un cásete de expresión que es capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de un polipéptido ARGOS de la invención. El término "expresión", tal como se utiliza en la presente, se refiere a la biosíntesis de un producto genético, incluyendo la transcripción y/o traducción de dicho producto genético. Por ejemplo, a los efectos de la presente invención, un cásete de expresión capaz de expresar un polinucleótido que inhibe la expresión de al menos un polipéptido ARGOS es un cásete de expresión capaz de producir una molécula de ARN que inhibe la transcripción y/o traducción de al menos un polipéptido ARGOS de la invención. La "expresión" o "producción" de una proteína o polipéptido a partir de una molécula de ADN se refiere a la transcripción y traducción de la secuencia de codificación para producir la proteína o el polipéptido, en tanto la "expresión" o "producción" de una proteína o polipéptido a partir de una molécula de ARN se refiere a la traducción de la secuencia de codificación del ARN para producir la proteína o el polipéptido.

A continuación se proporcionan ejemplos de polinucleótidos que inhiben la expresión de un polipéptido ARGOS.

/'. Supresión/cosupresión en el sentido del marco de lectura En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la expresión de un polipéptido ARGOS se puede obtener mediante supresión o cosupresión en el sentido del marco de lectura. Para la cosupresión, se diseña un cásete de expresión para expresar una molécula de ARN que corresponde a la totalidad o a una parte de un ARN mensajero que codifica un polipéptido ARGOS orientado en el sentido "del marco de lectura". La sobreexpresión de la molécula de ARN puede dar como resultado la expresión reducida del gen nativo. Por consiguiente, se analizan múltiples líneas de plantas transformadas con el cásete de expresión de cosupresión para identificar aquellas que presentan la mayor inhibición de la expresión del polipéptido ARGOS.

El polinucleótido usado para la cosupresión puede corresponder a la totalidad o a una parte de la secuencia que codifica el polipéptido ARGOS, la totalidad o una parte de la región 5' y/o 3' no traducida de un polipéptido de un transcripto ARGOS o la totalidad o una parte de la secuencia codificante y las regiones no traducidas de un transcripto que codifica un polipéptido ARGOS. En algunas realizaciones donde el polinucleótido comprende todo o parte de la región de codificación del polipéptido ARGOS, el cásete de expresión se diseña para eliminar el codón de inicio del polinucleótido de modo que no se traducirá ningún producto proteico.

La cosupresion se puede usar para inhibir la expresión de genes vegetales con el fin de producir plantas que poseen niveles no detectables de las proteínas codificadas por estos genes. Véase, por ejemplo Broin et al (2002) Plant Cell 14:1417- 432. También se puede usar cosupresion para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N°: 5.942.657. Los métodos para usar la cosupresion para inhibir la expresión de genes endógenos en plantas se describen en Flavell, et al., (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 91:3490-3496; Jorgensen, et al., (1996) Plant Mol. Biol. 31:957-973; Johansen y Carrington (2001 ) Plant Physiol. 126:930-938; Broin, et al., (2002) Plant Cell 14:1417-1432; Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Yu, et al., (2003) Phytochemistry 63:753-763; y las Patentes de los EE.UU. N°: 5.034.323, 5.283.184 y 5.942.657; cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Se puede incrementar la eficacia de la cosupresion incluyendo una región poli-dT en el cásete de expresión en una posición 3' con respecto a la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura y 5' con respecto a la señal de poliadenilación. Véase, la Publicación de Patente de los EE.UU. N°: 20020048814, incorporada en la presente a modo de referencia. Típicamente, dicha secuencia de nucleótidos presenta una identidad de secuencia sustancial con la secuencia del transcripto del gen endógeno, preferentemente más que un 65% aproximadamente de identidad de secuencia, más preferentemente más que aproximadamente un 85% de identidad de secuencia, con mayor preferencia más que un 95% aproximadamente de identidad de secuencia. Véase, las Patentes de los EE.UU. N°: 5.283.184 y 5.034.323; incorporadas en la presente a modo de referencia.

/'. Supresión antisentido En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la expresión del polipéptido ARGOS se puede lograr mediante supresión antisentido. Para la supresión antisentido, el cásete de expresión se diseña para que exprese una molécula de ARN complementaria de todo o parte del ARN mensajero que codifica al polipéptido ARGOS. La sobreexpresión de la molécula de ARN antisentido puede dar como resultado una expresión reducida del gen nativo. Por consiguiente, se analizan múltiples líneas de plantas transformadas con el cásete de expresión de supresión antisentido para identificar aquellas que presentan la mayor inhibición de la expresión del polipéptido ARGOS.

El polinucleótido de utilidad en la supresión antisentido puede corresponder a todo o parte del complemento de la secuencia que codifica al polipéptido ARGOS, todo o parte del complemento de la región no traducida 5' y/o 3' del transcripto ARGOS o todo o parte del complemento de la secuencia de codificación y la regiones no traducidas de un transcripto que codifica al polipéptido ARGOS. Además, el polinucleótido antisentido puede ser completamente complementario (es decir, 100% idéntico al complemento de la secuencia de interés) o parcialmente complementario (es decir, menos que un 100% idéntico al complemento de la secuencia de interés) de la secuencia de interés. La supresión antisentido se puede usar para inhibir la expresión de múltiples proteínas en la misma planta. Véase, por ejemplo, la Patente de los EE.UU. N°:5, 942,657. Además, se pueden usar porciones de los nucleótidos antisentido para interrumpir la expresión del gen de interés. En general, pueden usarse secuencias de al menos 50 nucleótidos, 100 nucleótidos, 200 nucleótidos, 300, 400, 450, 500, 550 o más. Se describen métodos para usar la supresión antisentido con el objeto de inhibir genes endógenos en plantas, por ejemplo, en Liu et al (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 y las Patentes de los EE.UU. N°: 5.759.829 y 5.942.657, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Es posible incrementar la eficacia de la supresión antisentido incluyendo una región poli-dT en el cásete de expresión en una posición 3' con respecto a la secuencia antisentido y 5' con respecto a la señal de poliadenilación. Véase, la Publicación de Patente de los EE.UU. N°: 20020048814, incorporada en la presente a modo de referencia.

/'/'/'. Interferencia con ARN de cadena doble En algunas realizaciones de la invención, se puede inhibir la expresión de un polipéptido ARGOS por medio de interferencia con ARN de cadena doble (dsARN). Para la interferencia con ARNcd, se expresa una molécula de ARN orientada en el sentido del marco de lectura como la que se describió precedentemente para la cosupresión y una molécula de ARN antisentido que es completa o parcialmente complementaria de la molécula de ARN orientada en el sentido del marco de lectura en la misma célula, dando como resultado la inhibición de la expresión del correspondiente ARN mensajero endógeno.

La expresión de las moléculas orientadas en el sentido del marco de lectura y antisentido se puede lograr diseñando el cásete de expresión para que contenga una secuencia orientada secuencia orientada en el sentido del marco de lectura y una secuencia antisentido. Como alternativa, se pueden usar casetes de expresión separados para las secuencias orientadas en el sentido del marco de lectura y las secuencias antisentido. Se pueden examinar múltiples líneas de plantas transformadas con el o los casetes de expresión para interferencia con ARNcd con el fin de identificar las líneas de plantas que muestran la mayor inhibición de la expresión del polipéptido ARGOS. Se describen métodos para usar interferencia de dsARN para inhibir la expresión de genes vegetales endógenos en Waterhouse et al. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 95:13959-13964, Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743, y WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631 y WO 00/49035; cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. ¡v. Interferencia con ARN en horquilla e interferencia con ARN en horquilla que contiene intrones En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la expresión de uno o un polipéptido ARGOS se puede obtener mediante la interferencia con ARN en horquilla (ARNh) o la interferencia con ARN en horquilla que contiene intrones (ARNhi). Estos métodos son altamente eficaces para inhibir la expresión de genes endógenos. Véase, Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4: 29-38 y las referencias citadas en la misma .

Para la interferencia con ARNh, se diseña un cásete de expresión para que exprese una molécula de ARN que se hibridiza consigo misma para formar una estructura en horquilla que comprende una región de bucle de cadena simple y un tallo con apareamiento de bases. La región del tallo con apareamiento de bases comprende una secuencia orientada en el sentido del marco de lectura correspondiente a todo o parte del ARN mensajero endógeno que codifica al gen cuya expresión se desea inhibir y una secuencia antisentido que es completa o parcialmente complementaria de la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura. Por consiguiente, la región de tallo con bases apareadas de la molécula generalmente determina la especificidad de la interferencia del ARN. Las moléculas de ARNhp son muy eficaces para inhibir la expresión de genes endógenos, y la interferencia de ARN que inducen es heredada por las generaciones de plantas subsiguientes. Véanse, por ejemplo, Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; y Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Se describen métodos para usar interferencia de hpARN para inhibir o silenciar la expresión de genes, por ejemplo, en Chuang y Meyerowitz (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 97:4985-4990; Stoutjesdijk et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini et al., BMC Biotechnology, 3:7, y la Publicación de Patente de los EE.UU. N°: 20030175965, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. En Panstruga et al. (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140, incorporada en la presente a modo de referencia, se describe un ensayo transitorio para la eficacia de construcciones de ARNh para silenciar la expresión genética in vivo.

Para el ARNhi, las moléculas que interfieren tienen la misma estructura general que para el ARNh, pero la molécula de ARN comprende además un intrón capaz de procesarse en la célula en la cual se expresa el ARNhi. El uso de un intrón minimiza el tamaño del bucle en la molécula de ARN en horquilla después del procesamiento, y esto incrementa la eficacia de la interferencia. Véase, por ejemplo, Smith et al. (2000) Nature 407:319-320. De hecho, Smith et al. demostraron un 100% de supresión de la expresión del gen endógeno usando interferencia mediada por ¡ARNhp. Los métodos para usar la interferencia con ARNhi para inhibir la expresión de genes endógenos vegetales se describen, por ejemplo, en Smith et al. (2000) Nature 407:319-320; Wesley et al. (2001) Plant J. 27:581-590; Wang y Waterhouse (2001) Curr. Opin. Planta Biol. 5:146-150; Waterhouse y Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell y Waterhouse (2003) Methods 30:289-295, y la Publicación de Patente de los EE.UU. N°: 20030180945, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia.

El cásete de expresión para la interferencia con ARNh también se puede diseñar de modo tal que la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura y la secuencia antisentido no corresponden al ARN endógeno. En esta realización, la secuencia orientada en el sentido del marco de lectura y la secuencia antisentido flanquean una secuencia en bucle que comprende una secuencia de nucleótidos correspondiente a todo o parte del ARN mensajero endógeno del gen de interés. Por consiguiente, es la región del bucle que determina la especificidad de la interferencia con ARN. Véase, por ejemplo, WO 02/00904, incorporada en la presente a modo de referencia. v. Interferencia mediada por amplicones Los casetes de expresión de amplicones comprenden una secuencia derivada de un virus de plantas que contiene todo o parte del gen de interés pero en general no todos los genes del virus nativo. Las secuencias virales presentes en el producto de transcripción del cásete de expresión permiten que el producto de la transcripción dirija su propia replicación. Los transcriptos producidos por el amplicón pueden estar en el sentido del marco de lectura o antisentido respecto de la secuencia blanco (es decir, el ARN mensajero del polipéptido ARGOS). Los métodos para usar amplicones en la inhibición de la expresión de genes endógenos vegetales se describen, por ejemplo, en Angelí y Baulcombe (1997) EMBO J. 16: 3675-3684, Angelí y Baulcombe (1999) Plant J. 20: 357-362, y en la Patente de los EE.UU. N°: 6.646.805, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. vi. Ribozimas En algunas realizaciones, el polinucleótido expresado por el cásete de expresión de la invención es un ARN catalítico o tiene una actividad de ribozima específica para el ARN mensajero del polipéptido ARGOS. Por consiguiente, el polinucleótido causa la degradación del ARN mensajero endógeno, dando como resultado una menor expresión del polipéptido ARGOS. Este método se describe, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. N°: 4.987.071, incorporada en la presente a modo de referencia. vii ARN pequeño de interferencia o micro ARN En algunas realizaciones de la invención, la inhibición de la expresión de un polipéptido ARGOS se puede lograr mediante interferencia con ARN por expresión de un gen que codifica un micro ARN (ARNmi). Los ARNmi son agentes reguladores que consisten de 22 ribonucleótidos aproximadamente. Los ARNmi son altamente eficaces en la inhibición de la expresión de genes endógenos. Véase, por ejemplo, Javier, et al., (2003) Nature 425:257-263, incorporada en la presente a modo de referencia.

Para la interferencia con ARNmi, el cásete de expresión es diseñado para que exprese una molécula de ARN que es modelado sobre un gen de ARNmi endógeno. El gen del ARNmi codifica un ARN que forma una estructura en horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleótidos que es complementaria de otro gen endógeno (secuencia blanco). Para suprimir la expresión de ARGOS, la secuencia de 22 nucleótidos se selecciona entre una secuencia de un transcripto ARGOS y contiene 22 nucleótidos de dicha secuencia ARGOS orientada en el sentido del marco de lectura y 21 nucleótidos de una secuencia antisentido correspondiente que es complementaria con la secuencia en el sentido del marco de lectura. Las moléculas de miARN son muy eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos, y la interferencia de ARN que inducen es heredada por generaciones subsiguientes de las plantas. 2. Inhibición de la expresión genética basada en polipéptidos En una realización, el polinucleótido codifica una proteína en dedo de zinc que se une a un gen que codifica un polipéptido ARGOS, dando como resultado una menor expresión del gen. En realizaciones particulares, la proteína con dedos de zinc se une a una región reguladora de un gen ARGOS. En otras realizaciones, la proteína en dedo de zinc se une a un ARN mensajero que codifica un polipéptido ARGOS e impide su traducción. Los métodos para seleccionar sitios para el direccionamiento por proteínas en dedo de zinc se describieron, por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. N°: 6.453.242, y los métodos para usar proteínas en dedo de zinc para inhibir la expresión de genes en plantas se describen, por ejemplo, en la publicación de Patente de los EE.UU. N°: 20030037355; cuyo contenido se incorpora en la presente a modo de referencia. 3. Inhibición de la actividad proteica basada en polipéptidos En algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido codifica un anticuerpo que se una a por lo menos un polipéptido ARGOS y reduce la actividad de regulación del desarrollo de células del polipéptido ARGOS. En otra realización, la unión del anticuerpo da como resultado un mayor recambio del complejo de anticuerpo-ARGOS por los mecanismos de control de calidad celulares. La expresión de anticuerpos en células vegetales y la inhibición de las vías moleculares por expresión y unión de anticuerpos a proteínas en células vegetales son bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, Conrad y Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21: 35-36, incorporada en la presente a modo de referencia. 4. Interrupción de genes En algunas realizaciones de la presente invención, se reduce o se elimina la actividad de un polipéptido ARGOS interrumpiendo al gen que codifica el polipéptido ARGOS. Se puede interrumpir al gen que codifica el polipéptido ARGOS empleando cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, en una realización el gen es interrumpido efectuando una marcación con transposones. En otra realización, el gen es interrumpido mutando plantas de maíz por mutagénesis al azar o dirigida, y seleccionando las plantas que presentan una actividad de regulación de la cantidad de células reducida.

/. Marcación con transposones En una realización de la invención, se usa una marcación con transposones para reducir o eliminar la actividad de ARGOS de uno o más polipéptidos ARGOS. La marcación con transposones comprende la inserción de un transposón dentro de un gen ARGOS endógeno para reducir o eliminar la expresión del polipéptido ARGOS. El término "gen ARGOS" se refiere al gen que codifica un polipéptido ARGOS acorde con la invención.

En esta realización, se reduce o se elimina la expresión de uno o más polipéptidos ARGOS insertando un transposón dentro de una región reguladora o una región codificante del gen que codifica el polipéptido ARGOS. Un transposón que se encuentra dentro de un exón, intrón, secuencia no traducida 5' o 3', un promotor o cualquier otra secuencia reguladora del gen ARGOS se puede usar para reducir o eliminar la expresión y/o la actividad del polipéptido ARGOS codificado.

Los métodos para efectuar la marcación con transposones de genes específicos en plantas son bien conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Maes et al. (1999) Trends Plant Sci. 4:90-96; Dharmapuri y Sonti (1999) FEMS Microbio!. Lett. 179:53-59; Meissner, et al., (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat, et al., (2000) J. Biosci. 25:57-63; Walbot (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107; y Gai, et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28:94-96; Fitzmaurice, et al., (1999) Genetics 153:1919- 928). Además, el proceso TUSC para seleccionar inserciones Mu en determinados genes se describe en Bensen, et al., (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena, er al., (1996) Science 274: 537-1540; y en la Patente de los EE.UU. N°: 5.962.764; cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia.

/'/'. Plantas mutantes con actividad reducida Hay otros métodos para disminuir o eliminar la expresión de genes endógenos en plantas que también son conocidos en la técnica y que se pueden aplicar de manera similar a la presente invención. Estos métodos incluyen otras formas de mutagénesis, tal como mutagénesis inducida por metansulfonato de etilo, mutagénesis por supresión y mutagénesis por supresión con irradiación rápida de neutrones usada en una genética inversa orientada en el sentido del marco de lectura (con PCR) para identificar líneas de plantas en las cuales se ha suprimido el gen endógeno. Por ejemplos de estos métodos véase Ohshima, et al., (1998) Virology 243:472-481; Okubara, et al., (1994) Genetics 137:867-874; y Quesada, et al., (2000) Genetics 154:421-436; cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Además, en la presente invención también se puede aplicar un método rápido y automatizable para rastrear mutaciones inducidas químicamente, el método TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes), que emplea HPLC desnaturalizante o digestión selectiva de endonucleasas de productos seleccionados de una PCR. Véase McCallum et al (2000) Nat. Biotechnol. 18:455-457, incorporado en la presente a modo de referencia.

Las mutaciones que afectan la expresión genética o interfieren con la función de la proteína codificada (actividad de regulación de la cantidad de células) son bien conocidas en la técnica. Las mutaciones de inserción en genes endógenos habitualmente dan como resultado mutantes nulas. Las mutaciones de residuos conservados son particularmente efectivas para inhibir la actividad de regulación de la cantidad de células de la proteína codificada. En la presente se describen residuos conservados de polipéptidos ARGOS vegetales apropiados para la mutagénesis, con el objeto de eliminar la actividad de regulación de la cantidad de células. Estos mutantes pueden aislarse de acuerdo con procedimientos bien conocidos, y pueden agruparse mutaciones en distintos loci ARGOS mediante cruzamientos genéticos. Véase, por ejemplo, Kusaba, et al., (2002) Plant Cell 14:2863-2882.

En otra realización de esta invención, se pueden usar los mutantes dominantes para provocar un silenciamiento del ARN debido a la inversión de genes y la recombinación de un locus genético duplicado. Véase, por ejemplo, Kusaba, eí al., (2003) Plant Cell 15:1455-1467.

La invención abarca métodos adicionales para reducir o eliminar la actividad de uno o más polipéptidos ARGOS. Los ejemplos de otros métodos para alterar o mutar una secuencia de nucleótidos genómica en una planta son conocidos en la técnica e incluyen, a modo de ejemplo, el uso de vectores de ARN:ADN, vectores de ARN:ADN de mutación, vectores de reparación de ARN:ADN, oligonucleótidos dobles mixtos, oligonucleótidos de ARN:ADN auto-complementarios y oligonucleobases recombinogénicos. Dichos vectores y métodos de uso son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las Patentes de los EE.UU. N°: 5.565.350; 5.731.181; 5.756.325; 5.760.012; 5.795.972; y 5.871.984; cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Véase también, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821, y Beetham, et al., (1999) Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. 96:8774-8778; cada una incorporada en la presente a modo de referencia.

//'/'. Modulación de la actividad de crecimiento y/o desarrollo de órganos en plantas En métodos específicos, se disminuye el nivel y/o la actividad de un regulador de la cantidad de células en una planta incrementando el nivel o la actividad del polipéptido ARGOS en la planta. Se describen métodos para incrementar el nivel y/o la actividad de polipéptidos ARGOS en una planta en otra parte de la presente documentación. Brevemente, estos métodos comprenden introducir un polipéptido ARGOS de la invención en una planta para incrementar el nivel y/o la actividad del polipéptido ARGOS. En otras realizaciones, se proporciona una secuencia de nucleotidos ARGOS, que codifica un polipéptido ARGOS, introduciendo en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleotidos ARGOS de la invención, expresando la secuencia ARGOS, incrementando la actividad del polipéptido ARGOS, y disminuyendo de este modo la cantidad de células en los tejidos o en otras partes de la planta. En otras realizaciones, la construcción de nucleotidos ARGOS que se introdujo en la planta se incorpora en forma estable en el genoma de la planta.

En otros métodos, se incrementa el número de células y biomasa de un tejido vegetal aumentando el nivel y/o la actividad del polipéptido ARGOS en la planta. Dichos métodos se describen con detalle en otra parte de la presente. En un método tal, se introduce una secuencia de nucleotidos ARGOS en la planta y la expresión de dicha secuencia de nucleotidos ARGOS disminuye la actividad del polipéptido ARGOS, y de esa manera incrementa el crecimiento y/o desarrollo de órganos vegetal en la planta o parte de planta. En otras realizaciones, la construcción de nucleotidos ARGOS que se introdujo en la planta se incorpora en forma estable en el genoma de la misma.

Como se describió previamente, el especialista podrá seleccionar el promotor apropiado que debe usar para modular el nivel/actividad de un polinucleótido y polipéptido en el crecimiento y/o desarrollo de órganos vegetal en la planta. Los ejemplos de promotores para esta realización se describieron en otra parte de la presente.

Por consiguiente, la presente invención provee además plantas que presentan un crecimiento y/o desarrollo de órganos vegetal modificado en comparación con el crecimiento y/o desarrollo de órganos vegetal de un tejido vegetal control. En una realización, la planta de la invención presenta un incremento en el nivel/actividad del polipéptido ARGOS de la invención y por ende presenta un mayor crecimiento y/o desarrollo de órganos vegetal en el tejido de la planta. En otras realizaciones, la planta de la invención presenta un nivel reducido o eliminado del polipéptido ARGOS de la invención y por ende muestra una disminución en el crecimiento y/o desarrollo de órganos vegetal en el tejido vegetal. En otras realizaciones, estas plantas han incorporado de forma estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos ARGOS de la invención, ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. iv. Modulación del desarrollo en raices Se proveen métodos de modulación del desarrollo radicular en una planta. El término "modulación del desarrollo radicular" se refiere a cualquier alteración en el desarrollo de la raíz de la planta en comparación con una planta control. Dichas alteraciones en el desarrollo radicular incluyen, a modo de ejemplo, alteraciones en el índice de crecimiento de la raíz primaria, el peso fresco de la raíz, el grado de formación de raíces laterales y adventicias, el sistema vascular, desarrollo del meristema o expansión radial.

Se proveen métodos de modulación del desarrollo radicular en una planta. Los métodos comprenden la modulación del nivel y/o de la actividad del polipéptido ARGOS en la planta. En un método, se provee una secuencia ARGOS de la invención en la planta. En otro método, la secuencia de nucleótidos ARGOS se provee introduciendo en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos ARGOS de la invención, expresando la secuencia ARGOS, y modificando así el desarrollo radicular. En aún otros métodos, la construcción de nucleótidos ARGOS introducida en la planta se incorpora en forma estable en el genoma de la planta.

En otros métodos, se modula el desarrollo de la raíz alterando el nivel o la actividad del polipéptido ARGOS en la planta. Un aumento en la actividad de ARGOS puede resultar en al menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo de la raíz, incluyendo, en un sentido no limitativo, mayores meristemas radiculares, mayor crecimiento radicular, mayor expansión radial, un sistema de vasculatura mejorado, mayor ramificación radicular, más raices adventicias, y/o un incremento en el peso fresco de la raíz, en comparación con una planta control.

Tal como se utiliza en la presente, el término "crecimiento radicular" abarca todos los aspectos de crecimiento de las diferentes partes que conforman el sistema radicular en diferentes etapas de su desarrollo en plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Se debe tener en cuenta que dicho mayor crecimiento radicular puede ser el resultado de un mayor crecimiento de una o más de sus partes incluyendo la raíz primaria, las raíces laterales, raíces adventicias, etc.

Los métodos para medir dichas alteraciones del desarrollo en el sistema radicular son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: 2003/0074698 y Werner, et al., (2001) PNAS 8:10487-10492, ambas incorporadas en la presente a modo de referencia.

Como se describió precedentemente, el especialista podrá reconocer al promotor apropiado para su uso en la modulación del desarrollo radicular en la planta. Los ejemplos de promotores para esta realización incluyen promotores constitutivos y promotores con preferencia por raices. Los ejemplos de promotores con preferencia por raíces se describieron en otra parte de la presente.

La estimulación del crecimiento radicular y el incremento en la masa radicular mediante un aumento en la actividad y/o nivel del polipéptido ARGOS también son de utilidad en el mejoramiento de la capacidad de permanecer en pie de una planta. El término "resistencia al vuelco" o "capacidad de permanecer en pie" se refiere a la capacidad de una planta de fijarse a sí misma en el suelo. Para las plantas con un hábito de crecimiento erecto o semi-erecto, este término también hace referencia a la capacidad de mantener una posición erecta bajo condiciones (ambientales) adversas. Esta característica se relaciona con el tamaño, la profundidad y la morfología del sistema radicular. Además, también puede usarse la estimulación del crecimiento radicular y el incremento de la masa radicular mediante la disminución del nivel y/o la actividad del polipéptido ARGOS en la promoción de la propagación in vitro de los explantes.

Además, la mayor producción de biomasa radicular debida a un mayor nivel y/o actividad de ARGOS tiene un efecto directo sobre el rendimiento y un efecto indirecto sobre la producción de los compuestos generados por las células de las raíces, o por cultivos de células obtenidas a partir de dichas raíces transgénicas. Un ejemplo de un compuesto interesante producido en cultivos de raíces es la shikonina, cuyo rendimiento puede mejorarse ventajosamente con dichos métodos.

Por consiguiente, la presente invención provee además plantas que presentan un desarrollo radicular modulado en comparación con el desarrollo radicular de una planta control. En algunas realizaciones, la planta de la invención presenta un mayor nivel/actividad del polipéptido ARGOS de la invención y mejoras en el crecimiento radicular y/o la biomasa de la raíz.

En otras realizaciones, estas plantas han incorporado en forma estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos ARGOS de la invención, ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. v. Modulación del desarrollo de brotes y de hojas También se proveen métodos para modular el desarrollo de brotes y de hojas en una planta. El término "modulación del desarrollo de brotes y/o de hojas" se refiere a cualquier alteración en el desarrollo de brotes y/o de hojas de la planta. Dichas alteraciones en el desarrollo de brotes y/o de hojas incluyen, a modo de ejemplo, alteraciones en el desarrollo de brotes del meristema, en la cantidad de hojas, el tamaño de hojas, en la vasculatura de hojas y tallo, longitud de internodos y senescencia de las hojas. Tal como se utiliza en la presente, los términos "desarrollo de hojas" y "desarrollo de brotes" abarca todos los aspectos del crecimiento de las diferentes partes que conforman el sistema foliar y el sistema de brotes, respectivamente, en las diferentes etapas de su desarrollo, tanto en plantas monocotiledóneas como dicotiledóneas. En la técnica se conocen métodos para medir estas alteraciones en el desarrollo del sistema de brotes y hojas. Véanse, por ejemplo Werner et al. (2001) PNAS 98:10487-10492, y la Solicitud de los EE.UU. N° 2003/0074698, que se incorporan en la presente documentación a modo de referencia.

El método para modular el desarrollo de brotes y/o de hojas en una planta comprende la modulación de la actividad y/o del nivel de un polipéptido ARGOS de la invención. En una realización, se provee una secuencia ARGOS de la invención. En otras realizaciones, la secuencia de nucleótidos ARGOS se puede proporcionar introduciendo en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos ARGOS de la invención, expresando la secuencia ARGOS, y modificando de este modo el desarrollo de los brotes y/o las hojas. En otras realizaciones, la construcción de nucleótidos ARGOS que se introdujo en la planta se incorpora en forma estable en el genoma de la planta.

En realizaciones específicas, se modula el desarrollo de brotes o de hojas incrementando el nivel y/o la actividad del polipéptido ARGOS en la planta. Un incremento en la actividad de ARGOS puede dar como resultado al menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo de los brotes y/o las hojas, incluyendo, en un sentido no limitativo, menor cantidad de hojas, menor superficie foliar, sistema vascular reducido, ¡nternodos más cortos y crecimiento acortado, y senescencia demorada de las hojas, en comparación con una planta control.

Como se describió precedentemente, el especialista podrá reconocer al promotor apropiado para su uso en la modulación del desarrollo de brotes y de hojas de la planta. Los ejemplos de promotores para esta realización incluyen promotores constitutivos, promotores con preferencia por brotes, promotores con preferencia por brotes del meristema y promotores con preferencia por hojas. Los ejemplos de promotores se describieron en otra parte de la presente.

La disminución de la actividad y/o el nivel de ARGOS en una planta resulta en ¡nternodos más cortos y en un crecimiento achaparrado. Por consiguiente, los métodos de la invención pueden usarse para producir plantas enanas. Además, como se describió previamente, la modulación de la actividad de ARGOS en la planta modula el crecimiento de las raices y los brotes. Por consiguiente, la presente invención provee además métodos para alterar la relación raíces/brotes. Puede modularse además el desarrollo de los brotes o las hojas disminuyendo el nivel y/o la actividad del polipéptido ARGOS en la planta.

Por consiguiente, la presente invención provee además plantas que presentan un desarrollo modulado de brotes y/o de hojas en comparación con una planta control. En algunas realizaciones, la planta de la invención tiene un mayor nivel/actividad del polipéptido ARGOS de la invención, alterando asi el desarrollo de brotes y/u hojas. Dichas alteraciones incluyen, pero en un sentido no limitativo, un incremento en el número de hojas, un incremento en la superficie foliar, una mayor vascularidad, internodos más largos y un incremento en la altura de la planta, así como alteraciones en la senescencia de hojas, en comparación con una planta control. En otras realizaciones, la planta de la invención presenta un menor nivel/actividad del polipéptido ARGOS de la invención. vi Modulación del desarrollo del tejido reproductor Se proveen métodos para modular el desarrollo del tejido reproductor. En una realización, se proveen métodos para modular el desarrollo floral en una planta. El término "modulación del desarrollo floral" se refiere a cualquier alteración en la estructura del tejido reproductor de una planta en comparación con una planta control en la cual no está modulada la actividad o el nivel del polipéptido ARGOS. El término "modulación del desarrollo floral" incluye además cualquier alteración en la sincronización del desarrollo del tejido reproductor de una planta (es decir, una sincronización demorada o acelerada del desarrollo floral) en comparación con una planta control en la cual no se ha modulado la actividad o el nivel del polipéptido ARGOS. Las alteraciones macroscópicas pueden incluir cambios en el tamaño, la forma, la cantidad o la localización de los órganos reproductivos, el período de tiempo de desarrollo en que se forman estas estructuras, o la capacidad de mantener o proceder con el proceso de florecimiento en momentos de estrés ambiental. Las alteraciones microscópicas pueden incluir cambios en los tipos o las formas de las células que conforman los órganos reproductores.

El método para modular el desarrollo floral en una planta comprende la modulación de la actividad ARGOS en una planta. En un método, se provee una secuencia ARGOS de la invención. La secuencia de nucleótidos ARGOS se puede proveer introduciendo en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos ARGOS de la invención, expresando la secuencia ARGOS y modificando de este modo desarrollo floral. En otras realizaciones, la construcción de nucleótidos ARGOS introducida en la planta se incorpora en forma estable en el genoma de la planta.

En métodos específicos, se modula el desarrollo floral disminuyendo el nivel o la actividad del polipéptido ARGOS en la planta. Una disminución en la actividad de ARGOS puede dar como resultado al menos una o más de las siguientes alteraciones en el desarrollo floral, incluyendo, en un sentido no limitativo, un florecimiento demorado, una menor cantidad de flores, esterilidad masculina parcial y menor establecimiento de semillas, en comparación con una planta control. Se puede usar inducción de un florecimiento demorado o la inhibición del florecimiento para mejorar el rendimiento en cultivos de forrajeo, tales como alfalfa. Los métodos para medir dichas alteraciones del desarrollo en el desarrollo floral son conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Mouradov, et al., (2002) The Plant Cell S111-S130, incorporada en la presente a modo de referencia.

Como se describió precedentemente, el especialista podrá reconocer al promotor apropiado para su uso en la modulación del desarrollo floral de la planta. Los ejemplos de promotores para esta realización incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores con preferencia por brotes y promotores con preferencia por inflorescencias.

En otros métodos, se modula el desarrollo floral aumentando el nivel y/o la actividad de la secuencia ARGOS de la invención. Dichos métodos pueden comprender la introducción de una secuencia de nucleótidos ARGOS en la planta y el aumento de la actividad del polipéptido ARGOS. En otros métodos, la construcción de nucleótidos ARGOS que se introdujo en la planta se incorpora en forma estable en el genoma de la planta. El aumento de la expresión de la secuencia ARGOS de la invención puede modular el desarrollo floral durante los períodos de estrés. Dichos métodos se describen en otra parte en la presente. Por consiguiente, la presente invención provee además plantas que presentan un desarrollo floral modulado en comparación con el desarrollo floral de la planta control. Las composiciones incluyen plantas que presentan un mayor nivel/actividad del polipéptido ARGOS de la invención y que presentan un desarrollo floral alterado. Las composiciones también incluyen plantas que presentan una mayor nivel/actividad del polipéptido ARGOS de la invención donde dichas plantas permanecen o avanzan a través del proceso de floración en épocas de estrés.

También se proveen métodos para usar las secuencias ARGOS de la invención para incrementar el tamaño y/o el peso de las semillas. El método comprende incrementar la actividad de las secuencias ARGOS en una planta o una parte de una planta, tal como la semilla. Un incremento en el tamaño y/o el peso de las semillas comprende un tamaño o un peso mayor de las semillas, y/o un incremento en el tamaño o el peso de una o más partes de las semillas, incluyendo, por ejemplo, el embrión, el endosperma, el recubrimiento de las semillas, la aleurona o el cotiledón.

Como se describió previamente, los especialistas en la técnica reconocerán los promotores apropiados para usar en el incremento del tamaño y/o el peso de las semillas. Los ejemplos de promotores de esta realización incluyen promotores constitutivos, promotores inducibles, promotores con preferencia por las semillas, promotores con preferencia por los embriones y promotores con preferencia por el endosperma.

El método para disminuir el tamaño de la semilla y/o el peso de la semilla en una planta comprende incrementar la actividad de ARGOS en la planta. En una realización, la secuencia de nucleótidos ARGOS puede proporcionarse introduciendo en la planta un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos ARGOS de la invención, expresando la secuencia ARGOS y disminuyendo de este modo el peso y/o el tamaño de las semillas. En otras realizaciones, la construcción de nucleotidos ARGOS introducida en la planta se incorpora en forma estable en el genoma de la planta.

Se reconoce además que el incremento en el tamaño y/o el peso de las semillas también se puede obtener incrementando la velocidad de crecimiento de los retoños o incrementando el vigor temprano. Tal como se utiliza en la presente, el término "vigor temprano" hace referencia a la capacidad de una planta de crecer rápidamente durante el desarrollo temprano, y se relaciona con el establecimiento exitoso, después de la germinación, de un sistema radicular bien desarrollado y un aparato fotosintético bien desarrollado. Además, un incremento en el tamaño y/o el peso de las semillas también puede resultar en un incremento en el rendimiento de la planta, en comparación con un control.

Por consiguiente; la presente invención provee además plantas que tienen un mayor peso de las semillas y/o un mayor tamaño de las semillas, en comparación con una planta control. En otras realizaciones, también se proveen plantas que presentan un mayor vigor y rendimiento de la planta. En algunas realizaciones, la planta de la invención tiene un mayor nivel/actividad de polipéptido ARGOS de la invención y un mayor número de semillas y/o tamaño de semilla. En otras realizaciones, estas plantas han incorporado en forma estable en su genoma una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleotidos ARGOS de la invención, ligada operativamente a un promotor que dirige la expresión en la célula vegetal. vii Método de uso de los polinucleótidos del promotor ARGOS Los polinucleótidos que comprenden los promotores ARGOS descritos en la presente invención, así como variantes y fragmentos de los mismos, son de utilidad en la manipulación genética de cualquier célula huésped, preferentemente una célula vegetal, cuando se ensamblan con una construcción de ADN de modo tal que la secuencia promotora está ligada operativamente a una secuencia de nucleótidos que comprende un polinucleótido de interés. De esta manera, los polinucleótidos de los promotores ARGOS de la invención se proveen en casetes de expresión junto con una secuencia de polinucleótidos de interés para su expresión en la célula huésped de interés. Tal como se describirá más adelante en el Ejemplo 2, las secuencias promotoras ARGOS de la invención se expresan en diversos tejidos y por consiguiente las secuencias promotoras pueden ser de utilidad en la regulación de la expresión temporal y/o espacial de los polinucleótidos de interés.

Las regiones promotoras híbridas sintéticas son conocidas en la técnica. Dichas regiones comprenden elementos promotores 5' de un polinucleótido ligados operativamente al elemento promotor de otro polinucleótido. En una realización de la invención, la expresión de la secuencia heteróloga es controlada por un promotor híbrido sintético que comprende las secuencias promotoras ARGOS de la invención, o una variante o un fragmento de éstas, ligadas operativamente a elementos promotores río arriba de un promotor heterólogo. Se han identificado los elementos promotores 5' que están comprometidos en el sistema de defensa de la planta y se pueden usar para generar un promotor sintético. Véase, por ejemplo, Rushton, et al., (1998) Curr. Opin. Plant Biol. 1:311-315. Como alternativa, la secuencia del promotor sintético ARGOS puede comprender duplicaciones de los elementos promotores 5' presentes dentro de las secuencias promotoras ARGOS.

Se reconoce que puede usarse la secuencia promotora de la invención con sus secuencias codificantes ARGOS nativas. Se puede usar una construcción de ADN que comprende el promotor ARGOS ligado operativamente con su gen ARGOS nativo para transformar cualquier planta y obtener un cambio fenotípico deseado, tal como la modulación del desarrollo de células, la modulación del desarrollo radicular, foliar, floral y embrionario, la tolerancia al estrés, y cualquier otro fenotipo descripto en otra parte de la presente documentación.

Las secuencias de nucleótidos promotoras y los métodos descriptos en la presente son útiles para regular la expresión de cualquier secuencia de nucleótidos heteróloga en una planta huésped, con el objeto de alterar el fenotipo de una planta. Los diversos cambios en el fenotipo son de interés, incluyendo la composición de ácidos grasos en una planta, la alteración del contenido de aminoácidos de una planta, la alteración del mecanismo de defensa de una planta y semejantes. Estos resultados se pueden lograr con la expresión de los productos heterólogos o con una mayor expresión de los productos endógenos en las plantas. Como alternativa, dichos resultados se pueden obtener suministrando una reducción de la expresión de uno o más productos endógenos, en particular enzimas o cofactores en la planta. Estos cambios dan como resultado un cambio en el fenotipo de la planta transformada.

Los genes de interés reflejan los mercados comerciales y los intereses de aquellos que están comprometidos en el desarrollo del cultivo. Los cultivos y mercados de interés cambian y, a medida que las naciones en desarrollo se abren a los mercados mundiales, también emergerán nuevos cultivos y tecnologías. Además, a medida que crece el conocimiento de caracteres y características agronómicas, tales como el rendimiento y la heterosis, varía la selección de genes a transformar en forma concordante. Las categorías generales de los genes de interés incluyen, por ejemplo, los genes comprometidos en la información, tal como dedos de zinc, los genes comprometidos en la comunicación, tal como quinasas, y los genes comprometidos en el mantenimiento, tal como las proteínas de shock de calor. Las categorías más específicas de transgenes incluyen, por ejemplo, genes que codifican características importantes para la agronomía, resistencia a insectos, resistencia a enfermedades, resistencia a herbicida, esterilidad, características de los granos y productos comerciales. En general, los genes de interés incluyen aquellos que participan en el metabolismo de aceites, almidón, hidratos de carbono o nutrientes, así como aquellos que afectan el tamaño de los granos, la carga de sacarosa y semejantes.

En determinadas realizaciones las secuencias de ácido nucleico de la presente invención se pueden usar en combinación ("apiladas") con otras secuencias de polinucleótidos de interés con el fin de crear plantas con un fenotipo deseado. Las combinaciones generadas pueden incluir múltiples copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la presente invención se pueden combinar con cualquier gen o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de caracteres, incluyendo, en un sentido no limitativo, caracteres deseables para alimentos para animales, tales genes que confieren un contenido elevado de aceite (por ejemplo, Patente de los EE.UU. N° 6.232.529); aminoácidos balanceados (por ejemplo, hordotioninas (Patentes de los EE.UU. N° 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802; y 5.703.409); alto contenido de lisina de cebada (Williamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; y WO 98/20122) y proteínas ricas en metionina (Pedersen, et al., (1986) J. Biol. Chem. 261 :6279; Kirihara, et al., (1988) Gene 71:359; y Musumura, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); mayor digestibilidad (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (Solicitud de Patente de los EE.UU. N° Acta: 10/053.410, presentada el 7 de noviembre, 2001); y tiorredoxinas (Solicitud de Patente de los EE.UU. N° Acta: 10/005.429, presentada el 3 de diciembre, 2001)); cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Los polínucleótidos de la presente invención también se pueden apilar con características deseables para resistencia a insectos, enfermedades o herbicidas (por ejemplo, proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patentes de los EE.UU. N°: 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; Geiser et al., (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme et al., (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); genes de detoxificación de fumonisina (Patente de los EE.UU. N°: 5.792.931); genes de avirulencia y resistencia a enfermedades (Jones et al., (1994) Science 266:789; Martin eí al., (1993) Science 262:1432; Mindrinos et al., (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintetasa (ALS) que conducen a resistencia a herbicidas, tal como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintetasa tal como fosfinotricina o Basta (por ejemplo, el gen bar); y resistencia a glifosato (gen EPSPS)); y características deseables para el procesamiento o los productos de procesos tal como alto contenido de aceites (por ejemplo, en la Patente de los EE.UU. N°: 6.232.529); aceites modificados (por ejemplo, genes de ácido graso desaturasas (Patente de los EE.UU. N°: 5.952.544; WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, ADPG pirofosforilasas (AGPasa), almidón sintetasas (SS), enzimas ramificadoras de almidón (SBE) y enzimas desramificadoras de almidón (SDBE)); y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, Patente de los EE.UU. N°: 5.602.321; beta-cetotiolasa, polihidroxibutirato sintetasa y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert et al., (1988) J. Bacterio!. 170:5837-5847) facilita la expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs)), cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. También se podrían combinar los polinucleótidos de la presente invención con los polinucleótidos que afectan características agronómicas, tal como esterilidad masculina (por ejemplo, véase la Patente de los EE.UU. N°: 5.583.210), longitud de tallos, momento de floración o características de tecnología de transformación tal como regulación del ciclo celular o direccionamiento de genes (por ejemplo, WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia.

En una realización, las secuencias de interés mejoran el crecimiento de las plantas y/o los rendimientos del cultivo. Por ejemplo, las secuencias de interés incluyen genes agronómicamente importantes que dan como resultado mejores sistemas radiculares primarios o laterales. Estos genes incluyen, en un sentido no limitativo, transportadores de nutrientes/agua e inductores del crecimiento. Los ejemplos de dichos genes incluyen, en un sentido no limitativo, H+-ATPasa de membrana plasmática de maíz (MHA2) (Frías et al., (1996) Plant Cell 8:1533-44); AKT1, un componente del aparato de captación de potasio en Arabidopsis , (Spalding et al., (1999) J Gen Physiol 773:909-18); genes RML que activan el ciclo de división celular en las células apicales de raíz (Cheng et al. (1995) Plant Physiol 708:881 ); genes de glutamina sintetasa de maíz (Sukanya et al., (1994) Plant Mol Biol 26:1935-46) y hemoglobina (Duff et al., (1997) J. Biol. Chem 27:16749- 6752, Arredondo-Peter er al., (1997) Plant Physiol. 775:1259-1266; Arredondo-Peter et al., (1997) Plant Physiol 774:493-500 y las referencias citadas en las mismas). La secuencia de interés también puede ser útil para expresar secuencias de nucleótidos antisentido de genes que afectan negativamente el desarrollo de la raíz.

Además, pueden alterarse caracteres de importancia agrícola, tales como el contenido de aceite, almidón y proteínas, por modificación genética, además del uso de métodos de cruzamiento tradicionales. Las modificaciones incluyen el incremento del contenido de ácido oleico, aceites saturados e insaturados, el incremento de los niveles de lisina y azufre, la provisión de aminoácidos esenciales y también la modificación del almidón. Las modificaciones de la proteína hordotionina se describen en las Patentes de los EE.UU. N°: 5.703.049, 5.885.801, 5.885.802 y 5.990.389, incorporadas en la presente a modo de referencia. Otro ejemplo es la proteína de semilla rica en lisina y/o azufre codificada por 2S albúmina de soja descrita en la Patente de los EE.UU. N°: 5.850016, y el inhibidor de quimotripsina de cebada, descrito en Williamson ef al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia.

Se pueden elaborar derivados de los siguientes genes por mutagénesis dirigida al sitio para incrementar el nivel de aminoácidos preseleccionados en el polipéptido codificado. Por ejemplo, el gen que codifica el polipéptido rico en lisina de cebada (BHL) deriva del inhibidor de quimiotripsina de cebada, Solicitud de Patente de los EE.UU. N°: 08/740.682, presentada el 1 de noviembre, 1996, WO 9820133, cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia. Otras proteínas incluyen proteínas vegetales ricas en metionina tales como de semilla de girasol (Lilley et al., (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, ed. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), págs. 497-502; incorporada en la presente a modo de referencia); de maíz (Pedersen et al., (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara et al., (1988) Gene 71:359; cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia); y de arroz (Musumura et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:123, incorporada en la presente a modo de referencia). Otros genes agronómicamente importantes codifican látex, Floury 2, factores de crecimiento, factores de almacenamiento en semillas y factores de transcripción.

Los genes de resistencia a insectos pueden codificar resistencia a plagas que representan una gran pérdida en el rendimiento, tal como gusanos de la raíz, gusanos cortadores, barrenador del maíz europeo y semejantes. Dichos genes incluyen, por ejemplo genes de las proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (Patentes de los EE.UU. N°: 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; y Geiser et al., (1986) Gene 48:109); y semejantes.

Los genes que codifican características de resistencia a enfermedades pueden incluir: genes de desintoxícación, tal como contra fumonisina (Patente de los EE.UU. N°: 5.792.931); genes de avirulencia (avr) y genes de resistencia a enfermedades (R) (Jones et al., (1994), Science 266: 789; Martin et al., (1993) Science 262: 1432; Mindrinos et al., (1994), Cell 78:1089); y semejantes.

Los caracteres de resistencia a herbicidas pueden incluir genes que codifican resistencia a los herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la acetolactato sintetasa (ALS), en particular los herbicidas tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen de acetolactato sintetasa (ALS) que contiene mutaciones que permiten obtener dicha resistencia, en particular las mutaciones S4 y/o Hra), genes que codifican resistencia a herbicidas que actúan inhibiendo la acción de la glutamina sintetasa, tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), u otros genes como los mencionados conocidos en la técnica. El gen bar codifica resistencia al herbicida basta, el gen nptll codifica resistencia a los antibióticos kanamicina y geneticina, y las mutantes del gen ALS codifican resistencia al herbicida clorsulfurón.

Los genes para esterilidad también pueden estar codificados en un cásete de expresión y proveen una alternativa a la emasculación física. Los ejemplos de genes usados de tal manera incluyen los genes con preferencia por tejido masculino y los genes con fenotipos de esterilidad masculina tal como QM, descritos en la Patente de los EE.UU. N°:5,583,210. Otros genes incluyen las quinasas y los que codifican compuestos tóxicos para el desarrollo gametofítico ya sea masculino o femenino.

La calidad del grano se refleja en características tales como los niveles y tipos de aceites, saturados e insaturados, calidad y cantidad de aminoácidos esenciales y los niveles de celulosa. En maíz, las proteínas modificadas de la hordotionina se describen en las Patentes de los EE.UU. N°: 5.703.049, 5.885.801, 5.885.802 y 5.990.389.

Las características comerciales también pueden estar codificadas por uno o más genes que podrían incrementar, por ejemplo, el almidón para la producción de etanol, o proveer expresión de proteínas. Otro uso comercial importante de las plantas transformadas es la producción de polímeros y bioplásticos tal como se describe en la Patente de los EE.UU.

N°: 5.602.321. Los genes, tal como de -cetotiolasa , PHBasa (polihidroxibutirato sintetasa) y acetoacetil-CoA reductasa (véase Schubert et al., (1988) J. Bacterio!. 170:5837-5847) facilitan la expresión de polihidroxialcanoatos (PHA).

Los productos exógenos incluyen enzimas y productos vegetales, así como los de otras fuentes incluyendo procariotas y otros eucariotas. Dichos productos incluyen enzimas, cofactores, hormonas y semejantes. Se puede incrementar el nivel de proteínas, en particular de proteínas modificadas con una mejor distribución de aminoácidos para mejorar el valor nutritivo de la planta. Esto se logra con la expresión de proteínas que poseen un mayor contenido de aminoácidos.

Esta invención se puede comprender mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes. Los especialistas en la técnica podrán apreciar que pueden ponerse en práctica otras realizaciones de la invención sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención, como se describe y reivindica en la presente.

EJEMPLOS Ejemplo 1. Aislamiento de las secuencias de ARGOS Se empleó una rutina para identificar todos los miembros de una familia de genes para realizar una búsqueda de los genes ARGOS de interés. Se preparó un conjunto diverso de todos los miembros conocidos de la familia de genes como secuencias de proteínas. Estos datos incluyen secuencias de otras especies. Se realizan búsquedas con estas especies en un conjunto de datos de secuencias de maíz propietarias, y se identifica un conjunto no redundante de aciertos superpuestos. Se toman las secuencias de nucleótidos de cualquier gen de interés por separado y se realizan búsquedas en la base de datos para obtener un conjunto no redundante de aciertos completamente superpuestos. Luego se compara el conjunto de aciertos de proteínas con los aciertos de nucleótidos. Si la familia de genes está completa, todos los aciertos de proteínas están contenidos en los aciertos de nucleótidos. La familia de genes ARGOS consiste de 3 genes de Arabidopsis , 8 genes de arroz, 9 genes de maíz, 9 genes de sorgo y 5 genes de soja. En la Figura 1 se provee una representación en la forma de un dendrograma de las relaciones de las proteínas codificadas por estos genes.

Ejemplo 2. Análisis de la secuencia ARGOS Los polipéptidos ZmARGOS de la presente invención tienen características en común con los genes ARGOS de una variedad de especies vegetales. La relación entre los genes de múltiples especies vegetales se muestra en una alineación, véanse las Figuras 2. La Figura 3 muestra ZmARGOS 1, 2, 3, y AtARGOS 1 (SEQ ID N°: 2, 4, 6 y 26). Las proteínas codificadas por los genes ARGOS contienen una región rica en prolina bien conservada cerca del extremo C-terminal. Los extremos N-terminales son más divergentes. Las proteínas son relativamente cortas, de 110 aminoácidos en promedio.

Ejemplo 3. Transformación y regeneración de las plantas transgénicas Se bombardean embriones inmaduros de maíz de plantas donantes de invernadero con un plásmido que contiene la secuencia ZmARGOS ligada operativamente al promotor inducible por sequía RAB17 (Vilardell, et al., (1990) Plant Mol Biol 14:423-432) y el gen marcador de selección PAT, que confiere resistencia al herbicida Bialafos. Como alternativa, se proporciona el gen marcador de selección en un plásmido separado. La transformación se llevó a cabo de la siguiente manera. Más adelante se muestran las recetas de los medios.

Preparación del tejido blanco: A las mazorcas se les quita la chala y se esterilizan las superficies en blanqueador Chlorox al 30%, más detergente Micro 0,5% por 20 minutos y luego se lavan dos veces con agua estéril. Se recortaron los embriones inmaduros y se colocaron con el eje embrionario hacia abajo (el lado del escutelo hacia arriba), 25 embriones por placa, sobre medio 560Y durante 4 horas y luego se alinearon dentro de la zona blanco de 2,5 cm como preparación para el bombardeo.

Preparación del ADN: Se prepara un vector plasmídico que comprende la secuencia ARGOS ligada operativamente a un promotor de ubiquitina. Este ADN plásmido y el ADN plásmido que contenía el marcador seleccionable PAT se hicieron precipitar sobre partículas de tungsteno de 1,1 pm (diámetro promedio) utilizando el siguiente procedimiento de precipitación por CaCI2: 100 pl de partículas de tungsteno preparadas en agua 10 µ? (1 pg) de ADN en solución amortiguadora Tris-EDTA (1 pg de ADN total) 100 pl de CaCI22,5 M 10 pl de espermidina 0,1 M Cada reactivo se agrega en forma consecutiva a la suspensión de partículas de tungsteno, mientras se mantiene esta última en un agitador para múltiples tubos. La mezcla final fue sonicada brevemente y se incubó bajo agitación con vórtex constante durante 10 minutos. Después del periodo de precipitación, los tubos fueron centrifugados brevemente, se eliminó el líquido, se lavaron con 500 mi de etanol al 100% y se centrifugaron durante 30 segundos. Se elimina el líquido nuevamente y se agregan 105 pl de etanol al 100% a los precipitados finales de partículas de tungsteno. Para el bombardeo con pistola de partículas, se sonican brevemente las partículas de tungsteno/ADN, se introducen 10 µ? en el centro de cada macrotransportador y se deja secar por aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo.

Tratamiento con pistola de partículas: Las placas de muestras fueron bombardeadas en el nivel N° 4 en una pistola de partículas N° HE34-1 o N° HE34-2. Todas las muestras recibieron un único disparo a 650 PSI, con un total de 10 alícuotas tomadas de cada tubo de partículas/ADN que se preparó.

Tratamiento subsiguiente: Luego del bombardeo, los embriones se mantuvieron en medio 560Y durante 2 días y luego se transfirieron a un medio de selección 560R que contenía Bialafos 3 mg/litro y se subcultivaron cada dos semanas. Después de aproximadamente 10 días de selección, los clones de los callos resistentes a la selección se transfirieron a medio 288J para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración de los embriones somáticos (2-4 semanas), los embriones somáticos bien desarrollados fueron transferidos a un medio para germinación y luego a un cuarto de cultivo iluminado. Aproximadamente 7-10 días mas tarde, las plántulas desarrolladas se transfirieron al medio libre de hormona 272V en tubos durante 7-10 días hasta que las plántulas se establecieron correctamente. Las plantas fueron transferidas luego a insertos en bandejas planas (equivalentes a macetas de 2,5") que contenían tierra para macetas y se dejaron crecer durante una semana en una cámara de crecimiento, haciéndolas crecer luego por 1-2 semanas adicionales en invernadero, y después se las transfirió a macetas clásicas 600 (1 ,6 galones) y se dejaron crecer hasta alcanzar la madurez. Se monitorea y se analiza la mayor tolerancia a la sequía de las plantas. Los ensayos para medir la mayor tolerancia a la sequía son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, rendimientos de capacidad de obtención de granos mejorados bajo condiciones de sequía, en comparación con plantas de maíz control bajo condiciones ambientales idénticas. Como alternativa, en las plantas transformadas se puede monitorear la modulación en el desarrollo del meristema (es decir, una disminución en la formación de espiguillas en la mazorca). Véase, por ejemplo, Bruce, et al., (2002) Journal of Experimental Botany 53:1-13.

Bombardeo y medios de cultivo: El medio de bombardeo (560Y) comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C-1416), mezcla de vitaminas de Eriksson 1,0 ml/l (1000X SIGMA-1511 ), tiamína HCI 0,5 mg/l, sacarosa 120,0 g/l,. 2,4-D 1,0 mg/l y L-prolina 2,88 g/l (llevada a volumen con H20 D-l después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); Gelrite 2,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con H20 D-l); y nitrato de plata 8,5 mg/l (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente). El medio de selección (560R) comprende sales básales N6 4,0 g/l (SIGMA C-1416), mezcla de vitaminas de Eriksson 1 ,0 ml/l (1000X SIGMA- 5 1 ), tiamina HCI 0,5 mg/l, sacarosa 30,0 g/l y 2,4-D 2,0 mg/l (llevado a volumen con H20 D-l después de ajustar el pH en 5,8 con KOH); Gelrite 3,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con H20 D-l); y nitrato de plata 0,85 mg/l y Bialafos 3,0 mg/l (ambos agregados después de esterilizar el medio y enfriar a temperatura ambiente).

El medio de regeneración de plantas (288J) comprende sales MS 4,3 g/l (GIBCO 11117-074), solución madre de vitaminas MS 5,0 ml/l (0,100 g de ácido nicotínico, tiamina HCI 0,02 g/l, piridoxina HCI 0,10 g/l y glicina 0,40 g/l, llevado a volumen con H20 D-l pulida) (Murashige y Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), mio-inositol 100 mg/l, zeatina 0,5 mg/l, sacarosa 60 g/l y ácido abscisico 1 ,0 ml/l 0,1 mM (llevado a volumen con H20 D-l pulida después de ajustar el pH en 5,6); Gelrite 3,0 g/l (agregado después de llevar a volumen con H20 D-l); y ácido indolacético 1 ,0 mg/l y Bialafos 3,0 mg/l (agregado después de esterilizar el medio y enfriar a 60°C). El medio libre de hormonas (272V) comprende sales MS 4,3 g/l (GIBCO 11117-074), solución madre de vitaminas MS 5,0 ml/l (ácido nicotínico 0,100 g/l, tiamina HCI 0,02 g/l, piridoxina HCI 0,10 g/l y glicina 0,40 g/l, llevado a volumen con H20 D-l pulida), mio-inositol 0,1 g/l y sacarosa 40,0 g/l (llevado a volumen con H20 D-l pulida después de ajustar el pH en 5,6); y bacto-agar 6 g/l (agregado después de llevar a volumen con H2O D-l pulida), esterilizado y enfriado a 60°C.

Ejemplo 5. Transformación mediada por Agrobacterium Para la transformación mediada por Agrobacterium del maíz con una secuencia antisentido de la secuencia ZmARGOS de la presente invención, se emplea preferentemente el método de Zhao (Patente de los EE.UU. N° 5.981.840 y publicación de Patente PCT WO 98/32326; cuyos contenidos se incorporan en la presente a modo de referencia). Brevemente, se aislan embriones inmaduros de maíz y los embriones toman contacto con una suspensión de Agrobacterium, donde las bacterias tienen la capacidad para transferir la secuencia ARGOS a por lo menos una célula de al menos uno de los embriones inmaduros (paso 1: el paso de infección). En esta etapa los embriones inmaduros fueron preferentemente sumergidos en una suspensión de Agrobacterium para el inicio de la inoculación. Los embriones fueron cocultivados durante un tiempo con Agrobacterium (paso 2: el paso de cocultivo). Preferentemente los embriones inmaduros fueron cultivados luego del paso de infección en un medio sólido. Luego de este período de cocultivo se contempla un paso opcional de "reposo". En este paso de reposo, los embriones fueron incubados en presencia de al menos un antibiótico que se sabe que inhibe el crecimiento de Agrobacterium sin el agregado de un agente selectivo para las plantas transformantes (paso 3: el paso de reposo). Preferentemente los embriones inmaduros se cultivaron en un medio sólido con antibiótico, pero sin un agente de selección para la eliminación de Agrobacterium y para una fase de reposo de las células infectadas. Luego, los embriones inoculados fueron cultivados en un medio que contenía un agente de selección y se hicieron crecer y se recuperaron los callos transformados (paso 4: el paso de selección). Preferentemente, se cultivaron los embriones maduros en un medio sólido con un agente de selección que da como resultado el crecimiento selectivo de las células transformadas. Luego los callos se regeneraron en plantas (paso 5: el paso de regeneración), y preferentemente los callos que crecieron en el medio selectivo se cultivaron en un medio sólido para regenerar plantas. Se monitorean las plantas y se califica la modulación en el desarrollo del meristema. Por ejemplo, alteraciones en el tamaño y la apariencia de los meristemas de los brotes y florales, y/o rendimientos mejorados de hojas, flores y/o frutos.

Ejemplo 6. La sobreexpresión de ZmARGOS afecta el tamaño de las plantas y el tamaño de los órganos.

La función del gen ZmARGOS se evaluó usando plantas transgénicas que expresan al transgen Ubi-ZmARGOS. La expresión del transgen se confirmó usando cebadores para RT-PCR específicos del transgen (SEQ ID N°: 38 para ARGOS y SEQ ID N°: 39 para PIN). Se evaluaron plantas T1 de nueve eventos de una sola copia en el campo. Las plantas transgénicas mostraron mejoras positivas del crecimiento en diversos aspectos.

Crecimiento vegetativo y acumulación de biomasa: En comparación con las hermanas no transgénicas, las plantas transgénicas (en la generación T1) mostró un promedio de 4% de incremento en la altura de la planta en todos los 9 eventos y hasta un 12% en el evento más alto. El tallo de las plantas transgénicas era más grueso que las hermanas no transgénicas según las mediciones de los valores del diámetro de los tallos, con un incremento promedio entre un 9% y 22% entre los nueve eventos. El incremento de la altura y del espesor del tallo de la planta dio como resultado una estatura y biomasa más grandes para las plantas transgénicas. La acumulación de biomasa estimada mostró un incremento del 30% en promedio y hasta un 57% en las líneas positivas transgénicas en comparación con las hermanas negativas.

Se encontró que ZmARGOS afectaba el crecimiento de las plantas principalmente por aceleración del índice de crecimiento pero no por extensión del período de crecimiento. El mayor crecimiento, es decir, el incremento en el tamaño y la acumulación de biomasa en la planta, parece deberse en gran parte a un índice de crecimiento acelerado y no a un período de crecimiento extendido porque las plantas transgénicas no presentaron demoras en la floración basado en las fechas de formación de sedas y de antesis. De hecho, las plantas transgénicas florecieron más temprano que las hermanas no transgénicas. En promedio en todos los eventos, los días hasta la floración se habían acortado entre 30 unidades de calor (1-1,5 días) y 69 unidades de calor (2-2,5 días). Por ello, la sobreexpresión del gen ZmARGOS aceleró el índice de crecimiento de la planta. El índice de crecimiento acelerado parece estar asociado con un mayor índice de proliferación celular.

El mayor crecimiento vegetativo, la acumulación de biomasa en transgénicos y el índice de crecimiento acelerado fueron evaluados en extensos experimentos a campo en antecedentes de híbridos y endogámicos de generaciones avanzadas (T3). Las plantas transgénicas mostraron, de manera reproducible, un incremento en la altura de la planta de hasta un 18%, en el diámetro del tallo de hasta un 10%, en la masa seca de los tallos de hasta un 15%, un incremento en el área foliar de hasta un 14%, una masa seca de la planta total de hasta un 25%. La floración más temprana observada en la generación T1 se observó nuevamente en la generación T3.

Crecimiento reproductor y rendimiento de granos: La sobreexpresión del gen ZmARGOSI también aumentó el crecimiento de órganos reproductivos. Las plantas transgénicas T1 mostraron una mayor longitud de mazorcas, un 10% aproximadamente en promedio, en los nueve eventos, y hasta un 14% para el evento más alto. El peso total de los granos por mazorca incrementó un 13% en promedio y hasta un 70% para un evento. El incremento en el peso total de granos parece atribuirse al mayor número de granos por mazorca y el tamaño de los granos. El promedio de los nueve eventos mostró que el número de granos por mazorca aumentó un 8%, y hasta un 50% en el evento más alto. El peso de 100 granos incrementó un 5% en promedio, y hasta un 13% para el evento más alto. El cambio positivo en las características de granos y mazorca está asociado con el incremento en el rendimiento de los granos.

El mayor crecimiento reproductivo y rendimiento de los granos de los transgénicos fue confirmado nuevamente en extensos experimentos a campo en generaciones avanzadas (T3). La mejora se observó en antecedentes de endogámicos e híbridos. En comparación con las hermanas no transgénicas como controles, las plantas transgénicas mostraron un incremento significativo en la masa seca de mazorcas primarias de hasta un 60%, en la masa seca de mazorcas secundarias de hasta 4,7 veces, de la masa seca de espigas de hasta un 25% y de la masa seca de chala de hasta un 40%. Los transgénicos mostraron hasta un 13% de incremento en el número de granos por mazorca y hasta un 13% de incremento en el rendimiento de granos.

Las plantas transgénicas también mostraron una reducción de ASI, de hasta 40 unidades de calor, una reducción de la esterilidad de hasta un 50% y una reducción en el número de granos abortados de hasta un 64%. La reducción es mayor cuando las plantas se cultivaron bajo condiciones de estrés de alta densidad de plantas. Una medición reducida de estos parámetros a menudo se relaciona con tolerancia al estrés biótico.

Además, el nivel de expresión del transgen se correlaciona significativamente con la masa seca de mazorca.

Ejemplo 7. Transformación de embriones de soja Se bombardean embriones de soja con un plásmido que contiene secuencias ARGOS antisentido ligadas operativamente a un promotor de ubiquitina como se indica a continuación. Con el fin de inducir la formación de embriones somáticos, se cultivan cotiledones de 3-5 mm de longitud disecados de semillas inmaduras, de superficie esterilizada del cultivar de soja A2872, con luz u oscuridad, a 26 °C, sobre un medio de agar apropiado durante seis a diez semanas. Luego se recortan los embriones somáticos productores de embriones secundarios y se colocan en un medio líquido adecuado. Después de una selección repetida de las masas de embriones somáticos que se multiplicaron como embriones en etapa globular temprana, las suspensiones se mantienen como se describe más adelante.

Los cultivos embriogénicos de soja en suspensión se pueden mantener en 35 mi de medio liquido sobre un agitador rotatorio, 150 rpm, a 26 °C con luz fluorescente con un programa de luz/oscuridad de 16:8 horas. Los cultivos se subcultivan cada dos semanas por inoculación de aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mi de medio líquido.

Luego se pueden transformar los cultivos en suspensión de soja embriogénica por el método de bombardeo con pistola de partículas (Kline et al (1987) Nature (Londres) 327:70, Patente de los EE.UU. N° 4.945.050). Se puede emplear un instrumento Biolistic PDS1000/HE de Du Pont (con retroalimentación con helio) para estas transformaciones.

El gen marcador de selección que se puede usar para facilitar la transformación de soja es un transgen compuesto del promotor 35S del virus en mosaico de la coliflor (Odell, et al., (1985) Nature 313:810-812), el gen de higromicina fosfotransferasa del plásmido pJR225 (de E. coli; Gritz, et al., (1983) Gene 25:179-188) y la región 3' del gen de la nopalina sintetasa del ADN-T del plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens . El cásete de expresión que comprende una secuencia ARGOS orientada en el sentido del marco de lectura ligada operativamente a un promotor de ubiquitina se puede aislar como un fragmento de restricción. Este fragmento se puede insertar entonces en un sitio de restricción único del vector que contiene al gen marcador.

A 50 pl de una suspensión 60 mg/ml de partículas de oro de 1 pm se agrega (en el orden dado): 5 µ? de ADN (1 pg/pl), 20 pl de espermidina (0,1 M) y 50 µ? de CaCI2 (2,5 M). La preparación de partículas se agita luego durante tres minutos, se centrífuga en microcentrífuga durante 10 segundos y se elimina el sobrenadante. Las partículas recubiertas con ADN se lavan luego una vez en 400 pl de etanol 70% y se vuelven a suspender en 40 µ? de etanol anhidro. La suspensión de ADN/partículas se puede sonicar tres veces durante un segundo por vez. Después se cargan cinco microlitros de partículas recubiertas con ADN sobre cada disco macrotransportador.

Se colocan aproximadamente 300-400 mg de un cultivo en suspensión de dos semanas en una caja de Petri de 60x15 mm vacía y el líquido residual del tejido se retira con la ayuda de una pipeta. Para cada experimento de transformación, habitualmente se bombardean 5-10 placas de tejido. La presión de ruptura de la membrana se define en 1100 psi y la cámara es evacuada hasta un vacío de 28 pulgadas de mercurio. El tejido se coloca aproximadamente a 3,5 pulgadas de la pantalla de retención y luego es bombardeado tres veces. Después del bombardeo, se puede dividir al tejido por la mitad y volver a colocarlo en el líquido y cultivarlo como se describiera previamente.

Cinco a siete días después del bombardeo, se cambia el medio líquido por medio líquido fresco y once a doce días después del bombardeo con medio fresco que contiene higromicina 50 mg/ml. Este medio selectivo se puede cambiar una vez por semana. Siete a ocho semanas después del bombardeo, se puede observar tejido transformado, verde, creciendo desde las masas embriogénicas necróticas, no transformadas. El tejido verde aislado se retira y se inocula en frascos individuales para generar nuevos cultivos embriogénicos transformados en suspensión, propagados por clonación. Cada línea nueva puede ser tratada como un evento de transformación independiente. Estas suspensiones se pueden subcultivar y mantener como masas de embriones inmaduros o se pueden regenerar hasta obtener plantas completas por maduración y germinación de embriones somáticos individuales.

Ejemplo 8. Transformación de tejido meristemático de girasol Se transforma tejido meristemático de girasol con un cásete de expresión, que contiene una secuencia ARGOS ligada operativamente a un promotor de ubiquitina, como se indica a continuación (véase también, la Patente Europea N° EP 0 486233, incorporada en la presente documentación a modo de referencia y Malone-Schoneberg, et al., (1994) Plant Science 103:199-207). Se eliminan las cáscaras de semillas de girasol maduras {Helianthus annuus L.) usando una trilladora con cabeza individual para trigo. Se esterilizan las superficies de las semillas durante 30 minutos en una solución de blanqueador Clorox al 20%, con la adición de dos gotas de Tween 20 por cada 50 mi de solución. Se lavan las semillas dos veces con agua destilada estéril.

Se preparan ejes embrionarios partidos usando una modificación del procedimiento descrito por Schrammeijer, et al., (Schrammeijer, et al., (1990) Plant Cell Rep. 9:55-60). Se embeben las semillas en agua destilada por 60 minutos, después de un procedimiento de esterilización de las superficies. Luego se separan los cotiledones de cada semilla para obtener una fractura clara en el plano del eje del embrión. Después de separar el extremo de la raíz, se disecan los explantes en forma longitudinal entre las hojas primordiales. Se colocan las dos mitades, con la superficie cortada hacia arriba, en un medio GBA que consiste en elementos minerales Murashige y Skoog (Murashige et al. (1962) Physiol. Plant. 15:473-497), vitaminas de Shepard (Shepard (1980) en Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops (University of Minnesota Press, St. Paul, Minnesota), sulfato de adenina 40 mg/l, sacarosa 30 g/l, 6-bencil-aminopurina (BAP) 0,5 mg/l, ácido indol-3-acético (IAA) 0,25 mg/l, ácido giberéiico (GA3) 0,1 mg/l, pH 5,6, y Phytagar 8 g/l.

Los explantes son sometidos a bombardeo con microproyectiles antes del tratamiento con Agrobacterium (Bidney, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313). Para este tratamiento se colocan entre treinta y cuarenta explantes en un circulo en el centro de una placa de 60 x 20 mm. Se suspenden nuevamente aproximadamente 4,7 mg de microproyectiles de tungsteno de 1,8 mm en 25 mi de solución amortiguadora TE estéril (Tris HCI 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), y se usan alícuotas de 1,5 mi para cada bombardeo. Cada placa se bombardea dos veces a través de una pantalla de nytex de 150 mm, colocada a una altura de 2 cm de las muestras, en un dispositivo de aceleración de partículas PDS 1000®.

Se usa la cepa desarmada de Agrobacterium tumefaciens EHA105 en todos los experimentos de transformación. Se introduce un vector de un plásmido binario que comprende el cásete de expresión que contiene al gen ARGOS ligado operativamente al promotor de ubiquitina en la cepa EHA105 de Agrobacterium por congelamiento-descongelamiento según describieron Holsters, et al., (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187. Este plásmido comprende además un gen marcador de selección con kanamicina (es decir, nptll). Las bacterias para los experimentos de transformación de plantas se cultivan durante la noche (a 28°C y con agitación continua a 100 RPM) en medio líquido YEP (extracto de levadura 10 g/l, bactopeptona 10 g/l y NaCI 5 g/l, pH 7,0), con los antibióticos apropiados necesarios para mantener la cepa bacteriana y los plásmidos binarios. La suspensión se puede usar cuando alcanza una DO6oo entre 0,4 y 0,8 aproximadamente. Las células de Agrobacterium se agrupan en pelets y se resuspenden a una DO600 final de 0,5 en medio de inoculación compuesto por MES 12,5 mM, pH 5,7, NH4CI 1 gm/l y MgSO4 0,3 gm/l.

Los explantes recién bombardeados se colocan en una suspensión de Agrobacterium , se mezclan y se dejan reposar por 30 minutos. Los explantes se transfieren luego a medio GBA y se cocultivan, con la superficie cortada hacia abajo, a 26°C y con días de 18 horas. Después de tres días de cocultivo, los explantes se transfieren al medio 374B (medio GBA sin reguladores del crecimiento y con un nivel de sacarosa reducido de 1%) suplementado con cefotaxima 250 mg/l y sulfato de kanamicina 50 mg/l. Los explantes se cultivan durante dos a cinco semanas en medio de selección y luego se transfieren a medio 374B fresco sin kanamicina para su desarrollo continuo por una o dos semanas. Los explantes con áreas de crecimiento diferenciadas, resistentes a antibióticos, que no han producido brotes apropiados para la escisión, se transfieren al medio GBA que contiene cefotaxima 250 mg/l con el fin de efectuar un segundo tratamiento con fitohormonas de 3 días. Se evalúa la presencia de NPTII por ELISA y la presencia de expresión transgénica evaluando la modulación en el desarrollo del meristema (es decir, una alteración en el tamaño y la apariencia de los meristemas florales) en muestras de hojas de brotes verdes, resistentes a kanamicina.

Los brotes positivos para NPTII se injertan en brotes con raíces de híbridos Pioneer® 6440 de girasol cultivados in vitro. Se hacen germinar semillas de superficies esterilizadas en medio 48-0 (sales Murashige y Skoog con media fuerza, sacarosa 0,5%, Gelrite™ 0,3%, pH 5,6) y se cultivan bajo las condiciones descritas para el cultivo de explantes. Se retira la porción superior del brote, se efectúa un corte vertical de 1 cm en el hipocótilo y se inserta el brote transformado en el corte. Se envuelve toda el área con parafilm para asegurar la raíz. Las plantas injertadas pueden transferirse a tierra después de una semana de cultivo in vitro. Los injertos en la tierra se mantienen bajo condiciones de humedad elevada, después de una aclimatación lenta al ambiente del invernadero. Los sectores transformados de las plantas T0 (generación progenitora) que maduran en el invernadero se identifican por NPTII ELISA y/o mediante análisis de actividad de ARGOS, al tiempo que las semillas transgénicas cosechadas de plantas T0 positivas para NPTII se identifican por medio de análisis de actividad de ARGOS en porciones pequeñas de cotiledones de hojas secas.

Un protocolo de transformación de girasol alternativo permite recuperar la progenie transgénica sin usar una presión de selección química. Se eliminan las cascaras de las semillas y se esterilizan sus superficies durante 20 minutos en una solución de blanqueador Chlorox al 20%, con la adición de dos o tres gotas de Tween 20 por cada 100 mi de solución, luego se lava tres veces con agua destilada. Se embeben las semillas esterilizadas en la oscuridad a 26°C por 20 horas en papel de filtro humedecido con agua. Se retiran los cotiledones y los extremos de las raíces, y se cultivan los explantes de meristemas en medio 374E (un medio GBA que consiste en sales MS, vitaminas de Shepard, sulfato de adenina 40 mg/l, sacarosa 3%, 6-BAP 0,5 mg/l, IAA 0,25 mg/l, GA 0,1 mg/l y Phytagar 0,8% a pH 5,6) por 24 horas en la oscuridad. Se eliminan las hojas primarias para exponer el meristema apical, se colocan aproximadamente 40 explantes, con el domo apical hacia arriba, en un círculo de 2 cm en el centro de una placa con medio 374M (un medio GBA con Phytagar 1,2%), y luego se cultivan en el medio por 24 horas en la oscuridad.

Se suspenden nuevamente 18,8 mg aproximadamente de partículas de tungsteno de 1,8 µ?t? en 150 µ? de etanol absoluto. Después de sonicar, se vierten 8 µ? de las mismas en el centro de la superficie del disco macrotransportador. Cada placa se bombardea dos veces con discos de ruptura a 650 psi en el primer nivel, con una pistola de helio con un vacío de 26 mm de Hg.

Se introduce el plásmido de interés en la cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA105 por congelamiento-descongelamiento, como se describió previamente. Se suspende nuevamente el precipitado de bacterias, cultivadas durante la noche a 28 °C en un medio líquido YEP (extracto de levadura 10 g/l, bactopeptona 10 g/l y NaCI 5 g/l, pH 7,0) en presencia de kanamicina 50 µ g/l , en medio de inoculación (ácido 2-(N-morfolin)etansulfónico 12,5 mM, MES 2 mM, NH4CI 1 g/l y 0,3 g/l MgS04 0,3 g/l a pH 5,7) hasta alcanzar una concentración final de 4,0 a una DO 600. Los explantes sometidos al bombardeo de partículas se transfieren a medio GBA (374E) y se coloca una gota de suspensión de bacterias directamente en la parte superior del meristema. Se cocultivan los explantes en el medio durante 4 días, después de lo cual se transfieren los explantes a medio 374C (GBA con sacarosa 1% y sin BAP, IAA o GA3, y suplementado con cefotaxima 250 pg/ml). Las plántulas se cultivan en el medio por aproximadamente dos semanas con días de 16 horas, bajo condiciones de incubación a 26 °C.

Se examina en explantes (2 cm de longitud aproximadamente) de dos semanas de cultivo en medio 374C la presencia de modulación en el desarrollo del meristema (es decir, una alteración del tamaño y aspecto de meristemas florales y brotes). Una vez identificados los explantes positivos (es decir, con un cambio en la expresión de ARGOS), se descartan aquellos brotes que no presentan una alteración en la actividad de ARGOS y se subdivide cada explante positivo en explantes nodales. Un explante nodal contiene al menos un nodo potencial. Se cultivan los segmentos nodales en medio GBA por tres o cuatro días para promover la formación de yemas auxiliares en cada nodo. Luego son transferidos a medio 374C y se dejan crecer por otras cuatro semanas. Se separan las yemas en desarrollo y se cultivan por otras cuatro semanas en medio 374C. Se analizan muestras de hojas agrupadas de cada brote recién recuperado empleando los ensayos de actividad proteica apropiados. En este momento, los brotes positivos recuperados de un único nodo generalmente estarán enriquecidos en el sector transgénico detectado en el ensayo inicial antes del cultivo nodal.

Los brotes recuperados positivos para la expresión alterada de ARGOS se injertan en brotes con raíces de híbridos Pioneer 6440 de girasol cultivados in vitro. Se preparan los brotes con raíces de la siguiente manera. Se eliminan la cascara de las semillas y se esterilizan sus superficies por 20 minutos en una solución de blanqueador Chlorox al 20%, con la adición de dos o tres gotas de Tween 20 por cada 100 mi de solución, luego se lava tres veces con agua destilada. Las semillas esterilizadas se hacen germinar sobre el filtro humedecido con agua por tres días, luego son transferidas a medio 48 (sales MS con media fuerza, sacarosa 0,5%, Gelrite 0,3%, pH 5,0) y se dejan crecer a 26°C en la oscuridad por tres días, luego se incuban bajo condiciones de cultivo con días de 16 horas. Se retira la porción superior del brote, se efectúa un corte vertical en cada hipocótilo y se inserta un brote transformado en un corte en V. El área del corte se envuelve con parafilm. Después de una semana de cultivo en el medio, las plantas injertadas son transferidas a tierra. Durante las primeras dos semanas, se mantienen bajo condiciones de humedad elevada para aclimatarlas al ambiente del invernadero.

Ejemplo 9. Variantes de las secuencias ARGOS A. Variantes de secuencias de nucleótidos de ARGOS que no alteran la secuencia de aminoácidos codificada Las secuencias de nucleótidos ARGOS se utilizan para generar variantes de las secuencias de nucleótidos que tienen la secuencia de nucleótidos del marco abierto de lectura con aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95% de identidad de secuencia de nucleótidos, en comparación con las secuencias de nucleótidos de los ORF iniciales no relacionados de los SEQ ID N° correspondientes. Estas variantes funcionales se generan usando una tabla de codones convencional. Si bien se altera la secuencia de nucleótidos de las variantes, la secuencia de aminoácidos codificada por los marcos abiertos de lectura no cambia.

B. Variantes de las secuencias de aminoácidos de polipéptidos ARGOS Se generan variantes de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos ARGOS. En este ejemplo se altera un aminoácido. Específicamente, se revisan los marcos de lectura abiertos para determinar la alteración del aminoácido apropiado. La selección del aminoácido a cambiar se efectúa consultando la alineación de proteínas (con los otros ortólogos y con otros miembros de familias de genes de diversas especies). Se selecciona un aminoácido que no se considera bajo una presión de selección elevada (no muy conservado), que puede ser sustituido fácilmente por un aminoácido con características químicas similares (es decir, cadenas laterales funcionales similares). Usando la alineación de proteínas detallada en las Figuras 2A a 2D, puede cambiarse un aminoácido apropiado. Una vez identificado el aminoácido apropiado, se pone en práctica el procedimiento que se describe a continuación en la sección C. Se generan variantes que tienen aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90% y 95% de identidad de secuencia de ácidos nucleicos usando este método.

C. Variantes adicionales de las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos ARGOS En este ejemplo se crean secuencias de proteínas artificiales que tienen 80%, 85%, 90% y 95% de identidad respecto de la secuencia de la proteína de referencia. Este último esfuerzo requiere de la identificación de regiones conservadas y variables en la alineación presentada en las Figuras 2A a 2D, y luego es necesaria la aplicación apropiada de una tabla de sustituciones de aminoácidos. Estas partes se describen con mayor detalle a continuación.

Mayormente, la determinación de cuáles de las secuencias de aminoácidos están alteradas se realiza sobre la base de las regiones conservadas entre la proteína ARGOS o entre los demás polipéptidos ARGOS. Sobre la base de alineación de secuencias, se representan las distintas regiones del polipéptido ARGOS que se pueden alterar con letras minúsculas, al tiempo que las regiones conservadas se representan con letras mayúsculas. Se considera que se pueden efectuar sustituciones conservadoras en las siguientes regiones conservadas sin alterar la función. Además, los especialistas en la técnica comprenderán que las variantes funcionales de la secuencia ARGOS de la invención pueden tener alteraciones de aminoácidos no conservadoras menores en el dominio conservado.

Luego se crean secuencias de proteínas artificiales que son diferentes de la original en los intervalos de 80-85%, 85-90%, 90-95% y 95-100% de identidad. Se buscan los puntos medios de estos intervalos, con intervalos de incertidumbre de, por ejemplo, más o menos 1%. Se efectuarán sustituciones de aminoácidos empleando el programa Perl modificado. En la Tabla 3 se provee la tabla de sustituciones.

Tabla 3. Tabla de sustituciones Sustitución Rango de Aminoáci muy similar y orden de Comentario do óptima cambio 1 L,V 1 Sustitución 50:50 L l,V 2 Sustitución 50:50 V I.L 3 Sustitución 50:50 A G 4 G A 5 D E 6 E D 7 W Y 8 Y W 9 s T 10 T s 11 K R 12 R K 13 N Q 14 Q N 15 F Y 16 La primera M L 17 metionina no puede cambiar No hay sustitutos H N.d. apropiados No hay sustitutos C N.d. apropiados No hay sustitutos P N.d. apropiados Primero, se identifican los aminoácidos conservados que no deberían cambiarse en la proteina, y se "marcan" para aislarlos de la sustitución. Por supuesto, la metionina inicial se agrega automáticamente a esta lista. Luego se efectúan los cambios.

No se cambian H, C y P bajo ninguna circunstancia. Los cambios tendrán lugar con isoleucina primero, pasando de N-terminal a C-terminal. Después leucina, y así sucesivamente avanzando por la lista hasta obtener el blanco deseado. Pueden efectuarse sustituciones de cantidades intermedias para no provocar una inversión de los cambios. La lista se ordena de 1 a 17, con el objeto de comenzar con tantos cambios de isoleucina como sea posible antes de la leucina, y se sigue del mismo modo hasta la metionina. Claramente, no será necesario cambiar muchos aminoácidos de este modo. L, I y V comprenderán una sustitución 50:50 de las dos sustituciones óptimas alternadas.

Se escriben las variantes de las secuencias de aminoácidos como salida del programa. Se usa el programa Perl para calcular los porcentajes de identidad. El uso de este procedimiento permite generar variantes de los polipéptidos ARGOS que tienen aproximadamente 80%, 85%, 90% y 95% de identidad de aminoácidos con la secuencia de nucleótidos del ORF inicial no alterado de las SEQ ID N°: 1, 3, 5 y 40-71.

Todas las publicaciones y solicitudes de patente en esta memoria descriptiva son indicativas del nivel de conocimiento del especialista a quien esta dirigida esta invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente se incorporan en la presente a modo de referencia como si cada publicación o solicitud de patente individual se incorporara específicamente e individualmente en la presente a modo de referencia.

La invención se ha descrito con referencia a diversas realizaciones y técnicas preferidas. Sin embargo, se deberá tener en cuenta que es posible efectuar muchas variaciones y modificaciones sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención .

Claims

REIVINDICACIONES:

1. Un polipéptido aislado, CARACTERIZADO PORQUE se selecciona del grupo formado por: a. un polinucleótido que tiene al menos un 70% de identidad de secuencia, determinada con el algoritmo GAP utilizando los parámetros predeterminados, con la secuencia de longitud completa de un polinucleótido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N°: 1, 3, 5 y 40-71; en donde el polinucleótido codifica un polipéptido que funciona como un modificador del tamaño de órganos; b. un polinucleótido que codifica un polipéptido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N°: 2, 4 y 6-37; y c. un polinucleótido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N°: 1, 3, 5 y 40-71; y d. un polinucleótido que es complementario del polinucleótido de (a), (b) o (c).

2. Un cásete de expresión recombinante, CARACTERIZADO PORQUE comprende al polinucleótido de la cláusula 1, en donde dicho polinucleótido está ligado operativamente, orientado en el sentido del marco de lectura o antisentido, a un promotor.

3. Una célula huésped, CARACTERIZADA PORQUE comprende al cásete de expresión de la cláusula 2.

4. Una planta transgénica, CARACTERIZADA PORQUE comprende al cásete de expresión recombinante de la cláusula 2.

5. La planta transgénica de la cláusula 4, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una monocotiledónea.

6. La planta transgénica de la cláusula 4, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una dicotiledónea.

7. La planta transgénica de la cláusula 4, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta se selecciona del grupo formado por: maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, maní y cacao.

8. Una semilla transgénica, CARACTERIZADA PORQUE es de la planta transgénica de la cláusula 4.

9. Un método para modular el tamaño de órganos en plantas, CARACTERIZADO PORQUE comprende: a. introducir en una célula vegetal un cásete de expresión recombinante que comprende al polinucleótido de la cláusula 1 ligado operativamente a un promotor; y b. cultivar la planta bajo condiciones de crecimiento de células vegetales; en donde el tamaño de órganos en dicha célula vegetal está modulado.

10. El método de la cláusula 9, CARACTERIZADO PORQUE la célula vegetal es de una planta seleccionada del grupo formado por: maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, maní y cacao.

11. Un método para modular una planta completa o el tamaño de órganos en una planta, CARACTERIZADO PORQUE comprende: a. introducir en una célula vegetal un cásete de expresión recombinante que comprende al polinucleótido de la cláusula 1 ligado operativamente a un promotor; b. cultivar la célula vegetal bajo condiciones de crecimientos de células vegetales; y c. regenerar una planta a partir de dicha célula vegetal; en donde el tamaño de órganos en dicha planta está modulado.

12. El método de la cláusula 11, CARACTERIZADO PORQUE la planta se selecciona del grupo formado por: maíz, soja, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, maní y cacao.

13. Un producto, CARACTERIZADO PORQUE deriva del método para procesar tejidos de plantas transgénicas que expresan un polinucleotido aislado que codifica un gen ARGOS, donde dicho método comprende: a. transformar una célula vegetal con un cásete de expresión recombinante que comprende un polinucleotido que tiene al menos 90% de identidad de secuencia con la secuencia de longitud completa de un polinucleotido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N°: 1, 3, 5 y 40-71, ligado operativamente a un promotor; y b. cultivar la célula vegetal transformada bajo condiciones de crecimiento de células vegetales; en donde el crecimiento en dicha célula vegetal transformada está modulado; c. cultivar la célula vegetal bajo condiciones formadoras de plantas para expresar el polinucleotido en el tejido vegetal; y d. procesar el tejido vegetal para obtener un producto.

14. El producto de acuerdo con la cláusula 13, CARACTERIZADO PORQUE el polinucleotido además codifica un polipéptido seleccionado del grupo formado por las SEQ ID N°: 2, 4 y 6-37.

15. La planta transgénica de la cláusula 13, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta es una monocotiledónea .

16. La planta transgénica de la cláusula 13, CARACTERIZADA PORQUE dicha planta se selecciona del grupo formado por: maíz, soja, girasol, sorgo, cañóla, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, mijo, maní y cacao.

17. El producto de acuerdo con la cláusula 13, CARACTERIZADO PORQUE aumenta la fuerza del tallo de una planta por sobreexpresion del polinucleótido.

18. El producto de acuerdo con la cláusula 13, CARACTERIZADO PORQUE aumenta el rendimiento mediante un incremento de la biomasa.

19. El producto de acuerdo con la cláusula 13, CARACTERIZADO PORQUE es un constituyente de etanol.