BRPI0709801B1

BRPI0709801B1 - Isolated polynucleotyde, expression cassette, method for modular size of plants without plants, method of modular any plant or organ size in a plant, product

Info

Publication number: BRPI0709801B1
Application number: BRPI0709801-4A
Authority: BR
Inventors: Guo Mei; Bruce Wesley; Gupta Rajeev; R. Simmons Carl
Original assignee: Pioneer Hi - Bred International, Inc.
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2017-11-21
Also published as: US20170037424A1; US20090222954A1; US20070234443A1; US7550575B2; AR060217A1; CN101484465A; US7834240B2; CA2647718C; US20140041081A1; US20100293670A1; BRPI0709801A2; MX2008012443A; US8575422B2; WO2007115064A3; US9518266B2; EP2004679A2; WO2007115064A2; CA2647718A1

Abstract

<b>polinucleotideo isolado, cassete de expressao, método para modular o tamanho de orgaos em plantas, método de modular toda a planta ou o tamanho de orgao em uma planta, produto<d> a presente invenção fornece polinucleotídeos e peptídeos relacionados com a família do gene zmargos.a presente provê ainda a seqúência genâmica para genes zmargos. zmargos é responsável por controlar o crescimento da planta, o tamanho de órgàos e o rendimento em culturas agrícolas.

Description

MÉTODO PARA AUMENTAR O RENDIMENTO DE UM GRÃO EM UMA PLANTA

DE MILHO

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção está relacionada, de forma geral, ao campo da biologia molecular.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A domesticação de várias plantas se correlacionou com aumentos dramáticos em produção. A maioria das variações fenotipicas ocorrendo em populações naturais é contínua e é efetuada por influência de múltiplos genes. A identificação de genes específicos responsáveis pelas dramáticas diferenças em produção, em plantas domesticadas, se tornou um foco importante da pesquisa agrícola.

[003] Em Arabidopsis, uma família de genes associados com mudanças vegetais que se relacionam a rendimento melhorado em cultivares, o gene regulado por auxina envolvido em tamanho de órgão (Auxin-Regulated Gene involved in Organ Size - ARGOS) é induzido por auxina. Esse gene é responsável pela regulação de proliferação celular e crescimento de órgãos. O ARGOS de Arabidopsis é expresso naturalmente em um nível baixa em vários tecidos jovens incluindo raízes, caules de inflorescências, flor, folhas jovens de rosetas e siliquas, mas indetectável em folhas maduras. Em estudos por Hu, et al. (2003 Plant Cell 15:1951-61) e Hu, et al. (2006 The Plant Journal 47(1):1-9) , plantas transgênicas que ectopicamente super-expressam cDNA de ARGOS senso ou anti-senso apresentam órgãos aéreos crescidos ou reduzidos, respectivamente. Alteração em tamanho de órgão demonstrado nessas plantas é associada com mudanças no número de células, e não em tamanho celular. O maior número de células é atribuído à duração do crescimento de órgão em Arabidopsis. A presente invenção inclui a identificação dos genes ARGOS putativos de milho, ZmARGOS 1-9 (SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 40-45 e 71) que são relacionados aos genes ARGOS de Arabidopsis (SEQ ID NOS: 59, 60 e 61). O ortólogo tendo a maior similaridade a ARGOS Arabidopsis (SEQ ID NO: 59) , é ZmARGOS 1 (SEQ ID NO: 1). A expressão de ZmARGOSl e 2 (SEQ ID NOS: 1 e 3) em milho foi primariamente nas raízes, endosperma inicial, espiga imatura e meristemas inflorescentes de broto e de espiga. A expressão está associada com tecidos crescendo ativamente, e é vista em um grau menor em tecidos maduros. Essa descoberta é consistente com o efeito positivo notado do gene em regular o crescimento e proliferação celular. 0 gene ZmARGOS 3 (SEQ ID NO: 5) expresso em um amplo espectro de tecidos e estágios de desenvolvimento.

Plantas transgênicas expressando ZmARGOSl (SEQ ID NO: 1) mostram um impacto positivo em acúmulo de biomassa e taxa de crescimento de planta de milho, assim como um aumento em tamanho de órgão. Esses genes de milho serão úteis para intensificar características agronômicas em milho (e outros cultivares). A presente invenção também inclui a identificação de genes ARGOS em outras espécies vegetais. A família de genes de arroz é representada por 8 membros da família. Nove membros da família de genes foram encontrados em Sorghum bicolor. Cinco seqüências gênicas também foram encontradas em Soja (Glycine max) . Três membros da família de genes ARGOS de Arabidopsis são aqui descritos.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Composições e métodos para controlar o crescimento vegetal e tamanho de órgão para produção crescente em uma planta são providos. As composições incluem seqüências de ARGOS de milho, soja, Arabidopsis, arroz e sorgo.

Composições da invenção compreendem sequências de aminoácidos e seqüências de nucleotídeos selecionadas de SEQ ID NOS: 1-37, 40-71 assim como variantes e fragmentos dessas.

Polinucleotídeos codificando as seqüências de ARGOS são providos em construções de DNA para expressão em uma planta de interesse. São ainda providos cassetes de expressão, plantas, células vegetais, partes de planta, e sementes compreendendo as seqüências da invenção. Em avanços específicos, o polinucleotídeo é operacionalmente ligado a um promotor constitutivo. São providos métodos para modular o nível de uma seqüência ARGOS em uma planta ou parte de planta são providos, assim como métodos para produção de uma planta transgênica. Os métodos compreendem introduzir em uma planta ou parte de planta um polinucleotídeo heterólogo ou cassete de expressão compreendendo uma seqüência ARGOS da invenção, cultivar a célula que recebeu a inserção sob condições apropriadas de crescimento e regenerar a planta a partir da dita célula. O nível de polipeptídeo ARGOS pode ser a\imentado ou diminuído. Tal método pode ser usado para aumentar o rendimento em plantas; em um avanço, o método é usado para aumentar o rendimento de grãos em cereais.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Dendrograma ilustrando a relação entre os polipeptideos ARGOS desta invenção de várias espécies vegetais: milho, arroz, soja, sorgo e Arabidopsis.

Figura 2: Alinhamento de seqüências polipeptidicas de milho, arroz, soja, sorgo e Arabidopsis com identificação de regiões conservadas. As proteínas possuem uma região bem conservada rica em prolina próxima ao C-terminal. As regiões N-terminal são geralmente divergentes. As proteínas são bem curtas, variando de 58 a 146, e com média de 110 aminoácidos.

Figura 3: Alinhamento de ZmARGOS 1, 2, e 3, com AtARGOS 1, destacando suas áreas de consenso, e substituições conservadas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui usados possuem o mesmo significado como comumente entendido por alguém de conhecimento ordinário na técnica a qual esta invenção pertence. A menos que mencionado de outra forma, as técnicas aqui empregadas ou contempladas são metodologias padrão bem conhecidas de alguém de conhecimento ordinário na técnica. Os materiais, métodos e exemplos são ilustrativos apenas e não limitantes. 0 seguinte é apresentado por meio de ilustração e não pretende limitar o escopo da invenção. A presente invenção será agora descrita mais completamente daqui em diante com referência aos desenhos que a acompanham, nos quais alguns, mas não todos os avanços da invenção são apresentados. De fato, essas invenções podem ser incorporadas de várias formas diferentes e não deveríam ser construídas como limitadas aos avanços aqui apresentados; ao contrário, esses avanços são providos de forma que esta descrição satisfaça requerimentos legais aplicáveis. Números similares referem-se a elementos similares, por conseguinte. Várias modificações e outros avanços da invenção aqui apresentada virão à mente de um especialista na técnica a qual essas invenções pertencem, tendo o benefício dos ensinamentos apresentados nas descrições precedentes e desenhos associados. Portanto, deve ser entendido que as invenções não devem estar limitadas aos avanços específicos descritos e que modificações e outros avanços devem ser incluídos no escopo das reivindicações em anexo. Apesar de termos específicos serem aqui empregados, eles são usados em um senso genérico e descritivo apenas, e não para propósitos de limitação. A prática da presente invenção empregará, a menos que indicado ao contrário, técnicas convencionais de botânica, microbiologia, cultura de tecidos, biologia molecular, química, bioquímica e tecnologia de DNA recombinante, que estão dentro da especialidade da técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Ver, e.g., Langenheim and Thimann, BOTANY: PLANT BIOLOGY AND ITS RELATION TO HUMAN AFFAIRS, John Wiley (1982); CELL CULTURE AND SOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS, vol. 1, Vasil, ed. (1984); Stanier, et al., THE MICROBIAL WORLD, 5th ed., Prentice-Hall (1986); Dhringra and Sinclair, BASIC PLANT PATHOLOGY METHODS, CRC Press (1985); Maniatis, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, vols. I and II, Glover, ed. (1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS, Gait, ed. (1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION, Hames and Higgins, eds. (1984); e a série METHODS IN ENZYMOLOGY, Colowick and Kaplan, eds, Academic Press, Inc., San Diego, CA.

Unidades, prefixos, e símbolos podem estar denotados na sua forma SI aceita. A menos que indicado ao contrário, ácidos nucléicos são escritos da esquerda para a direita na orientação 5' a 3' ; seqüências de aminoácidos são escritas da esquerda para a direita na orientação amino para carboxi, respectivamente. Amplitudes numéricas incluem os números definindo a variação. Aminoácidos podem ser aqui referidos tanto por seu símbolo de três letras comumente conhecido ou pelos símbolos de uma letra recomendados pela comissão de nomenclatura da IUPAC-IUB (Biochemical Nomenclature Commission). Nucleotídeos, da mesma forma, podem ser referidos por seus códigos de uma letra comumente aceitos. Os termos definidos abaixo são definidos mais completamente por referência à especificação como um todo.

Ao descrever a presente invenção, os seguintes termos serão empregados, e devem ser definidos como indicados abaixo.

Por "micróbio" pretende-se qualquer microorganismo (incluindo tanto microorganismos eucariontes ou procariontes), tais como fungos, leveduras, bactérias, actinomicetos, algas e protozoários, assim como outras estruturas unicelulares.

Por "amplificado" pretende-se a construção de múltiplas cópias de uma seqüência de ácidos nucléicos ou múltiplas cópias complementares à seqüência de ácidos nucléicos usando pelo menos uma das seqüências de ácidos nucléicos como modelo. Sistemas de amplificação incluem o sistema de reação em cadeia da polimerase (PCR), sistema de reação em cadeia da ligase (LCR), amplificação baseada em seqüência de ácidos nucléicos (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario), sistemas Q-Beta Replicase, sistema de amplificação baseado em transcrição (TAS), e amplificação de deslocamento de fita (SDA). Ver, e.g., DIAGNOSTIC MOLECULAR MICROBIOLOGY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Persing, et al.f eds., American Society for Microbiology, Washington, DC (1993). 0 produto de amplificação é chamado de amplicon. O termo "variantes modificados conservadamente" se aplica tanto a seqüências de aminoácido e de ácidos nucléicos. Com respeito a seqüências de ácidos nucléicos em particular, variantes modificados conservadamente referem-se àqueles ácidos nucléicos que codificam variantes idênticos ou modificados conservadamente das seqüências de aminoácidos. Por causa da degeneração do código genético, um grande número de ácidos nucléicos funcionalmente idênticos codifica qualquer dada proteína. Por exemplo, os códons GCA, GCC, GCG e GCU todos codificam o aminoácido alanina. Assim, em cada posição onde uma alanina é especificada por um códon, o códon pode ser alterado para qualquer dos códons correspondentes descritos sem alterar o polipeptídeo codificado. Tais variações em ácidos nucléicos são "variações silenciosas" e representam uma espécie de variação modificada conservadamente. Cada seqüência de ácidos nucléicos aqui que codifica um polipeptideo também descreve cada variação silenciosa possível do ácido nucléico. Alguém de conhecimento ordinário reconhecerá que cada códon em um ácido nucléico (exceto AUG, que é ordinariamente o único códon para metionina; uma exceção é Mícrococcus rubens, para o qual GTG é o códon de metionina (Ishizuka, et al., (1993) J. Gen. Microbiol. 139:425-32) pode ser modificado para produzir uma molécula funcionalmente idêntica. Dessa forma, cada variação silenciosa de um ácido nucléico, o qual codifica um polipeptídeo da presente invenção, está implícita em cada seqüência polipeptídica descrita e incorporada aqui por referência.

Como para seqüências de aminoácidos, um especialista reconhecerá que substituições, deleções ou adições individuais para um ácido nucléico, peptídeo, polipeptídeo, ou seqüência de proteínas que alterem, adicionem ou deletem um único aminoácido ou uma pequena porcentagem de aminoácidos na seqüência codificada são "variantes modificados conservadamente" quando a alteração resulta na substituição de um aminoácido por um aminoácido quimicamente similar. Assim, qualquer número de resíduos de aminoácidos selecionado do grupo de número inteiros consistindo de 1 a 15 pode ser, assim, alterados. Assim, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 7 ou 10 alterações podem ser feitas. Variantes modificados conservadamente provêm, tipicamente, similar atividade biológica como a seqüência polipeptídica não modificada a partir da qual eles são derivados. Por exemplo, especificidade de substrato, atividade enzimática, ou ligação ligante/receptor é de geralmente pelo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90%, preferencialmente 60-90% da proteína nativa para seu substrato nativo. Tabelas de substituições conservadas provendo aminoácidos funcionalmente similares são bem conhecidas na técnica. O seis grupos a seguir contêm, cada, aminoácidos que são substituições conservadas um para o outro: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido Aspártico (D), Ácido Glutâmico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina (Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V); e 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y), Triptofano (W).

Ver também, Creighton, PROTEINS, W.H. Freeman and Co. (1984) .

Como aqui usado, "consistindo essencialmente de" significa a inclusão de seqüências adicionais a um polinucleotideo objeto onde as seqüências adicionais não hibridizam seletivamente, sob condições de hibridização estringentes, ao mesmo cDNA que o polinucleotideo e onde as condições de hibridização incluem uma etapa de lavagem em 0,1X SSC e 0,1% de sódio dodecil sulfato a 65°C.

Por "codificando" ou "codificado", com respeito a um ácido nucléico especificado, pretende-se compreender a informação para tradução na proteína especificada. Um ácido nucléico codificando uma proteína pode compreender seqüências não traduzidas (e.g., íntrons) em regiões traduzidas do ácido nucléico, ou podem não possuir tais seqüências não traduzidas intervenientes (e.g., como em cDNA) . A informação pela qual uma proteína é codificada é especificada pelo uso de códons. Tipicamente, a seqüência de aminoácidos é codificada pelo ácido nucléico usando o código genético "universal". Contudo, variantes do código universal, tal como é presente em algumas mitocôndrias de plantas, animais, e fungos, a bactéria Mycoplasma capricolum (Yamao, et al. , (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:2306-9), ou o ciliado Macronucleus, podem ser usados quando o ácido nucléico é expresso usando esses organismos.

Quando o ácido nucléico é preparado ou alterado sinteticamente, pode-se tomar vantagem de preferências de códon conhecidas do hospedeiro visado onde o ácido nucléico deve ser expresso. Por exemplo, apesar de seqüências de ácidos nucléicos da presente invenção poderem ser expressas tanto em espécies de plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, seqüências podem ser modificadas para contabilizar as preferências de códon especificas e preferências de conteúdo GC de plantas monocotiledôneas ou plantas dicotiledôneas, já que essas preferências foram vistas por diferirem (Murray, et al., (1989) Nucleic Acids Res. 17:477-98 e aqui incorporada por referência). Assim, o códon preferido de milho para um aminoácido em particular deve ser derivado de seqüências gênicas conhecidas de milho. O uso de códon em milho para 28 genes de plantas de milho é listado na Tabela 4 de Murray, et al., supra.

Como aqui usado, "heterólogo" em referência a um ácido nucléico é um ácido nucléico que se origina de uma espécie estrangeira, ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificado de sua forma nativa em composição e/ou lócus genômico por intervenção humana deliberada. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um gene estrutural heterólogo é de uma espécie diferente daquela da qual o gene estrutural foi derivado ou, se da mesma espécie, um ou ambos são substancialmente modificados se sua forma original. Uma proteína heteróloga pode ser originar de uma espécie estrangeira ou, se da mesma espécie, ser substancialmente modificada de sua forma original por intervenção humana deliberada.

Por "célula hospedeira" pretende-se uma célula, a qual contém um vetor e suporta a replicação e/ou expressão do vetor de expressão. Células hospedeiras podem ser células procariontes, tais como células de E. coli, ou células eucariontes, tais como leveduras, células de insetos, plantas, anfíbios, ou de mamíferos. Preferencialmente, células hospedeiras são células vegetais monocotiledôneas ou dicotiledôneas, incluindo, mas não se limitando a, milho, sorgo, girassol, soja, trigo, alfafa, arroz, algodão, canola, cevada, milhete e tomate. Uma célula hospedeira de monocotiledônea particularmente preferida é uma célula hospedeira de milho. 0 termo "complexo de hibridização" inclui referência a uma estrutura duplex de ácido nucléico formada por duas seqüências de ácidos nucléicos de fita simples seletivamente hibridizadas uma à outra. 0 termo "introduzido", no contexto de inserir um ácido nucléico em uma célula, significa a "transfecção" ou "transformação" ou "transdução" e inclui referência à incorporação de um ácido nucléico em uma célula eucarionte ou procarionte, onde o ácido nucléico pode ser incorporado no genoma da célula (e.g., DNA cromossômico, de plasmideo, de plastideo ou mitocondrial), convertido em um replicon autônomo, ou expresso transientemente (e.g., mRNA transfectado). 0 termo "isolado" refere-se a material, tal como um ácido nucléico ou uma proteína, que é substancialmente ou essencialmente livre de componentes que normalmente acompanham ou interagem com o mesmo, como encontrado em seu ambiente naturalmente ocorrente. 0 material isolado compreende, opcionalmente, material não encontrado com o material em seu ambiente natural. Ácidos nucléicos, que são "isolados", como aqui definido, são também referidos como ácidos nucléicos "heterólogos". A menos que declarado de outra forma, o termo "ácido nucléico de ARGOS" significa um ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo ("polinucleotídeo ARGOS") codificando um polipeptídeo ARGOS.

Como aqui usado, "ácido nucléico" inclui referência a polímero de desoxirribonucleotídeo ou ribonucleotídeo tanto na forma de fita simples ou dupla-fita, e a menos que limitado ao contrário, engloba análogos conhecidos tendo a natureza essencial de nucleotídeos naturais já que hibridizam a ácidos nucléicos de fita simples de maneira similar a nucleotídeos naturalmente ocorrentes (e.g., ácidos nucléicos peptídicos).

Por "biblioteca de ácidos nucléicos" pretende-se uma coleção de DNA isolado ou moléculas de RNA, que compreendem e representam substancialmente toda a fração transcrita de um genoma de um organismo especificado. A construção de bibliotecas de ácidos nucléicos exemplares, tais como bibliotecas de DNA genômico e cDNA, é ensinada em referências padrão de biologia molecular, tais como Berger and Kimmel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, da série METHODS IN ENZYMOLOGY, vol. 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1987); Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., vols. 1-3 (1989); e CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, et al., eds, Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc. (1994 Supplement).

Como aqui usado "operacionalmente ligado" inclui referência a uma ligação funcional entre uma primeira seqüência, tal como um promotor e uma segunda seqüência, caracterizado pelo fato de que a seqüência promotora inicia e media a transcrição da seqüência de DNA correspondente à segunda seqüência. Geralmente, operacionalmente ligado significa que as seqüências de ácidos nucléicos sendo ligadas são contíguas e, onde necessário para juntar duas regiões codificadoras de proteína, contíguas e na mesma fase de leitura.

Como aqui usado, o termo "planta" inclui referência a plantas inteiras, órgãos vegetais (e.g., folhas, caules, raízes, etc.), sementes e células vegetais e progênie da mesma. Célula vegetal, como aqui usado inclui, sem limitação, culturas em suspensão de sementes, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, raízes, brotos, gametófitos, esporófitos, pólen, e micrósporos. A classe de plantas, que pode ser usada nos métodos da invenção, é geralmente tão ampla como a classe de plantas superiores passíveis e técnicas de transformação, incluindo tanto plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas incluindo espécies dos gêneros: Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nícotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianassim, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Glycine, Písum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Avena, Hordeum, Secale, Allium, e Triticum. Uma planta particularmente preferira é Zea mays.

Como aqui usado, "rendimento" inclui referência a alqueires por acre de um grão de cultivo na colheita, como ajustado para umidade de grãos (15% tipicamente). A umidade de grãos é medida no grão na colheita. 0 peso de teste ajustado de grão é determinado para ser o peso em libras por alqueire, ajustado para nível de umidade de grãos na colheita.

Como aqui usado, "polinucleotídeo" inclui referência a um desoxirribopolinucleotídeo, ribopolinucleotídeo, ou análogos desses que possuem a natureza essencial de um ribonucleotideo natural no qual hibridizam, sob condições de hibridização estringentes, para substancialmente a mesma seqüência de nucleotídeos como nucleotídeos naturalmente ocorrentes e/ou permitem a tradução no mesmo aminoácido(s) como o(s) nucleotídeo(s) naturalmente ocorrente(s). Um polinucleotídeo pode ser de comprimento total ou uma subseqüência de um gene estrutural heterólogo ou regulador. A menos que indicado ao contrário, o termo inclui referência à seqüência especificada, assim como, à seqüência complementar dessa. Assim, DNAs ou RNAs com espinhas dorsais modificadas para estabilidade ou por outras razões são "polinucleotídeos" como aquele termo é pretendido aqui. Além do mais, DNAs ou RNAs compreendendo bases não usuais, tais como inosina, ou bases modificadas, tais como bases tritiladas, para dar apenas dois exemplos, são polinucleotídeos como o termo é aqui usado. Será ponderado que uma grande variedade de modificações foi feita para DNA e RNA que servem a vários propósitos úteis conhecidos daqueles especialistas na técnica. O termo polinucleotídeo, como aqui empregado, abrange tais formas de polinucleotídeos modificadas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente, assim como as formas químicas de DNA e RNA características de vírus e células, incluindo inter alia, células simples e complexas.

Os termos "polipeptídeo," "peptídeo," e "proteína" são aqui usados intercambiavelmente para referir-se a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos se aplicam a polímeros de aminoácidos nos quais um ou mais resíduos de aminoácido são análogos químicos artificiais de um aminoácido correspondente naturalmente ocorrente, assim como a polímeros de aminoácidos naturalmente ocorrentes.

Como aqui usado "promotor" inclui referência a uma região de DNA acima do início de transcrição e envolvida no reconhecimento e ligação de RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um "promotor vegetal" é um promotor capaz de iniciar a transcrição em células vegetais. Promotores vegetais exemplares incluem, mas não são limitados a, aqueles que são obtidos a partir de plantas, vírus vegetais, e bactérias que compreendem genes expressos em células vegetais, tais como Agrobacterium ou Rhizobium. Exemplos são promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em certos tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xilema, traqueídeos, ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como "tecido-preferenciais". Um promotor específico de "tipo de célula" primariamente dirige a expressão em certos tipos de células em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "induzido" ou "regulável" é um promotor, que está sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que pode efetuar a transcrição por promotores induzidos incluem condições anaeróbicas ou a presença de luz. Outro tipo de promotor é um promotor regulado por desenvolvimento, por exemplo, um promotor que dirige a expressão durante o desenvolvimento do pólen. Promotores preferidos de tecido, específicos de tipo de célula, regulados por desenvolvimento e induzidos constituem a classe de promotores "não constitutivos". Um promotor "constitutivo" é um promotor, que está ativo sob a maioria das condições ambientais. 0 termo "polipeptídeo ARGOS" refere-se a uma ou mais seqüências de aminoácidos. 0 termo também inclui fragmentos, variantes, homólogos, alelos ou precursores (e.g.r pré-proproteínas ou pró-proteínas) dessas. Uma "proteína ARGOS" compreende um polipeptídeo ARGOS. A menos que declarado de outra forma, o termo "ácido nucléico de ARGOS" significa um ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo ("polinucleotídeo de ARGOS") codificando um polipeptídeo ARGOS.

Como aqui usado "recombinante" inclui referência a uma célula ou vetor, que foi modificado pela introdução de um ácido nucléico heterólogo ou que a célula é derivada de uma célula modificada dessa maneira. Assim, por exemplo, células recombinantes expressam genes que não são encontrados de forma idêntica na forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são, de outra forma, expressos anormalmente, super-expressos ou não expressos por completo como resultado de intervenção humana deliberada. 0 termo "recombinante" como aqui usado não engloba a alteração da célula ou vetor por eventos naturalmente ocorrentes (e.g., mutação espontânea, transformação/transdução/transposição natural) tais como aqueles ocorrendo sem intervenção humana deliberada.

Como aqui usado, um "cassete de expressão recombinante" é um construção de ácidos nucléicos gerada recombinantemente ou sinteticamente, com uma serie de elementos de ácidos nucléicos especificados, que permitem a transcrição de um ácido nucléico em particular em uma célula alvo. 0 cassete de expressão recombinante pode ser incorporado em um plasmideo, cromossomo, DNA mitocondrial, DNA de plastideo, vírus, ou fragmento de ácido nucléico. Tipicamente, a porção recombinante de cassete de expressão de um vetor de expressão inclui, dentre outras seqüências, um ácido nucléico a ser transcrito, e um promotor.

Os termos "resíduo" ou "resíduo de aminoácido" ou "aminoácido" são usados intercambiavelmente aqui para referir-se a um aminoácido que é incorporado em uma proteína, polipeptídeo, ou peptídeo (coletivamente "proteína") . 0 aminoácido pode ser um aminoácido naturalmente ocorrente e, a menos que limitado de outra forma, pode englobar análogos conhecidos de aminoácidos naturais que podem funcionar de maneira similar como aminoácidos naturalmente ocorrentes. 0 termo "hibridiza seletivamente" inclui referência a hibridização, sob condições de hibridização estringentes, de uma seqüência de ácidos nucléicos a uma seqüência de ácidos nucléicos alvo especificada a um grau detectavelmente maior (e.g., pelo menos 2 vezes sobre a base) do que sua hibridização a seqüências de ácidos nucléicos não alvo e para a exclusão substancial de ácidos nucléicos não alvo. Seqüências hibridizando seletivamente tipicamente possuem cerca de pelo menos 40% de identidade de seqüência, preferencialmente 60-90% de identidade de seqüência, e mais preferencialmente 100% de identidade de seqüência (i.e., complementar) uma à outra.

Os termos "condições estringentes" ou "condições de hibridização estringentes" incluem referência a condições sob as quais uma sonda irá hibridizar a sua seqüência alvo em um grau detectavelmente maior do que a outras seqüências (e.g., pelo menos 2 vezes sobre a base). Condições estringentes são dependentes de seqüência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Controlando a estringência das condições de hibridização e/ou lavagem, seqüências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (sondagem homóloga). Alternativamente, condições de estringência podem ser ajustadas para permitir alguma falta de correspondência em seqüências de forma que graus menores de similaridade sejam detectados (sondagem heteróloga). Otimamente, a sonda é de aproximadamente 500 nucleotídeos em comprimento, mas pode variar muito em comprimento a partir de menos de 500 nucleotídeos até igual ao comprimento total da seqüência alvo.

Tipicamente, condições estringentes serão aquelas nas quais a concentração de sais é menor do que cerca de 1,5 M de íons de Na, tipicamente concentração de cerca de 0,01 a 1,0 M de íons de Na (ou outros sais) em pH 7,0 a 8,3 e a temperatura é de pelo menos cerca de 30 C para sondas curtas (e.g., 10 a 50 nucleotídeos) e de pelo menos cerca de 60°C para sondas longas (e.g., maiores que 50 nucleotídeos) . Condições estringentes podem ser alcançadas, também, com a adição de agentes desestabilizantes, tais como formamida ou Denhardt's. Condições exemplares de baixa estringência incluem hibridização com uma solução tampão de 30 a 35% de formamida, NaCl 1 M, SDS 1% (sódio dodecil sulfato) a 37°C, e uma lavagem em SSC IX a 2X (SSC 20X = NaCl 3,0 M/trissódio citrato 0,3 M) a 50 a 55°C. Condições exemplares de estringência moderada incluem hibridização em 40 a 45% formamida, NaCl 1,0 M, SDS 1% a 37°C, e uma lavagem em 0,5X a SSC IX a 55 a 60°C. Condições exemplares de estringência elevada incluem hibridização em formamida 50%, NaCl 1 M, SDS 1% a 37 C, e uma lavagem em SSC 0,1X a 60 a 65°C por pelo menos 30 minutos. A especificidade é tipicamente a função de lavagens pós hibridização, os fatores críticos sendo a força iônica e temperatura da solução de lavagem final. Para híbridos DNA-DNA, o ponto térmico de derretimento (Tm) pode ser aproximado a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984) Anal. Biochem. 138:267-284: Tm = 81,5°C + 16,6 (log M) + 0,41 (%GC) - 0,61 (% form) - 500/L; onde M é a molaridade de cátions monovalentes, %GC é a porcentagem de nucleotídeos guanosina e citosina no DNA, % form é a porcentagem de formamida na solução de hibridização, e L é o comprimento do hibrido em pares de bases. A Tm é a temperatura (sob definidas força iônica e pH) na qual 50% de uma seqüência alvo complementar hibridiza a uma sonda perfeitamente correspondente. A Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de falta de correspondência; assim, condições de Tm, hibridização, e/ou lavagem podem ser ajustadas para hibridizar a seqüências da identidade desejada. Por exemplo, se seqüências com identidade >90% são procuradas, a Tm pode ser diminuída em 10°C. Por exemplo, se seqüências com >90% de identidade são procuradas, a Tm pode ser diminuída em 10°C. Geralmente, condições estringentes são selecionadas para serem cerca de 5°C menores do que o ponto térmico de derretimento (Tm) para a seqüência específica e seu complemento em uma definida força iônica e pH. Contudo, condições severamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 1, 2, 3, ou 4°C menor do que o ponto térmico de derretimento (Tm) ; condições moderadamente estringentes podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 6, 7, 8, 9 ou 10°C menor do que o ponto térmico de derretimento (Tm) ; condições de baixa estringência podem utilizar uma hibridização e/ou lavagem a 11, 12, 13, 14, 15 ou 20°C menor do que o ponto térmico de derretimento (Tm) . Usando a equação, composições de hibridização e lavagem, e Tm desejada, aqueles de conhecimento ordinário entenderão que variações na estringência de soluções de hibridização e/ou lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de falta de correspondência resulta em uma Tm de menos do que 45°C (solução aquosa) ou 32°C (solução de formamida), é preferível aumentar a concentração de SSC de forma que uma maior temperatura possa ser usada. Um guia extensivo para a hibridização de ácidos nucléicos é encontrado em Tijssen, LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY—HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, part I, chapter 2, "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," Elsevier, New York (1993); and CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, chapter 2, Ausubel, et al., eds, Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995). A menos que declarado de outra forma, na presente aplicação estringência elevada é definida como hibridização em SSC 4X, Denhardt' s 5X (5 g Ficoll, 5 g polivinipirrolidona, 5 g albumina de soro bovino em 500 ml de água), 0,1 mg/ml de DNA de esperma de salmão fervido, e Na fosfato 25 mM a 65°C, e uma lavagem em SSC 0,1X, SDS 0,1% a 65 °C.

Como aqui usado, "planta transgênica" inclui referência a uma planta, que compreende em seu genoma um polinucleotideo heterólogo. Geralmente, o polinucleotideo heterólogo é estavelmente integrado no genoma de forma que o polinucleotideo é passado a sucessivas gerações. O polinucleotideo heterólogo pode ser integrado no genoma sozinho ou como parte de um cassete de expressão recombinante. "Transgênico" é aqui usado para incluir qualquer célula, linha de célula, calo, tecido, parte de planta ou planta, o genótipo da qual tenha sido alterado pela presença de ácido nucléico heterólogo incluindo aqueles transgênicos inicialmente alterados dessa forma, assim como aqueles criados por cruzamentos sexuados ou propagação assexuada a partir do transgênico inicial. 0 termo "transgênico", como aqui usado, não engloba a alteração do genoma (cromossômico ou extra-cromossômico) por métodos convencionais de melhoramento vegetal ou por eventos naturalmente ocorrentes, tais como fertilização cruzada aleatória, infecção viral não recombinante, transformação bacteriana não recombinante, transposição não recombinante, ou mutação espontânea.

Como aqui usado, "vetor" inclui referência a um ácido nucléico usado na transfecção de uma célula hospedeira e no qual pode ser inserido um polinucleotideo. Vetores são freqüentemente replicons. Vetores de expressão permitem a transcrição de um ácido nucléico ai inserido.

Os seguintes termos são usados para descrever as relações de seqüência entre dois ou mais ácidos nucléicos ou polinucleotideos ou polipeptideos: (a) "seqüência referência", (b) "janela de comparação", (c) "identidade de seqüência", (d) "porcentagem de identidade de seqüência", e (e) "identidade substancial".

Como aqui usado, "seqüência referência" é uma seqüência definida usada como base para comparação de seqüências. Uma seqüência referência pode ser um subgrupo ou a totalidade de uma seqüência especificada; por exemplo, como um segmento de um cDNA ou seqüência gênica de comprimento total, ou o cDNA ou seqüência gênica completos.

Como aqui usado, "janela de comparação" faz referência a um segmento contíguo e específico de uma seqüência de polinucleotídeos, caracterizado pelo fato de que a seqüência de polinucleotídeos na janela de comparação pode ser comparada a uma seqüência referência, caracterizado pelo fato de que a porção da seqüência de polinucleotídeos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (i.e., espaços) comparada à seqüência referência (que não compreende adições ou deleções) para ótimo alinhamento dos dois polinucleotídeos. Geralmente, a janela de comparação é de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos em comprimento, e opcionalmente pode ser de 30, 40, 50, 100, ou mais longa. Aqueles especialistas na técnica entendem que evitar uma alta similaridade para uma seqüência referência devido à inclusão de espaços (gaps) na seqüência de polinucleotídeos, uma penalidade por espaço é tipicamente introduzida e subtraída do número de correspondências. Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na técnica. 0 algoritmo de homologia local (BESTFIT) de Smith and Waterman, (1981) Adv. Appl. Math 2:482, pode conduzir o alinhamento ótimo de seqüências para comparação; pelo algoritmo de alinhamento de homologia (GAP) de Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443-53; pela busca para método de similaridade (Tfasta and Fasta) de Pearson and Lipman, (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444; por implementações computadorizadas desses algoritmos, incluindo, mas não se limitando a: CLUSTAL no programa PC/Gene da Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, e TFASTA no pacote de software Wisconsin Genetics Software Package, Version 8 (disponibilizado pela Genetics Computer Group (GCG® programs (Accelrys, Inc., San Diego, CA)). O programa CLUSTAL é bem descrito por Higgins and Sharp, (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp, (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet, et al., (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang, et al., (1992) Computer Applications ín the Biosciences 8:155-65, e Pearson, et al., (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-31. 0 programa preferido para usar alinhamento ótimo global de múltiplas seqüências é PileUp (Feng and Doolittle, (1987) J. Mol. Evol., 25:351-60 que é similar ao método descrito por Higgins and Sharp, (1989) CABIOS 5:151-53 e incorporado por referência daqui em diante) . A família BLAST de programas que podem ser usados para buscas de similaridade em base de dados inclui: BLASTN para buscas por seqüências de nucleotídeos em relação a sequências de nucleotídeos da base de dados; BLASTX para buscas por seqüências de nucleotídeos em relação a base de dados de seqüências de proteínas; BLASTP para buscas por seqüências de proteínas em relação à base de dados de seqüências de proteínas; TBLASTN para busca por seqüências de proteína em relação a base de dados de seqüências de nucleotídeo; e TBLASTX para buscas por seqüências de nucleotídeos em relação à base de dados de seqüências de nucleotídeos. Ver CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Chapter 19, Ausubel, et al., eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995). GAP usa o algoritmo de Needleman e Wunsch, supra, para encontrar o alinhamento de duas seqüências completas que maximiza o número de correspondências e minimiza o número de espaços. GAP considera todas as posições de alinhamento e de espaços possíveis e cria o alinhamento com o maior número de bases com correspondência e o menor de espaços. Isto permite a provisão de uma penalidade de criação de espaços e uma penalidade de extensão de espaços em unidades de bases com correspondência. GAP deve fazer um saldo de número de penalidade de criação de espaços de correspondências para cada espaço que insere. Se uma penalidade por extensão de espaço maior que zero é escolhida, GAP deve, adicionalmente, fazer um saldo para cada espaço inserido do comprimento do espaço vezes a penalidade por extensão de espaço. Valores padrão de penalidade de criação de espaços e valores de penalidade de extensão de espaços na Versão 10 do pacote de software Wisconsin Genetics Software Package são 8 e 2, respectivamente. As penalidades de criação e extensão de espaços podem ser expressas como um número inteiro selecionado do grupo de números inteiros consistindo de 0 a 200. Assim, por exemplo, as penalidades de criação e extensão de espaços podem ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 ou maiores. GAP apresenta um membro da família de alinhamentos ótimos. Podem existir vários membros dessa família, mas nenhum outro membro possui uma melhor qualidade. GAP apresenta quatro figuras de mérito para alinhamentos: Quality, Ratio, Identity, e Similarity. A Quality é a métrica maximizada para alinhar as seqüências. Ratio é a Quality dividida pelo número de bases no segmento mais curto. Percent Identity é o percentual dos símbolos que de fato se correspondem. Percent Similarity é o percentual dos símbolos que são similares. Símbolos que estão através dos espaços são ignorados. Uma similaridade é pontuada quando o valor da matriz de pontuação para um par de símbolos é maior ou igual a 0,50, o limite de similaridade. A matriz de pontuação usada na Versão 10 do pacote de software GCG Wisconsin Genetics Software Package é BLOSUM62 (ver, Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915). A menos que declarado de outra forma, valores de identidade/similaridade de seqüência aqui providos referem-se ao valor obtido usando a suíte de programas BLAST 2.0 usando parâmetros padrão (Altschul, et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-402).

Como aqueles de conhecimento ordinário na técnica entenderão, buscas BLAST assumem que proteínas podem ser modeladas como seqüências aleatórias. Contudo, várias proteínas reais compreendem regiões de seqüências não aleatórias, que podem ser traços homopoliméricos, repetições de período curtas, ou regiões enriquecidas em um ou mais aminoácidos. Tais regiões de baixa complexidade podem ser alinhadas entre proteínas não relacionadas, apesar de outras regiões da proteína serem totalmente dissimilares. Um número de programas de filtro de baixa complexidade pode ser empregado para reduzir tais alinhamentos de baixa complexidade. Por exemplo, filtros de baixa complexidade SEG (Wooten and Federhen, (1993) Comput. Chem. 17:149-63) e XNU (Claverie and States, (1993) Comput. Chem. 17:191-201) podem ser empregados sozinhos ou em combinação.

Como aqui usado, "identidade de seqüência", ou "identidade" no contexto de duas seqüências de ácidos nucléicos ou polipeptidicas de polinucleotideos ou polipeptideos, faz referência aos resíduos nas duas seqüências que são a mesma quando alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação específica. Quando a porcentagem de identidade de seqüência é usada em referência a proteínas, é reconhecido que posições de resíduos, que não são idênticos, freqüentemente diferem por substituições de aminoácidos conservativas, onde os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (e.g., carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não mudam as propriedades funcionais da molécula. Quando seqüências diferem em substituições conservadas, a identidade de seqüência percentual pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Seqüências que diferem por tais substituições conservadas são ditas por ter "similaridade de seqüência" ou "similaridade". Meios de fazer esse ajuste são bem conhecidos daqueles especialistas na técnica. Tipicamente, isso envolve pontuar uma substituição conservada como uma parcial, ao invés de uma falta de correspondência completa, aumentando, dessa forma, a porcentagem de identidade de seqüência. Assim, por exemplo, onde um aminoácido idêntico recebe uma pontuação de 1 e uma substituição não conservativa recebe uma pontuação de zero, uma substituição conservada recebe uma pontuação entre zero e 1. A pontuação de substituições conservadas é calculada, e.g., de acordo com o algoritmo de Meyers and Miller, (1988) Computer Applic. Biol. Sei. 4:11-17, e.g., como implementado no programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, Califórnia, USA).

Como aqui usado, "porcentagem de identidade de seqüência" significa o valor determinado comparando-se duas seqüências otimamente alinhadas por uma janela de comparação, caracterizado pelo fato de que a porção da seqüência de polinucleotideos na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (i.e., espaços), se comparada à seqüência referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas seqüências. A porcentagem é calculada determinando-se o número de posições nas quais a base de ácido nucléico idêntica ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas seqüências para permitir o número de posições com correspondência, dividindo o número de posições com correspondência pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade de seqüência. O termo "identidade substancial" de seqüências de polinucleotídeos significa que um polinucleotídeo compreende uma seqüência que tem entre 50-100% de identidade de seqüência, preferencialmente pelo menos 50% de identidade de seqüência, preferencialmente pelo menos 60% de identidade de seqüência, preferencialmente pelo menos 70%, mais preferencialmente pelo menos 80%, mais preferencialmente pelo menos 90%, e mais preferencialmente pelo menos 95%, comparada a uma seqüência referência usando um dos programas de alinhamento descritos usando parâmetros padrão. Um especialista na técnica reconhecerá que esses valores podem ser ajustados apropriadamente para determinar a identidade correspondente de proteínas codificadas por duas seqüências de nucleotídeos, levando-se em conta a degeneração de códon, similaridade de aminoácidos, posicionamento de fase de leitura, e similares. Identidade substancial de seqüências de aminoácidos para esses propósitos significa, normalmente, identidade de seqüência entre 55-100%, preferencialmente pelo menos 55%, preferencialmente pelo menos 60%, mais preferencialmente pelo menos 70%, 80%, 90% e mais preferencialmente pelo menos 95%.

Outra indicação de que seqüências de nucleotideos são substancialmente idênticas é se duas moléculas hibridizam uma à outra sob condições estringentes. A degeneração do código genético permite várias substituições de aminoácidos que levam a variedades na seqüência de nucleotideos que codifica para o mesmo aminoácido, é possível, assim, é possível que a seqüência de DNA poderia codificar o mesmo polipeptídeo mas não hibridiza uma à outra sob condições estringentes. Isso pode ocorrer, e.g., quando uma cópia de um ácido nucléico é criada usando a degeneração de códon máxima permitida pelo código genético. Uma indicação de que as seqüências de ácidos nucléicos são substancialmente idênticas é que o polipeptídeo, que o primeiro ácido nucléico codifica, é imunologicamente reativo ao polipeptídeo codificado pelo segundo ácido nucléico. O termo "identidade substancial", no contexto de um peptídeo, indica que um peptídeo compreende uma seqüência com identidade de seqüência entre 55-100% em relação a uma seqüência referência preferencialmente pelo menos 55% de identidade de seqüência, preferencialmente 60% preferencialmente 70%, mais preferencialmente 80%, mais preferencialmente pelo menos 90% ou 95% de identidade de seqüência em relação à seqüência referência sobre uma janela de comparação especificada. Preferencialmente, alinhamento ótimo é conduzido usando o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch, supra. Uma indicação de que duas seqüências peptidicas são substancialmente idênticas é que um peptideo é imunologicamente reativo com anticorpos criados contra o segundo peptideo. Assim, um peptideo é substancialmente idêntico a um segundo peptideo, por exemplo, onde dois peptideos diferem apenas por uma substituição conservada. Além disso, um peptideo pode ser substancialmente idêntico a um segundo peptideo quando eles diferem por uma mudança não conservativa se o epitopo que o anticorpo reconhece é substancialmente idêntico. Peptideos que são "substancialmente similares" compartilham seqüências como notado acima exceto aquelas posições de resíduos, que não são idênticas, podem diferir por mudanças de aminoácido conservativas. A invenção descreve polinucleotídeos e polipeptídeos ARGOS. Os novos nucleotídeos e proteínas da invenção possuem um padrão de expressão que indica que eles regulam o número de células e, assim, desempenham um papel importante no desenvolvimento vegetal. Os polinucleotideos são expressos em vários tecidos vegetais. Os polinucleotideos e polipeptideos provêm, assim, uma oportunidade de manipular o desenvolvimento vegetal para alterar o desenvolvimento de sementes e tecido vegetativo, sincronismo ou composição. Isso pode ser usado para criar uma planta estéril, uma planta sem sementes ou uma planta com composição de endosperma alterada. Ácidos nucléicos A presente invenção provê, inter alia, ácidos nucléicos isolados de RNA, DNA, e análogos e/ou quimeras desses, compreendendo um polinucleotideo de ARGOS. A presente invenção também inclui polinucleotideos otimizados para expressão em diferentes organismos. Por exemplo, para expressão do polinucleotideo em uma planta de milho, a seqüência pode ser alterada para contabilizar para preferências especificas de códon e para alterar o conteúdo de GC, como de acordo com Murray, et al, supra. 0 uso de códon em milho para 28 genes de plantas de milho é listado na Tabela 4 de Murray, et al., supra.

Os ácidos nucléicos de ARGOS da presente invenção compreendem polinucleotideos de ARGOS isolados que incluem: (a) um polinucleotideo codificando um polipeptideo ARGOS e variantes conservadamente modificados e polimórficos desses; (b) um polinucleotideo tendo pelo menos 7 0% de identidade de seqüência em relação a polinucleotideos de (a) ou (b); (c) seqüências complementares de polinucleotideos de (a) ou (b). A seguinte tabela, Tabela 1, lista as identidades especificas dos polinucleotideos e polipeptideos aqui descritos. TABELA 1.

Construção de Ácidos nucléicos Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem ser feitos usando (a) métodos recombinantes padrão, (b) técnicas sintéticas, ou combinações desses. Em alguns avanços, os polinucleotideos da presente invenção serão clonados, amplificados, ou, ao contrário, construídos a partir de um fungo ou bactéria.

Os ácidos nucléicos podem convenientemente compreender seqüências além de um polinucleotideo da presente invenção. Por exemplo, um sítio de multiclonagem compreendendo um ou mais sítios de restrição de endonuclease pode ser inserido no ácido nucléico para auxiliar no isolamento do polinucleotideo. Ainda, seqüências traduzíveis podem ser inseridas para auxiliar no isolamento do polinucleotideo traduzível da presente invenção. Por exemplo, uma seqüência marcadora de hexa-histidina provê um meio conveniente para purificar as proteínas da presente invenção. 0 ácido nucléico da presente invenção excluindo a seqüência de polinucleotideos - é opcionalmente um vetor, adaptador, ou ligante para clonagem e/ou expressão de um polinucleotideo da presente invenção. Seqüências adicionais podem ser adicionadas para tais seqüências de clonagem e/ou expressão para otimizar sua função na clonagem e/ou expressão, para auxiliar no isolamento do polinucleotideo, ou para melhorar a introdução do polinucleotídeo em uma célula. Tipicamente, o comprimento de um ácido nucléico da presente invenção menos o comprimento de seu polinucleotídeo da presente invenção é de menos de 20 pares de quilobases, freqüentemente de menos de 15 kb, e freqüentemente de menos de 10 kb. O uso de vetores de clonagem, vetores de expressão, adaptadores, e ligantes é bem conhecido na técnica. Ácidos nucléicos exemplares incluem tais vetores como: Ml3, lambda ZAP Express, lambda ΖΑΡ II, lambda gtlO, lambda gtll, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II, lambda DASH II, lambda EMBL 3, lambda EMBL 4, pWE15, SuperCos 1, SurfZap, Uni-ΖΑΡ, pBC, pBS+/-, pSG5, pBK, pCR-Script, pET, pSPUTK, p3'SS, pGEM, pSK+/-, pGEX, pSPORTI and II, pOPRSVI CAT, pOPI3 CAT, pXTl, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, pOG44, pOG4 5, pFRTpGAL, pNEOpGAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, lambda MOSSlox, e lambda MOSElox. Vetores opcionais para a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, lambda ZAP II, e pGEX. Para uma descrição de vários ácidos nucléicos ver, e.g., Stratagene Cloning Systems, Catalogs 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA); and, Amersham Life Sciences, Inc, Catalog '97 (Arlington Heights, IL). Métodos sintéticos para construir ácidos nucléicos Os ácidos nucléicos isolados da presente invenção podem ser também preparados por síntese química direta por métodos, tais como, o método de fosfotriéster de Narang, et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:90-9; o método de fosfodiéster de Brown, et al., (1979) Meth. Enzymol. 68:109-51; o método de dietilfosforamidita de Beaucage et al., (1981) Tetra. Letts. 22 (20) :1859-62; o método de fosforamidita triéster em fase sólida descrito por Beaucage ,et al., supra, e.g., usando um sintetizador automatizado, e.g., como descrito em Needham-VanDevanter, et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:6159-68; e , o método de suporte sólido de Patente US No. 4.458.066. A síntese química geralmente produz um oligonucleotídeo de fita simples. Este pode ser convertido DNA de dupla-fita por hibridização com uma seqüência complementar ou por polimerização com uma DNA polimerase usando a fita simples como modelo. Um especialista reconhecerá que enquanto a síntese química de DNA é limitada a seqüências de cerca de 100 bases, seqüências mais longas podem ser obtidas pela ligação de seqüências mais curtas. UTRs e Preferência de Códons Em geral, a eficiência de tradução foi vista por ser regulada por elementos de seqüência específicos na região 5' não codificadora ou não traduzida (UTR 5') do RNA. Motivos de seqüência positivos incluem seqüências consenso de iniciação de tradução (Kozak, (1987) Nucleic Acids Res.15:8125) e a estrutura 5<G> 7 metil GpppG RNA cap (Drummond, et al., (1985) Nucleic Acids Res. 13:7375). Elementos negativos incluem estruturas stem-loop estáveis intramoleculares UTR 5' (Muesing, et al., (1987) Cell 48:691) e seqüências AUG ou quadros de iniciação de leitura curtos precedidos por um AUG apropriado no UTR 5' (Kozak, supra, Rao, et al., (1988) Mol. and Cell. Biol. 8:284). Dessa maneira, a presente invenção provê regiões UTR 5' e/ou 3' para modulação da tradução de seqüências codificadoras heterólogas.

Ainda, os segmentos codificando polipeptideos dos polinucleotideos da presente invenção podem ser modificados para alterar o uso de códons. 0 uso de códons alterado pode ser empregado para alterar a eficiência de tradução e/ou para otimizar a seqüência codificadora para expressão em um hospedeiro desejado ou para otimizar o uso de códon em uma seqüência heteróloga para expressão em milho. 0 uso de códon nas regiões codificadoras dos polinucleotideos da presente invenção pode ser analisado estatisticamente usando pacotes de software disponíveis comercialmente, tais como "Codon Preference" disponibilizado pelo University of Wisconsin Genetics Computer Group. Ver, Devereaux, et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:387-395; or MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haven, Conn.). Assim, a presente invenção provê uma característica de freqüêncía de uso de códons da região codificadora de pelo menos um dos polinucleotídeos da presente invenção. 0 número de polinucleotídeos (3 nucleotídeos por aminoácido) que podem ser usados para determinar uma freqüêncía de uso de códons pode ser qualquer número inteiro de 3 até o número de polinucleotídeos da presente invenção como aqui provido. Opcionalmente, os polinucleotídeos serão as seqüências de comprimento total. Um número exemplar de seqüências para análise estatística pode ser pelo menos 1, 5, 10, 20, 50 ou 100.

Embaralhamento de Seqüências A presente invenção provê métodos para embaralhamento de seqüências usando polinucleotídeos da presente invenção, e composições resultantes desses. 0 embaralhemento de seqüências é descrito na publicação PCT No. W096/19256. Ver também, Zhang, et al., (1997) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 94:4504-9; e Zhao, et al., (1998) Nature Biotech 16:258-61. Geralmente, o embaralhamento de seqüências provê meios para gerar bibliotecas de polinucleotídeos tendo uma característica desejada, que pode ser selecionada ou rastreada. Bibliotecas de polinucleotídeos recombinantes são geradas a partir de uma população de polinucleotídeos de seqüência relacionados, que compreendem regiões de seqüência, as quais possuem identidade de seqüência substancial e podem ser homologamente recombinadas in vitro ou in vivo. A população de polinucleotídeos de seqüência recombinada compreende uma subpopulação de polinucleotídeos que possui características desejadas ou vantajosas e que podem ser selecionadas por um método de seleção ou rastreamento adequado. As características podem ser qualquer propriedade ou atributo capaz de ser selecionado ou detectado em um sistema de rastreamento, e pode incluir propriedades de: uma proteína codificada, um elemento transcricional, uma seqüência controlando transcrição, processamento de RNA, estabilidade de RNA, conformação de cromatina, tradução, ou outra propriedade de expressão de um gene ou transgene, um elemento de replicação, um elemento se ligando a proteína, ou similares, tais como qualquer aspecto que confira uma propriedade passível de seleção ou detecção. Em alguns avanços, a característica selecionada será uma Km e/ou Kcat alterada sobre a proteína de tipo selvagem como aqui provido. Em outros avanços, uma proteína ou polinucleotídeo gerado a partir de embaralhamento de seqüências terá uma afinidade de ligação de ligante maior do que o polinucleotídeo de tipo selvagem não embaralhado. Ainda em outros avanços, uma proteína ou polinucleotídeo gerado a partir de embaralhamento de seqüências terá um pH ótimo alterado se comparado ao polinucleotídeo de tipo selvagem não embaralhado. 0 aumento em tais propriedades pode ser de pelo menos 110%, 120%, 130%, 140% ou mais do que 150% do valor de tipo selvagem.

Cassetes de expressão recombinantes A presente invenção provê ainda cassetes de expressão recombinantes compreendendo um ácido nucléico da presente invenção. A seqüência de ácidos nucléicos codificando o polinucleotídeo desejado da presente invenção, por exemplo, um cDNA ou uma seqüência genômica, codificando um polipeptídeo longo o suficiente para codificar uma proteína ativa da presente invenção, pode ser usado para construir um cassete de expressão recombinante que pode ser introduzido na célula hospedeira desejada. Um cassete de expressão recombinante compreenderá, tipicamente, um polinucleotídeo da presente invenção operacionalmente ligado a seqüências reguladoras iniciação de transcrição que irão direcionar a transcrição do polinucleotídeo na célula hospedeira visada, tal como tecidos de uma planta transformada.

Por exemplo, vetores de expressão em plantas podem incluir (1) um gene vegetal clonado sob controle transcricional de sequências reguladoras 5' e 3' e (2) um marcador de seleção dominante. Tais vetores de expressão em plantas podem conter também, se desejado, uma região reguladora promotora (e.g., uma conferindo expressão induzida ou constitutiva, regulada ambientalmente ou por desenvolvimento, ou especifica/seletiva de célula ou tecido), um sitio de inicio de transcrição, um sitio de ligação de ribossomo, um sinal de processamento de RNA, um sitio de terminação de transcrição, e/ou um sinal de poliadenilação.

Um fragmento promotor vegetal que irá direcionar a expressão de um polinucleotideo da presente invenção em todos os tecidos de uma planta regenerada pode ser empregado. Tais promotores são aqui referidos como promotores "constitutivos" e são ativos sob a maioria das condições ambientais e estados de desenvolvimento ou diferenciação celular. Exemplos de promotores constitutivos incluem o promotor 1'- ou 2'- derivado de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, o promotor Smas, o promotor de cinamil álcool desidrogenase (Patente US No. 5.683.439), o promotor Nos, o promotor de rubisco, o promotor de GRP1-8, o promotor de 35S de vírus de mosaico de couve-flor (CaMV), como descrito em Odell, et al., (1985) Nature 313:810-2; actina de arroz (McElroy, et ai., (1990) Plant Cell 163-171); ubiquitina (Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 12:619-632 e Christensen, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-89); pEMU (Last, et al., (1991) Theor. Appl. Genet. 81:581-8); MAS (Velten, et al., (1984) EMBO J. 3:2723-30); e histona H3 de milho (Lepetit, et al., (1992) Mol. Gen. Genet. 231:276-85; e Atanassvoa, et al., (1992) Plant Journal 2 (3) : 291-300); promotor ALS, como descrito em PCT Application No. WO 96/30530; GOS2 (Patente US No. 6.504.083) e outras regiões de iniciação de transcrição de vários genes vegetais conhecidos daqueles especialistas. Para a presente invenção, ubiquitina é o promotor preferido para expressão em plantas monocotiledôneas.

Alternativamente, o promotor vegetal pode dirigir a expressão de um polinucleotídeo da presente invenção em um tecido específico ou pode estar, ao contrário, sob controle ambiental ou de desenvolvimento mais preciso. Tais promotores são referidos aqui como promotores "induzidos" (Rabl7, RAD29). Condições ambientais que podem efetuar a transcrição por promotores induzidos incluem ataque de patógenos, condições anaeróbicas, ou a presença de luz. Exemplos de promotores induzidos são o promotor de Adhl, que é induzido por hipoxia ou estresse de frio, o promotor de Hsp70, que é induzido por estresse de calor, e o promotor de PPDK, que é induzido por luz.

Exemplos de promotores sob controle de desenvolvimento incluem promotores que iniciam a transcrição apenas, ou preferencialmente, em certos tecidos, tais como folhas, raízes, frutos, sementes, ou flores. A operação de um promotor pode variar, também, dependendo de sua localização no genoma. Assim, um promotor induzido pode se tornar completamente ou parcialmente constitutivo em certas localidades.

Se a expressão de polipeptideo é desejada, é geralmente desejável incluir uma região de poliadenilação na extremidade 3' de uma região codificadora de polinucleotideo. A região de poliadenilação pode ser derivada de uma variedade de genes vegetais, ou de T-DNA. A seqüência de extremidade 3' a ser adicionada pode ser derivada de, por exemplo, os genes de nopalina sintase ou octopina sintase, ou alternativamente de outro gene vegetal, ou menos preferencialmente de qualquer outro gene eucarionte. Exemplos de tais elementos reguladores incluem, mas não estão limitados a, regiões 3' de terminação e/ou poliadenilação, tais como aquelas do gene de nopalina sintase de Agrobacterium tumefaciens (nos) (Bevan, et al., (1983) Nucleic Acids Res. 12:369-85); o gene inibidor de proteinase II de batata (PINII) (Keil, et al., (1986) Nucleic Acids Res. 14:5641-50; and An, et al., (1989) Plant Cell 1:115-22); e o gene de CaMV 19S (Mogen, et al., (1990) Plant Cell 2:1261-72).

Uma seqüência de intron pode ser adicionada à região 5' não traduzida ou a seqüência codificadora da seqüência codificadora parcial para aumentar a quantidade da mensagem madura que se acumula no citosol. A inclusão de um intron passível de sofrer splicing na unidade de transcrição em ambas as construções de expressão em vegetal e animal foi mostrada por aumentar a expressão gênica em ambos os níveis de mRNA e de proteína até 1000 vezes (Buchman and Berg, (1988) Mol. Cell Biol. 8:4395-4405; Callis, et al., (1987) Genes Dev. 1:1183-200). Tal intensificação por intron de expressão gênica é tipicamente máxima quando colocada próxima da extremidade 5' da unidade de transcrição. O uso de íntrons Adhl-S de milho intron 1, 2, e 6, o intron Bronze-1 é conhecido na técnica. Ver geralmente, THE MAIZE HANDBOOK, Chapter 116, Freeling and Walbot, eds., Springer, New York (1994).

Seqüências sinal de vegetais, incluindo, mas não se limitando a, peptídeo sinal codificando seqüências de DNA/RNA que direcionam proteínas para a matriz extracelular da célula vegetal (Dratewka-Kos, et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:4896-900), tal como o gene de extensão de Nicotiana plumbaginifolia (DeLoose, et al., (1991) Gene 99:95-100); peptídeos sinal que direcionam proteínas para o vacúolo, tais como o gene de esporamina de batata-doce (Matsuka, et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:834) e o gene de lectina de cevada (Wilkins, et al., (1990) Plant Cell, 2:301-13); peptídeos sinal que fazem com que proteínas seja secretadas, tais como aquele de PRIb (Lind, et al., (1992) Plant Mol. Biol. 18:47-53) ou alfa-amilase de cevada (BAA) (Rahmatullah, et al., (1989) Plant Mol.

Biol. 12:119, e, aqui incorporados por referência), ou peptídeos sinal que direcionam proteínas para os plastidios, tais como aquele de enoil-Acp redutase de brássicas (Verwaert, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 26:189-202) são úteis na invenção. A seqüência sinal de alfa-amilase de cevada fusionada ao polinucleotídeo ARGOS é a construção preferida para expressão em milho para a presente invenção. 0 vetor compreendendo as seqüências de um polinucleotídeo da presente invenção compreenderá, tipicamente, um gene marcador, que confere um fenótipo selecionável em células vegetais. Usualmente, o gene marcador de seleção codificará resistência a antibióticos, com genes adequados incluindo genes codificando resistência ao antibiótico espectinomicina (e.g., o gene aada), o gene de estreptomicina fosfotransferase (SPT) codificando resistência a estreptomicina, o gene de neomicina fosfotransferase (NPTII) codificando resistência a canamicina ou geneticina, o gene de higromicina fosfotransferase (HPT) codificando resistência a higromicina, genes codificando resistência a herbicidas que atuam para inibir a ação de acetolactato sintase (ALS) , em particular os herbicidas do tipo sulfoniluréia (e.g., o gene de acetolactato sintase (ALS) contendo mutações levando a tal resistência em particular as mutações S4 e/ou Hra) , genes codificando resistência a herbicidas que atuam para inibir a ação de glutamina sintase, tais como fosfinotricina ou basta (e.g., o gene bar), ou outros genes conhecidos na técnica. 0 gene bar codifica resistência ao herbicida basta, e o gene ALS gene codifica resistência ao herbicida clorsulfuron.

Vetores típicos úteis para expressão de genes em plantas superiores são bem conhecidos na técnica e incluem vetores derivados do plasmídeo indutor de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers, et al., (1987) Meth. Enzymol. 153:253-77. Aqueles vetores são vetores vegetais integradores já que, em transformação, os vetores integram uma porção de DNA vetor no genoma da planta hospedeira. Vetores exemplares de A. tumefaciens úteis aqui são os plasmídeos pKYLX6 e pKYLX7 de Schardl, et al., (1987) Gene 61:1-11, e Berger, et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:8402-6. Outro vetor útil aqui é o plasmídeo pBI101.2 que está disponível pela CLONTECH Laboratories, Inc. (Paio Alto, CA).

Expressão de Proteínas em Células hospedeiras Usando os ácidos nucléicos da presente invenção, pode-se expressar uma proteína da presente invenção em uma célula construída de forma recombinante, tal como bactérias, leveduras, células de insetos, de mamíferos, ou preferencialmente células vegetais. As células produzem a proteína em uma condição não natural (e.g., em quantidade, composição, localização, e/ou tempo), pois elas foram geneticamente alteradas através de intervenção humana para fazerem isto. É esperado que aqueles especialistas na técnica sejam conhecedores de numerosos sistemas de expressão disponíveis para expressão de um ácido nucléico codificando uma proteína da presente invenção. Nenhuma tentativa de descrever em detalhes os vários métodos conhecidos para a expressão de proteínas em procariontes ou eucariontes será feita.

Resumidamente, a expressão de ácidos nucléicos isolados codificando uma proteína da presente invenção será tipicamente alcançada ligando-se operacionalmente, por exemplo, o DNA ou cDNA a um promotor (que é tanto constitutivo ou induzido) , seguido por incorporação em um vetor de expressão. Os vetores podem ser adequados para replicação e integração tanto em procariontes ou eucariontes. Vetores de expressão típicos contêm seqüências terminadoras, de iniciação de transcrição e tradução, e promotores úteis para a regulação da expressão do DNA codificando uma proteína da presente invenção. Para obter um nível elevado de expressão de um gene clonado, é desejável construir vetores de expressão que contêm, no mínimo, um promotor forte, tal como ubiquitina, para direcionar a transcrição, um sítio de ligação de ribossomo para iniciação de tradução, e um terminador de transcrição/ tradução. Promotores constitutivos são classificados como provendo uma amplitude de expressão constitutiva. Assim, alguns são promotores constitutivos fracos, e outros são promotores constitutivos fortes. Geralmente, por "promotor fraco" pretende-se um promotor que dirige a expressão de uma seqüência codificadora em nivel baixo. Por "nivel baixo" pretende-se em níveis de cerca de 1/10.000 transcritos até cerca de 1/100.000 transcritos até cerca de 1/500.000 transcritos. Conseqüentemente, um "promotor forte" dirige a expressão de uma seqüência codificadora em um "nível elevado", ou cerca de 1/10 transcritos até cerca de 1/100 transcritos até cerca de 1/1.000 transcritos.

Um especialista reconhecería que modificações poderíam ser feitas a uma proteína da presente invenção sem diminuir sua atividade biológica. Algumas modificações podem ser feitas para facilitar a clonagem, expressão, ou incorporação da molécula alvo em uma proteína de fusão. Tais modificações são bem conhecidas daqueles especialistas na técnica e incluem, por exemplo, uma metionina adicionada no amino-terminal para prover um sítio de iniciação, ou aminoácidos adicionais (e.g., poli His) colocados em qualquer dos terminais para criar sítios de restrição, ou códons de terminação, ou seqüências de purificação, convenientemente localizados.

Expressão em procariontes Células procariontes podem ser usadas como hospedeiros para expressão. Procariontes mais freqüentemente são representados por várias linhagens de E. coli; contudo, outras linhagens microbianas podem ser também usadas. Seqüências controle procariontes comumente usadas que são aqui definidas para incluir promotores para iniciação de transcrição, opcionalmente com um operador, junto com seqüências de sitio de ligação de ribossomos, incluem tais promotores comumente usados, como os sistemas promotores de beta lactamase (penicilinase) e lactose (lac) (Chang, et al., (1977) Nature 198:1056), o sistema promotor de triptofano (trp) (Goeddel, et al. , (1980) Nucleic Acids Res. 8 : 4057) e o promotor P L lambda derivado e sitio de ligação de ribossomo de gene N (Shimatake, et al., (1981) Nature 292:128). A inclusão de marcadores de seleção em vetores de DNA transfectados em E. coli é também útil. Exemplos de tais marcadores incluem genes especificando resistência a ampicilina, tetraciclina, ou cloranfenicol. 0 vetor é selecionado para permitir a introdução do gene de interesse na célula hospedeira apropriada. Vetores bacterianos são tipicamente de origem de plasmideo ou fago. Células bacterianas apropriadas são infectadas com partículas de vetor de fago ou transf ectadas com DNA de vetor de fago sem histonas. Se um vetor de plasmídeo é usado, as células bacterianas são transfectadas com o DNA de vetor de plasmídeo. Sistemas de expressão para expressar uma proteína da presente invenção estão disponíveis usando Bacillus sp. e Salmonella (Paiva, et al.r (1983) Gene 22:229-35; Mosbach, et al.t (1983) Nature 302:543-5). 0 vetor de plasmídeo pGEX-4T-l da Pharmacia é o vetor de expressão de E. coli preferido para a presente invenção.

Expressão em eucariontes Uma variedade de sistemas de expressão eucariontes, tais como leveduras, linhagens de células de insetos, células vegetais e de mamíferos, são conhecidos daqueles especialistas na técnica. Como resumidamente explicado abaixo, a presente invenção pode ser expressa nesses sistemas eucariontes. Em alguns avanços, células vegetais transformadas/transfectadas, como discutido infra, são empregadas como sistemas de expressão para a produção das proteínas da atual invenção. A síntese de proteínas heterólogas em leveduras é bem conhecida. Sherman, et al., (1982) METHODS IN YEAST GENETICS, Cold Spring Harbor Laboratory é um trabalho bem reconhecido descrevendo os vários métodos disponíveis para produzir a proteína em leveduras. Duas leveduras amplamente utilizadas para a produção de proteínas eucariontes são Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. Vetores, linhagens, e protocolos para expressão em Saccharomyces e Pichia são conhecidos na técnica e disponibilizados por fornecedores comerciais (e.g., Invitrogen). Vetores adequados usualmente possuem seqüências de controle de expressão, tais como promotores, incluindo 3-fosfoglicerato quinase ou álcool oxidase, e uma origem de replicação, seqüências de terminação e similares, como desejado.

Uma proteína da presente invenção, uma vez expressa, pode ser isolada a partir de leveduras lisando-se as células e aplicando-se técnicas padrão de isolamento de proteínas para os lisados ou as pelotas. 0 monitoramento do processo de purificação pode ser conseguido usando-se técnica de Western blot ou radioimuno-ensaios de outras técnicas padrão de imunoensaios.

As seqüências codificando proteínas da presente invenção podem ser também ligadas a vários vetores de expressão para uso em culturas de células de transfecção, por exemplo, de origem de mamíferos, insetos, ou vegetal. Sistemas de células de mamíferos freqüentemente serão na forma de monocamadas de células, apesar de que suspensões de células de mamíferos poderem ser também usadas.

Numerosas linhagens de células hospedeiras adequadas capazes de expressar proteínas intactas foram desenvolvidas na técnica, e incluem as linhagens de células HEK293, BHK21, e CHO. Vetores de expressão para essas células podem incluir seqüências de controle de expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor (e.g., o promotor CMV, um promotor HSV tk ou pgk (f osf oglicerato quinase) promotor), um intensificador (Queen, et al., (1986) Immunol. Rev. 89:49), e sítios processadores de informação necessários, tais como sítios de ligação de ribossomos, sítios de splice de RNA, sítios de poliadenilação (e.g., um sítio de adição SV40 T Ag poli A grande), e seqüências terminadoras de transcrição. Outras células animais úteis para produção de proteínas da presente invenção são disponibilizadas, por exemplo, pelo catálogo American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas (7th ed., 1992).

Vetores apropriados para expressar proteínas da presente invenção em células de insetos são usualmente derivados de bacilovirus SF9. Linhagens de células de insetos adequadas incluem linhagens de células larvas de mosquito, bicho da seda, larva de traça, traça, e Drosophila, tais como uma linha de células de Schneider (ver, e.g., Schneider, (1987) J. Embryol. Exp. Morphol. 27:353-65) .

Como com leveduras, quando células hospedeiras de animais ou plantas superiores são empregadas, seqüências de poliadenilação ou terminadoras de transcrição são tipicamente incorporadas no vetor. Um exemplo de uma seqüência terminadora é a seqüência de poliadenilação de gene de hormônio de crescimento bovino. Seqüências pra splicing acurado do transcrito pode ser também incluídas. Um exemplo de uma seqüência de splicing é o íntron VP1 de SV40 (Sprague, et al., (1983) J. Virol. 45:773-81).

Adicionalmente, seqüências gênicas para controlar a replicação na célula hospedeira podem ser incorporadas no vetor, tal como aquelas encontradas em vetores tipo vírus de papiloma bovino (Saveria-Campo, "Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector," in DNA CLONING: A PRACTICAL APPROACH, vol. II, Glover, ed., IRL Press, Arlington, VA, pp. 213-38 (1985)).

Além disso, o gene para ARGOS colocado no vetor de expressão vegetal apropriado pode ser usado para transformar células vegetais. 0 polipeptideo pode ser, então, isolado a partir de calos vegetais ou as células transformadas podem ser usadas para regenerar plantas transgênicas. Tais plantas transgênicas podem ser colhidas, e os tecidos apropriados (sementes ou folhas, por exemplo) podem ser sujeitos a técnicas de extração e purificação de proteína de larga escala. Métodos de Transformação Vegetal Numerosos métodos para introduzir genes estrangeiros em plantas são conhecidos e podem ser usados para inserir um polinucleotídeo ARGOS em um hospedeiro vegetal, incluindo protocolos de transformação vegetal biológicos e físicos. Ver, e.g., Miki, et al., "Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants," in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick and Thompson, eds. , CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993). Os métodos escolhidos variam com a planta hospedeira, e incluem métodos de transfecção química, tal como fosfato de cálcio, transferência de genes mediada por microorganismo, tal como Agrobacterium (Horsch, et al., (1985) Science 227:1229-31), eletroporação, microinjeção, e bombardeamento biolístico.

Cassetes de expressão e vetores e métodos de cultura in vitro para transformação de célula ou tecido vegetal e regeneração de plantas são conhecidos e estão disponíveis. Ver, e.g., Gruber, et al., "Vectors for Plant Transformation," in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, supra, pp. 89-119.

Os polinucleotídeos ou polipeptídeos isolados podem ser introduzidos na planta por uma ou mais técnicas tipicamente usadas para liberação direta em células. Tais protocolos podem variar dependendo do tipo de organismo, célula, planta ou célula vegetal, i.e., monocotiledônea ou dicotiledônea, visada para modificação gênica. Métodos adequados de transformar células vegetais incluem microinjeção (Crossway, et al., (1986) Biotechniques 4:320-334; e U.S. Patent 6.300.543), eletroporação (Riggs, et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:5602-5606, transferência direta de gene (Paszkowski, et al-, (1984) EMBO J. 3:2717-2722), e aceleração balística de partículas (ver, por exemplo, Sanford, et al., U.S. Patent No. 4.945.050; WO 91/10725; e McCabe, et al., (1988) Biotechnology 6:923-926). Também ver, Tomes, et al., Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile Bombardment. pp.197-213 in Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods eds. 0. L.

Gamborg & G.C. Phillips, Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York, 1995; U.S. Patent 5.736.369 (meristema);

Weissinger, et al., (1988) Ann. Rev. Genet. 22:421-477;

Sanford, et al., (1987) Particulate Science and Technology 5:27-37 (cebola); Christou, et al., (1988) Plant Physiol. 87:671-674 (soja); Datta, et al., (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein, et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4305-4309 (milho); Klein, et al., (1988) Biotechnology 6:559-563 (milho); WO 91/10725 (milho);

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Fromm, et al., (1990) Biotechnology 8:833-839; e Gordon- Kamm, et al., (1990) Plant Cell 2:603-618 (milho);

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Kaeppler, et al., (1990) Plant Cell Reports 9:415-418; e Kaeppler, et al., (1992) Theor. Appl. Genet. 84:560-566 (transformação mediada por fios de carbeto de silício); U.S. Patent No. 5.693.512 (sonicação); D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (eletroporação); Li, et al., (1993) Plant Cell Reports 12:250-255; e Christou and Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda, et al., (1996) Nature Biotech. 14:745-750; transformação de milho mediada por Agrobacterium (U.S. Patent 5.981.840); métodos de fios de carbeto de silício (Frame, et al., (1994) Plant J. 6:941-948); métodos a laser (Guo, et al. , (1995) Physiologia Plantarum 93:19-24); métodos de sonicação (Bao, et al., (1997) Ultrasound in Medicine & Biology 23:953-959; Finer and Finer (2000) Lett Appl Microbiol. 30:406-10; Amoah, et al., (2001) J Exp Bot 52:1135-42); métodos de polietileno glicol (Krens, et al., (1982) Nature 296:72-77); protoplastos de células de monocotiledôneas e dicotiledôneas podem ser transformados usando eletroporação (Fromiti, et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5824-5828) e microinjeção (Crossway, et al., (1986) Mol. Gen. Genet. 202:179-185); todos os quais são aqui incorporados por referência.

Transformação mediada por Agrobacterium O método mais amplamente utilizado para introduzir um vetor de expressão em plantas é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias de solo patogênicas de plantas, que transformam geneticamente células vegetais. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, carregam genes responsáveis pela transformação genética de plantas. Ver, e.g., Kado, (1991) Crit. Rev. Plant Sei. 10:1. Descrições dos sistemas vetores de Agrobacterium e métodos para transferência de gene mediada por Agrobacterium são providos em Gruber, et al., supra; Miki, et al., supra; and Moloney, et al., (1989) Plant Cell Reports 8:238.

Similarmente, o gene pode ser inserido na região T-DNA de um plasmideo Ti ou Ri derivado de A. tumefaciens ou A. rhizogenes, respectivamente. Assim, cassetes de expressão podem ser construídos como acima, usando esses plasmídeos. Várias seqüências controle são conhecidas, as quais, quando combinadas com uma seqüência codificadora heteróloga e transformadas em um organismo hospedeiro, apresentam fidelidade em expressão gênica em relação a especificidade de tecido/órgão da seqüência codificadora original. Ver, e.g., Benfey and Chua, (1989) Science 244:174-81. Particularmente seqüências controle adequadas para uso nesses plasmídeos são promotores para expressão constitutiva específica de folha do gene nas várias plantas alvo. Outras seqüências controle úteis incluem um promotor e um terminador do gene de nopalina sintase (NOS) . O promotor e terminador de NOS estão presentes no plasmideo pARC2, disponibilizado pela American Type Culture Collection e designado ATCC 67238. Se tal sistema é usado, o gene de virulência (vir) tanto do plasmídeo Ti ou Ri devem estar também presentes, tanto junto com a porção T-DNA, ou via um sistema binário aonde o gene vir está presente em um vetor separado. Tais sistemas, vetores para uso desta forma, e métodos de transformar células vegetais são descritos na patente US No. 4.658.082; Pedido de patente US No. 913.914, preenchida em Io de outubro de 1986, como referenciado na Patente US No. 5.262.306, emitida em 16 de novembro de 1993; e Simpson, et al., (1986) Plant Mol. Biol. 6:403-15 (também referenciado na patente '306); todas incorporadas por referência em sua integra.

Uma vez construídos, esses plasmídeos podem ser colocados em A. rhizogenes ou A. tumefaciens e esses vetores usados para transformar células de espécies vegetais, as quais são ordinariamente suscetíveis a infecção por Fusarium ou Alternaria. Diversas outras plantas transgênicas são também contempladas pela presente invenção incluindo, mas não se limitando a, soja, milho, sorgo, alfafa, arroz trevo, repolho, banana, café, aipo, tabaco, caupi, algodão, melão e pimenta. A seleção tanto de A. tumefaciens ou A. rhizogenes dependerá da planta sendo transformado dessa forma. Em geral, A. tumefaciens é o organismo preferido para transformação. A maioria das plantas dicotiledôneas, algumas gimnospermas e algumas poucas plantas monocotiledôneas (e.g., certos membros de Liliales e Arales) são suscetíveis a infecção com A. tumefaciens. A. rhizogenes também possui uma ampla variedade de hospedeiros, abrangendo a maioria das dicotiledôneas e algumas gimnospermas, o que inclui membros das Leguminosae, Compositae, e Chenopodiaceae. Plantas monocotiledôneas podem ser agora transformadas com algum sucesso. 0 pedido de patente européia No. 604 662 Al descreve um método para transformar monocotiledôneas usando Agrobacterium. O pedido de patente européia No. 672 752 Al descreve um método para transformar monocotiledôneas com Agrobacterium usando o escutelo de embriões imaturos. Ishida, et al., discutem um método para transformar milho expondo embriões imaturos a A. tumefaciens (Nature Biotechnology 14:745-50 (1996)).

Uma vez transformadas, essas células podem ser usadas para regenerar plantas transgênicas. Por exemplo, plantas inteiras podem ser infectadas com esses vetores ferindo a planta e, então, introduzindo o vetor no local do ferimento. Qualquer parte da planta pode ser ferida, incluindo folhas, caules e raízes. Alternativamente, tecido vegetal, na forma de um explante, tal como tecido dos cotilédones ou discos foliares, pode ser inoculado com esses vetores, e cultivado sob condições que promove a regeneração vegetal. Raizes ou brotos transformados por inoculação de tecido vegetal com A. rhizogenes ou A. tumefaciens, contendo o gene codificando a enzima de degradação de fumonisina, podem ser usados como fonte de tecido vegetal para regenerar plantas transgênicas resistentes a fumonisina, tanto via embriogênese somática ou organogênese. Exemplos de tais métodos para regenerar tecido vegetal são descritos em Shahin, Theor. Appl. Genet. 69:235-40 (1985); Patente US No. 4.658.082; Simpson, et al. , supra; e Pedido de patente US Nos. 913.913 e 913.914, ambas preenchidas em Io de outubro de 1986, como referenciado em Patente US No. 5.262.306, emitida em 16 de novembro de 1993, todas as descrições dessas incorporadas aqui por referência.

Transferência Direta de Gene Apesar do fato de que a variedade de hospedeiros para transformação mediada por Agrobacteríum ser ampla, algumas principais espécies de culturas e gimnospermas foram geralmente recalcitrantes a esse modo de transferência de genes, apesar de que algum sucesso ter sido recentemente alcançado em arroz (Hiei, et al., (1994) The Plant Journal 6:271-82). Diversos métodos de transformação vegetal, coletivamente referidos como transferência direta de gene, foram desenvolvidos como uma alternativa para transformação mediada por Agrobacterium.

Um método geralmente aplicável de transformação vegetal é a transformação mediada por microprojétil, onde DNA é carregado na superfície de microprojéteis medindo cerca de 1 a 4 pm. 0 vetor de expressão é introduzido em tecidos vegetais com um dispositivo biolistico que acelera os microprojéteis a velocidades de 300 a 600 m/s, o que é suficiente para penetrar as paredes e membranas celulares de células vegetais (Sanford, et al., (1987) Part. Sei. Technol. 5:27; Sanford, (1988) Trends Biotech 6:299; Sanford, (1990) Physiol. Plant 79:206; and Klein, et al., (1992) Biotechnology 10:268).

Outro método para liberação de DNA para plantas é a sonicação de células alvo como descrito em Zang, et al., (1991) BioTechnology 9:996. Alternativamente, fusões de lipossomos ou esferoplastos foram usadas para introduzir vetores de expressão em plantas. Ver, e.g., Deshayes, et al., (1985) EMBO J. 4:2731; e Christou, et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:3962. A absorção direta de DNA em protoplastos usando precipitação de CaCl2, álcool polivinil, ou poli-L-ornitina, foi também relatada. Ver, e.g., Hain, et al., (1985) Mol. Gen. Genet. 199:161; e Draper, et al., (1982) Plant Cell Physiol. 23:451. Δ eletroporação de protoplastos e células e tecidos inteiros foi também descrita. Ver, e.g., Donn, et al., (1990) in Abstracts of the Vllth Int'l. Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53; D'Halluin, et al., (1992) Plant Cell 4:1495-505; e Spencer, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 24:51-61.

Aumentando a atividade e/ou nível de um polipeptídeo ARGOS Métodos são providos para aumentar a atividade e/ou nível do polipeptídeo ARGOS da invenção. Um aumento no nível e/ou atividade do polipeptídeo ARGOS da invenção pode ser conseguido fornecendo à planta um polipeptídeo ARGOS. O polipeptídeo ARGOS pode ser provido introduzindo a seqüência de aminoácidos codificando o polipeptídeo ARGOS na planta, introduzindo na planta uma seqüência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo ARGOS ou alternativamente modificando um lócus genômico codificando o polipeptídeo ARGOS da invenção.

Como aqui discutido em outra parte, vários métodos são conhecidos na técnica para prover um polipeptídeo a uma planta incluindo, mas não se limitando a, introdução direta do polipeptideo na planta, introduzindo na planta (transientemente ou estavelmente) uma construção de polinucleotideo codificando um polipeptideo tendo atividade reguladora de número de células. É também reconhecido que os métodos da invenção podem empregar um polinucleotideo que não é capaz de dirigir, na planta transformada, a expressão de uma proteína ou um RNA. Assim, o nível e/ou atividade de um polipeptideo ARGOS pode ser aumentado alterando-se o gene codificando o polipeptideo ARGOS ou seu promotor. Ver, e.g., Kmiec, U.S. Patent 5.565.350; Zarling, et al., PCT/US93/03868. Portanto, são providas plantas mutagenizadas que carregam mutações em genes ARGOS, onde as mutações aumentam a expressão do gene ARGOS ou aumenta a atividade de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão do polipeptideo ARGOS codificado.

Reduzindo a atividade e/ou nível de um polipeptideo ARGOS Métodos são providos para reduzir ou eliminar a atividade de um polipeptideo ARGOS da invenção transformando uma célula vegetal com um cassete de expressão que expressa um polinucleotideo que inibe a expressão do polipeptideo ARGOS. 0 polinucleotideo pode inibir a expressão do polipeptideo ARGOS diretamente prevenindo a tradução do RNA mensageiro de ARGOS, ou indiretamente codificando um polipeptideo que inibe a transcrição ou tradução de um gene ARGOS codificando um polipeptideo ARGOS. Métodos para inibir ou eliminar a expressão de um gene em uma planta são bem conhecidos na técnica, e qualquer tal método pode ser usado na presente invenção para inibir a expressão de um polipeptideo ARGOS.

De acordo com a presente invenção, a expressão de um polipeptideo ARGOS é inibida se o nível de proteína do polipeptideo ARGOS é menos do que 70% do nível de proteína do mesmo polipeptideo ARGOS em uma planta que não foi geneticamente modificada ou mutagenizada para inibir a expressão daquele polipeptideo ARGOS. Em avanços da invenção em particular, o nível de proteína do polipeptideo ARGOS em uma planta modificada de acordo com a invenção é de menos de 60%, menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, menos de 5% ou menos de 2% do nível de proteína do mesmo polipeptideo ARGOS em uma planta que não é uma mutante ou que não foi geneticamente modificada para inibir a expressão daquele polipeptideo ARGOS. 0 nível de expressão do polipeptideo ARGOS pode ser medido diretamente, por exemplo, testando o nível de polipeptideo ARGOS expresso na célula vegetal ou planta, ou indiretamente, por exemplo, medindo a atividade de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão do polipeptideo ARGOS na célula vegetal ou planta, ou medindo a biomassa na planta. Métodos para efetuar tais testes são aqui descritos em outra parte.

Em outros avanços da invenção, a atividade dos polipeptideos ARGOS é reduzida ou eliminada transformando uma célula vegetal com um cassete de expressão compreendendo um polinucleotideo codificando um polipeptideo que inibe a atividade de um polipeptideo ARGOS. A atividade de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão de um polipeptideo ARGOS é inibida de acordo com a presente invenção de a atividade de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão do polipeptideo ARGOS é menos do que 70% da atividade de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão do mesmo polipeptideo ARGOS em uma planta que não foi modificada para inibir a atividade de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão daquele polipeptideo ARGOS. Em avanços particulares da invenção, a atividade de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão do polipeptideo ARGOS em uma planta modificada de acordo com a invenção é de menos do que 60%, menos do que 50%, menos do que 40%, menos do que 30%, menos do que 20%, menos do que 10%, ou menos do que 5% da atividade de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão do mesmo polipeptídeo ARGOS em uma planta que não foi modificada para inibir a expressão daquele polipeptídeo ARGOS. A atividade de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão de um polipeptídeo ARGOS é "eliminada" de acordo com a invenção quando não é detectável pelos métodos de teste aqui descritos em outra parte. Métodos de determinar a atividade de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão de um polipeptídeo ARGOS são aqui descritos em outra parte.

Em outros avanços, a atividade de um polipeptídeo ARGOS pode ser reduzida ou eliminada rompendo-se o gene codificando o polipeptídeo ARGOS. A invenção engloba plantas mutagenizadas que carregam mutações em genes ARGOS, onde as mutações reduzem a expressão do gene ARGOS ou inibem a atividade de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão do polipeptídeo ARGOS codificado.

Assim, vários métodos podem ser usados para reduzir ou eliminar a atividade de um polipeptídeo ARGOS. Além disso, mais de um método pode ser usado para reduzir a atividade de um único polipeptídeo ARGOS. Exemplos não limitantes de métodos de reduzir ou eliminar a expressão de polipeptídeos ARGOS são dados abaixo. 1. Métodos Baseados em Polinucleotídeos: Em alguns avanços da presente invenção, uma planta é transformada com um cassete de expressão que é capaz de expressar um polinucleotideo que inibe a expressão de um polipeptideo ARGOS da invenção. 0 termo "expressão", como aqui usado, refere-se à biossintese de um produto gênico, incluindo a transcrição e/ou tradução de dito produto gênico. Por exemplo, para os propósitos da presente invenção, um cassete de expressão capaz de expressar um polinucleotideo que inibe a expressão de pelo menos um polipeptideo ARGOS é um cassete de expressão capaz de produzir uma molécula de RNA que inibe a transcrição e/ou tradução de pelo menos um polipeptideo ARGOS da invenção. A "expressão" ou "produção" de uma proteína ou polipeptideo a partir de uma molécula de DNA refere-se à transcrição e tradução da seqüência codificadora para produzir a proteína ou polipeptideo, enquanto que "expressão" ou "produção" de uma proteína ou polipeptideo a partir de uma molécula de RNA refere-se à tradução da seqüência de RNA codificadora para produzir a proteína ou polipeptideo.

Exemplos de polinucleotídeos que inibem a expressão de um polipeptideo ARGOS são dados abaixo. i. Supressão/Co-supressão senso Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressão de um polipeptideo ARGOS pode ser obtida por supressão ou co-supressão senso. Para co-supressão, um cassete de expressão é projetado para expressar uma molécula de RNA correspondendo a todo ou parte de um RNA mensageiro codificando um polipeptideo ARGOS na orientação "senso". A super-expressão da molécula de RNA pode resultar em expressão reduzida do gene nativo. Dessa maneira, múltiplas linhas vegetais transformadas com o cassete de expressão de co-supressão são rastreadas para se identificar aquelas que apresentam a maior inibição de expressão de polipeptideo ARGOS. 0 polinucleotideo usado para co-supressão pode corresponder a toda ou parte da seqüência codificando o polipeptideo ARGOS, toda ou parte da região não traduzida 5' e/ou 3' de um transcrito de polipeptideo ARGOS, ou toda ou parte de ambas seqüência codificadora e regiões não traduzidas de um transcrito codificando um polipeptideo ARGOS. Em alguns avanços onde o polinucleotideo compreende toda ou parte da região codificadora para o polipeptideo ARGOS, o cassete de expressão é projetado para eliminar o códon de iniciação do polinucleotideo de forma que nenhum produto de proteína seja traduzido.

Co-supressão pode ser usada para inibir a expressão de genes vegetais para produzir plantas tendo níveis proteína indetectáveis para as proteínas codificadas por esses genes. Ver, por exemplo, Broin, et al., (2002) Plant Cell 14:1417-1432. A co-supressão pode ser também usada para inibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta. Ver, por exemplo, U.S. Patent No. 5.942.657. Métodos para usar co-supressão para inibir a expressão de genes endógenos em plantas são descritos em Flavell, et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:3490-3496; Jorgensen, et al., (1996) Plant Mol. Biol. 31:957-973; Johansen and Carrington (2001) Plant Physiol. 126:930-938; Broin, et al., (2002) Plant Cell 14:1417-1432; Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Yu, et al., (2003) Phytochemistry 63:753-763; e U.S. Patent Nos. 5.034.323, 5.283.184, e 5.942.657; cada qual é aqui incorporada por referência. A eficiência de co-supressão pode ser aumentada incluindo uma região poli-dT no cassete de expressão na posição 3' em relação à seqüência senso e 5' do sinal de poliadenilação. Ver, U.S. Patent Publication No. 20020048814, aqui incorporada por referência.

Tipicamente, tal seqüência de nucleotídeos possui identidade de seqüência substancial em relação à seqüência do transcrito do gene endógeno, otimamente maior do que cerca de 65% de identidade de seqüência, mais otimamente maior do que cerca de 8 5% de identidade de seqüência, otimamente maior do que cerca de 95% de identidade de seqüência. Ver U.S. Patent Nos. 5.283.184 e 5.034.323; aqui incorporadas por referência. ii. Supressão Anti-senso Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressão do polipeptideo ARGOS pode ser obtida por supressão anti-senso. Para supressão anti-senso, o cassete de expressão é projetado para expressar uma molécula de RNA complementar a todo ou parte de um RNA mensageiro codificando o polipeptideo ARGOS. Super-expressão da molécula de RNA anti-senso pode resultar em expressão reduzida do gene nativo. Dessa maneira, múltiplas linhas vegetais com o cassete de expressão de supressão anti-senso são rastreadas para se identificar aqueles que apresentam a maior inibição de expressão de polipeptideo ARGOS. 0 polinucleotideo para uso em supressão anti-senso pode corresponder a todo ou parte do complemento da seqüência codificando o polipeptideo ARGOS, todo ou parte do complemento da região não traduzida 5' e/ou 3' do transcrito ARGOS, ou todo ou parte do complemento de ambas seqüência codificadora e regiões não traduzidas de um transcrito codificando o polipeptideo ARGOS. Além disso, o polinucleotideo anti-senso pode ser totalmente complementar (i.e., 100% idêntico ao complemento da seqüência alvo) ou parcialmente complementar (i.e., menos de 100% idêntico ao complemento da seqüência alvo) em relação à seqüência alvo. Supressão anti-senso pode ser usada para inibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta. Ver, por exemplo, U.S. Patent No. 5.942.657. Adicionalmente, porções dos nucleotídeos anti-senso podem ser usadas para romper a expressão do gene alvo. Geralmente, seqüências de pelo menos 50 nucleotídeos, 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, 300, 400, 450, 500, 550 ou maiores podem ser usadas. Métodos para usar supressão anti-senso para inibir a expressão de genes endógenos em plantas são descritos, por exemplo, em Liu, et ai., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 e U.S. Patent Nos. 5.759.829 e 5.942.657, cada qual é aqui incorporada por referência. A eficiência de supressão anti-senso pode ser aumentada incluindo uma região poli-dT no cassete de expressão em uma posição 3' em relação à seqüência anti-senso e 5' do sinal de poliadenilação. Ver, U.S. Patent Publication No. 20020048814, aqui incorporada por referência. iii. Interferência de RNA de Dupla-Fita Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressão de um polipeptideo ARGOS pode ser obtida por interferência de RNA de dupla-fita (dsRNA). Para interferência de dsRNA, uma molécula de RNA senso como aquela descrita acima para co-supressão e uma molécula de RNA anti-senso, que é totalmente ou parcialmente complementar à molécula de RNA senso, são expressas na mesma célula, resultando em inibição da expressão do RNA mensageiro endógeno correspondente. A expressão das moléculas senso e anti-senso pode ser conseguida projetando o cassete de expressão para compreender tanto uma seqüência senso e uma seqüência anti-senso. Alternativamente, cassetes de expressão separados podem ser usados para as seqüências senso e anti-senso. Múltiplas linhas vegetais transformadas com o cassete de expressão de interferência de dsRNA, ou cassetes de expressão, são, então, rastreadas para se identificar linhas vegetais que apresentam a maior inibição de expressão de polipeptideo ARGOS. Métodos para usar interferência de dsRNA para inibir a expressão de genes vegetais endógenos são descritos em Waterhouse, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95:13959-13964, Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743, e WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631, e WO 00/49035; cada qual é aqui incorporada por referência. iv. Interferência de RNA Hairpin e Interferência de RNA Hairpin Contendo íntron Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressão de um polipeptideo ARGOS pode ser obtida por interferência de RNA hairpin (hpRNA) ou interferência de RNA hairpin contendo intron (ihpRNA). Esses métodos são altamente altamente eficientes em inibir a expressão de genes endógenos. Ver, Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38 e as referências ai citadas.

Para interferência de hpRNA, o cassete de expressão é projetado para expressar uma molécula de RNA que hibridiza a si mesma para formar uma estrutura hairpin que compreende uma região loop de fita simples e uma ramificação base-pareada. A região de ramificação base-pareada compreende uma seqüência senso correspondendo a todo ou parte do RNA mensageiro endógeno codificando o gene cuja expressão deve ser inibida, e uma seqüência anti-senso que é totalmente ou parcialmente complementar à seqüência senso. Assim, a região de ramificação base-pareada da molécula geralmente determina a especificidade da interferência de RNA. Moléculas de hpRNA são altamente eficientes em inibir a expressão de genes endógenos, e a interferência de RNA que induzem é herdada por subseqüentes gerações de plantas. Ver, por exemplo, Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:4985-4990; Stout j esdi j k, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; e Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38. Métodos para usar interferência de hpRNA para inbir ou silenciar a expressão de genes são descritos, por exemplo, em Chuang and Meyerowitz (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97:4985-4990; Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Pandolfini, et al., BMC Biotechnology 3:7, e U.S. Patent Publication No. 20030175965; cada qual é aqui incorporada por referência. Um teste transiente para a eficiência de construções de hpRNA em silenciar a expressão gênica in vivo foi descrito por Panstruga, et al., (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140, aqui incorporado por referência.

Para ihpRNA, as moléculas interferentes possuem a mesma estrutura geral como para hpRNA, mas a molécula de RNA compreende, adicionalmente, um intron que é capaz de sofrer splicing na célula na qual o ihpRNA é expresso. O uso de um íntron minimiza o tamanho do loop na molécula de RNA hairpin após splicing, e isso aumenta a eficiência de interferência. Ver, por exemplo, Smith, et al., (2000) Nature 407:319-320. De fato, Smith, et al., apresentam 100% de supressão de expressão de gene endógeno usando interferência mediada por ihpRNA. Métodos para usar interferência de ihpRNA para inibir a expressão de genes vegetais endógenos são descritos, por exemplo, em Smith, et al., (2000) Nature 407:319-320; Wesley, et al., (2001) Plant J. 27:581-590; Wang and Waterhouse (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5:146-150; Waterhouse and Helliwell (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Helliwell and Waterhouse (2003) Methods 30:289-295, e U.S. Patent Publication No. 20030180945, cada qual é aqui incorporada por referência. O cassete de expressão para interferência de hpRNA pode ser também projetado de forma que a seqüência senso e a seqüência anti-senso não correspondam a um RNA endógeno. Neste avanço, a seqüência senso e a seqüência anti-senso flanqueiam uma seqüência loop que compreende uma seqüência de nucleotídeos correspondendo a todo ou parte do RNA mensageiro endógeno do gene alvo. Assim, é a região loop que determina a especificidade da interferência de RNA. Ver, por exemplo, WO 02/00904, aqui incorporada por referência. v. Interferência mediada por Amplicon Cassetes de expressão amplicon compreendem uma seqüência vegetal derivada de vírus que contém todo ou parte do gene alvo, mas que geralmente não todos os genes do vírus nativo. As seqüências virais presentes no produto de transcrição do cassete de expressão permitem que o produto de transcrição direcione sua própria replicação. Os transcritos produzidos pelo amplicon podem ser tanto senso ou anti-senso em relação à seqüência alvo (i.e., o RNA mensageiro para o polipeptídeo ARGOS). Métodos de usar amplicons para inibir a expressão de genes vegetais endógenos são descritos, por exemplo, em Angell and Baulcombe (1997) EMBO J. 16:3675-3684, Angell and Baulcombe (1999) Plant J. 20:357-362, e U.S. Patent No. 6.646.805, cada qual é aqui incorporada por referência. vi. Ribozímas Em alguns avanços, o polinucleotídeo expresso pelo cassete de expressão da invenção é RNA catalítico ou possui atividade de ribozima específica para o RNA mensageiro do polipeptídeo ARGOS. Assim, o polinucleotídeo causa a degradação do RNA mensageiro endógeno, resultando em expressão reduzida do polipeptídeo ARGOS. Esse método é descrito, por exemplo, em U.S. Patent No. 4.987.071, aqui incorporada por referência.

vii. RNA de interferência pequeno ou Micro RNA

Em alguns avanços da invenção, a inibição da expressão de um polipeptídeo ARGOS pode ser obtida por interferência de RNA pela expressão de um gene codificando um micro RNA (miRNA). miRNAs são agentes reguladores consistindo de cerca de 22 ribonucleotídeos. miRNAs são altamente eficientes em inibir a expressão de genes endógenos. Ver, por exemplo, Javier, et al., (2003) Nature 425:257-263, aqui incorporado por referência.

Para interferência de miRNA, o cassete de expressão é projetado para expressar uma molécula de RNA que é modelada em um gene de miRNA endógeno. 0 gene miRNA codifica um RNA que forma uma estrutura hairpin contendo uma seqüência de 22 nucleotídeos que é complementar a outro gene endógeno (seqüência alvo). Para supressão da expressão de ARGOS, a seqüência de 22 nucleotídeos é selecionada de uma seqüência de transcrito ARGOS e contém 22 nucleotídeos de dita seqüência ARGOS na orientação senso e 21 nucleotídeos de uma seqüência anti-senso correspondente que é complementar à seqüência senso. Moléculas de miRNA são altamente eficientes em inibir a expressão de genes endógenos, e a interferência de RNA que induzem é herdada por subseqüentes gerações de plantas. 2. Inibição de Expressão Gênica baseada em Polipeptideo Em um avanço, o polinucleotideo codifica uma proteína dedo de zinco que se liga a um gene codificando um polipeptideo ARGOS, resultando em expressão reduzida do gene. Em avanços em particular, a proteína dedo de zinco se liga a uma região reguladora de um gene ARGOS. Em outros avanços, a proteína dedo de zinco se liga a um RNA mensageiro codificando um polipeptideo ARGOS e previne sua tradução. Métodos de selecionar sítios para direcionamento por proteínas dedo de zinco foram descritos, por exemplo, em U.S. Patent No. 6.453.242, e métodos para usar proteínas dedo de zinco para inibir a expressão de genes em plantas são descritos, por exemplo, em U.S. Patent Publication No. 20030037355; cada qual é aqui incorporada por referência. 3. Inibição de Atividade de Proteína baseada em Polipeptideo Em alguns avanços da invenção, o polinucleotídeo codifica um anticorpo que se liga a pelo menos um polipeptideo ARGOS, e reduz a atividade reguladora de número de células do polipeptideo ARGOS. Em outro avanço, a ligação do anticorpo resulta em recuperação aumentada do complexo anticorpo-ARGOS por mecanismos celulares de controle de qualidade. A expressão de anticorpos em células vegetais e a inibição de vias moleculares por expressão e ligação de anticorpos a proteínas em células vegetais são bem conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Conrad and Sonnewald (2003) Nature Biotech. 21:35-36, aqui incorporada por referência. 4. Rompimento de Gene Em alguns avanços da presente invenção, a atividade de um polipeptideo ARGOS é reduzida ou eliminada rompendo o gene codificando o polipeptideo ARGOS. O gene codificando o polipeptideo ARGOS pode ser rompido por qualquer método conhecido na técnica.' Por exemplo, em um avanço, o gene é rompido por marcação de transposon. Em outro avanço, o gene é rompido mutagenizando plantas usando mutagênese aleatória ou direcionada, e selecionando plantas que possuem atividade reguladora de número de células reduzida. i. Marcação de Transposon Em um avanço da invenção, marcação de transposon é usada para reduzir ou eliminar a atividade de ARGOS de um ou mais polipeptídeos ARGOS. Marcação de transposon compreende inserir um transposon com um gene ARGOS endógeno para reduzir ou eliminar a expressão do polipeptideo ARGOS. "Gene ARGOS" deve significar o gene que codifica um polipeptideo ARGOS de acordo com a invenção.

Neste avanço, a expressão de um ou mais polipeptídeos ARGOS é reduzida ou eliminada inserindo um transposon em uma região reguladora ou região codificadora do gene codificando o polipeptideo ARGOS. Um transposon que está em um éxon, íntron, sequência não traduzida 5' ou 3', um promotor, ou qualquer outra seqüência reguladora de um gene ARGOS pode ser usado para reduzir ou eliminar a expressão e/ou atividade do polipeptideo ARGOS codificado. Métodos para a marcação por transposon de genes específicos em plantas são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Maes, et al.t (1999) Trends Plant Sei. 4:90— 96; Dharmapuri and Sonti (1999) FEMS Microbiol. Lett. 179:53-59; Meissner, et al., (2000) Plant J. 22:265-274; Phogat, et al., (2000) J. Bíosci. 25:57-63; Walbot (2000) Curr. Opin. Plant Biol. 2:103-107; Gai, et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28:94-96; Fitzmaurice, et al., (1999) Genetics 153:1919-1928). Além disso, o processo TUSC para selecionar inserções Mu em genes selecionados foi descrito em Bensen, et al., (1995) Plant Cell 7:75-84; Mena, et al., (1996) Science 274:1537-1540; e U.S. Patent No. 5.962.764; cada qual é aqui incorporada por referência. ii. Plantas Mutantes com Atividade Reduzida Métodos adicionais para diminuir ou eliminar a expressão de genes endógenos em plantas são também conhecidos na técnica e podem ser similarmente aplicados à atual invenção. Esses métodos incluem outras formas de mutagênese, tais como mutagênese induzida por etil metanossulfonato, mutagênese por deleção, e mutagênese por deleção rápida de nêutron usada em um senso genético reverso (com PCR) para identificar linhas vegetais nas quais o gene endógeno foi deletado. Para exemplos desses métodos, ver Ohshima, et al., (1998) Virology 243:472-481; Okubara, et al., (1994) Genetics 137:867-874; e Quesada, et al., (2000) Genetics 154:421-436; cada qual é aqui incorporado por referência. Além disso, um método rápido e automático para rastrear mutações induzidas quimicamente, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes), usando HPLC desnaturante ou digestão seletiva de endonuclease de produtos de PCR selecionados é também aplicável à autal invenção. Ver, McCallum, et al., (2000) Nat. Biotechnol. 18:455-457, aqui incorporada por referência.

Mutações que causam impacto na expressão gênica ou que interferem com a função (atividade reguladora de número de células) da proteína codificada são bem conhecidas na técnica. Mutações de inserção em éxons gênicos usualmente resultam em mutantes nulos. Mutações em resíduos conservados são particularmente efetivas em inibir a atividade reguladora de número de células da proteína codificada. Resíduos conservados de polipeptídeos vegetais ARGOS adequados para mutagênese com a meta de eliminar a atividade reguladora de número de células foram descritos. Tais mutantes podem ser isolados de acordo com procedimentos bem conhecidos, e mutações em diferentes loci ARGOS podem ser combinados por cruzamento genético. Ver, por exemplo, Gruis, et al., (2002) Plant Cell 14:2863-2882.

Em outro avanço desta invenção, mutantes dominantes podem ser usados para iniciar o silenciamento de RNA devido à inversão gênica e recombinação de um lócus gênico duplicado. Ver, por exemplo, Kusaba, et al., (2003) Plant Cell 15:1455-1467. A invenção engloba métodos adicionais para reduzir ou eliminar a atividade de um ou mais polipeptídeos ARGOS. Exemplos de outros métodos para alterar ou mutar uma seqüência de nucleotideos genômica em uma planta são conhecidos na técnica e incluem, mas não são limitados a, o uso de vetores RNAiDNA, vetores mutacionais RNArDNA, vetores de reparo RNA:DNA, oligonucleotideos misturados duplos, oligonucleotideos RNA:DNA autocomplementares, e oligonucleobases recombinogênicas. Tais vetores e métodos de uso são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, U.S. Patent Nos. 5.565.350; 5.731.181; 5.756.325; 5.760.012; 5.7 95.972; e 5.871.984; cada qual é aqui incorporada por referência. Ver também, WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/25821, e Beetham, et al., (1999) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96:8774-8778; cada qual é aqui incorporada por referência. iii. Atividade moduladora de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão Em métodos específicos, o nível e/ou atividade de um regulador de número de células em uma planta é aumentado elevando-se o nível ou atividade do polipeptídeo ARGOS na planta. Métodos para elevar o nível e/ou atividade de polipeptídeos ARGOS em uma planta são aqui discutidos em outra parte. Resumidamente, tais métodos compreendem prover um polipeptídeo ARGOS da invenção a uma planta e, dessa forma, aumentar o nível e/ou atividade do polipeptídeo ARGOS. Em outros avanços, uma seqüência de nucleotídeos ARGOS codificando um polipeptídeo ARGOS pode ser provida introduzindo-se na planta um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos ARGOS da invenção, expressando a seqüência ARGOS, aumentado a atividade do polipeptídeo ARGOS, e, dessa forma, elevando o número de células de tecido na planta ou parte de planta. Em outros avanços, o construção de nucleotídeos ARGOS introduzido na planta é estavelmente incorporado no genoma da planta.

Em outros métodos, o número de células e biomassa de um tecido vegetal é aumentado elevando-se o nível e/ou atividade do polipeptídeo ARGOS na planta. Tais métodos são aqui descritos em detalhe em outra parte. Em um método, uma seqüência de nucleotídeos de ARGOS é introduzida na planta e a expressão de dita seqüência de nucleotídeos de ARGOS diminui a atividade do polipeptídeo ARGOS, e, dessa forma, o crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão na planta ou parte de planta. Em outros avanços, a construção de nucleotídeo ARGOS introduzida na planta é estavelmente incorporado no genoma da planta.

Como discutido acima, um especialista reconhecerá o promotor apropriado para uso para modular o nivel/atividade de um polinucleotideo e polipeptideo de crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão na planta. Promotores exemplares para este avanço foram aqui descritos em outra parte.

Dessa maneira, a presente invenção provê ainda plantas tendo um crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão modificado quando comparado ao crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão de um tecido vegetal controle. Em um avanço, a planta da invenção possui um nivel/atividade elevado do polipeptideo ARGOS da invenção e, assim, possui crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão aumentado no tecido vegetal. Em outros avanços, a planta da invenção possui um nivel reduzido ou eliminado do polipeptideo ARGOS da invenção e, assim, possui crescimento vegetal e/ou desenvolvimento de órgão reduzido no tecido vegetal. Em outros avanços, tais plantas possuem, estavelmente incorporadas em seu genoma, uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeos ARGOS da invenção operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão na célula vegetal. ív. Modulando o Desenvolvimento de Raiz Métodos para modular o desenvolvimento de raiz em uma planta são providos. Por "modular o desenvolvimento de raiz" pretende-se qualquer alteração no desenvolvimento da raiz da planta quando comparado a uma planta controle. Tais alterações no desenvolvimento da raiz incluem, mas não são limitadas a, alterações na taxa de crescimento da raiz primária, o peso fresco da raiz, a extensão de formação de raizes laterais e adventicias, o sistema vascular, desenvolvimento de meristema, ou expansão radial. Métodos para modular o desenvolvimento de raiz em uma planta são providos. Os métodos compreendem modular o nivel e/ou atividade do polipeptídeo ARGOS na planta. Em um método, uma seqüência ARGOS da invenção é provida para a planta. Em outro método, a seqüência de nucleotídeos ARGOS é provida introduzindo na planta um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos ARGOS da invenção, expressando a seqüência ARGOS e, portanto, modificando o desenvolvimento de raiz. Ainda em outros métodos, a construção de nucleotideo ARGOS introduzida na planta é estavelmente incorporada no genoma da planta.

Em outros métodos, o desenvolvimento de raiz é modulado alterando-se o nivel ou atividade do polipeptideo ARGOS na planta. Um aumento em atividade de ARGOS pode resultar em pelo menos um ou mais das seguintes alterações para desenvolvimento de raiz, incluindo, mas não se limitando a, meristemas radiculares maiores, aumentado em crescimento de raiz, expansão radial intensificada, um sistema vascular intensificado, ramificação de raiz aumentada, mais raizes adventicias, e/ou um aumento no peso fresco de raiz quando comparado a uma planta controle.

Como aqui usado, "crescimento de raiz" engloba todos os aspectos de crescimento das diferentes partes que perfazem o sistema radicular em diferentes estágios de seu desenvolvimento, tanto em plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Deve ser entendido que crescimento de raiz intensificado pode resultar de crescimento intensificado de uma ou mais de suas partes, incluindo a raiz primária, raizes laterais, raizes adventicias, etc. Métodos de medir tais alterações de desenvolvimento no sistema radicular são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, U.S. Application No. 2003/0074698 e Werner, et al.f (2001) PNAS 18:10487-10492, ambas são aqui incorporadas por referência.

Como discutido acima, um especialista reconhecerá o promotor apropriado para uso para modular o desenvolvimento de raiz na planta. Promotores exemplares para este avanço incluem promotores constitutivos e promotores preferidos de raiz. Promotores exemplares preferidos de raiz foram aqui descritos em outra parte.

Estimular o crescimento de raiz e aumentar a massa de raiz elevando-se a atividade e/ou nivel do polipeptideo ARGOS também é útil para melhorar a capacidade de sustentação de uma planta. O termo "resistência a corte" ou "capacidade de sustentação" refere-se à habilidade de uma planta para se fixar ao solo. Para plantas com um hábito ereto ou semi-ereto, este termo também refere-se à habilidade de manter uma posição vertical sob condições (ambientais) adversas. Este traço está relacionado ao tamanho, profundidade, e morfologia do sistema radicular. Além disso, estimular o crescimento de raiz e aumentar a massa de raiz elevando-se o nivel e/ou atividade do polipeptideo ARGOS também é útil para promover a propagação in vitro de explantes.

Adicionalmente, uma maior produção de biomassa de raiz devido a um nível e/ou atividade de atividade ARGOS elevado possui um efeito direto no rendimento e um efeito indireto de produção de compostos produzidos por células radiculares ou células radiculares transgênicas ou culturas de células de ditas células radiculares transgênicas. Um exemplo de um composto interessante produzido em culturas de raízes em chiconina, o rendimento do qual pode vantajosamente intensificado por ditos métodos.

Dessa maneira, a presente invenção provê ainda plantas tendo desenvolvimento de raiz modulado quando comparada ao desenvolvimento de raiz de uma planta controle. Em alguns avanços, a planta da invenção possui um nível/atividade aumentado do polipeptídeo ARGOS da invenção e possui crescimento de raiz e/ou biomassa de raiz intensificado. Em outros avanços, tais plantas têm estavelmente incorporado em seu genoma uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de nucleotídeos ARGOS da invenção operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão na célula vegetal. v. Modulando o Desenvolvimento de Broto e de Folha Métodos são também providos para modular o desenvolvimento de broto e folha em uma planta. Por "modular o desenvolvimento de broto e/ou folha" pretende-se qualquer alteração no desenvolvimento do broto e/ou folha da planta. Tais alterações no desenvolvimento de broto e/ou folha incluem, mas não são limitadas a, alterações no desenvolvimento de meristema de broto, no número de folhas, tamanho de folha, vasos de folha e caule, comprimento de internodo, e senescência foliar. Como aqui usado, "desenvolvimento de folha" e "desenvolvimento de broto" engloba todos os aspectos de crescimento das diferentes partes que perfazem o sistema foliar e o sistema de broto, respectivamente, em diferentes estágios de seu desenvolvimento, tanto em plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas. Métodos para medir tais alterações no desenvolvimento no sistema foliar e de broto são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Werner, et al., (2001) PNAS 98:10487-10492 e U.S. Application No. 2003/0074698, cada qual é aqui incorporada por referência. O método para modular o desenvolvimento de broto e/ou folha em uma planta compreende modular a atividade e/ou nível de um polipeptídeo ARGOS da invenção. Em um avanço, uma seqüência ARGOS da invenção é provida. Em outros avanços, a seqüência de nucleotídeos ARGOS pode ser provida introduzindo-se na planta um polinucleotídeo compreendendo uma seqüência de nucleotídeos ARGOS da invenção, expressando a seqüência ARGOS e, dessa forma, modificando o desenvolvimento de broto e/ou folha. Em outros avanços, a construção de nucleotídeos ARGOS introduzido na planta é estavelmente incorporada no genoma da planta.

Em avanços específicos, o desenvolvimento de broto ou folha é modulado diminuindo-se o nível e/ou atividade do polipeptídeo ARGOS na planta. Uma diminuição na atividade de ARGOS pode resultar em pelo menos uma ou mais das seguintes alterações no desenvolvimento de broto e/ou folha, incluindo, mas não se limitando a, número de folha reduzido, superfície foliar reduzida, vascular reduzido, internodos mais curtos e crescimento abalado, e senescência foliar retardada, quando comparado a uma planta controle.

Como discutido acima, um especialista reconhecerá o promotor apropriado para uso para modular o desenvolvimento de broto e folha da planta. Promotores exemplares para este avanço incluem promotores constitutivos, promotores preferenciais de broto, promotores preferenciais de meristema de broto, e promotores preferenciais de folha. Promotores exemplares foram aqui descritos em outra parte.

Diminuir a atividade e/ou nivel de ARGOS em uma planta resulta em internodos mais curtos e crescimento abalado. Assim, os métodos da invenção são úteis para produzir plantas anãs. Além disso, como discutido acima, a modulação de atividade de ARGOS na planta modula tanto o crescimento de raiz como de broto. Assim, a presente invenção prove, ainda, métodos para alterar a razão raiz/broto. O desenvolvimento de broto ou folha pode ser ainda modulado diminuindo-se o nivel e/ou atividade do polipeptideo ARGOS na planta.

Dessa maneira, a presente invenção provê ainda plantas tendo desenvolvimento de broto e/ou folha modulado quando comparado a uma planta controle. Em alguns avanços, a planta da invenção possui um nivel/atividade do polipeptideo ARGOS da invenção aumentado, alterando o desenvolvimento de broto e/ou folha. Tais alterações incluem, mas não são limitadas a, número de folhas aumentado, superfície foliar aumentada, vascularidade aumentada, internodos mais longos e estatura de planta aumentada, assim como alterações em senescência foliar, se comparado a uma planta controle. Em outros avanços, a planta da invenção possui um nivel/atividade do polipeptideo ARGOS da invenção diminuído. vi Modulando o Desenvolvimento de Tecido Reprodutivo Métodos para modular o desenvolvimento de tecido reprodutivo são providos. Em um avanço, são providos métodos para modular o desenvolvimento floral em uma planta. Por "modular o desenvolvimento floral" pretende-se qualquer alteração em uma estrutura de um tecido reprodutivo de planta se comparado a uma planta controle na qual a atividade ou nível do polipeptideo ARGOS não foi modulada. "Modular o desenvolvimento floral" inclui ainda qualquer alteração no sincronismo do desenvolvimento de um tecido reprodutivo de planta (i.e., um sincronismo atrasado ou acelerado de desenvolvimento floral) quando comparado a uma planta controle na qual a atividade ou nível do polipeptideo ARGOS não foi modulada. Alterações macroscópicas podem incluir mudanças em tamanho, formato, número, ou localização ou órgãos reprodutivos, o período de tempo de desenvolvimento com que essas estruturas se formam, ou a habilidade de manter ou proceder através do processo de florada em tempos de estresse ambientas. Alterações microscópicas podem incluir mudanças aos tipos ou formatos de células que perfazem os órgãos reprodutivos. O método para modular o desenvolvimento floral em uma planta compreende modular a atividade de ARGOS em uma planta. Em um método, uma seqüência ARGOS da invenção é provida. Uma seqüência de nucleotideos ARGOS pode ser provida introduzindo-se na planta um polinucleotideo compreendendo uma seqüência de nucleotideos ARGOS da invenção, expressando a seqüência ARGOS, e, dessa forma, modificando o desenvolvimento floral. Em outros avanços, a construção de nucleotideos ARGOS introduzido na planta é estavelmente incorporada no genoma da planta.

Em métodos específicos, o desenvolvimento floral é modulado diminuindo-se o nível ou atividade do polipeptídeo ARGOS na planta. Um decréscimo na atividade de ARGOS pode resultar em pelo menos uma ou mais das seguintes alterações em desenvolvimento floral, incluindo, mas não se limitando a, florada retardada, número de flores reduzido, esterilidade masculina parcial, e postura de sementes reduzida, quando comparado a uma planta controle. Induzir florada atrasada ou inibir a florada pode ser usado para intensificar o rendimento em cultivos de forrageio, tais como alfafa. Métodos para medir tais alterações de desenvolvimento em desenvolvimento floral são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Mouradov, et al., (2002) The Plant Cell S111-S130, aqui incorporada por referência.

Como discutido acima, um especialista reconhecerá o promotor apropriado para uso para modular o desenvolvimento floral da planta. Promotores exemplares para este avanço incluem promotores constitutivos, promotores induzidos, promotores preferenciais de brotos, e promotores preferenciais de inflorescência.

Em outros métodos, o desenvolvimento floral é modulado aumentando-se o nivel e/ou atividade da seqüência ARGOS da invenção. Tais métodos podem compreender introduzir uma seqüência de nucleotideos ARGOS na planta e aumentar a atividade do polipeptideo ARGOS. Em outros métodos, a construção de nucleotideos ARGOS introduzida na planta é estavelmente incorporada no genoma da planta. Aumentar a expressão da seqüência ARGOS da invenção pode modular o desenvolvimento floral durante períodos de estresse. Tais métodos são aqui descritos em outra parte. Dessa maneira, a presente invenção provê ainda plantas tendo desenvolvimento floral modulado quando comparado ao desenvolvimento floral de uma planta controle. Composições incluem plantas tendo um nível/atividade do polipeptideo ARGOS da invenção aumentado e tendo um desenvolvimento floral alterado. Composições também incluem plantas tendo um nível/atividade do polipeptídeo ARGOS da invenção aumentado caracterizado pelo fato de que a planta mantém ou procede o processo de florada em tempos de estresse. Métodos são também providos para o uso das seqüências ARGOS da invenção para aumentar o tamanho e/ou peso de semente. 0 método compreende aumentar a atividade das seqüências ARGOS em uma planta ou parte de planta, tal como a semente. Um aumento em tamanho e/ou peso de semente compreende um tamanho ou peso aumentado da semente e/ou um aumento no tamanho ou peso de uma ou mais partes da semente incluindo, por exemplo, o embrião, endosperma, cobertura da semente, aleurona, ou cotilédone.

Como discutido acima, um especialista reconhecerá o promotor apropriado para uso para aumentar o tamanho de semente e/ou peso de semente. Promotores exemplares deste avanço incluem promotores constitutivos, promotores induzidos, promotores preferenciais de semente, promotores preferenciais de embrião, e promotores preferenciais de endosperma. 0 método para diminuir o tamanho de semente e/ou peso de semente em uma planta compreende diminuir a atividade de ARGOS na planta. Em um avanço, a seqüência de nucleotideos ARGOS pode ser provida pela introdução na planta um polinucleotideo compreendendo uma seqüência de nucleotideos ARGOS da invenção, expressando a seqüência ARGOS, e, dessa forma, diminuindo o peso e/ou tamanho de semente. Em outros avanços, a construção de nucleotideos ARGOS introduzida na planta é estavelmente incorporada no genoma da planta. É ainda reconhecido que aumentar o tamanho e/ou peso de semente pode estar também acompanhado por um aumento na velocidade de crescimento de plântulas ou um aumento em vigor inicial. Como aqui usado, o termo "vigor inicial" refere-se à habilidade de uma planta crescer rapidamente durante o desenvolvimento inicial, e está relacionado ao estabelecimento bem-sucedido, após a germinação, de um sistema radicular bem desenvolvido e um aparato fotossintético bem desenvolvido. Além disso, um aumento em tamanho e/ou peso de semente pode resultar, também, em um aumento no rendimento vegetal quando comparado a um controle.

Dessa maneira, a presente invenção provê ainda plantas tendo um peso de semente e/ou tamanho de semente aumentado quando comparado a uma planta controle. Em outros avanços, plantas tendo vigor e rendimento vegetal aumentados são também providas. Em alguns avanços, a planta da invenção possui um nivel/atividade do polipeptideo ARGOS da invenção aumentado e possui um peso de semente e/ou tamanho de semente aumentado. Em outros avanços, tais plantas têm estavelmente incorporado em seu genoma uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma següência de nucleotideos ARGOS da invenção operacionalmente ligada a um promotor que dirige a expressão na célula vegetal.

vii. Método de Uso para polinucleotídeos promotores de ARGOS

Os polinucleotídeos compreendendo os promotores de ARGOS descritos na presente invenção, assim como variantes e fragmentos desses, são úteis na manipulação genética de qualquer célula hospedeira, preferencialmente célula vegetal, quando reunidos com uma construção de DNA, de forma que a seqüência promotora seja operacionalmente ligada a uma seqüência de nucleotideos compreendendo um polinucleotídeo de interesse. Dessa maneira, os polinucleotídeos promotores de ARGOS da invenção são providos em cassetes de expressão juntos com uma seqüência de polinucleotídeos de interesse para expressão na célula hospedeira de interesse. Como discutido no Exemplo 2 abaixo, as seqüências promotoras de ARGOS da invenção são expressas em uma variedade de tecidos e, assim, as seqüências promotoras são úteis em regular a expressão temporal e/ou espacial de polinucleotideos de interesse.

Regiões promotoras híbridas sintéticas são conhecidas na técnica. Tais regiões compreendem elementos promotores acima de um polinucleotídeo operacionalmente ligado ao elemento promotor de outro polinucleotídeo. Em um avanço da invenção, a expressão de seqüência heteróloga é controlada por um promotor híbrido sintético compreendendo as seqüências promotoras de ARGOS da invenção, ou um variante ou fragmento dessa, operacionalmente ligadas a elemento(s) promotor(es) acima, a partir de um promotor heterólogo. Elementos promotores acima que estão envolvidos no sistema de defesa da planta foram identificados e podem ser usados para gerar um promotor sintético. Ver, por exemplo, Rushton, et al., (1998) Curr. Opin. Plant Biol. 1:311-315. Alternativamente, uma seqüência promotora de ARGOS sintética pode compreender duplicações dos elementos promotores acima encontrados nas seqüências promotoras de ARGOS.

É reconhecido que a seqüência promotora da invenção pode ser usada com suas seqüências codificadoras de ARGOS nativa. Uma construção de DNA compreendendo o promotor de ARGOS operacionalmente ligado com seu gene de ARGOS nativo pode ser usada para transformar qualquer planta de interesse para perfazer uma mudança fenotipica desejada, tal como modular o número de células, modular o desenvolvimento de raiz, broto, folha, flores, e embrião, tolerância a estresse, e qualquer outro fenótipo aqui descrito em outra parte.

As seqüências promotoras de nucleotideos e métodos aqui descritos são úteis para regular a expressão de qualquer seqüência heteróloga de nucleotideos em uma planta hospedeira para variar o fenótipo de uma planta. Várias mudanças em fenótipo são de interesse incluindo modificar a composição de ácidos graxos em uma planta, alterar o conteúdo de aminoácido de uma planta, alterar um mecanismo de defesa contra patógenos de uma planta, e similares. Esses resultados podem ser alcançados provendo a expressão de produtos heterólogos ou expressão aumentada de produtos endógenos em plantas. Alternativamente, os resultados podem ser alcançados provendo uma redução de expressão de um ou mais produtos endógenos, particularmente enzimas ou co-fatores na planta. Essas mudanças resultam em uma mudança em fenótipo da planta transformada.

Genes de interesse são um reflexo dos mercados comerciais e interesses daqueles envolvidos no desenvolvimento do cultivo. Cultivos e mercados de interesse mudam, e à medida que as nações em desenvolvimento abrem mercados mundiais, novos cultivos e tecnologias irão também emergir. Além disso, como nosso entendimento de traços agronômicos e características, tais como aumento do rendimento e heterose, a escolha de genes para transformação irá se modificar dessa maneira. Categorias gerais de genes de interesse incluem, por exemplo, aqueles genes envolvidos em informação, tais como dedos de zinco, aqueles envolvidos em comunicação, tais como quinases, e aqueles envolvidos em manutenção, tais como proteínas de choque de calor. Mais categorias específicas de transgenes, por exemplo, incluem genes codificando importantes traços para agronomia, resistência a insetos, resistência a doenças, resistência a herbicidas, esterilidade, características de grão, produtos e comerciais. Genes de interesse incluem, geralmente, aqueles envolvidos no metabolismo de óleo, amido, carboidrato, ou nutrientes assim como aqueles afetando o tamanho de grão, carregamento de sacarose, e similares.

Em certos avanços, as seqüências de ácidos nucléicos da presente invenção podem ser usadas em combinação ("combinadas") com outras seqüências de polinucleotideos de interesse para criar plantas com um fenótipo desejado. As combinações geradas podem incluir múltiplas cópias de qualquer um ou mais dos polinucleotideos de interesse. Os polinucleotideos da presente invenção podem ser combinados com qualquer gene ou combinação de genes para produzir plantas com uma variedade de combinações de traços desejados, incluindo, mas não se limitando a, traços desejáveis para alimentação, tais como genes de alto nivel de óleos (e.g., Ü.S. Patent No. 6.232.529); aminoácidos balanceados (e.g., hordotioninas (U.S. Patent Nos. 5.990.389; 5.885.801; 5.885.802; e 5.703.409); alto teor de lisina em cevada (Williamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106; e WO 98/20122); e proteínas com muita metionina (Pedersen, et al., (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara, et al., (1988) Gene 71:359; e Musumura, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:123)); digestibilidade aumentada (e.g., proteínas de armazenamento modificadas (U.S. Application Serial No. 10/053.410, preenchida em 7 de novembro de 2001); e tioredoxinas (U.S. Application Serial No. 10/005.429, preenchida em 3 de dezembro 2001)), as descrições das quais são aqui incorporadas por referência. Os polinucleotideos da presente invenção podem ser também combinados com traços desejáveis para resistência a insetos, doenças ou herbicidas (e.g., proteínas tóxicas de Bacíllus thuringiensis (U.S. Patent Nos. 5.366.892; 5.747.450; 5.737.514; 5.723.756; 5.593.881; Geiser, et al., (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme, et al., (1994) Plant Mol. Biol. 24:825); genes de desintoxicação de fumonisina (U.S. Patent No. 5.792.931); genes de avirulência e resistência a doenças (Jones, et al., (1994) Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science 262:1432; Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintase (ALS) que levam a resistência a herbicidas, tais como as mutações S4 e/ou Hra; inibidores de sintase glutamina, tais como fosfinotricina ou basta (e.g., gene bar); e resistência a glifosato (gene EPSPS)); e traços desejáveis para processar ou produtos de processo, tais como alto conteúdo de óleo (e.g., U.S. Patent No. 6.232.529 ); óleos modificados (e.g., genes de desaturase de ácidos graxos (U.S. Patent No. 5.952.544; WO 94/11516)); amidos modificados (e.g., ADPG pirofosforilases (AGPase), amidos modificados (SS), enzimas de ramificação de amido (SBE) e enzimas de desramificação de amido (SDBE)); e polímeros ou bioplásticos (e.g., U.S. patent No. 5.602.321; beta-cetotiolase, polihidroxibutirato sintase, e acetoacetil-CoA redutase (Schubert, et al., (1988) J. Bacteriol. 170:5837-5847) facilitar a expressão de polihidroxialcanoatos (PHAs)), as descrições das quais são aqui incorporadas por referência. Pode-se também combinar os polinucleotídeos da presente invenção com polinucleotídeos afetando características agronômicas, tais como esterilidade masculina (e.g., ver U.S. Patent No. 5.583.210), força de caule, tempo de florada, ou traços de tecnologia de transformação, como regulação de ciclo celular ou direcionamento de genes (e.g., WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), as descrições das quais são aqui incorporadas por referência.

Em um avanço, seqüências de interesse melhoram o crescimento vegetal e/ou rendimentos de cultivo. Por exemplo, seqüências de interesse incluem genes agronomicamente importantes que resultam em sistemas radiculares primários ou laterais melhorados. Tais genes incluem, mas não estão limitados a, transportadores de nutrientes/água e indutores de crescimento. Exemplos de tais genes, incluem, mas não são limitados a, H+-ATPase de membrana plasmática de milho (MHA2) (Frias, et al., (1996) Plant Cell 8:1533-44); AKT1, um componente do aparato de absorção de potássio em Arabidopsis, (Spalding, et al., (1999) J Gen Physiol 113:909-18); genes RML que ativam o ciclo de divisão celular nas células radiculares apicais (Cheng, et al., (1995) Plant Physiol 108:881); genes glutamina sintetase de milho (Sukanya, et al., (1994) Plant Mol Biol 26:1935-46) e hemoglobina (Duff, et al., (1997) J.

Biol. Chem 27:16749-16752, Arredondo-Peter, et al., (1997) Plant Physiol. 115:1259-1266; Arredondo-Peter, et ai., (1997) Plant Physiol 114:493-500 e referências ai citadas). A seqüência de interesse pode ser útil, também, para expressar seqüências de nucleotideos anti-senso de genes que afetam negativamente o desenvolvimento de raiz.

Traços adicionais importantes agronomicamente, tais como conteúdo de óleo, amido e proteína podem ser geneticamente alterados além de se usar métodos de melhoramento tradicionais. Modificações incluem aumentar o conteúdo de ácido oléico, óleos saturadas insaturados, aumentar os níveis de lisina e enxofre, fornecer aminoácidos essenciais, e também modificação de amido. Modificações em proteína hordotionina são descritas em U.S. Patent Nos. 5.703.049, 5.885.801, 5.885.802, e 5.990.389, aqui incorporada por referência. Outro exemplo é proteína de semente rica em lisina e/ou enxofre codificada pela albumina 2S de soja descrita em U.S. Patent No. 5.850.016, e o inibidor de quimotrípsina de cevada, descrito em Williamson, et al., (1987) Eur. J. Biochem. 165:99-106, as descrições das quais são aqui incorporadas por referência.

Derivados das seqüências codificadoras podem ser feitos por mutagênese sítio direcionada para aumentar o nível de aminoácidos pré-selecionados no polipeptídeo codificado. Por exemplo, o gene codificando o polipeptídeo de alto conteúdo de lisina em cevada (BHL) é derivado do inibidor de quimotripsina de cevada, U.S. Application Serial No. 08/740.682, preenchida em Io de novembro de 1996, e WO 98/20133, as descrições das quais são aqui incorporadas por referência. Outras proteínas incluem proteínas vegetais ricas em metionina, tais como de sementes de girassol (Lilley, et al., (1989) Proceedings of the World Congress on Vegetable Protein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs, ed. Applewhite (American Oil Chemists Society, Champaign, Illinois), pp. 497-502; aqui incorporada por referência) ;■milho (Pedersen, et al. , (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; Kirihara, et al. , (1988) Gene 71:359; ambas as quais são aqui incorporadas por referência); e arroz (Musumura, et al., (1989) Plant Mol. Biol. 12:123, aqui incorporada por referência). Outros genes agronomicamente importantes codificam látex, Floury 2, fatores de crescimento, fatores de armazenamento de sementes, e fatores de transcrição.

Genes de resistência a insetos podem codificar resistência a pestes que causam uma grande retirada de rendimento, tais como larva-da-raiz, larva de besouro noctuídeo, lagarta européia, e similares. Tais genes incluem, por exemplo, genes de proteína tóxica de Bacillus thuringiensís (U.S. Patent Nos. 5.366.892; 5.747.450; 5.736.514; 5.723.756; 5.593.881; e Geiser, et al., (1986) Gene 48:109); e similares.

Genes codificando traços de resistência a doenças incluem genes de desintoxicação, tais como contra fumonosina (U.S. Patent No. 5.792.931); genes avirulência (avr) e resistência à doença (R) (Jones, et al., (1994) Science 266:789; Martin, et al., (1993) Science 262:1432; e Mindrinos, et al., (1994) Cell 78:1089); e similares.

Traços de resistência a herbicida podem incluir genes codificando resistência a herbicidas que atuam para inibir a ação de acetolactato sintase (ALS), em particular os herbicidas tipo sulfoniluréia (e.g., o gene de acetolactato sintase (ALS) contendo mutações levando a tal resistência, em particular as mutações S4 e/ou Hra), genes codificando resistência a herbicidas que atuam para inibir a ação de glutamina sintase, tais como fosfinotricina ou basta (e.g., o gene bar), ou outros tais genes conhecidos na técnica. O gene bar codifica resistência ao herbicida basta, o gene nptll codifica resistência aos antibióticos canamicina e geneticina, e os mutantes do gene ALS codificam resistência ao herbicida clorsulfuron.

Genes de esterilidade podem ser também codificados em um cassete de expressão e provém uma alternativa para retirada de pendão física. Exemplos de genes usados em tais meios incluem genes preferenciais de tecido masculino e genes com fenótipos de esterilidade masculina, tais como QM, descrito em U.S. Patent No. 5.583.210. Outros genes incluem quinases e aqueles codificando compostos tóxicos tanto para o desenvolvimento de gametófito masculino como para feminino. A qualidade de grão é refletida em traços, tais como níveis e tipos de óleos, saturado e insaturado, qualidade e quantidade de aminoácidos essenciais, e níveis de celulose. Em milho, proteínas hordotioninas modificadas são descritas em U.S. Patent Nos. 5.703.049, 5.885.801, 5.885.802, e 5.990.389.

Traços comerciais podem ser também codificados em um gene ou genes que poderíam aumentar, por exemplo, amido para a produção de etanol, ou prover a expressão de proteínas. Outro importante uso comercial de plantas transformadas é a produção de polímeros e bioplásticos, tais como descrito em U.S. Patent No. 5.602.321. Genes tais como β-cetotiolase, PHBase (polihidroxiburirato sintase), e acetoacetil-CoA redutase (ver, Schubert, et al. , (1988) J. Bacteriol. 17 0:5837-5847) facilitam a expressão de polihiroxialcanoatos (PHAs).

Produtos exógenos incluem enzimas e produtos vegetais, assim como aqueles de outras fontes incluindo procariontes e outros eucariontes. Tais produtos incluem enzimas, co-fatores, hormônios e similares. O nível de proteínas, proteínas particularmente modificadas, tendo distribuição de aminoácido melhorada para melhorar o valor nutricional da planta, pode ser aumentado. Isto é alcançado pela expressão de tais proteínas tendo conteúdo de aminoácido intensificado.

Esta invenção pode ser mais bem entendida por referência aos seguintes exemplos não limitantes. Será ponderado por aqueles especialistas na técnica que outros avanços da invenção podem ser praticados sem sair do espírito e do escopo da invenção, como aqui descrito e reivindicado.

EXEMPLOS

Exemplo 1. Isolamento de seqüências ARGOS

Uma rotina para identificar todos os membros de uma família de genes foi empregada para buscar genes ARGOS de interesse. Um grupo diverso de todos os membros conhecidos da família de genes, como seqüências de proteínas, foi preparado. Esses dados incluem seqüências de outras espécies. Essas espécies são contrapostas contra uma base de dados de seqüências de milho e um grupo não redundante de pontos se sobrepondo é identificado. Separadamente, pega-se as seqüências de nucleotídeos de qualquer gene de interesse em mãos e contrapõe-se contra a base de dados e um grupo não redundante de todos os pontos se sobrepondo é encontrado. 0 grupo de pontos de proteína é, então, comparado em relação aos pontos de nuçleotídeo. Se a família de genes está completa, todos os pontos de proteína estão contidos nos pontos de nucleotídeos. A família de genes ARGOS consiste de 3 genes de Arabidopsis, 8 genes de arroz, 9 genes de milho, 9 genes de sorgo, e 5 genes de soja. Uma representação em dendrograma das inter-relações das proteínas codificadas por esses genes é provida como a Figura 1.

Exemplo 2. Análise de Sequência ARGOS

Os polipeptídeos ZmARGOS da invenção atual possuem características comuns com genes ARGOS em uma variedade de espécies vegetais. A relação entre os genes das múltiplas espécies vegetais é mostrada em um alinhamento, ver Figuras 2. A figura 3 contém ZmARGOS 1, 2, 3, e AtARGOS 1 (SEQ ID NOS: 2, 4, 6 e 26). As proteínas codificadas pelos genes ARGOS possuem uma região rica em prolina bem conservada próxima do C-terminal. As regiões N-terminal são mais divergentes. As proteínas são relativamente curtas, em média 110 aminoácidos.

Exemplo 3. Transformação e Regeneração de Plantas transgênicas Embriões imaturos de milho de plantas de estufa doadoras são bombardeados com um plasmídeo contendo a seqüência ZmARGOS operacionalmente ligada ao promotor induzido por seca, promotor RAB17 (Vilardell, et al.r (1990) Plant Mol Biol 14:423-432) e o gene marcador de seleção PAT, que confere resistência ao herbicida Bialaphos. Alternativamente, o gene marcador de seleção é provido em um plasmídeo separado. A transformação é efetuada como a seguir. As receitas de meio seguem abaixo.

Preparação de Tecido Alvo: As espigas são descascadas e a superfície esterilizada em 30% de alvejante Clorox mais 0,5% de Micro detergente por 20 minutos, e enxaguadas duas vezes com água estéril. Os embriões imaturos são excisados e colocados com o eixo do embrião virado para baixo (lado do escutelo para cima), 25 embriões por placa, em meio 560Y por 4 horas e, então, alinhados na zona alvo de 2,5cm em preparação para o bombardeamento.

Preparação de DNA: Um vetor de plasmideo compreendendo a seqüência ARGOS operacionalmente ligada a um promotor de ubiquitina é feito. Esse DNA de plasmideo mais DNA de plasmideo contendo um marcador de seleção PAT são precipitados em pelotas de tungstênio de 1,1 pm (diâmetro médio) usando um procedimento de precipitação com CaCl2 como se segue: 100 μΐ preparado de partículas de tungstênio em água 10 μΐ (1 pg) de DNA em tampão Tris EDTA (1 pg de DNA total) 100 pl CaCl2 2,5 M

10 pl espermidina 0,1 M

Cada reagente é adicionado seqüencialmente à suspensão de partículas de tungstênio, enquanto mantido no misturador tipo vórtex multitubo. A mistura final é sonicada brevemente e deixada incubando sob agitação constante por 10 minutos. Após o período de precipitação, os tubos são centrifugados brevemente, o líquido removido, lavados com 500 ml de etanol 100%, e centrifugados por 30 segundos. Novamente, o líquido é removido, e 105 μΐ de etanol 100% são adicionados à pelota de partículas de tungstênio final. Para a pistola de bombardeamento de partículas, as partículas de tungstênio/DNA são sonicadas brevemente e 10 μΐ colocados no centro de cada macro-carregador e deixados secando por cerca de 2 minutos antes do bombardeamento.

Tratamento com Pistola de Partículas: As placas de amostra são bombardeadas no nível #4 na pistola de partículas #HE34-1 ou #HE34-2. Todas as amostras recebem um único tiro a 650 PSI, com um total de dez alíquotas retiradas de cada tubo de preparado partícuias/DNA.

Tratamento Subseqüente: Após o bombardeamento, os embriões são mantidos em meio 560Y por 2 dias, então transferidos para meio de seleção 560R contendo Bialaphos a 3 mg/litro, e sub-cultivados a cada 2 semanas. Após aproximadamente 10 semanas de seleção, clones de calos resistentes a seleção são transferidos para meio 288J para iniciar a regeneração vegetal. Após o amadurecimento do embrião somático (2-4 semanas), embriões somáticos bem desenvolvidos são transferidos para meio para germinação e transferidos para a sala de cultura iluminada. Aproximadamente 7-10 dias depois, as plântulas em desenvolvimento são transferidas para meio 272V sem hormônio em tubos por 7-10 dias até que as plântulas estejam bem estabelecidas. As plantas são, então, transferidas para inserções em planos (equivalente a pote de 2,5") contendo solo de pote e crescidas por 1 semana em uma câmara de crescimento, crescidas subseqüentemente por 1-2 semanas adicionais na estufa, então transferidas para potes clássicos 600 (1,6 galões) e cultivadas até a maturidade. As plantas são monitoradas e pontuadas para tolerância a seca aumentada. Testes para medir a tolerância a seca aumentada são rotina na técnica e incluem, por exemplo, rendimentos aumentados de capacidade de grãos por espiga sob condições de seca quando comparado a plantas de milho controle sob condições ambientais idênticas. Alternativamente, as plantas transformadas podem ser monitoradas para uma modulação em desenvolvimento de meristema (i.e., um decréscimo na formação de cravos na espiga). Ver, por exemplo, Bruce, et al., (2002) Journal of Experimental Botany 53:1-13.

Meios de Bombardeamento e Cultura: Meio de bombardeamento (560Y) compreende 4,0 g/1 de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/1 de mistura de Vitamina Eriksson's (lOOOx SIGMA-1511), 0,5 mg/1 de HC1 tiamina, 120,0 g/1 de sacarose, 1,0 mg/1 de 2,4-D, e 2,88 g/1 de L-prolina (levado ao volume com H2O dl seguindo o ajuste para pH 5,8 com KOH) ; 2,0 g/1 Gelrite™ (adicionado após levar ao volume com H20 dl); e 8,5 mg/1 de nitrato de prata (adicionados após esterilizar o meio e resfriar para temperatura ambiente). Meio de seleção (560R) compreende 4,0 g/1 de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 ml/1 de mistura de vitamina Eriksson's (lOOOx SIGMA-1511), 0,5 mg/1 de HC1 tiamina, 30,0 g/1 de sacarose, e 2,0 mg/1 de 2,4-D (levados ao volume com H20 dl seguindo o ajuste para pH 5,8 com KOH); 3,0 g/1 de Gelrite™ (adicionado após levar ao volume com H20 dl); e 0,85 mg/1 de nitrato de prata e 3,0 mg/1 de Bialaphos (ambos adicionados após esterilizar o meio e resfriar para temperatura ambiente).

Meio de regeneração vegetal (288J) compreende 4,3 g/1 de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/1 de solução de estoque de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotinico, 0,02 g/1 de HC1 tiamina, 0,10 g/1 de HC1 piridoxina, e 0,40 g/1 de glicina levados ao volume com H20 dl polida) (Murashige and Skoog (1962) Physiol. Plant. 15:473), 100 mg/1 de mio- inositol, 0,5 mg/1 de zeatina, 60 g/1 de sacarose, e 1,0 ml/1 de 0,1 mM ácido abscisico (levados ao volume com H20 dl polida após ajustar para pH 5,6); 3,0 g/1 de Gelrite™ (adicionados após levar ao volume com H20 dl); e 1,0 mg/1 de ácido indoloacético e 3,0 mg/1 de Bialaphos (adicionados após esterilizar o meio e resfriar para 60°C) . Meio sem hormônios (272V) compreende 4,3 g/1 de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 ml/1 de solução de estoque de vitaminas MS (0,100 g/1 de ácido nicotinico, 0,02 g/1 de HC1 tiamina, 0,10 g/1 de HC1 piridoxina, e 0,40 g/1 de glicina levados ao volume com H20 dl polida), 0,1 g/1 de mio-inositol, e 40,0 g/1 de sacarose (levados ao volume com H20 dl polida após ajustar o pH para 5,6); e 6 g/1 de Bacto-ágar (adicionado após levar ao volume com H20 dl polida), esterilizados e resfriados a 60° C.

Exemplo 5. Transformação por Agrobacterium Para transformação de milho mediada por Agrobacterium com uma seqüência anti-senso da seqüência ZmARGOS da presente invenção, preferencialmente o método de Zhao é empregado (U.S. Patent No. 5.981.840, e a publicação PCT W098/32326; os conteúdos das quais são aqui incorporados por referência). Resumidamente, embriões imaturos são isolados de milho e os embriões levados ao contato com uma suspensão de Agrobacterium, onde as bactérias são capazes de transferir a seqüência ARGOS a pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção). Nesta etapa, os embriões imaturos são preferencialmente imersos em uma suspensão de Agrobacterium para a iniciação da inoculação. Os embriões são co-cultivados por um tempo com as Agrobacterium (etapa 2: a etapa de co-cultivo). Preferencialmente, os embriões imaturos são cultivados em meio sólido após a etapa de infecção. Após este período de co-cultivo, uma etapa de "descanso" é contemplada. Nesta etapa de descanso, os embriões são incubados na presença de pelo menos um antibiótico conhecido por inibir o crescimento de Agrobacterium sem a adição de um agente seletivo para transformantes vegetais (etapa 3: etapa de descanso). Preferencialmente, os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com antibiótico, mas sem um agente de seleção, para eliminação de Agrobacterium e por uma fase de descanso para as células infectadas. Em seguida, os embriões inoculados são cultivados em meio contendo um agente seletivo e os calos em crescimento transformados são recuperados (etapa 4: a etapa de seleção). Preferencialmente, os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com um agente seletivo resultando no crescimento seletivo de células transformadas. 0 calo é, então, regenerado em plantas (etapa 5: a etapa de regeneração), e, preferencialmente os calos crescidos em meio seletivo são cultivados em meio sólido para regenerar as plantas. As plantas são monitoradas e pontuadas para uma modulação em desenvolvimento de meristema. Por exemplo, alterações de tamanho e aparência do broto e meristemas florais e/ou produção de folhas, flores e/ou frutos aumentada.

Exemplo 6. A super-expressão de ZmARGOS afeta o tamanho de planta e tamanho de órgão A função do gene ZmARGOS foi testada usando-se plantas transgênicas expressando o transgene Ubi-ZmARGOS. A expressão de transgene foi confirmada usando-se prímer RT-PCR especifico de transgene (SEQ ID NO: 38 para ARGOS, e SEQ ID NO: 39 para PIN) . Plantas TI de nove eventos de cópias simples foram avaliadas no campo. As plantas transgênicas apresentaram intensificações positivas em crescimento em diversos aspectos.

Crescimento Vegetativo e acúmulo de biomassa: Comparado aos aparentados não transgênicos, as plantas transgênicas (na geração Tl) apresentaram uma média de aumento de 4% em altura de planta por todos os 9 eventos e até 12% no evento mais alto. 0 caule das plantas transgênicas era mais espesso do que aparentados não transgênicas, como medido por valores de diâmetro de caule, com uma média de 9% a 22% de aumento dentre os nove eventos. 0 aumento da altura de planta e a espessura resultaram em uma maior estatura de planta e biomassa para as plantas transgênicas. 0 acúmulo de biomassa estimada apresentou um aumento de 30% em média e até 57% em linhas transgênicas positivas, comparado aos aparentados negativos.

ZmARGOS foi visto por causar impacto no crescimento vegetal principalmente acelerando a taxa de crescimento, mas não estendendo o período de crescimento. O crescimento intensificado, i.e., tamanho de planta aumentado e acúmulo de biomassa, aparenta ser largamente devido à taxa de crescimento acelerada, e não a um período estendido de crescimento, pois as plantas transgênicas não atrasaram a florada, baseado nas datas de formação de seda e antese. De fato, as plantas transgênicas floresceram mais cedo do que os aparentados não transgênicas. Em média, pelos eventos, os dias para florada foram encurtados entre 30 unidades de calor (1-1,5 dias), e 69 unidades de calor (2-2,5 dias). Portanto, a super-expressão do gene ZmARGOS acelerou a taxa de crescimento da planta. A taxa de crescimento acelerada parece estar associada com uma taxa de proliferação de célula elevada. 0 crescimento vegetativo intensificado, acúmulo de biomassa em transgênicos e taxa de crescimento acelerada foram ainda testados com experimentos de campo extensivos, tanto em híbridos como em bases intercruzadas em geração avançada (T3) . Plantas transgênicas reprodutivamente apresentaram altura de planta aumentada em até 18%, diâmetro de caule em até 10%, massa seca de pendão em até 15%, área foliar aumentada em até 14%, massa vegetal seca total em até 25%. A florada mais cedo observada na geração TI foi novamente observada na geração T3.

Crescimento reprodutivo e produção de grãos: A super-expressão do gene ZmARGOSl também intensificou o crescimento de órgão reprodutivo. Plantas transgênicas TI apresentaram comprimento de espiga aumentado, cerca de 10% na média de nove eventos, e até 14% para o maior evento. O peso total de grão por espiga aumentou 13% em média e até 70% para um evento. O aumento no peso total de grãos parece ser atribuído ao número de grãos e tamanho de grão aumentados. A média dos nove eventos mostrou que o número de grãos por espiga aumentou 8%, e até 50% no maior evento. O peso de 100 grãos aumentou 5% em média e até 13% para o maior evento. A mudança positiva nas características de grão e espiga está associada com aumento em produção de grãos. O crescimento reprodutivo intensificado e produção de grãos de transgênicos foram novamente confirmados em experimentos de campo extensivos na geração avançada (T3). A intensificação foi observada tanto em bases intercruzadas como híbridas. Como comparado com aparentado transgênico como controle, as plantas transgênicas apresentaram um aumento significativo em massa seca primária de espiga em até 60%, massa seca secundária de espiga em até 4,7 vezes, massa seca de pendão em até 25%, e massa seca de casca em até 40%. Os transgênicos apresentaram até 13% de aumento em número de grãos por espiga, e até 13% de aumento em produção de grãos.

Plantas transgênicas também apresentaram ASI reduzido, até 40 unidades de calor, esterilidade reduzida em até 50%, e número reduzido de grãos abortados em até 64%. A redução é mais quando as plantas foram cultivadas em uma condição de estresse de alta densidade de plantas. Uma medida reduzida desses parâmetros é freqüentemente relacionada à tolerância a estresse biótico.

Além disso, o nível de expressão de transgene está significativamente correlacionado com a massa seca de espiga.

Exemplo 7. Transformação de Embrião de Soja Embriões de soja são bombardeados com um plasmídeo contendo uma seqüência ARGOS operacionalmente ligada a um promotor de ubiquitina como se segue. Para induzir embriões somáticos, cotilédones de 3-5 mm em comprimento dissecados a partir de sementes imaturas com superfície esterilizada do cultivar de soja A2872, são cultivados na luz ou no escuro a 26°C em meio de ágar apropriado por seis a dez semanas. Embriões somáticos produzindo embriões secundários são, então, excisados e colocados em um meio líquido adequado. Após seleção repetida para agrupamentos de embriões somáticos que se multiplicaram como embriões iniciais de estágio globular, as suspensões são mantidas como descrito abaixo.

Culturas em suspensão embriogênicas de soja podem ser mantidas em 35 ml de meio líquido em um agitador de rotação, 150 rpm, a 26°C com luzes frias brancas fluorescentes em fotoperíodo de 16:8 hr dia/noite. As culturas são subcultivadas a cada duas semanas inoculando-se aproximadamente 35 mg de tecido em 35 ml de meio líquido.

Culturas em suspensão embriogênicas de soja podem ser, então, transformadas pelo método de bombardeamento por pistola de partículas (Klein, et al., (1987) Nature (London) 327:70-73, U.S. Patent No. 4.945.050). Um instrumento Du Pont Biolistic PDS1000/HE (de retroalimentação de hélio) pode ser usado para essas transformações.

Um gene marcador de seleção que pode ser usado para facilitar a transformação de soja é um transgene composto do promotor 35S de Vírus de Mosaico de Couve-Flor (Odell, et al., (1985) Nature 313:810-812), o gene de higromicina fosfotransferase de plasmídeo pJR225 (de E. coli; Gritz, et al., (1983) Gene 25: 179-188), e a região 3' do gene de nopalina sintase do T-DNA do plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens. O cassete de expressão compreendendo uma seqüência ARGOS senso operacionalmente ligada ao promotor de ubiquitina pode ser isolada como fragmento de restrição. Esse fragmento pode ser, então, inserido em um sitio de restrição em particular do vetor carregando o gene marcador.

Para 50 μΐ de uma suspensão de partículas de ouro de 1 pm a 60 mg/ml é adicionado (em ordem): 5 μΐ DNA (1 pg/μΐ), 20 μΐ espermidina (0,1 M) , e 50 μΐ CaCl2 (2,5 M) . A preparação de partículas é, então, agitada por três minutos, girada em um microfuge por 10 segundos e o sobrenadante removido. As partículas cobertas por DNA são, então, lavadas uma vez em 400 μΐ de etanol 70% e ressuspensas em 40 μΐ de etanol anidro. A suspensão DNA/partículas pode ser sonicada três vezes por um segundo cada. Cinco microlitros das partículas de ouro cobertas por DNA são, então, carregados em um disco macrocarregador.

Aproximadamente 300-400 mg de uma cultura de suspensão de duas semanas de idade são colocados em uma placa de petri vazia de 60x15 mm e o líquido residual removido do tecido com uma pipeta. Para cada experimento de transformação, aproximadamente 5-10 placas de tecido são normalmente bombardeadas. A pressão de ruptura de membrana é ajustada a 1100 psi, e a câmara evacuada a um vácuo de 28 polegadas de mercúrio. O tecido é colocado a aproximadamente 3,5 polegadas da tela de retenção e bombardeado três vezes. Após o bombardeamento, o tecido pode ser dividido ao meio e colocado de volta em liquid e cultivado como descrito acima.

De cinco a sete dias após o bombardeamento, o meio liquido pode ser trocado por meio fresco, e de onze a doze dias após o bombardeamento por meio fresco contendo higromicina a 50 mg/ml. Esse meio seletivo pode ser refrescado semanalmente. De sete a oito semanas após o bombardeamento tecido verde transformado pode ser observado crescendo a partir de agrupamentos embriogênicos necróticos não transformados. Tecido verde isolado é removido e inoculado em frascos individuais para gerar novas culturas em suspensão embriogênicas transformadas, propagadas clonalmente. Cada nova linha pode ser tratada como um evento de transformação independente. Essas suspensões podem ser, então, subcultivadas e mantidas como agrupamentos de embriões imaturos ou regeneradas em plantas inteiras por maturação e germinação de embriões somáticos individuais.

Exemplo 8. Transformação de Tecido Meristemático de Girassol Tecidos meristemáticos de girassol são transformados com um cassete de expressão contendo uma seqüência ARGOS operacionalmente ligada a um promotor de ubiquitina como se segue (ver também, European Patent Number EP 0 486233, aqui incorporada por referência, e Malone-Schoneberg, et ai., (1994) Plant Science 103:199-207). Sementes de girassol maduras (Helianthus annuus L.) são descascadas usando uma debulhadora de cabeça de trigo simples. Sementes têm suas superfícies esterilizadas por 30 minutos em uma solução alvejante de Clorox 20% com a adição de duas gotas de Tween 20 por 50 ml de solução. As sementes são enxaguadas duas vezes com água destilada estéril.

Explantes de eixo embriogênico dividido são preparados por uma modificação de procedimentos descrita por Schrammei j er, et al., (Schrammei j er, et al.f (1990) Plant Cell Rep. 9:55-60). Sementes são embebidas em água destilada por 60 minutos após o procedimento de esterilização da superfície. Os cotilédones de cada semente são, então, quebrados, produzindo uma fratura limpa no plano do eixo embriogênico. Após a excisão da ponta da raiz, os explantes são bisseccionados longitudinalmente entre as folhas primordiais. As duas metades são colocadas, cortadas com a superfície para cima, em meio GBA consistindo de Murashige and Skoog elementos minerais (Murashige, et al., (1962) Physiol. Plant., 15:473-497), adições de vitamina de Shepard (Shepard (1980) Emergent Techniques for the Genetic Improvement of Crops University of Minnesota Press, St. Paul, Minnesota), adenina sulfato 40 mg/1, sacarose 30 g/1, 6-benzil-aminopurina (BAP) 0,5 mg/1, ácido índolo-3-acético (IAA) 0,25 mg/1, ácido giberélico (GA3) , pH 5,6, e Phytagar 8 g/1.

Os explantes são sujeitos a bombardeamento por microprojéteis antes do tratamento com Agrobacterium (Bidney, et al.f (1992) Plant Mol. Biol. 18:301-313). De trinta a quarenta explantes são colocados em um circulo no centro de uma placa de 60 X 20 mm para este tratamento. Aproximadamente 4,7 mg de microprojéteis de tungstênio de 1,8 mm são ressuspensos em 25 ml de tampão TE estéril (10 mM Tris HC1, 1 mM EDTA, pH 8,0) e alíquotas de 1,5 ml são usadas por bombardeamento. Cada placa é bombardeada duas vezes através de uma tela nytex de 150 mm posicionada 2 cm acima das amostras em um dispositivo de aceleração de partículas PDS 1000®.

Agrobacterium tumefaciens linhagem EHA105 desarmada é usada em todos os experimentos de transformação. Um vetor de plasmídeo binário compreendendo o cassete de expressão que contém o gene ARGOS operacionalmente ligado ao promotor de ubiquitina é introduzido em Agrobacterium linhagem EHA105 via congelamento e descongelamento como descrito por Holsters, et al., (1978) Mol. Gen. Genet. 163:181-187. Esse plasmídio compreende ainda um gene marcador de seleção para canamicina (i.e., nptll) . As bactérias para experimentos de transformação vegetal são cultivadas de um dia para o outro (28°C e 100 RPM de agitação continua) em meio liquido YEP (estrato de levedura a 10 gm/1, Bactopeptona a 10 gm/1, e NaCl a 5 gm/1, pH 7,0) com os antibióticos apropriados necessários para manutenção de linhagem bacteriana e plasmídio binário. A suspensão é usada quando alcança uma OD60o de cerca de 0,4 a 0,8. As células de Agrobacterium são empelotadas e ressuspendidas a uma OD60o final de 0,5 em um meio de inoculação compreendido de MES 12,5 mM pH 5,7, NH4C1 1 gm/1, e MgS04 0, 3 gm/1.

Explantes frescos bombardeados são colocados em uma suspensão de Agrobacterium, misturados, e deixados sem perturbação por 30 minutos. Os explantes são, então, transferidos para meio GBA e co-cultivados, cortados com a superfície para baixo, a 26°C e dias de 18 horas. Após três dias de co-cultivo, os explantes são transferidos para 374B (meio GBA sem reguladores de crescimento e um nível reduzido de sacarose de 1%) suplementado com cefotaxima 250 mg/1 e sulfato de canamicina 50 mg/1. Os explantes são cultivados por duas a cinco semanas em seleção e, então, transferidos para meio fresco 374B sem canamicina por uma a duas semanas de desenvolvimento continuado. Explantes com áreas de crescimento diferenciadas resistentes a antibióticos que não produziram brotos adequados para excisão são transferidos para meio GBA contendo 250 mg/1 cefotaxime por um segundo tratamento de 3 dias com fito hormônio. Amostras de folhas de brotos verdes resistentes a canamicina são testadas para a presença de NPTII por ELISA e para a presença de expressão transgene testando-se para modulação em desenvolvimento meristemático (i.e., uma alteração de tamanho e aparência de broto e meristemas florais) .

Brotos positivos para NPTII são transplantados para estoque de raiz de plântulas de girassol Pioneer® hybrid 6440 cultivadas in vitro. Sementes com a superfície esterilizada são germinadas em meio 48-0 (sais Murashige and Skoog meia-força, sacarose 0,5%, gelrite 0,3%, pH 5,6) e cultivadas sob condições descritas para cultivo de explantes. A porção superior da plântula é removida, uma fatia vertical de 1 cm é feita no hipocótilo, e o broto transformado inserido no corte. A área toda é embalada com parafilme para segurar o broto. Plantas enxertadas podem ser transferidas para solo após uma semana de cultivo in vitro. Enxertos em solo são mantidos sob condições de alta umidade, seguido por uma aclimatação lenta ao ambiente de estufa. Setores transformados de plantas T0 (geração parental) amadurecendo na estufa são identificados por NPTII ELISA e/ou por análise de atividade de ARGOS de extratos de folha, enquanto sementes transgênicas colhidas de plantas To positivas para NPTII são identificadas por análise de atividade de ARGOS de pequenas porções de cotilédone de semente seca.

Um protocolo de transformação de girassol alternativo permite a recuperação de progênie transgênica sem o uso de pressão de seleção química. Sementes são debulhadas e têm a superfície esterilizada por 20 minutos em uma solução alvejante de Clorox 20% com a adição de duas a três gotas de Tween 20 por 100 ml de solução, então enxaguadas três vezes com água destilada. Sementes esterilizadas são embebidas no escuro a 26°C por 20 horas em filtro de papel molhado com água. Os cotilédones e radicais de raiz são removidos, e os explantes de meristema são cultivados em 374E (meio GBA consistindo de sais MS, vitaminas Shepard, sulfato de adenina 40 mg/1, sacarose 3%, 6-BAP 0,5 mg/1, IAA 0,25 mg/1, GA 0,1 mg/1, e Phytagar 0,8% em pH 5,6) por 24 horas no escuro. As folhas primárias são removidas para expor o meristema apical, em torno de 40 explantes são colocados com a cúpula apical voltadas para cima em um círculo de 2 cm no centro de 37 4M (meio GBA com Phytagar a 1,2%), e, então, cultivados em meio por 24 horas no escuro.

Aproximadamente 18,8 mg de partículas de tungstênio de 1,8 μπι são ressuspensos em 150 μΐ de etanol absoluto. Após a sonicação, 8 μΐ são colocados no centro da superfície do macrocarregador. Cada placa é bombardeada duas vezes com discos de ruptura a 650 psi na primeira estante a 26 mm de Hg de vácuo de hélio. O plasmídeo de interesse é introduzido em Agrobacterium tumefaciens linhagem EHA105 via congelamento e descongelamento como descrito previamente. A pelota de bactérias cultivada de um dia para o outro a 28 °C em um meio líquido YEP (extrato de leveduras 10 g/1, Bactopeptona 10 g/1, e NaCl 5 g/1, pH 7,0) na presença de canamicina 50 pg/l é ressuspendida em um meio de inoculação (ácido etanossulfônico 12,5 mM 2-mM 2-(N-morpholino), MES, NH4C1 1 g/1 e MgS04 0,3 g/1 em pH 5,7) para alcançar uma concentração final de 4,0 em OD 600. Explantes bombardeados com partículas são transferidos para meio GBA (374E), e uma gotícula de suspensão de bactérias é colocada diretamente em cima do meristema. Os explantes são co-cultivados em meio por 4 dias, após os quais os explantes são transferidos para meio 374C (GBA com sacarose 1% e sem BAP, IAA, GA3 e suplementado com cefotaxime 250 pg/ml) . As plântulas são cultivadas no meio por cerca de duas semanas sob dias condições de incubação de 16 horas e 26°C.

Explantes (em torno de 2 cm de comprimento) de cultura de duas semanas em meio 374C são rastreados para uma desenvolvimento de meristema (i.e., uma alteração de tamanho e aparência de broto e meristemas florais). Após explantes positivos serem identificados (i.e., uma mudança na expressão de ARGOS), aqueles brotos que falharam em exibir atividade de ARGOS são descartados, e cada explante positivo é subdividido em explantes nodais. Um explante nodal contém pelo menos um nodo potencial. Os segmentos nodais são cultivados em meio GBA por três a quatro dias para promover a formação de botões auxiliares a partir de cada nodo. Então, eles são transferidos para meio 374C e deixados se desenvolver por quatro semanas adicionais. Botões em desenvolvimento são separados e cultivados por quatro semanas adicionais em meio 374C. Amostras de folhas tiradas de cada broto recém recuperado são rastreadas novamente pelo teste de atividade de proteína apropriado. Neste momento, os brotos positivos recuperados a partir de um único nodo terão sido geralmente enriquecidos no setor transgênico detectado no teste inicial antes da cultura nodal.

Brotos recuperados positivos para expressão de ARGOS alterada são enxertados para estoque de raiz de plântulas de girassol Pioneer hybríd 6440 cultivadas in vitro. Os estoques de raiz são preparados da seguinte maneira.

Sementes são debulhadas e têm a superfície esterilizada por 20 minutos em uma solução alvejante de Clorox 20% com a adição de duas a três gotas de Tween 20 por 100 ml de solução, e são enxaguadas três vezes com água destilada. As sementes esterilizadas são germinadas no filtro molhado com água por três dias, então, elas são transferidas em meio 48 (sal MS meia-força, sacarose 0,5%, gelrite 0,3% pH 5,0) e cultivadas a 26°C no escuro por três dias, então incubadas em condições de cultivo de dias de 16 horas. A porção superior de plântulas selecionadas é removida, uma fatia vertical é feita em cada hipocótilo, e um broto transformado é inserido em um corte em V. A área de corte é embalada com parafilme. Após uma semana de cultivo no meio, as plantas enxertadas são transferidas para solo.

Nas primeiras duas semanas, elas são mantidas sob condições de alta umidade para se aclimatar a um ambiente de estufa.

Exemplo 9. Variantes de seqüências ARGOS A. Sequências de nucleotídeos variantes de ARGOS que não alteram a sequência de aminoácidos codificada As seqüências de nucleotídeos de ARGOS são usadas para gerar seqüências de nucleotídeos variantes tendo a seqüência de nucleotídeos do quadro de iniciação de leitura com cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90% e 95% de identidade de seqüência de nucleotídeo quando comparada à seqüência de nucleotídeos de ORF não alterado da SEQ ID NO correspondente. Esses variantes funcionais são gerados usando uma tabela de códon padrão. Enquanto a seqüência de nucleotídeos dos variantes são alterados, a seqüência de aminoácidos codificada pelos quadros de iniciação de leitura não mudam.

B. Seqüências de aminoácidos variantes de polipeptídeos ARGOS

Seqüências de aminoácidos variantes dos polipeptídeos ARGOS são geradas. Neste exemplo, um aminoácido é alterado. Especificamente, os quadros de iniciação de leitura são revisados para determinar a alteração de aminoácido apropriada. A seleção do aminoácido a ser mudado é feita consultando o alinhamento de proteína (com os outros ortóologos e outros membros da família de genes de várias espécies). Um aminoácido é selecionado o qual se supões não estar sob alta pressão de seleção (não altamente conservado) e que é, ao contrário, facilmente substituído por um aminoácido com características químicas similares (i.e., cadeia lateral funcional similar). Usando o alinhamento de proteína apresentado na Figura 2, um aminoácido apropriado pode ser mudado. Uma vez o aminoácido visado é identificado, o procedimento destacado na seção C, a seguir, é seguido. Variantes tendo cerca de 70%, 75%, 80%, 85%, 90% e 95% de identidade de seqüência de ácidos nucléicos são gerados usando este método.

C. Sequências de aminoácidos variantes adicionais de polipeptídeos ARGOS

Neste exemplo, seqüências de proteínas artificiais são criadas tendo 80%, 85%, 90% e 95% de identidade em relação à seqüência de proteínas referência. Este último esforço requer identificar regiões conservadas e variáveis a partir do alinhamento apresentado na Figura 2 e, então, a aplicação judiciosa de uma tabela de substituições de aminoácidos. Estas partes serão discutidas em mais detalhes abaixo.

Amplamente, a determinação de quais seqüências de aminoácidos são alteradas é feita baseada nas regiões conservadas entre proteína ARGOS ou entre os outros polipeptídeos ARGOS. Baseado no alinhamento de seqüência, as várias regiões do polipeptideo ARGOS que podem ser provavelmente alteradas estão representadas em letras minúsculas, enquanto as regiões conservadas estão representadas por letras maiúsculas. É reconhecido que substituições conservadas podem ser feitas nas regiões conservadas abaixo sem alterar a função. Além disso, um especialista entenderá que variantes funcionais da seqüência ARGOS da invenção podem ter alterações de aminoácidos não conservadas menores no domínio conservado.

Seqüências de proteínas artificiais são, então, criadas, as quais são diferentes da original nos intervalos de 80-85%, 85-90%, 90-95% e 95-100% de identidade. Pontos médios desses intervalos são visados, com amplitude liberal de mais ou menos 1%, por exemplo. As substituições de aminoácidos serão efetuadas por um Perl script padrão. A tabela de substituições é provida abaixo na Tabela 3.

Tabela 3. Tabela de substituições Primeiro, quaisquer aminoácidos conservados na proteína que não deveríam ser mudados são identificados e "cortados" para insulação da substituição. A metionina de inicio será, obviamente, adicionada a esta lista automaticamente. Em seguida, as mudanças são feitas. H, C e P não são mudados em qualquer circunstância. As mudanças ocorrerão, primeiro, com isoleucina, varrendo do N-terminal para C-terminal. Então, leucina, e dai para o final da lista até o que alvo desejado seja alcançado. Numerosas substituições interinas podem ser feitas de forma a não causar a reversão de mudanças. A lista é ordenada de 1-17, então começa com tantas mudanças de isoleucina como necessário antes de leucina, e dai até metionina. Claramente, vários aminoácidos não precisarão, desta maneira, ser mudados. L, I e V envolverão uma substituição 50:50 das duas substituições ótimas alternativas.

As seqüências de aminoácidos variantes são escritas como resultado. Perl script é usado para calcular as identidades percentuais. Usando esse procedimento, variantes dos polipeptideos ARGOS são gerados tendo cerca de 80%, 85%, 90% e 95% de identidade de aminoácidos em relação à seqüência de nucleotideos inicial de ORF não alterado de SEQ ID NOS: 1, 3, 5 e 40-71.

Todas as publicações e aplicações de patentes nesta especificação são indicativas do nivel daqueles especialistas na técnica a qual esta invenção pertence. Todas as publicações e aplicações de patentes são aqui incorporadas por referência na mesma extensão como se cada publicação ou aplicação de patente individual fosse especificamente e individualmente indicada por referência. A invenção foi descrita com referência a vários avanços e técnicas especificas e preferenciais. Contudo, deveria ser entendido que várias mudanças e modificações podem ser feitas permanecendo no espirito e escopo da invenção.

REIVINDICAÇÕES

Claims

1. Método para aumentar o rendimento do grão de uma planta de milho, caracterizado pelo fato de que o método compreende: a. introduzir em uma célula vegetal de milho, um cassete de expressão recombinante que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo operacionalmente ligado a um elemento regulador heterólogo na planta, em que o polipeptideo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 11; b. cultivar a célula vegetal de milho sob condições de crescimento de célula vegetal; e c. regenerar uma planta de milho a partir da referida célula vegetal de milho, resultando em uma planta de milho com rendimento aumentado do grão da planta de milho comparada a uma planta controle.

2. Método para aumentar o rendimento do grão de uma planta de milho sob condições de seca, caracterizado pelo fato de que o método compreende: a. introduzir em uma célula vegetal de milho sob condições de seca, um cassete de expressão recombinante que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptideo operacionalmente ligado a um elemento regulador heterólogo na planta, em que o polipeptideo compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95% idêntica à SEQ ID NO: 11; b. cultivar a célula vegetal de milho sob condições de crescimento de célula vegetal; e c. regenerar uma planta de milho sob condições de seca a partir da referida célula vegetal de milho, resultando em uma planta de milho sob condições de seca com rendimento aumentado do grão da planta de milho comparada a uma planta controle.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.

4. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o polipeptideo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 11.