CN107435046A - 一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法 - Google Patents

一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法，克隆了谷子SiARGOS基因编码区及其启动子序列，序列分析发现SiARGOS基因开放阅读框342bp，编码114个氨基酸，其蛋白具有农作物ARGOS蛋白典型的富含亮氨酸结构域，启动子区域2109bp，含有与生长素、乙烯、茉莉酸和赤霉素等多种植物激素调控有关的元件。系统发育分析表明，谷子ARGOS蛋白跟玉米ARGOS蛋白同源性最高。表达分析发现，SiARGOS基因在晋29A，K186及其杂种F1的根中表达水平差异很大。SiARGOS基因等位变异分析发现，SiARGOS基因ORF存在1个SNP，启动子区存在19个SNP和2个InDel，共发现4个单倍型，我们开发了三个功能标记，其中包括1个CAPS标记和2个SSR标记。

Description

一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发 方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法。
背景技术
作物产量性状与植株器官大小存在密切关系，植物器官大小除受光照、温度、营养和激素等外境环境条件影响外，主要受基因表达和信号转导等遗传因子调控，研究认为，细胞总数目的增加和单细胞体积增大两个连续并相关的过程控制植物器官的大小，而植物器官大小在不同物种中差异显著但在物种内个体之间却相对一致，说明器官发育过程中，细胞分裂受到遗传物质的严格控制。
前人已经克隆和研究了许多控制植物器官大小的相关基因，如ANT、ARF2、ARGOS、AtTOR、AtEBP1、BB和KLUH等，其中，ARGOS基因在拟南芥、水稻、玉米、大白菜、萝卜、紫花苜蓿中通过调控细胞数目或细胞体积来调节植物器官大小。2003年，在拟南芥中首次发现了ARGOS基因，该基因受生长素上调表达并通过“auxin→AXR1基因→ARGOS基因→ANT基因”信号通路实现细胞增殖和器官生长的调节；水稻OsARGOS基因也受生长素诱导上调表达，转基因植株侧生器官的花和叶片变大，角果数目和种子数量增多；玉米ZmARGOS受乙烯下调表达并参与器官大小的调控，拟南芥转基因植株抗旱性提高，ZmARGOS8基因超表达，转ZmARGOS8基因玉米产量大幅提高。目前，谷子ARGOS基因及其启动子研究尚无报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法。用同源克隆方法获得了谷子SiARGOS基因编码区及其启动子序列，用生物信息学方法分析了SiARGOS基因蛋白序列和启动子的顺式作用元件，采用荧光定量PCR方法分析了SiARGOS基因在谷子杂种中的表达差异，还对该基因编码区及其启动子序列进行了SNP和单倍型分析，同时开发了3个SiARGOS基因功能标记。
其具体技术方案为：
一种谷子SIARGOS基因的克隆方法，包括以下步骤：
通过拟南芥ARGOS的mRNA序列，在phtozome网站blast，得到谷子中的ARGOS序列，编号Si027037m，根据此序列，采用软件Primer Premier5.O设计包含该基因ORF的引物Siargos，引物序列为：Siargos-1F：ACAAATCCCCACCCTTGTCA，Siargos-1R：ACTCCTGAAAAGATGCTTCACA，以晋29A和K186的cDNA为模板，扩增得到PCR产物，经克隆测序后得到目标序列。PCR扩增总体积20μL包括：模板2μL，2×GC Buffer 10μL，10mmol/L dNTPs0.4μL，2μmol/L特异引物4μL，rTaq DNA聚合酶0.2μL，双蒸水4μL。PCR扩增程序：首先，95℃预变性3min；然后，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测。
根据phtozome网站序号Si027037m，将该基因向上游延伸约2kb，用软件PrimerPremier5.0设计启动子区PCR引物Argos-Pro，引物序列为：Argos-Pro-F：CTCTGTCGTCTGCAAGCAA和Argos-Pro-R：ACTGACAAGGGTGGGGATTT，以晋29A和K186基因组DNA为模板，扩增体系和条件(除退火温度和延伸时间改为60℃退火30s，72℃延伸2min)同上，扩增得到PCR产物，经克隆测序获得该基因启动子区序列。将获得启动子序列提交到PlantCARE，进行顺式作用元件的预测。
一种SiARGOS基因的表达分析方法，包括以下步骤：
蛋白比对采用DNAMAN软件，同源进化分析采用MEGA5生成无根进化树，进化树生成采用邻接法。
分别取晋29A、K186和“晋29AxK186”杂种F13d-9d的根系置于液氮中，提取RNA反转录后，采用Bio-Rad C1000 cycler real time PCR system进行实时荧光定量PCR分析。实时定量引物为SiArgos-RT-F：TTGCGTCGACTTACTTCAGC，SiArgos-RT-R：CATGCTCCTCACATCGGTTG。以谷子ACTIN基因作为对照(SiActin-F：TTCCCTGGTATTGCTGACCG，SiActin-R：CTCACCCTTCGAGATCCACA)。反应总体积10μL，包括：1/10cDNAtemplate(反转录第一链)1μL，SYBR Premix Ex Taq(DRR041D)5μL，2μmol/L特异引物1μL，ddH2O 3μL。RT-PCR扩增程序：首先，94℃预变性5min；然后，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。65℃-98℃绘制溶解曲线。采用比较阈值法进行定量分析，手工设定荧光阈值，确定循环数Ct值，根据Ct值，计算个样本的C值，C＝2-ΔCt，ΔCt＝Ct目标基因-Ct内标基因。实验设置3次生物学重复并采用双尾等方差t检验的方法进行显著性检验(P＜0.05)。
一种SiARGOS基因功能标记的开发方法，包括以下步骤：
对19份谷子材料进行基因编码区及启动子全长测序，用引物Siargos和Argos-Pro分别进行SiARGOS基因编码区和启动子扩增，用PCR产物进行克隆测序，利用DNAstar软件系统的Sequman、Editseq和MegAlign软件包进行DNA序列的分析，包括拼接、整理与SNP和单倍型分析。引物Siargos的扩增产物经限制性内切酶Acc II(CGˇCG)酶切后的片段差异，用于检测151bp位点的碱基差异；根据启动子区2处插入和缺失设计SSR引物AP-1和AP-2，用于启动子区的单倍型分型，其中AP-1-F：AGATGACTCTAAAGGGCATCG，AP-1-R：CAAGGGCAGCAGTGTTTTC；AP-2-F：GTCTTTTGGGATTGTGTCATC，AP-2-R：TGACTAATGTGGTACGGGTC。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明克隆了谷子SiARGOS基因编码区及其启动子序列，序列分析发现SiARGOS基因开放阅读框342bp，编码114个氨基酸，其蛋白具有农作物ARGOS蛋白典型的富含亮氨酸结构域，启动子区域2109bp，含有与生长素、乙烯、茉莉酸和赤霉素等多种植物激素调控有关的元件。系统发育分析表明，谷子ARGOS蛋白跟玉米ARGOS蛋白同源性最高。表达分析发现，SiARGOS基因在晋29A，K186及其杂种F1的根中表达水平差异很大。SiARGOS基因等位变异分析发现，SiARGOS基因ORF存在1个SNP，启动子区存在19个SNP和2个InDel，共发现4个单倍型，开发了三个功能标记，其中包括1个CAPS标记和2个SSR标记。
附图说明
图1 SiARGOS基因及其启动子的扩增图谱，其中，A为SiARGOS基因的扩增，M：100bpDNA marker；1：晋29A；2：K186；B为SiARGOS启动子的扩增，M：200bp DNA marker；1：晋29A；2：K186。
图2 SiARGOS和其它植物ARGOS氨基酸一级结构的比对分析；
图3 ARGOS的系统进化树；
图4晋29A，K186和F1不同天数的根系长度；
图5SiARGOS在4d和6d根系中的表达，其中，图5A为晋29A，K 186及其F1在4d 的表达，图5B为晋29A，K 186及其F1在6d的表达；
图6 SiARGOS基因的标记开发；
图7SiARGOS基因CAPS标记和启动子区SSR标记的开发；其中，A：SiARGOS SNP(C/G)位点限制性内切酶Acc II酶切位点的CAPS标记，M：DNA marker；1-6分别为：蒙选5084，长农35号，沙湾谷子，山东-5，晋29A，K186；B和C分别为SSR标记AP-1和AP-2，M：DNA marker；1-19分别为：矮宁黄，沙湾谷子，米优，河北十里香，张8311-13，ISE-4，冷生-1，品资15，钱串子，长农35号，山东-5，蒙选5084，长穗7，黑毛谷，吉林金谷2号，蒙金谷1号，石96355，高146A。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1材料和方法
1.1植物材料、种植与取样
用于基因及其启动子克隆的谷子品种：晋29A和K186，种植方式：每材料种植1行于试验田，行长2.5米，行距33cm，取样时期：拔节期幼叶；用于基因SNP和单倍型分析的谷子品种共19份：矮宁黄、沙湾谷子、米优、河北十里香、张8311-13、ISE-4，冷生-1、品资15、钱串子、长农35号、山东-5、蒙选5084、长穗7、黑毛谷、吉林金谷2号、蒙金谷1号、石96355、高146A，种植方式与取样时期同上；用于表型鉴定和基因表达的谷子品种：晋29A、K186和‘晋29AxK186’杂种F1，种植方式：将晋29A，K186和‘晋29A x K186’杂种F1种子播到装有蛭石种植钵中，观察晋29A，K186及其杂种F1在3-9天时根的生长情况，并适时用水冲干净根后测量、取样，观察双亲及杂种表型差异，并分别取样保存备用。
1.2 SiARGOS全长cDNA克隆
通过文献中获取的拟南芥ARGOS的mRNA序列，在phtozome(http：//www.phytozome.net/search.php)网站blast，得到谷子中的ARGOS序列，编号Si027037m，根据此序列，采用软件Primer Premier5.0设计包含该基因ORF的引物Siargos，引物序列为：Siargos-1F：ACAAATCCCCACCCTTGTCA，Siargos-1R：ACTCCTGAAAAGATGCTTCACA，以晋29A和K186的cDNA为模板，扩增得到PCR产物，经克隆测序后得到目标序列。PCR扩增总体积20μL包括：模板2μL，2×GC Buffer 10μL，10mmol/L dNTPs 0.4μL，2μmol/L特异引物4μL，rTaq DNA聚合酶0.2μL，双蒸水4μL。PCR扩增程序：首先，95℃预变性3min；然后，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存。取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测。
1.3 SiARGOS基因启动子克隆
根据phtozome(http：//www.phytozome.net/search.php)网站序号Si027037m，将该基因向上游延伸约2kb，用软件Primer Premier5.0设计启动子区PCR引物Argos-Pro，引物序列为：Argos-Pro-F：CTCTGTCGTCTGCAAGCAA和Argos-Pro-R：ACTGACAAGGGTGGGGATTT，以晋29A和K186基因组DNA为模板，扩增体系和条件(除退火温度和延伸时间改为60℃退火30s，72℃延伸2min)同上，扩增得到PCR产物，经克隆测序获得该基因启动子区序列。将获得启动子序列提交到PlantCARE(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，进行顺式作用元件的预测。
1.4 SiARGOS基因生物信息学分析
蛋白比对采用DNAMAN软件，同源进化分析采用MEGA5生成无根进化树，进化树生成采用邻接法。
1.5实时定量PCR分析
分别取晋29A、K186和“晋29AxK186”杂种F13d-9d的根系置于液氮中，提取RNA反转录后，采用Bio-Rad C1000 cycler real time PCR system进行实时荧光定量PCR分析。实时定量引物为SiArgos-RT-F：TTGCGTCGACTTACTTCAGC，SiArgos-RT-R：CATGCTCCTCACATCGGTTG。以谷子ACTIN基因作为对照(SiActin-F：TTCCCTGGTATTGCTGACCG，SiActin-R：CTCACCCTTCGAGATCCACA)。反应总体积10μL，包括：1/1O cDNA template(反转录第一链)1μL，SYBR Premix Ex Taq(DRR041D)5μL，2umol/L特异引物1μL，ddH2O 3μL。RT-PCR扩增程序：首先，94℃预变性5min；然后，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min。65℃-98℃绘制溶解曲线。采用比较阈值法进行定量分析，手工设定荧光阈值，确定循环数Ct值，根据Ct值，计算个样本的C值，C＝2-ΔCt，ACt＝Ct目标基因-Ct内标基因。实验设置3次生物学重复并采用双尾等方差t检验的方法进行显著性检验(P＜0.05)。
1.6 SNP和单倍型分析及功能标记开发
对19份谷子材料进行基因编码区及启动子全长测序，用引物Siargos和Argos-Pro分别进行SiARGOS基因编码区和启动子扩增，用PCR产物进行克隆测序，利用DNAstar软件系统的Sequman、Editseq和MegAlign软件包进行DNA序列的分析，包括拼接、整理与SNP和单倍型分析。引物Siargos的扩增产物经限制性内切酶Acc II(CGˇCG)酶切后的片段差异，用于检测151bp位点的碱基差异；根据启动子区2处插入和缺失发计SSR引物AP-1和AP-2，用于启动子区的单倍型分型，其中AP-1-F：AGATGACTCTAAAGGGCATCG，AP-1-R：CAAGGGCAGCAGTGTTTTC；AP-2-F：GTCTTTTGGGATTGTGTCATC，AP-2-R：TGACTAATGTGGTACGGGTC。
2结果与分析
2.1 SiARGOS基因编码区克隆
以晋29A和K186的cDNA为模板，用引物Siargos进行扩增，获得两条特异性条带，长度为491bp(图1A)，经克隆测序后发现ARGOS基因的ORF为342bp，同时，用相同引物在基因组DNA中的扩增产物也为491bp，序列一致，说明该基因没有内含子，这与拟南芥，水稻和玉米中报道的结果一致。核苷酸序列比对结果显示该基因编码区序列在晋29A和K186中没有差异。
2.2 SiARGOS基因生物信息学分析
氨基酸结构分析结果表明，SiARGOS基因编码144个氨基酸，SiARGOS具有富亮氨酸的典型结构域(图2)，将得到的谷子(Si)ARGOS蛋白与玉米(Zm)、小麦(Ta)、大麦(HV)、番茄(S1)、马铃薯(St)、大豆(Gm)和拟南芥(At)中的ARGOS蛋白进行了蛋白比对(图2)以及进化树分析(图3)，结果表明谷子ARGOS蛋白与玉米ARGOS蛋白同源性最高。
2.3 SiARGOS基因启动子的克隆和分析
为了进一步了解SiARGOS基因的表达调控机制，我们克隆得到了SiARGOS基因起始密码子前2109bp启动子序列(图1B)，采用PlantCARE对SiARGOS基因起始密码子(ATG)上游的2109bp片段进行了分析，发现该序列含有真核生物启动子的典型元件CAAT-box(19个)和TATA-box(6个)，能够与起始转录的转录因子结合；该区域存在AE-box、Box II、G-box、GTGGC-motif和Sp1等5个与光反应有关的元件；AP-2-like、CGTCA-motif(3个)、GARE-motif和TGA-element，它们是与乙烯、茉莉酸、赤霉素和生长素相关的转录因子的结合位点；GCN4-motif和Skn-1-motif(4个)是与胚乳表达相关的顺式作用元件；另外还存在其它转录因子结合的位点(表1)。
表1 SiARGOS启动子的调控区域预测分析
2.4 SiARGOS在晋29A，K186和F1幼苗根中的表达分析
在晋29A，K186及其F1中幼苗根长的生长发育表现出一定规律性，测量分析结果表明，从培养3d时开始测量，4d时杂种F1根长表现超亲优势，随着天数的增加，逐渐表现中亲优势(图4)。实时定量PCR结果显示SiARGOS在6d较4d时的表达量升高，在晋29A中的表达量比K186高，且杂种表现超亲优势(图5)，表达量与4d的双亲和杂种根系伸长规律是一致的，但与杂种6d的根系伸长表现中亲优势并不完全耦合，但是，在7d和9d中晋29A中的表达量比K186高，杂种表现出中亲优势，与杂种根系伸长规律又相吻合。SiARGOS基因在晋29A和K186中编码区并无差异，但其在根系中的表达水平却有很大差异，且与双亲和杂种根系伸长增大规律并不完全耦合，暗示在根系伸长过程中，在晋29A、K186及其杂种中SiARGOS基因表达受到复杂机制的调控。
2.5 SiARGOS基因的SNP和单倍型分析及标记开发
我们对19份谷子材料进行了SiARGOS基因编码区及其启动子测序，结果发现有2份材料在该基因编码区151bp(起始密码子83bp)处存在一个SNP(C/G)，导致该基因第28个氨基酸发生突变(Ala/Gly)，该碱基差异导致酶切位点Acc II(CGˇCG)发生变化(CGCG/CGGG，后者序列Acc II不能识别)，据此我们设计了一个CAPS标记(图6)。用引物Siargos对材料进行扩增，扩增长度为491bp，扩增产物经AccII酶切后，获得两种基因型，一种为(CGCG)基因型，将其命名为Hap-Ag-C，酶切不能被切开，酶切产物片段大小仍为491bp，另一种为(CGGG)基因型，将其命名为Hap-Ag-G，经酶切产生340bp和151bp两个片段(图7A)。
SiARGOS基因启动子区共存在19处SNP和2处插入和缺失(表2)，将材料分为4种单倍型Hap-AP1，Hap-AP2，Hap-AP3和Hap-AP4(表2)，4种单倍型的频率分别为5.26％、31.58％、36.84％和26.32％。根据启动子区-1652～-1651处(TA)2/3和-1165～-1163处(TCA)1/2的序列差异分别设计SSR引物AP-1和AP-2(图6)，用于启动子区的单倍型分型检测。AP-1(图7B)与AP-2(图7C)在4种单倍型Hap-AP1，Hap-AP2，Hap-AP3和Hap-AP4中的扩增条带分别为208bp与262bp，206bp与259bp，208bp与259bp和206bp与262bp。
表2 SiARGOS启动子序列的单倍型
3结论
本发明从谷子中克隆了SiARGOS基因编码区及其启动子序列，序列比对证实，SiARGOS与玉米ZmARGOS同源。启动子区域含有与植物激素、光周期及胚乳表达有关的元件。该基因在晋29A，K186及其杂种F14d和6d根中的表达显示，杂种F1表现超亲优势。在SiARGOS基因编码区和启动子区分别开发1个CAPS标记和2个SSR标记。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.一种谷子SIARGOS基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过拟南芥ARGOS的mRNA序列，在phtozome网站blast，得到谷子中的ARGOS序列，编号Si027037m，根据此序列，采用软件Primer Premier5.0设计包含该基因ORF的引物Siargos，引物序列为：Siargos-1F：ACAAATCCCCACCCTTGTCA，Siargos-1R：ACTCCTGAAAAGATGCTTCACA，以晋29A和K186的cDNA为模板，扩增得到PCR产物，经克隆测序后得到目标序列；PCR扩增总体积20μL包括：模板2μL，2×GC Buffer10μL，10mmol/L dNTPs0.4μL，2μmol/L特异引物4μL，rTaq DNA聚合酶0.2μL，双蒸水4μL；PCR扩增程序：首先，95℃预变性3min；然后，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测；
根据phtozome网站序号Si027037m，将该基因向上游延伸2kb，用软件PrimerPremier5.0设计启动子区PCR引物Argos-Pro，引物序列为：Argos-Pro-F：CTCTGTCGTCTGCAAGCAA和Argos-Pro-R：ACTGACAAGGGTGGGGATTT，以晋29A和K186基因组DNA为模板，扩增体系和条件：除退火温度和延伸时间改为60℃退火30s，72℃延伸2min，扩增得到PCR产物，经克隆测序获得该基因启动子区序列：将获得启动子序列提交到PlantCARE，进行顺式作用元件的预测。
2.一种SiARGOS基因的表达分析方法，其特征在于，包括以下步骤：
蛋白比对采用DNAMAN软件，同源进化分析采用MEGA5生成无根进化树，进化树生成采用邻接法；
分别取晋29A、K186和“晋29AxK186”杂种F13d-9d的根系置于液氮中，提取RNA反转录后，采用Bio-Rad C1000cycler real time PCR system进行实时荧光定量PCR分析；实时定量引物为SiArgos-RT-F：TTGCGTCGACTTACTTCAGC，SiArgos-RT-R：CATGCTCCTCACATCGGTTG；以谷子ACTIN基因作为对照(SiActin-F：TTCCCTGGTATTGCTGACCG，SiActin-R：CTCACCCTTCGAGATCCACA)；反应总体积10μL，包括：1/10cDNA template1μL，SYBR Premix ExTaq5μL，2μmol/L特异引物1μL，ddH2O3μL；RT-PCR扩增程序：首先，94℃预变性5min；然后，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸5min；65℃-98℃绘制溶解曲线；采用比较阈值法进行定量分析，手工设定荧光阈值，确定循环数Ct值，根据Ct值，计算个样本的C值，C＝2-ΔCt，ΔCt＝Ct目标基因-Ct内标基因；实验设置3次生物学重复并采用双尾等方差t检验的方法进行显著性检验。
3.一种SiARGOS基因功能标记的开发方法，其特征在于，包括以下步骤：
对19份谷子材料进行基因编码区及启动子全长测序，用引物Siargos和Argos-Pro分别进行SiARGOS基因编码区和启动子扩增，用PCR产物进行克隆测序，利用DNAstar软件系统的Sequman、Editseq和MegAlign软件包进行DNA序列的分析，包括拼接、整理与SNP和单倍型分析；引物Siargos的扩增产物经限制性内切酶Acc II酶切后的片段差异，用于检测151bp位点的碱基差异；根据启动子区2处插入和缺失设计SSR引物AP-1和AP-2，用于启动子区的单倍型分型，其中AP-1-F：AGATGACTCTAAAGGGCATCG，AP-1-R：CAAGGGCAGCAGTGTTTTC；AP-2-F：GTCTTTTGGGATTGTGTCATC，AP-2-R：TGACTAATGTGGTACGGGTC。
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