CN104774854B - 一个簇毛麦丝裂原活化蛋白激酶基因及其表达载体和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一个簇毛麦丝裂原活化蛋白激酶基因Hv‑MPK12及其所编码的蛋白质，属于基因工程领域。Hv‑MPK12的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。该基因来自二倍体簇毛麦(Haynaldia villosa,L.,2n＝2x＝14,基因组VV)，在抗白粉病二倍体簇毛麦中受白粉菌诱导表达增强。将该基因转化感病小麦品种扬麦158，结果表明Hv‑MPK12基因的过量表达可以增强扬麦158对小麦白粉病的抗性。因此，Hv‑MPK12可望用于基因工程育种，将其导入易感白粉病小麦品种中，有望提高小麦的白粉病抗性。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，公开了一个簇毛麦丝裂原活化蛋白激酶基因Hv-MPK12及其表达载体和应用。
背景技术：
小麦是我国乃至世界最重要的粮食作物之一，其生长发育却受多种非生物和生物胁迫。由小麦白粉菌(Blumeria graminis f.sp tritici)引起的小麦白粉病是小麦主要的病害之一。它属于专化寄生，可以在整个生育期侵染小麦的叶部、茎秆、穗部等。其中主要危害小麦叶片，严重时影响小麦正常的光合作用，从而影响其正常的生长，降低产量。一般情况下，小麦白粉病能够引起小麦减产5-19％，严重情况下能够使小麦减产30％以上(李振岐等，1997)。从九十年代以后，全国每年小麦白粉病的发病面积在600万公顷以上，严重危害小麦生产安全，因此小麦白粉病的防治越来越受到人们的关注。选育抗白粉病小麦品种是最有效的方法，而挖掘新的抗白粉病基因及解析抗病信号途径的分子机制将为抗性基因的选育奠定基础。
以往对小麦白粉病抗性的研究主要集中在抗白粉病基因的发掘和克隆方面，虽然已经发掘到很多抗白粉病基因，但是由于小麦基因组的复杂性使得抗白粉病基因的克隆异常艰难，限制了对抗性机制的系统研究。在小麦的一个野生近缘种簇毛麦的6V染色体上具有广谱抗白粉病的主效基因Pm21，而研究Pm21基因发挥抗病作用过程中所涉及的信号转导途径基因和重要的防卫反应基因，对于了解广谱抗性的分子机理，运用基因工程手段提高小麦对白粉病的抗性具有重要意义。
发明内容：
本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种簇毛麦丝裂原活化蛋白激酶基因Hv-MPK12。
本发明的另一目的是提供该基因的表达载体。
本发明的又一目的是提供该基因和表达载体的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
丝裂原活化蛋白激酶基因Hv-MPK12，来自簇毛麦，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
该簇毛麦丝裂原活化蛋白激酶基因编码的蛋白质Hv-MPK12，其氨基酸序列为SEQID NO.2。
含有所述的簇毛麦丝裂原活化蛋白激酶基因Hv-MPK12的表达载体。
含有所述的簇毛麦丝裂原活化蛋白激酶基因Hv-MPK12的表达载体优选以pBI220-6为出发载体，将所述的Hv-MPK12基因插入pBI 220-6的BamHⅠ和KpnⅠ酶切位点间所得。
所述的簇毛麦丝裂原活化蛋白激酶基因Hv-MPK12在培育抗白粉病小麦品种中的应用。
所述的簇毛麦丝裂原活化蛋白激酶基因Hv-MPK12的表达载体在培育白粉病小麦品种中的应用。
有益效果：
本发明从簇毛麦中克隆得到了一个丝裂原活化蛋白激酶基因Hv-MPK12及其所编码的蛋白质Hv-MPK12。Hv-MPK12可用于基因工程育种，将其插入表达载体pBI 220-6，得到该基因的过量表达载体导入感病小麦品种中，可以提高感白粉病小麦品种对白粉病的抗性。
附图说明
图1 Hv-MPK12在簇毛麦叶片经白粉菌诱导后的实时定量qPCR分析
0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h分别表示白粉病菌诱导了0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h的簇毛麦叶片cDNA样品。
图2 Hv-MPK12过量表达载体构建
图3 Hv-MPK12基因转化扬麦158的T0代阳性转基因植株PCR分子鉴定结果
M:DL2000，“Y158”泳道为受体扬158对照，“-”泳道为水对照，“+”泳道为质粒对照，其余编号泳道为不同的T0代转基因植株。箭头所示为扩增出的目标基因片段。
图4转基因Hv-MPK12 T0代植株苗期白粉病鉴定
具体实施方式
实施例1簇毛麦丝裂原活化蛋白激酶基因Hv-MPK12的克隆
本实验室前期利用簇毛麦受白粉菌诱导后的cDNA样品与大麦表达谱芯片Barley1 GeneChip(http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/barley.affx)进行杂交，通过比较接种白粉菌前后抗病簇毛麦的表达谱，筛选出上调表达的基因，包括病程相关蛋白、防卫反应基因、转录因子、信号传导因子和抗病基因类似物等。根据芯片杂交结果，选择上调表达、根据抗病相关钙离子通道基因设计的探针Contig4711，经NCBI注释为一个MAPK类基因，根据大麦的cDNA库(公知公用)序列用Primer3(http:// www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3www.cgi)设计全长引物，引物对序列为P1(ATGGGGGGAGGGAACGGCAT(SEQ ID NO.3))和P2(CTAGGCATGCATCTTGGAGA(SEQ ID NO.4))对簇毛麦受白粉菌诱导24hcDNA进行PCR扩增，经过筛选得到阳性单克隆进行测序，获得Hv-MPK12基因的cDNA全长。
测序结果表明，该基因完整的开放阅读框为1521bp，序列如SEQ ID NO.1所示，编码506个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。通过对该氨基酸序列进行保守结构分析，Hv-MPK12基因推导的蛋白序列属于植物的类PKc超家族，该蛋白序列在15-306位置包含一个MAP Kinase催化结构域：S_TKc，在催化结构与前具有一个ATP结合位点和底物结合位点。经BLAST分析，Hv-MPK12基因推导的蛋白质序列与面包小麦中的MAP Kinase(GenBankaccession ABC54587.1)具有99％一致性；与大麦的MAP Kinase(GenBank accessionCAD42638.1)具有98％一致性；与水稻的MAP Kinase 12(GenBank accession AAF23902.1)有88％一致性；与玉米的MAP Kinase(GenBank accession AFW75830.1)具有87％的一致性；与拟南芥的MAP Kinase(GenBank accession BAB02016.1)具有76％一致性。故将该基因命名为Hv-MPK12。
实施例2白粉菌诱导后Hv-MPK12的表达特征分析
把簇毛麦的非诱导和诱导不同时间的样品的cDNA为模板、以引物对P3(CTAGCTAGCTGGGGCTAATGTATTTCATC(SEQ ID NO.5))和P4(CTAGCTAGCAAAAGGAGCCACATAATTCA(SEQ ID NO.6))进行实时荧光定量qPCR分析，以管家基因Tubulin作为内参。PCR反应在实时荧光定量PCR仪(MyIQ，Bio-Rad，USA)上扩增并检测荧光。20μl PCR反应体系中含2×SYBR Green PCR Master Mix 10μl，0.4nmol/μl引物P3和P4，反转录产物2μl。扩增参数为：95℃10min，然后95℃15s、58℃30s，72℃1min，共40个循环。反应结束后，进行熔解曲线的测定。检测基因表达水平定量用MyiQ系统软件进行分析。qPCR结果表明：Hv-MPK12在白粉菌诱导1h后开始上调表达，在24h达到峰值，48h时表达水平下降，72h又显著上调表达(图1)。表明HvEREBP基因的表达显著受白粉菌诱导，该基因可能在簇毛麦抗白粉病途径中起一定作用。
实施例3 Hv-MPK12基因的表达载体的构建及其转化普通小麦扬麦158
把用P5(CTAGCAAGGAATCGAAGCGTA(SEQ ID NO.7))和P6(CTAGCCCAGCAGAAATGACAG(SEQ ID NO.8))从簇毛麦cDNA中扩增出来的Hv-MPK12基因片段构建入转化载体pBI 220-6(公知公用，参考文献：Jefferson RA,Kavanagh TA,Bevan MW.GUS fusions:beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higherplants.EMBO J.1987,6:3901-3907)，用BamH Ⅰ和Kpn Ⅰ分别双酶切载体pBI 220-6和目标片段Hv-MPK12基因，连接转化大肠杆菌获得重组子，由此将目标基因克隆到强启动子35s的下游，获得表达载体pBI220:HvEREBP(图2)。
将构建好的过量表达载体通过基因枪法转化扬麦158，四批次转化共轰击2240块幼胚，轰击前在高渗培养基(MS+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+0.4mol/L甘露醇,pH5.8)上预处理4小时，轰击后在高渗培养基上继续培养16小时。之后将愈伤组织转移至恢复培养基(1/2MS(只有大量元素减半的MS)+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L,pH5.8)上暗培养2周，再将其转移至含有除草剂的筛选培养基上(1/2MS+ZT 1mg/L+IAA 0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D1mg/L+蔗糖30g/L+3mg/L Bialaphos,pH5.8)，分化筛选培养2周。然后将具有抗性的愈伤组织转移到分化培养基中(1/2MS+水解酪蛋白200mg/L+ZT 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％,pH5.8)进行分化，待分化芽长至2-4cm时将其转移至生根培养基(1/2MS+IAA1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％,pH5.8)中。至再生苗长约5-8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1-2天，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得再生植株共180株。
提取所有再生植株基因组DNA，对转化植株利用载体上启动子引物P7(GATTCCATTGCCCAGCTATCTG(SEQ ID NO.9))和基因Hv-MPK12内部引物P8(CCATGAGCTCGAAAACAACA(SEQ ID NO.10))进行PCR扩增，以鉴定阳性植株。PCR程序：10-50ng/μl基因组模板，10μM的5’引物P7(35sF4)和3’引物P8(Hv-MPK12R)各0.5μl；2.5μl 10×buffer；2.5μl 2.5mM的dNTP；1.5μl 25mM的Mg2+；0.25μl(5U/μl)Taq polymerase(TaKaRa)，加水至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃45s，58℃45s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经8％的聚丙烯凝胶电泳检测。经过多次重复扩增，有17个单株能扩出目标基因条带，初步确定为阳性植株(图3)。
实施例4 T0代转基因植株的白粉病抗性鉴定
将实施案例3中所述17个阳性单株的幼嫩叶片剪下保存在6-BA保鲜培养基上，接入新鲜白粉菌孢子，培养7天，观察发病情况。抗性鉴定标准采用“0-9级”白粉病抗性反应型的分级标准(盛宝钦，1988)：0-2级为高抗、3-4级为中抗、5-6级为中感、7-9为高感。结果表明：T013-5、T016-4病级是1级；T02-3、T06-1病级是3级；T04-3、T015-1、T016-2病级为4级；T05-6、T011-5、T012-5、T019-2、T021-1病级为5级；T01-6，T018-4、T021-5表现为0级免疫；T012-4出现HR反应的坏死斑。而扬麦158受体对照则表现为7-8级感病(表1)(图4)。
表4-1转Hv-MPK12基因T0代植株苗期白粉病抗性鉴定
Claims (5)
1.一种丝裂原活化蛋白激酶基因Hv-MPK12，其特征在于核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
2.权利要求1所述的丝裂原活化蛋白激酶基因编码的蛋白质Hv-MPK12，其特征在于氨基酸序列为SEQ ID NO.2。
3.含有权利要求1所述的丝裂原活化蛋白激酶基因Hv-MPK12的表达载体。
4.权利要求1所述的丝裂原活化蛋白激酶基因Hv-MPK12在培育抗白粉病小麦品种中的应用。
5.权利要求3所述的表达载体在培育抗白粉病小麦品种中的应用。
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| 利用大麦基因芯片筛选簇毛麦抗白粉病相关基因及其抗病机制的初步研究;曹爱忠 等;《作物学报》;20061031;第32卷(第10期);1444-1452 * |
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