CN104630236A - 一个簇毛麦乙烯反应元件结合蛋白基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一个簇毛麦乙烯反应元件结合蛋白基因的应用。HvEREBP的cDNA序列为SEQ ID NO.1及其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO.2。HvEREBP是簇毛麦包含AP2/EREBP功能域的重要转录因子家族成员之一，可作为目的基因导入感病小麦品种，提高其赤霉病抗性和耐盐性。

Description

一个簇毛麦乙烯反应元件结合蛋白基因的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，公开了一个簇毛麦乙烯反应元件结合蛋白基因的应用。

背景技术：

小麦是世界上分布最广、种植面积最大的粮食作物，对人类粮食安全具有举足轻重的作用。禾布氏白粉菌小麦专化型(Blumeria gramimis f.sp.tritici Marchal，异名为Erysiphe graminisDC.f.sp.tritici Marchal,缩写为Bgt)是侵染小麦的专性活体寄生真菌，它的寄生范围还包括黑麦、燕麦以及其他小麦近缘植物如老芒麦(Elymus sibiricus)、冰草(Agropyron cristatum)、圆柱披碱草(Elymus cylindricus)和偃麦草(Elytrigia repens)等(参考文献：盛宝钦；段霞瑜；向齐君；周益林.我国北方11省(区)、直辖市小麦白粉病菌寄主范围研究.中国农业科学，1995，6:52-57)。多年以来，该病在全世界范围内普遍发生并危害严重。

簇毛麦(Haynaldia villosa,2n＝14,VV)，是小麦的一个野生近缘种，它高抗小麦白粉病、锈病、梭条花叶病、全蚀病等病害，并具有抗旱、耐盐、耐寒等特性，是小麦抗逆遗传改良的宝贵基因资源库。其中来自簇毛麦6VS的Pm21基因是目前抗白粉病主效基因之一，具有抗性强、抗谱广等特点，是目前为止最有效的抗白粉病基因(参考文献：Chen P D,Qi L L,Zhou B,et al.Development and molecμlar cytogenetic analysis of wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocationlines specifying resistance to powdery mildew.Theor Appl Genet,1995,91:1125-1128.)。

利用基因芯片筛选差异表达的基因，是后基因组时代进行高通量基因筛选与克隆的有效方法之一。为了研究Pm21基因对白粉病的抗性机理，本实验室利用接种白粉菌后的抗、感簇毛麦和非接种的抗病簇毛麦的cDNA，分别与大麦基因芯片上的探针杂交(参考文献：曹爱忠，李巧，陈雅平，邹晓文，王秀娥，陈佩度.利用大麦基因芯片筛选簇毛麦抗白粉病相关基因及其抗病机制的初步研究.作物学报，2006，32(10):1444-1452)。通过比较接种白粉菌前后抗病簇毛麦的表达谱，筛选出上调表达的基因，包括病程相关蛋白、防卫反应基因、转录因子、信号传导因子和抗病基因类似物等。根据以上基因芯片杂交结果，利用上调表达探针序列设计引物，从接种白粉菌后抗病簇毛麦的cDNA中克隆获得基因片段，对这些片段进行序列比对，选择与抗病性相关的序列，筛选抗病簇毛麦cDNA文库，获得了一个乙烯反应元件结合蛋白基因HvEREBP的全长，利用基因枪技术将其转化感白粉病小麦品种扬麦158中，以期提高其抗逆性。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术的上述缺陷，提供一种簇毛麦乙烯反应元件结合蛋白基因HvEREBP。

本发明的另一目的是提供该基因的表达载体。

本发明的又一目的是提供该基因和表达载体的应用。

本发明的目的可通过如下技术方案实现：

乙烯反应元件结合蛋白基因HvEREBP，来自簇毛麦，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

该簇毛麦乙烯反应元件结合蛋白基因编码的蛋白质HvEREBP，其氨基酸序列的GenBank获得accession number为FJ711058。

含有所述的簇毛麦乙烯反应元件结合蛋白基因HvEREBP的表达载体。

含有所述的簇毛麦乙烯反应元件结合蛋白基因HvEREBP的表达载体优选以pAHC25为出发载体，将所述的HvEREBP基因插入pAHC25的SmaI和SacI酶切位点间所得。

所述的簇毛麦乙烯反应元件结合蛋白基因HvEREBP在培育耐盐和/或赤霉病小麦品种中的应用。

所述的簇毛麦乙烯反应元件结合蛋白基因HvEREBP的表达载体在培育耐盐和/或赤霉病小麦品种中的应用。

有益效果：

本发明从簇毛麦中克隆得到了一个乙烯反应元件结合蛋白基因HvEREBP及其所编码的蛋白质HvEREBP。HvEREBP可用于基因工程育种，将其插入表达载体pAHC25，得到该基因的过量表达载体导入赤霉病感病小麦品种中，可以提高感病小麦品种对霉病的抗性。同时，转入本发明乙烯反应元件结合蛋白基因HvEREBP的转基因植株能够显著提高植株的耐盐性。

附图说明

图1HvEREBP过量表达载体构建

图2HvEREBP基因转化扬麦158的T₀代阳性转基因植株PCR分子鉴定结果

M:DL2000，1泳道为扬158对照，2泳道为水对照，24泳道为质粒对照，3-28泳道为不同的转基因植株。箭头所示为扩增出的目标基因片段。

图3转Hv-EREBP基因小麦苗期耐盐性生长指标：苗长(A)、根长(B)、苗鲜重(C)、苗干重(D)、根鲜重(E)、根干重(F)分析。

具体实施方式

实施例1簇毛麦乙烯反应元件结合蛋白基因HvEREBP的克隆

本实验室前期利用簇毛麦受白粉菌诱导后的cDNA样品与大麦表达谱芯片Barley 1GeneChip(http://www.affymetrix.com/products/arrays/specific/barley.affx)进行杂交，通过比较接种白粉菌前后抗病簇毛麦的表达谱，筛选出上调表达的基因，包括病程相关蛋白、防卫反应基因、转录因子、信号传导因子和抗病基因类似物等。根据芯片杂交结果，选择上调表达、根据抗病相关基因设计的探针Contig3867，经NCBI注释为一个EREBP转录因子基因，用Primer3(http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3www.cgi)设计简并引物，利用筛选簇毛麦叶片cDNA文库的方法克隆获得了该基因的全长序列。

本发明所用的白粉菌诱导12h的簇毛麦叶片cDNA文库(陈雅萍，2005)，能够满足对簇毛麦叶片中Pm21基因和其它抗性基因、防卫基因和其它优良基因的克隆研究。cDNA片段两端经Not I和Sal I酶切位点定向克隆于pSPORT1载体。pSPORT1载体能被1mmol/LIPTG(isopropylthio-β-galactoside)诱导，通过半乳糖苷启动子表达被克隆的基因。多克隆位点的设计便于用Henikoff法进行套式缺失的构建和测序，其它特征和PUC系列载体类似。为长期保存文库和减小筛库工作量，先从5个384孔板每4-5个小混合池中各吸1μl菌液，将其混合到一起，37℃扩大培养后提取质粒。每块384孔板提取80个质粒，共有400个质粒。首先用Contig3867引物P1(CTCTCCCAAGATGACTTCAG(SEQ ID NO.2))和P2(CATAAGAAACCTCGTCCAAG(SEQ ID NO.3))以上述的400个混合池质粒DNA为模板进行PCR扩增，筛选到一个阳性的混合质粒；然后取1.5μl初级混合池质粒做电击转化，涂10个LBA平板，37℃培养待其生长16h后，每平板分30个小区刮取菌落，接入含500μl LBA的1.5ml离心管中培养5个小时后，进行PCR筛选。用Contig3867引物对以这300个小区为模板进行PCR扩增，70％以上的次级克隆池可以扩出阳性条带。其中27号次级克隆池中阳性条带最浓，取5μl 27号菌液稀释200倍，每1mlLBA培养基中接种10μl。共100管菌液，用Contig3867引物对进行PCR筛选。50％的菌液可以扩增出阳性条带，其中17号菌液扩出的条带最浓。取17号菌液稀释10000倍，取10μl稀释液涂平板。用枪头挑取15-20个单克隆于500μl LBA中培养，用Contig3867引物对进行PCR筛选。筛选出含有目标片段的混合菌液，再次稀释铺板挑单克隆，LBA中培养后进行PCR筛选，最终获得1个阳性克隆。

测序结果表明，该cDNA克隆全长1429个碱基，序列如SEQ ID NO.1所示，其开放阅读框(ORF)长1185bp，编码394个氨基酸，氨基酸序列已提交GenBank获得accession number为FJ711058。通过对该氨基酸序列进行保守结构分析，HvEREBP基因推导的蛋白质序列属于植物的AP2超家族，分子量约为42.8KD，等电点(pI)为4.55。该蛋白质序列具有一个AP2保守结构域，AP2保守结构域前具有一个DNA结合位点。经BLAST分析，HvEREBP基因推导的蛋白质序列与水稻转录因子EREBP1(GenBank accession BAD19536)具有66％一致性，与玉米乙烯反应元件结合蛋白序列(GenBank accession ACG32553)具有58％一致性，与面包小麦乙烯反应元件结合蛋白序列(GenBank accession AAX13280)具有50％一致性，与拟南芥乙烯反应转录因子(GenBank accession NP_001077718)具有37％一致性。故将该基因命名为HvEREBP。

实施例2HvEREBP基因的表达载体的构建及其转化普通小麦扬麦158

把用P5(TCCCCCGGGATGTGCGGCGGCGCGATC(SEQ ID NO.4))和P6(ACGCGAGCTCTCAGAAACCACAAACGGGCATGTCA(SEQ ID NO.5))从簇毛麦cDNA中扩增出来的HvEREBP基因片段构建入转化载体pAHC-25(公知公用，参考文献：ChristensenA H，Quail P H,Ubiquitin promoter-based vectors for high-level expression of selectable and/orscreenable marker genes in monocotyledonous plants.Transgenic Research,1996,5:213-218.)，用SmaI和SacI分别双酶切载体pAHC-25和目标片段HvEREBP基因，以HvEREBP替换pAHC25载体上的GUS基因编码序列，连接转化大肠杆菌5α获得重组子，由此将目标基因克隆到强启动子Ubi的下游，获得表达载体pAHC-HvEREBP(图1)。除草剂抗性基因(Bar基因)作为植物转化的选择标记基因。

将构建好的过量表达载体通过基因枪法转化扬麦158，挑选约3000个幼胚愈伤进行基因枪轰击，轰击前在高渗培养基(MS++2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L+0.4mol/L甘露醇,pH5.8)上预处理4小时，轰击后在高渗培养基上继续培养16小时。之后将愈伤组织转移至恢复培养基(1/2MS(只有大量元素减半的MS)+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D2mg/L+蔗糖30g/L,pH5.8)上暗培养2周，再将其转移至含有除草剂的筛选培养基上(1/2MS+ZT 1mg/L+IAA 0.5mg/L+水解酪蛋白500mg/L+2,4-D1mg/L+蔗糖30g/L+3mg/L Bialaphos,pH5.8)，分化筛选培养2周。然后将具有抗性的愈伤组织转移到分化培养基中(1/2MS+水解酪蛋白200mg/L+ZT 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％,pH5.8)进行分化，待分化芽长至2-4cm时将其转移至生根培养基(1/2MS+IAA 1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂0.8％,pH5.8)中。至再生苗长约5-8cm、根系较健壮时，即可开管炼苗1-2天，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得再生植株共241株。

提取所有再生植株基因组DNA，对转化植株利用载体上启动子引物P7(TATACATGATGGCATATGCAG(SEQ ID NO.6))和基因HvEREBP内部引物P8(TGCAGCTTCTTCAGCACTGT(SEQ ID NO.7))进行PCR扩增，以鉴定阳性植株。PCR程序：10-50ng/μl基因组模板，10μM的5’引物P7(UbiF4)和3’引物P8(HvEREBP-R)各0.5μl；2.5μl 10×buffer；2.5μl 2.5mM的dNTP；1.5μl 25mM的Mg2+；0.25μl(5U/μl)Taq polymerase(TaKaRa)，加水至25μl。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃45s，58℃45s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经8％的聚丙烯凝胶电泳检测。其中119株可以扩增约687bp的目的条带，初步鉴定为阳性植株。图2中为多次稳定扩增出目标基因的的T₀代GmEREBP1-GmEREBP6等6个植株的PCR扩增结果。

实施例3T3代转基因植株的赤霉病抗性鉴定

在鉴定的所有T₃代转基因植株中，GmEREBP2-GmEREBP4这3个株系的平均病小穗数均小于阴性植株(表1)。但由于赤霉病的抗性鉴定往往受环境条件的影响较大，还需进行多年多点的进一步鉴定，因此初步推测HvEREBP基因的转入及表达一定程度上增强了小麦对赤霉病的抗性。

表1转基因植株的赤霉病抗性鉴定

实施例4T4代转基因植株的耐盐性鉴定

将转Hv-EREBP基因小麦幼苗先水培，再1/2MS培养培养至3叶期，之后用1/2MS+150mMNaCl溶液处理，继续生长至幼苗5叶期，取样并测量相关生长指标。盐胁迫对转Hv-EREBP基因小麦影响分析如图3，转入Hv-EREBP的转基因系E57(GmEREBP2)和E63(GmEREBP3)的苗长和根长都显著比受体对照扬麦158长，苗鲜重、根鲜重、苗干重和根干重都显著比对照高。结果表明转入Hv-EREBP基因提高了小麦的耐盐性。

Claims (2)

1.SEQ ID NO.1所示的簇毛麦乙烯反应元件结合蛋白基因HvEREBP在培育耐盐和/或赤霉病小麦品种中的应用。

2.含有SEQ ID NO.1所示的簇毛麦乙烯反应元件结合蛋白基因HvEREBP的表达载体在培育耐盐和/或赤霉病小麦品种中的应用。