CN114317566B - 白粉病抗性相关基因mpk15的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白粉病抗性相关基因MPK15的应用，属于植物基因工程领域。所述具体应用是使白粉病抗性相关基因MPK15在植株中进行过表达；其中，所述白粉病抗性相关基因MPK15的CDS序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明通过实验确认了MPK15基因在提高植物白粉病抗性方面具有潜在的应用价值，并为利用MPK15基因提高作物抗病性等方面的转基因作物的培育与创制奠定了良好的理论和应用基础。

Description

白粉病抗性相关基因MPK15的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种白粉病抗性相关基因MPK15的应用。

背景技术

白粉菌是一类重要的植物病害，广泛分布在世界各地，能够侵染包括重要农作物如小麦和大麦在内的近万种植物，对世界农业生产造成巨大危害。白粉菌为寄生型病原菌，在环境条件适宜的情况下，白粉菌能大量蔓延，侵染植物后，产生的孢子覆盖在植物表面，形成白色网状或白粉状的一层，故称为白粉病。白粉病在植物整个生育期均可发生，白粉菌侵染植物后，以单细胞的吸器插入寄主的表皮细胞内吸取养料，影响植物的生长和发育，严重发病时甚至造成叶片枯落及死亡。防治白粉病一般以农业防治和化学防治为主，创制抗病品种是抵抗白粉病最经济有效的方法，研究挖掘更多的抗病相关基因并研究及其抗病机理，可以为作物抗病品种的选育提供基因资源和理论基础。

植物在长期进化过程中形成了非常复杂天然免疫系统。在病原菌侵染植物时，植物通过免疫系统来抵抗病原菌入侵。植物可通过位于细胞质膜上的模式受体（PatternRecognition Receptors，PRRs）识别非常保守的病原菌相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），激活免疫反应，也称为PAMPs诱导的免疫反应（PAMPs triggered immunity，PTI），是植物抗病反应的第一层次。PTI也称为植物基础抗性，具有广谱性。研究发现，植物中的胞质型类受体类激酶（receptor-like cytoplasmickinases，RLCKs）是模式受体复合体成员中重要成员，这类蛋白可以传递免疫信号，参与病原菌相关分子模式的识别与PTI反应。

前期的研究发现，拟南芥RLCKs类蛋白BR-SIGNALING KINASE1（BSK1）参与了植物抗病反应，研究BSK1在拟南芥中的互作蛋白或磷酸化底物，可以挖掘更多的参与植物抗病的调控因子。本发明通过蛋白互作实验确定了一个由MPK15编码的蛋白激酶与BSK1在植物中存在相互作用。MPK15突变后，拟南芥对于白粉菌的抗病性减弱，而通过转基因提高MPK15的基因表达水平可以增强植物对白粉菌的抗病性。本发明以拟南芥与白粉菌为研究体系，通过对MPK15的功能分析，首次发现该基因对植物对真菌性病原菌的抗病反应具有重要作用。结果表明MPK15是创建抗病性的转基因作物以及进行作物分子设计的优良候选基因，具有很重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种白粉病抗性相关基因MPK15的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种白粉病抗性相关基因MPK15在提高植物对白粉病抗性中的应用，所述白粉病抗性相关基因MPK15的CDS全长序列如SEQ ID NO.1所示，所述白粉病抗性相关基因MPK15编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，白粉病抗性相关基因MPK15过表达能显著提高植物对白粉病的抗性。

进一步的，上述植物为拟南芥。

进一步的，上述具体应用方法为：

（a）构建含白粉病抗性相关基因MPK15的过表达载体；

（b）将含白粉病抗性相关基因MPK15的过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，获得含白粉病抗性相关基因MPK15过表达载体的农杆菌工程菌；

（c）将所述农杆菌工程菌转入到植物体内，筛选得到含有过表达白粉病抗性相关基因MPK15的纯合转基因抗白粉病植株。

进一步的，上述过表达载体为pEarleyGate103。

进一步的，上述农杆菌感受态细胞为GV3101。

进一步的，上述筛选为除草剂Basta抗性检测。

进一步的，上述一种白粉病抗性相关基因MPK15在提高植物对白粉病抗性中的应用中，含有所述过表达白粉病抗性相关基因MPK15的转基因抗白粉病植株在白粉菌胁迫下叶片上的白粉菌单孢子分生孢子梗数量显著低于野生型及所述MPK15基因无表达的突变体。

本发明的显著优点在于：

本发明通过基因工程技术获得了MPK15基因的超表达载体，并通过抗生素筛选获得了MPK15基因超表达纯合株系，在白粉菌胁迫下，这些株系具有明显的提高植物白粉病抗性的能力。本发明通过实验首次确认了MPK15基因可以提高植物对白粉病的抗性，为利用MPK15基因提高作物抗病性等方面的转基因作物的培育与创制奠定了良好的理论和应用基础。

附图说明

图1为检测BSK1与MPK15相互作用图。在本氏烟草的瞬时表达体系中，利用免疫共沉淀检测BSK1与MPK15存在相互作用（A）；通过转基因技术，构建稳定表达BSK1和MPK15的转基因拟南芥植株，通过免疫共沉淀检测在稳定表达的情况下，BSK1与MPK15在植物中的相互作用（B）；在烟草瞬时表达体系中，通过双分子荧光互补成像实验，检测BSK1与MPK15在植物中的相互作用（C）。

图2为MPK15突变体增强对白粉菌感病性图。 MPK15基因以及 MPK15突变体的突变位置示意图（A）；拟南芥野生型植株Col-0， bsk1， mpk15突变体植株在生长4周后，接种白粉病菌 Golovinomycescichoracearum UCSC1, 在侵染第5天后，对侵染叶片进行台盼蓝的染色结果（B）；白粉菌单孢子分生孢子梗定量的计数结果(C）。

图3为拟南芥中过表达MPK15增强对白粉菌抗性图。野生型植株Col-0和过表达植株中的生长发育情况（A）；MPK15过量表达植株中，MPK15蛋白的积累水平（B）；通过实时定量PCR检测野生型和MPK15过量表达植株中，MPK15基因的表达水平（C）；拟南芥野生型植株和过量表达 MPK15的转基因植株接种白粉菌，对侵染叶片进行台盼蓝的染色结果（D）；白粉菌单孢子分生孢子梗定量的计数结果（E）。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。

实施例1 通过蛋白互作实验将候选蛋白MPK15确认为研究目标

（1）材料与方法

将BSK1（At4g35230）和MPK15的全长CDS序列分别连入免疫共沉淀实验所需的植物表达载体pGWB11和pEarleyGate103并转化农杆菌GV3101。本氏烟草在22℃，9小时光照的温室中，生长4周后，将携带有相应载体的农杆菌瞬时注射转化本氏烟草，正常光照培养48小时，提取植物总蛋白进行免疫共沉淀实验，检测MPK15蛋白与BSK1蛋白的蛋白相互作用。

将带有自身启动子序列的BSK1和MPK15全长基因组DNA序列分别构建至pEarleyGate303和 pEarleyGate301载体中，得到自身启动子驱动的MPK15-GFP和BSK1-HA表达载体并转化农杆菌GV3101，再用沾花浸染的方法转化拟南芥，并通过Basta除草剂（10μg/ml终浓度）筛选得到稳定的纯合转基因株系。将转基因拟南芥植株在22℃，9小时光照的温室中，生长4周。提取拟南芥叶片总蛋白，进行免疫共沉淀实验，检测MPK15蛋白与BSK1蛋白的相互作用。

在双分子荧光互补实验中，分别构建表达MPK15与YFP的N末端、BSK1与YFP的C末端相连接的融合蛋白的表达载体，分别得到表达载体pMDC32-YC-BSK1和pMDC32-YN-MPK15 ，并转化农杆菌GV3101。本氏烟草在22℃，9小时光照的温室中，生长4周后，将携带有相应载体的农杆菌瞬时注射转化烟草，正常光照培养48小时，利用激光共聚焦显微镜观察与拍照。

（2）结果与分析

在免疫共沉淀实验和双分子荧光互补实验中都可以检测到BSK1和MPK15的互作信号，说明在烟草瞬时表达和拟南芥稳定表达的条件下，BSK1和MPK15存在相互作用，充分说明了两个蛋白的互作在植物中是存在的（图1 A-C）。

实施例2  mpk15突变体接种白粉菌的表型分析

（1）材料与方法

将拟南芥野生型植株Col-0， mpk15突变体的两个等位突变体（CRISPR/Cas9创制的突变，图2A）， bsk1突变体（已报道，The Plant Cell, Vol. 25: 1143–1157, March 2013）种植在22℃，9小时光照的温室中，生长4周，定量接种白粉菌分生孢子至植株叶片表面。在接菌5天后进行抗病表型鉴定，对侵染叶片叶片进行台盼蓝染色，拍照，并观察白粉菌在叶片上的生长情况。

为了定量分析植物的抗性，将接种白粉病菌的野生型和突变体植物的叶片在显微镜下进行单孢子分生孢子梗计数，并进行统计分析，实验至少重复3 次。

（2）结果与分析

在白粉菌接菌5天之后，野生型Col-0及 mpk15的叶片表面均产生白粉菌分生孢子， mpk15突变体在白粉菌接菌5天之后，在其叶表面有更多的孢子附着（图2B）。对各种基因型叶片上的单孢子上产生的分生孢子数量进行了定量分析，结果显示 mpk15两个等位突变体的分生孢子数明显高于野生型Col-0，表现增强的感病表型（图2C），这些结果表明MPK15正调控对白粉菌的抗性。

实施例3 过量表达 MPK15的转基因拟南芥接种白粉菌的表型分析

（1）材料与方法

将MPK15全长CDS序列连入pEarleyGate103载体中，构建得到35S启动子驱动MPK15的编码（CDS）序列表达载体并转化农杆菌GV3101，获得含白粉病抗性相关基因MPK15过表达载体的农杆菌工程菌，用沾花浸染的方法将农杆菌工程菌转化拟南芥，通过Basta除草剂（10 μg/ml终浓度）筛选得到纯合转基因株系，通过实时定量PCR检测，找到 MPK15基因表达水平显著提高的转基因株系。

将野生型Col-0， bsk1突变体， mpk15突变体的两个等位突变体（同实施例2），以及 MPK15过表达植株种植在22℃，9小时光照的温室中，生长4周后，接种白粉病菌（接种方法同实施例2）。在接菌5天后进行白粉菌抗病表型鉴定，对侵染叶片进行台盼蓝染色，拍照，并观察白粉菌在叶片上的生长情况。

为了定量分析植物的抗性，将接种白粉病菌的野生型和突变体植物的叶片在显微镜下进行单孢子分生孢子梗计数，并进行统计分析，实验至少重复3 次。

（2）结果与分析

定量PCR检测结果表明，过量表达 MPK15的转基因株系中， MPK15的基因表达水平显著高于野生型植物（图3C） ；且这两个过量表达 MPK15的转基因株系中也积累了大量的MPK15 蛋白（图3B）；在正常条件生长下，过量表达 MPK15的转基因株系的植株生长正常，与野生型类似（图3A）；接种白粉菌后，过量表达 MPK15的转基因株系的单孢子分生孢子梗数量显著低于野生型，说明过量表达 MPK15可以增强植物对白粉菌的抗性（图3 D-E）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 白粉病抗性相关基因MPK15的应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1731

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgggtggtg gtggcaatct cgtcgacggt gttcgtcgtt ggcttttctt tcaacgtcgt 60

ccttcttctt cttcttcttc caataatcac gatcagattc aaaatccccc caccgtttct 120

aatcccaacg acgacgaaga tttgaagaag cttaccgatc cgtctaagct aagacagatt 180

aaggttcagc aacgaaatca cttacctatg gagaagaagg gaatacctaa tgctgaattc 240

ttcacggagt atggagaagc aaatagatat cagattcaag aagtagttgg caaaggaagc 300

tatggagttg ttggttctgc tatagatact cacactggag aaagagttgc tatcaaaaag 360

attaacgatg tgtttgatca tatctctgat gcaaccagga ttcttaggga gattaagttg 420

ttacgcttgc ttcttcatcc agatgttgtt gagattaaac atattatgct tcctccttct 480

cgaagagagt ttcgtgatgt ttatgttgtc tttgagttga tggaatctga tcttcatcag 540

gttattaaag ctaatgatga tttaactcct gagcatcatc agtttttctt gtatcagctt 600

cttcgtggtt tgaagtatgt tcatgctgcg aatgtgtttc atcgggattt gaaaccaaag 660

aacattcttg ctaatgctga ttgcaagttg aagatttgtg actttggtct agctcgtgta 720

tcttttaatg atgcccctac cgctattttt tggactgatt atgttgctac tcggtggtac 780

cgtgcccctg aactctgtgg atcatttttc tcaaaatata cccctgcgat tgatatttgg 840

agcgttggtt gcatatttgc tgaaatgcta ttagggaagc cgctatttcc tggcaaaaat 900

gtggttcacc aattggatat tatgaccgat tttcttggca ctccaccacc tgaagccata 960

tcaaagatca gaaatgataa ggcgaggaga tatcttggca acatgaggaa aaaacagcca 1020

gtcccattct ctaaaaaatt ccctaaagca gatccttcgg cccttcgcct gttggaacgc 1080

ctgattgcct ttgatccaaa agatcgtcca tctgccgaag aagcattagc tgatccatac 1140

tttaatggtc tgtcaagtaa agtgcgggaa ccatcgacac agccgatttc aaagcttgaa 1200

tttgagtttg agagaaagaa attgacaaaa gatgatatca gagagttaat ttaccgagag 1260

atattagaat atcatcctca gatgctggag gaataccttc gtggtggcaa tcagctcagc 1320

ttcatgtacc ccagtggggt agatcgattt aggaggcagt ttgctcatct tgaagaaaat 1380

caaggtccag gaggaagaag taacgcactt cagagacagc atgcttcctt accaagagag 1440

cgagttccag catccaagaa tgaaacagtc gaagaaagaa gcaacgatat cgagagaaga 1500

acaacagctg ctgtagcttc aaccttagac agtcccaaag cttcacaaca agctgaaggt 1560

acagaaaatg gaggaggagg agggtatagt gcgcgtaacc tgatgaaaag ctctagcatt 1620

agtggttcta aatgcatagg tgtacaatct aaaaccaaca ttgaggattc catagtagag 1680

gaacaagatg agactgttgc tgtgaaagtt gcatctctac acaattctta g 1731

<210> 2

<211> 576

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Gly Gly Gly Asn Leu Val Asp Gly Val Arg Arg Trp Leu Phe

1               5                   10                  15

Phe Gln Arg Arg Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn Asn His Asp Gln

            20                  25                  30

Ile Gln Asn Pro Pro Thr Val Ser Asn Pro Asn Asp Asp Glu Asp Leu

        35                  40                  45

Lys Lys Leu Thr Asp Pro Ser Lys Leu Arg Gln Ile Lys Val Gln Gln

    50                  55                  60

Arg Asn His Leu Pro Met Glu Lys Lys Gly Ile Pro Asn Ala Glu Phe

65                  70                  75                  80

Phe Thr Glu Tyr Gly Glu Ala Asn Arg Tyr Gln Ile Gln Glu Val Val

                85                  90                  95

Gly Lys Gly Ser Tyr Gly Val Val Gly Ser Ala Ile Asp Thr His Thr

            100                 105                 110

Gly Glu Arg Val Ala Ile Lys Lys Ile Asn Asp Val Phe Asp His Ile

        115                 120                 125

Ser Asp Ala Thr Arg Ile Leu Arg Glu Ile Lys Leu Leu Arg Leu Leu

    130                 135                 140

Leu His Pro Asp Val Val Glu Ile Lys His Ile Met Leu Pro Pro Ser

145                 150                 155                 160

Arg Arg Glu Phe Arg Asp Val Tyr Val Val Phe Glu Leu Met Glu Ser

                165                 170                 175

Asp Leu His Gln Val Ile Lys Ala Asn Asp Asp Leu Thr Pro Glu His

            180                 185                 190

His Gln Phe Phe Leu Tyr Gln Leu Leu Arg Gly Leu Lys Tyr Val His

        195                 200                 205

Ala Ala Asn Val Phe His Arg Asp Leu Lys Pro Lys Asn Ile Leu Ala

    210                 215                 220

Asn Ala Asp Cys Lys Leu Lys Ile Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Val

225                 230                 235                 240

Ser Phe Asn Asp Ala Pro Thr Ala Ile Phe Trp Thr Asp Tyr Val Ala

                245                 250                 255

Thr Arg Trp Tyr Arg Ala Pro Glu Leu Cys Gly Ser Phe Phe Ser Lys

            260                 265                 270

Tyr Thr Pro Ala Ile Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Phe Ala Glu

        275                 280                 285

Met Leu Leu Gly Lys Pro Leu Phe Pro Gly Lys Asn Val Val His Gln

    290                 295                 300

Leu Asp Ile Met Thr Asp Phe Leu Gly Thr Pro Pro Pro Glu Ala Ile

305                 310                 315                 320

Ser Lys Ile Arg Asn Asp Lys Ala Arg Arg Tyr Leu Gly Asn Met Arg

                325                 330                 335

Lys Lys Gln Pro Val Pro Phe Ser Lys Lys Phe Pro Lys Ala Asp Pro

            340                 345                 350

Ser Ala Leu Arg Leu Leu Glu Arg Leu Ile Ala Phe Asp Pro Lys Asp

        355                 360                 365

Arg Pro Ser Ala Glu Glu Ala Leu Ala Asp Pro Tyr Phe Asn Gly Leu

    370                 375                 380

Ser Ser Lys Val Arg Glu Pro Ser Thr Gln Pro Ile Ser Lys Leu Glu

385                 390                 395                 400

Phe Glu Phe Glu Arg Lys Lys Leu Thr Lys Asp Asp Ile Arg Glu Leu

                405                 410                 415

Ile Tyr Arg Glu Ile Leu Glu Tyr His Pro Gln Met Leu Glu Glu Tyr

            420                 425                 430

Leu Arg Gly Gly Asn Gln Leu Ser Phe Met Tyr Pro Ser Gly Val Asp

        435                 440                 445

Arg Phe Arg Arg Gln Phe Ala His Leu Glu Glu Asn Gln Gly Pro Gly

    450                 455                 460

Gly Arg Ser Asn Ala Leu Gln Arg Gln His Ala Ser Leu Pro Arg Glu

465                 470                 475                 480

Arg Val Pro Ala Ser Lys Asn Glu Thr Val Glu Glu Arg Ser Asn Asp

                485                 490                 495

Ile Glu Arg Arg Thr Thr Ala Ala Val Ala Ser Thr Leu Asp Ser Pro

            500                 505                 510

Lys Ala Ser Gln Gln Ala Glu Gly Thr Glu Asn Gly Gly Gly Gly Gly

        515                 520                 525

Tyr Ser Ala Arg Asn Leu Met Lys Ser Ser Ser Ile Ser Gly Ser Lys

    530                 535                 540

Cys Ile Gly Val Gln Ser Lys Thr Asn Ile Glu Asp Ser Ile Val Glu

545                 550                 555                 560

Glu Gln Asp Glu Thr Val Ala Val Lys Val Ala Ser Leu His Asn Ser

                565                 570                 575

Claims (6)

1.一种白粉病抗性相关基因MPK15在提高植物对白粉病抗性中的应用，其特征在于：所述白粉病抗性相关基因MPK15的CDS全长序列如SEQ ID NO.1所示，所述白粉病抗性相关基因MPK15编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；其中，白粉病抗性相关基因MPK15过表达能显著提高植物对白粉病的抗性；所述植物为拟南芥。

2.根据权利要求1所述的白粉病抗性相关基因MPK15在提高植物对白粉病抗性中的应用，其特征在于：具体应用方法为：

（a）构建含白粉病抗性相关基因MPK15的过表达载体；

（b）将含白粉病抗性相关基因MPK15的过表达载体转入农杆菌感受态细胞中，获得含白粉病抗性相关基因MPK15过表达载体的农杆菌工程菌；

（c）将所述农杆菌工程菌转入到植物体内，筛选得到含有过表达白粉病抗性相关基因MPK15的纯合转基因抗白粉病植株。

3.根据权利要求2所述的白粉病抗性相关基因MPK15在提高植物对白粉病抗性中的应用，其特征在于：所述过表达载体为pEarleyGate103。

4.根据权利要求2所述的白粉病抗性相关基因MPK15在提高植物对白粉病抗性中的应用，其特征在于：所述农杆菌感受态细胞为GV3101。

5.根据权利要求2所述的白粉病抗性相关基因MPK15在提高植物对白粉病抗性中的应用，其特征在于：所述筛选为除草剂Basta抗性检测。

6.根据权利要求2所述的白粉病抗性相关基因MPK15在提高植物对白粉病抗性中的应用，其特征在于：含有所述过表达白粉病抗性相关基因MPK15的纯合转基因抗白粉病植株在白粉菌胁迫下叶片上的白粉菌单孢子分生孢子梗数量显著低于野生型及所述MPK15基因无表达的突变体。

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