CN101484465A - 控制植物生长和器官大小的玉米基因及其在改良作物植物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了ZmARGOS基因家族的多核苷酸和相关多肽。本发明提供了ZmARGOS基因的基因组序列。ZmARGOS负责控制植物生长、器官大小和作物植物的产量。

Description

控制植物生长和器官大小的玉米基因及其在改良作物植物中的应用

发明领域

本发明主要涉及分子生物学领域。

发明背景

许多植物的驯化都与产量的大幅提高相关。绝大多数在自然群体中发生的表型变异是持续性的并且是多种基因影响的结果。在已驯化植物中鉴定与产量大幅度变化相关的特异基因已成为农业研究的主要方向。

在拟南芥(Arabidopsis)(与提高农作物产量相关的植物变化相关的一个基因家族)中与器官大小基因有关的生长素-调控基因(ARGOS)可被生长素诱导。该基因负责调控细胞增殖和器官生长。拟南芥ARGOS在多种幼嫩组织包括根、花茎、花、幼嫩莲座叶和角果中低水平自然表达，但是在成熟的叶中未检测到。在Hu等，(2003Plant Cell 15：1951-61)和Hu等，(2006 The Plant Journal 47(1)：1-9)的研究中，异位过度表达有义或反义ARGOS cDNA的转基因植物其地上器官会分别增大和减小。这些植物中呈现的器官大小的改变与细胞数量而不是细胞大小的变化相关。增加的细胞数量是由于拟南芥中器官生长的持续时间。

本发明包括鉴定该推定的玉米ARGOS基因，与拟南芥ARGOS基因(SEQ ID NO：59、60和61)相关的ZmARGOS1-9(SEQ ID NO：1、3、5、40-45和71)。与拟南芥ARGOS(SEQ ID NO：59)相似性最大的正向同源基因为ZmARGOS 1(SEQ ID NO：1)。玉米中ZmARGOS1和2(SEQ ID NO：1和3)的表达主要在根、早期胚乳、未成熟的穗和枝条以及穗花的分生组织。该表达与生长活跃的组织相关，在成熟组织中的表达较低。该研究结果与该基因在调控生长和细胞增殖的显著正向作用一致。ZmARGOS 3基因(SEQ ID NO：5)在多种组织和发育阶段表达。

表达ZmARGOS1(SEQ ID NO：1)的转基因植物呈现对生物量积累和玉米植物生长速率以及器官大小增加的正向影响。这些玉米基因可应用于增加玉米(和其他农作物)的农学性状。

本发明也包括鉴定其他植物种的ARGOS基因。大米基因家族有8个代表性家族成员。在高粱(Sorghum bicolor)中发现了该基因家族的九个成员。在大豆(Glycine max)中发现了5个基因序列。本文公开了该ARGOS拟南芥基因家族的三个成员。

发明简述

本发明提供了控制植物生长和器官大小以增加产量的组合物和方法。该组合物包括来自玉米、大豆、拟南芥、大米和高粱的ARGOS序列。本发明组合物包括选自SEQ ID NO：1-37、40-71及其突变体和片段的氨基酸序列和核苷酸序列。

在相关植物中表达的DNA构建体中提供编码ARGOS序列的多核苷酸。进一步提供了包含本发明序列的表达盒、植物、植物细胞、植物部分和种子。在具体的实施方案中，该多核苷酸与组成性启动子可操作地相连。

本文提供了在植物或植物部分中调节ARGOS序列水平的方法。该方法包括向植物或植物部分导入包含本发明ARGOS序列的异源多核苷酸。ARGOS多肽的水平可被增加或降低。这类方法可用于增加植物的产量，在一个实施方案中，该方法被用于增加谷物的谷粒产量。

附图简述

图1：显示多种植物种：玉米、大米、大豆、高粱和拟南芥的本发明ARGOS多肽之间关系的树状图。

图2：鉴别出保守区的玉米、大米、大豆、高粱和拟南芥多肽序列的比对。该类蛋白在C-端附近具有高度保守的富含脯氨酸区域。N-端差异较大。该类蛋白较短，从58至146个氨基酸，平均110个氨基酸。

图3：ZmARGOS 1、2和3与AtARGOS 1的比对，标示出共有区域和保守替换。

发明详述

除非另外规定，本文使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同。除非另外提及，本文应用和涵盖的技术为本领域技术人员熟知的标准方法。所述材料、方法和实施例仅用作说明并不具有限制性。通过说明呈现以下内容并且不限制本发明范畴。

在下文中参考附图更全面描述本发明，其中显示了本发明的一些而不是全部实施方案。的确，这些发明可以许多不同形式实施并不应限制于本文列出的实施方案；而本文提供这些实施方案以使本公开满足适用的法律要求。全文中同样的数字表示同样的要素。

本文列出的本发明许多变体和其他实施方案(有利于阐明之前的说明书和附图中的教导)对于本发明所属领域的技术人员而言是熟知的。因此应当理解的是本发明不限于公开的具体实施方案并且所述修改和其他实施方案均包含于附加权利要求的范围。虽然本文应用了具体的术语，但是它们仅用于通用和描述性意义并不具有限制性。

除非另外说明，本发明的实施将应用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的传统技术，其均属于本技术领域。该类技术在文献中有详细说明。见例如Langenheim和Thimann，植物学：植物生物学及其与人类的关系(BOTANY：PLANT BIOLOGY AND ITS RELATION TO HUMANAFFAIRS)，John Wiley(1982)；植物细胞培养和体细胞遗传学(CELLCULTURE AND SOMATIC CELL GENETICS OF PLANTS)，第1卷，Vasil编辑.(1984)；Stanier等，微生物世界(THE MICROBIALWORLD)，第5版，Prentice-Hall(1986)；Dhringra和Sinclair，基础植物病理学方法(BASIC PLANT PATHOLOGY METHODS)，CRC Press(1985)；Maniatis等，分子克隆：实验室手册(MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL)(1982)；DNA克隆(DNA CLONING)，第I和II卷，Glover编辑，(1985)；寡聚核苷酸合成(OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS)，Gait编辑，(1984)；核酸杂交(NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION)，Hames和Higgins编辑，(1984)；及酶学方法(METHODS IN ENZYMOLOGY)系列，Colowick和Kaplan编辑，Academic Press，Inc.，San Diego，CA。

单位、字首和符号表示为SI接受形式。除非另外指明，核酸由左向右以5’至3’方向书写；氨基酸序列由左向右从氨基至羧基的方向书写。数字范围包括限定该范围的数值。本文中提及的氨基酸可为它们普遍使用的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会建议使用的单字母符号。同样，核苷酸以它们那被普遍接受的单字母编码表示。通过整体参考详细说明更加全面定义下文中定义的术语。

在描述本发明中可应用下列术语，其定义如下所示。

术语“微生物”指微生物(包括真核和原核微生物)，例如真菌、酵母、细菌、放线菌、藻类和原生动物以及其他单细胞结构。

术语“扩增”指使用至少该核酸序列之一作为模板构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝。扩增体系包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链反应(LCR)系统、核酸序列为基础的扩增(NASBA，Cangene，Mississauga，Ontario)、Qβ复制酶系统、转录为基础的扩增系统(TAS)和链置换扩增技术(SDA)。例如见诊断分子生物学：原理和应用(DIAGNOSTIC MOLECULAR MICROBIOLOGY：PRINCIPLES AND APPLICATIONS)，Persing等编辑，AmericanSociety for Microbiology，Washington，DC(1993)。扩增产物被称作扩增子。

术语“保守修饰变异体”应用于氨基酸和核酸序列。就具体核酸序列而言，保守修饰变异体指编码该氨基酸序列相同或保守修饰变异体的核酸。由于遗传密码的简并性，许多功能相同的核酸可编码任何给定的蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此在任何密码子规定为丙氨酸的位置，该密码子可被改变成任何所述相应密码子而不会改变被编码的多肽。这种核酸变异为“沉默变异”并代表了一类保守修饰变异。本文的每一个编码多肽的核酸序列也描述了该核酸每个可能的沉默变异。本领域普通技术人员可认识到，核酸中每一个密码子(除了AUG，其为甲硫氨酸的唯一密码子；一个例外是红色微球菌，它的甲硫氨酸密码子为GTG(Ishizuka等.，(1993)J.Gen.Microbiol.139：425-32)均可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，编码本文多肽的核酸的每一个沉默变异都内含各所述多肽序列并以参考形式并于本文。

对于氨基酸序列而言，技术人员应认识到当该变化引起用化学相似的氨基酸置换氨基酸时，改变、增加或缺失被编码序列中的单个氨基酸或一小部分氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的单个置换、缺失或添加为“保守修饰变异体”。因此，可改变选自1至15的整数的任何数量的氨基酸残基。因此，例如，可进行1、2、3、4、5、7或10个改变。保守修饰变异体通常与它们所衍生自的未修饰多肽序列具有相似的生物活性。例如，对天然底物的底物特异性、酶活力、或配体/受体结合至少为天然蛋白的30％、40％、50％，、60％、70％、80％或90％，优选60-90％。保守取代表提供了本领域熟知的功能相似氨基酸。

下列六组均包含可相互保守替换的氨基酸：

1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；

2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；及

6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。

参见：Creighton，PROTEINS，W.H.Freeman and Co.(1984)。

如本文所使用，“基本上由...组成”意指在目标多核苷酸中包含附加序列，其中在严格杂交条件下该附加序列不会与相同于该多核苷酸的cDNA选择性杂交并且其中该杂交条件包括在65℃ 0.1X SSC和0.1％十二烷基硫酸钠中的洗涤步骤。

“编码”或“被编码”，对于特定核酸而言，意指包含翻译成特定蛋白质的信息。编码蛋白质的核酸可能在该核酸的翻译区内含有非翻译序列(例如，内含子)，或者可能缺少这些插入的非翻译序列(例如，在cDNA中)。编码蛋白质的信息由密码子的使用来确定。通常，核酸编码氨基酸序列采用“通用”遗传密码。但是，例如在一些植物、动物、真菌线粒体、山羊支原体细菌(Mycoplasma capricolum)(Yamao等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：2306-9)或大核纤毛虫(ciliateMacronucleus)中，当使用这些生物体表达时可使用通用密码的变异体。

当以合成方式制备或改变核酸时，可利用表达该核酸的预期宿主的已知密码子偏好。例如，虽然本发明的核酸序列可在单子叶和双子叶植物种二者中表达，但是由于这些偏好已显示出不同所以可修饰序列以满足单子叶植物或双子叶植物的具体密码子偏好和GC含量偏好(Murray等，(1989)Nucleic Acids Res.17：477-98，此处引用作为参考)。因此，对特定氨基酸的玉米偏好密码子可衍生自已知玉米基因序列。来自玉米植物中28个基因的玉米密码子使用列于上文中Murray等的表4。

如本文所使用，提及核酸的“异源”指源自外来物种的核酸，或者如果来自同一物种则通过刻意的人为干扰使相对于其天然形式在组成和/或基因位点上发生实质性改变。例如，与异源结构基因上可操作地连接的启动子是来自与该结构基因所衍生自的物种不同的物种，或者，如果来自相同物种，则其中之一或二者均从其天然形式发生实质性改变。异源蛋白质可来自外来物种，或者，如果来自同一物种，则被刻意的人为干扰相对于其天然形式发生实质性改变。

“宿主细胞”意指含有载体并支持该表达载体复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞例如大肠埃希杆菌，或真核细胞例如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。宿主细胞优选地为单子叶或双子叶植物细胞，包括但不限于玉米、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、芸苔、大麦、小米和番茄。尤其优选的单子叶植物宿主细胞为玉米宿主细胞。

术语“杂交复合物”包括由两条单链核酸序列选择性相互杂交形成的双链核酸结构。

在向细胞插入核酸的内容中，术语“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”并包括将核酸掺入真核或原核细胞，其中该核酸可被整合入细胞基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转化成自主复制子或者瞬时表达的(例如，转染的mRNA)。

术语“已分离”指从在自然环境中与其伴随或相互作用的组分中实质上或基本游离的物质(例如核酸或蛋白质)。已分离物质任选包含在其天然环境中未发现伴随该物质的物质。如本文定义，“已分离”核酸也指“异源”核酸。除非另外说明，术语“ARGOS核酸”意指包含编码ARGOS多肽的多核苷酸(“ARGOS多核苷酸”)的核酸。

如本文所使用，“核酸”包括单链形式或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，除非另外限定，涵盖已知的具有天然核苷酸基本特性即能与单链核酸以类似天然核苷酸(例如，肽核酸)的方式杂交的类似物。

“核酸文库”意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含并实质上代表了特定生物基因组的全部转录片段。在标准分子生物学参考文献中教授了构建示例核酸文库(例如基因组和cDNA文库)的方法，例如Berger和Kimmel，分子克隆技术指南(GUIDE TO MOLECULARCLONING TECHNIQUES)，来自酶学方法丛书(the series METHODSIN ENZYMOLOGY)，第152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA(1987)；Sambrook等，分子克隆：实验室手册(MOLECULARCLONING：ALABORATORY MANUAL)，第2版，1-3卷，(1989)；以及分子生物学通用规程(CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY)，Ausubel等编辑，通用规程(CurrentProtocols)，Greene Publishing Associates，Inc.和John Wiley & Sons，Inc合资公司(1994增刊)。

如本文所使用，“可操作地连接”包括第一个序列(例如启动子)和第二个序列之间的功能性连接，其中该启动子序列起始并介导对应于第二个序列的DNA序列的转录。一般而言，可操作地连接意指被连接的核酸序列是邻近的，在需要连接两个蛋白质编码区处是邻近的并且在同一阅读框内。

术语“植物”包括完整植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子和植物细胞及其后代。植物细胞包括但不限于种子悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、枝条、配子体、孢子体、花粉以及小孢子。本发明方法中可用的植物种类通常宽泛至适用转化技术的高等植物种类，包括单子叶植物和双子叶植物，包括以下属的物种：南瓜属、玫瑰属、葡萄属、胡桃属、草莓属、莲花属、苜蓿属、Onobrychis、三叶草属、胡芦巴属、豇豆属、柑橘属、亚麻属、老鹳草属、木薯属、胡萝卜属、拟南芥菜属、芸苔属、萝卡属、芥子属、颠茄属、辣椒属、曼陀罗属、莨菪属、番茄属、烟草属、茄属、牵牛花属、洋地黄属、墨角纶属、菊苣属、向日葵属、莴苣属、雀麦属、天冬属、金鱼草属、萱草属、Nemesis、天竺葵属、黍属、狼尾草属、毛茛属、千里光属、喇叭舌属、黄瓜属、Browaalia、大豆属(Glycine)、豌豆属、菜豆属、黑麦草属、稻属、燕麦属、大麦属、黑麦属、葱属和小麦属。尤其优选的植物为玉米。

“产量”包括指收获时每英亩谷类作物的蒲式耳(bushel)，以谷物水分校正(通常为15％)。收获时测定谷物水分。测定校正后的谷物待测重量作为每蒲式耳重量(以磅计算)，用收获时的谷物水分校正。

“多核苷酸”包括脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，所述类似物具有天然核糖核苷酸的基本性质，即可在严格杂交条件下和与天然来源核苷酸实质相同的核苷酸序列杂交和/或者与天然核苷酸一样使得能够翻译成相同的氨基酸。多核苷酸可为天然或异源结构基因或调节基因的全长序列或子序列。除非另外指明，该术语包括特定序列及其互补序列。因此，为提高稳定性或其它原因而主链被修饰的DNA或RNA为该术语在本文中所指的“多核苷酸”。此外，含有罕见碱基(例如肌苷)或修饰碱基(例如三苯甲基化碱基)(仅举两例)的DNA或RNA为该术语在本文所指的多核苷酸。应该理解可对达到本领域技术人员已知的许多目的的DNA和RNA进行许多修饰。本文使用的术语多核苷酸涵盖多核苷酸的化学、酶或代谢修饰形式，以及病毒和细胞(尤其包括单细胞和复杂细胞)特有DNA和RNA的化学形式。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语用于其中一个或多个氨基酸残基为对应天然氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物以及天然氨基酸聚合物。

如本文所使用，“启动子”包括从转录起点的DNA上游区域并涉及识别和结合RNA聚合酶和其它起始转录的蛋白质。“植物启动子”为可在植物细胞中起始转录的启动子。示例植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒以及包含在植物细胞表达的基因的细菌(例如农杆菌或根瘤菌)中获得的启动子。启动子实例优选起始特定组织的转录，例如叶、根、种子、纤维、木质部脉管、通气管或厚壁组织。这些启动子被称为“组织优选的”。“细胞类型”特异启动子主要驱动一个或多个器官中特定细胞类型的表达，例如，根或叶的脉管细胞。“诱导型”或“调节型”启动子为受环境调控的启动子。可通过诱导启动子影响转录的环境条件的实例包括缺氧条件或光照条件。另一类启动子是发育调控型启动子，例如，驱动花粉发育过程中表达的启动子。组织优选、细胞类型特异性、发育调节型以及诱导型启动子构成了“非组成型”类启动子。“组成型”启动子为可在大多数环境条件下处于活性形式的启动子。

术语“ARGOS多肽”指一个或多个氨基酸序列。该术语也包括片段、变异体、同系物、等位基因或其前体(例如，前蛋白原或前蛋白)。“ARGOS蛋白”含有ARGOS多肽。除非另外说明，术语“ARGOS核酸”意指包含编码ARGOS多肽的多核苷酸(“ARGOS多核苷酸”)的核酸。

如本文所使用，“重组体”包括通过导入外源核酸而修饰的细胞或载体，或该细胞衍生自藉此修饰获得的细胞。因此，例如，作为刻意人为介入的结果，重组细胞可表达天然(非重组体)形式的细胞内相同形式中不存在的基因，或者表达或被异常表达、低下表达或不表达的天然基因。本文所用术语“重组体”不包含通过天然事件对细胞或载体的改变(例如，自发性突变、自然转化/转导/转位)，例如在没有刻意人为介入下发生的事件。

如本文所使用，“重组表达盒”为具有一系列特定核酸元件由重组或合成产生的核酸构建体，其可在靶细胞中转录特定核酸。重组表达盒可整合入质粒、染色体、线粒体DNA、质粒DNA、病毒或核酸片段。通常，表达载体的重组表达盒部分包括将要转录的核酸以及启动子。

术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”在本文中可互换使用，指整合入蛋白质、多肽或肽(统称为“蛋白质”)的氨基酸。氨基酸可以是天然氨基酸，除非另外限制，也可涵盖已知的与天然氨基酸以相似形式发挥功能的天然氨基酸类似物。

术语“选择性杂交”包括核酸序列与特定核酸目标序列在严格杂交条件下以比其与非目标核酸序列的杂交具有更高的可检测程度(例如，至少比背景高两倍)并实质上排除了非目标核酸的杂交。选择性杂交序列相互间通常具有约至少40％的序列同一性，优选60-90％的序列同一性，且最优选100％序列同一性(即互补)。

术语“严格条件”或“严格杂交条件”包括探针以比与其它序列更高可检测程度(例如，至少比背景高两倍)与其目标序列杂交的条件。严格条件依赖于序列并随环境不同而不同。通过调控杂交和/或洗涤条件的严格程度，可鉴定与探针最高100％互补的目标序列(同源探针)。或者，可调节严格度使序列中得以存在一些错配以检测较低相似度(异源探针)。探针的最佳长度为约500个核苷酸，但其长度也可从少于500个核苷酸到等于目标序列全长的范围内随意变化。

严格条件通常为盐浓度小于约1.5M钠离子的条件，通常约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，pH为7.0至8.3，用于短探针(例如，10到50个核苷酸)的温度至少为30℃，用于长探针(例如，大于50个核苷酸)的温度至少为约60℃。也可通过加入去稳定剂例如甲酰胺或Denhardt’s以达到严格条件。示例性低严格度条件包括在37℃、含30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲液中杂交，在50至55℃用1×至2×SSC(20×SSC＝3.0MNaCl/0.3M枸橼酸钠)洗涤。示例性中等严格度条件包括在37℃、40至45％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，在55至60℃用0.5×至1×SSC洗涤。示例性高严格度条件包括在37℃、50％甲酰胺、1MNaCl、1％ SDS杂交，在60至65℃用0.1×SSC洗涤。杂交后洗涤的功能通常为确保特异性，关键因素为终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体，可通过Meinkoth和Wahl，(1984)Anal.Biochem.138：267-84的方程计算Tm：T_m＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中，M为一价阳离子的摩尔浓度，％GC为DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸百分比，％甲酰胺为杂交溶液中甲酰胺百分比，L为杂交体的碱基对长度。Tm为在给定离子强度和pH下50％互补目标序列与完全匹配探针杂交时的温度。每1％的错配会使Tm下降约1℃；因此，可调节Tm、杂交条件和/或洗涤条件使其以期望同一性与序列杂交。例如，如果要找寻同一性≥90％的序列，可将Tm降低10℃。通常，所选严格条件比给定离子强度和pH下特异序列和其互补序列的热熔点(Tm)约低5℃。但是，非常严格条件可使用低于热熔点(Tm)1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严格条件可使用低于热熔点(Tm)6、7、8、9或10℃的杂交和/或洗涤；低严格条件可使用低于热熔点(Tm)11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤。通过使用方程、杂交和洗涤组合以及期望Tm，一般专业人员即可理解杂交严格度和/或洗涤溶液已阐述在内。如果错配结果的期望程度为低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，那么优选提高SSC浓度以使用更高的温度。核酸杂交的基本指导参见Tijssen，生物化学和分子生物学实验室技术—核酸探针杂交(LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY ANDMOLECULAR BIOLOGY--HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACIDPROBES)，第I部分，第2章，杂交原理及核酸探针分析策略综述(“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleicacid probe assays，”)Elsevier，New York(1993)；以及分子生物学通用规程(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，第2章，Ausubel等编辑，Greene Publishing和Wiley-Interscience，New York(1995)。除非另外说明，本发明中高严格度定义为在65℃、4×SSC、5×Denhardt’s(500ml水中含5g聚蔗糖、5g聚乙烯吡咯烷酮、5g牛血清白蛋白)、0.1mg/ml煮沸过的鲑精DNA以及25mM磷酸钠中杂交，以及在65℃、0.1×SSC、0.1％SDS中洗涤。

如本文所使用，“转基因植物”包括基因组中包含异源多核苷酸的植物。通常，异源多核苷酸可稳定地整合在基因组中，这样该多核苷酸传递至连续世代。异源多核苷酸可单独或者作为重组表达盒的一部分整合入基因组。本文中使用的“转基因”包括因异源核酸的存在而使基因型被改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括起始被如此改变的转基因植株以及由起始转基因植株的有性杂交或无性繁殖产生者。本文所用“转基因”不包括因常规植物育种方法或自然发生事件例如随机异体受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转位或自发突变引起的基因组(染色体或染色体外)的改变。

如本文所使用，“载体”包括用于宿主细胞转染并可在其中插入多核苷酸的核酸。载体通常为复制子。表达载体允许插入其中的核酸转录。

以下术语用于描述两个或多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参比序列”，(b)“对比窗口”，(c)“序列同一性”，(d)“序列同一性百分比”，以及(e)“实质同一性”。

如本文所使用，“参比序列”为用作序列对比基准的已定义序列。参比序列可以是特定序列的子序列或全部；例如，为全长cDNA或基因序列、或完整cDNA或基因序列的片段。

如本文所使用，“对比窗口”指包括多核苷酸序列的连续和特定片段，其中该多核苷酸序列可与参比序列对比并且其中对比窗口中的多核苷酸序列部分可含有相对于参比序列(不含添加或缺失)用于优化两个序列比对的添加或缺失(即裂隙)。通常，对比窗口长度至少为20个连续核苷酸，任选30、40、50、100或更长。本领域技术人员应理解通常引入裂隙罚分并将其从配对数值中减去以避免由于在多核苷酸序列中包含裂隙而引起的与参比序列的高度相似。

用于对比核苷酸和氨基酸序列的比对方法为本领域人员熟知。Smith和Waterman，(1981)Adv.Appl.Math 2：482中的局部同源性算法(BESTFIT)可优化比较序列的比对；也可通过Needleman和Wunsch，(1970)J.Mol.Biol.48：443-53中的同源比对算法(GAP)；还可通过Pearson和Lipman，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性检索方法(Tfasta和Fasta)；通过这些算法的计算机实施，包括但不限于：PC/Gene program中的CLUSTAL，(Intelligenetics，MountainView，California)和Wisconsin Genetics Software Package(WisconsinGenetics Software Package)第8版(可购自Genetics Computer Group

 programs(Accelrys，Inc.，San Diego，CA))中的TFASTA、GAP、BESTFIT、BLAST和FASTA。下列文献详细地阐述了CLUSTAL程序：Higgins和Sharp，(1988)Gene 73：237-44；Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-3；Corpet等，(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90；Huang等，(1992)Computer Applications in the Biosciences 8：155-65；以及Pearson等，(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-31。用于优化多序列总体比对的优选程序为PileUp(Feng和Doolittle，(1987)J.Mol.Evol.，25：351-60，且与Higgins和Sharp，(1989)CABIOS 5：151-53描述的方法相似，以参考形式并于本文)。用于相似性检索数据库的BLAST家族程序包括：在核苷酸数据库序列中进行核苷酸查询序列的BLASTN；在蛋白质数据库序列中进行核苷酸查询序列的BLASTX；在蛋白质数据库序列中进行蛋白质查询序列的BLASTP；在核苷酸数据库序列中进行蛋白质查询序列的TBLASTX和在核苷酸数据库序列中进行核苷酸查询序列的TBLASTX。参见分子生物学通用规程(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)，第19章，Ausubel等编辑，Greene Publishing和Wiley-Interscience，New York(1995)。

GAP使用了Needleman和Wunsch，supra的算法以寻找既能最大化配对数量又能最小化裂隙数量的两个完整序列的比对。GAP考虑所有可能的比对及裂隙位置，并创建最多配对碱基数目和最少裂隙的比对。这使得能够在匹配碱基单元中提供裂隙生成罚分和裂隙延伸罚分。GAP必须为其插入的每一个裂隙利用配对的裂隙生成罚分数量。如果选择裂隙延伸罚分大于0，GAP必须额外为每个被插入的裂隙利用裂隙长度与裂隙延伸罚分的乘积(make a profit for each gap insertedof the length of the gap times the gap extension penalty)。WisconsinGenetics Software Package第10版本中的默认裂隙生成罚分值和裂隙延伸惩罚值分别为8和2。裂隙生成和裂隙延伸罚分可表示为选自0至100之间的整数。因此，例如，裂隙生成和裂隙罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50或更多。

GAP代表了是最佳比对家族的一员。虽然这一家族中有很多成员，但是其它成员均没有更好的质量。GAP显示四个比对优值：质量、比率、同一性和相似性。质量是为了比对序列而最大化的度量。比率是将质量除以较短片段的碱基数目。同一性百分比是实际配对符号的百分比。相似性百分比是相似符号的百分比。忽略裂隙对应的符号。当一对符号的评分矩阵数值大于或等于0.50(相似性阈值)时会给出相似性评分。Wisconsin Genetics Software Package第10版本中用的评分矩阵为BLOSUM62(参见，Henikoff和Henikoff，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。

除非另外说明，本文提及的序列同一性/相似性数值指使用默认参数的BLAST2.0程序组件获得的数值(Altschul等，(1997)NucleicAcids Res.25：3389-402)。

正如本领域普通技术人员所理解，BLAST检索假设可将蛋白质建模为随机序列。但是，很多真实的蛋白质包含非随机序列区域(如同聚物束、短周期重复)或富含一个或多个氨基酸的区域。尽管蛋白质的其它区域完全不同，这些低复杂度区域仍可在非相关蛋白质之间比对。可使用很多低复杂度过滤程序减少这样的低复杂度比对。例如，可单独或联合使用SEG(Wooten和Federhen，(1993)Comput.Chem.17：149-63)和XNU(Claverie和States，(1993)Comput.Chem.17：191-201)低复杂度过滤器。

如本文所使用，两个核酸或多肽序列的“序列同一性”或“同一性”包括指在特定对比窗口下比对最大一致性时相同的两个序列中的残基。当序列同一性百分比用于指蛋白质时，人们认识到不相同的残基位置通常由于保守氨基酸替换而不同，其中氨基酸残基被其它具有相似化学性质(例如，电荷或疏水性)的氨基酸残基替换并因此不改变该分子的功能性质。在序列的保守替换不同时，可上调序列同一性百分比以修正该替换的保守性质。由于这些保守替换而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这一调整的方法为本领域技术人员所熟知。通常其中涉及将保守置换作为部分错配而非全部错配进行评分，藉此提高序列同一性百分比。因此，例如，当相同氨基酸评分为1且非保守替换评分为0时，保守替换评分介于0和1之间。例如，根据Meyers和Miller，(1988)Computer Applic.Biol.Sci.4：11-17的算法计算保守序列的评分，例如，如程序PC/GENE所实施(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)。

如本文所使用，“序列同一性百分比”指通过在对比窗口下比较两个优化比对序列得到的数值，其中对比窗口中的多核苷酸序列部分可包含与参比序列(其不包含增加或缺失)相比用于两个序列最佳比对的增加或缺失(即，裂隙)。通过测定两序列中出现的相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量以得到配对位置的数量，将配对位置的数量除以对比窗口中总位置数量并将该结果乘以100即得到序列同一性百分比。

术语多核苷酸序列的“实质同一性”指用所述采用标准参数的比对程序之一与参比序列对比时，含有介于50-100％序列同一性的序列的多核苷酸，优选至少50％序列同一性，优选至少60％序列同一性，优选至少70％，更优选至少80％，尤其优选至少90％，最优选至少95％序列同一性的多核苷酸。本领域技术人员应理解可适当调整这些数值通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框位置等测定由两条核苷酸序列编码的蛋白质的对应同一性。用于这些目的的氨基酸序列实质同一性通常指介于55-100％的序列同一性，优选至少55％，优选至少60％，更优选至少70％、80％、90％，且最优选至少95％的序列同一性。

核苷酸序列实质同一的另一个指征为两个分子是否在严格条件下相互杂交。基因密码的简并性允许很多可引起编码相同氨基酸的核苷酸序列变化的氨基酸替换，因此可能编码相同多肽的DNA序列在严格条件下并不会相互杂交。例如当使用遗传密码许可的最大密码子简并性产生核酸拷贝时就可能发生这种情况。两个核酸序列实质同一的一个指征为由第一个核酸编码的多肽与第二个核酸编码的多肽有免疫交叉反应性。

本文中多肽的术语“实质同一性”表明包含与参比序列的序列同一性介于55-100％的序列的肽，优选至少在特定对比窗口中与参比序列有55％序列同一性，优选60％，优选70％，更优选80％，最优选至少90％或95％的序列同一性。优选采用Needleman和Wunsch，supra的同源性比对算法指导最佳比对。两个肽序列实质同一的一个指征是第一个肽与抗第二多肽的抗体有免疫反应性。因此，例如当两个肽仅是由于保守替换而不同时第一个多肽与第二个多肽实质同一。此外，当两个多肽因非保守改变而不同时，如果抗体识别的表位实质同一，那么第一个多肽与第二个多肽是实质同一的。共有如上所述的序列(除了残基位置不同)“实质类似”的肽可由于保守氨基酸变化而不同。

本发明公开ARGOS多核苷酸和多肽。本发明的新颖核苷酸和蛋白质的表达形式表明它们可调节细胞数量并因此在植物发育中发挥重要作用。该多核苷酸可在多种植物组织中表达。因此该多核苷酸和多肽可为操纵植物发育以改变种子和营养组织发育、时序或组成提供机会。可利用这一点产生不育植株、无子植物或改变胚乳组成的植物。

核酸

本发明提供，特别是含有ARGOS多核苷酸的RNA、DNA的已分离核酸及其类似物和/或嵌合体。

本发明也包括在不同组织中被优化表达的多核苷酸。例如，对于在玉米植物中多核苷酸的表达，可改变序列以补偿特异密码子偏好并可依据Murray等之前所述改变GC含量。玉米植物中28个基因的玉米密码子的使用列于表4，如Murray等之前所述。

本发明的ARGOS核酸包含已分离的ARGOS多核苷酸，其中包括：

(a)编码ARGOS多肽及其保守修饰的和多态变异体的多核苷酸；

(b)与(a)或(b)的多核苷酸具有至少70％序列同一性的多核苷酸；

(c)(a)或(b)的多核苷酸的互补序列。

下表(表1)列出了多核苷酸和多肽的特异同一性并公开于本文。

表1

 

基因名称	植物种	多核苷酸/多肽	SEQ ID NO：
				ZmARGOS1	玉米	多核苷酸多肽基因组序列	SEQ ID NO：1SEQ ID NO：2SEQ ID NO：71
ZmARGOS2	玉米	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：3SEQ ID NO：4
				ZmARGOS3	玉米	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：5SEQ ID NO：6
ZmARGOS4	玉米	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：7SEQ ID NO：40
				ZmARGOS5	玉米	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：8SEQ ID NO：41
ZmARGOS6	玉米	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：9SEQ ID NO：42
				ZmARGOS7	玉米	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：10SEQ ID NO：43
ZmARGOS8	玉米	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：11SEQ ID NO：44
				ZmARGOS9	玉米	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：12SEQ ID NO：45
OsARGOS1	水稻	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：13SEQ ID NO：46
				OsARGOS2	水稻	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：14SEQ ID NO：47
OsARGOS3	水稻	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：15SEQ ID NO：48
				OsARGOS4	水稻	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：16SEQ ID NO：49
OsARGOS5	水稻	多核苷酸	SEQ ID NO：17

 

		多肽	SEQ ID NO：50
				OsARGOS6	水稻	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：18SEQ ID NO：51
OsARGOS7	水稻	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：19SEQ ID NO：52
				OsARGOS8	水稻	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：20SEQ ID NO：53
GmARGOS1	大豆	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：21SEQ ID NO：54
				GmARGOS2	大豆	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：22SEQ ID NO：55
GmARGOS3	大豆	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：23SEQ ID NO：56
				GmARGOS4	大豆	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：24SEQ ID NO：57
GmARGOS5	大豆	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：25SEQ ID NO：58
				SbARGOS1	高粱	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：29SEQ ID NO：62

 

基因名称	植物种	多核苷酸/多肽	SEQ ID NO：
				SbARGOS2	高粱	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：30SEQ ID NO：63
SbARGOS3	高粱	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：31SEQ ID NO：64
				SbARGOS4	高粱	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：32SEQ ID NO：65
SbARGOS5	高粱	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：33SEQ ID NO：66
				SbARGOS6	高粱	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：34SEQ ID NO：67
SbARGOS7	高粱	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：35SEQ ID NO：68
				SbARGOS8	高粱	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：36SEQ ID NO：69
SbARGOS9	高粱	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：37SEQ ID NO：70
				AtARGOS1	拟南芥	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：26SEQ ID NO：59
AtARGOS2	拟南芥	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：27SEQ ID NO：60
				AtARGOS3	拟南芥	多核苷酸多肽	SEQ ID NO：28SEQ ID NO：61

核酸构建

可使用(a)标准重组方法，(b)合成技术或其组合，得到本发明已分离的核酸。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸被克隆、扩增或构建自真菌或细菌。

该核酸可适当包含除本发明多核苷酸之外的序列。例如，可将包含一个或多个核酸内切酶限制位点的多克隆位点插入该核酸以辅助该多核苷酸的分离。也可插入可翻译序列辅助分离本发明已翻译的多核苷酸。例如，六-组氨酸标记序列可提供纯化本发明蛋白质的便利方法。本发明核酸-不包括多核苷酸序列-可任选为载体、衔接头或接头以克隆和/或表达本发明多核苷酸。可向该克隆和/或表达序列加入其它序列优化它们在克隆和/或表达中的功能、辅助分离该多核苷酸或促进将该多核苷酸导入细胞。通常，本发明核酸的长度小于本发明其多核苷酸的长度，小于20K碱基对，通常小于15Kb，经常小于10Kb。克隆载体、表达载体、衔接头和接头的使用为本领域已知。示例性核酸包括该类载体，例如M13、λZAP Express、λZAP II、λgt10、λgt11、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II、λDASH II、λEMBL 3、λEMBL4、pWE15、SuperCos 1、SurfZap、Uni-ZAP、pBC、pBS+/-、pSG5、pBK、pCR-Script、pET、pSPUTK、p3’SS、pGEM、pSK+/-、pGEX、pSPORTI和II、pOPRSVI CAT、pOPI3 CA、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMC1neo、pOG44、pOG45、pFRTβGAL、pNEOβGAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、λMOSSlox和λMOSElox。本发明的任选载体包括但不限于λZAP II和pGEX。各种核酸的描述参见，例如，Stratagene Cloning Systems，Catalogs 1995，1996，1997(La Jolla，CA)和Amersham Life Sciences，Inc，Catalog’97(Arlington Heights，IL)。

构建核酸的合成方法

可通过直接化学合成得到本发明已分离的核酸，通过如下方法：Narang等，(1979)Meth.Enzymol.68：90-9的磷酸三酯法；Brown等，(1979)Meth.Enzymol.68：109-51的磷酸二酯法；Beaucage等，(1981)Tetra.Letts.22(20)：1859-62的二乙基亚磷酰胺法；上文中Beaucage等描述的固相亚磷酰胺三酯法，例如使用自动合成仪(例如Needham-VanDevanter，等.，(1984)Nucleic Acids Res.12：6159-68所述)和美国专利第4,458,066号的固体载体方法。化学合成通常产生单链寡聚核苷酸。可通过与互补序列杂交或使用单链作为模板通过DNA聚合酶的聚合作用转化成双链DNA。技术人员可认识到虽然化学合成DNA限制于约100个碱基的序列，但是可通过连接较短序列得到更长的序列。

UTRs和密码子偏好

一般而言，已发现翻译效率受RNA5’非编码或非翻译区(5’UTR)特异序列元件的调控。阳性序列基序包括翻译起始共有序列(Kozak，(1987)Nucleic Acids Res.15：8125)和5<G>7甲基GpppG RNA帽结构(Drummond等.，(1985)Nucleic Acids Res.13：7375)。阴性元件包括稳定的分子内5’UTR茎-环结构(Muesing等，(1987)Cell 48：691)和AUG序列或在5’UTR中位于适当AUG之后的短开放阅读框(Kozak，supra，Rao等，(1988)Mol.and Cell.Biol.8：284)。因此本发明提供用于调节异源编码序列翻译的5’和/或3’UTR区。

此外，可修饰本发明多核苷酸的多肽编码区段以改变密码子使用。被改变的密码子使用可用于改变翻译效率和/或优化在期望宿主中表达的编码序列或优化在玉米中表达的异源序列的密码子使用。可使用商业购买的软件包例如购自University of Wisconsin GeneticsComputer Group的“密码子偏好”分析本发明多核苷酸编码区的密码子使用。参见Devereaux等，(1984)Nucleic Acids Res.12：387-395；或MacVector 4.1(Eastman Kodak Co.，New Haven，Conn.)。因此，本发明提供了至少一种本发明多核苷酸编码区特有的密码子使用频率。可用于测定密码子使用频率的多核苷酸(每个氨基酸3个核苷酸)数量可为从3至本文提供的本发明多核苷酸数量之间的任何整数。或者该多核苷酸为全长序列。用于统计分析的示例性序列数量为至少1、5、10、20、50或100个。

序列改组

本发明提供了使用本发明多核苷酸进行序列改组的方法和藉此得到的组合物。序列改组阐述于PCT出版物第96/19256号。也可参见Zhang等.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：4504-9；和Zhao等.，(1998)Nature Biotech 16：258-61。一般而言，序列改组可提供产生具有期望特性的多核苷酸文库，其可供选择或用于筛选。重组多核苷酸文库产生自相关序列多核苷酸群，其包含序列区，其具有实质序列同一性并可体外或体内同源重组。序列重组多核苷酸群包含具有期望或有利特性并可通过适当选择或筛选方法选择的多核苷酸亚群。该特性为可用于在筛选系统中选择或检测的任何性质或特性，可包括如下性质：被编码蛋白、转录元件、序列控制转录、RNA加工、RNA稳定性、染色质构象、翻译或基因或转基因的其它表达性质、复制元件、蛋白质-结合元件等，例如任何可形成可选择或可检测性质的特性。在一些实施方案中，该所选择特性为与本文提供的野生型蛋白质相比改变的Km和/或Kcat。在其它实施方案中，产生自序列改组的蛋白质或多核苷酸比非改组野生型多核苷酸的配体结合亲和性更强。在又一实施方案中，产生自序列改组的蛋白质或多核苷酸与非改组野生型多核苷酸相比其最优pH改变。该类性质的增加可至少为野生型数值的110％、120％、130％、140％或大于150％。

重组表达盒

本发明进一步提供包含本发明核酸的重组表达盒。可使用编码本发明期望多核苷酸的核酸(例如编码足够长的多肽以编码本发明活性蛋白质的基因组序列的cDNA)构建可导入期望宿主细胞的重组表达盒。重组表达盒通常包含与翻译起始调节序列可操作地连接的本发明多核苷酸，其可引导该多核苷酸在预期宿主细胞中(例如被转化植物的组织)的转录。

例如，植物表达载体可包括(1)5’和3’调节序列转录控制的克隆植物基因和(2)显性选择标记。需要时该类植物表达载体也可包含启动子调节区(例如，可形成诱导型或组成型、环境或发育调节型或细胞或组织特异性/选择性表达)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。

可使用可在再生植物的所有组织中引导本发明多核苷酸表达的植物启动子片段。该类启动子在本文中被称作“组成型”启动子，其在大多数环境条件下和发育或细胞分化状态下是活性的。组成型启动子的实例包括来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的T-DNA的1’或2’启动子、Smas启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利第5,683,439号)、Nos启动子、rubisco启动子、GRP1-8启动子、来自花椰菜花斑病毒(CaMV)的35S启动子(如Odell等，(1985)Nature313：810-2所述)；水稻肌动蛋白(McElroy等，(1990)Plant Cell 163-171)；泛素(Christensen等，(1992)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等，(1992)Plant Mol.Biol.18：675-89)；pEMU(Last等，(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-8)；MAS(Velten，等，(1984)EMBO J.3：2723-30)；玉米H3组蛋白(Lepetit等，(1992)Mol.Gen.Genet.231：276-85；Atanassvoa等，(1992)Plant Journal 2(3)：291-300)；ALS启动子如PCT申请WO 96/30530所述；GOS2(美国专利第6,504,083号)和其它本领域技术人员已知的来自各种植物基因的转录起始区。就本发明而言泛素为单子叶植物表达的优选启动子。

或者，该植物启动子可引导本发明多核苷酸在特异性组织中或在更精确的环境或发育控制条件下表达。该类启动子被称作“诱导型”启动子(Rab17，RAD29)。可通过诱导型启动子影响转录的环境条件包括病原体攻击、厌氧环境或存在光照。诱导型启动子的实例为Adh1启动子，其可被缺氧或冷应激诱导，Hsp70启动子，其可被热应激诱导，PPDK启动子，其可被光诱导。

发育控制下的启动子实例包括仅在或优选在某些组织例如叶、根、果实、种子或花中起始转录的启动子。启动子的操作也可根据其在基因组中的位置而变化。因此，诱导型启动可在某些位点成为完全或部分组成型的。

如果需要多肽表达，通常可在多核苷酸编码区的3’-端包含多腺苷酸化区。该多腺苷酸化区可来自各种植物基因或来自T-DNA。被加入的3’端序列可衍生自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或来自另一植物基因或较少优选任何其它真核基因。该类调节元件的实例包括但不限于3’终止和/或多腺苷酸化区例如来自根癌农杆菌胭脂碱合酶(nos)基因者(Bevan等，(1983)Nucleic Acids Res.12：369-85)；马铃薯蛋白水解酶抑制剂II(PINII)基因(Keil等，(1986)Nucleic AcidsRes.14：5641-50；和An等，(1989)Plant Cell 1：115-22)；以及CaMV19S基因(Mogen等，(1990)Plant Cell 2：1261-72)。

可在部分编码序列的5’非翻译区或编码序列加入内含子序列以增加在胞质溶胶中积累的成熟信号的量。在植物和动物表达构建体二者的转录单元中包含可剪接内含子已显示可在mRNA和蛋白质二者水平上增加基因表达至1000-倍(Buchman和Berg，(1988)Mol.CellBiol.8：4395-4405；Callis等，(1987)Genes Dev.1：1183-200)。当置于转录单位的5’端附近时该基因表达的内含子增强作用通常最强。使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6，Bronze-1内含子为本领域已知。可参见THE MAIZE HANDBOOK(玉米手册)，第116章，Freeling和Walbo(编辑)，Springer，New York(1994)。

植物信号序列包括但不限于将蛋白质定向于植物细胞胞外基质的编码信号肽的DNA/RNA序列(Dratewka-Kos等，(1989)J.Biol.Chem.264：4896-900)，例如本发明中可用皱叶烟草(Nicotianaplumbaginifolia)扩展基因(DeLoose等，(1991)Gene 99：95-100)；将蛋白质定向于液泡的信号肽，例如马铃薯sporamin基因(Matsuka等，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：834)和大麦凝集素基因(Wilkins等，(1990)Plant Cell，2：301-13)；可引起蛋白质分泌的信号肽，例如PRIb信号肽(Lind等，(1992)Plant Mol.Biol.18：47-53)或大麦α淀粉酶(BAA)(Rahmatullah等.，(1989)Plant Mol.Biol.12：119，以参考形式并于本文)或将蛋白质定位于质体的信号肽，例如油菜籽烯酰基ACP还原酶(Verwaert等，(1994)Plant Mol.Biol.26：189-202)。与ARGOS多核苷酸融合的大麦α淀粉酶信号序列为本发明用于在玉米中表达的优选构建体。

包含来自本发明多核苷酸序列的载体通常包含一个标记基因，其可形成植物细胞的选择性表型。通常该选择性标记基因编码抗生素抗性，适当的基因包括编码抗生素大观霉素抗性的基因(例如，aada基因)、编码链霉素抗性的链霉素磷酸转移酶(SPT)基因、编码卡那霉素或遗传霉素抗性的新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、编码潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶(HPT)基因、编码可抑制乙酰乳酸合酶(ALS)的除草剂(尤其是磺酰脲类除草剂)抗性的基因(例如含有引起该抗性的突变的乙酰乳酸合成酶(ALS)基因，尤其是S4和/或Hra突变)、编码可抑制谷氨酰胺合成酶的除草剂抗性的基因，例如草胺膦或草丁膦(例如bar基因)或其它本领域已知基因。该bar基因编码对除草剂草丁膦的抗性，ALS基因编码对除草剂氯磺隆的抗性。

可用于高等植物中基因表达的常用载体为本领域已知并包括衍生自如Rogers等，(1987)Meth.Enzymol.153：253-77所描述的根癌农杆菌的肿瘤-诱导(Ti)质粒。这些载体为植物整合型载体，因为在转化时该载体将载体DNA的一部分整合入宿主植物的基因组中。可用于本文的示例性根癌农杆菌载体为Schardl等，(1987)Gene 61：1-11和Berger等，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86：8402-6描述的质粒pKYLX6和pKYLX7。本文另一可用载体为购自CLONTECHLaboratories，Inc.(Palo Alto，CA)的质粒pBI101.2。

宿主细胞中的蛋白质表达

使用本发明的核酸可在重组工程细胞例如细菌、酵母、昆虫、哺乳动物或优选植物细胞中表达本发明蛋白质。该细胞在非-天然条件(例如，数量、组成、位置和/或时间)下生产该蛋白质，因为它们已通过人为干扰发生遗传学改变以做到这一点。

预期本领域技术人员熟知可用于表达编码本发明蛋白质的核酸的很多表达系统。本文不详细描述在原核细胞或真核细胞中表达蛋白质的各种方法。

简略而言，可通过例如将DNA或cDNA与启动子(可为组成型或诱导型)可操作地连接然后将其并入表达载体以完成编码本发明蛋白质的已分离核酸的表达。该载体适用于原核细胞或真核细胞中的复制和整合。典型的表达载体包含用于调节编码本发明蛋白质DNA表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。为了得到已克隆基因的高水平表达，需要构建包含至少一个引导转录的强启动子(例如泛素)、用于翻译起始的核糖体结合位点和转录/翻译终止子的表达载体。根据所提供的组成型表达的范围将组成型启动子分类。因此，有些为弱组成型启动子，其它为强组成型启动子。通常，“弱启动子”意指驱动编码序列低水平表达的启动子。“低水平”意指约1/10000转录物至约1/100000转录物至约1/500,000转录物的水平。相反，“强启动子”可驱动编码序列“高水平”表达，或约1/10转录物至约1/100转录物至约1/1000转录物。

技术人员将认识到可修饰本发明蛋白质而不降低其生物学活性。一些修饰可促进靶分子克隆、表达或并入融合蛋白。该类修饰为本领域技术人员熟知并包括，例如，在氨基端加入甲硫氨酸以提供起始位点，或在两端之一放置附加氨基酸(例如聚组氨酸)以产生适当定位的限制酶切位点或终止密码子或纯化序列。

原核细胞中的表达

原核细胞可用作表达宿主。原核细胞最普遍的代表为各种大肠埃希杆菌株(E.coli)；但是也可使用其它菌株。通常使用的原核控制序列(本文定义为包括转录起始启动子，任选含有操作子，还有核糖体结合位点序列)包括这些通常使用的启动子例如β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Chang等，(1977)Nature 198：1056)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel，等，(1980)Nucleic Acids Res.8：4057)和衍生自λ的PL启动子和N-基因核糖体结合位点(Shimatake等，(1981)Nature 292：128)。也可在在转染大肠杆菌的DNA载体中包含选择标记。该类标记的实例包括对氨苄青霉素、四环素或氯霉素具有抗性的基因。

所选择载体允许将相关基因导入适当的宿主细胞中。细菌载体通常为质粒或噬菌体来源。用噬菌体载体颗粒感染或用裸露的噬菌体载体DNA转染适当的细菌细胞。如果使用质粒载体，用该质粒载体DNA转染细菌细胞。可使用芽孢杆菌和沙门氏菌属获得用于表达本发明蛋白的表达系统(Palva等，(1983)Gene 22：229-35；Mosbach等，(1983)Nature 302：543-5)。Pharmacia的pGEX-4T-1质粒载体为本发明优选的大肠杆菌表达载体。

真核细胞中的表达

许多真核表达系统例如酵母、昆虫细胞系、植物和哺乳动物细胞为本领域技术人员已知。如下简述，本发明可在这些真核系统中表达。在一些实施方案中，将如下文所讨论的转化/转染植物细胞作为生产本发明蛋白质的表达系统。

在酵母中合成异源蛋白质已广为人知。Sherman等，(1982)METHODS IN YEAST GENETICS，Cold Spring Harbor Laboratory为广为认可的描述可用于在酵母中生产蛋白质的各种方法的专著。用于生产真核蛋白质的两种广泛使用的酵母为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。用于在酿酒酵母和毕赤酵母中表达的载体、菌种和方案为本领域已知并可从供应商购买(例如，Invitrogen)。适当的载体通常具有表达控制序列，例如启动子(包括3-磷酸甘油酸酯激酶或醇氧化酶)和复制起点、终止序列等。

本发明蛋白质一旦表达即可通过裂解细胞并将标准蛋白质分离技术应用于该裂解产物或沉淀从酵母中分离。可通过使用免疫印迹技术或其它标准免疫测定技术的放射免疫测定法监控纯化过程。

也可将编码本发明蛋白质的序列与各种表达载体连接用于转染例如哺乳动物、昆虫或植物来源的细胞培养物。哺乳动物细胞系统常为单层细胞形式虽然也可使用哺乳动物细胞悬液。本领域已开发了许多可表达完整蛋白质的适当宿主细胞系，包括HEK293、BHK21和CHO细胞系。这些细胞的表达载体可包括表达控制序列，例如复制起点、启动子(例如，CMV启动子、HSV tk启动子或pgk(磷酸甘油酸酯激酶)启动子)、增强子(Queen等，(1986)Immunol.Rev.89：49)和必要的加工信息位点，例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、多腺苷酸化位点(例如，SV40大T抗原poly A附加位点)和转录终止子序列。用于生产本发明蛋白质的其它动物细胞可来自例如美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(第7版，1992)。

用于在昆虫细胞中表达本发明蛋白质的适当载体通常衍生自SF9杆状病毒。适当的昆虫细胞系包括蚊幼虫、蚕、粘虫、蛾和果蝇细胞系，例如Schneider细胞系(参见，例如，Schneider，(1987)J.Embryol.Exp.Morphol.27：353-65)。

对于酵母而言，当使用更高级的动物或植物宿主细胞时通常将多腺苷酸化或转录终止子序列并入载体中。终止子序列的一个实例为来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。也可包括用于准确剪接转录物的序列。剪接序列的一个实例为来自SV40的VP1(Sprague等，(1983)J.Virol.45：773-81)。此外，可将在宿主细胞中控制复制的基因序列并于载体中例如存在于牛乳头状瘤病毒类型-载体中者(Saveria-Campo，“Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector，”DNACLONING：A PRACTICAL APPROACH，第二卷，Glover(编辑)，IRL出版社，Arlington，VA，第213-38页(1985))。

此外，可使用置于适当植物表达载体中的AGOS基因转化植物细胞。然后可从植物愈伤组织中分离该多肽或用转化细胞再生转基因植物。可收获该转基因植物，并可对适当的组织运用大规模蛋白质萃取和纯化技术。

植物转化方法

已知很多向植物中导入外源基因的方法并可用于向植物宿主中插入ARGOS多肽，包括生物学和物理学植物转化方案。参见，例如，Miki，等，“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants，”METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY ANDBIOTECHNOLOGY，Glick and Thompson(编辑)，CRC Press，Inc.，Boca Raton，第67-88页(1993)。所选方法随宿主植物而变化，包括化学感染方法例如磷酸钙、微生物介导的基因转移例如农杆菌(Horsch，等，(1985)Science 227：1229-31)、电穿孔、显微注射和基因枪轰击。

植物细胞或植物组织转化和再生的表达盒和载体以及体外培养方法为已知并可获得。参见，例如，Gruber，等.，“Vectors for PlantTransformation，”METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGYAND BIOTECHNOLOGY，supra，第89-119页。

可通过一种或多种通常使用的直接导入细胞的技术将已分离多核苷酸或多肽导入植物。该类方案可根据基因修饰靶向的生物体、细胞、植物或植物细胞(即单子叶或双子叶)的类型而变化。用于转化植物细胞的适当方法包括显微注射(Crossway等，(1986)Biotechniques4：320-334；美国专利第6300543号)、电穿孔(Riggs等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606)、直接基因转移(Paszkowski等，(1984)EMBO J.3：2717-2722)和基因枪颗粒加速(参见，例如，Sanford等，美国专利第4945050号；WO 91/10725；和McCabe等，(1988)Biotechnology 6：923-926)。也可参见Tomes，等，通过基因枪轰击直接向完整植物细胞转移DNA(Direct DNA Transfer into Intact Plant CellsVia Microprojectile Bombardment).第197-213页，Plant Cell，Tissue andOrgan Culture，Fundamental Methods.O.L.Gamborg & G.C.Phillips(编辑)，Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York，1995；美国专利第5736369号(分生组织)；Weissinger等，(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477；Sanford，等，(1987)Particulate Science and Technology5：27-37(洋葱)；Christou等，(1988)Plant Physiol.87：671-674(大豆)；Datta等.，(1990)Biotechnology 8：736-740(水稻)；Klein等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(玉米)；Klein等，(1988)Biotechnology 6：559-563(玉米)；WO 91/10725(玉米)；Klein等，(1988)Plant Physiol.91：440-444(玉米)；Fromm等，(1990)Biotechnology8：833-839；和Gordon-Kamm等，(1990)Plant Cell 2：603-618(玉米)；Hooydaas-Van Slogteren & Hooykaas(1984)Nature(London)311：763-764；Bytebier等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5345-5349(百合科)；De Wet等，(1985)In The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues，G.P.Chapman等(编辑)，第197-209页；Longman，NY(花粉)；Kaeppler等，(1990)Plant Cell Reports9：415-418；以及Kaeppler等，(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(whisker-介导转化)；美国专利第5693512号(超声)；D’Halluin等，(1992)Plant Cell 4：1495-1505(电穿孔)；Li等，(1993)Plant Cell Reports12：250-255；Christou和Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(水稻)；Osjoda等，(1996)Nature Biotech.14：745-750；农杆菌介导的玉米转化(美国专利第5981840号)；二氧化硅晶须方法(Frame等，(1994)Plant J.6：941-948)；激光方法(Guo等，(1995)Physiologia Plantarum93：19-24)；超声方法(Bao等，(1997)Ultrasound in Medicine &Biology 23：953-959；Finer and Finer(2000)Lett Appl Microbiol.30：406-10；Amoah等，(2001)J Exp Bot 52：1135-42)；聚乙二醇方法(Krens等，(1982)Nature 296：72-77)；可使用电穿孔转化单子叶和双子叶细胞的原生质体(Fromm等，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：5824-5828)和显微注射(Crossway等，(1986)Mol.Gen.Genet.202：179-185)；均以参考形式并于本文。

基于农杆菌的转化

将表达载体导入植物最普遍使用的方法是基于农杆菌的天然转化系统。根癌农杆菌(A.tumefaciens)和毛根农杆菌(A.rhizogenes)为植物致病性土壤细菌，其可遗传转化植物细胞。根癌农杆菌和毛根农杆菌的Ti和Ri质粒分别携带用于遗传转化植物的基因。参见，例如，Kado，(1991)Crit.Rev.Plant Sci.10：1。农杆菌载体系统和农杆菌介导的基因转移方法阐述于Gruber等，supra；Miki等，supra；和Moloney等，(1989)Plant Cell Reports 8：238。

相似的，该基因可插入分别来自根癌农杆菌或毛根农杆菌的Ti和Ri质粒的T-DNA区。因此，可使用这些质粒如上所述构建表达盒。已知许多控制序列，当其与异源编码序列偶联并转化入宿主有机体时就原始编码序列的组织/器官特异性而言呈现出保真基因表达。参见，例如，Benfey和Chua，(1989)Science 244：174-81。尤其适用于这些质粒的控制序列为该基因在各种靶植物中组成型叶-特异性表达的启动子。其它可用的控制序列包括来自胭脂碱合酶(NOS)基因的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2，可购自美国典型培养物保藏中心，编号为ATCC67238。如果使用该体系则来自Ti或Ri质粒之一的毒性(vir)基因也必须存在，或与T-DNA部分一起或通过二元系统(其中毒力基因存在于另一独立的载体中)。该类转化植物细胞的系统，其中使用的载体以及方法阐述于美国专利第4658082号，美国专利申请第913914号，申请日期1986年10月1日，如美国专利第5262306号中引用，授权于1993年11月16日；和Simpson等，(1986)Plant Mol.Biol.6：403-15(也被‘306专利引用)；其完整内容均以参考形式并于本文。

构建之后可将这些质粒置于毛根农杆菌或根癌农杆菌并将这些载体用于转化植物种细胞，其对镰孢菌属(Fusarium)或支链孢属(Alternaria)的感染敏感。本发明也涵盖其它转基因植物包括但不限于大豆、玉米、高粱、苜蓿、水稻、三叶草、卷心菜、香蕉、咖啡、芹菜、烟草、豇豆、棉花、甜瓜和胡椒。选择毛根农杆菌还是根癌农杆菌取决于藉此转化的植物。通常根癌农杆菌为转化优选的生物体。大多数双子叶植物、一些裸子植物和少数单子叶植物(例如，Liliales和Arales的某些成员)对根癌农杆菌感染敏感。毛根农杆菌的宿主范围也较宽，包括大多数双子叶植物和一些裸子植物，其包括豆科(Leguminosae)、菊科(Compositae)和藜科(Chenopodiaceae)的成员。单子叶植物的转化现在取得一些成功。欧洲专利申请第604662 A1号公开了用农杆菌转化单子叶植物的方法。欧洲专利第672752A1公开了用未成熟胚的盾片以农杆菌转化单子叶植物。Ishida等讨论了通过将根癌农杆菌与未成熟胚接触转化玉米的方法(NatureBiotechnology 14：745-50(1996))。

一经转化，这些细胞可用于再生转基因植物。例如，可用这些载体通过损伤植物并将载体引入伤口位点从而感染整个植物。可损伤植物的任何部分，包括叶、茎和根。或者可用这些载体接种外植体形式的植物组织，例如子叶组织或叶盘并在促进植物再生的条件下培养。用毛根农杆菌和根癌农杆菌(包含编码烟曲霉毒素降解酶的基因)接种植物组织形成的根或枝条可作为植物组织来源，或通过体细胞胚胎发育或器官形成再生烟曲霉毒素抗性转基因植物。该类再生植物组织的方法公开于Shahin，Theor.Appl.Genet.69：235-40(1985)；美国专利第4658082号；Simpson，等.，supra；美国专利申请第913913号和913914号，均申请于1986年10月1日，如美国专利申请第5262306号(授权于1993年11月16日)所引用，完整公开内容以参考形式并于本文。

直接基因转移

虽然农杆菌介导转化的宿主范围很广，一些主要的谷类作物种和裸子植物通常对该基因转移方法具有抗性，尽管最近已在水稻中取得一些成功(Hiei，等，(1994)The Plant Journal 6：271-82)。已研发了数种植物转化的方法(总称为直接基因转化)作为农杆菌介导转化的另一选择。

一种广泛适用的植物转化方法为微粒介导转化，其中将DNA载于1-4μm微粒的表面。用可将微粒加速至300至600m/s速度足以穿透植物细胞壁和膜的基因枪设备将该表达载体导入植物组织(Sanford等，(1987)Part.Sci.Technol.5：27；Sanford，(1988)TrendsBiotech 6：299；Sanford，(1990)Physiol.Plant 79：206；和Klein等，(1992)Biotechnology 10：268)。

另一种向植物物理传递DNA的方法为如Zang，等，(1991)BioTechnology 9：996中阐述的靶细胞超声。或者，使用脂质体或质体融合向植物中导入表达载体。参见，Deshayes等，(1985)EMBO J.4：2731；和Christou等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：3962。使用CaCl₂沉淀可直接摄取DNA至原生质体，也有报导使用聚乙烯醇或聚L-鸟氨酸。参见，例如，Hain，等，(1985)Mol.Gen.Genet.199：161；and Draper，et al.，(1982)Plant Cell Physiol.23：451。

已阐述了原生质体、完整细胞和组织的电穿孔。参见，例如，Donn等，(1990)，Abstracts of the VIIth Int’l.Congress on Plant Cell andTissue Culture IAPTC，A2-38，第53页；D’Halluin，等，(1992)Plant Cell4：1495-505；和Spence等，(1994)Plant Mol.Biol.24：51-61。

增加ARGOS多肽的活性和/或水平

提供了增加本发明ARGOS多肽活性和/或水平的方法。可通过向植物提供ARGOS多肽增加本发明ARGOS多肽的水平和/或活性。可通过向植物中导入编码ARGOS多肽的氨基酸序列、向植物中导入编码ARGOS多肽的核苷酸序列或通过修饰编码本发明ARGOS多肽的基因座提供ARGOS多肽。

如本文其它部分所述，本领域已知许多向植物提供多肽的方法，包括但不限于向植物中直接导入多肽，向植物中导入(瞬时或稳定)编码具有细胞数量调节物活性的多肽的多核苷酸构建体。也应该认识到本发明方法可应用不可在已转化植物中引导蛋白质或RNA表达的多核苷酸。因此，可通过改变编码ARGOS多肽或其启动子的基因增加ARGOS多肽的水平和/或活性。参见，例如，Kmiec，美国专利第5565350号；Zarling等，PCT/US93/03868。因此提供了携带ARGOS基因突变的诱变植物，其中该突变可增加ARGOS基因的表达或增加被编码ARGOS多肽的植物生长和/或器官发育活性。

降低ARGOS多肽的活性和/或水平

提供了通过用表达可抑制ARGOS多肽表达的多核苷酸的表达盒转化植物细胞降低或消除本发明ARGOS多肽活性的方法。该多核苷酸可直接通过抑制ARGOS信使RNA的翻译或间接通过编码抑制编码ARGOS多肽的ARGOS基因的转录或翻译抑制ARGOS多肽的表达。抑制或消除植物细胞基因表达的方法为本领域已知，本发明中可使用任何这种方法抑制ARGOS多肽的表达。

根据本发明，如果ARGOS多肽的蛋白水平低于未经基因修饰或诱变以抑制该ARGOS多肽表达的植物中相同ARGOS多肽蛋白水平的70％，则ARGOS多肽的表达被抑制。在本发明的具体实施方案中，根据本发明被修饰的植物中ARGOS多肽的蛋白水平低于未经基因修饰或诱变以抑制该ARGOS多肽表达的植物中相同ARGOS多肽蛋白水平的60％、低于50％、低于40％、低于30％、低于20％、低于10％、低于5％或低于2％。可直接通过例如检测植物细胞或植物中ARGOS多肽的表达水平或间接通过例如测定植物细胞或植物中ARGOS多肽的植物生长和/或器官发育活性或测定植物的生物量测定ARGOS多肽的表达水平。进行该类检测的方法阐述于本文其它部分。

在本发明的其它实施方案中，通过用包含编码可抑制ARGOS多肽活性的多肽的多核苷酸的表达盒转化植物细胞降低或消除ARGOS多肽活性。根据本发明如果ARGOS多肽的植物生长和/或器官发育活性小于未经修饰以抑制该ARGOS多肽的植物生长和/或器官发育活性的植物中相同ARGOS多肽的植物生长和/或器官发育活性的70％，则该ARGOS多肽的植物生长和/或器官发育活性被抑制。在本发明的具体实施方案中，根据本发明被修饰的植物中该ARGOS多肽的植物生长和/或器官发育活性小于未经修饰以抑制该ARGOS多肽表达的植物中该相同ARGOS多肽的植物生长和/或器官发育活性的60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。当通过本发明描述的检测方法不可检测时则根据本发明ARGOS多肽的植物生长和/或器官发育活性被“消除”。测定ARGOS多肽植物生长和/或器官发育活性的方法阐述本文其它部分。

在其它实施方案中，可通过干扰ARGOS多肽的编码基因降低或消除ARGOS多肽的活性。本发明涵盖具有ARGOS基因突变的诱变植物，其中该突变可降低ARGOS基因的表达或抑制被编码的ARGOS多肽的植物生长和/或器官发育活性。

因此，很多方法可用于降低或消除ARGOS多肽的活性。此外，不止一种方法可用于降低单个ARGOS多肽的活性。降低或消除ARGOS多肽表达的非限制性实例见以下内容。

1.基于多核苷酸的方法：

在本发明的一些实施方案中，用表达可抑制本发明ARGOS多肽表达的多核苷酸的表达盒转化植物。本文使用的术语“表达”指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，为达到本发明目的，表达可抑制至少一种ARGOS多肽的多核苷酸的表达盒为可产生可抑制至少一种本发明ARGOS多肽转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。从DNA分子“表达”或“生产”蛋白质或多肽指转录或翻译该编码序列以产生该蛋白或多肽，而从RNA分子“表达”或“生产”蛋白质或多肽指翻译RNA编码序列以产生该蛋白质或多肽。

可抑制ARGOS多肽表达的多核苷酸实例如下所示：

i 有义抑制/共抑制

在本发明的一些实施方案中，可通过有义抑制或共抑制抑制ARGOS多肽的表达。对于共抑制而言，设计一个表达盒表达全部或部分对应于以“有义”方向编码ARGOS多肽的信使RNA的RNA分子。该RNA分子的过度表达可导致天然基因表达降低。因此，筛选经共抑制表达盒转化的多种植物系以鉴定呈现ARGOS多肽表达最大抑制者。

用于共抑制的多核苷酸可对应于全部或部分编码ARGOS多肽的序列，全部或部分ARGOS多肽转录物的5′和/或3′非翻译区，或全部或部分编码ARGOS多肽转录物的编码序列和非翻译区两者。在一些实施方案中多核苷酸包含部分或全部ARGOS多肽的编码区，将该表达盒设计成消除该多核苷酸的起始密码子这样就不会翻译任何蛋白质。

共抑制可用于抑制植物基因表达以产生具有不可检测蛋白水平的由这些基因编码的蛋白质的植物。例如，参见，Broin等.，(2002)Plant Cell 14：1417-1432。共抑制也可用于抑制相同植物中的多种蛋白质的表达。例如，参见，美国专利第5942657号。使用共抑制抑制植物内源基因表达的方法阐述于Flavell等.，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：3490-3496；Jorgensen等，(1996)Plant Mol.Biol.31：957-973；Johansen和Carrington(2001)Plant Physiol.126：930-938；Broin等.，(2002)Plant Cell 14：1417-1432；Stoutjesdijk等，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Yu等，(2003)Phytochemistry 63：753-763；和美国专利第5034323号、5283184号和5942657号，均以参考形式并于本文。可通过在表达盒于有义序列的3′位置和多腺苷酸化信号的5′位置导入多聚-dT区增加共抑制效率。参见，美国专利申请第20020048814号，以参考形式并于本文。通常这种核苷酸序列与内源基因的转录物具有实质序列同一性，优选大于约65％序列同一性，更优选大于85％序列同一性，最优选大于95％序列同一性。参见，美国专利第5283184号和5034323号，以参考形式并于本文。

ii 反义抑制

在一些实施方案中，可通过反义抑制获得对ARGOS多肽表达的抑制。对于反义抑制而言，将该表达盒设计为表达与编码ARGOS多肽的信使RNA的全部或部分互补的RNA分子。该反义RNA分子的过度表达可导致原始基因的表达降低。因此，筛选用该反义抑制表达盒转化的多种植物系以识别呈现ARGOS多肽表达最大抑制者。

用于反义抑制的多肽可对应于编码ARGOS多肽的基因序列互补体的全部或部分，ARGOS转录物5′和/或3′非翻译区的全部或部分，编码ARGOS多肽的转录物的编码序列和非翻译区二者的互补体的全部或部分。此外，该反义多核苷酸可与目标序列完全互补(即与目标序列的互补物100％相同)或部分互补(即与目标序列的互补物小于100％相同)。反义抑制可用于抑制相同植物中多种蛋白质的表达。例如，参见美国专利第5942657号。而且，反义核苷酸的部分可用于干扰目标基因的表达。一般而言，可使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸，300、400、450、500、550或更多的核苷酸的序列。使用反义抑制来抑制植物中内源基因表达的方法阐述于，例如Liu等，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743和美国专利第5759829号和第5942657号，均以引用形式并于本文。通过在表达盒于反义序列的3’位置和多腺苷酸化信号的5’位置包含一个多聚-dT区可增加反义抑制的效率。参见美国专利出版物第20020048814号，以参考形式并于本文。

iii 双链RNA干扰

在本发明的一些实施方案中，可通过双链RNA干扰(dsRNA)获得对ARGOS多肽表达的抑制。对于dsRNA干扰而言，将如上所述用于共抑制的有义RNA分子和与有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子表达在相同的细胞中，从而抑制了对应内源信使RNA的表达。

通过设计包含有义序列和反义序列两者的表达盒完成该有义和反义分子的表达。或者，对有义和反义序列可使用单独的表达盒。筛选用dsRNA干扰表达盒转化的多种植物系以鉴别呈现ARGOS多肽表达最大抑制的植物系。使用dsRNA干扰抑制内源植物基因表达的方法阐述于Waterhouse等.，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95：13959-13964，Liu等，(2002)Plant Physiol.129：1732-1743，以及WO99/49029、WO 99/53050、WO 99/61631和WO 00/49035，均以参考形式并于本文。

iv 发夹RNA干扰和含内含子发夹RNA干扰

在本发明的一些实施方案中，可通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含内含子发夹RNA(ihpRNA)干扰抑制一个或多个ARGOS多肽的表达。这些方法可高效抑制内源基因的表达。参见Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38，以参考形式并于本文。

对于hpRNA干扰，将表达盒设计为表达可与其自身杂交的RNA分子以形成包含一个单链环区和一个碱基对茎的发夹结构。该碱基对茎区包含对应于全部或部分编码表达被抑制基因的内源信使RNA的有义序列和与该有义序列完全或部分互补的反义序列。因此，该分子的碱基对茎区通常决定了该RNA干扰的特异性。hpRNA分子可高效抑制内源基因的表达，它们所诱导的RNA干扰可遗传至植物后代中。参见，例如Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97：4985-4990；Stoutjesdijk等，(2002)Plant Physiol.129：1723-1731；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38。用于hpRNA干扰抑制或沉默基因表达的方法阐述于Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：4985-4990；Stoutjesdijk等，(2002)PlantPhysiol.129：1723-1731；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Pandolfini等，BMC Biotechnology 3：7，美国专利出版物第20030175965号；均以参考形式并于本文。hpRNA构建体沉默体内基因表达的有效性的瞬时分析阐述于Panstruga，et al.，(2003)Mol.Biol.Rep.30：135-140，通过引用并于本文。

对于ihpRNA而言，该干扰分子具有与hpRNA相同的通用结构，但是该RNA分子还包含可在表达该ihpRNA的细胞内被剪接的内含子。使用内含子可在剪接后最小化发夹RNA环的大小并且可增加干扰效率。参见，例如，Smith等，(2000)Nature 407：319-320。事实上Smith等人证实了使用ihpRNA介导干扰100％抑制内源基因的表达。使用ihpRNA干扰抑制内源植物基因表达的方法阐述于，例如，Smith等，(2000)Nature 407：319-320；Wesley等，(2001)Plant J.27：581-590；Wang和Waterhouse(2001)Curr.Opin.Plant Biol.5：146-150；Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.4：29-38；Helliwell和Waterhouse(2003)Methods 30：289-295，以及美国专利出版物第20030180945号，均以参考形式并于本文。

用于hpRNA干扰的表达盒可设计为该有义序列和反义序列不与内源RNA互补的形式。在这一实施方案中，该有义序列和反义序列侧接一个环序列，其包含对应于目标基因的全部或部分内源信使RNA的核苷酸序列。因此，是该环区决定了RNA干扰的特异性。参见，例如，WO 02/00904，以参考形式并于本文。

v.扩增子介导的干扰

扩增子表达盒包含植物病毒衍生序列，其包含全部或部分目标基因但一般不是该天然病毒的全部基因。存在于该表达盒转录产物中的该病毒序列允许转录产物引导自身的复制。由扩增子产生的转录物相对于目标序列(即该ARGOS多肽的信使RNA)可为有义或反义。使用扩增子抑制内源植物基因表达的方法阐述于，例如，Angell和Baulcombe(1997)EMBO J.16：3675-3684，Angell和Baulcombe(1999)Plant J.20：357-362，及美国专利第6646805号，均以参考形式并于本文。

vi 核酶

在一些实施方案中，由本发明表达盒表达的多核苷酸为催化性RNA或对ARGOS多肽的信使RNA具有特异核酶活性。因此，该多核苷酸可引起该内源信使RNA的降解，导致ARGOS多肽表达降低。这一方法阐述于，例如，美国专利第4987071号，以参考形式并于本文。

vii 小干扰RNA或微小RNA

在本发明的一些实施方案中，可通过表达编码微小RNA(miRNA)的基因进行RNA干扰从而抑制ARGOS多肽的表达。miRNA为由约22个核糖核苷酸组成的调节因子。miRNA高效抑制内源基因的表达。参见，例如，Javier等，(2003)Nature 425：257-263，以参考形式并于本文。

对于miRNA干扰而言，将该表达盒设计为表达建模于内源miRNA基因上的RNA分子。该miRNA基因编码形成含有与另一内源基因(目标基因)互补的22-核苷酸序列发夹结构的RNA。对于ARGOS表达抑制而言，该22-核苷酸序列选自ARGOS转录物序列并含有所述ARGOS序列有义方向的22个核苷酸和与该有义序列互补的对应反义序列的21个核苷酸。miRNA可高效抑制内源基因的表达并且它们诱导的RNA干扰可遗传至植物后代。

2.基于多肽的基因表达抑制

在一个实施方案中，多核苷酸编码与编码ARGOS多肽基因结合的锌指蛋白，导致该基因表达降低。在具体的实施方案中，该锌指蛋白与ARGOS的调控区结合。在另一实施方案中，该锌指蛋白与编码ARGOS多肽的信使RNA结合并抑制其转录。筛选锌指蛋白靶标位点的方法阐述于，例如，美国专利第6453242号，使用锌指蛋白抑制植物基因表达的方法阐述于，例如，美国专利出版物第20030037355号，均以参考形式并于本文。

3.基于多肽的蛋白活性抑制

在本发明的一些实施方案中，所述多核苷酸编码可至少与一种ARGOS多肽结合的抗体并减少ARGOS多肽的细胞数量调节物活性。在另一个实施方案中，抗体的结合通过细胞数量控制机制导致抗体-ARGOS复合物转换增加。在植物细胞中表达抗体和通过抗体的表达和植物细胞蛋白结合抑制分子途径为本技术领域已知。参见，例如，Conrad和Sonnewald(2003)Nature Biotech.21：35-36，以参考形式并于本文。

4.基因阻断

在本发明的一些实施方案中，通过阻断编码ARGOS多肽的基因降低或消除ARGOS多肽的活性。可通过本技术领域已知的任何方法阻断编码ARGOS多肽的基因。例如，在一个实施方案中，通过转座子标记技术阻断该基因。在另一个实施方案中，通过使用随机或定位突变诱变植物并筛选细胞数量调节物活性降低的植物以阻断该基因。

i 转座子标记技术

在本发明的一个实施方案中，使用转座子标记技术降低或消除一个或多个ARGOS多肽的ARGOS活性。转座子标记技术包括将转座子插入内源ARGOS基因以降低或消除ARGOS多肽的表达。“ARGOS基因”意指编码依据本发明的ARGOS多肽的基因。

在该实施方案中，通过将转座子插入编码ARGOS多肽基因的调控区或编码区降低或消除一个或多个ARGOS多肽的表达。可使用位于ARGOS基因的外显子、内含子、5′或3′非翻译序列、启动子或任何其它调控序列内的转座子降低或消除被编码的ARGOS多肽的表达和/或活性。

用于转座子标记植物中特异基因的方法为本技术领域熟知。参见，例如，Maes等.，(1999)Trends Plant Sci.4：90-96；Dharmapuri和Sonti(1999)FEMS Microbiol.Lett.179：53-59；Meissner等，(2000)PlantJ.22：265-274；Phoga等，(2000)J.Biosci.25：57-63；Walbot(2000)Curr.Opin.Plant Biol.2：103-107；Gai等，(2000)Nucleic Acids Res.28：94-96；Fitzmaurice等，(1999)Genetics 153：1919-1928)。此外，用于在已选择基因中筛选Mu插入的TUSC步骤已阐述于Bensen等，(1995)PlantCell 7：75-84；Mena等，(1996)Science 274：1537-1540；和美国专利第5962764号；均以参考形式并于本文。

ii 活性降低的突变植物

降低或去除植物内源基因表达的其它方法也为本领域已知并可相似的应用于本发明。这些方法包括其它形式的诱变作用，例如反义遗传意义(用PCR)上使用的用于鉴别内源基因缺失植物系的甲磺酸乙基酯诱导的诱变作用、缺失诱变和快中子缺失诱变。这些方法的实例见Ohshima等.，(1998)Virology 243：472-481；Okubara等，(1994)Genetics 137：867-874；以及Quesada等，(2000)Genetics 154：421-436；均以参考形式并于本文。此外，筛选化学诱导突变的快速和自动方法-TILLING(Targeting Induced Local Lesions In Genomes)(使用变性HPLC或选择性核酸内切酶消化已选择的PCR产物)也可用于本发明。见McCallum等，(2000)Nat.Biotechnol.18：455-457，以参考形式并于本文。

可影响被编码蛋白的基因表达或干扰其功能(细胞数量调节活性)的突变为本领域已知。基因外显子中的插入突变通常形成无效突变体。保守残基的突变通常可有效抑制被编码蛋白的细胞数量调节物活性。已阐述了适于以消除细胞数量调节物活性为目标的诱变作用的植物ARGOS多肽的保守残基。可根据本领域熟知的步骤分离该类突变体，并可通过基因交叉叠加不同ARGOS基因座中的突变。参见，例如，Gruis等，(2002)Plant Cell 14：2863-2882。

在本发明的另一实施方案中，由于基因倒置和重复基因座重组显性突变可用于引起RNA沉默。参见，例如，Kusaba等，(2003)Plant Cell15：1455-1467。

本发明涵盖降低或去除一个或多个ARGOS多肽活性的其它方法。改变或突变植物基因组核苷酸序列其它方法的实例为本领域已知并包括但不限于使用RNA:DNA载体、RNA:DNA突变载体、RNA:DNA修复载体、寡核苷酸杂双链、自身互补RNA:DNA寡聚核苷酸和重组基因寡核苷酸酶。所使用的该类载体和方法为本领域已知。参见，例如，美国专利第5565350号；5731181号；5756325号；5760012号；5795972号和5871984号，均以参考形式并于本文。也可参见WO 98/49350、WO 99/07865、WO 99/25821，以及Beetham等，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778；均以参考形式并于本文。

iii 调节植物生长和/或器官发育活性

在具体方法中，通过增加植物中ARGOS多肽的水平或活性增加植物中细胞数量调节物的水平和/活性。增加植物中ARGOS多肽的水平和/或活性的方法阐述于本文其它部分。简略而言，该类方法包括向植物提供本发明ARGOS多肽并藉此增加ARGOS多肽的水平和/或活性。在其它实施方案中，可通过将包含本发明ARGOS多肽序列的多核苷酸导入植物中、表达该ARGOS序列、增加该ARGOS多肽的活性并藉此增加植物或植物部分的组织细胞的数量，从而提供编码ARGOS多肽的ARGOS核苷酸序列。在其它实施方案中，导入植物中的该ARGOS核苷酸构建体被稳定整合入该植物的基因组中。

在其它方法中，可通过增加植物中ARGOS多肽的水平和/或活性增加植物组织的细胞数量和生物量。该类方法详细阐述于本文其它部分。在一个该类方法中，将ARGOS核苷酸序列导入植物中，该ARGOS核苷酸序列的表达可降低ARGOS多肽的活性并藉此增加植物生长和/或植物或植物部分的器官发育。在其它实施方案中，该导入植物的ARGOS核苷酸构建体被稳定整合入该植物的基因组中。

如上文所述，本领域技术人员可识别用于调节植物中植物生长和/或器官发育多核苷酸和多肽的水平/活性的适当启动子。本实施方案的示例性启动子阐述于本文其它部分。

因此，本发明进一步提供了相对于对照植物组织的植物生长和/或器官发育具有被修饰的植物生长和/或器官发育的植物。在一个实施方案中，本发明植物中本发明ARGOS多肽的水平/活性增加并因此植物组织中的植物生长和/或器官发育增加。在其它实施方案中，本发明植物中本发明ARGOS多肽水平被降低或消除并因此植物组织中植物生长和/或器官发育降低。在其它实施方案中，该类植物具有被稳定整合入它们基因组的核酸分子，该分子包含与驱动该植物细胞中表达的启动子可操作地连接的ARGOS核苷酸序列。

iv 调节根发育

本文提供了调节根发育的方法。通过“调节根发育”预期达到与对照植物相比植物根发育的任何改变。这些根发育的改变包括但不限于初生根的生长速率、新生根重量、侧根和不定根形成的范围、脉管系统、分生组织发育或径向膨胀的改变。

本文提供了调节根发育的方法。该方法包含调节植物中ARGOS多肽的水平和/或活性。在一个方法中，向植物提供本发明的ARGOS序列。在另一个方法中，通过向植物中导入包含本发明ARGOS核苷酸序列的多核苷酸、表达该ARGOS序列并藉此修饰根发育，从而提供ARGOS核苷酸序列。在又另一个方法中，导入该植物的ARGOS核苷酸构建体被稳定整合入该植物的基因组中。

在其它方法中，通过改变植物中ARGOS多肽的水平或活性调节根发育。ARGOS活性的增加可导致根发育的至少一种或多种以下改变，包括但不限于相对于对照植物分生组织更大、根生长增加、径向膨胀增强、脉管系统增强、根分枝增加、不定根更多和/或新生根重量增加。

如本文所使用，术语“根生长”涵盖单子叶和双子叶植物中组成其发育不同阶段根体系的不同部分生长的所有方面。也应该理解的是根生长增强可由其一个或多个部分包括初生根、侧根、不定根等的生长增强引起。

测量根体系中该发育改变的方法为本领域已知。参见，例如，美国专利第2003/0074698号和Werner等，(2001)PNAS 18：10487-10492，二者均以参考形式并于本文。

如上所述，本领域技术人员可识别用于调节植物中根发育的适当启动子。这一实施方案的示例性启动子包括组成型启动子和根-优选启动子。示例性根-优选启动子阐述于本文其它部分。

通过增加ARGOS多肽的活性和/或水平刺激根生长并增加根质量也可用于提高植物的直立稳定性。术语“倒伏抗性”或“直立稳定性”指植物将其自身固定于土壤中的能力。对于具有直立或半直立生长习惯的植物而言，该术语也指在不利(环境的)条件下保持直立位置的能力。这一性状与根系统的大小、深度和形态学有关。此外，通过增加ARGOS多肽的水平和/或活性刺激根生长并增加根质量也可用于提高外植体的体外繁殖。

而且，由ARGOS活性的水平和/或活性增加引起的更高根生物量的产生对产量具有直接作用并对由根细胞或转基因根细胞或所述转基因根细胞的细胞培养物生产的化合物的生产具有间接作用。由根培养物生产的一种相关化合物的实例为紫草素，通过该方法可有利增强其产量。

因此本发明进一步提供与对照植物的根发育相比根发育被调节的植物。在一些实施方案中，本发明植物的本发明ARGOS多肽的水平/活性增强并且根生长和/或根生物量增加。在其它实施方案中，该类植物将包含与驱动该植物细胞表达的启动子可操作地连接的本发明ARGOS核苷酸序列稳定整合入它们的基因组。

v 调节枝条和叶发育

本发明也提供调节植物中枝条和叶发育的方法。“调节枝条和/或叶发育”意指植物枝条和/或叶发育中的任何改变。这些枝条和/或叶发育的改变包括但不限于根分生组织发育、叶数量、叶大小、叶和茎脉管、节间长度和叶衰老的改变。如本文所使用，“叶发育”和“枝条发育”涵盖单子叶和双子叶植物中分别组成其发育不同阶段的叶体系和根体系的不同部位生长的所有方面。测量根和叶体系中这些发育改变的方法为本领域已知。参见，例如Werner等，(2001)PNAS98：10487-10492和美国专利申请第2003/0074698号，均以参考形式并于本文。

调节植物中根和/或叶发育的方法包括调节本发明ARGOS多肽的活性和/或水平。在一个实施方案中提供了本发明的ARGOS序列。在其它实施方案中，可通过向植物中导入包含本发明ARGOS核苷酸序列的多核苷酸、表达该ARGOS序列并藉此修饰根和/或叶发育以提供本发明ARGOS核苷酸序列。在其它实施方案中，导入植物的该ARGOS核苷酸构建体被稳定整合入该植物的基因组中。

在具体的实施方案中，通过降低植物中ARGOS多肽的水平和/或活性调节根和/或叶发育。ARGOS活性的降低可引起与对照植物相比至少一种或多种以下根和/或叶发育的改变，包括但不限于叶数量减少、叶表面减少、脉管减少、节间变短和生长矮小以及叶衰老推迟。

如上文所述，本领域技术人员可识别用于调节植物根和叶发育的适当启动子。该实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、枝条-优选启动子、枝条分生组织-优选启动子和叶-优选启动子。示例性启动子已阐述于本文其它部分。

降低植物中ARGOS活性和/或水平可引起节间变短和生长矮小。因此，本发明方法可用于生产矮生植物。此外，如上文所述，调节植物中ARGOS活性可调节根和枝条二者的生长。因此本发明进一步提供了改变根/枝条比例的方法。可通过降低植物中ARGOS多肽的水平和/或活性进一步调节枝条或叶的发育。

因此，本发明进一步提供与对照植物相比根和/或叶发育被调节的植物。在一些实施方案中，本发明植物中本发明ARGOS多肽水平/活性增强，根和/或叶发育被改变。这些改变包括但不限于与对照植物相比叶数量增加、叶表面增加、脉管形成增加、节间变长和植物增高以及叶衰老的改变。在其它实施方案中，本发明植物具有水平/活性降低的本发明ARGOS多肽。

vi 调节生殖组织发育

本文提供了调节生殖组织的方法。在一个实施方案中提供了调节植物中花发育的方法。“调节花发育”意指与其中ARGOS活性或水平未被调节的植物相比植物生殖组织结构的任何改变。“调节花发育”进一步包括与其中ARGOS活性或水平未被调节的植物相比植物生殖组织发育时间的任何改变(即花发育时间的推迟或加速)。肉眼可见的改变包括生殖组织大小、形状、数量或位置，这些结构形成的发育时间段或在环境压力下维持或进行开花过程的能力的变化。微观改变包括组成该生殖器官的细胞类型或形状的改变。

调节植物花发育的方法包括调节植物中的ARGOS活性。在一种方法中提供了本发明的ARGOS序列。可通过向植物中导入包含本发明ARGOS核苷酸序列的多核苷酸、表达该ARGOS序列并藉此调节花发育以提供ARGOS核苷酸序列。在其它实施方案中，该导入植物的ARGOS核苷酸构建体被稳定整合入该植物的基因组中。

在具体方法中，通过降低植物中ARGOS多肽的水平或活性调节花发育。ARGOS活性的降低可引起与对照植物相比至少一种或多种以下花发育的改变，包括但不限于开花推迟、花数量减少、部分雄株不育和结实率降低。诱导开花推迟或抑制开花可用于提高饲料作物例如苜蓿的产量。测量这些花发育的发育改变的方法为本领域已知。参见，例如，Mouradov等，(2002)The Plant Cell S111-S130，以参考形式并于本文。

如上所述，本领域技术人员可识别用于调节植物花发育的启动子。用于该实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、枝条-优选启动子和花-优选启动子。

在其它方法中，通过增强本发明ARGOS序列的水平和/或活性调节花发育。该类方法可包括将ARGOS核苷酸序列导入植物并增强该ARGOS多肽的活性。在其它方法中，导入植物的ARGOS核苷酸构建体被稳定整合入植物的基因组中。增强本发明ARGOS序列的表达可调节应激期间的花发育。该类方法阐述于本文其它部分。因此，本发明进一步提供了与对照植物的花发育相比花发育被调节的植物。组合物也包括本发明ARGOS多肽水平或活性被增强并且花发育被改变的植物。组合物也包括本发明ARGOS多肽水平/活性被增强的植物，其中该植物可在应激期间维持或进行开花过程。

也提供可使用本发明ARGOS序列增加种子大小和/或重量的方法。该方法包括增强植物或植物部分例如种子中ARGOS序列的活性。种子大小和/或重量的增加包括该种子大小或重量的增加和/或一个或多个种子部位包括例如胚、胚乳、种皮、糊粉层或子叶的大小或重量的增加。

如上所述，本领域技术人员可识别用于增加种子大小和/或种子重量的启动子。用于该实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、种子-优选启动子、胚-优选启动子和胚乳-优选启动子。

用于降低植物中种子大小和/或种子重量的方法包括降低植物中的ARGOS活性。在一个实施方案中，可通过向植物中导入包含本发明ARGOS核苷酸序列的多核苷酸、表达该ARGOS序列并藉此降低种子重量和/或大小以提供ARGOS核苷酸序列。在其它实施方案中，导入植物的ARGOS核苷酸构建体被稳定整合入该植物的基因组中。

应进一步认识到也可通过增加幼苗的种子生长速度或增强早期活力增加种子大小和/或重量。如本文所使用，术语“早期活力”指植物在早期发育阶段快速生长的能力并与发芽后建立良好发育的根体系和良好发育的光合器官相关。此外，与对照相比，种子大小和/或重量的增加也可引起植物产量的增加。

因此，本发明进一步提供与对照植物相比种子重量和/或种子大小增加的植物。在其它实施方案中提供了活力和植物产量增加的植物。在一些实施方案中，本发明植物中本发明ARGOS多肽的水平/活性增强并且种子重量和/或种子大小增加。在其它实施方案中该类植物具有被稳定整合入它们的基因组中的包含与驱动该植物细胞表达的启动子可操作地连接的ARGOS核苷酸序列的核酸分子。

Vii 使用ARGOS启动子多核苷酸的方法

包含本发明ARGOS启动子及其变异体和片段的多核苷酸当与一个DNA构建体装配在一起(这样该启动子序列可与包含相关多核苷酸的核苷酸序列可操作地连接)时可用于任何宿主细胞的基因操作，优选植物细胞。在这一方式中，在表达盒中与在相关宿主细胞中表达的相关多核苷酸序列一起提供本发明ARGOS启动子多核苷酸。如下列实施例2所述，本发明ARGOS启动子序列可在多种组织中表达，因此该启动子序列可用于调节相关多核苷酸的时序和/或时空表达。

合成杂交启动子区为本领域已知。该区包含与另一多核苷酸启动子元件可操作地连接的一种多核苷酸的上游启动子元件。在本发明的一个实施方案中，通过包含本发明ARGOS启动子序列的合成杂交启动子或其变异体或片段(与异源启动子的上游启动子元件可操作地连接)控制异源序列的表达。已鉴定出参与植物防御系统的上游启动子元件，其可用于产生合成启动子。参见，例如，Rushton等，(1998)Curr.Opin.Plant Biol.1：311-315。或者，合成ARGOS启动子序列可包含存在于ARGOS启动子序列中的上游启动子元件的副本。

应认识到本发明启动子序列可与其天然ARGOS编码序列一起使用。包含与其天然ARGOS基因可操作地连接的ARGOS启动子的DNA构建体可用于转化任何相关植物以得到期望的表型改变，例如调节细胞数量、调节根、枝条、花和胚的发育、应激耐受力和本文其他部分阐述的其他表型的改变。

本文公开的启动子核苷酸序列和方法可用于调节宿主植物中任何异源核苷酸序列的表达以改变该植物的表型。人们感兴趣的各种表型改变包括改变植物的脂肪酸组成、改变植物的氨基酸含量、改变植物的病原体防御机制等。可通过提供植物中异源产物的表达或增加内源产物的表达得到这些结果。或者，可通过提供一种或多种内源产物(尤其是植物中的酶或辅因子)表达的降低得到这些结果。这些变化可引起被转化植物表型的改变。

相关基因可反应商业市场和参与农作物研发者的兴趣。相关农作物和市场发生变化，发展中国家参与世界市场，新的农作物和技术就会出现。此外，随着我们对于农作物性状和特性例如产量和杂交优势认识的增加，用于转化的基因选择随之变化。相关基因的大致分类包括，例如，参与信息的基因，例如锌指，参与通信的基因，例如激酶以及参与管家的基因，例如热休克蛋白。更具体的转基因分类，例如，包括编码农作物重要性状、昆虫抗性、疾病抗性、除草剂抗性、不育性、谷粒特性和商业产品的基因。相关基因一般包括涉及油、淀粉、糖或营养物代谢以及影响核仁大小、蔗糖载量等的基因。

在某些实施方案中，本发明核苷酸序列可与其他相关多核苷酸序列组合以产生具有期望表型的植物。该产生的组合可包括任何一种或多种相关多核苷酸的多拷贝。本发明多核苷酸可与任何基因或基因组合叠加以生产具有多种期望性状组合的植物，包括但不限于动物饲料需要的性状例如高油基因(例如，美国专利第6232529号)；平衡的氨基酸(例如，hordothionins(美国专利第5990389号、5885801号、5885802号和5703409号)；大麦高赖氨酸(Williamson等，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106；和WO 98/20122)；高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等，(1988)Gene71：359；Musumura等，(1989)Plant Mol.Biol.12：123))；消化性增强(例如，被修饰的贮存蛋白(美国专利申请序列号10/053410，2001年11月7日申请)；硫氧还蛋白(美国专利申请序列号10/005429，2001年11月3日申请))，其公开内容均以参考方式并于本文。本发明的多核苷酸也可叠加有利于昆虫、疾病或除草剂抗性的性状(例如，苏芸金杆菌毒性蛋白(美国专利第5366892号；5747450号；5737514号；5723756号；5593881号；Geiser等.，(1986)Gene 48：109)；外源凝集素(VanDamme等.，(1994)Plant Mol.Biol.24：825)；烟曲霉毒素解毒基因(美国专利第5792931号)；无毒和疾病抗性基因(Jones等，(1994)Science266：789；Martin等，(1993)Science 262：1432；Mindrinos等，(1994)Cell78：1089)；可产生除草剂抗性，例如S4和/或Hra突变的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体；谷氨酰胺合酶抑制剂，例如草胺膦或草丁膦(例如，bar基因)；草甘磷抗性(EPSPS基因))；有利于加工处理或加工产品的性状，例如高油(例如，美国专利第6,232,529号)；被改良的油类(例如脂肪酸去饱和酶基因(美国专利第5952544号；WO 94/11516))；被改良的淀粉(例如ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合酶(SS)、淀粉分枝酶(SBE)和淀粉脱枝酶(SDBE))；聚合物或生物塑料(例如美国专利第5602321号；β-酮硫解酶，聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)促进多羟基脂肪酸酯的表达(PHAs))，其公开以参考形式并于本文。也应将本发明的多核苷酸与影响农作物性状(例如雄株不育(例如参见美国专利第5583210号)、茎强度、开花时间)的多核苷酸或转化技术性状例如细胞周期调节或基因打靶(例如，WO 99/61619；WO 00/17364；WO99/25821)组合，其公开以参考形式并于本文。

在一个实施方案中，相关序列可促进植物生长和/或农作物产量。例如，相关序列包括可改良初生根和侧根系统的农业重要基因。这些基因包括但不限于养分/水运输和生长诱导。该类基因的实例包括但不限于玉米细胞膜H⁺-ATP酶(MHA2)(Frias等，(1996)Plant Cell8：1533-44)；AKT1，拟南芥(Arabidopsis)中的钾摄取器官的组分(Spalding等，(1999)J Gen Physiol 113：909-18)；可在根顶端细胞中活化细胞分裂周期的RML基因(Cheng等.，(1995)Plant Physiol 108：881)；玉米谷氨酰胺合成酶基因(Sukanya等，(1994)Plant Mol Biol26：1935-46)和血红蛋白(Duff等，(1997)J.Biol.Chem 27：16749-16752，Arredondo-Peter等，(1997)Plant Physiol.115：1259-1266；Arredondo-Peter等，(1997)Plant Physiol 114：493-500及其中引用的参考文献)。相关序列也可用于表达负作用于根发育的基因的反义核苷酸序列。

此外，除了使用传统的选育方法也可遗传学改变农业上重要的性状例如油、淀粉和蛋白含量。改良包括增加油酸、饱和和不饱和油的含量、增加赖氨酸和硫的水平，提供必须氨基酸及对淀粉的改良。Hordothionin蛋白的改良阐述于美国专利第5703049号、5885801号、5885802号核5990389号，以参考形式并于本文。另一个实例为由大豆2S白蛋白编码的富含赖氨酸和/或硫的种子蛋白(阐述于美国专利第5850016号)以及来自大麦的糜蛋白酶抑制剂(阐述于Williamson等，(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106)，其公开内容均以参考形式并于本文。

可通过定点突变得到编码序列的衍生物以增加被编码多肽中预选定氨基酸的水平。举例而言，编码大麦高赖氨酸多肽(BHL)的基因衍生自大麦糜蛋白酶抑制剂，美国专利申请序列号08/740682，1996年1月1日申请和WO98/20133，其公开内容均以参考形式并于本文。其它蛋白质包括富含甲硫氨酸的植物蛋白，例如来自向日葵种子(Lilley等，(1989)Proceedings of the World Congress on VegetableProtein Utilization in Human Foods and Animal Feedstuffs，Applewhite编辑(American Oil Chemists Society，Champaign，Illinois)，497-502页；以参考形式并于本文)、谷物(Pedersen等，(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等，(1988)Gene71：359；二者均以参考形式并于本文)；和水稻(Musumura，等.，(1989)Plant Mol.Biol.12：123，以参考形式并于本文)。其它农业上重要的基因编码乳胶、Floury 2、生长因子、种子贮藏因子和转录因子。

昆虫抗性基因可编码对严重影响产量的害虫的抗性，例如食根虫(rootworm)、切根虫(cutworm)、欧洲玉米螟(European Corn Borer)等。该类基因包括，例如，苏芸金杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白基因(美国专利第5366892号、5747450号、5736514号、5723756号、5593881号以及Geiser等，(1986)Gene48：109)；等等。

编码疾病抗性的基因包括脱毒基因，例如对抗fumonosin(美国专利第5792931号)；无毒力(avr)和疾病抗性(R)基因(Jones等，(1994)Science 266：789；Martin等，(1993)Science 262：1432；and Mindrinos等(1994)Cell 78：1089)；等等。

除草剂抗性性状可包括编码用于抑制乙酰乳酸合酶(ALS)作用的除草剂抗性的基因，尤其是磺酰脲类除草剂(例如，包含引起该抗性的突变的乙酰乳酸合酶(ALS)基因，尤其是S4和/或Hra突变)、编码用于抑制谷氨酰胺合酶作用的除草剂抗性的基因，例如草胺膦或草丁膦(例如，bar基因)或其它本领域已知基因。bar基因编码除草剂草丁膦抗性，nptII基因编码对抗生素卡那霉素和遗传霉素的抗性，ALS-基因突变体编码对除草剂氯磺隆的抗性。

也可在表达盒中编码不育基因并提供物理去雄的另一选择。用于该方法的基因的实例包括雄株组织-优选基因和具有雄柱不育表型的基因如QM，阐述于美国专利第5583210号。其它基因包括激酶和编码对雄株或雌株配子体发育具有毒性的化合物的基因。

谷粒的质量反映在性状中，例如饱和和不饱和油的水平和类型、必需氨基酸的质量和数量以及纤维素的水平。在谷物中，改良hordothionin蛋白阐述于美国专利第5703049号、5885801号、5885802号和5990389号。

商业性状也可在一个或多个可增加例如乙醇产生用淀粉或提供蛋白表达的基因上编码。转化植物的另一个重要的商业用途为生产聚合物和生物塑料，例如美国专利第5602321号中所述。基因例如β-酮硫解酶、PHB酶(多羟基丁酸酯合酶)和乙酰乙酰辅酶A还原酶(参见，Schubert等，(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847)可促进多羟基脂肪酸酯(PHAs)的表达。

外源产物包括植物酶和产物以及来自于包括原核细胞和其它真核细胞在内的其它来源的酶和产物。这些产物包括酶、辅因子、激素等。可增加蛋白质的水平尤其是具有改良的氨基酸分布以提高植物营养价值的改良蛋白质。可通过表达该类氨基酸含量提高的蛋白完成。

可通过参考以下非限制性实施例更好的理解本发明。本领域技术人员应理解可在不偏离如本文所公开和要求的本发明精神和范围的前提下实施本发明的其它实施方案。

实施例

实施例1.分离ARGOS序列

应用鉴定一个基因家族全部成员的常规方法寻找相关ARGOS基因。制备该基因家族各种组的所有已知成员的蛋白序列。该数据包括来自其它种的序列。在专有玉米序列数据组中搜索这些种并鉴定出重叠结果的非冗余组。分步而言，得到相关任何基因的核苷酸序列，在数据库中搜索并检索到所有重叠结果的非冗余组。然后将这些蛋白质结果的组与核苷酸结果比较。如果该基因家族是完整的，所有的蛋白质结果包含在核苷酸结果中。ARGOS基因家族由3个拟南芥基因、8个水稻基因、9个玉米基因、9个高粱基因和5个大豆基因组成。由这些基因编码的蛋白质相互关系的树状图例见图1。

实施例2.ARGOS序列分析

本发明的ZmARGOS多肽与多个植物种的ARGOS基因具有共同特性。多个植物种该基因的关系以比对形式表示，见图2。图3包含ZmARGOS 1、2、3和AtARGOS1(SEQ ID NO：2、4、6和26)。由ARGOS基因编码的蛋白质近C-末端具有一个高度保守的富含脯氨酸区。N-末端差异更大。该蛋白质相对较短，平均含有110个氨基酸。

实施例3.转基因植物的转化和再生

用含有与干旱诱导启动子RAB17启动子(Vilardell等，(1990)Plant Mol Biol 14：423-432)可操作地连接的ZmARGOS序列和选择标记基因PAT(可赋予除草剂Bialaphos抗性)的质粒轰击来自温室供体植物的未成熟玉米胚。或者可在另一独立的质粒中提供该选择标记基因。根据如下步骤进行转化。培养基配方如下所示。

靶组织的制备：

将穗去壳并用30％Cloros漂白剂加0.5％ Micro去污剂表面灭菌20分钟，并用无菌水冲洗两遍。将未成熟的胚切碎并将胚轴面朝下放置(盾片面朝上)，每个平板放置25个胚，于560Y培养基中放置4小时然后排列在2.5-cm靶区域内用于轰击。

DNA的制备

制备包含与泛素启动子可操作地连接的ARGOS序列的质粒载体。使用如下所示的氯化钙沉淀方法将该质粒DNA和含有PAT选择标记的质粒DNA一起沉淀至1.1μm(平均直径)钨颗粒上：

100μl在水中的制备的钨颗粒

Tris EDTA缓冲液中含有10μl(1μg)DNA(1μg总DNA)

100μl 2.5M CaCl₂

10μl 0.1M亚精胺

按顺序将各试剂加入钨颗粒混悬液并同时置于多管漩涡混悬仪上。将最终混合物简略超声处理并在持续漩涡混悬下温育10分钟。在沉淀阶段后，将试管简单离心、移除液体，用500ml 100％乙醇洗涤并离心30秒。再次移除液体，向终钨颗粒沉淀加入105μl 100％乙醇。对于基因枪轰击而言，将钨/DNA颗粒简略超声处理并将10μl点样于各大载体(macrocarrier)中央并在轰击之前干燥约2分钟。

基因枪处理

在基因枪#HE34-1或#HE34-2中以#4水平轰击样品板。所有样品均接受650 PSI的单次轰击，总计从各已制备的颗粒/DNA试管中取10个等分试样。

后续处理

轰击后将胚于560Y培养基中培养2天，然后转移至含有3mg/LBialaphos的560R筛选培养基中，然后每2周移种一次。约筛选10周后，将筛选-抗性愈伤组织克隆转移至288J培养基中开始植物再生。体细胞胚成熟后(2-4周)将发育好的体细胞转移至发芽培养基并转移至光照培养室。约7-10天后，将正在发育的小植株转移至无272V激素的培养基试管中培养7-10天直至小植株生长起来。然后将植株转移至含有盆栽土的平板中嵌入物(inserts in flats)(相当于2.5＂盆)中并在生长室里生长1周，接着在温室中继续生长1-2周，然后转移至传统的600盆(1.6加仑)并生长至成熟。监测并记录植物干旱抗性的增强。检测干旱抗性增强的测定法为本技术领域已知并包括，例如，与相同环境条件下的对照玉米植物相比在干旱条件下核心抽穗容量产量(kemel-earring capacity yields)的增加。或者，可监测被转化植物分生组织发育的调节(即穗上小穗的形成减少)。参见，例如，Bruce等，(2002)Journal of Experimental Botany 53：1-13。

轰击和培养基：

轰击培养基(560Y)包含4.0g/l N6基底盐(basal salt)(SIGMAC-1416)、1.0ml/l Eriksson’s Vitamin Mix(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、120.0g/l蔗糖、1.0mg/l 2，4-D和2.88g/l L-脯氨酸(用KOH调至pH5.8后用D-I H₂O定容)；2.0g/l Gelrite(用D-I H₂O定容后加入)以及8.5mg/l硝酸银(将培养基灭菌并冷却至室温后加入)。选择培养基(560R)包含4.0g/l N6基底盐(SIGMA C-1416)、1.0ml/l Eriksson’s Vitamin Mix(1000X SIGMA-1511)、0.5mg/l盐酸硫胺素、30.0g/l蔗糖、2.0mg/l 2，4-D(用KOH调至pH5.8后用D-I H₂O定容)；3.0g/l Gelrite(用D-I H₂O定容后加入)以及0.85mg/l硝酸银和3.0mg/l bialaphos(两者均在将培养基灭菌并冷却至室温后加入)。

植物再生培养基(288J)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素贮备液(0.100g烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇、0.40g/l甘氨酸(用精制的(polished)D-I H₂O定容)(Murashige和Skoog(1962)Physiol.Plant.15：473)、100mg/l肌肌醇、0.5mg/l玉米素、60g/l蔗糖和1.0ml/l 0.1mM脱落酸(调至pH5.6之后用精制的D-I H₂O定容)；3.0g/l Gelrite(用D-I H₂O定容后加入)以及1.0mg/l吲哚乙酸和3.0mg/l bialaphos(将培养基灭菌并冷却至60℃后加入)。无激素培养基(272V)包含4.3g/l MS盐(GIBCO 11117-074)、5.0ml/l MS维生素储备液(0.100g/l烟酸、0.02g/l盐酸硫胺素、0.10g/l盐酸吡哆醇和0.40g/l甘氨酸，用精制的D-I H₂O定容)、0.1g/l肌肌醇、40.0g/l蔗糖(调至pH5.6之后用精制的D-I H₂O定容)和6g/l细菌培养用琼脂(用精制的D-I H₂O定容后加入)，灭菌并冷却至60℃。

实施例5.农杆菌介导的转化

对于用本发明ZmARGOS序列的反义序列农杆菌介导转化玉米而言，优选使用Zhao描述的方法(美国专利第5981840号和PCT专利公开说明书WO98/32326；其内容以参考形式并于本文)。简略而言，从玉米中分离未成熟的胚并使其与农杆菌的混悬液接触，其中该细菌可将ARGOS序列转化至至少一个未成熟胚的至少一个细胞中(步骤1：感染步骤)。在该步骤中优选将未成熟胚浸渍于农杆菌的混悬液中以起始温育。将胚与农杆菌共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在感染步骤之后优选将未成熟胚培养在固体培养基上。在共培养阶段之后可考虑任选进行“静息”步骤。在该静息步骤中，在至少存在一种已知可抑制农杆菌生长的抗生素并且不加入植物转化筛选试剂的条件下温育胚(步骤3：静息步骤)。优选在含有抗生素(但不含筛选试剂)的固体培养基中培养未成熟胚以消除农杆菌并提供被感染细胞的静息阶段。接下来在含有筛选试剂的培养基中培养接种胚并回收生长中的已转化愈伤组织(步骤4：筛选步骤)。优选在含有筛选试剂的固体培养基中培养未成熟胚以得到转化细胞的选择性生长。然后将愈伤组织再生至植物中(步骤5：再生步骤)，优选将生长于筛选培养基中的愈伤组织培养于固体培养基中以再生植物。监控植物的分生组织发育的调节并评分。例如枝条和花分生组织的大小和外观的变化和/或叶、花和/或果实的产量增加。

实施例6.ZmARGOS的过度表达影响植物大小和器官大小

通过使用表达Ubi-ZmARGOS转基因的转基因植物检测ZmARGOS基因的功能。通过使用转基因特异引物RT-PCR(ARGOS用SEQ ID NO：38，PIN用SEQ ID NO：39)验证转基因的表达。在田地里评价来自九次单拷贝事件的T1植物。转基因植物呈现数个方面的正向生长增强。

营养生长和生物量积累

与非转基因同胞相比，转基因植物(T1代)在所有9个事件中呈现植物高度平均增加4％，最高事件中为12％。经茎的直径值的测定，转基因植物的茎比非转基因同胞更厚并在九个事件中平均增加9％至22％。植物高度和茎厚度的增加使转基因植物的植物株型和生物量更大。与阴性同胞相比转基因阳性系的估计生物量积累呈现平均30％至57％的增加。

已发现ZmARGOS主要通过加快生长速度但不延长生长阶段影响植物生长。生长增强，即植物大小和生物量积累增加似乎主要是由于生长速度加快而不是由于生长阶段延长，因为基于抽丝和开花日期而言转基因植物的花期并未被推迟。事实上转基因植物比非转基因同胞开花早。在所有事件中，开花时间平均缩短至30热量单位(1-1.5天)和69热量单位(2-2.5天)。因此ZmARGOS基因的过度表达可加快植物的生长速度。生长速度加快似乎与细胞繁殖速度增加有关。

通过大范围的田间试验进一步检测杂交和近交背景的后生世代(T3)转基因植株的营养的生长、生物量积累的增加和生长速度的加快。转基因植物重现性呈现植物高度增加18％，茎直径增加10％，蒂(stalk)干质量增加15％，叶面积增加14％，总植物干质量增加25％。T1世代中观察的开花提前也在T3世代中再次观察到。

生殖生长和谷粒产量

ZmARGOS1基因的过度表达也可增强生殖器官生长。T1转基因植物呈现穗长度增加，9个事件中平均增加10％，最高事件中增加14％。每穗的总核仁质量平均增加13％，某一事件中增加70％。总核仁重量的增加似乎是由于每穗核仁数量和核仁大小增加。九个事件的平均显示每穗核仁数量平均增加8％，最高事件中增加50％。100核仁重量平均增加5％，最高事件中增加13％。核仁和穗特性的阳性变化与谷粒产量增加有关。

再一次在大范围田间试验中验证后生世代(T3)中转基因植株生殖生长和谷粒产量的增加。在近交和杂交背景中均观察到增加。与作为对照的非转基因同胞相比，转基因植物呈现主穗干质量显著增加至60％，次穗干质量增加4.7倍，雄花穗干质量增加25％，谷壳干质量增加40％。转基因植物呈现每穗核仁数量增加13％，谷粒产量增加13％。

转基因植物也呈现AS1降低至40热量单位，不结果实降至50％，败育核仁数量降至64％。当植物在应激条件下于高植物密度生长时该降低更多。这些参数测定值的降低通常与生物应力耐受性相关。

此外，转基因表达水平与穗干质量显著相关。

实施例7大豆胚转化

如下用含有与泛素启动子可操作地连接的ARGOS序列的质粒轰击大豆胚。为了诱导体细胞胚，将从表面灭菌的大豆培育植物A2872的未成熟种子切割的长度为3-5mm的子叶在适当的琼脂培养基上于26℃光照或无光条件下培养六至十周。然后将产生次生胚的体细胞胚切断并置于适当的液体培养基中。在重复筛选象早期球形胚一样繁殖的体细胞胚集簇之后，按照如下所述保存该混悬液。

可在旋转振荡器(150rpm)上在35ml液体培养基中于26℃(开花灯为16:8小时日/夜时间表)保持大豆胚混悬培养物。通过在35ml液体培养基中温育约35mg组织每两周移种该培养物。

然后通过基因枪轰击方法转化大豆胚发生的混悬培养物(Klein等，(1987)Nature(London)327：70-73，美国专利第4945050号)。这些转化中可使用Du Pont Biolistic PDS1000/HE仪器(helium retrofit)。

可用于促进大豆转化的选择标记基因是由来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell等，(1985)Nature 313：810-812)、来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自大肠杆菌；Gritz等，(1983)Gene25：179-188)以及来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒T-DNA的胭脂碱合酶的3’区域组成的转基因。含有与泛素启动子可操作地连接的ARGOS有义序列的表达盒可作为限制性片段被分离。可将该片段插入携带该标记基因的载体的泛素限制酶切位点中。

向50μl 60mg/ml 1μm金颗粒混悬液中加入(按顺序)：5μl DNA(1μg/μl)、20μl精脒(0.1M)和50μl CaCl₂(2.5M)。然后将该颗粒制剂搅拌三分钟，在微型离心机上旋转10秒中并去除上清。然后用400μl 70％乙醇将DNA-包裹的颗粒洗涤一次并重悬于40μl的无水乙醇中。将DNA/颗粒混悬液超声处理三次，每次1秒钟。之后将5微升的DNA-包裹金颗粒载样于各大载体盘上。

将约300-400mg生长了两周的混悬培养物置于空的60 x 15mm培养皿中并用移液管将残余液体从组织中除去。对于每一个转化试验，常规轰击约5-10板组织。将膜破裂压力设置为1100psi并将轰击室抽真空至28英寸汞柱。将组织置于距防护屏障约3.5英寸远的地方并轰击三次。轰击后可将组织平均分成两份，放回至液体中并按照如上所述培养。

轰击后五至七天，用新鲜培养基替换液体培养基，轰击后十一至十二天用含有50mg/ml潮霉素的新鲜培养基替换。该筛选培养基可每周更新。轰击后七至八周可观察到绿色的转化组织从未转化的坏死胚发生的集簇中生长出来。移除已分离的绿色组织并在单独的烧瓶中温育以生成新的、克隆繁殖的、转化胚形成混悬培养物。每一新系可认为是独立的转化事件。然后将这些混悬液移种并以未成熟胚集簇或通过单个体细胞胚的成熟和萌芽再生至完整的植物中保持。

实施例8.向日葵分生组织转化

如下用含有与泛素启动子可操作地连接的ARGOS序列的表达盒转化向日葵分生组织(也可参见，欧洲专利号EP 0 486233，以参考形式并于本文，及Malone-Schoneberg.，(1994)Plant Science103：199-207)。使用单一麦穗脱粒机将向日葵种子(Helianthus annuusL.)脱壳。将种子表面用20％ Clorox漂白剂溶液(每50ml溶液中加入两滴吐温20)灭菌30分钟。用无菌蒸馏水洗涤种子两遍。

按照Schrammeijer等(Schrammeijer等.，(1990)Plant Cell Rep.9：55-60)所述法的变体制备分裂胚轴外植体。将种子于蒸馏水中吸胀60分钟然后进行表面灭菌步骤。将各种子的子叶折断，在胚轴平面形成整齐的裂痕。在切除根尖之后将外植体在原始叶之间纵向对切。将两半切面朝上放置于组成为Murashige和Skoog矿物元素(Murashige.，(1962)Physiol.Plant.，15：473-497)、Shepard′s维生素添加剂(Shepard(1980)，Emergent Techniques for the Genetic Improvement ofCrops(University of Minnesota Press，St.Paul，Minnesota)、40mg/l硫酸腺嘌呤、30g/l蔗糖、0.5mg/l6-苄基-氨基嘌呤(BAP)、0.25mg/l吲哚-3-乙酸(IAA)、0.1mg/l赤霉酸(GA3)，pH5.6和8g/l Phytagar的GBA培养基中。

在用农杆菌处理前用基因枪轰击该外植体(Bidney等，(1992)Plant Mol.Biol.18：301-313)。在该处理中将三十至四十株外植体在60X 20mm平板的中心摆放成圆形。将约4.7mg 1.8mm的钨微颗粒重悬于25ml的无菌TE缓冲液(10mM Tris HCl，1mM EDTA，pH8.0)中，每次轰击使用1.5ml等分试样。穿过150mm nytex屏障(放置于PDS1000

颗粒加速装置中的样品上方2cm)将各板轰击两次。

回复平常的(Disarmed)根癌农杆菌株EHA105被用于所有的转化试验。将含有表达盒(包含与泛素启动子可操作地连接的ARGOS基因)的二元质粒载体通过如Holsters等.，(1978)Mol.Gen.Genet.163：181-187描述的冻融法导入农杆菌株EHA105。该质粒进一步包含卡那霉素选择标记基因(即nptII)。用于植物转化试验的细菌在含有维持细菌株和二元质粒的适当抗生素的液体YEP培养基(10gm/l酵母提取物、10gm/l细菌用蛋白胨和5gm/l NaCl，pH7.0)中生长过夜(28℃，100RPM持续搅动)。当其OD₆₀₀达到约0.4至0.8时使用该混悬液。将农杆菌细胞沉淀并重悬于含有12.5mM MES pH5.7、1gm/lNH₄Cl和0.3gm/l MgSO₄的温育培养基中至终OD₆₀₀为0.5。

将刚轰击的外植体放置于农杆菌混悬液中、混合并静置30分钟。然后将该外植体转移至GBA培养基，切面朝下，于26℃、18小时日照的条件下共培养。共培养三天后将该外植体转移至添加了250mg/l头孢噻肟和50mg/l硫酸卡那霉素的374B中(不含生长调节物质并且蔗糖水平降至1％的GBA培养基)。将外植体在选择条件下培养二至五周，然后转移至不含卡那霉素的新鲜374B培养基中继续生长一至两周。将具有分化和抗生素抗性生长区域(还未产生适合切割的枝条)的外植体转移至含有250mg/l头孢噻肟的GBA培养基中进行第二个为期三天的植物激素处理。通过ELISA测定来自绿色、卡那霉素抗性枝条的叶样品中是否存在NPTII以及通过检测分生组织发育的调节(即枝条和花分生组织大小和外观的改变)测定是否存在转基因表达。

将NPTII-阳性枝条嫁接至Pioneer

杂交6440体外-生长的向日葵幼苗砧木。表面已灭菌的种子在48-0培养基(半浓度的Murashige和Skoog salts、0.5％蔗糖、0.3％gelrite，pH5.6)中萌芽，并在所述外植体培养物的条件下生长。去除幼苗的上面部分，在下胚轴处做一个1cm的垂直切口，将已转化的枝条插入该切口。用石蜡膜包裹整个部位以保护枝条。体外培养一周后的已嫁接植物可转移至土壤中。土壤中的嫁接植物应在高湿度条件下维持，然后缓慢适应温室环境。通过NPTII ELISA和/或通过分析叶萃取物的ARGOS活性鉴定在温室中成熟的T0植物(亲代)的已转化部分，通过分析干种子子叶一小部分的ARGOS活性鉴定从NPTII-阳性T0植物收获的转基因种子。

另一种向日葵转化方案可回收转基因子代而不需使用化学选择压力。将种子去壳并在含有20％Clorox的漂白溶液(每100ml溶液加中入两至三滴吐温20)中表面灭菌20分钟，然后用蒸馏水冲洗三遍。将已灭菌的种子在用水湿润的滤纸上于26℃在黑暗中吸胀20小时。去除子叶和根基(root radical)，将分生组织外植体于374E(含有MS盐、Shepard维生素、40mg/l硫酸腺嘌呤、3％蔗糖、0.5mg/l 6-BAP、0.25mg/l IAA、0.1mg/l GA和0.8％Phytagar的GBA培养基，pH5.6)中在无光条件下培养24小时。去除初生叶以暴露顶端分生组织，将约40株外植体顶端向上放置于374M(含有1.2％Phytagar的GBA培养基)中央的2cm圆形中然后于该培养基上无光培养24小时。

将约18.8mg 1.8μm的钨颗粒重悬于150μl无水乙醇中。超声处理后将8μl滴至大载体表面中央。在第一架中以26mm汞柱氦枪真空(Hg helium gun vacuum)用650psi破裂盘压力(650psi rupture discs)对每板轰击两次。

通过之前所述的冻融法将相关质粒导入根癌农杆菌株EHA105。将28℃在液体YEP培养基(10g/l酵母提取物、10g/l细菌用蛋白胨和5g/l NaCl，pH7.0)中在50μg/l卡那霉素存在下的细菌过夜生长的沉淀重悬于温育培养基(12.5mM 2-mM 2-(N-吗啉代)乙磺酸，MES，1g/l NH₄Cl和0.3g/l MgSO₄，pH5.7)至终浓度为OD600＝0.4。将经颗粒轰击的外植体转移至GBA培养基(374E)并将一滴细菌混悬液直接置于分生组织的顶部。在该培养基中将外植体共培养4天，之后将该外植体转移至374C培养基(含有1％蔗糖并不含BAP、IAA、GA3，并添加了250μg/ml头孢噻肟的GBA)。将小植株在该培养基上在16-小时日照和26℃温育条件下培养约两周。

筛选在374C培养基中培养两周的外植体(约2cm长)的分生组织发育的调节(即枝条和花分生组织大小和外观的变化)。鉴定出阳性(即ARGOS表达改变)外植体后，丢弃未呈现ARGOS活性变化的枝条并将各阳性外植体细分为结节外植体。一个结节外植体含有至少一个潜在的结节。将结节片段在GBA培养基上培养三至四天以促进各结节腋芽的形成。然后将其转移至374C培养基并继续发育四周。分离正在发育的芽并于374C培养基上继续培养四周。通过适当的蛋白质活性测定再次筛选来自各新回收枝条的已收集的叶样品。这时，回收自单个结节的阳性枝条通常会富集于结节培养前初始分析中所检测到的转基因部分中。

将所回收的具有阳性ARGOS表达改变的枝条嫁接至Pioneer杂交6440体外生长的向日葵幼苗砧木(seedling rootstock)。按照下列方式制备砧木。将种子去壳并用20％Clorox漂白溶液(每100ml溶液加入两至三滴吐温20)表面灭菌20分钟，用蒸馏水冲洗三遍。将已灭菌的种子在用水湿润的滤纸上吸胀三天，然后转移至48培养基(半浓度的Skoog salts、0.5％蔗糖、0.3％gelrite，pH5.0)并于26℃无光生长三天，然后在16小时日照的条件下培养。去除所筛选幼苗的上部，在各下胚轴做一个垂直切口，将已转化的枝条插入该V-切口中。用石蜡膜包裹切割区域。在培养基中培养一周后将嫁接植物转移至土壤。在开始的两周内使其在高湿度条件下维持以适应温室环境。

实施例9.ARGOS序列变体

A.不改变被编码氨基酸序列的ARGOS核苷酸序列变异体

ARGOS核苷酸序列用于产生含有与对应SEQ ID NO的起始未改变的ORF核苷酸序列相比具有70％、75％、80％、85％、90％和95％核苷酸序列同一性的开放阅读框的核苷酸序列的变异核苷酸序列。使用标准的密码表产生这些功能变异体。虽然这些变体的核苷酸序列被改变但是由该开放阅读框编码的氨基酸序列没有变化。

B.ARGOS多肽的变异体氨基酸序列

产生ARGOS多肽的变异体氨基酸序列。在该实施例中改变了一个氨基酸。具体而言，观察该开放阅读框以确定适当的氨基酸改变。通过参考蛋白质比对(与其它直系同源体和来自多个物种的其它基因家族成员)筛选需要改变的氨基酸。筛选一个被认为不处于高筛选压力(不高度保守)下的氨基酸，其可被具有相似化学特性(即相似的功能侧链)的氨基酸轻易取代。使用图2中列出的蛋白质比对可改变一个适当的氨基酸。一旦确定了目标氨基酸，按照以下部分C列出的步骤进行。使用该方法可产生具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性的变异体。

C.ARGOS多肽其它的变异体氨基酸序列

在该实施例中，可产生与参比蛋白质序列相比具有80％、85％、90％和95％同一性的人造蛋白质序列。后一项工作需要从图2列出的比对组中鉴定出保守和可变区域，然后慎重应用氨基酸替换表。以下更加详细地讨论这些部分。

整体而言，确定哪一个氨基酸被改变是基于ARGOS蛋白质之间或其它ARGOS多肽之间的保守区域。基于序列比对，有可能被改变的ARGOS多肽的多个区域以小写字母表示，而保守区域由大些字母表示。应该认识到可在以下保守区域进行保守替换而不改变其功能。此外，本领域技术人员应理解本发明的ARGOS序列的功能变异体可在保守结构域中具有少数不保守氨基酸改变。

然后产生人工蛋白序列，其与原始序列在80-85％、85-90％、90-95％和95-100％同一性间隔不同。将这些间隔的中点作为目标，例如自由度为加减1％。通过自定义Perl script程序(custom Perl script)完成氨基酸替换。替换表见表3。

表3 替换表

 

氨基酸	极度相似和最佳替换	改变顺序等级	评论
				I	L，V	1	50:50替换
L	I，V	2	50:50替换
				V	I，L	3	50:50替换
A	G	4
				G	A	5
D	E	6
				E	D	7
W	Y	8
				Y	W	9
S	T	10
				T	S	11
K	R	12

 

R	K	13
				N	Q	14
Q	N	15
				F	Y	16
M	L	17	不能改变第一个甲硫氨酸
				H		Na	无好的替换
C		Na	无好的替换
				P		Na	无好的替换

首先，鉴定蛋白质中不应改变的任何保守氨基酸并“划清界限”不被替换。起始甲硫氨酸当然被自动加入这一行列。接下来再进行改变。

在任何情况下都不改变H、C和P。变化首先发生在异亮氨酸，从N-末端直至C-末端。然后是亮氨酸，并按照列表一直向下直至达到期望的目标。可进行中间数字替换以不引起逆转变化。该列表的顺序为1-17，因此在亮氨酸之前必要时进行许多的异亮氨酸变化，然后直到甲硫氨酸。很明显以这种方式很多氨基酸不必变化。L、I和V涉及两个交替最佳替换的50:50替换。

写出变异体氨基酸序列作为结果。使用Perl script计算同一性百分比。使用该程序，产生具有与SEQ ID NO：1、3、5和40-71的起始未改变的OFR核苷酸序列具有约80％、85％、90％和95％氨基酸同一性的ARGOS多肽变异体。

该说明书中的所有出版物和专利申请指明了本发明所属领域普通技术人员的水平。所有出版物和专利申请均以参考形式并于本文，与通过参考方式明确和单独指明各单独出版物或专利申请的程度相同。

通过参考多种具体和优选的实施方案和技术阐述本发明。但是应当理解的是可进行多种变化和改变但是仍属于本发明的精神和范围。

序列表

<110>Pioneer Hi-Bred International，Inc.

<120>Maize Genes For Controlling Plant Growth

And Organ Size And Their Use In Improving Crop Plants

<130>2196

<150>60/788,123

<151>2006-03-31

<160>71

<170>FastSEQ for Windows Version 4.0

<210>1

<211>879

<212>DNA

<213>玉米(Zea mays)

<400>1

<210>2

<211>146

<212>PRT

<213>玉米(Zea mays)

<400>2

<210>3

<211>936

<212>DNA

<213>玉米(Zea mays)

<400>3

<210>4

<211>144

<212>PRT

<213>玉米(Zea mays)

<400>4

<210>5

<211>1067

<212>DNA

<213>玉米(Zea mays)

<400>5

<210>6

<211>105

<212>PRT

<213>玉米(Zea mays)

<400>6

<210>7

<211>152

<212>PRT

<213>玉米(Zea mays)

<400>7

<210>8

<211>119

<212>PRT

<213>玉米(Zea mays)

<400>8

<210>9

<211>64

<212>PRT

<213>玉米(Zea mays)

<400>9

<210>10

<211>106

<212>PRT

<213>玉米(Zea mays)

<400>10

<210>11

<211>118

<212>PRT

<213>玉米(Zea mays)

<400>11

<210>12

<211>126

<212>PRT

<213>玉米(Zea mays)

<400>12

<210>13

<211>103

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<400>13

<210>14

<211>68

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<400>14

<210>15

<211>147

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<400>15

<210>16

<211>130

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<400>16

<210>17

<211>127

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<400>17

<210>18

<211>105

<212>PRT

<213>玉米(Zea mays)

<400>18

<210>19

<211>105

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<400>19

<210>20

<211>120

<212>PRT

<213>稻(Oryza sativa)

<400>20

<210>21

<211>96

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max)

<400>21

<210>22

<211>96

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max)

<400>22

<210>23

<211>66

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max)

<400>23

<210>24

<211>66

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max)

<400>24

<210>25

<211>90

<212>PRT

<213>大豆(Glycine max)

<400>25

<210>26

<211>130

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>26

<210>27

<211>135

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>27

<210>28

<211>88

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>28

<210>29

<211>146

<212>PRT

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>29

<210>30

<211>88

<212>PRT

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>30

<210>31

<211>107

<212>PRT

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>31

<210>32

<211>58

<212>PRT

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>32

<210>33

<211>148

<212>PRT

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>33

<210>34

<211>120

<212>PRT

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>34

<210>35

<211>101

<212>PRT

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>35

<210>36

<211>106

<212>PRT

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>36

<210>37

<211>72

<212>PRT

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>37

<210>38

<211>13

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>38

<210>39

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>39

<210>40

<211>459

<212>DNA

<213>玉米(Zea mays)

<400>40

<210>41

<211>360

<212>DNA

<213>玉米(Zea mays)

<400>41

<210>42

<211>195

<212>DNA

<213>玉米(Zea mays)

<400>42

<210>43

<211>321

<212>DNA

<213>玉米(Zea mays)

<400>43

<210>44

<211>357

<212>DNA

<213>玉米(Zea mays)

<400>44

<210>45

<211>381

<212>DNA

<213>玉米(Zea mays)

<400>45

<210>46

<211>312

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>46

<210>47

<211>207

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>47

<210>48

<211>444

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>48

<210>49

<211>537

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>49

<210>50

<211>384

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>50

<210>51

<211>318

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>51

<210>52

<211>318

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>52

<210>53

<211>363

<212>DNA

<213>稻(Oryza sativa)

<400>53

<210>54

<211>291

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<400>54

<210>55

<211>291

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<400>55

<210>56

<211>312

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<400>56

<210>57

<211>201

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<400>57

<210>58

<211>273

<212>DNA

<213>大豆(Glycine max)

<400>58

<210>59

<211>393

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>59

<210>60

<211>408

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>60

<210>61

<211>267

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>61

<210>62

<211>441

<212>DNA

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>62

<210>63

<211>267

<212>DNA

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>63

<210>64

<211>324

<212>DNA

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>64

<210>65

<211>177

<212>DNA

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>65

<210>66

<211>447

<212>DNA

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>66

<210>67

<211>363

<212>DNA

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>67

<210>68

<211>306

<212>DNA

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>68

<210>69

<211>321

<212>DNA

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>69

<210>70

<211>219

<212>DNA

<213>高粱(Sorghum bicolor)

<400>70

<210>71

<211>2436

<212>DNA

<213>玉米(Zea mays)

<400>71

Claims (19)

1.分离的多核苷酸，选自：

a.由GAP算法在缺省参数条件下测定，与选自SEQ ID NO：1、3、5和40-71的多核苷酸的全长序列具有至少70％序列同一性的多核苷酸；其中该多核苷酸编码用作器官大小调节物的多肽；

b.编码选自SEQ ID NO：2、4和6-37的多肽的多核苷酸；及

c.选自SEQ ID NO：1、3、5和40-71的多核苷酸；及

d.与(a)、(b)或(c)的多核苷酸互补的多核苷酸。

2.重组表达盒，其包含权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸与启动子以有义或反义方向可操作地连接。

3.包含权利要求2的表达盒的宿主细胞。

4.包含权利要求2的重组表达盒的转基因植物。

5.权利要求4的转基因植物，其中所述植物为单子叶植物。

6.权利要求4的转基因植物，其中所述植物为双子叶植物。

7.权利要求4的转基因植物，其中所述植物选自玉米、大豆、向日葵、高粱、芸苔、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米、花生和可可。

8.来自权利要求4转基因植物的转基因种子。

9.一种调节植物器官大小的方法，其包括：

a.向植物细胞中导入含有与启动子可操作地连接的权利要求1的多核苷酸的重组表达盒；

b.在植物细胞生长的条件下培养该植物；其中所述植物细胞的器官大小被调节。

10.权利要求9的方法，其中所述植物细胞来自选自玉米、大豆、向日葵、高粱、芸苔、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米、花生和可可的植物。

11.一种调节整个植物或植物中器官大小的方法，包括：

a.向植物细胞中导入含有与启动子可操作地连接的权利要求1的多核苷酸的重组表达盒；

b.在植物细胞生长的条件下培养所述植物细胞；及

c.从所述植物细胞再生植物；其中所述植物的器官大小被调节。

12.权利要求11的方法，其中所述植物选自玉米、大豆、高粱、芸苔、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、小米、花生和可可。

13.衍生自加工处理表达编码ARGOS基因的分离的多核苷酸的转基因植物组织的方法的产物，该方法包括：

a.用含有与选自SEQ ID NO：1、3、5和40-71的多核苷酸全长序列具有至少90％序列同一性并与启动子可操作地连接的多核苷酸的重组表达盒转化植物细胞；及

b.在植物细胞生长的条件下培养该已转化植物细胞；其中所述已转化植物细胞的生长被调节；

c.使所述植物细胞在植物形成的条件下生长，以在所述植物组织中表达多核苷酸；及

d.加工处理所述植物组织得到产物。

14.根据权利要求13的产物，其中所述多核苷酸进一步编码选自SEQ ID NO：2、4和6-37的多肽。

15.权利要求13的转基因植物，其中所述植物为单子叶植物。

16.权利要求13的转基因植物，其中所述植物选自玉米、大豆、向日葵、高粱、芸苔、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦和小米。

17.根据权利要求13的产物，其可通过过度表达所述多核苷酸提高植物的茎杆强度。

18.根据权利要求13的产物，其可通过增加生物量增加产量。

19.根据权利要求13的产物，其是乙醇的构成物。

Images