HU209143B

HU209143B - Method for producing nitrilase specific to halogenated benzonitryl, sequences containing its coding gene and cells containing said sequences

Info

Publication number: HU209143B
Application number: HU87911A
Authority: HU
Inventors: David M Stalker
Original assignee: Rhone Poulenc Agrochimie
Priority date: 1986-01-08
Filing date: 1987-01-05
Publication date: 1994-03-28
Also published as: RU2043417C1; CA1331156C; DK464087A; AU611080B2; JP2580499B2; IL81168A0; AU6898487A; DK6487A; WO1987004181A1; EP0290455A1; EP0229042A2; PL156394B1; HUT43874A; BR8705281A; JPH07194377A; JPH0795952B2; KR880701050A; CN87100135A; PL263575A1; NZ218810A

Description

A találmány tárgya eljárás halogénezett benzonitrilre specifikus nitriláz, ezt kódoló gént tartalmazó szekvenciák és ezt tartalmazó sejtek előállítására.

Új lehetőségek előtt nyitott széles utat, hogy képesek vagyunk mikroorganizmusok és magasabb rendű szervezetek sejtjeiben új genetikai tulajdonságokat kialakítani. Ezek egyik színtere a citotoxikus tulajdonságokkal rendelkező anyagokkal kapcsolatos. A mezőgazdaságban például számos vegyületet alkalmaznak kártevők, gyomok és hasonlók irtására. Ezek a vegyületek sok esetben viszonylag hosszú tartózkodási idővel vagy stabil maradékkal rendelkeznek.

Sok esetben szükséges, hogy megkülönböztessük a megtartandó és az elpusztítandó fajokat. Gyakori igény például, hogy a vegyületek szelektíven irtsák a gyomokat, és emellett csak minimális káros hatást fejtsenek ki a kultúrnövényre. A legtöbb széles spektrumú herbicid azonban jelentős mértékben károsítja a kultúrnövényt is, így elsődlegesen csak preemergens vagy óvatos posztemergens alkalmazással használható.

Jelentős igény tehát, hogy az élő sejtek módosításával külső behatásokkal szemben, így citotoxikus szerek ellen rezisztenciát alakítsunk ki.

A 4535060 számú USA-beli szabadalmi leírás olyan bakteriális aroA gént ismertet, amely glifozát rezisztenciát alakít ki a glifozáttal szemben érzékeny sejtekben. Hsu és Camper [Can. J. Microbiol. 22, 537-543 (1976)] ioxinil-lebontó anyag izolálását ismerteti talajjal dúsított tenyészetből. Hsu és Clemson [Dissert. Abstr. Intrn. 836, 8, 3708 (1976)] 3,5-dihalogén-4-hidroxi-benzonitril típusú herbicidek mikrobiológiai lebontását ismerteti. Ingram és Puliin [(Pestje. Sci., 5, 217-291 (1974)] bromoxinil ellenállóképességét vizsgálja három különböző talajban. Smith [Abstrp. Meeting Weed Soc. Am., 16-17. oldal (1971)] bromoxinil lebomlását vizsgálja „Regina” nehéz-agyagban. Smith és Fletcher [Hort. Rés., 4,60-62 (1964)] 3,5-dihalogén-4-hidroxi-benzonitrilek és talajmikroorganizmusok kölcsönhatását vizsgálja.

Harper [Int. J. Biochem. 17(6), 677-683, 1985] benzonitrilre specifikus nitrilázt ismertet. A vizsgált szubsztrátiimok köre nem terjed ki a halogénezett benzonitrilekre, sőt a bemutatott adatok inkább azt sugallják, hogy a nitriláz specifitása a benzonitril vonatkozásában olyan erős, hogy szubsztituált benzonitrilek esetén nem lehet az enzim hatására számítani.

Comai és munkatársai [Crop Protection 3(4), 399— 408,1984] általános jellegű kitanítást adnak arra, hogy valamely herbicid.rezisztenciát kódoló gén felhasználható az adott herbicidre rezisztens növények kialakítására.

A találmány tárgya eljárás halogénezett benzonitrilre specifikus, mintegy 34 kd móltömegű bakteriális nitriláz előállítására oly módon, hogy baktériumot benzonitril rezisztenciára vizsgálunk és az adott szelektálható tulajdonsággal rendelkező baktériumokat kiválogatjuk, a baktérium genomját mintegy 5-50 kb méretű fragmensekre hasítjuk, a fragmenseket megfelelő vektorba beépítve baktériumba klónozzuk és a benzonitrilre specifikus nitriláz enzimeket kódoló kiónokat kiválogatjuk, majd izoláljuk a benzonitrilre specifikus enzimet kifejező gént tartalmazó DNS szekvenciát, a kívánt gént tartalmazó DNS szekvenciát gazdasejtbe transzformáljuk és az enzimet gazdasejtben kifejezzük.

A találmány szerint előállított és halogénezett benzonitrilre, közelebbről 3,5-dibróm-4-hidroxi-benzonitrilre (bromoxinil) és/vagy 3,5-dijód-4-hidroxi-benzonitrilre (ioxinil) specifikus nitriláz felhasználható a bromoxinillel vagy ezzel rokon herbicidekkel kezelt területek detoxifikálására és gazdasejtek megvédésére a herbicidek citotoxikus hatásával szemben. A génszerkezet felhasználható arra, hogy különbséget tegyen az adott szerkezetet tartalmazó gazdasejtek és a szerkezetet nem tartalmazó gazdasejtek között.

A találmány tárgya továbbá eljárás olyan új DNS szekvencia, génszerkezet, transzformált gazdasejt, növény és peptid előállítására, amely alkalmas halogénezett hidroxil-benzonitrilek, közelebbről 3,5-dibróm- vagy 3,5-dijód-4-hidroxi-benzonitril hidrolízisére. A találmány szerinti enzim itt a vegyület hidrolizálásával megszünteti az adott nitrilek herbicid hatását és így megvédi a vegyületre érzékeny sejteket és gazdaszervezeteket, valamint detoxifikálja az adott vegyülettel fertőzött területet.

Az adott génszerkezet olyan egysejtű mikroorganizmusból, előnyösen baktériumból állítható elő, amely nitrogénforrásként, előnyösen egyedüli nitrogénforrásként képes alkalmazni a benzonitril-szánmazékot. A továbbiakban benzonitril kifejezés alatt halogénezett p-hidroxi-benzonitrilt, előnyösen 3,5-dijódvagy 3,5-dibróm-4-hidroxi-benzonitrilt, illetve nitriláz alatt olyan nitrilázt értünk, amely nitrogénforrásként, előnyösen egyedüli nitrogénforrásként a fenti halogénezett benzonitrileket alkalmazza.

Az enzim különböző eljárásokkal előállítható. Előnyösen olyan baktériumból nyerjük ki, amely természetes közegként bromoxinilt vagy ioxinilt tartalmazó környezetben fordul elő. Előnyösen alkalmazhatók a bélbaktériumok, elsősorban a Klebsiella rendbe tartozó baktériumok. Ezen belül kiemeljük a Klebsiella pneumoniae-t, főleg ennek ozaenae változatát. Talajból történő izolálás helyett a mikroorganizmust talajban vagy más tápközegben tenyésztjük növekvő benzonitril koncentráció és csökkentett más nitrogénforrás mennyisége mellett, míg a mikroorganizmus hozzászokik ahhoz, hogy egyedüli nitrogénforrásként a benzonitrilt alkalmazza.

A nitrilázt tartalmazó baktériumok eredetétől függetlenül megfelelő vizsgálattal ellenőrizni kell, hogy a nitriláz kellő mértékben alkalmas a benzonitril dézoxifikálására. Szükséges emellett, hogy a nitriláz megkülönböztesse a benzonitrilt a halogén nélküli vagy más szubsztituenseket tartalmazó analógoktól. A találmány szerinti nitriláz tehát specifikus az adott benzonitrilekre és viszonylag inaktív vagy lényegesen kevésbé áktív más analógokkal szemben.

Előnyös továbbá, ha a sejtburjánzás nem csökken le jelentős mértékben, vagyis a csökkenés legfeljebb mintegy 10%-os, ha a baktérium normál nitrogénforrás, például ammónia helyett megfelelő kon2

HU 209 143 Β centrációjú benzonitrilben fejlődik. Nem specifikus benzonitrilekkel ilyen eredmény nem érhető el.

A találmány értelmében különböző gazdatörzsek alkalmazhatók, amelyekben a nitrilázt kódoló szekvenciát megfelelő eljárásokkal azonosítjuk. A gén előfordulhat a kromoszómában vagy a plazmidban. A genom, előnyösen a restrikciós endonukleázzal, fragmentálható, amikor is egy vagy több endonukleázt alkalmazunk a mintegy 5 kb és 50 kb méretű fragmensek előállításához. A fragmensek megfelelő vektorral a szokásos baktériumokba, például E. coliba klónozhatok, és a kapott transzformánsokat nitriláz aktivitásra szelektáljuk, amikor is a gazdaszervezet jelenti a negatív hátteret.

Egyszerre egy vagy több olyan klón azonosítható, amely tartalmazza a kívánt nitriláz aktivitást. A kívánt DNS fragmenst, plazmidot vagy vírust tartalmazó kromoszómán kívüli sejtszervek a szokásos módon izolálhatok, például sejtroncsolással, a DNS kicsapásával, és a vektor DNS, plazmid vagy vírus DNS elválasztásával a kromoszomális DNS-től. Az extrakromoszomális DNS restrikciós endonukleázzal hasítható és a kívánt fragmensek ismert elválasztó eljárásokkal izolálhatok. A különböző méretű fragmenseket például elektroforézissel, sűrűség gradiens centrifugálással vagy hasonló eljárásokkal azonosítjuk.

A mérettől függően a fragmenst általában tovább kezeljük, hogy mérete jobban közelítsen a gén és a hozzá kapcsolódó szabályozó szakaszának méretéhez. Az enzimet kódoló szekvenciát és az ahhoz kapcsolt szabályozó szekvenciát tartalmazó fragmens különböző eljárásokkal kezelhető. Alkalmazható például különböző restrikciós enzimekkel különböző reakcióelegyekben végrehajtott parciális hasítás, miután klónozással ellenőrizzük, hogy melyik fragmens őrizte meg a nitriláz kifejezéséhez szükséges képességet.

Eljárhatunk úgy is, hogy az enzimet izoláljuk, és részlegesen szekvenáljuk. Az aminosav-szekvencia alapján olyan minták készíthetők, amelyek alkalmasak a gént tartalmazó fragmensek azonosítására. Ha ezt a megoldást restrikciós enzimekkel végzett hasítással kombináljuk, a fragmensek klónozhatok és a kívánt gén jelenlétére vizsgálhatók. Emellett, exonukleáz, így Bal31 segítségével a fragmens egyik vagy mindkét végéről nukleotidok távolíthatók el, miáltal csökkentjük a felesleges nukleotidok számát.

Eljárhatunk úgy is, hogy a gént megfelelő gazdasejtbe klónozzuk, és messenger RNS-t mintával végzett vizsgálattal és megfelelő in vitro vagy in vivő lefordítórendszerrel, például Xenopus oocitában vagy roncsolt reticulocitával történő azonosítással izoláljuk. Az izolált messenger RNS felhasználható a cDNS előállítására, amelynek során a szokásos módon reverz transzkriptázt alkalmazunk és a DNS polimerázzal kialakítjuk a komplementer láncot. A fenti eljárással kapott génszerkezetből hiányzik az átíráshoz tartozó szabályozó szakasz.

A nitrilázt kifejező gént tartalmazó DNS szekvencia egy sor más DNS-szekvenciához kapcsolható a megfelelő gazdasejtbe történő bevezetés céljából. A kapcsolódó szekvenciák a gazdasejt típusától, a gazdasejtbe történő bevezetés módjától függnek, valamint attól, hogy episzomális fenntartás vagy integráció a cél.

Prokarióta gazda esetén számos olyan vektor létezik, amely alkalmas arra, hogy a DNS szekvenciát transzformálással, konjugációval, transzdukcióval vagy transzfekcióval a prokarióta gazdasejtbe bevezessük. DNS szekvenciaként alkalmazható egy sor plazmid, így a pBR322, pACYC184, pM89, ÚRK291 stb., kozmid, így a pVKlOO, valamint vírus, így a P22.

Eukarióta gazda esetén is több módszer alkalmazható a DNS bevezetésére, így Ca^-ionnal kicsapott DNS-sel történő transzformálás, ahol a DNS nem replikálódó DNS-szekvenciát, egy plazmidot vagy egy minikromoszómát tartalmaz, Agrobacterium-szekvenciát tartalmazó DNS-en történő transzformálás, mikropipettával végzett mikroinjektálás vagy elektroporáció. Az a tény, hogy a DNS szerkezet tartalmaz-e megfelelő replikálórendszert, meghatározza azt, hogy a DNS episzóma elemként replikálódik-e vagy a DNS beépül a gazdasejt genomjába, és a génszerkezet a gazdasejtben fejeződik ki. Episzómaelemként alkalmazható például tumort kiváltó plazmid, például Ti vagy Ri, valamint ezek fragmensei, továbbá vírusok, például CaMV, TMV, vagy ezek fragmensei, amelyek nem halálosak a gazdasejtre, és ahol a génszerkezet oly módon van jelen az episzómaelemben, amely lehetővé teszi a génszerkezet kifejezését. Előnyösen alkalmazhatók a replikáié funkcióval bíró, más funkcióktól, így daganatképződéstől, fertőzőképességtől stb. azonban mentes fragmensek.

A nitrilázforrásból nyert fragmensek megfelelő klónozó vektor alkalmazásával klónozhatók. A klónozás megvalósítható valamely megfelelő egysejtű mikroorganizmusban, például baktériumban, így E. coliban. Előnyösen valamely kozmidot alkalmazunk, amikor is részleges vagy teljes emésztéssel megfelelő méretű fragmenseket kapunk. így például a pVKlOO kozmid megfelelő restrikciós enzimmel részlegesen emészthető és plazmid, kromoszóma vagy ezek fragmensei részleges vagy teljes emésztésével kapott fragmenshez kapcsolhatók. Burkolással biztosítjuk, hogy csak a kívánt méretű fragmensek kerüljenek be a gazdaszervezetbe.

A gazdaszervezetet benzonitril rezisztencia alapján lehet kiválogatni. A befogadó törzsek transzduktáns kiválasztását lehetővé tevő genetikai tulajdonságok kialakítása érdekében módosítható^ . Mikroorganizmussokban a transzduktáns felhasználható más mikroorganizmushoz történő kapcsoláshoz, amelynek során kívánt esetben mobilizált plazmid alkalmazható. A nitriláz gént tartalmazó ffagmens mérete számos technikával tovább csökkenthető. így például kozmid, vektor izolálható restrikciós endonukleázzal, például EcoRI, BglII, Smal stb. enzimekkel végzett hasítással, és a kapott fragmensek megfelelő vektorban, előnyösen a korábban használt kozmid vektorban klónozhatók. A kozmid vektor helyett egy sor más, kisméretű klónozóvektor, így pACYC177, pACYC184 alkalmazható. Ily

HU 209 143 Β módon a klónozáshoz és a benzonitril rezisztencia kialakításához általában mintegy 5 kb alatti, előnyösen mintegy 4 kb alatti, különösen előnyösen mintegy 1 kb alatti méretű fragmenseket alkalmazunk.

A fragmens mérete általában 1 kb és kisebb, mint 5 kb, előnyösen kisebb, mint 4 kb, különösen legalább mintegy 1047 bp, illetve az oldalsó szakaszokkal együtt legalább llOObp, előnyösen kisebb, mint 1,5 kb. A lehetséges fragmensek közül kiemeljük a Klebsiella ozaenae BglII-Smal fragmensét, valamint a mintegy 1210 bp méretű PstI—Hindii fragmenst.

A nitriláz enzim bármely szokásos módon akár prokarióta, akár eukarióta sejtben, így bakétrium, élesztő, micéliumos gomba vagy növényi sejtben kifejezhető. Ha kiválasztás nem érhető el, az enzim izolálható a sejt lizálásával és a nitriláz önmagában ismert módon történő izolálásával. Ebből a célból alkalmazható kromatográfia, elektroforézis, affinitás kromatográfia és hasonló eljárások. Előnyösen úgy járunk el, hogy a bromoxinilt megfelelő funkciós csoporton, például karboxilcsoporton keresztül oldhatatlan hordozóhoz kapcsoljuk, és ezt használjuk a nitriláz izolálásához.

A nitriláz specifikus aktivitása legalább mintegy 0,1 μιηόΐ ammónia/perc/mg fehérje, általában legalább 0,5 pmól a Harper által leírt [Biochem. J. 167, 685692 (1977)] körülmények között.

A tisztított enzim széleskörűen felhasználható. Alkalmazható a bromoxinil, ioxinil vagy más rokon benzonitril közvetlen kimutatásához. Ezenkívül az adott enzim a kimutatni kívánt anyaghoz, például hapténhez, antigénhez vagy antitesthez kapcsolva diagnosztikai vizsgálatoknál jelzőanyagként alkalmazható (3654090, 3 817837 és 3 850752 számú USA-beli szabadalmi leírások). A hozzákapcsolás módját, valamint az analizált anyag koncentrációjának meghatározását áz idézett irodalmak részletesen ismertetik.

A nitrilázt kódoló DNS szekvencia többféle módon felhasználható. Alkalmazható próbaként a vad-típusú vagy mutált nitrilázok izolálásához. Emellett rekombinációval a gazdasejtbe beépíthető belső benzonitril rezisztencia kialakítása érdekében.

Növényi sejtek esetén az adott gén mint a teljes szerkezet része mikropipettávál a növényi sejtmagba befecskendezhető, miáltal rekombinációval a gazda genomba beépül. Emellett a génszerkezet elektroporációval a növényi sejtbe beépíthető. Ha a génszerkezetet olyan forrásból nyerjük, amelynek szabályozó szignálját a növényi sejt nem ismeri fel, a kifejezéshez megfelelő szabályozószignált kell beépíteni. Vírus vagy plazmid, például tumort kiváltó plazmid alkalmazása és feltérképezése esetén a promotertől lefelé olyan hasítási helyet választunk, amelybe a génszerkezet beépíthető és kívánt távolságban van a promotertől. Ha a DNS szekvencia nem rendelkezik megfelelő hasítási hellyel, exonukleázzal, így Bal31-gyel többször emészthető, és szintetikus restrikciós endonukleázhely (linker) építhető be.

Külön kiemeljük a tumort kiváltó plazmid, például Ti vagy Ri alkalmazását, ami lehetővé teszi a nitriláz génnek növényi sejtkromoszómába történő beépítését.

A Ti plazmidok és Ri plazmidok alkalmazását a WO 84/02913,02919 és 02920 számon közrebocsátott PCT bejelentések, a 0116 718 számú európai közrebocsátási irat és Matzke és Chilton: J. Mól. Appl. Genetics, 1, 39-49 (1981) ismertetik.

Ha olyan jobb oldali vagy jobb és bal oldali TDNS-t alkalmazunk, ahol az egyes oldalak a növényi sejt által felismerhető kezdetet és befejezést jelző átíró és lefordító szabályozó szignál alatt nitriláz gént tartalmazó kifejező szakaszt szegélyeznek, a kifejező szakasz a növényi genomba beépülhet, és lehetővé teszi a nitriláz enzim kifejeződését a növényi sejtben a differenciálódás különböző fokozataiban.

Különböző szerkezetek állíthatók elő a növényi sejtben történő kifejezéshez. Ezek a szerkezetek olyan kifejezőszakaszt tartalmaznak, amely növényi sejtben működőképes és kifejezi a nitrilázt az adott növényi gazdasejtben.

Az átíráshoz különböző átíró kezdőszakaszok (promoterszakasz) alkalmazhatók, amelyek vagy önállóak, vagy aktiválhatok.

Az átíró kezdőszakasz a nitrilázt kódoló génhez kapcsolódik, és kiváltja az átírást a kezdőkódtól felfelé, általában a kezdőkódtól számított 200 bázison belül, ahol a le nem fordított 5’-szakasz nem tartalmaz ATG-t.

A gén 3’-vége egy vagy több stop-kódot tartalmaz, amely a növényi gazdasejtben funkcionáló átíró befejezőszakaszhoz kapcsolódik. Ez a befejezőszakasz ugyanahhoz vagy attól eltérő génhez kapcsolódik, mint a kezdőszakasz.

A kifejezőszakasz összetétele tehát az átírás irányát figyelembe véve, kezdőszakasz, gén, amelynek átírását a kezdőszakasz ellenőrzi, valamint befejezőszakasz, amely befejezi az átírást és gondoskodik a messenger RNS termeléséről.

Átíró- és lefordító szabályozó szakaszként előnyösen alkalmazható opine promoter és befejezőszakasz, ami lehetővé teszi a nitriláz gén önálló kifejeződését. Alkalmazhatók azonban más promoterek és/vagy befejezőszakaszok is, amelyek például a növényi gazdasejtben az aktivált vagy szabályozott kifejezést biztosítják. A Ti plazmidból alkalmazható az a promoter szakasz, amely „opine” promotert tartalmaz, ilyen az oktopin-szintáz promoter, a nopalin-szintáz promoter, az agropin-szintáz promoter, a mannopinszintáz promoter és hasonlók. Promoterként alkalmazható továbbá víruspromoter, így a CaMV VI szakasz vagy a teljes hosszúságú (35S) promoter, valamint a ribulóz-l,5-bifoszfát karboxilát génnel kapcsolt promoter, például a kis alegység, fazeolinnal, fehérjetárolóval, B-konglicininnel, cellulóz képződménnyel kapcsolt gének és hasonlók.

Az egyes szekvenciák a szokásos módon kapcsolhatók össze. A promoter szakasz a gén, például az „opine” gén 5’-végén lévő szakasz alapján azonosítható, és restrikciós térképezéssel és szekvenálással szekvenálható és izolálható. Ennek megfelelően, a lezárószakasz a gén 3’-végén izolálható. A szekvenciák klónozhatok és a megfelelő irányban összekapcsolhatók a

HU 209 143 Β nitriláz génnek a növényi gazdasejtben történő önálló kifejezése érdekében.

Ha a kultúrnövény sejtjeit a nitriláz enzimet kifejező funkciós gén bevezetésével módosítjuk, a bromoxinil, ioxinil vagy ezzel analóg herbicidek különböző növényfajtáknál olyan koncentrációban alkalmazhatók, amelyek biztosítják a gyomok közel teljes vagy teljes elpusztulását, míg a kultúrnövény viszonylag érintetlen marad. Ily módon jelentős megtakarítás érhető el a trágyázásban, hatékonyabb öntözés alkalmazható, és kiküszöbölhetők a gyomok káros hatásai.

A nitriláz enzimet kifejező kifejezőszakasz számos növényfajtába beépíthető, így egyszikű és kétszikű növényekbe, például kukorica, búza, szójabab, dohány, gyapot, paradicsom, burgonya, káposztafélék, rizs, földimogyoró, petúnia, napraforgó, cukorrépa, pázsitfű és hasonló növényekbe. A gén beépíthető a sejtekbe és más növényi részekbe, így a kallusz szövetbe, a más szövetekbe, a gyökerekbe, a gumókba, a szaporítóanyagba, a csíranövénybe, a magba, a levélbe, a hajtásba, a pollenbe és más hasonló részekbe.

Benzonitril-rezisztencia kialakítása esetén készítmények széles köre alkalmazható kultúrnövényeknek gyomoktól történő megvédésére, így a kultúrnövény fejlődésének fokozására és a tápanyagért történő versengés csökkentésére. így például a bromoxinil gyomok posztemergens irtására felhasználható önmagában vagy más termékekkel kombinálva védett kultúrnövények, így napraforgó, szójabab, kukorica, gyapot és hasonló növények esetében.

A peszticid hatóanyagokat a megfelelő készítmények formájában olyan mennyiségben hordjuk fel, hogy a bromoxinil mennyisége általában 0,01-0,4 g/m², előnyösen 0,02-0,2 g/m², míg a többi herbicid mennyisége 0,01-0,4 g/m² legyen. A készítmények a hatóanyagok mellett különböző adalékanyagokat, így detergenseket, segédanyagokat, szélesítőszereket, vastagítószereket, stabilizálószereket és hasonló segédanyagokat alkalmaznak. A készítmény lehet szilárd vagy folyékony halmazállapotú, így nedvesíthető por, emulgeálható koncentrátum és folyékony koncentrátum.

Az oldatkészítmény a szokásos módon, például permetezéssel, öntözéssel, porlasztással és más hasonló módon alkalmazható.

A találmány tárgyát közelebbről az alábbi, nem korlátozó jellegű példákkal világítjuk meg.

A vizsgálatok során a restrikciós enzimeket és a T4 ligázt a gyártó előírásai alapján alkalmazzuk. A klónozás és a molekulaanalízis standard módszereit Maniatis és munkatársai: Molecular Cloning:' A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labotaroty New York (1982) szerint (a továbbiakban Maniatis) végezzük. A klónanalízist Ish-Horowitz és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 9, 2989-2998 (1981) szerint végezzük. A részleges emésztést a szokásos módon végezzük (Maniatis, 379. o.). Ennek során a különböző körülmények között végzett emésztésekben kapott fragmenseket méret szerint frakcionáljuk, és ez alapján meghatározzuk a kívánt méretű fragmens előállításához szükséges körülményeket.

A klónozási vizsgálatokhoz az E. coli MM294 törzset [Hanahan: Mól. HBiol. 166, 557-580 (1983)] alkalmazzuk.

Antibiotikum alkalmazása esetén ezek mennyisége: Cm (kloramfenikol) 25 pg/ml, Tc (tetraciklin) 10 pg/ml, Ap (penicillin) 300 pg/ml.

A DNS plazmid E. coliba történő transzformálását Mandel és Higa: J. Mól. Bioi. 53, 159-162 (1970) szerint végezzük.

Bromoxinillal fertőzött talajmintából baktériumokat izolálunk. Az egyik baktérium Klebsiella pneumoniae ssp. ozaenae-nak minősül. A bromoxinil érzékenység és a nitriláz parciális tisztításával és jellemzésével mintegy 34 kDal molekulatömegű aktív enzimet kapunk.

A K. ozaenae szilárd L-agaron történő ismételt tenyésztésével olyan változatot kapunk, amely nem képes a bromoxinilt egyetlen nitrogénfoírásként hasznosítani, ha olyan folyékony tápközegben tenyésztjük, amely 1 literre számolva 1,5 g KH₂PO₄-et, 3,5 g K₂HPO₄-et, 0,1 g MgSO₄x7 H₂O-t, 50 mg élesztő extraktumot, valamint 0,1 tömeg% citrátot, glicerint és szukcinátot tartalmaz különböző nyomelemek mellett [Bamett és Ingraham: J. Appl. Bacteriol. 18,131-143 (1975)]. Ez a tápközeg YETE multi-karbon tápközeg néven ismert. A YETE multi-karbon tápközeg 0,05 tömeg% bromoxinilt tartalmaz. Annak ellenére, hogy az adott organizmus nem képes a bromoxinilt egyetlen nitrogénforrásként alkalmazni, 0,05 tömeg% bromoxinilt tartalmazó L-tápközegben változatlan sűrűséggel tenyészik. A K. ozaenae változat egyik telepét kiválasztjuk, és 10 ml L-tápközegben (Maniatis, 69. oldal) tenyésztjük. Ezzel párhuzamosan három, egymástól független K. ozaenae telepet választunk ki a bromoxinilt tartalmazó LB-lemezről, és ugyanilyen körülmények között tenyésztjük. Ugyanezt a négy K. ozaenae telepet (1. a változat + 3 K. ozaenae) egyidejűleg 0,05 tömeg% bromoxinillal kiegészített 10 ml Ltápközegben is tenyésztjük. A telepeket 30 °C hőmérsékleten teljes sűrűségig tenyésztjük, majd az egyes tenyészetekből Ish, Horowitz és munkatársai: Nucl. Acids Rs. 9,2989 (1981) módszerével mini-prep plazmid DNS-t preparálunk. Az emésztetlen plazmid DNS-t 0,5 tömeg%-os agaróz gélen elektroforézissel vizsgáljuk, és a plazmid sávokat etídium-bromid szűréssel tesszük láthatóvá.

A K. ozaenae változat egyetlen (68 kb méretű) plazmidot termel mind bromoxinil jelenlétében, mind bromoxinil hiányában. A három K. ozaenae telep na gyobb plazmidot eredményez (90 kb) 0,05 tömeg% bromoxinil jelenlétében. Bromoxinil hiányában mind a két plazmidforma megtalálható a három K. ozaenae telepben. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a nagyobb plazmid kisebb plazmiddá alakul, és ezzel egyidejűleg mintegy 22 kb méretű plazmid DNS-t veszít el, ha bromoxinil kiválasztás is történik.

Mind a négy telepet 0,05 tömeg% bromoxinilt tartalmazó 200 ml L-tápközegben tenyésztjük. A sejteket French-préssel elroncsoljuk, a nagysebességű felülúszót 0,05 mól/1 KPO₄ (pH=7,5) és 2,5 mmól/1 ditiotreitol

HU 209 143 Β (DTT) tartalmú pufferral szemben dializáljuk, és az egyes nyers extraktumokat bromoxinil specifikus nitriláz aktivitásra vizsgáljuk. A K. ozaenae változatból nyert nyers extraktum nem tartalmaz kimutatható nitriláz aktivitást, míg a többi K. ozaenae nyers extraktumok 0,124, 0,105 és 0,143 pmól NH/perc/mg fehérje nitriláz specifikus aktivitást mutatnak. A sejteket (200 ml) 30 °C hőmérsékleten 0,1 tömeg% glukózt és 0,04 tömeg% bromoxinilt tartalmazó M9 közegben [Miller: Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory (1972)] közepes logaritmikus fázisig tenyésztjük. A sejtek roncsolásával, ultracentrifugálással és a felülúszó 0,05 mól/1 KPO₄ (pH=7,5) és 2,5 mmól/1 DTT tartalmú pufferral szemben történő dialízisével nyers extraktumot állítunk elő. A szubsztrátum koncentráció minden esetben 3 mmól/1 bromoxinil. Az ammónia felszabadulást Harper: Biochem. J. 167,685-692 (1977) módszerével követjük. A K. ozaenae változatnak az a képessége, hogy bromoxinilt tartalmazó L-tápközegben fejlődni tud, azt eredményezheti, hogy a mikroorganizmusban az adott vegyületre nézve szerzett átjárhatatlanság alakul ki. Ennek ellenére, a mikroorganizmus az adott tápközegben nem tudja a bromoxinilt egyedüli nitrogénforrásként hasznosítani.

Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a K. ozaenae nitriláz plazmidban kódolt. Az enzimet kódoló gén (gének) feltehetően a K. ozaenae plazmidból bromoxinil távollétében spontán lehasadó 22 kb méretű plazmid DNS szegmensben található. A K. ozaenae bromoxinil specifikus nitrilázt E. coliban fejezzük ki.

A 0,05 tömeg% bromoxinil szelekció közben tenyésztett K. ozaenae-ból plazmid DNS-t preparálunk ki, és a DNS-t MM294 E. coli törzsbe (thi, gyrA96, endl^-, hsdR17) transzformáljuk. A transzformánsokat nitrogén (N^-) hiányos szilárd agaróz minimál tápközegben (összetétel 1 literre számolva: 1,5 g KH₂PO₄,

3,5 g K₂HPO₄, 0,1 g MgSO₄x7 H₂O és 0,1 tömeg% glukóz) szelektáljuk, ahol a tápközeg egyedüli nitrogénforrásként 0,05 tömeg% bromoxinilt tartalmaz. Ötnapos inkubálás után az elválasztó lemezeken tíz telep jelenik meg. A telepeket 0,05 tömeg% bromoxinilt tartalmazó L-agar lemezekre rétegezzük, és az MM294ben tiamin auxotrofikus marker jelenlétére vizsgáljuk. A minimál-tápközegben tiamin távollétében az E. coli telepek nem fejlődtek ki. Valamennyi telep fejlődőképes tiaminnal és egyedüli nitrogénforrásként 0,05 tömeg% bromoxinillal kiegészített M9 tápközegben. Az adott közegben azonban nem érhető el növekedés bromoxinil távollétében. Két telepen további analízist végzünk. A 90 kb-os plazmidot tartalmazó E. coli MM294 nyers extraktum bromoxinil specifikus nitriláz aktivitása 0,216 pmól NH₃/perc/mg. A kisméretű plazmidot tartalmazó E. coli MM294 nem eredményez kimutatható nitriláz aktivitást. Az E. coliban található nagyméretű 90 kb plazmid jele pBrxl, míg a kisméretű plazmid (68 kb) jele pBrxlA.

Annak megállapítására, hogy az MM294 E. coli törzs, amely tartalmazza a pBrxl plazmidot, a bromoxinil specifikus nitriláz reakció eredményeként a megfelelő metabolitot termeli, 2 ml MM294 (pBrxl) tenyészetet 24 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten 0,05 tömeg% bromoxinillal kiegészített M9 tápközegben tenyésztünk. A tenyészet szűrletéből vett mintát C_lgHPLC oszlopon kromatografáljuk. A szűrletbe bevitt valamennyi bromoxinil új metabolitnak megfelelő csúcsot eredményez. A csúcshoz tartozó metabolitot spektrumanalízis alapján 3’,5’-dibróm-4-hidroxi-benzoesavként (DBHB) azonosítottuk. A bromoxinil specifikus plazmiddal kódolt nitriláz kifejeződésének terméke tehát E. coliban is ugyanaz, mint K. ozaenae esetében. A bromoxinil specifikus nitriláz gént E. coliba klónozzuk.

Annak meghatározására, hogy a bromoxinil specifikus enzimet kódoló DNS szegmens klónozható-e E. coliban, a pBrxl plazmidot BamHI segítségével emésztjük, amikor is 2 db, 53 kb és 37 kb fragmenst kapunk. A BamHI fragmenseket a pACYC184 E. coli plazmid vektor [Chang és Cohen: J. Bacteriol. 134, 1141 (1978)] BamHI helyére ligáljuk, és MM294 E. coli törzsbe transzformáljuk. A pACYC184 BamHI helyére történő klónozás a tetraciklin rezisztencia gén betoldásos inaktiválását eredményezi. Tíz klóramfenikol-rezisztens és tetraciklin-érzékeny MM294 telepet választunk ki, mini-prep klónanalízissel DNS-t állítunk elő, és BamHI segítségével emésztjük. Négy klón tartalmazza a 37 kb BamHI fragmenst, és egy klón tartalmazza a pBrxl nagyméretű 53 kb BamHI DNS fragmensét. Öt klón olyan klónozott BamHI fragmenst tartalmaz, amely megtalálható a pBrxlA plazmidban is, és amely a pBrxl plazmid DNS-éből a 22 kb szakasz spontán kiiktatásával visszamaradó DNS szegmensnek felel meg. Mind a tíz kiónt 200 ml L-tápközegben tenyésztjük 200 pg/ml klóramfenikol jelenlétében (a plazmid kiválogatása érdekében), nyers extraktumot állítunk elő, és vizsgáljuk a bromoxinil specifikus nitriláz aktivitást. A 37 kb BamHI fragmenst tartalmazó négy klón 0,140 pmól NH₃/perc/mg fehérje nitriláz specifikus aktivitást mutat, míg a többi hat klón nem eredményez kimutatható nitriláz aktivitást. Az adatok arra utalnak, hogy a bromoxinil specifikus nitriláz aktivitást kódoló gén a pBrxl plazmidból klónozott 37 kb BamHI fragmensben található, és ez a fragmens magába foglalja a bromoxinil távollétében spontán lehasadó 22 kb DNS szegmenst.

A BamHI fragmensnek a pACYC184 vektoron belüli elhelyezkedésének meghatározására a fenti négy klón DNS-ét EcoRI segítségével emésztjük, és 0,07 tömeg%-os agaróz gélen elektroforézissel vizsgáljuk. Analizáljuk továbbá a pBrxl és pBrxlA plazmidok kombinált EcoRI emésztését is.

A pACYC184 vektoron belül a 37 kb BamHI fragmens mindkét orientációja kimutatható, és ezeket rendszer pBrx2 és pBrx3 plazmidnak jelöljük. Megfigyelhető továbbá, hogy a három EcoRI fragmens a 22 kb DNS szegmensben található, amely spontán kiiktatódik a pBrxl és pBrx3 plazmidokból. Az EcoRI fragmensek mérete rendre 18 kb, 3 kb és 1,9 kb. A bromoxinil specifikus nitrilázt kódoló gén tehát a három EcoRI fragmens egyikében található, ha a nitriláz gént nem osztja ketté az EcoRI hasítóhely.

HU 209 143 Β

Az E. coli bromoxinil specifikus nitrilázának (pBrx3) elhelyezkedését vizsgálva az alábbi eredményeket kapjuk.

1. táblázat

A bromoxinil specifikus nitriláz egy E. coli periplazmatikus enzim

Tenyésztési körülmények^a)	Nitriláz specifikus akti vitás⁶¹
toluollal kezelt sejtek (L-tápközeg)	0,829
lizozimmal kezelt sejtek (L-tápközeg)	0,796
teljes sejt (L-tápközeg)	0,770
teljes sejt (L-tápközeg + Brxl)	1,25
teljes sejt (M9)^cl	0,950
teljes sejt (M9 + Brxl)	1,45
teljes sejt/pACYC184 (M9)	0

a) = A pBrx3 plazmidot tartalmazó MM294 E. coli sejteket stacionárius fázis eléréséig 5 ml tápközegben tenyésztjük 37 °C hőmérsékleten. A 20 pg/ml klóramfenikolt és 0,04 tömeg% bromoxinilt tartalmazó tenyészeteket (Brxl) mutatjuk ki. Minden tenyészetből 1 ml-t összegyűjtünk, egyszer nitriláz pufferrel (0,1 mól/1 KPO₄, pH = 7,5) mossuk, és a sejteket 0,1 ml fenti pufferban szuszpendáljuk. 50 pl mintát Harper: Biochem. J. 167, 685-692 (1977) szerint nitriláz aktivitásra vizsgálunk 3 mmól/1 bromoxinil szubsztrátum jelenlétében és távollétében.

b) = pmól NH₃/per/mg fehérje értéket határozunk meg, ahol az 1,4

O.D.₆q0 megfelel 10® sejt/ml= 150 pg értéknek.

c) = Maniatis, 69. oldal.

Az adatok arra utalnak, hogy a nitriláz enzim a sejtplazmában helyezkedik el. Megfigyelhető továbbá, hogy az enzim a tápközegben bromoxinil távollétében is kifejeződik, ha az enzim kifejezéséhez nem szükséges bromoxinil indukció.

A bromoxinil specifikus nitriláz további tisztítása.

A K. ozaenae nitriláz további tisztításával az alábbi eredményeket kapjuk:

2. táblázat

Bromoxinil specifikus nitriláz tisztítása E. coliból (kiindulási anyag 6 g sejt)

Frakció	Térfogat (ml)	Fehérje (mg)	pmól NH₃/perc	S.A.^b)
Nyers^a)	100	210	18,15	0,086
35-50 tömeg% NH4SO4	6	83	26,77	0,250
DEAE Sephadex	56	19	15,52	0,820

a) = A sejteket 30 °C hőmérsékleten 0,04 tömeg% bromoxinilt és glukózt tartalmazó M9 tápközegben közepes logaritmikus fázisig tenyésztjük. A sejtek roncsolásával, ultracentrifugálással és 0,05 mól/1 KPO₄ (pH = 7,5) és 2,5 mmól/1 DTT tartalmú pufferrel végzett dialízissel nyers extraktumot állítunk elő. A szubsztrátum koncentráció 3 mmól/1 minden nitriláz vizsgálatnál.

b) = pmól NH₃/perc/ng.

2,5 cm²xl0 cm méretű oszlopot 0,05 tömeg% KPO₄ (pH= 7,5) 2,5 mmól/1 DTT és 1 mmól/1 EDTA tartalmú pufferral egyenlítünk ki. A minták felvitele után az oszlopot 300 ml fenti pufferral fejlesztjük ki, amely lineáris gradienssel 0,02 mól/1 és 0,40 mól/1 koncentráció között változó nátrium-kloridot tartalmaz. A gradiens végén 1 mól/1 nátrium-kloridot tartalmazó puffért alkalmazunk. 5 ml-es frakciókat gyűjtünk össze, és az egyes frakciókból 0,075 ml-es mintában vizsgáljuk a nitriláz aktivitást. A 0,22 mól/1 koncentrációjú sóval egy csúcsot adó enzimaktivitást eluálunk. Az aktív frakciók a bevitt nitriláz aktivitás mintegy 75%-át tartalmazzák.

A DEAE oszlopról nitriláz csúccsal távozó frakciókat 0,02 mól/1 KPO₄-gyel (pH = 7,5) szemben dializáljuk, és minden frakcióból 50 μΐ (6 pg fehérje) részletet 11,25 tömeg%-os denaturált Laemmli-gélen [Natúré 227, 680-685 (197)] megfuttatjuk. Az aktivitás csúcsnak megfelelő dúsított fehérjesáv 34000 móltömegű polipeptid. Az aktív frakciókból további polipeptid nem nyerhető ki. Ez arra utal, hogy a bromoxinil specifikus nitriláz egy mintegy 34000 móltömegű polipeptid és feltehetően egyetlen gén terméke.

A pBrx2 kiónt EcoRI segítségével teljesen emésztjük, és mintegy 19 kb fragmenst izoláljuk. A fragmenst EcoRI segítségével emésztett pACYC184 vektorba (3,9 kb) építjük be, amelynek során pBrx5 plazmidot kapunk, amit a korábban leírt módon E. coliba transzformálunk. A plazmidot a szokásos módon izoláljuk, és BglII segítségével emésztjük. így mintegy 6,7 kb fragmenst kapunk, amely a nitriláz gént és a pACYC184 vektor pBrx5 plazmidból származó szakaszait tartalmazza. A fragmens ismételt ligálása után izoált pBrx7 plazmidot Smal és BglII segítségével emésztve mintegy 3,9 kb fragmenst kapunk, amelyet Smal-BamHI segítségével emésztett pACYC177 vektorba (3,7 kb) építünk be [Chang és Cohen: J. Bacteriol. 134, 1141-1156 (1978)]. A kapott penicillin rezisztens plazmidot a leírt módon E. coliba transzformáljuk, és a transzformánsokat penicillinre szelektált közegen kiválogatjuk. így pBrx8 plazmidot kapunk, amely egy 3,9 kb fragmensen hordozza a nitriláz gént.

A pBrx8 plazmidot PstI segítségével részlegesen emésztjük, és a fragmenseket PstI segítségével emésztett pUC 18-ba építjük be [Yanisch-Perron és munkatársai: Gene, 33, 103-119 (1985)]. A kapott plazmidokat E. coliba klónozzuk, és vizsgáljuk a nitriláz aktivitást. Egy klón 5,3 kb méretű pBrx9 plazmidot tartalmaz, amelyet izolálunk, és PstI és HincII segítségével tovább emésztve 1210bp fragmenssé alakítunk, amely a PstI helyből kiindulva egyenlő távolságokban HincII, Clal, Sáli, Seal és Sphl hasítóhelyeket tartalmaz. A Pstl-HincII fragmenst Sanger és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5468 (1977) szerint szekvenáljuk. A vizsgálatok során az alábbi szekvenciát kapjuk, ahol a kódolt aminosavat is megjelöljük:

HU 209 143 Β

CTGCAGCATAGTACGCCCTTGAAGAGGATACGCTCTTTGGCGAGCCATCAAAATAACCGGATTTTC 95 125

ATG GAC ACC ACT TTC AAA GCA GCC GCT GTT CAG GCC GAA CCG GTA TGG ATG GAT CCC GCT Hét Asp Thr Thr Phe Lys Alá Alá Alá Val Gin Alá Glu Pro Val Trp Met Asp Alá Alá

155 185

GCA ACA GCC GAT AAG ACC GTG ACG CTA GTA GCT AAA GCC GCA GCG GCT GGC GCG CAG CTC Alá Thr Alá Asp Lys Thr Val Thr Leu Val Alá Lys Alá Alá Alá Alá Gly Alá Gin Leu

215 245

GTC GCA TTT CCC GAA TTG TGG ATT CCG GGC TAC CCA GGA TTC ATG CTC ACG CAC AAC CAA Val Alá Phe Pro Glu Leu Trp Ile Pro Gly Try Pro Gly Phe Met LeuThr His Asn Gin

275 305

ACC GAA ACC CTA CCA TTC ATC ATT AAA TAC CGC AAC CAG CCA ATC CCC GCC GAT CGA CCA Thr Glu The Leu Pro Phe Ile Ile Lys Try Arg Lys Gin Alá Ile Alá Alá Asp Gly Pro

335 365

GAA ATC GAA AAA ATT CGC TGC GCG GCT CAG GAG CAT AAC ATT GCG CTC TCC TTT GGG TAC Glu Ile Glu Lys Ile Arg Cys Alá Alá Gin Glu His Asn Ile Alá Leu Ser Phe Gly Tyc

395 425

AGC GAA CGG GCT GGC CGT ACT CTC TAC ATG TCA CAA ATG CTT ATC GAT GCC GAT CGC ATC Ser Glu Arg Alá Gly Arg Thr Leu Tyr Met Ser Gin Met Leu Ile Asp Alá Asp Gly Ile

455 485

ACC AAA ATT CGT CGT CGA AAG CTC AAA CCA ACC CGC TTT GAA CGA GAA CTC TTT GGC GAA Thr Lys Ile Arg Arg Arq Lys Leu Lys Pco Thr Arg Phe Glu Arg Glu Leu Phe Gly Glu

515 545

GGT GAC GGA TCG GAC TTA CAG GTC GCC CAA ACT AGC GTT CGT CGG GTG GGT GCC CTC AAC Gly Asp Gly Ser Asp Leu Gin Val Alá Gin Thr Sec Val Gly Arg Val Gly Alá Leu Asn

575 605

TGC GCG CAG AAT TTG CAG TCG CTA AAC AAC TTT CCG CTT GCT GCC GAG GGT GAA CAG ATA Cys Alá Glu Asn Leu Gin Sec Leu Asn Lys Phe Alá Leu Alá Alá Glu Gly Glu Gin Ile

635 665

CAT ATC TCC GCC TGG CCA TTC ACG CTT GGA AqC CCT GTG CTC GTC GGA GAC TCC ATC CGC His Ile Ser Alá Trp Pro Phe The Leu Gly Sec Pto Val Leu Val Gly Asp Ser Ile Gly

695 725

GCC ATC AAC CAG GTC TAC GCG GCC GAG ACG GGG ACC TTC GTT CTC ATG TCG ACG CAG GTG Alá Ile Asn Gin Val Tyr Alá Alá Glu Thr Gly The Phe Val Leu Met Sec Thr Gin Val

755 · 785

GTT GGA CCG ACC GGC ATC GCC GCC TTC GAG ATC GAA GAC AGC TAC AAC CCC AAT CAG TAT Val Gly Pro Thr Gly He Alá Alá Phe Glu Ile Glu Asp Arg Tyr Asn Pro Asn Gin Tyr

815 845

CTT GGT GGT GGG TAC GCG CGG ATG TAC GGG CCT GAC ATG CAG TTG AAG AGC AAG TCG TTG Leu Gly Gly Gly Tyr Alá Arg Ile Tyr Gly Pro Asp Met Gin Leu Lys Ser Lys Ser Leu

875 905

TCA CCG ACC GAA GAG CGC ATC GTC TAC GCC GAG ATC GAC CTG TCG ATG CTT GAG GCA GCA Sec Pro Thr Glu Glu Gly Ile Val Tyr Alá Glu Ile Asp Leu Ser Met Leu Glu Alá Alá

935 965

AAG TAC TCG CTC GAT CCC ACG GGC CAC TAT TCG CGC CCT GAT GTG TTC AGC CTG TCG ATT Lys Tyr Ser Leu Asp Pro Thr Gly Ilis Tyr Ser Arg Pro Asp Val Phe Ser Val Sec Ile

995 1025

AAC CGG CAA CGG CAG CCT GCG GTG TCA GAA GTT ATC GAC TCA AAC GGT GAC GAG GAC CCC Asn Arg Gin Arg Gin Pro Alá Val Ser Glu Val Ile Asp Ser Asn Gly Asp Glu Asp Pro

1055 1085

AGA GCA GCA TGC GAG CCC GAC GAG GGG GAT CGT GAG GTC GTA ATC TCT ACG GCA ATA GGG Arg Alá Alá Cys Glu Pro Asp Glu Gly Asp Arg Glu Val Val Ile Ser Thr Alá Ile Gly

1115 1155

GTT CTA CCC CGT TAT TGC GGA CAT TCC TAATAAAAAGAGACACGTGGTACCAAAGGCGTCTTCATGTCCA Val Leu Pro Arg Tyr Cys Gly His Ser

1200

GACGCAGAAAATATAGCCCAGAGTTAAAACGCGAAGCCATCCCTTTAACCCGTCAAC

HU 209 143 Β

Az 5’ és 3’ nem kódoló oldalsó szakaszoktól lényegében mentes Pstl-HincII fragmens végére EcoRI linker kapcsolható, EcoRI segítségével emészthető, és ezután a növényi kifejezőszakaszba beépíthető, amihez a pCGN451 EcoRI helyére építjük be.

A pCGN451 olyan oktopin szakaszt tartalmaz, amely mintegy 1566 bp méretű 5’ nem-kódoló szakaszt, amely egy EcoRI linkeren keresztül a gén 3’ végéhez kapcsolódik, valamint mintegy 1349 bp méretű 3’ nem kódoló DNS-t tartalmaz. A pTi koordinátái: 11207-12 823 a 3’ szakasz és 13 643-15 208 az 5’ szakasz [Barker és munkatársai: Plánt Molecular Biology, 2,335 (1983)]. Az 5’-fragmenst az alábbi módon állítjuk elő: A kódoló szakasz 5’-végét tartalmazó kis szubklónozott fragmenst BamHI-EcoRI fragmensként a BamHI és EcoRI enzimekkel emésztett pBR322 plazmidba klónozva pCGN407 plazmidot kapunk. (A pBR322 plazmid egyetlen BamHI és EcoRI helyet tartalmaz a tetraciklin rezisztens szakaszban.) A BamHI-EcoRI fragmens a kódoló szakaszban egy XmnI helyet, míg a pBR322 két XmnI helyet tartalmaz. A pCGN407-et XmnI segítségével emésztjük, Bal31 nukleázzal hasítjuk (Maniatis, 135-137. oldal), és a fragmenshez EcoRI linkért adunk. EcoRI és BamHI hasítás után a fragmenseket méret szerint frakcionáljuk, a frakciókat klónozzuk, és szekvenáljuk. Egyik esetben a teljes kódoló szakaszt és az 5’ nem lefordított szekvencia 10 bp részét eltávolítjuk, miközben az 5’ nem átírt szakasz, az mRNS fedőrésze és az 5’ nem lefordított szakasz 16 bp része (a BamHI helyhez) sértetlen marad. Ezt a kis fragmenst 7 tömeg%-os akril-amid gélen végzett méret szerinti frakcionálással és a mintegy 130 bp hosszúságú fragmensék eluálásával kapjuk. Ezt a méret szerint frakcionált DNS-t M13mp9-be [Vieira: Gene, 19, 259 (1982)] ligáljuk, több kiónt szekvenálunk, és a szekvenciát az oktopin-szintáz gén ismert szekvenciájához hasonlítjuk. A fragmenst tartalmazó M13 plazmid jele pI4. Ezt a plazmidot BamHI és EcoRI segítségével emésztve egy kis fragmenst kapunk, amelyet a pTiA6 [Garfinkel és Nester: J. Bacteriol. 144, 732, (1980)] 5’ szekvenciát tartalmazó XholBamHI fragmenséhez és 3’ szekvenciát tartalmazó EcoRI-XhoI fragmenséhez kapcsolunk. A kapott Xhol fragmenst egy pCGN426 jelű pUC8 származék Xhol helyére klónozzuk. Ez a plazmid annyiban különbözik a pUC8-tól, hogy egyetlen EcoRI helyét DNS polimeráz I tölti ki, és a HincII restrikciós endonukleáz nukleáz-szennyeződése miatt elveszítette a PstI és HindlII helyeket, amikor a pUC8 egyetlen HincII helyére Xhol linker épült be. A kapott pCGN45l plazmid egyetlen EcoRI helyet tartalmaz a fehérjekódoló szekvenciáknak az 5’ nem kódoló szakasz (amely a T-DNS jobb szegélyét tartalmazó 1550 bp méretű 5’nem átírt szekvenciát, az mRNS cap-szekvenciát és a 16 bp méretű 5’ nem lefordított szekvenciát tartalmazza), és a 3’ szakasz (amely 267 bp méretű kódolószakaszt, stop-kódot, 196bp méretű 3 ’ nem lefordított DNS-t, poli-Α helyet és 1153 bp méretű 3’ nem átírt szekvenciát tartalmaz) közé történő beépítésére.

A pCGN451 oktopin-szintetáz (öcs) szakaszt tartalmazó Xhol fragmensét pCGN517 plazmidba építjük be, amely tetraciklin rezisztencia és kanamicin rezisztencia géneket tartalmaz. A pCGN517 pHC79-ből [Hohn: Gene, 11,291 (1980)] állítható elő a pUC4K-ból [Vieira: Gene 19, 259 (1982)] származó Kan^r génnek az egyetlen PstI helyre történő beépítésével. A pCNG517-et Sáli segítségével emésztjük, és az Xhol fragmenst az egyetlen Sáli helyre beépítjük.

Az Xhol fragmenst egy második, pCGN529 plazmid Xhol helyére is beépítjük. A pCGN529 pACYC184-ből a Tn5-ből [Rothstein és munkatársai: Movable Genetic Elements, 99. oldal (1981) Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York] állítható elő: a pACYC184 HindlII-BamHI fragmensét a Tn5-ből származó Kan^r génnel helyettesítjük, a visszamaradó BamHI helyre ezután beépítjük a 2,4 bp méretű, pRIA4 TLDNS-ből származó [White és Nester: J. Bacteriol. 144, 710 (1980)] BglII fragmenst.

Az öcs szakaszt tartalmazó Xhol fragmenst, amelyben az öcs szakasz egyetlen EcoRI helyére nitriláz gén van beépítve, pCGN517-be és pCGN529-be építjük be, miáltal két, pNl és pN2 plazmidot kapunk. Ezek a Ti vagy Ri plazmidok T-DNS-ével történő egyesítés érdekében A. tumefaciens-be vagy A. rhizogenes-be vihetők be. A megfelelő plazmidokkal történő egyesítés háromutas párosítással valósítható meg Comai és munkatársai: Plasmid, 10,21-30 (1983) módszerével. pRK2073 (Garfinkel), pNl és pN2 plazmidokat tartalmazó E. coli, A. tumefaciens A722 [Garfinkel: J. Bacteriol. 144, 732 (1980)] vagy A. rhizogenes A4T [White: J. Bacteriol. 144, 710 (1980)] gazdákat egy éjszakán keresztül tenyésztünk, és a megfelelő tenyészeteket összekeverjük, és 150 pg/ml kanamicint tartalmazó AB lemezekre [Proc. Nat. Acad. Sci. 71, 3672-3676 (1974)] rétegezzük. Az egyes telepeket kétszer újra rétegezzük. A megfelelő egyesítést a teljes Agrobacterium DNS Southern-analízisével ellenőrizzük. Az endonukleázzal emésztett DNS-t nick transzlációval radioaktívan jelzett pBrx8-cal vizsgáljuk.

Bromoxlnil specifikus nitriláz gén kifejezése gyökérgolyva-szövetben

A nitriláz gént egy 2,6 kb fragmensen hordozó pBrx9 plazmidot BamHI segítségével emésztünk, és valamely 5’ oldalsó szakasz eltávolítására Bal31 segítségével kezeljük (Maniatis, 135-137. oldal). BamHI linkért adunk hozzá, és visszazárjuk. A kapott plazmidok ampicillin rezisztenciával rendelkeznek. Ezeket a korábban leírt módon E. coliba transzformáljuk, és a transzformánsokat ampicillin szelektív közegen kiválogatva 5,2 kb méretű pBrxló és pBrxl7 plazmidokat kapunk, amelyek egy 2,6 kb fragmensen hordozzák a nitriláz gént. A pBrxl6-ot BamHI segítségével emésztjük, és HincII segítségével részlegesen emésztjük. Az 1,2 kb méretű nitriláz gén fragmenst izoláljuk.

A pCGN46 plazmidot BamHI és Smal enzimekkel emésztjük. A kapott fragmensek közül csak egy alkalmas arra, hogy a fenti BamHI-HincII fragmenst inszertálja. A klónozás elvégzésével 6,6 kb méretű pBrx22 plazmidot kapunk, amely tartalmazza a nitriláz gén fragmenst.

HU 209 143 Β

A pCGN46 [Comai és munkatársai: Natúré, 317, 741-744 (1985)] egy mannopin-szintáz (MAS) kifejező szakasz, amely egy MAS promotert és öcs 3’ szakaszt tartalmaz. A pCGN46 előállítását az alábbiakban foglaljuk össze: A T-R-DNS [Barker és munkatársai: Plánt Mól. Bioi. 2, 325, (1983)] mannopin-szintáz promoter szakaszt (P_MAS) tartalmazó részét hordozó

5,5 kbp méretű EcoRI fragmenst (Ecol3 vagy EcoC) egy pVK232 jelű vektorba klónozzuk. A pVK232 EcoRI segítségével végzett emésztése után Ecol3-at építünk be a pACYC184 EcoRI helyére, miáltal pCGN14 plazmidot kapunk. A pCGN14-et Sphl és Clal segítségével emésztjük (Barker és munkatársai fent idézett szekvenciájának 21562 és 20128 helyén), így eltávolítjuk P_MAS szakaszt, amelyet pUC19-be (Pharmacia Inc.) építünk be, amelyet Sphl és Acél segítségével emésztve pCGN40-et kapunk. A P_MASszakasz tartalmaz egy Clal felismerő helyet, amelyet metilezünk, amelynek hatására az emésztésnek ellenáll. A pCGN40-et EcoRV és EcoRI segítségével emésztjük, amikor is az EcoRV hely a T-DNS-ben, míg az EcoRI hely a pUC19 polilinkerjének van, amikor is P_mas szakaszt tartalmazó fragmenst kapunk. Az oktopin-szintáz szakaszt tartalmazó pCGN451-et Smal és EcoRI segítségével emésztjük, és a nagyobb fragmenst izoláljuk, amelyből az oktopin-szintáz 5’ szakasz kiiktatódott. Az EcoRV-EcoRI P_MAS szakaszt oktopinszintáz 5’ szakasz helyébe az pCGN451 nagyobb fragmensébe építjük be, ahol az átírás kezdő- és befejező szakaszait egy polilinker választja el, amikor is pCGN46-ot kapunk.

Az 1,2 kb nitriláz gén fragmenst tartalmazó pBrx22 plazmidot a fent leírt módon E. coliba transzformáljuk. A plazmidot a szokásos módon állítjuk elő, és Xhol segítségével emésztve olyan 4,1 kb fragmenst kapunk, amely MAS promotert, a bakteriális 5’ nem lefordítódó szekvencia 25 bázispárját tartalmazó bromoxinil gént és öcs 3’ szakaszt tartalmaz. A 4,1 kb fragmenst Sáli segítségével emésztett pCGN783 plazmidba beépítve mintegy 31 kb méretű pBrx28 plazmidot kapunk.

pCGN783 előállítása pCGN!67 előállítása

A pCGN167 előállításához CaMV-ből [Gardner és munkatársai: Nucl. Acids Rés. 9,2871—2888 (1981)] Alul fragmenst állítunk elő Alul segítségével végzett emésztéssel. A kapott mintegy 590 bp Alul fragmenst (bp 7144-7735) az M13mp7 [Vieire: Gene, 79, 259 (1982)] HincII helyére klónozzuk.

így C614-et kapunk, amely a vektor polilinkerjében lévő EcoRI helyen EcoRI segítségével hasítható. így olyan C614 EcoRI fragmenst kapunk, amely csak alig valamivel nagyobb, mint az 590 bp fragmens, és amely 35S promotert tartalmaz. Ezt pUC8 [Vieira és munkatársai: Gene, 79, 259 (1982)] EcoRI helyére klónozva pCGN 146-ot kapunk.

A promoter szakasz elrendezése érdekében a pCGN 146 BglII helyét (bp 7670) BglII-vel és Bal31gyel kezeljük (Maniatis, 135-137. oldal), és ezután a Bal31-gyel kezelt DNS-hez egy BglII linkért kapcsolunk. így pCGN147-et kapunk.

A szelektált pCGN147 klón szekvenálása szerint a Bal31gyel végzett emésztés során mintegy 125 nukleotid eliminálódott a BglII helytől 5 irányban, és a kapott promoter a CaMV szekvencia 7144-7544 nukleotidjait tartalmazza.

Promoter szakaszt, megkülönböztető markert (KAN 2 ATG-vel) és 3’ szakaszt tartalmazó pCGN148a-t állítunk elő pCGN528 (lásd később) BglII segítségével végzett hasításával és a pCGN147 BamHI-BglII promoter firagmensének beépítésével. Ezt a fragmenst pCGN528 BglII helyére klónozzuk, és így a BglII hely a pCGN528 kanamicin génjének középpontjába esik.

A fenti szerkezethez alkalmazott pCGN528 „ingázó” vektor az alábbi módon állítható elő: pCGN525-öt állítunk elő kanamicin gént magába záró Tn5-öt tartalmazó ColEl::Tn5 plazmid [Jorgenson és munkatársai: Mól. Gén. 777,65 (1979)] HindlII-BamHI emésztésével, és a kanamicin gént tartalmazó HindlII-BamHI fragmensnek a pACYC184 [Chang és Cohen: J. Bacteriol. 134, 1141-1156 (1978)] tetraciklin génjében található HindlII-BamHI helyre történő beépítésével. pCGN525-öt állítunk elő pTiA6 [Tomashow és munkatársai: Cell. 79, 729-739 (1980)] BamHI 19 fragmensének pCGN525 BamHI helyére történő beépítésével. pCGN528-at állítottunk elő pCGN526 kis Xhol fragmensének Xhol segítségével végzett emésztéssel és ismételt ligálással történő kiiktatásával.

pCGN 149a-t állítjuk elő pMB9KanXXI BamHI kanamicin gén fragmensének pCGN 148a BamHI helyére történő klónozásával. A pMB9KanXXI olyan pUC4K variáns [Vieire és Messing: Gene, 19, 259-268 (1982)], amelyből hiányzik az Xhol hely, de tartalmazza a Tn903 funkcionális kanamicin génjét, ami lehetővé teszi az Agrobacteriumban történő hatékony kiválasztást.

A pCGN149a-t BglII és Sphl segítségével emésztjük. ApCGN149akisBglII-SphIfragmensétMl (lásd később) BamHI és Sphl emésztésével kapott BamHISphl fragmenssel helyettesítjük. így pCGN167-et kapunk, amely tartalmazza a teljes hosszúságú CaMV promotert, az lATG-kanamicin gént, a 3’ véget és a bakteriális Tn903 típusú kanamicin gént. Az Ml a pCGN550 (lásd a pCGN587 előállítását) EcoRI fragmense, amelyet M13mp9 EcoRI klónozóhelyére klónozunk úgy, hogy az lATG-kanamicin gén PstI helye az M13mp9 polilinker szakaszának középpontjába helyezkedjenek el.

A pCGN587 előállítása

Az ΑΡΗ3ΊΙ teljes strukturális génjét tartalmazó Tn5 (Jorgansen és munkatársai: Mól. Gén. Génét. 777, 65, 1979) HindlII-Smal fragmensét HindlIISmal emésztett pUC8-ba (Vieira és Messing: Gene, 72, 259-268, 1982) klónozzuk. Ez a fragmenst HindlII-EcoRI fragmenssé alakítja, mivel közvetlenül az Smal hely szomszédságában egy EcoRI hely található. Az ΑΡΗ3ΊΙ gén 3’-szakaszát tartalmazó Patl-EcoRI fragmenst egy EcoRI-BamHI-Sall-Patl linkerrel kombináljuk a pUC7 EcoRI helyén, és így pCGN546W-t kapunk. Az ΑΡΗ3ΊΙ ATG kezdő ko10

HU 209 143 Β dórijától felfelé és a leolvasó kereten kívül egy felesleges ATG kodon található. Ennek kiiktatásához az ΑΡΗ3ΊΙ 5’-végéről származó Sau3 A-Patl fragmenst, amely nem tartalmazza a felesleges ATG-t, a pCGN546W BamHI-PstI helyére inszertáljuk, és így pCGN550 plazmidot kapunk. A pCGN550 EcoRI fragmensét, amely tartalmazza az ΑΡΗ3ΊΙ gént, a pUC8-pUC13-om (K.Buckley: Doktori disszertáció, UC-San Diego, 1985) EcoRI helyére klónozzuk, és így pCGN551 plazmidot kapunk. A pCGN551 EcoRI fragmensét, amely az ép kanamicin rezisztencia gént tartalmazza, a pCGN451 EcoRI helyére inszertáljuk, és így pCGN552 plazmidot kapunk, amely megfelelő orientációban tartalmazza a kanamicin rezisztencia gént. Ezt az ocs/KAN gént alkalmazzuk szelektálható markerként a pCGN587 biner vektor transz típusához.

Az oktopin szintáz promoter kazetta 5’ szakasza a pTiAó plazmid Xhol helyéről származó 15208-13644 bp DNS-t (Barker és munkatársai Plánt Mól. Bioi. 2, 335— 350, 1983), valamint a T-DNS transzferben található TDNS határ szekvenciát tartalmazza. A pCGN587 plazmidban a pCGN552-ből származó ocs/KAN gén szelektálható markerként és jobb határként szolgál. A bal határszakaszt egy 602-2212 bp HindlII-Smal darabként (pCGN502) először M13mp9-be klónozzuk, és KpnlEcoRI fragmensként a pCGN565-be visszaklónozzuk, így pCGN38O plazmidot kapunk. A pCGN565 egy klónozó vektor, amely a pUCB-pUC13-om szekvencián (K. Buckley: Doktori disszertáció, UC-San Diego, 1985) alapul, de pUC18 linkért (Yanisch-Perron és munkatársai: Gene 33, 103-119, 1985) tartalmaz. A pCGN580 plazmidot BamHI enzimmel linearizáljuk és a pVCK102 plazmid [Knauf és Nester: Plasmid 8(45), 1982] kis BglII fragmensének helyettesítésére használjuk. így pCGN585 plazmidot kapunk. A pCGN585 kis Sáli fragmensét a pCGN552 Xhol fragmensével helyettesítve, amely tartalmazza az ocs/KAN gént, pCGN587 plazmidot kapunk.

709 (1 ATG-kanamicin 3 ’ -szakasz) előállítása

A pCGN566 a pUC13-om [K. Buckley: Doktori disszertáció, UC-San Diego (1985)] EcoRI-HindlII helyére beépítve a pUC18 (Yanisch és Perron idézett műve) 58 bp EcoRI-HindlII linkerjét tartalmazza. A pNW31c-8, 29-1 [Tomashow és munkatársai: Cell, 19, 729 (1980)] HindlII-BglII fragmensét, amely ORFl-et és -2-t (Barker és munkatársai idézett műve) tartalmaz, pCGN566 plazmidba szubklónozzuk. Ehhez kimetszük a pCGN566 plazmid HindlII-BamHI fragmensét, és a visszamaradó teljes vektort a fenti HindlII-BglII fragmenssel egyesítjük. így pCGN703 plazmidot kapunk.

A pCGN703 Sau3A fragmensét, amely tartalmazza a pTiA6 7. transzkripciós egység 3’ szakaszát - megfelel a pT115955 [Barker és munkatársai idézett műve (1983)] 2396-2920 bázisának -, pUCI8 (Yanisch, Perron és munkatársai idézett műve) BamHI helyére szubklónozzuk, és így pCGN709-et kapunk.

pCGN766c (35s promoter 3’ szakasz) előállítása

A pCGN167 (lásd fent) HindlII-BamHI fragmensét, amely CaMV 35s promotert, lATG-kanamicin gént és pTiA6 BamHI 19 fragmensét tartalmazza, pUC19 plazmidba (Norrander és munkatársai idézett műve, Yanisch, Perron és munkatársai idézett műve) klónozzuk. Ehhez kimetszük a pUC19 plazmid BamHI-HindlII fragmensét, és a visszamaradó teljes vektort a fenti HindlII-BamHI fragmenssel egyesítjük, így pCGN976 plazmidot kapunk.

A 7. transzkripciós egység 35s promoterét és 3’ szakaszát pCGN976 0,7 kb HindlII-EcoRI fragmensének (35s promoter) és pCGN709 0,5 kb EcoRI-Sall fragmensének (7. transzkripciós egység 3’ szakasza, lásd fent) a pCGN566 HindlII-Sall helyére történő beépítéssel kifejlesztjük, és így pCGN766c-t kapunk.

pCGN783 végső előállítása

A pCGN766c 0,7 kb HindlII-EcoRI fragmensét (CaMV-35s promoter) pCGN766c 1,5 kb EcoRI-Sall fragmenséhez (1ATG-KAN-3'szakasz) ligáljuk a pUC19 (Bethesda Research Labs., USA) HindlII-Sall helyében, és így pCGN778-at kapunk.

Gentamicin rezisztens marker előállításához a pPHIJl plazmid (Hirsch és munkatársai, 1984) 3,1 kb EcoRI-PstI fragmenséből izoláljuk a gentamicin rezisztencia gént, és pUC9 plazmidba (Vieira és Messing: Gene 19, 259-268, 1982) klónozzuk. így pCGN549 plazmidot kapunk. Ennek HindlII-BamHI fragmensét, amely tartalmazza a gentamicin rezisztencia gént, a pCGN587 HindlII-BglII fragmensével kicserélve pCGN594 plazmidot kapunk. A pCGN594 HindlII-BamHI szakaszát, amely egy 5’-ocs-kanamicin-ocs-3’ fragmenst tartalmaz, a pUC18 (Yanisch-Perron és munkatársai; Gene 33,103-119,1985) HindlIIBamHI polilinker szakaszával helyettesítjük, és így pCGN739 plazmidot kapunk.

A pCGN778 2,2 kb szakaszával, a HindlII-Sall fragmenssel, amely CaMV 35s promotert és a 1ATGKAN-3’ szakaszt tartalmazza, helyettesítjük a pCGN739 HindlII—Sáli polilinker szakaszát, és így pCGN783-at kapunk. A pBrxl7-et BamHI segítségével emésztjük, és HincII segítségével részlegesen emésztjük, a 1,2 kb nitriláz gén fragmenst izoláljuk. A BamHI-HincII beépítjük a pCGN566 plazmidba. Ehhez kimetszük a pCGN566 BamHI-Sma I fragmensét, és a visszamaradó teljes vektort a fenti BamHI-HincII . fragmenssel egyesítjük. így nitriláz gén fragmenst tartalmazó 3,7 kb pBrx25 plazmidot kapunk.

A pCGN566-ot az alábbi módon állítjuk elő: A pUC13-at (Cm^R) [Ken Buckley doktori disszertációja, U.C. San Diego, (1985)] EcoRI és HindlII segítségével emésztjük, és a pUC18 és pUC19 polilinkerjeit beépítjük a linearizált pUC 13-ba, és így p CGN566-ot kapunk, amely tartalmazza a klóramfenikol rezisztens markert.

Az 1,2 kb nitriláz gén fragmenst tartalmazó pBrx25 plazmidot a fent leírt módon E. coliba transzformáljuk. A plazmidot a szokásos módon izoláljuk, és BamHI és EcoRI segítségével emésztjük, így ismét az 1,2 kb nitriláz gén fragmenst kapjuk. A BamHI és EcoRI fragmenst beépítjük a pCGN46 plazmidba. Ehhez kimetszük a pCGN46 BamHI-EcoRI fragmensét, és a viszszamaradó teljes vektort a fenti BamHI-EcoRI frag11

HU 209 143 Β menssel egyesítjük. így a nitriláz gén fragmenst tartalmazó 6,6 kb p Brx27 plazmidot kapjuk.

A pBrx27-et a fent leírt módon E. coliba transzformáljuk. A plazmidot a szokásos módon izoláljuk, és Xhol segítségével emésztjük, így 4,1 kb fragmenst kapunk, amely tartalmazza a MAS promotert, a bakteriális 5’ lefordított szekencia 11 bázispárját magába foglaló bromoxinil nitriláz gént és az öcs 3’ szakaszt. A

4,1 kb fragmenst Sáli segítségével emésztett pCGN783-ba építjük be, és így mintegy 31 kb pBrx29 plazmidot kapunk.

A nitriláz kifejezés detektálása

A pBrx28 és pBrx29 plazmidokat Agrobacterium tumefaciens K12 törzsbe [Nester: Ann. Rév. Micro. 35,531 (1981); Hoekema és munkatársai: Natúré, 303, 179 (1983)] transzformáljuk. A K12 (pBrx28) és K12 (pBrx29) alkalmas a korallvirág gyökérgolyva [Garfinkel: J. Bacteriol. 144, 732 (1980)] kialakítására.

Mintegy 1 g (friss tömeg) gyökérgolyva szövetet folyékony nitrogénben 0,1 mól/1 trisz (pH = 7,5), 10 mól/1 EDTA, 0,15 mól/1 nátrium-klorid, 0,05 tömeg% NP-40 (Nonidet P-40, nemionos detergens), 25 mg/ml BSA, 1 mmól/1 DTT és 0,13 pg/ml leupeptin tartalmú pufferben megőrlünk. A mintákat 0,05 g polivinil-pirrolidon (Sigma). hozzáadása után homogenizáljuk, majd 15 000 g mellett 15 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten centrifugáljuk, 25 pl antiszérumot, amelyet a tisztított nitriláznak nyálba történő befecskendezésével állítunk elő, és 250 pl 10 vegyes%-os S. aureus (Calbiochem) szuszpenziót adunk minden felülúszóhoz, és 16 órán keresztül 4 ’C hőmérsékleten inkubáljuk. A mintákat centrifugáljuk, és a pelletet kétszer 20 mmól/1 trisz (pH = 7,5), 1 mmól/1 EDTA, 150 mmól/1 nátrium-klorid és 0,05 tömeg% NP-40 (lásd fent) eleggyel kétszer mossuk. A pelletekeet 100 pl 0,125 mól/trisz (pH = 6,8), 4 tömeg% SDS, 20 tömeg% glicerol és 10 tömeg% BMe (β-merkapto-etanol) elegyben szuszpendáljuk, és 2 percen keresztül 90 ’C hőmérsékleten melegítjük. A teljes mintát 10 tömeg%-os akril-amid gélen [V. K. Laemmli: Natúré, 227, 680-685 (1970)] elektroforézissel vizsgáljuk. A reszolvált polipeptideket nitrocellulóz szűrőre (Schleicher és Schuell) visszük Burnette [Anal. Bioi. Chem. 112, 195-203 (1981)] által leírt módon. A nitrocellulóz szűrőket (Schleicher és Schuell) ezután „BLOTTO”-ban (Johnson és munkatársai: Gén. Anal. Technoi. 1, 38-42 (1983)] 1-3 órán keresztül 42 ’C hőmérsékleten, majd egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk, ahol a „BLOTTO” 1: 50 hígítású antinitriláz szérumot tartalmaz. A szűrőket 10 percen keresztül 20 mmól/1 trisz (pH = 7,5) és 150 mmól/1 nátrium-klorid elegyben, 20 percen keresztül 0,05 tömegbe Tween 20-szal kiegészített fenti pufferban és további 10 percen keresztül ismét Tween 20 nélküli pufferban mossuk. A szűrőkhöz 10⁶ cpm/ml ¹²⁵J-dal jelzett A fehérjét (9 p Ci/mg, NEN) tartalmazó „BLOTTO”-t adunk, és szobahőmérsékleten 2 órán keresztül inkubáljuk. A szűrőket egy éjszakán keresztül 50 mmól/1 trisz (pH = 7,5), 1 mól/1 nátriumklorid és 0,4 tömeg% szarkozil eleggyel mossuk. Öblítés és szárítás után a szűrőket -70 ’C hőmérsékleten Kodak AR röntgen filmen exponáljuk Dupont Cronex erősítőszer alkalmazásával.

A. rhizogenes-szel együtt tenyésztett dohánylevél metszetek transzformálására és regenerálására Dohánynövényeket tenyésztünk steril körülmények között [25 ’C, 16 óra fehér fény, MS táptalaj (Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants; 1 mg/1 indolecetsav (IAA), 0,15 mg/1 kinetin)]. A legnagyobb hajtás átültetésével kapott háromhetes növényeket alkalmazzuk szövetdonorként. Fiatal leveleket (a csúcstól számított negyedik levél alatt) válogatunk ki, 2 mm átmérőjű metszeteket készítünk, és (3 cm átmérőjű) Petri-csészékben 1 mg/1 IAA tartalmú 1 ml MS közegre helyezzük. A metszeteket egy éjszakán keresztül teljes sötétségben tartjuk, majd Agrobacterium (A722xpNl vagy pN2) sejteket (10⁸-10⁹/ml növényi tápközeg) adunk a tenyészethez. A tenyésztést 1824 órán keresztül sötétben folytatjuk. A levélmetszeteket hormon nélküli és 350 mg/1 cefotaxint (Boehringer, Mannheim) tartalmazó MS közeggel háromszor mosva megszabadítjuk az Agrobacterium sejtektől. Ezután 9 cm átmérőjű Petri-csészékben hormon nélküli 10 ml MS közegre helyezzük. Növényi agart (Gibco, 0,6 tömeg%, 350 mg/1 cefotaxin) tartalmazó Petri-csészéket parafilmmel lezárunk, és a szövetdonor növénnyel azonos körülmények között tartjuk. A 2-4 hetes gyökereket levágjuk, és 2 mg/1 IAA és 2 mg/1 kinetin tartalmú fenti közegben az adott körülmények között tartjuk. A regenerálódó hajtások 2-5 hét elteltével láthatók.

A növényeket hatleveles állapotban bromoxinil oldattal permetezzük meg. 10 cm átmérőjű cserepekben egy növényt nevelünk, és minden cserépre 2,5 ml oldatot permetezünk. A növényeket 25 ’C hőmérsékleten, 70%-os relatív páratartalom és 60 órás megvilágítási periódusban üvegházban tartjuk. A növekedést 9 nappal a permetezés után értékeljük a 0,5 cm-nél hosszabb új levelek megszámolásával.

A fenti eljárással bromoxinil rezisztens növények állíthatók elő, amelyek a szabadban bromoxinil jelenlétében jelentős károsító hatás nélkül termeszthetők.

A találmány szerinti megoldás lehetővé teszi herbicidekkel szemben, elsősorban benzonitril herbicidekkel szemben rezisztens növények kifejlesztését, amikor is a nitrilázt kódoló gént a növényi gazdába beépítjük, miáltal a gén benzonitril rezisztenciát fejleszt ki. A génnek megfelelő bakteriális gazdába történő klónozásával olyan enzim állítható elő, amelyek a fenti aktivitással rendelkeznek, és széles körben, így különböző minták vagy benzonitril szubsztrátumok vizsgálatára felhasználhatók. Az enzimek és az enzimet kifejező baktériumok felhasználhatók továbbá a benzonitril eltávolítására a fertőzött környezetből.

A találmány szerinti megoldás részleteit a könynyebb megértés érdekében néhány példával világítottuk meg, szakember számára azonban nyilvánvaló, hogy az oltalmi körön belül különböző változatok és módosítások lehetségesek.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás halogénezett benzonitrilre specifikus, mintegy 34 kd móltömegű bakteriális nitriláz előállítására, azzal jellemezve, hogy egy Klebsiella baktériumot halogénezett benzonitril rezisztenciára vizsgálunk és a rezisztens baktériumot kiválogatjuk, a baktérium DNS-ét mintegy 5-50 kb méretű fragmensekre hasítjuk, a fragmenseket megfelelő vektorba beépítve baktériumba klónozzuk és a halogénezett benzonitrilre specifikus nitriláz enzimeket kódoló kiónokat kiválogatjuk, majd izoláljuk a halogénezett benzonitrilre specifikus nitriláz enzimet kifejező gént tartalmazó DNS szekvenciát, a kapott DNS szekvenciát vektorba beépítve bakteriális vagy növényi gazdasejtbe transzformáljuk és az enzimet a gazdasejtben kifejezzük. (Elsőbbsége: 1986. 01.08.)
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 3,5-dihalogénezett p-hidroxi-benzonitrilre rezisztens baktériumokat válogatunk ki.

(Elsőbbsége: 1987.01. 05.)
3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 3,5-dihalogénezett p-hidroxi-benzonitrilre rezisztens K. ozaenae-t válogatunk ki.

(Elsőbbsége: 1987. 01.05.)
4. Eljárás halogénezett benzonitrilre specifikus bakteriális nitrilázt kifejező gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy Klebsiella baktériumot halogénezett benzonitril rezisztenciára vizsgálunk és a rezisztens baktériumot kiválogatjuk, a baktérium DNS-ét mintegy 5-50 kb méretű fragmensekre hasítjuk, a fragmenseket megfelelő vektorba beépítve baktériumba klónozzuk és a halogénezett benzonitrilre specifikiis'nitriláz enzimeket kódoló kiónokat kiválogatjuk, majd izoláljuk a halogénezett benzonitrilre specifikus enzimet kifejező gént tartalmazó DNS szekvenciát és a kapott DNS szekvenciát vektorba beépítve bakteriális vagy növényi gazdasejtbe transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1986.01.08.)
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a DNS szekvenciát E. coli sejtbe transzformáljuk. (Elsőbbsége: 1986. 03. 28.)
6. Eljárás halogénezett benzonitrilre specifikus bakteriális nitrilázt kódoló gént tartalmazó kifejező szakasz előállítására, azzal jellemezve, hogy Klebsiella baktériumból származó, és halogénezett benzonitrilre specifikus bakteriális nitrilázt kódoló gént tartalmazó DNS szekvenciához bakteriális vagy növényi sejtben működő átíró és lefordító szabályozó szakaszokat kapcsolunk.

(Elsőbbsége: 1986.01.08.)
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább egy T-DNS szegélyt alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1986.01.08.)
8. A 6-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy „opine”-t kódoló génből származó átíró kezdő szakaszt alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1986.01.08.)
9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mannopin-szintáz átíró és lefordító kezdő szabályozó szakaszt alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1986.03.28.)
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy növényi sejtben működő átíró szabályozó szakaszt alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1986.03.28.)
11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy baktérium sejtben működő átíró szabályozó szakaszt alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1986.03.28.)
12. Eljárás E. coliban és/vagy A. tumefaciensben replikálódó és halogénezett benzonitrilre specifikus bakteriális nitrilázt kifejező plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely 6. igénypont szerint előállított kifejező szakaszt E. coliban és/vagy A. tumefaciensben kifejeződő vektorhoz kapcsolunk. (Elsőbbsége: 1986.01.08.)
13. A 12,igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy legalább egy T-DNS szegélyt tartalmazó kifejező szakaszt alkalmazunk.

(Elsőbbsége: 1986.01.08.)
14. Eljárás transzformált növényi sejt vagy növény előállítására, azzal jellemezve, hogy növényi sejtbe

6-10. igénypont szerint előállított, növényi sejtben működő kifejező szakaszt viszünk be, és kívánt esetben a regenerálódó növényt felneveljük.