【附图说明】
以下详述,以例的方式提供,但不旨在限制本发明于描述的单独特定实施方式,这些实施方式可结合附图理解,其中:
图1描绘总结分配给DNA和蛋白序列的SEQ ID NO的表。
图2描绘作为筛选用阳性对照使用的编码BTV1VP5(SEQ ID NO:10)的pCG102质粒。
图3描绘作为筛选用阳性对照使用的编码BTV1VP2(SEQ ID NO:4)的pCG100质粒。
图4描绘作为筛选用阳性对照使用的编码BTV1VP2-c-myc(SEQID NO:6)的pCG101质粒。
图5是指示AHSV VP510AE12抗体的CHO细胞裂解物的蛋白印迹选择性地检测pCG102表达的BTV1VP5蛋白(SEQ ID NO:10)。
图6是指示小鼠抗-c-Myc抗体的CHO细胞裂解物的蛋白印迹选择性地检测c-Myc-标记的pCG101表达的BTV1VP2蛋白(SEQ IDNO:6),但不检测未标记的pCG100表达的BTV1VP2蛋白(SEQ IDNO:4)。
图7a和7b是用指示的构建体转染的CHO细胞的裂解物的蛋白印迹。L167和L168多克隆BTV1VP2抗体选择性地检测在用pCG100转染的细胞中表达的VP2蛋白(SEQ ID NO:4)。
图8显示编码BTV VP2的多核苷酸的序列比对和序列同一性百分率。
图9显示编码BTV VP5的多核苷酸的序列比对和序列同一性百分率。
图10描绘用于4种浮萍表达构建体的浮萍-优化的BTV1抗原的鉴定和布置。
图11描绘串联含有细胞质地定位的VP2和VP5的pMerD01质粒。
图12描绘串联含有细胞质地定位的VP2(具有优化的5’UTR)和VP5的MerD02质粒。
图13描绘MerD03质粒,细胞质地定位的VP2单独。
图14描绘MerD04质粒,细胞质地定位的VP2,具有优化的5’UTR单独。
图15描绘使用VP2抗体的来自表达各种MerD构建体的浮萍的裂解物的代表性的蛋白印迹。
图16描绘使用VP2和VP5抗体的来自表达MerD01构建体的浮萍的裂解物的代表性的蛋白印迹。
图17描绘自表达MerD01,MerD02,MerD03和Mer04的浮萍的裂解物的VP2蛋白印迹。
图18描绘自表达MerD01和MerD02的浮萍的裂解物的VP5单克隆抗体克隆#10AE12蛋白印迹。
图19描绘用于VP2的Agilent 2100生物分析仪光密度测定法分析的代表性的像。
图20描绘在注射位点的局部反应的平均尺寸。
图21描绘第1BTV疫苗接种后的直肠温度。
图22描绘第2BTV疫苗接种后的直肠温度。
图23描绘BTV攻击后的直肠温度。
图24描绘BTV攻击后的临床体征。
图25描绘通过血清中和的BTV1抗体滴度。
图26描绘在各处理组中通过qRT-PCR测量的平均病毒血症滴度。
图27显示BTV1VP2的蛋白序列比对和序列同一性百分率。
图28显示7种BTV1VP5及1种BTV2VP5序列的蛋白序列比对和序列同一性百分率。
【发明详述】
提供在动物中引发免疫原性应答的包含BTV多肽,抗原和其片段和变体的组合物。抗原性多肽或其片段或变体在植物或藻中产生。抗原性多肽或片段或变体可配制成疫苗或药物组合物及,其用来在动物中引发或刺激保护性应答。在一实施方式中,多肽抗原是BTV VP2或BTV VP5多肽或其活性片段或变体。
需知,本发明的抗原性多肽可为全长多肽或其活性片段或变体。“活性片段”或“有活性的变体”期望片段或变体保留多肽的抗原性性质。由此,本发明包括在动物中引发免疫原性应答的任何BTV多肽,抗原,表位或免疫原。BTV多肽,抗原,表位或免疫原可为任何BTV多肽,抗原,表位或免疫原,诸如但不限于在动物,诸如绵羊,牛或山羊中引发,诱导或刺激应答的蛋白,肽或其片段或变体。
本发明涉及牛,绵羊或山羊疫苗或组合物,其可包含有效量的重组BTV抗原和药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂,佐剂或媒质。
在一些实施方式中,疫苗还包含佐剂,诸如水包油(O/W)乳剂,其描述于US专利7,371,395。
在仍其他实施方式中,佐剂包括
氢氧化铝和皂苷,CpG或其组合。
在一些实施方式中,动物中的应答是保护性免疫应答。
“动物”是指哺乳动物,鸟,等。动物或宿主包括哺乳动物和人。动物可选自:马(例如,马),狗(例如,狗,狼,狐,山狗,豺),猫(例如,狮,虎,家养猫,野生猫,其他大猫,及其他猫包括猎豹和山猫),绵羊(例如,绵羊),牛(例如,牛),猪(例如,猪),山羊(例如,山羊),禽(例如,鸡,鸭,鹅,火鸡,鹌鹑,雉鸡,鹦鹉,雀,鹰,乌鸦,鸵鸟,鸸鹋和鹤鸵),灵长类动物(例如,狐猴,跗猴,猴,长臂猿,猿)和鱼。术语“动物”也包括在发育的全部阶段,包括胚胎和胚胎阶段的个体动物。
本文所用的术语“植物”包括双子叶(双子叶植物)植物和单子叶(单子叶植物)植物。双子叶植物包括,但不限于,豆诸如豌豆,紫花苜蓿和大豆,胡萝卜,芹菜,番茄,马铃薯,烟草,胡椒,油菜,甜菜,卷心菜,花椰菜,嫩茎花椰菜,莴苣,花生,等。单子叶植物包括,但不限于,谷物诸如小麦,大麦,高粱和粟,黑麦,黑小麦,玉米,稻或燕麦,甘蔗,浮萍,草,等。术语“植物”也包括非-开花植物包括但不限于蕨,木贼,石松,藓,苔,金鱼藻,藻。本文所用的术语“藻”和“藻”包括任何能产生多肽或其片段或变体的藻的株。藻可包括红色,棕和绿藻,配子体,等。藻可为微藻。微藻可为破囊壶菌科(Thraustochytriaceae),例如,裂殖壶菌属(Schizochytrium),破囊壶菌属(Thraustochytrium),类网粘菌属(Labyrinthuloides)和日本壶菌属(Japonochytrium)。
除非另外解释的,本文所用的全部技术和科学术语具有与由本公开所属领域普通技术人员通常明白的相同的含义。单数术语“a”,“an”和“the”包括复数个指示物,除非情景明显另外指示。类似地,词汇“或”旨在包括“和”,除非情景明显另外指示。
需知,在本公开和特别在权利要求和/或段落中,术语诸如“包含(comprises)”,“包含(comprised)”,“包含(comprising)”等可具有美国专利法中规定的含义;例如,它们可意指“包括(includes)”,“包括(included)”,“包括(including)”,等;及术语诸如“基本上由…组成(consisting essentially of)”和“基本上由…组成(consistsessentially of)”具有美国专利法中规定的含义,例如,它们允许未明确地叙述的要素,但排除见于。
本发明的抗原性多肽能保护免于BTV。即,它们能刺激动物中的免疫应答。“抗原”或“免疫原”是指在宿主动物中诱导特定免疫应答的物质。抗原可包含全生物,杀死的,衰减的或活的;生物的亚单位或部分;含有具有免疫原性性质的插入子的重组载体;能在提供给宿主动物后诱导免疫应答的DNA的碎片或片段;多肽,表位,半抗原,或其任何组合。另外,免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。
本文所用的术语“免疫原性蛋白,多肽或肽”包括在一旦施用给宿主,其能引发针对蛋白的体液和/或细胞类型导向的免疫应答的意义上有免疫学活性的多肽。优选蛋白片段是具有与总蛋白基本上相同的免疫学活性的片段。由此,本发明的蛋白片段包含至少一个表位或抗原决定簇,或基本上由其组成或由其组成。"免疫原性"蛋白或多肽,如本文所用,包括蛋白的全长序列,其类似物,或其免疫原性片段。“免疫原性片段"是指包括一个或更多表位由此引发上述免疫学应答的蛋白片段。该片段可使用本领域熟知的任意数的表位标位技术鉴定。见,例如,Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology,Vol.66(Glenn E.Morris,Ed,1996)。例如,线性表位可通过例如,同时在固体支持物上合成大量肽,肽对应于蛋白分子的部分,及使肽与抗体反应而肽仍附接于支持物来确定。该技术本领域熟知且描述于,例如,美国专利No.4,708,871;Geysen等人,1984;Geysen等人,1986。类似地,构象表位容易由诸如通过,例如,x-射线晶体学和2-维核磁共振测定氨基酸的空间构象来鉴定。见,例如,Epitope MappingProtocols,见上。
如本文所述,本发明包括抗原性多肽的活性片段和变体。由此,术语“免疫原性蛋白,多肽或肽”还涵盖序列的缺失,添加和取代,只要多肽发挥产生本文定义的免疫学应答的功能。术语"保守性变异"表示氨基酸残基被另一生物学类似的残基取代,或核酸序列中核苷酸取代,使得编码的氨基酸残基不变化或是另一生物学类似的残基。在这点上,特别优选的取代会通常是在性质上保守性的,即,在氨基酸家族之内发生的那些取代。例如,氨基酸是通常分为4个家族:(1)酸性--天冬氨酸和谷氨酸;(2)碱性--赖氨酸,精氨酸,组氨酸;(3)非-极性--丙氨酸,缬氨酸,亮氨酸,异亮氨酸,脯氨酸,苯丙氨酸,甲硫氨酸,色氨酸;及(4)不带电的极性--甘氨酸,天冬酰胺,谷氨酰胺,半胱氨酸,丝氨酸,苏氨酸,酪氨酸。苯丙氨酸,色氨酸和酪氨酸是有时分类为芳族氨基酸。保守性变异的例包括一种疏水残基诸如异亮氨酸,缬氨酸,亮氨酸或甲硫氨酸对另一疏水残基的取代,或一种极性残基对另一极性残基的取代,诸如精氨酸对赖氨酸,谷氨酸对天冬氨酸,或谷氨酰胺对天冬酰胺的取代,等;或会对生物学活性不具有主要效应的氨基酸用结构上相关的氨基酸的类似保守性取代。因此,与参照分子具有基本上相同的氨基酸序列,但具有少数基本上不影响蛋白的免疫原性的氨基酸取代的蛋白在参照多肽的定义之内。本文包括由这些修饰产生的多肽的全部。术语"保守性变异"也包括使用取代的氨基酸代替未经取代的亲本氨基酸,只要是针对取代的多肽产生的抗体也与未经取代的多肽进行免疫反应。
术语"表位"指称特定B细胞和/或T细胞所应答的抗原或半抗原上的位点。术语也与”抗原决定簇”或”抗原决定簇位点”互换使用。认识相同的表位的抗体可在显示一种抗体阻断另一抗体与靶抗原的结合的能力的简单免疫测定中鉴定。
对组合物或疫苗的”免疫学应答”是细胞宿主和/或抗体-介导的对目的组合物或疫苗的免疫应答的发展。通常,"免疫学应答"包括但不限于一种或更多下列效应:特别针对在目的组合物或疫苗中包括的抗原的抗体,B细胞,辅助性T细胞,和/或细胞毒性T细胞的产生。优选地,宿主会显示治疗性或保护性免疫学应答,使得对新感染的抗性会增强和/或疾病的临床严重性减小。该保护会通过由感染的宿主正常显示的症状的减小或缺乏,更快恢复时间和/或感染的宿主中降低的病毒滴度来展示。
合成抗原是也包括的定义之内,例如,多表位,侧接表位,及其他重组体或合成来源的抗原。见,例如,Bergmann等人,1993;Bergmann等人,1996;Suhrbier,1997;Gardner等人,1998。免疫原性片段,为本发明的目的,会通常包括分子的至少约3个氨基酸,至少约5个氨基酸,至少约10~15个氨基酸,或约15~25个氨基酸或更多氨基酸。片段长度无临界上限,其可包含蛋白序列的几乎全长,或甚至包含蛋白的至少一个表位的融合蛋白。
因此,表达表位的多核苷酸的最小结构是其包含编码BTV多肽的表位或抗原决定簇的核苷酸,或基本上由其组成或由其组成。编码BTV多肽的片段的多核苷酸可包含编码多肽的序列的最小15个核苷酸,约30~45个核苷酸,约45~75或至少57,87或150个连续或连续的核苷酸,或基本上由其组成或由其组成。表位确定过程,诸如,产生重叠肽库(Hemmer等人,1998),Pepscan(Geysen et al.,1984;Geysen et al.,1985;Van der Zee R.et al.,1989;Geysen,1990;Multipin.RTM.Peptide Synthesis Kits de Chiron)和算法(De Groot等人,1999;PCT/US2004/022605)可用在本发明中的实践中。
术语“核酸”或“多核苷酸”指称线性或分支的,单或双链的RNA或DNA,或其杂交体。术语也包括RNA/DNA杂交体。下列是多核苷酸的非限制性例:基因或基因片段,外显子,内含子,mRNA,tRNA,rRNA,核酶,cDNA,重组多核苷酸,分支的多核苷酸,质粒,载体,任何序列的分离的DNA,任何序列的分离的RNA,核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸,诸如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物,尿嘧啶,其他糖和连接基诸如氟核糖和硫醇酯,及核苷酸分枝。核苷酸序列可还在聚合之后修饰,诸如由与标记组分缀合。包括在此定义内的其他类型的修饰是封头,一种或更多天然存在的核苷酸用类似物的取代,及将多核苷酸附接于蛋白,金属离子,标记组分,其他多核苷酸或固体支持物的手段的导入。多核苷酸可由化学合成获得或源于微生物。
术语“基因”广泛地用来指称与生物学功能关联的任何多核苷酸段。由此,基因如在基因组序列中包括内含子和外显子,或如在cDNA中仅编码序列和/或它们的表达需要的调控序列。例如,基因也指称表达mRNA或功能RNA,或编码特异性蛋白,及包括调控序列的核酸片段。
本发明还包含编码BTV抗原,表位或免疫原的多核苷酸的互补链。互补链可为聚合物及任何长度,且可以任何组合含有脱氧核糖核苷酸,核糖核苷酸和类似物。
术语“蛋白”,“肽”,“多肽”和“多肽片段”在本文互换使用以指称任何长度的氨基酸残基的聚合物。聚合物可为线性或分支的,其可包含修饰的氨基酸或氨基酸类似物,且其可由非氨基酸的化学部分间断。术语也包括已天然地或由干预修饰的氨基酸聚合物;例如二硫键形成,糖基化,脂质化,乙酰化,磷酸化或任何其他操作或修饰,诸如用标记或生物活性组分缀合。
“分离的”生物学组分(诸如核酸或蛋白或细胞器)指称已在组分天然地存在的生物细胞中从其他生物学组分基本上分离的或纯化的组分,例如,其他染色体和额外-染色体DNA和RNA,蛋白和细胞器。已“分离”的核酸和蛋白包括由标准纯化方法纯化的核酸和蛋白。术语也包含由重组技术以及化学合成制备的核酸和蛋白。
本文所用的术语“纯化的”不需要绝对纯度;其旨在作为相对术语。由此,例如,纯化的多肽制备物是相比多肽在其天然的环境中,多肽更富集的制备物。即,多肽从细胞组分分离。“基本上纯化的”其期望使得多肽代表几个实施方式已去除至少60%,至少70%,至少80%,至少90%,至少95%,或至少98%,或更多细胞组分或物质。同样,多肽可为部分纯化的。“部分纯化的”期望去除小于60%的细胞组分或物质。对于多核苷酸也同样适用。本文公开的多肽可由本领域知道的任何手段纯化。
如上所述,抗原性多肽或其片段或变体是在植物或藻中产生的BTV抗原性多肽。公开的多核苷酸和由此编码的多肽的片段和变体也包括在本发明中。“片段”是指部分多核苷酸或由此编码的部分抗原性氨基酸序列。多核苷酸片段可编码保留天然蛋白的生物学活性,因此具有如在本文别处提到的免疫原性活性的蛋白片段。多肽序列的片段保留在动物中诱导保护性免疫应答的能力。
“变体”旨在表示基本上类似序列。对于多核苷酸,变体包含在天然多核苷酸之内的一个或更多位点的一个或更多核苷酸的缺失和/或添加,和/或在天然多核苷酸中一个或更多位点的一个或更多核苷酸的取代。如本文所用,“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。本发明的特定多核苷酸(即,参照多核苷酸)的变体也可通过比较由变体多核苷酸编码的多肽和由参照多核苷酸编码的多肽之间的百分率序列同一性来评价。“变体”蛋白旨在表示通过在天然蛋白中的一个或更多位点的一个或更多氨基酸的缺失或添加,和/或天然蛋白中的一个或更多位点的一个或更多氨基酸的取代而源于天然蛋白的蛋白。本发明包括的变体蛋白有生物学活性,即,它们有引发免疫应答的能力。
一方面,本发明提供来自绵羊,牛或山羊的BTV多肽。在另一方面,本发明提供具有SEQ ID NO:4,6,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25所示的序列的多肽,及其变体或片段。
而且,自绵羊,牛或山羊的BTV多肽的同源物旨在本发明的范围之内。如本文所用,术语“同源物”包括直系同原物,类似物和旁系同原物。术语“类似物”指称具有相同的或类似功能,但在不相关的生物中独立地进化的2种多核苷酸或多肽。术语“直系同原物”指称来自不同物种,但从共同的祖先基因通过物种形成进化的2种多核苷酸或多肽。正常情况下,直系同原物编码具有相同的或类似功能的多肽。术语“旁系同原物”指称通过在基因组之内复制相关的2种多核苷酸或多肽。旁系同原物通常具有不同功能,但这些功能可相关。类似物,野生型BTV多肽的直系同原物和旁系同原物可通过翻译后修饰,通过氨基酸序列差异,或通过两者不同于野生型BTV多肽。尤其是,本发明的同源物会通常与野生型BTV多肽或多核苷酸序列的全部或部分呈现至少80~85%,85~90%,90~95%或95%,96%,97%,98%,99%序列同一性,及会呈现类似功能。变体包括等位基因变体。术语"等位基因变体"指称含有导致蛋白的氨基酸序列变化及在天然的群(例如,病毒物种或变种)之内存在的多态性的多核苷酸或多肽。该天然的等位基因变异可一般导致多核苷酸或多肽的1~5%变异。等位基因变体可通过在许多不同物种中测序目的核酸序列来鉴定,其可通过使用鉴定那些物种中的相同的遗传座位的杂交探针来容易进行。任何和全部该核酸变异及得到的氨基酸多态性或是天然的等位基因变异的结果且不改变目的基因的功能活性的变异旨在本发明的范围之内。
如本文所用,术语”衍生物”或“变体”指称多肽,或编码多肽的核酸,其具有一个或更多保守性氨基酸变异或其他少数修饰,使得(1)对应多肽相比野生型多肽具有基本上相当的功能,或(2)针对多肽产生的抗体与野生型多肽是免疫反应性的。这些变体或衍生物包括具有BTV多肽一级氨基酸序列的少数修饰,其可导致相比未修饰的对应物多肽具有基本上相当的活性的肽的多肽。该修饰可为有意的,如通过定点诱变,或可为自发的。术语“变体”还涵盖序列的缺失,添加和取代,只要多肽发挥产生本文定义的免疫学应答的功能。
术语"保守性变异"表示氨基酸残基被另一生物学类似的残基取代,或核酸序列中核苷酸取代,使得编码的氨基酸残基不变化或是另一生物学类似的残基。在这点上,特别优选的取代会通常是在性质上保守性的,如上所述。
本公开的多核苷酸包括作为遗传密码的结果的简并,例如,对于特定宿主的优化的密码子利用的序列。如本文所用,“优化的”指称被遗传加工成增加其在给定物种中表达的多核苷酸。为了提供优化的编码BTV多肽的多核苷酸,BTV蛋白基因的DNA序列可修饰为(1)包含由在特定物种中高度表达的基因优选的密码子;(2)包含在所述物种中实际上发现的核苷酸碱基组成的A+T或G+C含量;(3)形成所述物种的起始序列;或(4)消除导致去稳定,不适当的多聚腺苷酸化,RNA的降解和终止,或形成二级结构发卡或RNA剪接位点的序列。所述物种中BTV蛋白的增加的表达可通过利用在真核生物和原核生物,或特定物种中密码子利用的分布频度达到。术语“优选的密码子利用频度”指称由利用核苷酸密码子来特定给定氨基酸的特定宿主细胞呈现的偏好。有20种天然的氨基酸,其中多数由多于一种密码子特定。因此,全部简并核苷酸序列包括在公开中,只要由核苷酸序列编码的BTV多肽的氨基酸序列功能性地未变化。
2个氨基酸序列之间的序列同一性可由NCBI(美国生物技术信息中心)配对blast及blosum62矩阵,使用标准参数建立(见,例如,可在”美国生物技术信息中心”(NCBI,Bethesda,Md.,USA)服务器上,以及在Altschul等人利用的BLAST或BLASTX算法;由此,此文献讲关于“blasts”使用算法或BLAST或BLASTX和BLOSUM62矩阵)。
关于序列“同一性”可指称具有同一核苷酸或氨基酸的位置数除以2个序列中较短者中核苷酸或氨基酸的数,其中2个序列的比对可根据Wilbur和Lipman算法测定(Wilbur和Lipman),例如,使用20个核苷酸的窗口大小,4个核苷酸的字长,及4的间隔罚分,及包括比对的序列数据的计算机-辅助分析和解析,可使用可商购的程序便利地进行(例如,IntelligeneticsTM Suite,Intelligenetics Inc.CA)。当说RNA序列与DNA序列类似,或具有一定程度的序列同一性或同源性时,DNA序列中的胸腺嘧啶(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。由此,RNA序列在本发明的范围之内,且可源于DNA序列,通过认为DNA序列中的胸腺嘧啶(T)等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。
2个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性,或2个核苷酸序列之间的序列同一性可使用Vector NTI软件包(Invitrogen,1600Faraday Ave.,Carlsbad,CA)测定。
以下文献提供用于比较序列的相对同一性或同源性的算法,及另外地或替代性地关于上述,这些参考文献中的教导可用于测定百分率同源性或同一性:Needleman SB和Wunsch CD;Smith TF和Waterman MS;Smith TF,Waterman MS和Sadler JR;Feng DF和Dolittle RF;Higgins DG和锐PM;Thompson JD,Higgins DG和Gibson TJ;及,Devereux J,Haeberlie P和Smithies O。而且,无需过度实验,本领域技术人员可谘询用于测定百分率同源性的许多其他程序或参考文献。
杂交反应可在不同“严格度”条件下进行。增加杂交反应的严格度的条件是熟知的。见例如,“Molecular Cloning:A LaboratoryManual”,第2版(Sambrook等人,1989)。
本发明还包括在载体分子或表达载体中含有和可操作地连接于启动子元件和任选地增强子的BTV多核苷酸。
“载体”指称包含待体外或体内递送到靶细胞的异源多核苷酸的重组DNA或RNA质粒或病毒。异源多核苷酸可包含旨在防止或治疗的目的序列,且可任选地为表达盒形式。如本文所用,载体无需在最终靶细胞或受试者中能复制。术语包括克隆载体和病毒载体。
术语“重组体”是指不天然存在或以不见于天然的排列连接到另一多核苷酸的半合成,或合成来源的多核苷酸。
“异源”是指源于与所比较的其余实体遗传上不同的实体。例如,多核苷酸可由遗传加工技术放入源于不同来源的质粒或载体,且是异源多核苷酸。自其天然编码序列移出且可操作地连接于非天然序列的编码序列的启动子是异源启动子。
本发明涉及绵羊,牛和山羊疫苗或药物或免疫学组合物,其可包含有效量的重组BTV抗原和药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂或媒质。
本文所述的主题部分针对与在植物或藻表达系统中制备的BTV抗原相关的组合物和方法,其高度免疫原性,及保护动物免于自BTV株的攻击。
【组合物】
本发明涉及BTV疫苗或组合物,其可包含有效量的重组BTV抗原和药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂或媒质。在一实施方式中,重组BTV抗原在植物或藻中表达。
在一实施方式中,本文公开的主题针对组合物,其包含由浮萍表达系统和自浮萍,包括浮萍属(Lemna)的植物材料产生的BTV抗原,及药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂或媒质。
在一实施方式中,重组BTV抗原在藻中表达。在仍另一实施方式中,藻选自裂殖壶菌属(Schizochytrium)。在一实施方式中,重组BTV抗原可在裂殖壶菌属(Schizochytrium)蛋白表达系统中表达,如描述于,例如US专利No.7,001,772和US专利申请公开No.2008/0022422。
在一实施方式中,本文公开的主题针对由包含BTV抗原的植物或藻表达系统和自植物或藻的材料产生的蛋白。
在一实施方式中,本文公开的主题针对疫苗或组合物包含BTV抗原由浮萍表达系统和自浮萍的植物材料产生的。
在一实施方式中,本文公开的主题针对稳定地转化的表达BTV抗原的植物或植物培养物,其中植物或植物培养物是浮萍。
本发明包括在动物,诸如绵羊,牛或山羊中引发免疫原性应答的任何BTV多肽,抗原,表位或免疫原。BTV多肽,抗原,表位或免疫原可为在动物,诸如绵羊,牛或山羊中引发,诱导或刺激应答的任何BTV多肽,抗原,表位或免疫原,诸如但不限于蛋白,肽或其片段。
在一实施方式中,其中BTV免疫学组合物或疫苗是重组免疫学组合物或疫苗,组合物或疫苗包含重组载体和药学或兽医学可接受的赋形剂,载体或媒质;重组载体是可包含编码多肽,抗原,表位或免疫原的多核苷酸的植物表达载体。BTV多肽,抗原,表位或免疫原,可为VP1,VP2,VP3,VP4,VP5,NS1,VP7,NS2,VP6,NS3,NS3a或其任何片段。
在另一实施方式中,BTV多肽,抗原,表位或免疫原可源于被BTV株感染的绵羊,牛或山羊。在一实施方式中,BTV抗原,表位或免疫原是RNA聚合酶(VP1),外部壳体蛋白(VP2,VP5),内部壳体蛋白(VP3),封头的酶(VP4),细管形成蛋白(NS1),外部核心表面蛋白(VP7),基质蛋白(NS2),解螺旋酶(VP6),及糖蛋白(NS3和NS3a)。以下表1(修饰的自Wilson和Mecham 2000)总结BTV的基因和它们的蛋白功能。
表1.蓝舌病毒基因及编码的蛋白,蛋白的位置,性质,及功能
在一实施方式中,其中BTV免疫学组合物或疫苗是重组免疫学组合物或疫苗,组合物或疫苗包含重组载体和药学或兽医学可接受的赋形剂,载体或媒质;重组载体是可包含编码BTV多肽,抗原,表位或免疫原的多核苷酸的植物表达载体。BTV多肽,抗原,表位或免疫原,可为BTV外部壳体多肽(VP2,VP5),核心或亚-核心壳体蛋白(V1,VP3或VP4),或其他多肽诸如NS1,NS2,NS3,VP6或VP7。
在一实施方式中,BTV抗原,表位或免疫原是VP2或VP5。在另一实施方式中,VP2可修饰为当在浮萍中表达时使得定位到细胞质。在另一实施方式中,VP2可具有对于在浮萍中表达优化的5’UTR。
在仍另一实施方式中,BTV抗原可源于BTV1。在一实施方式中,BTV1序列优化为在浮萍中表达。
在另一实施方式中,BTV抗原可为VP2或VP5。在仍另一实施方式中,BTV抗原可为BTV血清型1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23或24的VP2或VP5。在另一实施方式中,VP2或VP5从法国分离物分离。
本发明涉及BTV组合物或疫苗,其可包含有效量的重组BTV抗原和药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂,佐剂或媒质。在一实施方式中,BTV抗原可为BTV VP2或VP5。
在另一实施方式中,重组BTV抗原在植物或藻中表达。在仍另一实施方式中,植物是浮萍植物,包括浮萍属(Lemna)植物。在仍另一实施方式中,植物是浮萍(Lemna minor)。在一实施方式中,重组BTV抗原可在专利浮萍(Lemna minor)蛋白表达系统,有利地Biolex氏LEX systemSM中表达。
在另一实施方式中,药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂,佐剂或媒质可为油包水乳剂。在仍另一实施方式中,油包水乳剂可为水/油/水(W/O/W)三层乳剂。在仍另一实施方式中,佐剂包括
氢氧化铝和皂苷,CpG或其组合。
本发明还包括在载体分子或表达载体中含有和可操作地连接于启动子元件和任选地增强子的BTV多核苷酸。
一方面,本发明提供具有SEQ ID NO:4,6,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25所示的序列的BTV多肽,及其变体或片段。
在另一方面,本发明提供与本发明的抗原性多肽,特别与具有SEQ ID NO:4,6,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25所示的序列的多肽具有至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性的多肽。
在仍另一方面,本发明提供以上鉴定的BTV多肽的片段和变体(SEQ ID NO:4,6,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25),其可由本领域技术人员使用良好知道的分子生物学技术容易制备。
变体是同源多肽,其具有与SEQ ID NO:4,6,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25所示的氨基酸序列具有至少75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%同一性的氨基酸序列。
BTV多肽的免疫原性片段包括具有SEQ ID NO:4,6,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25所示的序列的BTV多肽的至少8,10,15或20个连续氨基酸,至少21个氨基酸,至少23个氨基酸,至少25个氨基酸,或至少30个氨基酸,或其变体。在另一实施方式中,BTV多肽的片段包括在全长BTV多肽上发现的特定抗原性表位。
在另一方面,本发明提供编码BTV多肽的多核苷酸,诸如编码具有SEQ ID NO:4,6,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25所示的序列的多肽的多核苷酸。在仍另一方面,本发明提供编码与具有SEQ ID NO:4,6,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25所示的序列的多肽,或这些多肽之一的保守性变体,等位基因变体,同源物或包含至少8或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段,或这些多肽的组合具有至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性的多肽的多核苷酸。
在另一方面,本发明提供具有SEQ ID NO:1,2,3,5,6,7,8或9所示的核苷酸序列的多核苷酸,或其变体。在仍另一方面,本发明提供与具有SEQ ID NO:1,2,3,5,6,7,8或9所示的序列的多核苷酸之一具有至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少95%,96%,97%,98%或99%序列同一性的多核苷酸,或其变体。
本发明的多核苷酸可在相同的转录单元之内包含附加序列,诸如额外的编码序列,控制元件诸如启动子,核糖体结合位点,5’UTR,3’UTR,转录终止子,多聚腺苷酸化位点,在相同的或不同启动子控制下的额外的转录单元,允许克隆,表达,同源重组,及宿主细胞转化的序列,及提供本发明的实施方式可期望的任何此类构建体。
BTV多肽,抗原,表位或免疫原的表达用元件有利地存在于本发明的载体中。以最小方式,此包含用于特定载体诸如质粒和特定病毒载体,例如,非痘病毒的病毒载体的起始密码子(ATG),终止密码子和启动子,及任选地也多聚腺苷酸化序列,基本上由其组成或由其组成。当多核苷酸编码多聚蛋白片段,例如BTV肽时,有利地,在载体中,ATG放置在阅读框的5’,而终止密码子放置在3’。可存在用于控制表达的其他元件,诸如增强子序列,稳定化序列,诸如内含子和允许蛋白分泌的信号序列。
本发明也涉及制备物,其包含载体,诸如表达载体,例如,治疗组合物。制备可包含一种或更多载体,例如,表达载体,诸如体内表达载体,包含及表达一种或更多BTV多肽,抗原,表位或免疫原。在一实施方式中,在药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂或媒质中,载体含有及表达多核苷酸,其包含编码(及有利地表达)BTV抗原,表位或免疫原的多核苷酸,基本上由其组成或由其组成。由此,根据本发明的一实施方式,制备物中的其他载体包含编码,及在适当的环境载体下表达BTV多肽,抗原,表位或免疫原,或其片段的一种或更多其他蛋白的多核苷酸,基本上由其组成或由其组成。
根据另一实施方式,制备物中的载体包含编码BTV多肽,抗原,表位或免疫原的一种或更多蛋白或其片段的多核苷酸,表达多核苷酸的载体,或基本上由其组成或由其组成。在另一实施方式中,制备物包含1种,2种或更多包含编码及表达,有利地体内,BTV多肽,抗原,融合蛋白或其表位的多核苷酸的载体。本发明也针对包含编码及表达来自不同动物种诸如但不限于绵羊,牛或山羊的不同BTV多肽,抗原,表位或免疫原,例如,BTV多肽,抗原,表位或免疫原的多核苷酸的载体混合物。
根据本发明的仍进一步实施方式,表达载体是质粒载体或DNA质粒载体,尤其是体内表达载体。在特定,非限制性例中,可将pVR1020或1012质粒(VICAL Inc.;Luke等人,1997;Hartikka等人,1996,见,例如,美国专利No.5,846,946和6,451,769)用作用于多核苷酸序列的插入的载体。pVR1020质粒源于pVR1012,且含有人tPA信号序列。在一实施方式中,人tPA信号包含GenBank登录号No.HUMTPA14的从氨基酸M(1)到氨基酸S(23)。在另一特定,非限制性例中,作为用于多核苷酸序列的插入的载体利用的质粒可含有GenBank登录号No.U28070的从氨基酸M(24)到氨基酸A(48)的马IGF1的信号肽序列。可在实践中谘询或采用的DNA质粒的附加信息见于,例如,美国专利No.6,852,705;6,818,628;6,586,412;6,576,243;6,558,674;6,464,984;6,451,770;6,376,473和6,221,362。
术语质粒盖任何DNA转录单元,其包含根据本发明的多核苷酸和对于其在期望的宿主或靶细胞中体内表达必需的元件;且,在这点上,需知,超螺旋的或非-超螺旋的,环状质粒,以及线性形式,旨在本发明的范围之内。
各质粒包含,或基本上由其组成,除了编码BTV抗原,表位或免疫原的多核苷酸之外,任选地融合于异源肽序列,变体,类似物或片段,可操作地连接于启动子或在启动子控制下或依赖于启动子的编码NDV多肽,抗原,表位或免疫原的多核苷酸。一般而言,采用在真核细胞中发挥功能的强启动子是有利的。强启动子可为但不限于人或鼠来源,或任选地具有另一来源诸如大鼠或豚鼠的立即早期巨细胞病毒启动子(CMV-IE),超启动子(Ni,M.et al.,Plant J.7,661-676,1995)。CMV-IE启动子可包含实际启动子部分,其可或可不相关于增强子部分。可参考EP-A-260148,EP-A-323597,美国专利No.5,168,062,5,385,839和4,968,615,以及PCT申请No WO87/03905。CMV-IE启动子有利地是人CMV-IE(Boshart等人,1985)或鼠CMV-IE。
更总而言之,启动子具有病毒,植物,或细胞来源。可在本发明的实践中有用地采用的非CMV-IE的强病毒启动子是SV40病毒的早期/晚期启动子或Rous肉瘤病毒的LTR启动子。可在本发明的实践中有用地采用的强细胞启动子是细胞骨架基因的启动子,诸如例如结蛋白启动子(Kwissa等人,2000),或肌动蛋白启动子(Miyazaki等人,1989)。
可使用任何组成性,可调节的或刺激-依赖性启动子。例如,组成型启动子可包括来自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露碱合酶启动子。或者,使用热休克基因启动子,旱-诱导性基因启动子,病原体-诱导性基因启动子,创伤-诱导性基因启动子,及光/暗-诱导性基因启动子可为有利。使用由植物生长调节物,诸如脱落酸,茁长素,细胞分裂素和赤霉酸控制的启动子可为有用。启动子也可选择为提供组织-特异性表达(例如,根,叶和花-特异性启动子)。
质粒可包含其他表达控制元件。合并稳定化序列,例如,内含子序列,例如,玉米醇脱氢酶内含子(Callis et al.Genes &Dev.1(10):1183-1200,1987年12月),hCMV-IE的第1内含子(PCT申请No.WO1989/01036),兔β-珠蛋白基因的内含子II(van Ooyen等人,1979)特别有利。在另一实施方式中,质粒可包含3’UTR。3’UTR可为但不限于土壤杆菌胆脂碱合酶(Nos)3’UTR(Nopaline synthase:transcript mapping and DNA sequence.Depicker,A.et al.J.Mol.Appl.Genet.,1982;Bevan,NAR,1984,12(22):8711-8721)。
至于用于质粒和非痘病毒的病毒载体的多聚腺苷酸化信号(多聚A),可使用牛生长激素(bGH)基因的聚(A)信号(见美国5,122,458),或兔β-珠蛋白基因的聚(A)信号或SV40病毒的聚(A)信号。
“宿主细胞”表示通过施用外源多核苷酸,诸如重组质粒或载体已遗传改变的,或能遗传改变的原核生物或真核细胞。当指称遗传改变的细胞时,术语指称原本改变的细胞及其后代。
在一实施方式中,重组BTV抗原在转基因植物或藻中表达。在另一实施方式中,转基因植物是浮萍属(Lemna)植物。在仍另一实施方式中,转基因植物是浮萍(Lemna minor)。在仍另一实施方式中,重组BTV抗原可在浮萍(Lemna minor)蛋白表达系统,Biolex氏LEXsystemSM中表达。浮萍(Lemna minor)蛋白表达系统的细节可,例如,见于美国专利No.6,815,184,7,022,309,7,160,717,7,176,024,6,040,498和7,161,064。在仍另一实施方式中,转基因藻是裂殖壶菌属(Schizochytrium)。藻类蛋白表达系统的细节可,例如,见于US7,001,772,US 2008/0022422。实施方式中的BTV抗原可为本文公开的任何多肽,或由本文公开的任何多核苷酸编码的多肽。
【在浮萍或微藻中表达BTV多肽的方法】
由此,在本发明的一些实施方式中,抗原性BTV多肽,或其片段或变体,在浮萍或微藻中表达。这些方法包含使用本领域知道的任何适合的转化方法导入浮萍植物或微藻的表达盒的使用。这些表达盒之内的多核苷酸可经修饰用于在浮萍或微藻中抗原性BTV多肽,或其片段或变体的增强的表达,如下。
【抗原性BTV多肽的浮萍或微藻表达盒】
通过用包含编码抗原性BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸的表达盒转化浮萍或微藻来获得表达BTV多肽,或其片段或变体的转基因浮萍或微藻。以此方式,在表达盒之内构建编码目标BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸及通过本领域知道的任何适合的转化方法导入浮萍植物或微藻培养物。
在一些实施方式中,用包含编码目标BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸的表达盒转化的浮萍植物或微藻也已用提供用于另一目标异源多肽,例如,另一BTV多肽,片段或其变体的表达的表达盒转化。提供用于另一异源目的多肽的表达的表达盒可通过相同的或通过不同的导入方法,例如,通过相同的或不同转化方法,同时或在不同时间提供到用于导入浮萍植物或微藻的相同的多核苷酸(例如,到相同的转化载体)上,或提供到用于导入浮萍植物或微藻的不同多核苷酸(例如,到不同转化载体)上。
用于在浮萍或微藻的转化中使用的表达盒包含至少包含可操作地连接于目标多核苷酸,即,编码BTV多肽,片段或其变体的多核苷酸的转录起始区(例如,启动子)的表达控制元件。本文所用的“可操作地连接的”参照核苷酸序列指称放入彼此功能关系的多核苷酸序列。一般而言,可操作地连接的DNA序列是连续的,且当必需接合2个蛋白编码区时,在阅读框中。该表达盒用用于插入待在启动子和其他表达控制元件转录调节下的目的多核苷酸(例如,一个目的多核苷酸,2个目的多核苷酸,等)的多个限制性位点提供。在本发明的特定实施方式中,待转移的多核苷酸含有2个或更多表达盒,各含有至少一个目的多核苷酸。
“表达控制元件”是指DNA的调控区,通常包含TATA盒,能指导RNA聚合酶II,或在一些实施方式中,RNA聚合酶III,来在用于特定编码序列的适当的转录起始位点起始RNA合成。表达控制元件可额外地包含通常定位到TATA盒的上游或5’的其他识别序列,其影响(例如,增强)转录起始速度。此外,表达控制元件可额外地包含通常定位到TATA盒的下游或3’的序列,其影响(例如,增强)转录起始速度。
转录起始区(例如,启动子)可为天然或同源或外源或异源于浮萍或微藻宿主,或可为天然的序列或合成序列。说到外源,其期望转录起始区未见于导入转录起始区的野生型浮萍或微藻宿主。“功能启动子”是指当可操作地连接于编码目标BTV多肽,或其片段或变体的序列时,能驱动编码的多肽,片段或变体的表达(即,转录和翻译)的启动子。启动子可基于期望的结果选择。由此,本发明的表达盒可包含用于在浮萍中表达的组成性,诱导性,组织-优选的或其他启动子。
本领域知道的任何适合的启动子可在本发明的表达盒中采用,包括细菌,酵母,真菌,昆虫,哺乳动物和植物启动子。例如,植物启动子,包括浮萍或微藻启动子,可使用。例示启动子包括,但不限于,花椰菜嵌合病毒35S启动子,冠瘿碱合成酶启动子(例如,nos,mas,ocs,等),泛素启动子,肌动蛋白启动子,双磷酸核酮糖(RubP)羧基化酶小亚基启动子,及醇脱氢酶启动子。浮萍RubP羧基化酶小亚基启动子为本领域所知(Silverthorne et al.(1990)Plant Mol.Biol.15:49)。自感染植物或微藻的病毒的其他启动子也适合,包括但不限于自芋花叶病毒,小球藻病毒(例如,小球藻病毒腺嘌呤甲基转移酶启动子;Mitra et al.(1994)Plant Mol.Biol.26:85),番茄番茄斑萎病毒,烟草脆裂病毒,烟草坏死病毒,烟草环斑病毒,番茄环斑病毒,黄瓜花叶病毒,花生矮化病毒,紫花苜蓿花叶病毒,甘蔗杆状的杆状DNA病毒等分离的启动子。
可选择表达控制元件,包括启动子来给期望的调节水平。例如,在一些实例中,使用赋予组成性表达的启动子可为有利(例如,自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的甘露碱合酶启动子)。或者,在其他情况中,使用应答特定环境刺激(例如,热休克基因启动子,旱-诱导性基因启动子,病原体-诱导性基因启动子,创伤-诱导性基因启动子,及光/暗-诱导性基因启动子)或植物生长调节物(例如,来自由脱落酸,茁长素,激活素和赤霉酸诱导的基因的启动子)活化的启动子可为有利。作为进一步替代,可选择提供组织-特异性表达的启动子(例如,根,叶和花-特异性启动子)。
给定启动子的总体强度可受顺式作用核苷酸序列诸如上游活化序列的组合和空间组织的影响。例如,源于根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)章鱼碱合酶基因的活化核苷酸序列可增强自根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)甘露碱合酶启动子(见美国专利5,955,646)的转录。在本发明中,表达盒可含有插入启动子序列的上游而增强目的抗原性BTV多肽,或其片段或变体的表达的活化核苷酸序列。在一实施方式中,表达盒包括可操作地连接于源于根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)甘露碱合酶基因的启动子的源于根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)章鱼碱合酶基因的3个上游活化序列(见U.S专利5,955,646)。
表达盒由此以5’-3’转录方向包括,包含转录和翻译起始区的表达控制元件,编码目标抗原性BTV多肽(或其片段或变体)的多核苷酸,及在植物中发挥功能的转录和翻译终止区。可根据本发明用本领域知道的任何适合的终止序列。终止区可为与转录起始区天然的,可为与目的编码序列天然的,或可源于另一来源。方便的终止区自根瘤土壤杆菌(A.tumefaciens)的Ti-质粒可利用,诸如章鱼碱合成酶和胆脂碱合成酶终止区。也见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262:141;Proudfoot(1991)Cell 64:671;Sanfacon et al.(1991)GenesDev.5:141;Mogen et al.(1990)Plant Cell 2:1261;Munroe et al.(1990)Gene 91:151;Ballas et al.(1989)Nucleic Acids Res.17:7891;及Joshiet al.(1987)Nucleic Acids Res.15:9627。额外的例示终止序列是豌豆RubP羧基化酶小亚基终止序列和花椰菜嵌合病毒35S终止序列。
一般而言,表达盒会包含用于选择转化的浮萍细胞或组织的可选择的标记物基因。可选择的标记物基因包括编码抗生素抗性的基因,诸如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些,以及赋予对除草化合物的抗性的基因。除草剂抗性基因通常编码不敏感于除草剂或在其可作用之前在植物中降解或解毒除草剂的酶的修饰的靶蛋白。见DeBlock et al.(1987)EMBO J.6:2513;DeBlocket al.(1989)Plant Physiol.91:691;Fromm et al.(1990)BioTechnology8:833;Gordon-Kamm et al.(1990)Plant Cell 2:603。例如,已使用编码突变体靶酶,5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的基因获得对于草甘膦或磺酰脲除草剂的抗性。已通过使用编码解毒相应除草剂的膦丝菌素乙酰转移酶,腈水解酶或2,4-二氯苯氧基乙酸单氧合酶的细菌基因获得对于草铵膦,溴苯腈和2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性。
为本发明的目的,可选择的标记物基因包括,但不限于,编码新霉素磷酸转移酶II(Fraley et al.(1986)CRC Critical Reviews in PlantScience 4:1);氰酰胺水合酶(Maier-Greiner et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:4250);天冬氨酸激酶;二氢吡啶二羧酸合酶(Perlet al.(1993)BioTechnology 11:715);条基因(Toki et al.(1992)PlantPhysiol.100:1503;Meagher et al.(1996)Crop Sci.36:1367);色氨酸脱羧酶(Goddijn et al.(1993)Plant Mol.Biol.22:907);新霉素磷酸转移酶(NEO;Southern et al.(1982)J.Mol.Appl.Gen.1:327);潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG;Shimizu et al.(1986)Mol.Cell.Biol.6:1074);二氢叶酸还原酶(DHFR;Kwok et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:4552);膦丝菌素乙酰转移酶(DeBlock et al.(1987)EMBOJ.6:2513);2,2-二氯丙酸脱卤素酶(Buchanan-Wollatron et al.(1989)J.Cell.Biochem.13D:330);乙酰羟酸合酶(Anderson等人的美国专利No.4,761,373;Haughn et al.(1988)Mol.Gen.Genet.221:266);5-烯醇丙酮酰-莽草酸-磷酸合酶(aroA;Comai et al.(1985)Nature317:741);卤代芳基腈水解酶(Stalker等人的WO 87/04181);乙酰-辅酶A羧基化酶(Parker et al.(1990)Plant Physiol.92:1220);二氢蝶酸合酶(sulI;Guerineau et al.(1990)Plant Mol.Biol.15:127);及32kDa光系统II多肽(Hirschberg et al.(1983)Science 222:1346(1983))的基因。
也包括编码对于下列物质有抗性的基因:庆大霉素(例如,aacC1,Wohlleben et al.(1989)Mol.Gen.Genet.217:202-208);氯霉素(Herrera-Estrella et al.(1983)EMBO J.2:987);甲氨喋呤(Herrera-Estrella et al.(1983)Nature 303:209;Meijer et al.(1991)Plant Mol.Biol.16:807);潮霉素(Waldron et al.(1985)Plant Mol.Biol.5:103;Zhijian et al.(1995)Plant Science 108:219;Meijer et al.(1991)Plant Mol.Bio.16:807);链霉素(Jones et al.(1987)Mol.Gen.Genet.210:86);大观霉素(Bretagne-Sagnard et al.(1996)TransgenicRes.5:131);博来霉素(Hille et al.(1986)Plant Mol.Biol.7:171);磺酰胺(Guerineau et al.(1990)Plant Mol.Bio.15:127);溴苯腈(Stalker et al.(1988)Science 242:419);2,4-D(Streber et al.(1989)BioTechnology 7:811);膦丝菌素(DeBlock et al.(1987)EMBO J.6:2513);大观霉素(Bretagne-Sagnard and Chupeau,TransgenicResearch 5:131)。
条基因赋予对于草铵膦-型除草剂,诸如膦丝菌素(PPT)或双丙氨膦,等的除草剂抗性。如上所述,可用于载体构建体的其他可选择的标记物包括,但不限于,pat基因,也用于双丙氨膦和膦丝菌素抗性,用于咪唑啉酮抗性的ALS基因,用于潮霉素抗性的HPH或HYG基因,用于草甘膦抗性的EPSP合酶基因,用于对Hc-毒素的抗性的Hm1基因,及本领域普通技术人员常规使用及知道的的其他选择性剂。见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3:506;Chistopherson etal.(1992)PNAS USA 89:6314;Yao et al.(1992)Cell 71:63;Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6:2419;Barkley et al.(1980)The Operon177-220;Hu et al.(1987)Cell 48:555;Brown et al.(1987)Cell 49:603;Figge et al.(1988)Cell 52:713;Deuschle et al.(1989)PNAS USA86:5400;Fuerst et al.(1989)PNAS USA 86:2549;Deuschle et al.(1990)Science 248:480;Labow et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343;Zambretti et al.(1992)PNAS USA 89:3952;Baim et al.(1991)PNASUSA 88:5072;Wyborski et al.(1991)Nuc.Acids Res.19:4647;Hillenand-Wissman(1989)Topics in Mol.And Struc.Biol.10:143;Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.Agents Chemother.35:1591;Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry 27:1094;Gatz et al.(1992)Plant J.2:397;Gossen et al.(1992)PNAS USA 89:5547;Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36:913;Hlavka et al.(1985)Handbook of Experimental Pharmacology 78;和Gill et al.(1988)Nature 334:721。该公开通过引用并入本文。
可选择的标记物基因的以上列表不旨在限制。可在本发明中使用任何可选择的标记物基因。
【用于在植物或微藻宿主中增强的表达的核苷酸序列的修饰】
当BTV多肽或其片段或变体在浮萍或微藻之内表达时,可将表达的编码BTV多肽或其片段或变体的多核苷酸序列修饰为增强其分别在浮萍或微藻中表达。一种该修饰是使用植物-优选的密码子,特别浮萍-优选的密码子,或使用微藻-优选的密码子,诸如裂殖壶菌属(Schizochytrium)-优选的密码子的多核苷酸的合成。用植物-优选的密码子合成核苷酸序列的方法在本领域中可利用。见,例如,美国专利No.5,380,831和5,436,391;EP 0359472;EP 0385962;WO91/16432;Perlak等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 15:3324;Iannacome等人(1997)Plant Mol.Biol.34:485;及Murray等人(1989)Nucleic Acids.Res.17:477。合成可使用任何本领域技术人员知道的方法实现。优选的密码子可自浮萍或微藻中表达的蛋白中最高频度的密码子确定。例如,浮萍(Lemna minor)的密码子利用频度见于表A,裂殖壶菌属(Schizochytrium)的密码子利用频度见于表B。
表A.浮萍(Lemna minor)[gbpln]:4个CDS的(1597个密码子)
表B裂殖壶菌属(Schizochytriumsp.)ATCC_20888[gbpln]:3CDS氏(6473个密码子)
为本发明的目的,“浮萍-优选的密码子”指称在浮萍中具有大于17%的密码子利用频度的密码子。本文所用的“浮萍属(Lemna)-优选的密码子”指称在浮萍属(Lemna)中具有大于17%的密码子利用频度的密码子。本文所用的“浮萍(Lemna minor)-优选的密码子”指称在浮萍(Lemna minor)中具有大于17%的密码子利用频度的密码子,其中浮萍(Lemna minor)中的密码子利用频度从密码子利用数据库(GenBank Release 160.0,2007年6月15日)得到。”微藻-优选的密码子”指称在微藻中具有大于17%的密码子利用频度的密码子。本文所用的术语“微藻-优选的密码子”指称在破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)中具有大于17%的密码子利用频度的密码子。本文所用的“裂殖壶菌属(Schizochytrium)-优选的密码子”指称在裂殖壶菌属(Schizochytrium)中具有大于17%的密码子利用频度的密码子,其中裂殖壶菌属(Schizochytrium)中的密码子利用频度从密码子利用数据库得到。
还需知,编码目标BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸的全部或任何部分,可优化或合成。换言之,也可使用完全优化的或部分优化的序列。例如,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,87%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或100%的密码子可为浮萍-优选的或微藻-优选的密码子。在一实施方式中,90和96%之间的密码子是浮萍-优选的或微藻-优选的密码子。编码目标BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸序列的编码序列,可包含以在膨胀浮萍(Lemna gibba)中至少17%或在浮萍(Lemna minor)中至少17%的频度使用的密码子。在一实施方式中,BTV多肽是VP2或VP5多肽,例如,SEQ ID NO:4所示的VP2多肽或SEQ ID NO:10所示的VP5多肽,及包含此VP2多肽的优化的编码序列的表达盒,其中编码序列包含浮萍-优选的密码子,例如,浮萍(Lemna minor)-优选的或膨胀浮萍(Lemna gibba)-优选的密码子。在一该实施方式中,表达盒包含SEQ ID NO:3,其含有编码SEQ ID NO:4所示的VP2多肽的浮萍(Lemna minor)-优选的密码子。在另一该实施方式中,表达盒包含SEQ ID NO:9,其含有编码SEQ ID NO:10所示的VP5多肽的浮萍(Lemna minor)-优选的密码子。
也可对编码目标BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸进行其他修饰,以增强其在浮萍或微藻中表达。这些修饰包括,但不限于,消除可有害于基因表达的编码假多聚腺苷酸化信号,外显子-内含子剪接位点信号,转座子-样重复子的序列和其他该良好表征的序列。可将序列的G-C含量调至对于浮萍平均的水平,如通过参考此植物中表达的知道的基因计算。当可能时,可将编码异源目的多肽的多核苷酸修饰为避免预测的发卡二级mRNA结构。
在用于在动物,植物和藻中的翻译起始密码子的最佳翻译起始情景核苷酸序列之间有知道的差异。本文所用的“翻译起始情景核苷酸序列”指称翻译起始密码子的直接5’的3个核苷酸的同一性。“翻译起始密码子”指称起始自目的核苷酸序列转录的mRNA的翻译的密码子。这些翻译起始情景核苷酸序列的组成可影响翻译起始的效率。见,例如,Lukaszewicz et al.(2000)Plant Science 154:89-98;和Joshi et al.(1997);Plant Mol.Biol.35:993-1001。在本发明中,可将编码目标抗原性BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸的翻译起始密码子的翻译起始情景核苷酸序列修饰为增强在浮萍中表达。在一实施方式中,修饰核苷酸序列,使得翻译起始密码子的直接上游的3个核苷酸是”ACC”。在第2实施方式中,这些核苷酸是”ACA”。
浮萍或藻中BTV多肽的表达也可通过使用5’前导序列增强。该前导序列可发挥作用来增强翻译。本领域熟知翻译前导序列,且包括,但不限于,微小核糖核酸病毒前导序列,例如,EMCV前导序列(脑心肌炎5’非编码区;Elroy-Stein et al.(1989)PNAS USA 86:6126);马铃薯Y病毒前导序列,例如,TEV前导序列(烟草刻蚀病毒;Allisonet al.(1986)Virology 154:9);人免疫球蛋白重-链结合蛋白(BiP;Macajak and Sarnow(1991)Nature 353:90);来自紫花苜蓿花叶病毒的包被蛋白mRNA的未翻译的前导序列(AMV RNA 4;Jobling andGehrke(1987)Nature 325:622);烟草花叶病毒前导序列(TMV;Gallie(1989)Molecular Biology of RNA,23:56);马铃薯刻蚀病毒前导序列(Tomashevskaya et al.(1993)J.Gen.Virol.74:2717-2724);Fed-15’非翻译区(Dickey(1992)EMBO J.11:2311-2317);RbcS 5’非翻译区(Silverthorne et al.(1990)J.Plant.Mol.Biol.15:49-58);及玉米黄萎病斑点病毒前导序列(MCMV;Lommel et al.(1991)Virology81:382)。也见,Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiology 84:965。包含植物内含子序列,包括自玉米醇脱氢酶1(ADH1)基因,蓖麻子过氧化氢酶基因,或拟南芥属(Arabidopsis)色氨酸通路基因PAT1的内含子序列的前导序列也已显示增加在植物中的翻译效率(Callis etal.(1987)Genes Dev.1:1183-1200;Mascarenhas et al.(1990)PlantMol.Biol.15:913-920)。
在本发明的一些实施方式中,对应于玉米醇脱氢酶1基因(ADH1;GenBank登录号X04049)的核苷酸1222~1775的核苷酸序列被插入编码目标BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸的上游,以增强其翻译效率。在另一实施方式中,表达盒含有自膨胀浮萍(Lemna gibba)核酮糖-双-磷酸羧基化酶小亚基5B基因的前导序列(RbcS前导序列;见Buzby et al.(1990)Plant Cell 2:805-814)。
需知,上述任何表达-增强核苷酸序列修饰可在本发明中使用,包括任何单修饰或任何可能的修饰的组合。短语“为增强的表达修饰的”在浮萍中,如本文所用,指称含有这些修饰的任何一种或任何组合的多核苷酸序列。
【转化的浮萍植物和浮萍根瘤培养物或转化的微藻】
本发明提供表达目标BTV多肽,或其片段或变体的转化的浮萍植物。术语“浮萍”指称浮萍科(Lemnaceae)的成员。此家族目前分为如下5属和38物种的浮萍:浮萍属(Lemna)(稀脉萍(L.aequinoctialis),L.disperma,L.ecuadoriensis,膨胀浮萍(L.gibba),L.japonica,浮萍(L.minor),L.miniscula,L.obscura,L.perpusilla,L.tenera,L.trisulca,L.turionifera,L.valdiviana);多根紫萍属(SPirodela)(S.intermedia,多根紫萍(S.polyrrhiza),S.punctata);芜萍属(Wolffia)(Wa.angusta,Wa.arrhiza,Wa.australina,Wa.borealis,Wa.brasiliensis,Wa.columbiana,Wa.elongata,Wa.globosa,Wa.microscopica,Wa.neglecta);扁平无根萍属(Wolffiella)(Wl.caudata,Wl.denticulata,Wl.gladiata,Wl.hyalina,Wl.lingulata,Wl.repunda,Wl.rotunda及Wl.neotropica)及少根紫萍属(Landoltia)(L.punctata)。浮萍科(Lemnaceae)的任何其他属或物种,如果它们存在,也在本发明的方面。浮萍属(Lemna)物种可使用由Landolt(1986)Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds:Thefamily of Lemnaceae—A Monograph Study (Geobatanischen InstitutETH,Stiftung Rubel,Zurich)描述的分类学方案分类。
如本文所用,“植物”包括全体植物,植物器官(例如,叶(叶),茎,根,等),种子,植物细胞,及这些的后代。转基因植物的部分待理解为在本发明的范围之内,以包含,之前用目的多核苷酸转化,由此至少部分由转基因细胞组成的转基因植物或它们的后代中来源的例如,植物细胞,植物原生质体,植物可由其再生的植物细胞组织培养物,组织,植物愈伤组织,胚胎以及花,胚珠,茎,果实,叶,根,根端,根瘤,等。如本文所用,术语“植物细胞”包括种子,胚胎,胚珠,分生组织区,愈伤组织,叶,叶,根,根瘤,苗,花药和花粉的细胞。
如本文所用,“浮萍根瘤”是指包含浮萍细胞的浮萍组织,其中至少约50%,55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,95%或100%的细胞是分化的细胞。如本文所用,“分化的细胞”,是指具有使其区别于未分化的细胞或其他组织类型中发现的细胞的至少一种表型特征(例如,特征性的细胞形态或标记物核酸或蛋白的表达)的细胞。本文所述的浮萍根瘤培养物的分化的细胞形成在它们的相邻细胞壁融合的互连的细胞的铺装的光滑表面,根瘤开始组织成贯穿组织散发的叶原基。根瘤培养物的组织表面具有经胞间连丝彼此连接的表皮细胞。
浮萍的生长习性对培养方法是理想的。植物通过新叶的植物性芽殖,以类似于酵母的无性繁殖的宏观方式,快速增殖。此增殖由植物性芽殖自分生组织细胞发生。分生组织区小且见于叶的腹表面。分生组织细胞位于2个袋中,在叶中脉的各侧各一个。小中脉区也是将各叶与其母叶连接的根来源及茎出现的位点。分生组织袋被组织瓣保护。叶自这些袋交替发芽。倍增时间随物种不同,且短至20~24小时(Landolt(1957)Ber.Schweiz.Bot.Ges.67:271;Chang et al.(1977)Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.24:19;Datko and Mudd(1970)PlantPhysiol.65:16;Venkataraman et al.(1970)Z.Pflanzenphysiol.62:316)。浮萍的密集培养导致每单位时间生物质蓄积的最高速度(Landolt and Kandeler(1987)The Family of Lemnaceae—AMonographic Study Vol.2:Phytochemistry,Physiology,Application,Bibliography(Veroffentlichungen des Geobotanischen Institutes ETH,Stiftung Rubel,Zurich)),干重蓄积为鲜重的6~15%(Tillberg et al.(1979)Physiol.Plant.46:5;Landolt(1957)Ber.Schweiz.Bot.Ges.67:271;Stomp,未公开的数据)。在不同条件下生长的许多浮萍物种的蛋白含量已报道在15~45%干重的范围(Chang et al.(1977)Bull.Inst.Chem.Acad.Sin.24:19;Chang and Chui(1978)Z.Pflanzenphysiol.89:91;Porath et al.(1979)Aquatic Botany 7:272;Appenroth et al.(1982)Biochem.Physiol.Pflanz.177:251)。使用这些值,浮萍中蛋白产生/l培养基的水平与酵母基因表达系统在相同的数量级。
本发明也提供表达目标BTV多肽,或其片段或变体的转化的微藻植物。术语“微藻”或“微藻”指称破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)的成员。此家族目前分为4属:裂殖壶菌属(Schizochytrium),破囊壶菌属(Thraustochytrium),类网粘菌属(Labyrinthuloides)和日本壶菌属(Japonochytrium)。
本发明的转化的浮萍植物或微藻可通过将包含编码BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸的表达构建体导入目标浮萍植物或微藻来获得。
术语“导入”在多核苷酸的情景中,例如,表达构建体包含编码BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸,旨在表示以多核苷酸进入浮萍植物或微藻细胞内部的方式提供给浮萍植物或微藻多核苷酸。其中待导入多于一种多核苷酸,这些多核苷酸可单核苷酸构建体的部分组装,或作为分离的核苷酸构建体,及可位于相同的或不同转化载体上。因此,这些多核苷酸可在单转化事件中,在分离的转化事件中,或,例如,作为繁殖过程的部分导入目的浮萍或微藻宿主细胞。本发明的组合物和方法不依赖于将一种或更多多核苷酸导入浮萍植物或微藻的特定方法,仅在乎多核苷酸进入至少一个浮萍植物或微藻细胞内部。本领域熟知将多核苷酸导入植物或藻的方法,包括但不限于瞬时转化方法,稳定的转化方法,及病毒-介导的方法。
“瞬时转化”在多核苷酸诸如编码BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸的情景中,旨在表示将多核苷酸导入浮萍植物或微藻,及不整合进浮萍植物或微藻的基因组。
“稳定地导入(stably introducing)”或“稳定地导入(stablyintroduced)”在导入浮萍植物或微藻的多核苷酸(诸如编码BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸)的情景中是指导入的多核苷酸稳定地合并进浮萍或微藻基因组,由此浮萍植物或微藻经多核苷酸稳定地转化。
“稳定的转化(Stable transformation)”或“稳定地转化(stablytransformed)”旨在表示多核苷酸,例如,编码BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸,导入浮萍植物或微藻整合进植物或藻的基因组,且能被其后代,更特别,被多个连续世代的后代遗传。在一些实施方式中,连续世代包括营养性地(即,无性繁殖),例如,用克隆繁殖产生的后代。在其他实施方式中,连续世代包括经性繁殖产生的后代。
可将表达构建体包含编码BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸使用本领域技术人员知道的任何转化流程导入目标浮萍植物或微藻。适合的将核苷酸序列导入浮萍植物或植物细胞或根瘤或微藻的方法包括微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques 4:320-334),电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602-5606),土壤杆菌属(Agrobacterium)-介导的转化(美国专利No.5,563,055和5,981,840,均通过引用并入本文),直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBOJ.3:2717-2722),弹道粒子加速(见,例如,美国专利No.4,945,050;5,879,918;5,886,244;及5,932,782(各通过引用并入本文);及Tomes等人(1995)”Direct DNA Transfer into Intact PlantCells via Microproj ectile Bombardment,”in Plant Cell,Tissue,andOrgan Culture:Fundamental Methods,ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag,Berlin);McCabe et al.(1988)Biotechnology6:923-926)。已转化的细胞可根据常规方式生长为植物。
如上所述,稳定地转化的浮萍或微藻可由本领域知道的任何基因转移方法,诸如在美国专利No.6,040,498或美国专利申请公开No.2003/0115640,2003/0033630或2002/0088027中公开的基因转移方法之一获得。浮萍植物或根瘤培养或微藻可通过许多方法,包括土壤杆菌属(Agrobacterium)-介导的基因转移,弹道轰击或电穿孔中的任何一种,用含有本文所述的核酸序列的表达盒有效转化。使用的土壤杆菌属(Agrobacterium)可为根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。稳定的浮萍或微藻转化体可由具有目的核酸序列和赋予对于选择剂的抗性的基因的转化浮萍或微藻细胞分离,之后是在含有选择剂的培养基中培养转化的细胞。见,例如,美国专利No.6,040,498,其内容通过引用整体并入本文。
在这些方法中利用的稳定地转化的浮萍植物或微藻应呈现正常形态,且由性繁殖能育和/或能营养性地(即,无性繁殖),例如,用克隆繁殖来繁殖。优选地,转化的本发明的浮萍植物或微藻含有单拷贝的包含编码BTV多肽,或其片段或变体的多核苷酸的转移的核酸,及转移的核酸中无明显的重排。需知,本发明的转化的浮萍植物或微藻可含有以低拷贝数存在的转移的核酸(即,每转化的细胞不多于12拷贝,不多于8拷贝,不多于5拷贝,替代性地,不多于3拷贝,还替代性地,少于3拷贝的核酸)。
表达BTV多肽,或其片段或变体的转化的植物或微藻,可在对于表达抗原性BTV多肽,或其片段或变体适合的条件下培养。BTV多肽,或其片段或变体,可然后自浮萍植物或微藻,培养基,或浮萍植物或微藻和培养基收获,及,如果需要,使用如在本文别处描述的本领域知道的任何常规分离和纯化方法纯化。抗原性BTV多肽,或其片段或变体,可然后制成用于治疗性应用的疫苗,如在本文别处描述。
【制备BTV多肽的方法】
如在本文完整描述,在一实施方式中,产生BTV多肽的方法,其包括:(a)在浮萍培养基之内培养浮萍植物或浮萍根瘤,其中浮萍植物或浮萍根瘤稳定地转化而表达多肽,且其中多肽自包含所述多肽的编码序列的核苷酸序列表达;及(b)收集抗原性多肽自所述浮萍植物或浮萍根瘤。术语收集包括,但不限于,自培养基收获或纯化。
在浮萍或微藻中产生重组多肽之后,可使用用于蛋白纯化的本领域中可利用的任何方法。各种步骤包括自非蛋白或植物或微藻物质游离蛋白,之后是目标蛋白自其他蛋白的纯化。纯化过程中的初始步骤包括离心,过滤或其组合。在组织的细胞外空间之内分泌的蛋白可使用真空或离心提取获得。最小处理也可涉及粗产物的制备。其他方法包括浸软和提取,以便允许提取物的直接使用。
纯化目标蛋白的方法可利用蛋白尺寸,物理化学性质和结合亲和力的差异。该方法包括层析,包括普鲁卡因胺亲和性,大小排阻,高压液体,逆相和阴离子交换层析,亲和性标签,过滤、等。尤其是,固定的Ni-离子亲和层析可用于纯化表达的蛋白。见,Favacho et al.(2006)Protein expression and purification 46:196-203.See also,Zhouet al.(2007)The Protein J 26:29-37;Wang et al.(2006)Vaccine15:2176-2185;及WO/2009/076778。保护剂可用于纯化处理诸如渗压剂,抗氧化剂,酚氧化抑制物,蛋白酶抑制物等。
【使用方法】
在一实施方式中,本文公开的主题针对免疫接种绵羊,牛或山羊的方法,包括给绵羊,牛或山羊施用有效量的疫苗,其可包含有效量的重组BTV多肽或抗原和药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂,佐剂或媒质。
在本发明的一实施方式中,方法包含单次施用用本发明的乳剂或典型晶体盐配制的疫苗组合物。在一实施方式中,本文公开的主题针对免疫接种绵羊,牛或山羊的方法,包括给绵羊,牛或山羊施用在植物或藻,及自浮萍属(Lemna)的植物材料或自裂殖壶菌属(Schizochytrium)的微藻材料中产生的BTV多肽或抗原。
在一实施方式中,本文公开的主题针对引发免疫应答的方法,包括给绵羊,牛或山羊施用包含在引发免疫应答的植物或藻中表达的BTV多肽或抗原的疫苗。
在一实施方式中,本文公开的主题针对制备稳定地转化的浮萍植物的方法,包含:(a)向植物导入包含BTV抗原基因的遗传构建体;及(b)栽培植物。转化浮萍的方法在本领域中可利用。
在一实施方式中,本文公开的主题针对制备疫苗或组合物的方法,包括分离由浮萍或微藻表达系统产生的BTV抗原,和任选地与药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂,佐剂或媒质组合。
在一实施方式中,本文公开的主题针对制备疫苗或组合物的方法,包括将由浮萍属(Lemna)表达系统和自浮萍属(Lemna)的植物材料产生的BTV抗原和任选地药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂,佐剂或媒质组合。
在另一实施方式中,本文公开的主题针对制备疫苗或组合物的方法,包括将由裂殖壶菌属(Schizochytrium)表达系统和裂殖壶菌属(Schizochytrium)材料产生的BTV抗原和任选地药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂,佐剂或媒质组合。
施用可为皮下或肌内施用。施用可无针施用(例如Pigjet或Bioject)。
在本发明的一实施方式中,可采用初施-追施方案,其包括使用至少一种常见的多肽,抗原,表位或免疫原的至少一次初次施用和至少一次追加施用。一般,在初次施用中使用的免疫学组合物或疫苗在性质上不同于作为追加使用的那些。但是,需知,可将相同的组合物用作初次施用和追加施用。此施用流程称之为“初施-追施”。
本发明的初施-追施可包括重组病毒载体,其用来表达BTV编码序列或其片段。特别是,病毒载体可表达BTV基因或编码抗原性多肽的其片段。本文涵盖的病毒载体包括但不限于痘病毒[例如,痘苗病毒或衰减的痘苗病毒,禽痘病毒或衰减的禽痘病毒(例如,金丝雀痘,鸡痘,鸽痘,鸽痘,鹌鹑痘,ALVAC,TROVAC;见例如,US 5,505,941,US 5,494,8070),浣熊痘病毒,猪痘病毒,等],腺病毒(例如,人腺病毒,狗腺病毒),疱疹病毒(例如狗疱疹病毒,火鸡的疱疹病毒,Marek氏病病毒,感染性喉气管炎病毒,猫疱疹病毒,喉气管炎病毒(ILTV),牛疱疹病毒,猪疱疹病毒),杆状病毒,反转录病毒,等。在另一实施方式中,禽痘表达载体可为金丝雀痘载体,诸如,ALVAC。在仍另一实施方式中,禽痘表达载体可为鸡痘载体,诸如,TROVAC。本发明的待表达的BTV抗原被插入到在特定痘病毒启动子控制下,例如,昆虫痘病毒桑红缘灯蛾(Amsacta moorei)42K启动子(Barcena,Lorenzo et al.2000),痘苗启动子7.5kDa(Cochran等人,1985),痘苗启动子I3L(Riviere等人,1992),痘苗启动子HA(Shida,1986),牛痘启动子ATI(Funahashi等人,1988),痘苗启动子H6(Taylor等人,1988b;Guo等人,1989;Perkus等人,1989),尤其。
在另一实施方式中,禽痘表达载体可为金丝雀痘载体,诸如,ALVAC。BTV多肽,抗原,表位或免疫原可为BTV VP2或BTV VP5。病毒载体可为vCP2289,其编码BTV密码子-优化的合成VP2和VP5(见US 2007/0280960)。
在本发明的初施-追施流程的另一方面,施用包含本发明的BTV抗原的组合物,之后是施用包含含有及体内表达BTV抗原的重组病毒载体的疫苗或组合物,或灭活的病毒疫苗或组合物包含BTV抗原,或含有或表达BTV抗原的DNA质粒疫苗或组合物。同样,初施-追施流程可包含施用包含含有及体内表达BTV抗原的重组病毒载体的疫苗或组合物,或灭活的病毒疫苗或组合物包含BTV抗原,或含有或表达BTV抗原的DNA质粒疫苗或组合物,之后是施用本发明的包含BTV抗原的组合物。还需注意,初次和二次施用可含有包含本发明的BTV抗原的组合物。
初施-追施方案包括使用至少一种常见的多肽和其/或变体或片段的至少一次初次施用和至少一次追加施用。初次施用中使用的疫苗可在性质上不同于作为后期追加疫苗使用的那些。初次施用可包含一次或更多施用。类似地,追加施用可包含一次或更多施用。
用于是哺乳动物的靶物种的组合物的剂量体积,例如,绵羊,牛或山羊组合物的剂量体积,基于病毒载体,例如,基于非-痘病毒-载体的组合物,通常约0.1~约5.0ml之间,约0.1~约3.0ml之间,及约0.5ml~约2.5ml之间。
疫苗功效可在通过用BTV的强毒株,诸如BTV-1/2/3/4/8/9/16或17株攻击动物,诸如绵羊,牛或山羊最后免疫之后约2~4周测试。例如,BTV株可为血清型17,其原本分离自来自Tulare郡,CA的绵羊的血(见Bonneau,DeMaula et al.2002;DeMaula,Leutenegger etal.2002)。BTV株也可为血清型8,灭活的疫苗,其为目前自Merial有限公司可利用的。
其他株可包括BTV1(分离物,法国),BTV1(分离物,澳大利亚),BTV1(分离物,南非洲),BTV2(分离物,USA),BTV3(分离物,南非洲),BTV4-9,BTV10(分离物,USA),BTV11(分离物,USA),BTV12,BTV13(分离物,USA),BTV14-17,BTV17(分离物,USA),BTV18,BTV19,BTV20(分离物,澳大利亚),BTV21-24或科西嘉BTV。
将同源和异源株用于攻击,以测试疫苗功效。动物可真皮内,皮下,喷雾,鼻内,眼内,气管内和/或经口攻击。
对于BTV,对牛和山羊评价扩展的血管损伤。也对于BTV,对绵羊评价口,鼻和前胃粘膜的卡他性发炎,蹄的冠状垫和板的发炎,上皮抓痕,颊粘膜的坏死,及膨胀的/发炎的/蓝舌和口。可自攻击后的全部动物收集拭子用于病毒分离。以上-指示的组织中病毒抗原的存在或缺失可由定量实时反转录酶聚合酶链反应(qRRT-PCR)评价。血样品可在攻击前和后收集,和可分析抗-BTV特异性抗体的存在。
初施-追施可有利地以2~6周间隔,例如,约3周间隔进行。根据一实施方式,也有利地使用基于病毒载体的疫苗进行每半-年追加或每年追加。动物有利地在第1次施用时是至少6~8周龄。
初施-追施流程中使用的包含本发明的重组体抗原性多肽的组合物含于药学或兽医学可接受的媒质,稀释剂,佐剂或赋形剂。本发明的流程保护动物免于绵羊,牛或山羊BTV和/或预防感染的动物中的疾病进展。
各种施用优选以1~6周间隔,及更特别约3周间隔进行。根据优选的模式,也包括优选使用疫苗的基于病毒载体的免疫学组合物的每年追加。动物在第1次施用时优选是至少1日龄。
本领域技术人员应明白,本公开以例提供,本发明不限于此。自本公开及本领域的知识,本领域技术人员可无需任何过度实验而确定对于各注射流程待使用的施用数,施用途径,及剂量。
本发明涵盖至少一次给动物施用有效量的根据本发明制造的治疗组合物。动物可为雄性,雌性,怀孕的雌性和新生儿。此施用可为经各种途径包括但不限于肌内(IM),真皮内(ID)或皮下(SC)注射或经鼻内或口服施用。治疗组合物根据本发明也可通过无针设备(例如用Pigjet,Dermojet,Biojector,Avijet(Merial,GA,USA),Vetjet或Vitajet设备(Bioject,Oregon,USA))施用。施用质粒组合物的另一方法是使用电穿孔(见,例如tollefsen等人,2002;Tollefsen等人,2003;Babiuk等人,2002;PCT申请No.WO99/01158)。在另一实施方式中,将治疗组合物由基因枪或金粒子轰击递送到动物。
在一实施方式中,本发明提供治疗有效量的制剂的施用,其用于在靶细胞中递送和表达BTV抗原或表位。治疗有效量的确定是本领域普通技术人员的常规实验。在一实施方式中,制剂含有包含表达BTV抗原或表位的多核苷酸的表达载体和药学或兽医学地可接受的载体,媒质或赋形剂。在另一实施方式中,药学或兽医学地可接受的载体,媒质或赋形剂辅助转染或多核苷酸转移到宿主动物的其他手段和/或改善宿主中载体或蛋白的保存。
在一实施方式中,本文公开的主题提供检测方法,其用于感染的及免疫接种的动物之间的区分(DIVA)。
目前,有几种可利用的BTV疫苗。Merial提供灭活的BTV1和BTV8疫苗。Intervet提供灭活的BTV8疫苗。Pfizer提供灭活的BTV1,BTV4和BTV8疫苗。最近已描述区别BTV-疫苗接种的和BTV-感染的动物之间的方法(Anderson,J et al,J.Virol.Methods,1993;SílviaC.Barros et al.,Veterinary-Microbiology,2009)。
本文公开,本发明的疫苗或组合物的使用允许在动物中检测BTV感染。本文公开,本发明的疫苗或组合物的使用允许通过区分感染的及免疫接种的动物之间(DIVA)来检测动物中的感染。已开发基于非-结构蛋白的诊断性测试,诸如使用针对NS1的单克隆抗体的间接NS3-ELISA和竞争性ELISA。但是,如果疫苗未足够纯化,灭活的疫苗可仍诱导针对非-结构蛋白的低水平的抗体。此限制会由本发明通过表达仅外部壳体蛋白VP2和VP5来克服。
【生产的物品】
在一实施方式中,本文公开的主题针对用于实施引发或诱导免疫应答的方法的试剂盒,其可包含重组BTV免疫学组合物或疫苗,或灭活的BTV免疫学组合物或疫苗,重组BTV病毒组合物或疫苗中的任何一种,及用于实施方法的使用说明。
本发明的另一实施方式是用于实施在动物中诱导针对BTV的免疫学或保护性应答的方法的试剂盒,其包含组合物或疫苗,所述组合物或疫苗包含本发明的BTV抗原和重组BTV病毒免疫学组合物或疫苗,及用于实施以有效量在动物中引发免疫应答的递送方法的使用说明。
本发明的另一实施方式是用于实施在动物中诱导针对BTV的免疫学或保护性应答的方法的试剂盒,其包含组合物或疫苗,所述组合物或疫苗包含本发明的BTV抗原和灭活的BTV免疫学组合物或疫苗,及用于实施以有效量在动物中引发免疫应答的递送方法的使用说明。
本发明的再一方面涉及用于根据上述本发明初施-追施疫苗接种的试剂盒。试剂盒可包含至少2个瓶:第1瓶含有本发明的初施疫苗接种的疫苗或组合物,及第2瓶含有本发明的追施疫苗接种的疫苗或组合物。试剂盒可有利地含有用于额外的初施疫苗接种或额外的追施-疫苗接种的额外的第1或第2瓶。
以下实施方式包括在本发明。在一实施方式中,公开了包含BTV抗原或其片段或变体及药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂或媒质的组合物。在另一实施方式中,公开了上述组合物,其中BTV抗原或其片段或变体含有包含绵羊,牛或山羊BTV抗原的至少15个氨基酸的免疫原性片段。在仍另一实施方式中,公开了以上组合物,其中BTV抗原或其片段或变体在浮萍或微藻中产生。在一实施方式中,公开了以上组合物,其中BTV抗原或其片段或变体是部分纯化的。在一实施方式中,公开了以上组合物,其中BTV抗原或其片段或变体是基本上纯化的。在一实施方式中,公开了以上组合物,其中BTV抗原或其片段或变体是BTV1多肽。在一实施方式中,公开了以上组合物,其中BTV1多肽是VP2或VP5多肽。在一实施方式中,公开了以上组合物,其中BTV抗原或其片段或变体与SEQ ID NO:4,6,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25所示的序列具有至少80%序列同一性。在一实施方式中,公开了以上组合物,其中BTV抗原由与SEQ ID NO:1,2,3,5,7,8或9所示的序列具有至少70%序列同一性的多核苷酸编码。
在一实施方式中,公开了以上组合物,其中药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂,佐剂或媒质是油包水乳剂或水包油乳剂。在另一实施方式中,公开了免疫接种敏感于绵羊,牛或山羊BTV的动物的方法,包括给动物施用以上组合物。在一实施方式中,公开了免疫接种敏感于绵羊,牛或山羊BTV的动物的方法,包括初施-追施方案。在一实施方式中,公开了在浮萍或微藻中表达的基本上纯化的抗原性多肽,其中多肽包含与具有SEQ ID NO:4,6,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24或25所示的序列的多肽具有至少80%序列同一性的氨基酸序列。在任何实施方式中,动物优选是绵羊,牛,或山羊。在一实施方式中,公开了在动物中诊断BTV感染的方法。在仍另一实施方式中,公开了用于初施-追施疫苗接种的试剂盒,其包含至少2个瓶,其中第1瓶含有本发明的组合物,及第2瓶含有用于追施疫苗接种的组合物,所述组合物包含:包含重组病毒载体的组合物,或包含灭活的病毒组合物的组合物,或含有或表达BTV抗原的DNA质粒组合物。
药学或兽医学地可接受的载体,媒质,佐剂或赋形剂为本领域技术人员熟知。例如,药学或兽医学地可接受的载体,媒质,佐剂或赋形剂可为0.9%NaCl(例如,盐水)溶液或磷酸盐缓冲剂。可用于本发明的方法的其他药学或兽医学地可接受的载体,媒质,佐剂或赋形剂,包括,但不限于,聚-(L-谷氨酸)或聚乙烯吡咯烷酮。药学或兽医学地可接受的载体,媒质,佐剂或赋形剂可为任何化合物或辅助载体施用的化合物的组合(或自发明的载体体外表达的蛋白);有利地,载体,媒质,佐剂或赋形剂可辅助转染和/或改善载体(或蛋白)的保存。剂量和剂量体积在概述中讨论,且也可由本领域技术人员自本公开内容结合本领域知识,无需任何过度实验而确定。
含有季铵盐的阳离子脂质,其为有利地但不完全适合于质粒,有利地是具有以下式的那些:
其中R1是具有12~18个碳原子的饱和的或不饱和的直链脂肪族自由基,R2是含有2或3个碳原子的另一脂肪族自由基,和X是胺或羟基,例如DMRIE。在另一实施方式中,阳离子脂质可相关于中性脂质,例如DOPE。
这些阳离子脂质中,偏好将给予DMRIE(N-(2-羟乙基)-N,N-二甲基-2,3-双(十四烷基氧基)-1-丙烷铵;WO96/34109),有利地关联于中性脂质,有利地DOPE(二油酰-磷脂酰-乙醇胺;Behr,1994),以形成DMRIE-DOPE。
有利地,与佐剂混合的质粒无准备地和有利地与制备物施用同时或制备物施用之前不久;例如,在施用之前不久或之前形成,形成质粒-佐剂混合物,有利地,由此为混合物形成复合物在施用之前提供足够的时间,例如施用前约10和约60分钟之间,诸如施用前大致30分钟。
当DOPE存在时,DMRIE:DOPE摩尔比有利地是约95:约5~约5:约95,更有利地约1:约1,例如,1:1。
DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂:质粒重量比可在约50:约1和约1:约10,诸如约10:约1和约1:约5,及约1:约1和约1:约2,例如,1:1和1:2之间。
在另一实施方式中,药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂,媒质或佐剂可为油包水乳剂。适合的油包水乳剂的例包括基于油的油包水疫苗乳剂,其于4℃稳定的,且是流体,其含有:6~50v/v%的含有抗原的水相,优选12~25v/v%,50~94v/v%的含有总共或部分非-可代谢的油(例如,矿物油诸如石蜡油)和/或可代谢的油(例如,植物油或脂肪酸,多元醇或醇酯)的油相,0.2~20p/v%的表面活性剂,优选3~8p/v%,后者总共或部分,或在混合物中是聚甘油酯,所述聚甘油酯优选是聚甘油(聚)蓖麻油酸酯,或聚氧乙烯蓖麻毒素油或其他氢化的聚氧乙烯蓖麻毒素油。可用于油包水乳剂的表面活性剂的例包括乙氧基化的山梨糖醇酐酯(例如,聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯(Tween
),可获自AppliChem,Inc.,Cheshire,CT)和山梨糖醇酐酯(例如,山梨糖醇酐单油酸酯(Span
),可获自Sigma Aldrich,St.Louis,MO)。此外,关于油包水乳剂,也见US 6,919,084,例如,实施例8。在一些实施方式中,含有抗原的水相包含盐溶液,其包含一种或更多缓冲剂。适合的缓冲溶液的一例是磷酸盐缓冲液。在一实施方式中,油包水乳剂可为水/油/水(W/O/W)三层乳剂(美国专利No.6,358,500)。其他适合的乳剂的例描述于美国专利No.7,371,395。
本发明的免疫学组合物和疫苗可包含一种或更多药学或兽医学地可接受的载体,赋形剂,媒质或佐剂,或基本上由其组成。在本发明中的实践使用的适合的载体或佐剂是:(1)丙烯酸或甲基丙烯酸,马来酸酐和烯基衍生聚合物的聚合物,(2)免疫刺激序列(ISS),诸如具有一个或更多非-甲基化的CpG单元的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等人,1996;WO98/16247),(3)水包油乳剂,诸如SPT乳剂描述于由M.Powell,M.Newman,Plenum Press 1995出版的“Vaccine Design,The Subunit and Adj uvant Approach”的第147页,及乳剂MF59描述于相同的文献的第183页,(4)含有季铵盐的阳离子脂质,例如,DDA(5)细胞因子,(6)氢氧化铝或磷酸铝,(7)皂苷或(8)通过引用引用及合并到本申请中的任何文献中讨论的其他佐剂,或(9)其任何组合或混合物。
对于病毒载体尤其适合的水包油乳剂(3)可基于:轻液体石蜡油(European pharmacopoeia type),类异戊二烯油诸如角鲨烷,角鲨烯,自烯,例如异丁烯或癸烯的寡聚化得到的油,具有直链烷基的酸或醇的酯,诸如植物油,油酸乙酯,丙二醇,二(辛酸酯/癸酸酯),甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯,或分支的,脂肪醇或酸的酯,尤其异硬脂酸酯。
油与乳化剂组合使用而形成乳剂。乳化剂可为非离子表面活性剂,诸如:一方面是,山梨糖醇酐,二缩甘露糖醇(例如无水甘露糖醇油酸酯),甘油,聚甘油或丙二醇的酯,及另一方面是,油酸,异硬脂酸,蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯,所述酯任选地被乙氧基化,或是聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物块,诸如普流尼克,例如,L121。
在类型(1)佐剂聚合物之中,偏好将给予交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物,尤其由糖或多元醇的聚烯基醚交联的。这些化合物被称之为卡波姆(Pharmeuropa,vol.8,no.2,1996年6月)。本领域技术人员也可参照US 2,909,462,其提供通过具有至少3个羟基,优选不多于8个该基团的聚羟基化合物交联的此类丙烯酸聚合物,至少3个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和的,脂肪族自由基取代。优选的自由基是含有2~4个碳原子的那些,例如乙烯基,烯丙基和其他乙烯键合地不饱和基团。不饱和的自由基也可含有其他取代基,诸如甲基。以卡波泊尔名称售的产品(BF Goodrich,Ohio,USA)是尤其适合的。它们由烯丙基蔗糖或由烯丙基季戊四醇交联。它们之中,参照卡波泊尔974P,934P和971P。
至于马来酸酐-烯基衍生共聚物,偏好将给予EMA(Monsanto),其是直链或交联的亚乙基-马来酸酐共聚物,且它们是,例如,由二乙烯基醚交联的。也参照J.Fields等人,1960。
关于结构,丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选由具有下式的基本单元形成:
其中:
●R1和R2,其可相同或不同,代表H或CH3
●x=0或1,优选x=1
●y=1或2,x+y=2。
对于EMA,x=0且y=2,而对于卡波姆,x=y=1。
这些聚合物在水或生理学盐溶液(20g/l NaCl)中是可溶性的,且可将pH调至7.3~7.4,例如,由苏打(NaOH),以提供可掺入表达载体的佐剂溶液。在最终免疫学或疫苗组合物中的聚合物浓度可在约0.01~约1.5%w/v,约0.05~约1%w/v,及约0.1~约0.4%w/v之间的范围内。
细胞因子(5)可在免疫学或疫苗组合物中为蛋白形式,或可在宿主中与免疫原或其表位共表达。偏好将给予由与表达免疫原或其表位的相同的载体,或由其分离的载体的一种或多种细胞因子的共表达。
本发明包含制备该组合组合物;例如通过将有活性的组分,有利地一起混合,以及与佐剂,载体,细胞因子和/或稀释剂混合。
可在本发明中使用的细胞因子包括,但不限于,粒细胞集落刺激因子(G-CSF),粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF),干扰素α
干扰素β
干扰素γ,
白细胞介素
白细胞介素
白细胞介素-2(IL-2),白细胞介素-3(IL-3),白细胞介素-4(IL-4),白细胞介素-5(IL-5),白细胞介素-6(IL-6),白细胞介素-7(IL-7),白细胞介素-8(IL-8),白细胞介素-9(IL-9),白细胞介素-10(IL-10),白细胞介素-11(IL-11),白细胞介素-12(IL-12),肿瘤坏死因子α(TNFα),肿瘤坏死因子β
及转化生长因子β
。需知,细胞因子可与本发明的免疫学或疫苗组合物共施用和/或依次施用。由此,例如,本发明的疫苗也可含有体内表达适合的细胞因子,例如,与待免疫接种的或待引发免疫学应答的此宿主匹配的细胞因子(例如,用于待施用于牛的制备物的牛细胞因子)的外源核酸分子。
有利地,本发明的免疫学组合物和/或疫苗包含对于引发治疗性应答有效量的一种或更多本文讨论的多肽,或基本上由其组成或由其组成;及,有效量可自本公开,包括并入本文的文献,及本领域知识,无需过度实验而测定。
在基于表达的多肽的免疫学组合物和/或疫苗的情况中,剂量可包括,约1μg~约2000μg,有利地约50μg~约1000μg和更有利地约100μg~约500μg的BTV抗原,表位或免疫原。剂量体积可为约0.1和约10ml之间,有利地约0.2和约5ml之间。
现在通过下列非限制性实施例进一步描述本发明。
【实施例】
DNA插入子,质粒和重组病毒或植物载体的构建使用由J.Sambrook等人(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2ndEdition,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NewYork,1989)描述的标准分子生物学技术进行。
【实施例1:BTV1VP5表达质粒pCG102,BTV1VP2表达质粒pCG100,及BTV1VP2+c-Myc表达质粒pCG101的构建】
这些实验的目的是产生含有来自BTV血清型1的VP2或VP5基因的基于pVR1012的质粒构建体,及确证在CHO-转染的细胞中的表达。pVR1012的细节可,例如,见于VICAL Inc.;Luke等人,1997;Hartikka等人,1996;美国专利No.5,846,946和6,451,769。设计这些实验来产生适当的对照,以优化浮萍-表达的BTV抗原的检测/定量。
将对于哺乳动物表达优化的BTV1VP2ORF(SEQ ID NO:2),对于哺乳动物表达优化的含有c-myc标签的BTV1VP2(SEQ ID NO:5),及对于哺乳动物表达优化的BTV1VP5ORF(SEQ ID NO:8)使用载体和插入子的EcoRV和XbaI位点克隆进质粒pVR1012,以分别产生pCG100,pCG101和pCG102。在使用阳离子脂质体2000(Invitrogen,Carlsbad CA)对CHO-K1细胞的瞬时转染之后,测量BTV1VP2蛋白(SEQ ID NO:4)和BTV1VP5蛋白(SEQ ID NO:10)的体外表达。将在6cm直径板中90%融合的CHO-K1用各5μg质粒和10μl阳离子脂质体,根据生产商的使用说明转染。转染之后,将细胞于含有1%SVF的MEM-glutamaxmedium(Invitrogen,CarlsbadCA)中培育24小时。收获培养上清液及由蛋白的TCA沉淀浓缩50倍。将细胞用PBS洗涤,通过刮收获,及使用Laemmli SDS-PAGE装载缓冲剂裂解。通过使全细胞提取物及浓缩的(50x)培养上清液经历SDS-PAGE和用针对VP2蛋白的兔多克隆抗体(GENOVAC,Freiburg,德国)或针对VP5蛋白的单克隆抗体(10AE12,Ingenasa,西班牙)蛋白印迹来分析重组蛋白产生和分泌。
将用于表达分析的单克隆抗体(自Ingenasa,西班牙提供的抗体AHSV10AE12)的表位定位到VP5蛋白的氨基酸85~92之内,不同环状病毒属(Orbivirus),如非洲马疫病毒(AHSV),蓝舌病毒(BTV)和流行性出血性疾病病毒(EHDV)之中的高度保守的区(Martinez-Torrecuadrada et al.Virology,257,449-459;1999)。这些表位定位结果提示,可将单克隆抗体用作组特定剂,及我们的结果指示,此观察是正确的。第二抗体是1/10000稀释的抗-小鼠IRDye800。
如显示于图5,在pCG102-转染的CHO细胞级分中,但非上清液中,由AHSV10AE12抗体特别检测到BTV1VP5。图7和8显示自不同BTV血清型的VP2上Pab L167和Pab L168的蛋白印迹结果。泳道分配是(1)标记物,(2)pVR1012,(3)pCG100(VP2BTV1),(4)pIV001(VP2BTV2),(5)pIV002(VP2BTV4),(6)pKMR003(VP2BTV8),(7)pCG030(VP2BTV9),及(8)pIV003(VP2BTV16)。
【实施例2:BTV浮萍表达载体的构建和植物的转化】
使用Biolex氏LEX系统TM,专利浮萍(Lemna minor)蛋白系统表达来自病原性BTV1分离物的浮萍-优化的BTV VP2(SEQ ID NO:3)和BTV VP5(SEQ ID NO:9)基因。如显示于图10,11,12,13和14,产生几种变体,包括表达VP2和VP5的载体(MerD01 &MerD02)和表达仅VP2的载体(MerD03 & MerD04)。
产生用于筛选的转基因系(表2)。转基因系产生之后,就在培养基和组织中BTV的表达对它们筛选。简言之,使植物在小研究容器中生长2周,并收集得到的培养基和组织用于分析。为组织分析,将冷冻的组织均质化,离心及移出上清液用于测定。
制备自含有BTV抗原的系的粗组织提取。全部步骤于4℃进行。将100g的冷冻的生物质(植物材料收获的自培养基)与200ml提取缓冲剂(50mM NaPO4,0.3M NaCl,10mm EDTA,pH7.4)混合,然后在韦林氏搅切器中用20s爆裂均质化4次,并在期间10~20s冷却。匀浆物于4℃以10,000×g离心30min,由通过乙酸纤维素滤器过滤澄清(0.22μm)。得到的匀浆物于4℃存储或在冰上用于立即测试。余下的匀浆物以等份于-80℃冷冻用于进一步分析。使用Bradford测定,用牛血清白蛋白作为标准物测定总可溶性蛋白(TSP)。
选择4个浮萍-BTV1表达系用于在初始筛选步骤之后剂量。选择表达的更高水平的VP2的系,由于VP2蛋白/抗原被认为显著贡献于含有所述蛋白/抗原的疫苗组合物的保护性免疫效应。使最高浮萍优化的如由对于BTV的蛋白印迹测定的表达VP2的系在剂量容器中生长,以提供在表征和动物研究中使用的生物质。
表2.BTV表达浮萍细胞系产生和筛选
构建体 |
描述 |
产生的系# |
筛选的系# |
MerD01 |
VP2+VP5 |
188 |
114 |
MerD02 |
VP2(优化的5‘UTR)+VP5 |
159 |
54 |
MerD03 |
VP2 |
299 |
184 |
MerD04 |
VP2(优化的5‘UTR) |
134 |
56 |
蛋白印迹用于测定浮萍-表达的BTV抗原的分子量(MW)。自浮萍的重组表达的多肽/抗原的制备的细节也见US专利申请公开US2004/261148。简言之,使100mg的冷冻的植物组织在1ml的提取缓冲剂中均质化(1:10比,w/v),离心及移出上清液用于测定。提取缓冲剂是通过向标准提取缓冲剂添加适当的量的TWEEN 80和/或甘油而获得的50mM NaPO4,0.3M NaCl,10mm EDTA,pH7.4。1.0%TWEEN 80,10%甘油,及1.0%TWEEN 80/10%甘油缓冲剂。将提取的样品在提取之后立即在SDS缓冲剂中混合,然后是在冰上2小时温育,之后是SDS缓冲剂,在冰上4小时温育,之后是SDS缓冲剂,1x,2x和3×冷冻-解冻,之后是SDS缓冲剂。然后将样品在还原性条件下在4~20%Tris-甘氨酸凝胶上解析。
测得,当检定VP5蛋白时,应将10%甘油加入提取缓冲剂。根据数据,VP5蛋白的聚集可能和使用蛋白印迹的定量可能低估了样品中存在的VP5蛋白的量(即由于蛋白在凝胶上不良好分离,残留的聚集物检测不到)。对于VP5表达检测,将VP5单克隆抗体克隆#10AE12用于蛋白印迹。蛋白印迹结果显示于图18。
使用SDS/PAGE考马斯光密度测定法(表3)和Agilent 2100生物分析仪方法(表4)定量VP2抗原。对于考马斯光密度测定法,将在标准考马斯-染色的SDS/PAGE凝胶上VP2抗原条带的密度与牛血清白蛋白(BSA)标准物比较。比较性光密度测定法然后产生VP2蛋白浓度。定量的SDS/考马斯光密度测定法结果显示于表3。
表3.SDS/考马斯光密度测定法结果
构建体 |
SV |
描述 |
抗原浓度(μg/ml) |
%TSP |
MerD01 |
53A |
VP2+VP5 |
78.2 |
3.36 |
MerD02 |
3K |
VP2(优化的5‘UTR)+VP5 |
48.1 |
2.72 |
MerD03 |
80A |
VP2 |
52.7 |
2.82 |
MerD04 |
11D |
VP2(优化的5‘UTR) |
65.8 |
2.82 |
除了SDS-PAGE考马斯光密度测定法之外,使用Agilent 2100生物分析仪定量BTV VP2。此仪器是设计用于测量尺寸及定量蛋白的基于芯片的系统。由将MW和条带强度与由生产商供给的标准蛋白阶梯比较来实现测量。结果显示于表4。
表4.浮萍-BTV1VP2系的表达水平
浮萍系 |
平均VP2抗原浓度(μg/ml) |
平均%TSP 1,2 |
MerD01 |
69.4 |
1.78 |
MerD02 |
59.0 |
3.16 |
MerD03 |
56.3 |
3.49 |
MerD04 |
60.2 |
2.67 |
1Agilent生物分析仪2100记录指示+/-10%误差。
2平均总可溶性蛋白在1.8和2.1mg/ml之间。
基于的这些结果,全部4个浮萍-BTV1系以接近50μg/ml靶或其以上的水平表达VP2抗原。
【实施例3:绵羊的疫苗接种】
待测试的疫苗/制剂显示于下表5。
表5
名称 |
疫苗剂量 |
抗原 |
佐剂 |
BTVPUR AlSap1* |
1mL |
商业BTV1抗原 |
氢氧化铝/皂苷1 |
BTV-浮萍1 |
1.2mL |
粗BTV1VP2/VP5(≈50μg) |
氢氧化铝/皂苷 |
BTV-浮萍2 |
1.2mL |
浓缩的BTV1VP2/VP5(≈200μg) |
氢氧化铝/皂苷 |
BTV-浮萍3 |
1.2mL |
粗BTV1VP2/VP5(≈50μg) |
Emulsigen/CpG2 |
BTV-浮萍4 |
1.2mL |
浓缩的BTV1VP2/VP5(≈200μg) |
Emulsigen/CpG |
BTVPUR AlSap1*:含有灭活的BTV1病毒的商业BTV疫苗。
氢氧化铝/皂苷1:一类晶体盐佐剂。
Emulsigen/Cp G
2:
是商业水包油佐剂。
将31只在D0时4和6月龄之间的雌性和雄性绵羊用于疫苗接种实验中。在D2,对31只绵羊个别称重,然后随机分配到5只绵羊的5组(G1~G5)和6只绵羊的1组(G6)。在D0和D21,自组G1的动物接收一个剂量的1mL的商业疫苗BTVPUR AlSap1及作为阳性对照动物。自组G2,G3,G4和G5的各动物接收一个剂量的1.2mL的BTV-浮萍组合物,如描述于表6。自组G6的动物保持不变,及作为阴性对照动物。在除了肘之外的胸部的右侧面,在D0,及在胸部的左侧面,在D21,由皮下途径进行疫苗注射。
表6
BTV1*攻击物质由在感染的绵羊收集的红细胞(RBC)组成,及于-70℃存储。
【实施例4:通过血清中和的抗体滴定】
在D-29,研究开始之前,基于ELISA滴定,全部绵羊针对BTV是阴性的,及由此包括。在D0,在疫苗接种之前,由SN(血清中和)测试确认它们的阴性血清学状态。贯穿研究的对于各处理组的平均抗体滴度(SN测试)显示于图25。
在取各直肠温度之后进行血测试。在第0天(第1免疫之前),D21(在第2疫苗接种之前),D35,D42(在攻击之前)和D56,在干管上对全部动物在颈静脉实施血样品。对血样品离心,以收获血清。将血清等分入2个样品,然后热灭活(于56℃实施30分钟),及以微孔板中1/3起始的3倍稀释测试。将100μl的稀释的血清于37℃温育1小时,伴随含有大致25TCID50病毒/孔的给定BTV血清型(BTV1)的病毒悬浮液的50微量滴定。然后将含有500,000细胞/mL的50μl的VERO细胞悬浮液添加到混合物,并将板于37℃温育7天。读板基于致细胞病变效应。通过在角度转化之后回归来计算以log10(PD50%)表达的血清滴度。大于0.48的滴度被认为是阳性的。
如显示于图25,在攻击之前及之后抗体滴度全部显著高于对照。
【实施例5:浮萍-产生的BTV疫苗的功效-定量RT-PCR测试】
在D42(在攻击之前),D47,D49,D51,D54和D56,通过用管颈穿刺对全部绵羊采血样。为了在血中检测及定量蓝舌病毒RNA,对这些样品进行由qRT-PCR测试的分析。使用商业试剂盒提取RNA之后,将RNA由热处理第1次变性。然后将一个等份(以一式两份)与TaqMan MGB探针,BTV特定引物和试剂根据说明温育用于扩增(Invitroge Super Script III Platinum One Step Kit)。BTV特定引物设计为杂交在保守的BTV区(在全部知道的BTV血清型之中保守的)之内的核酸序列。荧光信号与合成的DNA量成比例。通过与标准化的RNA样品比较来进行样品中BTV核酸的定量。RNA量表示为Log10数的RNA拷贝/mL血。
qRT-PCR结果显示于图26和下表7。全部绵羊被确认为在攻击之前(D42)对于BTV病毒RNA是阴性的。在G6(对照组),全部绵羊在攻击之后的全部分析日期是阳性的。个体病毒血症滴度在全部攻击后时期期间高,跨6.60~8.59log10RNA拷贝/mL。相反,全部免疫接种的动物在整个攻击后时期对于病毒血症保持阴性。由此在各免疫接种的组中的100%的动物中证明了病毒血症的阻止。在各免疫接种的组相比对照组中病毒血症的一般动力学显著减少(p=0.003)。
表7.用BTV1攻击后病毒血症
【实施例6:浮萍-产生的BTV疫苗的临床体征】
在D-2和D-1取全部动物的直肠温度,以使动物习惯操作,但不分析。使用弯脚规测量注射宽度(以cm),位点数,及局部反应。在以下时间记录临床体征:D0(在第1免疫之前),D0(4pm),D1,D2,D7,D14,D21(在第2疫苗接种之前),及D21(4pm),D22,D23,D28,D35。
在第42天,将冷冻的攻击株(BTV1)通过在温水中部分浸没来解冻,然后保持在压碎的冰上。用3mL的攻击株测试全部绵羊,在腹股沟区的多个注射点真皮内注射。在任何其他操作之前进行直肠温度测量。在测试之前在第42天,然后D47~D56每天测量全部动物的直肠温度。结果示于图21,22和23。如显示于图23,自D47起,对照组的平均直肠温度(G6)显著增加,在D42(攻击)和D48之间平均+0.9℃。相反,全部免疫接种的组的平均直肠温度未增加及贯穿监控的时期保持大致稳定。统计学比较展示,相比对照组G6,各免疫接种的组呈现显著更低最大过热(p<0.001)。
在D47~D56,每天对全部动物进行临床检查。临床体征包括:淤血耳,眼,鼻孔,唇,耳,眼,口,鼻孔,唇,及槽的膨胀,唾液分泌,叫,跛,咳嗽/呼吸困难,腹泻,流涕/结痂,瘀点,红斑和重量。以定性尺度特别评定动物的一般条件和行为:分值0分配为“良好条件”其是指动物完全健康,移动及注意力集中。分值1分配为“冷漠”,其是指动物保持彼此疏远及缓慢移动。分值2分配为“抑郁”,其是指动物处于与注意迹象相反的状态。分值3分配为“衰弱”,其是指动物处于侧卧及不动状态。重量表示为0表示正常,1表示瘦,及2表示消瘦。在攻击后的每天对各动物计算过热分值。过热分值计算如下:直肠温度≤40.0℃=分值0;40.0℃<直肠温度<41.0℃=分值1;41.0℃≤直肠温度<42.0℃=分值2;直肠温度≥42.0℃=分值4。通过合计过热分值,一般条件分值,身体条件分值,观察的特定临床体征数(观察的+1分每迹象),及随着攻击-相关的判断的预料不到的迹象数(记录的+1分每迹象)计算每天临床分值。对于各动物,由在攻击后时期(D47-D56)的总个体每日临床分值计算全局临床分值(GCS)。平均每天临床分值示于图24。结果显示,在D48,G6(对照组)中的平均每天临床分值达到峰值及保持高(5.8和6.5分之间)直到D51。此组中的GCS跨20~53分之间。但是,在免疫接种的组中,在整个研究中平均每天临床分值保持非常低(<1分),及对于一半的动物,个体GCS等于0或绝不超过的5。GCS的统计学比较展示了各免疫接种的组和对照组之间的显著差异(p<0.01)。
BTV-浮萍组合物/疫苗的功效评定指示,对于100%的免疫接种的动物的针对BTV攻击的强保护,和在全部免疫接种的动物中攻击之后病毒血症的完全防止。临床体征评定显示在疫苗接种后治疗-相关的一般反应的缺失,第1和第2注射之后满意的局部安全性,及满意的免疫应答。
【实施例7:在裂殖壶菌属(Schizochytrium)中BTV抗原的表达】
将密码子-优化的BTV VP2和VP5基因克隆进表达载体pAB0018(ATCC保藏号PTA9616)。BTV基因的特定核酸序列经优化用于在裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)中表达。另外地,表达载体含有赋予对裂殖壶菌属(Schizochytrium)转化体的抗性的选择标记物盒,来自裂殖壶菌属(Schizochytrium)天然基因而驱动转基因表达的启动子,及终止子。
将裂殖壶菌属(Schizochytrium sp.)(ATCC 20888)用作用含有BTV基因的表达载体,使用电穿孔方法转化的宿主。使裂殖壶菌属(Schizochytrium)的转基因株的冷冻浓储物生长在M50-20(描述于US 2008/0022422)上至汇合。将增长的裂殖壶菌属(Schizochytrium)培养物转移到50mL圆锥管及以3000g离心15min或以100,000g离心1小时。得到的沉淀和可溶性级分用于表达分析及动物攻击研究。
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由此描述了本发明的详细优选的实施方式,需知,由以上段落定义的发明不受以上描述所示的特定细节限制,可进行许多其明显的变异而不脱离本发明的精神或范围。
将本申请引用的文献中引用的或参考的全部文献,及本文引用的或参考的全部文献(“本文引用的文献”),及本文引用的文献中引用的或参考的全部文献,以及本文提及的任何产品的任何生产商的使用说明,描述,产物说明书,及产品书页或通过引用并入本文的任何文献通过引用并入本文,且可在本发明的实践中采用。
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