RS50830B - Sintetički domeni imunoglobulina sa vezujućim svojstvima izgrađenim u područjima molekula različitim od komplementarno određujućih područja - Google Patents

Abstract

Postupak za inženjering imunoglobulina koji obuhvaća modifikovano područje strukturne petlje da bi se osigurala ne-CDR vezujuće mesto i da bi se odredilo vezivanje navedenog imunoglobulina na epitopu antigena, pri čemu se nemodifikovano područje strukturne petlje značajno ne veže za navedeni epitopu, obuhvaćjući korake:- pribavljanja nukleinske kiseline koja dekodira imunoglobulin koji sadrži bar jedno područje strukturne petlje,- modifikovanja bar jednog nukleotidnog ostatka navedenog područja strukturne petlje postupkom mutageneze, pri čemu navedeno modifikovanjea) je postupak mutageneze odabran iz grupe koju čine nasumične, polu-nasumične, na određenom mestu usmereno nasumične, ispitivane mutageneze i kombinatorička dostignuća, ilib) je uključeno više od jedne strukturne petlje da bi se osigurala vezujuće mesto za navedeni epitop, ilic) je isključena ugradnja biološki aktivnog peptida od 2 do 40 amino kiselina u Fc domenu,- prenošenje navedene modifikovane nukleinske kiseline u ekspresijski sistem,- ekspresije navedenog modifikovanog imunoglobulina,- stavljanja u kontakt ekspresioniranog modifikovanog imunoglobulina sa epitopima, te- određivanja da li se navedeni modifikovani imunoglobulin vezuje za navedeni epitop.Prijava sadrži još 31 patentni zahtev.

Description

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za modifikovanje i proizvodnju modifikovanog imunoglobulina.

[0002] Opšte područje je modifikovanje proteina sa ciljem da ih se poboljša sa specifičnim svojstvima vezivanja. Pobliže, modifikovani proteini, o kojima se ovde radi, jesu imunoglobulini (antitela), i još bliže, jednostruki domeni ili parovi ili kombinacije jednostrukih domena imunoglobulina. Specifična svojstva vezivanja imunoglobulina su važne osobine, jer oni kontrolišu interakciju sa drugim molekulama kao što su antigeni, i omogućuju upotrebu imunoglobulina za dijagnostičke i terapeutske aplikacije.

[0003] Osnovna struktura antitela će se ovde objasniti upotrebom intaktnog IgGl imunoglobulina kao primer.

[0004] Dva identična teška (e. heavy, H) i dva identična laka (e. light, L) lanca se kombinuju tako da obrazuju molekul antitela oblika Y. Svaki teški lanac ima četiri domena. Amino terminalni varijabilni domeni (VH) prisutni su kod tipova Y. Nakon njih slijede tri konstantna domena: CH1, CH2 i karboksi terminalni CH3, pri bazi Y's korena. Kratko rastezanje, sklopka, povezuje varijabilna i konstantna područja teškog lanca. Zglob povezuje CH2 i CH3 (Fc fragment) s ostatkom antitela (Fab fragmenti). Jedan Fc i dva identična Fab fragmenta mogu se proizvesti proteolitičkim odcepljenjem od zgloba u intaktnom molekulu antitela. Laki lanci su konstruisani od dva domena, variabilnog (VL) i konstantnog (CL), odvojeni pomoću sklopke.

[0005] Disulfidne veze u zglobnom području povezuju dva teška lanca. Laki lanci su povezani s teškim lancima pomoću dodatnih disulfidnih veza. Ugljovodonične grupe povezane preko Asn, drže se na različitim položajima u konstantnim domenima, u zavisnosti od klase imunoglobulina. Za IgGl dve disulfidne veze u zglobnom području, između parova Cys235 i Cys238, ujedinjuju dva teška lanca. Laki lanci su povezani sa teškim lancima pomoću dve dodatne disulfidne veze, između Cys229s u CH1 domenima i Cys214s u CL domenima. Ugljovodonične grupe su povezane na Asn306 svake CH2, stvarajući naglašenu izbočinu u korenu Y.

[0006] Te osobine imaju duboke funkcionalne posledice. Varijabilna područja teških i lakih lanaca (VH) i (VL) leže kod "tipova" od Y, gde su oni smešteni tako da reaguju sa antigenom. Taj tip molekula je strana na kojoj se nalazi N-kraj aminokiselinske sekvence. Stuktura od Y strši na način da efikasno posreduje efektorske funkcije, kao što je aktivacija komplementa i interakcija s Fc receptorima, ili ADCC i ADCP. Njegovi CH2 i CH3 domeni strše za olakšavanje interakcije sa efektorskim proteinima. C-kraj aminokiselinske sekvence smešten je na suprotnoj strani tipa, koji se može nazvati "donji deo" od Y. Struktura intaktnog IgGl prikazana je na slici la.

[0007] Dva tipa lakog lanca, nazvani lambda( X)i kapa (k), pronađeni su u antitelima. Određeni imunoglobulin ima A. lance iliklance, nikad od svakog po jedan. Nije pronađena nikakva funkcionalna razlika između antitela koja imajuXiliklance.

[0008] Strukturna organizacija monomera glavne klase humanog imunoglobulina je prikazana na slici lb. Klase se razlikuju u sastavu i sekvenci njihovih dotičnih teških lanaca. Oba, IgM i IgE, nedostaje zglobno područje, ali svaki od njih sadrži domen ekstra teškog lanca (CH4). Brojevi i mesta disulfidnih veza (linije) koje povezuju lance razlikuju se među izotipovima. Oni se takođe razlikuju po raspodeli N-povezanih ugljovodoničnih grupa, simbolično prikazanih kao krugova.

[0009] Svaki domen u molekulu antitela ima sličnu strukturu od dve beta ploče pakirane tesno jedne nasuprot drugoj u sabijenoj antiparalelnoj beta bačvi. Ta konzervirana struktura je nazvana imunoglobulinski nabor. Imunoglobulinski nabor konstantnih domena sadrži 3-nitnu ploču pakiranu nasuprot 4-nitne ploče. Nabor je stabilizovan sa vodonikovom vezom između beta niti svake ploče, sa hidrofobnom vezom između ostataka suprotnih ploča u unutrašnjosti i sa disulfiđnom vezom između ploča. 3-nitna ploča sadrži niti C, F i G, a 4-nitna ploča ima niti A, B, E i D. Slova od A do G označavaju sekvencijalne položaje beta niti duž aminokiselinske sekvence imunoglobulinskog nabora.

[0010] Nabor varijabilnih domena ima 9 beta niti raspoređenih u dve ploče od po 4 i 5 niti. 5-nitna ploča je strukturno homologna sa 3-nitnom pločom konstantnih domena, ali sadrži i dodatne niti C i C". Preostale niti (A, B, C, D, E, F, G) imaju istu topologiju i sličnu strukturu kao i njihovi suprotni delovi u konstantnom domenu imunoglobulinskih nabora. DisulfiDNK veza povezuje niti B i F u suprotnim pločama, kao u konstantnim domenima. Imunoglobulinski nabor prikazan je na slici 2 za konstantni i varijabilni domen imunoglobulina.

[0011] Varijabilni domen oba imunoglobulinska lanca, lakog i teškog, sadrži tri hipervarijabilne petlje, ili područja koja određuju komplementarnost (e. complementaritv-determining regions, CDRs). Tri CDR-a od V domena (CDR1, CDR2, CDR3) skupljaju se najednom kraju beta bačve. CDR-i su petlje koje spajaju beta niti B-C, C'-C" i F-G imunoglobulinskog nabora. Ostaci u CDR-u se menjaju od jednog do drugog molekula imunoglobulina, i time daju antigensku specifičnost za svako antitelo.

[0012] VL i VH domeni kod tipova molekula antitela su tesno pakirani tako da 6 CDR-a (3 na svakom domenu) deluje zajedno u konstrukciji površine (ili gnijezda) za vezivanje specifično za antigen. Prirodno mesto vezivanja antigena u antitelu je stoga sastavljeno od petlji koje povezuju niti B-C, C'-C" i F-G lakog lanca varijabilnog domena i niti B-C, C'-C" i F-G teškog lanca varijabilnog domena.

[0013] Upotrebom 3D strukture proteina kao pomoć za konstrukciju, aminokiselinski ostaci smešteni na površini mnogih proteina se randomiziraju upotrebom strukture jezgra proteina kao kostura. Primeri za tu strategiju su opisani ili objavljeni u sledećim publikacijama koje su ovde uvrštene kao literatura: Nvgren PA, Uhlen M., Curr Opin Struct Biol. (1997) 7:463-9; Binz HK, Amstutz P, Kohl A, Stumpp MT, Briand C, Forrer P, Grutter MG, Pluckthun A. Nat Biotechnol. (2004) 22:575-82; Vogt M, Skerra A. Chembiochem. (2004) 5:191-9; US 6,562.617.

[0014] Osnovno načelo ove tehnike se temelji na opažanju da mnogi proteini imaju stabilno jezgro, nastalu specifičnim rasporedom sekundarnih strukturnih elemenata, kao što su beta ploče ili alfa uzvojnice, koje su međusobno povezane sa strukturama kao što su petlje, zavoji ili randomski namotaji. Tipično, ta tri posljednja strukturna elementa su manje presudni za ukupnu strukturu proteina, i aminokiselinski ostaci u tim strukturnim elementima mogu se zameniti često bez uništenja opšteg nabora proteina. Prirodno nastali primer za to konstrukcijsko načelo jesu CDR-i u antitelima. Veštački primeri uključuju lipokaline, ankirine i druge proteinske kosture.

[0015] Petlje, koje nisu CDR-petlje u urođenom imunoglobulinu, nemaju antigen koji veže ili epitop koji veže specifično, ali doprinosi pravilnom nabiranju celog imunoglobulinske molekula i/ili njegovog efektora ili drugih funkcionalnih grupa i zbog toga se u svrhu ovog pronalaska nazivaju strukturnim petljama.

[0016] U US patentu 6,294,654 je pokazano da se mogu proizvesti izmenjena antitela u kojima se peptidni antigen može ugraditi u ne-CDR petlju antitela (Ab) u CH1 područje između zglobnog područja i varijabilnog područja, a dobijeni Ab se može preuzeti u APC tako da je peptidni antigen prisutan na površini APC-a u kontekstu MHC II, te stoga uzrokuje imunološku reakciju. Ti umetnuti peptidi su epitopi i opšta struktura nosećeg molekula nije važna. Pokazano je da se ras peptid može staviti na (ne-CDR) petlju imunoglobulina i imunoglobulin će još uvek biti izlučen. U ćelijama postoji utvrđena "kontrola kvalitete" koja sprečava da se imunoglobulin izlučuje ako on nije pravilno nabran, i izmenjena aminokiselinska sekvenca petlje može uzrokovati nabiranjc proteina u strukturi koju će ćelija detektovati kao nepravilnu, te je stoga i razgraditi. Tako, pored prikazanih primera smatralo se da je teško dalje modificirati strukturne petlje bez izmene prirode imunoglobulina.

[0017] US patentna prijava 2004/0101905 opisuje vezivanje molekula koji sadrži ciljno mesto vezivanja i Fc efektorski peptid. Fc efektorski peptid je peptid koji deluje zajedno sa efektorskim molekulom. Pokazano je umetanje efektorskog peptida u ne-CDR petlju CH1-domena imunoglobuiinskog fragmenta.

[0018] Fc efektorski peptidi su strukture koje nastaju prirodnim putem u ne-CDR petljama antitela i stoga se očekuje da ona ne uništavaju strukturu imunoglobulina ako se kalemi na različita ekvivalentna mesta u imunoglobulinu.

[0019] Međutim, svaki peptid kalemljen u ne-CDR petlju prema ovoj publikaciji ima visoku mogućnost da postane neaktivan zbog različitog strukturnog okruženja koje je bilo odabrano.

[0020] U oba gore navedena dokumenta stanja tehnike se tvrdi da je teško umetnuti peptide u petlju koja bi trebala zadržati svoju strukturu i funkciju, jer je presudno da se ne naruši imunoglobulinska struktura nabora, budući da je to važno za funkciju i izlučivanje.

[0021] US patentne prijave 2004/0132101 i 2005/0244403 opisuju mutante imunoglobulina sa izmenjenim afinitetom vezivanja na efektorski ligand, koji su prirodni Ugandi za strukturne petlje antitela. U tim dokumentima su opisane brojne mutacije u raznim područjima po ćelom molekulu imunoglobulina koji utječe na efektorsku funkciju celog antitela.

[0022] WO 01/83525 se odnosi na proteine koji sadrže Fc domene kondenzovani na biološki aktivne peptide, pri čemu su spomenuti peptidi kondenzovani na Fc domene na njihovim N- ili C-krajevima.

[0023] US 2002/0106370 opisuje himerne polipeptide koji sadrže vezni deo koji pokazuje specifičan afinitet vezivanja za površinu eukariotske ciljne ćelije i efektorski deo.

[0024] WO 02/32925 opisuje proteine sposobne za sličnu funkciju antitela. Da bi se to postiglo, u spomenute proteine su takođe uvedene strukture petlji koji strukturom i položajem odgovaraju CDR petljama.

[0025] WO 2006/036834 opisuje molekule i metode u kojima su biološki aktivni peptidi ugrađeni u područje petlje Fc domena. Biološki aktivan peptid sa željenom biološkom aktivnošću se najprije odabere i zatim se uvede u Fc domene povezivanjem peptida na protein ili umetanjem dotične nukleinske kiseline u Fc domene koju kodira ta nukleinska kiselina.

[0026] Drugi dokumenti stanja tehnike pokazuju daje imunoglobulinu sličan kostur bio upotrebljen utoliko za svrhu modifikacije postojećeg mesta vezivanja antigena, da bi se time uvela nova svojstva vezivanja. Međutim, ukoliko, su samo CDR područja bila izmenjena u pogledu vezivanja antigena, drugim rečima, u slučaju nabora imunoglobulina, samo prirodno mesto vezivanja antigena može se modifikovati da bi se promenio njegov afinitet ili specificičnost vezivanja. Postoji obilna literatura koja opisuje različite formate takvih modifikovanih imunoglobulina, često izraženih u obliku Fv fragmenata (scFv) jednostrukog lanca ili Fab fragmenata, prikazanih na površini čestica faga ili pomoću topivosti izražene u raznim prokariotskim ili eukariotskim sistemima ekspresije. Među vodećim autorima u tom području jesu Greg Winter, Andreas Pllickthun i Hennie Hoogenboom.

[0027] Cilj predmetnog pronalaska je osigurati imunoglobuline sa uvedenim novim mestima vezivanja antigena, i metode za modifikaciju i proizvodnju spomenutih imunoglobulina.

[0028] Zbog toga se predmetni pronalazak odnosi na postupak modifikacije imunoglobulina, koji uključuje modifikaciju u strukturnom području petlje za dobijanje ne-CDR mesta vezivanja i određivanje vezivanja spomenutog imunoglobulina na epitopu antigena, pri čemu se nemodifikovano strukturno područje petlje ne veže značajno na spomenuti epitop, a taj postupak uključuje sledeće korake: - osiguravanje nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulin koji uključuje najmanje jedno strukturno područje petlje, - modificikaciju najmanje jednog nukleotidnog ostatka u najmanje jednom navedenom strukturnom području petlje pomoću mutageneze, pri čemu navedena modifikacija je ili: a) pomoću postupka mutageneze koja je odabrana od randomske, polu-randomske. randomiziranja direktno na mestu, skeniranja mutageneze i

kombinacijskog pristupa, ili

b) više od jedne strukturne petlje kako bi se dobilo vezivanje na samom mestu na navedeni epitop, ili c) isključivanjem ugradnje biološki aktivnog peptida od 2 do 40 amino kiselina na Fc domenu.

- prenos navedene modificirane nukleinske kiseline u sistem ekspresije,

- ekspresiju navedenog modifikovanog imunoglobulina,

- dovođenje u dodir ekspresioniranog modifikovanog imunoglobulina sa epitopom, i - utvrđivanje da li se navedeni modifikovani imunoglobulin veže za navedeni epitop.

[0029] Posebno, navedeni postupak modifikacije uključuje vezivanje imunoglobulina specifično za epitop antigena odabranog iz grupe koju čine alergeni, antigeni povezani sa tumorom, samo-antigeni, enzimi, bakterijski antigeni, gljivični antigeni, antigeni protozoa i virusni antigeni. Pomoću modifikacije u strukturnom području petlje imunoglobulin se može konstrukcijski vezati na epitop. U poželjnom rešenju, imunoglobulin se veže specifično na najmanje dva takva epitopa, koja se razlikuju jedan od drugog, i oni su od istog antigena ili su od različitih antigena.

[0030] Na primer, postupak koji se odnosi na modifikaciju vezivanja imunoglobulina specifično na najmanje jedan epitop i uključuje najmanje jednu modifikaciju u najmanje jednom strukturnom području petlje spomenutog imunoglobulina i određuje specifično vezivanje navedenog najmanje jednog područja petlje na najmanje jedan drugi epitop, pri čemu je epitop odabran iz grupe gore navedenih antigena, i pri čemu se nemodifikovano strukturno područje petlje (ne-CDR područje) veže specifično za navedeni najmanje jedan drugi epitop, uključuje korake: - osiguravanje nukleinske kiseline koja kodira specifično vezivanje imunoglobulina na najmanje jedan prvi epitop koji uključuje najmanje jedno strukturno područje petlje, - modificiranje najmanje jednog nukleotidnog ostatka od najmanje jednog navedenog područja petlje kodiranog sa navedenom nukleinskom kiselinom,

- prenos navedene modifikovane nukleinske kiseline u sistem ekspresije,

- ekspresiju navedenog modifikovanog imunoglobulina,

- dovođenje u dodir ekspresioniranog modifikovanog imunoglobulina sa navedenim najmanje jednim drugim epitopom, i - utvrđivanje da li se navedeni modifikovani imunoglobulin veže specifično na drugi epitop.

[0031] Postupak prema pronalasku se odnosi prvenstveno na najmanje jednu modifikaciju u najmanje jednom strukturnom području petlje navedenog imunoglobulina i na utvrđivanje specifičnog vezivanja navedenog najmanje jednog područja petlje na najmanje jedan antigen odabran iz grupe koju čine alergeni, antigeni povezani sa tumorom, samo-antigeni, enzimi, bakterijski antigeni, gljivični antigeni, virusni antigeni i antigeni protozoa, pri čemu se imunoglobulin koji sadrži nemodifikovano strukturno područje petlje ne veže specifično na taj navedeni najmanje jedan antigen.

[0032] Pojam "imunoglobulini" prema predmetnom pronalasku koji se treba modifikovati (kako se ovde koristi, pojmovi imunoglobulin i anfttelo se ovde mogu međusobno zameniti) može pokazati mono- ili multispecifična ili muttivalentna svojstva vezivanja, najmanje dva, prvenstveno najmanje tri specifična mesta vezivanja za epitope npr. antigena, efektorskih molekula/proteina. Imunoglobulini prema pronalasku su takođe funkcionalni fragmenti koji su prihvaćeni u struci, kao što su Fc. Fab, scFv, dimeri jednostrukog lanca od CH/CL domena, Fv ili drugi derivati ili kombinacije imunoglobulina, domeni teških i lakih lanaca varijabilnog područja (kao što je Fd, VI, Vk, Vh) i konstantno područje intaktnog antitela kao što je CH1, CH2, CH3, CH4, C-lambda i C-kapa, kao takođe i minidomena koji se sastoji od dve beta-niti imunoglobulinskog domena povezane sa strukturnom petljom.

[0033] Podrazumeva se da pojam "imunoglobulin", "modifikovani imunoglobulin" ili "imunoglobulin prema pronalasku" uključuje takođe i derivate imunoglobulina. Derivat je bilo koja kombinacija jednog ili više imunoglobulina prema pronalasku i/ili fuzijski protein u kojem se bilo koji domen iii minidomen imunoglobulina prema pronalasku može fuzionirati na bilo koji položaj jednog ili više drugih proteina (kao što su drugi imunoglobulini, ligandi, proteini kostura, enzimi, toksini i slično). Derivat imunoglobulina prema pronalasku može se takođe dobiti vezivanjem na druge supstance raznim hemijskim tehnikama kao što je kovalentno vezivanje, elektrostatička interakcija, disulfidno vezivanje itd.

[0034] Druge supstance povezane za imunoglobuline mogu biti lipidi, ugljovodonici, nukleinske kiseline, organski i neorganski molekuli ili njihova bilo koja kombinacija (npr. PEG, prolekovi ili lekovi). Derivat je takođe imunoglobulin sa istom aminokiselinskom sekvencom, ali izgrađen potpuno ili delomično od ne-prirodnih ili hemijski modifikovanih amino kiselina.

[0035] Modifikovani molekuli prema predmetnom pronalasku upotrebit će se kao samostojeći proteini, takođe kao i fuzijski proteini ili derivati, najčešće tipično fuzionirani na takav način da postanu deo većih struktura antitela ili celih antitela mo-delovanja, disulfidno vezivanje itd.

[0036] Druge supstance povezane za imunoglobuline mogu biti lipidi, ugljovodonici, nukleinske kiseline, organski i neorganski molekuli ili njihova bilo koja kombinacija (npr, PEG, prolekovi ili lekovi). Derivat je takođe imunoglobulin sa istom aminokiselinskom sekvencom, ali izgrađen potpuno ili delomično od ne-prirodnih ili hemijski modifikovanih amino kiselina.

[0037] Modifikovani molekuli prema predmetnom pronalasku upotrebit će se kao samostojeći proteini, takođe kao i fuzijski proteini ili derivati, najčešće tipično fuzionirani na takav način da postanu deo većih struktura antitela ili celih molekula antitela, ili njihovi delovi kao što su Fab fragmenti, Fc fragmenti, Fv fragmenti i drugo. Proteini koji su proizvod modifikacije moći će se upotrebiti za dobijanje molekula koji su monospecifični, bispecifični, trispecifični, i koji možda mogu istovremeno nositi više specifičnosti, te će biti moguće istovremeno kontrolisati i izvršiti prethodnu selekciju valence vezivanja u skladu sa zahtevima planirane upotrebe takvih molekula.

[0038] Prema predmetnom pronalasku, područja vezivanja za antigene ili za mesta vezivanja antigena svih vrsta alergena, antigena povezanih sa tumorom, samo-antigena, enzima, bakterijskih antigena, gljivičnih antigena, antigena protozoa i virusnih antigena mogu se uvesti u strukturnu petlju date strukture antitela.

[0039] Pojam "antigen" prema predmetnom pronalasku znači molekuli ili strukture za koje se zna da ulaze u interakciju ili da mogu ući u interakciju sa područjem CDR-petlje imunoglobulina. Strukturna područja petlji prema stanju tehnike ne ulaze u interakcije sa antigenima, već ona više doprinose ukupnoj strukturi i/ili vezivanju na efektorske molekule.

[0040] Pojmovi "alergeni, antigeni povezani sa tumorom, samo-antigeni, enzimi, bakterijski antigeni, gljivični antigeni, antigen protozoa i virusni antigeni" prema predmetnom pronalasku uključuju sve alergene i antigene koji se mogu prepoznati sa strukturom antitela, i fragmente takvih molekula (posebno podstrukture koje se uopštenito spominju kao "epitopi" (npr. epitopi B-ćelije)), sve dok su one imunološki relevantne, tj. dok ih takođe mogu prepoznati priroDNK ili monoklonska antitela.

[0041] Pojam "epitop" prema predmetnom pronalasku znači molekulska struktura koja može u celosti sastaviti specifičnog učesnika vezivanja ili biti deo specifičnog učesnika vezivanja na domenu vezivanja ili imunoglobulin predloženog pronalaska.

[0042] Hemijski, epitop može ili obuhvatiti ugljovodonik, peptid, masnu kiselinu, neorgansku supstancu ili njegove derivate i bilo koje njegove kombinacije. Ako je epitop polipeptid, on će u peptidu uobičajeno uključiti najmanje 3 amino kiseline, prvenstveno 8 do 50 amino kiselina, i naročito između oko 10-20 amino kiselina u peptidu. Gornja granica dužina peptida nije presuDNK i ona može obuhvatiti gotovo celu dužinu polipeptidne sekvence. Epitopi mogu biti linearni ili konformacijski epitopi. Linearni epitop je sastavljena od jednog segmenta primarne sekvence polipeptidnog lanca. Linearni epitopi mogu biti susedni ili se mogu preklapati. Konformacijski epitopi su sastavljene od amino kiselina koje su sakupljene zajedno nabiranjem polipeptida tako da obrazuju tercijarnu strukturu i amino kiseline nisu nužno međusobno susedne, jeDNK prema drugoj u linearnoj sekvenci.

[0043] Specifično, epitopi su bar deo dijagnostički relevantnih molekula, tj. odsutnost ili prisutnost epitopa u uzorku je u kvalitativnoj ili kvantitativnoj korelaciji sa obolenjem ili sa zdravstvenim stanjem ili sa stanjem procesa u proizvodnji ili u okolini i u pogledu stanja hrane. Epitopi mogu takođe biti bar deo terapeutski relevantnih molekula, tj. molekula na koje se može ciljati sa specifičnim domenima vezivanja koje menjaju tok bolesti.

[0044] "Alergeni, sa tumorom povezani antigeni, samo-antigeni, enzimi, bakterijski antigeni, gljivični antigeni, antigeni protozoa i virusni antigeni" kojima se daje prednost su oni alergeni ili antigeni, za koje je bilo provjereno dajesu ili da mogu biti imunološki ili terapeulski važni, posebno oni za koje je ispitana klinička đelotvornost.

[0045] S druge strane, u skladu s drugim oblikom predmetnog pronalaska u strukturna područja petlji mogu se takođe uvesti i druge sposobnosti vezivanja, npr. sposobnosti vezivanja za male molekule, kao što su lekovi ili enzimi, katalitička mesta enzima ili enzimski supstrati ili za analog prelaznog stanja enzimskog supstrata.

[0046] Prvenstveno, novo mjesto vezivanja antigena u strukturnoj petlji je nepoznato nemodifikovanom imunoglobulinu. Stoga, ciljevi kao što su efektorski molekuli ili Fc-rcccptori su prvenstveno isključeni iz veznih molekula i specifičnosti imunoglobulina prema pronalasku.

[0047] Prvenstveno, nova mesta vezivanja antigena u strukturnoj petlji su uvedena supstitucijom, brisanjem i/ili umetanjem imunoglobulina kodiranog sa odabranom nukleinskom kiselinom.

[0048] U skladu sa drugim poželjnim rešenjem predmetnog pronalska, rezultat modifikacije najmanje jednog nukleotida je supstitucija, brisanje i/ili umetanje imunoglobulina kodiranog sa navedenom nukleinskom kiselinom.

[0049] Modifikacija najmanje jednog područja petlje može imati za posljedicu u supstituciji, brisanju i/ili umetanju jedne ili više amino kiselina, prvenstveno mutaciju u tački, izmjenu cele petlje, a naročito izmenu najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 i sve do 30 amino kiselina.

[0050] Takođe prednost se daje mestu usmerenom randomskoj mutaciji. Tom metodom se jedan ili više ostataka specifične amino kiseline petlje zamenjuje ili uvodi upotrebom randomski stvorenih umetaka u takve strukturne petlje. Alternativno, prednost se daje upotrebi kombinovanih pristupa.

[0051] Najmanje jedno područje petlje se prvenstveno mutira ili modificira randomski, semi-randomski ili, posebno postupcima ranđomske mutageneze usmerene prema mestu. Ti se postupci mogu upotrebiti za dobijanje aminokiselinskih modifikacija na željenim položajima imunoglobulina predmetnog pronalaska. U tim slučajevima položaji se biraju randomski, ili se izmene amino kiselina vrše upotrebom jednostavnih pravila. Na primer, svi ostaci se mogu mutirati u alanin, što se spominje kao alaninsko pretraživanje. Takvi postupci se mogu povezati sa složenijim pristupima inženjeringa koji koristi metode selekcije za pretraživanje viših nivo različitosti sekvenci. Postupak kome se daje prednost prema pronalasku odnosi se na randomski modifikovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži najmanje jednu nukleotidnu ponavljajuću jedinicu koja ima sekvencu 5'-NNS-3\ 5'-NNN-3' ili 5'-NNK-3\

[0052] Randomski modifikovani molekuli nukleinske kiseline može sadržati gore navedene ponavljajuće jedinice koje kodiraju za sve poznate prirodno nastale amino kiseline.

[0053] U struci je dobro poznato da postoje razne tehnologije selekcije koje se mogu upotrijebiti za identifikaciju i izolaciju proteina sa određenim karakteristikama vezivanja i afinitetima, uključivši na primer, tehnologije pokazivanja, kao što je pokazivanje faga, pokazivanje ribosoma, pokazivanje površine ćelije, i slično, kako je dole opisano. Postupci proizvodnje i pretraživanja varijanti antitela su dobro poznate u struci. Opšte metode molekularne biologije za antitela, ekspresiju, čišćenje i pretraživanje opisane su u Antibodv Engineering, izdanje Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001; i Havhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689; Mavnard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76.

[0054] "Strukturna petlja" ili "ne-CDR-petlja" prema predmetnom pronalasku podrazumeva se na sledeći način: imunoglobulini su sastavljeni od domena sa takozvanim imunoglobulinskim naborom. U suštini, anti-paralelne beta ploče su povezane sa petljom tako da obrazuju sabijenu antiparalelnu beta bačvu. U varijabilnom području neke petlje domena bitno doprinose specifičnosti antitela, tj. vezivanju na antigen. Te petlje se zovu CDR-petlje. Sve druge petlje domena antitela više doprinose strukturi molekule i/ili efektorskoj funkciji. Te petlje su ovde definisane kao strukturne petlje ili ne-CDR-petlje.

[0055] Molekuli nukleinskih kiselina koje kodiraju modifikovane imunoglobuline (i koji su uvek uključeni dole kroz celi opis: imunoglobulinski fragmenti) mogu se klonirati u ćelije domaćina, ekspresovati i ispitati u pogledu njihove specifičnosti vezivanja. Te čestice se izvode upotrebom dobro poznatih postupaka, i mnoge metode koje se mogu upotrebiti u predmetnom pronalasku opisane su u Molecular Cloning-A Laboratorv Manual, 3.sup.rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratorv Press, Ne\v York, 2001), i Current Protocols in Molecular Biologv (John Wiley & Sons). Nukleinske kiseline koje kodiraju modificirane imunoglobuline predmetnog pronalaska mogu se ugraditi u vektor ekspresije za ekspresiju navedenih imunoglobulina. Vektori ekspresije tipično uključuju imunoglobulin koji je radno povezan, to jest postavljen je u funkcionalan odnos, sa kontrolnim ili regulatorskim sekvencama, selektivnim markerima, bilo kojim učesnicima fuzije i/iii dodatnim elementima. Modifikovani imunoglobulini predmetnog pronalaska mogu se proizvesti uzgojem ćelija domaćina transformisanih sa nukleinskom kiselinom, prvenstveno vektorom ekspresije, koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira modifikovane imunoglobuline, pod odgovarajućim uslovima za izazivanje ili uzrokovanje ekspresije modifikovanih imunoglobulina. Postupci uvođenja egzogenih molekula nukleinskih kiselina u domaćina su dobro poznate u struci, i one će zavisiti od upotrebljenom domaćinu. Naravno, za ekspresiju modifikovanih imunoglobulina takođe se mogu upotrebiti bez-ćelijski ili sistemi ekspresije bez ćelija.

[0056] U poželjnom rešenju predmetnog pronalaska, modifikovani imunoglobulini se očiste ili izoluju nakon ekspresije. Modifikovani imunoglobulini se mogu izolovati ili očistiti na mnogo načina koji su stručnjaku poznati. Standardne metode čišćenja uključuju hromatografske tehnike, elektroforetske tehnike, imunološke tehnike, taloženje, dijalizu, flltraciju, koncentracija i hromatofokusiranje. Čišćenje se često može postići sa posebnim učesnikom fuzije. Na primer, antitela se mogu očistiti upotrebom glutationske smole ako se koristi GST fuzija, Ni<+2>afinitetnom hromatografijom ako se koristi His-tag ili sa imobilizisanim anti-flag antitelom ako se koristi flag-tag. Za opšte upućivanje u pogledu prikladnih tehnika čišćenja, vidi Antibodv Purification: Principles and Practice, 3.sup.rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994. Naravno, modifikovani imunoglobulini prema predmetnom pronalasku mogu se takođe ekspresionirati na površini domaćina, posebno na površini stanica bakterija, insekata ili gljivica ili na površini faga ili virusa.

[0057] Modifikovani imunoglobulini mogu se pretražiti upotrebom raznih metoda, koje uključuju, ali se ne ograničavaju samo na one koje se koriste u eksperimentima in vitro, in vivo i u eksperimentima koji se temelje na ćelijama, i tehnologijama selekcije. U postupcima pretraživanja mogu se koristiti automatizovane i visokopropustljive tehnologije pretraživanja. Za pretraživanje se može upotrebiti učesnik fuzije ili obeležavanja, na primer enzim, sredstvo za imunološko obeležavanje, obeležavanje s izotopom ili obeležavanje sa malim molekulima kao što su fluorescentne ili kolorimetrijske boje ili luminogeni molekuli.

[0058] U poželjnom rešenju, funkcionalna i/ili biofizička svojstva imunoglobulina su ispitana analizom in vitro. U poželjnom rešenju, antitelo je pretraženo u polgedu funkcionalnosti, na primer u pogledu njegove sposobnosti da deluje katalitički na reakciju ili u pogledu njegovog afiniteta vezivanje na njegov cilj.

[0059] U analizama se mogu upotrebiti razni postupci detekcije koji uključuju, ali nisu ograničeni samo na hromogeno, fluorescentno, luminiscentno ili obeležavanje sa izotopima.

[0060] Kao što je poznato u struci, podgrupa metoda pretraživanja su one koje su odabrane za povoljne članove biblioteke. Te metode se ovde spominju kao "metode selekcije", i one se u predmetnom pronalasku koriste za pretraživanje modifikovanih imunoglobulina. Kada se biblioteke imunoglobulina pretražuju upotrebom metode selekcije, propagiraju se, izoluju i/ili promatraju samo oni članovi biblioteke kojima se daje prednost, to jest oni koji ispunjavaju neke od kriterijuma selekcije. Kao što će se oceniti, budući da se posmatra samo većina pristalih varijanta, takva metoda omogućuje pretraživanje biblioteka koje su veće od onih koje se mogu pretražiti metodom ispitivanja pristajanja pojedinačnih članova biblioteke. Selekciju omogućuje svaka metoda, tehnika ili učesnik fuzije koji povezuje kovalentno ili nekovalentno fenotip imunoglobulina sa njegovim genotipom, to jest funkciju antitela sa nukleinskom kiselinom koja ga kodira. Na primer, upotreba pokazivanja faga kao metode selekcije omogućuje fuziju članova biblioteke na gen III. protein. Na taj način, selekcija ili izolacija modifikovanih imunoglobulina koji ispunjavaju neke kriterij ume, na primer afinitet vezivanja na imunoglobulinski cilj, takođe se bira ili izoluje nukleinsku kiselinu koja ga kodira. Kada se jednom izoluje, gen ili geni koji kodiraju modifikovane imunoglobuline mogu se zatim povećati. Taj proces izolacije i povećanja, koji se spominje kao ispiranje, može se ponoviti, čime se omogućuje obogaćivanje varijanta povoljnog antitela u biblioteci. Sekvenciranje nukleinske kiseline povezane nukleinske kiseline omogućuje na kraju identifikaciju gena.

[0061] U struci je poznatno mnoštvo metoda selekcije koje se mogu upotrebiti u predmetnom pronalasku za pretraživanje imunoglobulinskih biblioteka. One uključuju, ali nisu ograničene samo na pokazivanje faga (Phage displav of peptides and antibodies: a laboratorv manuel, Kay et al., 1996, Academic Press, San Diego, Califi, 1996; Lovvman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832-10838; Smith, 1985, Science 228:1315-1317) i njegovih derivata kao što je selektivna infekcija faga (Malmborg et al., 1997, J Mol Biol 273:544-551), selektivno infektivan fag (Krebber et a!., 1997, J Mol Bio! 268:619-630), i usporeno infektivno ispiranje (Benhar et al., 2000, J Mol Biol 301:893-904), pokazivanje površine ćelije (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399) kao što je pokazivanje na bakterijama (Georgiou et al., 1997, Nat Biotechnol 15:29-34; Georgiou et al., 1993, Trends Biotechnol 11:6-10; Lee et al., 2000, Nat Biotechnol 18:645-648; Jun et al„ 1998, Nat Biotechnol 16: 576-80), gljivicama (Boder & Wittrup, 2000, Metodas Enzvmol 328:430-44; Boder & VVittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553-557), i ćelijama sisara (Whitehorn et al., 1995, Bio/technology 13:1215-1219), takođe kao i tehnologije in vitro pokazivanja (Amstutz et al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:400-405) kao stoje pokazivanje polizoma (Mattheakis et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026), pokazivanje ribozoma (Hanes etal., 1997, Proc Natl Acađ Sci USA 94:4937-4942), pokazivanje mRNK (Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:12297-12302; Nemoto et al., 1997, FEBS Lett 414: 405-408), i sistem pokazivanja inaktivacije ribozoma (Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc 124, 538-543).

[0062] Druge metode selekcije koje se mogu upotrebiti u predmetnom pronalasku uključuju metode koje se ne oslanjaju na pokazivanje, kao što su metode in vivo koje uključuju, ali nisu ograničene samo na periplazmičku ekspresiju i citometrijsko pretraživanje (Chen et al., 2001, Nat Biotechnol 19:537-542), analiza komplementacije fragmenta antitela (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:10340-10344; Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:12141-12146), i pretraživanje dva gljivična hibrida (Fields & Song, 1989, Nature 340:245-246) upotrebljeno u metodi selekcije (Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:11723-11728). U alternativnom rešenju, selekcija je moguća pomoću učesnika fuzije koji se veže na specifičnu sekvencu na vektoru ekspresije, i tako povezuje kovalentno ili nekovalentno učesnika fuzije i povezanu Fc varijantu člana biblioteke sa nukleinskom kiselinom koja ga kodira. Na primer, PCT WO 00/22906; PCT WO 01/49058; PCT WO 02/04852; PCT WO 02/04853; PCT WO 02/08023; PCT WO 01/28702; i PCT WO 02/07466 opisuju takve učesnike fuzije i tehnike koje se mogu upotrebiti u predmetnom pronalasku. U alternativnom rešenju, do in vivo selekcije može doći ako ekspresija antitela utiče u nekoj meri na rast, reprodukciju ili na prednost ćelije u pogledu preživaljavanja.

[0063] Podgrupa metoda selekcije koje se navode kao metode "usmerene evolucije" su one koje uključuju pletenje ili stvaranje povoljnih sekvenci tokom selekcije; ponekad sa ugradnjom novih mutacija. Kao što će stručnjak proceniti, metoda usmerene evolucije može olakšati identifikaciju najpovoljnijih sekvenci u biblioteci, a ona može povećati različitost sekvenci koje se pretražuju. U struci je poznato mnoštvo metoda umjerene evolucije koje se mogu upotrebiti u predmetnom pronalasku za pretraživanje varijanta antitela, koje uključuju, ali nisu ograničene samo na menjanje položaja DNK (PCT WO 00/42561 A3; PCT WO 01/70947 A3), menjanje položaja eksona (U.S. Pat. br. 6,365,377; Kolkman & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19:423-428), menjanje položaja porodice (Crameri et al., 1998, Nature 391:288-291; U.S. Pat. br. 6,376,246), RACHITT.TM. (Coco et al., 2001, Nat Biotechnol 19:354-359; PCT WO 02/06469), STEP i randomsko prajmiranje in vitro rekombinacije (Zhao et al., 1998, Nat Biotechnol. 16:258-261; Shao et al., 1998, Nucleic acids Res 26:681-683), slaganje gena posredstvom eksonukleaze (U.S. Pat. br. 6,352,842; U.S. Pat. br. 6,361,974), Gene Site Saturation Mutagenesis. TM. (U.S. Pat. br. 6,358,709), Gene Reassembly. TM.

(U.S. Pat. br. 6,358,709), SCRATCHY (Lutz et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:11248-11253), metoda fragmentacije DNK (Kikuchi et a!., Gene 236: 159-167), mienjanje položaja jednonitne DNK (Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133-137), i tehnologija modifikacije evolucije antitela usmerena na AMEsistem. TM. (Applied Molecular Evolution), (U.S. Pat. br. 5,824,514; U.S. Pat. br. 5,817,483; U.S. Pat. br. 5,814,476; U.S. Pat. br. 5,763,192; U.S. Pat. br. 5,723,323).

[0064] U poželjnom rešenju se varijante antitela mogu pretaživati upotrebom jednog ili više analiza koji se temelje na stanicama ili in vivo. Za takve analize, očišćeni ili neočišćeni modifikovani imunoglobulini se tipično dodaju egzogeno tako da se ćelije izlažu pojedinačnim imunoglobulinima ili talozima imunoglobulina koji pripadaju biblioteci. Te se analize tipično, ali ne i uvek, temelje na funkciji imunoglobulina; to jest, sposobnosti antitela da se veže na svoj cilj i da posreduje neki biohemijski dogođaj, na primer efektorsku funkciju, inhibiciju vezivanja liganda/receptora, apoptozu i slično. Takvi analize često uključuju posmatranje reakcije ćelija na antitelu, na primer preživljavanje ćelija, smrt ćelija, izmenu morfologije ćelija ili transkripcijsko delovanje takve ekspresije ćelija iz prirodnog gena ili reporterskog gena. Na primer, takvim analizama može se meriti sposobnost varijante antitela da izazove ADCC, ADCP, ili CDC. Za neke analize može biti potrebno dodati dodatne ćelije ili komponente, to jest dodatno uz ciljne ćelije, na primer serumski komplement, ili efektorske ćelije kao što su monociti periferne krvi (PBMCs), NK ćelije, makrofagi i slično. Takve dodatne ćelije mogu biti iz bilo kog organizma, prvenstveno ljudskog, iz miša, pacova, zeca i majmuna. Imunoglobulini mogu uzrokovati apoptozu određenih ćelijskih linija koje ekspresioniraju ciij, ili one mogu posredovati napad na ciljne ćelije sa imunološkim ćelijama koje su se dodale u analizi. Metode za posmatranje smrti ćelija ili sposobnosti za život su u struci poznate i one uključuju upotrebu boja, imunohemikalija, citohemikalija i radeoaktivnih reagenasa. Na primer, analize obojenja kaspaze mogu omogućiti merenje apoptoze, i vezivanje ili oslobađanje radeoaktivnih supstance ili fluorescentnih boja, kao što je alamar plavo, što može omogućiti praćenje rasta ćelija ili aktivacije. U poželjnom rešenju može se upotrebiti DELFIA. RTM. analiza citotoksičnosti na osnovi EuTDA (Perkin Elmer, MA). Alternativno, smrt ili oštećenje ciljne ćelije može se pratiti merenjem oslobađanja jednog ili više prirodnih intracelularnih komponenata, na primer laktat dehidrogenaze. Transkripcijska aktivacija može takođe poslužiti kao metoda za ispitivanje funkcije u analizama koje se temelje na ćelijama. U tom slučaju, reakcija se može pratiti ispitivanjem prirodnih gena ili imunoglobulina koji mogu biti nadregulisani, može se meriti na primer oslobađanje određenih interleukina, ili se alternativno može očitati preko reporterskog konstrukta. Analize koji se temelje na stanicama mogu takođe uključiti merenje morfoloških promena stanica kao reakcije na prisutnost modifikovanih imunoglobulina. Tipovi ćelija za takve analize mogu biti prokariotski ili eukariotski, a u struci je poznato da se mogu upotrebiti razne ćelijske linije. Alternativno, pretraživanje na temelju ćelija može se izvesti upotrebom ćelija koje su se transformisale ili transfektirale sa nukleinskim kiselinama koje kodiraju varijante. To jest, varijante antitela se ne dodaju egzogeno u ćelije. Na primer, u jednom rešenju, za pretraživanje na temelju ćelija koristi se pokazivanje površine ćelija. Može se upotrebiti učesnik fuzije koji omogućuje pokazivanje modifikovanih imunoglobulina na površini ćelije (VVitrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399).

[0065] U poželjnom rešenju, imunogenost modifikovanih imunoglobulina može se utvrditi eksperimentalno upotrebom jednog ili više analiza koje se temelje na ćelijama. U poželjnom rešenju, za eksperimentalno kvantitativno utvrđivanje imunogenosti koriste se analize aktivacije T-ćelije ex vivo. Po tom postupku, antigen koji predstavlja ćelije i prirodne T ćelije iz sparenih donora se pobuđuju jednom ili više puta sa peptidom ili sa celim dotičnim antitelom. Zatim se aktivacija T ćelija može dokazati upotrebom brojnih postupaka, na primer praćenjem proizvodnje citokina ili merenjem utroška triciranog timidina. U najpoželjnijem rešenju, proizvodnja interferona gama prati se primenom analize Elispot (Schmittel et. al., 2000, J. Immunol. Meth., 24: 17-24).

[0066] Biološka svojstva modifikovanih imunoglobulina predmetnog pronalaska mogu se okarakterisati u analizma sa ćelijom, tkivom i u ćelom organizmu. Kao stoje u struci poznato, lekovi se često ispituju na životinjama, koje uključuju, ali nisu ograničene samo na miševe, pacove, zečeve, pse, mačke, svinje i majmune, za merenje delotvornosti leka za lečenje bolesti ili modela bolesti, ili za merenje farmakokinetike, toksičnosti i drugih svojstava. Životinje se mogu smatrati modelima bolesti. Terapeutici se često ispituju na miševima, uključujući, ali ne ograničavajući se samo na bezdlake miševe, SCID miševe, miševe sa ksenograftom i transgene miševe (uključujući ugnječene i izbijene). Takve analize mogu pružiti značajne podatke za utvrđivanje mogućnosti upotrebe antitela kao terapeutika. Za ispitivanje se može upotrijebiti bilo koji organizam, prvenstveno sisara. Na primer, zbog njihove genetičke sličnosti sa ljudima, majmuni mogu biti prikladni terapeutski modeli, i stoga se mogu upotrebiti za ispitivanje delotvornosti, toksičnosti, farmakokinetike ili drugih svojstava modifikovanih imunoglobulina predmetnog pronalaska. Testovi na ljudima su potrebni na kraju za odobrenje leka, i stoga su naravno predviđeni i ti eksperimenti. Tako se dakle modifikovani imunoglobulini predmetnog pronalaska mogu ispitati na ljudima za utvrđivanje njihove terapeutske delotvornosti, toksičnosti, imunogenosti, farmakokinetike i/ili drugih kliničkih svojstava.

[0067] Modifikovani imunoglobulini predmetnog pronalaska mogu se upotrebiti u širokom području proizvoda antitela. U jednom rešenju, varijanta antitela predmetnog pronalaska upotrebljava se za terapiju ili profilaksu, za preparativnu ili analitičku upotrebu, kao dijagnostički, industrijski spoj ili reagens za istraživanje, prvenstveno kao terapeutik. Varijanta antitela može se upotrebiti u sastavu antitela koje je monoklonsko ili poliklonsko. U rešenju kome se daje prednost, modifikovani imunoglobulini predmetnog pronalaska upotrebljavaju se za ubijanje ciljnih ćelijaa koje nose ciljni antigen, na primer ćelije raka. U alternativnom rešenju, modifikovani imunoglobulini predmetnog pronalaska upotrebljavaju se za blokiranje, antagoniziranje ili za agoniziranje ciljnog antigena, na primer antagoniziranje citokina ili citokin receptora. U drugom poželjnom rešenju, modifikovani imunoglobulini predmetnog pronalaska upotrebljavaju se za blokiranje, antagoniziranje ili za agoniziranje ciljnog antigena i za ubijanje ciljnih ćelija koje nose ciljni antigen. U drugom poželjnom rešenju, modifikovani imunoglobulini predmetnog pronalaska upotrebljavaju se za blokiranje, antagoniziranje ili za agoniziranje faktora rasta ili receptora faktora rasta i za ubijanje ciljnih ćelija koje nose ili koje trebaju ciljni antigen. U alternativnom rešenju, modifikovani imunoglobulini predmetnog pronalaska upotrebljavaju se za blokiranje, antagoniziranje ili za agoniziranje enzima i supstrata enzima.

[0068] Modifikovani imunoglobulini predmetnog pronalaska mogu se upotrebiti za razne terapeutske svrhe. U poželjnom rešenju, antitelo koje uključuje modifikovane imunoglobuline daje se pacijentu za tečenje specifičnog poremećaja. Za svrhu predmetnog pronalaska, "pacijent" uključuje kako ljude, tako takođe i životinje, prvenstveno sisare, a poželjno ljude. Kao "specifičan poremećaj" ovde se misli na poremećaj koji se može ublažiti davanjem farmaceutskog preparata koji sadrži modifikovani imunoglobulin predmetnog pronalaska.

[0069] U jednom rešenju, modifikovani imunoglobulin prema predmetnom pronalasku je samo terapeutski aktivno sredstvo koje se daje pacijentu. Alternativno, modifikovani imunoglobulin prema predmetnom pronalasku se daje u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapeutskih sredstava, koja uključuju, ali se ne ograničavaju samo na citotoksična sredstva, hemoterapeutska sredstva, citokine, sredstva koja inhibiraju rast, anti-hormonska sredstva, inhibitore kinaze, anti-angiogenska sredstva, kardeoprotektante ili druga terapeutska sredstva. Modifikovani imunoglobulini mogu se dati zajedno sa jednim ili više drugih terapeutskih režima. Na primer, varijanta antitela predmetnog pronalaska može se dati pacijentu samo sa hemoterapijom, radijacijskom terapijom ili sa oba, sa hemoterapijom i radijacijskom terapijom. U jednom rešenju, modifikovani imunoglobulini predmetnog pronalaska mogu se dati zajedno sa jednim ili više antitela, koja mogu ili ne moraju sadržati varijantu antitela predmetnog pronalaska. U skladu sa drugim rešenjem pronalaska, modifikovani imunoglobulini predmetnog pronalaska i jedna ili više drugih antikancerogenih terapija koriste se za lečenje raka ćelije ex vivo. Može se zamisliti da se takvo ex vivo lečenje može primeniti i posebno za transplantaciju autologne koštane srži. Moguće je naravno da se antitela pronalaska upotrebe u kombinaciji takođe i sa drugim terapeutskim tehnikama, kao što je hirurgija.

[0070] Varijanta drugih terapeutskih sredstava može se upotrebiti za davanje sa modifikovanim imunoglobulinima predmetnog pronalaska. U jednom rešenju, modifikovani imunoglobulin se daje sa anti-angiogenim sredstvom, što je spoj koji blokira ili interferira do nekog stepena razvoj krvnih žila. Anti-angiogeni faktor može biti, na primer, mali molekul ili protein, na primer antitelo, Fc fuzija, ili citokin, koji se veže za faktor rasta ili za receptor faktora rasta koji je uključen u napredovanju angiogeneze. Anti-angiogeni faktor kojem se ovde daje prednost je antitelo koje se veže za faktor rasta vaskularnog endotela (e. Vascular Endothelial Grovvth Factor, VEGF). U alternativnom rešenju, modifikovani immunoglobulin se daje sa terapeutskim sredstvom koje izaziva ili pojačava adaptivnu imunološku reakciju, na primer antitelo koje cilja na CTLA-4. U alternativnom rešenju, modifikovani imunoglobulin se daje sa inhibitorom tirozin kinaze, to je molekul koji inhibira do neke mere delovanje tirozin kinaze. U alternativnom rešenju, modifikovani imunoglobulini predmetnog pronalaska daju se sa citokinom. Kako se ovde radi, sa pojmom "citokin" se misli na generički pojam za proteine koje oslobađa populacija ćalije koje djeluju na druge ćelije kao međućelijski posrednici koji uključuju hemokine.

[0071] Predviđeni su farmaceutske kompozicije u kojima su formulisani modifikovani imunoglobulini predmetnog pronalaska i jedno ili više terapeutskih aktivnih sredstava. Formulacije varijante antitela predmetnog pronalaska se pripremaju za skladištenje mešanjem navedenog imunoglobulina koji ima željeni stepen čistoće sa najboljim farmaceutski prihvatljivim nosačima, pomoćnim sredstvima ili stabilizatorima (Remington's Farmaceutski Sciences, 16. izdanje, Osol, A. Ed., 1980), u obliku liofiliziranih formulacija ili vodenih rastvora. Formulacije koje se upotrebljavaju za davanje in vivo su prvenstveno sterilne. To se lako vrši filtracijom kroz sterilne membrane za filtraciju ili drugim metodama. Modifikovani imunoglobulini i druga ovde opisana terapeutski aktivna sredstva mogu se takođe formulisati kao imunolipozomi i/ili se mogu staviti u mikrokapsule.

[0072] Davanje farmaceutske kompozicije koja sadrži modifikovani imunoglobulin predmetnog pronalaska, prvenstveno u obliku sterilnog vodenog rastvora, može se izvesti na mnogo načina koji uključuju, ali se ne ograničavaju samo na oralno, supkutano, intravenozno, intranazalno, intraotikalno, transdermalno, površinski (npr. gelovi, masti, losioni, kreme itd.), intraperitonealno, intramuskularno, intrapulmonalno

TM

(npr. tehnologija za inhalaciju AERx koja je komercijalno dostupna od firme Aradigm, ili sistem za isporuku u pluća Inhance TM koji je komercijalno dostupan od firme Inhale Thcrapeutics), vaginalno, parenteralno, rektalno ili intraokularno.

[0073] Kako se ovde koristi pojam "specifično vezivanje" odnosi se na reakciju povezivanja pomoću koje se određuje i prepoznaje dotični ligand u heterogenoj populaciji molekula. Tako, dakle, pod utvrđenim uslovima (npr. uslovi imunološkog stanja u slučaju imunoglobulina), specifično antitelo veže se na svoj poseban "cilj", a ne veže se u značajnoj količini na druge molekule prisutne u uzorku. Sa CDR antitela mogu se usporediti modifikovana područja strukturne petlje proteinskih jedinica koje vežu antigen ili molekule, ali ne i antigene kao takve.

[0074] Pojam "sistem ekspresije" odnosi se na molekule nukleinskih kiselina koje sadrže željenu kodnu sekvencu i kontrolne sekvence u radnom povezivanju, tako da domaćin transformisan ili transfektisan sa tim sekvencama može proizvesti kodirane proteine. Da bi se podstakao transformaciju, sistem ekspresije može biti uključen na vektor; međutim, relevantna DNK može tada takođe biti ugrađena u hromozom domaćina.

[0075] Prema poželjnom rešenju ovog pronalaska, sistem ekspresije može uključiti vektor. Za ovu svrhu se kao prikladan može upotrebiti bilo koji u struci poznati vektor ekspresije.

[0076] Modifikovani imunoglobulin se prvenstveno ekspresuju u domaćinu, prvenstveno u bakterijskoj, gljivičnoj, biljnoj ćeliji, u životinjskoj ćeliji ili u biljci ili životinji.

[0077] Za ekspresiju modifikovanog imunoglobulina može se upotrebiti veliko mnoštvo odgovarajućih ćelija domaćina koje uključuju, ali nisu ograničene samo na ćelije sisara (životinjske ćelije), biljne ćelije, bakterije (npr. Bacillus subtilis, Escherichia coli), ćelije insekata, i gljivice (npr. Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae). Na primer, mnoštvo ćelijskih linija koje se mogu upotrebiti u predmetnom pronalasku opisano je u ATCC katalogu ćelijskih linija, koji se može dobiti od „American Tipe Culture Collection". Osim toga, za ekspresiju imunoglobulina prema predmetnom pronalasku kao domaćini se takođe mogu upotrebiti biljke i životinje. Vektori ili kazete ekspresije kao takođe i transfekcije mogu se odabrati prema upotrebljenom domaćinu.

[0078] Naravno takođe se mogu upotrebiti i sistemi ekspresije bez ćelija ili protein bez ćelija. Platforme ekspresije za in vitro transkripciju/translaciju proteina, koje proizvode dovoljne količine proteina nude mnoge prednosti proteinske ekspresije bez ćelija, čime se uklanja potreba za laborijskim prethodnim i naknadnim koracima (npr. transformacija ćelije domaćina, uzgoj ili liza) koji su tipično povezani sa sistemima ekspresije na osnovnim ćelijama.

[0079] Drugi vid predmetnog pronalaska odnosi se na postupak proizvodnje imunoglobulina ili njegovog farmaceutskog preparata koji sadrži najmanje jednu modifikaciju u strukturnom području petlje spomenutog imunoglobulina i određivanje vezivanja spomenutog imunoglobulina za epitopu antigena, pri čemu se nemodifikovani imunoglobulin ne veže značajno za navedeni epitop, a postupak obuhvata korake: - ostvarivanja nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulin koji sadrži najmanje jedno područje petlje, - modifikacija najmanje jednog nukleotidnog ostatka najmanje jednog navedenog područja petlje,

- prenosa navedene modificirane nukleinske kiseline u sistem ekspresije,

- ekspresija navedenog modifikovanog imunoglobulina,

- dovođenja u dodir ekspresovanog modifikovanog imunoglobulina sa epitopom, - utvrđivanja da li se navedeni modifikovani imunoglobulin veže za navedeni epitop, i - ostvarivanja vezivanja modifikovanog imunoglobulina za navedeni epitop i prema potrebi njegovom završnom preradom u farmaceutski preparat.

[0080] Posebno se ovaj pronalazak odnosi na postupak multi-specifičnog vezivanja imunoglobulina, specifično za najmanje jedan prvi molekul ili njegov farmaceutski preparat koji sadrži najmanje jednu modifikaciju u najmanje jednom strukturnom području petlje navedenog imunoglobulina i utvrđivanja specifičnog vezivanja navedenog najmanje jednog područja petlje na najmanje jedan drugi molekul odabran iz grupe koju čine alergeni, antigeni povezani sa tumorom, samo-antigeni, enzimi, bakterijski antigeni, gljivični antigeni, antigeni protozoa i virusni antigeni, pri čemu se imunoglobulin koji sadrži nemodifikovano strukturno područje petlje ne veže specifično za navedeni najmanje jedan drugi molekul, a postupak obuhvata korake: - ostvarivanja nukleinske kiseline koja kodira imunoglobulin specifičnog vezivanja za najmanje jedan prvi molekul koji uključuje najmanje jedno strukturno područje petlje, - modifikacija najmanje jednog nukleotidnog ostatka iz najmanje jednog navedenog područja petlje kodiranog sa navedenom nukleinskom kiselinom,

- prenosa navedene modifikovane nukleinske kiselina u sistem ekspresije,

- ekspresija navedenog modifikovanog imunoglobulina,

- dovođenja u dodir ekspresovanog modifikovanog imunoglobulina sa navedenim najmanje jednim drugim molekulom, i - utvrđivanja đa li se navedeni modifikovani imunoglobulin veže specifično za drugi molekul i - ostvarivanja modifikovanog imunoglobulina specifičnog vezivanja za navedenim najmanje jedan drugi molekul, i opciono

- njegova završna prerada u farmaceutski preparat.

[0081] Prednost se daje modifikaciji više od jedne specifičnosti u članu para specifičnog vezivanja (Kufer et al. (2004) Trends u Biotechnology sv. 22, stranice 238-244).

[0082] Izvršeni su brojni pokušaji da se proizvedu multi-specifična, npr. bispecifična, monoklonska antitela ili fragmenti antitela. Jedan problem u proizvodnji bispecifičnog antitela izgrađenog od dva različita polipeptidna lanca (teški i laki lanac) je potrebna ekspresija četiri različita lanca (dva teška i dva laka lanca) u jednoj ćeliji, a to ima za posledicu brojne različite kombinacije molekula koje se moraju rastaviti od željenog bispecifičnog molekula u smeši. Zbog njihove sličnosti, rastavljanje tih molekula je teško i skupo. Za smanjenje na najmanju moguću meru pojave takvih neželjenih parova bile su upotrebljene brojne tehnike (Čarter (2001) Journal of Immunological Methods, sv. 248, stranice 7-15).

[0083] Jedno rešenje problema je proizvodnja jednog polipeptidnog lanca sa dve specifičnosti, kao npr. dva međusobno povezana scFvs ili proizvodnja takozvanog diatela. Za takve molekule se pokazalo da su oni jako daleko od nabiranja prirodnog molekula i njih je stražno teško proizvesti (LeGall et al. (2004) Protein Engineering, Design & Selection, sv. 17 stranice 357-366).

[0084] Drugi problem sadašnje konstrukcije bispeciflčnih antitela je činjenica da čak ako su izvorna antitela bivalentno vezana za svog dotičnog učesnika vezivanja (npr. IgG), dobijeno bispecifično antitelo je monovalentno za svakog dotičnog učesnika vezivanja.

[0085] Multi-specifični molekuli predmetnog pronalaska kojima se daje prednost rešavaju te probleme.

[0086] Ekspresija bispecifičnog molekula kao što je polipeptidni lanac moguća je (modifikovani Ig domen sa dva specifična vezivanja, vidi primere), i nju je lakše izvesti nego ekspresiju dva polipeptidna lanca antitela (Cabilly et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277 (1984)).

[0087] Takođe se može proizvesti molekul sličan antitelu (tj. izgrađenu od 2 polipeptidna lanca), zbog činjenice da se druga specifičnost nalazi u ne-varijabilnom delu molekula pa nema potrebe za dva različita teška lanca ili za dva različita laka lanca. Stoga, dakle, ovde ne postoji mogućnost za pogrešno sparivanje dva lanaca.

[0088] Antitelo predmetnog pronalaska može se sastojati od teškog lanca i lakog lanca, koji zajedno obrazuju varijabilno područje vezivanja za specifičnog učesnika vezivanja. Druga specifičnost se može stvoriti sa modifikovanom petljom bilo koje strukturne petlje teškog lanca ili lakog lanca. Mesto vezivanja se takođe može oblikovati sa više od jedne ne-CDR petlje koja može biti strukturno susedna (na teškom lancu ili na lakom lancu ili na oba lanca).

[0089] Modifikovano antitelo ili njegov derivat može biti potpuno antitelo ili fragment antitela (npr. Fab, CH1-CH2, CH2-CH3).

[0090] Moguće je vezivanje za učesnike vezivanja mono- ili multivalentno ili čak sa različitom valencom za različite učesnike vezivanja, zavisno od konstrukcije.

[0091] Postoje brojne različite petlje koje se mogu dobiti za selekciju i za konstrukciju specifičnog mesta vezivanja u ne-CDR područjima teškog i lakog lanca. Mogu se konstruisati derivati antitela koji imaju čak više od dve specifičnosti bez. gore navedenih problema.

[0092] Domeni specifičnog vezivanja unutar jednog polipeptidnog lanca mogu biti povezani sa ili bez peptidnog linkera.

[0093] Neke klase antitela mogu se smatrati multi-specifičnim, posebno bispecifičnim po prirodi: oni se vezuju za antigen (koji je tipično npr. strana struktura ili struktura povezana sa rakom) sa varijabilnim područjem i vežu se na Fc-efektorske molekule sa Fc delom (npr. Fc receptori na razne imunološke ćelije ili komplementarni protein) omogućavajući tako učinke kao što su ADCC, ADCP ili CDC.

[0094] Fc-efektorski molekuli se vežu pomoću Fc-dela imunoglobulinskog molekula (za IgGl on se sastoji od domena CH2 i CH3) i brojni postupci su bili opisani za optimiziranje efektorske funkcije sa poboljšanjem vezivanja Fc-dela molekula antitela pomoću tehnika gliko-inženjeringa (US 6,602,684) ili pomoću proteinskog inženjeringa direktno na Fc (US 2005/0054832) ili posredno inženjeringom izvan Fc (US 2005/02444403). Oba, vezivanje Fc područja za Fc receptor i/ili vezivanje za komplementarne proteine kao što je Cql bilo je izmenjeno pomoću tih tehnika. Uobičajeno, afinitet vezivanja za takve Fc-efektorske molekule se nastoji poboljšati, jer on korelira sa poboljšanjem efektorskih funkcija.

[0095] Sa sadašnjim pronalaskom moguće je konstruisati vezivanje antitela na Fc-efektorske molekule izvan prirodnog Fc područja vezivanja. Modifikovane petlje u domenu antitela različitog od petlje uključene u vezanje "prirodnog" Fc-efektorskog molekula mogu se odabrati iz biblioteke ili konstruisati za vezivanje na jedan ili više Fc-efektorskih molekula. Antitelo sa takvim dodatnim mestom vezivanja Fc-efektorskog molekula imat će jaču naklonost prema određenom Fc-efektorskom molekulu ili efektorskoj ćeliji koja pokazuje Fc-efektorski molekul i stoga može imati čak i jači učinak nego antitela podvrgnuta gliko-inženjeringu ili sa drugačije poboljšanim Fc područjima. Međutim, za određena rešenja predmetnog pronalaska, efektorske karakteristike dotičnog antitela koji se želi modifikovati ne treba direktno menjati, već ih treba zadržati van dometa modifikacije u strukturnoj petlji prema predmetnom pronalasku.

[0096] Fragmenti antitela imaju određene prednosti u poređenju sa celim antitelom. Fragmenti imaju uobičajeno dobra svojstva biološke raspodele i mogu se lakše proizvoditi. Međutim, većini konstrukcija fragmenata antitela nedostaju efektorske funkcije i imaju kratko vreme trajanja in vivo (Holliger P, et al. Nat Biotechnol.(2005) 23:1126-36.).

[0097] Niti domen CH1, niti CkiliCXdomen ne posreduju efektorske funkcije i to je razlog što Fab-ovi ne pokazuju ADCC, ADCP ili CDC. WO 02/44215 opisuje vezivanje molekula koji se sastoji od mesta vezivanja antigena antitela i peptida koji veže Fc-efektorske molekule. Na taj način se može konstruisati fragment antitela koje pokazuje efektorske funkcije. Peptid je bio ugrađen u vezni molekul u položaju koji ne uništava vezivanje antigena, niti sposobnost peptida da se veže za Fc-efektorski molekul.

[0098] Međutim, prema predmetnom pronalasku, vezivanje za Fc-efektorski molekul može se izvesti sa domenima modifikovanog imunoglobulina koji su bili odabrani za vezivanje Fc-efektorskih molekula iz biblioteka sekvenci randomskih petlji unutar fiksnog kostura imunoglobulinskog domena. Zbog toga je moguće odabrati specifične sekvence petlji koje se neće vezivati na Fc-efektorske molekule van kostura Ig-domena. Polipeptidi koji se dobiju iz predmetnog pronalaska mogu se stoga sastojati prvenstveno od više od 100 amino kiselina.

[0099] Za odabir moguće efektorske funkcije takvih domena prema predmetnom pronalasku, za vezivanje na Fc-receptore i/ili komplementne faktore kao što je CIq, mogu se odabrati biblioteke domena mutanata CH1, CkiliCk.

[0100] Da bi se povećao vek trajanja in vivo molekula koji se sastoji od ili koji sadrži takve domene (npr. CH1, CH2, CH3, CH4, Ckili C/V), za vezivanje na FcRn prema predmetnom pronalasku mogu se odabrati biblioteke mutanata npr. CH1, CH2, CH3, CI 14, CkiliCXdomeni.

[0101] FcRn-receptori za selekciju mogu se osigurati na površini ćelija koja ekspresioniraju dotične prirodne receptore ili pomoću ekspresije i čišćenja vanćelijskog dela dotičnog receptora. Za svrhu ovog pronalaska prvo pretraživanje na FcRn može se odabrati za mutant domene koji se dalje mogu ispitati in vitro i čak dalje okarakterisati u FACS analizama vezivanjem na ćelije koje ekspresioniraju FcRn receptor. Može se dalje okarakterisati rangiranjem afiniteta vezivanja na razne rekombinantne FcRn, izoformne i alotipove npr. tehnikama rezonance sa površine plazmona.

[0102] Imunoglobulin predloženog rešenja pronalaska je humanog ili mišjeg porekla.

[0103] Budući da se modifikovani imunoglobulin može upotrebiti za razne svrhe, posebno u farmaceutskim kompozicijama, imunoglobulin je prvenstveno humanog ili mišjeg porekla. Naravno, modifikovani imunoglobulin može takođe biti humanizirani ili himcrni imunoglobulin.

[0104] Prema drugom poželjnom rešenju humani imunoglobulin je odabran iz grupe koja sadrži IgAl, IgA2, IgD, lgE, IgGl, IgG2, IgG3, lgG4 i IgM.

[0105] Mišji imunoglobulin je prvenstveno odabran iz grupe koja sadrži IgA, IgD, IgF, IgGl, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3 i IgM.

[0106] Modifikovani imunoglobulin može se dobiti iz jednog od gore navedenih klasa imunoglobulina.

[0107] Imunoglobulin prvenstveno sadrži teški i/ili laki lanac imunoglobulina ili njegov deo.

[0108] Modifikovani imunoglobulin može sadržati teški i/ili laki lanac, najmanje jedan varijabilni i/ili konstantni domen.

[0109] Imunoglobulin prema predmetnom pronalasku sadrži najmanje jedan konstantni domen imunoglobulina ili njegov deo koji uključuje minidomen.

[0110] Konstantan domen je jedinica nabora imunoglobulina konstantnog dela molekula imunoglobulina, koji se takođe spominje kao domen konstantnog područja (npr. CH1, CH2, CH3, CH4, C-kapa, C-lambda).

[0111] Varijabilan domen je jedinica nabora imunoglobulina varijabilnog dela molekula imunoglobulina, koji se takođe spominje kao domen varijabilnog područja (npr. Vh, Vk, VI. Vd).

[0112] Imunoglobulin prema pronalasku kojem se daje prednost sastoji se od konstantnog domena odabranog iz grupe koju čine CM, CI 12, CH3, CH4, Ig-kapa-C, Ig-lambda-C, ili njegov deo koji uključuje minidomen, sa najmanje jednim područjem petlje, i okarakterisan je time da navedeno najmanje jedno područje petlje uključuje najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju koja formira najmanje jedno modifikovano područje petlje, pri čemu se navedeno najmanje jedno modifikovano područje petlje veže specifično za najmanje jedan epitop antigena.

[0113] Imunoglobulin može sadržati najmanje jedan jednostruki domen ili njegov deo, uključujući minidomen koji se sastoji od dve beta-niti domena imunoglobulina koja je povezana za strukturnu petlju, za varijabilni jednostruki domen imunoglobulina ili za jednostruki lanac Fv.

[0114] Drugi poželjni imunoglobulin prema pronalasku sastoji se od varijabilnog domena teškog ili lakog lanca, ili njegovog dela uključujući minidomen, sa najmanje jednim područjem petlje, a okarakterisan je time da navedeno najmanje jedno područje petlje sadrži najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju koja formira najmanje jedno modifikovano područje petlje, pri čemu navedeno najmanje jedno modifikovano područje petlje se veže specifično za najmanje jedan epitop antigena.

[0115] Prema poželjnom rešenju konstantan domen je odabran iz grupe koju čine CH1, CH2, CH3, CH4, Ig-kapa-C, Ig-lambda-C i njihove kombinacije.

[0116] Modifikovani imunoglobulin prema predmetnom pronalasku može sadržati jedan ili više konstantnih domena (npr. najmanje dva, tri, četiri, pet, šest, deset domena). Ako je u modifikovanom imunoglobulinu prisutno više od jednog domena, ti domeni mogu biti istog tipa ili različitih tipova (npr. CH1-CH1-CH2, CH3-CH3). Naravno, takođe redosled jednostrukog domena može biti bilo koje vrste (npr. CH1-CH3-CH2, CH4-CH1-CH3-CH2).

[0117] Sve brojčane oznake aminokiselinskih sekvenci imunoglobulina izvršene su prema IMGT šemi numerisanja (1MGT, international ImmunoGene Tics information system@imgt.cines.fr; http://imgt.cines.fr; Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res. 27: 209-212; Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Res. 28: 219-221; Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res. 29: 207-209; Lefranc et al., 2003, Nukleic Acids Res. 31: 307-310; Lefranc et al., 2005, Dev Comp Immunol 29:185-203).

[0118] Prema drugom poželjnom rešenju, modifikovana područja petlji CH1, CH2, CH3 i Cl 14 obuhvataju amino kiseline 7 do 21, amino kiseline 25 do 39, amino kiseline 41 do 81, amino kiseline 83 do 85, amino kiseline 89 do 103 i amino kiseline 106 do 117, pri čemu je numerisanje prema 1MGT.

[0119] Područja petlji lg-kapa-C i lg-lambda-C humanog porekla obuhvataju prvenstveno amino kiseline 8 do 18, amino kiseline 27 do 35, amino kiseline 42 do 78, amino kiseline 83 do 85, amino kiseline 92 do 100, amino kiseline 108 do 117 i amino kiseline 123 do 126, pri čemu je numerisanje prema IMGT.

[0120] Područja petlji Ig-kapa-C i Ig-lambda-C mišjeg porekla obuhvataju prvenstveno amino kiseline 8 do 20, amino kiseline 26 do 36, amino kiseline 43 do 79, amino kiseline 83 do 85, amino kiseline 90 do 101, amino kiseline 108 do 116 i amino kiseline 122 do 125, pri čemu je numerisanje prema IMGT.

[0121] Područja strukturnih petlji varijabilnog domena imunoglobulina humanog porekla obuhvataju prvenstveno amino kiseline 8 do 20, amino kiseline 44 do 50, amino kiseline 67 do 76 i amino kiseline 89 do 101, pri čemu je numerisanje prema IMGT.

[0122] Prema poželjnom rešenju predmetnog pronalaska područja strukturnih petlji varijabilnog domena imunoglobulina mišjeg porekla obuhvataju amino kiseline 6 do 20, amino kiseline 44 do 52, amino kiseline 67 do 76 i amino kiseline 92 do 101, pri čemu je numerisanje prema IMGT.

[0123] Gore navedena područja amino kiselina dotičnih imunoglobulina obuhvataju područja petlji koja će se modifikovati.

[0124] Imunoglobulin prema pronalasku je prvenstveno kamiljeg porekla.

[0125] Kamilja antitela sadrže samo jedan teški lanac i imaju isti antigenski afinitet kao normalna antitela koja se sastoje od lakih i teških lanaca. Prema tome, antitela od kamile su puno manja nego npr. ljudska antitela, koja im dozvoljavaju da penetriraju u tkivo kako bi dohvatilti antigen, što veći proteini nisu sposobni učiniti. Štoviše, komparativna jednostavnost, visoki afinitet i specifičnost te potencijal za postizanje i interakciju sa aktivnim mestima, predstavljaju prednosti kamiljih antitela teškog lanca naspram uobičajenih antitela u konstrukciji, proizvodnji i primeni spojeva kliničkih vrednosti.

[0126] Imunoglobulin kamiljeg porekla sadrži prvenstveno najmanje jedan konstantan domen odabran iz grupe koja se sastoji od CH1, CH2 i CH3.

[0127] Područja petlji od CH1, CH2 i CH3 kamiljeg imunoglobulina sadrže amino kiseline 8 do 20, amino kiseline 24 do 39, amino kiseline 42 do 78, amino kiseline 82 do 85, amino kiseline 91 do 103 i amino kiseline 108 do 117, pri čemu je numerisanje prema IMGT.

[0128] Prema poželjnom rešenju predmetnog pronalaska specifično vezivanje modifikovanog imunoglobulina na molekulu utvrđuje se analizom vezivanja odabranim iz grupe koju čine imunološki analize, prvenstveno analize sa enzimom povezanog imunosorbenta (ELISA), analize rezonance površine plazmona, spektroskopija nuklearne magnetne rezonance razlike prenosa zasićenja, spektroskopija nuklearne magnetne rezonance prenosa NOE (trNOE), analize nadmetanja, analize vezivanja u tkivu, analize vezivanja u živoj ćeliji i analize ćelijskog ekstrakta.

[0129] Analize vezivanja mogu se izvesti upotrebom raznih metoda koje su poznate u struci i koje uključuju, ali se ne ograničavaju samo na analize koji se temelje na FRET (Fluorescence Resonance Energv Transfer) i BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer), AlfaScreen.TM. (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay), Scintillation Proximity Assay, ELISA (Enzim-Linked Immunosorbent Assay), SPR (Surface Plasmon Resonance, koji je takođe poznat kao BIACORE), izotermalna titracijska kalorimetrija, diferencijalna pretražna kalorimetrija, elektroforeza na gelu i hromatografija, uključujući i gel filtraciju. Te i druge metode mogu imati prednost za neke učesnike fuzije ili obeležavanja.

[0130] Modifikovani imunoglobulin se prvenstveno konjuguje na sredstvo za obeležavanje odabrano iz grupe koju čine organski molekuli, enzimi za obeležavanje, radeoaktivna sredstva za obeležavanje, obojena sredstva za obeležavanje, fluorescentna sredstva za obeležavanje, kromogena sredstva za obeležavanje, luminescentna sredstva za obeležavanje, hapteni, digoksigenin, biotin, metalni kompleksi, metali, koloidno zlato i njihove smeše.

[0131] Modifikovani imunoglobulin se može konjugovati na druge molekule koji omogućavaju jednostavnu detekciju navedenog konjugata, na primer, u analizama vezivanja (npr. ELISA) i proučavanjima vezivanja.

[0132] Poželjno rešenje predmetnog pronalaska se odnosi na postupak proizvodnje imunoglobulina sa povećanim polovičnim životom koji obuhvata korake: - konstruisanja modifikovanog imunoglobulina postupkom prema predmetnom pronalasku, uključujući mutantni domen odabran iz grupe koja se sastoji od CH1, CH2, CH3, CH4, C-kapa i C-lambda, te ima specifičnost vezivanja prema samo-antigenu kroz modifikaciju u području strukturne petlje, i

- proizvodnje preparata koji ima povećan polovični život.

[0133] Poželjno rešenje predmetnog pronalaska, odnosi se na postupak prema predmetnom pronalasku, prema kome modifikovani imunoglobulin ima specifičnost vezivanja na FcRn.

[0134] Poželjno rešenje predmetnog pronalaska, odnosi se na metodu proizvodnje konstruisanog imunoglobulina sa efektorskim delovanjem, koji obuhvata korake: - konstruisanja modifikovanog imunoglobulina postupkom prema predmetnom pronalasku, koji sadrži mutantni domen odabaran iz grupe koja se sastoji od CH1, CH2, CH3, CH4, C-kapa i C-lambda, te ima specifičnost vezivanjana efektor molekula kroz modifikaciju u području strukturne petlje, i - proizvodnje preparata sa efektorskim delovanjem, pri čemu je navedeni fragment konstruisanog antitela najbolji Fab ili Fc fragment.

[0135] Imunoglobulin prema predmetnom pronalasku se može sastojati od konstantnog domena odabranog iz grupe koju čine CH1, CH2, CH3, CFI4, Igk-C, Igl-C, ili njegov deo koji uključuje minidomen, ili njihove kombinacije, sa najmanje jednim područjem petlje, okarakterisan im time da navedeno najmanje jedno područje petlje obuhvata najmanje jednu aminokiselinsku modifikaciju koja formira najmanje jedno modifikovano područje petlje, pri čemu se navedeno najmanje jedno modifikovano područje petlje veže specifično za najmanje jedan epitop antigena.

[0136] Povoljno je kombinovati molekularno najmanje jedan modifikovani domen antitela (= vezivanje za specifičnog učesnika preko ne-varijabilnih sekvenci ili strukturne petlje) sa najmanje jednim drugim veznim molekulom koji može biti antitelo, fragment antitela, rastvorivi receptor, ligand ili drugi modifikovani domen antitela.

[0137] Molekul je odabran iz grupe koju čine proteinski molekuli, nukleinske kiseline i ugljovodonici.

[0138] Područja petlji modifikovanih imunoglobulina mogu se specifično vezati za bilo koju vrstu veznih molekula, posebno na proteinske molekule, proteine, peptide, polipeptide, nukleinske kiseline, glikane, ugljovodonike, lipide, male organske molekule, neorganske molekule. Naravno, modifikovani imunoglobulini mogu sadržati najmanje dva područja petlji pri čemu se svako područje petlji može specifično vezati za druge molekule ili epitope.

[0139] Prema poželjnom rešenju predmetnog pronalaska, molekul koji se veže na modifikovano strukturno područje petlje odabran je iz grupe koju čine antigeni povezani sa tumorom, posebno EpCAM, sa tumorom povezan glikoprotein-72 (TAG-72), sa tumorom povezan antigen CA 125, antigen specifičan za membranu prostate (PSMA), antigen povezan s melanomom visoke molekularne mase (HMW-MAA), sa tumorom povezan antigen koji ekspresuje ugljovodonike srodne sa Lewis Y, antigen embrionalnog karcinoma (CEA), CEACAM5, HMFG PEM, mucin MUCI, MUCI8 i antigen povezan sa citokeratinskim tumorom, bakterijski antigeni, virusni antigeni, alergeni, fluorescin, lisozim, receptor 9 sličan toll-u, eritropojetin, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD11, CDlla, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29. CD30, CD33 (protein p67), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, GD3, 1L-I, IL-1R, IL-2, IL-2R, IL-4, IL-5, 1L-6, IL-6R, IL-8, IL-12, 1L-15, 1L-18, IL-23, interferon alfa, interferon beta, interferon gama; TNF-alfa, TNFbeta2, TNF.alfa, TNFalfabeta, TNF-R1, TNF-R1I, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, RANKL, TV/EAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEGl, OX40L, TRAIL receptor-1, Al adenozin receptor, limfotoksin beta receptor, TACI, BAFF-R, EPO; LFA-3, ICAM-1, ICAM-3, integrin betal, integrin beta2, integrin alfa4/beta7, integrin alfa2, integrin alfa3, integrin alfa4, integrin alfa5, integrin alfa6, integrin alfaV, alfaVbeta3 integrin, FGFR-3, faktor rasta keratinocita, VLA-1, VLA-4, L-selektin, anti-Id, E-selektin, HLA, HLA-DR, CTLA-4, receptor T ćelije, B7-1, B7-2, VNRintegrin, TGFbetal, TGFbeta2, eotaksinl, BLyS (stimulator B-Iimfocita), komplement C5, IgE, faktor VII, CD64, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (ErbB4), faktor tkiva, VEGF, VEG-FR, receptor endotelina, VLA-4, ugljovodonici kao što je krvna grupa antigena i srodni ugljovodonici, Galili-glikozilacija, gastrin, gastrin receptori, sa tumorom povezani ugljovodonici, hapten NP-cap ili NIP-cap, receptor alfa/beta T ćelije, E-selektin, digoksin, alkalna fosfataza placente (PLAP) i testikularnom PLAP slična alkalna fosfataza, transferin receptor, heparanaza I, humani kardijalni miozin, glikoprotein Ilb/lIIa (GPIIb/IIIa), humani citomegalovirus (HCMV) gH glikoprotein ovojnice, HIV gpl20, HCMV, respiratorni sincitijalni virus RSV F, RSVF Fgp, VNRintegrin, Hep B gpl20, CMV, gpllbllla, HIV IIIB gpl20 V3 petlja, respiratorni sincitijalni virus (RSV) Fgp, herpes simpleks virus (HSV) gD glikoprotein, HSV gB glikoprotein, HCMV gB glikoprotein ovojnice, perfringenski toksin klostridija i njihovi fragmenti.

[0140] Modifikovani imunoglobulin prema predmetnom pronalasku može se vezati prvenstveno za jedan od gore opisanih molekula. Ti molekuli takođe uključuju i alergene.

[0141] Prema drugom rešenju predmetnog pronalaska, kojoj se daje prednost, modifikovani su aminokiselinski ostaci u CH3 u položajima 15 do 17, 29 do 34, 85.4 do 85.3, 92 do 94, 97 do 98 i/ili 108 do 110, pri čemu je numerisanje prema IMGT.

[0142] Modifikacija imunoglobulina prema predmetnom pronalasku je prvenstveno brisanje, zamena ili umetanje.

[0143] Prema predmetnom pronalasku najmanje 1, prvenstveno najmanje 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 i 15, amino kiseline se brišu, zamenjuju sa drugim amino kiselinama (takođe sa modifikovanim amino kiselinama) ili se umeću u područje petlje imunoglobulina. Međutim, maksimalan broj amino kiselina umetnutih u područje petlje imunoglobulina ne srne preći broj 30, prvenstveno 25, još bolje 20 amino kiselina. Zamena i umetanje amino kiselina vrši se prvenstveno randomski metodom poznatom u struci i kako je opisano u predloženoj patentnoj prijavi.

[0144] Imunoglobulin prema pronalasku je prema specifičnom rešenju okarakterisan time, što CH3 područje obuhvata SEQ ID br. 16 ili SEQ ID br. 18, ako se EpCam veže za navedeni imunoglobulin, SEQ ID br. 20, ako se fluorescein veže za navedeni imunoglobulin, SEQ ID br. 22, 24, 26, 28, 30 ili 32, kad se lisozim veže za navedeni imunoglobulin, SEQ ID br. 34, 36, 38 ili 40, kad se TLR9 veže za navedeni imunoglobulin, i SEQ ID br. 42, kad se lisozim i/ili eritropojetin vežu za navedeni imunoglobulin.

[0145] Prema specifičnom rešenju pronalaska imunoglobulin je okarakterisan time, što on obuhvata SEQ ID br. 44 ili SEQ ID br. 46, kad se lisozim i gp41 vežu za navedeni imunoglobulin.

[0146] Modifikovani imunoglobulin se prvenstveno konjuguje na sredstvo za obeležavanje ili na reporterski molekul odabran iz grupe koju čine organske molekule, enzimska sredstva za obeležavanje, radeoaktivna sredstva za obeležavanje, obojena sredstva za obeležavanje, fluorescentna sredstva za obeležavanje, hromogena sredstva za obeležavanje, luminescentna sredstva za obeležavanje, hapteni, digoksigenin, biotin, metalni kompleksi, metali, koloidno zlato i njihove smeše.

[0147] Modifikovani imunoglobulini konjugovani na sredstvo za obeležavanje kako je gore naznačeno mogu se upotrebiti, na primer, u dijagnostičkim postupcima.

[0148] Upotreba imunoglobulina koji se može dobiti postupkom prema predmetnom pronalasku koristi se za dobijanje vakcine za aktivnu imunizaciju. Pritom, imunoglobulin se upotrebljava kao antigenska lekovita supstanca za formulisanje vakcina ili se upotrebljava za primamljivanje ili hvatanje antigenskih struktura koje se upotrebljavaju u formulaciji vakcina.

[0149] Imunoglobulin koji se može dobiti postupkom prema predmetnom pronalasku koristi se takođe za dobijanje proteinske biblioteke imunoglobulina.

[0150] Imunoglobulini prema predmetnom pronalasku mogu biti korišćeni za izolaciju specifičnih molekula iz uzorka. Ako se multispecifični imunoglobulini koriste više od jednog, molekuli se mogu izolovati iz uzorka. Posebno je prednosna upotreba modifikovanih imunoglobulina u takvim metodama, jer one dozvoljavaju, npr. generisanje matrice sa homogenom površinom i sa određenom količinom učesnika vezivanja (tj. modifikovani imunoglobulini) koji su tako imobilisani, što omogućava vezivanje na molekule koji se trebaju izolovati. U suprotnom, ako se koriste mono-specifični učesnici vezivanja, ne može se proizvesti homogena matrica, jer se jednostruki učesnici vezivanja ne vežu sa istom delotvornošću na matricu.

[0151] Ovo se može postići postupkom za specifično vezivanje i/ili detekciju molekula koja obuhvataju korake: (a) dovođenja u dodir modifikovanog imunoglobulina prema predmetnom pronalasku ili modifikovanog imunoglobulina koji se može dobiti postupkom prema predmetnom pronalasku sa testiranim uzorkom od kojeg se očekuje da sadrži navedeni molekul, i (b) detekcije mogućeg nastanka specifičnog kompleksa imunoglobulina i molekula, ili postupkom za specifičnu izolaciju molekula, koji obuhvata korake: (a) dovođenja u dodir modifikovanog imunoglobulina prema predmetnom pronalasku ili modifikovanog imunoglobulina koji se može dobiti postupkom prema predmetnom pronalasku sa uzorkom koji sadrži navedeni molekul, (b) odvajanja nastalog kompleksa specifičnog imunoglobulina i molekula, i (c) opciono, izolacija molekula iz navedenog kompleksa.

[0152] Modifikovani imunoglobulini prema predmetnom pronalasku mogu se upotrebiti za isporuku najmanje jednog jedinjenja povezanog na CDR-ove i/ili modifikovano područje petlji za cilj. Takvi imunoglobulini se mogu upotrebiti za ciljanje terapeutskih supstance na mesta poželjna za delovanje tokom lečenja bolesti.

[0153] Ovo se može postići postupkom za ciljanje jedinjenja na cilj, obuhvatajući korake: (a) dovođenja u dodir modifikovanog imunoglobulina prema predmetnom pronalasku ili modifikovanog imunoglobulina dobijenog postupkom prema predmetnom pronalasku koji se može specifično vezati za navedeno jedinjenje, (b) isporuke sastava imunoglobulina/jedinjenja u cilj.

[0154] Imunoglobulin prema predmetnom pronalasku ili koji se može dobiti postupkom prema predmetnom pronalasku može biti deo proteinske biblioteke.

[0155] Poželjni postupci za konstruisanje navedene biblioteke mogu se naći gore i u primerima. Biblioteka prema predmetnom pronalasku može se upotrebiti za identifikaciju vezivanja imunoglobulina na određeni molekul.

[0156] Postojeći imunoglobulin može se izmeniti za uvođenje mesta vezivanja antigena u bilo koji domen ili minidomen upotrebom proteinske biblioteke dotičnog domena od najmanje 10, prvenstveno 100, još bolje 1000, i još bolje 10000, i još bolje 100000, najbolje više od 1000000 varijanti domena sa najmanje jednom modifikovanom petljom. Biblioteka se zatim pretraži u pogledu vezivanja na specifičan antigen. Nakon molekularne karakterizacije u pogledu željenog svojstva, odabrani domen ili minidomen se klonira u izvorni imunoglobulin tehnikama genetskog inženjeringa tako da on zameni područje divljeg tipa. Alternativno, da se dobije imunoglobulin sa dodatnim mestom vezivanja za specifičan antigen može se izmijeniti samo DNK koja kodira za petlju ili kodira za mutirane amino kiseline.

[0157] Izbor mesta za mutiranu, za antigen-specifičnu strukturnu petlju zavisi od strukture izvornog imunoglobulina i od svrhe dodatnog mesta vezivanja. Ako je, na primer. izvorni molekul celovit imunoglobulin kojem treba umetnuti dodatno mesto za vezivanje antigena bez poremećaja efektorske funkcije, petlje koje će se modifikovati treba odabrati između domena udaljeni od CH2 i CH3 koje su prirodni učesnici vezivanja za Fc-efektorske molekule. Ako je izvorni imunoglobulin Fab, modifikacija petlje je moguća u konstantnom domenu lakih lanaca ili teških lanaca ili u dotičnom varijabilnom domenu. Za stvaranje biblioteka mogu se pripremiti biblioteke koje potiču od mutanata izvornih molekula sa mutacijama u jednoj ili u više strukturnih petlji jednog ili više domena. Izbor sa potpuno mutiranim izvornim molekulima može imati neke prednosti, jer će izbor za vezivanje antigena sa modifikovanom strukturnom petljom dati prostorno povoljne modifikacije ako se ispituje takođe i u pogledu drugih svojstava koja bi trebao pokazati mutirani imunoglobulin.

[0158] Zahtevana veličina (tj. broj varijanti proteina) proteinske biblioteke mutiranog domena ili minidomena ili fuzijskog molekula domena zavisi od zadatka. Uopšteno, biblioteka za novo stvaranje mesta vezivanja antigena mora biti veća od biblioteke upotrebljene za dalju modifikaciju već postojećeg konstruisanog mesta vezivanja antigena učinjenog od modifikovane strukturne petlje (npr. za pojačavanje afiniteta ili izmenu fine specifičnosti prema antigenu).

[0159] Imunoglobulin prema pronalasku može biti sadržan u imunoglobulinskoj biblioteci ili biblioteci nukleinske kiseline koja obuhvata veći broj imunoglobulina, npr. konstantan domen, minidomen i/ili najmanje jedno strukturno područje petlje sadržane u minidomenu, ili molekulu nukleinske kiseline koja je kodira. Biblioteka sadrži članove sa različitim modifikacijama, pri čemu je mnoštvo definirano sa modifikacijama u najmanje jednom strukturnom području petlje. Nukleinska kiselina biblioteke uključuje prvenstveno najmanje 10 različitih članova (što ima za posledicu u iztncni jedne amino kiseline) i još bolje uključuje najmanje 100, još bolje 1000 ili 10000 različitih članova (npr. konstruisanih pomoću strategija randomizacije ili tehnikama kombinatorike). Prednost se daje takođe još i većoj različitosti pojedinačnih brojeva članova, kao što je najmanje 1000000 ili najmanje 10000000.

[0160] Dva različita domena ili minidomena odabrani iz najmanje dve biblioteke prema pronalasku mogu se upotrebiti u kombinaciji za stvaranje multispecifičnih imunoglobulina. Ti odabrani specifični imunoglobulini mogu se kombinovati međusobno i sa drugim molekulima, slično gradnji blokova, za konstruisanje optimalnog rasporeda domena ili minidomena da se dobiju željena svojstva.

[0161] Osim toga, jedan ili više modifikovanih imunoglobulina prema pronalasku mogu se uvesti na različitim ili na svim različitim mestima proteina po mogućnosti bez destrukcije strukture proteina. Sa takvim tehnikama "povlačenja domena" stvaraju se nove biblioteke koje se mogu ponovo odabrati za željena svojstva.

[0162] Poželjna biblioteka može sadržati imunoglobuline prema pronalasku odabrani iz grupe koju čine domeni imunoglobulina, minidomeni ili njihovi derivati.

[0163] Poželjno rešenje predmetnog pronalaska je vezivanje molekula za antigen (molekul za vezivanje antigena) koje obuhvata najmanje jedan imunoglobulinsku domen i strukturno područje petlje koje je bilo modifikovano prema predmetnom pronalasku za vezivanje za antigen, pri čemu navedeno vezivanje molekula ne uključuje varijabilni domen antitela. On može sadržavati druge delove koji se mogu upotrebiti za aktivitnosti antitela (npr. kao što su prirodna ili modifikovana efektorska područja (sekvence); međutim, njoj nedostaje "prirodno" područje vezivanja antitela, tj. varijabilni domeni u položaju njegovog prirodnog nastanka. Ti molekuli vezanja antigena prema predmetnom pronalasku imaju prednosti koja su opisana gore za navedene molekule, ali bez specifične aktivnosti vezivanja antitela, ali međutim sa novom uvedenom specifičnom aktivnosti vezivanja u strukturno područje petlje.

[0164] Prvenstveno, ti molekuli vezivanje antigena prema predmetnom pronalasku uključuju CH1, CH2, CH3, CH4, lg-kapa-C, Ig-lambda-C i njihove kombinacije; navedene kombinacije uključuju najmanje dve, prvenstveno najmanje četiri, posebno najmanje šest konstantnih domena i najmanje jedno strukturno područje petlje modifikovano prema predmetnom pronalasku. Prvenstveno, ta strukturna područja petlji su povezana preko strukturnog područja petlje koje je modifikovano prema predmetnom pronalasku ili preko strukturne petlje koja je prirodno prisutna između takva dve konstantna domena. Rešenje tih molekula koji vežu antigen prema predmetnom pronalasku sastoji se od Fc područja antitela sa najmanje jednom modifikacijom u strukturnoj petlji prema predmetnom pronalasku. Takođe za molekule koji vežu antigen prema predmetnom pronalasku povoljno je da se nova mesta vezivanja antigena u strukturnu petlju uvedu tehnologijama randomizacije, tj. izmenom jednog ili više aminokiselinskih ostataka petlje pomoću tehnika randomizacije ili uvođenjem randomski stvorenih umetaka u takve strukturne petlje. Alternativno, prednost se daje upotrebi kombinovnih pristupa.

[0165] Modifikovani imunoglobulin može imati mesto vezivanja antigena koje je strano nemođifikovanom imunoglobulinu i koje je ugrađeno u jednu ili više strukturnih petlji. Pojam "strano" znači da mesto vezivanja antigena nije nastalo prirodnim putem pomoću specifičnog područja imunoglobulina, i stranog učesnika vezivanja, već seje neprirodni učesnik vezivanja imunoglobulina povezao pomoću mesta vezivanja antigena. To znači da se učesnik vezivanja, kao stoje Fc-receptor ili efektor imunosnog sistema, ne smatra vezanim sa mestom vezivanja antigena koje je strano nemođifikovanom imunoglobulinu.

[0166] Prvenstveno, antigen je odabran iz grupe koju čine patogeni antigen, sa tumorom povezan antigen, enzim, supstrat, samo-antigen, organski molekuli ili alergeni. Još bolje, antigeni su odabrani iz grupe koju čine virusni antigeni, bakterijski antigeni ili antigeni iz patogena eukariota ili faga. Prednost se daje virusnim antigenima koji obuhvataju IIAV-, IIBV-, HCV-, HTV I-, HIV 11-, parvovirus-, gripe-, HSV-, viruse hepatitisa, flaviviruse, Westnile virus, virus ebole, Pox virus, mali pox virus, Measles Virus, virus herpesa, adenovirus, papiloma virus, polioma virus, parvovirus, rino virus, Coxsackie virus, polio virus, Echo virus, virus japanskog encefalitisa, Dengue Virus, Tick Borne virus encefalitisa, virus žute groznice, korona virus, respiratorni sincitijalni virus, virus parainfluence, La Crosse Virus, Lassa Virus, Rabies Viruse, antigene rota virusa; prvenstveno bakterijski antigeni uključuju antigene pseudomonas, mikobakterija, stafilokoka, salmonele, meningokoka, borelija, listerija, Neisseria, klostridije, ešerihije, legionele, bacila, laktobacila, streptokoka, enterokoa, Coryne bakterije, nokardije, rodokoka, Moraxella, Brucella, Campylobacter, Cardeobacterium, Francisella, Helicobacter, Haemophilus, Klebsiella, Shigella, Yersinia, Vibrio, klamidije, Leptospira, Rickettsia, miko bakterija, Treponema, Bartonella. Prednost se daje eukariotskim antigenima patogenih eukariota koji uključuju antigene Giardia, Toxoplasma, Cyclospora, Cryptosporidium, Trichinella, Yeasts, Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Blastomyces, histoplazme, koksideoide.

[0167] Imunoglobulini prema predmetnom pronalasku kojima se daje prednost uključuju najmanje dva mesta vezivanja antigena, prvo mesto vezivanja za prvi epitop, i drugo mesto vezivanja za drugi epitop.

[0168] Prema poželjnom rešenju, predloženi imunoglobulin obuhvata najmanje dva područja petlji, prvo područje petlje vezivanja na prvi epitop, i drugo područje petlje vezivanja na drugi epitop. Barem prvo ili barem drugo područje petlje ili oba mogu se nalaziti u strukturnoj petlji. Imunoglobulini prema predmetnom pronalasku uključuju njihove fragmente za koje se u struci zna da su oni funkcionalni i da sadrže bitne elemente prema predmetnom pronalasku: strukturno područje petlje modifikovano prema predmetnom pronalasku.

[0169] Prvenstveno, imunoglobulin prema predmetnom pronalasku sastavljen je od najmanje dva imunoglobulinska domena, ili njihovih delova koji uključuju minidomene, a svaki domen sadrži najmanje jedno mesto vezivanja antigena.

[0170] Takođe je poželjan imunoglobulin prema pronalasku, koji sadrži najmanje jedan domen konstantnog područja ili njegov deo koji uključuje minidomen. Tako, varijabilni domen, koji je na primer modifikovan u C-terminalnom području, ili varijabilni domen povezan za modifikovano CH1 područje, na primer modifikovani CH1 minidomen, je jedno od rešenja kojima se daje prednost.

[0171] Imunoglobulin prema pronalasku kojem se daje prednost obuhvata domen koji ima najmanje 50% homologije sa nemođifikovanom domenom.

[0172] Pojam "homologija" znači da polipeptidi imaju iste ili konzervisane ostatke na odgovarajućem položaju u svojoj primarnoj, sekundarnoj ili tercijarnoj strukturi. Pojam se takođe proteže i na dve ili više nukleotidne sekvence koje kodiraju homologne polipeptide. "Homologni domen imunoglobulina" znači domen imunoglobulina prema pronalasku koji ima najmanje oko 50%-tnu identičnost aminokiselinskih sekvenci s obzirom na urođenu sekvencu pune dužine sekvence domena imunoglobulina ili bilo koji drugi fragment pune dužine sekvence domena imunoglobulina kako je ovde opisano. Prvenstveno, homologni domen imunoglobulina imat će najmanje oko 50%-tnu identitčnost aminokiselinske sekvence, prvenstveno najmanje oko 55%-tnu identičnost aminokiselinske sekvence, još bolje najmanje oko 60%-tnu identičnost aminokiselinske sekvence, još bolje najmanje oko 65%-tnu identičnost aminokiselinske sekvence, još bolje najmanje oko 70%-tnu identičnost aminokiselinske sekvenca, još bolje najmanje oko 75%-tnu identičnost aminokiselinske sekvence, još bolje najmanje oko 80%-tnu identičnost aminokiselinske sekvence, još bolje najmanje oko 85%-tnu identičnost aminokiselinske sekvence, još bolje najmanje oko 90%-tnu identičnost aminokiselinske sekvence, još bolje najmanje okoe 95%-tnu identičnost aminokiselinske sekvence prema urođenoj sekvenci domena imunoglobulina, ili bilo koji drugi specifično definisan fragment sekvence domena imunoglobulina pune dužine kako je ovde opisano.

[0173] "Procenat (%) identičnosti aminokiselinske sekvence" s obzirom na ovde navedene imunoglobulinske sekvence domena definisan je kao procenat aminokiselinskih ostataka u sekvenci kandidata koje su identične sa aminokiselinskim ostacima u specifičnoj sekvenci domena imunoglobulina, nakon poravnavanja sekvence i umetanja raspora, ako je potrebno, da se postigne maksimalan postotak identičnosti sekvence, pri čemu se ne uzimaju u obzir nikakve konzervativne supstitucije kao deo identičnosti sekvence. Poravnavanje u svrhu određivanja procenta identičnosti aminokiselinske sekvence može se postići na razne načine koji su u struci poznati, na primer, upotrebom javno dostupnih računarskih programa kao što su programi BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNKSTAR). Stručnjak može odrediti odgovarajuće parametre za merenje poravnanja, koje uključuju bilo koji algoritam potreban za postizanje maksimalnog poravnanja po celoj dužini sekvenci koje se žele porediti.

[0174] Vrednosti u procentima za identičnost aminokiselinske sekvence mogu se dobiti kako je dole opisano upotrebom WU-BLAST-2 računarskog programa (Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)). Većina WU-BLAST-2 parametara pretraživanja su postavljeni kao zadate vrednosti. One koji nisu postavljeni kao zadate vrednosti, tj. parametri koji se mogu namestiti, namešteni su sa sledećim vrednostima: mera preklapanja = 1, preklapanje frakcije = 0,125, prag riječi (T)=ll, i matrica sabiranja = BLOSUM62. Kad se koristi VVUBLAST-2, % vrednosti identičnosti aminokiselinske sekvence se određuju deljenjem (a) broja sparivanja identičnih aminokiselinskih ostataka između aminokiselinske sekvence dotičnog imunoglobulinskog domena koji ima sekvencu dobijenu od urođenog domena imunoglobulina i poređenjem dotične aminokiselinske sekvence (tj. sekvence prema kojoj se upoređuje dotični domen imunoglobulina koji može biti domen nemodifikovanog imunoglobulina) kako je određeno pomoću WU-BLAST-2 s (b) ukupnog broja aminokiselinskih ostataka nerandomiziranih delova dotičnog domen imunoglobulina. Na primer, u izjavi "polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu A koja ima ili koje imaju najmanje 80%-tnu identičnost aminokiselinske sekvence sa aminokiselinskom sekvencom B", aminokiselinska sekvenca A se uspoređuje sa dotičnom aminokiselinskom sekvencom i aminokiselinska sekvenca Bje dotična aminokiselinska sekvenca dotičnog domena imunoglobulina.

[0175] U poželjnom rešenju prema predmetnom pronalasku imunoglobulin je bispecifično antitelo ili bispecifično antitelo jednostrukog lanca. Dalje je poželjno da imunoglobulin sadrži bispecifični domen ili njegov deo uključujući i minidomen.

[0176] Imunoglobulin prema predmetnom pronalasku može se koristiti za bilo koju svrhu poznatu u struci za imunoglobuline, ali takođe su moguće i aplikacije koje zavise od kombinacija specifičnosti uvedenih sa predmetnim pronalaskom. S tim u vezi, imunoglobulini prema predmetnom pronalasku se koriste prvenstveno za terapeutsku i profilaktičku upotrebu (npr. kao aktivna ili pasivna imunoterapija); za preparativnu i analitičku upotrebu i za dijagnostičku upotrebu.

[0177] Imunoglobulini predmetnog pronalaska mogu se upotrebiti u garnituri vezanih učesnika koji sadrže: (a) modifikovani imunoglobulin koji ima mesto vezivanja antigena stranog imunoglobulina ugrađenog u jednu ili više strukturnih petlji, i (b) vezni molekul koji sadrži epitop navedenog antigena.

[0178] Takav vezni molekul ove garniture prema predmetnom pronalasku može se upotrebiti za identifikaciju specifičnosti vezivanja modifikovanog imunoglobulina prema predmetnom pronalasku. Upotrebom veznog molekule ove garniture prema predmetnom pronalasku, može se uvrditi potencijal modifikovanog imunoglobulina prema predmetnom pronalasku.

[0179] Potencijal, kako je ovde definisano, je svojstvo vezivanja modifikovanog molekula za njegov antigen. Vezivanje se može utvrditi kvantitativno i/ili kvalitativno u pojmovima specifičnosti i/ili afiniteta i/ili prikladnosti pri upotrebi za kontrolu kalitete.

[0180] Osim toga, vezni molekulu iz garniture prema predmetnom pronalasku može se upotrebiti za selekciju modifikovanog immunoglobulina prema predmetnom pronalasku iz biblioteke koja sadrži najmanje 10, prvenstveno najmanje 100, još bolje najmanje 1000, još bolje najmanje 10000, posebno najmanje 100000 imunoglobulina s različitim modifikacijama u strukturnim petljama.

[0181] U saglasnosti sa predmetnim pronalaskom, jedna ključna osobina predmetnog pronalaska je da se modifikacija imunoglobulinskog domena odvija u područjima koja nisu normalno uključena u vezivanje antigena, drugim rečima, u područjima različitim od CDRs antitela. Bilo je zapaženo da specifičan nabor imunoglobulinskog domena omogućava uvođenje randomskih mutacija u područja koja su strukturno analogna CDR-ima, ali su različita po položaju u sekvenci. Područja navedena u predmetnom pronalasku jesu, kao CDRs, područja petlji koja povezuju beta trake imunoglobulinskog nabora.

[0182] Bolje određeno, ovde je opisano da se uvođenjem randomskih mutacija u petlje koje povezuju beta niti A-B i E-F humanog IgGl CH3 domena, biraju mutirani CH3 domeni koji se vežu specifično za Toll-u sličan receptor 9-peptida (TLR-9) ili na ,,hen egg" lisozim, a to su peptid i protein koji se normalno ne prepoznaju i vežu sa humanim CH3 domenom u IgGl. Mutacije koje smo mi uveli uključuju mutacije u kojima su odabrani aminokiselinski ostaci u divljem tipu sekvence zamenjeni sa randomski odabranim ostacima, a oni takođe uključuju ubacivanje posebnih aminokiselinskih ostataka u gore navedene petlje.

[0183] Po analogiji imunoglobulinski domeni iz bilo koje klase imunoglobulina i iz imunoglobulina iz bilo koje vrste pristupačne su za ovaj tip modifikacije. Osim toga, manipulisati se može ne samo sa specifičnom petljom na koju se cilja u predmetnom pronalasku, već se na isti način može manipulisati i sa bilo kojom petljom koja povezuje beta niti u imunoglobulinskim domenima.

[0184] Domeni imunoglobulina nakon modifikacije iz bilo kojeg organizma i iz bilo koje klase imunoglobulina može se upotrebiti prema predmetnom pronalasku kao takvi (kao jednostruki domeni), ili kao deo većeg molekula. Na primer, oni mogu biti deo intaktnog imunoglobulina, koji s tim u vezi može imati svoje "normalno" područje vezivanja antigena nastalo od 6 CDRs i novog, modifikacijom dobijeno područje vezivanja antigena. Slično tome, može se proizvesti multi-specifičan, npr. bispecifičan imunoglobulin. Domen imunoglobulina nakon modifikacije može takođe biti deo bilo kojeg proteina fuzije. Upotreba tih konstrukcijski promenjenih domena imunoglobulina spada uopšteno u područje upotrebe imunoglobulina.

[0185] Kao domeni imunoglobulina ovde se podrazumevaju sledeći domeni imunoglobulina:

za IgG, IgD i IgA: VL, CL, VH, CH1, CH2, CH3

za IgM i IgE : VL, CL, VH, CH1, CH2, CH3, CH4

1. Jednostruki domeni imunoglobulina randomizirani na jednoj strani, tj. u petlji

koja povezuje beta niti B-C, D-E ili F-G ("vrh", sa izuzećem varijabilnih domena koje su pokriveni sa mnogo patenata) ili beta niti A-B, C-D, (C-C i C"-D u slučaju varijabilnih domena) ili E-F ("dno"). Randomizirati se može jednostruka petlja ili bilo koja kombinacija petlji. Ostaci se mogu zameniti, brisati, ili se mogu umetnuti dodatni ostaci.

2. Jednostruki imunoglobulinski domeni randomizirani na obe strane, na vrhu i na dnu. 3. Bilo koji protein koji sadrži jedan od jednostruko randomiziranih domena, kao što su: a) dimeri "jednostrukog lanca CH3" (scCH3), scCH2, scCHl/CL, randomizirani na jednoj ili na obe strane, b) jednostruki lanac Fv randomiziran na "dnu", tj. na strani nasuprot CDR-ovima, c) Fab fragmenti randomizirani na "dnu", tj. na C-terminalnom kraju domena CHl i domene CL, d) Fc fragmenti (tj. proteini koji se sastoje od CH2-CH3) randomizirani na jednoj ili na obe strane,

e) celoviti imunoglobulini randomizirani na dnu Fc-a,

f) drugi pogodni domeni.

[0186] Osnovne prednosti jednostrukih domena jesu: oni su slični po svim razlozima

koji se koriste za isticanje kamiljeg VH molekula ("nanotela", vidi www.ablynx.com). Randomizirane imunoglobulinski domeni su vrlo mali proteini (molekulske mase pribl. 12-15 kDa, zavisno od broja umetnutih aminokiselinskih ostataka) i zbog toga će imati sldeće prednosti u poređenju sa konvencionalnim antitelima ili fragmentima antitela kao što su scFv i Fab-ovi: prepoznavanje neuobičajenih ili skrivenih epitopa, vezivanje u gnezdima ili aktivnim mestima proteinskih ciljeva, lagana proizvodnja i mnoge druge. U slučaju imunoglobulinskog domena koji je randomiziran na obe strane, može se dobiti bivalentni ili bispecifični molekul. Glavne prednosti jednostrukih domena kao dela proteina fuzije su dodatna svojstva vezivanja koja se mogu dobiti modifikacijom na bilo kojem drugom proteinu.

[0187] Mislilo se da se za proizvodnju proteina može upotrebiti bilo koji sistem ekspresije. Analogno jednostrukim domenima, kako je ovde opisano, mogu se pronaći antitela iz kamile, koja imaju samo VH, ali ne i VL. U tim proteinima su za vezanje antigena odgovorni samo 3 CDR-a (umesto 6 kao u "normalnom" antitelu odgovornom za vezivanje antigena).

[0188] Sledeći patentni dokumenti su ovde u celosti uvršteni kao literatura kako se dalje iznosi: US 6,294,654 Modifikovani imunoglobulinski molekul koji ugrađuje antigen u ne-CDR područje petlje,

US 5,844,094 Ciljano vezivanje polipeptida,

US 5,395,750 Postupak za proizvodnju proteina koji se vežu na prethodno određene antigene,

US 2004/0071690 Polivalentni i polispecifični reagensi visokog aviditeta,

US 2004/0018508 Surogatna antitela i postupci za njihovo dobijanje i upotrebu, US 2003/0157091 Multi-funkcionalni proteini,

US 2003/0148372 Postupak za pretraživanje biblioteka koje pokazuju fag s različitim ligandima,

US 2002/0103345 Proteini koji vežu antigen sličan bispecifičnom imunoglobulinu i postupak njihove proizvodnje,

US 2004/0097711 Imunoglobulinska superporodica proteina,

US 2004/0082508 lzlučeni proteini,

US 2004/0063924 lzlučeni proteini,

US 2004/0043424 Imunoglobulinaka superporodica proteina,

US 5,892,019 Proizvodnja imunoglobulina kodiranog sa jednim genom,

US 5,844,094 Polipeptid ciljanog vezivanja.

[0189] Predmetni pronalazak će se dalje prikazati u sledećim slikama i primerima čija svrha nije ograničenje pronalaska.

[0190] Slika la prikazuje strukturu intaktnog IgGl. Domeni su označeni sa strelicama.

[0191] Slika lb prikazuje strukturnu organizaciju glavnih izotipova monomera humanog imunoglobulina. Disulfidne veze su prikazane kao linije, N-povezane ugljovodonične grupe su prikazane kao krugovi.

[0192] Slika 2 prikazuje imunoglobulinski nabor za konstantni (levo) i varijabilni (desno) domeni imunoglobulina. Beta niti su označene sa strelicama.

[0193] Slika 3 prikazuje molekularni model konstrukcijski modifikovanog CH3 domena prema predmetnom pronalasku, sa randomiziranim delom označenim sa površinom koja je pristupačna rastvaraču.

[0194] Slika 4 prikazuje šematski PCRs upotrebljene za proizvodnju fragmenata upotrijebljenih za slaganje mutiranog CH3 domena. PCR prajmeri su označeni strelicama sa njihovom pripadnom 5'-3' orijentacijom, i vertikalne linije označavaju približne položaje uvedenih mesta ograničenja koja su upotrebljena za slaganje imitiranog gena. Sledeća mesta ograničenja nalaze se na prajmerima za ligacije PCR fragmenata: CH3LNCO: Ncol; CH3LSAC i CH3CSAC: Sacl; CH3CHIN i CH3RHIN: HindJII; CH3RNOT: Noti.

[0195] Slika 5 prikazuje neke primere kako se imunoglobulinski domeni ove prijave mogu upotrebiti. Randomizirana područja su označena sa simbolom zvezdice. Specifičnosti randomiziranih područja u jednom molekulu mogu biti jednake ili različite.

[0196] Slika 6 prikazuje šematsku konstrukciju bispecifično modifikovanog CH3 domena. Nazivi prajmera dati su u poljima a strelice označavaju smer u kojem se prajmeri produžuju. Polja sa kosim linijama označavaju relativne položaje područja koja su randomizirana u ovom konstruktu, polja sa vertikalnim linjama pokazuju relativne položaje područja koja su bila uvedena za stvaranje klona C24, i prikazana su mesta ograničenja upotrebljena za postupak kloniranja.

[0197] Slika 7 prikazuje šematski konstrukciju bispecifično modifikovanog CH3 domena. Nukleotidna sekvenca i njezina translacija prikazana je na osnovi konstrukcije bispecifično modifikovanog CH3 domena. Crvene sekvence pokazuju randomizirana područja da bi se stvorio bispecifičan konstrukt, dok zelena polja pokazuju područja u kojima je sekvenca bila randomizirana da bi se stvorio klon C24.

[0198] Slika 8 prikazuje listu sekvenci koje su ovde opisane.

OPIS SPECIFIČNIH PRIMERA:

Primer 1: Konstrukcija CH3 biblioteke i pokazivanje površine faga

[0199] Kristalna struktura fragmenta IgGl Fc, koja je objavljena u Brookhaven Database kao ulaz 10QO.pdb upotrebljena je kao pomoć u konstrukciji mutiranog CH3 domena.

[0200] Sekvenca koja je upotrebljena kao osnova za konstrukciju CH3 biblioteke data je u SEQ ID br. I. U toj sekvenci, prva amino kiselina odgovara prolinu 343 iz lanca Brookhaven database entry loqo.pdb. Poslednji ostatak koji se nalazi u loqo.pdb je serin 102 iz SEQ ID br. 1. Nakon detaljne analize strukture loqo.pdb i vizualne kontrole ostataka koji obrazuju petlju koja povezuje beta niti, odlučeno je da se randomiziraju ostaci 17, 18 i 19, koji su deo petlje koja povezuje beta traku A-B, kao takođe i 71, 72, 73, 76, i 77, koje su deo petlje koja povezuje beta niti E-F u SEQ ID br. 1. Molekularni model modifikovanog CH3 domena, sa randomiziranim delom pokazan pomoću površine dostupne rastvaraču prikazan je na slici 3. Modifikovani gen je proizveden pomoću niza PCR reakcija, nakon kojih je sledila ligacija dobijenih PCR proizvoda. Da bi sc olakšala ligacija, neki kodoni nukleotidne sekvence koji kodiraju za SEQ ID br. 1 su modifikovani za proizvodnju mesta ograničenja bez izmene aminokiselinskih sekvenci (tihe mutacije). Za umetanje u vektor kloniranja pHENl (Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11;19(15):4133-7. Multi-subunit proteins on the surface of filamentous phage: methodologies for displaying antibody (Fab) heavy and light ehains. Hoogenboom HR, Griffiths AD, Johnson KS, Chiswell DJ, Hudson P, VVinter G.) u okvir sa pelB sekrecijskim signalom, ekstra nukleotidni ostaci koji kodiraju Met-Ala su povezani na 5' kraj sekvence za stvaranje mesta ograničenja Ncol. Za randomizirane ostatke, odabran je kodon NNS (IUPAC kod, gde S znači C ili G) koji kodira svih 20 amino kiselina koje nastaju prirodnim putem, ali izbegava 2 izvan 3 zaustavna kodona. Modifikovana sekvenca je data kao nukleotidna sekvenca u SEQ ID br. 2 i kao aminokiselinska sekvenca u SEQ ID br. 3. Slovo X u SEQ ID br. 3 označava randomizirane aminokiselinske ostatke. Sekvence PCR prajmera upotrebljene za slaganje mutiranog CH3 domena date su u SEQ ID br. 4 do 9. Slika 4 prikazuje šematski PCR fragmente stvorene za slaganje mutiranih gena, i prajmere upotrebljene u tu svrhu.

[0201] cDNK teškog lanca humanog monoklonskog antitela 3D6 (Felgenhauer M, Kohl J, RUker F. Nucleotide sekvences of cD-NAs eneoding V-regions of H- i L-chains of human monoclona! antibođy specific to HIV-l-gp41. Nucleic Acids Res. 1990 Aug 25;18(I6):4927) je upotrebljena kao šablona za PCR reakcije. 3 PCR proizvodi su probavljeni sa Sad i/ili Hindlll i međusobno povezani. Proizvod povezivanja je dalje probavljen sa Ncol i Noti i povezan u fagemid vektor pHENl koji pokazuje površinu, koji je prethodno bio probavljen sa Ncol i Noti. Broj odabranih klonova je kontrolisano restrikcijskom analizom i sekvenciranjem DNK i pronađeno je da sadrži planirani umetak, uključivši pravilno umetnute randomizirane sekvence. Za sledeće korake dobijanja faga, usledili su standardni protokoli. Ukratko, smeša za povezivanje je prenesena u ćelije E. coli TG1 pomoću elektroporacije. Zatim su čestice faga spašene iz ćelija E. coli TG1 sa pomoćnim fagom M13-K07. Čestice faga su zatim istaložene iz supernatanta kulture sa PEG/NaCl u 2 koraka, rastvorene u vodi i upotrebljene za selekciju ispiranjem ili, alternativno, one su smeštene na minus 80°C.

Primer 2: Konstrukcija CH3+3 biblioteke

[0202] Ova biblioteka je konstruisana i klonirana na isti način kao i CH3 biblioteka. Aminokiselinska sekvenca konstrukta data je u SEQ ID br. 10, koja odgovora nukleotidnoj sekvenci u SEQ ID br. 11, i prajmeri upotrebljeni za konstrukciju su bili SEO ID br. 4-7, SEO ID br. 9 i SEQ ID br. 12.

Primer 3: Konstrukcija CH3+5 biblioteke

[0203] Ova biblioteka je konstruisana i klonirana na isti način kao CH3 biblioteka. Aminokiselinska sekvenca konstrukta data je u SEQ ID br. 13, koja odgovara nukleotidnoj sekvenci u SEQ ID br. 14, i prajmeri upotrebljeni za konstrukciju bili su SEQ ID br. 4-7, SEQ ID br. 9 i SEO ID br. 15.

Primer 4: Ispiranje CH3 - faga biblioteke na TLR-9 peptidu

[0204] 3 kruga ispiranja izvedeno je prema standardnim protokolima. Ukratko, primijenjena je sledeća metoda. Pločice Maxisorp sa 96 rupica (Nunc) su prevučene sa sintetičkim peptidom koji predstavlja deo sekvence Tollu sličnog receptora 9 (TLR-9). 200 u.1 sledećeg rastvora dodano je u svaku rupicu: 0,1 M Na-karbonatni pufer, pH 9,6, sa sledećim koncentracijama rastvorenog peptida:

1. krug ispiranja: 1 mg/ml TLR-9 peptida,

2. krug ispiranja: 500 ug/ml TLR-9 peptida,

3. krug ispiranja: 100fig/ml TLR-9 peptida.

[0205] Inkubacija je bila 1 sat pri 37°C, zatim je sledilo blokiranje sa 2% suvim mlekom (M-PBS) sa 200 ul po rupici tokom I sata na sobnoj temperaturi.

[0206] Biblioteki koja pokazuje površinu faga je zatim omogućena reakcija s vezanim peptidom dodatkom 100 jul suspenzije faga i 100/al 4%-tnog suvog mleka (M-PBS), a zatim je inkubirano 45 minuta uz mućkanje i 90 minuta bez mućkanja na sobnoj temperaturi.

[0207] Nepovezane čestice faga su isprane kako sledi. Nakon 1. kruga ispiranja 10 x 300 u.1 T-PBS, 5 x 300 u.1 PBS; nakon 2. kruga ispiranja: 15 x 300 ul T-PBS, 10 x 300 ul PBS; nakon 3. kruga ispiranja: 20 x 300 uj T-PBS, 20 x 300fil PBS.

[0208] Ispiranje povezanih čestica faga izvedeno je dodatkom 200 u.1 po rupici 0,1 M glicina, pH 2,2, i inkubacijom uz mućkanje 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je suspenzija faga neutralisana dodatkom 60 u.1 2M Tris baze, i zatim je inficirana u ćelije E. coli TG1 mešanjem 10 ml eksponencijalno rastuće kulture sa 0,5 ml ispranog faga i inkubacijom 30 minuta na 37°C. Na kraju su inficirane bakterije stavljene na pločice na TYE medijum sa 1% glukozom i 100 u.g/ml ampicilinom i inkubirane preko noći na 30°C.

Primer 5: Kloniranje odabranih klonova CH3 mutanata

odabranih prema TLR-9 za rastvorljivu ekspresiju

[0209] Fagemid DNK iz faga odabranog kroz 3 kruga ispiranja izolovan je sa midi-prep. DNK koja kodira mutirana CH3 područja i po šaržama je povećan pomoću PCR i kloniranog Ncol-NotI u vektoru pNOTBAD/Myc-His, koji je E. coli vektor ekspresije pBAD/Myc-His (Invitrogen) sa umetnutim Noti mestom ograničenja da se olakša kloniranje. Povezani konstrukti su prenešeni elektroporacijom u ćelije E. coli LMG194 (Invitrogen) i rasli su preko noći na 30°C na TYE mediju sa 1% glukozom i ampicilinom. Odabrani klonovi su inokulisani u 200 u.1 2xYT medijuma sa ampicilinom, rasli su preko noći na 30°C, i inducirani dodatkom L-arabinoze do krajnje koncentracije od 0,1%. Nakon ekspresije preko noći na 16°C, ćelije u skupljene centrifugiranjem i obrađene sa 100 uJ Na-boratnog pufera, pH 8,0, preko noći na 4°C za dobijanje periplazmičkih ekstrakata. 50 (al periplazmičkih ekstrakata je upotrebljeno za ELISA (vidi dole).

Primer 6: ELISA CH3 mutanata odabranih prema TLR-9

Odabrani klonovi su ispitani u pogledu specifičnog vezivanja za TLR-9 peptid pomoću

ELISA.

[0210] Prevlačenje: Mikrotitarska pločica (NUNC, Maxisorp), 100 u.1 po rupici, 20 u.g TLR-9 peptida/ml 0,1 M Na-karbonatnog pufera, pH 9,6, lh pri 37°C.

Ispiranje: 3 x 200 p.1 PBS

Blokiranje: 1%BSA-PBS, lh na sobnoj temperaturi

Ispiranje: 3 x 200 u.1 PBS

Vezivanje periplazmičkog ekstrakta: 50 uJ periplazmičkog

ekstrakta, 50 u.1 2% BSA-PBS, na sobnoj temperaturi

preko noći.

Ispiranje: 3 x 200 uJ PBS

1. antitelo: anti-His4 (Ojagen), 1:1000 u 1% BSA-PBS, 90

min na sobnoj temperaturi 100 u.1 po rupici.

Ispiranje: 3 x 200 ul PBS

2. antitelo: kozji anti mišji* HRP (SIGMA), 1:1000 u 1%

BSA-PBS, 90 min na sobnoj temperaturi, 100 u.1 po rupici.

Ispiranje: 3 x 200 uJ PBS

Detekcija: 3 mg/ml OPD u Na-citratnom/fosfatnom puferu, pH

4,5, 0,4 ul 30% H202.

Zaustavljanje: 100 ml 3M H2S04.

Očitavanje apsorpcije: 492/620 nm

[0211] Klonovi koji su dali visok signal u toj prvoj, preliminarnoj analizi ELISA su uzgajani u zapremini od 20 ml pod istim usiovima kao što je gore opisano. Njihovi periplazmički ekstrakti su izolovani u 1/20 zapremini kulture kao što je gore opisano i ispitani pomoću ELISA (kao što je gore opisano) zbog potvrđivanja.

Primer 7: ispiranje CH3 i CH3+5 - fag biblioteka na hen egg lisozimu

[0212] Izvršena su 3 kruga ispiranja. Maxisorp pločice sa 96 rupica (Nunc) su prevučene sa hen egg lisozimom, sa dodatkom 200 u.1 slijedećeg rastvora po rupici:

PBS, sledećih koncentracija rastvorenog hen egg lisozima:

1. krug ispiranja: 2 mg/ml HEL

2. krug ispiranja: 1 mg/ml HEL

3. krug ispiranja: 1 mg/ml HEL

[0213] Inkubacija je bila 1 sat na 37°C, zatim seje blokiralo sa 2% suvim mlekom (M-PBS) s 200 u.1 po rupici 1 sat na sobnoj temperaturi.

[0214] Biblioteki koja pokazuje površinu faga je zatim omogućena reakcija sa povezanim hen egg lisozimom dodatkom 100 u.1 suspenzije faga i 100 ul 4% suvog mleka (M-PBS), zatim je inkubirano 45 minuta uz mućkanje i 90 minuta bez mućkanja na sobnoj temperaturi.

[0215] Nepovezane čestice faga su isprane kako sledi:

1. krug ispiranja: 10 x 300 jal T-PBS, 5 x 300 ul PBS

2. krug ispiranja: 15 x 300 ul T-PBS, 10 x 300 ui PBS

3. krug ispiranja: 20 x 300 |al T-PBS, 20 x 300 (al PBS

[0216] Ispiranje vezanih čestica faga izvedeno je dodatkom 200 uJ po rupici 0,1 M glicina, pli 2,2, i inkubacijom uz mućkanje 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim je suspenzija faga neutralisana dodatkom 60 u.1 2M Tris-Base, zatim infekcijom u ćelijama E. coli TG1 sa smešom od 10 ml za eksponencijalan rast kulture sa 0,5 ml ispranog faga i inkubacijom 30 minuta na 37°C. Na kraju, inficirane bakterije su stavljene na pločicu na TYE medij um sa 1% glukozom i 100 p.g/ml ampicilinom i inkubirane su preko noći na 30°C.

Primer 8: Kloniranje odabranih klonova iz primera 7 za rastvorljivu ekspresiju

[0217] Kloniranje odabranih klonova za rastvorljivu ekspresiju izvedeno je kao što je gore opisano za CH3 mutante odabrane prema TLR-9.

Primer 9: Rastvorljiva ekspresija odabranih klonova iz primera 7

[0218] Rastvorljiva ekspresija odabranih klonova izvedena je kao što je gore opisano za CH3 mutante odabrane prema TLR-9. Periplazmički ekstrakti su ispitani u preliminarnim analizama ELISA (protokol vidi u primeru 10).

[0219] Klonovi koji su dali visok signal u toj prvoj, preliminarnoj analizi ELISA uzgajani su u zapremini od 20 ml pod istim uslovima kao što su gore opisani. Njihovi periplazmički ekstrakti su izolovni u 1/20 zapremini kulture kako je gore opisano i ispitani su pomoću ELISA (kao što je opisano u primeru 10) zbog potvrđivanja.

Primer 10: ELISA CH3 mutanata odabranih prema hen egg lisozimu

[0220]

Prevlačenje: Mikrotitarska pločica (NUNC, Maxisorp), 100 p.1 po

rupici, 100 ug hen egg lisozima/ml u PBS-u, 1 h na 37°C.

Ispiranje: 3 x200 u.1 PBS

Blokiranje: 1% BSA-PBS, 1 h na sobnoj temperaturi

Ispiranje: 3 x200 u.1 PBS

Vezivanje periplazmičkog ekstrakta: 50 u.1 periplazmičkog ekstrakta 50 p.12%BSA-PBS, na sobnoj temperaturi preko noći

Ispiranje: 3 x 200 ul PBS

1. antitelo: anti-His4 (Qiagen), 1:1000 u 1% BSA-PBS, 90

min na sobnoj temperaturi 100 u.1 po rupici

Ispiranje: 3 x 200 u.1 PBS

2. antitelo: kozji anti mišji<*>HRP (SIGMA), 1:1000 u 1% BSA-

PBS, 90 min na sobnoj temperaturi (sobna temperatura),

100 p.1 po rupici

Ispiranje: 3 x 200 u.1 PBS

Detekcija: 3 mg/ml OPD u Na-citratni/fosfatni pufer, pH 4,5, 0,4 p.1 30% H202Zaustavljanje: 100 ml 3M H2S04

Očitavanje apsorpcije: 492/620 nm

[0221] Opaženo je da hen egg lisozim reaguje sa anti-his4 antitelom, pa je zbog toga opažena relativno visoka pozadina.

Primer 11: CL biblioteka

[0222] Vizualna kontrola kristalne strukture Fab fragmenta (upotrebljena je struktura Fab humanog monoklonskog antitela 3D6: RSCB Protein Data Bank http://www.rcsb.org/pdb/) Entry 1DFB.PDB (He XM, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1992 Aug l ;89( 15):7154-8) i računarom potpomognuta analiza (npr. Protein Explorerje upotrijebljen za tu svrhu (http://molvis.sdsc.edu/protexpl/frntdoor.htm)) sekundarne i tercijarne strukture ovog proteina) omogućuje identifikaciju ostataka koji se nalaze u područjima petlje koja povezuju beta niti kostura CL-domena. Ti ostaci uključuju amino kiseline 8 do 18, amino kiseline 27 do 35, amino kiseline 42 do 78, amino kiseline 83 do 85, amino kiseline 92 do 100, amino kiseline 108 do 117 i amino kiseline 123 do 126 (brojčane oznake prema IMGT sistemu (Lefranc MP, et al. Nucleic Acids Res. 2005 Jan 1:33 (Database issue):D593-7; Lefranc MP, et al. Dev Comp Imunol. 2005;29(3): 185-203)).

[0223] Pobliže, ostaci 11, 12, 14-18 i 92-95 su randomizirani unutar humanog CL domena (SEQ ID br. 48). Randomizacija je postignuta sa PCR povećavanjem kodnih sekvenci sa PCR prajmerima u kojima su položaji relevantnih kodona kodirani sa nukleotidnom sekvencom 5'-NNS-3', koja potencijalno kodira za svih 20 amino kiselina, dok izbegava 2 od 3 zaustavna kodona. Umetak biblioteke je povećan sa dve odvojene PCR reakcije, i dva PCR fragmenta su povezana zajedno preko HpyCH4IV mesta ograničenja koje je uvedeno kao tiha mutacija pomoću PCR prajmera. Prajmeri dalje osiguravaju ograničenje mesta endonukleaze Ncol i Noti za kloniranje u vektor pHEN koji pokazuje fag (Hoogenboom HR, et al. Nucleic Acids Res. 1991 Aug 11;19(15):4133-7). C-terminalni cistein iz CL domena nije uključen za pokazivanje faga, ali se može dodati kasnije kad se modifikovani CL klon upotrebljava npr. za konstrukciju Fab fragmenta.

[0224] Kao šablona za PCR povećavanje upotrebljen je plazmid kao što je pRcCMV-3D6LC (Riiker F, et al. Ann N Y Acad Sci. 199] Dec 27;646:212-9), koji kao umetak sadrži kompletan laki lanac humanog monoklonskog antitela.

[0225] Za CL+3 (SEO ID br. 50, 51) i CL+5 (SEQ ID br. 52, 53) biblioteke, koje sadrže dodatne ostatke umetnute između položaja 92 i 95 CL domena, upotrebljeni su prajmeri CLRHPY3 i CLRHPY5 umesto prajmera CLRHPY.

[0226] Dole je prikazana nukleotiDNK i aminokiselinska sekvenca krajnjeg proizvoda PCRs i povezivanja, klonirana u Ncol mesto od pHENl, koji vodi do povezivanja pelB vodeće sekvence na N-kraj konstrukta (SEO ID br. 48, 49):

Lista prajmera za CL biblioteku:

[0204J

[0227] Broj odabranih klonova biblioteke (mutirani CL domeni klonirani u fagmid vektor pHENl) kontroliše se pomoću restrikcijske analize i pomoću DNK sekvenciranja da li sadrže umetak kako je planirano, uključivši i pravilno umetnute randomizirane sekvence. Za sledeće korake dobijanja faga, slede standardi protokoli. Ukratko, smeša za povezivanje se prenosi eletroporacijom u TG1 ćelije E. coli. Zatim se fag čestice spašavaju iz ćelije E. coli TG1 sa pomagačem fag M13-K07. Fag čestice se zatim istalože iz supernatanta kulture sa PEG/NaCl u 2 koraka, rastvore se u vodi i koriste se za selekciju ispiranjem, alternativno, one se mogu spremiti na minus 80°C.

Primer 12: CH1 biblioteka

[0228] Vizualna kontrola kristalne strukture Fab fragmenta (upotrebljena je struktura Fab humanog monoklonskog antitela 3D6: RSCB Protein Data Bank Entry 1DFB.PDB) i računarom potpomognuta analiza (za tu svrhu korištenje Protein Explorer) sekundarne i tercijarne strukture tih proteina omogućuju identifikaciju ostataka koji se nalaze u područjima petlji koje povezuju beta niti kostura CH1-domena. Ti ostaci uključuju amino kiseline 7 do 21, amino kiseline 25 do 39, amino kiseline 41 do 81, amino kiseline 83 do 85, amino kiseline 89 do 103 i amino kiseline 106 do 117 (brojčane oznake prema IMGT sistemu brojčanog označavanja).

[0229] Pobliže, ostaci 12-19 i 93-100 su randomizirani unutar humanog CH1 domena (SEQ ID br. 54, 55). Randomizacija je postignuta pomoću PCR amplifikacije kodnih sekvenci sa PCR prajmerima u kojima su položaji relevantnih kodona kodirani sa nukleotidnom sekvencom 5'-NNS-3', koja potencijalno kodira za svih 20 amino kiselina, dok izvbegava 2 od 3 zaustavna kodona. Umetak biblioteke se uvećava pomoću dve odvojene PCR reakcije, i dva PCR fragmenta se povezuju zajedno preko BstEll mesta restrikciije koje se pojavljuje prirodnim putem u CH1 domenu. Prajmeri dalje osiguravaju mesto restrikcije endonukleaze Ncol i Noti za kloniranje u vektor pHEN koji pokazuje fag. C-terminalni cistein u CH1 domenu nije uključen za pokazivanje faga, već se on može dodati kasnije ako se upotrebljava modifikovani CH1 klon, npr. za konstrukciju Fab fragmenta.

[0230] Kao šablona za PCR povećavanje upotrijebljen je plazmid kao stoje pRcCMV-3D6HC, koji kao umetak sadrži kompletan teški lanac humanog monoklonskog antitela.

[0231] Dolje je prikazana nukleotiDNK i aminokiselinska sekvenca krajnjeg proizvoda PCRs i povezivanja, klonirana u Ncol mesto u pHENl, što dovodi do povezivanja pelB vodeće sekvence naN-kraju konstrukta (SEQ ID br. 54, 55):

Lista prajmera za CH1 biblioteku

[0232]

[0233] Broj odabranih klonova biblioteke (mutirani CH1 domeni klonirani u fagmid.vektor pHENl) se kontroliše restrikcijskom analizom i pomoću DNK sekvenciranja u pogledu sadržaja umetka prema planu, uključivši i pravilno umetnute randomizirane sekvence. Za sledeće korake dobijanja faga slede zatim standardni protokoli. Ukratko, smeša za povezivanje se prenosi elektroporacijom u E. coli ćelije TGI. Zatim se fag čestice spašava od E. coli ćelije TG1 sa pomagačem fag M13-K07. Čestice faga se zatim istalože iz supernatanta kulture sa PEG/NaCl u 2 koraka, rastvore se u vodi i koriste se za selekciju ispiranjem, alternativno, one se mogu spremiti na minus 80°C.

Primer 13: Ispiranje CHI - fag biblioteke na hen egg lisozim (HEL)

[0234] 3 kruga ispiranja izvode se sa CHI - fag bibliotekom (vidi primer 12). Maxisorp pločice sa 96 rupica (Nunc) se prevuku s hen egg lisozimom dodatkom 200 u.1 sledećeg rastvora po rupici: PBS, sa sledećim koncentracijama rastvorenog hen egg lisozima:

1. krug ispiranja: 2 mg/ml HEL

2. krug ispiranja: 1 mg/ml HEL

3. krug ispiranja: 1 mg/ml HEL

[0235] Inkubacija je I sat na 37°C, zatim se blokira sa 2% suvim mlekom (M-PBS) sa 200 uf po rupici 1 sat na sobnoj temperaturi.

[0236] Površini koja pokazuje fag biblioteku se zatim omogući reakcija sa povezanim hen egg lisozimom dodatkom 100 u.1 suspenzije faga i 100 u.1 4% suvog mleka (M-PBS), zatim se inkubira 45 minuta uz mućkanje i 90 minuta bez mućkanja na sobnoj temperaturi.

[0237] Nepovezane fag čestice se isperu kako sledi:

1. krug ispiranja: 10 x 300 ul T-PBS, 5 x 300 p.1 PBS

2. krug ispiranja: 15 x 300 ul T-PBS, 10 x 300 ul PBS

3. krug ispiranja: 20 x 300 ul T-PBS, 20 x 300 ul PBS

[0238] Ispiranje povezanih fag čestica se vrši dodatkom 200 jal po rupici 0,1 M glicina, pH 2,2, i inkubacijom uz mućkanje 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim se suspenzija faga neutrališe dodatkom 60 ul 2M Tris-Base, zatim se inficira u ćelije TG1 E. coli pomoću mešavine od 10 ml za eksponencijalan rast kulture sa 0,5 ml ispranog faga i inkubacijom 30 minuta na 37°C. Na kraju, inficirane bakterije se stave na pločice sa medijem TYE i sa 1% glukozom i 100 ug/ml ampicilinom, i inkubira se na 30°C preko noći.

Kloniranje odabranih klonova CHI mutanata odabranih prema lisozimu za rastvorljivu

ekspresiju

[0239] Fagmid DNK iz faga odabran kroz 3 kruga ispiranja se izoluje sa midi-prep. DNK, kodira mutirani CHI-domen se po šaržama povećava pomoću PCR i klonira se Ncol-NotI u vektor pNOTBAD/Myc-His, koji je E. coli vektor ekspresije pBAD/Myc-His (Invitrogen) s umetnutim Noti mestom restrikcije da se olakša kloniranje. Povezani konstrukti se prenesu elektroporacijom u E. coli ćelije LMG194 (Invitrogen) i rastu na 30°C na medijumu TYE sa 1% glukozom i ampicilinom preko noći. Odabrani klonovi se inokulišu u 200 ul 2xYT medija sa ampicilinom, rastu preko noći na 30°C i induciraju se dodatkom L-arabinoze do krajnje koncentracije od 0,1%. Nakon ekspresije na I6°C preko noći, ćelije se skupe centrifugiranjem i obrade se sa 100 ul Na-boratnog pufera, pH 8,0, na 4°C preko noći za dobijanje periplazmičkih ekstrakata. 50 ul periplazmičkih ekstrakata se koristi za ELISA-u.

[0240] Klonovi koji daju visok signal u ovom prvom, preliminarnoj ELISA analizi uzgajaju se u zapremini od 20 ml pod istim uslovima kao što je gore opisano. Njihovi periplazmički ekstrakti se izoluju u 1/20 zapremini kulture kao što je gore opisano i ispitaju se pomoću ELISA (kao stoje opisano dole) zbog potvrđivanja.

ELISA CHI mutanata odabranih prema hen egg lisozimu

[0241]

Prevlačenje: Mikrotitarska pločica (NUNC, Maxisorp), 100 ul po rupici, 100 ug hen egg lisozima/ml u PBS-u, 1 h na 37°C

Ispiranje: 3 x 200 ul PBS

Blokiranje: 1% BSA-PBS, 1 h na sobnoj temperaturi

Ispiranje: 3 x 200 ul PBS

Vezanje periplazmičkog ekstrakta: 50 ul periplazmičkog ekstrakta 50 ul 2% BSA-PBS, na sobnoj temperaturi preko noći

Ispiranje: 3 x 200 ul PBS

1. antitelo: anti-His4 (Qiagen), 1:1000 u 1% BSA-PBS, 90

min na sobnoj temperaturi 100 u.1 po rupici

Ispiranje: 3 x 200 ul PBS

2. antitelo: kozji anti mišji<*>HRP (S1GMA), 1:1000 u 1% BSA-

PBS. 90 min na sobnoj temperaturi 100 ul po rupici

Ispiranje: 3 x 200 ul PBS

Detekcija : 3 mg/ml OPD u Na-citratnom/fosfatnom puferu, pH 4,5, 0,4 ul 30% H202

Zaustavljanje: 100 ml 3M H2S04

Očitavanje apsorpcije: 492/620 nm

[0242] Klonovi se smatraju pozitivnim ako je njihov ELISA signal najmanje tri puta veći od pozadinskog signala.

Primer 14: Ispiranje CL - fag biblioteke na hen egg lisozimu (HEL)

[0243] 3 kruga ispiranja se izvode sa CL - fag bibliotekom (vidi primer 11). Maxisorp pločice sa 96 rupica (Nunc) se prevlače sa hen egg lisozimom dodatkom 200 ul sledećeg rastvora po rupici: PBS, sa sledećim koncentracijama rastvorenog hen egg lisozima:

1. krug ispiranja: 2 mg/ml HEL

2. krug ispiranja: 1 mg/ml HEL

3. krug ispiranja: 1 mg/ml HEL

[0244] Inkubacija je 1 sat na 37°C, zatim blokiranje sa 2%-tnim suvim mlekom (M-PBS) s 200 ul po rupici 1 sat na sobnoj temperaturi.

[0245] Površini koja pokazuje biblioteku faga se zatim omogući reakcija sa povezanim hen egg lisozimom dodatkom 100 ul suspenzije faga i 100 ul 4%-tnog suvog mleka (M-PBS), zatim se inkubira 45 minuta uz mućkanje i 90 minuta bez mućkanja na sobnoj temperaturi.

[0246] Nepovezane fag čestice se isperu kako sledi:

1. krug ispiranja: 10 x 300 ul T-PBS, 5x 300 ul PBS

2. krug ispiranja: 15 x 300 ul T-PBS, 10x 300 ul PBS

3. krug ispiranja: 20 x 300 ul T-PBS, 20 x 300 ul PBS

[0247] Ispiranje povezanih fag čestice se izvodi dodatkom 200 ul po rupici 0,1 M glicina, pH 2,2, i inkubacijom uz mućkanje 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim se suspenziju faga neutrališe dodatkom 60 ul 2M Tris baze, zatim se vrši infekcija u TG1 ćelije E. coli pomoću mešavine od 10 ml kulture za eksponencijalni rast sa 0,5 ml ispranog faga i inkubacijom 30 minuta na 37°C. Na kraju se inficirane bakterije stave u pločicu na TYE medijumu sa 1% glukozom i 100 ug/ml ampicilinom i inkubira se na 30°C preko noći.

Kloniranje odabranih klonova CL mutanata odabranih prema lisozimu za rastvorljivu

ekspresiju

[0248] Fagmid DNK iz faga odabranog kroz 3 kruga ispiranja se izoluje sa midi-prep. DNK, kodira mutirani CL-domen se poveća po šaržama pomoću PCR i kloniranog Ncol-Notl u vektoru pNOTBAD/Myc-His, koji je vektor ekspresije pBAD/Myc-His E. coli (Invitrogen) sa umetnutim Noti mestom ograničenja da se olakša kloniranje. Povezani konstrukti se prenesu elektroporacijom u ćelije LMG194 E. coli (Invitrogen) i rastu na 30°C na medijumu TYE sa 1% glukozom i ampicilinom preko noći. Odabrani klonovi se inokuliraju u 200 ul 2xYT medija sa ampicilinom, rastu preko noći na 30°C i induciraju se dodatkom L-arabinoze do kranje koncentracije od 0,1%. Nakon ekspresije na 16°C preko noći, ćelije se skupe centrifugiranjem i obrade sa 100 ul Na-boratnog pufera, pH 8,0, pri 4°C preko noći za dobijanje periplazmičkih ekstrakata. 50 ul periplazmičkih ekstrakata se koristi za ELISA-u.

[0249] Klonovi koji daju visok signal u toj prvoj, preliminarnoj ELISA analizi se uzgajaju u zapremini od 20 ml pod istim uslovima kao što je gore opisano. Njihovi periplazmički ekstrakti se izoluju u 1/20 zapremini kulture kao što je gore opisano i ispitaju se pomoću ELISA (kao što je opisano dole) zbog potvrđivanja.

ELISA za CL mutante odabrane prema hen egg lisozimu

[0250]

Prevlačenje: Mikrotitarska pločica (NUNC, Maxisorp), 100 ul po rupici, 100 ug hen egg lisozima/ml u PBS-u, I h na 37°C

Ispiranje: 3 x200 uf PBS

Blokiranje: 1% BSA-PBS, 1 h na sobnoj temperaturi

Ispiranje: 3 x 200 ul PBS

Vezivanje periplazmičkog ekstrakta: 50 ul periplazmičkog ekstrakta 50 ul 2% BSA-PBS, na sobnoj temperaturi preko noći

Ispiranje: 3 x 200 ul PBS

1. antitelo: anti-His4 (Oiagen), 1:1000 u 1% BSA-PBS, 90

min na sobnoj temperaturi 100 ul po rupici

Ispiranje: 3 x 200 ul PBS

2. antitelo: kozji anti mišji<*>HRP (SIGMA), 1:1000 u 1% BSA-

PBS, 90 min na sobnoj temperaturi 100 u.1 po rupici

Ispiranje: 3 x 200 ul PBS

Detekcija : 3 mg/ml OPD u Na-citratnom/fosfatnom puferu, pH 4,5, 0,4 u.1 30% H2O2

Zaustavljanje: 100 ml 3M H2S04

Očitavanje apsorpcije: 492/620 nm

[0251] Klonovi se smatraju pozitivnim ako je njihov ELISA signal najmanje tri puta veći od pozadinskog signala.

[0252] Primer 15: Konstrukcija imunoglobulinske domene koja je randomizirana na obje strane (bispecifično modificirana CH3 domena)

[0253] Ovaj primer opisuje modifikovani domen imunoglobulina sa dve specifičnosti vezivanje.

[0254] Konstrukcija ovog modifikovanog domena imunoglobulina uključuje sledcću strategiju: • modifikovani CH3 domen, klon C24 (vidi primer 10), dobijena od CH3+5 biblioteke koje se veže specifično na lisozim upotrebljena je kao polazni materijal, • ostaci koji se žele randomizirati se identifikuju u toj modifikovanom CH3 domenu koja povezuje 6-niti imunoglobulinskog nabora, i koja se nalazi na suprotnoj strani domena u poređenju sa ostacima koji su mutirani pri stvaranju klona C24, • PCR prajmeri su konstruisani tako da omogućuju randomizaciju tih ostataka i sintezu tog modificiranog imunoglobulinskog domena postupkom koji je sličan gore opisanom postupku za biblioteke CH3, CH3+3 i CH3+5.

[0255] 4 PCR proizvoda koji imaju randomizirane položaje su povezani i umeci pune dužine su povećani pomoću PCR. Zatim su oni klonirani u pHEN-1 preko mesta Ncol-Notl i transformisani u TG-1 ćelijama E. coli za konstrukt biblioteka od otprilike 108 kolonija. 20 randomski odabranih kolonija je sekvencisano i pronađeno je da su randomizirani položaji nezavisno mutirani. Takođe, nije opažen nijedan "divlji tip"

(C24) sekvence. Biblioteka faga je stvorena po standardnim protokolima, i dobijen je titar faga od 6,32 x 1010 TU/ml.

[0256] Za ispitivanje bispecifičnosti, rekombinantni humani eritropojetin (rhEPO) je odabran kao drugi antigen, dok se očekivalo da je konstrukt zadržao njegovu izvorno modifikovanu specifičnost za hen egg lisozim. rhEPO-reaktivan fag je odabran u 4 kruga ispiranja. Da bi sačuvalo populaciju C24 klonova koji bi nakon mutageneze i dalje trebali vezivati hen egg lisozim, prvi krug selekcije na rhEPO je popraćen sa krugom ispiranja faga populacije na hen egg lisozimu (1 mg/ml u PBS). 200ulrhEPO je prevučeno na 5 rupica mikrotitarske pločice (Maxisorp, Nunc) u 0,1 M Na-karbonatnom puferu, pH 9,6, u opadajućim koncentracijama u uzastopnim krugovima ispiranja (vidi dole tabelu). Nakon blokiranja sa 2% M-PBS, fagi u sredstvu za blokiranje je omogućeno vezivanje na sobnoj temperaturi tokom 2 h. Nakon 20 ispiranja sa T-PBS i 20 sa PBS-om, isprano je sa 0,1 M glicinom, pH 2,2, i neutralisano sa 2M Tris. Isprani fag je upotrijebljen neposredno za infekciju eksponencijalno rastućih TG-1. Inficirane ćelije su odabrane na medijumu koji je sadržao ampicilin. Čestice faga su spašene iz supernatanta kulture nakon superinfekcije s pomagačem fagom M13-KG7, koncentriranim sa PEG-om i upotrebljenim u drugom krugu ispiranja. Brojevi ulaznog i izlaznog faga utvrđeni su kao transformisane jedinice E. coli nakon svakog kruga ispiranja (tabela 8).

[0257] Dobijene kolonije su sastrugane sa pločica, uzgajane su u 2xYT sa ampicilinom i njihova plazmiDNK DNK je izolovana sa midi-prep. Umeci su povećani sa PCR, a zatim su supklonirani u vektor pNOTBAD i transformisani u E. coli vrsti E104. 4x72 kolonije su uzgajane u 200 ul 2xYT sa ampicilinom i indukovane sa 0,1% L-arabinozom sledećeg dana. Nakon 24 h ekspresije na I6°C, oni su lizirani sa 200 ul Na-boratnog pufera, pH 8,0 kroz 6 h na 4°C i periplazmički ekstrakt je upotrebljen za

ELISA.

[0258] Za ELISA, Maxisorp pločice su prevučene sa hen egg lisozimom u PBS-u (20 ug/ml) ili rhEPO u 0,1 M Na-karbonatnom puferu, pH 9,6, tokom 1 h na 37°C. Nakon blokiranja sa 1% BSA-PBS, periplazmičkom ekstraktu je omogućeno vezivanje u istom sredstvu za blokiranje preko noći. Pokazalo se daje vezivanje sa anti-His-(4) antitelom i sa kozjim antimišjim IgG antitelom, konjugovanim sa HRP (za detekciju hen egg lisozima) ili AP (za rhEPO detekciju). Obojenja reakcije OPD konverzije (HRP) očitano je pri 492/620 nm nakon zaustavljanja sa 1,25 M H2SO4, i pNPP pretvaranje (AP) je očitana pri 405/620 nm. 14 klonova sa obećavajućim vrednostima apsorpcije je odabrano za ekspresiju u merilu od 20 ml. Nakon 24 h indukcije sa arabinozom pri 16°C, ćelije su skupljene i lizirane preko noći u 1 ml Na-boratnog pufera pri 4°C, i lizat je upotrebljen za ELISA. Analiza ELISA je izvedena kao gore u 4 paralele i u rupicama bez periplazmičkog ekstrakta, a uzorak bez antigena je uzet kao negativna kontrola. Rezultati (tabela 9) su dobijeni sa klonom prema SEQ ID br. 42, 43.

Primer 16: Modifikovani CH3 domeni osiguravaju bispecifičnost u Fab-sličnom formatu

[0259] U konstruktu koji je upotrebljen u ovom primeru, oba lanca, VL i VH, antitela su fuzionirana na modifikovani CH3 domen.

[0260] VL i VH područje humanog monoklonskog antitela 3D6 (He XM, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 1992 89:7154-8.; Kohl J, et al. Ann N Y Acad Sci. 1991 646:106-14.; Felgenhauer M, et al. Nucleic Acids Res. 1990 18:4927), koje prepoznaje epitop na gp41 u HIV-1 upotrebljeno je kao učesnik fuzije za modifikaciju CH3 domena klona C24 koji se veže specifično za hen egg lisozim.

[0261] U cilju da se unapredi formiranje VL-CH3/VH-CH3 dimera preko disulfidne veze, ostaci Ser-Cys su dodati na C-kraj C24 sekvence.

[0262] Nukleotidne i aminokiselinske sekvence dva lanca, 3D6VL-C24 i 3D6VH-C24, date su u SEO ID br. 47, 46 i SEQ ID br. 45, 44.

[0263] Konstruisani su prajmeri koji omogućavaju povećavanje kodiranih područja, uvođenje mesta ograničenja istovremeno (tihe mutacije), koji su upotrebljeni za međusobno povezivanje kodnih područja. Za ekspresiju gena odabran je sistem ekspresije Pichia pastoris. Konstrukti su klonirani u prikladne vektore ekspresije Pichia pastoris: 3D6VL-C24 je kloniran u pPIC9K (krajnji naziv: pPIC9K3LC) i 3D6VH-C24 (krajnji naziv: pPICZ3HC) je kloniran u pPICZalfaA. Konstrukt pPICZ3HC je linearizovan sa Bgl II, transformisan u Pichia pastoris GS115 i transformanti su odabrani na krutom mediju koji je sadržao zeocin. Jedan od transformanata je zatim upotrebljen kao ćelija domaćin za Sal I-linearizirani konstrukt pPIC9K3LC. Zatim su odabrani dvostruki transformanti na mediju RDB.

[0264] Klonovi su inokulirani u 30 ml YPG medija i rasli su do OD^oo= 10, i zatim su inducirani dodatkom 1% metanola u BMMY medij. Indukcija je nastavljena 36 sati na 16°C. Supernatanti su odstranjeni centrifugiranjem i zatim su koncentrisani otprilike 10 puta. Prisutnost rekombinantnog proteina je potvrđena pomoću Western blota sa anti-His (4) antitelom, i utvrđena mu je koncentracija od približno 50 - 100 u.g/1 početne kulture.

[0265] Prvi funkcionalni analize su provedene sa deseterostruko koncentrisanim supernatantom. Najprije su rupice Maxisorp pločica prevučene sa 20 ug/ml hen egg lisozima u PBS-u ili 20 ug/ml epitopa antitela 3D6 u 0,1 M Na-karbonatnom puferu, pH 9,6, tokom 1 h na 37°C. 3D6 epitop je upotrebljena u obliku rekombinantno proizvedenog GST fuzijskog proteina. Nakon blokiranja sa 1% BSA-PBS. koncentrisanim supernatantima je omogućeno vezivanje preko noći u istom sredstvu za blokiranje. Pokazalo se da je vezivanje sa anti-His (4) antitelom i kozjim anti-mišjim antitelom, konjugovanim na HRP, i što se videlo kao obojena reakcija dobijena iz OPD pretvaranjem pri 492/620 nm (tabela 10).

Claims (32)

1. Postupak za inženjering imunoglobulina koji obuhvaća modifikovano područje strukturne petlje da bi se osigurala ne-CDR vezujuće mesto i da bi se odredilo vezivanje navedenog imunoglobulina na epitopu antigena, pri čemu se ne modifikovano područje strukturne petlje značajno ne veže za navedeni epitopu, obuhvaćjući korake: - pribavljanja nukleinske kiseline koja dekodira imunoglobulin koji sadrži bar jedno područje strukturne petlje, - modifikovanja bar jednog nukleotidnog ostatka navedenog područja strukturne petlje postupkom mutageneze, pri čemu navedeno modifikovanje a) je postupak mutageneze odabran iz grupe koju čine nasumične, polu-nasumične, na određenom mestu usmereno nasumične, ispitivane mutageneze i kombinatorička dostignuća, ili b) je uključeno više od jedne strukturne petlje da bi se osigurala vezujuće mesto za navedeni epitop, ili c) je isključena ugradnja biološki aktivnog peptida od 2 do 40 amino kiselina u Fc domenu, - prenošenje navedene modifikovane nukleinske kiseline u ekspresijski sistem, - ekspresije navedenog modifikovanog imunoglobulina, - stavljanja u kontakt ekspresioniranog modifikovanog imunoglobulina sa epitopima, te - određivanja da li se navedeni modifikovani imunoglobulin vezuje za navedeni epitop.

2. Postupak prema zahtevu 1,naznačen time, što se navedeni imunoglobulini specifično vežu za bar dva različita epitopa.

3. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 ili 2, obuhvata bar jednu modifikaciju u bar jednom području strukturne petlje navedenog imunoglobulina i određivanje specifičnog vezivanja navedenog bar jednog područja strukturne petlje na bar jednom molekul odabran iz grupe koju čine alergeni, antigeni povezani sa tumorom, lični antigeni, enzimi, bakterijski antigeni, gljivični antigeni, virusni antigeni i protozooalni antigeni, pri čemu se nemodifikovano područje strukturne petlje specifično ne veže za bar jedan navedeni molekul.

4. Postupak prema zahtevu 3, n a z n a č e n t i m e , što je bar jedan molekul odabran iz grupe koju čine antigeni povezani sa tumorom, posebno EpCAM, sa tumorom povezan giikoprotein-72 (TAG-72), sa tumorom povezan antigen CA 125, specifičan antigen membrane prostate (PSMA), antigen povezan sa melanomom velike molekulske težine (HMVV-MAA), sa tumorom povezan antigen koji ekspresionira ugljovodonik povezan sa Levvis Y, karcinoembriogeni antigen (CEA), CEACAMS, HMFG PEM, mucin MUCI, MUCI8 i sa tumorom povezan antigen citokeratin, bakterijski antigeni, virusni antigeni, alergeni, fluorescein, lizozim, toll-like receptor 9, eritropoetin, CD2, CD3, CD3E, CD4, CD11, CD1 la, CD14, CD18, CD19, CD20, CD22, CD23, CD25, CD28, CD29, CD30, CD33 (p67 protein), CD38, CD40, CD40L, CD52, CD54, CD56, CD80, CD147, GD3, IL-1, IL-1R, IL-2, 1L-2R, IL-4, IL-5, IL-6, 1L-6R, IL-8, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, interferon alfa, interferon beta, interferon gama; TNF-alfa, TNFbeta2, TNF.alfa, TNF alfabeta, TNF-R1, TNF-R11, FasL, CD27L, CD30L, 4-1BBL, TRAIL, RANKL, TVVEAK, APRIL, BAFF, LIGHT, VEGI, OX40L, TRAIL Receptor-1, Al Adenozin Receptor, Limfotoksin Beta Receptor, TACI, BAFF-R, EPO; LFA-3, ICAM-1,1CAM-3, integrin betal, integrin beta2, integrin alfa4/beta7, integrin alfa2, integrin alfa3, integrin alfa4, integrin alfa5, integrin alfa6, integrin alfav, alfaVbeta3 integrin, FGFR-3, Keratinocit Faktor Rasta. VLA-1, VLA-4, L-selektin, anti-Id, E-selektin, HLA, HLA-DR, CTLA-4, receptor T ćelije, B7-1, B7-2, VNGintegrin, TGFbetal, TGFbeta2, eotaksinl, BlyS (B-limfocit Stimulator), komplementarni C5, IgE, faktor VII, CD64, CBL, NCA 90, EGFR (ErbB-1), Her2/neu (ErbB-2), Her3 (ErbB-3), Her4 (Erb-84), tkivni faktor, VEGF, VEGFR, endotelin rcceptori, VLA-4, ugljovodonici kao što su antigeni krvne grupe i slični ugljovodonici, Galili-Glikozilati, Gastrin, Gastrin receptori, ugljovodonici povezani tumorom, Hapten NP-cap ili NIP-cap, alfa/beta receptor T ćelije, E-selektin, dioksin, placentalna alkalna fosfataza (FLAP) i testikularna poput-PLAP alkalna fosfataza, transferin receptor, Heparanaza 1, humani kardijalni miozin, Glikoprotein Ilb/IIIa (GP Ilb/IIIa), humani citomegalovirus (HCMV) gH razvijajući glikoprotein, FIIV gpl20, HCMV, respiratorni sincicijski virus RSV F, RSVF Fgp, VNRintegrin, Hep B gp!20, CMV, gpllbllla, HIV 11IB gpl20 V3 petlja, respiratorni sincicijski virus (RSV)Fgp, Herpes simple.Kvirus (HSV)gD glikoprotein, HSV gB glikoprotein, HCMV gB razvijajući glokoprotein, toksin Clostridium perfringens i njegovi fragmenti.

5. Postupak prema zahtevu 3, pri čemu navedeni modifikovani imunoglobulin ima vezujuću specifičnost za FcRn.

6. Postupak prema zahtevu 3, pri čemu navedeni modifikovani imunoglobulin ima vezujuću specifičnost za delotvorni molekul.

7. Postupak proizvodnje imunoglobulina ili njegovog farmaceutskog peparata pomoću inženjeringom modifikovnog imunoglobulina postupkom prema bilo kom zahtevu 1 do6, naznačen t i m e , što je - modifikovani imunoglobulin dovršen u farmaceutskom preparatu.

8. Postupak prema bilo kom zahtevom 1 do 7, naznačen t i m e , što navedeni imunoglobulin je multi-specifično vezujući specifično za bar jedan prvi molekul i bar jedan drugi molekul kroz bar jednu modifikaciju u bar jednom području strukturne petlje navedenog imunoglobulina, pri čemu je drugi molekul odabran iz grupe koju čine alergeni, antigeni povezani sa tumorom, lični antigeni, enzimi, bakterijski antigeni, gljivični antigeni, virusni antigeni i protozooalni antigeni.

9. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 8, n a z n a č e n t i m e , što imunoglobulini sadrže težak i/ili lak lanac imunoglobulina ili njegov deo.

10. Postupak prema bilo kom zahtevom 1 do 9, n a z n a č e n t i m e , što imunoglobulin sadrži bar jedan konstantan domen i/ili bar jedan varijabilni domen imunoglobulina.

11. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 10, n a z n a č e n t i m e , što imunoglobulin sadrži bar jedan pojedinačni domen ili njegov deo uključujući minidomen koji se sastoji od dva beta-lanca imunoglobulin domena povezana strukturnom petljom, pojedinačnim imunoglobulin varijabilnim domenom ili Fv pojedinačnim lancem.

12. Postupak prema bilo kom zahtevom 1 do 11,naznačen time, što imunoglobulin sadrži konstantni domen odabran iz grupe koju čine CHI, CH2, CH3, CH4, CL, te njihove kombinacije, uključujući i Fab fragment, Fc fragment ili imunoglobulin pune dužine.

13. Postupak prema bilo kom zahtevom 1 do 12, n a z n a č e n t i m e , što imunoglobulin sadrži jedan od Ig-kapa ili Ig-lambda.

14. Postupak prema bilo kom zahtevom 1 do 13, n a z n a č e n t i m e , što imunoglobulin obuhvata neka od područja petlje CHI, CH2, CH3 ili CH4 koja obuhvataju modifikaciju u jednom ne-kiselinskom položaju unutar aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koju čine aminokiseline 7 do 21, aminokiseline 25 do 39, aminokiseline 41 do 81, aminokiseline 83 do 85, aminokiseline 89 do 103 i aminokiseline 106 do 117, pri čemu je numerisanje prema IMGT.

15. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 14, n a z n a č e n t i m e , što je imunoglobulin humani, humanizovani ili himerički imunoglobulin.

16. Postupak prema zahtjevu 14, naznačen time, što imunoglobulin sadrži neka od područja petlje Ig-kapa ili Ig-lambda koja obuhvataju modifikaciju u jednom aminokiselinskom položaju unutar aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koju čine aminokiseline 8 do 18, aminokiseline 27 do 35, aminokiseline 42 do 70, aminokiseline 83 do 85, aminokiseline 92 do 100, aminokiseline 108 do 117 i aminokiseline 123 do 126, pri čemu je numerisanje prema IMGT.

17. Postupak prema zahtevu 15 ili 16, n a z n a č e n t i m e , što imunoglobulin sadrži neka od podučja strukturne petlje varijabilnog domena koji sadrži modifikaciju u jednom spolašnjem aminokiselinskom položaju unutar aminokiselinske sekvence odabrane iz skupine koju čine aminokiseline 8 do 20, aminokiseline 44 do 50, aminokiseline 67 do 76 i aminokiseline 89 do 101, pri čemu je numerisanje prema IMGT.

18. Postupak prema zahtevu 15dol7, naznačen t i m e , što je imunoglobulin odabran iz grupe koju čine IgAl, IgA2, IgD, IgE, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 i IgM.

19. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 14, naznačena t i m e , što je imunoglobulin mišjeg porekla.

20. Postupak prema zahtevu 19, naznačen time, što je imunoglobulin mišji imunoglobulin odabran iz grupe koju čine IgA, IgD, IgE, IgGl, lgG2A, IgG2B, IgG2C, lgG3 i IgM.

21. Postupak prema zahtevu 19 ili 20, n a z n a č e n t i m e , što imunoglobulin sadrži neka od područja petlje Ig-kapa ili Ig-lambda koja obuhvataju modifikaciju u jednom aminokiselinskom položaju unutar aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koju čine aminokiseline 8 do 20, aminokiseline 26 do 36, aminokiseline 43 do 79, aminokiseline 83 do 85, aminokiseline 90 do 101, aminokiseline 108 do 116 i aminokiseline 122 do 125, pri čemu je numerisanje prema IMGT.

22. Postupak prema bilo kom zahtevu 19 do 21, n a z n a č e n t i m e , što imunoglobulin obuhvata neka od podučja strukturne petlje varijabilnog domena koji sadrži modifikaciju u jednom aminokiselinskom položaju unutar aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koju čine aminokiseline 6 do 20, aminokiseline 44 do 52, aminokiseline 67 do 76 i aminokiseline 92 do 101, pri čemu je numerisanje prema IMGT.

23. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 22, n a z n a č e n t i m e , što je imunoglobulin odabran iz grupe koju čine Fab fragment, Fc fragment, pojedinačni domen imunoglobulina, pojedinačno-Iančani CH3 dimer (scCH3), scCH2, scCHl/CL i kompletni imunoglobulini.

24. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 23, n a z n a č e n t i m e , što navedena modifikacija rezultuje supstitucijom i/ili brisanjem i/ili umetanjem nukleotida.

25. Postupak prema bilo kom zahtevom 1 do 24, n a z n a č e n t i m e , što je nukleotidna sekvenca bar jednog područja petlje modifikovana na jednu stranu usmerenom i/ili nasumičnom i/ili polu-nasumičnom mutacijom.

26. Postupak prema zahtevu 25, n a z n a č e n t i m e , što navedena modifikovana nukleotidna sekvenca sadrži bar jednu ponavljajuću jedinicu nukleotida koja ima sekvencu 5'-NNS-3', 5'-MNN-3' ili 5'-NNK-3'.

27. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 26, n a z n a č e n t i m e , što ekspresijski sistem obuhvata vektor.

28. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 27, n a z n a č e n t i m e , što je modifikovani imunoglobulin ekspresionisan u domaćinu poželjno u jednoj od bakterija domaćina, gljivici, ćeliji biljke, u ćelijii životinje ili u biljci za životinje.

29. Postupak prema s bilo kom zahtevu 1 do 28, n a z n a č e n t i m e , što je specifično vezivanje modifikovanog imunoglobulina na molekulu određeno testom vezivanja odabranim iz grupe koju čine imunološki testovi, poželjan je test enzim-vezujuće imunoanalize (ELISA), testovi rezonance površinske plazme, nuklearna magnetska rezonantna spektroskopija diferencije transfera zasićenosti, nuklearna magnetska rezonantna spektroskopija transfera NOE (trNOE), kompetitivni testovi, testovi vezivanja tkiva, testovi vezivanja na žive ćelije i testovi ćelijskih ekstrakata.

30. Postupak prema bilo kom zahtevu 1 do 29, n a z n a č e n t i m e , što je modifikovani imunoglobulin vezan za oznaku odabranu iz grupe koju čine organski molekuli, enzimske oznake, radioaktivne oznake, obojene oznake, fluorescentne oznake, hromogene oznake, luminescentne oznake, hapteni, digoksigeni, biotin, metalni kompleksi, metali, koloidno zlato i njihove smeše.

31. Postupak produživanja polu-života molekulein vivo,ugrađivanjem modifikovanog imunoglobulina prema zahtevu 5.

32. Postupak proizvodnje molekula sa delotvornim funkcijama, ugrađivanjem modifikovanog imunoglobulina prema zahtevu 6.