CN105664157A - 一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物，它包括对Fc的改造，提高Tm、T1/2，增强ADCC、CDC；噬菌体和酵母表面展示抗体库的构建；通过CPG2006/IL-2提高EBV促IgG+记忆性B细胞永生化效率。本发明通过对人源化抗体Fc区的定点突变和分子重构，增强其生物学功能，结合酵母表面展示技术，构建新型人源化抗体库；建立并改进EB病毒（EBV）感染IgG+记忆性B细胞使其永生化、从恢复期病人血细胞中筛选针对特定病毒的人源化单克隆抗体的技术平台；构建具有自主知识产权的针对HCMV的高效治疗性抗体，该抗体可以高效特异的在体外及细胞内针对HCMV的抗体进行筛选。
Description
技术领域
本发明涉及一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物。
背景技术
人巨细胞病毒（humancytomegalovirus,HCMV）是一种广泛传播的机会性潜伏感染病原体，在发展中国家如中国，成人感染率在90%以上，潜伏感染的HCMV终身存在,人体内难以被清除，在免疫低下的状况下（如肿瘤、器官移植）容易再激活并引起严重的损伤。HCMV感染是新生儿致畸的首要病毒病因。目前对HCMV既无清空潜伏感染的措施，亦无有效的预防母婴垂直传播的手段。
完全人源化治疗性抗体避免了鼠源单抗可能导致的人抗鼠抗体反应（HAMA），在临床治疗中可望发挥重要的作用。因为其具有高亲和力和特异性，能够在复杂的混合物中识别微量的抗原并中和抗原。恒定区Fc区还可以激发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）和补体依赖的细胞毒性作用（CDC），有效地清除靶细胞。
治疗性抗体药物已经成为目前生物技术药物中品种最多、销售额最大的类型，在非霍奇金淋巴瘤、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤和哮喘、银屑病、类风湿性关节炎等自身免疫病的治疗中已经发挥了重要的作用，但用于病毒治疗的报道较少，主要有抗呼吸道合胞病毒的帕利珠单抗（Synagis）。发展完全人源化的、高效的、稳定性好的、特异性或广谱性的抗病毒治疗性抗体是控制新发和重大病毒性传染病、保障人类健康的迫切需求，也是历史交给我们的迫切任务。近年随着抗体工程技术的进步，完成这一任务正成为现实。
目前，国内外的单抗药物主要应用于治疗肿瘤、防治器官移植排斥等方面。美国Genentech公司研发的人源化单克隆抗体赫赛汀（herceptin）是第一个针对HER-2阳性乳腺癌的、以癌基因为靶的治疗药物，对转移性乳腺癌有明显疗效。中国第四军医大学细胞工程中心和华神集团共同研发的利卡汀（碘美妥昔单抗注射液）是全球第一个批准上市的用于治疗中晚期原发性肝细胞肝癌的单克隆抗体。中国疾病预防控制中心梁米芳等在利用scFv等抗体库筛选抗病毒抗体方面开展了卓有成效的工作。但总的来看，国内外关于抗病毒治疗性抗体，尤其是关键技术及应用方面的报道相对较少。发展抗病毒治疗性抗体研发的关键技术并对严重威胁国人健康的HCMV病毒开展人源抗体筛选、研制，契合国家战略规划，既是保障人民健康的迫切需求，也是发展生物高新技术的重大机遇。
发明内容
本发明提供了一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物，它通过对人源化抗体Fc区的定点突变和分子重构，增强其生物学功能，结合酵母表面展示技术，构建新型人源化抗体库；建立并改进EB病毒（EBV）感染IgG+记忆性B细胞使其永生化、从恢复期病人血细胞中筛选针对特定病毒的人源化单克隆抗体的技术平台；构建具有自主知识产权的针对HCMV的高效治疗性抗体，该抗体可以高效特异的在体外及细胞内针对HCMV的抗体进行筛选。
本发明采用了以下技术方案：一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物，其特征是它包括对Fc的改造，提高Tm、T1/2，增强ADCC、CDC；噬菌体和酵母表面展示抗体库的构建；通过CPG2006/IL-2提高EBV促IgG+记忆性B细胞永生化效率，所述的对Fc的改造，提高Tm、T1/2，增强ADCC、CDC为恒定区Fc区还可以激发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）和补体依赖的细胞毒性作用（CDC），有效地清除靶细胞，所述的噬菌体和酵母表面展示抗体库的构建过程为能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失，T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋白质，很少受到限制，所述的通过CPG2006/IL-2提高EBV促IgG+记忆性B细胞永生化效率为采用EBV中国株感染B细胞,提高EBV永生化B细胞的效率。
本发明具有以下有益效果：采用了以上技术方案后，本发明是通过对人源化抗体Fc区的定点突变和分子重构，增强其生物学功能，结合酵母表面展示技术，构建新型人源化抗体库；建立并改进EB病毒（EBV）感染IgG+记忆性B细胞使其永生化、从恢复期病人血细胞中筛选针对特定病毒的人源化单克隆抗体的技术平台；构建具有自主知识产权的针对HCMV的高效治疗性抗体，本发明采用优化程序，建立一套具有普适性的、适合国情并具有自主知识产权的从恢复期病人血细胞中筛选针对HCMV的人源化单克隆抗体的技术体系。
附图说明
图1为本发明抗体结构示意图。
图2为本发明抗巨细胞病毒人源化抗体药物实验流程图。
图3为本发明单克隆抗体的生产的流程图。
附图说明
在图1中，本发明提供了一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物，它包括对Fc的改造，提高Tm、T1/2，增强ADCC、CDC；噬菌体和酵母表面展示抗体库的构建；通过CPG2006/IL-2提高EBV促IgG+记忆性B细胞永生化效率，所述的对Fc的改造，提高Tm、T1/2，增强ADCC、CDC为恒定区Fc区还可以激发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）和补体依赖的细胞毒性作用（CDC），有效地清除靶细胞，所述的噬菌体和酵母表面展示抗体库的构建过程为能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失，T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋白质，很少受到限制，所述的通过CPG2006/IL-2提高EBV促IgG+记忆性B细胞永生化效率为采用EBV中国株感染B细胞,提高EBV永生化B细胞的效率。
本发明提供了一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物，并且详细介绍了这种人源化抗体药物的涉及制备方法及优点。该抗体可以高效特异的在体外及细胞内针对HCMV的抗体进行筛选。
（一）人源化抗体Fc区改造技术
通过对Fc晶体及其与受体的共结晶的三维结构分析，预测与其功能相关的重要氨基酸位点，采用定点突变的方法改变Fc的关键氨基酸，或者对整个Fc功能域进行分子重构，从而达到加强其生物学功能和增加其稳定性的目的。增加其体内半衰期，延长抗体寿命。在基于改造优化的Fc的基础上，构建噬菌体展示人源抗体库和酵母表面展示人源抗体库。
1、单链丝状噬菌体展示系统
（1）PⅢ展示系统。
丝状噬菌体是单链DNA病毒，PⅢ是病毒的次要外壳蛋白，位于病毒颗粒的尾端，是噬菌体感染大肠埃希菌所必须的。每个病毒颗粒都有3个～5个拷贝PⅢ蛋白，其在结构上可分为N1、N2和CT3个功能区域，这3个功能区域由两段富含甘氨酸的连接肽G1和G2连接。其中，N1和N2与噬菌体吸附大肠埃希菌菌毛及穿透细胞膜有关，而CT构成噬菌体外壳蛋白结构的一部分，并将整个PⅢ蛋白的C端结构域锚定于噬菌体的一端。PⅢ有2个位点可供外源序列插入，当外源的多肽或蛋白质融合于PⅢ蛋白的信号肽(SgⅢ)和N1之间时，该系统保留了完整的PⅢ蛋白，噬菌体仍有感染性；但若外源多肽或蛋白直接与PⅢ蛋白的CT结构域相连，则噬菌体丧失感染性，这时重组噬菌体的感染性由辅助噬菌体表达的完整PⅢ蛋白来提供。PⅢ蛋白很容易被蛋白水解酶水解，所以有辅助噬菌体超感染时，可以使每个噬菌体平均展示不到一个融合蛋白，即所谓“单价”噬菌体。
（2）PⅧ及其他展示系统。
PⅧ是丝状噬菌体的主要外壳蛋白，位于噬菌体外侧，C端与DNA结合，N端伸出噬菌体外，每个病毒颗粒有2700个左右PⅧ拷贝。PⅧ的N端附近可融合五肽，但不能融合更长的肽链，因为较大的多肽或蛋白会造成空间障碍，影响噬菌体装配，使其失去感染力。但有辅助噬菌体参与时，可提供野生型PⅧ蛋白，降低价数，此时可融合多肽甚至抗体片段。此外，尚有丝状噬菌体PⅥ展示系统的研究报道。PⅥ蛋白的C端暴露于噬菌体表面，可以作为外源蛋白的融合位点，可以用于研究外源蛋白C端结构区域功能。从所掌握的文献来看，该系统主要用于cDNA表面展示文库的构建，并取得了不错的筛选效果。
2、λ噬菌体展示系统
（1）PV展示系统。
λ噬菌体的PV蛋白构成了它的尾部管状部分，该管状结构由32个盘状结构组成，每个盘又由6个PV亚基组成。PV有两个折叠区域，C端的折叠结构域（非功能区）可供外源序列插入或替换。目前，用PV系统已成功展示了有活性的大分子蛋白β-半乳糖苷酶（465ku）和植物外源凝血素BPA（120ku）等。λ噬菌体的装配在细胞内进行，故可以展示难以分泌的肽或蛋白质。该系统展示的外源蛋白质的拷贝数为平均1个分子/噬菌体，这表明外源蛋白质或多肽可能干扰了λ噬菌体的尾部装配。
（2）D蛋白展示系统。
D蛋白的分子质量为11ku，参与野生型λ噬菌体头部的装配。低温电镜分析表明，D蛋白以三聚体的形式突出在壳粒表面。当突变型噬菌体基因组小于野生型基因组的82%时，可以在缺少D蛋白的情况下完成组装，故D蛋白可作为外源序列融合的载体，而且展示的外源多肽在空间上是可以接近的。病毒颗粒的组装可以在体内也可以在体外，体外组装即是将D融合蛋白结合到λD-噬菌体表面，而体内组装是将含D融合基因的质粒转化入λD-溶源的大肠埃希菌菌种中，从而补偿溶源菌所缺的D蛋白，通过热诱导而组装。该系统有一个很好的特点，噬菌体上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制，这对于展示那些可以对噬菌体装配造成损害的蛋白质时特别有用。
3、T4噬菌体展示系统
T4噬菌体展示系统是20世纪90年代中期建立起来的一种新的展示系统。它的显著特点是能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失。T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋白质，很少受到限制。吴健敏等成功地将大小约215aaSOC/mE2融合蛋白展示于T4噬菌体衣壳表面。令人值得关注的是，SOC与HOC蛋白的存在与否，并不影响T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌体组装时可优于DNA的包装而装配于衣壳的表面，事实上，在DNA包装被抑制时，T4是双股DNA噬菌体中唯一能够在体内产生空衣壳的噬菌体（SOC和HOC也同时组装）。因此，在用重组T4做疫苗时，它能在空衣壳表面展示目的抗原，这种缺乏DNA的空衣壳苗，在生物安全性方面具有十分光明的前景。
（二）EBV感染IgG+记忆性B细胞使其永生化筛选单克隆抗体技术
建立免疫磁珠分选IgG+记忆性B细胞技术，采用EBV中国株感染B细胞,提高EBV永生化B细胞的效率。优化程序，建立一套具有普适性的、适合国情并具有自主知识产权的从恢复期病人血细胞中筛选针对HCMV的人源化单克隆抗体的技术体系。
在图2中，下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
1、单克隆抗体制备：
（1）动物的选择与免疫
纯种BALB/C小鼠，较温顺，离窝的活动范围小，体弱，食量及排污较小，一般环境洁净的实验室均能饲养成活。
佐剂：福氏完全佐剂、福氏不完全佐剂。
初次免疫抗原1～50μg加福氏完全佐剂皮下多点注射或脾内注射（一般0.8～1ml,0.2ml/点）；3周后，第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip（腹腔内注射）（ip剂量不宜超过0.5ml）；3周后，第三次免疫剂量同一，不加佐剂，ip（5～7天后采血测其效价）；2～3周，加强免疫，剂量50～500μg为宜，ip或iv（静脉内注射）；3天后，取脾融合。
（2）细胞融合
骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。
在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。
制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。
与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周，拉颈处死，浸泡在75%酒精内，3～5min，用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜，用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管），反复冲洗，吸出冲洗液，冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min，用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml，加入96孔板，100μl/孔，放入37℃CO2孵箱培养。
制备免疫脾细胞
最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死，无菌取脾脏，培养液洗一次，脾脏研碎，过细胞筛，离心，细胞用培养液洗2次，计数，取108脾淋巴细胞悬液备用。
制备骨髓瘤细胞
取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次计数，取得×107细胞备用。
融合
将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。
90s内加入37℃预温的1ml45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。离心，800rpm,6min。充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。
将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。
（3）选择杂交瘤细胞及抗体检测
HAT选择杂交瘤细胞
脾细胞和骨髓瘤细胞经PEG处理后，形成多种细胞的混合体，只有脾细胞与骨髓细胞形成的杂交瘤细胞才有意义。在HAT选择培养液中培养时，由于骨髓瘤细胞缺乏胸苷激酶或次黄嘌呤鸟嘌呤核糖转移酶，故不能生长繁殖，而杂交瘤细胞具有上述两种酶，在HAT选择培养液可以生长繁殖。
在用HAT选择培养1～2天内，将有大量瘤细胞死亡，3～4天后瘤细胞消失，杂交细胞形成小集落，HAT选择培养液维持7～10天后应换用HT培养液，再维持2周，改用一般培养液。在上述选择培养期间，杂交瘤细胞布满孔底1/10面积时，即可开始检测特异性抗体，筛选出所需要的杂交瘤细胞系。在选择培养期间，一般每2～3天换一半培养液。
抗体的检测
检测抗体的方法应根据抗原的性质、抗体的类型不同，选择不同的筛选方法，一般以快速、简便、特异、敏感的方法为原则。
常用的方法有：放射免疫测定（RIA）可用于可溶性抗原、细胞McAb的检测；酶联免疫吸附试验（ELISA）可用于可溶性抗原、细胞和病毒等McAb的检测；免疫荧光试验适合于细胞表面抗原的McAb的检测；其它如间接血凝试验、细胞毒性试验、旋转粘附双层吸附试验等。
（4）杂交瘤的克隆化
杂交瘤克隆化一般是指将抗体阳性孔进行克隆化。因为经过HAT筛选后的杂交瘤克隆不能保证一个孔内只有一个克隆。在实际工作中，可能会有数个甚至更多的克隆，可能包括抗体分泌细胞、抗体非分泌细胞、所需要的抗体（特异性抗体）分泌细胞和其它无关抗体的分泌细胞。要想将这些细胞彼此分开就需要克隆化。克隆化的原则是，对于检测抗体阳性的杂交克隆尽早进行克隆化，否则抗体分泌的细胞会被抗体非分泌的细胞所抑制，因为抗体非分泌细胞的生长速度比抗体分泌的细胞生长速度快，二者竞争的结果会使抗体分泌的细胞丢失。即使克隆化过的杂交瘤细胞也需要定期的再克隆，以防止杂交瘤细胞的突变或染色体丢失，从而丧失产生抗体的能力。
有限稀释法克隆：克隆前1天制备饲养细胞层（同细胞融合）。将要克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹干，计数。调整细胞为3～10个细胞/ml。取头天准备的饲养细胞层的细胞培养板，每孔加入稀释细胞100μl。孵育于37℃、5%CO2孵箱中。在第7天换液，以后每2～3天换液1次。8～9天可见细胞克隆形成，及时检测抗体活性。将阳性孔的细胞移至24孔板中扩大培养。每个克隆应尽快冻存。
（5）杂交瘤细胞的冻存与复苏
杂交瘤细胞的冻存
细胞冻存液：50%小牛血清；40%不完全培养液；10%DMSO（二甲基亚砜）。冻存液最好预冷，操作动作轻柔、迅速。冻存时从室温可立即降至0℃后放入-70℃超低温冰箱，次日转入液氮中。
细胞复苏方法：将玻璃安瓿自液氮中小心取出，放37℃水浴中，在1min内使冻存的细胞解冻，将细胞用完全培养液洗涤两次，然后移入头天已制备好的饲养层细胞的培养瓶内，置37℃、5%CO2孵箱中培养，当细胞形成集落时，检测抗体活性。
（6）单克隆抗体的大量生产
在图3中，体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。
实体瘤法：对数生长期的杂交瘤细胞按1～3×107/ml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2ml,共2～4点。待肿瘤达到一定大小后（一般10～20天）则可采血，从血清中获得单克隆抗体的含量可达到1～10mg/ml。但采血量有限。
腹水的制备：常规是先腹腔注射0.5mlPristane(降植烷)或液体石蜡于BALB/C鼠，1～2周后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞，接种细胞7～10天后可产生腹水。
2、B淋巴细胞的永生化
(1)标本
肺癌患者阳性的肿瘤引流淋巴结(tumordraininglymphnode,TDLN),肺癌患者均未经过化疗和放疗，每次手术从肺癌患者体内切下一至数个新鲜、肿胀的TDLN，同时切下一至数块肿瘤组织，立即投入已消毒的离心管中，并迅速运至实验室处理。肿瘤组织经剪碎、研磨、消化等处理，再固定在96孔培养板上，肿瘤细胞表面相关抗原作为下一步筛选特异性人型单链抗体之用。
(2)制成单核淋巴细胞悬液
将TDLN剪碎，去除结缔组织。在100目金属网上研磨，用Hank’s液洗涤1次(1000r/min,10min)，再用RPMI1640(含10%FBS)稀释成1∶1的细胞悬液。按1份该细胞悬液、1份淋巴细胞分离液(Ficoll)混匀，2000r/min离心20min，吸取中间白膜层，再将白膜层用RPMI1640培养液洗涤3次，每次1000r/min离心20min，吸取中间白膜层，再将白膜层用RPMI1640培液洗涤3次，每次1000r/min离心10min，沉淀后与RPMI1640混匀后计数，使单核细胞终浓度为2×106/ml。
(3)制成B淋巴细胞悬液
取5ml绵羊红细胞(SRBC)，PBS洗涤5次，每次1800r/min离心5min，再加入4倍体积pH9.0的AET后，37℃水浴15min，再洗涤5次，离心条件同上，配成10%AET-SRBC。用含10%胎牛血清的RPMI1640培液将10%AETSRBC稀释至1%AET-SRBC。将上述单核细胞悬液与等量的1%AET-SRBC混合，37℃水浴15min(每5min摇匀一次)后，1000r/min离心5min，4℃放置45min后，用RPMI1640培液稀释至1∶1悬液。再按1份悬液、1份Hank’s液、1份淋巴细胞分离液混合，2000r/min离心20min，吸取中间白色B淋巴细胞层。再用RPMI1640洗涤1次，1000r/min离心10min。最后，用含10%胎牛血清的RPMI1640培液重悬B淋巴细胞，使B淋巴细胞终浓度为1×106/ml。37℃CO2培养箱中培养，每天观察细胞生长情况和细胞形态，并以COUNTER血细胞计数仪进行细胞计数。
(4)饲养层细胞制备
转化试验前一天，用Ficoll淋巴细胞分离液分别分离人单核细胞、新生儿脐带血单核细胞及骨髓基质细胞(2000r/min离心20min)，经60Coγ射线照射30min，按1∶1∶1的比例混合后加入96孔板内(每孔浓度为1×105)，37℃过夜备用。
(5)EB病毒感染及B细胞永生化
取B95-8株EB病毒培养液上清液和上述B细胞悬液按1∶100、1∶10、1∶1的比例混匀，再加入已铺有饲养层细胞的96孔培养板中，在37℃的CO2培养箱中培养数天，显微镜下观察B细胞生长状况。筛选细胞生长状态良好者，进一步在CO2培养箱中培养数天，显微镜下观察B细胞生长状况。筛选细胞生长状态良好者，进一步培养繁殖。
（三）针对HCMV的治疗性抗体的筛选和细胞水平抗病毒效应评价
利用基于优化的Fc骨架的噬菌体表面展示和酵母表面展示抗体库，或者利用EBV转染B细胞永生化技术，针对HCMV糖蛋白gL和糖蛋白gH，筛选高效抗HCMV的人源化单克隆抗体。
人型抗体的检测:利用免疫比浊原理，按照免疫球蛋白测定试剂盒说明书操作。以OSK-1单克隆细胞上清液(含人型IgG)为阳性对照，以RPMI1640培液为阴性对照，用BECKMANDU-7000紫外分光度度仪(λ=340nm)读取96孔上清液的吸光度(A值)，判断是否分泌人IgG。
Claims (1)
1.一种抗巨细胞病毒人源化抗体药物，其特征是它包括对Fc的改造，提高Tm、T1/2，增强ADCC、CDC；噬菌体和酵母表面展示抗体库的构建；通过CPG2006/IL-2提高EBV促IgG+记忆性B细胞永生化效率，所述的对Fc的改造，提高Tm、T1/2，增强ADCC、CDC为恒定区Fc区还可以激发抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC）和补体依赖的细胞毒性作用（CDC），有效地清除靶细胞，所述的噬菌体和酵母表面展示抗体库的构建过程为能够将两种性质完全不同的外源多肽或蛋白质，分别与T4衣壳表面上的外壳蛋白SOC（9ku）和HOC（40ku）融合而直接展示于T4噬菌体的表面，因此它表达的蛋白不需要复杂的蛋白纯化，避免了因纯化而引起的蛋白质变性和丢失，T4噬菌体是在宿主细胞内装配，不需通过分泌途径，因而可展示各种大小的多肽或蛋白质，很少受到限制，所述的通过CPG2006/IL-2提高EBV促IgG+记忆性B细胞永生化效率为采用EBV中国株感染B细胞,提高EBV永生化B细胞的效率。
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| CN108484755A (zh) * | 2018-03-01 | 2018-09-04 | 成都绿能创客工业设计有限公司 | 一种用于生物标记物筛选的抗体合成方法 |
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| CN101098891A (zh) * | 2005-01-05 | 2008-01-02 | F-星生物技术研究与开发有限公司 | 分子中互补决定区以外的区域中工程改造了的具有结合特性的合成免疫球蛋白结构域 |
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2016
- 2016-03-11 CN CN201610135918.6A patent/CN105664157A/zh active Pending
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