CN105247050A - 用于文库构建、亲和力结合剂筛选和其表达的整合系统 - Google Patents

Abstract

本发明提供适用于展示载体的重组多核苷酸。所述重组多核苷酸从5′到3′包括：编码将展示在表面上的氨基酸序列的第一核酸序列(或插入物)；第一预选限制位点；编码能够展示在所述表面上的表面肽的第二核酸序列；和第二预选限制位点。本发明还提供可以高通量方式转化成表达载体的相应展示载体以和其使用方法。

Description

用于文库构建、亲和力结合剂筛选和其表达的整合系统

发明技术领域

本申请涉及展示文库的构建和筛选，特别是其载体的设计和用途。

发明背景

特异性结合例如抗原的靶标的例如抗体的亲和力结合剂的高通量筛选可以通过包括噬菌体展示、核糖体/mRNA展示、酵母展示和哺乳动物展示的表面展示技术进行。已经研发了各种展示载体，从而，在表达后，肽或蛋白质的文库可展示在噬菌体、细菌、酵母或哺乳动物细胞的表面上。亲和力结合剂因此可经由例如噬菌体淘选或荧光激活细胞分选(FACS)的文库筛选和选择过程鉴定。因此，对应于亲和力结合剂的克隆必须进一步表征以确定结合剂的同一性，以及用于下游应用。

通常，来自结合克隆的插入物单个地或全体地转移或亚克隆到表达载体中，从而可表达、纯化或进一步表征插入物。然而，转移来自展示载体的插入物到表达载体的所述亚克隆过程是耗时、艰巨且低通量的。另外，亚克隆的效率低且无法预测，从约50％到约80％变化。因此，存在对于快速、廉价且高通量的方法来加速亲和力结合剂鉴定和表征过程的需要。

发明概述

本发明的方面涉及用于例如从展示到表达的高通量转化的载体的设计和用途。在一些实施方案中，所述设计需要审慎工程改造在具体序列位置处的限制酶位点和采用限制酶与DNA连接酶的组合来促进所述转化。各种文库可使用本发明的载体来构建，以能够实现高通量文库筛选、结合剂选择/回收和结合剂表征。在实施所述高通量过程后，已经惊奇地发现可实现高转化率(例如，超过90％、超过95％或接近100％)，由此大大加速结合剂发现和表征过程。

一方面，提供适用于构建各种载体的重组多核苷酸。所述重组多核苷酸从5′到3′包含：编码将在表面上展示的氨基酸序列的第一核酸序列；选自由XbaI、NcoI、SalI和XhoI位点组成的组的第一限制位点；编码能够展示在所述表面上的表面肽的第二核酸序列；和选自由XbaI、NcoI、SalI和XhoI组成的组位点的第二限制位点。在各种实施方案中，所述第一核酸序列与所述第二核酸序列同框工程改造。当通过其相应限制酶裂解时，所述第一限制位点和所述第二限制位点生成相容性粘性末端。

在一些实施方案中，所述第一核酸序列编码例如Fab的抗体片段。所述第二核酸序列可编码噬菌体外壳蛋白、酵母外壁蛋白、细菌外部膜蛋白、细胞表面系链结构域或衔接子或其截断或衍生物。例如，所述第二核酸序列可为丝状噬菌体M13的基因III或其截断或衍生物。所述第二核酸序列也可编码能够结合结合配偶体的衔接子，其中所述结合配偶体作为融合体表达并直接展示在所述表面上。相应地，所述表面肽可用于噬菌体展示、酵母展示、细菌展示或哺乳动物展示或在不同宿主之间的穿梭展示(例如，经由衔接子)。在各种实施方案中，在表达时，所述表面肽和由所述第一核酸序列编码的氨基酸序列作为融合蛋白展示在所述表面上。

在某些实施方案中，所述第一限制位点和所述第二限制位点各自编码不干扰所述氨基酸序列的结合亲和力和/或所述表面肽或融合蛋白的展示的氨基酸。在一些实施方案中，所述第一限制位点和/或所述第二限制位点为XbaI位点。

另一方面，提供高通量转化成表达载体的展示载体。所述展示载体包含本文所述的重组多核苷酸和所述第一限制位点的5’或所述第二限制位点的3’的融合标签序列。在一些实施方案中，当所述融合标签序列在所述第二限制位点的3’时，将其被工程改造以使得在(a)通过裂解所述第一限制位点和所述第二限制位点除去所述第二核酸序列和(b)再连接由此生成的相容性粘性末端时，所述第一核酸序列与所述融合标签序列同框。所述融合标签序列可选自以下标签中的一种或多种：碱性磷酸酶标签、Avi标签、角质酶标签、halo标签、flag标签、c-myc标签、组氨酸标签、GST标签、绿色荧光蛋白标签、HA标签、E-标签、Strep标签、Strep标签II和YoI1/34标签。所述展示载体可提供在展示载体的文库中，其中各个展示载体具有独特的第一核酸序列，由此形成用于选择的文库。

另一方面，提供将展示载体转化成表达载体的方法。所述方法包括：提供本文所述的展示载体；用其相应限制酶裂解所述第一限制位点和所述第二限制位点，由此生成所述相容性粘性末端；和再连接所述相容性粘性末端以生成表达载体，其中所述第一核酸序列与所述融合标签序列同框。

在一些实施方案中，所述方法可还包括在所述第二核酸序列内裂解以增加在所述再连接步骤中的再连接效率。在某些实施方案中，在所述再连接步骤之前，可将来自所述裂解步骤的产物稀释以增加分子内连接。

在各种实施方案中，在所述再连接步骤之后，可将由此生成的表达载体引入宿主中，以进一步表征所述第一核酸序列。示例性进一步表征包括定序所述第一核酸序列和/或表达所述第一核酸序列。

在各种实施方案中，所述方法为高效率的方法。例如，所述提供、裂解、再连接和引入步骤可在小于12小时内、在小于8小时内或在小于4小时内完成。

所述方法可以高通量方式执行，其中多种展示载体可平行地转化成多种表达载体。因此，可将所述多种表达载体引入宿主群体中以进一步表征。所述高通量转化可具有高于90％、高于95％或高于98％的转化率(从所述多种展示载体转化到所述多种表达载体)。

又一方面，提供鉴定对于靶标的亲和力结合剂的方法。所述方法包括：筛选各自含有本文所述的展示载体的第一宿主的群体，以获得对于靶标具有结合亲和力的第一宿主的亚群，其中各第一宿主在所述第一宿主的表面上展示由在所述展示载体中的独特第一核酸序列编码的氨基酸序列，并且其中所述第一宿主的亚群各自展示对于所述靶标的亲和力结合剂；从所述第一宿主的亚群中分离的展示载体通过裂解所述第一限制位点和所述第二限制位点以除去所述第二核酸序列并再连接由此生成的相容性粘性末端而转化成表达载体；和将所述表达载体引入第二宿主的群体中，以进一步表征所述亲和力结合剂。在各种实施方案中，所述方法可以高通量方式执行，其中所述转化步骤可具有高于90％、高于95％或高于98％的转化率。

还提供了使用本文所述的载体构建且用于进行本文所述的方法的文库和试剂盒。进一步提供在筛选过程期间产生的子文库和由本文所述的方法获得的亲和力结合剂。

附图简述

图1提供示出本发明的示例性载体的示意性限制酶图谱。

图2提供示出示例性载体在不同浓度下的转化率的凝胶电泳图像。使用一种限制酶XbaI。

图3提供示出示例性载体在不同浓度下的转化率的凝胶电泳图像。使用两种限制酶XbaI和XmnI。

发明详述

本发明涉及整合亲和力结合剂发现与其下游表征的高通量方法。已经惊人地显示所述高通量方法节约大量的时间和工作。因此，从文库筛选、结合剂选择到结合剂表征的整个过程可为流线型的，同时显著加速亲和力结合剂发现和表征的步伐。在实践中，本发明的高通量方法在商业上在亲和力试剂发现方面是符合需要的，并且可应用到各种展示平台，包括噬菌体展示、细菌展示、酵母展示、哺乳动物展示以和其他展示系统。

应理解，上述一般描述和以下详细描述均仅为示例性和解释性的并且不限制本文描述的组合物和方法。在本申请中，除非另外明确陈述，否则使用单数包括复数。同样地，除非另外陈述，否则使用“或”意指“和/或”。类似地，“包含(comprise)”、“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(including)”并不旨在限制性的。应理解，本文中描述的本发明的方面和实施方案包括由方面和实施方案组成和/或主要由方面和实施方案组成。

定义

为了方便起见，在此集中了在说明书、实施例和附加权利要求书中采用的某些术语。除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域一般技术人员通常理解的含义相同的含义。

本文所使用的下列术语和措辞旨在具有下列含义：

冠词“一(a/an)”在本文中用来指代冠词的语法对象中的一个或一个以上(即，“至少一个”)。举例来说，“要素”意指一个要素或多于一个要素。

“宿主群体”意指可向其中引入多核苷酸的文库并将其展示的一组宿主。所述宿主可为噬菌体、酵母、细菌或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，可使用来自单一培养物的细胞群体，即其中在所述群体中的各个细胞具有相同细胞类型。供选地，也可使用细胞的混合培养物。细胞可为粘附物，即，细胞生长附着到固体底物，或供选地，细胞可处于悬浮中。哺乳动物细胞可为来源于原发肿瘤的细胞、来源于转移性肿瘤的细胞、原代细胞、已经丧失接触抑制作用的细胞、转换的原代细胞、不朽的原代细胞、可经历细胞凋亡的细胞及来源于其的细胞系。

本文使用的术语“约”意指在20％内，更优选在10％内且最优选在5％内。

术语“亲和力结合剂”、“结合剂”和“结合蛋白”可互换地用以指与另一蛋白或分子具有特异性或一般亲和力的肽链。在结合可行时，使蛋白质接触以形成复合物。在宿主的表面上表达的本发明的亲和力结合剂可优选为抗体、抗体的片段或衍生物、蛋白质或肽。如果抗体或肽在与其结合其他物质相比以更大的亲和力、亲和力、更容易地和/或以更久的持续时间结合抗原或靶标，则所述抗体或肽“亲和力结合”、“特异性结合”或“优先”结合所述抗原或靶标。通过阅读这个定义应理解，例如，特异性或优先结合第一靶标的抗体或肽可以或可以不特异性或优先结合第二靶标。因此，“亲和力结合”、“特异性结合”或“优先结合”并不一定需要(尽管其可包括)排外的结合。在一些实施方案中，“特异性结合”意指蛋白对于特定的抗原或表位表现出明显的亲和力，并且通常没有表现出显著的交叉反应性。结合“没有表现出显著的交叉反应性”的蛋白的抗原为不会可观地结合除其靶标外的实体(例如，不同表位或不同分子)的抗原。对特定表位具有特异性的抗原特异性蛋白例如将不会与在相同蛋白或肽上的远距表位显著地交叉反应。特异性结合可根据用于测定所述结合的任何本领域认可的方法测定。优选地，特异性结合根据Scatchard分析和/或竞争性结合测定来测定。“亲和力”结合包括以至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹M^-1或10¹⁰M^-1的亲和力的结合。具有大于10⁷M^-1或10⁸M^-1的亲和力的抗原结合蛋白通常以相应更大的特异性结合。

本文使用的术语“氨基酸序列”是指任何长度的邻接氨基酸残基的序列。术语“多肽”、“肽”、“寡肽”或“蛋白质”在本文中可与术语“氨基酸序列”互换使用。

“抗体”为能够经由位于免疫球蛋白分子的可变区中的至少一个抗原识别位点特异性结合例如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等靶标的免疫球蛋白分子。本文使用的术语不仅涵盖完整的多克隆或单克隆抗体，而且涵盖其片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)₂、Fv)、单链(ScFv)、其突变体、天然存在的变体、包含具有具有所需特异性的抗原识别位点的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体及包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他改性构造。

“抗体片段”仅包含完整抗体的一部分，通常包括完整抗体的抗原结合位点且因此保留结合抗原的能力。由本发明定义涵盖的抗体片段的实例包括：(i)Fab片段，具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab′片段，其为在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)具有VH和CH1结构域的Fd片段；(iv)具有VH和CH1结构域和在CH1结构域的C-末端的一个或多个半胱氨酸残基的Fd′片段；(v)单一抗体的具有VL和VH结构域的Fv片段；(vi)由VH结构域组成的dAb片段；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab′)₂片段，包括在绞链区中由二硫键连接的两个Fab′片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如，单链Fv；scFv)；(x)具有两个抗原结合位点的“双抗”，其包含连结到在同一多肽链中的轻链可变结构域(VL)的重链可变结构域(VH)；(xi)“线性抗体”，其包含一对串联的Fd链段(VH-CH1-VH-CH1)，其与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。

本文使用的术语“抗体变体”是指在重链和/或轻链中具有单一或多处突变的抗体。在一些实施方案中，所述突变存在于可变区中。在一些实施方案中，所述突变存在于恒定区中。

术语“结合配偶体”可与“靶标”互换使用以指被识别并与肽或蛋白质结合的分子。当结合抗体或抗体片段时，结合配偶体可为抗原或其表位。结合配偶体可在筛选中用以鉴定其亲和力结合剂。

“生物淘选”为选择结合指定靶标的肽的亲和力选择技术。生物淘选包括3个主要步骤：使用先前构建的文库用靶标捕集亲和力结合剂(“淘选”)、洗涤和洗脱。细节在下文中提供。

本文使用的“细胞表面系链结构域”是指赋予多肽联结宿主细胞外膜的能力的氨基酸序列，并且其有时但并非始终天然地存在于目标蛋白质中。如本文所述，细胞表面系链结构域例如包括跨膜域或糖苷基磷脂酰肌醇信号序列。

“嵌合抗体”是指如下抗体：其中重链和轻链的氨基酸序列各自的一部分与在来源于特定物种或属于特定种类的抗体的相应序列同源，同时这些链的剩余链段与另一者中的相应序列同源。通常，在这些嵌合抗体中，轻链和重链两者的可变区模拟来源于一种哺乳动物物种的抗体的可变区，而恒定部分与在来源于另一哺乳动物物种的抗体中的序列同源。所述同源形式的一个明显优势在于，例如，可变区可使用来自非人宿主生物体的易于得到的杂交瘤或B细胞以及来源于例如人细胞制备的恒定区的目前已知的来源。虽然可变区具有易于制备的优势且特异性不受其来源影响，但是与来自人来源的恒定区相比，人抗体恒定区很少会由注入抗体时的人受试者引起免疫反应。然而，所述定义不限于所述特定的实例。

如通常所理解，“密码子”为编码在多肽链中的特异性氨基酸残基或终止翻译(终止密码子)的一系列3个核苷酸(三联体)。存在64种不同的密码子(61种密码子编码氨基酸，外加3种终止密码子)，但仅20种不同的密码子翻译氨基酸。丰富的密码子数目允许许多氨基酸将由多于一种密码子编码。不同的生物体(和细胞器官)常显示特定优选或偏向于编码同一氨基酸的多种密码子中的一种。

抗体的“恒定区”是指单独或组合的抗体轻链的恒定区或抗体重链的恒定区。轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3，或在IgM和IgE的情况下，CH4)的恒定区给予重要的生物性质，如分泌、经胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照惯例，恒定区结构域的编号在它们变得离抗体的抗原结合位点或氨基末端更远时增加。

“简并序列”为具有N1和核苷酸的长度且包含高达4^N1种不同序列的核酸序列。通常，如果序列的位置中的一些或全部具有若干可能的碱基或取代，则所述序列被称作“简并的”。假设∑＝{T，C，A，G}为DNA字母，则序列(例如，引物)可显示为S＝x₁x₂...x_l，其中 并且l为S的长度。序列的简并度为其所含的独特序列组合的数目，可计算为d(S)＝∏^l _i＝1|x_i|。在一些实施方案中，简并密码子取代可通过产生序列来实现，其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代。简并也可为选择性或限制性的，其中仅选择的位置亚组经受取代，和/或一个或多个或所有位置通过优化混合碱基和/或脱氧肌苷残基的组成和比率在限制下取代。

“展示”是指不同重组多肽在例如噬菌体、酵母、细菌和哺乳动物细胞的宿主的表面上的呈现。

本文使用的术语“展示载体”是指能够在宿主中自律地复制并能能够将在载体中的插入物表达并展示为在宿主的表面上的融合蛋白的一部分的质粒或噬菌体DNA或其他DNA序列。

文库的“多样性”是指由在文库中的多核苷酸编码的不同重组多肽的数目。

术语“表达载体”是指能够表达已经克隆到其中的基因或任何开放阅读框的载体。所述表达可在转化到宿主细胞中之后或在体外系统中发生。克隆的DNA或插入物通常操作性连接一个或多个调节序列，例如启动子、活化子/阻遏子结合位点、终止子、增强子等。

术语“融合(fuse)”、“融合(fusion)”或“连接”是指在单一蛋白中的两个多肽之间的共价键联。多肽通常经由肽键彼此直接地或经由氨基酸连接子接合。任选地，肽可经由本领域的技术人员已知的非肽共价键键联。

本文使用的术语“融合标签”为位于靶标蛋白的C-末端或N-末端的肽或蛋白，其改进靶标蛋白的溶解、检测、纯化、表达中的一种或多种。所述融合标签通常与靶标蛋白同框工程改造。常用的融合标签包括但不限于：碱性磷酸酶标签、Avi标签、角质酶标签、halo标签、flag标签、c-myc标签、组氨酸(His)标签、GST标签、绿色荧光蛋白(GFP)标签、HA标签、E-标签、Strep标签、Strep标签II和YoI1/34标签。

本文使用的术语“重链”是指经由其氨基末端区联结免疫球蛋白轻链的较大免疫球蛋白亚单元。重链包含可变区(VH)和恒定区(CH)。恒定区还包含CH1、铰链、CH2和CH3结构域。在IgE、IgM和IgY的情况下，重链包括CH4结构域，但不具有铰链结构域。本领域技术人员将了解重链被分类为gamma、mu、alpha、delta或epsilon(γ、μ、α、δ、ε)，在它们之中具有一些亚类(例如，γ1至γ4)。所述链的本质是将抗体的“类别”分别确定为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等)被很好地表征并且已知赋予功能特异化。

“宿主”旨在包括可为或已经为载体或并入外源核酸分子、多核苷酸和/或蛋白质的受体的任何单个病毒、细胞或其培养物。其还旨在包括单一病毒或细胞的子代。由于天然、偶然或故意突变，子代可不必与原始亲本细胞完全相同(在形态方面或在基因组或总DNA互补序列方面)。病毒可为噬菌体。这些细胞可为原核的或真核的，并且可包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞、动物细胞和哺乳动物细胞，例如鼠科、大鼠、猿或人的细胞。

“人源化”抗体是指具有基本上来源于来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点的分子且所述分子的剩余免疫球蛋白结构基于人免疫球蛋白的结构和/或序列。抗原结合位点可包括融合到恒定结构域上的完全可变结构域或仅接枝到在可变结构域中的适当框架区上的互补判定区(CDR)。抗原结合位点可为野生型或通过一个或多个氨基酸取代改性，例如改性成与人免疫球蛋白更紧密地相似。人源化抗体的一些形式保留全部CDR序列(例如，含有来自小鼠抗体的全部六个CDR的人源化小鼠抗体)。人源化抗体的其他形式具有一个或多个CDR(一、二、三、四、五或六个)，其相对于原抗体有所改变，所述一个或多个CDR又被称为“来源于”一个或多个CDR的一个或多个CDR。

当两个基因或阅读框一起克隆以产生邻接阅读框而没有破坏其中的密码子时，基因或阅读框与另一者“同框”，从而当被表达时，生成表达两种基因或阅读框的融合蛋白。通常，上游基因或阅读框为开放阅读框。阅读框为将在核酸中的核苷酸序列分成一组连续的不相交密码子的方式。开放阅读框(ORF)为含有起始密码子和通常具有为多重3核苷酸的长度但不含在指定阅读框中的终止密码子的随后区的阅读框。

本文使用的“插入物”为连接相容性位点到载体中的异源核酸序列。插入物可包含编码一种或多种多肽的一个或多个核酸序列。插入物可包括调节区或其他核酸成分。

“分离的”或“纯化的”多肽或多核苷酸，例如“分离的多肽”或“分离的多核苷酸”，被纯化到超过其本质上存在状态的状态。例如，“分离的”或“纯化的”多肽或多核苷酸可基本上不含多孔材料或来自得到蛋白或多核苷酸的细胞或组织源的其他污染蛋白，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物。将具有小于约50％的非抗原结合蛋白(在本文中也称作“污染蛋白”)或化学前体的抗原结合蛋白的制剂视为“基本上不含”。将40％、30％、20％、10％且更优选5％(干重)的非抗原结合蛋白或化学前体视为基本上不含。

本文使用的“文库”是指包含编码不同重组多肽的多核苷酸的各种集合或混合物。在某些实施方案中，多核苷酸的文库可包含在指定多核苷酸集合中的至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵个或更多或更少的不同多核苷酸。通常，在文库中的不同多核苷酸经由例如来自单一动物物种(例如，人、小鼠、兔、山羊、马)、组织类型、器官或细胞类型的其来源而相关。“文库”可包含普通种属的多核苷酸。例如，种属可为编码某一类型或分类的免疫球蛋白亚单元多肽的多核苷酸，例如，文库可编码抗体μ、γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2、δ或ε重链或抗体κ或λ轻链。尽管本文所述的任一文库的各成员可编码相同重链或轻链恒定区，但是文库总起来说可包含至少10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵个或更多或更少的不同可变区，即“多个”可变区与常见的恒定区联结。在文库中的不同多核苷酸也可经由例如来自单一动物物种(例如，人、小鼠、兔、山羊、马等)、组织类型、器官或细胞类型的其来源而相关。

本文使用的术语“轻链”是指联结重链的氨基末端区的较小免疫球蛋白亚单元。正如重链一样，轻链包括可变区(VL)和恒定区(CL)。轻链分类为κ或λ。这些轻链中的一对可联结各种重链中的任意一对以形成免疫球蛋白分子。并且在轻链的意义中涵盖具有与κ恒定区(C-κ)连接的λ可变区(V-λ)或与λ恒定区(C-λ)连接的κ可变区(V-κ)的轻链。

术语“标示物”或“报道体”是指可附着到另一目标基因或蛋白的调节序列的基因或蛋白，从而在宿主细胞或生物体中表达时，报道体可赋予可相容易于选择、鉴定和/或测量的某些特征。报道体基因常用作某一基因是否已经引入宿主细胞或生物体中或在宿主细胞或生物体中表达的指示。常用的报道体的实例包括：抗生素抗性基因、营养缺陷性(auxotropic)标示物、β-半乳糖苷酶(由细菌基因lacZ编码)、荧光素酶(来自萤火虫)、氯霉素乙酰转移酶(CAT；来自细菌)、GUS(β-葡糖醛酸糖苷酶；常用于植物中)和绿色荧光蛋白(GFP；来自水母)。报道体或标示物可为可选择或可筛选的。可选择的标示物(例如，抗生素抗性基因、营养缺陷性标示物)为赋予适合人工选择的特征的基因；通常表达可选择的标示物的宿主细胞受对细胞生长具有毒性或抑制性的选择性试剂保护。可筛选的标示物(例如，gfp、lacZ)通常允许研究人员区别所希望有的细胞(表达标示物)和不想要的细胞(未表达标示物或以不足水平表达)。

本文使用的“核酸”、“核酸序列”、“寡核苷酸”、“多核苷酸”或其他语法等效物是指共价连接在一起的至少两个核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸为包括例如20、50、100、200、300、500、1000、2000、3000、5000、7000、10,000等任何长度的聚合物。本文所述的多核苷酸通常含有磷酸二酯键，尽管在一些情况下，包括可具有至少一个不同连键的核酸类似物，例如氨基磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基氨基磷酸酯连键，及肽核酸骨架和连键。可制造天然存在的多核苷酸及类似物的混合物；供选地，可制造不同多核苷酸类似物的混合物及天然存在的多核苷酸和类似物的混合物。下面是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核糖酶、cDNA、cRNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可包含修饰的核苷酸，例如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，则可在聚合物装配之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可由非核苷酸组分打断。可在聚合之后，如通过与标记组分缀合来进一步修饰多核苷酸。术语还包括双链分子和单链分子两者。除非另有说明或要求，作为多核苷酸的本发明的任何实施方案涵盖双链形式和已知或预测构成双链形式的两个互补单链形式两者。多核苷酸由四个核苷酸碱基的特异性序列组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；并且当多核苷酸为RNA时，尿嘧啶(U)代替胸腺嘧啶。因此，术语“多核苷酸序列”为多核苷酸分子的字母表示。除非另外指示，否则一个特定核酸序列也隐含地涵盖其经过保守性修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体地，简并密码子取代可通过产生序列来实现，其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代。

“可操作地连接”是指其中所述组分处于允许它们以其预定方式起作用的关系的两种或多种组分的并置。例如，如果启动子和/或增强子以顺式起作用以控制或调节所连接序列的转录，启动子和/或增强子则操作性连接到编码序列。通常而言，但并不一定地，“操作性连接的”DNA序列为邻接的且在必要的情况下连接两个蛋白编码区或在分泌性前导体的情况下，为邻接或同框的。然而，尽管操作性连接的启动子通常位于编码序列的上游，但其并不一定与编码序列邻接。如果多聚腺苷酸化位点位于编码序列的下游，则多聚腺苷酸化位点操作性连接到所述编码序列，从而转录经编码序列进行到多聚腺苷酸化序列。连接通过本领域已知的重组方法实现，例如使用PCR方法、通过退火或通过在任何方便的限制位点连接。如果常规限制性位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或连接子。

本文使用的术语“肽”、“多肽”或“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物。这些术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物、含有修饰的残基的那些和非天然存在的氨基酸聚合物。在本发明的情况下，术语“多肽”涵盖抗体或其片段。

术语“重组”多核苷酸或核酸在本文中是指在其自然环境中不常见的多核苷酸或核酸，例如包含在本质上不一起存在的至少两个序列的任何核酸。重组核酸可例如通过使用分子生物学方法而体外产生或者例如通过在新染色体位置通过同源或非同源重组插入核酸而体内产生。应了解一旦重组核酸制成并且重新引入宿主细胞或生物体中，它就可例如使用宿主细胞的体内细胞机制而非体外操作来非重组地复制；然而，这类核酸，一旦重组产生，虽然随后非重组地复制，但是出于本发明的目的，仍然被认为重组。

“回收”在本文中用以指所要物种从池中不是所要的其余物种中粗分离。

“限制核酸内切酶”或“限制酶”为在称为识别位点的一个位点处结合双链核酸(例如，DNA)并在所述识别位点外部产生单一双链截点的酶。称为限制位点和裂解位点的双链截点通常位于远离识别位点的短距离内或所述短距离处。一些限制位点常出现在DNA(例如，每几百个碱基对)中，其他的限制位点不太常见(稀有截点；例如，每10,000个碱基对)。识别位点通常约4-8bp长。裂解通常生成1-6个具有5′或3′端点的核苷酸单链突出，尽管一些酶生成钝末端。所述酶和关于其识别和裂解位点的信息自例如NewEnglandBiolabs的商业供应商得到。本文使用的限制位点为“相容的”，如果一旦通过适当的限制酶裂解，则可通过DNA连接酶连接。在一些实施方案中，所述相容性限制位点包括那些双链序列，一旦通过适当的限制酶裂解，这些序列则产生具有可通过DNA连接酶连接的互补突出序列的“粘性末端”。

本文使用的“筛选”是指如下方法，其中包含所要物种的池经受其中可检测所要物种的测定，并且接着在池的等分试样中，检测所要物种并回收或获得任选的富集部分。

“表面蛋白”或“表面肽”是指赋予多肽联结和/或呈现在例如噬菌体、酵母、细菌和哺乳动物细胞的宿主的表面上的能力的氨基酸序列。所述表面蛋白可为噬菌体外壳蛋白、酵母外壁蛋白、细菌外部膜蛋白、细胞表面系链结构域或衔接子或其截断或衍生物。表面蛋白可用于噬菌体展示、酵母展示、细菌展示或哺乳动物展示或在不同宿主之间的穿梭展示。

除非另有说明，否则本文使用的术语“转录”是指由DNA模板合成RNA；术语“翻译”是指由mRNA模板合成多肽。转录和翻译统称为“表达”。

本文使用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移到或引入宿主细胞中的方法。转化的细胞包括原代主题细胞和其子代。所述宿主细胞可为细菌、酵母、哺乳动物细胞和植物细胞。

抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。轻链部分的可变区(VL)和重链部分的可变区(VH)决定抗原识别和特异性。各自由通过3个互补判定区(CDR)连接的4个构架区(FR)组成的VL和VH也称作高变区。CDR补充抗原的形状并决定抗体的亲和力和对于抗原的特异性。在VL和VH两者中存在6个CDR。每个链中的CDR通过FR紧密保持在一起，并且与来自另一链的CDR一起有助于抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两种确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列变化性的方法(Kabat编号方案；参见Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(第5版，1991，NationalInstitutesofHealth，BethesdaMd.))；和(2)基于抗原-抗体复合物的结晶研究的方法(Chothia编号方案，其校正在由Kabat提出的CDR-L1和CDR-H1中插入和缺失的位点(indel)；参见Al-lazikani等(1997)J.Molec.Biol.273：927-948))。也可使用其他编号方法或方案。本文使用的CDR可指由任一方法或两种方法的组合或其他合乎需要的方法限定的CDR。另外，可使用高度保守的芯、边界和高变区的新定义。

本文使用的术语“载体”是指能够将另一核酸运输到它已连接的核酸的核酸分子。载体包括在联结恰当的控制成分时能够复制且可将基因序列转移到宿主中或转移到宿主之间的任何遗传成分，例如质粒、噬菌体载体、噬粒、转位子、装配型质粒、染色体、人造染色体、附加体、病毒、病毒体等。一种类型的载体为附加体，即能够外染色体复制的核酸。另一类型的载体为设计用来与宿主细胞的基因材料重组的整合载体。载体可自律地复制并整合，并且载体的性质可根据细胞环境而不同(即，载体可在一种宿主细胞类型中自律地复制并在另一宿主细胞类型中完全地整合)。载体通常含有一种或少量的限制性核酸内切酶识别位点和/或用于位点特异性重组的位点。外来的DNA片段可在这些位点裂解并连接到载体中。载体可含有适合在转化或转染的细胞的鉴定中使用的标示物。例如，标示物可提供抗生素抗性、荧光、酶以和其他特征。作为第二实例，标示物可补充在培养介质中没有的营养缺陷性缺乏或供给关键性营养素。

在适用领域中的普通技术人员通常将理解如本文所述的在重组核酸技术、微生物学、免疫学、抗体工程改造及分子和细胞生物学领域中使用的其他术语。

展示和选择

使用展示技术以将不同的重组多肽呈现在例如噬菌体、酵母、细菌和哺乳动物细胞的宿主的表面上。使用各种展示载体以将在载体中的插入物表达并展示为在宿主的表面上的融合蛋白的一部分。通过将多种这样的融合蛋白暴露于靶标，因此可使用本领域通常已知的各种体外选择方法来鉴定对靶标的亲和力结合剂。

一种常用的选择方法被称为生物淘选。生物淘选的第一步是构建展示文库。所述文库的多样性和大小可为10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵个或更多或更少的不同成员(例如，多核苷酸)。文库构建包括将所要基因或阅读框插入本文所述的展示载体中。所述插入物可编码抗体片段。例如，所述插入物可为设计用来将变化/突变引入抗体片段(例如，各个CDR区)的多个无规突变或简并寡聚核苷酸。所述插入物也可通过两个限制位点侧接以促进克隆。可选择限制位点以实现高效率克隆(例如，高于约80％、高于约85％、高于约90％或高于约95％)。

在一些实施方案中，所述展示文库可使用含有本发明的重组多核苷酸的载体构建。所述重组多核苷酸从5′到3′可包括：编码将展示在表面上的氨基酸或多肽序列的第一核酸序列(或插入物)；第一预选限制位点；编码用于展示的表面蛋白的第二核酸序列；和第二预选限制位点。这些组分可操作性连接在一起并连接到载体上。在一些实施方案中，当通过其相应限制性核酸内切酶裂解时，第一限制位点和第二限制位点生成相容性粘性末端。

在某些实施方案中，可选择第一限制位点和第二限制位点以各自编码不干扰氨基酸或多肽序列与靶标的结合亲和力和/或表面蛋白的展示的氨基酸。在第一核酸序列编码抗体片段的情况下，可根据以下标准中的一个或多个选择第一限制位点和第二限制位点：

(1)限制位点罕见地存在于人种系Vκ、Vλ或VH中；

(2)限制位点不存在于文库中(例如，6个CDR区)；

(3)在裂解之后，暴露粘性末端(例如，4-碱基粘性末端)。在一些情况下，预期，与其他粘性末端(例如，2-碱基粘性末端)或钝末端相比，4-碱基粘性末端增加自连接效率；

(4)限制位点不编码任何同框终止密码子，并且其编码与抗体片段的结构相容的氨基酸(例如，不允许Cys)；

(5)这些位点在载体中为独特的；

(6)可使相应限制酶钝化(例如，在例如65℃的较高温度下)；和/或

(7)相应限制酶价廉，但稳固，并且缺乏星号活性。

例如，可选择第一限制位点和第二限制位点以满足上述所有标准。在本文举例说明的噬粒Fad22的情况下，所述位点包括XbaI、NcoI、SalI和XhoI位点。在一个实施方案中，第一限制位点为XbaI位点。在一些实施方案中，第二限制位点为XbaI位点。对于其他载体，本领域的普通技术人员将能够遵循上述标准来选择适当的限制位点。

在某些实施方案中，第一核酸序列可为开放阅读框且可与第二核酸序列同框工程改造，从而在表达时可生成表达两种序列的融合蛋白。所述融合蛋白因此可呈现在宿主的表面上。为了促进表面呈现，可选择第二核酸序列以编码例如噬菌体外壳蛋白、酵母外壁蛋白、细菌外部膜蛋白或细胞表面系链结构域或其截断或衍生物的表面蛋白。例如，可使用丝状噬菌体M13的基因III或其截断或衍生物。因此，表面蛋白能够实现噬菌体展示、酵母展示、细菌展示或哺乳动物展示或在不同宿主之间的穿梭展示。

在各种实施方案中，提供高通量转化成表达载体的展示载体。所述展示载体可含有上述重组多核苷酸和第二限制位点的3’的融合标签序列。在一些实施方案中，所述融合标签序列可工程改造，从而在(a)通过裂解第一限制位点和第二限制位点除去第二核酸序列，和(b)再连接由此生成的相容性粘性末端时，第一核酸序列与融合标签序列同框。示例性融合标签序列包括以下标签中的一种或多种：碱性磷酸酶标签、Avi标签、角质酶标签、halo标签、flag标签、c-myc标签、组氨酸标签、GST标签、绿色荧光蛋白标签、HA标签、E-标签、Strep标签、Strep标签II和YoI1/34标签及本领域的普通技术人员已知的其他标签。融合标签序列可操作性连接到在载体中的其他成分。在一些实施方案中，可选择特异性限制位点以侧接融合标签序列，从而促进交换和/或克隆。例如，如在图1中所示，将FlagHis6标签用于Fad22质粒中。FlaHis6标签由SalI位点(例如，上游)和XbaI位点(例如，下游)侧接。所述位点可经由沉默诱变工程改造。另外，所述SalI位点直接配置在CH1结构域的C-末端的下游或最靠近CH1域的C-末端的限制位点。这些位点可促进CH1下游的标签的方便交换。除了SalI之外或代替SalI，许多其他的限制位点也可引入CH1ORF下游和其外部以促进各种载体成分的引入和去除。

在展示文库构建期间，可使用展示载体的文库，其中各展示载体可含有编码独特的肽或抗体片段的独特的第一核酸序列。

一旦构建了文库，生物淘选的下一步骤为捕集或淘选步骤，其中所展示的肽结合所要靶标。淘选利用在由宿主提供的亲和力结合剂与其靶标之间的结合相互作用，从而仅具有结合亲和力的特异性肽结合靶标。所述靶标通常直接或间接地附着到固相或固定在固相中。例如，由噬菌体呈现的抗体可在微量滴定板中用涂覆的抗原加以选择。在捕获步骤之后，通常使用温和的洗涤步骤来洗掉没有在其表面上呈现亲和力结合剂的未结合的宿主；仅保留具有所要亲和力的结合的宿主。最后步骤包括洗脱或回收步骤，其中结合的宿主经由蛋白酶裂解、pH改变或其他环境条件洗脱。最终结果是收集并分析展示在结合的宿主上的特异性肽。所述循环可多次发生(例如，在越来越严格的洗涤条件下)以对于靶标筛选强亲和力的结合剂。

还可使用其他体外选择方法。例如，各种标示物或报道体可促进选择。一种常用的报道体为GFP蛋白，其中亲和力结合剂可经由荧光激活细胞分选(FACS)选择。

在一些实施方案中，在回收亲和力结合剂之后，必须表达、定序或进一步表征相应的多核苷酸。使用本发明的载体，可将展示载体在简单的裂解-再连接步骤中转化成表达载体，排除对于亚克隆目标多核苷酸的需要。因此，本发明提供用于亲和力结合剂的更有效且更快的下游评价的有吸引力的供选方法。

在噬菌体展示中的转化载体

在以下部分中，提供关于质粒载体的详细描述。然而，本领域的一般技术人员应理解，所述描述同样地适用于使用标准分子克隆技术的其他类型的载体。例如，关于噬菌体(例如，M13噬菌体)外壳蛋白(例如，GP3、GP8或GP7)的论述同样适用于其他表面蛋白，例如酵母外壁蛋白、细菌外部膜蛋白、细胞表面系链结构域或衔接子。还应所述理解以下描述适用于各种抗体和抗体片段(包括例如Fab、Fab′Fd、Fd′、Fv、dAb、分离的CDR区、F(ab′)₂和scFv)。此外，使用本发明的载体和方法鉴定的抗体片段可用于构建各种形式的抗体，例如人源化抗体、嵌合抗体和包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰的构造。

类似地，尽管下文提供的描述集中在分离编码抗体或特异性识别抗原的抗体片段的多核苷酸，但是所述方法同样适用于分离编码具有其他所要性质的多肽(例如，抗体)的多核苷酸，所述性质包括例如特异性结合配偶体；对结合配偶体具有较高结合亲和力；抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；补体依赖性细胞毒性(CDC)；激动剂或拮抗剂功能；诱发或抑制细胞凋亡、血管生成、增殖；活化信号途径的抑制作用。可同时或单个地筛选多种性质。这些所要性质的测定方法在本领域中已知。

噬菌体展示方法为用于研究蛋白的相互作用的技术。这种技术基于在噬菌体的表面上表达(展示)目标结合蛋白和基于其容量选择所述结合蛋白以与结合配偶体形成复合物。通常，存在用于展示结合蛋白、噬菌体载体和质粒载体的两种类型的载体，分别产生多价噬菌体或单价噬菌体。

在涉及噬菌体载体的第一方法中，原理依赖于噬菌体基因组的基因重组：编码目标结合蛋白的序列插入所述噬菌体基因组中。序列插入紧挨着编码形成噬菌体的外壳蛋白复合物的蛋白的基因局部化。所述外壳由例如最常用的GP3和GP8蛋白的不同蛋白构成。目标序列紧挨着编码这些外壳蛋白的基因插入能够实现目标结合蛋白与噬菌体的外壳蛋白的融合。重组噬菌体(即，噬菌体载体)随后感染细菌，并且在其中复制其基因组。重组噬菌体基因组的表达引起生成在其表面上表达待筛选的异源结合蛋白的噬菌体，其中外壳蛋白的所有复本都展示异源蛋白(即，异源蛋白重复地或多价地展示在指定噬菌体上)。在筛选步骤期间，使被称为靶标或结合配偶体的不同蛋白或分子与所述目标蛋白接触。当在噬菌体表面上的结合蛋白与结合配偶体之间形成复合物时，将所述复合物纯化且随后可由重组噬菌体基因组确定编码目标结合蛋白的核苷酸序列。

示例性噬菌体载体包括在国际专利公告WO92/06204号中描述的M13IX30、M13IX11、M13IX34、M13IX13或M13IX60，和在美国专利6,057,098号中描述的用于产生多价展示文库的方法中使用例如载体668-4的任何来源的噬菌体载体。尽管大多数噬菌体展示方法已经使用丝状噬菌体，但还知道λ形噬菌体展示系统(WO95/34683；美国专利5,627,024号)、T4噬菌体展示系统(Ren等，Gene，215：439(1998)；Zhu等，CancerResearch，58(15)：3209-3214(1998)；Jiang等，Infection&Immunity，65(11)：4770-4777(1997)；Ren等，Gene，195(2)：303-311(1997)；Ren，ProteinSci.，5：1833(1996)；Efimov等，VirusGenes，10：173(1995))和T7噬菌体展示系统(Smith和Scott，MethodsinEnzymology，217：228-257(1993)；美国专利5,766,905号)。

第二噬菌体展示方法组合使用质粒(展示)载体和辅助噬菌体以便产生在其表面上表达目标结合蛋白的噬菌体的文库。质粒载体包含编码目标结合蛋白的序列和噬菌体序列，特别是编码将与目标结合蛋白融合的外壳蛋白(即，所展示的蛋白融合基因)的序列，其克隆到小质粒中。质粒载体还由用于复制噬菌体基因组(例如，噬菌体复制源，如Ff或f1源)和保持载体(例如，质粒复制源，如pBR322或pMB1)在宿主细胞中的不同功能序列构成。质粒载体不含整个噬菌体基因组，这是为何这种方法与用于产生在其表面上表达作为融合蛋白的结合蛋白的噬菌体的辅助噬菌体的使用相组合的原因。辅助噬菌体在感染宿主细胞(例如，大肠杆菌)时，能够通过自在质粒中不存在的完整噬菌体基因组补充蛋白来复制和包装噬菌体基因组。市售的辅助噬菌体包括可购自NewEnglandBiolabs的M13K07及可购自Stratagene的R408和VCSM13，其通常具有降低包装效率的突变，从而确保优先包装质粒基因组。另外，用一种或多种补体衔接子使辅助噬菌体工程改造以防止被不相关的噬菌体或质粒颗粒污染。由于使用辅助噬菌体，表达来自辅助噬菌体基因组的所有广泛类型的噬菌体蛋白以及由质粒编码的少量融合蛋白，从而由细胞挤出的噬菌体颗粒含有通常大大过量的野生型的两种蛋白。藏有GP3质粒展示载体并被辅助噬菌体感染的来自大肠杆菌的噬菌体颗粒的典型制剂将表现出融合蛋白表达的泊松分布(Poissondistribution)：10％或更少的颗粒将展示融合蛋白的一种复本；很小百分数的颗粒将展示两种复本；且剩余的大多数颗粒将仅展示野生型GP3且不展示融合蛋白。因此，主展示物种为单价的，而大多数颗粒根本不展示。

展示的价在根本上由于其对于辨别不同亲和力的结合剂的能力的影响而是重要的。早期研究显示多价展示以正鉴定的选择形式防止最高亲和力克隆，因为多价赋予弱结合性克隆以高表观亲和力(活动性)。单价展示允许基于纯粹的亲和力选择且因此通常对于许多研究而言是优选的，其中目的在于自文库鉴定最紧密的集合变体。相反地，在初始选择体具有低亲和力的应用中——例如结合指定靶标的肽的从头选择——多价增加分离稀有且弱结合的克隆的改变。常用的策略是从多价展示开始，并且随后随着所展示肽的亲和力成熟而移到单价展示。

辅助噬菌体的使用可通过使用细菌包装细胞系技术排除，其详细描述在美国专利8,227,242号中，其全部公开内容以引用的方式结合到本文中来。

除了选择用于构建突变体文库的合适载体之外，拣选突变体的噬菌体文库还需要构建并传播许多变体的策略、使用靶标受体亲和纯化的程序和评价结合富集的结果的方法。参见美国专利5,223,409号、5,403,484号、5,571,689号和5,663,143号。

现在已经研发了基本噬菌体展示原理的许多其他改进和变化。这些改进增强展示系统筛选结合选定靶标分子的肽文库并展示具有对于所要性质筛选这些蛋白的潜在性的功能蛋白的能力。已经研发了用于噬菌体展示反应的组合反应装置(WO98/14277)且已经使用噬菌体展示文库来分析并控制双分子相互作用(WO98/20169；WO98/20159)和限制螺旋肽的性质(WO98/20036)。WO97/35196描述分离亲和力配体的方法，其中使噬菌体展示文库与其中配体将结合靶标分子的—种溶液和其中亲和力配体不会结合靶标分子的第二溶液接触，以选择性地分离结合配体。WO97/46251描述生物淘选具有亲和力纯化的抗体的无规噬菌体展示文库且随后分离结合噬菌体，接着使用微板孔分离高亲和力结合噬菌体的微淘选过程的方法。WO97/47314描述使用可为噬菌体展示文库的组合文库来区分酶特异性的底物扣除文库的用途。用于使用噬菌体展示选择适用于洗涤剂中的酶的方法描述在WO97/09446中。选择特异性结合蛋白的另外方法描述在美国专利5,498,538号和5,432,018号及WO98/15833中。另外，衔接子直接展示和跨物种展示，包括但不限于在以下文献中描述的那些：Wang等，Adapter-DirectedDisplay：AModularDesignforShuttlingDisplayonPhageSurfaces，J.Mol.Biol(2010)395，1088-1101和Wang等，Yeastsurfacedisplayofantibodiesviatheheterodimericinteractionoftwocoiled-coiladapters，JournalofImmunologicalMethods(2010)354，11-19，也可用于本发明中。

产生肽文库和筛选这些文库的方法还公开在美国专利5,723,286号、5,432,018号、5,580,717号、5,427,908号、5,498,530号、5,770,434号、5,734,018号、5,698,426号、5,763,192号和5,723,323号中。

通常，噬菌体展示通过抗体片段融合到例如GP3、GP8或GP7的在M13噬菌体上的外壳蛋白中的一种上来实现。在本发明的一个实施方案中，构建称为Fad22的质粒，其中代替全长GP3蛋白使用GP3C-末端(“CT”)片段。已经显示GP3CT片段具有比全长GP3小的毒性，而在展示在噬菌体表面上的抗体片段方面同样有效。

使用本文所述的重组多核苷酸和载体，可构建噬菌体展示文库。例如，可选择限制位点以侧接GP3CT片段。在本文举例说明的噬粒Fad22的情况下，所述位点包括XbaI、NcoI、SalI和XhoI位点。在一个实施方案中，第一限制位点为XbaI位点。在一些实施方案中，第二限制位点为XbaI位点。

对于靶标的所要亲和力结合剂(例如，抗体片段)可经由例如上述生物淘选方法的筛选和回收步骤鉴定。接着，常需要在宿主(例如，大肠杆菌)中表达没有GP3CT片段的抗体片段，以进一步纯化并表征所述抗体片段。通常存在两种实现这个目标的方法。

第一方法为基因方法，其中将琥珀终止密码子(TAG)插在编码抗体片段的基因和编码GP3片段的基因之间。在用于噬菌体筛选的细菌抑制基因菌株(例如，TG1或ER2738)中，遗传等位基因SupE抑制琥珀终止密码子，并且作为替代，插入氨基酸(通常，谷氨酰胺)，因此允许经由GP3片段表面展示抗体片段。然而，在通常用以表达的非抑制菌株(例如，HB2151)中，细菌翻译机制核糖体在抗体片段和GP3片段之间的琥珀终止密码子处停止，这引起合成并输出抗体片段的细菌胞外质，但未合成并输出其具有GP3片段的融合蛋白。这方法的优势在于不再需要展示载体的操作。作为替代，抗体片段可通过从琥珀抑制菌株简单地移动相同展示载体到非抑制菌株而在大肠杆菌中表达。然而，这种方法也具有若干缺点：(a)抑制效率是菌株依赖性的，并且通常小于30％，其降低噬菌体展示效率；(b)琥珀终止密码子不是强末端密码子，并且因此即使在非抑制菌株中也存在漏通读(leakyread-through)，导致在细菌胞外质中可溶性抗体片段的产率降低；和(c)因为在抑制菌株中还展示并选择了含有内部琥珀终止密码子的抗体片段，所以这些内部琥珀终止密码子必须通过费劲且昂贵的定点诱变过程替换为其他密码子，从而使这些抗体片段在非抑制菌株中表达。

第二“裂解-再连接”方法与上述方法的不同之处在于，在展示载体从大肠杆菌中提取出之后，将载体用特异性限制酶消化以释放GP3片段，并且随后载体使用T4DNA连接酶自连接，接着转化到用于表达的特异性胜任大肠杆菌菌株中。Pershad等(Anal.Biochem.412(2011)：210-216)使用MfeI(很少使用且相对昂贵的限制酶)来从噬菌体展示载体中切除GP3编码序列。还已知MfeI酶展示星号活性(NEB)，并且其高保真版本MfeI-HF降低但没有消除星号活性。另外，MfeI限制位点CAATTG编码Gln和Leu，并且已知Gln对例如脱酰胺基的后翻译敏感，这可不利地影响亲和力结合剂的结构和功能。

与MfeI形成对比，本发明的载体利用具有以下优势中的一种或多种的限制位点：

(1)限制位点罕见地存在于人种系Vκ、Vλ或VH中；

(2)限制位点不存在于文库中(例如，6个CDR区)；

(3)限制位点编码与例如抗体片段的亲和力结合剂的结构相容的氨基酸；

(4)这些位点在载体中为独特的；和/或

(5)相应限制酶价廉，但稳固，并且缺乏星号活性。

使用本发明的重组多核苷酸和载体，展示载体可以高通量高效率方式转化成表达载体。在一些实施方案中，将展示载体转化成表达载体的方法。所述方法包括：提供本文所述的展示载体；用其相应限制酶裂解所述第一限制位点和所述第二限制位点，由此生成相容性粘性末端；和再连接所述相容性粘性末端以生成表达载体，其中所述第一核酸序列与所述融合基因标签序列同框。

所述方法可还包括另外在所述第二核酸序列内裂解以增加在所述再连接步骤中的再连接效率。所述裂解可生成与粘性末端相比不太可能连接的钝末端。

在一些实施方案中，在所述再连接步骤之前，可将来自所述裂解步骤的产物稀释以增加再连接效率。稀释可用水，例如用水以1∶10或1∶20或1∶100稀释，以促进分子内相互作用(即，载体再连接)超过分子间相互作用(即，在载体和GP3片段之间的连接)。

在再连接步骤之后，可将表达载体引入宿主中，以进一步表征第一核酸序列，包括在宿主中表达相应肽或对第一核酸序列进行定序。在一些实施方案中，所述提供、裂解、再连接和引入步骤可在小于12小时内、在小于8小时内或在小于4小时内完成。

在文库筛选和选择的情况下，多种(例如，数百或成千种)展示载体可平行地转化成多种表达载体，并且可将所述多种表达载体引入宿主群体中。因此，本发明的方法可以高通量方式执行。在一些实施方案中，从所述多种展示载体到所述多种表达载体的转化率可高于80％、高于85％、高于90％、高于92％、高于95％或高于98％。因为接近100％的转化率，可实现数百或成千或上百万个单个菌落的平行处理(例如，在单个的96孔板中)，排除对于进一步表征各个单一菌落的需要并显著增强通量。

本发明另外提供鉴定对于靶标的亲和力结合剂的方法。所述方法可包括：筛选各自含有本文所述的展示载体的第一宿主的群体，以获得对于靶标具有结合亲和力的第一宿主的亚群。各个第一宿主在其表面上展示由在所述展示载体中的独特第一核酸序列编码的氨基酸序列。第一宿主的亚群各自展示对靶标的亲和力结合剂。所述方法还包括从所述第一宿主的亚群中分离的展示载体通过裂解所述第一限制位点和所述第二限制位点以除去所述第二核酸序列并再连接由此生成的相容性粘性末端而转化成表达载体。所述方法另外包括将所述表达载体引入第二宿主的群体中，以进一步表征所述亲和力结合剂。在各种实施方案中，所述方法可以高通量方式执行。例如，所述转化步骤的转化率可高于80％、高于85％、高于90％、高于92％、高于95％或高于98％。

本发明的各个方面可单独、组合或以前面描述的实施方案中未具体讨论的各种布置来使用，因此在其应用上不限于前述说明书中阐明或在附图中图示的组件的详情和布置。举例来说，在一个实施方案中描述的方面可以任何方式与在其他实施方案中描述的方面组合。

实施例

在Fad22的一种示例性设计(图1)中，将两个XbaI限制位点工程改造以侧接GP3C-末端片段(标记“GP3CT”)。一个XbaI位点(XbaI(4116))配置在GP3的GGT密码子253(编码Gly)的上游，而另一XbaI位点(XbaI(3645))安置在在GP3的TCT密码子406(编码Ser)之后配置的两个终止密码子(TGATAA)的下游。选择XbaI限制位点，因为其满足以下标准：

(1)其罕见地存在于人种系Vκ、Vλ或VH中；

(2)其不存在于文库中(例如，6个CDR区)；

(3)在裂解之后，代替2-碱基粘性末端或钝末端，暴露4-碱基粘性末端。在一些实施方案中，4-碱基粘性末端可增加自连接效率；

(4)XbaI位点(TCTAGA)编码与抗体片段的结构相容的氨基酸丝氨酸和精氨酸；

(5)这两个XbaI位点为在Fad22中的存在的仅有的两个XbaI位点；

(6)限制酶XbaI可在65℃下钝化；

(7)相应限制酶XbaI价廉，但稳固，并且缺乏星号活性。

仍然参考图1，Fad22质粒含有两个来源：一种用于噬菌体复制(f1ori)，并且另一种用于质粒复制(pMB1ori)。Fad22还含有编码b-内酰胺酶且给予抗b-内酰胺抗生素(青霉素(penicillin)、氨苄西林(ampicillin)等)的抗性的Bla标记基因。lac启动子(Plac)配置在融合基因(编码基因的抗体片段和GP3CT基因)的上游。编码基因的抗体片段(例如，Fab)可包含各种目标结构域，例如，如在图1中所示的Vκ1、CL、VH3和CH1结构域。这些结构域可以任何合适的顺序布置以表达抗体片段。各个结构域具有引入其中的一个或多个突变，生成突变体的文库。在Fad22中分别在Vκ1-CL和VH3-CH1的上游还包括两个核糖体结合位点(RBS1和RBS2)和两个分泌信号序列(SS1和SS2)以促进翻译和其分泌。

在一个实施例中，在用XbaI20倍过度消化(overdigestion)Fad22之后，可连接并复切超过95％的DNA片段。可使用的另外酶包括NcoI、SalI和XhoI。

据说明，在XbaI消化，接着用T4DNA连接酶自连接之后，当开始质粒浓度等于或低于2ng/μl时，可获得展示载体到表达载体的几乎100％转化(图2)。然而，当开始质粒浓度处于或高于10ng/μl时，转化率低于50％(图2)。这个结果可通过较高浓度有利于分子间连接，而不是分子内自连接的事实解释。

转化效率使用例如XbaI和XmnI的两种限制酶的组合进一步改进。XmnI(GAATAATTTC)位点存在于编码GP3C-末端片段的基因中，并且通过XmnI限制酶消化产生与粘性末端相比更难以连接的钝末端(如通过XbaI生成)。实验说明，在XbaI和XmnI组合，接着用T4DNA连接酶自连接的情况下，即使开始质粒浓度为约10ng/μl，也实现展示载体到表达载体的几乎100％转化(图3)，其显著高于在仅使用XbaI时在10ng/μl下的结果(图2)。因此，XbaI和XmnI的组合显著扩展开始质粒浓度的范围，并且改进这种裂解-再连接方法的稳固性，特别是在高通量设置下，其中同时处理数百或甚至上千种质粒样品，并且其中开始质粒浓度通常相差数倍。

等效方案

本发明尤其提供用于高通量筛选和选择的新方法和载体。虽然已经讨论了本发明的具体实施方案，但是以上说明书是说明性的，并非限制性的。在阅读本说明书之后，本发明的许多变化对于本领域技术人员而言将为显而易见的。本发明的整个范围应通过参考权利要求书与其等效物的整个范围以及说明书与这类变化来确定。

以引用的方式并入

本文提到的所有出版物、专利、序列数据库条目都通过引用整体并入本文中，就如同具体且单个地指出单个的公开案或专利各自通过引用并入本文中一样。

Claims (25)

1.一种重组多核苷酸，所述重组多核苷酸从5′到3′包含：

编码将在表面上展示的氨基酸序列的第一核酸序列；

选自由XbaI、NcoI、SalI和XhoI位点组成的组的第一限制位点；

编码能够展示在所述表面上的表面肽的第二核酸序列；和

选自由XbaI、NcoI、SalI和XhoI位点组成的组的第二限制位点；

其中所述第一核酸序列与所述第二核酸序列同框工程改造；

其中所述第一限制位点和所述第二限制位点在通过其相应限制酶裂解时生成相容性粘性末端。

2.如权利要求1所述的重组多核苷酸，其中所述第一核酸序列编码抗体片段。

3.如权利要求1或2所述的重组多核苷酸，其中所述第一限制位点和所述第二限制位点各自编码不干扰所述氨基酸序列的结合亲和力的氨基酸。

4.如权利要求1-3中任一项所述的重组多核苷酸，其中所述第一限制位点和所述第二限制位点各自编码不干扰所述表面肽的展示的氨基酸。

5.如权利要求1-4中任一项所述的重组多核苷酸，其中所述第一限制位点为XbaI位点。

6.如权利要求1-5中任一项所述的重组多核苷酸，其中所述第二限制位点为XbaI位点。

7.如权利要求1-6中任一项所述的重组多核苷酸，其中所述第二核酸序列编码噬菌体外壳蛋白、酵母外壁蛋白、细菌外部膜蛋白、细胞表面系链结构域或衔接子或其截断或衍生物。

8.如权利要求1-7中任一项所述的重组多核苷酸，其中所述第二核酸序列为丝状噬菌体M13的基因III或其截断或衍生物。

9.如权利要求1-7中任一项所述的重组多核苷酸，其中所述第二核酸序列编码能够结合结合配偶体的衔接子，其中所述结合配偶体表达为融合基因并直接展示在所述表面上。

10.如权利要求1-9中任一项所述的重组多核苷酸，其中所述表面肽用于噬菌体展示、酵母展示、细菌展示或哺乳动物展示或在它们之间的穿梭展示。

11.如权利要求1-10中任一项所述的重组多核苷酸，其中在表达时，所述氨基酸序列和所述表面肽在所述表面上展示为融合蛋白。

12.一种用于高通量转化成表达载体的展示载体，所述展示载体包含：

如权利要求1-11中任一项所述的重组多核苷酸；和

所述第一限制位点的5’或所述第二限制位点的3’的融合标签序列。

13.如权利要求12所述的展示载体，其中当所述融合标签序列在所述第二限制位点的3’时，所述融合标签序列被工程改造以使得在(a)通过裂解所述第一限制位点和所述第二限制位点除去所述第二核酸序列，和(b)再连接由此生成的相容性粘性末端时，所述第一核酸序列与所述融合标签序列同框。

14.如权利要求12或13所述的展示载体，其中所述融合标签序列选自以下标签中的一种或多种：碱性磷酸酶标签、Avi标签、角质酶标签、halo标签、flag标签、c-myc标签、组氨酸标签、GST标签、绿色荧光蛋白标签、HA标签、E-标签、Strep标签、Strep标签II和YoI1/34标签。

15.如权利要求12-14中任一项所述的展示载体，其提供在展示载体的文库中，其中各展示载体具有独特的第一核酸序列。

16.一种用于将展示载体转化成表达载体的方法，所述方法包括：

提供如权利要求12-15中任一项所述的展示载体；

用其相应限制酶裂解所述第一限制位点和所述第二限制位点，由此生成所述相容性粘性末端；和

再连接所述相容性粘性末端以生成表达载体，其中所述第一核酸序列与所述融合标签序列同框。

17.如权利要求16所述的方法，其还包括在所述第二核酸序列内裂解以增加在所述再连接步骤中的再连接效率。

18.如权利要求16或17所述的方法，其还包括在所述再连接步骤之前，稀释来自所述裂解步骤的产物。

19.如权利要求16-18中任一项所述的方法，其还包括在所述再连接步骤之前，将所述表达载体引入宿主中，以进一步表征所述第一核酸序列。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述进一步表征包括定序所述第一核酸序列和/或表达所述第一核酸序列。

21.如权利要求19所述的方法，其还包括将多种展示载体平行地转化成多种表达载体，和将所述多种表达载体引入宿主群体中，由此以高通量方式执行所述方法。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述多种展示载体到所述多种表达载体的转化率高于90％或95％。

23.一种鉴定对于靶标的亲和力结合剂的方法，所述方法包括：

筛选各自含有如权利要求12-15中任一项所述的展示载体的第一宿主的群体，以获得对于靶标具有结合亲和力的第一宿主的亚群，其中各第一宿主在所述第一宿主的表面上展示由在所述展示载体中的独特第一核酸序列编码的氨基酸序列，并且其中所述第一宿主的亚群各自展示对于所述靶标的亲和力结合剂；

从所述第一宿主的亚群中分离的展示载体通过裂解所述第一限制位点和所述第二限制位点以除去所述第二核酸序列并再连接由此生成的相容性粘性末端而转化成表达载体；和

将所述表达载体引入第二宿主的群体中，以进一步表征所述亲和力结合剂。

24.如权利要求23所述的方法，其以高通量方式执行。

25.如权利要求23或24所述的方法，其中所述转化步骤的转化率高于90％或95％。