JPH06505866A - 結合タンパク質の最適化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２３、前記結合ドメインが、ＣＤＲ類である、請求項２１に記載の宿主細胞。

２４、請求項２１に記載の宿主細胞で製造される、結合タンパク質。

２５、前記結合タンパク質が、抗体である、請求項２４に記載の結合タンパク質 。

２６、前記結合ドメインが、ＣＤＲ類である、請求項２４に記載の結合タンパク 質。

明細書 結合タンパク質の最適化 技術背景 本発明は、リガンド−タンパク質の結合相互作用一般に関し、そしてさらに詳細 には、抗原−抗体結合アフィニティーの最適化方法に関する。

抗体は、を椎動物免疫系により産生される、抗原に結合する混合型（ｈｅｔｅｒ ｏｍｅｒｉｃ）結合タンパク質である。その分子は、２つのヘビーチェーンとジ スルフィド結合により接続された２つのライトチェーンとから構成される。抗体 は、その７字の両方の短いアームの末端に位置する抗原結合部分を有するＹ字形 構造を有する。抗原結合部分に相当するヘビーチェーンおよびライトチェーンポ リペプチド上のこの領域は、可変領域として知られている。抗体の結合特異性は 、抗原とヘビーチェーンおよびライトチェーンの可変領域の両方との相互作用が 複合したものである。この領域内の相違が、抗体間の結合特異性の変化の主な原 因である。

免疫系は、殆ど無限といって良い数の異なった抗体を産生ずる能力を有する。こ の様に大きな多様性は主として、各鎖の可変領域を形成する本体論的再結合、お よび、ヘビーチェーンおよびライトチェーンの異なった対形成を介して生じる。

各鎖の可変領域の骨格構造内に、非常に多様な超可変領域配列により特徴付けら れるドメインが存在する。これらの超可変領域の配列は、天然のタンパク質内の 抗原結合ポケットを構成するので、抗体の多様性の原因の主な部分である。これ らの領域内のアミノ酸配列の相違が、異なる抗原−抗体結合相互作用の形成をも たらす。従って超可変領域配列は、抗原の官能基に相補性であり、これは、相補 性決定部位（ＣＤＲｓ）として知られている。ＣＤＲ配列の多様な組合わせの創 造により天然の免疫系を模倣できるならば、実質的に任意の所望の抗原に対して 高いアフィニティーを有する抗体の迅速な産生ができるので、非常に価値がある 。このような抗体は、種々の診断および治療目的に使用され得る。

最近まで、所望の分子に対する抗体の産生は、天然の免疫応答の操作のみにより 行われていた。この方法には、実験用動物の古典的な免疫技法およびモノクロー ナル抗体の産生等が含まれる。モノクローナル抗体の産生は、困難であり、かつ 時間を用する。モノクローナル抗体の産生には、一連の異なった技法が含まれ、 動物細胞中でのみ実施される。動物細胞は、比較的世代時間が長（、そして培養 物の生存を保証するために非常な注意が要求される。

細菌中で広範な種類の多様な抗体分子を産生ずる方法も、本明細書では参考文献 として援用する、Ｈｕｓｅら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４６：１２７５−１２８１　 （１９８９）に記載されている。この方法では、ベクターとしてバクテリオファ ージλを使用する。このλベクターは、長い直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子である。

このベクターを用いた抗体産生には、ＤＮＡ配列のヘビーチェーンおよびライト チェーンの集合を異なったベクターにクローニングすることが含まれる。次に、 ベクターをランダムに組み合わせ、ヘビーチェーンおよびライトチェーンを同時 発現させ、抗体フラグメントの形成を司る単一のベクターを形成する。この方法 の欠点は、抗体アフィニティーがインビボ由来のアフィニティーに制限される点 である。このアフィニティーの相違は、体細胞変異として知られている特異的な 免疫学的アフィニティーの成熟プロセスに起因する。組換えライブラリー由来の 抗体は、このプロセスの恩恵を受けない。さらに抗体の配列は、ライブラリー内 で不均一に発現され得る。この不均一は、クローニング方法自身に起因する。こ の方法目体の結果は、もし高いアフィニティーの配列よりも中位のアフィニティ ーの抗体が主体の場合には、中位のアフィニティーの抗体のみの選択を引き起こ す。

従って、天然の免疫学的プロセスを模倣し、インビボ由来のものと異なるインビ トロ由来の抗原結合アフィニティーを提供する、抗原結合アフィニティーを最適 化する方法に対する要求が存在する。本発明は、これらの要求を満たし、そして 関連する利点をも提供する。

及豆旦！１ 本発明は、少なくとも１組のスプライシング部位を有する結合タンパク質をコー ドする２つあるいはそれ以上の核酸を提供する工程、ここで、スプライシング部 位の組が１つあるいはそれ以上のコードされた結合ドメインの両末端に隣接して いる；その核酸を混合し、結合タンパク質をコードする混合核酸の親集合を製造 する工程：および、核酸の間にスプライシング部位の組を介して結合ドメインを ランダムに組み込み、結合タンパク質をコードする核酸の別の集合を製造する工 程、ここで、少な（とも１つの結合タンパク質は、親集合の構成要素と実質的に 異なった結合特性により特徴付けられる；により、フードされた結合タンパク質 の結合特性を最適化するための核酸操作方法に関する。

図面の簡単な説明 図１は、混合型（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ）結合タンパク質由来の結合ドメイン の混合を示すダイアグラムである。上部：混合型（ｈｅｔｅｒｏ＋＊ｅｒｉｃ） 結合タンパク質は、２つのポリペプチド（ｖＨおよびｖＬ）によりコードされる 。各ポリペプチドの結合ポケットは、３つの異なる結合ドメイン、■、８１から ＨＣＤＲ３、およびり。ＤＲＩからＬＣＩ）Ｒ３より構成される。（Ａ）は、異 なるＶＨＣＤＲ類と異なるｖＬＣＤＲ類との混合を示す。（Ｂ）は、両ポリペプ チドのＣＤＲｌとＣＤＲ２および３との混合を示す。（Ｃ）は、両ポリペプチド のＣＤＲ３とＣＤＲ１および２との混合を示す。

及朋！ＪｌｌＬ１哩 本発明は、複数の結合タンパク質の間に結合ドメインを混合するための、簡単で 効率的な方法に関する。この方法は、所望の結合タンパク質の結合特性を最適化 するために使用し得、そしてこの方法は、関連する結合ドメインをランダムに相 互交換することで、特定の抗原に結合し得る可能性のあるタンパク質の数を増加 させるという利点がある。関連する機能を示すドメインの相互交換は、実質的に 異なる結合相互作用を与える結果的な相違を、抗原の結合相互作用にもたらす可 能性を増大させる。この結合タンパク質は、無数の診断および治療方法に有用で ある。

１つの実施態様では、ヘビーチェーンおよびライトチェーンの抗体フラグメント のクローニングされた集合を、元のクローニングされた集合とは実質的に異なる 結合特性を有し、特定の抗原に対する結合タンパク質を生じさせるために使用す る０元のクローニングされた集合内の抗体フラグメントは全て、所望の抗原に対 して結合特異性およびアフィニティーを示し、従って、機能的に関連している。

新規な抗体が、関連する抗体間のＣＤＲ配列の異なる組み合わせをランダムに混 合することにより生成される。例えば、１本鎖核酸に特異的な変異誘発、あるい は混合される所望の配列に隣接すした位置に、制限酵素認識部位のような１組の 開裂部位の導入の何れかにより、ＣＤＲ配列は混合される。この組内の各開裂部 位は、混合される配列の両端に存在しなければならず、そして１つの部位の開裂 後に生ずる末端は、他の部位に生ずる末端とのライゲーションに非適合性でなけ ればならない。末端の非適合性は、引き続くライゲーションの際に、混合された 配列が適切な配向をすることを保証する。コードする核酸の集合は、制限酵素の ような開裂試薬で開裂され、そして次に、再度ライゲージクンされ、抗体フラグ メント骨格内にＣＤＨのランダムな組み合わせを形成する。この様にして、各ヘ ビーチェーンあるいはライトチェーン内の個々のＣＤＲｓは混合され得る。ある いは、ヘビーチェーンからのＣＤＨの完全な組をライトチェーンからの完全な組 と混合し、元のクローニングされた集合内の構成要素と実質的に異なった結合特 性を、特定の抗体に対して示す抗体を産生じ得る。

本明細書の用語「結合タンパク質」とは、特定の分子に対して結合活性を示すタ ンパク質を指す。この用語は、結合機能が保持されている限り、ポリペプチドの フラグメントをも含むことが理解される。このような結合タンパク質は、単一の 結合ドメインのタンパク質、および複数の結合ドメインのタンパク質を含み得る 。複数の結合ドメインのタン１＜り質は、結合活性全体に協同して寄与する、ポ リペプチドの一次構造に沿った２つあるいはそれ以上の、独立しそして不連続な 領域を含むタンパク質を含む。各々の結合活性は、３つの不連続な相補性決定部 位に由来するので、複数の結合ドメインのタンパク質の特定の具体例は、抗体の ヘビーチェーンおよびライトチェーンを含む。結合タンパク質は、単一モノマー 種（ｍａｎｏｍｅｒｉｃ）あるいは複合モノマー種（＋＊ｕｌｔｉｍｅｒｉｃ） であり得るＯ混合型（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ）結合タンパク質は、複合モノマ ー種（＋ｎｕｌ　ｔ１＋１ｅｒｉｃ）結合タンパク質の１つの例であり、特定の リガンドに対して協同して結合活性を示す、少な（とも２つの異なったサブユニ ットから構成される。混合型（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ）結合タンパク質と呼ぶ 場合、この用語は、ポリペプチドの集合体（ａｓｓｅｍｂｌｙ）および集合した 複合体の結合機能が保持されている限り、サブユニットのフラグメントを含むこ とが理解される。混合型（ｈｅｔｅｒｏｍｅｒｉｃ）結合タンパク質は例えば、 ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２部分、Ｔ細胞レセプター、インテグリン、ホルモン レセプター類および伝達物質レセプターのような、抗体およびそのフラグメント を含む。

本明細書の用語「結合ドメイン」は、そのアミノ酸配列が、与えられたタンパク 質の特定の領域を表し、そしてそれ自身あるいは他のドメインとの組合わせで天 然のタンパク質の結合特性と類似した結合特性を示す、ポリペプチドあるいはポ リヘフチトヲコードする核酸を指す。このドメインの境界は、結合活性が維持さ れる限り、重要ではない。結合ドメインの具体的な例は、ヘビーチェーンあるい はライトチェーンの抗体配列の可変領域内の、相補性決定部位を含む。

本明細書の用語「最適化」は、任意の定量的アッセイシステムで判定した場合に 、実質的に異なる結合特性を有する関連した結合タンパク質を得るための、結合 タンパク質の結合特性の改変を指す。この用語は、アフィニティー、結合活性（ ａｖｉｄｉｔｙ）、あるいは特異性の増大および減少の両方を含む。

最適の結合特性は、結合タンパク質の特定の適応に依存する。

例えば、高アフィニティーの腫瘍抗原結合タンパク質のアフィニティーの減少は 、その結合タンパク質の腫瘍塊への透過を可能にする最適な方法となり得る。逆 に、最適結合特性を得るためには、特定のリガンドに対して低い特異性を示す結 合タンパク質のアフィニティーを増大する必要がある。

本明細書の用語「スプライシング部位」は、第二の核酸との結合に使用し得る、 １つの核酸内の予め定められた領域を指す。以後「挿入的変異誘発」と呼ぶ１本 鎖核酸に特異的な変異誘発、および制限開裂／ライゲーシヨンのような方法を、 ２つの核酸をそのスプライシング部位での接続に使用し得る。相補鎖間のハイブ リダイゼーシヨンを行わせるため一般に、このスプライシング部位は充分に相同 とする。例えば、挿入的変異誘発、および、１本鎖のオーバーハングができる酵 素を用いた制限開裂／ライゲーション法は、２つの相補鎖間のハイブリダイゼー ションが可能なスプライシング部位を用いる。あるいは、２つの核酸内に含まれ るスプライシング部位は、相補鎖間の配列相同性がなくても接続し得る。このよ うなスプライシング部位の例は、平滑な二本鎖末端を作る制限酵素部位である。

本明細書の用語「スプライシング部位の組」は、２つあるいはそれ以上のスプラ イシング部位を指す。最も単純な形態では、この組は１対のスプライシング部位 である；しかじ、組は、核酸セグメントを接続するために使用される任意の奇数 あるいは偶数のスプライシング部位であり得る。３つのスプライシング部位は、 組をっ（る奇数の部位の具体的な例である。

この場合には、スプライシング部位の１つは、他の２つの部位の各々と協同して 、独立あるいは同時に、核酸の接続に使用され得る。近隣したＣＤＲ領域の置換 を、例えば、両方のＣＤＲ領域に隣接した２つの構成要素、およびこの２つのＣ ＤＲ領域間の第三の構成要素を有する１組のスプライシング部位を用いて実施し 得る。

本明細書の用語「開裂部位」は、ホスホジエステル骨格が特異的に開裂され得る 、核酸内の位置を指す。開裂部位は、例えば、Ｂｓｔ　ＸＩ、Ｆｏｋ　Ｉおよび Ｂｇｌ　Ｉの様な制限酵素認識部位であり得る。この定義内には、化学的開裂部 位も含まれる。

本明細書の用語「開裂試薬」は、それにより開裂部位が開裂される手段を指す。

例えば、開裂部位が制限酵素認識部位の場合、開裂試薬は制限酵素である。本明 細書の用語「ライゲーションに非適合コな末端を作る開裂試薬は、非相補性の１ 本鎖を含む末端、あるいは二本鎖核酸の各末端から突き出た非相補性の１本鎖を 含むように改変され得る末端、を製造する試薬である。任意の非均等分割（ｎｏ ｎ−ｉｓｏｓｃｈｉｚｏｍｅｒｉｅ）酵素対、および、核酸内の同じ部位を認識 するが、認識配列の外側のホスホジエステル結合を開裂、あるいは認識部位内の 未確認の配列を開裂する酵素、が使用され得る。このような酵素の例には、Ｂｓ ｔ　ＸＩ、　Ｆｏｋ　ＩおよびＢｇｌ　Ｉが含まれる。

本発明は、結合タンパク質の最適化の方法を提供する。この方法は：（ａ）少な くとも１組のスプライシング部位を有する結合タンパク質をコードする２つある いはそれ以上の核酸を提供する工程、ここで、該スプライシング部位の組が１つ あるいはそれ以上のコードされた結合ドメイン両端に隣接している；（ｂ）該２ つあるいはそれ以上の核酸を混合し、結合タンパク質をコードする混合核酸の親 集合を製造する工程；および、（Ｃ）該２つあるいはそれ以上の核酸の間に、該 スプラシング部位の組を介して該結合ドメインをランダムに組込み、結合タンパ ク質をコードする核酸の別の集団を製造する工程、ここで、少なくとも１つの結 合タンパク質が、該親集合の構成要素と実質的に異なった結合特性により特徴づ けられる：を包含する。

本発明を、現時点で最も好ましい実施態様：　ＦａｂおよびＦｖのような、特定 の抗原に対する抗体フラグメントの結合アフィニティーの最適化に関して記載す る。しかし、原理はすべての結合タンパク質に関°して同じであるので、本明細 書に記載した方法は、本発明の範囲を逸脱することなく、他の抗体以外の結合タ ンパク質の最適化のために使用し得る。抗体フラグメント以外の結合タンパク質 は、例えば、Ｔ細胞レセプター、インテグリン、ホルモンレセプターおよび伝達 物質レセプター、ステロイド様ホルモン、および、ＤＮＡ結合タンパク質を含み 得る。

抗体分子内の抗原結合ドメインは、相補性決定部位（ＣＤＲｓ）として知られて おり、そして、ヘビーチェーンおよびライトチェーンの両方のポリペプチドの可 変領域内に位置する。各可変領域内に３つのＣＤＲ５が存在する（図１、上部） 。これらのドメインは、天然の構造に適切に折り畳まれると、抗原結合相互作用 の大部分を構成する。ＣＤＲは、典型的には約１０から１５アミノ酸残基の長さ であり、そしてポリペプチド骨格の一次構造に沿って不連続に存在する。

ＣＤＲは、抗体と抗原との間の結合相互作用の大部分を構成するので、これらの 配列は、変異、あるいは他の異なるＣＤＲ５と相互交換すると、親分子とは特定 の抗原に対する結合特性が実質的に異なる新しい抗体が生成する。抗原結合タン ノくり質内で、異なるが関連するドメインの相互交換による結合相互作用の最適 化は、一連の機能的に関連のある結合タンノくり質が特定の抗原に対して得られ るので有利である。この様なドメインの翼なる組み合わせは、ランダムな配列の 変化よりも、機能の如何なる制限も無しに、結合特性に生産的な変化をもる結合 ドメイン、および異なる方法で同じ抗原を認識するドメインを、同系のドメイン とランダムに混合し、実質的に異なった結合特性をもたらす新しい組合わせを製 造し得る。混合は、共に混合することにより結合ドメインの順序を変える行為で ある。

機能的に関連するタンパク質内の結合ドメインの混合の例は、関連する抗体のヘ ビーチェーンあるいはライトチェーンの内あるいはその間のＣＤＨの全ての組合 わせのランダムな製造である。この様なランダムな混合は、ＣＤＨの完全な組、 ＣＤＲのサブセットあるいは個々のＣＤＲ５の何れをその方法に使用するかに依 存し、幾つかのレベルで達成し得る。第一に、ヘビーチェーンあるいはライトチ ェーン内のＣＤＲ５の完全な組（ＣＤＲ１から３）は、反対の鎖のＣＤＲ５の完 全な組とランダムに混合され得る。この混合は効果として、異なるヘビーチェー ンと異なるライトチェーンとの対形成により新しい抗体フラグメントを製造する 。第二に、サブセット（例えば、２つのｃＤＲｓ）あるいは個々のＣＤＲは、ラ ンダムに混合して、複数結合ドメインタンパク質内の結合ドメインの分画の置換 による、異なる結合特性を有する類似の抗体が製造される。第三に、ＣＤＲ混合 による異なった結合特性に関して選択された抗体は、選択的変異誘発によりさら に最適化され得る。

ＣＤＨの混合は、種々の方法により達成し得る。例えば、挿入的変異誘発を、２ つあるいはそれ以上の核酸の親集合内で、結合ドメインをランダ、ムに混合する ために使用し得る。その集合内の１つあるいはそれ以上の核酸を、変異誘発のテ ンプレートとして使用し得る。テンプレートは、Ｍ１３由来のベクターの様なベ クターを使用して当業者により製造される１本鎖核酸であり得る。テンプレート 集合とランダムに混合されるドメインは、例えば、テンプレート核酸上の結合ド メイン（単数あるいは複数）に隣接するスプライシング部位に相補的な各末端の スプライシング部位によるポリメレースチェーンリアクション（ＰＣＲ）により 、合成され得る。ＰＣＲ用のテンプレート材料源は、例えば、ｍＲＮＡあるいは ｃＤＮＡｓのクローニングされた集合であり得る。隣接する配列に相補的なスプ ライシング部位は、挿入される配列が適切な方向であることを保証する。あるい は、混合される結合ドメイン、およびそれらの対応するスプライシング部位を生 成するために、化学合成法を使用し得る。

合成された結合ドメインは、もし二本鎖形態である場合は、例えば、熱あるいは アルカリで変性され一本鎖を生成し、テンプレートとアニールされる。相補的配 列によるハイブリダイゼーシコンは、非常に特異的であるので、２つの核酸を予 め決定された部位でともに接続するのに有利である。スプライシング部位がどこ に配置されるかを決定する基準は、開裂部位であるスプライシング部位に関連し て、以下に記載されている。アニールされたスプライシング部位は、二本鎖核酸 を生産するためのプライマー伸長用の基質として使用され得る。アニールされた スプライシング部位が比較的大きくて、安定な二本鎖を維持し得るならば、核酸 のアニールされた集合は、宿主微生物に直接導入され得る。微生物内の生合成機 構は、二本鎖核酸を生産し得る。このような方法で生産された、結合タンパク質 をコードする核酸集合は、結合タンノくり質のペアレント集合内にランダムに組 み込まれた結合ドメインを有し、少なくとも１つのコードされた結合タン）１り 質がペアレント集合のメンバーとは本質的に異なる結合特性により特徴づけられ る核酸の異なる集合を生産する。

ＣＤＨの混合はまた、開裂部位のようなスプライシング部位のセットを、結合タ ンパク質をコードする核酸内の予め決定された位置に導入することにより完成さ れ得る。このことは、図１に図解により示す。図中、開裂部位のセットは、Ａお よびＡｏ、ＢおよびＢｏ、あるいはＣおよびＣｏで示した。開裂部位は、例えば 、制限酵素認識配列であり得る。このような認識配列は、当該分野に公知の方法 により核酸に導入され得る。本明細書に参考文献として援用する、Ｋｕｎｋｌｅ ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、　８２： ４８８−４９２　（１９８５）に記載されている部位特異変異誘発は、その１つ の方法である。開裂部位は、開裂後に２つの端につくられる末端が次の連結に適 していないように選択されるべきである。非適合末端は、そのフラグメントがと もにＣＤＲ配列の混合後に適当な配置になるようにする。例えば、ヘビーチェー ン（ＶＭ）およびライトチェーン（＋／Ｌ）フラグメント（図１、上部）をコー ドするベクターが、開裂試薬Ａで開裂されるときには、生産される末端は、Ａお よびＡｏである。Ａ末端は、Ａ°末端ではなく他のＡ末端に適合する。次の連結 では、Ａのみが他のＡと接続され、同様にＡｏは他のＡｏに接続されて、ｖＨお よびｖＬフラグメントのもとの配置が再構築される。開裂部位の組はまた、予め 選択された位置に唯−認められるように選択されるべきである。ベクター内ある いは結合タンパク質のコーディング領域内の他の位置にコードされる余分な開裂 部位もまた、混合の間に開裂される。これらの望ましくない余分の部位での開裂 は、本質的には混合工程の間に除去される余分なフラグメントを生じる。

制限酵素認識開裂部位から選択されたスプライシング部位および相補的な相同性 を有する配列は、結合親和性の最適化のための使用に有利であるが、しかし、別 の部位もまた使用され得る。例えば、予め決定された位置で特異的に開裂する、 当該分野に公知の化学的開裂法が、使用され得る。しかし、制限酵素認識部位は 、十分に特定されており、それらの開裂試薬である制限酵素は、安価で商業的に 入手可能である。特異的な配列を認識するが認識配列以外の核酸を開裂するか、 あるいは認識部位内の判明していない配列で開裂する数種の制限酵素が存在する 。このメカニズムは、同じ酵素が２つの異なった開裂部位で異なる末端を生産し 得るという更なる利点を提供する。例えば、Ｆｏｋ　Ｉは、配列５’−ＧＧＡＴ Ｇ−３′を認識するが、二本鎖ＤＮＡのホスホジエステル骨格を上および下側の 鎖について、各々９、および下流側の１３塩基に開裂する。従って、末端の開裂 部位の配列は、連結の適合性を決定するが不変認識配列ではない。

結合タンパク質をコードする核酸に導入された開裂部位は、混合されるべき結合 ドメインの反対側の末端に隣接するように配置されるべきである。この部位はま た、結合タンパク質、発現配列あるいはベクター配列のいずれかの機能に必要と されない位置に配置されるべきである。開裂部位が、必要不可欠なコーディング 領域内に配置されるときには、その部位は、アミノ酸残基の保存されるべき置換 のみがなされるように選択されなければならない。相補的相同配列を用いるスプ ライシング部位は、その配列がハイブリダイズできるようにするために、集合の 全ての構成要素に十分に相同であるように選択されるべきである。ｖＨＣＤＲの 全組のｖＬｃＤＲとの混合では、開裂部位は、各鎖に対して３つすべてのＣＤＨ の外側に位置するべきである。図１の上部に、開裂部位ＡおよびＡｏの対が、ｖ ＨおよびｖＬ配列の近傍に位置する配置を示す。Ａ開裂部位は、Ｖ。

ＣＤＲ３（ＨＣＤＲｌ）とＶＬ　ＣＤ［！　１（ＬＣＤＲＩ）との間に位置する 。Ａ°開裂部位は、ＨＣＤＲＩとＬＣＤ１ｌＩ３との間でベクターのもう一方の 部位に位置する。開裂部位の組の厳密な配置は、混合されるべきドメインの構成 に依って変化し得る。開裂部位の組をどこに導入するか、あるいは結合ドメイン に隣接させ、混合し得るために適切な相補配列を決定することは当業者は知り得 る。

ｖ８およびｖＬ抗体鎖をコードする２つ以上の核酸は、混合され、混合されるべ き全ドメインをコードするランダム集合を生産し得る。スプライシング部位とし て開裂部位を用いるＶ。ＣＤＲのｖＬＣＤＲとの混合は１．開裂試薬Ａ（図ＩＡ ）による核酸の混合集合の開裂、次いでＶＨＣＤＲとｖＬＣＤＲとのランダム組 み合わせを再形成するように混合物を連結して実施する。親分子と比較して異な る結合親和性を示す抗体は、当該分野に公知の方法により、原核発現系あるいは 真核発現系で、コードする核酸の新しい集合を発現することにより選択され得る 。

結合タンパク質をフードする核酸は、当該分野に公知の種々の任意のベクター中 にクローニングされ得る。あるいは、その核酸は、最初に、本明細書に記載の最 適化法、および結合タンパク質を構成するポリペプチドの発現の両方を可能にす るベクター中にクローニングされ得る（図１、上部）。複数の結合タンパク質の ために、２つ以上の核酸配列の同時発現が、一般的に起こり、個別のポリペプチ ドを生成する。個別のポリペプチドは、翻訳後あるいは翻訳と同時に自己会合（ ｓｅｌｆ−ａｓｓｅ＊＋ｂｌｅ）　して機能性分子を形成する。同時発現はまた 、例えば共に結合し、依然複数の結合タンパク質に会合する可能性のある１本鎖 としてのサブユニットポリペプチドを発現することにより完成され得る。結合し たポリペプチドの同時発現の具体的な例は、ヘビーおよびライトチェーン抗体フ ラグメントポリペプチドの、フレキシブルなポリペプチドあるいは２つのサブユ ニットを接続して１本鎖にするポリペプチドリンカ−との発現である。このリン カ−は、ヘビーおよびライトチェーン部分を結合させて機能性Ｆａｂフラグメン トにするのに十分フレキシブルである。このことは本明細書に参考文献として援 用する米国特許第４．９４６．７７８号に開示されている。

同時発現に使用され得るベクターは公知であるか、または当業者により構築され 得る。同様に、モノマー結合タンパク質の発現に使用され得るベクターも公知で あるか、あるいは当業者により構築され得る。このようなベクターは、転写、翻 訳、調節およびポリペプチドの選別に必要な全発現要素を含むべきである。この ポリペプチドはタンパク質を作る。このようなベクターはまた、異なる形態での 回収のためのメカニズムを含み得る。ファージミド（Ｐｈａｇｅｍｉｄｓ）は、 この特別な例である。なぜならそれらはプラスミドあるいはファージベクターの いずれかとして使用され得るからである。ベクターは、原核あるいは真核宿主系 のいずれにおいても、発現要素が複製起点に適切であるかぎり、使用され得る。

どの宿主系が特定のベクターに適しているかは、当業者は知り得る。従って、本 発明は、ベクター、ベクターにより形質転換された宿主細胞、および宿主細胞か ら産生された結合タンパク質を提供する。これらの宿主細胞は上記の最適化の方 法により生産された結合タンパク質をコードする核酸を含む。

個別のＣＤＲあるいはＣＤＨのサブセットの混合のために、ＣＤＲの全組の混合 のための上記方法と同じ方法が使用され得る。例えば、ＣＤＲ１は、ｖ、４およ びｖＬの両方のＣＤＲ１と２との間のスプライシング部位を使用して、ｖ）Ｉお よびＶＬの両方のＣＤＲ２および３とランダムに混合され得る。導入された２つ のスプライシング部位は、混合過程に使用され得る部位の組を構成する。その部 位の組は、図ＩＢに部位ＢおよびＢｏとして示す。従って、ＨｃＤＲｌとＬＣＤ Ｒ２との間にある結合ドメインは混合されるべきドメインであるので、スプライ シング部位の組は％　ＨＣＤＲｌとり。ＤＲ２とに隣接する。ＣＤＲ１とＣＤＲ ２との間にスプライシング部位を有する核酸は、例えば、混合されてランダム集 合を生成し得る。スプライシング部位間の配列は、例えば、挿入変異誘発あるい は制限開裂／連結により、ランダムに集合中に組み込まれる。挿入変異誘発には 、核酸の集合は、最初に、選択されたテンプレート分子とアニールされるべきで ある。制限開裂／連結には、位置ＢおよびＢｏでの核酸の最初の開裂で、混合さ れるべき結合ドメイン（ＨＣＤＲＩ、ＨＣＤＲ２、ＬＣｆｌＲｉ：図ＩＢ）が放 出される。混合され開裂された集合の、続く連結は、ｖＨ鎖およびＶ、鎖の両方 に対する、ＣＤＲＬとＣＤＲ２あるいは３とのランダム組み合わせを共にもたら す。結合ドメインの新規組み合わせは、上記の結合親和性の生産的変化について 、発現によりスクリーニングされ得る。このようなスクリーニングの方法には、 例えば、ＥＬＩＳＡ、イムノプロット、パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）、プラーク リフト（ｐｌａｑｕｅｌｉｆｔ）、平衡透析、および競合アッセイが含まれる。

これらの方法は、当業者には公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｖら、Ａｎｔｉｂ ｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉ ｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　（１９８ｇ）に記載されている。これは、本明細書に参考文献として 援用する。

ＣＤＲ１以外の結合ドメインもまた混合され得る。例えば、ＣＤＲ３は、本明細 書に記載の方法によりＣＤＲ１および２と混合され得る。■、４および・ｖＬ両 両列列中ＣＤＲ２と３との間のスプライシング部位を使用して、これらの部位の 間の結合ドメインは、混合され得る（図ＩＣ）。関連機能を有する結合タンノ（ り質をコードする核酸の集合は、混合され、開裂試薬Ｃで処理され、そして次に 再連結されて結合ドメインのランダム組み合わせを生産する。あるいは、テンプ レートおよびＣに位置するスプライシング部位を有する合成結合ドメインは、挿 入変異誘発による結合ドメインのランダム組み込みで混合され得る。同様に、Ｃ ＤＲ２は、ＣＤＲｌおよび３とランダムに混合され得る。例えば、３つのメンバ ーを有するスプライシング部位の組が使用され得、これは、挿入変異誘発により 有効に行われる。２つのスプライシング部位は、ヘビーおよびライトチェーン両 配列上のＣＤＲ２の範囲外に位置し得る。第三のスプライシング部位は、ＣＤＨ 間、例えば、ＨＣＤＲ３とＬＣＤＦＩＩとの範囲の配列内に位置し得る。同様に 、近隣のＣＤＲは、外部に位置するスプライシング部位、およびそれらの間に位 置する共通の部位を有することにより混合され得る。スプライシング部位を有す る核酸の、上記の構成体とのアニーリングは、例えば、集合内のＨＣＤＲ２およ びＬＣＤＲ□のランダム組み込みをもたらす。さらに、ＤＮＡの複製前にＤＮＡ の修復機能の発生を実証するＤＨＩＯＢ（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌ。

ｇｉｅｓ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　ＭＤ）のようないくつかの細菌株が存在する 。

これらの菌株では、合成核酸およびテンプレート核酸に対応する配列がほぼ等し い頻度で得られる。従って、多くの異なるテンプレートが多くの異なる合成核酸 とともに使用され、互いに独立した、すべての可能な順列を得る。

混合されていない親分子に比較して最適化された結合特性を示す選択された結合 タンパク質は、選択変異誘発によりさらに最適化され得る。関連結合ドメインの 混合後に得られた組み合わせは、異なる抗原結合特性による有益な特性を有する 結合タンパク質を提供し得るが、選択されたそれらの分子は、最適な抗原結合性 に要求される最善の配列を必ずしもコードし得ない。選択された配列は、開始親 分子から得られ得る、単なる最適配列である。ランダムアミノ酸変化を組み込む 選択変異誘発、あるいは既知配列に基づくアミノ酸変化の所望の偏向は、より有 益な結合特性を与える生産的変化をさらに提供し得る。

変異誘発は、当該分野では標準的な方法により実施され得る。その方法ではコー ドする核酸内の予め決定された位置でドを使用する。あるいは、変異誘発に使用 されたオリゴヌクレオチドは、種々のアミノ酸コドンを生産する方法により合成 され得るが、予め決定された配列に偏向する。そしてこの予め決定された配列は 、最適化された結合タン／ｆり質内の結合ドメインの１つか、あるいはすべてで る。相当な数のアミノ酸コドンの位置が特異的配列であるべきときには、この合 成方法は、変異体オリゴヌクレオチドを作成するための使用に有利である。この 方法は、米国特許出願番号第０７７５７３．６４８号に詳細に開示されていて、 これは本明細書に参考文献として援用する。簡単には、この方法は、２つの反応 カラムを用ｔまたオリゴヌクレオチド合成を伴う。第一のカラムでＧよ、特異的 コドンのヌクレオチド配列は、連続的に合成される。第二のカラムでは、縮重コ ドンが、コドンの第一および第二のモノマーの位置で、４種のすべてのヌクレオ チドの混合物を力、ノブリングすることにより合成される。コドンは、第三モノ マーの位置で、グアニンとチミン、あるいはシトシンとアデニンのヌクレオチド のいずれかの混合物を力・ノブリングすることにより完成される。２つのカラム の反応生成物の混合により、予め決定された配列と、所望の位置でのランダム配 列との両方を含むオリゴヌクレオチドの集合が得られる。合成は、予め決定され た付加される配列をカップリングするために、この混合物を使用して進行される か、あるいは、付加されるランダム配列の合成のために２つのカラムにさらに分 けることにより進行され得る。このような変異体オリゴヌクレオチドの使用によ り、変化は結合ドメイン中でなされ得て、得られた結合タンパク質を、上記のよ うに、標準的な組換え発現法を使用して、最適化された結合特性のために選択し 得る。

以下の実施例は、例を示すことを意図し、本発明を限定することは意図していな い。

Ｌ立丘ユ ム　のためのＣＤＨの、　・な４ この実施例は、ｖＨおよびＶＬＣＤＲの継続的な混合操作によるＦａｂ結合親和 性の最適化、および前の操作で得られたＦａｂフラグメントよりヒトβ−エンド ルフィンに対して高親和性を示す分子の選択を示す。

ＣＲ′　Ａ　の　。　の　み゛　み 組換え細胞表面発現ライブラリーから選択され、ヒトβ−エンドルフィンペプチ ドに対して親和性を有するＦａｂフラグメントを、最適化のプロトコル用に使用 した。米国特許出願番号第０７１５９０．２１９号に詳細に記載されており、本 明細書に参考文献として援用するこの系では、ヘビーおよびライトチェーン配列 を、Ｌａｃプロモーター／オペレーターの転写制御のもとに、ジシストロン性（ ｄｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）オペロン由来のフィラメント状のバクテリオファージ Ｍ１３の表面上で同時発現する。その他に述べられていなければ、ファージ培養 、ベクター単離、ＤＮＡ制限開裂、連結および形質転換などのような決まった操 作のために行われたすべての組換え法は、当業者には公知の標準的な方法であっ た。このような方法は、５ａｎＢｒｏｏｋら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ 　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂ ｏｒ、　１９８９、およびＡｕ５ｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏ ｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　 ａｎｄＳｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８９に認められる。この両方は、 本明細書に参考文献として援用する。

ＣＤＨの混合のために使用される制限部位を得るために、図１に図示した制限パ ターンを与えるのに必要なところで、変異誘発を行った。ｒＡＪおよび「Ａｏ」 制限部位は、Ｂｓｔ　ＸＩに対応し、ｒＢＪおよび「Ｂｏ」は、Ｄｒａ　Ｉｌｌ に対応し、モしてｒｃＪおよび「Ｃｏ」は、Ｆｏｋ　Ｉに対応する。図１中のＡ ＳＡ’およびＢｏに対応する３つの部位のみが、変異誘発による組み込みに必要 であった。なぜなら、残りの部位は、天然に、はとんどのヘビーおよびライトチ ェーン配列中に認められるからである。

しかし、Ｄｒａ　ＩｌｌおよびＦｏｋ　１部位は、変異体オリゴヌクレオチド５ −ＣＧＡＴＧＧＣＣＣＴＣＴＡＣＧＡＧＡＡＣＣＡＴＣ−３°および５°−ＡＴ ＡＡＴＡＴＣＣＣＡＡＣＣＴＡＡＴＴＴＡＣ−３°を用いて、ベクターから除去 した。変異誘発を、本明細書に参考文献として援用するＫｕｎｋｅｌら、Ｍｅｔ ｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５４：３６７−３８２　（１９８７）の方法で実施 する。試薬、細菌株およびプロトコルを、ＢｉＯＲｉｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ ｓ　ｆｉｔ　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ。

Ｒｉｃｈ＋＊ｏｎｄ、　ＣＡ）から得、変異誘発を製造業者の推奨通りに実施す る。簡単には、ＣＪ２３６の一夜培養物（１ｍｌ）を、５０　ｕｌの５ＯＢ−Ｃ ＡＰに接種し、ｏｌ）ｅｓｅ　”　０．３まで増殖する。変異誘発されるべきテ ンプレートを含むファージを、１　：　１００に希釈し、１０μｌを培養物に加 えた。インキニベーシ璽ンを３７℃でさらに４時間続ける。培養物を、４℃で１ ２．０００　ｒｐ＋＊で１５分間、２回遠心分離する。上清を新しいチェーンに 移す。ＲＮａｓｅ　Ａを加えて（１０ｍｇ／＋＊ｌの１５μｌ）、次に３．５　 Ｍ　ＮＨａＯＡｃ中の２０％ＰＥＧ　１１０００を７．５ｍｌ加える。懸濁液を 水中で３０分間インキュベートし、上記のように１回遠心分離する。ペレットを ２００μｌの高塩緩衝液（３００ｍＭ　ＮａＣ１，１００ｍＭ　）リス、ｐＨ８ ，０，１ａ＋Ｍ　ＥＤＴＡ）中に再懸濁し、ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ”（Ｓｔｒａｔａ ｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）およびＣＪ２３６の両方で濾過する。

ＣＪ２３６フアージのストックを、等容量のフェノール／クロロホルム／イソア ミルアルコール（１：　１　：　１／４８）で抽出し、その後ｄｔ１２Ｑにより 逆抽出する。これらのウラシル含有核酸をエタノールで沈澱させ、洗浄し、２０ μｌのｄＨ２０に再懸濁させ、そして定量する。ウラシル含有テンプレート（２ ３３μｇ）を、２０　ｎｇ（１μｌ中）のリン酸化された変異体オリゴヌクレオ チド、および１μｌの１０　Ｘアニーリング緩衝液（Ｚｏｏ　ｍＭヒトス、ｐＨ ７，４，２０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．５００　ｉ＋Ｍ　ＮａＣ１）と混合して最終容 量をｌＯμｌにし、７０℃に加熱し、徐々に室温に冷却する。反応物を水中に置 き、１μｍのｌＯｘ合成緩衝液（４ｍＭ　各ｄＮＴＰ。

？、５　ｍＭ　ＡＴＰ、　１７５１Ｍ　トリス、ｐＨ７，４，３７，５ｍＭ　Ｍ ｇＣｂ、２１５ｍＭ　ＤＴＴ）、１ｕ１のＴ４　ＤＮＡリガーゼ（３−５−Ｌ　 ＝　ット）、およびｌμｌのＴ４　Ｄｎａポリメラーゼ加える。反応物を５分間 、水中でインキユベートし、その後、３７°Ｃで９０分間インキュベートする。

反応を、９０μｌの停止緩衝液（１０ｍＭ　トリス、Ｉ）Ｈ８，０１１０ｍＭＥ ＤＴＡ）を加えて停止し、ＸＬＩ−Ｂｌｕｅ”細胞中に形質転換する。

変異体オリゴヌクレオチド配列を表Ｉに示す。ここで、下線をつけた部分は組み 込まれた制限酵素部位を示す。このオリゴヌクレオチドは、Ｖｈｓ　Ｖ（あるい はベクター配列の非コーディング鎖に対応する。すべての変異を、制限酵素消化 および配列分析により確認する。配列決定は、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｅａｄ、　Ｓｅｔ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、　７４：５４６３−５４６７　 （１９７７）の方法により、５ｅｑｕｅｎａｓｅＲバージヨン２．０のＤＮＡシ ークエンシングキットを製造業者の推奨通りに使用して実施する。

（以下余白） に　い゛れるオリゴヌクレオチド レオチド　監虹１皿監　配刀ユＳ’　Ｔｈ坦［」−ＣＩ　Ｆｏｋ　工　５雷−Ａ ＴＡＡＡＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴＣＡＧＣ−３１ ＣＤＲＡによる　Ａ　の Ｆａｂ結合親和性を最適化するために、ＣＤＲ混合の３回連続操作を行う。混合 操作のどの回も結合の数を拡張し、それは新規に生成した抗体を異なるＣＤＨの それら自身および初期の選択されたＦａｂフラグメントのセットと組み合わせて 用いることにより試験され得る。

最初の結合のセット、ヘビーチェーンＣＤＲ類を、ヒトβ−エンドルフィンに対 する抗原結合親和性を示す抗体が異なるライトチェーンＣＤＲ類と混合した。こ の混合により、異なるヘビーチェーン抗原結合配列を異なる相浦的ライトチェー ン抗原結合配列を用いて有効に試験する。

ＣＤＲ１［のヘビーおよびライトチェーンを混合するためニ、上記の抗体配列を コードする変異ベクターをＢｉｔ　ＸＩで消化した。

それぞれのベクターの等量を結合して、最終的に５から１０ｇｇの間の総ＤＮＡ を産生ずる。消化の完了をアガノース（ａｇａｎｏＨ）ゲル電気泳動により確認 した。等量のフェノール／クロロボルムで１回、クロロホルムで１回抽出し、次 にエタノールで沈澱することにより反応を停止する。ベレットを７０％エタノー ルで洗浄し、減圧乾燥して８．５μｍの蒸留水または脱イオン水（ｄＨ２０）に 再懸濁する。１μｌの１０×リガーゼ緩衝液（５０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ％ｐＨ ７，８，１０１Ｍ　ＭｇＣｌ２．２０　ｍＭ　ＤＴＴ、　１ｍＭ　ＡＴＰ、　５ ０ｐ　ｇ／ｍｌ　ＢＳＡ）を加え、次１ｃ０．５　μｍ（７）Ｔ４　ＤＮＡ　’ Ｊガーゼ（２Ｕ／μｍ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ、　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）を加える。適合する宿主株 中にエレクトロポレーシ薗ンする前に、連結物を１６℃で一夜または室温で２時 間インキュベートする。

本明細書で参考文献として援用する、Ｓｍｉ　ｔｈら、Ｆｏｃｕｓ　１２：３８ −４０　（１９９０）に記載されたようにして、Ｅ、　ｃｏｌｔ　ＭＫ３Ｇ−３ をエレクトロポレーシヨンする。ＭＫ３０−３の新鮮なコロニーをマグネシウム を含まない５　ｍｌのＳＯＢ（２０ｇのバクトートリプトン、５ｇのバクトーイ ーストエクストラクト、０．５８４　ｇのＮａＣ１，０，１８６ｇのＫＣＩをｄ Ｈ２０で１．０００■１にする）内に接種して細胞を調製し、３７℃で一夜激し く曝気して増殖させる。マグネシウムを含まなイ５ＯＢ（５００ｍｌ）　ｉｉ： 、−夜培養物を１　：　１０００ノ比率で接種し、３７℃で激しく曝気してｏＩ ）ｓｓａが０．８になるまで（約２から３時間）増殖させる。Ｇ５３０−ター（ Ｓｏｒｖａｌｌ、　Ｎｅｗｔｏｖｎ、　ＣＴ）内で４℃で１０分間、５．０００ 　ｒｐ＋＊（２，６００Ｘ　ｇ）で遠心分離して細胞を回収し、５００　ｍｌの 水冷１０％（体積比）滅菌グリセロール中に再懸濁し、再び同じ方法で遠心分離 および再懸濁する。３回目の遠心分離の後、細胞を１０％滅菌グリセロール中に 再懸濁して最終容量を約２ｍｌとして、懸濁液のＯＤ、、。が２００から３００ になるようにする。普通、上清を流し出した後、容器に残った１０％グリセロー ルに再懸濁する。細胞はマイクロセントリフスージ管に４０μＩずつのアリコー トとしてドライアイス−エタノール浴を用いて凍結し一７０℃で凍結保存する。

使用前に凍結細胞を水上で徐々に解凍し、細胞懸濁液４０μｌにつき約ｔｏ　ｐ ｇから５００　ｎｇのベクターと混合してエレクトロポレーシ璽ンする。１つの ４０　μｍアリコートを０．１ｃｍのエレクトロポレーションチャンバ−（Ｂｉ ｏ−Ｒａｄ、　Ｒｉｃｔｏ＊ａｎｄ、　ＣＡ）に入れ、パルス長（τ）″４　ｍ ｓを与える４にΩの並列抵抗２５μＦ、１．８８ＫＶを用いて０℃で１回パルス をかける。パルスをかけた細胞の１０μｌアリコートを１２−　Ｘ　７５−　ｍ ｕの培養管に入れて、ｌ　ｍｌの５ＯＣ（９８ｍＩ　ＳＯＨに１　＋ａｌの２Ｍ 　ＭｇＣｌ２および１　ｍｌの２Ｍグルコースを加える）で希釈し、選択培地中 での培養に先立ち３７℃で１時間、培養液を振盪する。簡単には、上記１■１の ライブラリー培養液を２ＸＹＴ培地（１６ｇトリプトン、１０ｇイーストエクス トラクト、Ｓｇ　ＮａＣ１）中で５０倍希釈し、３７℃で５−８時間培養して増 殖する。細菌は１０，０００　Ｘ　ｇで遠心分離することによりペレット化する 。ファージを含む上清を滅菌管に移し、４℃で保存する。

表面の膜上に新しく生成されたＦａｂフラグメントを発現スル精製ファージを、 ＸＬＩ　Ｂｌｕｅ”″細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃ Ａ）の５０　ｍｌの液体培養液から調製する。その細胞は４℃で保存したファー ジストックを１０組ｏ、ｉ、で感染させたものである。

培養液を２ｍ１ＭのＩ　ＰＴＧで誘導する。上清を２回遠心分離して透明にし、 １７７、５容量のＰＥＧ溶液（２５％ＰＥＧ−８０００，２，５Ｍ　ＮａＣ１） を加えてファージを沈澱させ、次に４°Ｃで一夜インキュベートする。

沈澱物を１０，０００　Ｘ　ｇで９０分間遠心分離することにより回収する。フ ァージペレットを０．（１１Ｍトリス−ＨＣｌ５ｐＨ７，６，１，ＯｍＭ　ＥＤ ＴＡおよび０．１％サルコシルからなる２５　ｍｌの溶液に再懸濁し、次に室温 で３０分間ゆるやかに振盪する。溶液を０．５　Ｍ　ＮａＣ１に調整し、最終的 には５％ポリエチレングリコール濃度になるようにする。４℃で２時間放置後、 ファージを含む沈澱物を１５．０００Ｘｇで１時間遠心分離することにより回収 する。沈澱物を１０ｍ１のＮＥＴ！ｌ衝液（０，１Ｍ　ＮａＣ１，１，０＋ａＭ 　ＥＤＴＡ、および０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ７，６）中に再懸濁し、 よ（混合し、そしてファージは１７０，０００　Ｘ　ｇで３時間遠心分離するこ とにより再びペレット化する。ファージペレットを２　ｍｌのＮＥＴ緩衝液に一 夜再懸濁し、１１０，０００　Ｘ　ｇで１８時間の塩化セシウム遠心分１！！（ １０ｍｌの緩衝液中に３．８６ｇの塩化セシウム）にかける。ファージのバンド を集め、ＮＥＴ緩衝液で７倍に希釈し、再び１７０．０００　Ｘ　ｇで３時間遠 心分離し、再懸濁し、０．１ｍＭのアジ化ナトリウム含有の０．３　ｍｌのＮＥ Ｔ緩衝液中で４℃で保存する。

結合親和性は、表面発現ファージをヒトβ−エンドルフィンで被覆したプレート 上にパニングすることにより評価する。

β−エンドルフィンをストレプトアビジン被覆プレートに結合し、次にビオチン 化し、そしてウラシル存在下でＲＺ１０３２のようなＳｕｐ　Ｅ　ＬＬＩ−０１ −株中で増殖したファージを吸収する。

このように増殖したファージは、阻害後に残存するファージはすべて通常の増殖 条件では生存せず、従ってパニングを妨害しないことを保証する。その代わりに 、標識した抗原を用いる標準逆免疫スクリーニング法もまた、用い得る。ビオチ ン化試薬をジメチルホルムアミドに、１墓ｌの溶媒に対して固体のＮＨＳ−ＳＳ −ビオチン（スルホスクシンイミジル２−（ビオチンアミド）エチル−１，３° −ジチオプロピオネート；　Ｐｉｅｒｃｅ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　ＩＬ）が２ ．４ｍｇの割合で溶解し、そして製造者が指示する通りに使用する。小規模の反 応を、溶解した試薬１μｌを滅菌した重炭酸塩緩衝液（０，１Ｍ　ＮａＨＣＯ３ ，ｐＨ８，６）で１　ｍｇ／ｍｌに希釈したβ−エンドルフィンの４３μｌと混 合して行う。２５℃で２時間放置後、残ったビオチン化試薬を５００μｌの１Ｍ エタノールアミン（ＨＣＩでｐＨ９に調整）とさらに２時間反応させる。試料全 体をＩ　Ｂ／ｍｌのＢＳＡを含む１ｍｌのＴＢＳで希釈し、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ 　３０ウルトラ−フィルター（Ａｍｆｃｏｎ）で約５０μｌまで濃縮し、同じフ ィルターを、２　＋ｅｌのＴＢＳで３回および０．０２％ＮａＮ３および７×１ ０１２のＵＶ−不活化阻害ファージ（以下を参照）を含む１　ｍｌのＴＢＳで１ 回洗浄し、最終的な濃縮液（６０−８０μｌ）を４℃で保存する。

ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン試薬でビオチン化したβ−エンドルフィンはジスルフィ ド含有チェーンを介してビオチンと結合している。

パニングは、ポリスチレンベトリブレート（６０Ｘ　１５■ｌ）に、０．Ｉ　Ｍ 　ＮａＨＣＯ３ｐＨ８，６−０，０２％ＮａＮ３に１　ｍｇ／ｍｌのストレプト アビジン（ＢＲＬ）を含む溶液１璽ｌを入れ、コールドルーム内の小すな気密プ ラスチック箱中で一夜インキュベートして行う。次の日ストレプトアビジンを除 去し、少なくとも１０　ｍｌの阻害液（２９Ｂ／ｍｌのＢＳＡ：　３　ｕ　ｇ／ ｍｌのストレプトアビジン；　０．Ｉ　Ｍ　Ｎａ■ｃｏ３ｐＨ８，６−０，０２ ％Ｎａｐｓ）に置き換え、そして室温で少なくとも１時間インキュベートする。

阻害液を除去し、０．５％ツイーン２０を含むトリス緩衝液添加生理食塩水（Ｔ ＢＳ−０，５％ツイーン２０）でプレートをすばやく３回洗浄する。

β−エンドルフィンに結合し、抗体フラグメントを発現するファージを、ライブ ラリーの５０μｍ量と反応した阻害されたビオチン化β−エンドルフィン（２， ７Ｍｇβ−エンドルフィン）の５μｌを用いて選択する。各混合液を４℃で一夜 インキュベートし、１　＋ｌｌのＴＢＳ−０，５％ツイーン２０で希釈し、上記 のように調製したストレプトアビジン被覆ベトリブレートに移す。

室温で１０分間振盪した後、未結合ファージを除去し、プレートをＴＢＳ−０， ５％ツイーン２０で３０−９０分かけて１０回洗浄する。結合したファージを、 ８００μｌの滅菌した溶出緩衝液（１ｍｇ／ｍ１ＢＳＡ、０．１　Ｍ　ＭＣＩ、 　グリセロールでｐＨ２，２に調整）を用いてプレートから１５分間溶出させ、 溶出液は４８μｌの２Ｍ）リス（ｐＨ未調整）で中和する。各溶出液の２０μｌ 量を、投入するファージの希釈液により、ＭＫ３０−３濃縮細胞で力価を測定す る。

２回目のパニングは、ライブラリーからの最初の溶出液７５０μｍを５　ｙｓＭ のＤＴＴで１ｏ分間処理して、残ったビオチン化結合タンパクをビオチン基に結 合させているジスルフィド結合を切断することにより行われる。処理した溶出液 はｃｅｎｔｒｔｃｏｎ　３０ウルトラフイルター（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し、Ｔ ＢＳ−０，５％ツイーン２゜で３回洗浄し、濃縮して最終容量を約５０μｌにす る。最終的な濃縮液を５．０μｌ（２，７Ｍｇβ−エンドルフィン）の阻害され たビオチン化β−エンドルフィンを含むチューブに移し、−夜インキュベートす る。溶液を１ｍｌのＴＢＳ−０，５％ツイーン２ｏで希釈し、パンし、新たに調 製したストレプトアビジン被覆ベトリブレートで上記のように溶出する。２回目 の溶出液全体（８００μｌ）を４８μｌの２Ｍ　トリスで中和し、その２０μｌ を１回目の溶出液および投入ファージの希釈液で、同時に力価を測定する。必要 ならば、均質のファージ集合が得られるまで更にパニングを行い得る。さらに、 検出用の試薬類が入手可能であればファージをプラーク精製し得る。

パニングによって選択されたファージは、配列をコードしたＦａｂのＤＮＡ配列 決定によって特徴づけられる。配列決定に用いるテンプレートは、精製した集合 から得られた個々のプラークを有するＸＬＩの一夜培養物の１　：　１００希釈 液を含む１　ｍｌの２ＸＹＴの培養液を接種して調製する。プラークは、滅菌し たつまようじで採取する。３７℃で５−６時間振盪してインキュベートした後、 １．５■ｌのマイクロフユージチューブに移す。２００μｍのＰＥＧ溶液を加え 、次にポルテックス攪拌し、氷上に１０分間静置する。マイクロフユージで１２ ．ｏｏｏ　ｘ　ｇで５分間遠心分離してファージ沈澱物を回収する。上清を捨て 、ペレットを２３０　μ１（７）ＴＥ（１０ｍＭ　）リス−ＨＣｌ５ｐＨ７，５ 、ｌ　ｍＭ　ＥＤＴＡ）中に黄色ピペットチップで静かにピペッティングして再 懸濁する。フェノール（２００μｌ）を加え、次に短かくポルテックス攪拌し、 マイクロフユージで相分離する。水相を別のチューブに移して、上記のフェノー ル抽出のように、２００μｌのフェノール／クロロホルム（１：１）で、抽出す る。３　Ｍ　Ｎａ０Ａｃの０．１容量を加え、次に２．５容量のエタノールを加 えて一２０℃で２０分間沈澱させる。

沈澱したテンプレートは、マイクロフニージで１２．Ｇｏｏ　Ｘ　ｇ’ｔ’８分 間遠心分離して回収する。ペレットは７０％エタノールで洗浄し、乾燥後２５μ ｌのＴＨに再懸濁する。配列決定は、５ｅｑｕｅｎａｓｅ”配列決定キットを製 造者（Ｕ、Ｓ、　Ｂｉｏｅｈｅｍｉｃａｌ、　Ｃ１ｅｖｅｌａｎｄ、　ＯＨ）が 提供するプロトコールに従って行う。

２回目のＣＤＲ混合は、選択された抗原結合フラグメントのヘビーおよびライト チェーン集合の中でランダムに結合した異なるＣＤＨの組合せを必要とする。Ｃ ＤＲ２および３配列を興なるＣＤＲ１配列を有するヘビーおよびライトチェーン 集合の中で混合した。ヘビーおよびライトチェーン双方の組合せから、および１ 回目に選択された抗体から得られた抗体を、これらの最適化操作に用いた。

最適化の第１回目の操作がすでに行われたが、選択されたＦａｂ配列を含むベク ターはまだ変異誘発によって組み込まれた制限酵素部位をコードする。従って、 それぞれのベクターの等量を組み合わせて（全量５−１０μｇ）、Ｆｏｋ　Ｉを 用いて完全に消化させる。連結反応の次の段階、エレクトロポレーションおよび スクリーニングを上記のように行う。

３回目のＣＤＲ混合は、翼なるＣＤＲ３配列を有するヘビーおよびライトチェー ン集合の中でランダムに結合したＣＤＲ１および２を必要とする。これ以前に得 られたヒトβ−エンドルフィンに対する結合親和性について選択された抗体のす べてを等量ずつ混合し、前記のようにＢｇｌ　Ｉにより消化した。同様に、連結 反応およびスクリーニングも、上記のように行った。結合親和性の定量は、標識 したβ−エンドルフィンに対する平衡透析および５ｃｈａｔａｎｄプロット分析 によって行う。

本発明は現時点で好ましい実施態様を参考として記載したが、当業者によって種 々の修正が本発明から外れることな（行われ得ることが理解されるべきである。

従って、本発明は以下のクレームによってのみ限定される。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）（至） 平成５年６月２１日

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．（ａ）少なくとも１組のスプライシング部位を有する結合タンパク質をコー ドする２つまたはそれ以上の核酸を提供する工程、 ここで、該スプライシング部位の組が、１つまたはそれ以上のコードされた結合 ドメインの両端に隣接している；（ｂ）該２つまたはそれ以上の核酸を混合し、 結合タンパク質をコードする混合核酸の親集合を製造する工程；および（ｃ）該 ２つまたはそれ以上の核酸の間に、該スプライシング部位の組を介して該結合ド メインをランダムに組込み、結合タンパク質をコードする核酸の別の集合を製造 する工程、ここで、少なくとも１つの結合タンパク質は該親集合の構成要素と実 質的に異なった結合特性によって特徴付けられる；を包含する、コードされた結 合タンパク質の結合特性を最適化するための、核酸操作方法。
2. ２．前記工程（ａ）がさらに、結合タンパク質をコードする少なくとも１つの核 酸を、酵素的重合により合成することを包含する、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記酵素的重合が、ポリメラーゼチェーンリアクションである、請求項２に 記載の方法。
4. ４．前記工程（ａ）がさらに、結合タンパク質をコードする少なくとも１つの核 酸の化学合成を包含する、請求項１に記載の方法。
5. ５．前記工程（ｃ）がさらに、 （ｃ１）前記混合核酸の親集合の前記スプライシング部位に、少なくとも１組の 開裂部位を導入する工程；（ｃ２）該開裂部位を、開裂試薬で切断し、ライゲー ションに適合しない末端を各スプライシング部位に製造し、そして、結合タンパ ク質をコードする前記核酸から前記１つまたはそれ以上のコードされた結合ドメ インを切り出す工程；および（ｃ３）該切り放された結合ドメインを、結合タン パク質をコードする該核酸に連結する工程； を包含する、請求項１に記載の方法。
6. ６．前記工程（ｃ）がさらに、前記２つまたはそれ以上の核酸の間に存在する前 記スプライシング部位の一本領領域をアニーリングすることを包含する、 ここで、該スプライシング部位は、特異的なハイブリダイゼイションを行うのに 十分なヌクレオチド配列の同一性を相補鎖の間に有する、 請求項２に記載の方法。
7. ７．前記２つまたはそれ以上の核酸が、一本鎖である、請求項６に記載の方法。
8. ８．前記工程（ｃ）がさらに、前記２つまたはそれ以上の核酸の間に存在する前 記スプライシング部位の一本鎖領域をアニーリングすることを包含する、 ここで、該スプライシング部位は、特異的なハイブリダイゼイションを行うのに 十分なヌクレオチド配列の同一性を相補鎖の間に有する、 請求項４に記載の方法。
9. ９．前記２つまたはそれ以上の核酸が、一本鎖である、請求項８に記載の方法。
10. １０．前記結合タンパク質が、抗体である、請求項１に記載の方法。
11. １１．前記結合ドメインが、ＣＤＲ類である、請求項１に記載の方法。
12. １２．前記開裂部位の組が、制限酵素認識部位である、請求項５に記載の方法。
13. １３．前記制限酵素認識部位が、Ｂｓｔ　ＸＩ、Ｆｏｋ　ＩおよびＤｒａ　ＩＩ Ｉからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
14. １４．前記開裂試薬が、制限酵素である、請求項５に記載の方法。
15. １５．（ａ）少なくとも１組のスプライシング部位を有する結合タンパク質をコ ードする２つまたはそれ以上の核酸を提供する工程、 ここで、該スプライシング部位の組が、１つまたはそれ以上のコードされた結合 ドメインの両端に隣接している；（ｂ）該２つまたはそれ以上の核酸を混合し、 結合タンパク質をコードする混合核酸の親集合を製造する工程；および（ｃ）該 ２つまたはそれ以上の核酸の間に、該スプライシング部位の組を介して該結合ド メインをランダムに組込み、結合タンパク質をコードする核酸の別の集合を製造 する工程、ここで、少なくとも１つの結合タンパク質は、該親集合の構成要素と 実質的に異なった結合特性によって特徴付けられた、異なる結合タンパク質をコ ードする核酸の集合を製造する工程； を包含する方法によって製造される結合タンパク質をコードする、核酸。
16. １６．前記結合タンパク質が、抗体である、請求項１５に記載の核酸。
17. １７．前記結合ドメインが、ＣＤＲ類である、請求項１５に記載の核酸。
18. １８．（ａ）少なくとも１組のスプライシング部位を有する結合タンパク質をコ ードする２つまたはそれ以上の核酸を提供する工程、 ここで、該スプライシング部位の組が、１つまたはそれ以上のコードされた結合 ドメインの両端に隣接している；（ｂ）該２つまたはそれ以上の核酸を混合し、 結合タンパク質をコードする混合核酸の親集合を製造する工程；および（ｃ）該 ２つまたはそれ以上の核酸の間に、該スプライシング部位の組を介して該結合ド メインをランダムに組込み、結合タンパク質をコードする核酸の別の集合を製造 する工程、ここで、少なくとも１つの結合タンパク質は、該親集合の構成要素と 実質的に異なった結合特性によって特徴付けられた、異なる結合タンパク質をコ ードする核酸の集合を製造する工程； を包含する方法によって製造される結合タンパク質をコードする核酸を含む、ベ クター。
19. １９．前記結合タンパク質が、抗体である、請求項１８に記載のベクター。
20. ２０．前記結合ドメインが、ＣＤＲ類である、請求項１８に記載のベクター。
21. ２１．請求項１８に記載のベクターで形質転換された、宿主細胞。
22. ２２．前記結合タンパク質が、抗体である、請求項２１に記載の宿主細胞。
23. ２３．前記結合ドメインが、ＣＤＲ類である、請求項２１に記載の宿主細胞。
24. ２４．請求項２１に記載の宿主細胞で製造される、結合タンパク質。
25. ２５．前記結合タンパク質が、抗体である、請求項２４に記載の結合タンパク質 。
26. ２６．前記結合ドメインが、ＣＤＲ類である、請求項２４に記載の結合タンパク 質。