CN101258243A

CN101258243A - 新的噬菌体展示技术

Info

Publication number: CN101258243A
Application number: CNA2006800323105A
Authority: CN
Inventors: R·伯里奥尼; M·克勒门蒂
Original assignee: Ribovax Biotechnologies SA
Current assignee: Ribovax Biotechnologies SA
Priority date: 2005-07-07
Filing date: 2006-07-06
Publication date: 2008-09-03
Also published as: WO2007007154A2; AU2006267968A1; JP2009500030A; KR20080039869A; US7811973B2; CA2614304A1; EP1904634A2; EP1904634B1; ZA200800104B; WO2007007154A3; IL188554A0; AU2006267968B2; US20080312101A1; ATE495252T1; BRPI0612589A2; DE602006019598D1; RU2008104610A

Abstract

本发明提供用于在丝状噬菌体表面产生和筛选融合蛋白质的新技术。具体地，可以使用单个载体产生细胞和噬菌体文库，所述细胞和噬菌体文库含有融合于两个噬菌体外壳蛋白质的任一个的给定系列的蛋白质序列。该方法简化和改进随后基于噬菌体展示的蛋白质结合分子的选择效率，该蛋白质结合分子具有治疗或诊断用途，例如抗体、肽或表位结合区。

Description

新的噬菌体展示技术

发明领域

本发明涉及产生噬菌体展示文库的改良的噬菌粒载体。

发明背景

基于噬菌体展示的技术为克隆、表达、筛选和产生由于结合其他蛋白质或任意其他生物学靶从而具有生物学功能的多肽提供方法。基于亲和力的反复筛选使从大的蛋白质序列文库中分离的相关克隆得以富集，这些蛋白质序列例如抗体、表位、抗原、生物活性肽、酶抑制剂、酶、DNA结合蛋白质、分离的蛋白质结构域、或受体的配体。

噬菌体展示技术开始于从任意含核酸的材料分离的序列，并产生几种类型的产物(抗体、酶、肽等等)，其与其他技术相结合可以满足现代生物技术的大量需求。近来，一些作者报道不仅使用不同噬菌体展示技术可以获得功能性蛋白质序列，而且重组噬菌体可以直接用于许多应用(例如在诊断学中、用于免疫、在蛋白质组学中、作为抗菌化合物、在细胞转化中、用于工业生物技术、在毫微技术中等等)。

而且，抗体片段(例如在重组噬菌体表面表达的可变重/轻链异二聚体(或Fab)和单链可变区(或scFv))的所有大的组成成分的构建，其随后通过抗原“淘选”进行基于亲和力的噬菌体筛选，已经发展为多用和快速的获得具有期望的亲和力和特异性抗体的方法。此类筛选方法随后可以通过创建所选噬菌体的突变抗体所有组成成分来优化，并且抽取例如可以在更严格性条件下结合抗原和具有更强亲和力的后代样品。

噬菌体展示技术的优点在于丝状噬菌体(例如M13、f1或Fd)的小尺寸和适应性、可感染细菌细胞(尤其带有F-性菌毛的大肠杆菌细胞)、和具有高度同源性的、单链的基因组。已经开发了许多载体、文库、和展示的形式，可以在许多近期的文章(Sidhu等人，2000；Benhar，2001；Sidhu，2001；Szardenings，2003；Bradbury和Marks，2004；Hust和Dubel，2004；Mancini等人，2004；Pini等人，2004；Conrad和Scheller，2005；Hust和Dubel，2005；Silacci等人，2005；Smith等人，2005)和书中(“噬菌体展示：实践方法”，266卷，编辑Clackson和Lowman H，Oxford Univ.Press，2004；“噬菌体展示：实验室手册”，Burton DR等人，CSHL Press，2001)看到。

形成丝状噬菌体表面的蛋白质序列(称为外壳蛋白质)可以更多或更少有效的调节和展示克隆到其N-或C-末端从而形成融合蛋白质的异源蛋白质序列。为此使用不同的外壳蛋白质(cp)，尤其是次要外壳蛋白质(也称为外壳蛋白质III/3、g3p、gIIIp、p3、pIII、cpIII或cp3)和主要外壳蛋白质(也称为外壳蛋白质VIII/8、g8p、gVIIIp、p8、pVIII、cpVIII或cp8)，也有其他外壳蛋白质cp6、cp7和cp9(Gao等人，1999；Hufton等人，1999；Kwasnikowski等人，2005)。依赖于改良噬菌体蛋白质的存在的拷贝数，在高效价展示(即当噬菌体蛋白质以大量拷贝存在时，例如cp8)和低效价展示(即当噬菌体蛋白质以少数拷贝存在时，例如cp3、cp6、cp7或cp9)之间产生差异，这两种方法都提供筛选结合于特异靶的蛋白质序列的可能性。

可以通过使用噬菌体载体或噬菌粒载体来实现外壳蛋白质与要展示蛋白质的融合，提供可以用特异性结合剂或靶来筛选的文库(O′Connell等人，2002)。两种情况下，修饰外壳蛋白质从而使其被转录和翻译成在其N末端具有异源蛋白质序列的融合蛋白质，并且通过分泌/前导序列而显示。

当使用噬菌体载体时，直接将编码融合蛋白质的DNA克隆到噬菌体基因组的外壳蛋白质中，从而允许高展示水平，但是在异源序列的大小和克隆策略方面有很强的限制。已经描述了几种此类系统的变体，其中改良的和未改良的相同外壳蛋白质的变体存在于同种噬菌体载体中。此类载体定义为“88”、“33”或“8+8”类型(Enshell-Seijffers等人，2001；Petrenko和Smith，2004)。

当使用噬菌粒载体时，构建体更小并且包含在细菌和噬菌体细胞周期中触发复制但是只表达一个(或少数)外壳蛋白质的序列。噬菌粒载体更易于通过重组DNA技术操作，从而产生在噬菌体表面表达的序列文库。然而，这些载体仅在转化的细菌细胞随后被支持噬菌体正确复制和包装的完整噬菌体(“辅助”噬菌体)感染时，可以提供完整噬菌体，从而为重组噬菌体的再感染和随后的扩增提供所需的外壳蛋白质的野生型版本。

在载体和序列优化的可能性方面已经有了广泛的研究，这些载体和序列被用于实现噬菌体展示筛选、鉴定在使用一种外壳蛋白质而不是其他外壳蛋白质时的某些系统规定参数(Makowski，1993)或鉴定在异源蛋白质序列实际上如何通过不同外壳蛋白质来展示中的差别(Iannolo等人，1995；Weiss和Sidhu，2000；Weiss等人，2000；Roth等人，2002；Li等人，2003；Held和Sidhu，2004)。

例如，两个或多个具有不同性质的蛋白质序列(例如一个结合抗原而另一个结合在固体底物上存在的配体，或不同的表位结合肽)在单个双功能噬菌体(也称为“二元展示”或“双重展示”噬菌体)上展示。可以通过将具有不同外壳蛋白质(或同样外壳蛋白质的不同变体)的各个序列按框架克隆到相同噬菌粒载体的不同转录单位中，装配成单或双顺反子变体，或通过用两个噬菌粒载体(每个对应于一个特异性融合外壳蛋白质)双重感染细菌细胞从而获得相似噬菌体(Bonnycastle等人，1997；Malik和Perham，1997；Gao等人，1999；Gao等人，2002；Chen等人，2004；WO 98/05344；WO95/05454，WO 01/25416)。噬菌体展示技术虽然很有效，但是目前仍然存在改进的空间，而且用于展示的外壳蛋白质的选择仍然是重要问题。

事实上，系统的效率基本上受到使用一个而不是另一个特异性外壳蛋白质序列来表达、展示和筛选的蛋白质序列的“适合度”所影响，这一性质是不可能预先确定的。例如，考虑到为此目的更常用的外壳蛋白质，cp8似乎更适合于筛选肽或低亲和力抗体，因为cp8系统的多价性可以增加结合容量。相反，由于异源蛋白质序列在噬菌体表面存在的低拷贝数，基于cp3的展示可能更适合于筛选高亲和力抗体。然而，由于在文库中抗体的亲和力是高度可变的，并且不可能预知，所以其他因素也可以影响展示系统，例如在大肠杆菌周质空间的基于cp3/cp8的融合蛋白质的蛋白质水解降解，或除去噬菌粒所包含序列的重组事件。

考虑到噬菌体展示肽时，甚至与之更相关的类似问题已在某些文献中被证明，作为此技术可能性的完全开发，其明确指示需要构建至少两个不同的噬菌体文库，从含编码所展示的抗体/肽所有组成成分的DNA的相同样品开始。在关于使用cp3和cp8展示和筛选蛋白质序列的文献中，对蛋白质表位和肽的(Rousch等人，1998；Zwick等人，1998；Adda等人，1999；Gao和Zhong，1999；Yip等人，2001；Al-bukhari等人，2002；O′Connor K等人，20051)、抗体的(Kretzschmar和Geiser，1995)、或酶的(Verhaert等人，1999)不同性质和/或序列进行了报道。而且，也描述了将各自用不同噬菌粒单独产生的两个噬菌体文库混合(Jacobsson等人，2003)，或者将用一个外壳蛋白质筛选的序列重新克隆到展示另一个外壳蛋白质的文库中(Wang等人，1997)。使用噬菌体展示文库也可以鉴定功能性蛋白质序列，该文库中随机序列被无特异性方向地克隆，但是通过载体主链中放置于克隆位点5’和3’区的调控和编码序列使实际转录和翻译具有方向性(Zelenetz和Levy，1990；van Zonneveld等人，1995；Stratmann和Kang，2005)。

几个专利申请公开了噬菌体展示技术的变体，例如cpVII和cpIX的组合使用(WO 00/71964)、在噬菌体载体中附加限制性酶切位点(WO03/093471，WO 03/91425)、重链和轻链序列以相反的转录方向头对头放置的双向启动子的使用(Den等人，1999)、以单或双顺反子表达排列的不同组合的编码序列(Kirsch等人，2005)、在外壳蛋白质中引入突变(WO02/103012；WO 00/06717)、或文库构建、表达和筛选的不同方法(WO98/20036；WO 98/14277；WO 97/35196；WO 97/46251；WO 97/47314；WO97/09446；WO 03/029456)。可选择地，许多资料描述了将蛋白质序列组装到噬菌粒中的基于位点特异性重组的克隆系统(WO92/20791，WO95/021914，WO97/020923，WO00/31246，WO96/40714；Tsurushita等人，1996；Sblattero和Bradbury，2000)。

然而，这些资料都没有公开如何从编码异源蛋白质的DNA文库和单个噬菌粒开始产生单个噬菌体文库，从而能够展示融合于两个外壳蛋白质的一个或另一个的异源蛋白质。

发明概述

本发明提供用单个噬菌粒载体和单一的克隆和转化步骤来克隆、产生和筛选氨基酸序列的方法，该氨基酸序列作为与在丝状噬菌体表面两个外壳蛋白质的任一个融合的蛋白质。

在第一个实施方案中，本发明提供用于DNA双向克隆的噬菌粒载体，该DNA编码与两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端融合的氨基酸序列。

在第二个实施方案中，本发明提供噬菌粒载体，包含：

a)编码第一个功能性外壳蛋白质的DNA，在其5’端包含第一个DNA接头；和

b)编码第二个功能性外壳蛋白质的DNA，其转录方向与第一个功能性外壳蛋白质相反，并且在其5’端包含第二个DNA接头；

其中第一个和第二个DNA接头包含至少一个同一的限制性内切酶位点，该位点不存在于噬菌粒载体中所述接头之外。

属类上定义为pDD(用于双重展示的噬菌粒)的此种噬菌粒的实例包含两个单独的DNA接头，也称为DIS接头，每个在其5’端具有靠近的SpeI-BgII限制性酶切位点(SEQ ID NO.：1)，紧跟其后的可以是编码形成DIS接头2的蛋白质接头的DNA序列(SEQ ID NO.：2和SEQ ID NO.：3)。可选择地，在单个序列中SpeI-BgII限制性酶切位点可以与附加的两个不同DNA序列组合，所述两个不同的DNA序列各自编码两条链下游和上游的蛋白质接头，从而可以形成DD-DIS接头2(SEQ ID NO.：5)。DNA接头可以按读码框与编码功能性外壳蛋白质的DNA的5’端一起被转录，也可按读码框与编码与其融合并且被所述功能性外壳蛋白质展示的蛋白质序列的DNA的3’端一起被转录。

在第三个实施方案中，本发明提供包含双重展示表达盒(DD表达盒)的噬菌粒载体。此类载体还包含一个DNA盒，其用于克隆、表达和展示至少一种蛋白质序列，所述蛋白质序列通过所述DNA接头之一的方法被融合在所述功能性外壳蛋白质的任一个的N-末端。

克隆到pDD载体中以后，DD表达盒有效连接于两个功能性外壳蛋白质的任一个，依赖于DD表达盒克隆的方向，并且允许其通过存在于DD表达盒内的序列而被转录和翻译成在其N末端包含异源序列的融合蛋白质。

通过包含编码称为修饰的cp3(cp3^＊，SEQ ID NO.：6)和修饰的cp8(cp8^＊，SEQ ID NO.：8)的两种功能性外壳蛋白质的DNA的pDD载体提供类似的噬菌粒。此类载体的实例包括cp3^＊DDcp8^＊(SEQ ID NO.：10)、DDa表达盒(SEQ ID NO.：11)、或DDb表达盒(SEQ ID NO.：12)。

DD表达盒可以包括一个或多个附加基因，例如，编码选择型标记的基因、改变细菌代谢的基因或与融合在两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端的异源蛋白质序列相互作用的蛋白质序列。此类附加基因不依赖于DD表达盒插入的方向而转录和翻译，且以任意方向定向。

在第四个实施方案中，本发明提供上述定义的载体用于产生噬菌体或细胞文库的用途，其中所述文库的每个蛋白质序列通过DIS接头融合在两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端。

在第五个实施方案中，本发明提供用上述定义的载体获得的噬菌体或细胞文库，其中所述文库的每个蛋白质序列通过DIS接头融合在两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端。

功能性外壳蛋白质的实例是修饰的cp3蛋白质(cp3^＊蛋白质；SEQ IDNO.：7)和修饰的cp8蛋白质(cp8^＊蛋白质；SEQ ID NO.：9)。

可以使用能够被克隆到任意类型载体中、或已经克隆到pDD载体中的DD表达盒来产生文库。对于后面一种情况，在DD表达盒中构建的文库应该以限制性内切酶消化从而在DIS接头内将其切断，并与用提供可匹配末端的酶切割的pDD载体连接，从而获得DD表达盒的双向克隆。

然后可以将pDD载体文库在细菌细胞中维持，因为细胞文库中的噬菌粒可以使用细菌复制起始位点进行复制。可选择地，通过用辅助噬菌体感染此类细菌细胞，该文库可以作为噬菌体文库被复制，并以含噬菌粒并且在其表面表达异源蛋白质序列的重组噬菌体的形式被纯化，该异源蛋白质通过DIS接头融合在两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端。

在第六个实施方案中，本发明提供用于产生噬菌体或细胞文库的包含上述定义载体的试剂盒，其中所述文库的每个蛋白质序列通过DIS接头融合在两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端。

在第七个实施方案中，本发明提供产生噬菌体或细胞文库的方法，其中所述文库的每个蛋白质序列通过DIS接头融合在两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端，该方法包括：

a)在用于DNA双向克隆的噬菌粒载体的相应DIS接头中插入DD表达盒，该DNA编码融合在两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端的氨基酸序列；和

b)用得到的载体转化细胞。

可以通过将DD表达盒与以BgII消化并具有可匹配末端的载体连接从而获得所述DD表达盒的插入。

通过本发明的方法获得的重组噬菌体以及融合蛋白质可以以分离的形式或混合物的形式使用，用于结合、检测、中和、和/或改变配体、细胞或靶分子。可以在体内和/或体外检测此类重组噬菌体的活性或融合蛋白质的活性。

在所有实施方案中，通过DIS接头融合在两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端的异源蛋白质序列可以是抗体、抗体片段、表位、表位结合区、抗原、变应原、生物活性肽、酶、酶抑制剂、酶催化位点、DNA结合蛋白质、分离的蛋白质结构域、受体的配体、受体、生长因子、细胞因子、和目的蛋白质序列的邻近或重叠片段。

在下面的说明中提供本发明的更多的实施方案，包括分离的重组DNA和蛋白质序列，以及其他方法和用途。

附图描述

图1：cp3^＊DNA(SEQ ID NO.：6)和蛋白质(SEQ ID NO.：7)的DNA和蛋白质序列的比对。在5’端，包括SpeI和SfiI限制性酶切位点(方框中；SEQ ID NO.：1)和编码Gly4Ser接头序列(总共12个氨基酸)的DIS接头2(加下划线；SEQ ID NO.：2和SEQ ID NO.：3)与编码肠杆菌噬菌体(Enterobacteria phage)M13(蛋白质序列SWISSPROT登录号P69168；核苷酸序列基因库登录号NC_003287，片段2224-2853包括原始终止密码子)的外壳蛋白质cp3的216-424氨基酸的5’DNA片段按读码框相融合。在3’端，在终止密码子(加下划线)之后通过PCR加入NheI位点(方框中)。核苷酸A₅₂₃被G₅₂₃取代(导致Ser₁₇₅被Gly₁₇₅取代)也被框于方框中。

图2：琼脂糖凝胶电泳显示通过使用引物cp3^＊FW(SEQ ID NO.：13)和cp3^＊RW(SEQ ID NO.：14)而获得的cp3^＊DNA扩增产物，出现约680bp的条带。

图3：(A)由寡核苷酸HA标签接头FW(SEQ ID NO.：17)和HA标签接头RW(SEQ ID NO.：18)退火形成的HA标签接头序列。加下划线的是单链的5’端，一个可匹配XhoI(CTCGAG)，另一个可匹配SpeI(ACTAGT)限制性酶内切位点。(B)HAcp3^＊DNA(SEQ ID NO.：19)和蛋白质(SEQ IDNO.：20)的DNA和蛋白质序列的比对。得到的221个氨基酸的cp3^＊序列与PelB前导序列(SEQ ID NO.：25)和HA标签融合，从而产生一个258个氨基酸的蛋白质序列。

图4：噬菌粒载体pRIB1-cp3^＊(A)、pRIB1-HAcp3^＊(B)和pRIB1-e44cp3^＊(C)的图示，包含两个有效连接于PelB前导/分泌序列的LacZ启动子(LacZp)。LaczP-PelB片段按读码框仅与cp3^＊融合(A中)、与另外包含HA标签的cp3^＊融合(HA，B中)或与e44重链(e44HC，C中)序列融合、或与e44轻链(e44LC，C中)融合。也标出其他相关元件，例如氨苄青霉素(Amp^r)和氯霉素抗性(CAT)基因，以及克隆位点和复制起点。

图5：以pRIB1系列载体转化的大肠杆菌XL1Blue的总细胞提取物的Western印迹。(A)在以pRIB1-cp3^＊(阴性对照)或pRIB1-HAcp3^＊转化的细菌细胞中用抗HA标签抗体检测的HA标签的表达。(B)在以pRIB1-e44cp3(阳性对照)或pRIB1-e44cp3^＊转化的细菌细胞中用抗人Fab抗体检测的e44 Fab的表达。因为附加了由DIS接头2编码的序列，所以e44重链的条带稍高。因为该蛋白质的表达不受融合于重链的外壳蛋白质尺寸的限制，所以轻链的量更高。

图6：(A)cp8^＊的DNA和蛋白质序列(SEQ ID NO.：8和SEQ ID NO.：9)的比对。在5’端，包括SpeI和SfiI限制性酶切位点(方框中；SEQ ID NO.：1)和编码Gly4Ser接头序列(总共12个氨基酸)的DIS接头2(加下划线；SEQID NO.：2和SEQ ID NO.：3)与编码肠杆菌噬菌体的外壳蛋白质cp8的24-73氨基酸(蛋白质序列SWISSPROT登录号P69541；核苷酸序列基因库登录号NC_003287，片段1370-1522包括原始终止密码子)的5’DNA片段按读码框相融合。在3’端，在终止密码子(加下划线)之后通过PCR加入NheI位点。(B)琼脂糖凝胶电泳显示通过使用引物cp8^＊FW(SEQ ID NO.：15)和cp8^＊RW(SEQ ID NO.：16)而获得的cp8^＊DNA扩增产物，出现约200bp的条带。

图7：HAcp8^＊的DNA和蛋白质序列(SEQ ID NO.：21和SEQ ID NO.：22)的比对。得到的cp8^＊序列的62个氨基酸与PelB前导序列(SEQ ID NO.：25)和HA标签融合，从而产生一个99个氨基酸的蛋白质序列。

图8：以pRIB2系列载体转化的大肠杆菌XL1Blue的总细胞提取物的Western印迹。(A)在未转化(阴性对照)或以pRIB2-HAcp8^＊(可区别HAcp8^＊成熟和未成熟形式)转化的细菌细胞中用抗HA标签抗体检测的HA标签的表达。(B)在以未转化(阴性对照)或以pRIB2-e44cp8^＊转化的细菌细胞中用抗人Fab抗体检测e44 Fab的表达。

图9：展示DIS接头2修饰的外壳蛋白质的重组噬菌体的生产，将表达正常cp3的噬菌体(阳性对照；使用pRIB-cp3)或表达cp3^＊，例如(使用pRIB1-cp3^＊；A)的噬菌体、表达融合于HA标签的cp3^＊(使用pRIB-HAcp3和使用pRIB1-HAcp3^＊；B)的噬菌体、或表达融合于e44 Fab(使用pRIB-e44cp3和pRIB1-e44cp3^＊；C)的噬菌体中测量的每微升的克隆形成单位(cfu)进行比较。

图10：展示含DIS接头2的外壳蛋白质的重组噬菌体的生产，将表达阳性对照和表达正常cp3，例如(使用pRIB-cp3)的噬菌体、或表达融合于e44 fab(使用pRIB-e44cp3)的噬菌体与那些表达e44cp8^＊(使用pRIB2-e44cp8^＊；A)、cp8^＊(使用pRIB2-cp8^＊；B)或HAcp8^＊(使用pRIB2-HAcp8^＊；C)的噬菌体中测量的每微升克隆形成单位(cfu)进行比较。

图11：使用表达HA-cp3^＊(使用pRIB1-HAcp3^＊；A)或HA-cp8^＊(使用pRIB2-HAcp8^＊；B)的重组噬菌体以牛血清白蛋白质(BSA)、抗HA标签抗体(抗HA)或丙型肝炎病毒E2蛋白质(E2)作为结合剂进行的淘选实验。Y轴显示以结合剂在最后步骤洗脱的噬菌体的值(噬菌体排出量，根据文中公式III计算，单位为cfu/μl)。

图12：使用表达e44-cp3或e44-cp3^＊(使用pRIB2-e44cp3^＊；A)和e44-cp8^＊(使用pRIB2-e44cp8^＊；B)的重组噬菌体以牛血清白蛋白质(BSA)或丙型肝炎病毒E2蛋白质(E2)作为结合剂进行的淘选实验。Y轴显示以结合剂在最后步骤洗脱的噬菌体的值(噬菌体排出量，根据文中公式III计算，单位为cfu/μl)。

图13：(A)pBS-DDdeltaBgl噬菌粒载体的结构，其中克隆了pDD接头，其包含进一步操作所需的限制性内切酶位点。(B)图示将pBS-DD接头2(衍生自pBS-DDdeltaBgl)修饰为pDD-cp3^＊cp8^＊的克隆策略的流程图。DD-DIS接头2与以反方向克隆的编码两个修饰外壳蛋白质序列的DNA的5’端交叉。

图14：DD表达盒和其元件的图示(不按标尺)。(A)DNA元件的基本特征和排列，包括DD表达盒中的限制性内切酶的一般单个位点(SRE)或DIS接头特异性的限制性内切酶单个位点(DIS-SRE)；(B)DD表达盒中的DNA元件、BgII和SpeI位点、SRE、和标记基因的特征和排列，所述DD表达盒被用于表达单个肽或功能性蛋白质作为带有功能性外壳蛋白质的融合蛋白质。(C)在表达Fab的DD表达盒中的DNA元件、BgII和SpeI位点、SRE和标记基因的特征和排列，其中重链可变区域表达为具有功能性外壳蛋白质的融合蛋白质，并且轻链可变区域由相同DD表达盒中分离的基因表达。(D)在表达有单个转录本的两个序列的DD表达盒中的DNA元件、BgII和SpeI位点、SRE和标记基因的特征和排列，其中一个开始于核糖体结合位点(RBS)的序列表达为具有功能性外壳的融合蛋白质。标记基因或其他不表达为具有功能性外壳蛋白质的融合蛋白质的基因各自的位置和数量、和SRE的位置和数量是纯粹示例性的，并且可以适应于DD表达盒的特异性用途。每个图示上方的箭头表示从DD表达盒到载体主链的转录方向，并且在DD表达盒克隆到pDD载体的情况下，那里出现通过DIS接头融合的功能性外壳蛋白质。

图15：包含cp3^＊和cp8^＊(pDD-cp3^＊cp8^＊)的本发明的噬菌粒载体原型的结构，其为空载体时可以包括不同的序列(例如单一的DD-DIS接头、填充DNA或标记基因)。无论是否使用空载体，DD表达盒的插入都提供两种形式的pDD载体，一种包含展示带有cp8^＊(pDD-Fuscp8^＊)的融合蛋白质的基因，另一种包含展示带有cp3^＊(pDD-Fuscp3^＊)的融合蛋白质的基因。这些重组基因以较重的线表示。

图16：cp3^＊DDcp8^＊的序列(SEQ ID NO.：10)，出现包含由双重BgIII酶切位点和SpeI单酶切位点形成的序列(SEQ ID NO.：4)，其与编码cp3^＊的DNA序列(在5’与DD-DIS接头2连接；相应蛋白质序列在下面的反义链中显示)和编码cp8^＊的DNA序列(在3’与DD-DIS接头2连接；相应蛋白质序列在正义链中显示)相连接。该序列被包含在图14和15的pDD-cp3^＊cp8^＊中。

图17：与pDD载体相适合的示例的DD表达盒的序列(DDa表达盒；SEQ ID NO.：11)，例如图15中或以pDD-cp3^＊cp8^＊设计的DD表达盒，其具有相关的限制性酶切位点、克隆到SacI和XbaI之间的序列(在DD表达盒中组成型表达)和用于克隆到XhoI和SpeI之间的序列(当DD表达盒通过DIS接头融合于功能性外壳蛋白质时在DD表达盒中组成型表达)的两个不同LacZ启动子(LacZp)和PelB起始密码子、氯霉素抗性基因(CAT)起始和终止密码子、和用作PelB序列和DIS接头之间的填充DNA的HA标签。CAT基因也可以以相反的方向被克隆。

图18：与pDD载体相适合的示例的DD表达盒的序列(DDb表达盒；SEQ ID NO.：11)，例如图15中或以pDD-cp3^＊cp8^＊设计的DD表达盒，其具有相关的限制性酶切位点、用于克隆到SacI和XbaI之间的序列(在DD表达盒中组成型表达)和用于克隆到XhoI和SpeI之间的序列(当DD表达盒通过DIS接头融合于功能性外壳蛋白质时在DD表达盒中组成型表达)的两个不同LacZ启动子(LacZp)和PelB起始密码子、Zeocin抗性基因(ZEO)起始和终止密码子、和用作PelB序列和DIS接头之间填充DNA的HA标签。ZEO基因也可以以相反的方向被克隆。

图19：随机选择的pDD-cp3^＊cp8^＊的限制性分析，其中DDa(A)或DDb(B)表达盒用BgII限制性酶切位点克隆，并且在DDa和DDb盒中用NheI(切割载体中cp3^＊的3’端)和XbaI(位于BgII限制性酶切位点附近，不连接功能性外壳蛋白质)消化。与DNA标记(M)相比，从其中表达盒按照带有cp3^＊的读码框被插入的克隆(A栏的1、3和4克隆；B栏的2、4和6克隆)中提取的质粒DNA比从其中表达盒按照带有较短cp8^＊序列的读码框被插入的克隆(A组的2、5和6克隆；B组的1、3和5克隆)中提取的质粒DNA，呈现两个具有更相似长度的片段。这是由于cp3^＊比cp8^＊的尺寸更大。

图20：使用展示HA肽(A栏)或e44 fab(B栏)的融合于cp3^＊或cp8^＊的重组噬菌体进行淘选实验，并且用抗HA肽抗体(抗HA；A栏)或丙型肝炎病毒E2重组蛋白质(E2；B栏)作为结合剂淘选。在两种情况下使用牛血清白蛋白质(BSA)作为阴性结合剂。用包括表达CAF基因的DD表达盒的pDD-cp3^＊cp8^＊噬菌粒、和基于pRIB1的载体(作为cp3^＊阳性对照)或基于pRIB2的载体(作为cp8^＊阳性对照)的两者之一来表达肽和fab。只表达cp3的pRIB载体作为阴性对照。Y轴显示以结合剂在最后步骤洗脱的噬菌体的值(噬菌体排出量，根据文中公式III计算)。

图21：使用展示HA肽(A栏)或e44 fab(B栏)的融合于cp3^＊或cp8^＊的重组噬菌体进行淘选实验，并且用抗HA肽抗体(抗HA；A栏)或丙型肝炎病毒E2重组蛋白质(E2；B栏)作为结合剂淘选。两种情况下使用牛血清白蛋白质(BSA)作为阴性结合剂。用包含表达CAF或ZEO基因的DD表达盒的pDD-cp3^＊cp8^＊噬菌粒作为筛选标记来表达肽和fab。也使用基于pRIB1的载体(作为cp3^＊阳性对照)或基于pRIB2的载体(作为cp8^＊阳性对照)。Y轴显示以结合剂在最后步骤洗脱的噬菌体的值(噬菌体排出量，根据文中公式III计算)。

图22：从基于pDDb的大肠杆菌文库中随机选择的克隆的限制性分析(A)和Western印迹分析(B)。每个克隆的识别号在(A)的上方表示，并且保留在(B)中。当准备Western印迹时将具有相同限制性图谱的克隆(见图19)放在一边。

图23：描述用本发明的载体制备文库和筛选重组噬菌体的方法的流程图。

发明详述

本发明潜在的技术难题是如何建立简单和有效的系统，其可以在丝状噬菌体中将要表达的氨基酸序列表达和展示为与两个可选的噬菌体外壳蛋白质的任一个融合的蛋白质，而不用克隆该序列两次，该系统是在单个或两个噬菌粒载体中，和/或不用感染细菌细胞两次。

通过构建噬菌粒载体来解决该技术难题，该载体允许DNA的双向克隆，所述DNA编码与重组噬菌体两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端融合的氨基酸序列。

一般定义为pDD(双重展示的噬菌粒)的此类载体的基本元件有：

本发明的载体中包括的特异性DNA接头序列此后表示为“DIS接头”(展示和插入位点接头)。限制性内切酶的同一位点目的在于当用此类酶消化并且暴露于单一的连接反应(由于平头或单链、互补的3’/5’末端)时，产生彼此相互匹配或与末端具有相同酶切位点的插入DNA片段匹配的功能性外壳蛋白质的5’端。

而且，DIS接头应设计为可以与编码功能性外壳蛋白质的DNA的5’端按读码框转录，并且与编码通过所述功能性外壳蛋白质展示和与其融合的蛋白质序列的DNA的3’端按读码框转录。因此，功能性外壳蛋白质和被展示的蛋白质序列通过由DIS接头编码的蛋白质接头而分离。该蛋白质接头不应定性地改变(例如由于其长度或其对配体的亲和力)功能性外壳蛋白质和被展示的蛋白质序列的性质。

噬菌粒载体的类似接头已经在文献中公开，并且其限制性内切酶位点类型和位置都适合于本发明的需要。实施例(图1和6)显示包括两个限制性内切酶位点(SEQ ID NO.：1)的DIS接头，其可以与编码Gly4Ser接头的附加的序列相组合，从而形成DIS接头2(SEQ ID NO.：2和SEQ ID NO.：3)。特别优选的接头是那些在融合蛋白质的接头点提供高度灵活性的接头。一个示例的和优选的接头具有公式(Gly4Ser)_n，其中n为1-5。文献中也鉴定了适合Fab或Scfv的接头(Hennecke等人，1998)。在噬菌粒载体中的两个DIS接头可以是简单匹配的(即具有一个或多个同一的限制性内切酶位点)或同一的(即如同实施例中的一样也具有同一的接头序列)。

根据实施例和附图中的不同标准和情况，可以将编码DIS接头的DNA序列和功能性外壳蛋白质序列进行排列。本发明的噬菌粒可以包含两个DIS接头，它们由具有可变长度和特征的DNA序列分开，但是两个DIS接头也可以通过共同的限制性内切酶位点彼此直接连接，如DD-DIS接头2中所示(图16；SEQ ID NO.：4：和SEQ ID NO.：5)。

在现有技术中公开了以接头序列修饰的外壳蛋白质，包括类似于那些限定DIS接头的限制性内切酶位点(WO 04/078937，WO 03/091425，WO02/088315，WO 99/29888)。然而，这些资料都没有公开噬菌粒载体中两个DIS接头的组合和物理排列从而获得与两个功能性外壳蛋白质的任一个融合的蛋白质序列的双向克隆。

而且，载体中存在DIS接头和相应的以反方向克隆(即各从不同的链转录)的功能性外壳蛋白质，使得噬菌粒载体的构建还包含DNA盒，其用于通过所述DIS接头之一来克隆、表达和展示至少一个与所述功能性外壳蛋白质的任一个的N末端融合的蛋白质序列。

通过所述DIS接头之一来克隆、表达和展示至少一个与所述功能性外壳蛋白质的任一个的N末端融合的蛋白质序列的特异性DNA盒在后面表示为双重展示表达盒(DD表达盒)。产生DD表达盒的不同形式在图14中呈现。

通过载体中存在的与DIS接头共同的限制性内切酶位点，可以将DD表达盒克隆到pDD载体中，然后依赖于DD表达盒克隆的方向，DD表达盒被有效连接于两个功能性外壳蛋白质的任一个，从而使其通过存在于DD表达盒和DIS接头内的序列，转录和翻译为在N末端包含异源序列的融合蛋白质。

事实上，每个编码功能性外壳蛋白质的DNA片段(在pDD载体中以转录的反义方向组装但是本身没有合适的启动子)需要插入正确的启动子(如果缺失，要在5’端正确的插入含有起始ATG的融合的蛋白质序列)，从而使其能够转录和翻译，这可以由DD表达盒来提供。由于DD表达盒可以以两个相反的方向插入，因此仅在每个pDD载体中的功能性外壳蛋白质之一含有DD表达盒即可实现(图15)。

在统计学上，DD表达盒以两个方向插入的机会是相等的，同时在连接混合物中每个DD表达盒有几个拷贝可以被利用。因此，预期用pDD载体和几种基于相同DD表达盒的DNA片段(对于克隆进入的异源蛋白质序列不同)构建的文库将包含至少一对pDD载体，其具有各自以一种或另一种方向克隆的DD表达盒。因此，形成根据本发明的方法构建的文库的细胞重组噬菌体群可能存在两种版式的异源蛋白质序列的所有组成成分(即融合于一种或另一种功能性外壳蛋白质)。

“功能性外壳蛋白质”应当意为丝状噬菌体外壳蛋白质的全部或一部份，其能够插入到噬菌体外壳中，并且能够展示所述噬菌体表面融合于其N末端的异源序列。外壳蛋白质可以是由任意丝状噬菌体(例如M13、fl和fd)编码的蛋白质之一，包括cp3、cp7、cp8或cp9。

如实施例中所示，本发明的噬菌粒中克隆的功能性外壳蛋白质的第一个和第二个序列具有编码称为修饰的cp3(cp3^＊，SEQ ID NO.：6和SEQ IDNO.：7)和修饰的cp8(cp8^＊，SEQ ID NO.：8和SEQ ID NO.：9)的两个功能性外壳蛋白质的DNA，但是两个序列在它们的5’端都不含有正确表达所需的序列(图1和6)。只有插入要展示的异源序列和合适的调控序列之后，第一个或第二个功能性外壳蛋白质才能够实际地转录和翻译为展示此异源序列的融合蛋白质。

实施例也显示编码cp3^＊和cp8^＊的DNA可以以相反的方向直接克隆，并通过共同的限制性内切酶位点而彼此连接，从而形成DD-DIS接头2，其被包含在获得的称为cp3^＊DDcp8^＊的序列中(图16；SEQ ID NO.：10)。

已知这些蛋白质的天然的功能性变体，并且在实施例中公开了有功能性外壳蛋白质活性的天然外壳蛋白质的特异性变体。大量非天然外壳蛋白质变体也被表达，并且测试它们展示异源蛋白质序列的性质(Iannolo等人，1995；Gao C等人，1999；Petrenko等人，2002；Weiss等人，2003；Weiss和Sidhu，2000；Held和Sidhu，2004；Kwasnikowski等人，2005)。任何这些外壳蛋白质序列的可选的非天然和天然的变体，其能够展示融合于其N末端的蛋白质，可以在本发明的载体中作为功能性外壳蛋白质使用。

而且，功能性外壳蛋白质也可以包含一个或多个短的异源序列(通常称为“标签”序列)，其应该位于不影响表达和展示活性的位置。这些功能性外壳蛋白质的变体由上述定义的氨基酸序列之一和提供附加性质而不显著破坏蛋白质展示活性的氨基酸序列组成。此类附加性质的实例提供更简单的检测过程、附加的结合部分或融合蛋白质的翻译后修饰(例如磷酸化、内切蛋白质酶解消化)。

部分、配体和接头的设计，以及融合蛋白质的构建、纯化、检测和使用的方法和策略在文献中被广泛讨论(Nilsson等人，1997；″嵌合基因和杂合蛋白质的应用″酶学方法。卷326-328，学术出版社，2000；WO01/77137)。

此类附加蛋白质序列可以位于噬菌粒载体，在DIS接头内、一个或两个功能性外壳蛋白质内或在DIS接头和一个或两个功能性外壳蛋白质的N末端区域之间。而且，此类附加序列可以位于本发明的噬菌粒中存在的一个或两个功能性外壳蛋白质序列的对应位置，或者可以其在一个与另一个外壳蛋白质之间有所不同。此方法可以帮助在根据本发明的方法产生的文库中所有噬菌体的检测和分离，其中插入的功能性展示盒(双重展示表达盒，或DD表达盒)可以使异源蛋白质序列融合于特异性的功能性外壳蛋白质。

因此，例如多组氨酸、FLAG、c-Myc、HA标签、蛋白质水解位点或任意其他可以通过特异性底物、酶或抗体检测或固定的短的标签序列就特别值得关注。在噬菌粒载体中可以存在不同的标签(单个或精确组合)，从而帮助融合蛋白质的体内和/或体外鉴定、或其纯化。已测试了不同外壳蛋白质的多种标签序列(Nakashima等人，2000)。标签也允许含水的两相分隔(Bandmann等人，2002)或荧光介导的检测(Morino等人，2001)。类似的附加序列可以作为外壳蛋白质和所展示的异源序列之间的系链，正如所示的能够促进外壳蛋白质上的展示的富含脯氨酸的系链(Nakayama等人，1996)。

术语“异源蛋白质序列”指天然存在的丝状噬菌体各自的非天然存在的氨基酸或核苷酸序列。本发明中融合蛋白质、异源序列与各自天然的多肽序列并不相同。所述蛋白质序列一般至少由5个氨基酸组成。

“第一个”和“第二个”功能性外壳蛋白质应预期为两个不同序列的功能性外壳蛋白质，如实施例中所示的具有修饰的cp3蛋白质(cp3^＊蛋白质；SEQ ID NO.：7)和修饰的cp8蛋白质(cp8^＊蛋白质，SEQ ID NO.：9)。它们应当衍生自相同或不同的噬菌体，并且每个相对应于能在所述噬菌体表面展示异源序列的不同外壳蛋白质，或者以两种不同方式在序列水平上被修饰的相同外壳蛋白质(例如短的和长的版本、天然的和突变的版本、有标签的和无标签的版本、两个不同标签的序列，等等)。

编码两个功能性外壳蛋白质的DNA将噬菌粒载体pDD自然分成两个部分(见图15)：

a)主链，即在编码两个功能性外壳蛋白质的DNA各自的3’端之间的区域，并且含有在细菌和噬菌体中复制所需的最小元件，以及可能的附加基因，例如筛选标记的第一个基因；

b)在每个编码功能性外壳蛋白质的DNA的5’端的DIS接头5’端之间的区域，DD表达盒被克隆到其中或可以通过DIS接头被克隆到其中。

文献中提供许多在细菌和噬菌体中复制所需最小元件的实例，例如在实施例中所描述的载体中包含的ColE1 ad f1(+)起点。

通过在所述DIS接头中存在的限制性内切酶位点内克隆的序列来确定展示盒的内容。当噬菌粒载体没有任何被展示的序列时(“空”载体)，展示盒可以是(图15)：

a)单一缺乏的，两个DIS位点通过共同的限制性内切酶位点的可匹配末端融合为一个；

b)由非必需、非编码DNA序列(通常称为“填充”序列)组成；

c)包含第二个筛选标记的基因(与主链中所包含的不同)，其通过位于5’和3’端两个填充DNA序列与两个DIS接头分隔开。

“筛选标记基因”应意为编码允许对表达所述基因的细胞进行阳性或阴性筛选的蛋白质的基因。在本发明中，基因可以编码例如使转化噬菌粒载体的细菌细胞具有抗生素抗性的蛋白质、帮助维持载体的蛋白质。系统中每个元件(即主链、展示表达盒、和双重展示表达盒)的特异性筛选标记的选择使应用合适筛选标准来分离含有预期噬菌粒载体的细菌成为可能。一般的细菌耐药性基因是赋予氨苄青霉素、四环素、新霉素/卡那霉素、zeocin、或氯霉素抗性的基因。

第一个DNA序列“有效连接”于第二个DNA序列应预期为两个DNA序列连接从而使第一个DNA序列(通常包含非/可调控启动子或其他转录调控位点)可以使(或以可测量的程度修饰)第二个DNA序列(例如基因的完全或部分的开放读码框)转录。有效连接于信号序列的启动子序列的存在和指向DD表达盒的特异性末端使转录方向为由表达盒向pDD主链内部，决定了与允许插入DD表达盒的对称元件相比DD表达盒的功能性不对称性。

可以通过用克隆和/或PCR过程产生的合适DD表达盒取代“空”载体中的展示表达盒从而使用pDD载体展示异源蛋白质序列。

“双重展示表达盒”(DD表达盒)应意为线性DNA片段，其具有与噬菌粒载体的DIS接头中存在的限制性内切酶位点(通常在所述表达盒的剩余部分缺少)相匹配的5’和3’末端，还包含至少一个有效连接于含起始ATG的前导序列的可诱导型或组成型启动子区域，位于线性片段两端之一，并且编码在主链中存在的一个或另一个功能性外壳蛋白质的N-末端展示的蛋白质序列。

如图14所示，DD表达盒通过具有不同功能的DNA片段不对称并接而形成，通常由一个或多个限制性内切酶位点分离开。此种不对称排列导致转录具有从表达盒开始向载体主链的特异性方向。当DD表达盒克隆到pDD载体中时，此转录使编码被展示序列的DNA与pDD载体中编码功能性外壳蛋白质的DNA通过DIS接头相融合。

在实施例中提供了在LacZ启动子和PelB信号序列的控制下用于表达肽和蛋白质的两个DD表达盒，称为Dda表达盒(图17；SEQ ID NO.：11)和DDb表达盒(图18；SEQ ID NO.：12)。特异性表达盒主要是标记基因的类型不同，从而使包含这些序列的载体可以筛选。因此使用抗生素抗性可以筛选克隆，其中pDD载体(或任意其他载体)含有基于可获得抗性的DD表达盒。

功能性前导/信号序列是那些在多种原核基因中鉴定的用于将蛋白质定位于周质空间的序列，例如PelB(来自胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)；在实施例中描述)、MalE4、PhoA4、LamB4和Lpp4。也已鉴定了改良的前导序列(Strobel等人，2003)。

通过前导序列展示的DD表达盒介导的融合蛋白质的表达可能通过(细菌中的组成型或可诱导型的)启动子的存在而实现，该启动子在DD表达盒内，其5’端有效连接于编码所述蛋白质序列的含起始ATG的前导序列。该启动子的5’端与包含一个或多个附加基因的DD表达盒的另一端通过填充DNA序列而分离开。

文献提供了关于如何优化载体设计和培养条件从而促进展示蛋白质表达的可比较的实例，其可以用于使本发明的载体适合于特定用途(“噬菌体展示”：实践方法，266卷，编辑Clackson和Lowman H，Oxford Univ.Press，2004；“噬菌体展示：实验室操作手册”，Burton DR等人，CSHL Press，2001；Corisdeo和Wang，2004；Kirsch等人，2005；Sidhu等人，2000；Benhar，2001；Sidhu，2001；Szardenings，2003；Bradbury和Marks，2004；Hust和Dubel，2004；Mancini等人，2004；Pini等人，2004；Conrad和Scheller，2005；Hust和Dubel，2005；Silacci等人，2005；Smith等人，2005)。

在DIS接头之间或DD表达盒内的填充DNA可以含有另外的DD表达盒中所希望的元件，例如可以影响或不影响克隆和/或展示方法的一个或多个附加基因(即可以自主转录和翻译为蛋白质的DNA序列)。例如，另外的筛选标记基因(与主链中所包含的标记基因不同，如果在克隆前存在，则其存在于空载体的展示表达盒中)可以整合于DD表达盒中，从而可以筛选出含正确DD表达盒的噬菌粒载体。

可选择地，附加基因可以编码丝状噬菌体的另一个不同的功能性外壳蛋白质、修饰细菌细胞代谢或生理学的蛋白质(Bothmann和Pluckthun，1998)、或与通过DIS接头融合于功能性外壳蛋白质的展示蛋白质相互作用或修饰其活性的蛋白质。后者的实例的代表是免疫球蛋白质轻链基因，其一旦在细菌中表达，能够与融合于功能性外壳蛋白质的免疫球蛋白质重链片段形成异二聚体，从而在噬菌体表面形成完全抗原结合位点。通过此方式表达的其他异二聚体的配偶体是那些通常的膜受体蛋白质。然而，DD表达盒中此类附加的完全基因预期从DD表达盒插入的方向自主转录和翻译，尽管它们可以在可诱导启动子系统的控制下表达。

可以在任意类型的载体(包括pDD载体)中产生、克隆、维持和修饰DD表达盒。当DD表达盒克隆到本发明的噬菌粒中或者其插入其他类型的载体中时，可以以不同方式排列在DD表达盒中克隆的元件(Hoet等人，2005；Kirsch等人，2005；Schoonbroodt等人，2005)，并且也可以在细菌中利用基于Cre/Lox的系统改组(Sblattero和Bradbury，2000)。本发明的噬菌粒载体允许构建由可转录和可翻译序列组成的表达单位，从而产生包含载体中存在的两个功能性外壳蛋白质的任一个的融合蛋白质。DD表达盒提供启动子、核糖体结合位点(如需要)、起始密码子和前导/分泌序列，其能够驱动相应的单或双顺反子转录本的表达，在该转录本的3’端具有编码功能性外壳蛋白质的DNA。DD表达盒也包含足够建立异源序列作为可溶蛋白质表达的序列。

术语“启动子”指在该处可以通过RNA聚合酶起始转录的序列。作为范例的原核启动子包括聚合酶结合位点和任选的σ因子位点。启动子可以是组成型的(即始终有活性)或可调控型的(即只在特定条件下有活性)。在大肠杆菌中，启动子长度在30-50个碱基对之间。可调控型启动子可以响应调节的化学药品，例如葡萄糖、乳糖、IPTG、cAMP、色氨酸或其他小分子。启动子可以通过抑制剂和/或激活剂来调控，也可以通过改变培养条件(例如改变温度、pH、营养素等等)来调控。

由于在噬菌粒载体和DD表达盒中DIS接头的限制性内切酶位点对于获得本发明的双向克隆和展示方法具有基本的重要性，应该通过初步测序和/或消化DNA来确定它们的数量，尤其是在DD表达盒中(而且如果需要也在pDD主链中)。在存在不需要的附加位点的情况下，可以使用例如PCR诱变的技术(例如在实施例中所示)来修饰这些位点，而不定性的改变与原始DNA相联系的活性。

可以通过选择其中密码子使用最适合于细菌细胞的DNA序列来优化噬菌粒载体中包含的DNA序列和编码功能性外壳蛋白质、DIS接头或通过功能性展示盒表达的蛋白质的DNA序列(Rodi等人，2002)。一旦检测到正确的异源序列，可以获得用于获得根据表达该序列的生物的密码子适应性和优化的软件和标准，并且所述软件和标准能够帮助选择缺乏限制性内切酶位点的DNA序列，此种DNA序列对于克隆到噬菌粒载体或其他表达载体中可能是危险的(Grote等人，2005)。

由于噬菌粒载体的结构和两个并列于两个DIS接头的功能性外壳蛋白质的相反方向，在空载体(或其他DD表达盒)中可以通过只存在于噬菌粒载体的两个DIS接头和DD表达盒的5’和3’端的限制性内切酶位点来实现用所希望的DD表达盒取代DNA表达盒，所述DD表达盒可以以两个同等可能的方向整合。因此被展示的蛋白质可以通过DIS接头编码的蛋白质序列与所述外壳蛋白质的任一个按读码框连接并表达。

因此，本发明提供从单个空载体和单个DD表达盒开始，产生两个不同的展示噬菌粒载体的方法，该载体可以用于转化细菌细胞培养物。由获得的重组噬菌体的进一步用途而决定，可以适当的维持通过单克隆和转化步骤获得细胞培养物，作为包括含表达任一个融合蛋白质的pDD载体的转化细胞的混合物。可选择地，可以分析在原始混合的细胞培养物中的单克隆(例如通过提取质粒DNA，然后通过DNA测序和/或限制性分析)，来鉴定和繁殖只含有所希望方向的一种或两种类型pDD载体的分离的特定克隆。

而且，在噬菌粒载体(空载体或已经包含DD表达盒的载体)中筛选标记基因的选择和位置允许应用特定培养条件来筛选含所希望噬菌粒载体的细菌克隆。

一旦理解了本发明，即可产生许多种含DD表达盒的噬菌粒载体，其中DD表达盒允许融合于两个功能性外壳蛋白质的任一个的至少一个蛋白质序列的克隆、表达和展示。具体地，插入DD表达盒的模块结构和可选方法允许展示作为通常基于噬菌体展示系统的筛选测定所需要的蛋白质序列的大型文库，其优势在于以单克隆和转化方法产生的单个噬菌体文库中可能在两个不同外壳蛋白质上展示相同的蛋白质。该方法可以很大地增加在噬菌体文库中鉴定相关序列的机会，而不重复目前文献公开的技术中所需的克隆和/或转化步骤，例如重组噬菌体在cp3或cp8中表达融合蛋白质的情况(Kretzschmar和Geiser，1995；Wang等人，1997；Rousch等人，1998；Zwick等人，1998；Adda等人，1999；Verhaert等人，1999；Yip等人，2001；Al-bukhari等人，2002；Jacobsson等人，2003；O′Connor K等人，2005)。因此，通过使用允许DD表达盒双向克隆的噬菌粒载体转化细菌细胞，可以获得改良的噬菌体展示文库和更大水平的多样性。

在此范围，DD表达盒包含用于在信号/前导序列和pDD载体DIS接头中的插入位点之间以正确读码框克隆被展示序列的合适限制性内切酶位点。如果在不同重组噬菌体中多于一个序列被展示(通常发生于肽或抗体的所有组成成分)，那么被克隆的DNA片段组通过此类限制性内切酶位点而连接到DD表达盒中，从而产生相应的双重噬菌粒组(即具有的每个DNA片段有效连接于编码任一个功能性外壳蛋白质的DNA)。如果在已经克隆在pDD载体中的DD表达盒中构建文库(即与特异性功能性外壳蛋白质在相同读码框)，那么此类文库应该用限制性内切酶消化从而在DIS接头内切割，并将其与用提供可匹配末端的酶切割的pDD载体相连接，从而获得所希望的DD表达盒的双向克隆。

“转化的细胞”指包含外源的自复制DNA的细胞，该DNA可以通过任意方法引入(例如电穿孔、化学转化或感染、包括噬菌体感染)。

本发明提供产生噬菌体展示文库的试剂盒和方法，其中通过用于单个DD表达盒的双向克隆的单个噬菌粒载体的使用，和应用单个的、基于DIS接头的克隆和转化步骤，每个存在于文库中的单个蛋白质序列与两个外壳蛋白质的任一个融合。试剂盒可能包括用于DD表达盒双向克隆的唯一噬菌粒载体、或用于产生匹配pDD载体的DD表达盒的载体和引物，并且所述载体和引物允许正确克隆cDNA/基因组、PCR扩增产物、或任意其他编码用功能性外壳蛋白质展示的蛋白质序列的双链合成DNA。

产生细胞或噬菌体文库的方法，其中所述文库的每个蛋白质序列融合于两个功能性外壳蛋白质的任一个的N-末端，包括：

a)在用于DNA双向克隆的噬菌粒载体的相应DNA接头中插入DD表达盒，双向克隆的DNA编码融合在两个功能性外壳蛋白质的任一个N末端的氨基酸序列；和

b)用得到的载体转化细菌细胞。

在用于克隆和表达丝状噬菌体表面的任意特异性氨基酸序列的方法中也应用这些步骤，尤其当希望检测文库中此类氨基酸序列的存在时。

当使用实施例中所希望的DIS接头时，可以通过将用BgII消化并具有可匹配末端的DD表达盒和载体相连接从而插入DD表达盒。

用本发明的载体和方法获得的文库可以使用通常在综述中公开的技术(Mancini等人，2004；Pini等人，2004；Rhyner等人，2004)或在最近的文献中描述的用于选择更合适策略和形式的改进方法(Lou等人，2001；Vanhercke等人，2005)来筛选或“淘选”。

本发明提供新的含噬菌体复制起始区和不依赖噬菌体起始区的噬菌粒载体。噬菌粒不包括一套完整的噬菌体基因，例如用于产生噬菌体颗粒的足够数目的基因。当细胞被携带不存在于噬菌粒中的必需的噬菌体基因的“辅助”噬菌体感染时，含噬菌粒的细胞可以产生含噬菌粒基因组的类噬菌体颗粒。噬菌粒载体需要辅助噬菌体从而可以感染细菌细胞。

除了在实施例中公开的一个辅助噬菌体以外，文献中鉴定了其他合适的辅助噬菌体和细菌培养条件和支持它们使用的大肠杆菌菌株(Rondot等人，2001；Baek等人，2002；Intasai等人，2003；Kramer等人，2003；Soltes等人，2003；Ravn等人，2004)。一般而言，不论DD表达盒以何方向插入，辅助噬菌体都应当支持重组噬菌体的感染和繁殖，除非希望仅一种类型的重组噬菌体感染和繁殖(即展示蛋白质只与特定的功能性外壳蛋白质融合)。

DD表达盒中所包括的序列和通过DIS接头融合于pDD载体中存在的任一个功能性外壳蛋白质N末端的序列可以是与配体或靶分子相互作用的任意目的序列，所述靶分子包括例如抗体(包括例如Fab、ScFV片段，和任意其他表位结合片段或衍生物)、表位、表位结合区、抗原、变应原、生物活性肽、酶、酶抑制剂、酶催化位点、DNA结合蛋白质、分离的蛋白质结构域、受体的配体、受体、生长因子、细胞因子和目的蛋白质序列的邻近或重叠片段。

在被展示蛋白质由两个不同蛋白质序列形成的情况下(例如免疫球蛋白质的重链和轻链的可变区形成的fab)，一个序列被克隆到DD表达盒中与功能性外壳蛋白质融合，而另一个序列通过在DD表达盒内或pDD载体主链中克隆的完整、分离的基因而被克隆和自主表达。

DD表达盒应当使融合于功能性外壳蛋白质的DNA序列被正确转录和翻译，该DNA序列可以是先前从其他载体、cDNA文库、或基因组文库中克隆和/或扩增的，或者是通过化学合成产生的核酸。具体地，DNA应编码有治疗或诊断目的的蛋白质，例如哺乳动物蛋白质，和更优选人类的蛋白质，或人类病原微生物(例如病毒)。编码人类蛋白质的DNA来源可以是任意人类细胞和组织，但是由于噬菌体展示技术在鉴定免疫相关蛋白质(例如抗体或抗原)中的广泛使用，优选的人DNA和cDNA来源是表达具有诊断或治疗目的抗原的细胞(例如癌细胞)或可以从血液、骨髓、扁桃体或癌中分离的产生抗体的细胞(例如浸润肿瘤的淋巴细胞、总体外周血液淋巴细胞、循环的记忆B细胞)。这些细胞可以从特定个体中分离(天然的或暴露于抗原的)，并且可以先通过任意合适标准筛选(例如具有同型IgG的表达抗体的B细胞或表面表达CD27的B细胞)。

根据本发明制备的噬菌粒载体可以用于同时表达大量蛋白质序列，例如那些从细胞或组织衍生的cDNA文库中编码的蛋白质，或融合于两个外壳蛋白质的任一个的噬菌体或细胞文库中编码的蛋白质，其优势在于不同的蛋白质可以以双向克隆方法所确定的两种可能构象而更好的表达和/或更好的展示。而且，可以使用抗外壳蛋白质自身的抗体来检测噬菌体(Dente等人，1994；Bhardwaj等人，1995)。

本发明的载体也可以用于再产生涉及在两个差异缺失的外壳蛋白质之间形成复合物的其他更复杂的策略，其可以通过异源蛋白质序列的相互作用而实现，例如在SIP中(Hennecke等人，1998；Cebe和Geiser，2000)。可选择地，本发明的载体适合产生“景观(landscape)”重组噬菌体(Petrenko等人，2002)，或双功能噬菌体(Gao等人，1999；Chen等人，2004)，其中一种类型的蛋白质序列可以通过任一个功能性外壳蛋白质来展示。

可以用任意适合于噬菌体的筛选方法来筛选根据本发明方法产生的噬菌体文库。例如，可以将噬菌体暴露于可溶或固定的(例如固定在平板或小珠上)纯化抗原、或暴露于整体细胞、组织或动物，从而鉴定黏附于复合结构中存在的靶上的噬菌体，尤其是用于靶鉴定/确认的生理学或治疗学相关部位(例如在体内或体外结合于癌细胞或内皮)。用这些抗原筛选噬菌体可以认为是正筛选(即为了检测结合于特异性配体的分子)或负筛选(即为了排除结合于特定配体的噬菌体)。

然后，可以从细菌细胞中提取所选的噬菌粒载体，其中异源序列被克隆、表达和基于其结合的特异配体而特异性分离，然后将该载体测序、PCR扩增、和/或再克隆到其他合适载体中，例如用于在细菌、植物、酵母或哺乳动物细胞中进行大规模重组生产。

一旦以可以通过功能性双重展示表达盒而正确克隆和表达的形式提供被展示的序列，本发明的载体、方法和文库适合于噬菌体展示的任意已知用途。序列可以衍生自大型cDNA/EST文库，或甚至广泛基因组/蛋白质文库组，这些文库用于鉴定相关开放读码框或蛋白质结构域和序列家族的筛选(Rosander等人，2002；Jacobsson等人，2003；Faix等人，2004)。除抗体以外，当筛选与生物学活性或计算模型的合适测定方法结合时，噬菌体展示技术可以用于检测生物活性肽的筛选(Pastor等人，2004；Falciani等人，2005)。

可以筛选通过噬菌体展示的非随机或随机肽文库来选择表达特异性结合于抗体的肽的噬菌体，从而使噬菌体表达的肽序列基序可以定义为变应原、抗独特型、B或T细胞表位或疫苗(Zhong等人，1997；Davies等人，2000；De Berardinis等人，2000；Goletz等人，2002)。可选择地，“三明治”测定方法是基于只在噬菌体上克隆和表达可变链，同时抗原和一条可变链以可溶形式提供，从而有利于抗原驱动的可变链和重链复合物的稳定性(Watanabe等人，2002)。

在以多种原因进行的选择过程中，可以进一步操作噬菌体。例如在溶液中培养抗体和表达抗原的噬菌体的混合物，并用结合于琼脂糖凝胶小珠的蛋白质G或蛋白质A来沉淀免疫复合物。然后，沉淀的噬菌体可以用于诱导大肠杆菌感染或用于通过ELISA测量相互作用，从而可能通过产生的噬菌斑的数目来定量沉淀的噬菌体(Al-bukhari等人，2002)。

可以通过使用文库所暴露的全部细胞或组织来进行用噬菌体展示技术表达和筛选的蛋白质序列的生物学活性更普遍的测定方法。随后基于其与复合物结构的结合(或不结合)来选择相关的重组噬菌体，复合物结构例如具有特异特征的人细胞表面(包括肿瘤细胞)，从而帮助鉴定新的标记和治疗靶(Edwards等人，2000；Landon和Deutscher，2003；Mutuberria等人，2004；Shukla和Krag，2005)。可选择地，相互作用不仅与噬菌体和细胞的结合相关联，而且与其内化相关联，从而能够鉴定具有此类具有特异活性的细胞的特异性肽或抗体(Legendre和Fastrez，2002；Florea等人，2003Elrick等人，2005)。

与特异性配体的相互作用可以通过应用常用淘选方法来检测，或通过更高级的生物生理学技术来鉴定展示的蛋白质和其结合配偶体之间的相互作用，例如基于荧光的光谱法或显微镜(Lagerkvist等人，2001；Jaye等人，2004)、磷酸酶反应(Han等人，2004)、或其他高通量技术(Paus等人，2003；Rhyner等人，2004；Steukers等人，2006)。一般而言，淘洗方法的成功也依赖于筛选的文库的尺寸，因为正如许多展示抗体片段的文库所显示的，在具有大量的克隆进文库的不同序列中可以找到的对于靶有高度亲和力的蛋白质(Hust和Dubel，2005)。

一般而言，通过本发明的方法获得的重组噬菌体或融合蛋白质可以直接用于结合、检测、中和、和/或改变配体、细胞或靶分子，其中所述重组噬菌体或融合蛋白质是分离的形式或混合物的形式。

作为融合于克隆和排列到根据本发明的噬菌粒载体中的任一个所选外壳蛋白质的蛋白质展示的一个或多个蛋白质序列，一旦根据一个或多个淘选循环被选择出来，那么可以根据本领域已知的方法(例如用限制性内切酶从噬菌粒载体分离、直接测序、和/或通过PCR扩增)分离和表征结合的重组噬菌体和相关DNA序列。随后可以将这些序列转移到更合适的载体中用于进一步在原核或真核宿主细胞中修饰和/或表达，正如许多书和综述中所描述的关于如何克隆和产生重组蛋白质的方法，包括牛津大学出版社出版的具有系列题目“实践方法”的书(″DNA克隆2：表达系统″，1995；″DNA克隆4：哺乳动物系统″，1996；″蛋白质表达″，1999；″蛋白质纯化技术″，2001)。

编码展示和选择的蛋白质序列的DNA序列，一旦被插入到合适的附加型载体或非同源或同源整合型载体中，即可以通过转化它们的合适方法(转化、转染、接合、原生质体融合、电穿孔、磷酸钙沉淀、直接显微注射等等)将其引入到合适的宿主细胞中。选择特定质粒或病毒载体的重要因素包括：含载体的受体细胞更容易从那些不含载体的受体细胞中被识别和选择；在特定宿主中所期望的载体拷贝数；和是否期望能够在不同物种的宿主细胞中“穿梭”的载体。

载体应当允许融合蛋白质在转录起始/终止调控序列的控制下在原核或真核宿主细胞中表达，该调控序列在所述细胞中可选择为组成型活性或可诱导型。随后在此类细胞中基本富集的细胞系被分离而成为稳定细胞系。对于真核宿主(例如酵母、昆虫或哺乳动物细胞)，依赖于宿主的本性，可以使用不同的转录和翻译调控序列。它们可以衍生自病毒来源，例如腺病毒、牛乳头状瘤病毒、猿猴病毒等等，其中调控信号与高水平表达的特定基因相关联。实例是疱疹病毒的TK启动子、SV40早期启动子、酵母gal4基因启动子等等。选择允许抑制和激活的转录起始调控信号，从而使基因的表达可以被调控。也可以通过引入允许选择含表达载体的宿主细胞的一个或多个标记来选择被所引入的DNA稳定转化的细胞。标记也可以是为营养缺陷型宿主提供光营养、杀虫剂抗性(例如抗生素)、或重金属(例如铜)等等。可选择的标记基因可以直接连接于要表达的DNA基因序列，或通过共转染被引入相同的细胞中。为了优化表达也需要附加的转录调控元件。

宿主细胞可以是原核或真核的。优选的是真核宿主，例如哺乳动物细胞，例如人类、猴子、小鼠、昆虫(使用基于杆状病毒的表达系统)和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，因为它们可以提供蛋白质分子的翻译后修饰，包括正确折叠或在正确位点糖基化。酵母细胞也可以进行翻译后肽修饰，包括糖基化。可以利用许多使用强启动子序列和高拷贝数质粒的重组DNA策略在酵母中产生所希望的蛋白质。酵母在克隆的哺乳动物基因产物中识别前导序列，并分泌具有前导序列的肽(即前体肽)。对于重组多肽的长期、高产量生产，优选能够稳定表达的。例如，用表达载体转化稳定表达目的多肽的细胞系，该载体可以包含病毒复制起始点和/或内源表达元件，并在相同或分开的载体上含有可选择的标记基因。引入载体以后，细胞在富集培养基中生长1-2天，然后换成选择性培养基。可选择标记的目的是赋予选择抗性，其存在允许成功表达引入序列的细胞生长和恢复。可以利用适合于细胞类型的组织培养技术来增殖稳定转化细胞的抗性克隆。随后在此类细胞中基本富集的细胞系被分离以提供稳定细胞系。

可获得的作为表达宿主的哺乳动物细胞是本领域公知的，包括许多可从美国模式培养物保藏所(ATCC)获得的无限增殖细胞系，包括(但不限于)中国仓鼠卵巢(CHO)、海拉细胞(HeLa)、幼仓鼠肾(BHK)、猴肾(COS)、C127、3T3、BHK、HEK 293、Per.C6、Bowes黑色素瘤和人肝细胞癌(例如Hep G2细胞和许多其他细胞系。在杆状病毒系统中，杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料是商业上可以试剂盒形式获得的(例如英杰(Invitrogen)的商品)。

对于噬菌体表达免疫球蛋白质可变链的情况，尤其是人类免疫球蛋白质可变链，一个重要的修饰是将选择的Fab或scFV转变为具有优选同种型和恒定区的完全免疫球蛋白质。此类修饰允许例如从噬菌体展示文库衍生的单链Fv或Fab产生以所有同种型构建的完全人类单克隆抗体，并在哺乳动物或昆虫细胞中表达(Ames等人，1995；Mahler等人，1997；Persic等人，1997；Boel等人，2000；Liang等人，2001；Guttieri等人，2003)。随后可以在其他载体中克隆和表达用本发明的载体和方法筛选的蛋白质，例如使其融合于其他展示支架(例如麦芽糖结合蛋白质)(Zwick等人，1998)，或者使它们不作为分离的重组蛋白质形式、而是作为重组蛋白质混合物的形式表达和选择(Sharon等人，2005；Meijer等人，2006)。对于根据本发明展示和选择的肽(和低于100个氨基酸的蛋白质)，这些序列是很短的，足以用化学合成技术产生，例如固相合成和液相合成。例如，对于固相合成，相应于合成肽的羧基末端的氨基酸结合于有机溶剂中的不可溶的支持物上，并且通过交替反复的反应，以合适的保护基团保护的氨基基团和侧链功能基团按从羧基端到氨基端的顺序一个接一个的聚集，并释放结合树脂的氨基酸或肽的氨基基团的保护集团，从而以此方式使肽链得以延伸。纯化的肽也可以包括在合成过程中引入的其他化学基团，或者它们可以进一步被修饰形成树状聚体(dentrimer)(Pini等人，2005)。

可以通过任意已知方法纯化重组蛋白质，即任意常规方法，包括抽提、沉淀、层析、电泳等等。纯化本发明的蛋白质优选使用的另外纯化方法是用单克隆抗体或亲和基团进行的亲和层析，此类抗体和基团可结合靶蛋白质，并且其被产生和固定于柱中所包含的凝胶基质上。使含蛋白质的不纯制品通过该柱。此过程中，蛋白质会通过肝素、蛋白质A、蛋白质G、或特异性抗体结合于柱上。清洗以后，通过改变pH或离子强度将蛋白质从凝胶上洗脱下来。可选择地，可以使用HPLC(高效液相色谱法)。用蛋白质纯化中常用的基于水-乙腈溶剂来进行洗脱。

通过本发明的方法鉴定的噬菌体展示蛋白质序列可以有几种其他用途，例如免疫检测、研究T细胞/MHC相关活性(Matsushita等人，2001；Zhao等人，2001；Kurokawa等人，2002；Li等人，2005)、和生物活性抗体或蛋白质的B或T细胞表位作图(Bugli等人，2001；Dromey等人，2004；DiNiro等人，2005)。根据本发明的方法产生的组合文库也可以用于蛋白质工程，即通过在各个噬菌体中表达蛋白质的序列变体，然后筛选噬菌体从而鉴定那些表达与受体、配体、抗原或酶底物具有更高亲和力的融合蛋白质变体的噬菌体(Heinis等人，2001；Schooltink和Rose-John，2005)，也检测防护性或致病性的人抗体(Ditzel，2000)。噬菌体展示技术也用于表征识别非蛋白质靶的蛋白质，这些靶包括例如脂肪酸(Gargir等人，2002)、植物激素(Suzuki等人，2005)、DNA(Nilsson等人，2000)、或聚糖(van de Westerlo等人，2002；Ravn等人，2004)。

实施例描述构建体的设计和使用编码两个外壳蛋白质(cp3和cp8)的DNA序列建立本发明的噬菌体展示技术的实验，该DNA序列用含稀有限制性内切酶切割位点和基于Gly4Ser序列的DIS接头2扩增和在N末端突变。产生分别表达N-末端修饰的cp3和cp8蛋白质(cp3^＊和cp8^＊)的噬菌粒载体。并产生正确表达融合在编码cp3^＊或cp8^＊的DNA序列N末端的异源序列(肽或人Fab)的细胞和重组噬菌体。修饰的噬菌体蛋白质-肽融合蛋白质的表达并不影响噬菌体的产生、组装和感染力。确认该系统证明基于融合肽和抗体的结合特性进行的表达修饰蛋白质的噬菌体的亲和筛选是有效的，显示在周质空间中Fab分子的正确组装。

以DIS接头修饰的外壳蛋白质序列可以以合适的方向插入到pBluescript衍生的支架中。这一基本pDD载体与含被展示序列(肽或抗体可变区)的DD表达盒和抗生素抗性标记相连接，从而选择重组pDD载体，其中这些序列被融合在两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端。

本发明的其他特征和优势通过下面详述的实施例而更明显地说明。本发明的附加的实施方案可以包括此处所述特征的任意组合。所有参考文献、未发表和已发表的专利申请的内容都在本说明书中清楚地引用作为参考。

实施例

实施例1：DNA序列的制备和表达，所述DNA序列是DIS接头2修饰的并且编码用于展示蛋白质和肽的丝状噬菌体外壳蛋白质3(cp3^＊)

a)材料和方法

M13辅助双链DNA的产生

以商业上可获得的M13辅助噬菌体(VCSM13，斯彻特基因(Stratagene)，La Jolla，CA)为来源分离双链复制型DNA。50μl携带F’附加体的细菌菌株培养物(大肠杆菌XL1Blue，斯彻特基因(Stratagene)，LaJolla，CA)与1×10¹¹噬菌体颗粒混合于2ml LB培养基中。混合物在37℃持续搅动培养4-5小时。然后将混合物在12,000×g离心5分钟以沉淀被感染的细菌。除去上清以后，将细菌沉淀用肯强(Qiagen)小量制备试剂盒进行标准DNA提取，并以1％琼脂糖凝胶电泳分析。

编码DIS接头2N末端修饰的cp3蛋白质(cp3^＊蛋白质)的基因的产生

用引物cp3^＊FW和cp3^＊RW(SEQ ID NO.：13和SEQ ID NO.：14；表I)进行产生编码cp3^＊基因的PCR反应。根据制造商说明书，以50pg模版DNA和300mM各引物用高保真延伸(罗氏(Roche))进行PCR扩增。所用的PCR条件是：95℃ 2分钟(1个循环)；95℃ 20秒，63℃ 30秒，72℃ 40秒(35个循环)。PCR扩增之后，向PCR反应体系中加入2.5单位的AmpliTaq聚合酶(Applied Biosystems，Foster City，CA)，在72℃再培育20分钟，从而以不依赖于模板的形式向扩增片段的3’端添加单个脱氧腺苷。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，并用凝胶提取试剂盒(肯强(Qiagen))纯化。

然后根据制造商说明书，通过在3’端添加的单个脱氧腺苷将cp3^＊基因连接到pGEM T-Easy载体(普洛麦格(Promega))中。用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH5α细胞。一天以后，挑取10个白色克隆，接种于4mlLuria-Bertani(LB；“分子克隆：实验室手册”，Sambrook等人，Cold SpringHarbor Press，Ny，1989)培养基中，并于37℃连续搅拌培养过夜。一天以后，将2ml细菌悬浮液使用小量制备肯强(Qiagen)试剂盒进行质粒DNA提取/纯化。然后通过限制性内切酶分析携带cp3^＊基因的pGEM T-Easy质粒。选择一个克隆并进行测序，从而证实编码cp3^＊的基因的核苷酸序列正确，和鉴定在核苷酸序列中的A₅₂₃到G₅₂₃突变产生氨基酸Ser₁₇₅被Gly₁₇₅取代。

基本pRIB载体

基本pRIB载体包含存在于pBluescript IISK(+)载体(斯彻特基因(Stratagene)，基因库登录号X52328)中的元件，包括噬菌体复制起点(F1(+)；3-459碱基对)、质粒复制起点(ColE1；1032-1972碱基对)和氨苄青霉素抗性基因(Amp^r，1975-2832碱基对)。

在该载体包含的表达盒中包括另外三个元件。第一个元件包含LacZ操纵子的启动子(SEQ ID NO.：23)、含ATG的前导序列PelB(SEQ ID NO.：24和SEQ ID NO.：25)、和允许插入编码蛋白质序列(例如免疫球蛋白质轻链)的DNA的SacI-XbaI克隆位点，插入序列与前导序列(PelB，在5’端)读码框一致，并且作为末端有终止密码子的片段被克隆。第二个元件是氯霉素抗性基因(CAT)。第三个元件包含Lac Z操纵子的启动子(SEQ ID NO.：23)、含ATG的前导序列PelB、允许插入编码蛋白质序列(例如免疫球蛋白质重链可变区)的DNA的XhoI-SpeI克隆位点，插入序列与前导序列(PelB，在5’端)读码框一致，并且具有编码功能性外壳蛋白质(例如cp3^＊)的包括终止密码子的DNA序列和使用SpeI-NheI克隆位点被克隆。在空载体中，SacI-XbaI、SpeI-NheI、和XhoI-SpeI克隆位点通过具有可匹配末端的DNA填充片段而分离，该片段在克隆步骤中被替换。例如通过连接具有可匹配此类限制性内切酶位点的单链末端的两个寡核苷酸(LC填充FW和LC填充RW；SEQ ID NO.：26和SEQ ID NO.：27；表I)退火形成的合成片段，可以在SacI-XbaI克隆位点插入填充DNA序列。

表达cp3^＊和相关融合蛋白质的pRIB1载体的构建

使用pRIB基本载体构建pRIB1-cp3^＊载体，其中将从pGEM-T Easy上切下的编码cp3^＊的SpeI-NheI片段连接在上述的SpeI-NheI克隆位点。连接混合物用于转化电感受态的大肠杆菌DH5α细胞。一天以后，挑取10个菌落，接种于4ml LB培养基中，并于37℃连续搅拌培养过夜。一天以后，将2 ml细菌悬浮液使用小量制备肯强(Qiagen)试剂盒进行质粒DNA提取/纯化。然后通过限制性内切酶分析携带修饰的cp3^＊基因的质粒，从而验证cp3^＊的方向正确。

从pRIB1-cp3^＊开始构建pRIB1-HAcp3^＊载体，经XhoI和SpeI双重消化，并连接于编码流感病毒血凝素(HA标签序列为YPYDVPDYA)表位的双链合成DNA序列，且该DNA序列具有XhoI和SpeI可匹配末端。通过将寡核苷酸(HA标签接头FW和HA标签接头RW；见表I中的序列；SEQID NO.：17和SEQ ID NO.：18)以1μM浓度混合并于95℃变性5分钟从而获得HA标签接头。将寡核苷酸混合物转移到95℃预热的水中，并使其冷却到室温从而获得特异性退火。用由XhoI-SpeI双重消化的pRIB1-cp3^＊和HA标签接头组成的连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH5α细胞。一天以后，挑取10个菌落，接种于4ml LB培养基中，并于37℃连续搅拌培养过夜。一天以后，将2ml细菌悬浮液使用小量制备肯强(Qiagen)试剂盒进行质粒DNA提取/纯化，然后通过限制性内切酶分析来验证HA标签的存在。一个克隆显示所希望的特性，即具有与cp3^＊按读码框融合的HA标签，选择该克隆并用于表达实验。

用编码人单克隆重组Fab(称为e44，但是与e8一致)的重链和轻链的DNA序列来构建pRIB1-e44cp3^＊载体，所述重组Fab以其对丙型肝炎病毒E2蛋白质的亲和力而从噬菌体展示文库中分离出来(Burioni等人，1998b)。分别用XhoI-SpeI和XbaI-SacI克隆位点将e44的重链和轻链克隆到pRIB1-cp3^＊中。转化的大肠杆菌显示所希望的特性，即具有与cp3^＊按读码框融合的e44重链和在XbaI-SacI位点之间克隆的e44轻链，将其用于表达实验。用非修饰的cp3序列(没有DIS接头2)以相同的方式构建对照载体(pRIB-e44cp3)。

基于文献中可获得的噬菌粒(Burioni等人，1997；Burioni等人，1998)产生编码cp3的对照pRIB质粒，具有或没有融合于N末端的fab(e44)或肽(HA标签)(和命名为pRIB-cp3、pRIB-HAcp3、pRIB-e44cp3)。

用基于pRIB1-cp3^＊的质粒分析HAcp3^＊和e44cp3^＊的表达

将合适的大肠杆菌XL1Blue克隆(含pRIB1-cp3^＊、pRIB1-HAcp3^＊、pRIB1-e44cp3^＊或pRIB1-e44cp3)接种于10ml含氨苄青霉素(100μg/ml)的超级培养基中(SB；“分子克隆：实验室手册”，Sambrook等人，Cold SpringHarbor Press，NY，1989)，在37℃旋转振荡培养8小时。在此点向生长中的细菌加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG，1mmol/L；西格玛(Sigma)，Saint Louis，MI)，再于30℃培养过夜。然后通过离心收集细胞，重悬于1ml磷酸盐缓冲液中(PBS；“分子克隆：实验室手册”，Sambrook等人，ColdSpring Harbor Press，NY，1989)，并进行冻融过程(37℃和-80℃3个循环，每个步骤15分钟)。在微量离心机中以15000g室温离心沉淀细胞碎片，上清用于定量蛋白质含量。将20μg总蛋白质上样于12％丙烯酰胺凝胶(“分子克隆：实验室手册”，Sambrook等人，Cold Spring Harbor Press，NY，1989)，通过电泳分离。将分离开的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上，然后膜用含10％牛奶的PBS/0.1％吐温-20(西格玛(Sigma))封闭1小时。然后洗膜，并将其以1∶1000稀释的抗HA标签抗体(HA.11，Covance)、或1∶10000稀释的结合于辣根过氧化物酶的山羊抗人Fab(HRP，西格玛(Sigma))在含5％牛奶的PBS/0.1％吐温-20中培育。再培育1小时，用PBS/0.1％吐温-20洗膜3次。为检测Fab，膜直接用Supersignal West Pico化学发光底物(皮尔斯(Pierce))进行增强的化学发光检测。为了检测HA标签，再将膜以结合于辣根过氧化物酶的抗小鼠抗体(1∶1000稀释)在PBS/0.1％吐温-20中培育1小时。用PBS/0.1％吐温-20洗膜3次，然后用Supersignal West Pico化学发光底物(皮尔斯(Pierce))进行增强的化学发光检测。

b)结果

通过PCR扩增而修饰编码cp3的天然M13基因序列，从而截短N末端并掺入具有SpeI和SfiI限制性内切酶位点(在5’端，编码12个氨基酸序列)和在终止密码子之后的NheI限制性内切酶位点(在3’端，图1)的DIS接头2。该变体也已知为BAC76618，并含有肠杆菌噬菌体M13的cp3蛋白质(SWISSPROT登录号P69168)的216-424氨基酸，其缺乏原始信号序列和附加N末端结构元件，但是它仍然能够呈现正确的融合蛋白质，正如在用于此范围内的噬菌粒如pFCAH-E8d(基因库登录号AB096107)中所示。

所获得的编码N末端修饰的cp3(cp3^＊)的PCR产物编码cp3^＊蛋白质(221个氨基酸；图2)，随后将其连接到pGEM T-Easy中并测序。扩增的片段在核苷酸序列中包含A₅₂₃到G₅₂₃的突变，其产生Ser₁₇₅被Gly₁₇₅取代，在本专利说明书中测试发现其不影响蛋白质定位或活性。

基本pRIB载体包含存在熟知的pBluescript II SK(+)载体中足够质粒和噬菌体复制的元件，和抗生素抗性基因。该载体还包含具有附加标记基因(氯霉素抗性基因)的表达盒和两个转录单位。两个转录单位都包括lac操纵子的启动子、含ATG的前导序列PelB和允许插入编码蛋白质序列的DNA的特异性克隆位点。具体地，一个此类位点允许融合用于在重组噬菌体表面表达异源蛋白质序列的编码功能性外壳蛋白质的DNA序列(例如cp3^＊)。

获得的pRIB1-cp3^＊随后用于产生一系列pRIB1载体，其中编码已表征的肽抗原(HA标签)或人Fab(称为e44并且其表征为结合丙型肝炎病毒E2)(Burioni R等人，1998a)的DNA序列与cp3^＊按读码框融合(图3)。获得的载体pRIB1-HAcp3^＊和pRIB1-e44cp3^＊(图4)随后与相应的对照噬菌粒pRIB1-cp3^＊和pRIB-e44相比较，用于表征应用于噬菌体展示的cp3^＊的特性。

通过以含pRIB1-cp3^＊、pRIB1-HAcp3^＊、pRIB-e44cp3或pRIB1-e44cp3^＊的细菌克隆制备的总蛋白质提取物的Western印迹和用抗HA标签(图5A)或抗人Fab(图5B)抗体分析，来验证基于cp3^＊的融合蛋白质的表达。Western印迹显示HA标签和e44 fab都在细菌中正确表达为用pRIB1-cp3^＊载体与cp3^＊形成的融合蛋白质。

c)结论

以DIS接头2修饰的cp3蛋白质序列(cp3^＊)可以在噬菌粒载体中被克隆和表达，从而允许基于cp3^＊的融合蛋白质在细菌中正确表达。

实施例2：DIS接头2修饰的DNA序列的制备和表达，该DNA序列编码用于展示蛋白质和肽的丝状噬菌体外壳蛋白质8(cp8^＊)

a)材料和方法

编码DIS接头2N末端修饰的cp8蛋白质(cp8^＊蛋白质)的基因的产生，表达基于cp8^＊的融合蛋白质的相关载体，和它们的分析

从商业上可获得的M13辅助噬菌体开始产生cp8^＊，克隆策略与实施例1中关于cp3^＊的策略相同。用引物cp8^＊FW和cp8^＊RW(SEQ ID NO.：15和SEQ ID NO.：16；表I)进行PCR反应。所用的PCR条件是：95℃2分钟(1个循环)；95℃20秒，63℃30秒，72℃40秒(35个循环)。根据制造商说明书用高保真延伸(罗氏(Roche))进行PCR扩增。使用的DNA模板(从VCSM13获得)和引物浓度与在cp3^＊PCR扩增中所述相同。PCR扩增之后，向PCR反应体系中加入2.5单位的AmpliTaq聚合酶，在72℃再培育20分钟。PCR产物在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，并用凝胶提取试剂盒(肯强(Qiagen))纯化。

然后将修饰的cp8^＊基因连接到pGEM T easy载体中。然后通过限制性内切酶分析并测序，从而证实cp8^＊序列正确。

将用SpeI-NheI消化的pRIB1-cp3^＊与用SpeI-NheI消化从而从pGEM-T Easy上切下的cp8^＊片段连接，构建pRIB2-cp8^＊载体。如实施例1中所示使用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH5α细胞。然后用与上述pRIB1-HAcp3^＊和pRIB1-e44cp3^＊相同的克隆策略，也从pRIB2-cp8^＊产生pRIB2-HAcp8^＊和pRIB2-e44cp8^＊。

如上述HAcp3^＊和e44cp3^＊所述对总细胞提取物进行Western印迹检测HAcp8^＊和e44cp8^＊。

b)结果

以DIS接头2修饰cp8的N末端和产生相关噬菌粒的方法与修饰cp3所用方法相同(见实施例1)。该变体含有肠杆菌噬菌体M13的cp8蛋白质(SWISSPROT登录号P69541)的24-73氨基酸，其仅缺乏原始信号序列。通过PCR扩增来修饰编码cp8的M13基因序列(cp8^＊，62个氨基酸：图6A)，产生的PCR产物(图6B)随后用于构建pRIB2-cp8^＊载体和克隆了含HA标签(图7)或人Fab e44的基于cp8^＊融合蛋白质的一系列载体。

与基于cp3^＊的融合蛋白质类似，通过以含pRIB2-HAcp8^＊、pRIB2-e44cp8^＊或没有任何噬菌粒载体的细菌克隆制备的总蛋白质提取物的Western印迹和用抗HA标签(图8A)或抗人Fab(图8B)抗体分析，来验证基于cp8^＊的融合蛋白质的表达。Western印迹显示HA标签和e44 Fab都作为用pRIB2-cp8^＊载体形成的具有cp8^＊的融合蛋白质在细菌中正确表达。

c)结论

可以在噬菌粒载体中克隆和表达以DIS接头2修饰的cp8蛋白质序列(cp8^＊)，从而使能够在细菌中正确表达基于cp8^＊的融合蛋白质。

实施例3：展示融合于肽或抗体的cp3^＊或cp8^＊的噬菌体的功能验证

a)材料和方法

噬菌粒的扩增

下面的方法按文献所述实行(分子克隆：实验室手册”，Sambrook等人，Cold Spring Harbor Press，NY，1989)。用电穿孔法(0.2cm大肠杆菌脉冲杯，2.5Kv)将50ng噬菌粒载体(pRIB1-cp3、pRIB-HAcp3、pRIB-e44cp3、pRIB1-cp3^＊、pRIB1-HAcp3^＊、pRIB1-e44cp3^＊、pRIB2-cp8^＊、pRIB2-HAcp8^＊或pRIB2-e44cp8^＊)转化到电感受态大肠杆菌XL1-Blue细胞中。

立刻于室温用1ml和随后2ml的SOC培养基(氯化钠0.5g/L、胰蛋白质胨20.0g/L、酵母提取物5.0g/L、KCl 2.5mMol，用NaOH调节pH到7.0：高压灭菌以后，在使用前1升培养基加入5ml的2 M MgCl₂灭菌溶液和20ml的1M灭菌葡萄糖溶液)冲洗各杯。将3ml培养物转移到50ml聚丙烯管中，在37℃以250rpm振动培养1小时。从各培养物中取出1μl和10μl计算转化效率：将它们涂于添加氨苄青霉素(Amp；100μg/ml)和四环素(Tet；10μg/ml)的LB琼脂平板上，平板于37℃培养过夜。将各管中剩余的内含物转移到含20ml SB的瓶中，其中添加4μl低浓度Amp(20μg/ml)和40μl Tet(10μg/ml)，在37℃以250rpm振动培养1小时。各培养物再在100ml SB+50μl高浓度Amp(50μg/ml)+200μl的Tet(10μg/ml)中37℃培养1小时。

辅助噬菌体超感染

向各液体培养物中加入VCSM13辅助噬菌体(斯彻特基因(Stratagene)，10¹²空斑形成单位[pfu])，再于37℃以250rpm振动培养2小时。加入卡那霉素(70μg/ml)并于30℃以250rpm振动培养过夜。

聚乙二醇(PEG)介导的噬菌体沉淀

来自各个培养物的50ml细菌通过离心进行沉淀，在JA10转子(Beckman)中于4℃以4000rpm(2700g)离心30分钟。将各个上清转移到含10ml 20％PEG(聚乙二醇，wt 8000；西格玛(Sigma))/2.5M NaCl溶液的新管中。轻轻翻转管子3-4次使溶液充分混合。然后将混合物在冰上培育至少30分钟。于4℃以15000rpm离心40分钟来沉淀各个噬菌体样品。除去上清，小心不要搅动沉淀。残余的上清用1ml吸管吸去。将沉淀重悬于1ml的1％BSA/PBS(1g的牛血清白蛋白质溶解于100ml PBS中并调节pH到pH7.4)中，并转移到1.5ml管中。

用重悬噬菌体感染XL-1 Blue细胞

将大肠杆菌XL1-Blue的一个克隆接种于含有添加Tet(10μg/ml)的30ml SB的100ml瓶中，于37℃培养。用1μl各个噬菌体(1∶100稀释)(iii)感染在中间对数期(OD₆₀₀＝≈0.6)的2ml细菌培养物，和在37℃振动培养细胞20分钟。用SB将各个感染的培养物补至10ml(ii)，和以1∶1000稀释(i)。将从各培养物中取出10μl和100μl涂于添加Amp(100μg/ml)和Tet(10μg/ml)的LB琼脂平板上。平板于37℃培养过夜。

噬菌体CFU的测定

当菌落为最佳大小时(在平板上清楚可见)，计数并用公式(I)计算cfu/μl：

(计数的菌落/平板体积)×10³(i)×10⁴(ii)×10²(iii)

噬菌体-抗原结合测定

96孔高结合能力ELISA平板(Costar)的两组孔用0.3μg不同测试蛋白质包被：商业化鼠抗HA标签单克隆抗体(HA.11，Covance；溶解于25μlPBS)，或按文献所述(Lesniewski等人，1995)制备的重组E2蛋白质溶于ECB缓冲液(Env包被缓冲液，0.1M碳酸氢钠，pH8.6)。通过加入50μl的1％BSA/PBS来制备阴性对照孔。平板在4℃培养过夜。加入180μl1％BSA/PBS并在37℃培育2小时来阻断包被反应。从每个ELISA平板孔中吸去BSA/PBS溶液，各孔加入70μl重悬的噬菌体(用上述提供的产生噬菌粒载体pRIB1-HAcp3^＊、pRIB1-e44cp3^＊、pRIB2-e44cp8^＊、pRib2-HAcp8^＊的方法产生)，平板在37℃培养2小时。吸出孔中的内含物转移到分离的管中(称为输入量(INPUT))，并于4℃储存。用56℃预热的PBS/吐温-20(PBS含0.5％(体积比(v/v))吐温-20，西格玛(Sigma))洗平板10次。然后每个孔用50μl淘选洗脱缓冲液(0.1M HCl pH2.2)洗脱。将具有相同抗原的孔中的内含物混合(称为排出量(OUTPUT))并转移到含12μl淘选中和缓冲液(1M Tris碱，pH9.1)的干净管中。

收集的样品组：

第1组：

pRIB1-HAcp3^＊抗HA抗体排出量

pRIB2-HAcp8^＊抗HA抗体排出量

pRIB1-HAcp3^＊抗BSA排出量

pRIB2-HAcp8^＊抗BSA排出量

pRIB1-HAcp3^＊抗E2排出量

pRIB2-HAcp8^＊抗E2排出量

第2组：

pRIB1-e44cp3^＊抗E2排出量

pRIB-e44cp3抗E2排出量

pRIB1-e44cp3^＊抗BSA排出量

pRIB-e44cp3抗BSA排出量

第3组：

pRIB-e44cp3抗E2排出量

pRIB2-e44cp8^＊抗E2排出量

pRIB-e44cp3抗BSA排出量

pRIB2-e44cp8^＊抗BSA排出量

在中间对数期(OD₆₀₀＝≈0.6)，以上述输入量和排出量的噬菌体感染的细菌培养物的2 ml用来定量输入量和排出量噬菌体。感染的细胞在37℃振动培养20分钟。用所有排出量和1μl输入量(1∶100稀释)(iii)感染细胞。用SB将各个感染的培养物补至10ml(ii)，和将如下体积的各培养物涂布于添加Amp(100μg/ml)和Tet(10μg/ml)的LB琼脂平板上：1∶1000(i)稀释的10μl和100μl输入量感染的培养物，不稀释的1μl和10μl排出量感染的培养物。平板在37℃培养过夜。

当菌落为最佳大小时，计数并用如下公式(II)计算输入量噬菌体的cfu/μl：

(计数的菌落/平板体积)×10³(i)×10⁴(ii)×10²(iii)

计数排出量噬菌体的最佳大小的菌落并用如下公式(III)计算噬菌体的cfu/μl

(计数的菌落/平板体积)×10⁴(ii)

b)结果

通过表达基于cp3^＊或cp8^＊的融合蛋白质的重组噬菌体感染细胞和展示异源蛋白质进行效率的比较分析。

对于两种转化反应(用相应阳性对照、基于cp3的载体)，所有实验中的电穿孔效率都相同。以pRIB1-cp3^＊、pRIB1-HAcp3^＊和pRIB1-e44cp3^＊载体获得的cfu/μl值与阳性对照噬菌体相同，证明在cp3^＊中的序列修饰并不影响噬菌体正确组装，从而使噬菌体蛋白质能够正确表达(图9)。此证据也通过基于pRIB2的载体证实(图10)。

当用固定于ELISA平板上的特异性结合剂(例如抗体或病毒蛋白质)淘选基于cp3^＊或cp8^＊的噬菌体时，进行另一个用于评估富集和选择的功能测定。

用商业化的抗HA标签的单克隆抗体相对于阴性对照蛋白质(BSA；HCV的E2蛋白质)获得的pRIB1-HAcp3^＊和pRIB2-HAcp8^＊噬菌体的高度富集，证明具有融合于cp3^＊或cp8^＊的HA标签的噬菌体能够正确展示肽，并能用特异性结合剂对其进行有效选择(图11)。

用HCV的E2蛋白质(由e44 Fab特异性识别的抗原)可以获得类似水平的pRIB2-e44cp3^＊或pRIB1-e44cp8^＊噬菌体的富集，再次证实噬菌体能够正确展示抗体，并能用正确抗原有效筛选(图12)。当与对照抗原(BSA)相比时，表达e44cp3^＊的噬菌体显示与表达e44cp3的噬菌体相当的针对特异性抗原的选择性，而e44cp8^＊则效率较低，可证明是由于在高价cp8蛋白质上表达的其他fab观察到的已知的非特异结合效应。

c)结论

表达cp3^＊和cp8^＊的噬菌粒载体可以用于在重组噬菌体表面展示蛋白质和鉴定特异性结合剂，包括肽和抗体片段。

实施例4：pDD-cp3^＊cp8^＊和与其相容的DD表达盒的构建

a)材料和方法

pDD-cp3^＊cp8^＊主链的构建

尽管SfiI可以低效切割其在DIS接头2中的单个位点，也可以用识别SfiI中心序列(GCCnnnnnGGC；见图13A)的其他限制性内切酶如BglI来将载体线性化。

然而，因为在pBlueScript II(SK+)已经存在两个其他BglI位点，所以pBlueScript II(SK+)原始序列要用2组引物经过两轮定向诱变来修饰，引物称为Mut BglIA FW和RW(SEQ ID NO.：28和SEQ ID NO.：29；表I)和Mut BglIB FW和RW(SEQ ID NO.：30和SEQ ID NO.：31；表I)，从而除去两个存在于原始DNA序列中的BglI位点。通过删除含在PvuII和SapI限制性内切酶位点之间含有MCS和LacZ序列的0.5 kb片段，并在这些位点之间连接通过两个寡核苷酸(pDD接头FW和pDD接头RW；SEQID NO.：32和SEQ ID NO.：33；表I)退火获得的携带可匹配末端(一端为平头，另一端为具有AGC序列的单链5’末端)的合成接头，来修饰得到的载体(pBS-deltaBglI)。于4℃培养过夜以后，10μl连接混合物用于转化大肠杆菌XL-1 Blue感受态细胞。一天以后，挑取10个菌落用于小量制备DNA提取，从而确定合成接头的存在。选择一个显示正确限制性模式的克隆，测序，并命名为pBS-DDdeltaBgl。

使用该噬菌粒产生pDD-cp3^＊cp8^＊主链。在此范围用EcoRI和NheI消化pBS-DDdeltaBgl，并与称为pDD接头2的合成接头(SEQ ID NO.：34)相连接，该接头携带相关限制性内切酶位点(尤其SpeI)和可匹配末端。通过pBlueScript II的PCR扩增产生合成的pDD接头2，所用引物为pDD接头2 FW和RW(SEQ ID NO.：35和SEQ ID NO.：36；表I)。PCR扩增以后，用EcoRI和NheI消化pDD接头2，并克隆到pBS-DDdeltaBgl中。获得的连接混合物在4℃培养过夜，然后用于转化大肠杆菌XL-1 Blue细胞。一天以后，挑取10个菌落用于小量制备DNA提取，从而确定携带SpeI位点的pDD接头2正确插入。

使用这样的质粒(称为pBS-DDdeltaBgl2)产生pDDcp3^＊cp8^＊，使用从pRIB1-cp3^＊和pRIB2-cp8^＊获得的编码cp3^＊和cp8^＊的DNA序列，但是先通过定位诱变修饰而除去不需要的限制性内切酶位点。事实上，除在SfiI位点中的BglI位点以外，原始存在于这些序列中的DIS接头2包含BglI限制性内切酶位点，但并不改变编码的氨基酸(甘氨酸)。在cp3^＊和cp8^＊中用引物deltaBgl接头FW和RW(SEQ ID NO.：37和SEQ ID NO.：38；表I)除去C到A的取代(在DIS接头2的27位点，SEQ ID NO.：2)，从而产生的现称为cp3^＊dBgl(SEQ ID NO.：39)和cp8^＊dBgl(SEQ ID NO.：40)的编码cp3^＊和cp8^＊的DNA。另外，在cp8^＊dBgl的5’端用引物cp8^＊FW new和cp8^＊RW(SEQ ID NO.：39和SEQ ID NO.：40；表I)插入一个EcoRI。

pBS-DDdeltaBgl2质粒首先用SpeI和NheI消化，然后与携带可匹配末端的cp3.^*dBglI片段连接。获得的连接混合物在4℃培养过夜，然后用于转化大肠杆菌DH5α细胞。一天以后，挑取10个菌落用于小量制备DNA提取，从而确定cp3^＊dBgl正确插入。然后用EcoRI和SpeI消化从一个阳性克隆提取的质粒，并与携带可匹配末端的cp8.^*dBglI片段连接。一天以后，挑取10个菌落用于小量制备DNA提取，从而确定cp8^＊dBgl正确插入，产生pDD-cp3^＊cp8^＊。

表达CAT的DD表达盒(DDa表达盒)的构建

首先修饰pRIB1-HAcp3^＊载体，从而使用Bglupd FW和RW(SEQ IDNO.：43和SEQ ID NO.：44)通过一轮定位诱变在SacI和XbaI克隆位点的5’端插入一个BglI位点。得到的质粒称为pRIB1-Dda，用BglI消化该质粒，并将携带该表达盒(SEQ ID NO.：11)的片段连接于以BglI消化的pDD-cp3^＊cp8^＊。获得的连接混合物在4℃培养过夜，然后用于转化在添加氯霉素(20μg/ml)的LB琼脂平板上生长的大肠杆菌DH5α细胞。一天以后，随机挑取10个菌落用于小量制备DNA提取，从而确定DDa表达盒通过NheI和XbaI消化以任意方向插入，结果产生表达CAT抗性的pDDa-cp3^＊和pDDa-cp8^＊载体。

表达Zeocin抗性的DD表达盒(ZEO；DDb表达盒)的构建

用引物Zeo FW和RW(SEQ ID NO.：45和SEQ ID NO.：46；表I)从pSVZeo质粒(英杰(Invitrogen))中以PCR扩增Zeocin抗性基因。将PCR片段克隆到pGEMTeasy中。因为在该基因中存在一个BglI位点，所以用引物ZeodeltaBgl FW和RW(SEQ ID NO.：47和SEQ ID NO.：48；表I)进行一轮定位诱变。然后用StuI和XbaI消化修饰的ZEO基因，并克隆到pDDa-cp3^＊的相应位点，从而获得pDDb-cp3^＊。通过用BglI消化pDDb-cp3^＊和再连接两片段来获得相应的pDDb-cp8^＊载体。用NheI和XbaI消化从随机选取的菌落中提取的质粒DNA，从而鉴定在任一方向具有相应于DDb表达盒的BglI片段的克隆。用添加Zeocin(10μg/ml)的细菌细胞常用培养基选择出含有pDDb-cp3^＊和pDDb-cp8^＊质粒的克隆。

在所有构建体中用商品化试剂盒(快速改变定向诱变试剂盒：斯彻特基因(Stratagene)#200518)进行定向诱变。这些引物在相关位点引入单个核苷酸取代，其可以通过酶消化或测序被容易地检测，并且不改变载体的其他特性。关于质粒DNA提取和消化、DNA片段纯化和连接、和细胞转化的其他技术如文献中所述的进行。

用小量制备试剂盒(肯强(Qiagen))进行质粒DNA的提取。使用连接混合物转化电感受态大肠杆菌DH5α细胞，从而获得足够的克隆用以挑取和表征。

b)结果

前述实施例显示由插入DIS接头(尤其是DIS接头2)而在两个功能性外壳蛋白质的序列中的修饰仍然提供完全的功能性外壳蛋白质。可以根据图13概述的策略将编码cp3^＊和cp8^＊的序列组装到本发明的噬菌粒载体(pDD)中。

通过修饰pBlueScript II(SK+)载体和引入合成接头产生基本载体pDD-cp3^＊cp8^＊，该接头允许顺序克隆以相反方向放置的cp3^＊和cp8^＊，并通过DD-DIS接头(DD-DIS接头2)将其5’端分离。在构建过程中添加或缺失特定限制性内切酶位点，从而使克隆方法有效。

pDD-cp3^＊cp8^＊载体(图13)是用于进行蛋白质序列的双向克隆的主链载体，该蛋白质序列是作为具有cp3^＊(成为概念上等同于pRIB1系列载体的质粒)或cp8^＊(成为概念上等同于pRIB2系列载体的质粒)的融合蛋白质序列被展示，依赖于DD表达盒在哪个方向与BglI线性化的载体具有可匹配的5’和3’末端并且可能包含其他的元件。

该质粒代表DD表达盒可以被插入的主链，用于表达含cp3^＊或cp8^＊的融合蛋白质。可以通过以不对称方式组合不同类型的序列形成DD表达盒(图14)，从而使提供完整DIS接头的表达盒的一个末端可以介导与pDD主链中两个功能性外壳蛋白质之一的读码框一致的序列的融合和转录。剩余序列可以提供不依赖于DD表达盒插入方向的其他功能。

可以通过插入填充DNA或标记基因而进一步修饰基本的pDD-cp3^＊cp8^＊载体(和通常的任意载体，其如在图14、15和16中所示，呈现由DD-DIS接头分离的功能性外壳蛋白质编码序列的相同组装)，从而使插入的DD表达盒可以缺失或添加标记基因，以利于筛选其中插入DD表达盒的克隆(图15)。

从pRIB1-HAcp3^＊开始产生两种类型的DD表达盒，称为DDa和DDb表达盒(图17和18)，在用于克隆要展示的蛋白质序列的DIS接头附近的位置插入BglI位点和保留HA作为填充DNA。两种DD表达盒中，位于用于转录融合蛋白质的5’端启动子与用于克隆任意其他目的序列(例如表达fab时的轻链可变区)的一对限制性内切酶位点之间的标记基因不同。该标记基因(CAT或ZEO)可以以与DD表达盒中其他转录单位相同的方向克隆到DD表达盒中(即指向DD表达盒末端，其中形成的DIS接头来表达融合蛋白质)，或以相反的方向克隆(有利于避免来自其他启动子的连读转录活性)。

当用受限于表达盒的限制性内切酶位点(即BglI)从pDD载体切去Dda表达盒和DDb表达盒，并用同样酶从pDD载体切去DD表达盒时，DD表达盒以两种可能的方向插入以连接混合物转化的每个克隆中，由于用两种酶的组合消化，一个切割在表达盒内，而另一个切割在主链中(图19)。该结果也显示如何不需载体测序而分析插入事件，和在筛选过程中或之前可以如何分类(group)克隆。

当DDa和DDb表达盒被克隆到pDD或任意其他载体中时，它们可以用于构建文库。然而，用BglI消化并与具有可匹配末端的pDD载体连接可作为产生具有所希望特征的文库的手段。

结论

可以通过一系列克隆步骤产生pDD载体和可匹配的DD表达盒，可以容易的继之用质粒DNA提取/纯化方法从克隆中测序和/或消化基于pDD的中间体载体。

一旦产生了这些pDD载体和DD表达盒，它们即可用于产生以一个或另一个可能方向克隆的序列文库。例如通过该方法产生的Fab文库应含有可选择的重组噬菌体，其中产生重链片段并且展示为与cp3^＊或cp8^＊融合的蛋白质。HA标签肽或其他从抗原衍生的肽也有相同的应用。

上述载体可以有效地用于连接于噬菌体表面的两个外壳蛋白质的任一个的抗体片段、肽或其他蛋白质的构建和双重展示，从而能够不需要双重克隆、转化和感染过程即可同时筛选所展示的序列。

本发明的方法增加了克隆抗体或其他蛋白质序列的可能性，其表达和/或展示效率依赖于所融合的外壳蛋白质。而且，不同组合的筛选系统的使用有利于鉴定具有正确结构和序列的克隆。

实施例5：展示融合于肽或抗体的cp3^＊或cp8^＊的基于pDD的重组噬菌体的功能验证

a)材料和方法

如图1和文献所述进行噬菌粒的扩增、辅助噬菌体超感染、聚乙二醇(PEG)介导的噬菌体沉淀、用重悬噬菌体感染XL-1 Blue细胞、噬菌体CFU测定、噬菌体-抗原结合测定、和噬菌体cfu/μl的计算(分子克隆：实验室手册”，Sambrook等人，Cold Spring Harbor Press，NY，1989)。

关于细胞选择的条件，按上述使用Tet，而在包括pDDa衍生物的实验中用氯霉素(Caf；20μg/ml和100μg/ml)取代氨苄青霉素，在包括pDDb衍生物的实验中使用Zeocin(Zeo；10μg/ml和50 μg/ml)取代氨苄青霉素。

以50ng的噬菌粒载体(pRB32、pRIB1-HAcp3^＊、pRIB2-HAcp8^＊、pRIB1-e44cp3^＊、pRIB2-e44cp8^＊、pDDa-HAcp3^＊、pDDa-HAcp8^＊、pDDa-e44cp3^＊、pDDa-e44cp8^＊、pDDb-HAcp3^＊、pDDb-HAcp8^＊、pDDb-e44cp3^＊、pDDb-e44cp8^＊)电穿孔(0.2cm大肠杆菌脉冲杯，2.5Kv)电感受态大肠杆菌XL1-Blue细胞。

收集的样品组如下：

第1组：

pDDa-HAcp3^＊抗HA抗体排出量

pDDa-HAcp3^＊抗BSA排出量

pDDa-HAcp8^＊抗HA抗体排出量

pDDa-HAcp8^＊抗BSA排出量

pRIB1-HAcp3^＊抗HA抗体排出量

pRIB1-HAcp3^＊抗BSA排出量

pRIB2-HAcp8^＊抗HA抗体排出量

pRIB2-HAcp8^＊抗BSA排出量

pRB32抗HA抗体排出量

pRB32抗BSA排出量

第2组：

pDDa-e44cp3^＊抗E2排出量

pDDa-e44cp3^＊抗BSA排出量

pDDa-e44cp8^＊抗E2排出量

pDDa-e44cp8^＊抗BSA排出量

pRIB1-e44cp3^＊抗E2排出量

pRIB1-e44cp3^＊抗BSA排出量

pRB32抗E2排出量

pRB32抗BSA排出量

第3组：

pDDa-HAcp3^＊抗HA抗体排出量

pDDa-HAcp3^＊抗BSA排出量

pDDb-HAcp3^＊抗HA抗体排出量

pDDb-HAcp3^＊抗BSA排出量

pRIB1-HAcp3^＊抗HA抗体排出量

pRIB1-HAcp3^＊抗BSA排出量

pDDa-HAcp8^＊抗HA抗体排出量

pDDa-HAcp8^＊抗BSA排出量

pDDb-HAcp8^＊抗HA抗体排出量

pDDb-HAcp8^＊抗BSA排出量

pRIB2-HAcp8^＊抗HA抗体排出量

pRIB2-HAcp8^＊抗BSA排出量

第4组：

pDDa-e44cp3^＊抗E2排出量

pDDa-e44cp3^＊抗BSA排出量

pDDb-e44cp3^＊抗E2排出量

pDDb-e44cp3^＊抗BSA排出量

pRIB1-e44cp3^＊抗E2排出量

pRIB1-e44cp3^＊抗BSA排出量

pDDa-e44cp8^＊抗E2排出量

pDDa-e44cp8^＊抗BSA排出量

pDDb-e44cp8^＊抗E2排出量

pDDb-e44cp8^＊抗BSA排出量

pRIB2-e44cp8^＊抗E2排出量

pRIB2-e44cp8^＊抗BSA排出量

b)结果

按照基于pRIB1和pRIB2的重组噬菌体的功能性比较相同的方法分析基于pDD的重组噬菌体和表达基于cp3^＊或cp8^＊的融合蛋白质。

第一组实验预期首先验证pDD-cp3^＊cp8^＊与表达CAF选择标记(pDDa型噬菌粒)的DD表达盒的组合可以正确表达和选择在cp3^＊或cp8^＊上的肽和fab(图20)。然后，第二组实验意在验证pDD-cp3^＊cp8^＊与表达CAF选择标记(pDDa型噬菌粒)或ZEO选择标记(pDDb型噬菌粒)的DD表达盒的组合，还允许正确表达和选择cp3^＊或cp8^＊上的肽和fab(图22)。

对于两种转化反应(用相应阳性对照、基于cp3的载体)，所有实验中的电穿孔效率都相同。以基于pRIB1-、pRIB2-、pDDa-和pDDb-的载体获得的cfu/μl值相同(约10⁸--10⁹)，证明当产生含ZEO或CAT选择标记的基于pDD的噬菌粒时，用中间体噬菌粒pRIB1和pRIB2向cp3和cp8中引入的修饰也并不影响噬菌体正确组装。

当使用蛋白质或抗体作为此类噬菌体的靶时，可获得特异性的基于pDD的重组噬菌体的高度富集，在包含基于CAF或ZEO的DD表达盒的噬菌粒之间也没有任何差异。此特性可以在使用cp3^＊或cp8^＊表达肽的pDD噬菌粒中重现，但是其显著较低，仅当使用cp8^＊用于表达高度特异性Fab的pDD噬菌体，这仍然证实了文献中和上述以pRIB1和pRIB2获得的结果。

c)结论

pDD-cp3^＊cp8^＊噬菌粒可以与包含作为筛选标记的CAF或ZEO的DD表达盒组合，从而表达和选择重组噬菌体表面基于cp3^＊或cp8^＊的融合蛋白质形式的蛋白质序列。

实施例6：pDD可相容载体的构建用于表达使用基于pDD的文库选择的序列

a)材料和方法

制备来自人骨髓的cDNA文库，并将该文库用作PCR反应的模板，其中根据文献所述扩增编码人IgG1免疫球蛋白质轻链和重链可变区的DNA(Burioni等人，1998a；“噬菌体展示：实验室手册”，Burton DR等人，CSHL Press，2001)。

PCR引物在3’端被部分的变性，并且在5’端包含将其克隆到DDb表达盒中所需的限制性内切酶位点。对于轻链特异性的扩增产物首先用XbaI和SacI消化，并以琼脂糖凝胶纯化。用XbaI和SacI消化5μg的pDDb-HAcp3^＊，获得的载体主链经凝胶纯化、去磷酸化，并用于制备与编码轻链的DNA片段可相容的连接混合物。于4℃培养过夜之后，将DNA混合物沉淀，重悬于20μl水中，并用于通过电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1 Blue细胞。然后细胞在3ml的SOC中于37℃培养1小时。以10μl和100μl培养物涂板，从而定量克隆数。随后将剩余细菌培养物以10ml的含氨苄青霉素(10μg/ml)、Zeocin(10μg/ml)和四环素(10μg/ml)的SB稀释。在37℃培养1小时以后，细胞用含氨苄青霉素(50μg/ml)、Zeocin(50μg/ml)和四环素(10μg/ml)的SB稀释到100ml，并于37℃培养过夜。一天以后，收集细胞并用于DNA纯化和提取。

将获得的携带轻链的基于pDDb的文库用XhoI和SpeI消化，并且用于插入原始扩增产物中恢复的重链，所述重链是从用XhoI和SpeI消化并通过琼脂糖凝胶纯化的。连接反应用于通过上述电穿孔转化感受态大肠杆菌XL1 Blue细胞。

随后用BglI消化产生的携带轻链和重链的基于pDDb的文库，除去相同载体中的片段。将整分试样的文库涂布于含氨苄青霉素(50μg/ml)和Zeocin(50μg/ml)的LB琼脂平板上。文库的克隆数估计在10⁴-10⁵克隆。从平板上随机选择菌落，培养过夜，并用于小量DNA提取/纯化(然后用NheI和XbaI消化并如上所述以琼脂糖凝胶分析)和蛋白质Western印迹分析(如上所述，用连接辣根过氧化物酶的山羊抗人Fab抗体检测)。

结果

用从人骨髓细胞衍生的DNA文库将来自任意IgG1的轻链和重链克隆到DDb表达盒中，该DDb表达盒已经被克隆到pDDb载体内，在XhoI-SpeI之间具有HA标签作为填充DNA。

将编码轻链和重链的DNA顺序克隆到该载体中，除去填充DNA，并且用BglI消化得到的文库，与以两种可能方向之一再插入的DDb表达盒再连接，由此产生基于pDDb的文库，其中重链作为带有cp3^＊或cp8^＊的融合蛋白质而表达。

随机选择在Zeocin(由于DDb表达盒中的标记基因而使细胞对其有抗性)存在下生长的大肠杆菌转化株的菌落，并在DNA和蛋白质水平分析(图22)。对提取的质粒DNA的限制性分析显示，此类克隆具有以任一可能方向的DDb表达盒，并且表达其中重链连接于cp8^＊或cp3^＊的人fab融合蛋白质。分子量和表达水平的差异与限制性分析结果一致，因为具有使重链融合于cp8^＊的方向的DDb表达盒的克隆，与具有使重链融合于cp3^＊的方向DDb表达盒的克隆相比，表达以更高水平产生的更小重组蛋白质。

结论

DDb表达盒用于产生人fab文库，其中重链作为含cp3^＊或cp8^＊的融合蛋白质表达。该文库通过使用以在DIS接头的限制性内切酶位点消化并再连接的基于pDD基本质粒的单个文库而产生。

该基本方法也被应用于序列的文库，其被克隆到任意类型质粒的DD表达盒中，并且随后如在本实施例或其他情况中示例的，转移到pDD基本载体中，概述于图15。

通过噬菌体展示和亲和选择来鉴定载体的基于pDD的系统中相关序列的全部过程被概述(图23)。从pDD载体和克隆到DD表达盒中要分析的序列文库的合适组合开始，连接和转化步骤提供编码两种类型融合蛋白质(例如包含cp3^＊或cp8^＊)的细胞文库，其可通过应用正确抗生素组合来选择。然后辅助噬菌体转染使可以同时产生重组噬菌体文库，其中要筛选的蛋白质在使用单个pDD载体混合于相同文库的两个噬菌体群中表达。该文库随后可以用文献中报道的方法筛选，从而分离、测序和表征作为cp3^＊或cp8^＊融合蛋白质而表达和展示的相关蛋白质和肽。

表I：PCR引物和寡核苷酸的概述

引物名称 SEQ 引物序列

ID

NO.：

cp3^*FW 13 GACAAAACTAGTGGCCAGGCCGGCCAGGGTGGC

GGTGGCTCTCCA

cp3^*RW 14 GTGGTGGCTAGCTTAAGACTCCTTATT

cp8^*FW 15 ACTAGTGGCCAGGCCGGCCAGGGTGGCGGTGGCT

CTGCTGAGGGTGACGATCCCGCA

cp8^*RW 16 GTGGTGGCTAGCTCAGCTTGCTTTCGAGGTGAATT

T

HA标签接头FW 17 TCGAGTATCCATATGATGTTCCAGATTATGCTA

HA标签接头FW 18 CTAGTAGCATAATCTGGAACATCATATGGATAC

LC填充FW 26 CCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCT

LC填充RW 27 CTAGAGGGTGGAAGGAGACTGGGTCATCTGGAGC

T

Mut BglI A FW 28 GCGCGTCCCATTCGACATTCAGGCTGCGC

Mut BglI A RW 29 GCGCAGCCTGAATGTCGAATGGGACGCGC

Mut BglI B FW 30 TTCTGCGCTCGGCACTTCCGGCTGGCT

Mut BglI B RW 31 AGCCAGCCGGAAGTGCCGAGCGCAGAA

pDD接头FW 32 CTGGCTAGCAAAGGCCAGGCCGGCCAAAGAATTC

GCTCTTCC

pDD接头RW 33 AGCGGAAGAGCGAATTCTTTGGCCGGCCTGGCCT

TTGCTAGCCAG

pDD接头2 FW 35 GCGCGTAATACGACTCACTATAGGGC

pDD接头2 RW 36 CAGCTGGCTAGCATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTG

deltaBgl接头FW 37 CCGGCCAGGGTGGAGGTGGCTCT

deltaBgl接头RW 38 AGAGCCACCTCCACCCTGGCCGG

cp8^*FW new 41 ATGTACTAGTGGCCAGGCCGGCCAGGG

cp8^*RW new 42 GGAATCCTAGAATTCTCAGCTTGCTTTCGAGGTGA

AT

BglupdFW 43 AATGAGTAGGCCTTGTTGACAATTAATCATCGGCA

TAGT

BglupdRW 44 AACTGGATCTAGACATGATAAGATACAACATTGAT

GAGTTTGG

Zeo FW 45 AATGAGTAGGCCTTGTTGACAATTAATCATCGGCA

TAGT

Zeo RW 46 AACTGGATCTAGACATGATAAGATACATTGATGAG

TTTGG

ZeodeltaBgl FW 47 GAGCAGCCGTGGGGACGGGAGTTCGCCC

ZeodeltaBgl RW 48 GGGCGAACTCCCGTCCCCACGGCTGCTC

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序列表

<110>里博瓦克斯生物工艺有限公司

<120>新的噬菌体展示技术

<130>PAF04WO-SCB947

<150>PCT/EP05/007325

<151>2005-07-07

<160>48

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>SpeI-SfiI DIS接头DNA序列

<400>1

actagtggcc aggccggcc 19

<210>2

<211>36

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>DIS接头2DNA序列

<400>2

actagtggcc aggccggcca gggtggcggt ggctct 36

<210>3

<211>12

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>DIS接头2蛋白质序列

<400>3

Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>BglI-SpeI-BglI DD-DIS接头

<400>4

gccggcctgg ccactagtgg ccaggccggc 30

<210>5

<211>66

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>DD-DIS接头2

<400>5

agagccacct ccaccctggc cggcctggcc actagtggcc aggccggcca gggtggaggt 60

ggctct 66

<210>6

<211>672

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cp3*DNA序列

<400>6

actagtggcc aggccggcca gggtggcggt ggctctccat tcgtttgtga atatcaaggc 60

caatcgtctg acctgcctca acctcctgtc aatgctggcg gcggctctgg tggtggttct 120

ggtggcggct ctgagggtgg tggctctgag ggtggcggtt ctgagggtgg cggctctgag 180

ggaggcggtt ccggtggtgg ctctggttct ggtgattttg attatgaaaa gatggcaaac 240

gctaataagg gggctatgac cgaaaatgcc gatgaaaacg cgctacagtc tgacgctaaa 300

ggcaaacttg attctgtcgc tactgattac ggtgctgcta tcgatggttt cattggtgac 360

gtttccggcc ttgctaatgg taatggtgct actggtgatt ttgctggctc taattcccaa 420

atggctcaag tcggtgacgg tgataattca cctttaatga ataatttccg tcaatattta 480

ccttccctcc ctcaatcggt tgaatgtcgc ccttttgtct ttggcgctgg taaaccatat 540

gaattttcta ttgattgtga caaaataaac ttattccgtg gtgtctttgc gtttctttta 600

tatgttgcca cctttatgta tgtattttct acgtttgcta acatactgcg taataaggag 660

tcttaagcta gc 672

<210>7

<211>221

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>cp3*蛋白质序列

<400>7

Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly Ser Pro Phe Val Cys

1 5 10 15

Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly

35 40 45

Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser

50 55 60

Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn

65 70 75 80

Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln

85 90 95

Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala

100 105 110

Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn

115 120 125

Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val

130 135 140

Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu

145 150 155 160

Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Gly Ala

165 170 175

Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe

180 185 190

Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val

195 200 205

Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys Glu Ser

210 215 220

<210>8

<211>195

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cp8*DNA序列

<400>8

actagtggcc aggccggcca gggtggcggt ggctctgctg agggtgacga tcccgcaaaa 60

gcggccttta actccctgca agcctcagcg accgaatata tcggttatgc gtgggcgatg 120

gttgttgtca ttgtcggcgc aactatcggt atcaagctgt ttaagaaatt cacctcgaaa 180

gcaagctgag ctagc 195

<210>9

<211>62

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>cp8*蛋白质序列

<400>9

Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Gly Asp

1 5 10 15

Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asn Ser Leu Gln Ala Ser Ala Thr Glu

20 25 30

Tyr Ile Gly Tyr Ala Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly Ala Thr

35 40 45

Ile Gly Ile Lys Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser

50 55 60

<210>10

<211>849

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>通过DD-DIS接头2将cp3*连接于cp8*

<400>10

ttaagactcc ttattacgca gtatgttagc aaacgtagaa aatacataca taaaggtggc 60

aacatataaa agaaacgcaa agacaccacg gaataagttt attttgtcac aatcaataga 120

aaattcatat ggtttaccag cgctaaagac aaaagggcga cattcaaccg attgagggag 180

ggaaggtaaa tattgacgga aattattcat taaaggtgaa ttatcaccgt caccgacttg 240

agccatttgg gaattagagc cagcaaaatc accagtagca ccattaccat tagcaaggcc 300

ggaaacgtca ccaatgaaac catcgatagc agcaccgtaa tcagtagcga cagaatcaag 360

tttgccttta gcgtcagact gtagcgcgtt ttcatcggca ttttcggtca tagccccctt 420

attagcgttt gccatctttt cataatcaaa atcaccggaa ccagagccac caccggaacc 480

gcctccctca gagccgccac cctcagaacc gccaccctca gagccaccac cctcagagcc 540

gccaccagaa ccaccaccag agccgccgcc agcattgaca ggaggttgag gcaggtcaga 600

cgattggcct tgatattcac aaacgaatgg agagccacct ccaccctggc cggcctggcc 660

actagtggcc aggccggcca gggtggaggt ggctctgctg agggtgacga tcccgcaaaa 720

gcggccttta actccctgca agcctcagcg accgaatata tcggttatgc gtgggcgatg 780

gttgttgtca ttgtcggcgc aactatcggt atcaagctgt ttaagaaatt cacctcgaaa 840

gcaagctga 849

<210>11

<211>1944

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>DDa表达盒

<400>11

ggccggcctg gccgcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 60

ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 120

acacaaattc taaactagct taaggagaca gtcataatga aatacctatt gcctacggca 180

gccgctggat tgttattact cgctgcccaa ccagccatgg ccgagctcca gatgacccag 240

tctccttcca ccctctagaa cgcgttagta aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga 300

ataaataaat cctggtgtcc ctgttgatac cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa 360

atgaggcgtt gatcggcacg taagaggttc caactttcac cataatgaaa taagatcact 420

accgggcgta ttttttgagt tgtcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa 480

aaaaattact ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag aacattttga 540

ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc gttcagctgg atattacggc 600

ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca caagttttat ccggccttta ttcacattct 660

tgcccgcctg atgaatgctc atccggaatt acgtatggca atgaaagacg gtgagctggt 720

gatatgggat agtgttcacc cttgttacac cgttttccat gagcaaactg aaacgttttc 780

atcgctctgg agtgaatacc acgacgattt ccggcagttt ctacacatat attcgcaaga 840

tgtggcgtgt tacggtgaaa acctggccta tttccctaaa gggtttattg agaatatgtt 900

tttcgtctca gccaatccct gggggagttc accagttttg atttaaacgt ggccaatatg 960

gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg ggcaaatatt atacgcaagg cgacaaggtg 1020

ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat gccgtttgtg atggcttcca tgtcggcaga 1080

atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat gagtggcagg gcggggcgta atttttttaa 1140

ggcagttatt ggtgccctta aacgcctggt tgctacgcct gaataagtga taataagcgg 1200

atgaatggca gaaattcgaa agcaaattcg acccggtcgt cggttcaggg cagggtcgtt 1260

aaatagccgc ttatgtctat tgctggttta ccggtttatt gactaccgga agcagtgtga 1320

ccgtgtgctt ctcaaatgcc tgaggccagt ttgctcaggc tctccccgtg gaggtaataa 1380

ttgacgatat gatccttttt ttctgatcaa aagtgctcat cattggttac taacgcgtcc 1440

atggggcgga gaatgggccg gaactgggcg gagttagggg cgggatgggc agagtccatg 1500

gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ggcctctgag ctattccaga 1560

agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa aaagctcccg ggagcttgga 1620

tcgggctgca ggaattcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc 1680

aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc 1740

tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaaattcta aactagctta 1800

aggagacagt cataatgaaa tacctattgc ctacggcagc cgctggattg ttattactcg 1860

ctgcccaacc agccatggcc caggtgaaac tgctcgagta tccatatgat gttccagatt 1920

atgctactag tggccaggcc ggcc 1944

<210>12

<211>1203

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>DDb表达盒

<400>12

ggccggcctg gccgcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 60

ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 120

acacaaattc taaactagct taaggagaca gtcataatga aatacctatt gcctacggca 180

gccgctggat tgttattact cgctgcccaa ccagccatgg ccgagctcca gatgacccag 240

tctccttcca ccctctagac atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta 300

gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa 360

ccattataag ctgcaataaa caagtttcga ggtcgagtgt cagtcctgct cctcggccac 420

gaagtgcacg cagttgccgg ccgggtcgcg cagggcgaac tcccgtcccc acggctgctc 480

gccgatctcg gtcatggccg gcccggaggc gtcccggaag ttcgtggaca cgacctccga 540

ccactcggcg tacagctcgt ccaggccgcg cacccacacc caggccaggg tgttgtccgg 600

caccacctgg tcctggaccg cgctgatgaa cagggtcacg tcgtcccgga ccacaccggc 660

gaagtcgtcc tccacgaagt cccgggagaa cccgagccgg tcggtccaga actcgaccgc 720

tccggcgacg tcgcgcgcgg tgagcaccgg aacggcactg gtcaacttgg ccatggttta 780

gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat gccgatgatt aattgtcaac 840

aaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg gagcttggat cgggctgcag gaattcacga 900

caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac 960

tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt 1020

gagcggataa caatttcaca caaattctaa actagcttaa ggagacagtc ataatgaaat 1080

acctattgcc tacggcagcc gctggattgt tattactcgc tgcccaacca gccatggccc 1140

aggtgaaact gctcgagtat ccatatgatg ttccagatta tgctactagt ggccaggccg 1200

gcc 1203

<210>13

<211>45

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cp3*正向PCR引物

<400>13

gacaaaacta gtggccaggc cggccagggt ggcggtggct ctcca 45

<210>14

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cp3*反向PCR引物

<400>14

gtggtggcta gcttaagact ccttatt 27

<210>15

<211>57

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cp8*正向PCR引物

<400>15

actagtggcc aggccggcca gggtggcggt ggctctgctg agggtgacga tcccgca 57

<210>16

<211>36

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cp8*反向PCR引物

<400>16

gtggtggcta gctcagcttg ctttcgaggt gaattt 36

<210>17

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>HA tag接头正向寡核苷酸

<400>17

tcgagtatcc atatgatgtt ccagattatg cta 33

<210>18

<211>33

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>HA tag接头反向寡核苷酸

<400>18

ctagtagcat aatctggaac atcatatgga tac 33

<210>19

<211>774

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>完整HAcp3*DNA序列

<400>19

atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgctgc ccaaccagcc 60

atggcccagg tgaaactgct cgagtatcca tatgatgttc cagattatgc tactagtggc 120

caggccggcc agggtggcgg tggctctcca ttcgtttgtg aatatcaagg ccaatcgtct 180

gacctgcctc aacctcctgt caatgctggc ggcggctctg gtggtggttc tggtggcggc 240

tctgagggtg gtggctctga gggtggcggt tctgagggtg gcggctctga gggaggcggt 300

tccggtggtg gctctggttc cggtgatttt gattatgaaa agatggcaaa cgctaataag 360

ggggctatga ccgaaaatgc cgatgaaaac gcgctacagt ctgacgctaa aggcaaactt 420

gattctgtcg ctactgatta cggtgctgct atcgatggtt tcattggtga cgtttccggc 480

cttgctaatg gtaatggtgc tactggtgat tttgctggct ctaattccca aatggctcaa 540

gtcggtgacg gtgataattc acctttaatg aataatttcc gtcaatattt accttccctc 600

cctcaatcgg ttgaatgtcg cccttttgtc tttggcgctg gtaaaccata tgaattttct 660

attgattgtg acaaaataaa cttattccgt ggtgtctttg cgtttctttt atatgttgcc 720

acctttatgt atgtattttc tacgtttgct aacatactgc gtaataagga gtct 774

<210>20

<211>258

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>完整HAcp3*蛋白质序列

<400>20

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Lys Leu Leu Glu Tyr Pro Tyr Asp

20 25 30

Val Pro Asp Tyr Ala Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly

35 40 45

Ser Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser Asp Leu Pro Gln

50 55 60

Pro Pro Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

65 70 75 80

Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser

85 90 95

Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr

100 105 110

Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp

115 120 125

Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala

130 135 140

Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly

145 150 155 160

Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser

165 170 175

Gln Met Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn

180 185 190

Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro

195 200 205

Phe Val Phe Ser Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp

210 215 220

Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala

225 230 235 240

Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys

245 250 255

Glu Ser

<210>21

<211>297

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>完整HAcp8*DNA序列

<400>21

atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgctgc ccaaccagcc 60

atggcccagg tgaaactgct cgagtatcca tatgatgttc cagattatgc tactagtggc 120

caggccggcc agggtggcgg tggctctgct gagggtgacg atcccgcaaa agcggccttt 180

aactccctgc aagcctcagc gaccgaatat atcggttatg cgtgggcgat ggttgttgtc 240

attgtcggcg caactatcgg tatcaagctg tttaagaaat tcacctcgaa agcaagc 297

<210>22

<211>99

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>完整HAcp8*蛋白质序列

<400>22

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Lys Leu Leu Glu Tyr Pro Tyr Asp

20 25 30

Val Pro Asp Tyr Ala Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly

35 40 45

Ser Ala Glu Gly Asp Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asn Ser Leu Gln

50 55 60

Ala Ser Ala Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala Trp Ala Met Val Val Val

65 70 75 80

Ile Val Gly Ala Thr Ile Gly Ile Lys Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser

85 90 95

Lys Ala Ser

<210>23

<211>109

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>LacZ启动子

<400>23

cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg 60

cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac aatttcaca 109

<210>24

<211>99

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>来自胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)的改造的PelB信号DNA序列

<400>24

aaggagacag tcataatgaa atacctattg cctacggcag ccgctggatt gttattactc 60

gctgcccaac cagccatggc ccaggtgaaa ctgctcgag 99

<210>25

<211>28

<212>PRT

<213>人工

<220>

<223>来自胡萝卜软腐欧文氏菌的改造的PelB信号蛋白质序列

<400>25

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Lys Leu Leu Glu

20 25

<210>26

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>SacI-XbaI LC填充正向寡核苷酸

<400>26

ccagatgacc cagtctcctt ccaccct 27

<210>27

<211>35

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>SacI-VbaI LC填充反向寡核苷酸

<400>27

ctagagggtg gaaggagact gggtcatctg gagct 35

<210>28

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>Mut BglI A正向PCR引物

<400>28

gcgcgtccca ttcgacattc aggctgcgc 29

<210>29

<211>29

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>Mut BglI A反向PCR引物

<400>29

gcgcagcctg aatgtcgaat gggacgcgc 29

<210>30

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>Mut BglI B正向PCR引物

<400>30

ttctgcgctc ggcacttccg gctggct 27

<210>31

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>Mut BglI B反向PCR引物

<400>31

agccagccgg aagtgccgag cgcagaa 27

<210>32

<211>42

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>pDD接头正向寡核苷酸

<400>32

ctggctagca aaggccaggc cggccaaaga attcgctctt cc 42

<210>33

<211>45

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>pDD接头反向寡核苷酸

<400>33

agcggaagag cgaattcttt ggccggcctg gcctttgcta gccag 45

<210>34

<211>268

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>pDD接头2 PCR产物

<400>34

gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg gcccccctcg aggtcgacgg 60

tatcgataag cttgatatcg aattcctgca gcccggggga tccactagtt ctagagcggc 120

cgccaccgcg gtggagctcc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt gcgcgcttgg 180

cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 240

tacgagccgg aagcatgcta gccagctg 268

<210>35

<211>26

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>pDD接头2正向PCR引物

<400>35

gcgcgtaata cgactcacta tagggc 26

<210>36

<211>35

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>pDD接头2反向PCR引物

<400>36

cagctggcta gcatgcttcc ggctcgtatg ttgtg 35

<210>37

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>deltaBgl接头正向PCR引物

<400>37

ccggccaggg tggaggtggc tct 23

<210>38

<211>23

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>deltaBgl接头反向PCR引物

<400>38

agagccacct ccaccctggc cgg 23

<210>39

<211>666

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cp3*dBgl DNA序列

<400>39

actagtggcc aggccggcca gggtggaggt ggctctccat tcgtttgtga atatcaaggc 60

caatcgtctg acctgcctca acctcctgtc aatgctggcg gcggctctgg tggtggttct 120

ggtggcggct ctgagggtgg tggctctgag ggtggcggtt ctgagggtgg cggctctgag 180

ggaggcggtt ccggtggtgg ctctggttcc ggtgattttg attatgaaaa gatggcaaac 240

gctaataagg gggctatgac cgaaaatgcc gatgaaaacg cgctacagtc tgacgctaaa 300

ggcaaacttg attctgtcgc tactgattac ggtgctgcta tcgatggttt cattggtgac 360

gtttccggcc ttgctaatgg taatggtgct actggtgatt ttgctggctc taattcccaa 420

atggctcaag tcggtgacgg tgataattca cctttaatga ataatttccg tcaatattta 480

ccttccctcc ctcaatcggt tgaatgtcgc ccttttgtct ttagcgctgg taaaccatat 540

gaattttcta ttgattgtga caaaataaac ttattccgtg gtgtctttgc gtttctttta 600

tatgttgcca cctttatgta tgtattttct acgtttgcta acatactgcg taataaggag 660

tcttaa 666

<210>40

<211>189

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cp8*dBgl DNA序列

<400>40

actagtggcc aggccggcca gggtggaggt ggctctgctg agggtgacga tcccgcaaaa 60

gcggccttta actccctgca agcctcagcg accgaatata tcggttatgc gtgggcgatg 120

gttgttgtca ttgtcggcgc aactatcggt atcaagctgt ttaagaaatt cacctcgaaa 180

gcaagctga 189

<210>41

<211>27

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cp8*FW newPCR引物

<400>41

atgtactagt ggccaggccg gccaggg 27

<210>42

<211>37

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>cp8*RW newPCR引物

<400>42

ggaatcctag aattctcagc ttgctttcga ggtgaat 37

<210>43

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>BglupdFW正向PCR引物

<400>43

aatgagtagg ccttgttgac aattaatcat cggcatagt 39

<210>44

<211>43

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>BglupdFW反向PCR引物

<400>44

aactggatct agacatgata agatacaaca ttgatgagtt tgg 43

<210>45

<211>39

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>Zeo正向PCR引物

<400>45

aatgagtagg ccttgttgac aattaatcat cggcatagt 39

<210>46

<211>40

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>Zeo反向PCR引物

<400>46

aactggatct agacatgata agatacattg atgagtttgg 40

<210>47

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>ZeodeltaBgl FW PCR引物

<400>47

gagcagccgt ggggacggga gttcgccc 28

<210>48

<211>28

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>ZeodeltaBgl RW PCR引物

<400>48

gggcgaactc ccgtccccac ggctgctc 28

Claims

1. 用于DNA的双向克隆的噬菌粒载体，该DNA编码与两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端融合的氨基酸序列。

2. 噬菌粒载体，其包含：

b)编码第二个功能性外壳蛋白质的DNA，具有与第一个功能性外壳蛋白质相反的转录方向，并且在其5’端包含第二个DNA接头；

3. 权利要求2的载体，其中DNA接头可以与编码功能性外壳蛋白质的DNA的5’端按读码框转录，和与编码通过所述功能性外壳蛋白质融合和展示的蛋白质序列的DNA的3’端按读码框转录。

4. 权利要求3的载体，其中第一个和第二个DNA接头包含选自SEQID NO.：1和SEQ ID NO.：2的序列。

5. 权利要求3的载体，其中第一个和第二个DNA形成选自SEQ IDNO.：4和SEQ ID NO.：5的序列。

6. 权利要求5的载体，包含cp3^＊DDcp8^＊(SEQ ID NO.：10)。

7. 前述权利要求的任一项的载体，还包含用于克隆、表达和展示至少一个蛋白质序列的DNA表达盒，该蛋白质序列通过所述DNA接头之一融合于所述功能性外壳蛋白质的任一个的N末端。

8. 权利要求7的噬菌粒载体，其中通过DNA接头融合于两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端的蛋白质序列是抗体、抗体片段、表位、表位结合区、抗原、变应原、生物活性肽、酶、酶抑制剂、酶催化位点、DNA结合蛋白质、分离的蛋白质结构域、受体的配体、受体、生长因子、细胞因子和目的蛋白质序列的连续或重叠的片段。

9. 前述权利要求的任一项的载体，其中编码两个功能性外壳蛋白质的DNA是修饰的cp3(cp3^＊，SEQ ID NO.：6)和cp8(cp8^＊，SEQ ID NO.：8)。

10. 权利要求7的载体，其包含DDa表达盒(SEQ ID NO.：11)或DDb表达盒(SEQ ID NO.：12)。

11. 权利1到10的载体用于产生噬菌体或细胞文库的用途，其中所述文库的各个蛋白质序列通过DNA接头融合于两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端。

12. 使用权利要求1到10的载体获得的噬菌体或细胞文库，其中所述文库的各个蛋白质序列通过DNA接头融合于两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端。

13. 权利要求12的噬菌体或细胞文库，其中通过DNA接头融合于两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端的蛋白质序列是抗体、抗体片段、表位、表位结合区、抗原、变应原、生物活性肽、酶、酶抑制剂、酶催化位点、DNA结合蛋白质、分离的蛋白质结构域、受体的配体、受体、生长因子、细胞因子和目的蛋白质序列的连续或重叠的片段。

14. 权利要求12的噬菌体或细胞文库，其中两个功能性外壳蛋白质是修饰的cp3蛋白质(cp3^＊蛋白质，SEQ ID NO.：7)和修饰的cp8蛋白质(cp8^＊蛋白质，SEQ ID NO.：9)。

15. 用于产生噬菌体或细胞文库的试剂盒，其中所述文库的各个蛋白质序列通过DIS接头融合于两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端，包含权利要求1到10的载体。

16. 用于产生噬菌体或细胞文库的方法，其中所述文库的各个蛋白质序列通过DNA接头融合在两个功能性外壳蛋白质的任一个的N末端，该方法包括：

a)在权利要求2的载体的相应DNA接头中插入DNA表达盒；和

b)用产生的载体转化细菌细胞。

17. 权利要求11的方法，其中通过连接已经用BglI消化的DNA表达盒和所述载体从而获得所述DD表达盒的插入。

18. 通过权利要求16或17的方法获得的重组噬菌体或融合蛋白质用于结合、检测、中和、和/或改变配体、细胞或靶分子的用途，其中所述重组噬菌体或融合蛋白质是以分离的形式或以混合物的形式。