RU2008104610A

RU2008104610A - Новые методики фагового дисплея

Info

Publication number: RU2008104610A
Application number: RU2008104610/13A
Authority: RU
Inventors: Роберто БУРИОНИ (IT); Роберто Буриони; Массимо КЛЕМЕНТИ (IT); Массимо Клементи
Original assignee: Рибовакс Байотекнолоджиз Са (Ch); Рибовакс Байотекнолоджиз Са
Priority date: 2005-07-07
Filing date: 2006-07-06
Publication date: 2009-08-20
Also published as: IL188554A0; BRPI0612589A2; US7811973B2; ZA200800104B; EP1904634A2; WO2007007154A3; DE602006019598D1; EP1904634B1; WO2007007154A2; ATE495252T1; KR20080039869A; AU2006267968B2; JP2009500030A; AU2006267968A1; US20080312101A1; CA2614304A1; CN101258243A

Abstract

1. Фагмидный вектор для создания двух фагмид, экспрессирующих аминокислотную последовательность в виде белка, слитого с любым одним из двух функционально активных белков оболочки нитевидного фага, посредством клонирования ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность для слияния c N-концом любого одного или другого из двух функционально активных белков оболочки, причем указанный фагмидный вектор содержит ! а) ДНК, кодирующую первый функционально активный белок оболочки, содержащий первый ДНК-линкер на своем 5'-конце; и ! б) ДНК, кодирующую второй функционально активный белок оболочки, имеющую направление транскрипции, противоположное направлению транскрипции первого функционально активного белка оболочки, и содержащую второй ДНК-линкер на своем 5'-конце; ! где указанные две фагмиды создаются за единственный этап клонирования и трансформации; ! где первый и второй ДНК-линкеры содержат, по крайней мере, один идентичный сайт фермента рестрикции, не присутствующий за пределами указанного линкера в фагмидном векторе; ! где первый и второй ДНК линкеры могут транскрибироваться с сохранением рамки считывания с 5'-концом ДНК, кодирующей функционально активный белок оболочки и с 3'-концом ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность для слияния с указанным функционально активным белком оболочки. ! 2. Вектор по п.1, где первый и второй ДНК-линкеры содержат последовательность, выбранную из SEQ ID NO.:1 и SEQ ID NO.:2. ! 3. Вектор по п.1, где первая и вторая ДНК образуют последовательность, выбранную из SEQ ID NO.:4 и SEQ ID NO.:5. ! 4. Вектор по п.3, содержащий ср3*DDcp8* (SEQ ID NO.:10). ! 5. Вектор по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащи�

Claims

1. Фагмидный вектор для создания двух фагмид, экспрессирующих аминокислотную последовательность в виде белка, слитого с любым одним из двух функционально активных белков оболочки нитевидного фага, посредством клонирования ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность для слияния c N-концом любого одного или другого из двух функционально активных белков оболочки, причем указанный фагмидный вектор содержит

а) ДНК, кодирующую первый функционально активный белок оболочки, содержащий первый ДНК-линкер на своем 5'-конце; и

б) ДНК, кодирующую второй функционально активный белок оболочки, имеющую направление транскрипции, противоположное направлению транскрипции первого функционально активного белка оболочки, и содержащую второй ДНК-линкер на своем 5'-конце;

где указанные две фагмиды создаются за единственный этап клонирования и трансформации;

где первый и второй ДНК-линкеры содержат, по крайней мере, один идентичный сайт фермента рестрикции, не присутствующий за пределами указанного линкера в фагмидном векторе;

где первый и второй ДНК линкеры могут транскрибироваться с сохранением рамки считывания с 5'-концом ДНК, кодирующей функционально активный белок оболочки и с 3'-концом ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность для слияния с указанным функционально активным белком оболочки.

2. Вектор по п.1, где первый и второй ДНК-линкеры содержат последовательность, выбранную из SEQ ID NO.:1 и SEQ ID NO.:2.

3. Вектор по п.1, где первая и вторая ДНК образуют последовательность, выбранную из SEQ ID NO.:4 и SEQ ID NO.:5.

4. Вектор по п.3, содержащий ср3*DDcp8* (SEQ ID NO.:10).

5. Вектор по любому из предыдущих пунктов, дополнительно содержащий ДНК-кассету для клонирования, экспрессии и представления, по крайней мере, одной белковой последовательности для слияния с N-концом любого одного или другого из двух функционально активных белков оболочки посредством одного из указанных ДНК-линкеров.

6. Фагмидный вектор по п.5, где белковая последовательность для слияния с N-концом любого одного или другого из двух функционально активных белков оболочки посредством ДНК-линкера является антителом, фрагментом антитела, эпитопом, эпитопсвязывающей областью, антигеном, аллергеном, биологически активным пептидом, ферментом, ингибитором фермента, каталитическим участком фермента, ДНК-связывающим белком, выделенным белковым доменом, лигандами рецепторов, рецептором, фактором роста, цитокином, непрерывными или перекрывающимися фрагментами представляющей интерес белковой последовательности.

7. Вектор по п.1, где ДНК, кодирующая два функционально активных белка оболочки, является модифицированными cp3 (cp3*, SEQ ID NO.:6) и cp8 (cp8*, SEQ ID NO.:8).

8. Вектор по п.1, содержащий DDa-кассету (SEQ ID NO.:11) или DDb-кассету (SEQ ID NO.:12).

9. Применение вектора по пп.1-8 для создания фаговой или клеточной библиотеки, где каждая белковая последовательность указанной библиотеки является слитой с N-концом любого одного или другого из двух функционально активных белков оболочки посредством ДНК-линкера.

10. Фаговая или клеточная библиотека, полученная с использованием вектора по пп.1-8, где каждая белковая последовательность указанной библиотеки является слитой с N-концом любого одного или другого из двух функционально активных белков оболочки посредством ДНК-линкера.

11. Фаговая или клеточная библиотека по п.10, где белковая последовательность для слияния с N-концом любого одного или другого из двух функционально активных белков оболочки посредством ДНК-линкера является антителом, фрагментом антитела, эпитопом, эпитопсвязывающей областью, антигеном, аллергеном, биологически активным пептидом, ферментом, ингибитором фермента, каталитическим участком фермента, ДНК-связывающим белком, выделенным белковым доменом, лигандами рецепторов, рецептором, фактором роста, цитокином, непрерывными или перекрывающимися фрагментами представляющей интерес белковой последовательности.

12. Фаговая или клеточная библиотека по п.10, где два функционально активных белка оболочки являются модифицированным белком cp3 (белок cp3*, SEQ ID NO.:6) и модифицированным белком cp8 (белок cp8*, SEQ ID NO.:8).

13. Набор для создания фаговой или клеточной библиотеки, где каждая белковая последовательность указанной библиотеки является слитой с N-концом любого одного или другого из двух функционально активных белков оболочки посредством DIS-линкера, содержащий

а) вектор по пп.2-8;

б) векторы и праймеры для создания DD-кассет, совместимых с вектором по пп.2-8 и позволяющих клонирование ДНК, кодирующей белковую последовательность для представления с использованием функционально активного белка оболочки.

14. Способ получения фаговой или клеточной библиотеки, где каждая белковая последовательность указанной библиотеки является слитой с N-концом любого одного или другого из двух функционально активных белков оболочки посредством ДНК-линкера, включающий

а) встраивание ДНК-кассеты в соответствии с ДНК-линкерами вектора по п.2; и

б) трансформацию бактериальных клеток полученными векторами.

15. Способ по п.14, где встраивание указанной DD-кассеты получено посредством лигирования ДНК-кассеты и указанного вектора, который был расщеплен BglI.

16. Применение рекомбинантных фаговых или слитых белков, полученных посредством способов по п.14 или 15 для связывания, обнаружения, нейтрализации и/или изменения лиганда, клетки или молекулы-мишени, где указанные рекомбинантные фаговые или слитые белки находятся в выделенной форме или в виде смесей.

17. Применение фаговой или клеточной библиотеки по п.10 или 11 для отбора белковых последовательностей, клонированных и экспрессированных в указанной библиотеке, которые специфически связывают антиген, антитело, лиганд, клетку.