BRPI0612589A2 - tecnoloias de apresentação em fago - Google Patents

Abstract

TECNOLOGIAS DE APRESENTAçãO EM FAGO. A presente invenção refere-se a novas tecnologias para produzir e rastrear proteínas de fusão sobre a superfície de fagos filamentosos. Em particular, um único vetor pode ser usado para gerar bibliotecas de célula e de fago contendo uma dada série de seqúências de proteína fundidas a uma ou outra de duas proteínas de revestimento de fago. Essa abordagem simplifica e melhora a eficácia da subseqúente seleção baseada em apresentação em fago de moléculas de ligação de proteína que têm utilidade terapêutica ou diagnóstica, tais como anticorpos, peptídeos ou regiões de ligação de epítopo.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TECNOLOGIAS DE APRESENTAÇÃO EM FAGO".

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se a vetores de fagomídeo melhorados parageração de bibliotecas de apresentação em fago.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As tecnologias baseadas em apresentação em fago fornecemmeios para clonar, expressar, selecionar e manipular polipeptídeos com fun-ções biológicas mediadas por sua ligação a outra proteína ou qualquer outroalvo biológico. O processo repetitivo da seleção baseada em afinidade per-mite o enriquecimento em clones relevantes isolados a partir de grandes bi-bliotecas de seqüências de proteína, tais como anticorpos, epítopos, antíge-nos, peptídeos bioativos, inibidores de enzimas, enzimas, proteínas de liga-ção ao DNA, domínios de proteína isolados, ou Iigantes de receptores.

Em combinação com outras técnicas, tecnologias de apresenta-ção em fago, que começam a partir de seqüências isoladas de qualquer tipode material contendo ácido nucléico e levam a diversos tipos de produtos(anticorpos, enzimas, peptídeos, etc.), podem satisfazer um grande númerode necessidades da biotecnologia moderna. Recentemente, vários autoresrelataram não apenas que seqüências funcionais de proteína podem ser ob-tidas usando tecnologias diferentes de apresentação em fago, mas tambémque o fago recombinante pode ser usado diretamente para muitas aplica-ções (tais como em diagnóstico, para imunização, para proteômica, comocompostos antibacterianos, na transformação celular, para biotecnologia in-dustrial, em nanotecnologias, etc.).

Além do mais, a construção de grandes repertórios de fragmen-tos de anticorpo tais como heterodímeros de cadeia pesada/leve variável (ouFabs) e regiões variáveis de cadeia única (ou scFv) expressos sobre a su-perfície de fago recombinante, seguida pela seleção baseada em afinidadede fago por "panning" em antígenos, tem sido desenvolvido como um méto-do versátil e rápido para se obter anticorpos que têm a afinidade e especifi-cidade desejadas. Esse processo de seleção pode ser subseqüentementeotimizado pela criação de repertórios de anticorpo mutante do fago selecio-nado e amostrado para descendentes que, por exemplo, se ligam ao antíge-no sob condições mais estringentes e com maior afinidade.

Tecnologias de apresentação em fago têm a vantagem da pe-quena dimensão e adaptabilidade de fago filamentoso (tais como M13, f1 ouFd), que infectam células bacterianas (em particular células de Escherichiacoli contendo F-piliJ e têm genomas de filamento simples altamente homólo-gos. Um grande número de vetores, bibliotecas e formatos de apresentaçãotem sido desenvolvido, como revisado em vários artigos recentes (Sidhu etai, 2000; Benhar, 2001; Sidhu, 2001; Szardenings, 2003; Bradbury & Marks12004; Hust & Dubel, 2004; Mancini et ai, 2004; Pini et ai, 2004; Conrad &Scheller, 2005; Hust & Dubel, 2005; Silacci et ai., 2005; Smith et ai, 2005), enos livros ("Phage display: A practical Approach", vol. 266, ed. Clackson &Lowman H1 Oxford Univ. Press, 2004; "Phage Display: A Iaboratory Manual",Burton DR et ai, CSHL Press, 2001).

As seqüências de proteína que formam a superfície do fago fila-mentoso (chamadas de proteínas de revestimento) podem acomodar e a-presentar mais ou menos eficientemente seqüências de proteínas heterólo-gas que são clonadas em suas terminações-N ou -C formando proteínas defusão. Proteínas de revestimento (cp) diferentes têm sido usadas para essepropósito, em particular a proteína de revestimento menor (também denomi-nada de proteína de revestimento III/3, g3p, glIIp, p3, plll, cplll, ou cp3) e aproteína de revestimento maior (também denominada de proteína de reves-timento VIII/8, g8p, gVlllp, p8, pVIII, cpVIII, ou cp8), mas também as outrasproteínas de revestimento cp6, cp7, e cp9 (Gao et ai., 1999; Hufton et ai.,1999; Kwasnikowski et ai, 2005). Dependendo do número de cópias nasquais a proteína de fago modificada está presente, pode ser feita uma distin-ção entre apresentação de alta valência (isto é quando a proteína de fagoestá presente em um grande número de cópias, tal como para cp8) e de bai-xa valência (isto é quando a proteína de fago está presente em um pequenonúmero de cópias, tal como para cp3, cp6, cp7 ou cp9), ambas as aborda-gens fornecendo a possibilidade de selecionar seqüências de proteína quese ligam a um alvo específico.

A fusão da proteína de revestimento com a proteína a ser apre-sentada pode ser realizada tanto pelo uso de um vetor de fago quanto umvetor de fagomídeo, fornecendo bibliotecas que podem ser rastreadas usan-do agentes de ligação específicos ou alvos (O1ConneII et ai, 2002). Em am-bos os casos, uma proteína de revestimento é modificada a fim de ser trans-crita e traduzida em uma proteína de fusão que tem uma seqüência de pro-teína heteróloga clonada em sua terminação-N e exposta por meio de umaseqüência de secreção/líder.

Quando se usa um vetor de fago, o DNA que codifica a proteínade fusão é clonado diretamente em uma proteína de revestimento do geno-ma do fago, permitindo grandes níveis de apresentação, mas com uma fortelimitação no tamanho e na estratégia de clonagem da seqüência heteróloga.Diversas variantes desse sistema foram descritas, em que combinações devariantes modificadas e não modificadas da mesma proteína de revestimen-to estão presentes no mesmo vetor de fago. Tais vetores são definidos comotipo "88", "33", ou "8+8" (Enshell-Seijffers et aí., 2001; Petrenko & Smith,2004).

Quando se usa um vetor de fagomídeo, o constructo é menor ecompreende seqüências que desencadeiam a replicação durante o ciclo ce-lular bacteriano e de fago mas que expressam apenas uma (ou poucas) dasproteínas de revestimento. Os vetores de fagomídeo são manipulados maisfacilmente pela tecnologia de DNA recombinante a fim de gerar bibliotecasde seqüências a ser expressas sobre a superfície do fago. Entretanto, essesvetores podem fornecer o fago completo apenas quando as células bacteria-nas transformadas são infectadas mais tarde com um fago completo (o fago"auxiliar") que suporta a replicação correta e a montagem do fago, fornecen-do a versão selvagem das proteínas de revestimento necessárias para a re-infecção do fago recombinante e a conseqüente amplificação.

Extensos estudos têm sido feitos sobre a possibilidade de otimi-zar os vetores e as seqüências a ser usadas para a realização dos rastrea-mentos de apresentação em fago, identificando algumas restrições no usode uma proteína de cobertura ao invés de outra (Makowski, 1993), ou dife-renças em como seqüências de proteína heterólogas são realmente apre-sentadas pelas diferentes proteínas de revestimento (lannolo et al., 1995;Weiss & Sidhu1 2000; Weiss et al., 2000; Roth et al., 2002; Li et al., 2003;Held & Sidhu, 2004).

Por exemplo, duas ou mais seqüências de proteína que têmpropriedades distintas (por exemplo, uma se liga a um antígeno e outra seliga a um Iigante presente sobre um substrato sólido, ou peptídeos que seligam a epítopos diferentes), foram apresentadas em um único fago bifun-cional (também chamado na literatura como fago de "apresentação dual" oude "apresentação dupla"). Um fago similar pode ser obtido pela clonagem decada seqüência "in frame" com uma proteína de revestimento diferente (ouuma variante diferente da mesma proteína de revestimento) em unidades detranscrição distintas no mesmo vetor de fagomídeo, montadas em variantesmono- ou bicistrônicas ou por infecção dupla de células bacterianas comdois vetores de fagomídeo, cada um para uma proteína de revestimento defusão específica (Bonnycastle et al., 1997; Malik and Perham, 1997; Gao etal., 1999; Gao et al., 2002; Chen et al., 2004; WO 98/05344; WO 95/05454,WO 01/25416). Apesar de muito eficiente, as tecnologias de apresentaçãoem fago atualmente disponíveis ainda tem espaço para aprimoramento, e aescolha da proteína de revestimento para a apresentação ainda permaneceum assunto importante.

De fato, a eficiência do sistema pode ser substancialmente afe-tada pela "adaptação" da seqüência de proteína a ser expressa, apresentadae rastreada usando uma seqüência de proteína de revestimento específicaao invés de outra, uma propriedade que pode não ser possível determinarcom antecedência. Por exemplo, considerando as proteínas de revestimentomais freqüentemente usadas para esse propósito, cp8 parece mais apropri-ada para selecionar peptídeos ou anticorpos de baixa afinidade, devido asua capacidade de ligação aumentada pela multivalência do sistema cp8.Em contraste, apresentação baseada em cp3 parece ser mais apropriadapara selecionar anticorpos de alta afinidade, dado o pequeno número de có-pias nas quais as seqüências de proteína heterólogas estão presentes sobrea superfície do fago. Entretanto, dado que a afinidade dos anticorpos emuma biblioteca é altamente variável e impossível de prever, outros fatorespodem afetar o sistema de apresentação tal como a degradação proteolíticade proteína de fusão baseada em cp3/cp8 no espaço periplasmático de E.coli, ou eventos de recombinação que eliminam seqüências incluídas no ve-tor de fagomídeo.

Problemas similares, que são ainda mais relevantes quando seconsidera peptídeos apresentados em fago, foram demonstrados em váriosartigos, indicando claramente a necessidade de construir pelo menos duasbibliotecas distintas de apresentação em fago, começando a partir da mes-ma amostra que contem DNA que codifica o repertório de anticorpo/peptídeoa ser apresentado, para uma exploração completa dessa técnica. Quando sepesquisa na literatura sobre o uso de cp3 e cp8 para apresentar e selecionarseqüências de proteínas, propriedades e/ou seqüências diferentes são rela-tadas para epítopos de proteína e peptídeos (Rousch et al., 1998; Zwick etai, 1998; Adda et al., 1999; Gao & Zhong, 1999; Yip et ai, 2001; Al-bukhariet al., 2002; O1Connor K et al., 20051), anticorpos (Kretzschmar & Geiser,1995) ou enzimas (Verhaert et al., 1999). Além disso, também foi descritomisturar duas bibliotecas de fago, cada uma gerada separadamente com umfagomídeo diferente (Jacobsson et al., 2003) ou reclonar seqüências sele-cionadas usando uma proteína de revestimento em uma biblioteca que apre-senta outra proteína de revestimento (Wang et al., 1997). Seqüências fun-cionais de proteína também foram identificadas usando bibliotecas apresen-tadas em fago em que seqüências aleatórias são clonadas sem uma orien-tação específica, mas são realmente transcritas e traduzidas direcionalmentepor meio de seqüências regulatórias e codificantes posicionadas na região 5'e 3' do sítio de clonagem, dentro da cadeia principal do vetor (Zelenetz &Levy1 1990; van Zonneveld et ai, 1995; Stratmann & Kang, 2005).

Diversos pedidos de patente descrevem variantes da tecnologiade apresentação em fago, tal como o uso combinado de cpVII e cplX (WO00/71964), a adição de sítios de restrição em vetores de fago (WO03/093471, WO 03/91425), o uso de promotores bidirecionais com seqüên-cias de cadeia pesada e leve posicionadas cabeça à cabeça em orientaçõestranscricionais opostas (Den et ai, 1999), combinações diferentes que codi-ficam seqüências arranjadas para expressão mono- ou bi-cistrônica (Kirschet aí., 2005), a introdução de mutações em proteínas de revestimento (WO02/103012; WO 00/06717) ou abordagens diferentes para a construção, ex-pressão e rastreamento de biblioteca (WO 98/20036; WO 98/14277; WO97/35196; WO 97/46251; WO 97/47314; WO 97/09446; WO 03/029456).Alternativamente, muitos documentos descrevem sistemas de clonagem ba-seados em recombinação sítio-específica para montar seqüências de proteí-nas em fagomídeos (W092/20791, W095/021914, W097/020923,WOOO/31246, W096/40714; Tsurushita et ai, 1996; Sblattero & Bradbury,2000).

Entretanto, nenhum desses documentos descreve como gerar,começando a partir de uma biblioteca de DNA que codifica proteínas heteró-Iogas e um único fagomídeo, uma única biblioteca de fago que permite aapresentação de proteínas heterólogas fundidas a qualquer uma das duasproteínas de revestimento.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece meios para clonar, produzir e ras-trear seqüências de aminoácidos como proteínas fundidas com qualqueruma de duas proteínas de revestimento sobre a superfície de fago filamen-toso, usando um único vetor de fagomídeo e uma etapa única de clonageme transformação.

Em uma primeira modalidade, a presente invenção fornece veto-res de fagomídeo para a clonagem bidirecional de um DNA que codifica umaseqüência de aminoácidos a ser fundida na terminação N de qualquer umade duas proteínas de revestimento funcionais

Em uma segunda modalidade, a presente invenção fornece ve-tores de fagomídeo que compreendem:

a) Um DNA que codifica uma primeira proteína de revesti-mento funcional que compreende um primeiro Iigante deDNA em sua extremidade 5'; e

b) Um DNA que codifica uma segunda proteína de revesti-mento funcional, que tem a direção de transcrição opostaàquela da primeira proteína de revestimento funcional eque compreende um segundo Iigante de DNA na sua extremidade 5';

em que os primeiro e segundo Iigantes de DNA compreendempelo menos um sítio idêntico para uma enzima de restrição não presentefora do dito Iigante no vetor de fagomídeo.

Exemplos de tais fagomídeos, genericamente definidos comopDD (fagomídeo para Apresentação Dupla), são aqueles que compreendemdois Iigantes de DNA separados, também chamados de Iigantes DIS, cadaum tendo sítios de restrição de Spel-Bgll adjacentes (SEQ ID NO.: 1) emsuas extremidades 5', que podem ser seguidos pela seqüência de DNA queCodifica um Iigante de proteína que forma um Iigante2 DIS (SEQ ID NO.: 2 eSEQ ID NO.: 3). Alternativamente, os sítios de restrição de Spel-Bgll podemser combinados em uma única seqüência (SEQ ID NO.: 4) que, com a adi-ção de duas seqüências de DNA distintas, cada uma codificando um Iigantede proteína à jusante e à montante nas duas filamentos, pode formar umLigante2 DD-DIS (SEQ ID NO.: 5). O Iigante de DNA pode ser transcrito "inframe" com a extremidade 5' do DNA que codifica uma proteína de revesti-mento funcional e com a extremidade 3' do DNA que codifica uma seqüênciade proteína a ser fundida e apresentada pela dita proteína de revestimentofuncional.

Em uma terceira modalidade, a presente invenção fornece veto-res de fagomídeo que compreendem um cassete de expressão de Apresen-tação Dupla (Double Display) (cassete de DD). Tal vetor ainda compreendeum cassete de DNA para a clonagem, a expressão e a apresentação de pelomenos uma seqüência de proteína a ser fundida na terminação N de qual-quer uma das ditas proteínas de revestimento funcionais por meio de um dosditos Iigante de DNA.

Após ser clonado dentro de um vetor pDD, o cassete de DD setorna operativamente ligado a uma ou outra das duas proteínas de revesti-mento funcionais, dependendo da orientação na qual o cassete de DD é clo-nado e permitindo sua transcrição e tradução em uma proteína de fusão quecompreende uma seqüência heteróloga em sua terminação N por meio deseqüências presentes dentro do cassete de DD.

Fagomídeos similares são fornecidos por meio de vetores pDDque compreendem o DNA que codifica as duas proteínas de revestimentofuncionais chamadas cp3 modificada (cp3*, SEQ ID NO.: 6) e cp8 modifica-da (cp8*, SEQ ID NO.: 8). Exemplos de tais vetores são aqueles que com-preendem cp3*DDcp8* (SEQ ID NO.: 10), cassete de DDa (SEQ ID NO.:11), ou cassete de DDb (SEQ ID NO.: 12).

O cassete de DD pode incluir um ou mais genes adicionais, porexemplo, que codificam um gene marcador de seleção, um gene que alterao metabolismo bacteriano ou uma seqüência de proteína que interage com aseqüência de proteína heteróloga fundida na terminação-N de qualquer umadas duas proteínas de revestimento funcionais. Tais genes adicionais sãotranscritos e traduzidos independentemente da orientação na qual o cassetede DD está inserido e podem ser orientados em qualquer direção.

Em uma quarta modalidade, a presente invenção fornece o usodo vetor definido acima para gerar uma biblioteca de fago ou de célula, emque cada seqüência de proteína da dita biblioteca é fundida na terminação-Nde qualquer uma das duas proteínas de revestimento funcionais por meio deum Iigante DIS.

Em uma quinta modalidade, a presente invenção fornece biblio-tecas de fago ou de célula obtidas usando os vetores definidos acima, emque cada seqüência de proteína da dita biblioteca é fundida na terminação-Nde qualquer uma das duas proteínas de revestimento funcionais por meio deum ligante DIS.

Exemplos das duas proteínas de revestimento funcionais são aproteína cp3 modificada (proteína cp3*; SEQ ID NO.: 7) e proteína cp8 modi-ficada (proteína cp8*; SEQ ID NO.: 9).

As bibliotecas podem ser geradas usando um cassete de DDque pode ser clonado em qualquer tipo de vetor, ou que já está clonado emum vetor pDD. No último caso, a biblioteca construída no cassete de DD de-ve ser submetida a digestão com uma enzima de restrição que corta dentrodo Iigante DIS e a ligação com um vetor pDD cortado com uma enzima quefornece extremidades compatíveis a fim de se obter a clonagem bidirecionaldo cassete de DD.

A biblioteca de vetores pDD pode então ser mantida na célulasbacterianas, já que os fagomídeos na biblioteca de células podem ser repli-cados usando a origem para replicação bacteriana. Alternativamente, a bibli-oteca pode ser replicada como uma biblioteca de fagos, pela infecção de taiscélulas bacterianas com o fago auxiliar, e purificados na forma de fago re-combinante contendo os fagomídeos e expressando as seqüências de prote-ínas heterólogas sobre na sua superfície, sendo fundidas na terminação-Nde qualquer uma das duas proteínas de revestimento funcionais por meio deum Iigante DIS.

Em uma sexta modalidade, a presente invenção fornece kits pa-ra gerar uma biblioteca fago ou de célula em que cada seqüência de proteí-na da dita biblioteca é fundida na terminação-N de qualquer uma das duasproteínas de revestimento funcionais por meio de um Iigante DIS, compre-endendo um vetor definido acima.

Em uma sétima modalidade, a presente invenção fornece méto-dos para produzir uma biblioteca de fago ou célula em que cada seqüênciade proteína da dita biblioteca é fundida na terminação-N de qualquer umadas duas proteínas de revestimento funcionais por meio de um Iigante DIS,que compreende:

a) inserir um cassete de DD em correspondência aos IigantesDIS de um vetor de fagomídeo para a clonagem bidirecionalde um DNA que codifica uma seqüência de aminoácidos aser fundida na terminação-N de qualquer uma das duas pro-teínas de revestimento funcionais; e

b) transformar as células com os vetores resultantes.

A inserção do dito cassete de DD pode ser obtida pela ligaçãode um cassete de DD e um vetor que tenha sido digerido com Bgll e temextremidades compatíveis.

Fago recombinante, assim como proteínas de fusão, obtidos pe-los os métodos da invenção podem ser usados, em formas isoladas ou emforma de misturas, para ligar, detectar, neutralizar, e/ou alterar um ligante,uma célula ou uma molécula-alvo. Essa atividade do fago recombinante oudas proteínas de fusão pode ser detectada in vivo e/ou in vitro.

Em todas as modalidades, a seqüência de proteína heterólogaque está fundida na terminação-N de qualquer uma de duas proteínas derevestimento funcionais por meio de um ligante DIS pode ser um anticorpo,um fragmento de anticorpo, um epítopo, uma região de ligação a epítopo,um antígeno, um alérgeno, um peptídeo bioativo, uma enzima, um inibidorde enzima, um sítio catalítico enzimático, uma proteína de ligação a DNA,um domínio de proteína isolado, um ligante para receptores, um fator decrescimento, uma citocina, e fragmentos contíguos ou superpostos de umaseqüência de proteína de interesse.

Modalidades adicionais da presente invenção, incluindo DNArecombinante isolado e seqüências de proteína assim como outros métodose usos, serão fornecidas na descrição a seguir.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Alinhamento do DNA e seqüência de proteína do DNA(SEQ ID NO.: 6) e proteína (SEQ ID NO.: 7) de cp3*. Na extremidade 5', oIigante2 DIS (sublinhado; SEQ ID NO.: 2 e SEQ ID NO.: 3), incluindo os sí-tios de restrição Spel e Sfil (dentro de retângulo; SEQ ID NO.: 1) e a se-qüência que codifica o ligante Gly4Ser (para um total de 12 aminoácidos),está fundido "in frame" com a 5' do fragmento de DNA que codifica os ami-noácidos 216-424 da proteína de revestimento cp3 de Enterobacteria phageM13 (seqüência de proteína do SWISSPROT No. de Acesso P69168; se-qüência de nucleotídeo do GENBANK No. de Acesso, NC_003287, fragmen-to 2224-2853 incluindo o códon de parada original). Na extremidade 3', umsítio Nhel (dentro de retângulo) é adicionado por PCR logo após o códon deparada (sublinhado). A substituição do nucleotídeo A523 para G523 (que leva àsubstituição de Sen7Spor Glyns) também está dentro de um retângulo.

Figura 2: Eletroforese em gel de agarose mostrando o produtode amplificação do DNA de cp3* obtido pelo uso dos iniciadores cp3*FW(SEQ ID NO.: 13) e cp3*RW (SEQ ID NO.: 14), aparecendo como uma ban-da de aproximadamente 680 bp.

Figura 3: (A) Seqüência do Iigante HA tag que resulta do ane-Iamento dos oligonucleotídeos do Iigante HA tag FW (SEQ ID NO.: 17) e Ii-gante HA tag RW (SEQ ID NO.: 18). As extremidades 5' de filamento sim-ples, uma compatível com os sítio de restrição Xhol (CTCGAG) e a outracom Spel (ACTAGT), estão sublinhadas. (B) Alinhamento do DNA e seqüên-cia de proteína do DNA (SEQ ID NO.: 19) e seqüência de proteína (SEQ IDNO.: 20) de HAcp3*. A seqüência de 221 aminoácidos de cp3* está fundidacom a seqüência líder PeIB (SEQ ID NO.: 25) e o HA tag, gerando uma se-qüência de proteína de 258 aminoácidos.

Figura 4: Representação esquemática dos vetores de fagomí-deo pRIB1-cp3* (A), pRIB1-HAcp3* (B), e pRIB1-e44cp3* (C) compreenden-do dois promotores LacZ (LacZp) que estão operativamente ligados a se-qüência líder/secretora de PeIB. O segmento LaczP-PeIB está fundido "inframe" com cp3* apenas (em A), com cp3* contendo ainda HA tag (HA, emB) ou as seqüências de cadeia pesada e44 (e44HC, em C), ou com a cadeialeve e44 (e44LC, em C). Outros elementos relevantes, tais como os genesde resistência a ampicilina (Ampr) e ao cloranfenicol (CAT)1 assim como sí-tios de clonagem e origens de replicação estão indicados.

Figura 5: Western blots de extratos celulares totais de E. ColiXLIBIue transformada com uma série de vetores pRIB1. (A) Expressão deHA tag detectada usando anticorpos anti-HA tag em células bacterianastransformadas com pRIB1-cp3* (controle negativo) ou pRIB1-HAcp3*. (B)Expressão de Fab e44 detectada usando anticorpos anti-Fab humanos emcélulas bacterianas transformadas com pRIB1-e44cp3 (controle positivo) oupRIB1-e44cp3*. A banda da cadeia pesada e44 é discretamente maior devi-do à adição da seqüência codificada pelo Iigante2 DIS. A quantidade de ca-deias leves é maior já que a expressão dessa proteína não é limitada peladimensão da proteína de revestimento fundida a cadeia pesada.

Figura 6: (A) Alinhamento da seqüência de DNA e de proteínade cp8* (SEQ ID NO.: 8 e SEQ ID NO.: 9). Na extremidade 5', o Iigante2 DIS(sublinhado; SEQ ID NO.: 2 e SEQ ID NO.: 3), incluindo os sítios de restriçãoSpele Sfil (dentro de um retângulo; SEQ ID NO.: 1) e a seqüência que codi-fica o Iigante Gly4Ser (para um total de 12 aminoácidos) está fundida "inframe" com a 5' do fragmento de DNA que codifica os aminoácidos 24-73 daproteína de revestimento cp8 de Enterobacteria phage (seqüência de proteí-na de No. de Acesso do SWISSPROT P69541; seqüência de nucleotídeo doGENBANK No. de Acesso, NC_003287, fragmento 1370-1522 incluindo ocódon de parada original). Na extremidade 3', um sítio de Nhel é adicionadopor PCR logo após o códon de parada (sublinhado). (B) Eletroforese em gelde agarose mostrando o produto de amplificação de DNA de cp8* obtido pe-lo uso dos iniciadores cp8*FW (SEQ ID NO.: 15) e cp8*RW (SEQ ID NO.:16), e que aparece como uma banda de aproximadamente 200 bp.

Figura 7: Alinhamento da seqüência de DNA e de proteína deHAcp8* (SEQ ID NO.: 21 e SEQ ID NO.: 22). A seqüência de 62 aminoáci-dos de cp8* resulta fundida com a seqüência líder de PeIB (SEQ ID NO.: 25)e HA tag, gerando uma seqüência de proteína de 99 aminoácidos.

Figura 8: Western blots de extratos celulares totais de E. ColiXLIBIue transformada com uma série de vetores pRIB2. (A) Expressão deHA tag detectada usando anticorpos anti- HA tag em células bacterianas nãotransformadas (controle negativo) ou transformadas com pRIB2-HAcp8*(HAcp8* nas formas madura e imatura pode ser distinguida). (B) Expressãode Fab e44 detectada usando anticorpos anti-Fab humanos em células bac-terianas não transformadas (controle negativo) ou transformadas compRIB2-e44cp8*.

Figura 9: Produção de um fago recombinante apresentando pro-teínas de revestimento modificadas por Iigante2 DIS1 comparando a unidadeformadora de colônia (cfu) por microlitro medida para fago expressando cp3normal (controle positivo; usando pRIB-cp3) ou cp3*, tal como (usandopRIB1-cp3*; A), fundido a HA tag (usando pRIB-HAcp3 e usando pRIB1-HAcp3*; Β), ou fundido a Fab e44 (usando pRIB-e44cp3 e usando pRIB1-e44cp3*; C).

Figura 10: Produção de fago recombinante apresentando prote-ínas de revestimento contendo o Iigante2 DIS, comparando a unidade for-madora de colônia (cfu) por microlitro medida para fago que expressa oscontroles positivos, cp3 normal como tal (usando pRIB-cp3) ou fundida a fabe44 (usando pRIB-e44cp3) comparado àquela que expressa e44cp8* (usan-do pRIB2-e44cp8*; A), cp8* (usando pRIB2-cp8*; B), ou HAcp8* (usandopRIB2-HAcp8*; C).

Figura 11: Experimentos de "panning" usando fago recombinan-te expressando HA-cp3* (usando pRIB1-HAcp3*; A) ou HA-cp8* (usandopRIB2-HAcp8*; B) contra albumina sérica bovina (BSA), anticorpo anti- HAtag (anti-HA), ou proteína E2 do vírus da hepatite C (E2) como agente Iigan-te. O eixo de Y mostra o valor dos fagos que são eluídos no final do proce-dimento ao agente de ligação (fago OUTPUT, calculado de acordo com afórmula Ill no texto, em cfu/μΙ).

Figura 12: Experimentos de "panning" usando fago recombinan-te expressando e44-cp3 ou e44-cp3* (usando pRIB2-e44cp3*; A) e e44-cp8*(usando pRIB2-e44cp8*; B) contra albumina sérica bovina (BSA), ou proteí-na E2 do vírus da hepatite C (E2) como agente de ligação. O eixo de Y mos-tra o valor dos fagos que são eluídos no final do procedimento ao agente deligação (fago OUTPUT, calculado de acordo com a fórmula Ill no texto, emcfu/μΙ).

Figura 13: (A) Estrutura do vetor de fagomídeo pBS-DDdeltaBglno qual um Iigante pDD que compreende os sítios de restrição necessáriospara manipulação adicional foi clonado. (B) Fluxograma mostrando a estra-tégia de clonagem para modificar pBS-DDIigante2 (derivado de pBS-DDdeItaBgI) em pDD-cp3*cp8*, que está representado esquematicamente.O DD-DIS Iigante2 está ao lado das extremidades 5' do DNA que codifica asduas seqüências de proteína de revestimento modificadas clonadas em dire-ções opostas.

Figura 14: Representações esquemáticas dos cassetes de DD ede seus elementos (sem escala). (A) aspectos básicos e arranjo de elemen-tos de DNA1 incluindo sítios únicos genéricos para enzimas de restrição (S-REs) ou sítios únicos para enzimas de restrição específicas para o IiganteDIS (DIS-SREs) em um cassete de DD; (B) aspectos básicos e arranjo deelementos de DNA1 sítios de Bgll e Spel, SREs, e de um gene marcador emum cassete de DD para expressar um peptídeo único ou proteína funcionalcomo uma proteína de fusão com uma proteína de revestimento funcional.(C) aspectos básicos e arranjo de elementos de DNA, sítios de Bgll e Spel,SREs1 e um de gene marcador em um cassete de DD para expressar umFab em que a região variável de uma cadeia pesada é expressa como umaproteína de fusão com uma proteína de revestimento funcional e a regiãovariável de uma cadeia leve é expressa por um gene separado dentro domesmo cassete de DD. (D) aspectos básicos e arranjo de elementos deDNA, sítios Bgll e Spel, SREs, e um de gene marcador em um cassete deDD para expressar duas seqüências dentro de um único transcrito em queaquela que começa após o Sítio de Ligação a Ribossomo (RBS) está ex-pressa como uma proteína de fusão com um revestimento funcional. A posi-ção respectiva e número de marcador ou outros genes não expressos comouma proteína de fusão com uma proteína de revestimento funcional, assimcomo a posição e número de SREs, são meramente exemplares podem e- ser adaptados para o uso específico do cassete de DD. A seta no alto decada representação esquemática indica a direção de transcrição apontandodo cassette de DD para o esqueleto do vetor e, no caso o cassette de DDestá clonado em um vetor pDD, onde está presente a proteína de revesti-mento funcional que está fundida por meio do Iigante DIS.

Figura 15: Estrutura do protótipo do vetor de fagomídeo da in-venção incluindo cp3* e cp8* (pDD-cp3*cp8*), que pode incluir seqüênciasdiferentes quando vazio (por exemplo, um Iigante simples DD-DIS, DNA"stuffer" ou um gene marcador). Sempre que um vetor vazio é usado, a in-serção do cassette de DD fornece duas formas do vetor pDD, uma contendoo gene para apresentar a proteína de fusão com cp8* (pDD-Fuscp8*) e aoutra, o gene para apresentar a proteína de fusão com cp3* (pDD-Fuscp3*).Esses genes recombinantes estão indicados com a linha mais grossa.

Figura 16: seqüência de cp3*DDcp8* (SEQ ID NO.: 10), apre-sentando um Iigante2 DD-DIS (SEQ ID NO.: 4) que inclui a seqüência for-mada pelo sítio duplo de Bgll e o sítio único de Spel (SEQ ID NO.: 4) queestá ligada com a seqüência de DNA que codifica cp3* (em 5' ao Iigante2DD-DIS; a seqüência de proteína correspondente é mostrada abaixo da fila-mento anti-sentido) e a seqüência de DNA que codifica cp8* (em 3' ao Iigan-te2 DD-DIS; a seqüência de proteína correspondente é mostrada sobre afilamento de sentido). Essa seqüência é compreendida em pDD-cp3*cp8* dafigura14e15.

Figura 17: seqüência de um cassete de DD exemplar (cassetteDDa; SEQ ID NO.: 11) compatível com um vetor pDD, tal como aqueles es-boçados na Figura 15 ou com pDD-cp3*cp8*, com os sítios de restrição rele-vantes, os dois promotores LacZ distintos (LacZp) e o códon de partida PeIBpara a seqüência a ser clonada entre Sacl e Xbal (que é expressa constituti-vamente no cassete de DD) e para a seqüência a ser clonada entre Xhol eSpel (que é expressa constitutivamente no cassete de DD quando o cassetede DD está fundido a uma proteína de revestimento funcional por meio deum Iigante DIS), os códons de partida e parada do gene de resistência aocloranfenicol (CAT) e o HA tag que é usado como DNA "stuffer" entre a se-qüência de PeIB e o Iigante DIS. O gene CAT também pode "ser clonado nadireção oposta.

Figura 18: seqüência de um cassette de DD exemplar (cassetteDDb; SEQ ID NO.: 12) compatível com um vetor pDD, tal como aqueles es-boçados na Figura 15 ou pDD-cp3*cp8*, com os sítios de restrição relevan-tes, os dois promotores de LacZ distintos (LacZp) e os códons de partida dePeIB para a seqüência a ser clonada entre Sacl e Xbal (que é expressaconstitutivamente no cassete DD) e para seqüência a ser clonada entre Xhole Spel (que é expressa constitutivamente no cassete de DD quando o cas-sete de DD está fundido a uma proteína de revestimento funcional por meiode um Iigante DIS), os códons de partida e de parada do gene de resistênciaa Zeocina (ZEO), e o HA tag que é usado como DNA "stuffer" entre a se-qüência de PeIB e o Iigante DIS. O gene ZEO também pode ser clonado nadireção oposta.

Figura 19: análise de restrição de clones de pDD-cp3*cp8* sele-cionados aleatoriamente nos quais o cassete DDa (A) ou DDb (B) foi clona-do usando os sítios de restrição de Bgll e digeridos com Nhel (cortando naterminação 3' de cp3* no vetor) e Xbal (posicionado próximo ao sítio de res-trição de Bgll não ligado à proteína de revestimento funcional) nos cassetesDDa e DDb. Comparado a um marcador de DNA (Μ), o DNA de plasmídeoextraídos dos clones nos quais o cassete está inserido "in frame" com cp3*apresenta dois fragmentos que têm uma extensão mais similar (clones 1, 3,e 4 no painel A; clones 2, 4, e 6 no painel B) do que aqueles nos quais ocassete está inserido "in-frame" com a seqüência cp8* mais curta (clones 2,5, e 6 no painel A; clones 1, 3, e 5 no painel B). Isso é devido à maior di-mensão da seqüência de cp3* comparada a de cp8*.

Figura 20: Experimentos de "panning" usando fago recombinan-te apresentando o peptídeo HA (painel A) ou fab e44 (painel B) fundido comcp3* ou cp8* e "panned" usando anticorpo anti-peptídeo HA (anti-HA; painelA) ou proteína recombinante E2 do vírus da Hepatite C (E2; painel B) comoagente de ligação. Em ambos os casos, a albumina sérica bovina (BSA) foiusada como agente de ligação negativo. O peptídeo e fab foram expressosusando um fagomídeo pDD-cp3*cp8* que "inclui um cassete de DD expres-sando o gene CAF e os vetores baseados em pRIB1 (para o controle positi-vo de cp3*) ou vetores baseados em pRIB2 (para o controle positivo decp8*). O vetor pRIB, expressando apenas cp3, é fornecido como controlenegativo. O eixo Y mostra o valor dos fagos que são eluidos no final do pro-cedimento ao agente de ligação (fago OUTPUT, calculado de acordo com afórmula Ill no texto).

Figura 21: Experimentos de "panning" usando fago recombinan-te apresentando o peptídeo HA (painel A) ou fab e44 (painel B) fundido comcp3* ou cp8* e "panned" usando anticorpo anti-peptídeo HA (anti-HA; painelA) ou proteína recombinante E2 do vírus da Hepatite C (E2; painel B) comoagente de ligação. Em ambos os casos, a albumina sérica bovina (BSA) foiusada como agente de ligação negativo. O peptídeo e fab foram expressosusando um fagomídeo pDD-cp3*cp8* que inclui um cassete de DD que ex-pressa o gene CAF ou ZEO como marcador de seleção. Vetores baseadosem pRIB1 (para o controle positivo de cp3*) ou os vetores baseados empRIB2 (para o controle positivo de cp8*) também foram usados. O eixo de Ymostra o valor dos fagos que são eluídos no final do procedimento ao agentede ligação (fago OUTPUT1 calculado de acordo com a fórmula Ill no texto).

Figura 22: Análise de restrição (A) e Western blot (B) de clonesescolhidos aleatoriamente de uma biblioteca de E. coli baseada em pDDb. Onúmero que identifica cada clone está indicado acima de (A) e foi mantidoem (B). Os clones que têm o mesmo padrão de restrição (veja figurai9) fo-ram colocados ao lado um do outro quando se preparou o Western blot.

Figura 23: Fluxograma delineando o processo de preparação debibliotecas e seleção de fago recombinante usando os vetores da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O problema técnico que fundamenta a presente invenção é co-mo estabelecer um sistema simples e eficaz que permite a expressão deuma seqüência de aminoácido a ser expressa e apresentada como uma pro-teína de fusão com qualquer uma de duas proteínas de revestimento de fagoalternativas em um fago filamentoso, sem clonar essa seqüência duas ve-zes, tanto em um único como em dois vetores de fagomídeo, e/ou sem infec-tar células bacterianas duas vezes.

A solução para esse problema técnico é obtida pela construçãode vetores de fagomídeo que permitem a clonagem bidirecional de um DNAque codifica uma seqüência de aminoácido a ser fundida na terminação-Nde qualquer uma de duas proteínas de revestimento funcionais do fago re-combinante.

Os elementos básicos desse vetor, genericamente definidos co-mo pDD (fagomídeo para Apresentação Dupla) são:

a) um DNA que codifica uma primeira proteína de revestimentofuncional que compreende um primeiro Iigante de DNA nasua extremidade 5'; eb) um DNA que codifica uma segunda proteína de revestimen-to funcional, que tem a direção de transcrição oposta àquelada primeira proteína de revestimento funcional e que com-preende um segundo Iigante de DNA na sua extremidade 5';em que o primeiro e o segundo Iigantes de DNA compreendempelo menos um sitio idêntico para uma enzima de restrição não presente forado dito Iigante no vetor de fagomídeo.

Seqüências Iigantes de DNA específicas a ser incluídas nos ve-tores da invenção são daqui por diante indicadas como "ligantes DIS" (ligan-tes de Sítio de Inserção e Apresentação). O sítio idêntico para uma enzimade restrição é planejado para fazer as extremidades 5' das proteínas de re-vestimento funcionais compatíveis uma com a outra, ou ao sítio de inserçãode um fragmento de DNA que tem o mesmo sítio nas suas extremidades,quando digerido com tal enzima e exposto a uma reação de ligação simples(devido às extremidades 3' / 5' cegas ou de filamento simples, complementa-res).

Além disso, o Iigante DIS deve ser desenhado de uma forma queele possa ser transcrito "in frame" com a extremidade 5' do DNA que codificauma proteína de revestimento funcional, e com a terminação 3' do DNA quecodifica uma seqüência de proteína a ser fundida e apresentada pela ditaproteína de revestimento funcional. Dessa forma, a proteína de revestimentofuncional e a seqüência de proteína a serem apresentadas são conseqüen-temente separadas por um Iigante de proteína codificado pelo Iigante DIS.Esse Iigante de proteína não deve alterar qualitativamente (por exemplo,devido ao seu tamanho ou sua afinidade por um ligante) as propriedadestanto da proteína de revestimento funcional como da seqüência e proteína aser apresentada.

Ligantes similares foram descritos para vetores de fagomídeo naliteratura e podem ser adaptados às necessidades da invenção em relaçãoao tipo de sítio de restrição e posição. Os exemplos (figurai e 6) mostramum ligante DIS que inclui dois sítios de restrição (SEQ ID NO: 1) que podemser combinados com uma seqüência adicional que codifica um liganteGly4Ser, o Iigante2 DIS em formação (SEQ ID NO: 2 e SEQ ID NO.: 3). Li-gantes particularmente preferidos são aqueles que fornecem um alto grau demobilidade à proteína de fusão no ponto do ligante. Um Iigante exemplar epreferido tem a fórmula (Gly4Ser)n, onde η é 1-5. Ligantes adaptados paraFab ou Scfv foram identificados na literatura (Hennecke et al., 1998). Os doisIigantes DIS nos vetores de fagomídeo podem ser simplesmente compatí-veis (isto é, têm um ou mais sítios de restrição idênticos) ou idênticos (isto é,têm também seqüência ligante idêntica, como nos exemplos).

O arranjo de seqüências de DNA que codificam o ligante DIS eseqüências de proteína de revestimento funcionais pode ser obtido de acor-do com diferentes critérios e situações apresentadas nos exemplos e nasfiguras. Os fagomídeos da invenção podem conter dois Iigantes DIS separa-dos por uma seqüência de DNA que tem extensão e características variá-veis, mas os dois Iigantes DIS também podem ser também ligados direta-mente um ou outro por meio do sítio de restrição comum, como mostradopara o Iigante2 DD-DIS (figurai6; SEQ ID NO.: 4: e SEQ ID NO.: 5).

Proteínas de revestimento modificadas com seqüências adapta-doras/ligantes, incluindo sítios de restrição similares àqueles que definem oligante DIS1 foram descritos na técnica anterior (WO 04/078937, WO03/091425, WO 02/088315, WO 99/29888). Entretanto, nenhum desses do-cumentos descreve a combinação e o arranjo físico de dois Iigantes DIS emum vetor de fagomídeo a fim de obter a clonagem direcional de uma se-qüência de proteína fundida a qualquer uma de duas proteínas de revesti-mento funcionais.

Além disso, a presença dos Iigantes DIS e das proteínas de re-vestimento funcionais correspondentes clonadas em orientação oposta (istoé, sendo cada transcrita a partir de um filamento diferente) em um vetorpermite a construção de vetores de fagomídeo que compreendem ainda umcassete de DNA para a clonagem, a expressão e a apresentação de pelomenos uma seqüência de proteína a ser fundida na terminação-N de qual-quer uma das ditas proteínas de revestimento funcionais por meio de um dodito ligante DIS.O cassete de DNA específico que permite a clonagem, a ex-pressão e a apresentação de pelo menos uma seqüência de proteína a serfundida na terminação-N de qualquer uma das ditas proteínas de revesti-mento funcionais por meio de um dos ditos Iigantes DIS é daqui em dianteindicado como cassete de expressão de Apresentação Dupla (Cassete deDD). Formas diferentes nas quais um cassete de DD pode ser gerado sãoapresentadas na figurai 4.

Após ser clonado dentro de um vetor pDD por meio do sítio derestrição comum aos Iigantes DIS presentes dentro do vetor, o cassete deDD se torna operativamente ligado a qualquer uma das duas proteínas dérevestimento funcionais, dependendo da orientação na qual o cassete de DDé clonado, permitindo sua transcrição e tradução em uma proteína de fusãoque compreende uma seqüência heteróloga na sua terminação-N por meiodas seqüências presentes dentro do cassete de DD do Iigante DIS.

De fato, cada segmento de DNA que codifica uma proteína derevestimento funcional, sendo montada em um vetor pDD com um sentidodiferente de transcrição mas sem um promotor apropriado, requer a inserçãocorreta de um promotor (e de uma seqüência de proteína de partida conten-do ATG a ser fundida na extremidade 5', se não houver) a fim de ser trans-crito e traduzido, que pode ser fornecido por um cassete de DD. Dadas asduas orientações opostas nas quais o cassete de DD pode ser inserido, issoserá obtido para apenas uma das proteínas de revestimento funcionais emcada vetor pDD contendo um cassete de DD (figurai5).

Estatisticamente, há chances iguais de que o cassete de DD se-ja inserido em um sentido ou outro, e ao mesmo tempo há várias cópias decada cassete de DD disponíveis na mistura de ligação. Portanto, espera-seque uma biblioteca construída com o vetor pDD e vários fragmentos de DNAbaseados no mesmo cassete de DD (e diferente para seqüência de proteínaheteróloga que é clonada dentro dela) conterá pelo menos um par de veto-res pDD tendo cada cassete de DD que é clonado em uma ou outra orienta-ção. Dessa forma, a população de fagos recombinantes de células que for-mam uma biblioteca construída de acordo com os métodos da invenção re-presenta potencialmente um repertório de seqüências de proteína heterólo-gas em dois formatos (isto é, fundido a qualquer uma das proteínas de re-vestimento funcionais).

Uma "proteína de revestimento funcional" deve ser planejadacomo uma proteína de revestimento inteira, ou uma porção dela de um fagofilamentoso que é capaz de ser inserida no revestimento do fago e de apre-sentar uma seqüência heteróloga fundida na sua terminação-N na superfíciedo dito fago. A proteína de revestimento pode ser uma daquelas codificadaspor qualquer fago filamentoso (por exemplo, M13, fl e fd), incluindo cp3, cp7,cp8 ou cp9.

Como mostrado nos exemplos com o DNA que codifica as duasproteínas de revestimento funcionais chamadas cp3 modificada (cp3*, SEQID NO.: 6 e SEQ ID NO.: 7) e cp8 modificada (cp8*, SEQ ID NO.: 8 e SEQ IDNO.: 9), tanto a primeira como a segunda seqüência das proteínas de reves-timento funcionais clonados nos fagomídeos da invenção não contêm asseqüências necessárias para sua expressão correta na sua extremidade 5'(figurai e 6). Apenas após a inserção de uma seqüência heteróloga a serapresentada, junto com as seqüências regulatórias apropriadas, a primeiraou a segunda proteína de revestimento funcional é de fato transcrita e tradu-zida em uma proteína de fusão que apresenta tal seqüência heteróloga.

Os exemplos também mostram que o DNA que codifica cp3* ecp8* pode ser clonado diretamente na orientação oposta e ligado um ou ou-tro por meio de um sítio de restrição comum, formando um Iigante2 DD-DISque está compreendido na seqüência resultante chamada cp3*DDcp8* (figu-rais; SEQ ID NO.: 10).

Variantes funcionais naturais dessas proteínas são conhecidas,e variantes específicas das proteínas de revestimento naturais como proteí-nas de revestimento funcionais são descritas nos exemplos. Um grande nú-mero de variantes de proteína de revestimento não naturais também foi ex-presso e testado quanto às suas propriedades em apresentar seqüências deproteína heterólogas (lannolo etal., 1995; Gao C et ai, 1999; Petrenko etal.,2002; Weiss etal., 2003; Weiss & Sidhu, 2000; Held & Sidhu, 2004; Kwasni-kowski et ai, 2005). Qualquer uma dessas variantes não naturais e naturaisalternativas de seqüências de proteína de revestimento que permitem a a-presentação da proteína fundida na sua terminação-N pode ser usada nosvetores da invenção como proteínas de revestimento funcionais.

Além disso, a proteína de revestimento funcional também podeconter uma ou mais seqüências heterólogas curtas (comumente referidascomo seqüências "sinalizadoras") que devem estar localizadas em uma po-sição que não afeta a expressão correta e atividades de apresentação. Es-sas variantes das proteínas de revestimento funcionais compreendem umadas seqüências de aminoácido como definido acima e uma seqüência deaminoácido que fornece propriedades adicionais sem prejudicar significati-vamente a atividade de apresentação da proteína. Exemplos de tais proprie-dades adicionais fornecem um procedimento de detecção mais fácil, umaporção de ligação adicional, ou a modificação pós-traducional da proteína defusão (por exemplo, fosforilação, digestão endoproteolítica).

Desenho de moléculas e Iigantes assim como métodos e estra-tégias para a construção, purificação, detecção e uso de proteínas de fusãosão amplamente discutidos na literatura (Nilsson et al., 1997; "Applications ofchimeric genes and hybrid proteins" Methods Enzymol. Vol. 326-328, Aca-demic Press, 2000; WO 01/77137).

Tais "seqüências de proteína adicionais podem ser posicionadasno vetor de fagomídeo dentro do Iigante DIS, dentro de uma ou ambas asproteínas de revestimento funcionais, ou entre o Iigante DIS e a região N-terminal de uma ou ambas as proteínas de revestimento funcionais. Alémdisso, essa seqüência adicional pode ser posicionada em correspondênciade apenas uma ou ambas as seqüências de proteína de revestimento fun-cionais presentes no fagomídeo da invenção, ou ela pode ser diferente deuma ou da outra proteína de revestimento. Essa abordagem pode ajudar nadetecção e no isolamento de todos os fagos nas bibliotecas geradas de a-cordo com os métodos da invenção nos quais o cassete de apresentaçãofuncional (o cassete de expressão de Apresentação Dupla, ou cassete deDD) foi inserido de uma forma que a seqüência de proteína heteróloga éfundida a um proteínas de revestimento funcionais específicas.

Portanto, é de interesse particular incluir seqüências tais comopoliistidina, FLAG, c-Myc, HA tag, sítios proteolíticos, ou qualquer outra se-qüência "sinalizadora" curta que pode ser detectada ou imobilizada por meiode substratos, enzimas ou anticorpos específicos. "Sinalizadores" diferentes(sozinhos ou em uma combinação precisa) podem estar presentes no vetorde fagomídeo, ajudando a identificação in vivo ou in vitro da proteína de fu-são, ou sua purificação. Várias seqüências sinalizadoras foram testadas pa-ra diferentes proteínas de revestimento (Nakashima et ai, 2000). O sinaliza-dor também pode permitir partição em duas fases aquosas (Bandmann etai, 2002) ou detecção mediada por fluorescência (Morino et ai, 2001). Se-qüências adicionais similares podem agir como condutor entre a proteína derevestimento e a seqüência heteróloga a ser apresentada, como mostradopara condutores ricos em prolina que são capazes de melhorar a apresenta-ção na proteína de revestimento (Nakayama et ai, 1996).

O termo "seqüência de proteína heteróloga" indica que a se-qüência não ocorre naturalmente como uma seqüência de aminoácido ounucleotídeo de um fago filamentoso de ocorrência natural. No contexto deuma proteína de fusão, uma seqüência heteróloga não ocorre na mesmaseqüência de polipeptídeo que um polipeptídeo natural respectivo. A se-qüência de proteína sob consideração compreende tipicamente pelo menos5 aminoácidos.

Uma "primeira" e uma "segunda" proteínas de revestimento fun-cional devem ser planejadas como duas seqüências diferentes de proteínasde revestimento funcionais, como mostrado nos exemplos com proteína cp3modificada (proteína cp3*; SEQ ID NO.: 7) e proteína cp8 modificada (prote-ína cp8*, SEQ ID NO.: 9). Eles devem derivadas do mesmo fago ou de fagosdiferentes, e cada uma deve corresponder a uma proteína de revestimentodiferente conhecida por ser capaz de apresentar seqüências heterólogassobre a superfície do dito fago, o a mesma proteína de revestimento modifi-cada no nível da seqüência de duas maneiras diferentes (por exemplo umaversão curta e uma longa, uma versão mutada e uma natural, uma versãosinalizada e uma não sinalizada, duas seqüências sinalizadas de forma dife-rente, etc).

Os DNAs que codificam as duas proteínas de revestimento fun-cionais dividem fisicamente o vetor de fagomídeo pDD em duas partes (vejafigurai 5):

a) o esqueleto, que é a região compreendida entre as extremi-dades 3' do DNA que codifica cada uma das duas proteínasde revestimento funcionais e que contém os elementos ne-cessários mínimos para replicação em bactérias e fagos, epossivelmente genes adicionais tais como um primeiro genepara um marcador de seleção;

b) a região compreendida entre as extremidades 5' dos Iigan-tes DIS na extremidade 5' de cada DNA que codifica umaproteína de revestimento funcional, onde o cassete de DDestá clonado ou pode ser clonado por meio de Iigantes DIS.

A literatura fornece vários exemplos de elementos mínimos ne-cessários para replicação em bactérias e fagos, tais como a origem CoIEI ef1 (+) incluídas nos vetores descritos nos exemplos.

O conteúdo do cassete de apresentação é determinado pela se-qüência clonada dentro dos sítios de restrição presentes nos ditos IigantesDIS. Quando o vetor de fagomídeo é desprovido de qualquer seqüência aser apresentada (um vetor "vazio"), o cassete de expressão pode (figurai 5):

a) estar simplesmente ausente, estando os dois sítios DIS fun-didos em apenas um devido às terminações compatíveisdos sítios de restrição comuns.

b) consistir em uma seqüência de DNA não codificante, nãoessencial (comumente referida como seqüência "stuffer");

c) compreender o gene para um segundo gene marcador deseleção (diferente daquele compreendido na estrutura prin-cipal) que está separado dos dois Iigantes DIS por duas se-qüências de DNA "stuffer" posicionadas nas extremidades 5'e 3'.Um "gene marcador de seleção" deve ser planejado como umgene que codifica uma proteína que permite a seleção positiva ou negativada célula que expressa o dito gene. No contexto da presente invenção, ogene pode codificar, por exemplo, uma proteína que permite a resistência dacélula bacteriana transformada com o vetor de fagomídeo a um antibiótico,ajudando a manutenção do vetor. A escolha do marcador de seleção especí-fico para cada elemento do sistema (isto é, o esqueleto, o cassete de apre-sentação, e o cassete de expressão de apresentação dupla) dá a oportuni-dade de aplicar critérios de seleção apropriados para isolar bactérias quecontêm o vetor de fagomídeo desejado. Genes bacterianos típicos de resis-tência a fármacos são aqueles que conferem resistência a amplicilina, tetra-ciclina, neomicina, zeocina ou cloranfenicol

Uma primeira seqüência de DNA "operativamente ligada" a umasegunda seqüência de DNA deve ser pretendido que as duas seqüências deDNA são unidas de uma forma que a primeira seqüência de DNA (geralmen-te compreendendo um promotor não-/regulável ou outro sitio regulatóriotranscricional) permite, ou modifica em alguma extensão mensurável, atranscrição da segunda seqüência de DNA (por exemplo, uma fase abertade leitura completa ou parcialmente completa de um gene). A presença deuma seqüência promotora operativamente ligada a uma seqüência de sinal eapontando para uma extremidade específica do cassete de DD faz a trans-crição direcional do cassete para o esqueleto de pDD, determinando a assi-metria funcional do cassete de DD comparada com a simetria funcional doselementos que permitem a inserção do cassete de DD.

O uso do vetor pDD para apresentar seqüências de proteína he-terólogas é permitido pela substituição do cassete de apresentação no vetor"vazio" por um cassete de DD apropriado gerado por clonagem e/ou proce-dimentos de PCR.

Um "cassete de expressão de Apresentação Dupla" (cassete deDD) deve ser planejado como um fragmento de DNA linear que tem extremi-dades 5' e 3' compatíveis com um sítio de restrição presente nos IigantesDIS do vetor de fagomídeo (e geralmente ausente do resto do dito cassete),ainda compreendendo pelo menos uma região promotora induzível ou cons-titutiva operativamente ligada a uma seqüência líder de partida, contendoATG, localizada em uma de duas extremidades do fragmento linear e quecodifica a seqüência de proteína a ser apresentada na terminação-N dequalquer uma das proteínas de revestimento funcionais presentes no esqueleto.

Como mostrado na figurai 4, o cassete de DD é formado pelajustaposição assimétrica de segmentos de DNA que têm função diferente,geralmente separados por um ou mais sítios para enzimas de restrição. Es-se arranjo assimétrico é responsável pela direção específica na qual a trans-crição é iniciada a partir do cassete em direção ao esqueleto do vetor.

Quando o cassete de DD é clonado em um vetor pDD, essa transcriçãopermite a fusão do DNA que codifica a seqüência a ser apresentada ao DNAque codifica a proteína de revestimento funcional no vetor pDD por meio deum Iigante DIS.

Dois cassetes de DD para expressar peptídeos e proteínas sobo controle de um promotor LacZ e uma seqüência de sinal PeIB são forneci-dos nos exemplos sob o nome de cassete DDa ((figurai7; SEQ ID NO.: 11)e cassete DDb (figurai8; SEQ ID NO.: 12). Os cassetes específicos diferemessencialmente no tipo de gene marcador que permite a seleção de vetoresque compreendem essas"seqüências. Usando a resistência a antibiótico, épossível portanto selecionar clones nos quais o vetor pDD (ou qualquer outrovetor) contém o cassete de DD como base da resistência adquirida.

Seqüências líder/de sinal funcionais são aquelas identificadasem vários genes procarióticos para localizar uma proteína ém um espaçoperiplasmático, tal como PeIB (de Erwinia carotovora; descrito nos exem-plos), MalE4, PhoA4, LamB4, e Lpp4. Seqüências líder melhoradas tambémforam identificadas (Strobel et ai., 2003).

A expressão mediada pelo cassete DD da proteína de fusão,que é apresentada por meio da seqüência líder, é tornada possível pela pre-sença de um promotor (constitutivo ou induzível na bactéria) que é operati-vamente ligado em 5' à seqüência líder de partida contendo ATG que codifi-ca a dita seqüência de proteína, dentro do cassete de DD. A extremidade 5'desse promotor é separada da outra extremidade do cassete de DD que po-de compreender um ou mais genes adicionais, por uma seqüência de DNA"stuffer".

A literatura fornece vários exemplos comparativos sobre comootimizar tanto o desenho do vetor como as condições de cultura a fim de me-lhorar a expressão da proteína apresentada, e que podem ser usados naadaptação dos vetores da invenção para usos específicos ("Phage display: Apractical Approach", vol. 266, ed. Clackson & Lowman H1 Oxford Univ. Press,2004; "Phage Display: A Iaboratory Manual", Burton DR et ai, CSHL Press,2001; Corisdeo & Wang, 2004; Kirsch et ai, 2005; Sidhu et ai, 2000; Be-nhar, 2001; Sidhu, 2001; Szardenings, 2003; Bradbury & Marks, 2004; Hust& Dubel, 2004; Mancini et ai, 2004; Pini et ai, 2004; Conrad & Scheller,2005; Hust & Dubel, 2005; Silacci et ai, 2005; Smith et ai, 2005).

O DNA "stuffer" entre os Iigantes DIS no cassete de DD podeconter elementos adicionais que podem ser desejáveis no cassete de DDtais como um ou mais genes adicionais (isto é, seqüências de DNA que po-dem ser transcritas autonomamente e traduzidas em uma proteína) que po-dem ou não afetar os processos de clonagem e/ou apresentação. Por exem-pio, um gene marcador de seleção adicional (diferente daqueles compreen-didos no esqueleto e no cassete de apresentação do vetor vazio, se presen-te antes da clonagem) pode ser integrado no cassete de DD, permitindo aseleção de vetores de fagomídeo contendo o cassete de DD correto.

Alternativamente, o gene adicional pode codificar outra proteínade revestimento funcional diferente do fago filamentoso, uma proteína quemodifica o metabolismo ou a fisiologia da célula bacteriana (Bothmann &Pluckthun, 1998), ou uma proteína que interage com ou modula a atividadeda proteína a ser apresentada fundida à proteína de revestimento funcionalpor meio do Iigante DIS. Um exemplo desse último caso é representado porum gene de cadeia leve de imunoglobulina, que uma vez expresso na bacté-ria, pode heterodimerizar com um segmento de uma cadeia pesada de imu-noglobulina fundida à proteína funcional, formando um sítio de ligação deantígeno completo sobre a superfície do fago. Outros parceiros de heterodi-merização que podem ser expressos dessa maneira são aqueles típicos dealgumas proteínas de receptor de membrana. Entretanto, tais genes comple-tos adicionais no cassete de DD são planejados para ser transcritos e tradu-zidos independentemente da orientação na qual o cassete de DD é inserido,mesmo que sua expressão possa ser colocada sob o controle dos sistemasde promotor induzíveis.

O cassete de DD pode ser gerado, clonado, mantido e modifica-do em qualquer tipo de vetor, incluindo um vetor pDD. Os elementos clona-dos no cassete de DD podem ser organizados de diferentes maneiras (Hoetet ai, 2005; Kirsch et ai, 2005; Schoonbroodt et ai, 2005) e também podemser recombinados explorando sistemas baseados em Cre/Lox em bactérias(Sblattero & Bradbury, 2000), tanto quando o cassete de DD é clonado emum fagomídeo da invenção como quando ele é inserido em um outro tipo devetor. Os vetores de fagomídeo da invenção permitem a construção de umaunidade de expressão que consiste em uma seqüência capaz de ser trans-crita e traduzida para uma proteína de fusão que inclui qualquer uma de du-as proteínas de revestimento funcionais presentes no vetor. O promotor, umsítio de ligação de ribossomo (se necessário), o códon de partida, a seqüên-cia líder/de secreção é fornecida pelo cassete de DD, o que pode conse-qüentemente direcionar a expressão de um transcrito mono ou bicistrônicoque tem o DNA que codifica a proteína de revestimento funcional na sua ex-tremidade 3'. O cassete de DD também pode conter a seqüência suficientepara estabelecer a expressão da seqüência heteróloga como uma proteínasolúvel.

O termo "promotor" refere-se a uma seqüência na qual transcri-ção pode ser iniciada por uma RNA polimerase. Promotores procarióticosexemplares incluem um sítio de ligação de polimerase e opcionalmente umsítio para fator sigma. Um promotor pode ser constitutivo (isto é, sempre ati-vo) ou regulável (isto é ativo apenas sob certas condições). Em E. coli, pro-motores têm entre 30-50 pares de base de extensão. Promotores reguláveispodem responder a químicos regulatórios tais como glicose, lactose, IPTG,cAMP, triptofano, ou outras moléculas pequenas. Promotores podem serregulados por repressores e/ou ativadores e também podem ser moduladospela alteração das condições de cultura (por exemplo, alterando a tempera-tura, pH nutrientes, etc.).

Dada a importância fundamental dos sítios de restrição para osligantes DIS no vetor de fagomídeo e no cassete de DD a fim de obter a clo-nagem bidirecional e processo de apresentação da invenção, seu númerodeve ser determinado, em particular no cassete de DD (mas também no es-queleto de pDD se necessário), por seqüênciamento preliminar e/ou diges-tão do DNA. No caso onde sítios adicionais indesejados estão presentes,tecnologias tais como mutagênese por PCR (como mostrado nos exemplos)permitem a modificação desses sítios sem alterar qualitativamente as ativi-dades associadas ao DNA original.

Uma otimização das seqüências de DNA a serem incluídas novetor de fagomídeo e que codificam a proteína de revestimento funcional, oIigante DIS, ou as proteínas expressas por meio do cassete de apresentaçãofuncional pode ser obtida pela seleção da seqüência de DNA na qual o usode códon é o mais apropriado para as células bacterianas (Rodi et a!., 2002).Programas e critérios a ser aplicados para obter uma adaptação e otimiza-ção de códon de acordo com o organismo que expressa a seqüência estãodisponíveis e ajudam a escolher uma seqüência de DNA que não tem sítiosde restrição potencialmente perigosos para clonagem no vetor de fagomídeoem si ou outros vetores de expressão, uma vez que a seqüência heterólogacorreta tenha sido detectada (Grote et ai, 2005).

A substituição do cassete de DNA no vetor vazio (ou de outrocassete de DD) com o cassete de DD desejado é tornado possível pelo sítiode restrição presente apenas nos dois Iigantes DIS do fagomídeo e na ex-tremidade 5' e 3' do cassete de DD que, dada a estrutura do vetor de fago-mídeo e as orientações opostas das duas proteínas de revestimento funcio-nais justapostas aos Iigantes DlS, pode ser integrado em duas orientaçõesigualmente possíveis. Portanto, a(s) proteína(s) a ser apresentada(s) po-de(m) ser unida(s) e expressa(s) "in frame" com qualquer uma das ditas pro-teínas de revestimento usando a seqüência de proteína codificada pelo Ii-gante DIS.

Dessa forma, a invenção fornece meios para gerar, começandode um único vetor vazio e um único cassete de DD, dois vetores de fagomí-deo de apresentação distintos que podem ser usados para transformar cultu-ras de células bacterianas. Dependendo do uso adicional do fago recombi-nante resultante, ele pode ser apropriado para manter a cultura celular, obti-da por uma única etapa de clonagem e transformação, como contendo umamistura de células transformadas contendo vetores pDD que expressamqualquer uma das duas proteínas de fusão. Alternativamente, clones únicosna cultura celular mista original podem ser analisados (por exemplo, por ex-tração de DNA de plasmídeo, seguida por seqüênciamento de DNA e/ouanálise de restrição) para identificar e propagar separadamente clones es-pecíficos que contêm apenas um dos dois tipos de vetores pDD que tem aorientação desejada.

Além disso, a escolha e a localização dos genes marcadores deseleção no vetor de fagomídeo (vazio ou já compreendendo um cassete deDD) permitem que condições de cultura específicas sejam aplicadas paraselecionar clones bacterianos que contem o vetor de fagomídeo desejado.

Uma vez compreendida a invenção, uma grande variedade devetores de fagomídeo que compreendem um cassete de DD que permitem aclonagem, expressão e apresentação de pelo menos uma seqüência de pro-teína fundida a qualquer uma de duas proteínas de revestimento funcionaispode ser gerada. Em particular, a estrutura modular e formas alternativaspara inserção do cassete de DD permitem apresentar grandes bibliotecas deseqüências de proteína, como geralmente requerido para ensaios de rastre-amento baseados no sistema de apresentação em fago, com a vantagem deter as mesmas proteínas potencialmente apresentadas em duas proteínasde revestimento distintas em uma única biblioteca de fago gerada com umúnico processo de clonagem e transformação. Essa abordagem pode au-mentar consideravelmente as oportunidades de identificar seqüências rele-vantes em uma biblioteca de fago, sem repetir as etapas de clonagem e/outransformação como requerido até agora nas tecnologias descritas na litera-tura, por exemplo no caso de fago recombinante expressando proteínas defusão em cp3 ou cp8 (Kretzschmar & Geiser, 1995; Wang et al., 1997; Rous-ch et al., 1998; Zwick et ai, 1998; Adda et al., 1999; Verhaert et al., 1999;Yip et ai, 2001; Al-bukhari et al., 2002; Jacobsson et al., 2003; O1Connor Ket al., 2005). Dessa forma, bibliotecas de fago melhoradas, e níveis maioresde diversidade podem ser obtidos pela transformação de células bacterianascom vetores de fagomídeo que permitem a clonagem bidirecional de umcassete de DD.

Nesse escopo, o cassete de DD contém sítios de restrição apro-priados para clonar uma seqüência a ser apresentada na disposição corretaentre as seqüências líder/de sinal e o sítio que é usado para a inserção doligante DIS do vetor pDD. Se mais de uma seqüência tem que ser apresen-tada no fago recombinante distinto (como geralmente acontece com repertó-rios de peptídeos ou anticorpos), o painel de fragmentos de DNA a ser clo-nados e ligados dentro de um cassete de DD por meio de tais sítios de res-trição, gerando um painel duplo correspondente de fagomídeos (isto é, tendocada fragmento de DNA operativamente ligado a DNA que codifica uma ou aoutra proteína de revestimento funcional). Se a biblioteca for construída emum cassete de DD já clonado em um vetor pDD (isto é, "in frame" com umaproteína de revestimento funcional específica), tal biblioteca deve ser sub-metida à digestão com uma enzima de restrição específica que corta dentrodo Iigante DIS e a ligação com um vetor pDD cortado com uma enzima quefornece extremidades compatíveis a fim de obter a clonagem bidirecionaldesejada do cassete de DD.

Uma "célula transformada" é uma célula que contém DNA auto-replicante que é estranho para a célula e que pode ser introduzido por qual-quer método (por exemplo, eletroporação, transformação química, ou infec-ção, incluindo infecção por fago).

A presente invenção fornece kits e métodos para gerar bibliote-cas de apresentação em fago nas quais cada seqüência de proteína únicaestá presente na biblioteca fundida com qualquer uma de duas proteínas derevestimento, por fazer uso de um único vetor de fagomídeo para clonagembidirecional de um único cassete de DD, e aplicar uma única etapa de clona-gem e transformação baseada no Iigante DIS. Os kits podem incluir o únicovetor de fagomídeo para clonagem bidirecional do cassete de DD, ou veto-res e iniciadores para gerar cassetes de DD compatíveis com os vetorespDD e permitir a clonagem correta de seqüências de cDNA/genômicas, pro-dutos de amplificação por PCR, ou qualquer outro DNA sintético de filamentodupla que codifica uma seqüência de proteína a ser apresentada usandouma proteína de revestimento funcional.

O método para gerar uma biblioteca de célula ou de fago, emque cada seqüência de proteína da dita biblioteca é fundida na terminação-Nde qualquer uma de duas proteínas de revestimento funcionais, compreende:

(a) inserir um cassete de DD em correspondência dos Iigantesde DNA de um vetor de fagomídeo para a clonagem bidire-cional de um DNA que codifica uma seqüência de aminoáci-do a ser fundida na terminação-N de qualquer uma de duasproteínas de revestimento funcionais; e

(b) transformar células bacterianas com os vetores resultantes.

Essas etapas se aplicariam também a métodos para clonar eexpressar qualquer seqüência de aminoácido específica sobre a superfíciede um fago filamentoso, em particular sempre for desejável detectar a pre-sença de tal seqüência de aminoácido dentro de uma biblioteca.

Quando se usa um Iigante DIS tal como aquele descrito nos e-xemplos, a inserção do cassete de DD pode ser obtida pela ligação de umcassete de DD e um vetor que foi digerido com Bgll e tem extremidadescompatíveis.

As bibliotecas obtidas usando os vetores e os métodos da in-venção podem ser selecionadas ou "panned" usando as tecnologias comu-mente descritas em revisões (Mancini et al., 2004; Pini et al., 2004; Rhyneret al., 2004) ou os métodos aprimorados descritos em artigos recentes paraescolher a estratégia e formato mais apropriados (Lou et ai, 2001; Vanherc-ke et al, 2005).

A invenção fornece novos vetores de fagomídeo que contêmtanto uma origem de replicação de fago como uma origem independente defago. Fagom ídeos não incluem um conjunto completo de genes de fago, porexemplo, número suficiente de genes para produzir partículas de fago. Célu-las que carregam fagomídeo podem produzir partículas semelhantes a fagosque contêm o genoma do fagomídeo quando as células são infectadas porum fago "auxiliar" que carrega genes de fago necessários não presentes nofagomídeo. O vetor de fagomídeo precisa de um fago auxiliar a fim de infec-tar células bacterianas.

Não considerando aquele discutido nos exemplos, outros fagosauxiliares apropriados, junto com condições de cultura de bactéria e cepasde E. coli que suportam seu uso, podem ser identificados na literatura (Ron-dot et ai, 2001; Baek et ai, 2002; Intasai et ai, 2003; Kramer et ai, 2003;Soltes et ai, 2003; Ravn et ai, 2004). Em geral, o fago auxiliar deve ajudar ainfecção e a propagação do fago recombinante qualquer que seja a orienta-ção na qual o cassete de DD esteja inserido, a menos que seja desejadopermitir a infecção e a propagação de apenas um tipo de fago recombinante(isto é, que apresenta proteínas fundidas a apenas uma proteína de revesti-mento funcional).

A seqüência a ser incluída no cassete de DD e fundida a termi-nação-N de qualquer uma das proteínas de revestimento funcionais presen-tes no vetor pDD por meio de um Iigante DIS pode ser qualquer seqüênciade interesse conhecida por estar interagindo com um Iigante ou uma se-qüência-alvo tal como anticorpos (incluindo fragmentos como Fabs, ScFV1 equalquer outro fragmento de ligação de epítopo ou derivado), epítopos, regi-ões de ligação de epítopo, antígenos, alérgenos, peptídeos bioativos, enzi-mas, inibidores de enzimas, sítios catalíticos enzimáticos, proteínas de liga-ção ao DNA, domínios de proteína isolados, Iigantes para receptores, recep-tores, fatores de crescimento, citocinas, e fragmentos contíguos ou super-postos da seqüência de proteína de interesse.

No caso de proteínas a ser apresentadas que são formadas porduas seqüências de proteínas distintas (tal como as regiões variáveis deuma cadeia pesada e uma leve de uma imunoglobulina formando um fab),uma das seqüências é clonada no cassete de DD a ser fundido a uma prote-ína de revestimento funcional, enquanto a outra é clonada e expressa auto-nomamente por um gene separado completo clonado também dentro docassete de DD, ou no esqueleto do vetor pDD.

O cassete de DD deve permitir a transcrição e tradução corretasde uma seqüência de DNA a ser fundida em uma proteína de revestimentofuncional que foi clonada previamente e/ou amplificada a partir de outrosvetores, bibliotecas de cDNA, ou bibliotecas genômicas, ou ácidos nucléicosgerados por síntese química. Em particular, o DNA deve codificar proteínaque tem interesse diagnóstico e terapêutico, tal como proteínas de mamífe-ro, e mais preferivelmente proteínas humanas, ou organismos patogênicoshumanos (por exemplo, vírus). A fonte para DNA que codifica proteínas hu-manas pode ser qualquer célula e tecido humano mas, dado o uso extensivode tecnologias de apresentação em fago para identificar proteínas relaciona-das à imunidade (tais como anticorpos ou antígenos), a fonte preferida deDNA humano e cDNA são células que expressam antígenos que têm inte-resse diagnóstico ou terapêutico (por exemplo, células de câncer) ou célulasque produzem anticorpos que podem ser isoladas do sangue, medula óssea,tonsilas, ou cânceres (tais como linfócitos infiltrantes de tumores, linfócitosde sangue periférico total, células B de memória circulantes). Essas célulaspodem ser isoladas de indivíduos específicos (virgem ou expostas a antíge-no) e podem ser selecionadas previamente por qualquer critério apropriado(por exemplo, células B que expressam anticorpos que têm o isotipo IgG ouque expressam CD27 sobre a superfície).

Vetores de fagomídeo preparados de acordo com a presenteinvenção podem ser usados para expressar simultaneamente um grandenúmero de seqüências de proteína, tais como aquelas codificadas em biblio-tecas de cDNA derivadas de células ou tecidos, em um fago ou uma biblio-teca de célula fundida a qualquer uma das duas proteínas de revestimento,tirando vantagem do fato de que proteínas diferentes podem ser mais bemexpressas e/ou mais bem apresentadas em uma das duas conformaçõespossíveis determinadas por processo de clonagem bidirecional. Além disso,o fago pode ser detectado usando anticorpos contra as proteínas de reves-timento em si (Dente etal., 1994; Bhardwaj etal., 1995).

Os vetores da invenção também podem ser usados para repro-duzir outras estratégias mais complexas envolvendo a formação de comple-xos entre duas proteínas de revestimento marcadas diferentemente que po-dem ser mediadas pela interação de seqüências de proteína heterólogas,tais como em SIP (Hennecke et ai, 1998; Cebe & Geiser, 2000). Alternati-vamente, o vetor da invenção pode ser adaptado para gerâr fago recombi-nante "landscape" (Petrenko et ai, 2002), ou fago bifuncional (Gao et al.,1999; Chen etal., 2004) em que apresentação de uma categoria de seqüên-cias de proteína pode ser obtida para qualquer uma das proteínas de reves-timento funcionais.

As bibliotecas de fago produzidas de acordo com os métodos dainvenção podem ser rastreadas usando qualquer ensaio de rastreamentoconhecido por ser aplicável com fago. Por exemplo, o fago pode ser expostoa um antígeno purificado, solúvel ou imobilizado (por exemplo, sobre umaplaca ou sobre esferas) ou exposto a células inteiras, tecidos ou animais, afim de identificar fagos que aderem a alvos presentes em estruturas comple-xas, e em particular em localizações fisiologicamente ou terapeuticamenterelevantes (por exemplo, ligação a células de câncer ou a endotélio in vivoou in vitro) para identificação/validação do alvo. A seleção do fago feita con-tra esses antígenos pode ser considerada como uma seleção positiva (isto é,para detectar moléculas de que se ligam a Iigantes específicos) ou comoseleção negativa (isto em para eliminar ligação de fago a certos ligantes).

Então, os vetores de fagomídeo selecionados nos quais umaseqüência heteróloga foi clonada, expressa e isolada especificamente combase na sua ligação a um Iigante específico, podem ser extraídos das célu-las bacterianas, e seqüênciados, amplificados por PCR, e/ou reclonados emoutro vetor apropriado, por exemplo, para a produção recombinante em largaescala em células bacterianas, de planta, de levedura ou de mamífero.Os vetores, os métodos, e as bibliotecas da invenção podem seradaptadas a qualquer um dos usos conhecidos de apresentação em fago,uma vez que as seqüências a ser apresentadas são fornecidas em um for-mato que pode ser clonado corretamente e expresso por meio do cassete deapresentação dupla funcional. As seqüências podem ser derivadas de gran-des bibliotecas de cDNA/ESTs, ou mesmo bibliotecas de genoma/proteoma-completo que são rastreadas para identificar Fases Abertas de Leitura oufamílias de domínios e seqüências de proteína relevantes (Rosander et ai,2002; Jacobsson et ai, 2003; Faix etal., 2004). Além de anticorpos, tecnolo-gias de apresentação em fago podem ser usadas para detectar seleção depeptídeo bioativo, quando a seleção é acoplada a um ensaio apropriado pa-ra a atividade biológica ou modelagem computacional (Pastor et ai, 2004;Falciani et ai, 2005).

Bibliotecas de peptídeos não-aleatórios ou aleatórios apresenta-dos por bacteriófagos podem ser rastreados para selecionar peptídeos queexpressam fagos que se ligam especificamente a anticorpos, para que osmotivos seqüência de peptídeo expressos pelo fago permitam a definição dealérgenos, antiidiotipos, epítopos de célula B ou T, ou vacinas (Zhong et ai,1997; Davies etal., 2000; De Berardinis et ai, 2000; Goletz etal., 2002). Al-ternativamente, ensaios "sanduíche" são baseados na clonagem e na ex-pressão ápenas da cadeia variável no fago, entretanto o antígeno e uma ca-deia variável são fornecidos em solução, a fim de tirar vantagem da estabili-zação direcionada por antígeno do complexo de cadeia leve e pesada variá-vel (Watanabe et ai, 2002).

Manipulação adicional dos fagos pode ser feita durante o pro-cesso de seleção por várias razões. Por exemplo, misturas de fagos queexpressam anticorpo e antígeno podem ser incubadas em solução e oscomplexos imunes são precipitados com Proteína G ou Proteína A Iigada aesferas de Sefarose. O fago precipitado pode então ser usado para induzirinfecção de E. Coli ou para medir interações por ELISA, para que seja pos-sível quantificar o fago precipitado pela determinação do número de placasproduzidas (Al-bukhari et ai, 2002).Uma análise mais geral das atividades biológicas de uma se-qüência de proteína expressa e rastreada usando tecnologias de apresenta-ção em fago pode ser realizada pelo uso de células inteiras ou tecidos aosquais as bibliotecas são expostas. Os fagos recombinantes relevantes sãoentão selecionados com base em sua ligação (ou ausência de ligação) aestruturas complexas tais como a superfície de células humanas que têmcaracterísticas específicas, incluindo células tumorais, ajudando a identifica-ção de novos marcadores e alvos terapêuticos (Edwards et ai, 2000; Lan-don & Deutscher1 2003; Mutuberria et ai, 2004; Shukla & Krag, 2005). Alter-nativamente, a interação também pode não estar associada apenas com aligação dos fagos às células, mas a sua internalização, permitindo a identifi-cação de peptídeos célula-específicos ou anticorpos que têm essa atividadeespecífica (Legendre & Fastrez, 2002; Florea et ai, 2003 Elrick et ai, 2005).

A detecção da interação com o Iigante específico pode ser reali-zada pela aplicação dos métodos de "panning" usuais, ou pela aplicação detecnologias biofísicas mais sofisticadas para avaliação de interações entre aproteína apresentada e seu parceiro de ligação, tal como espectroscopia oumicroscopia baseada em fluorescência (Lagerkvist et ai, 2001; Jaye et ai,2004), reação de fosfatase (Han et ai, 2004), ou outras tecnologias de altaprodutividade (Paus et ai, 2003; Rhyner et ai, 2004; Steukers et ai, 2006).Em geral, o sucesso de uma abordagem de "panning" também depende" dadimensão da biblioteca rastreada já que, como mostrado para várias biblio-tecas que apresentam fragmentos de anticorpo, proteínas com maior afini-dade para um alvo são encontradas em bibliotecas que tem um númeromaior de seqüências distintas clonadas dentro delas (Hust & Dubel, 2005).

Em geral, os fagos recombinantes ou proteínas de fusão obtidospelos métodos da invenção podem ser usados diretamente para ligação,detecção, neutralização e/ou alteração de um ligante, uma célula, ou umamolécula-alvo, em que os ditos fagos recombinantes ou proteínas de fusãoestão em formas isoladas ou nas formas de misturas.

Uma vez que uma ou mais seqüências de proteína, apresenta-das como uma proteína de fusão com qualquer uma das proteínas de reves-timento selecionadas clonadas e arranjadas em um vetor de fagomídeo deacordo com a invenção, tenham sido selecionadas após um ou mais ciclosde "panning", o fago recombinante associado e a seqüência de DNA relevan-te podem ser isolados e caracterizados de acordo com os métodos conheci-dos na técnica (por exemplo, separados do vetor de fagomídeo usando en-zimas de restrição, seqüênciados diretamente, e/ou amplificados por PCR).

Essas seqüências podem então ser transferidas para dentro de vetores maisapropriados para modificação adicional e/ou expressão dentro de célulashospedeiras procarióticas ou eucarióticas, como descrito em vários livros erevisões sobre como clonar e produzir proteínas recombinantes, incluindoalguns títulos na série "A Practical Approach" publicada por Oxford UniversityPress ("DNA Cloning 2: Expression Systems", 1995; "DNA Cloning 4: Mam-malian Systems", 1996; "Protein Expression", 1999; "Protein Purification Te-chniques", 2001).

A seqüência de DNA que codifica a seqüência de proteína apre-sentada e selecionada, uma vez inserida em um vetor epissomal ou não-homologamente ou homologamente integrante adequado, pode ser introdu-zida nas células hospedeiras apropriadas por qualquer meio adequado(transformação, transfecção, conjugação, fusão de protoplasto, eletropora-ção, precipitação com fosfato de cálcio, microinjeção direta, etc.) para trans-formá-la. Fatores de importância na seleção de um plasmídeo ou vetor viralparticular incluem: a facilidade com a qual células receptoras que contêm ovetor podem ser reconhecidas e selecionadas a partir das células receptorasque não contêm o vetor; o número de cópias do vetor que é desejado em umhospedeiro em particular; e se é desejável ser capaz de "transportar"' o vetorentre células hospedeiras de espécies diferentes.

Os vetores devem permitir a expressão da proteína de fusão nacélula hospedeira procariótica ou eucariótica sob o controle de seqüênciasregulatórias de iniciação/terminação transcricional, que são escolhidas porser constitutivamente ativas ou induzíveis na dita célula. Uma linhagem celu-lar substancialmente enriquecida em tais células pode então ser isolada parafornecer uma linhagem celular estável. Para hospedeiros eucarióticos (porexemplo, células de levedura, inseto ou mamífero), seqüências regulatóriastranscricionais e traducionais diferentes podem ser empregadas, dependen-do da natureza do hospedeiro. Elas podem ser derivadas de fontes virais,tais como adenovírus, vírus do papiloma bovino, Simian vírus, ou semelhan-tes, onde os sinais regulatórios estão associados com um gene particularque tem um alto nível de expressão. Exemplos são o promotor TK do Herpesvírus, o promotor precoce de SV40, o promotor do gene gal4 de levedura,etc. Sinais regulatórios de iniciação transcricional podem ser selecionados,os quais permitem repressão e ativação para que a expressão dos genespossa ser modulada. As células que foram transformadas estavelmerite peloDNA introduzido podem ser selecionadas também pela introdução de um oumais marcadores que permitem a seleção de células hospedeiras que con-têm o vetor de expressão. O marcador também pode fornecer fototrofia a umhospedeiro auxotrófico, resistência a biocida, por exemplo, antibióticos, oumetais pesados tais como cobre, ou semelhantes. O gene marcador selecio-nável pode ser tanto ligado diretamente às seqüências gênicas de DNA a serexpressas, ou introduzido na mesma célula por co-transfecção. Elementosregulatórios transcricionais adicionais também podem ser necessários paraexpressão ótima.

Células hospedeiras podem ser tanto procarióticas como eucari-óticas. Preferidos são hospedeiros eucarióticos, por exemplo, células demamífero, tais como células de ser humano, macaco, camundongo, inseto(usando sistemas de expressão a base de baculovírus) e células de Ováriode Hamster Chinês, porque elas fornecem modificações pós-traducionais amoléculas de proteína, incluindo dobramento correto ou glicosilação em sí-tios corretos. Células de levedura também podem realizar modificações pós-traducionais de peptídeo incluindo glicosilação. Existem várias estratégias deDNA recombinante que utilizam seqüências de promotores fortes e alto nú-mero de cópias de plasmídeos que podem ser utilizados para produção dasproteínas desejadas em levedura. Leveduras reconhecem seqüências líderem produtos de gene de mamífero clonados e secretam peptídeos que car-regam seqüências líder (isto é, pré-peptídeos). Para produção de alta produ-tividade de longo prazo de um polipeptídeo recombinante, expressão estávelé preferida. Por exemplo, linhagens celulares que expressam estavelmente opolipeptídeo de interesse podem ser transformadas usando vetores de ex-pressão que podem conter origens virais de replicação e/ou elementos deexpressão endógenos e um gene marcador selecionável no mesmo vetor ouem um vetor separado. Após a introdução do vetor, as células podem serdeixadas crescer por 1-2 dias em um meio enriquecido antes delas seremtrocadas para meio seletivo. A finalidade do marcador selecionável é conferirresistência a seleção, e sua presença permite crescimento e recuperação decélulas que expressam com sucesso as seqüências introduzidas. Clonesresistentes de células estavelmente transformadas podem proliferar usandotécnicas de cultura de tecido apropriadas para o tipo celular. Uma linhagemcelular substancialmente enriquecida em tais células pode ser então isoladapara fornecer uma linhagem celular estável.

Linhagens celulares de mamíferos disponíveis como hospedei-ros para expressão são conhecidas na técnica e incluem várias linhagenscelulares imortalizadas disponíveis a partir da American Type Culture Collec-tion (ATCC) incluindo, mas não limitadas a, células de ovário de hamsterchinês (CHO), HeLa, rim de hamster recém-nascido (BHK), rim de macaco(COS), C127, 3T3, BHK, HEK 293, Per.C6, melanoma de Bowes e de carci-noma hepatocelula? humano (por exemplo Hep G2) e várias outras linhagenscelulares. No sistema de baculovírus, os materiais para sistemas de expres-são de baculovírus/célula de inserto são disponíveis comercialmente na for-ma de um kit (por exemplo, comercializado pela Invitrogen).

No caso de fagos que expressam cadeias variáveis de imuno-globulina, em particular cadeias variáveis de imunoglobulina humana, umaimportante modificação é a conversão da Fab ou scFV selecionada em umaproteína de imunoglobulina completa que tem um isotipo preferido e umaregião constante. Esse tipo de modificação permite, por exemplo, gerar anti-corpos monoclonais completamente humanos de todos os isotipos construí-dos a partir de Fv de cadeia única ou Fabs derivados de biblioteca de apre-sentação em fago e expressar em células de mamífero ou de inseto (Ameset al, 1995; Mahler etal., 1997; Persic etal., 1997; Boel et ai, 2000; Liang etal., 2001; Guttieri etal., 2003). As proteínas selecionadas usando os vetorese os métodos da invenção podem então ser clonadas e expressas em outrosvetores que permitem, por exemplo, a fusão a outra estrutura de apresenta-ção tal como a proteína de ligação de maltose (Zwick et al., 1998) ou suaexpressão e seleção não como proteínas recombinantes isoladas mas comouma mistura de proteínas recombinantes isoladas (Sharon et al., 2005; Mei-jer etal., 2006). No caso de peptídeos (e de proteínas abaixo de 100 amino-ácidos) apresentados e selecionados de acordo com a invenção, essas se-qüências são curtas o suficiente para serem produzidas usando tecnologiasde síntese química, tal como síntese em fase sólida e síntese em fase líqui-da. Como uma síntese em fase sólida, por exemplo, o aminoácido que cor-responde a terminação carbóxi do peptídeo a ser sintetizado está ligado aum suporte que é insolúvel em solventes orgânicos, e por repetição alterna-da de reações, uma em que aminoácidos com seus grupos amino e gruposfuncionais de cadeia lateral protegidos com grupos protetores apropriadossão condensados um por um em ordem da terminação carbóxi para a termi-nação amino, e uma onde os aminoácidos ligados à resina ou o grupo prote-tor dos grupos amino dos peptídeos são liberados, a cadeia de peptídeo éentão estendida dessa maneira. Os peptídeos purificados também podemincluir outros grupos químicos introduzidos durante síntese ou eles podemser ainda modificados para formar dendrímeros (Pini etal., 2005).

Purificação das proteínas recombinantes pode ser realizada porqualquer um dos métodos conhecidos para esse propósito, isto é, qualquerprocedimento convencional envolvendo extração, precipitação, cromatogra-fia, eletroforese, ou semelhante. Um procedimento de purificação adicionalque pode ser usado de preferência para purificar a proteína da invenção écromatografia de afinidade usando anticorpos monoclonais ou grupos deafinidade, que se ligam a proteína-alvo e que são produzidos e imobilizadosem uma matriz de gel contida dentro de uma coluna. Preparações impurascontendo as proteínas são passadas pela coluna. A proteína ficará ligadaespecificamente à coluna por heparina, proteína A, proteína G, ou pelo anti-corpo específico enquanto que as impurezas passarão direto. Após lavagem,a proteína é eluída do gel por uma alteração de pH ou força iônica. Alternati-vamente, HPLC (Cromatografia Líquida de Alta Eficiência) pode ser usada. Aeluição pode ser realizada usando um solvente a base de acetonitrila e águacomumente empregado para purificação de proteína.

Seqüências de proteína apresentadas em fago identificadas pe-los métodos da invenção podem encontrar várias outras aplicações, tal comoimunodetecção, o estudo de atividades de células T/relacionadas a MHC(Matsushita et ai, 2001; Zhao et ai, 2001; Kurokawa et ai, 2002; Li et ai,2005), e mapeamento de epítopo de célula B ou T de proteínas ou anticor-pos biologicamente ativos (Bugli et ai, 2001; Dromey et ai, 2004; Di Niro etai, 2005). Bibliotecas combinatórias geradas de acordo com os métodos dainvenção também podem ser usadas para manipulação de proteína, pelaexpressão em cada fago de uma variante de seqüência de uma proteína eentão rastreamento do fago para identificar aqueles que expressam varian-tes de proteína de fusão que têm maior afinidade por um receptor, um Iigan-te, um antígeno, ou um substrato enzimático (Heinis et ai, 2001; Schooltinke Rose-John, 2005) assim como a detecção de anticorpos humanos proteto-res ou patogênicos (Ditzel, 2000). Alternativamente, essas variantes podemser selecionadas com base na sua estabilidade a proteólise (Bai & Feng,2004). A tecnologia de apresentação em fago também pode ser usada paracaracterizar proteínas que reconhecem alvos não protéicos tais como ácidosgraxos (Gargir et ai, 2002), hormônios de plantas (Suzuki et ai, 2005), DNA(Nilsson et ai, 2000), ou glicanas (van de Westerlo et ai, 2002; Ravn et ai,2004).

Os exemplos descrevem o desenho de constructos e experimen-tos para estabelecer a tecnologia de apresentação em fago da invenção porfazer uso de seqüências de DNA que codificam duas proteínas de revesti-mento (cp3 e cp8) que foram amplificadas e mutadas na terminação-N u-sando um Iigante2 DIS contendo um raro sítio de corte de enzima de restri-ção e uma seqüência baseada em Gly4Ser. Vetores de fagomídeo que ex-pressam separadamente as proteínas cp3 e cp8 modificadas N-terminais(cp3* e cp8*) foram gerados. A produção de células e fagos recombinantesque expressam seqüências heterólogas (um peptídeo ou Fab humano) fun-didas na terminação-N da seqüência codificante de DNA de cp3* ou cp8* foidemonstrada. A expressão da proteína de fusão de proteína de fago-peptídeo não afeta a produção, montagem e infectividade de fago. O sistemafoi validado demonstrando que seleção de afinidade de fagos que expres-sam as proteínas modificadas realizada com base nas características deligação do peptídeo fundido e anticorpo é eficaz, mostrando a montagemcorreta da molécula de Fab no espaço periplasmático.

As seqüências de proteína de revestimento modificadas comIigante DIS podem ser inseridas na orientação apropriada em uma estruturaderivada de pBluescript. Esse vetor pDD básico foi ligado com um cassetede DD que contém uma seqüência a ser apresentada (um peptídeo ou regi-ões variáveis de anticorpo) e um marcador de resistência a antibiótico, per-mitindo a seleção dos vetores pDD recombinantes nos quais essas seqüên-cias foram fundidas na terminação-N de qualquer uma das duas proteínasde revestimento funcionais.

Outras características e vantagens da presente invenção se tor-narão mais claras a partir dos seguintes exemplos detalhados. Modalidadesadicionais da invenção podem incluir qualquer combinação de característi-cas descritas aqui. Os conteúdos de todas as referências, pedidos de patetependentes e patentes publicadas, citados por esse pedido estão por meiodesse expressamente incorporados por referência.

EXEMPLOS

Exemplo 1: Preparação e Expressão de uma Seqüência de DNAModificada com Liqante2 DIS que Codifica uma Proteína de Revestimento 3de Faqo Filamentoso (cp3*) para Apresentar Proteínas e Peptídeos

a) Materiais & Métodos

Produção de DNA de filamento dupla de M13 auxiliar.

Um bacteriófago M13 auxiliar comercialmente disponível(VCSM13, Stratagene, La Jolla, CA) foi usado como uma fonte para isola-mento de seu DNA de filamento duplo de forma replicante. Em 2 ml de meioLB, 50 μl de uma cultura de uma cepa bacteriana que carrega um epissomoF' (E.Coli XLIBlue, Stratagene1 La Jolla, CA) foram misturados com 1x1011partículas de bacteriófago. A mistura foi incubada por 4 a 5 horas a 37°Ccom agitação constante. A mistura foi então centrifugada a 12.000 χ g por 5minutos para precipitar as bactérias infectadas. Após o sobrenadante serremovido, o precipitado de bactérias foi usado em um protocolo de extraçãode DNA padronizado usando o kit Qiagen mini prep e analisado por eletrofo-rese em gel de ágarose 1%.

Produção de um gene que codifica uma proteína cp3 modificadapor ligante2 DIS N-terminal (proteína cp3*)

A reação de PCR para a gerar um gene que codifica cp3* foirealizada usando os iniciadores cp3*FW e cp3*RW (SEQ ID NO.: 13 e SEQID NO.: 14; Tabela I). A amplificação por PCR foi realizada usando ExpandHigh Fidelity (Roche), de acordo com as instruções do fabricante, usando 50pg de um DNA molde e 300 mM de cada iniciador. As condições de PCRusadas foram: 95°C por 2 min (1 ciclo); 95°C por 20 s, 63°C por 30 s, 72°Cpor 40 s (35 ciclos). Após a amplificação por PCR, 2,5 unidades de polime-rase AmpIiTaq (Applied Biosystems, Foster City, CA) foram adicionadas àreação de PCR1 que foi incubada por 20 min adicionais a 72°C a fim de per-mitir a adição de uma única desoxiadenosina, de uma forma independentedo molde, nas extremidades 3' dos fragmentos amplificados. O produto dePCR foi submetido a eletroforese em um gel de agarose 1,5% e purificadousando um kit de extração de gel (Qiagen).

O gene cp3* foi então ligado no vetor pGEM T-Easy (Promega)1por meio de uma única desoxiadenosina adicionada nas terminações 3', se-guindo as instruções do fabricante. A mistura de ligação foi usada paratransformar células eletrocompetentes DH5alfa de E. Coli. No dia seguinte,10 colônias brancas foram coletadas, inoculadas em 4 ml de caldo Luria-Bertani (LB; "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Sambrook et al., ColdSpring Harbor Press, NY, 1989), e incubadas durante a noite a 37°C em agi-tação constante. No dia seguinte, 2 ml de suspensão de bactérias foram u-sados para extração/purificação de DNA de plasmídeo usando o kit miniprepQiagen. Os plasmídeos pGEM T-Easy carregando o gene cp3* foram entãoanalisados por enzimas endonuclease de restrição. Um clone foi escolhido eseqüênciado a fim de verificar a seqüência de nucleotídeo correta do geneque codifica cp3*, identificando a mutação A523 para G523 na seqüência denucleotídeo que produz uma substituição de aminoácido de Ser175 to Gly175.

O vetor pRIB básico

O vetor pRIB básico compreende elementos presentes no vetorpBluescript Il SK(+) (Stratagene, No. de Acesso do Genbank. X52328), inclu-indo uma origem de replicação de fago (F1(+); bp 3-459), uma origem de10 replicação de plasmídeo (ColE1; bp 1032-1972) e um gene de resistência àampicilina (Ampr1 bp 1975-2832).

Três elementos adicionais estão inclusos em um cassete de ex-pressão contido nesse vetor. Um primeiro elemento compreende um promo-tor do operon Lac Z (SEQ ID NO.: 23), uma seqüência líder PeIB contendoATG (SEQ ID NO.: 24 e SEQ ID NO.: 25) e um sítio de clonagem Sacl-Xbalque permite a inserção de um DNA que codifica uma seqüência de proteína(por exemplo, uma cadeia leve de imunoglobulina), "in frame" com a se-qüência líder (PelB, na extremidade 5') e clonada como um fragmento termi-nal com um códon de parada. O segundo elemento é um gene de resistênciaao cloranfenicol (CAT). O terceiro elemento compreende um promotor dooperon Lac-Z (SEQ ID NO.: 23), uma seqüência líder PeIB contendo ATG,um sítio de clonagem Xhol-Spel que permite a inserção de um DNA que co-difica uma seqüência de proteína (por exemplo, a região variável de umacadeia pesada de imunoglobulina), "in frame" com a seqüência líder (PelB,na extremidade 5') e com uma seqüência de DNA (na extremidade 3') quecodifica uma proteína de revestimento funcional (por exemplo, cp3*) incluin-do o códon de parada e que pode ser clonada usando um sítio de clonagemSpel-Nhel. No vetor vazio, os sítios de clonagem Sacl-Xbal, Spel-Nhel, eXhol-Spel são separados por fragmentos "stuffer" de DNA com extremidadescompatíveis que são substituídos durante as etapas de clonagem. Por e-xemplo, uma seqüência "stuffer" de DNA pode ser inserida no sítio de clona-gem Sacl-Xbal pela ligação de um fragmento sintético obtido pelo anelamen-to de dois oligonucleotídeos (LCstuffer FW e LCstuffer RW; SEQ ID NO.: 26e SEQ ID NO.: 27; Tabela I) que têm extremidades de filamento simplescompatíveis com tais sítios de restrição.

Construção dos vetores pfílBI para expressão de cp3* e dasproteínas de fusão relacionadas

O vetor pRIB1-cp3*foi construído usando um vetor pRIB básicono qual o fragmento Spel-Nhel que codifica cp3* clivado de pGEM-T Easy foiligado no sítio de clonagem Spel-Nhel descrito acima. A mistura de ligaçãofoi usada para transformar células eletrocompetentes DH5alfa de E. Coli. Nodia seguinte, 10 colônias foram coletadas, inoculadas em 4 ml de caldo LB eincubadas durante a noite a 37°C com agitação constante. No dia seguinte,2 ml de suspensão de bactérias foram usados para extração/purificação deDNA de plasmídeo usando o kit miniprep Qiagen. Os plasmídeos carregandoo gene cp3* modificado foram então analisados por enzimas endonucleasede restrição a fim de verificar a orientação correta de cp3*.

O vetor pRIB1-HAcp3* foi construído partindo de pRIB1-cp3*,que foi duplamente digerido com Xhol e Spel e ligado com uma seqüênciade DNA sintética, de filamento duplo que codifica o epítopo da hemaglutininado vírus influenza (seqüência HA tag YPYDVPDYA), e que tem extremida-des compatíveis com Xhole Spel. O Iigante HA tag foi obtido pela mistura deoligonucleotídeos (ligante tag HA FrW e Iigante HA tag RW; veja seqüênciana Tabela I; SEQ ID NO.: 17 e SEQ ID NO.: 18) em uma concentração de1μΜ e desnaturação deles a 95°C por 5 minutos. A mistura de oligonucleo-tídeos foi então transferida para água pré-aquecida a 95°C e deixada esfriarem temperatura ambiente a fim de obter o anelamento específico. A misturade ligação, composta por pRIB1-cp3* duplamente digerido por Xhol-Spel eligante HA tag, foi usada para transformar células eletrocompetentesDH5alfa de E. Coli. No dia seguinte, 10 colônias foram coletadas, inoculadasem 4 ml de caldo LB e deixadas durante a noite a 37°C com agitação cons-tante. No dia seguinte, 2 ml de suspensão de bactérias foram usados paraextração/purificação de DNA de plasmídeo usando o kit miniprep Qiagen eentão analisado pelas enzimas endonuclease de restrição a fim de verificar apresença de HA tag. Um clone mostrando as características desejadas, ouseja, possuir HA tag fundido "in trame" com cp3*, foi escolhido e usado paraexperimentos de expressão.

O vetor pRIB1-e44cp3* foi construído usando as seqüências de5 DNA que codificam a cadeia pesada e leve de Fab monoclonal recombinantehumano (chamado de e44 mas idêntico a e8) isolado de uma biblioteca deapresentação em fago por sua afinidade com a proteína E2 do vírus da He-patite C.(Burioni et ai, 1998b). As cadeias pesada e leve de e44 foram clo-nadas em pRIB1-cp3*usando os sítios de clonagem Xhol-Spel e Xbal-Sacllrespectivamente. O clone de E. coli transformado mostrando as característi-cas desejadas, tendo assim a cadeia pesada de e44 fundida "in frame" comcp3* e a cadeia leve de e44 clonada entre os sítios Xbal-SacI, foi usado paraexperimentos de expressão. Um vetor de controle (pRIB-e44cp3) foi constru-ído da mesma maneira usando uma seqüência de cp3 não modificada (semum Iigante2 DIS).

Plasmídeos pRIB de controle que codificam cp3, com e sem umFAB (e44) ou um peptídeo (HA tag) fundido na terminação-N, foram gerados(e denominados pRIB-cp3, pRIB-HAcp3, pRIB-e44cp3) com base em fago-mídeos disponíveis na literatura (Burioni et a!., 1997; Burioni etal., 1998).

Análise de expressão de HAcp3* e e44cp3*usando plasmídeosbaseados em pRIB 1 -cp3 *

10 ml de caldo super (SB; "Molecular Cloning: A Laboratory Ma-nual", Sambrook etal., Cold Spring Harbor Press, NY, 1989) contendo ampi-cilina (100 Mg/ml) foi inoculado com o clone apropriado de E. CoIiXLIBIue(contendo pRIB1-cp3*, pRIB1-HAcp3*, pRIB1-e44cp3*, ou pRIB1-e44cp3) ecultivado por 8 horas a 37°C em um agitador rotatório. Nesse ponto, isopro-piltio-p-D galactosídeo (IPTG, 1 mmol/L; Sigma, Saint Louis, Ml) foi adicio-nado às bactérias em crescimento que foram incubadas adicionalmente du-rante a noite a 30°C. As células foram coletadas por centrifugação, ressus-pensas em 1 ml de salina tamponada com fosfato (PBS; "Molecular Cloning:A Laboratory Manual", Sambrook etal., Cold Spring Harbor Press, NY, 1989)e submetidas a um procedimento de congelamento-descongelamento (3 ci-cios de 37°C e -80°C, cada etapa por 15 minutos). Os restos celulares foramprecipitados por centrifugação a 15.000 g em temperatura ambiente em umamicrocentrífuga, e o sobrenadante foi usado para quantificar o conteúdo deproteína. 20 microgramas de proteínas totais foram aplicados em um gel deacrilamida 12% ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Sambrook et ai,Cold Spring Harbor Press, NY, 1989) e separados por eletroforese. As prote-ínas resolvidas foram transferidas para membranas de nitrocelulose, queforam então bloqueadas por uma primeira incubação de 1 hora de comPBS/Tween 20 0,1% (Sigma) contendo 10% de leite. As membranas foramentão lavadas e incubadas com anticorpo anti- HA tag (HA.11, Covance)diluído a 1:1000, ou com anti-Fab humano de cabra conjugado com peroxi-dase de rábano-silvestre (HRP, Sigma) diluído a 1:10000 em PBS/Tween-200,1% (Sigma) contendo 5% de leite. Após uma segunda incubação de 1 ho-ra, as membranas foram lavadas três vezes com PBS/Tween-20 0,1%. Paraa detecção de Fab a membrana foi submetida diretamente a detecção porquimioluminescência ampliada usando o substrato quimioluminescente Su-persignal West Pico (Pierce). Para a detecção de HA tag, a membrana foiincubada por 1 hora adicional com um anti-camundongo conjugado a peroxi-dase de rábano silvestre em PBS/Tween-20 0,1% (diluição 1:1000). Apóstrês lavagens com PBS/Tween-20 0,1% as membranas foram submetidas àdetecção por quimioluminescência ampliada usando o substrato quimiolumi-nescente Supersignal West Pico (Pierce).

b) Resultados

A seqüência do gene M13 natural que codifica cp3 foi modificadaatravés de amplificação por PCR a fim de ser N-terminalmente truncada eincorporar um Iigante2 DIS com os sítios de endonuclease de restrição Spele Sfil (em 5', codificando uma seqüência de 12 aminoácidos) e um sítio derestrição Nhel após o códon de parada (em 3'; figurai). Essa variante, tam-bém conhecida como BAC76618 e que contém aminoácidos 216-424 de pro-teína cp3 de Enterobacteria phage M13 (No. de Acesso SWISSPROTP69168), não tem a seqüência de sinal original e elementos estruturais N-terminais adicionais mas ainda é capaz de apresentar corretamente proteí-nas de fusão, como mostrado em fagomídeos usados para esse objetivo talcomo pFCAH-E8d (No. de Acesso do GENBANK AB096107).

O produto de PCR resultante codificando a cp3 N-terminalmentemodificada (cp3*) que codifica a proteína cp3* (221 aminoácidos, figura2), foientão ligado a pGEM T-Easy e seqüênciado. O segmento amplificado con-tém uma mutação A523 para G523 na seqüência de nucleotídeo que produzuma substituição de aminoácido Seri7S para GIyi7S que não tem efeito sobrea localização ou atividade da proteína como testado no presente pedido depatente.

O vetor pRIB básico compreende elementos presentes no bem-conhecido vetor pBluescript Il SK(+)que são suficientes para replicação deplasmídeo e fago, assim como um gene de resistência a antibiótico. Essevetor ainda contém um cassete de expressão com um gene marcador adi-cional (gene de resistência ao cloranfenicol) e duas unidades transcricionais.

Ambas as unidades transcricionais incluem o promotor do operon lac, umaseqüência líder PeIB contendo ATG e sítios de clonagem específicos quepermitem a inserção de uma DNA que codifica uma seqüência de proteína.

Em particular, um de tais sítios permite a fusão com uma seqüência de DNAque codifica uma proteína de revestimento funcional a ser usada para ex-pressar seqüências de proteínas heterólogas sobre a superfície do fago re-combinante (por exemplo, cp3*).

O pRIB1 -cp3* resultante foi então usado para gerar uma série devetores pRIB1 nos quais o DNA que codifica tanto um antígeno de peptídeobem caracterizado (HA tag) quanto um Fab humano, chamado e44 e carac-terizado como se ligando a proteína E2 de HCV (Burioni R et ai, 1998a), foifundido "in frame" com cp3* (figura3). Os vetores resultantes pRIB1-HAcp3*e pRIB1-e44cp3* (Fig.4) foram então usados para caracterizar as proprieda-des de cp3* para aplicações de apresentação em fago, como comparadoaos fagomídeos de controle pRIB1-cp3* e pRIB-e44 correspondentes.

A expressão das proteínas de fusão baseadas em cp3* foi verifi-cada por Western blot de extrato de proteína total preparado com clonesbacterianos contendo pRIB1-cp3*, pRIB1-HAcp3*, pRIB-e44cp3 ou pRIB1-e44cp3* e analisada com anti-HA tag (figura5A) ou anti-Fab humano (figu-ra5B). Os Western blots mostram que tanto tag HA como fab e44 são corre-tamente expressos em bactérias como proteína de fusão com cp3* usandoos vetores pRIB1-cp3*.

c) Conclusão

A seqüência da proteína cp3 modificada com o Iigante2 DIS(cp3*) pode ser clonada e expressa em um vetor de fagomídeo que permitea expressão correta de proteína de fusão baseada em cp3* em bactérias.

Exemplo 2: Preparação e Expressão de uma Seqüência de DNA

Modificada com Liqante2 DIS que Codifica uma proteína de Revestimento8de Faqo Filamentoso (cp8*) para Apresentação de Proteínas e Peptídeos

a) Materiais e Métodos

Produção de um gene que codifica uma proteína cp8 modificadacom ligante2 DIS N-terminal (proteína cp8*), vetores relacionados que ex-pressam proteínas de fusão baseadas em cp8* e suas análises

A produção de cp8* começando a partir de um bacteriófago auxi-liar M13 disponível comercialmente e a estratégia de clonagem são idênticasàquelas indicadas no Exemplo 1 para cp3*. O PCR foi realizado usando osiniciadores cp8*FW e cp8*RW (SEQ ID NO.: 15 e SEQ ID NO.: 16; Tabela I).

As condições de PCR usadas foram: 95°C por 2min (1 ciclo); 95°C por 20 s,63°C por 30 s, 72°C por 40 s (35 ciclos). A amplificação por PCR foi realiza-da usando Expand High Fidelity (Roche) de acordo com as instruções domanual. O molde de DNA (obtido de VCSM13) e as concentrações de inicia-dores usadas foram as mesmas descritas para a amplificação de cp3* porPCR. Após a amplificação por PCR1 2,5 unidades de polimerase AmpIiTaqforam adicionadas e a reação foi incubada por mais 20 minutos a 72°C. Oproduto de PCR foi submetido a eletroforese em um gel de agarose 1,5% epurificado usando o kit de extração de gene (Qiagen).

O gene cp8* modificado foi então ligado ao vetor pGEM-T easy eos clones foram então analisados por enzimas endonuclease de restrição eseqüênciados a fim de verificar a seqüência correta de cp8*.

O vetor pRIB2-cp8* foi construído usando pRIB1-cp3* que foidigerido com Spel -NheI e ligado com a cp8* derivada de pGEM-T Easy cor-tada com digestão por Spel-Nhel. A mistura de ligação foi usada para trans-formar células DH5alfa de E. coli eletrocompetentes como indicado no E-xemplo 1. Conseqüentemente, pRIB2-HAcp8* e pRIB2-e44cp8* também fo-ram gerados começando por pRIB2-cp8* e usando a mesma estratégia declonagem descrita acima para pRIB1-HAcp3* e pRIB1-e44cp3*.

O Western blot em extratos celulares totais para detectarHAcp8* e e44cp8 * foi realizada como descrito acima para HAcp3* ee44cp3*.

b) Resultados

A abordagem para modificar a terminação-N de cp8 com o Iigan-te2 DIS e para gerar os vetores de fagomídeo relacionados foi a mesma u-sada para modificar cp3 (veja Exemplo 1). Essa variante, que contém os a-minoácidos 24-73 de proteína cp8 de Enterobacteria phage M13 (No. de A-cesso SWISSPROT. P69541), não tem apenas a seqüência de sinal original.

A seqüência do gene M13 que codifica cp8 foi modificada através de amplifi-cação por PCR (cp8*, 62 aminoácidos: figura6A) gerando um produto dePCR (figura6B) que foi então usado para construir o vetor pRIB2-cp8* e umasérie de vetores nos quais a proteína de fusão baseada em cp8* contendoHA tag (figura7) ou Fab e44 humano foi clonada.

Similarmente a proteínas de fusão baseadas em cp3*, a expres-são de proteínas de fusão baseadas em cp8* foi verificada por Western blotde extrato de proteína total preparado com clones bacterianos contendopRIB2-HAcp8*, pRIB2-e44cp8*, ou sem nenhum vetor de fagomídeo, e ana-Iisada com anticorpos anti-HA tag (figura8A) ou anti-Fab humano (figura8B).

Os Western blots mostram que tanto HA tag como fab e44 são corretamenteexpressos em bactérias como proteína de fusão com cp8* usando vetorespRIB2-cp8*.

c) Conclusões

A seqüência da proteína cp8 modificada com o Iigante2 DIS(cp8*) pode ser clonada e expressa em um vetor de fagomídeo que permitea expressão correta de proteína de fusão baseada em cp8* em bactérias.Exemplo 3: Validação Funcional de Faao Apresentando cp3* oucp8* fundida a um Peptídeo ou um Anticorpo

a) Materiais & Métodos

Amplificação dos fagomídeos

Os métodos a seguir foram realizados como descrito na literatu-ra (Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Sambrook et ai, Cold SpringHarbor Press, NY, 1989). Células XL 1-BIue de E. coli eIetrocompetentesforam eletroporadas (cubeta Pulser de E. coli de 0,2 cm, 2,5 Kv) com 50 ngdo vetor de fagomídeo (pRIB1-cp3, pRIB-HAcp3, pRIB-e44cp3, pRIB1-cp3*,pRIB1-HAcp3*, pRIB1-e44cp3*, pRIB2-cp8*, pRIB2-HAcp8*, ou pRIB2-e44cp8*).

Cada cubeta foi lavada imediatamente com 1 ml e depois, com 2ml de meio SOC (cloreto de sódio o,5 g/L, triptona 20,0 g/L. extrato de leve-dura 5,0 g/L, KCI 2,5 mMol, pH ajustado para 7.0 com NaOH; após autocla-vagem, 5 ml de uma solução estéril de MgCI2 2M e 20 ml de uma soluçãoestéril de glicose 1 M para 1 litro de meio, são adicionadas pouco antes douso) em temperatura ambiente. A cultura de 3 ml foi transferida para um tubode polipropileno de 50 ml e agitada em 250 rpm por 1 hora a 37°C. 1 fil e 10 jilde cada cultura foram removidos para calcular a eficiência da transformação;elas foram plaqueadas em placa de ágar LB com ampicilina (Amp; 100 |ig/ml) etetraciclina (Tet; 10 |a.g/ml) e as placas foram incubadas a 37°C durante anoite. O conteúdo restante de cada tubo foi transferido para uma garrafacontendo 20 ml de SB acrescido de 4 |jJ de Amp de baixa concentração(20 jig/ml) e 40^il de Tet (10 pg/ml) e foi incubado e agitado a 250 rpm por 1hora a 37°C. Cada cultura foi completada para 100 ml com SB + 50 jjJ deAmp de alta concentração (50 pg/ml) + 200 fil de Tet (10 pg/ml) e incubadapor mais 1 hora a 37°C.

Superinfecção com fago auxiliar

Fago auxiliar VCSM13 (Stratagene, 1012 unidades formadorasde placa [pfu]) foi adicionado a cada cultura líquida que foi incubada posteri-ormente por 2 horas a 37°C a 250 rpm. Canamicina (70 |o.g/ml) foi adicionadae as culturas foram incubadas e agitadas durante a noite a 250 rpm a 30°C.Precipitação de fago mediada por polietileno glicol (PEG)50 ml de bactérias de cada cultura foram precipitadas por centri-fugação a 4000 rpm (2700 g) em um rotor JA10 (Beckman) por 30 minutos a4°C. Cada sobrenadante foi transferido para um tubo limpo contendo 10 mlde solução de PEG 20% (polietileno glicol, pm 8000; Sigma)/NaCI 2,5 M. Asolução foi misturada cuidadosamente pela inversão delicada do tubo 3-4vezes. As misturas foram então incubadas por pelo menos 30 minutos sobregelo. Cada amostra de fago foi precipitada por centrifugação a 15.000 rpmpor 40 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado, com cuidado para nãoagitar o precipitado. O sobrenadante residual foi removido por aspiração comuma pipeta de 1 ml. O precipitado foi ressuspenso em 1 ml de BSA/PBS 1%(1 g de albumina sérica bovina dissolvida em 100 ml de PBS e pH ajustadopara 7.4) e foi transferido para um tubo de 1,5 ml.

Infecção de células XL-1 Blue com fago ressuspenso

Uma colônia de E. coli XLI-BIue foi inoculada em uma garrafade 100 ml contendo 30 ml de SB acrescido de Tet (10 |jg/ml) e a cultura foiincubada a 37°C. 2 ml da cultura bacteriana em fase semi-logarítmica(ODeoo= =0,6) foram infectados com 1 |il de cada fago (diluído a 1:100) (iii) eas células foram incubadas e agitadas por 20 min a 37°C. Cada cultura in-fectada foi completada para 10 ml (ii) com SB e foi diluída para 1:1000 (i). 10ul e 100 ul de cada cultura foram plaqueados em placas de ágar LB acresci-das de Amp (100 |jg/ml) e Tet (10 pg/ml). As placas foram incubadas duran-te a noite a 37°C.

Determinação de CFU de fago

Quando as colônias eram de tamanho ótimo (claramente visíveissobre a placa), elas foram contadas e cfu/|il foi calculada usando a fórmula (I):

(colônias contadas /volume plaqueado) X 103(i) X 104(ii) X 102 (iii).

Ensaio de ligação fago-antígeno

Séries de duas cavidades de uma placa de ELISA de 96 cavida-des de alta capacidade de ligação (Costar) foram revestidas com 0,3 ^g dediferentes proteínas de teste: um anticorpo monoclonal anti-HA tag de muri-no comercial (HA.11 ,Covance; dissolvido em 25 fil de PBS) ou uma proteínaE2 preparada como descrito na literatura (Lesniewski et ai, 1995) dissolvidaem tampão ECB (Env Coating Buffer, bicarbonato de sódio 0,1 M, pH 8.6).

As cavidades para os controles negativos foram preparados pela adição de50 |il de BSA/PBS 1 %. A placa foi incubada durante a noite a 4°C. A reaçãode revestimento foi bloqueada pela adição de 180 M-I de BSA/PBS 1% e foiincubada a 37°C por 2 horas. A solução de BSA/PBS foi aspirada de cadacavidade da placa de ELISA e 70 \i\ do fago ressuspenso (gerado usando oprotocolo fornecido acima para os vetores de fagomídeo pRIB1-HAcp3*,pRIB1-e44cp3*, pRIB2-e44cp8*, pRib2-HAcp8*) foram adicionados a cadacavidade e a placa foi incubada por 2 horas a 37°C. O conteúdo das cavida-des foi aspirado e transferido para tubos separados (denominados como IN-PUT) e armazenados a 4°C. A placa foi lavada dez vezes com PBS/Tween-20 (PBS contendo Tween-20 0,5% (v/v), Sigma) pré-aquecido a 56°C. Cadacavidade foi então eluído com 50 jll! de tampão de eluição de "panning" (HCI0,1 MpH 2.2). O conteúdo de ambos as cavidades com o mesmo antígenofoi misturado (denominados como OUTPUT) e transferidos para um tubolimpo contendo 12 jal de tampão de neutralização de "panning" (Tris base1M, pH 9.1).

O grupo de amostras foi coletado:

Grupo 1:

OUTPUT pRIB1-HAcp3* contra anti-HAOUTPUT pRIB2-HAcp8* contra anti-HAOUTPUT pRIB1-HAcp3* contra BSAOUTPUT pRIB2-HAcp8* contra BSAOUTPUT pRIB1 -HAcp3* contra E2OUTPUT pRIB2-HAcp8* contra E2

Grupo 2:

OUTPUT pRIB1 -e44cp3* contra E2OUTPUT pRIB-e44cp3 contra E2OUTPUT pRIB1 -e44cp3* contra BSAOUTPUT pRIB-e44cp3 contra BSA

Grupo 3:

OUTPUT pRIB-e44cp3 contra E2OUTPUT pRIB2-e44cp8* contra E2OUTPUT pRIB-e44cp3 contra BSAOUTPUT pRIB2-e44cp8* contra BSA

Fagos OUTPUT e INPUT foram quantificados usando 2 ml dacultura bacteriana na fase semi-logaritimica (OD6oo= =0.6), que foram infec-tados pelos fagos INPUT e OUTPUT como descrito acima. As células infec-tadas foram incubadas e agitadas por 20 minutos a 37°C. As células foraminfectadas com todo o output e 1 |xl de INPUT (diluído a 1:100) (iii). Cadacultura infectada foi completada para 10 ml (ii) com SB e os seguintes volu-mes de cada cultura foram plaqueados em placas de ágar LB acrescidas deAmp (100 Mg/ml) e Tet (10 pg/ml): 10 jil e 100 fil de cultura infectada comINPUT diluída 1:1000 (i) 1 ^il e 10 [il de cultura infectada com OUTPUT nãodiluída. As placas foram incubadas durante a noite a 37°C.

Quando as colônias tinham o tamanho ótimo, elas foram conta-das e cfu/|il de fago foi calculada usando a seguinte fórmula (II) para fagoINPUT:

(Colônias contadas /volume plaqueado) X 103(i) X 104(ii) X 102 (iii)

As colônias de tamanho ótimo para fago OUTPUT foram conta-das e a cfu/jal de fago foi calculada usando a seguinte fórmula (III)(Colônias contadas /volume plaqueado) X 104 (ii)

b) Resultados

Uma análise comparativa da eficiência pela qual o fago recombi-nante expressando proteínas de fusão baseadas em cp3* ou cp8* infectacélulas e apresenta a proteína heteróloga foi realizada.

A eficiência da eletroporação foi a mesma para ambas as rea-ções de transformação (usando o controle positivo correspondente, vetorbaseado em cp3) em todos os experimentos. Os valores de cfu/jxl obtidoscom os vetores pRIB1-cp3*, pRIB1-HAcp3*, e pRIB1-e44cp3* foram osmesmos do fago de controle positivo, demonstrando que a modificação deseqüência em cp3* não afetou a montagem correta do fago, levando a ex-pressão correta das proteínas do fago (figura9). Essa evidência foi confirma-da também para vetores baseados em pRIB2 (figurai 0).

Um ensaio mais funcional foi realizado para verificar o enrique-cimento e a seleção ao realizar "panning" do fago baseado em cp3* ou cp8*contra um agente de ligação específica (tal como um anticorpo ou proteínaviral) imobilizado em uma placa de ELISA.

Um grande enriquecimento no fago pRIB1-HAcp3* e pRIB2-HAcp8*foi obtido usando um anticorpo monoclonal comercial contra HA tagcom relação as proteínas de controle negativo (BSA; proteína E2 de HCV),demonstrando que os fagos que têm HA tag fundida a cp3* ou cp8* estavamapresentando corretamente o peptídeo e podem ser selecionados eficiente-mente contra um agente de ligação específica (figurai 1).

Um nível de enriquecimento similar em fago pRIB2-e44cp3* oupRIB1-e44cp8* foi obtido usando a proteína E2 de HCV (o antígeno especifi-camente reconhecido por Fab e44), confirmando de novo que os fagos esta-vam apresentando corretamente o anticorpo e podiam ser eficientementeselecionados contra o antígeno coreto (figurai 2). Quando comparado a umantígeno de controle (BSA), o fago expressando e44cp3* mostrou uma sele-tividade contra antígeno específico comparável àquela do fago que expressae44cp3, enquanto que e44cp8* foi menos eficiente, provavelmente devidoaos efeitos de ligação inespecífica conhecidos observados para outros fabsexpressos na proteína cp8 de alta valência.

c) Conclusões

Os vetores de fagomídeo que expressam cp3* e cp8* podem serusados para apresentar proteínas e identificar agentes de ligação específica,incluindo peptídeos e fragmentos de anticorpo, sobre a superfície de um fa-go recombinante.

Exemplo 4: Construção de pDD-cp3*cp8* e de cassetes de DDcompatíveis com pDD-cp3*cp8*

a) Materiais & MétodosConstrução da cadeia principal de pDD-cp3*cp8*

Mesmo que SfiI possa cortar com baixa eficiência seu sítio únicoem Iigante2 DIS, um vetor também pode ser Iinearizado com outra enzimade restrição denominada Sgr//que reconhece a mesma seqüência central deSfil (GCCnnnnnGGC; veja figurai 3A).

Entretanto, como dois outros sítios Bgll já estão presentes empBlueScript Il (SK+), a seqüência original de pBlueScript Il (SK+) foi modifi-cada em duas rodadas de mutagênese direcionada ao sítio usando um 2conjuntos de iniciadores, denominados Mut BgIIA FW e RW (SEQ ID NO.: 28e SEQ ID NO.: 29; Tabela I) e Mut BgIIB FW e RW (SEQ ID NO.: 30 e SEQID NO.: 31; Tabela I), a fim de remover dois sítios de Bgll presentes na se-qüência de DNA original. O vetor resultante (pBS-deltaBgll) foi modificadopela deleção de um fragmento de 0,5 kb contendo a seqüência de MCS eLacZ compreendidas entre os sítios de restrição Pvull e Sapl e pela ligaçãoentre esses sítios de um Iigante sintético obtido pelo anelamento de dois oli-gonucleotídeos (ligante pDD FW e Iigante pDD RW; SEQ ID NO.: 32 e SEQID NO.: 33; Tabela I) que carregam extremidades compatíveis (cega em umlado, com uma extremidade 5' de filamento simples que tem a seqüênciaAGC do outro lado). Após incubação durante a noite a 4°C, 10|jl da misturade ligação foram usados para transformar células XL-1 Blue de E. coli com-petentes. No dia seguinte, 10 colônias foram coletadas e usadas para extra-ção de DNA com mini prep a fim de verificar a presença do ligante sintético.

Um clone mostrando o padrão de restrição certo foi escolhido, seqüênciadoe denominado pBS-DDdeltaBgl.

Esse plasmídeo foi usado para a produção da cadeia principalde pDD-cp3*cp8*. Nesse escopo, pBS-DDdeltaBgl foi digerido com EcoRI eNhel e ligado com um ligante sintético denominado Ligante2 pDD (SEQ IDNO.: 34) que carrega sítios de restrição relevantes (Spel, em particular) eextremidades compatíveis. O Ligante2 pDD sintético foi gerado por amplifi-cação por PCR de pBlueScript Il usando os iniciadores Ligante2 pDD FW eRW (SEQ ID NO.: 35 e SEQ ID NO.: 36; Tabela l).Após a amplificação porPCR, Ligante2 pDD foi digerido com EcoRI e Nhel e clonado em pBS-DDdeItaBgI. A mistura de ligação obtida foi incubada durante a noite a 4°C eentão usada para transformar células XL-1 Blue de E. coli. No dia seguinte,10 colônias foram coletadas e usadas para extração de DNA com mini prepa fim de verificar a inserção correta de Ligante2 pDD carregando o sítio de Spel.

Tal plasmídeo (denominado pBS-DDdeltaBgl2) foi usado paragerar pDD-cp3*cp8* usando seqüências de DNA que codificm cp3* e cp8*que foi obtidas de pRIB1-cp3* e pRIB2-cp8* que foram previamente modifi-cados por mutagênese direcionada ao sítio para eliminar sítios de restriçãoindesejados. De fato, o Iigante2 DIS originalmente presente nessas seqüên-cias contém um sítio de restrição de Bgll além daquele compreendido nosítio de-Sfil, sem alterar o aminoácido codificado (uma glicina). A substitui-ção de C por A (na posição 27 de Iigante2 DIS, SEQ ID NO.: 2) foi removidaem cp3* e cp8* usando os iniciadores Iigante deltaBgl FW e RW (SEQ IDNO.: 37 e SEQ ID NO.: 38; Tabela I) gerando o DNA que codifica cp3* ecp8* agora denominadas cp3*dBgl (SEQ ID NO.: 39) e cp8*dBgl (SEQ IDNO.: 40). Além disso, um EcoRI foi inserido em 5'de cp8*dBgl usando osiniciadores cp8* FW novo e cp8* RW (SEQ ID NO.: 39 e SEQ ID NO.: 40;Tabelai).

O plasmídeo pBS-DDdeltaBgl2 foi digerido primeiro com Spel eNhel e então ligado com o fragmento cp3*dBgll carregando extremidadescompatíveis. A mistura de ligação obtida foi incubada durante a noite a 4°C eentão usada para transformar células de DHSaIfa de E. coli. No dia seguinte,10 colônias foram coletadas e usadas para extração de DNA com mini prepa fim de verificar a inserção correta de cp3*dBgl. O plasmídeo que foi extraí-do de um clone positivo foi então digerido com EcoRI e Spel e ligado comum fragmento de cp8*dBgll carregando extremidades compatíveis. No diaseguinte, 10 colônias foram coletadas e usadas para extração de DNA commini prep a fim de verificar a inserção correta de cp8*dBgl, levando a pDD-cp3*cp8*.

Construção do cassete de DD expressando CAT (cassete DDa).

O vetor pRIB1 -HAcp3* foi primeiro modificado a fim de inserir umsítio de Bgh a 5' dos sítios de clonagem Sacie Xbal por uma rodada de mu-tagênese direcionada ao sítio usando Bglupd FW e RW (SEQ ID NO.: 43 eSEQ ID NO.: 44). O plasmídeo resultante, denominado pRIB1-DDa, foi dige-rido com Bgll e o fragmento carregando esse cassete (SEQ ID N0.:11) foiligado em pDD-cp3*cp8* digerido com Bgll. A mistura de ligação obtida foiincubada durante a noite a 4°C e então usada para transformar célulasDH5alfa de E. coli que foram cultivadas em placas de ágar LB acrescidascom Cloranfenicol (20 pg/ml). No dia seguinte, 10 colônias foram coletadasaleatoriamente e usadas para extração de DNA com mini prep a fim de veri-ficar a inserção do cassete DDa em qualquer direção por digestão por Nhele Xbal e conseqüentemente os vetores pDDa-cp3* e pDDa-cp8* expressan-do resistência a CAT.

Construção do cassete de DD expressando a resistência a Zeo-cina (ZEO; cassete DDb).

O gene de resistência a Zeocina foi amplificado por PGR usandoos iniciadores Zeo FWe RW (SEQ ID NO.: 45 e SEQ ID NO.: 46; Tabela I)do plasmídeo pSVZeo (Invitrogen). O fragmento de PCR foi clonado empGEMTeasy. Como um sítio de Bgll estava presente no gene, uma rodadade mutagênese direcionada ao sítio foi realizada usando os iniciadores Zeo-deltaBgl FW e RW (SEQ ID NO.: 47 e SEQ ID NO.: 48; Tabela I). O geneZEO modificado foi então digerido com Stule Xbal e clonado no sítio corres-pondente de pDDa-cp3*, obtendo-se pDDb-cp3*. O vetor pDDb-cp8* corres-pondente foi obtido por digerir pDDb-cp3* com Bglle religar os dois fragmen-tos. Clones que têm o fragmento de Bgll correspondente ao cassette DDbem uma ou em outra direção foram identificados por digestão com Nhel eXbal do plasmídeo de DNA extraído de colônias escolhidas aleatoriamente.

Os clones contendo os plasmídeos pDDb-cp3* e pDDb-cp8* foram sele-cionados no meio usual para células bacterianas acrescidas com Zeocina(10 g/ml).

A mutagênese direcionada ao sítio foi realizada em todas asconstruções usando um kit comercial (QuickChange Site-Directed mutage-nesis kit: Stratagene #200518). Esses iniciadores introduzem substituiçõesde nucleotídeo único nos sítios relevantes que podem ser facilmente checa-dos por digestão enzimática ou seqüênciamento e que não alteram outrascaracterísticas do vetor. Outras tecnologias para extração e digestão deDNA de plasmídeo, purificação e ligação de fragmento de DNA e transfor-mação celular foram realizadas como descrito na literatura.

As extrações de DNA de plasmídeo foram realizadas usando umkit miniprep (Qiagen). A mistura de ligação foi usada para transformar célu-las DH5alfa de E. Coli eIetrocompetentes a fim de se obter colônias suficien-tes para coletar e caracterizar.

b) Resultados

Os exemplos anteriores acima mostram que a modificação naseqüência de duas proteínas de revestimento funcionais devido a inserçãode um ligante DIS (Iigante2 DIS, em particular) ainda fornece proteínas derevestimento totalmente funcionais. As seqüências que codificam cp3* ecp8* podem ser montadas em um vetor de fagomídeo da invenção (pDD) deacordo com a estratégia resumida na figurai 3.

O vetor básico pDD-cp3*cp8* foi gerado pela modificação dovetor pBlueScript Il (SK+) e introdução de Iigantes sintéticos que permitem aclonagem seqüêncial de cp3* e cp8* posicionadas em direção oposta e quetêm suas extremidades 5' separadas por um Iigante DD-DIS (Iigante2 DD-DIS). Sítios de restrição específicos foram adicionados ou deletados durantea construção para tornar o processo de clonagem eficaz.

O vetor pDD-cp3*cp8* (figurai 3) é um esqueleto de vetor pararealizar a clonagem bidirecional de uma seqüência de proteína a ser apre-sentada como uma proteína de fusão tanto com cp3* (tornando-se um plas-mídeo conceitualmente idêntico à série de vetores pRIB1) quanto comcp8*(tornando-se um plasmídeo conceitualmente idêntico à série de vetorespRIB2), dependendo em qual direção um cassete de DD que tem as extre-midades 5' e 3' compatíveis com o vetor Iinearizado de Bgll e possivelmenteincluindo outros elementos.

Esse plasmídeo representa uma cadeia principal no qual umcassete de DD pode ser inserido para expressar uma proteína como umaproteína de fusão que contém cp3* ou cp8*. O cassete de DD pode ser for-mado pela combinação de diferentes tipos de seqüências de uma maneiraassimétrica (figurai 4), tal que uma extremidade do cassete, fornecida com oIigante DIS completo, possa mediar a fusão e a transcrição de uma seqüên-cia "in frame" com uma das ,duas proteínas de revestimento funcionais noesqueleto de pDD. O resto da seqüência pode fornecer outras funções nãodependentes da orientação na qual o cassete de DD está inserido.

O vetor básico pDD-cp3*cp8* (e em geral qualquer vetor queapresenta a mesma montagem de seqüências que codificam proteínas derevestimento funcionais separadas por um Iigante DD-DIS mostradas na fi-gurai 15, e 16) pode ser ainda modificado pela inserção de um DNA "stuf-fer" ou um gene marcador, tal que a inserção do cassete de DD possa estarassociada com a deleção ou adição de um gene marcador, facilitando a se-leção de clones nos quais o cassete DD está inserido, (figurai 5)

Dois tipos de cassetes de DD, denominados cassete DDa e DDb(figurai 7 e 18) foram produzidos começando por pRIB1-HAcp3*, inserindoum sítio de Bgll e mantendo HA como um DNA "stuffer" na posição próximaao Iigante DIS que será usado para clonar a seqüência de proteína a serapresentada. Os dois cassetes diferem pelo gene marcador posicionado en-tre a extremidade 5' do promotor usado para transcrever a proteína de fusãoe um par de sítios de restrição que são usados para clonar qualquer outraseqüência de interesse (por exemplo, uma região variável de uma cadeialeve quando se expressa um FAB) no cassete DD. Esse gene marcador(CAT ou ZEO) pode ser clonado no cassete de DD com a mesma orientaçãodas outras unidades de transcrição no cassete de DD (isto é, apontando pa-ra a extremidade do cassete de DD onde o Iigante DIS é formado para ex-pressar a proteína de fusão) ou pode ter a orientação oposta (com a vanta-gem de evitar atividades transcricionais de "read-through" de outros promotores).

Quando o cassete DDa e o cassete DDb são removidos do vetorpDD usando o sítio de restrição que limita o cassete (isto é, Bgll) e o cassetede DD é religado em um vetor pDD cortado com a mesma enzima, o cassetede DD é inserido em uma das duas orientações possíveis em cada clonetransformado com a mistura de ligação, como a digestão com uma combina-ção de duas enzimas, uma cortando dentro do cassete e a outra dentro dacadeia principal (figurai 9). Esse resultado também mostra como os eventosde inserção podem ser analisados sem o seqüênciamento de vetores e co-mo os clones também podem ser agrupados antes ou durante os procedi-mentos de rastreamento.

Os cassetes DDa e DDb podem ser usados para construir umabiblioteca quando eles são clonados em pDD ou em qualquer outro vetor.Entretanto, a digestão com Bgll e a ligação com um vetor pDD que tem ex-tremidades compatíveis é útil para se ter uma biblioteca com as característi-cas desejadas.

Conclusões

Os vetores pDD e os cassetes de DD compatíveis podem sergerados por uma série de etapas de clonagem que podem ser facilmenteacompanhadas pelo seqüênciamento e/ou digestão dos vetores intermediá-rios baseados em pDD a partir de clones usando métodos de extra-ção/purificação de DNA de plasmídeo.

Uma vez que esses vetores pDD e cassetes de DD são gerados,eles podem ser usados para gerar bibliotecas de seqüências que são clona-das em uma ou outras das orientações possíveis. Por exemplo, uma biblio-teca de Fab gerada dessa maneira pode conter um fago recombinante alter-nativo no qual o fragmento de cadeia pesada é produzido e apresentadocomo uma proteína de fusão com cp3* ou cp8*. O mesmo se aplica ao pep-tídeo HA tag ou outros peptídeos derivados de um antígeno.

Os vetores descritos acima podem ser eficientemente usadospara a construção e apresentação dupla de fragmentos de anticorpo, peptí-deos ou outras proteínas ligadas a uma das duas proteínas de revestimentosobre a superfície do fago, permitindo o rastreamento simultâneo de se-qüências apresentadas nas duas formas, sem um procedimento duplo declonagem, transformação e infecção.

A abordagem da presente invenção aumenta as possibilidadesde clonar anticorpos ou outras seqüências de proteínas cuja expressão e/oueficiência de apresentação é dependente do contexto da proteína de reves-timento fundida. Além disso, o uso de combinações diferentes de sistema deseleção (específicas para o cassete "vazio" e DD que contém os vetores defagomídeo) facilita a identificação de clones que têm a estrutura e seqüênciacorretas.

Exemplo 5: Validação Funcional de Fago Recombinante basea-do em pDD Apresentando cp3* ou cp8* fundida a um Peptídeo ou um Anti-corpo

a) Materiais & Métodos

A amplificação dos fagomídeos, superinfecção de fago auxiliar,precipitação de fago mediada por polietileno glicol (PEG), infecção de célu-las XL-IBIue com fago ressuspenso, determinação da CFU de fago, ensaiode ligação fago-antígeno e o cálculo de cfu/^il de fago foram realizados comodescrito em F.1 e na literatura (Molecular Cloning: A Laboratory Manual",Sambrook et ai, Cold Spring Harbor Press, NY1 1989).

Com relação às condições para seleção celular, Tet é usadacomo descrito acima enquanto que a Ampicilina é substituída por Cloranfeni-col (Caf; 20|jg/ml e 100pg/ml) nos experimentos que incluem derivados depDDa e com Zeocina (Zeo; lOpg/ml e 50pg/ml) nos experimentos que inclu-em derivados de pDDb.

Células XLI-BIue de E. coli eletrocompetentes foram eletropora-das (cubeta Pulser de E. co//'de 0,2 cm, 2,5 Kv) com 50 ng do vetor de fa-gomídeo (pRB32, pRIB1-HAcp3*, pRIB2-HAcp8*, pRIB1-e44cp3*, pRIB2-e44cp8*, pDDa-HAcp3*, pDDa-HAcp8*, pDDa-e44cp3*, pDDa-e44cp8*,pDDb-HAcp3*, pDDb-HAcp8*, pDDb-e44cp3*, pDDb- e44cp8*).

Os seguintes grupos de amostras foram coletados:

Grupo 1:

OUTPUT pDDa-HAcp3* contra anti-HAOUTPUT pDDa-HAcp3* contra BSAOUTPUT pDDa-HAcp8* contra anti-HAOUTPUT pDDa-HAcp8* contra BSAOUTPUT pRIB1-HAcp3* contra anti-HAOUTPUT pRIB1 -HAcp3* contra BSAOUTPUT pRIB2-HAcp8* contra anti-HAOUTPUT pRIB2-HAcp8* contra BSAOUTPUT pRB32 contra anti-HAOUTPUT pRB32 contra BSAGrupo 2:

OUTPUT pDDa- e44cp3* contra E2OUTPUT pDDa- e44cp3* contra BSAOUTPUT pDDa- e44cp8* contra E2OUTPUT pDDa- e44cp8* contra BSAOUTPUT pRIB1-e44cp3* contra E2OUTPUT pRIB1-e44cp3* contra BSAOUTPUT pRB32 contra E2OUTPUT pRB32 contra BSAGrupo 3:

OUTPUT pDDa-HAcp3* contra anti-HAOUTPUT pDDa- HAcp3* contra BSAOUTPUT pDDb- HAcp3* contra anti-HAOUTPUT pDDb- HAcp3* contra BSAOUTPUT pRIB1-HAcp3* contra anti-HAOUTPUT pRIB1-HAcp3* contra BSAOUTPUT pDDa- HAcp8* contra anti-HAOUTPUT pDDa- HAcp8* contra BSAOUTPUT pDDb- HAcp8* contra anti-HAOUTPUT pDDb- HAcp8* contra BSAOUTPUT pRIB2-HAcp8* contra anti-HAOUTPUT pRIB2-HAcp8* contra BSAGrupo 4:

OUTPUT pDDa- e44cp3* contra E2OUTPUT pDDa- e44cp3* contra BSAOUTPUT pDDb- e44cp3* contra E2OUTPUT pDDb- e44cp3* contra BSAOUTPUT pRIB1-e44cp3* contra E2OUTPUT pRIB1-e44cp3* contra BSAOUTPUT pDDa- e44cp8* contra E2

OUTPUT pDDa- e44cp8* contra BSA

OUTPUT pDDb-e44cp8* contra E2OUTPUT pDDb-e44cp8* contra BSAOUTPUT pRIB2-e44cp8* contra E2OUTPUT pRIB2-e44cp8* contra BSA

b) Resultados

Fagos recombinantes baseados em pDD e expressando proteí-nas de fusão baseadas em cp3*- ou cp8*- foram analisados seguindo amesma abordagem pela qual fagos recombinantes baseados em pRIB1- epRIB2- foram comparados funcionalmente.

Um primeiro conjunto de experimentos planejado para verificarprimeiro que a combinação de pDD-cp3*cp8* com um cassete de DD queexpressa um marcador de seleção de CAF (fagomídeos do tipo pDDa) per-mite a expressão correta e a seleção de peptídeos e fabs ou com cp3* oucom cp8* (figura20). Então, um segundo conjunto de experimentos foi plane-jado para verificar que a combinação de pDD-cp3*cp8* com um cassete deDD que expressa um marcador de seleção de CAF (fagomídeos do tipo pD-Da) ou ZEO (fagomídeos do tipo pDDb) permite a seleção e expressão cor-retas de peptídeos e fabs em cp3* ou cp8* (figura22).

A eficácia da eletroporação foi a mesma para ambas as reaçõesde transformação (usando o controle positive correspondente, vetor baseadoem cp3) em todos os experimentos. Os valores de cfu/jo.1 obtidos com veto-res baseados em pRIB1, baseados em pRIB2, baseados em pDDa e basea-dos em pDDb foram similares (cerca de 108'-109), demonstrando que a mo-dificação introduzida em cp3 e cp8 usando os fagomídeos intermediáriospRIB1 e pRIB2 não afeta a ligação correta do fago quando fagomídeos ba-seados em pDD que contém o marcador de seleção de CAT ou ZEO sãogerados.Um grande enriquecimento em fago recombinante baseado empDD específico é obtido, novamente sem nenhuma diferença relevante entreos fagomídeos incluindo o cassete de DD baseado em CAF ou ZEO, quandose usa uma proteína ou anticorpo como alvo para tal fago. Essa propriedadeé reprodutivamente encontrada em fagomídeos pDD que expressam umpeptídeo usando cp3* ou cp8*, enquanto é significativamente menor quandoapenas cp8* é usada para fagomídeos pDD que expressam um Fab alta-mente específico, confirmando ainda os resultados obtidos na literatura epara os fagomídeos pRIB1 e pRIB2 descritos acima.

c) Conclusões

O fagomídeo pDD-cp3*cp8* pode ser combinado com um casse-te de DD que compreende CAF ou ZEO como marcador de seleção paraexpressar e selecionar seqüências de proteínas na forma de proteínas defusão baseadas em cp3* ou cp8* sobre a superfície do fago recombinante.

Exemplo 6: Construção de vetores compatíveis com pDD paraexpressar seqüências selecionadas usando uma biblioteca baseada em pDD

a) Materiais & Métodos

Uma biblioteca de cDNA de medula óssea humana foi preparadae essa biblioteca foi usada como molde para reação de PCR na qual o DNAque codifica a região variável das cadeias leve e pesada de imunoglobulinasIgGI humanas foi amplificado de acordo com a literatura (Burioni et ai,1998a; "Phage Display: A Iaboratory Manual", Burton DR et ai, CSHL Press, 2001).

Os iniciadores de PCR eram parcialmente degenerados na ex-tremidade 3' e continham os sítios de restrição necessários para cloná-losem um cassete DDb nas suas extremidades 5'. Os produtos de amplificaçãoespecíficos para as cadeias leves foram digeridos primeiro com Xbal e Sacle purificados em gel de agarose. Cinco microgramas de pDDb-HAcp3* foramdigeridos com Xbal e Saci, e o esqueleto do vetor resultante foi purificadoem gel, defosforilado e usado para a preparação de uma mistura de ligaçãocom os segmentos de DNA compatíveis codificando a cadeia leve. Após in-cubação durante a noite a 4°C, a mistura de DNA foi precipitada, ressuspen-sa em 20 microlitros de água e usada para transformar células competentesXLI-BIue de E. coli por eletroporação. As células então foram incubadas em3 ml de SOC a 37°C por 1 h. 10 e 100 pi da cultura foram plaqueadas a fimde quantificar o número dos clones. O restante da cultura bacteriana foi en-tão diluída em 10 ml de SB contendo Ampicilina (10 M-g/ml), (Zeocina 10 |ig/ml),e Tetraciclina (10 ng/ml). Após 1 hora de incubação a 37°C, as células foramdiluídas em 100 ml de meio SB contendo Ampicilina (50 ng/ml), Zeocina(50 ng/ml), e Tetraciclina (10 pg/ml),e incubada durante a noite a 37°C. Nodia seguinte, as células foram coletadas e usadas para purificação e extra-ção de DNA.

A biblioteca baseada em pDDb resultante carregando as cadeiasleves foi digerida com Xhol e Spel e usada para inserção das cadeias pesa-das recuperadas a partir dos produtos de amplificação originais que forampreviamente digeridos com Xhol e Spel e purificados a partir de gel de aga-rose. A reação de ligação foi usada para transformar células XL1 Blue de E.coli competentes por eletroporação como descrito acima.

A biblioteca baseada em pDDb resultante carregando as cadeiasleve e pesada foi então digerida com Bgll e os fragmentos foram religadosno mesmo vetor. Alíquotas da biblioteca foram plaqueadas em ágar LB con-tendo Ampicilina (50 |ig/ml) e Zeocina (50 |ig/ml). O número de clones nabiblioteca foi avaliado ha ordem de 104- 105 clones. Colônias foram escolhi-das aleatoriamente das placas, cultivadas durante a noite em cultura, e usa-das para extração/purificação DNA com miniprep (seguida pela digestãocom Nhel e Xbal e análise em gel de agarose como descrito acima) e paraanálise de proteínas em Western blot (usando um anti-Fab humano de cabraconjugado com peroxidase de rábano-silvestre para detecção como descritoacima).Resultados

Uma biblioteca de DNA derivada de células da medula óssea30 humana foi usada para clonar as cadeias leve e pesada de IgGI em umcassete DDb já clonado dentro de um vetor pDDb que tem HA tag comoDNA "stuffer" entre Xhol-Spel.O DNA que codifica as cadeias leve e pesada foi seqüêncial-mente clonado nesse vetor, eliminando o DNA "stuffer", e a biblioteca resul-tante foi digerida com Bgll e religada com o objetivo de reinserir o casseteDDb em uma das duas orientações possíveis, gerando dessa maneira umabiblioteca baseada em pDDb na qual as cadeias pesadas são expressascomo uma proteína de fusão com cp3* ou cp8*.

Colônias de transformantes de E. coli incubadas na presença deZeocina (contra a qual as células são resistentes devido ao gene marcadorno cassete DDb) foram escolhidas aleatoriamente e analisadas tanto no ní-vel de DNA como de proteína (figura22). Tais clones têm o cassete DDb ori-entado em uma das orientações possíveis, como mostrado pela análise derestrição do DNA de plasmídeo extraído, e expressam fabs humanos comoproteínas de fusão nas quais a cadeia pesada está ligada a cp8* ou a cp3*.

A diferença no peso molecular e nível de expressão são consistentes com oresultado da análise de restrição, já que os clones que têm o cassete DDborientado na direção que permite a fusão da cadeia pesada a cp8*, expressaproteínas recombinantes menores que são produzidas em níveis maiorescomparados aos clones que têm o cassete DDb orientado na direção quepermite a fusão da cadeia pesada com cp3*.

Conclusões

O cassete DDb foi usado para gerar uma biblioteca de fabs hu-manos na qual as cadeias pesadas são expressas como proteínas de fusãocontendo cp3* ou cp8*. Essa biblioteca foi obtida pelo uso de uma única bi-blioteca baseada em um plasmídeo pDD que foi simplesmente digerido comum sitio de restrição no Iigante DIS e religado.

Esse processo básico pode ser aplicado também para bibliotecade seqüências que são clonadas em um cassete de DD dentro de qualquertipo de plasmídeo e então transferidas em um vetor baseado em pDD comoexemplificado no presente exemplo ou na outra situação brevemente suma-rizada na Fig 15.

O processo completo para identificar seqüências relevantes emum sistema baseado em pDD para vetor por apresentação em fago e sele-ção de afinidade pode ser descrito (figura23). Começando da combinaçãoapropriada de vetor pDD e de biblioteca de seqüências a ser analisadas quesão clonadas dentro de um cassete de DD, a etapa de ligação e transforma-ção fornece uma biblioteca celular, selecionável pela aplicação da combina-ção correta de antibióticos, que codifica os dois tipos de proteínas de fusão(por exemplo, compreendendo cp3* ou cp8*). Infecção por fago auxiliar tornaentão possível produzir simultaneamente uma biblioteca de fago recombi-nante na qual as proteínas a serem rastreadas são expressas em duas po-pulações de fagos mistas na mesma biblioteca gerada usando um único ve-tor pDD. Essa biblioteca pode ser rastreada usando as abordagens relatadasna literatura a fim de isolar, seqüênciar, e caracterizar proteínas e peptídeosrelevantes que são expressos e apresentados como proteínas de fusão comcp3* ou cp8*.<table>table see original document page 71</column></row><table>REFERÊNCIAS

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<110> RiboVax Biotechnologies SA

<120> Tecnologias de apresentação em fago

<130> PAF04WO-SCB947

<150> PCT/EPO5/007325

<151> 2005-07-07

<160> 48

<170> Versão de patente 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SpeI - Seqüência ligante de DNA DIS

<400> 1

actagtggcc aggccggcc

<210> 2

<211> 36

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> SpeI - Seqüência ligante 2 de DNA DIS

<400> 2

actagtggcc aggccggcca gggtggcggt ggctct

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> SpeI - Seqüência ligante 2 proteína DIS<400> 3

Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> BgII-SpeI-BgII DD-DIS ligante<400> 4

gccggcctgg ccactagtgg ccaggccggc 30

<210>. 5

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DIS ligante 2<400> 5

agagccacct ccaccctggc cggcctggcc actagtggcc aggccggcca gggtggaggt 60ggctct 66

<210> 6

<211> 672

<212> DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> seqüência de DNA cp3*<4 00> 6

actagtggcc aggccggcca gggtggcggt ggctctccat tcgtttgtga atatcaaggc 60caatcgtctg acctgcctca acctcctgtc aatgctggcg gcggctctgg tggtggttct 120ggtggcggct ctgagggtgg tggctctgag ggtggcggtt ctgagggtgg cggctctgag 180ggaggcggtt ccggtggtgg ctctggttct ggtgattttg attatgaaaa gatggcaaac 240gctaataagg gggctatgac cgaaaatgcc gatgaaaacg cgctacagtc tgacgctaaa 300

ggcaaacttg attctgtcgc tactgattac ggtgctgcta tcgatggttt cattggtgac 360

gtttccggcc ttgctaatgg taatggtgct actggtgatt ttgctggctc taattcccaa 420

atggctcaag tcggtgacgg tgataattca cctttaatga ataatttccg tcaatàttta 480

ccttccctcc ctcaatcggt tgaatgtcgc ccttttgtct ttggcgctgg taaaccatat 540

gaattttcta ttgattgtga caaaataaac ttattccgtg gtgtctttgc gtttctttta 600

tatgttgcca cctttatgta tgtattttct acgtttgcta acatactgcg taataaggag 660

tcttaagcta gc 672

<210> 7

<211> 221

<212 > PRT

<213 > Artificial

<220>

<223> seqüência de proteína cp3*<400> 7

Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly Ser Pro Phe Val Cys1 5 10 15

Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro Val Asn Ala20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly35 40 45

Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser50 55 60

Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn65 70 75 BO

Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln85 90 95

Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala100 105 110

Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn115 120 125Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val130 135 140

Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr Leu145 150 155 160

Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe Gly Ala165 170 175

Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile Asn Leu Phe180 185 190

Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe Met Tyr Val19.5 200 205

Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys Glu Ser210 215 220

<210> 8

<211> 195

<212 > DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência DNA cp8*<400> 8

actagtggcc aggccggcca gggtggcggt ggctctgctg agggtgacga tcccgcaaaa 60gcggccttta actccctgca agcctcagcg accgaatata tcggttatgc gtgggcgatg 120gttgttgtca ttgtcggcgc aactatcggt atcaagctgt ttaagaaatt cacctcgaaa 180gcaagctgag ctagc. 195

<210> 9

<211> 62

<212> PRT

<213 > Artificial

<220>

<223> seqüência de proteína cp8*

<400> 9

Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu Gly Asp1 5 10 15Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asn Ser Leu Gln Ala Ser Ala Thr Glu20 25 30

Tyr Ile Gly Tyr Ala Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly Ala Thr35 40 45

Ile Gly Ile Lys Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser50 55 60

<210> 10

<211> 849

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> cp3 * ligado a cp8* por meio de um ligante 2 DD-DIS<400> 10

ttaagactcc ttattacgca gtatgttagc aaacgtagaa aatacataca taaaggtggc 60

aacatataaa agaaacgcaa agacaccacg gaataagttt attttgtcac aatcaataga 120

aaattcatat ggtttaccag cgctaaagac aaaagggcga cattcaaccg attgagggag 180

ggaaggtaaa tattgacgga aattattcat taaaggtgaa ttatcaccgt caccgacttg 24 0

agccatttgg gaattagagc cagcaaaatc accagtagca ccattaccat tagcaaggcc 300

ggaaacgtca ccaatgaaac catcgatagc agcaccgtaa tcagtagcga cagaatcaag 360

tttgccttta gcgtcagact gtagcgcgtt ttcatcggca ttttcggtca tagccccctt 420

attagcgttt gccatctttt cataatcaaa atcaccggaa ccagagccac caccggaacc 480gcctccctca gagccgccac cctçagaacc gccaccctca gagccaccac cctcagagcc 540

gccaccagaa ccaccaccag agccgccgcc agcattgaca ggaggttgag gcaggtcaga 600

cgattggcct tgatattcac aaacgaatgg agagccacct ccaccctggc cggcctggcc 660

actagtggcc aggccggcca gggtggaggt ggctctgctg agggtgacga tcccgcaaaa 720

gcggccttta actccctgca agcctcagcg accgaatata tcggttatgc gtgggcgatg 780

gttgttgtca ttgtcggcgc aactatcggt atcaagctgt ttaagaaatt cacctcgaaa 840

gcaagctga

<210> 11

<211> 1944

<212 > DNA

<213> Artificial

849<220>

<223> DDa cassete

<400> 11

ggccggcctg gccgcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 60

ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 120

acacaaattc taaactagct taaggagaca gtcataatga aatacctatt gcctacggca 180

gccgctggat tgttattact cgctgcccaa ccagccatgg ccgagctcca gatgacccag 240

tctccttcca ccctctagaa cgcgttagta aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga 300

ataaataaat cctggtgtcc ctgttgatac cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa 360

atgaggcgtt gatcggcacg taagaggttc caactttcac cataatgaaa taagatcact 420

accgggcgta ttttttgagt tgtcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa 4 80

aaaaattact ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag aacattttga 540

ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc gttcagctgg atattacggc 600

ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca caagttttat ccggccttta ttcacattct 660

tgcccgcctg atgaatgctc atccggaatt acgtatggca atgaaagacg gtgagctggt 720

gatatgggat agtgttcacc cttgttacac cgttttccat gagcaaactg aaacgttttc 780

atcgctctgg agtgaatacc acgacgattt ccggcagttt ctacacatat attcgcaaga 840

tgtggcgtgt tacggtgaaa acctggccta tttccctaaa gggtttattg agaatatgtt 900

tttcgtctca gccaatccct gggggagttc accagttttg atttaaacgt ggccaatatg 960

gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg ggcaaatatt atacgcaagg cgacaaggtg 1020

ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat gccgtttgtg atggcttcca tgtcggcaga 1080

atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat gagtggcagg gcggggcgta atttttttaa 114 0

ggcagttatt ggtgccctta aacgcctggt tgctacgcct gaataagtga taatâagcgg 1200

atgaatggca gaaattcgaa agcaaattcg acccggtcgt cggttcaggg cagggtcgtt 1260

aaatagccgc ttatgtctat tgctggttta ccggtttatt gactaccgga agcagtgtga 1320

ccgtgtgctt ctcaaatgcc tgaggccagt ttgctcaggc tctccccgtg gaggtaataa 1380

ttgacgatat gatccttttt ttctgatcaa aagtgctcat cattggttac taacgcgtcc 1440

atggggcgga gaatgggccg gaactgggcg gagttagggg cgggatgggc agagtccatg 1500

gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ggcctctgag ctattccaga 1560

agtagtgagg aggctttttt ggaggcctag gcttttgcaa aaagctcccg ggagcttgga 1620

tcgggctgca ggaattcacg acaggtttcc cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc 1680aattaatgtg agttagctca ctcattaggc accccaggct ttacacttta tgcttccggc 1740

tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac acaaattcta aactagctta 1800

aggagacagt cataatgaaa tacctattgc ctacggcagc cgctggattg ttattactcg 1860

ctgcccaacc agccatggcc caggtgaaac tgctcgagta tccatatgat gttccagatt 1920

atgctactag tggccaggcc ggcc 1944

<210> 12<211> 1203<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> DDb cassete<400> 12

ggccggcctg gccgcgcaac gcaattaatg tgagttagct cactcattag gcaccccagg 60

ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat tgtgagcgga taacaatttc 120

acacaaattc taaactagct taaggagaca gtcataatga aatacctatt gcctacggca 180

gccgctggat tgttattact cgctgcccaa ccagccatgg ccgagctcca gatgacccag 240

tctccttcca ccctctagac atgataagat acattgatga gtttggacaa accacaacta 3 00

gaatgcagtg aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa 3 60

ccattataag ctgcaataaa caagtttcga ggtcgagtgt cagtcctgct cctcggccac 420

gaagtgcacg cagttgccgg ccgggtcgcg cagggcgaac tcccgtcccc acggctgctc 480

gccgatctcg gtcatggccg gcccggaggc gtcccggaag ttcgtggaca cgacctccga 540

ccactcggcg tacagctcgt ccaggccgcg cacccacacc caggccaggg tgttgtccgg 600

caccacctgg tcctggaccg cgctgatgaa cagggtcacg tcgtcccgga ccacaccggc 660

gaagtcgtcc tccacgaagt cccgggagaa cccgagccgg tcggtccaga actcgaccgc 720

tccggcgacg tcgcgcgcgg tgagcaccgg aacggcactg gtcaacttgg ccatggttta 780gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat gccgatgatt aattgtcaacaaggcctagg cttttgcaaa aagctcccgg gagcttggat cgggctgcag gaattcacga

caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga gttagctcac 960

tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt gtggaattgt 1020

gagcggataa caatttcaca caaattctaa actagcttaa ggagacagtc ataatgaaat 1080

acctattgcc tacggcagcc gctggattgt tattactcgc tgcccaacca gccatggccc 1140

840900aggtgaaact gctcgagtat ccatatgatg ttccagatta tgctactagt ggccaggccg 1200gcc 1203

<210> 13

<211> 45

<212 > DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cp3* à frente do iniciador de PCR

<400> 13

gacaaaacta gtggccaggc cggccagggt ggcggtggct ctcca 45

<210> 14

< 211> 27

<212 > DNA

<213 > Artificial

<22 0>

<223> cp3* com iniciador de PCR reverso

<400> 14

gtggtggcta gcttaagact ccttatt 27

<210> 15

<211> 57

<212 > DNA

<213> Artificial

<220>

<223> cp8* à frente do iniciador de PCR

<400> 15

actagtggcc aggccggcca gggtggcggt ggctctgctg agggtgacga tcccgca 57

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial

<2 2 0><223>

cp8* com iniciador de PCR reverso<400> 16

gtggtggcta gctcagcttg ctttcgaggt gaattt 36

<210> 17

<211> 33

<212> DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Ligante HA Tag à frente do oligomucleotideo<400> 17

tcgagtatcc atatgatgtt ccagattatg cta 33

<210> 18

<211> 33

<212> DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Ligante HA Tag reverso ao oligomucleotideo<400> 18

ctagtagcat aatctggaac atcatatgga tac 33

<210> 19

<211> 774

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> seqüência HAcp3* completa<400> 19

atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgctgc ccaaccagcc 60

atggcccagg tgaaactgct cgagtatcca tatgatgttc cagattatgc tactagtggc 120

caggccggcc agggtggcgg tggctctcca ttcgtttgtg aatatcaagg ccaatcgtct 180

gacctgcctc aacctcctgt caatgctggc ggcggctctg gtggtggttc tggtggcggc 240

tctgagggtg gtggctctga gggtggcggt tctgagggtg gcggctctga gggaggcggt 300tccggtggtg gctctggttc cggtgatttt gattatgaaa agatggcaaa cgctaataag 360ggggctatga ccgaaaatgc cgatgaaaac gcgctacagt ctgacgctaa aggcaaactt 420gattctgtcg ctactgatta cggtgctgct atcgatggtt tcattggtga cgtttccggc 480cttgctaatg gtaatggtgc tactggtgat tttgctggct ctaattccca aatggctcaa 540gtcggtgacg gtgataattc acctttaatg aataatttcc gtcaatattt accttccctc 600cctcaatcgg ttgaatgtcg cccttttgtc tttggcgctg gtaaaccata tgaattttct 660attgattgtg acaaaataaa cttattccgt ggtgtctttg cgtttctttt atatgttgcc 720acctttatgt atgtattttc tacgtttgct aacatactgc gtaataagga gtct 774

<210> 20

<211> 258

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Seqüência de proteína HAcp3* completa

<400> 20

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Lys Leu Leu Glu Tyr Pro Tyr Asp20 25 30

Val Pro Asp Tyr Ala Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly35 40 45

Ser Pro Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser Asp Leu Pro Gln50 55 - 60

Pro Pro Vál Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly65 70 75 80

Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser85 90 95

Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr100 105 HO

Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp115 120 125

Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala130 135 140Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly145 150 155 160

Leu Ala Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser165 170 175

Gln Met Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn180 185 190

Phe Arg Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro195 200 205

Phe Val Phe Ser Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp210 215 220

Lys Ile Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala225 230 235 240

Thr Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys245 2S0 255

Glu Ser

<210> 21

<211> 297

<212> DNA

<213> Artificial

<22 0>

<223> Seqüência de DNA HAcp8* completa

<400> 21 atgaaatacc tattgcctac ggcagccgct ggattgttat tactcgctgc ccaaccagcc 60atggcccagg tgaaactgct cgagtatcca tatgatgttc cagattatgc tactagtggc 120caggccggcc agggtggcgg tggctctgct gagggtgacg atcccgcaaa agcggccttt 180aactccctgc aagcctcagc gaccgaatat atcggttatg cgtgggcgat ggttgttgtc 240attgtcggcg caactatcgg tatcaagctg tttaagaaat tcacctcgaa agcaagc 29*7

<210> 22

<211> 99

<212> PRT

<213 > Artificial

<220><223 >

Seqüência de proteína HAcp8* completa<400> 22

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Lys Leu Leu Glu Tyr Pro Tyr Asp20 25 30

Val Pro Asp Tyr Ala Thr Ser Gly Gln Ala Gly Gln Gly Gly Gly Gly35 40 45

Ser Ala Glu Gly Asp Asp Pro Ala Lys Ala Ala Phe Asn Ser Leu Gln50 55 60

Ala Ser Ala Thr Glu Tyr Ile Gly Tyr Ala Trp Ala Met Val Val Val65 70 75 80

Ile Val Gly Ala Thr Xle Gly Ile Lys Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser85 90 95

Lys Ala Ser

< 210 > 23

<211> 109

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> promotor LAcZ<400> 23

cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg 60

cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac aatttcaca 109

<210> 24

<211> 99

<212> DNA

<213> Artificial

<22 0>

<223> sinal da seqüência de DNA adaptado a PelB de erwinia carotovora

<400> 24

aaggagacag tcataatgaa atacctattg cctacggcag ccgctggatt gttattactcgctgcccaac cagccatggc ccaggtgaaa ctgctcgag

60

99<210> 25

<211> 28

<212 > PRT

<213> Artificial

<220>

<223> sinal da seqüência de proteína adaptado a PelB de erwinia carotovo

<400> 25

Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Val Lys Leu Leu Glu

20 25

<210> 26

<211> 27

<212 > DNA

<213 > Artificial

<22 0>

<223> SacI-XbaI nLC stuffer" oligonucleotideo

<400> 26

ccagatgacc cagtctcctt ccaccct 27

<210> 27

<211> 35

<212 > DNA

<213> Artificial

<220>•

<223> SccI-XbaI lc"sstuffer" oligonucleotideo reverso

<400> 27

ctagagggtg gaaggagact gggtcatctg gagct

<210> 28<211> 29<212> DNA<213> Artificial

35

<220><223> Mut BglI à frebte do inicidor de PCR

<400> 28

gcgcgtccca ttcgacattc aggçtgcgc

<210> 29

<211> 29

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> mut BglI como iniciador de PCR reveso

<400> 29

gcgcagcctg aatgtcgaat gggacgcgc

<210> 30

<211> 27

<212 > DNA

<213> Artificial

<220>

<223> mut BglI à frente do iniciador de PCR

<400> 30

ttctgcgctc ggcacttccg gctggct

<210> 31

<2ll> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> mut BglI à frente do iniciador de PCR

<400> 31

agccagccgg aagtgccgag cgcagaa

<210> 32

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> Ligante pDD à frente de um oligonucleotídeo<400> 32

ctggctagca aaggccaggc cggccaaaga attcgctctt cc 42

<210> 33

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ligante pDD oligonucleotídeo reverso

<400> 33

agcggaagag cgaattcttt ggccggcctg gcctttgcta gccag 45

<210> 34

<211> 268

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ligante pDD produto de PCT

<4 00> 34 gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg gcccccctcg aggtcgacgg 60tatcgataag cttgatatcg aattcctgca gcccggggga tccactagtt ctagagcggc 120cgccaccgcg gtggagctcc agcttttgtt ccctttagtg agggttaatt gcgcgcttgg 180cgtaatcatg gtcatagctg tttcctgtaa attgttatcc gctcacaatt ccacacaaca 240tacgagccgg aagcatgcta gccagctg 266

<210> 35

<211> .26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ligante 2 pDD à frente de um iniciador de PCR<400> 35

gcgcgtaata cgactcacta tagggc 26

<210>

36<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Ligante 2 pDD com iniciador de PCR reveso<400> 36

cagctggcta gcatgcttcc ggctcgtatg ttgtg 35

<210> 37

<211> 23

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Delta Bgl ligador à frente do iniciador de PCR<400> 37

ccggccaggg tggaggtggc tct 23

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DeltaBgl ligador com iniciador de PCR reverso<4 00> 38

agagccacct ccaccctggc cgg 23

<210> 39<211> 666<212> DNA

<213> Artificial

<220> . '<223> Seqüência de DNA cp3*dBgl

<4 00> 39

actagtggcc aggccggcca gggtggaggt ggctctccat tcgtttgtga atatcaaggc 60caatcgtctg acctgcctca acctoctgtc aatgctggcg gcggctctgg tggtggttct 120ggtggcggct ctgagggtgg tggctctgag ggtggcggtt ctgagggtgg cggctctgag 180ggaggcggtt ccggtggtgg ctctggttcc ggtgattttg attatgaaaa gatggcaaac 240gctaataagg gggctatgac cgaaaatgcc gatgaaaacg cgctacagtc tgacgctaaa 300ggcaaacttg attctgtcgc tactgattac ggtgctgcta tcgatggttt cattggtgac 360gtttccggcc ttgctaatgg taatggtgct actggtgatt ttgctggctc taattcccaa 420atggctcaag tcggtgacgg tgataattca cctttaatga ataatttccg tcaatattta 480ccttccctcc ctcaatcggt tgaatgtcgc ccttttgtct ttagcgctgg taaaccatat 540gaattttcta ttgattgtga caaaataaac ttattccgtg gtgtctttgc gtttctttta 600tatgttgcca cctttatgta tgtattttct acgtttgcta acatactgcg taataaggag 660tcttaa 666

<210> 40

<211> 189

<212 > DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Seqüência de DNA cp8*dBgl<400> 40

actagtggcc aggccggcca gggtggaggt ggctctgctg agggtgacga tcccgcaaaa 60

gcggccttta actccctgca agcctcagcg accgaatata tcggttatgc gtgggcgatg 120gttgttgtca ttgtcggcgc aactatcggt atcaagctgt ttaagaaatt cacctcgaaa 180gcaagctga 189

<210> 41

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Novo iniciador de PCR cp8*FW<400> 41

atgtactagt ggccaggccg gccaggg 27

<210> 42<211> 37<212> DNA<213> Artificial<220>

<223> Novo iniciador de PCR cp8*RW

<400> 42

ggaatcctag aattctcagc ttgctttcga ggtgaat

<210> 43

<211> 39

<212 > DNA

<213> Artificial

<220>

<223> BglipFW à frente do iniciador de PCR

<4 00> 43

aatgagtagg ccttgttgac aattaatcat cggcatagt

<210> 44

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador de PCR reverso

<400> 44

aactggatct agacatgata agatacaaca ttgatgagtt tgg

<210> 45

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Zeo à frente do iniciador de PCR

<400> 45

aatgagtagg ccttgttgac aattaatcat cggcatagt

<210> 46<211> 40<212> DNA

<213 > Artificial

<220>

<223> Zeo iniciador de PCR reverso<400> 46

aactggatct agacatgata agatacattg atgagtttgg

4728DNA

Artificialc220>

c223> Iniciador de PCRc400> 47

gagcagccgt ggggacggga gttcgccc

c210> 48

s211> 28

;212 > DNA

c213 > Artificial

;220>

c223> Iniciador de PCR;400> 48

gggcgaactc ccgtccccac ggctgctc

210>211>212>213 >

Claims (18)

1. Vetor de fagomídeo para clonagem bidirecional de um DNAque codifica uma seqüência de aminoácido a ser fundida à terminação N deuma ou outra de duas proteínas de revestimento funcionais.

2. Vetor de fagomídeo que compreende:a) Um DNA que codifica uma primeira proteína de revesti-mento funcional que compreende um primeiro Iigante deDNA na sua extremidade 5'; eb) Um DNA que codifica uma segunda proteína de reves-timento funcional, que tem a direção de transcrição o-posta àquela da primeira proteína de revestimento fun-cional, e que compreende um segundo Iigante de DNAna sua extremidade 5';em que o primeiro e o segundo Iigantes de DNA compreendempelo menos um sítio idêntico para uma enzima de restrição não presentefora do dito Iigante no vetor de fagomídeo.

3. Vetor de acordo com a reivindicação 2, em que o Iigante deDNA pode ser transcrito em fase de leitura ("in frame") com a extremidade 5'do DNA que codifica uma proteína de revestimento funcional, e com a ex-tremidade 3' do DNA que codifica uma seqüência de proteína a ser fundida eapresentada pela dita proteína de revestimento funcional.

4. Vetor de acordo com a reivindicação 3, em que os primeiro esegundo Iigantes de DNA compreendem uma seqüência escolhida a partirde SEQ ID NO.: 1 e SEQ ID NO.: 2.

5. Vetor de acordo com a reivindicação 3, em que os primeiro esegundo DNA formam uma seqüência escolhida a partir de SEQ ID NO.: 4 eSEQ ID NO.: 5.

6. Vetor de acordo com a reivindicação 5, compreendendocp3*DDcp8* (SEQ ID NO.: 10).

7. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteri-ores ainda compreendendo um cassete de DNA para a clonagem, a ex-pressão, e a apresentação de pelo menos uma seqüência de proteína a serfundida à terminação N de uma ou outra das ditas proteínas de revestimen-to funcionais por meio de um dos ditos Iigantes de DNA.

8. Vetor de fagomídeo de acordo com a reivindicação 7, emque a seqüência de proteína a ser fundida à terminação N de uma ou outrade duas proteínas de revestimento funcionais por meio de um Iigante deDNA é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um epítopo, uma região deligação de epítopo, um antígeno, um alérgeno, um peptídeo bioativo, umaenzima, um inibidor de enzima, uma sítio catalítico enzimático, uma proteínade ligação de DNA, um domínio de proteína isolado, um Iigante para recep-tores, um receptor, um fator de crescimento, uma citocina, e fragmentos con-tíguos ou superpostos de uma seqüência de proteína de interesse.

9. Vetor de acordo com qualquer uma das reivindicações anteri-ores, em que o DNA que codifica as duas proteínas de revestimento funcio-nais são cp3 (cp3*, SEQ ID NO.: 6) e cp8 (cp8*, SEQ ID NO.: 8) modificadas.

10. Vetor de acordo com a reivindicação 7, compreendendo umcassete de DDa (SEQ ID NO.: 11) ou um cassete de DDb (SEQ ID NO.-.12).

11. Uso de um vetor como definido nas reivindicações I a 10,para gerar uma biblioteca de fago ou de célula em que cada seqüência deproteína da dita biblioteca é fundida à terminação N de uma ou outra de du-as proteínas de revestimento funcionais por meio de um Iigante de DNA.

12. Biblioteca de fago ou de célula obtida usando um vetor comodefinido nas reivindicações 1 a 10, em que cada seqüência de proteína dadita biblioteca é fundida à terminação N de uma ou outra de duas proteínasde revestimento funcionais por meio de um Iigante de DNA.

13. Biblioteca de fago ou de célula de acordo com a reivindica-ção 12, em que a seqüência de proteína a ser fundida à terminação N deuma ou outra de duas proteínas de revestimento funcionais por meio de umligante de DNA, é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um epítopo,uma região de ligação de epítopo, um antígeno, um alérgeno, um peptídeobioativo, uma enzima, um inibidor de enzima, um sítio catalítico enzimático,uma proteína de ligação ao DNA, um domínio de proteína isolado, um Iigantepara receptores, um receptor, um fator de crescimento, uma citocina, efragmentos contíguos ou superpostos de uma seqüência de proteína de inte-resse.

14. Biblioteca de fago ou de célula de acordo com a reivindica-ção 12, em que as duas proteínas de revestimento funcionais são proteínacp3 modificada (proteína cp3*; SEQ ID NO.: 7) e proteína cp8 modificada(proteína cp8*; SEQ ID NO.: 9).

15. Kit para gerar uma biblioteca de fago ou célula em que cadaseqüência de proteína da dita biblioteca é fundida à terminação N de uma ououtra de duas proteínas de revestimento funcionais por meio de um IiganteDIS1 compreendendo um vetor como definido nas reivindicações 1 a 10.

16. Método para produzir uma biblioteca de fago ou de célula emque cada seqüência de proteína da dita biblioteca é fundida à terminação Nde uma ou outra de duas proteínas de revestimento funcionais por meio deum Iigante de DNA, compreendendo:a) inserir um cassete de DNA em correspondência dos Iigan-tes de DNA de um vetor como definido na reivindicação 2;eb) transformar células bacterianas com os vetores resultantes.

17. Método como definido na reivindicação 11, em que a inser-ção do dito cassete de DD é obtida pela ligação de um cassete de DNA e odito vetor que foram digeridos com Bgll.

18. Uso de fago recombinante ou proteínas de fusão obtidas pe-los métodos como definido nas reivindicações 16 ou 17, para ligação, detec-ção, neutralização e/ou alteração de um ligante, uma célula, ou uma molécu-la-alvo, em que o dito fago recombinante ou proteínas de fusão estão nasformas isoladas ou nas formas de misturas.