ES2241117T3 - Biblioteca de expresion de peptidos o proteinas in vitro. - Google Patents
Biblioteca de expresion de peptidos o proteinas in vitro.Info
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- C12N2795/10111—Myoviridae
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Abstract
Un método para producir una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas, que presenta una población diversa de péptidos o proteínas, en la que los péptidos o proteínas están asociados de manera específica con el DNA que los codifica a través de uniones covalentes proteína:DNA, comprendiendo dicho método al menos las etapas de: 1) preparar una biblioteca genética amplificable de moléculas de DNA que contienen: (i) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos se une de manera específica a la secuencia que la codifica a través de uniones covalentes proteína:DNA (resto de unión), y (ii) una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que va a ser presentada (resto de presentación), y 2) expresar la biblioteca genética así formada, en la que dicha molécula de DNA cuando se expresa produce un producto resultante de la traducción que contiene el resto de presentación y el resto de unión, y en la que dichamolécula de DNA contiene al menos un sitio de unión para el resto de unión.
Description
Biblioteca de expresión de péptidos o proteínas
in vitro.
La presente invención se refiere a métodos para
producir una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas in
vitro, que presenta una población diversa de péptidos o
proteínas, la biblioteca de expresión así producida y el uso de la
biblioteca para identificar péptidos o proteínas que exhiben
propiedades deseadas. La invención también se refiere a secuencias
de DNA específicas que incluyen la región codificadora de los
péptidos o las proteínas y que se unen de manera específica al
producto resultante de su traducción a través de uniones
covalentes.
Del mismo modo que las bibliotecas proveen al
lector de una vasta colección de libros diversos que son
recuperables, así también una biblioteca molecular provee a un
banco de referencia de moléculas que se pueden seleccionar y
recuperar. Esas bibliotecas pueden contener material genético, por
ejemplo fragmentos de secuencias de DNA en un plásmido o
bacteriófago, o pueden expresar péptidos o proteínas codificados por
el material genético de la biblioteca. En este último caso, para
permitir la selección del miembro relevante de la biblioteca, el
péptido o la proteína expresado debe estar necesariamente asociado
con el material genético que lo codifica. En la actualidad, esto se
consigue de varias maneras diferentes.
En primer lugar, los péptidos se pueden presentar
en las superficies externas de empaquetamientos genéticos tales como
células, virus y esporas, en particular bacteriófagos, bacterias o
levaduras, en forma de partes fusionadas de una proteína de
presentación. El resto invariable de la proteína de presentación de
una biblioteca particular se selecciona de modo que presente la
característica de que se expresa en la superficie del
empaquetamiento genético, por ejemplo una célula o virión, y está
asociado de manera estable con la célula o virión de manera que los
empaquetamientos genéticos que expresan la proteína o el péptido
diana se pueden recuperar.
Smith y Scott (Smith (1985), Science, 228,
1315-1316; Scott y Smith (1990), Science,
249, 386-390) describen el uso del
bacteriófago Fd como vector del sistema de presentación de una
secuencia aleatoria de péptidos expuestos sobre la superficie del
virión. El documento US-A-5223409 de
Ladner describe la expresión de familias de dominios de unión
potenciales sobre la superficie externa de células bacterianas o de
bacteriófagos. Otros investigadores de muchos laboratorios han
usado de manera similar esos empaquetamientos genéticos para generar
bibliotecas de expresión. Muchos de estos trabajos se han realizado
en fagos filamentosos como el M13 que han demostrado ser un sistema
robusto y relativamente fácil de manejar.
Sin embargo, esta tecnología aún adolece de
algunos inconvenientes, como el tiempo y el esfuerzo requeridos para
construir una biblioteca que sea lo suficientemente grande como para
producir variantes suficientes para la selección. De manera
adicional, los empaquetamientos genéticos usados hasta la fecha
deben ser mantenidos en un estado viable que permita tanto la
expresión de la proteína o del péptido codificado como también la
propagación del empaquetamiento genético durante las sucesivas
etapas de escrutinio. Además, el polipéptido presentado debe ser
compatible con su salida del organismo y con el ensamblaje de un
miembro de una pareja de fusión dentro de la estructura apropiada
sobre el organismo. Asimismo, debido a que la síntesis de proteínas
tiene lugar in vivo, solamente aquellas modificaciones que
el hospedador que ejecuta la traducción pueda realizar, pueden ser
incorporadas en la secuencia presentada.
El tiempo invertido en la propagación de los
empaquetamientos genéticos seleccionados durante el protocolo de
escrutinio representa también una carga de tiempo importante para
el investigador. Además, en la biblioteca de presentación de
péptidos in vivo actualmente utilizada, es necesario
transfectar un hospedador con el material genético de la biblioteca
para permitir su replicación y su expresión, y se sabe que la
transformación es un procedimiento no eficiente que por ello reduce
el número de miembros que pueden estar presentes en una biblioteca
de expresión.
En fechas más recientes, se han descrito
bibliotecas de expresión in vitro que solucionan algunas de
las limitaciones de las bibliotecas de expresión in vivo,
anteriormente mencionadas. Por ejemplo, se ha descrito un sistema de
presentación en polisomas en el que una proteína completa y
correctamente plegada, que porta diferentes péptidos de
presentación en diferentes miembros de la biblioteca, y el mRNA que
la codifica, permanecen ambos unidos a los ribosomas. Esto se
consigue garantizando que la cadena de la proteína no abandona el
ribosoma y que el mRNA no abandona el ribosoma (es decir, no hay
ningún codón de terminación y los ribosomas están estabilizados).
Estas bibliotecas de expresión son el asunto de varias solicitudes
de patentes, por ejemplo, las publicadas en el documento WO92/02536
(The Regents of the University of Colorado), en el documento
WO93/03172 (University Research Corporation) y en el
documento WO91/05058 (Kawasaki).
Las bibliotecas en polisomas adolecen de algunas
limitaciones. El RNA es muy sensible a las RNasas y por ello es
difícil trabajar con él. Mantener la unión de los ribosomas
requiere la presencia continuada de iones de magnesio lo cual crea
problemas en la etapa de escrutinio y en otras etapas en las que
deben estar siempre presentes. Y lo que es más importante, todas
las etapas posteriores a la traducción, especialmente durante el
escrutinio y el procedimiento de selección, no se deben realizar
con reactivos rigurosos ya que la unión polisoma:RNA se debe
mantener.
Una biblioteca diferente de expresión in
vitro que ha sido sugerida, implica el uso de proteínas de unión
a DNA. Estas proteínas se expresan en una bacteria o en otro
organismo delimitado por una membrana, usando un plásmido que
contiene un sitio de unión para la proteína de unión a DNA. El
polipéptido y el ácido nucleico que lo codifica se encuentran
ligados operativamente ya que la proteína se asocia de manera
transitoria con el ácido nucleico que la codifica. Las secuencias de
la biblioteca se introducen en el polipéptido sin que se afecte la
unión al DNA mediante la inserción del resto de presentación para
producir una proteína de fusión. Estas bibliotecas se encuentran
descritas, por ejemplo, en la solicitud de patente internacional
publicada en el documento WO93/08278 (Affymax Technologies
NV).
Aunque estas bibliotecas in vitro tienen
la ventaja de que el escrutinio se puede realizar in vitro,
debido a que la proteína de fusión codificada no reconoce
únicamente a su propio DNA codificador (sino que reconoce y se
asocia con su sitio de unión sobre el DNA dondequiera que éste
aparece), al menos la traducción se debe realizar in vivo con
sólo un único miembro de la biblioteca por célula hospedadora u
organismo hospedador. Esto restringe seriamente la complejidad que
la biblioteca puede alcanzar. Por eso son aplicables algunas de las
limitaciones de las bibliotecas de expresión in vivo, tales
como la no eficiencia de la transformación. Además, la asociación
entre las proteínas de unión a DNA y sus sitios de unión sobre el
DNA es no covalente, y existe por ello un OFF-TIME
tiempo de poca producción asociado con la interacción que puede ser
del orden de solamente 30 minutos. Por ello el tiempo empleado para
realizar las etapas de escrutinio después de la traducción debe
mantenerse lo más corto posible y las condiciones de escrutinio se
deben seleccionar de manera que el OFF-RATE índice
de poca producción no aumente más. Por lo tanto existen todavía
limitaciones restrictivas con las bibliotecas de expresión de la
técnica anterior.
Se ha descubierto ahora de manera sorprendente
que se puede generar una biblioteca de expresión de péptidos o
proteínas en la que los productos específicos resultantes de la
traducción del material genético en la biblioteca están
directamente unidos y por enlaces covalentes a la secuencia de DNA
que los codifica. Esto obvia por lo tanto el uso de
empaquetamientos genéticos celulares, con sus limitaciones
inherentes, durante la construcción y el escrutinio de la biblioteca
de expresión. Este avance permite un escrutinio rápido de los
péptidos o proteínas deseados con ciclos de selección, de
amplificación del DNA y de expresión. Aunque la amplificación del
DNA puede implicar su autorreplicación, ésta puede realizarse en
lugar de ello de manera conveniente y rápida usando técnicas
estándar de amplificación, por ejemplo, la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) como se describirá con más detalle más
adelante.
Las bibliotecas de expresión de la invención, que
implican uniones covalentes DNA:proteína, se han hecho posibles por
la inclusión de una secuencia dentro del material genético que
codifica una proteína o una de sus porciones que se une
covalentemente a su propio DNA codificador, y que incluye, o se
solapa, o está adyacente a, la secuencia que codifica el péptido o
la proteína que va ser presentado. Cuando ha tenido lugar la
expresión, la proteína de unión al DNA y el péptido o la proteína
de presentación, constituyen un único polipéptido, que se une
covalentemente al DNA codificador. Se advertirá que esta unión será
posible solamente si el material genético y el producto resultante
de su traducción están accesibles el uno al otro. Así pues, el
material genético preferiblemente debe estar desprovisto de
secuencias que codifican de manera efectiva péptidos o proteínas
que interfirieran con la interacción proteína:DNA.
Además, como se advertirá a partir del comentario
que viene más adelante, en determinados casos la proteína de unión
al DNA escindirá el DNA al que se une. En estas circunstancias,
dependiendo de la construcción de las moléculas de DNA de la
biblioteca y de la colocación de las secuencias de la biblioteca
dentro de ellas, la proteína de unión al DNA puede estar unida
covalentemente a un fragmento de DNA que no contiene las secuencias
de la biblioteca debido a la escisión entre el fragmento y el resto
de la molécula de DNA. Sin embargo, dependiendo de las condiciones
de hibridación que se usen, la cadena molde conservará los
fragmentos complementarios de las dos cadenas codificadoras y por
ello la proteína de unión al DNA permanece asociada con el DNA que
la codifica a través del intermediario de un enlace covalente
DNA:proteína. La referencia a una unión "directa", según aquí
se utiliza, tiene la intención de incluir esta posibilidad. Además,
en este caso está claro que la proteína de unión a DNA está unida a
un fragmento del DNA que la codifica. Esta posibilidad queda
abarcada sin embargo por la expresión "específicamente asociadas
con el DNA que las codifica", según aquí se utiliza.
Contemplado de este modo desde uno de los
aspectos, la presente invención proporciona un método para producir
una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas, que presenta
una población diversa de péptidos o proteínas, en la que los
péptidos o proteínas están asociados de manera específica con el DNA
que los codifica a través de uniones covalentes proteína:DNA,
comprendiendo dicho método al menos las siguientes etapas:
1) preparar una biblioteca genética amplificable
de moléculas de DNA que contienen:
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos se une específicamente a la secuencia que la codifica a través de uniones covalentes proteína:DNA (resto de unión), y
- (ii)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que va a ser presentada (resto de presentación), y
2) expresar la biblioteca genética así formada,
en la que dicha molécula de DNA cuando se expresa produce un
producto resultante de la traducción que contiene el resto de
presentación y el resto de unión, y en la que dicha molécula de DNA
contiene al menos un sitio de unión para el resto de unión.
Así, se puede realizar la creación de una
multitud de productos de traducción diferentes que se unen
covalentemente al material genético específico que los codifica.
Este descubrimiento se ha utilizado para la formación de la
biblioteca de expresión de péptidos o proteínas aquí descrita. Esta
biblioteca difiere de bibliotecas previas in vivo que usan
células u organismos unicelulares para expresar los péptidos, ya
que el péptido o la proteína que se va a presentar, se presenta
directamente sobre el material genético que lo codifica y no sobre
la superficie de una membrana o pared celular.
Además, generalmente se puede conseguir una
presentación monovalente o divalente y este método permite la
expresión de diversidades extremadamente elevadas en la biblioteca.
De manera adicional, cuando se ha de realizar una amplificación por
PCR del material genético que codifica un miembro de la biblioteca
que exhibe las propiedades deseadas, esto se puede ejecutar in
situ sobre el DNA de ese miembro de la biblioteca de péptidos,
ya que el DNA se encuentra libremente accesible libremente para
unirse a los cebadores apropiados y no requiere una extracción o
elución previa de los materiales utilizados durante su selección o
de porciones no genéticas del conjugado de la biblioteca de
péptidos o proteínas. Esto simplifica y agiliza el procedimiento de
manera significativa. Además, el tratamiento riguroso, p. ej., un
pH bajo, normalmente requerido para la elución del material genético
de células o de viriones que se unen a una diana, antes de la
amplificación, no es necesario.
De manera adicional, a diferencia de las
bibliotecas de expresión in vitro de la técnica anterior, la
unión covalente entre el DNA y el polipéptido codificado significa
que el péptido o la proteína presentado no se desprenderá del DNA
por acción de las condiciones iónicas y de los disolventes que
romperían los bacteriófagos, las interacciones proteína de unión a
DNA:DNA o los ribosomas. Además, la unión covalente permite que la
selección se lleve a cabo en un intervalo de temperaturas más
amplio y con etapas intermedias de congelación. Por ello de este
modo la selección es mucho más conveniente y potencialmente mucho
menos rigurosa.
Según aquí se utiliza, la expresión "que se une
específicamente a dicha secuencia codificadora" quiere indicar
que la secuencia de aminoácidos, aunque puede no reconocer
exclusivamente al DNA que la codifica si se aísla y se introduce en
una serie de secuencias de DNA diferentes, se unirá a su propia
secuencia codificadora cuando es producida a partir de su DNA
codificador mediante transcripción y traducción. Esta especificidad
se puede conseguir de varios modos según se describe más adelante.
Según aquí se denomina, DNA "codificador" quiere indicar la
molécula de DNA que cuando se expresa produce un producto de la
traducción que contiene la proteína o el péptido de presentación y
el resto de unión a DNA. La región del DNA a la que se une el resto
de unión a DNA no está sin embargo necesariamente dentro de la
región que codifica el resto de presentación o el resto de unión,
sino que está presente simplemente en la misma molécula de DNA.
Las proteínas que interaccionan in vitro
con la secuencia de DNA que las codifica se conocen aquí como
"proteínas que actúan en cis" (también denominadas "proteínas
cis") y establecen un enlace covalente con sus DNA moldes
propios. "Proteínas que actúan en pseudo-cis"
se consideran aquí aquellas proteínas que actúan de la manera en
cis (es decir, que se unen al DNA que las codifica) en condiciones
apropiadas.
Una biblioteca de expresión de péptidos o
proteínas pseudo-cis se puede crear mediante el uso
de un resto de unión a DNA que se une covalentemente al DNA que lo
codifica en condiciones apropiadas. Por ejemplo, esto se puede
conseguir realizando la etapa de la traducción dentro de los
confines de una célula u organismo, en el que cada célula contiene
el DNA que codifica solamente un único miembro de la biblioteca.
En este caso, debido a que el resto de unión al
DNA tendrá solamente un único sitio de reconocimiento y unión
disponible (aunque puede haber más de una copia del DNA), se unirá
a su propio DNA codificador (acción en pseudo-cis).
Esto proporciona así un enlace operacional entre el DNA codificador
y el péptido o la proteína expresado, unido a través de un enlace
covalente. Según aquí se utiliza, el "sitio de unión" incluye
el sitio de reconocimiento con el que el resto de unión al DNA se
asocia antes de la unión covalente, es decir, esta expresión se
refiere a la secuencia de nucleótidos requerida para conseguir la
unión covalente de la proteína de unión al DNA.
De este modo la invención proporciona en un
aspecto preferido, un método para producir una biblioteca de
expresión de péptidos o proteínas según se ha definido en lo que
antecede, en la que la expresión del material genético se realiza
in vivo con un único miembro de la biblioteca, opcionalmente
presente en más de una copia, expresado por célula hospedadora u
organismo hospedador.
Proteínas pseudo-cis apropiadas
son todas las proteínas que reconocen sitios de unión específicos
(sitios de unión) sobre el DNA y que dan lugar a un enlace
covalente DNA:proteína. Como ejemplos se incluyen proteínas
terminales, proteínas que intervienen en la replicación y otras
proteínas que intervienen en el cebado. Además, se pueden usar
fragmentos, variantes o derivados funcionalmente equivalentes de
proteínas conocidas de unión covalente al DNA. Se advertirá que las
proteínas de unión que actúan en cis que se describen más adelante
se pueden también usar en el método anteriormente descrito.
Las proteínas que actúan de verdad en cis ofrecen
ventajas particulares para preparar bibliotecas de expresión in
vitro. Ejemplos de proteínas que actúan en cis incluyen las
proteínas que están implicadas en la iniciación de la replicación.
El tipo de replicación en círculo rodante se usa comúnmente entre
replicones circulares de diferentes orígenes, por ejemplo fagos que
portan DNA monocatenario (ss) (del inglés. " single
stranded") y bicatenario (ds) (del inglés,
" double stranded") (Van Mansfield y col.,
(1984), Adv. Exp. Med. Biol., 179, 221-230;
Baas y Jansz (1988), Cur. Topics Microbiol. Immunol., 136,
31-70), plásmidos que portan ssDNA (Gruss y Ehrlich
(1989); Microbiol. Rev., 53, 231-241; Novick
(1989), Ann. Rev. Microbiol., 43, 537-565),
virus de plantas que portan ssDNA (Stenger y col. (1991), PNAS, 88,
8025-8033); Saunders y col., (1991), Nucl. Acids
Res., 19, 2325-2330), virus animales que portan
ssDNA y dsDNA (Berns (1990), Microbiol. Rev., 54,
316-329; Dasgupta y col., (1992), J. Mol.
Biol., 228, 1-6) y plásmidos bacterianos que
portan dsDNA (Kham, 1997, Microbiol. Molec. Biol. Rev.,
61(4), 445-455). En los sistemas estudiados,
las proteínas que intervienen en la iniciación poseen actividad de
cerrar melladuras y actividad similar a la de las topoisomerasas.
El sistema mejor estudiado es el del fago \phiX174 que porta
ssDNA, en el que la proteína A hace una mella NICKS en el sitio del
ori en la cadena vírica de la forma replicativa y establece
un enlace covalente con el extremo 5' de la cadena cortada. El
extremo 3' se extiende después de esto por acción de la polimerasa
del hospedador, desplazando la cadena vírica 5', y después de una
ronda de replicación la cadena vírica parental se religa y la
proteína A se transfiere a la cadena de la progenie para iniciar un
nueva ronda de replicación (Baas y Jansz, 1988, supra). Se
ha descubierto también que la proteína A de P2 corta el sitio del
ori en la región codificadora del gen A, en un sitio que
está desprovisto de estructura secundaria y se une al extremo 5' de
la cadena cortada (Liu y Hagg\ring{a}rd-Ljungquist
(1994), Nucl. Acids Res., 22,
5204-5210).
Esta acción en cis se ha descrito que actúa in
vivo y por ello la etapa de la traducción se puede realizar
in vivo, pero con más de un único miembro de la biblioteca
expresándose por célula, antes de que la célula se rompa para
producir la biblioteca del sistema de presentación. El
procedimiento que permite a la proteína cis exhibir una acción en
cis a pesar de la presencia de otros sitios de unión apropiados
sobre otras moléculas de DNA también contenidas en la célula o el
organismo no es conocido, aunque se ha sugerido que durante la
traducción se produce una compartimentalización o que las proteínas
cis no difunden con facilidad en la célula.
Así, en un aspecto más preferido, la presente
invención proporciona un método para producir una biblioteca de
expresión de péptidos o proteínas según se ha definido en lo que
antecede, en la que dicha secuencia de aminoácidos que se une de
manera específica a dicha secuencia codificadora, deriva de una
proteína que actúa en cis o de uno de sus fragmentos, derivados o
variantes funcionalmente equivalente, y la expresión del material
genético se realiza in vivo con al menos un miembro de la
biblioteca, opcionalmente presente en más de una copia, expresado
por célula hospedadora u organismo hospedador.
Proteínas que actúan en cis apropiadas y que
siguen actuando en cis in vitro incluyen la familia de
proteínas que intervienen en la replicación que incluye P2A, que
están relacionadas por su secuencia (preferiblemente que exhiben una
identidad de las secuencias del 60%, más preferiblemente del 70%,
80% o 90%), por su organización y por su modo de replicación; tales
como las proteínas equivalentes procedentes del fago 186
(Sivaprasad y col., 1990., J. Mol. Biol., 213,
449-463), HP1 (Esposito y col., 1996, Nucl.
Acids Res., 24, 2360-2368) y PSP3 (Bullas y
col., 1991, Virology, 185, 918-921) y sus
fragmentos, derivados y variantes funcionalmente equivalentes. Las
proteínas que actúan en cis y que actúan en cis in vivo
exhiben propiedades de replicación en círculo rodante y una
organización similares a las de P2A. Estas proteínas incluyen por
ejemplo la proteína A de \phiX174 según se ha mencionado
anteriormente. Las proteínas pseudo-cis apropiadas
están relacionadas con P2A, tal como proteínas terminales, por
ejemplo, procedentes de diferentes organismos.
El uso de las bibliotecas anteriormente
mencionadas permite un aumento en la diversidad de la biblioteca y
una reducción en la relación señal-ruido debida al
bajo número de células hospedadoras u organismos hospedadores
requerido en comparación con las bibliotecas de expresión in
vivo conocidas.
Siempre se ha supuesto que las proteínas que
actúan en cis actúan solamente in vivo, y una acción
correspondiente in vitro no ha sido ni sugerida ni
observada. De manera sorprendente, se ha encontrado sin embargo que
la acción en cis está conservada incluso cuando la traducción se
realiza in vitro.
Como se advertirá, numerosas ventajas dimanan de
este descubrimiento. En primer lugar, la formación de un enlace
covalente tiene varias ventajas según se ha mencionado previamente.
Además, debido a que las proteínas codificadas son capaces de
encontrar el DNA que las codifica a pesar de la presencia de cadenas
de DNA próximas que exhiben un sitio de unión apropiado, la
preparación completa de la biblioteca y su escrutinio se pueden
realizar in vitro. Esto reduce radicalmente el tiempo y el
esfuerzo invertidos en los procedimientos de generación y
escrutinio, y se evitan muchas de las limitaciones de las
bibliotecas in vivo. Por ejemplo, se pueden ahorrar al menos
12 horas por ronda de expresión, escrutinio y amplificación. Ya que
se puede prescindir por completo de células hospedadoras u
organismos hospedadores, la biblioteca puede tener hasta 10^{12}
miembros diferentes.
La traducción in vitro permite la
incorporación de muchas modificaciones
co-traduccionales y
post-traduccionales (que se pueden hacer por métodos
químicos o enzimáticos, durante o después de la etapa de
traducción), algunas de las cuales no eran posibles con
anterioridad cuando la traducción se realizaba in vivo. Por
ejemplo, se pueden realizar fosforilación o sulfatación, formación
de enlaces disulfuro, glicosilación o isomerización. (Estas etapas
también se podrían realizar en miembros de la biblioteca una vez
expresados in vivo y luego soltados). Estas reacciones se
pueden llevar a cabo in vitro complementando el extracto con
la enzima responsable de la modificación. También se pueden
introducir aminoácidos no naturales, por ejemplo, cargando
químicamente un t-RNA o modificando el aminoácido
que está sobre un t-RNA cargado.
De este modo en un aspecto especialmente
preferido, la presente invención proporciona un método para producir
una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas según se ha
definido en lo que antecede, en el que dicha secuencia de
aminoácidos que se une de manera específica a dicha secuencia
codificadora, deriva de una proteína que actúa en cis o de uno de
sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalente, y
la expresión del material genético se realiza in vitro.
Según aquí se utiliza, fragmentos, derivados y
variantes "funcionalmente equivalentes" definen a péptidos o
proteínas relacionadas con, o que derivan de, una proteína natural
según aquí se ha definido (p. ej., una proteína que actúa en cis),
en los que la secuencia de aminoácidos ha sido modificada con una o
múltiples sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos,
que pueden de manera alternativa o de manera adicional incluir
aminoácidos que han sido modificados químicamente, p. ej., mediante
desglicosilación o glicosilación, pero que no obstante conservan la
funcionalidad deseada, p. ej., exhiben propiedades cis o
pseudo-cis de unión a DNA. De manera conveniente,
esos derivados o variantes pueden tener una identidad de la
secuencia del 80% o 90% con respecto a la proteína natural de la que
derivan. Variantes funcionalmente equivalentes incluyen variaciones
biológicas naturales (p. ej., variantes alélicas o variaciones
geográficas dentro de una especie) y derivados preparados usando
técnicas conocidas. Por ejemplo, se pueden preparar péptidos o
proteínas funcionalmente equivalentes o por síntesis química o en
forma recombinante usando las técnicas conocidas de mutagénesis
dirigida a un sitio específico, mutagénesis aleatoria, o escisión
enzimática y/o ligamiento de ácidos nucleicos.
Se advertirá que las proteínas que actúan en cis
o sus fragmentos, variantes o derivados, se pueden utilizar para
generar bibliotecas de la invención conforme a los métodos
descritos para las proteínas que actúan en
pseudo-cis, que se describirán con más detalle más
adelante.
Convenientemente, las proteínas cis, de uso en
los métodos de la invención, derivan del sistema de iniciación de la
replicación del DNA del fago P2. La proteína A de P2 reconoce una
secuencia del iniciador definida, localizada dentro del gen A de P2
sobre la mismísima molécula de DNA que la codifica (acción en cis) y
hace una mella específicamente en una de las cadenas mientras forma
un enlace covalente con una de las bases del extremo libre en el
sitio de la mella (Liu y
Hagg\ring{a}rd-Ljungquist, 1994, supra).
Ese complejo proteína-DNA constituye un conjugado
genético que se puede usar para los fines de la presentación de
péptidos. La secuencia del gen A de P2 ha sido publicada (Liu y
col. (1993). J. Mol. Biol., 231,
361-374).
Se sabe que la proteína A de P2 es capaz de
tolerar alteraciones de aminoácidos (véase por ejemplo Liu y col.,
1993, supra) y por ello péptidos o proteínas de la
presentación se pueden introducir en ella sin pérdida de función. La
propiedad de acción en cis de A permite construcciones in
vitro de bibliotecas de péptidos o proteínas, sometiendo a una
biblioteca de DNA moldes (con secuencias que codifican diferentes
péptidos A o proteínas A híbridos que van a ser presentados, un
promotor apropiado para transcribir el gen A y el sitio al que P2A
se une) a una etapa de transcripción/traducción acopladas en un
extracto libre de células. Esto da como resultado péptidos A o
proteínas A híbridos que se unen covalentemente a sus propios DNA
moldes.
Los conjugados híbridos A:DNA constituyen una
biblioteca in vitro de péptidos o proteínas que presenta los
diferentes péptidos A o proteínas A híbridos que pueden ser
sometidos a una técnica de revestimiento de una superficie (del
inglés, "panning") frente a una diana o que pueden ser
analizados con respecto a una actividad deseada. Los conjugados
híbridos específicos A:DNA que se unen a la diana o que exhiben una
propiedad deseada, se pueden recuperar, en caso necesario, y el
material genético se puede luego amplificar, por ejemplo mediante
PCR, y someter a una etapa de transcripción/traducción acopladas en
un extracto libre de células. Este ciclo se puede luego repetir a
conveniencia para obtener un clon híbrido individual A:DNA. El
seguimiento de este procedimiento se puede realizar mediante
secuenciación del DNA hasta que se obtienen un número apropiado de
secuencias de DNA. Técnicas de escrutinio apropiadas se describen
con más detalle más adelante.
Según aquí se utiliza con referencia a la
biblioteca de expresión de péptidos o proteínas que presenta una
población diversa de péptidos o proteínas, la expresión "péptido
o proteína" quiere abarcar una secuencia de aminoácidos que
contiene al menos una secuencia de presentación (el resto de
presentación) (que puede estar contenida dentro de, solapada con, o
ser distinta de, la secuencia que se une al DNA que la codifica),
que varía en los diferentes miembros de la biblioteca y que puede
ser seleccionada a través de procedimientos de selección apropiados.
Cada uno de los miembros de la biblioteca de expresión contiene
también como parte del polipéptido expresado, una secuencia
invariable (que puede ser una parte o la totalidad de la secuencia)
que es responsable de la unión del péptido o de la proteína
resultante de la expresión al DNA codificador (el resto de unión).
Necesariamente, tanto el resto de unión como el resto de
presentación son expresados en un solo péptido o proteína.
Cuando el resto de presentación es más grande que
un péptido (y aquí se denomina proteína de presentación), es
probable que diferentes aminoácidos de la proteína sean invariables,
tal como cuando una proteína se usa como andamiaje, y que los
miembros de la biblioteca difieran sólo en algunas regiones de la
proteína de presentación.
Las secuencias de DNA que codifican los péptidos
o proteínas para su expresión en las bibliotecas de la invención,
que contienen secuencias que codifican el resto de presentación y
los restos de unión, y al menos uno de los sitios de unión para el
resto de unión, en las que las moléculas de ácido nucleico incluyen
moléculas con secuencias degeneradas y/o funcionalmente
equivalentes, constituyen un aspecto más de la invención. Las
moléculas de ácido nucleico funcionalmente equivalentes incluyen
fragmentos, derivados y variantes, por ejemplo secuencias
sustancialmente homólogas y que hibridan, que codifican péptidos o
proteínas como los que aquí se han definido, que presentan la
funcionalidad requerida, p. ej., la acción de unión en cis.
Por "sustancialmente homólogas" se indican
secuencias que presentan una homología de la secuencia de al menos
el 60%, preferiblemente de al menos el 70% o el 80%. Las secuencias
que hibridan incluidas dentro del alcance de la invención son
aquellas secuencias que se unen en condiciones no rigurosas (SSC
6X/formamida al 50% a temperatura ambiente) y lavado en condiciones
de baja rigurosidad (SSC 2X, temperatura ambiente, más
preferiblemente SSC 2X, 42ºC, o en condiciones de mayor rigurosidad
p. ej. SSC 2X, 65ºC (en donde SSC = NaCl 0,15 M, citrato sódico
0,015 M, pH 7,2), así como las secuencias que se hibridarían en las
condiciones anteriormente mencionadas, sino fuera por la
degeneración del código.
Se advertirá que mediante la producción de una
biblioteca de secuencias de DNA (que llevan asociadas las proteínas
o péptidos que codifican), la presente invención también
proporciona una biblioteca de presentación de DNA. Esta biblioteca
bifuncional está preparada para poder realizar la selección de sus
miembros sobre la base de los restos de presentación de
péptidos/proteínas o de DNA.
La invención se lleva a cabo convenientemente
usando como el resto de unión la proteína A de P2 o uno de sus
fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes. La
secuencia de nucleótidos relevante para la unión al resto de unión
a DNA debe también proporcionarse en un sitio adecuado, aunque este
sitio puede encontrarse desplazado de la posición en la que se
encuentra presente en la naturaleza. En el caso de P2A por ejemplo,
al menos la secuencia TCGGA, que aparece por ejemplo en la
secuencia GCGCCTCGGAGTCCTGTCAA, debe estar incluida en el DNA que
codifica los péptidos o las proteínas de la biblioteca de expresión,
o uno de sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente
equivalentes, secuencia que es reconocida por el resto de unión al
DNA y forma un enlace covalente con el DNA. Convenientemente la
secuencia que codifica el resto de presentación está insertada en,
solapada con, o adyacente a, la secuencia que codifica el extremo N-
terminal de la proteína A de P2.
Las moléculas de DNA usadas para generar la
biblioteca pueden estar provistas de medios tanto para la
amplificación como para la transcripción. Las moléculas de DNA
adecuadas con medios para la amplificación incluyen DNA bicatenario
con un origen de replicación, por ejemplo plásmidos autorreplicantes
que pueden por ello replicarse in vitro en, por ejemplo,
extractos libres de células, o in vivo si están presentes
células hospedadoras. Cuando el DNA no es capaz de autorreplicarse,
esto puede solucionarse en casos apropiados mediante la inclusión de
un origen de replicación. Por ejemplo, determinadas proteínas aquí
descritas, tales como P2A, se unen a sus propios orígenes de
replicación. Si la proteína no se suelta del origen (tal como
sucede cuando se utilizan los mutantes aquí descritos), la
replicación de la molécula de DNA que contiene el gen del resto de
unión al DNA se inhibe. En estos casos puede incluirse un segundo
origen de replicación. Según convenga, las moléculas de ácido
nucleico encargadas de generar la biblioteca, están en forma de
vectores, de plásmidos o de DNA lineal.
Como alternativa, el DNA se puede amplificar
mediante una intervención técnica, por ejemplo, proveyendo al DNA de
sitios apropiados para que se unan los cebadores en una reacción de
amplificación, por ejemplo PCR, que permite realizar una
amplificación in vitro. Evidentemente esos sitios estarían
presentes en la mayoría de los casos de manera inherente en todas
las moléculas de DNA, de manera que la elección apropiada de los
cebadores facilitaría la amplificación.
Los medios para la transcripción incluyen la
provisión de la secuencia de un promotor. Si se usa un gen de tipo
salvaje, o una de sus secuencias degeneradas, o uno de sus
fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes, el
promotor puede estar presente de manera constitutiva. Si no es el
caso, se puede incluir un promotor inducible o no inducible. En los
casos en los que el producto de la traducción inhibiera la
transcripción (como cuando se usa una P2A mutante según aquí se
describe) es aconsejable usar un promotor inducible, que puede estar
activado solamente durante la etapa de la transcripción/traducción.
Como alternativa en esta caso, se puede usar un promotor no
inducible si éste actúa con efectividad de modo inducible, p. ej.,
con un nivel de transcripción muy bajo en las condiciones apropiadas
(p. ej., un promotor de T7 en hospedadores bacterianos que
contienen un gen regulado de la polimerasa de T7 o mediante el
suministro de un promotor en un momento apropiado, p. ej., mediante
una infección vírica). Si de todas maneras se usa un promotor no
inducible, y si durante el transcurso del escrutinio de la
biblioteca se ha de realizar la traducción en un hospedador
bacteriano, un gen inducible de polimerasa debe estar presente en la
bacteria o se debe introducir mediante infección.
Los ejemplos de promotores inducibles apropiados
incluyen AraB, el promotor lambda (en células que expresan un
represor sensible a la temperatura, tal como
N4830-1), o un promotor de TAC o LAC combinado con
una secuencia eficiente del LAC O. Los promotores no inducibles
adecuados incluyen el promotor de T7 o los promotores de SP6 o de
dT3. El promotor debe estar situado aguas arriba del polipéptido que
ha de ser expresado, pero esto se puede conseguir cuando el
promotor está situado aguas abajo mediante circularización del DNA
lineal.
Las moléculas de DNA de uso en la preparación de
la biblioteca deben también contener necesariamente diversas
secuencias codificadoras de los péptidos o proteínas de la
presentación para obtener una biblioteca de los diferentes péptidos
o proteínas que van a ser presentados. Esas secuencias diferentes se
pueden introducir, por ejemplo, mediante aleatorización como se
describe en la literatura usando secuencias de cebadores
aleatorizados en PCR (Schmidt y Skerra (1993), Protein
Engineering, 6, 109-122) según se describe con
más detalle más adelante. Las secuencias de cebadores aleatorizados
se pueden producir usando una síntesis química estándar con
sintetizadores de DNA comerciales, o se pueden adquirir
comercialmente. Como alternativa, especialmente cuando la variación
se ha de hacer en aminoácidos no contiguos, se pueden producir
megacebadores y modificarse por mutagénesis.
Las moléculas de DNA con las características
necesarias para la generación de una biblioteca constituyen un
aspecto más de la invención.
La expresión del material genético de la
biblioteca se puede realizar según se describe con más detalle más
adelan-
te.
te.
Contemplada desde un nuevo aspecto, la invención
proporciona una biblioteca de expresión in vitro de péptidos
o proteínas que presenta una población diversa de péptidos o
proteínas, en la que los péptidos o proteínas están asociados de
manera específica con el DNA que los codifica a través de uniones
covalentes proteína:DNA, y en la que dicha secuencia codificadora la
porta una molécula de DNA que contiene una secuencia que codifica
una secuencia de aminoácidos que se une específicamente a dicha
secuencia codificadora (resto de unión), una secuencia que codifica
una secuencia de aminoácidos que va a ser presentada (resto de
presentación), y al menos un sitio de unión para el sitio de
unión.
Como resultará evidente a partir de lo
anteriormente expuesto, la invención proporciona muchos tipos
diferentes de bibliotecas y métodos para generarlas. Aunque los
métodos para la preparación de estas bibliotecas estarían dentro
del alcance del destinatario experto, lo que se expone a
continuación se aporta para ilustrar algunos tipos de bibliotecas y
cómo éstas se podrían crear, haciendo referencia particular al uso
del gen que codifica P2A como ejemplo de proteína que actúa en
cis.
Se puede crear una biblioteca en la que los
péptidos o proteínas que van a ser presentados exhiben una variación
aleatoria, pseudo-aleatoria, parcialmente aleatoria
o una variación dispersa y la totalidad o una parte del material
genético que codifica los miembros de la biblioteca, se puede
sintetizar por métodos químicos o pueden derivar de secuencias
genómicas/codificadoras procedentes de diferentes organismos. Las
regiones modificadas pueden estar contiguas o no contiguas.
Bibliotecas combinatorias (en las que las regiones modificadas
están contiguas) generalmente consisten en menos de 20 aminoácidos
debido al número posible de permutaciones. Es por lo tanto apropiado
usar regiones no contiguas de variación para extensiones de
aminoácidos más largas. Así por ejemplo, en un péptido de
presentación de 40 residuos, se podrían generar permutaciones de
solamente 13 de estos aminoácidos. Esto tiene la ventaja de
disminuir el número total de permutaciones (de miembros de la
biblioteca) con respecto a una biblioteca en la que todas las
posiciones se habían modificado. El uso de secuencias en las que
determinados residuos son invariables proporciona una estructura
(invariable) de andamiaje en la que se han modificado algunas
regiones contenidas dentro del andamiaje o sostenidas por el
andamiaje.
Estas estructuras de andamiaje pueden existir de
manera inherente en las proteínas en las que las bibliotecas se
podrían usar para aislar variantes de las proteínas que exhibieran
propiedades deseadas, sobre la base de la variación de residuos
seleccionados. Así por ejemplo, la especificidad o la estabilidad
térmica de una enzima se podría variar si la enzima original se
usara como andamiaje. Como alternativa, las secuencias de andamiaje
se pueden introducir adyacentes al sitio de unión al DNA, o dentro
de él, para la presentación de un péptido o proteína de presentación
discontinuo. Las secuencias de andamiaje pueden estar localizadas
en uno o en más sitios en cualquier parte dentro de la secuencia del
péptido o de la proteína que se une al DNA que lo codifica, con la
condición de que la secuencia(s) de andamiaje no interfiera
con la unión covalente del péptido o proteína codificado a su
DNA.
Como se ha mencionado previamente, el material
genético que codifica los diferentes miembros de la biblioteca se
puede generar mediante el uso de cebadores en los que una porción
del cebador se ha modificado (para generar un conjunto de cebadores)
para producir las permutaciones anteriormente descritas. De esta
manera se pueden crear hasta 10^{12}-10^{14}
miembros de la biblioteca. En el caso de los productos codificados
(tal como P2A y sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente
equivalentes) que se unen al DNA que los codifica a través de la
cadena codificadora, para permitir la transcripción de la cadena
molde y la unión de P2A a la cadena codificadora, es necesario en el
caso de los productos finales resultantes de la generación y
amplificación (si esta última se realiza) ser al mismo tiempo
cadenas molde y cadenas codificadoras. Esto se puede conseguir
mediante el uso, por ejemplo, de cebadores de la cadena molde que
contienen secuencias de la biblioteca (es decir, un conjunto
reunido de cebadores modificados), que adicionalmente contienen un
sitio de unión para el cebador de la cadena molde, para permitir una
posterior amplificación si ésta se requiere. Este sitio se puede
usar además como identificador único para la selección (y
amplificación) post-escrutinio. Una vez se ha
generado un grupo de cadenas molde que incluyen las secuencias de
la biblioteca, un cebador adecuado que se une a la cadena molde se
puede usar para producir cadenas codificadoras que contienen las
secuencias de la biblioteca.
La generación de las moléculas de ácido nucleico
para la preparación de la biblioteca y/o para la amplificación de
las mismas se puede realizar fácilmente usando una mezcla de estos
cebadores de manera simultánea o consecutiva. Si la amplificación se
va a realizar al mismo tiempo que la generación de la biblioteca,
se puede usar un cebador único para realizar una serie a
amplificaciones lineales, seguido del uso del segundo cebador, o
ambas reacciones se pueden realizar a la vez. Los cebadores pueden
estar compuestos por bases nucleotídicas que pueden estar en forma
de derivados (p. ej., con un resto para la inmovilización), o por
constituyentes alternativos apropiados, tales como constituyentes
derivados de PNA, o por sus combinaciones.
Las moléculas de ácido nucleico que codifican los
diferentes miembros de la biblioteca o sus partes variables, se
pueden generar como alternativa por mutación o clonación,
opcionalmente en combinación con técnicas de amplificación. Así por
ejemplo, se puede crear una biblioteca inicial por clonación y se
puede usar como molde inicial que se puede después modificar usando
un conjunto de cebadores con secuencias de la biblioteca y/o por
mutagénesis aleatoria.
De primordial importancia en las moléculas de
ácido nucleico utilizadas para preparar las bibliotecas de expresión
de la invención es la región que codifica el resto de unión al DNA.
Según se ha mencionado previamente, esta región incluye cualquier
proteína de unión a DNA o sus fragmentos, derivados o variantes
funcionalmente equivalentes, que forma un enlace covalente con el
material genético que la codifica, para formar un enlace operativo.
Dependiendo de si la etapa de la traducción se va a tener lugar
in vitro o in vivo, con un miembro único o con
múltiples miembros de la biblioteca por célula hospedadora u
organismo hospedador, el resto de unión al DNA puede actuar de la
manera en cis o de la manera en pseudo-cis. Un
ejemplo de un resto de unión a DNA que actúa en cis, que es
apropiado para usar en la invención, es la proteína P2A o sus
fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes.
Un fragmento apropiado que comprende al menos la
región de la proteína de unión al DNA que es necesaria para
conseguir una unión covalente con el DNA, debe estar presente en
las moléculas de ácido nucleico usadas para constituir la
biblioteca. Por ejemplo, en el caso de P2A, debe estar presente el
gen que codifica la proteína o una de sus secuencias degeneradas o
uno de sus fragmentos, variantes o derivados funcionalmente
equivalentes, que tiene propiedades apropiadas de unión a DNA. Este
gen se puede modificar mediante la adición o deleción de secciones
del gen si el péptido expresado o la proteína expresada resultante
conserva su actividad funcional, es decir, sigue produciendo un
enlace covalente con el DNA. Por ejemplo, el sitio de unión del
péptido/proteína sobre el DNA (sitio de unión) puede ser desplazado
o se puede introducir un sitio de unión adicional (por ejemplo, si
el sitio de unión de tipo salvaje es afuncional debido a la
variación p. ej. mediante mutación). Esto es particularmente
importante para asegurar que el péptido o la proteína de
presentación queda unido al DNA que lo codifica cuando el resto de
unión al DNA que se usa produce adicionalmente la melladura del
DNA.
Además, la región que codifica el péptido o la
proteína de presentación (resto de presentación) puede estar
insertada dentro de, estar situada adyacente a, o estar fuera de,
la región que codifica el resto de unión al DNA, con la condición de
que el resto de presentación una vez expresado se una
covalentemente al resto de unión al DNA, es decir, sea parte del
mismo péptido o proteína expresado. Esto puede requerir mover el
codón de terminación en dirección aguas abajo de la región que
codifica el resto de presentación. Al igual que sucedía con la
ubicación sobre el DNA del sitio de unión a la proteína, se debe
garantizar mediante la ubicación apropiada de la región que
codifica el resto de presentación, que el resto de presentación
queda unido al DNA que lo codifica, especialmente cuando la
melladura de la cadena codificadora de DNA está implicada. Esto se
puede conseguir de varias maneras diferentes.
La melladura tiene lugar en la cadena
codificadora y el péptido o la proteína de unión al DNA (unido al
péptido o a la proteína de presentación) está unido covalentemente
al extremo 5' creado durante el procedimiento de melladura. De este
modo se debe garantizar que el material genético que codifica el
resto de presentación lo porta la parte de la cadena codificadora
que está unida covalentemente al péptido expresado o a la proteína
expresada, o que queda asociada con ella. Si el DNA sigue estando
en forma bicatenaria después de la traducción y durante la
selección, la cadena molde garantizará que ambas cadenas
codificadoras estén asociadas con el resto de unión al DNA.
Como alternativa, para la traducción se puede
usar un DNA circular que dará como resultado, después de la
melladura (en condiciones de no hibridación), una cadena
codificadora lineal que comprende la cadena codificadora completa
delante de la melladura. Si como alternativa no se usa ni DNA
circular ni condiciones que favorecen la hibridación, el sitio de
unión de la proteína y el sitio de las secuencias de la biblioteca
se elegirán de manera que el resto de unión al DNA se una
covalentemente a la parte de la cadena codificadora que codifica el
resto de presentación. Esto se puede conseguir mediante la
inserción de la región que codifica el resto de presentación en el
lado terminal que codifica el extremo carboxilo del sitio de unión
(en cuyo caso éste último puede también estar desplazado de su
posición natural). Esto se consigue de la manera más sencilla
haciendo la inserción en dirección aguas abajo del sitio de unión
presente en la naturaleza, es decir, en el extremo que codifica el
extremo carboxilo. Sin embargo, la región que codifica el resto de
presentación se puede introducir en el extremo amino si el sitio de
unión está también desplazado aguas arriba.
En caso necesario, el sitio de unión se puede
desplazar para que preceda a la región codificadora completa. Cuando
la región que codifica el resto de presentación se ha de insertar
en el extremo amino, para garantizar la transcripción, si las
secuencias de la biblioteca son introducidas por cebadores, se deben
utilizar megacebadores que comprenden de manera adicional al menos
un promotor apropiado y un codón de iniciación que preceden a las
secuencias de la biblioteca.
Las secuencias de la biblioteca se pueden
insertar dentro de la región codificadora, en lugar de en el extremo
amino o en el extremo carboxilo, mediante por ejemplo amplificación
de un DNA circularizado usando cebadores que se hibridan a la
secuencia codificadora pero que adicionalmente comprenden secuencias
de la biblioteca en una porción que no se hibrida. Después de una
extensión usando uno de estos cebadores, se puede seleccionar un
cebador apropiado para producir una cadena hibridadora en la que las
cadenas terminales del producto bicatenario resultante de la
extensión (después de la hibridación) son romas o después de una
digestión con una endonucleasa de restricción apropiada exhiben
extremos protuberantes de manera que se puede realizar una ligación
para producir moléculas de DNA con secuencias de la biblioteca
insertadas internamente.
Si las proteínas han de ser presentadas, p. ej.,
en forma de andamiaje, se advertirá que la proteína de presentación
se debe de insertar en la secuencia codificadora u en el sitio
relevante, y posteriormente se debe modificar en residuos
específicos o en regiones específicas para producir la
biblioteca.
De manera adicional, la ubicación de la región
que codifica el resto de presentación se debe determinar por la
tolerancia del péptido o proteína codificado, en particular la del
resto de unión al DNA, a las inserciones o sustituciones en ese
sitio.
Las moléculas de ácido nucleico de la invención
pueden comprender adicionalmente otras características tales como
marcadores de resistencia a antibióticos. Por ejemplo, el gen de la
\beta-lactamasa se puede incluir cuando las etapas
de amplificación y/o traducción/transcripción y/o escrutinio y/o
aislamiento, pudieran implicar una transformación, para permitir la
identificación y la selección (por medio de su resistencia a los
antibióticos) de los transformantes apropiados.
Las moléculas pueden contener marcadores
alternativos o moléculas de reporte (por ejemplo nucleótidos
marcados radiactivamente o uno de los miembros de una pareja de
unión tal como estreptavidina:biotina) de manera que se pueda
determinar la presencia o identidad de dichas moléculas de ácido
nucleico. También se pueden usar marcadores o moléculas de reporte
como herramienta para la inmovilización y/o purificación de las
moléculas de ácido nucleico, por ejemplo en el caso de usar un
marcador biotina, se pueda usar una columna que lleva estreptavidina
para recoger las moléculas. De manera adicional, las moléculas de
ácido nucleico que codifican la biblioteca pueden incluir
nucleótidos no naturales o bases metiladas, especialmente en las
secuencias flanqueantes, para estabilizar el DNA de los lisados
celulares y/o durante la selección.
Por motivos de conveniencia, cualquiera de los
cebadores utilizado en los métodos anteriormente descritos puede
también llevar unido un resto encargado de la inmovilización, tal
como biotina, que permite que los productos resultantes de la
extensión de esos cebadores (el material genético que codifica la
biblioteca) sean aislados con facilidad en etapas posteriores.
Además, cuando así convenga, los cebadores pueden ir provistos de
características que han de ser incorporadas en las moléculas de
ácido nucleico resultantes, p. ej., secuencias de promotores,
secuencias de terminación, genes requeridos para conferir
resistencia a antibióticos.
Una vez que se han creado las moléculas de ácido
nucleico que codifican la biblioteca, la biblioteca se puede generar
mediante las etapas de (i) amplificación del material genético,
(ii) transcripción y (iii) traducción, en las que las dos últimas
etapas normalmente irán acopladas. Dependiendo de si se utiliza una
función cis o pseudo-cis de la proteína de unión al
DNA, estas etapas se pueden realizar in vitro o in
vivo. Cuando se usan proteínas de unión que actúan en cis, cada
una de las etapas se puede realizar in vitro o in
vivo. Cuando se usan proteínas de unión que actúan en
pseudo-cis, la amplificación se puede realizar in
vitro o in vivo, pero la transcripción y la traducción
se deben realizar in vivo.
La amplificación se puede realizar in
vitro durante la generación del material genético de la
biblioteca si, por ejemplo, se usan cebadores y PCR para generar
las moléculas. Como alternativa, o de manera adicional, las
moléculas de ácido nucleico se pueden amplificar mediante métodos
convencionales de amplificación in vitro tales como PCR,
NASBA (también conocida como 3SR) (véase Malek y col. (1994),
Methods. Mol. Biol., 28, 253-260; Gebinoga y
Oehlenschlager (1996), Eur. J. Biochem. 235,
256-261; y Ehritch y col. (1997), Eur. J.
Biochem., 243, 358-364) o mediante una
amplificación lineal. Como alternativa la replicación se puede
realizar in vitro usando extractos libres de células (véase
por ejemplo Kool, 1996, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct.
USA, 25, 1-28) o in vivo después de la
inserción de las moléculas de ácido nucleico en células
hospedadoras o en organismos hospedadores, por ejemplo, mediante
transfección.
Si la replicación se realiza in vitro, el
extracto libre de células se debe elegir adecuadamente, por ejemplo,
debe contener los dNTP. La circularización se debe realizar antes
de la transfección o de la replicación cuando sea necesario.
Además, según se menciona más adelante, para evitar que el
desprendimiento de la proteína de unión al DNA tenga lugar durante
la replicación, se puede requerir un mutante que no se desprenda.
Las moléculas de ácido nucleico pueden ya existir en las células
hospedadoras o en los organismos hospedadores si su generación se
hizo por mutación.
La generación de la biblioteca que expresa el
péptido de presentación se puede realizar in vivo cultivando
células transformadas u organismos transformados. Los organismos
apropiados para este fin incluyen bacterias (tales como E.
coli), virus, bacteriófagos y células tales como levaduras, o
células procariotas, células eucariotas o arquebacterias. Para
liberar la biblioteca de expresión, las células u organismos se
deben entonces lisar para liberar las unidades de expresión formadas
por proteína/péptido:DNA y/o el material genético que codifica la
biblioteca, y se deben de purificar (p. ej., plásmido o
minicromosoma) antes de la transcripción/traducción. Sin embargo
según aquí se utiliza, el término "biblioteca" quiere abarcar
una colección de miembros de la biblioteca aún contenidos dentro de
sus células hospedadoras u organismos hospedadores cuando se crea
in vivo, así como los miembros de la biblioteca después de
liberados, si se produce in vivo, o si se crea in
vitro.
In vitro, la transcripción/traducción
acopladas se pueden realizar en extractos libres de células. Se
puede realizar convenientemente en extractos libres de células
procedentes de procariotas o de eucariotas, por ejemplo, de E.
coli (Nevin y Pratt (1991), FEBS, 291,
259-263). Extractos libres de células procedentes de
procariotas (p. ej., de E. coli, S-30 o
S-135) y procedentes de eucariotas (p. ej., de
germen de trigo o de reticulocitos) se encuentran comercialmente
disponibles (Amersham/Promega). Dependiendo de la construcción de
las moléculas de DNA y de si una proteína que interviene en la
melladura es codificada, puede ser necesario circularizar el DNA
antes de la traducción para garantizar que el resto de presentación
queda asociado con el DNA que lo codifica.
Ya se lleve a cabo in vivo o in
vitro, cuando se ha usado un promotor inducible, el
procedimiento de la transcripción debe ser inducido.
Se ha encontrado que la unión de determinadas
proteínas de unión a DNA (p. ej., P2A se puede mejorar in
vitro, por ejemplo, alterando las propiedades del sitio de
unión. Como alternativa, se pueden requerir cofactores específicos
(p. ej. proteínas específicas del hospedador) para aumentar la
unión y la actividad de las proteínas de unión al DNA.
Preferiblemente, el sitio de unión debe ser monocatenario. Esto se
puede conseguir de varias maneras diferentes, por ejemplo, cuando se
usa un DNA bicatenario, se puede introducir un bucle o abertura en
el sitio de unión. Un oligonucleótido con desapareamientos se puede
incluir durante la reacción de traducción, el cual se hibrida con la
cadena codificadora en ambos de los lados adyacentes al sitio de la
unión. En la región que contiene el sitio de unión en la cadena
codificadora, la porción correspondiente del oligonucleótido con
desapareamientos no es capaz de hibridarse haciendo de este modo que
la cadena codificadora sea efectivamente monocatenaria a lo largo de
esta región. El uso de un cebador con desapareamientos constituye un
aspecto preferido de la invención.
Esta región de desapareamiento se puede extender
por la longitud de la región de unión o se puede extender más allá
de esta región, por ejemplo puede presentar desapareamientos a lo
largo de una región de 10 nucleótidos. Por ejemplo, en el caso del
sitio de unión de P2A (TCGGA, presente en la secuencia
5'-AGCGGCATCGCCGCGCCTCGGAGTCCTGTC-3')
se puede usar un oligonucleótido con desapareamientos que contiene
una secuencia tal como
3'-TCGCCGTAGCGGCGTAAGATTCTAGGACAG-5'
en la que la región de desapareamiento está subrayada.
Como alternativa, se pueden usar cebadores
apropiados para generar el material de ácido nucleico que codifica
la biblioteca y/o su amplificación para introducir una región
monocatenaria en el sitio de unión. Esto se puede realizar, por
ejemplo, usando un cebador que lleva una región de desapareamiento
en el sitio de la unión. Si el sitio de unión está dentro de la
región codificadora del resto de unión a DNA, en ese caso la
secuencia del desapareamiento se debe seleccionar de manera que no
se afecte la secuencia de aminoácidos codificada por el DNA y debe
por lo tanto ser una variación silente, es decir, una variación del
codón en la tercera posición, pero que codifica el mismo
aminoácido. Los autores de la presente invención han encontrado que
se observaba una unión mejorada cuando un desapareamiento estaba
presente en la cadena molde correspondiente al sitio de unión sobre
la cadena codificadora.
Si como alternativa el sitio de unión está
situado en el extremo de la región codificadora y se usa un cebador
con desapareamientos, después de la etapa de escrutinio se pueden
seleccionar cebadores apropiados de manera que durante la
amplificación el sitio de unión se restablece.
Como alternativa, si el sitio de unión se forma
en el extremo del DNA, el DNA bicatenario de esta región puede
hacerse monocatenario mediante digestión con una endonucleasa de
restricción que deja una extensión 5' que contiene la totalidad o
parte del sitio de unión. Por ejemplo, la enzima HgaI deja una
protuberancia de 5 bases en 5', a 5 nucleótidos desde el sitio de
reconocimiento de HgaI. Si esta región es demasiado pequeña, en ese
caso una región más grande puede hacerse monocatenaria mediante la
incorporación de bases no naturales en uno de los cebadores de la
amplificación (p. ej. desoxiuridinas) seguido del uso de enzimas de
reparación del DNA tales como la
uracil-DNA-glicosilasa o la
endonucleasa de T4 para cortar por nucleótidos específicos dejando
una región monocatenaria (Watson y Bennet (1997),
BioTechniques, 23, 858-864).
Cuando la invención se realiza usando
determinadas proteínas de unión que actúan en cis, tales como P2A, o
sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente equivalentes,
siempre que el resto de unión al DNA esté asociado covalentemente
con el DNA que lo codifica, éste representa un intermediario
cinético y si la replicación está teniendo lugar, el péptido o la
proteína se religarán a la cadena codificadora y se soltarán de
esta cadena pasando a una nueva secuencia codificadora con un sitio
de unión intacto. La replicación puede evitarse in vitro,
pero esta transferencia representa un problema potencial en los
casos en los que la traducción se lleva a cabo in vivo.
Para evitar esto, se puede usar un mutante que no
se suelte. El uso de un resto de unión modificado que permanece
unido covalentemente al DNA que lo codifica en métodos de la
invención, constituye un aspecto preferido de la invención. En el
caso de P2A por ejemplo, se puede usar Y450F, que comprende una
sustitución de la tirosina situada en la posición del aminoácido
450 de la proteína A con fenilalanina. Debe de observarse sin
embargo que cuando la reacción de traducción se realiza in
vitro, con la condición de que la replicación no tenga lugar,
(p. ej. garantizando que no se encuentren presentes los dNTP), la
proteína de tipo salvaje permanecerá asociada con el DNA que la
codifica, permitiendo que el escrutinio se realice.
Una biblioteca generada según aquí se describe,
se puede usar en cualquiera de las aplicaciones para las que se usan
las bibliotecas de sistemas de presentación convencionales in
vivo o in vitro de la técnica. Estos usos se encuentran
perfectamente documentados en la literatura. Por ejemplo, la
biblioteca de la invención se puede usar para identificar un
péptido o una proteína que se une de manera específica a una
molécula diana.
Es un hecho conocido en la técnica que péptidos
de tamaño diferente se pueden ordenarse en una estructura terciaria
apropiada para producir un dominio con características estéricas y
de carga particulares. Este dominio puede, en virtud de su
ordenación terciaria específica, reconocer específicamente una
molécula diana particular o unirse específicamente a ella. Ejemplos
de estos péptidos incluyen, pero no se limitan a ellos, las
regiones de unión de proteínas y las regiones variables de unión de
los anticuerpos. Incluso péptidos pequeños, sin una estructura
terciaria definida pueden también presentar propiedades de unión a
dianas específicas. Los péptidos que las bibliotecas de la
invención presentan pueden ser por lo tanto péptidos pequeños, por
ejemplo de hasta 40 residuos de aminoácidos, p. ej. de 5 a 30,
preferiblemente de 7 a 20 y más preferiblemente de 10 a 15 residuos
de aminoácidos, que no tienen una estructura terciaria fija, o
pueden ser péptidos de mayor tamaño que forman una estructura
terciaria fija.
Como alternativa, la biblioteca puede expresar
proteínas de presentación (que forman parte del polipéptido que
contiene el resto de unión al DNA) en las que solamente algunos
residuos están modificados en los diferentes miembros de la
biblioteca. Por ejemplo, una proteína con una especificidad
definida, tal como un anticuerpo o un receptor, puede constituir la
base de una biblioteca, en la que varias, por ejemplo de 5 a 30,
preferiblemente de 7 a 20 posiciones de aminoácidos están
modificadas en la biblioteca y se pueden seleccionar proteínas de
presentación que exhiben una especificidad alterada.
Las moléculas diana pueden incluir compuestos
químicos de pequeño tamaño, por ejemplo heterociclos o compuestos
farmacéuticos, polipéptidos, proteínas, polinucleótidos o cualquier
entidad que presente características distintivas en su superficie
que pueden ser reconocidas de manera específica. Así, por ejemplo,
se pueden identificar péptidos o proteínas de unión a dianas
específicas, que tendrían utilidad en ensayos diagnósticos, por
ejemplo en procedimientos clínicos para determinar los niveles de
moléculas biológicas o no biológicas en el organismo humano o en
muestras, extractos o materiales derivados de ellos, o en ensayos
que determinan los niveles de materiales biológicos o no biológicos
en otros materiales no derivados de muestras biológicas.
Las bibliotecas conforme a la invención también
presentan utilidad en protocolos de escrutinio para identificar
compuestos con propiedades bioquímicas, biológicas o estructurales
apropiadas, por ejemplo, para identificar péptidos o proteínas que
presentan una determinada actividad bioquímica en un ensayo
definido. Mediante este método, se pueden identificar péptidos o
proteínas que presentan propiedades enzimáticas, inhibidoras o
estimuladoras, los cuales pueden tener utilidad, por ejemplo, en el
campo farmacéutico. Por ejemplo, se puede realizar el escrutinio de
actividades enzimáticas realizando el seguimiento, por ejemplo, de
una actividad aumentada o disminuida tal como quimiofluorescencia,
actividad de nucleasa, actividad de fosfotransferasa, inhibición,
etc. Si se usan polipéptidos de andamiaje con una actividad
conocida, variantes con propiedades alteradas o con una actividad
alterada se pueden seleccionar en la biblioteca.
Esos polipéptidos o proteínas una vez
identificados en la biblioteca, se pueden usar para la preparación
de compuestos con la actividad particular, por ejemplo,
inhibidores, activadores, o catalizadores de determinadas reacciones
o interacciones.
En general, los péptidos o proteínas de interés
se identifican en la biblioteca conforme al siguiente protocolo que
incluye las etapas de: (i) escrutinio, (ii) aislamiento y/o
purificación, (iii) evolución, (iv) amplificación, (v) preparación
de una biblioteca de re-escrutinio (incluyendo
transcripción y traducción), (vi) re-escrutinio (y
siguiendo a continuación las etapas de (ii) a (vi) tantas veces como
sea necesario), y (vii) aislamiento del material genético de
interés. Las etapas (ii) y/o (iii) y/o (iv) pueden sin embargo no
aplicar según convenga).
Independientemente de si las proteínas actúan en
cis o actúan en pseudo-cis, las etapas de
escrutinio y aislamiento se deben realizar in vitro. Si se
utilizan proteínas de unión que actúan en cis o sus fragmentos,
derivados o variantes funcionalmente equivalentes, las etapas
restantes se deben realizar in vitro o in vivo. Sin
embargo, si se usan proteínas que actúan en
pseudo-cis o sus fragmentos, derivados o variantes
funcionalmente equivalentes, al menos parte de la etapa (v), en
concreto la transcripción y la traducción, se deben realizar in
vivo.
El escrutinio, que se debe realizar in
vitro, implica el uso de un ensayo apropiado, tal como un ensayo
de unión por afinidad, un ensayo de reparto en fases o un ensayo
enzimático para identificar péptidos o proteínas de interés de la
presentación, según se describe en adelante con más detalle. El
ensayo de reparto en fases (véase por ejemplo Garg y col., 1994,
Biotech. Appl. Biochem. 20 119-215) tiene
aplicaciones particulares para identificar péptidos/proteínas de
presentación que se reparten en las fases orgánicas (p. ej. Tritón
X-114) como resultado de la variación existente en
la biblioteca. Este método tiene una mejor aplicabilidad general si
la fase orgánica, p. ej., un detergente, se modifica para que porte
un miembro de una pareja de unión apropiada para el péptido o
proteína diana de la presentación, p. ej. un anticuerpo o un
antígeno.
La identificación de propiedades enzimáticas
alteradas se basa en propiedades físicas alteradas, p. ej. la unión
a un sustrato o la exposición a un sitio previamente inaccesible,
p. ej. mediante una actividad de proteasa o mediante
fosforilación.
La unión del péptido o de la proteína de
presentación a un miembro de una pareja de unión apropiado se puede
identificar mediante cualquiera de los medios apropiados, por
ejemplo, mediante unión por afinidad y elución, o mediante
evidencia de la actividad enzimática, p. ej. la producción del
producto de la reacción. Por lo tanto, las bibliotecas de la
invención se pueden usar para identificar miembros de parejas de
unión en los que el péptido o la proteína expresado es uno de los
miembros de la pareja de unión. De esta manera las bibliotecas de
la invención proporcionan alternativas totalmente in vitro a
técnicas tales como el sistema de los dos híbridos. En este
sistema, se crean dos moléculas híbridas cada una de las cuales
porta uno de los miembros de una pareja de unión (tal como una
enzima y su sustrato). Cuando estos miembros de las parejas de
unión se unen, las otras partes funcionales de las proteínas de
fusión se reúnen. Mediante una selección apropiada de estos restos
funcionales de las proteínas de fusión, se puede identificar una
interacción detectable.
Este tipo de sistema se encuentra descrito por
ejemplo en Field y Song (1989, Nature, 340,
245-246), y en él las proteínas de fusión contienen
diferentes partes de GAL4 de Saccharomyces cerevisiae, cuyos
componentes se reúnen mediante la unión de los miembros de la pareja
de unión expresados en las proteínas de fusión, reconstituyen GAL4
de manera que se puede observar su actividad de activación
transcripcional. Esto indica por lo tanto que ha tenido lugar la
unión entre los miembros de la pareja de unión de las proteínas de
fusión. Gyuris y col., 1993, Cell, 75,
791-803, describe de manera similar la
complementación de los componentes de un activador de la
transcripción. Además, Rossi y col. (1997, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 94, 8405-8410) han descrito una
complementación utilizando mutantes de
\beta-galactosidasa por deleción. También se puede
conseguir una complementación en la que la segunda proteína de
fusión es una entidad más compleja pero que posee las
características anteriormente descritas, es decir, un miembro de la
pareja de unión y un resto funcional que interacciona con un resto
funcional presente en la primera proteína de fusión. Un ejemplo de
esto se proporciona en Krebber y col., (1997, J. Mol. Biol.,
268, 607-618) en el que un fago no infeccioso se
hace infeccioso uniendo una proteína de fusión a través de los
miembros de una pareja de unión apropiados. Aronheim y col. (1997,
Mol. Cell Biol., 17, 3094-3102) describen un
sistema en el que el equivalente de la segunda proteína de fusión
lleva un miembro de la pareja de unión que tiene naturaleza de
ácido nucleico y el resto funcional es una proteína presente en la
membrana plasmática a la que el miembro del par de unión se
une.
De esta manera la biblioteca de la invención
puede expresar una proteína de fusión que contiene un resto
responsable de una interacción de unión (la totalidad o una parte
del péptido o de la proteína de presentación) y un segundo resto
implicado en la complementación. Una segunda proteína de fusión (o
una entidad apropiada) que porta el miembro de la pareja de unión y
el componente requerido para la complementación, puede formar parte
de la biblioteca o puede adicionarse a la biblioteca. El miembro de
la pareja de unión de una o de ambas de las proteínas de fusión
puede estar modificado en la biblioteca.
Dependiendo de la construcción de las moléculas
de ácido nucleico de la invención, según se ha mencionado
anteriormente, puede ser necesario realizar el escrutinio en
condiciones de hibridación.
La biblioteca puede ser modificada antes del
escrutinio, por ejemplo, modulando el plegamiento del péptido o
proteína presentado mediante la adición de enzimas tales como
chaperonas (por ejemplo, hsp70) o modificadores del plegamiento
tales como la proteína disulfuro-isomerasa, agentes
oxidantes, o enzimas que alteran la actividad oxidante del
citoplasma bacteriano o de los extractos en los que tiene lugar la
traducción. Además, se puede realizar el escrutinio de proteínas
tanto homo-oligoméricas como
hetero-oligoméricas. Por ejemplo, el receptor de la
partícula de reconocimiento de señal (SR) es un heterodímero de
subunidades denominadas SR-alfa y
SR-beta, y se puede obtener la expresión de una
biblioteca que exprese variantes de sólo una de las subunidades.
Las variantes se pueden luego ensayar con respecto a una propiedad
deseada que es independiente de la otra subunidad, o con respecto a
una propiedad dependiente antes de la heterodimerización con la otra
subunidad.
Un ejemplo clásico de heterodimerización es el
proporcionado por las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo. En
este caso por ejemplo solamente una de las cadenas podría
encontrarse presente en la biblioteca y la otra cadena podría ser
aportada durante el ensayo. Además de un polipéptido, en la etapa de
escrutinio se pueden añadir metales, porfirinas, cofactores, DNA,
RNA y otras moléculas, para alterar las propiedades del péptido o de
la proteína de presentación.
Después del escrutinio, los péptidos o proteínas
de interés, del sistema de presentación, se deben de separar del
conjunto reunido de la biblioteca (aislamiento) y opcionalmente
purificarse. En determinados casos esto se habrá realizado durante
el escrutinio, por ejemplo durante el uso de columnas de
afinidad.
Se puede realizar una evolución de las moléculas
de DNA seleccionadas para generar nuevas variaciones en la
biblioteca que pueden exhibir las propiedades deseadas en mayor
medida. Esto se ha realizado en la técnica anterior para obtener
por evolución una fucosidasa a partir de una galactosidasa (véase
Zhang y col. (1997), PNAS USA, 94, 4504-4509) o
para alterar una función enzimática específica (véase Crameri y
col., (1997), Nature Biotechnology, 15,
436-438; You y Arnold (1996), Protein Eng.,
9, 77-83).
La evolución se puede realizar mediante la
introducción de nuevas mutaciones adicionales en localizaciones
aleatorias usando químicamente uno cualquiera de los varios
procedimientos conocidos en la técnica; usando genéticamente cepas
mutadoras de bacterias (Dengen y Cox (1974), J. Bact., 117,
477-487), cepas bacterianas que introducen
sustituciones de aminoácidos usando tRNA supresores (Markiewicz y
col., (1984), J. Mol. Biol., 240, 421-433),
mediante técnicas de PCR mutagénica tales como la aleatorización de
codones regionales (Cormack y Struhl (1993), Science, 262,
244-248) o usando uno de los métodos estándar para
disminuir la fidelidad de la polimerasa usada en una reacción de PCR
o de la transcriptasa inversa en NASBA. Se pueden usar cebadores
con desapareamientos o bibliotecas con megacebadores para introducir
sustituciones en localizaciones definidas. Los miembros de la
biblioteca seleccionados que contienen diferentes variaciones
independientes se pueden también recombinar usando la tecnología de
mezclado de DNA (del inglés, "DNA shuffling") (Stemmer
(1994), Nature, 370, 389-391) o mediante
métodos de clonación más convencionales.
Después del aislamiento o de la evolución si ésta
se realiza, los miembros de la biblioteca seleccionados o los
miembros de la biblioteca obtenidos por evolución se amplifican (en
caso necesario) y se prepara una biblioteca para el
re-escrutinio usando cualquiera de los
procedimientos anteriormente descritos para la generación de la
biblioteca. Como consecuencia de que un péptido o una proteína esté
unido al material genético de la biblioteca, para obtener el
material genético en una forma adecuada para las etapas
posteriores, p. ej. transformación, puede ser necesario extraer la
región codificadora en una molécula de DNA diferente, tal como un
vector. El re-escrutino se puede entonces realizar
tantas veces como convenga para estabilizar la población
seleccionada, aumentando opcionalmente la rigurosidad del escrutinio
o introduciendo nuevas variaciones (p. ej., evolución in
vitro).
Una vez completado el escrutinio, el material
genético que codifica el péptido o proteína seleccionado se puede
aislar, por ejemplo, mediante purificación del plásmido o del
minicromosoma. Opcionalmente, los miembros de la biblioteca
seleccionados se pueden amplificar antes del aislamiento, por
ejemplo, mediante transformación y cultivo o mediante PCR.
De lo anteriormente expuesto resultará evidente
que se pueden usar varios métodos para generar y escrutar la
biblioteca de la invención. Sin embargo, se prefieren los
siguientes esquemas. Cuando se usan proteínas de unión que actúan
en cis o sus fragmentos, derivados o variantes funcionalmente
equivalentes, para permitir que tenga lugar el protocolo más rápido
y eficiente (según se ha descrito previamente) todas las etapas se
deben realizar in vitro. Ya que en esos casos no se requieren
organismos vivos, se observará que el procedimiento completo es
susceptible a una automatización. Además, no es necesario utilizar
condiciones o procedimientos que se seleccionan para garantizar la
viabilidad de los organismos.
Preferiblemente, las construcciones genéticas
usadas para crear la biblioteca de expresión se construyen usando
cebadores (con secuencias de la biblioteca) que se reasocian a las
secuencias de la biblioteca y las insertan en el extremo carboxilo
del resto de unión al DNA. Esto evita el requerimiento de
condiciones de hibridación durante la traducción o de
circularización antes de la traducción cuando se usan restos de
unión al DNA que se comportan de manera similar a P2A.
Se prefiere además, cuando se usan proteínas de
unión al DNA o sus fragmentos, variantes o derivados funcionalmente
equivalentes que tienen tendencia a soltarse del DNA que los
codifica, mutar la proteína de unión a DNA, p. ej., Y450F según
aquí se ha descrito, de manera que la proteína o sus fragmentos,
variantes o derivados se unan a éste pero que no se suelten
(manteniéndose así el enlace operacional entre el DNA y el producto
que éste codifica. De manera adicional, puede requerirse un sitio
de ori adicional para permitir que tenga lugar la replicación. La
construcción debe contener además promotores inducibles.
Preferiblemente, el resto de unión a DNA deriva
de la proteína P2A o de uno de sus fragmentos, variantes o derivados
funcionalmente equivalentes. Durante la traducción, el uso de un
oligonucleótido con desapareamientos puede ser conveniente. La
presencia de al menos un marcador de resistencia a antibióticos se
prefiere también para la transformación final de las células
hospedadoras una vez aisladas, con la secuencia de ácido nucleico
seleccionada.
Cuando se utilizan proteínas de unión que actúan
en pseudo-cis o sus fragmentos, derivados o
variantes funcionalmente equivalentes para generar la biblioteca, la
amplificación del material genético se realiza preferiblemente
in vitro mediante técnicas apropiadas tales como PCR. Las
construcciones preferidas son aquellas en las que las secuencias de
la biblioteca aparecen en el extremo carboxilo de la región que
codifica el resto de unión al DNA, para evitar el uso de
megacebadores y de problemas en el caso de que se produzca la
melladura de la cadena de DNA. También se prefiere la presencia de
genes que codifican marcadores de resistencia a antibióticos y un
promotor inducible. Durante el escrutinio, se prefiere que la
amplificación se realice también in vitro.
Así contemplada desde un nuevo aspecto, la
invención proporciona un método para identificar y/o purificar un
miembro de una biblioteca que exhibe propiedades deseadas, a partir
de una biblioteca de expresión de péptidos o proteínas según se ha
definido en lo que antecede, comprendiendo dicho método al menos las
etapas de a) someter a escrutinio una biblioteca de la invención y
b) seleccionar y aislar el miembro de la biblioteca relevante. El
método se puede extender al aislamiento del péptido o de la
proteína que exhibe la propiedad deseada o del DNA que lo codifica,
mediante la etapa adicional de aislar el péptido, la proteína o el
DNA que lo codifica a partir del miembro de la biblioteca
aislado.
En los casos en los que la propiedad deseada es
la capacidad para unirse a una diana, se pueden usar moléculas
diana, preferiblemente en forma purificada, para seleccionar un
conjugado genético que porta un péptido o una proteína de unión
específica a una diana en la biblioteca de varias maneras
diferentes. De manera conveniente, la diana puede estar unida a un
soporte sólido y se puede usar como una matriz de afinidad.
Numerosos soportes sólidos y métodos para la unión de moléculas
directa o indirectamente, de manera covalente o no covalente (p.
ej., mediante un acoplamiento
biotina-estreptavidina o
IgG-proteína A) se conocen muy bien en la técnica y
se encuentran ampliamente descritos en la literatura.
Así por ejemplo, se pueden usar soportes en forma
de pocillos de microtitulación, tubos, varillas, partículas, fibras
o capilares. Ventajosamente, el soporte puede comprender partículas
magnéticas, p. ej. las bolitas supermagnéticas producidas por Dynal
AS (Oslo, Noruega y comercializadas con la marca comercial de
DYNABEADS).
Para la selección, la biblioteca de expresión se
puede poner en contacto con la diana unida a un soporte sólido. El
soporte se puede lavar para retirar los miembros de la biblioteca
que no se unen a la diana o se puede extraer de la biblioteca de
expresión de una manera apropiada para el soporte que se ha usado.
Los conjugados seleccionados formados por péptido/proteína:DNA se
pueden luego desprender del soporte sólido, en caso necesario,
mediante ruptura de la unión entre las moléculas diana y el soporte
sólido, o entre las moléculas diana y los conjugados formados por
péptido/proteína:DNA, para la subsiguiente amplificación o
aislamiento del material genético. Como alternativa, la
amplificación se puede realizar in situ sin ruptura de la
unión de la diana al conjugado formado por péptido/proteína:DNA, o
sin desprender el material genético del conjugado.
La molécula diana se puede también usar en forma
de un agente libre en ausencia de un soporte. La selección se puede
luego realizar retirando los conjugados no unidos, por ejemplo
usando anticuerpos dirigidos a una región del péptido o de la
proteína expresado que está presente en todos los miembros de la
biblioteca y que está accesible solamente cuando no se encuentra
unida a moléculas diana. Las moléculas diana, como alternativa,
pueden estar provistas de un medio para la inmovilización de manera
que esto se puede usar para separar la diana y los conjugados
péptido/proteína DNA unidos después de mezclar la diana y la
biblioteca. Este medio de inmovilización puede por ejemplo
constituir uno de los miembros de una pareja de acoplamiento, p.
ej. estreptavidina-biotina, unido a la molécula
diana, y el otro miembro unido a un soporte que va a usarse para la
recuperación.
Así contemplado desde otro aspecto más, la
invención proporciona un método para identificar un péptido o una
proteína de unión específica a una diana, comprendiendo dicho
método al menos las etapas de a) someter a escrutinio una biblioteca
de la invención con moléculas diana y b) seleccionar y aislar un
miembro de la biblioteca que se une a dicha molécula diana, y c)
aislar el péptido o la proteína que se une específicamente a dicha
molécula diana. También se proporciona un método para aislar un DNA
que codifica un péptido o una proteína de unión específica a una
diana, en el que después de la anterior etapa b), se aísla el DNA
que expresa el péptido o la proteína que se une de manera
específica a dicha molécula diana.
Puede ser necesario realizar más de un único
ciclo de escrutinio y selección para obtener un péptido o una
proteína de unión a una diana, de la especificidad deseada.
De manera similar, la biblioteca se puede someter
a escrutinio para identificar una proteína o un péptido con
atributos funcionales particulares, p. ej., una actividad
enzimática.
Un péptido o una proteína seleccionado, unido al
DNA que lo codifica, se puede aislar separándolo del material
genético, se puede sintetizar mediante transcripción y traducción
del material genético que puede ser amplificado, o se puede
sintetizar por métodos químicos después de secuenciar la secuencia
de DNA apropiada que lo codifica, o de secuenciar directamente el
péptido o la proteína. La síntesis química del péptido o de la
proteína se puede realizar con métodos muy conocidos en la técnica
que implican series cíclicas de reacciones de desprotección
selectiva de los grupos funcionales de un aminoácido terminal y
acoplamiento de residuos de aminoácidos protegidos de manera
selectiva, seguidos finalmente por la desprotección completa de
todos los grupos funcionales. La síntesis se puede realizar en una
disolución o en un soporte sólido usando fases sólidas adecuadas,
conocidas en la técnica.
Preferiblemente, si la afinidad del péptido o de
la proteína seleccionado por la molécula diana o la actividad del
péptido o de la proteína no se afecta de manera significativa,
solamente se puede sintetizar el resto de presentación del péptido
o proteína expresado. De manera opcional, puede ser necesario o
preferible producir el péptido o la proteína en la forma en la que
aparece en el polipéptido que contiene el resto de unión al DNA,
generando una parte o la totalidad de la secuencia del resto de
unión al DNA y/o otras regiones del péptido o proteína expresado.
Esto es especialmente cierto cuando se ha producido una biblioteca
de andamiaje.
Los conjugados apropiados formados por
péptido/proteína de unión a una diana:DNA pueden estar provistos de
una molécula de reporte para uso en ensayos cualitativos o
cuantitativos para determinar la presencia o ausencia de moléculas
diana.
Por lo tanto, contemplado desde aún otro aspecto
más, la invención proporciona un método para realizar un ensayo de
la presencia de una molécula diana en una muestra, comprendiendo
dicho método (a) poner en contacto dicha muestra (p. ej., de un
material biológico, derivada de un material biológico o de un
material no biológico) con una sonda molecular que comprende (i) un
resto de unión a una diana, de un péptido o de una proteína, capaz
de unirse de manera selectiva a dicha molécula diana, que lleva
unido el DNA que lo codifica, el resto de DNA, seleccionado en la
biblioteca de la invención y (ii) un resto de reporte; y (b)
determinar directa o indirectamente la sonda unida a la diana.
Sondas moleculares bifuncionales (que comprenden
(i) y (ii) según se han descrito anteriormente), de uso en el
ensayo, constituyen un aspecto más de la invención.
En este método analítico, la determinación de la
unión del compuesto bifuncional a cualquiera de las dianas frente a
las que es específico, que está presente en la muestra, puede ser
directo o indirecto. Las determinaciones directas e indirectas son
muy conocidas en el campo de los ensayos diagnósticos. Estos
procedimientos pueden implicar la separación del compuesto
bifuncional unido (o no unido), cualquiera de los cuales puede
servir como analito. La determinación del conjugado formado por
molécula diana:compuesto bifuncional puede ser cualitativa o, más
preferiblemente, cuantitativa, y podrá implicar la determinación
directa o indirecta del resto de reporte.
El ensayo se puede dirigir a la determinación de
una segunda diana con la primera diana, en la que el resto de
reporte presente en una sonda dirigida a la segunda diana es
reconocido por el compuesto bifuncional. De esta manera un compuesto
bifuncional puede estar dirigido a una sonda, preferiblemente
molecular, que reconoce a otra diana, en cuyo caso se permite que
la sonda se una a la otra diana en condiciones adecuadas antes de
la adición del compuesto bifuncional según se ha mencionado
anteriormente.
Para proporcionar la sonda, los conjugados
formados por péptido/proteína de unión específica a una diana:DNA
pueden incorporar un resto de reporte, o se pueden conjugar con él,
de manera que se puede determinar y/o cuantificar la presencia de
la diana de interés en la muestra del ensayo.
El resto de unión del péptido o de la proteína a
una diana en el compuesto bifuncional se une a la diana en virtud de
una región de unión a la diana que constituye algunos o todos los
residuos de aminoácidos del péptido o de la proteína expresados.
Generalmente, esto corresponderá al menos a una porción del resto de
presentación según se ha definido previamente.
El resto de reporte puede ser cualquier resto
capaz de una detección directa o indirecta, p. ej., en virtud de sus
propiedades enzimáticas, emisión de radiación, propiedades de
dispersión o absorción, de sus propiedades magnéticas, o de su
capacidad para cooperar con un agente de complementación, o de
unirse a él, para producir un efecto detectable, p. ej.,
interaccionar con una enzima para producir una señal,
desprendimiento de un gas, emisión de luz, cambio de color,
turbidez, precipitación, etc. El resto de reporte puede ser, de
manera alternativa, cualquier parte del conjugado formado por
péptido/proteína:DNA que sea reconocible y que se pueda unir a otra
molécula que pueda producir directa o indirectamente una señal. Así
por ejemplo, se puede utilizar un anticuerpo dirigido contra una
región particular del material genético o del péptido/proteína. Los
restos anteriormente mencionados son muy conocidos dentro del campo
de los ensayos diagnósticos.
El resto de reporte en los compuestos
bifuncionales de la invención se puede incorporar en, o se puede
conjugar con, el resto de péptido/proteína o el resto de DNA. Así,
a modo de ejemplo, se pueden usar aminoácidos o nucleótidos marcados
radiactivamente en la construcción del péptido/proteína o del DNA
que lo codifica, actuando en ese caso los radioisótopos como restos
de reporte integrados en las estructuras del péptido/proteína o del
ácido nucleico. Esos constituyentes marcados se pueden incorporar
durante la preparación de la biblioteca progenitora o durante las
posteriores etapas de escrutinio o amplificación cuando éstas se
realicen.
Como alternativa, una molécula de reporte se
puede conjugar con el péptido/proteína o con el DNA que directa o
indirectamente permite la detección o medida de la presencia de la
diana a la que el péptido o la proteína es capaz de unirse. Esas
moléculas de reporte incluyen por ejemplo, marcadores radiactivos,
marcadores químicos, por ejemplo, cromóforos o fluoróforos (p. ej.,
colorantes como la fluoresceína y la rodamina) o reactivos de alta
densidad electrónica tales como la ferritina, hemocianina u el oro
coloidal.
Como alternativa, la molécula de reporte puede
ser una enzima, por ejemplo, peroxidasa o fosfatasa alcalina, en
cuyo caso la presencia de la enzima se visualiza mediante su
interacción con un resto adecuado, por ejemplo, un sustrato. La
actividad enzimática la puede proporcionar la proteína o el péptido
expresado, inclusive la entidad de unión a la diana del péptido o
de la proteína, si la diana a la que éste/a se une es por ejemplo
un receptor para la enzima o es un sustrato para la enzima. El
acoplamiento de enzimas a péptidos o a proteínas se puede obtener
utilizando técnicas convencionales, p. ej., usando una enzima
activada tal como una fosfatasa alcalina activada (Boehringer
Mannheim Biochemicals).
El resto de reporte también puede formar parte de
una pareja de señalización en la que el otro miembro de la pareja se
encuentra en, o está en estrecha proximidad a, la diana a la que se
une el péptido o la proteína, por ejemplo, un compuesto fluorescente
y un sustrato desactivador de la fluorescencia. Como se ha
mencionado con anterioridad, el péptido/proteína o el DNA también se
pueden detectar mediante la asociación con, o la unión de, otra
molécula que reconozca su identidad, por ejemplo, un anticuerpo
dirigido contra parte de la secuencia que puede constituir la
región de unión a la diana del péptido o proteína o una región del
péptido o de la proteína no implicada en la unión a la diana, que
se puede añadir opcionalmente para fines de reconocimiento, o en el
caso de un DNA, que se puede dirigir contra motivos específicos de
naturaleza ácido nucleica. De este modo, la región de unión
específica a una diana puede estar dentro un péptido o una proteína
de mayor tamaño, en cuyo caso las porciones del péptido o de la
proteína no implicadas en la unión a la diana pueden prestar un
papel estructural o funcional para el péptido o la proteína
expresado, p. ej., como secuencia de andamiaje, o pueden actuar como
un resto de reporte, o como un grupo enlazador que enlaza la región
de unión específica a una diana, a un resto de reporte o a otro
componente de la sonda, p. ej., una molécula de transporte o una
macromolécula.
Los compuestos bifuncionales útiles de acuerdo
con la invención se pueden producir conjugando una molécula de
reporte al péptido o proteína apropiado resultante, ya sea
directamente o a través de un resto enlazador. Generalmente esto se
puede hacer mediante reacción con una funcionalidad carboxilo o una
funcionalidad amina opcionalmente activada que se encuentra en el
péptido o en la proteína. Estas reacciones de conjugación se
encuentran dentro de la capacidad de un químico de experiencia
ordinaria.
Como alternativa, la molécula de reporte se puede
introducir utilizando un aminoácido marcado apropiadamente, en la
construcción del péptido o de la proteína.
Los compuestos bifuncionales que hacen de sonda
se pueden usar para reconocer dianas específicas de interés en
diferentes sistemas conocidos en la técnica, que incluyen ensayos
diagnósticos como se ha mencionado con anterioridad.
Los siguientes Ejemplos se proporcionan
únicamente a modo de ilustración, con referencia a los dibujos en
los que:
La Figura 1 muestra la construcción de las
construcciones pEN21 y pEN24, y
La Figura 2 muestra la producción de moléculas de
DNA que contienen una región aleatorizada de 30 pares de bases
generados por PCR, en la que la pista 1 es un marcador (\lambda,
HindIII) y la pista 2 es el producto de la PCR.
A. Un plásmido o un fragmento de PCR que
contiene el promotor de T7, un sitio de unión al ribosoma, el gen A
de P2 y el terminador de T7. Plásmidos de este tipo han sido
descritos por Liu y Hagg\ring{a}rd-Ljungquist
(1994, supra) o se pueden obtener procedentes de
Biotechnology Centre de Oslo, Universidad de Oslo (BiO).
B. Un cebador (cebador de la biblioteca) que
contiene las siguientes secuencias complementarias a las del
plásmido/fragmento:
- -
- promotor de T7,
- -
- sitio de unión al ribosoma,
- -
- 30 nucleótidos aleatorios (XXT/G) detrás del primer codón de iniciación ATG, y como alternativa, un codón de cisteína detrás del primer codón de iniciación y detrás de la secuencia aleatoria (en el caso de las bibliotecas constreñidas de péptidos).
- -
- aproximadamente 20 nucleótidos en dirección aguas abajo desde el primer codón de iniciación, complementarios a la secuencia codificadora correspondiente al gen A de P2.
Los cebadores deben ser sintetizados a medida o
se deben obtener procedentes de BiO.
C. Un cebador de PCR para la región del promotor
de T7 (BiO).
D. Un cebador de PCR para la región del
terminador de T7 (en sentido contrario al de las agujas del reloj)
(BiO).
E. Una diana unida a un soporte sólido. A
conveniencia, esto se puede realizar usando una diana biotinilada y
uniendo esta diana a estreptavidina o avidina dispuesta sobre un
soporte sólido. Como alternativa, la propia avidina puede ser la
"diana" si se buscan péptidos que se unen a avidina.
Streptavidina unida a pocillos de microtitulación o estraptavidina
unida a partículas magnéticas o Avidin-Resin
se puede adquirir procedente de Dynal (Noruega) o Promega (EE.UU.),
respectivamente.
F. Un extracto S30 de T7 correspondiente a la
transcripción/traducción acopladas in vitro de moldes
lineales se puede obtener procedente de Promega (EE.UU.)
* El resto del material necesario es material
considerado estándar por toda persona que trabaje con técnicas de
biología molecular.
1. Comenzando con un plásmido o de un fragmento
de PCR según se ha mencionado en el apartado A, se realiza una PCR
lineal añadiendo el cebador de la biblioteca mencionado en el
apartado B. El montaje exacto de esta reacción es dependiente del
cebador y las mismas consideraciones que se aplican a una PCR o a
una secuenciación por ciclos también se aplican en este caso. Esto
generará una biblioteca de hasta de 10^{12} a 10^{13}
moléculas, dependiendo de la efectividad de la PCR. Para evitar una
competición entre cebadores en la etapa siguiente, los cebadores de
la biblioteca restantes se deben retirar preferiblemente en este
momento mediante el uso de una columna de
Centricon-100 (Amicon).
2. Para amplificar este material, se realizan
5-7 ciclos de PCR con los cebadores de los
apartados C y D. Esta PCR se realiza usando el DNA extendido por el
cebador de la biblioteca, separado en cinco partes alícuotas.
3. Una porción del material procedente de la
biblioteca generada (ex. una quinta parte) se añade a un extracto
S30 para fragmentos lineales que contiene
RNA-polimerasa de T7 (F), según se describe en el
manual de Promega. La reacción se incuba durante
30-60 min a 37ºC y después se detiene colocando el
tubo(s) en hielo.
4. La diana va unida directamente a un soporte
sólido por medio del sistema de
biotina-estreptavidina. La avidina acoplada a la
matriz Resin o a bolitas magnéticas de estreptavidina se
puede obtener comercialmente procedente de Promega y Dynal
respectivamente.
5. El extracto S30 se diluye en proporción 1:10
en el tampón de unión conveniente (Sambrook y col. (1989), en
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), y la
biblioteca de péptidos en el extracto S30 se deja interaccionar con
la diana durante 1-3 horas (o durante toda la
noche). Los compuestos no unidos se retiran mediante lavados 5X con
PBS 1X + Tween-20 (Sigma) al 0,5% durante 5 minutos.
El complejo unido péptido-proteína
A-DNA se eluye de la diana con el diluyente
conveniente, por ejemplo biotina si la diana es avidina y se busca
un péptido de unión a avidina. También se puede realizar una elución
con dH_{2}O hirviente para desprender el complejo de la diana y
desprender simultáneamente el material genético del material no
genético.
6. El DNA eluido se concentra antes de entrar en
la siguiente ronda de PCR. Esto se realiza de la manera más
conveniente usando una columna Centricon-100 y
siguiendo las recomendaciones del fabricante. El volumen final del
DNA eluido es 50 \mul. Como alternativa, el complejo se puede
purificar antes de la PCR sin separación del material genético y del
material no genético.
7. Se prepara una nueva reacción de PCR usando
los cebadores de los apartados C y D con 30-40
ciclos.
8. El procedimiento completo desde la etapa 3
hasta la etapa 7 se realiza de nuevo de cuatro a cinco veces.
9. Después del último ciclo de elución y PCR los
fragmentos necesitan ser clonados con el fin de aislar y estudiar
los fragmentos individuales para determinar sus secuencias. Esto se
realiza digiriendo el fragmento de la última PCR con XbaI y BamHI y
ligando el resultado al vector pET-3a (Novagene) (A)
digerido con las mismas enzi-
mas.
mas.
10. El vector ligado se utiliza luego para
transformar E. coli. Debido a que hay muchas copias de la
misma secuencia, la eficiencia de la transformación no es
crítica.
11. Se escogen los clones individuales y el DNA
plasmídico se aísla mediante protocolos estándar. Se realiza una
ronda final con el extracto S30 y selección (etapas de 3 a 7) para
prevenir la presencia de compuestos de unión que solamente actúan de
manera cooperativa (junto con otros compuestos de unión).
12. El producto de la última PCR se secuencia a
lo largo de la región variable, y se obtiene una secuencia consenso.
Con el fin de obtener una buena secuencia consenso, se deben
secuenciar hasta 50 clones.
13. La secuencia peptídica deducida se sintetiza
y se somete a ensayos independientes con respecto a sus propiedades
de unión.
Se obtiene una población de la biblioteca usando
un cebador de bases aleatorizadas para la amplificación del gen A.
El módulo de presentación que corresponde a aproximadamente 3.000
pares de bases se muestra de manera esquemática de la siguiente
manera en el caso del plásmido pEE709 linearizado (el gen A
insertado en pET8C = pET3d en el sitio NcoI después de
rellenar).
En el que:
- T7p = promotor \diameter10 de T7
- T7t = terminador de T7
- RBS = sitio de unión al ribosoma
- AUG = codón de iniciación para la proteína A
- A = proteína A
- P = péptido/proteína presentado
- B = cebador de la cadena de la biblioteca que contiene una secuencia aleatoria (L) según se ha definido en el Ejemplo 1
- C = cebador de PCR (T7p)
- D = cebador de PCR (T7t)
En el diagrama anterior el inserto del gen A
comienza con GCC (el segundo codón) y finaliza con GCA (bases
3.427-3.429). (Véase la secuencia de DNA de Liu y
col., 1993, supra).
Los cebadores usados en el Ejemplo son de la
siguiente manera:
Una población de fragmentos de DNA con un grupo
SET de bases aleatorizadas se obtiene de la siguiente manera:
Se realiza una amplificación lineal (o extensión
del cebador) sobre el plásmido pEE709) linearizado (HindIII) con el
cebador B de la biblioteca. La mezcla de reacción de 100 \mul
contiene: 0,3 \mug de DNA plasmídico (aproximadamente 6 x
10^{10} moléculas o 0,1 pmoles), 5 \mug de DNA cebador de la
biblioteca (aproximadamente 7 x 10^{13} moléculas o 125 pmoles) y
el resto de los componentes como los que se describen para la
reacción de PCR más adelante. La mezcla se somete a 5 ciclos de PCR
como se describe más adelante. El cebador de la biblioteca se retira
preferiblemente usando Centricon-100. El DNA
extendido del cebador de la biblioteca (biblioteca) se diluye y se
subdivide en cinco partes alícuotas de 100 \mul (volumen final) y
se somete a una PCR limitada (5 ciclos) usando los cebadores C y D.
Cada una de las mezclas de reacción contiene: 0,6 \mug de DNA de
cebador de la biblioteca extendido, 125 pmoles de los respectivos
cebadores C y D, un concentración 0,2 mM de cada uno de los dNTP,
KCl 50 mM, MgCl_{2} 4 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 9,0 a
25ºC), Tritón X-100 al 0,1% y 2,5 U de
Taq-DNA-polimerasa (Promega) en un
volumen final de 100 \mul. La mezcla se somete a 35 ciclos de 1
minuto a 94ºC, 2 minutos a 42ºC y 3 minutos a 72ºC en un
termociclador (Perkin Elmer modelo PCR1000). El producto de la PCR
se purifica mediante la retirada de los cebadores
(Centricon-100) tratamiento con fenol y
precipitación en etanol. En este punto la biblioteca debe comprender
de 10^{12} a 10^{13} moléculas de DNA.
Una estrategia alternativa para generar la
biblioteca sería simplemente ejecutar ciclos de PCR sobre el
fragmento de DNA del vector usando los cebadores B y D de la
biblioteca para dirigir la PCR.
A. Una mezcla de extracto S30 de T7 y de
extracto S30 para moldes lineales, de Promega, se usa para una
transcripción/traducción acopladas de moldes de DNA lineales. La
transcripción del gen A está dirigida por la
RNA-polimerasa de T7 desde el promotor
\diameter10 de T7. Uno de los cinco grupos de la biblioteca de
DNA, que se ha tratado con fenol y precipitado en etanol, se
resuspende en 9 \mul de agua destilada. A este volumen se añaden
los componentes (5 \mul de la mezcla de aminoácidos, 20 \mul de
la pre-mezcla de S30, 1 \mul de S30 de T7 y 15
\mul de S30 para moldes lineales) del protocolo que utiliza S30
(Promega) hasta constituir un volumen final de 50 \mul. El
procedimiento de transcripción/traducción acopladas se deja que
tenga lugar durante 60 minutos (o durante el tiempo que se requiera)
a 37ºC.
B. La mezcla de reacción (50 \mul) se añade a
50 \mul de SoftLink Avidin Resin (Promega) y se deja que se
mezclen durante 2 horas a temperatura ambiente para el revestimiento
de la superficie (del inglés, "panning") con los
péptidos que se unen a Avidina. La Resina se sedimenta por
centrifugación (10.000 rev/min durante 5 minutos) y se lava (cinco
veces con PBS, Na_{2}HPO_{4} 20 mM, NaCl 100 mM, pH 7,5). Los
compuestos potenciales de unión a avidina se eluyen con biotina 5 mM
o simplemente sometiendo el complejo avidina-Resina
completo a una PCR con los cebadores C y D según se ha descrito en
el apartado 1A. El producto de la PCR se separa de la
avidina-Resina por centrifugación, se trata con
fenol y se precipita en etanol antes de ser sometido a un nuevo
ciclo de transcripción/traducción acopladas y de revestimiento de
una superficie. Los ciclos de presentación de péptidos y
revestimiento de una superficie se pueden repetir hasta que se
alcanza el enriquecimiento en péptidos previsto. Se pueden usar
anticuerpos policlonales específicos para proteína A, para vigilar
la presencia y el aumento de la proteína A de soporte durante el
revestimiento de la superficie. Después de la cuarta ronda de
revestimiento de una superficie, el producto final de la PCR se
corta con las enzimas de restricción XbaI y BamHI y se inserta en
pET-3a (cortado con las mismas enzimas) mediante una
ligación. Después de las transformaciones, las colonias individuales
se aíslan y los plásmidos se extraen para la determinación de la
secuencia del inserto con el fin de obtener la secuencia de
aminoácidos del péptido.
Se prepara una biblioteca de péptidos y se somete
a escrutinio según se describe en el Ejemplo 2, pero antes de la
traducción (etapa 2), las moléculas de DNA se purifican y luego se
circularizan con la DNA-ligasa de T4 (New England
Biolabs), conforme a las instrucciones del fabricante y de
acuerdo con protocolos estándar (véase Sambrook, 1989,
supra).
En este caso, no es necesario mantener
condiciones de hibridación durante el escrutinio y éste se puede por
lo tanto realizar, por ejemplo, en Tritón X-100 al
1%, KOAc 0,5 M o en Tritón X-100 al 1%, NaCl 350 mM,
glicerol al 5%, que son condiciones adecuadas de escrutinio en el
caso de la heterodimerización de receptores SRP, o en Tritón
X-100 al 1%, urea 2 M, NaCl 100 mM,
Tris-HCl 50 mM, pH 5 o en Tritón
X-100 al 1%, SDS al 0,1%, NaCl 100 mM,
Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, condiciones que son
adecuadas para el escrutinio de interacciones de
antígeno:anticuerpo.
Experimento
1
Una cantidad igual de DNA de dos plásmidos que
portan el gen A de P2 (pEE709; también porta un gen de resistencia a
amp, Liu y Hagg\ring{a}rd-Ljungquist, 1994,
supra) y el gen A de P2 fusionado a una extensión de seis
histidinas justo en el extremo N-terminal de A
(pEE711; también porta un gen de resistencia a amp, Liu y
Hagg\ring{a}rd-Ljungquist, 1994, supra), se
sometieron a una reacción de transcripción/traducción acopladas en
un extracto S30-T7 (Promega, EE.UU.). La presencia
de la extensión de histidina transforma la proteína A en una
proteína de unión a Ni. Por lo tanto el plásmido pEE711 que expresa
His::A debe unirse de manera selectiva a un soporte sólido que
contenga Ni si la proteína A está actuando en cis en el extracto
S30-T7.
En las dos construcciones de estos plásmidos, la
construcción del gen A está bajo el control del promotor
\diameter10 del fago T7. Después de la traducción se determinó el
grado de unión a una columna que contiene Ni.
Un microgramo del DNA del plásmido pEE709 y del
plásmido pEE711 respectivamente se añadieron al kit del
extracto de transcripción/traducción acopladas (20 \mul de
pre-mezcla para S30, 5 \mul de la mezcla de
aminoácidos y 15 \mul del sistema del extracto S30 de T7 en E.
coli para DNA circular, (Promega, EE.UU.). Se dejó que la
transcripción/traducción tuviera lugar durante 60 minutos a 37ºC. La
mezcla que contiene el extracto se diluyó 12 veces en tampón de
lavado (Qiagen; Tampón 11 - fosfato sódico 50 mM pH 8,0, NaCl 300
mM, imidazol 20 mM, PMSF 1 mM) y se sometió a una selección con Ni
mediante adición a una columna para centrifugación que contiene
Ni-NTA (Qiagen, Alemania) equilibrada con el Tampón
1 (fosfato sódico 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 20 mM) en
condiciones no desnaturalizantes. El lavado se realizó tres veces
con 600 \mul de Tampón 11 y la elución se realizó dos veces con
250 \mul de Tampón 111 (fosfato sódico 50 mM pH 8,0, NaCl 300 mM,
imidazol 250 mM) según lo recomendado por el fabricante (véase el
protocolo del kit Ni-NTA Spin, Qiagen,
Alemania, primavera de 1994). Se utilizó una centrífuga de mesa
estándar para centrifugar las columnas que contienen Ni durante 2
minutos a 2.000 rpm durante los lavados y la elución. Células
competentes JM109 de alta eficiencia (Promega, EE.UU.) se
transformaron con una porción del eluyente y se les asignó una
puntuación con respecto a las colonias resistentes a ampicilina. Los
plásmidos de las colonias individuales se aislaron y se caracterizó
su tipo mediante electroforesis en gel de agarosa.
Para determinar la distribución (proporción) de
los tipos de plásmido en el eluyente, la presencia de los plásmidos
se midió mediante la transformación de la cepa JM 109 (Promega) con
respecto a la resistencia a amp. Se escogieron las colonias y se
analizaron con respecto al tipo de plásmido que presentaban
(diferenciados por tamaño) después de la extracción de los plásmidos
seguida de electroforesis en gel de agarosa. También se determinó la
proporción de pEE711 (His::A) con respecto a pEE709 (A) en ausencia
de la selección en la columna que contiene Ni.
Los resultados que se obtuvieron se muestran en
la Tabla de abajo:
\begin{minipage}[t]{47mm} Proporción de plásmidos que portan His:A/A en ausencia de la selección con Ni\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{47mm} Proporción de plásmidos que portan His:A/A después de la selección con Ni (media de 4 experimentos)\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{48mm} Enriquecimiento del plásmido que porta His:A en comparación con el plásmido que porta A después de la selección con Ni\end{minipage} |
0,7 | 9,3 | 13,3 |
Experimento
2
En el segundo experimento, dos nuevas
construcciones de plásmidos, pEN21 (una construcción que porta el
gen A con un gen de resistencia a amp, véase la Figura 1) y pEN24
(una construcción que porta His::gen A con una etiqueta de seis
residuos de histidina y un gen de resistencia a kanamicina, véase la
Figura 1) se sometieron al mismo tipo de experimento que el anterior
experimento 1, con las modificaciones que se indican en la sección
de materiales y métodos más adelante. Utilizando esta resistencia
diferencial a antibióticos es posible asignar una puntuación a los
tipos individuales de plásmidos directamente como colonias
bacterianas.
Los plásmidos pEN21 y pEN24 derivan de pET21a y
de pET24a (Novagen Inc. EE.UU.). Los vectores pET21a y pET24a
difieren únicamente su marcador seleccionable (resistencia a
ampicilina y a kanamicina respectivamente). Los plásmidos pEN21 y
pEN24 se construyeron mediante cortes de restricción de pEE709 y
pEE711 con XbaI y BlpI que corta OUT OF del gen A y de regiones
flanqueantes. pET21a y pET24a se cortaron con las mismas enzimas de
restricción. Los fragmentos que portan el gen A y fragmentos de los
nuevos vectores se aislaron en un gel de agarosa después de una
electroforesis, mediante el uso de columnas SpinBind (FMC).
El fragmento que porta A procedente de pEE709 se clonó en el vector
pET21a y el fragmento que porta His-A se clonó en el
vector pET24a.
Los plásmidos se incubaron durante 30 minutos en
los extractos S30 y a los tipos de plásmidos se les asignó una
puntuación mediante su resistencia diferencial a antibióticos
utilizando placas con ampicilina (pEN21) y kanamicina (pEN24)
después de la transformación de la cepa BK2118 de E. coli por
electroporación. El tampón 11 se modificó en este caso para que
contuviera imidazol 1 mM en lugar de imidazol 20 mM y se omitió el
inhibidor de proteasas PMSF, y se denominó tampón 11*). La columna
para centrifugación que contiene Ni-NTA se equilibró
con tampón de lavado (Tampón 11*, condiciones no desnaturalizantes).
Los lavados se realizaron tres veces con 600 \mul de Tampón 11* y
la elución se realizó dos veces con 250 \mul de Tampón 111 de la
manera recomendada por el fabricante (véase el protocolo del kit
Ni-NTA Spin, Qiagen, Alemania, primavera de
1994). Una mezcla de los plásmidos, de cantidades iguales de DNA de
pEN21 y pEN24, que no se había expuestos al extracto S30, se sometió
a la selección con Ni como control.
Los resultados se muestran en la Tabla que viene
a continuación.
\begin{minipage}[t]{47mm} Proporción de los plásmidos que portan His:A/A en el extracto antes de la selección con Ni (media de 10 experimentos)\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{47mm} Proporción de los plásmidos que portan His:A/A después de la selección con Ni (media de 10 experimentos)\end{minipage} | \begin{minipage}[t]{48mm} Enriquecimiento del plásmido que porta His:A en comparación con el plásmido que porta A después de la selección con Ni\end{minipage} |
0,5 | 3,4 | 6,8 |
En el caso en el que el extracto S30 se omitió y
la mezcla de plásmidos puros se sometió a la columna que contiene
Ni, no se observó enriquecimiento.
Como era de esperar, en todos los experimentos la
proporción de los plásmidos His:A/A en ausencia de la selección con
Ni fue aproximadamente 1. En contraste, la proporción de los
plásmidos His::A (A después de la selección con Ni (aproximadamente
9,3 y 3,4) produjo un enriquecimiento de los plásmidos His::A de
aproximadamente 13 y 7 respectivamente. Para determinar si estas
cifras demuestran una eficiente acción en cis de la proteína A de P2
etiquetada con HIS in vitro, es necesario comparar estos
valores de enriquecimiento con el enriquecimiento que podría
obtenerse teóricamente usando las condiciones experimentales
anteriormente empleadas. Para permitir hacer una comparación de los
datos experimentales con los valores teóricos, se midió el fondo
inespecífico en las fracciones eluyentes y se estimó la cantidad de
His::A sintetizada en la reacción de transcripción/traducción. El
fondo inespecífico que queda en las muestras se midió realizando una
selección en una columna que contiene níquel sobre los plásmidos sin
traducción en el lisado de E. coli. Un tercio del eluyente se
utilizó para transformar E. coli y se hizo el recuento de las
colonias resultantes. Usando la eficiencia de transformación medida
en las células de E. coli utilizadas, se calculó luego que el
eluyente contiene 0,3 fmoles de cada uno de los plásmidos en
ausencia de proteína A de P2 etiquetada con His.
Se estima que aproximadamente 5 fmoles (3 x
10^{9} moléculas) de proteína A se sintetizaron en la reacción
estándar. Suponiendo por lo tanto que todas las moléculas de His::A
sintetizadas estaban unidas a una molécula de DNA codificador, el
enriquecimiento obtenido sería (5 + 0,3)/0,3 = 18. El
enriquecimiento medio obtenido en los dos experimentos fue (13 +
7)/2 = 10. Por lo tanto, se interpreta que estos resultados indican
que la proteína A de P2 es capaz de actuar eficientemente en cis
in vitro, así como de presentar una extensión de seis
histidinas fusionadas justo en su extremo
N-terminal. A pesar de la escasa eficiencia de la
traducción en los presentes experimentos, se espera que se puede
obtener una biblioteca de 10^{12} miembros. Se prevé además que
lavados adicionales o más enérgicos mejorarán el enriquecimiento,
ayudando con ello a la producción de las bibliotecas de la
invención.
Experimento
5
Se prepararon moléculas de DNA para ser
utilizadas en la expresión de una biblioteca de péptidos de la
invención.
Se prepararon moléculas de DNA para ser
utilizadas en la expresión de una biblioteca de presentación de
péptidos in vitro, por medio de la amplificación del gen A
procedente del plásmido pEN21 linearizado (véase la Figura 1 y el
Ejemplo 4) usando los siguientes cebadores:
[144 nucleótidos, con una región de
30 bases aleatorizadas y un sitio único XbaI (letras minúsculas),
que corresponde al cebador B del Ejemplo 2 con la adición de 9
nucleótidos en
5'].
[Cebador de 40 bases,
complementario al área en dirección aguas arriba del plásmido pEN21,
que cubre el promotor de T7 así como bases en dirección aguas arriba
del promotor de T7, que corresponde al cebador C del Ejemplo 2 con
la adición de 15 nucleótidos en
5'].
D: 5' CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG 3'
[Cebador de 21 bases,
complementario a una secuencia en dirección aguas abajo del
terminador de T7, y que corresponde al cebador D del Ejemplo
2].
Los cebadores se sintetizaron en un sintetizador
de DNA/RNA Applied Biosystems 394 y se comprobaron mediante
electroforesis en gel de poliacrilamida. El cebador de la biblioteca
manifestó heterogeneidad en el gel debido a su naturaleza
aleatorizada.
Los cebadores B y D se usaron para preparar las
moléculas de DNA de la biblioteca en una reacción de PCR (realizada
de manera similar a la reacción de PCR descrita en el Ejemplo 2)
usando 5 \mul de tampón para polimerasa (Tampón Vent pol. 10X,
New England Biolabs), 50 pmoles del cebador B, 20 pmoles del
cebador D, 10 ng de DNA molde (pEN21), 1 \mul de mezcla de los
dNTP (10 mM, New England Biolabs), 1 \mul de Deep Vent
polymerase (New England Biolabs), todo ello en un volumen
total de 50 \mul, con un arranque en caliente a 94ºC durante 5
minutos, una temperatura de reasociación de 55ºC durante 30 segundos
(reasociaciones posteriores a 58ºC durante 2 minutos), una
temperatura de polimerización de 74ºC durante 2 minutos
(polimerizaciones posteriores a 74ºC durante 7 minutos) durante 25
rondas.
El cebador C se usa para amplificar de nuevo la
biblioteca (y retirar las moléculas de los heterodúplex) en ausencia
del cebador B de la biblioteca. Es aconsejable retirar el cebador B
mediante purificación antes de esta etapa de amplificación.
Se produjo un módulo de presentación de DNA de
aproximadamente 3.000 pares de bases con una secuencia aleatorizada
de 30 bases en el extremo 5' del gen A (detrás del codón de
iniciación ATG). El producto de PCR que constituye la biblioteca se
muestra en la Figura 2.
Claims (18)
1. Un método para producir una biblioteca de
expresión de péptidos o proteínas, que presenta una población
diversa de péptidos o proteínas, en la que los péptidos o proteínas
están asociados de manera específica con el DNA que los codifica a
través de uniones covalentes proteína:DNA, comprendiendo dicho
método al menos las etapas de:
1) preparar una biblioteca genética amplificable
de moléculas de DNA que contienen:
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos se une de manera específica a la secuencia que la codifica a través de uniones covalentes proteína:DNA (resto de unión), y
- (ii)
- una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos que va a ser presentada (resto de presentación), y
2) expresar la biblioteca genética así formada,
en la que dicha molécula de DNA cuando se expresa produce un
producto resultante de la traducción que contiene el resto de
presentación y el resto de unión, y en la que dicha molécula de DNA
contiene al menos un sitio de unión para el resto de unión.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que
la expresión del material genético es una expresión celular in
vitro con un único miembro de la biblioteca, opcionalmente
presente en más de una copia, expresado por una célula hospedadora o
un organismo hospedador.
3. Un método según la reivindicación 1, en el que
dicha secuencia de aminoácidos que se une de manera específica a la
secuencia que la codifica, es una proteína que actúa en cis, que
interacciona in vitro con la secuencia de DNA que la
codifica y que establece un enlace covalente con su propio DNA
molde, y la expresión del material genético es una expresión
celular in vitro con al menos un único miembro de la
biblioteca, opcionalmente presente en más de una copia, expresado
por célula hospedadora u organismo hospedador.
4. Un método según la reivindicación 1, en el que
dicha secuencia de aminoácidos que se une a la secuencia que la
codifica, deriva de una proteína que actúa en cis, que interacciona
in vitro con la secuencia de DNA que la codifica y que
establece un enlace covalente con su propio DNA molde, y la
expresión del material genético es una expresión in vitro en
un extracto libre de células.
5. Un método según la reivindicación 3 ó 4, en el
que dicha proteína que actúa en cis es la proteína A del
bacteriófago P2 (P2 A).
6. Un método según la reivindicación 4 ó 5, en el
que dicha expresión se realiza en presencia de un oligonucleótido
con desapareamientos que se hibrida con el DNA adyacente al sitio
de unión por ambos lados pero que no se hibrida en la región que
corresponde al sitio de unión.
7. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 6, en el que dicha secuencia de aminoácidos
que va a ser presentada tiene hasta 40 residuos de aminoácidos.
8. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 7, en el que dicha secuencia de aminoácidos
que va a ser presentada se genera por clonación, o comprende
fragmentos de DNA procedentes de una clonación.
9. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 8, en el que dicho resto de unión se
modifica de manera que el resto de unión queda unido covalentemente
a dicho DNA codificador.
10. Un método según la reivindicación 9, en el
que dicho resto de unión deriva de la proteína A del bacteriófago P2
(P2 A), que se ha modificado sustituyendo la tirosina situada en la
posición del aminoácido 450 con fenilalanina.
11. Una biblioteca de expresión de péptidos in
vitro, producida conforme al método de una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 10.
12. Una molécula de DNA que contiene una
secuencia de DNA que codifica un péptido o una proteína para su
expresión en una biblioteca conforme a la reivindicación 11, que
contiene:
(i) una secuencia de nucleótidos que codifica una
secuencia de aminoácidos, en la que la secuencia de aminoácidos se
une de manera específica a la secuencia que la codifica a través de
uniones covalentes proteína:DNA (resto de unión), y
(ii) una secuencia de nucleótidos que codifica
una secuencia de aminoácidos que va a ser presentada (resto de
presentación), en la que dicha molécula de DNA cuando se expresa
produce un producto de la traducción que contiene el resto de
presentación y el resto de unión, y en la que dicha molécula de DNA
contiene al menos un sitio de unión para el resto de unión.
13. Un vector de DNA que contiene una secuencia
de DNA según la reivindicación 12.
14. Un método para identificar y/o purificar un
miembro de una biblioteca que exhibe propiedades deseadas, en una
biblioteca de expresión de péptidos o proteínas como la definida en
la reivindicación 11, que comprende al menos las etapas de a)
someter a escrutinio una biblioteca como la definida en la
reivindicación 11, y b) seleccionar y aislar el miembro relevante
de la biblioteca.
15. Un método para identificar un péptido o una
proteína de unión específica a una diana, comprendiendo dicho método
al menos las etapas de a) someter a escrutinio una biblioteca según
la reivindicación 11 con moléculas diana, b) seleccionar y aislar un
miembro de la biblioteca que se une a dicha molécula diana, y c)
aislar el péptido o la proteína que se une de manera específica a
dicha molécula diana.
16. Un método según la reivindicación 15, en el
que de manera adicional se aísla el DNA que expresa el péptido o la
proteína que se une de manera específica a dicha molécula
diana.
17. Un método de ensayo para determinar la
presencia de una molécula diana en una muestra, comprendiendo dicho
método (a) poner en contacto dicha muestra con una sonda molecular
que comprende (i) un resto de unión a la diana contenido en un
péptido o en una proteína, capaz de unirse de manera selectiva a
dicha molécula diana, que está unido al DNA codificador, el resto
de DNA, seleccionado en la biblioteca según la reivindicación 11,
y (ii) un resto de reporte; y (b) determinar directa o
indirectamente diana unida a la sonda.
18. Una sonda molecular bifuncional para usar en
el método de ensayo según la reivindicación 17, que comprende (i) un
resto de un péptido o de una proteína capaz de unirse
selectivamente a una molécula diana, que está unido al DNA
codificador, el resto de DNA, seleccionado en la biblioteca según
la reivindicación 11, y (ii) un resto de reporte.
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