NO322653B1 - Fremgangsmate for femstilling av et in vitro peptid- eller proteinekspresjonsbibliotek, peptid- eller proteinekspresjonsbibliotek, fremgangsmate for a identifisere et malmolekyl, samt bifunksjonell molekylaer probe for anvendelse i en slik fremgangsmate. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåter for å fremstille et in vitro- peptid eller proteinekspresjonsbiblio-tek som oppviser en mangfoldig populasjon av peptider eller proteiner som angitt i krav 1. Oppfinnelsen omfatter også et DNA-molekyl inneholdende en DNA-sekvens som koder for et peptid eller protein for ekspresjon i et bibliotek som angitt i krav 12 for å identifisere peptider eller proteiner som oppviser ønskede egenskaper. Oppfinnelsen angår også fremgangsmåter for identifisering og/eller opprensing av en bibliotekdel som oppviser ønskede egenskaper som angitt i krav 14 og 15 samt bifunksjonelle molekylære prober som angitt i krav 18.

På samme måte som biblioteker skaffer leseren en stor samling av en mengde bøker som kan hentes tilbake, således gir også et molekylbibliotek en referansebank av molekyler som kan bli valgt ut og skaffet tilbake. Slike bibliotek kan inneholde genetisk materiale, for eksempel fragmenter av DNA-sekvenser i en plasmid eller bakteriofag, eller uttrykker peptider eller proteiner kodet av det genetiske materiale i biblioteket. I sistnevnte tilfelle for å tillate utvelgelse av den relevante del av biblioteket, må det uttrykte peptid eller protein nødvendigvis assosiere med det genetiske materiale som koder for dette. For tiden blir dette oppnådd på et antall forskjellige måter.

For det første kan peptider bli oppvist på ytteroverflåtene av genetiske pakker så som celler, virus og sporer, spesielt bakteriofag, bakterier eller gjær som fuserte deler av et oppvisningsprotein. Den invariante del av oppvisningsproteinet i et spesielt bibliotek blir valgt til å ha de karakteristika at det blir uttrykt på overflaten av den genetiske pakke, for eksempel en celle eller et virion, og er stabilt assosiert med cellen eller virionet slik at de genetiske pakker uttrykker målproteinet eller peptidet som skal bli gjenvunnet.

Smith og Scott (Smith (1985), Science, 228, s. 1315-6; Scott og Smith (1990), Science, 249, s. 386-390) beskriver bruken av bakteriofag Fd som en oppvisningsvektor for en tilfeldig sekvens av peptider som er eksponert på virion-overflaten. US-A-5223409 til Ladner uttrykker familier av potensielle bindingsdomener på ytteroverflaten av bakterielle celler eller bakteriofager. Andre forskere i mange la-boratorier har på lignende måte brukt slike genetiske pakker for å danne ekspresjonsbibliotek. En mengde av dette arbeid har blitt utført på filamentøse fager lik M13, som har vist seg å være et robust og relativt lett system å håndtere.

Imidlertid lider denne teknologi fremdeles av visse ulem-per, lik tiden og anstrengelsene som er nødvendig for å danne et bibliotek som er stort nok til å gi nok varianter for utvelgelse. I tillegg må de genetiske pakker som benyttes til nå bli opprettholdt i levedyktig tilstand for å tillate både ekspresjon av det kodede proteinet eller peptid og også videreføring av den genetiske pakke under på-følgende utvelgelsestrinn. Videre må det aktuelle polypeptid være kompatibelt med eksport fra organismen og sammen-setning av fusjonspartneren i den passende struktur på organismen. I tillegg, siden proteinsyntese inntreffer in vivo, kan kun slike modifikasjoner som kan bli utført av translasjonsverten bli inkorporert i den aktuelle sekvens.

Tidén som er nødvendig ved videreføring av utvalgte genetiske pakker i løpet av utvelgelsesfremgangsmåten presen-terer også en signifikant tidsbyrde for forskeren. Videre er det nødvendig i det fortiden brukte in vivo-peptid oppvisningsbibliotek å transfektere det genetiske materiale av biblioteket inn i en vertsorganisme for å tillate replikasjon og ekspresjon og transformering er kjent for å være en ineffektiv prosedyre som følgelig reduserer antallet deler som kan være til stede i et ekspresjonsbibliotek.

Nyligere har in vitro- ekspresjonsbibliotek blitt beskrevet som overvinner enkelte av de ovennevnte begrensninger for in vivo- ekspresjonsbibliotek. For eksempel har polysomopp-visning blitt beskrevet hvor et korrekt foldet fullstendig protein som bærer forskjellige oppvisningspeptider i forskjellige deler av biblioteket samt dets kodende mRNA begge forblir bundet til ribosomene. Dette blir oppnådd ved å sikre at proteinkjeden ikke forlater ribosomet og at mRNA ikke forlater ribosomet (det vil si det finnes intet stopp-kodon og ribosomene er stabilisert). Slike ekspresjonsbibliotek er målet for flere patentsøknader, for eksempel som publisert i WO92/02536 (The Regents of the University of Colorado), WO93/03172 (University Research Corporation) og WO91/05058 (Kawasaki).

Polysombibliotek lider av visse begrensninger. RNA er meget følsom for RNAser og er således vanskelig å arbeide med. For å vedlikeholde festing til ribosomene kreves stadig tilstedeværelse av magnesiumioner som danner problemer for utvelgelse og andre trinn hvor dette alltid må være til stede. Viktigere er at alle trinn etter translasjonen, spesielt i løpet av utvelgelse og seleksjonsprosedyren, ikke kan bli utført med kraftige reagenser etter som poly-som:RNA-bindingen må bli opprettholdt.

Ett forskjellig in vitro-ekspresjonsbibliotek som har blitt antydet involverer bruken av DNA-bindende proteiner. Disse proteiner blir uttrykt i et bakterium eller annen membran-begrenset organisme ved å bruke et plasmid inneholdende et bindingssete for DNA-bindende protein. Polypeptidet og den kodende nukleinsyre er operativt forbundet siden proteinet transcient assosierer med den kodende nukleinsyre. Biblioteksekvenser blir introdusert i polypeptidet uten å påvirke bindingen til DNA ved innsetning av den oppvisende enhet for å gi et fusjonsprotein. Slike bibliotek er beskrevet i for eksempel den internasjonale patentsøknad publisert som WO93/08278 (Affymax Technologies NV).

Selv om slike in vitro-bibliotek har den fordel at utvelgelse kan bli utført in vitro, siden de kodede fusjonspro-teiner ikke enestående gjenkjenner sitt eget kodende DNA (men i stedet gjenkjenner og assosierer med sitt bindende sete på DNA uansett hvor dette opptrer), må i det minste translasjonen bli utført in vivo med kun en enkelt biblio-teksdel per vertscelle eller organisme. Dette begrenser al-vorlig kompleksiteten som biblioteket kan oppnå. Således er enkelte avbegrensningene av in vivo-ekspresjonsbibliotek så som ineffektiviteten av transformasjonen aktuelle. Videre er assosiasjonen mellom DNA-bindingsproteinene og deres bindingssete på DNA ikke kovalent og det er således en tidsforsinkelse assosiert med interaksjonen som kan være i størrelsesorden på kun 30 minutter. Således må tiden som det tar å utføre utvelgelsestrinnene etter translasjon bli holdt så lav som mulig, og utvelgelsesbetingelsene må bli valgt slik at forsinkelsen ikke blir ytterligere øket. Således eksisterer fremdeles restriktive begrensninger med ekspresjonsbibliotek ifølge tidligere teknikk.

Det har nå overraskende blitt funnet at et peptid- eller protein-ekspresjonsbibliotek kan bli dannet hvor de spesifikke translasjonsprodukter av det genetiske materiale i biblioteket er direkte og kovalent bundet til den kodende DNA-sekvens. Dette fjerner således bruken av cellulære genetiske pakker med sine iboende begrensninger i løpet av konstruksjonen og utvelgelsen av ekspresjonsbiblioteket. Dette fremskritt tillater rask utvelgelse av ønskede peptider eller proteiner med cykler av utvelgelse, DNA-amplifikasjon og ekspresjon. Selv om DNA-amplifikasjon kan innbefatte cellereplikasjon, kan dette i stedet lett og raskt bli utført ved å bruke standard amplifikasjonsteknikker, for eksempel polymerase-kjedereaksjon (PCR) som vil bli beskrevet i større detalj nedenfor.

Kovalente DNArproteinekspresjonsbibliotek ifølge oppfinnelsen blir gjort mulig ved å innbefatte en sekvens inne i det genetiske materialet som koder for et protein eller en del derav som binder kovalent til sitt eget kodende DNA og som innbefatter eller er overlappende til eller hosliggende til den kodende sekvens for peptidet eller proteinet som skal oppvises. Når dette uttrykkes, danner det DNA-bindende protein og det oppvisende peptid eller protein seg som et enkelt polypeptid som blir kovalent festet til det kodende DNA. Det vil bli forstått at slik binding kun vil være mulig dersom det genetiske materialet og dets translasjonsprodukt er tilgjengelig for hverandre. Således bør det genetiske materiale fortrinnsvis ikke inneholde sekvenser som effektivt koder for peptider eller proteiner som kan inn-virke på protein:DNA-interaksjon.

Videre, slik det vil bli forstått av beskrivelsen nedenfor, vil i visse tilfeller det DNA-bindende protein spalte DNA til hvilket det blir bundet. Under disse forhold, avhengig av konstruksjonen av DNA-molekylene av biblioteket og plasseringen av biblioteksekvensene i disse, kan det DNA-bindende protein bli kovalent bundet til et DNA-fragment som ikke inneholder biblioteksekvensene grunnet spaltning av fragmentet fra resten av DNA-molekylet. Imidlertid, forutsatt at hybridiserende betingelser blir brukt, vil templatkjeden beholde de komplementære to kodende kjedefragmenter og således forblir det DNA-bindende protein assosiert med sitt kodende DNA via mellomproduktet av en kovalent DNA:proteinbinding. Referanser til en "direkte" binding som brukt heri er ment å innbefatte denne mulighet. Videre er det klart i et slik tilfelle at det DNA-bindende protein er bundet til et fragment av sitt kodende DNA. Denne mulighet er imidlertid omfattet av uttrykket "spesifikt assosiert med det DNA som koder for dem" som benyttet heri.

Således betraktet fra et aspekt fremskaffer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å fremstille et peptid-eller protein-ekspresjonsbibliotek som oppviser en stor populasjon av peptider eller proteiner, hvor peptidene eller proteinene er spesifikt assosiert med det DNA som koder for dem via kovalent protein:DNA-binding hvor nevnte fremgangsmåte omfatter minst de følgende trinn: 1) å fremstille et amplifiserbart genetisk bibliotek av DNA-molekyler som inneholder 1) en nukleotidsekvens som koder for en aminosyresekvens som bindes spesifikt til nevnte kodende sekvens via kovalent protein:DNA-binding (bindende enhet) 2) en sekvens som koder for en aminosyresekvens for oppvisning (oppvisende enhet) og minst ett bindingssete for den bindende enhet og 2) uttrykke det genetiske bibliotek således dannet, hvor nevnte DNA-molekyl, når uttrykt, gir et translasjonsprodukt som inneholder oppvisningsenheten og den bindende enhet, og hvor nevnte DNA-molekyl har minst et bindingssete for den bindende enhet.

Følgelig kan dannelsen av et antall forskjellige translasjonsprodukter som binder kovalent til sitt spesifikke kodende genetiske materiale bli oppnådd. Dette funn har blitt brukt for å utvikle peptid- eller protein-ekspresjonsbiblioteket beskrevet heri. Dette bibliotek er forskjellig fra tidligere in vivo-bibliotek som bruker celler eller encel-lede organismer til å uttrykke peptidene ettersom peptidet eller proteinet for oppvisning blir presentert direkte på det genetiske materialet som koder for det og ikke på overflaten av en membran eller en cellevegg.

Videre kan monovalent eller bivalent visning generelt bli oppnådd og denne metode tillater ekspresjon av ekstremt store bibliotekdiversiteter. I tillegg, når PCR-amplifika-sjonen av det genetiske materiale som koder for en bibliotekdel som oppviser de ønskede egenskaper skal utføres, kan dette bli oppnådd in situ på DNA av denne del av peptidbiblioteket ettersom dette DNA fritt er tilgjengelig for å binde passende primere og ikke krever tidligere ekstraksjon eller eluering fra materialene benyttet under dets seleksjon eller ikke-genetiske deler av peptid eller protein bibliotekkonjugatet. Dette forenkler og fremskynder i ve-sentlig grad fremgangsmåten. Videre er en hard behandling, for eksempel lav pH, som vanligvis er nødvendig for eluering av det genetiske materiale fra målbindende celler eller virioner før amplifikasjon ikke nødvendig.

I tillegg, i motsetning til in vitro-ekspresjonsbiblioteket ifølge tidligere teknikk, betyr den kovalente binding mellom DNA og det kodede polypeptid, at det oppviste peptid eller protein ikke vil bli frigjort fra DNA ved ioniske tilstander og oppløsningsmidler som ville ødelegge bakteriofager, DNA-bindende protein:DNA-interaksjoner eller ribo-somer. Videre tillater kovalent binding seleksjon å bli ut-ført i et bredere temperaturområde, over lengere og med mellomliggende frysetrinn. Således er seleksjon mye lettere så vel som potensielt mye kraftigere.

Som benyttet heri, er uttrykket "binder spesifikt til nevnte kodende sekvens" ment å indikere at aminosyresekvensen, selv om den ikke enestående behøver å gjenkjenne sitt kodende DNA om isolert og introdusert til en serie av forskjellige DNA-sekvenser, vil binde til sin egen kodende sekvens når den fremstilles fra sitt kodende DNA ved transkripsjon og translasjon. Dette kan spesifikt bli oppnådd på et antall måter som beskrevet nedenfor. Som referert til heri, er det "kodende" DNA ment å bety det DNA-molekyl som, når uttrykt, gir et translasjonsprodukt som inneholder det oppviste protein eller peptid og den DNA-bindende enhet. Området av DNA til hvilket den DNA-bindende enhet binder seg, ligger imidlertid ikke nødvendigvis innenfor det området som koder for de oppvisende eller bindende enheter, men er enkelt til stede på samme DNA-molekyl.

Proteiner som samvirker in vitro med DNA-sekvensen som koder for disse er kjent heri som "cis-virkende proteiner"

(også referert til som cis-proteiner) og etablerer en kovalent binding til sitt eget DNA-templat. "Pseudo-cis-virkende proteiner" er vurdert heri til å være slike proteiner som virker på cis-måte (det vil si, binder til sitt kodende DNA) under passende betingelser.

Ett pseudo-cis peptid- eller protein-ekspresjonsbibliotek kan bli dannet ved bruken av en DNA-bindende enhet som binder kovalent til det DNA som koder for dette under passende betingelser. For eksempel kan dette bli oppnådd ved å ut-føre translasjonstrinnet innenfor grensen av en celle eller organisme hvori hver celle inneholder DNA som koder for kun en enkelt bibliotekdel.

I dette tilfelle, siden den DNA-bindende enhet kun vil ha et enkelt gjenkjennelses- og festende sete tilfeldig (selv om det kan være mer enn en kopi av DNA), vil den binde til sin egen kodende DNA (pseudo-cis virkning). Dette gir således en operasjonell tilknytning mellom det kodende DNA og det uttrykte peptid eller protein festet via en kovalent binding. Som benyttet heri innbefatter "festende sete" gjenkjennelsessetet hvorved den DNA-bindende enhet assosierer før kovalent binding, det vil si dette uttrykk refere-rer til nukleotidsekvensen som er nødvendig for å oppnå kovalent binding av det DNA-bindende protein.

Således fremskaffer foreliggende oppfinnelse i et foretrukket aspekt en fremgangsmåte for å fremskaffe et peptid- eller protein-ekspresjonsbibliotek som definert ovenfor hvor ekspresjonen av det genetiske materiale blir utført in vivo med en enkel bibliotekdel som eventuelt er til stede i mer enn en kopi uttrykt per vertscelle eller organisme.

Passende pseudo-cis proteiner er ethvert protein som gjenkjenner spesifikke bindingsseter (festende seter) på DNA og som resulterer i en kovalent DNA:proteinbinding. Eksempler innbefatter terminale proteiner, replikasjonsproteiner og andre igangsettende proteiner. Vidre kan funksjonelt-ekvivalente fragmenter, varianter eller derivater av kjente kovalente DNA-bindende proteiner bli brukt. Det vil bli forstått at cis-bindende proteiner beskrevet nedenfor også kan bli brukt i den ovenfor beskrevne metode.

Riktige cis-virkende proteiner gir spesielle fordeler ved

fremstilling av in vitro-ekspresjonsbibliotek. Eksempler på cis-virkende proteiner innbefatter slike som er involvert i å sette i gang replikasjon. Rullende sirkeltype replikasjon blir vanlig brukt blant sirkulære replikasjoner av forskjellig avstamning, for eksempel enkeltkjedete (ss) og dobbeltkjedete (ds) DNA-fager (Van Mansfield et al. (1984), Adv. Exp. Med. Biol., 179, s. 221-230; Baas & Jansz (1988), Cur. Topics Microbiol. Immunol., 136, s. 31-70, ssDNA plasmider (Gruss & Ehrlich (1989), Microbiol. Rev., 53, s. 231-241; Novick (1989), Ann. Rev. Microbiol., 43, s. 537-565), ssDNA plantevirus (Stenger et al. (1991), PNAS, 88, s. 8029-8033; Saunders et al., (1991), Nucl. Acids Res., 19, s. 2325-2330), ss og ds DNA animalske virus (Berns

(1990), Microbiol. Rev. 54, s. 316-329; Dasgupta et al.

(1992), J. Mol. Biol. 228, s. 1-6) og ds DNA bakterielle plasmider (Kham, 1997, Microbiol. Molec. Biol. Rev., 61 (4), s. 445-455). I de studerte systemer har initiserings-proteinene en "nick"-lukkende og topoisomeraselignende aktivitet. Det best studerte system er det til ssDNA fagen

<j)X174, hvor A-protein "nick-ene", ori-setet og den virale kjede av den replikative form danner en kovalent binding til den 5'-ende av den spaltede kjede. Den 3'-ende blir deretter forlenget av vertspolymerasen og erstatter den 5'-virale kjede og etter en replikasjonsrunde er den parentale virale kjede religert og A-proteinet blir overført til av-komststammen for å sette i gang en ny replikasjonsrunde (Baas & Jansz, 1988, supra). P2 A-proteinet har også blitt funnet å spalte ori-setet i det kodende området av A-genet ved et sete som mangler sekundærstruktur og binder til den 5'-ede ende av den spaltende kjede (Liu & Haggård-Ljungquist (1994), Nucl. Acids Res., 22, s. 5204-5210).

Denne cis-virkning har blitt rapportert å virke in vivo og således kan translasjonstrinnet bli utført in vivo, men med mer enn en enkel bibliotekdel som blir uttrykt på en celle før cellen blir ødelagt for å gi oppvisningsbiblioteket. Prosessen som tillater cis-proteinet å oppvise cis-virkning, til tross for tilstedeværelsen av andre passende bindingsseter på andre DNA-molekyler også inneholdt i cellen eller organismen, er ikke kjent selv om det har blitt antydet at kompartmentalisering inntreffer under translasjon eller at cis-proteinene ikke lett kan difundere i cellen.

Således i et mer foretrukket aspekt kan foreliggende oppfinnelse brukes for å danne et peptid- eller protein-eks-pres jonsbibliotek som definert ovenfor hvor nevnte aminosyresekvens som binder spesifikt til nevnte kodende sekvens er avledet fra et cis-virkende protein eller et funksjonelt ekvivalent fragment, derivat eller variant derav, og ekspresjon av det genetiske materialet blir utført in vivo med minst én bibliotekdel som eventuelt er til stede i mer enn en kopi uttrykt per vertscelle eller organisme.

Passende cis-virkende proteiner som forblir cis-virkende in vitro innbefatter familien av replikasjonsproteiner innbefattende P2A, som er relatert ved sekvens (fortrinnsvis oppvisende 60% sekvensidentitet, mer foretrukket 70, 80 eller 90%), organisasjon og replikasjonsmåte; så som ekvivalente proteiner fra fag 186 (Sivaprasad et al., 1990. J. Mol. Biol., 213, s. 449-463), HPl (Esposito et al., 1996, Nucl. Acids Res., 24, s. 2360-2368) og PSP3 (Bullas et al., 1991, Virology, 185, s. 918-921) og funksjonelt ekvivalente fragmenter, derivater og varianter derav. Cis-virkende proteiner som er cis-virkende in vivo oppviser lignende rullende sirkelreplikasjonsegenskaper og organisasjon som P2A. Slike proteiner innbefatter for eksempel A-proteinet av

<j)X174 som nevnt ovenfor. Passende pseudo-cis-proteiner er relatert til P2A, så som terminalproteiner, for eksempel fra forskjellige organismer.

Bruken av de ovennevnte bibliotek tillater en økning i di-versiteten i biblioteket og en reduksjon i signal til bak-grunnsstøyforholdet grunnet det lave antallet vertsceller eller organismer som er nødvendig i forhold til kjente in vivo- ekspresjonsbibliotek.

Cis-virkende proteiner har alltid blitt antatt kun å virke in vivo og en tilsvarende virkning in vitro har verken blitt antydet eller observert. Overraskende har det imidlertid blitt funnet at cis-virkningen blir opprettholdt selv når translasjon blir utført in vitro.

Slik det vil bli forstått, stammer flere fordeler fra dette funn. For det første har dannelsen av en kovalent binding flere fordeler som nevnt tidligere. Videre, siden de kodede proteiner er i stand til å finne sitt kodende DNA til tross for tilstedeværelsen av tilstøtende kjeder av DNA som oppviser et passende bindingssete, kan hele fremstillingen av biblioteket og dets utvelgelse bli utført in vitro. Dette reduserer radikalt tiden og kreftene som er involvert i dannelse og utvelgelse og mange av begrensningene hos in vivo-bibliotek blir unngått. For eksempel kan minst 12 timer bli spart hver runde av ekspresjon, utvelgelse og amplifikasjon. Siden vertsceller eller organismer kan sløyfes fullstendig, kan biblioteket ha opptil IO<12> forskjellige deler.

In vitro-translasjonen tillater inkorporering av mange ko-og posttranslasjonelle modifikasjoner (som kan bli foretatt kjemisk eller enzymatisk, i løpet av eller etter translasjonstrinnet), hvorav enkelte ikke tidligere var mulige når translasjonen ble utført in vivo. For eksempel kan fosfory-lering eller sulfatering, dannelse av disulfidbindinger, glycosylering eller isomerisering bli utført. (Disse trinn kunne også bli utført på bibliotekdeler når de blir uttrykt in vivo og så frigjort.) Disse reaksjoner kan bli utført in vitro ved å supplementere ekstraktet med enzymet som er ansvarlig for modifikasjonen. Ikke-naturlige aminosyrer kan også bli innført ved for eksempel kjemisk å tilføre et t-RNA med dette eller ved å modifisere aminosyren på et til-ført t-RNA.

Således, i et spesielt foretrukket aspekt, gir foreliggende oppfinnelse mulighet for å fremstille et peptid- eller protein-ekspresjonsbibliotek som definert ovenfor hvor nevnte aminosyresekvens som binder spesifikt til nevnte kodende sekvens er avledet fra et cis-virkende protein eller funksjonelt-ekvivalent fragment, derivat eller variant derav og ekspresjon av det genetiske materiale blir utført in vitro.

Som benyttet heri, angir "funksjonelt-ekvivalente" fragmenter, derivater og varianter peptider eller proteiner relatert til eller avledet fra et nativt protein som definert heri (for eksempel et cis-virkende protein), hvor aminosyresekvensen har blitt modifisert ved enkel eller multippel aminosyresubstitusjon, addisjon og/eller fjerning som alternativt eller i tillegg inkluderer aminosyrer som har blitt kjemisk modifisert, for eksempel ved deglycosylering eller glycosylering, men som ikke desto mindre opprettholder den ønskede funksjonalitet, for eksempel å oppvise cis-eller pseudo-cis DNA-bindende egenskaper. Passende kan slike derivater eller varianter ha 80 eller 90% sekvensidentitet med native protein hvorfra de er avledet. Funksjonelt-ekvivalente varianter innbefatter naturlige biologiske variasjoner (for eksempel alleliske varianter eller geografisk variasjon innenfor en art) og derivater fremstilt ved å bruke kjente teknikker. For eksempel kan funksjonelt-ekvivalente peptider eller proteiner bli fremstilt enten ved kjemisk syntese eller i rekombinant form ved å bruke kjente teknikker med seterettet mutagenese, tilfeldig mutagenese eller enzymatisk spaltning og/eller ligering av nukleinsyrer.

Det vil bli forstått at cis-virkende proteiner eller fragmenter, varianter eller derivater derav kan bli brukt for å danne bibliotek ifølge oppfinnelsen i henhold til metodene beskrevet for pseudo-cis-virkende proteiner som vil bli beskrevet i større detalj nedenfor.

Passende er cis-proteinene for anvendelse i fremgangsmåtene i henhold til oppfinnelsen avledet fra fag P2 DNA-replika-sjonsinitieringssystemet. P2 A-proteinet gjenkjenner en definert initiatorsekvens som ligger inne i P2A-genet og det nøyaktig samme DNA-molekyl som koder for dette (cis-virkning) og spalter spesifikt en av kjedene mens det danner en kovalent binding med en ende av de frie baser ved spalt-ningssetet (Liu & Haggård-Ljungquist, 1994, supra). Et slikt protein DNA-kompleks utgjør et genetiske konjugat som kan bli brukt for peptidoppvisningsformål. Sekvensen av P2 A-genet har blitt rapportert (Liu et al. (1993), J. Mol. Biol., 231, s. 361-374).

Det er kjent at P2A-proteinet kan tolerere aminosyreend-ringer (se for eksempel Liu et al., 1993, supra) og således kan oppvisningspeptider eller proteiner bli introdusert uten tap av funksjon. Egenskapen av cis-virkning av A tillater peptid eller protein bibliotekkonstruksjoner in vitro ved å utsette et bibliotek av DNA-templater (med sekvenser som koder for forskjellige hybrid A-peptider eller proteiner for oppvisning, en passende promoter for å transkribere A-genet og området til hvilket P2A binder seg) for et cellefritt koblet transkripsjons/translasjonstrinn. Dette resulterer i hybride A-peptider, eller proteiner som binder kovalent til sitt eget templat-DNA.

Hybrid A:DNA-konjugatene utgjør et in vitro-peptid- eller protein-bibliotek som oppviser de forskjellige hybrid A-peptider eller proteiner som kan bli utsatt for utvelgelse mot et mål eller undersøkt for en ønsket aktivitet. De spesifikke hybride A:DNA-konjugater som binder til målmaterialet eller oppviser en ønsket egenskap kan bli gjenvunnet hvor nødvendig, og det genetiske materialet kan så bli amplifikert ved for eksempel PCR, og utsatt for et koblet transkripsjon/translasjonstrinn i et cellefritt ekstrakt. Denne syklus kan så bli gjentatt om ønsket for å gi en in-dividuell hybrid A:DNA-klon. Dette kan bli overvåket ved DNA-sekvensering inntil et passende antall DNA-sekvenser blir dannet. Passende teknikker for utvelgelse er beskrevet i større detalj nedenfor.

Som benyttet heri i referanse til peptid- eller protein-ekspres jonsbiblioteket som oppviser en diverse populasjon av peptider eller proteiner, er uttrykket "peptid eller protein" ment å dekke en aminosyresekvens som inneholder minst en oppvisningssekvens (den oppvisende enhet) (som kan være inneholdt i overlapp med eller være distinkt fra sekvensen som binder til det kodende DNA), som blir variert i forskjellige deler av biblioteket og som kan bli utvalgt via passende seleksjonsprosedyrer. Hver ekspresjonsbiblio-tekdel inneholder også som del av det uttrykte polypeptid i en invariant sekvens (som kan være del eller alt av sekvensen) som er ansvarlig for binding av peptidet eller proteinet som stammer fra ekspresjon til det kodende DNA (den bindende enhet). Nødvendigvis blir både de bindende og oppvisende enheter uttrykt på et enkelt peptid eller protein.

Når den oppvisende enhet er større enn et peptid (og referert til heri som oppvisningsproteinet), er det sannsynlig at forskjellige aminosyrer av proteinet vil være invariante, så som når et protein blir brukt som et skaffeli, og at bibliotekdelene vil være forskjellige kun i visse områder i oppvisningsproteinet.

DNA-sekvensene som koder for peptidene eller proteinene for ekspresjon i bibliotek ifølge oppfinnelsen, inneholdende sekvenser som koder for de oppvisende og bindende enheter og minst ett festesete for den bindende enhet hvor nukleinsyremolekylene innbefatter molekyler med det genererte og/eller funksjonelt-ekvivalente sekvenser som angitt i krav 12, danner et ytterligere aspekt av oppfinnelsen. Funksjonelt-ekvivalente nukleinsyremolekyler innbefatter fragmenter derivater og varianter, for eksempel en i hovedsak homolog og hybridiserende sekvens som koder for peptider eller proteiner som definert heri med den nødvendige funksjonalitet, for eksempel cis-bindende virkning.

Med "i hovedsak homolog" menes sekvenser som oppviser minst 60%, fortrinnsvis minst 70 eller 80 % sekvenshomologi. Hybridiserende sekvenser innbefattet i omfanget av oppfinnelsen er slike som binder under ikke-stringente betingelser (6 X SSC/50% formamid ved romtemperatur) og vaskes under betingelser med lav stringens (2 X SSC, romtemperatur, mer foretrukket 2 X SSC, 42°C eller betingelser med høyere stringens, for eksempel 2 X SSC, 65°C (hvor SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumsitrat, pH 7,2), så vel som slike som, bortsett fra for degenerasjonen av koden ville hybridisere under de ovennevnte betingelser.

Det vil bli forstått at ved fremstillingen av et bibliotek av DNA-sekvenser (med assosierte kodede proteiner eller peptider), fremskaffer foreliggende oppfinnelse også et DNA-oppvisningsbibliotek. Således blir et bifunksjonelt bibliotek fremskaffet for seleksjon av deler basert på sine oppvisende peptid/protein eller DNA-enheter.

Oppfinnelsen blir passende utført ved å bruke P2 A-proteinet eller et funksjonelt-ekvivalent fragment, derivat eller variant derav som den bindende enhet. Den relevante nukleotidsekvens for binding av den DNA-bindende enhet må også bli plassert ved et egnet sete, selv om dette kan være beveget fra sin naturlig opptredende posisjon. I tilfelle med for eksempel P2A, bør minst sekvensen TCGGA, for eksempel i sekvensen GCGCCTCGGAGTCCTGTCAA, bli inkludert i det DNA som koder for peptidene eller proteinene av ekspresjonsbiblioteket eller et funksjonelt-ekvivalent fragment, derivat eller variant derav som blir gjenkjent av den DNA-bindende enhet og danner en kovalent binding med denne. Passende blir sekvensen som kode for den oppvisende enhet satt inn i, overlapper med eller er hosliggende sekvensen som koder for den N-terminale del av P2 A-proteinet.

DNA-molekylene benyttet for å danne biblioteket kan bli fremskaffet ved hjelp av både amplifikering og transkripsjon. Egnede DNA-molekyler med muligheter for amplifikering innbefatter dobbeltkjedet DNA med et replikasjonsstartpunkt, for eksempel celle-replikerende plasmider, som således kan replikere in vitro i for eksempel cellefrie ekstrakter, eller in vivo om til stede i vertsceller. Når DNA ikke er i stand til å cellereplikere, kan dette i passende tilfeller bli overvunnet ved å inkludere et replikasjonsstartpunkt. For eksempel binder visse proteiner beskrevet heri, så som P2A, til sitt eget replikasjonsstartpunkt. Dersom proteinet ikke blir frigjort fra startpunktet (så som når mutanter beskrevet heri blir brukt), blir replikasjonen av DNA-molekylet som inneholder det DNA-bindende en-hetsgen hemmet. I disse tilfeller kan et andre replikasjonsstartpunkt bli inkludert. Passende er nukleinsyremolekyler for å danne biblioteket i form av vektorer, plasmider eller lineære DNA.

Alternativt kan dette DNA bli amplifikert via teknisk behandling, for eksempel ved å utstyre dette DNA med passende seter for å binde primere for en amplifikasjonsreaksjon, for eksempel PCR, for å tillate amplifikering in vitro. Klart vil slike seter i de fleste tilfeller inherent være til stede i et hvert DNA-molekyl, slik at det passende valg av primere ville lette amplifikering.

Metoder for transkripsjon innbefatter plassering av en promoter-sekvens. Dersom et villtypegen eller en degenerert sekvens eller funksjonelt-ekvivalent fragment, derivat eller variant derav blir benyttet, kan promoteren være konstituitivt til stede. Om ikke, kan en induserbar eller ikke-induserbar promoter bli inkludert. I tilfeller hvor translasjonsproduktet ville inhibere transkripsjonen (så som når en mutant P2A blir benyttet som beskrevet heri), er det tilrådelig å bruke en induserbar promoter som kan bli aktivert kun i løpet av transkripsjon/translasjonstrinnet. Alternativt i et slikt tilfelle kan en ikke-induserbar promoter bli brukt dersom denne effektivt virker på en induserbar måte, eksempelvis ved meget lav transkripsjon under passende betingelser (for eksempel T7 i bakterielle verts-organismer inneholdende et regulert T7 polymerase-gen eller ved tilføring av en promoter ved et passende tidspunkt for eksempel ved viral infeksjon). Imidlertid dersom en ikke-induserbar promoter blir brukt i løpet av bibliotekutvel-geisen og translasjon skal bli utført i en bakteriell vertsorganisme, må et induserbart polymerasegen være til stede i bakterien eller innføres ved infeksjon.

Eksempler på passende induserbare promotere innbefatter AraB, lambda promoter (i celler som uttrykker en tempera-tursensitiv repressor, så som N4830-1), eller en TAC eller LAC promoter kombinert med en effektiv LAC 0 sekvens. Passende ikke-induserbare promotere innbefatter T7-promoteren eller SP6 eller T3-promotere. Promoteren bør være oppstrøms for polypeptidet som skal uttrykkes, men dette kan bli oppnådd dersom promoteren er nedstrøms ved sirkularisering av lineært DNA.

DNA-molekyler for bruk ved fremstilling av biblioteket må også nødvendigvis inneholde flere oppvisningspeptid eller proteinkodende sekvenser for å gi et bibliotek av forskjellige peptider eller proteiner for oppvisning. Slike forskjellige sekvenser kan bli innført ved for eksempel rando-misering som beskrevet i litteraturen ved å bruke randomiserte primersekvenser i PCR (Schmidt og Skerra (1993), Protein Engineering, 6, s. 109-122) som beskrevet i større detalj nedenfor. Randomiserte primersekvenser kan bli dannet ved å bruke standard kjemisk syntese med kommersielle DNA-syntetisatorer, eller kan bli innkjøpt kommersielt. Alternativt, spesielt hvor variasjon skal bli dannet i ikke-et-terfølgende aminosyrer, kan megaprimere bli dannet og variert ved mutagenese.

Ekspresjonen av det genetiske materiale fra biblioteket kan bli utført som beskrevet i større detalj nedenfor.

Betraktet fra et ytterligere aspekt kan oppfinnelsen anven-des for å fremskaffe et in vitro-peptid- eller protein-eks-pres jonsbibliotek som oppviser en mangfoldig populasjon av peptider eller proteiner, hvor peptidene eller proteinene er spesifikt assosiert med det DNA som koder for dem via kovalent protein:DNA-binding, og hvor nevnte kodende sekvens blir båret på et DNA-molekyl som inneholder en sekvens som koder for en aminosyresekvens som binder spesifikt til nevnte kodende sekvens (bindende enhet) en sekvens som koder for en aminosyresekvens for oppvisning (oppvisningsenhet), og minst ett sete for festing av den bindende enhet.

Slik som vil være klart fra det ovennevnte, fremskaffer oppfinnelsen muligheten til å danne mange forskjellige typer bibliotek og fremgangsmåter for fremstilling av slike. Selv om metoder for fremstilling av slike bibliotek vil ligge innenfor omfanget av den erfarne fagmann, blir det følgende gitt for å illustrere enkelte typer bibliotek og hvordan disse kan bli dannet under spesiell henvisning til anvendelsen av genet som koder for P2A som et eksempel på et cis-virkende protein.

Et bibliotek kan bli dannet hvor peptidene eller proteinene for oppvisning har tilfeldig, pseudo-tilfeldig, delvis tilfeldig eller spredt variasjon, og alt eller deler av det genetiske materialet som koder for deler av biblioteket kan bli syntetisert kjemisk eller avledet fra genomiske/kodende sekvenser fra forskjellige organismer. De forskjellige områder kan være sammenhengende eller ikke-sammenhengende. Kombinatoriske bibliotek (hvor de forskjellige områder er sammenhengende) består generelt av mindre enn 20 aminosyrer grunnet det mulige antall permutasjoner. Det er følgelig passende å bruke ikke-kontinuerlige områder av variasjon for lengere strekninger av aminosyrer. Således i for eksempel ett oppvisningspeptid på 40 residuer, kan permutasjoner av kun 13 av disse aminosyrer bli dannet. Dette har den fordel å redusere det totale antall per mutasjoner (bibliotekdeler) i forhold til et bibliotek hvor alle posisjoner ble variert. Bruken av sekvenser hvor visse residuer er invariante gir en skaffeli (invariant) struktur med visse områder inneholdt i denne eller støttet av skaffeliet som blir variert.

Disse skaffeli-strukturer kan eksistere iboende i proteiner hvor bibliotek kunne bli brukt for å isolere varianter av

proteinene som oppviser ønskede egenskaper basert på variasjon ved utvalgte residuer. Således kan for eksempel spesifisiteten eller termisk stabilitet hos et enzym bli variert dersom de opprinnelige enzym ble benyttet som et skaffeli.

Alternativt kan skaffelisekvenser bli introdusert ved siden av eller innenfor den DNA-bindende enhet for presentasjon av et ikke-sammenhengende oppvisningspeptid eller protein. Skaffelisekvenser kan være beliggende ved ett eller flere seter hvor som helst inne i sekvensen av peptidet eller proteinet som fester seg til et kodende DNA forutsatt at skaffelisekvensen(e) ikke innvirker på den kovalente binding av det kodede peptid eller protein med dets DNA.

Som nevnt tidligere, kan genetisk materiale som koder for de forskjellige bibliotekdeler bli dannet via bruken av primere hvor en del av primeren blir variert (for å danne en primermengde) for å gi permutasjonene beskrevet ovenfor. Opp til 1012-10<14> bibliotekdeler kan bli dannet på denne måte. I tilfelle med kodede produkter (så som P2A og dets funksjonelt-ekvivalente fragmenter, derivater eller varianter derav) som binder til sitt kodende DNA via den kodende kjede for å tillate transkripsjon av templatkjeden og binding av P2A til det kodende kjede, er det nødvendig for sluttproduktene som stammer fra dannelsen og amplifike-ringen {om sistnevnte blir utført) å være både templat og kodende kjeder. Dette kan bli oppnådd ved anvendelsen av for eksempel templatkjede-primere inneholdende biblioteksekvenser (det vil si en kjent mengde varierte primere), ytterligere inneholdende ett templatkjede primerbindende sete for å tillate ytterligere amplifikering om dette er ønsket. Dette sete kan videre bli brukt som et enestående identifiserende punkt for utvelgelse (og amplifikering) etter utvelgelse. Når et sett av templatkjeder har blitt dannet som innbefatter biblioteksekvensene, kan en passende primer som binder til templatkjeden bli brukt for å danne kodende kjeder inneholdende biblioteksekvensene.

Dannelse av nukleinsyremolekylene for fremstilling av biblioteket og/eller deres amplifikering kan lett bli utført ved å bruke en kombinasjon av disse primere samtidig eller etter hverandre. Dersom amplifikering skal bli utført på samme tid som generering av biblioteket, kan en enkelt primer bli brukt for å utføre en serie av lineære amplifika-sjoner fulgt av anvendelsen av den andre primer eller begge reaksjoner og kan bli utført samtidig. Primere kan bestå av nukleotidbaser som kan være derivatiasert (for eksempel med en immobiliseringsenhet), eller alternativt passende be-standdeler, så som avledet fra PNA, eller kombinasjoner derav.

Nukleinsyremolekyler som koder for forskjellige bibliotekdeler eller de variable deler derav kan alternativt bli dannet ved mutasjon eller kloning eventuelt i kombinasjon med amplifikeringsteknikker. Således kan for eksempel et initielt bibliotek bli dannet ved kloning og bli brukt som et initialt templat som ytterligere kan bli variert ved å bruke en mengde primere med biblioteksekvekser og/eller ved tilfeldig mutagenese.

Av stor viktighet i nukleinsyremolekyler for å fremstille ekspresjonsbibliotek ifølge oppfinnelsen er det område som koder for den DNA-bindende enhet. Som tidligere nevnt inkluderer dette ethvert DNA-bindende protein eller funksjonelt-ekvivalent fragment, derivat eller variant derav som danner en kovalent binding med sitt kodende genetiske materiale for å danne en operativ tilknytning. Avhengig av hvorvidt translasjonstrinnet skal bli utført in vitro eller in vivo med et enkelt eller flere biblioteksdeler per vertscelle eller organisme, kan den DNA-bindende enhet virke på cis-eller pseudo-cis måte. Et eksempel på en cis-virkende DNA-bindende enhet som er passende for bruk i oppfinnelsen, er P2A-proteinet eller dets funksjonelt-ekvivalente fragmenter, derivater eller varianter derav.

Et passende fragment omfattende minst det område av det DNA-bindende protein som er nødvendig for å oppnå kovalent binding til DNA, må være til stede i nukleinsyremolekylene benyttet for å danne biblioteket. For eksempel, i tilfelle med P2A bør genet som koder for proteinet eller en degenerert sekvens eller et funksjonelt-ekvivalent fragment, derivater eller varianter derav med passende DNA-bindende egenskaper være til stede. Dette gen kan bli variert ved tilsetning eller fjerning av deler av genet dersom det resulterende uttrykte peptid eller protein opprettholder sin funksjonelle aktivitet, det vil si fremdeles resulterer i en kovalent binding til DNA. For eksempel, kan det peptid/proteinbindende sete på DNA (festesete) bli flyttet, eller et ytterligere bindingssete innført (for eksempel dersom det villtypebindende sete er. ikke-funksjonelt grunnet variasjon for eksempel ved mutasjon). Dette er spesielt viktig for å sikre at oppvisningspeptidet eller proteinet forblir bundet til DNA som koder for dette når den DNA-bindende enhet som blir brukt ytterligere resulterer i spaltning av den ene kjeden hos DNA.

Videre kan området som koder for oppvisningspeptidet eller proteinet (oppvisende enhet) bli satt inn i, ligge ved siden av, eller falle utenfor området som koder for den DNA-bindende enhet, forutsatt at den oppvisende enhet, når den en gang er uttrykt, er kovalent bundet til den DNA-bindende enhet, det vil si er del av samme uttrykte peptid eller protein. Dette kan kreve fjerning av termineringskodonet til nedstrøms for området som koder for oppvisningsenheten. Slik som med plasseringen av det proteinbindende sete på DNA, bør det bli sikret ved passende plassering av området som koder for oppvisningsenheten at oppvisningsenheten forblir bundet til DNA som koder for denne, spesielt når spaltning av den kodende DNA-kjede er involvert. Dette kan bli oppnådd på et antall forskjellige måter.

Spaltning av en kjede inntreffer på den kodende kjede og det DNA-bindende peptid eller protein (bundet til det oppvisende peptid eller protein) som er kovalent bundet til den 5'-ende dannet i løpet av spaltningsprosessen. Således bør det bli sikret at det genetiske materiale som koder for oppvisningsenheten blir båret på den del av den kodende kjede som er kovalent bundet til det uttrykte peptid eller protein eller forblir assosiert med denne. Dersom DNA blir opprettholdt i dobbeltkjedet form etter translasjon og i løpet av utvelgelse, så vil templatkjeden sikre at begge de kodende kjeder er assosiert med den DNA-bindende enhet.

Alternativt kan sirkulært DNA bli benyttet for translasjon, noe som vil, etter spaltning av en kjede (under ikke-hybridiserende betingelser), resultere i en lineær kodende kjede omfattende hele den kodende kjede før spaltning. Alternativt om verken sirkulært DNA blir brukt eller hybridiserende betingelser, bør det proteinfestende sete og setet av biblioteksekvensene bli valgt slik at den DNA-bindende enhet binder seg kovalent til den delen av den kodende kjede som koder for oppvisningsenheten. Dette kan bli oppnådd ved innsetning av det oppvisningsenhetskodende område ved den karboksylkodende terminalside av festesetet (hvor sistnevnte også kan være forskjøvet fra sin naturlige posisjon). Dette blir lettest oppnådd ved å sette inn nedstrøms det naturlige forekommende festesetet, det vil si ved den karboksyl kodende ende. Imidlertid kan området som koder for oppvisningsenheten bli innført ved aminoenden dersom festesetet også er skiftet oppstrøms.

Om nødvendig kan festesetet være skiftet for å ligge foran hele det kodende område. Når området som koder for oppvisningsenheten skal bli satt inn ved aminoenden for å sikre transkripsjon, bør, dersom biblioteksekvensene blir innført med primere, megaprimere bli benyttet, omfattende i tillegg minst en passende promoter og startkodon som ligger foran biblioteksekvensene.

Biblioteksekvenser kan bli satt inn inne i det kodende område i stedet for ved amino- eller karboksylenden, ved for eksempel amplifikering av sirkulariserte DNA ved å bruke primere som hybridiserer til den kodende sekvens, men som ytterligere omfatter biblioteksekvenser i en ikke-hybridiserende del. Etter utvelgelse ved å bruke en slik primer kan en passende primer bli valgt ut for å danne en hybridiserende kjede hvor terminalkjedene av det dobbeltkjedede forlengelsesprodukt (etter hybridisering) er butt-endede, eller som, etter spaltning med en passende restriksjonsen-donuklease, oppviser overheng slik at ligering kan bli ut-ført for å gi DNA-molékyler med internt innsatte biblioteksekvenser.

Dersom proteiner skal bli oppvist, for eksempel som et skaffeli, så vil det bli forstått at oppvisningsproteinet bør bli satt inn i den kodende sekvens eller et relevant sete og derpå variert ved spesifikke residuer eller områder for å danne biblioteket.

I tillegg bør plasseringen av området som koder for oppvisningsenheten bli bestemt ut fra toleransen av det kodede peptid eller protein, spesielt den DNA-bindende enhet for innsetninger eller erstatninger ved dette setet.

Nukleinsyremolekyler ifølge oppfinnelsen kan i tillegg omfatte ytterligere trekk, så som markører for antibiotika-resistens. For eksempel kan genet for p-laktamase bli satt inn når amplifikering og/eller translasjon/transkripsjon og/eller utvelgelse og/eller isolasjonstrinn kunne involvere transformasjon for å tillate identifikasjon og utvelgelse (ved sin antibiotiske resistens) av passende trans-formanter.

Molekylene kan inneholde alternative markører eller rap-portmolekyler (for eksempel radiomerkede nukleotider eller en partner av et bindingspar så som streptavidin:biotin), slik at tilstedeværelsen eller identiteten av nevnte nukleinsyremolekyler kan bli bekreftet. Markør- eller rapport-molekylene kan også bli brukt som et verktøy for immobilisering og/eller opprenskning av nukleinsyremolekylene. For eksempel i tilfelle med en biotin-markør, kan en streptavi-dinbærende kolonne bli brukt for å samle molekylene. I tillegg kan nukleinsyremolekyler som koder for biblioteket innbefatte ikke-naturlige nukleotider eller metylerte baser, spesielt i de flankerende sekvenser for å stabilisere DNA i cellelysater og/eller under utvelgelse.

For enkelhets skyld kan enhver av primerne benyttet i metodene beskrevet ovenfor også ha en immobiliseringsenhet festet, så som biotin, for å tillate deres utvidelsesprodukter (det genetiske materiale som kode i biblioteket) til lett å bli isolert for senere trinn. Videre, hvor passende, kan primerne bli utstyrt med trekk til å bli inkorporert i de resulterende nukleinsyremolekyler, for eksempel promoter-sekvenser, avslutningssekvenser, gener som er nødvendige for å gi antibiotikumresistens.

Når nukleinsyremolekyler som koder i biblioteket har blitt dannet, kan biblioteket bli generert ved trinnene (i) amplifikering av det genetiske materiale, (ii) transkripsjon, og (iii) translasjon, hvor sistnevnte to trinn vanligvis vil være koblet. Avhengig av hvorvidt en cis- eller pseudo-cis DNA-bindende proteinfunksjon blir benyttet, kan disse trinn bli utført in vitro eller in vivo. Når cis-bindende proteiner blir brukt, kan hvert trinn bli utført enten in vitro eller in vivo. Når pseudo-cis-bindende proteiner blir brukt, kan amplifikering bli utført in vitro eller in vivo, men transkripsjon og translasjon må bli utført in vivo.

Amplifikering kan bli utført in vitro i løpet av dannelsen av det genetiske materialet for biblioteket dersom for eksempel primere og PCR blir brukt for å danne molekylene. Alternativt, eller i tillegg, kan nukleinsyremolekylene bli amplifikert ved konvensjonelle in vitro-amplifikasjonsmeto-der, så som PCR, NASBA (også kjent som 3SR) (se Malek et al. (1994), Methods Mol. Biol., 28, s. 253-260; Gebinoga & Oehlenschlager (1996), Eur. J. Biochem., 235, s. 256-261; og Ehricht et al., (1997), Eur. J. Biochem., 243, s. 358-364) eller lineær amplifikasjon. Alternativt kan replikasjon bli utført in vitro ved å bruke cellefrie ekstrakter (se for eksempel Kool, 1996, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. USA, 25, s. 1-28) eller in vivo etter innsetning av nukleinsyremolekylene i vertsceller eller organismer, for eksempel ved transfeksjon.

Dersom replikasjon blir utført in vitro, bør det cellefrie ekstrakt bli valgt på passende måte, for eksempel bør det inneholde dNTP-er. Sirkularisering kan bli utført før transfeksjon eller replikasjon hvor nødvendig. Videre, som nevnt nedenfor, for å unngå løsning av det DNA-bindende protein, noe som inntreffer i løpet av replikasjon, kan en ikke-løsnende mutant være nødvendig. Nukleinsyremolekylene kan allerede eksistere i vertsceller eller organismer dersom deres dannelse var ved mutasjonen.

Dannelse av biblioteket som uttrykker oppvisningspeptidet kan bli utført in vivo ved å dyrke opp transformerte celler eller organismer. Passende organismer til dette formål innbefatter bakterier (så som E. coli), virus, bakteriofager og celler, så som gjær, eller prokaryote, eukaryote celler eller erkebakterier kan bli benyttet. For å frigjøre eks-pres jonsbiblioteket, bør cellene eller organismene så bli lysert for å frigjøre proteinene/peptidet:DNA-ekspresjons-enhetene og/eller det genetiske materiale som koder biblioteket og renset (for eksempel plasmid eller minikromosom) før transkripsjon/translasjon. Imidlertid, som brukt heri, er uttrykket "bibliotek" ment å omfatte en samling av bibliotekdeler fremdeles inneholdt i sine vertsceller eller organismer når dannet in vivo så vel som bibliotekdeler etter frigjøring, om dannet in vivo eller om dannet in vitro.

In vitro, koblet transkripsjon/translasjon kan bli utført i cellefri ekstrakter. Dette kan passende bli utført i cellefrie ekstrakter fra prokaryoter eller eukaryoter, for eksempel av E. coli (Nevin & Pratt (1991), FEBS, 291, s. 259-263) . Prokaryotet (for eksempel E. coli, S-30 eller S-135) og eukaryotet (for eksempel hvetekim eller retikulocytt) cellefrie ekstrakter er kommersielt tilgjengelige (Amersham/Promega). Avhengig av konstruksjonen av DNA-molekylene og hvorvidt et kjedespaltende protein er kodet, kan det være nødvendig å sirkularisere DNA før translasjon for å sikre at oppvisningsenheten forblir assosiert med sitt kodende DNA.

Uansett om det utføres in vivo eller in vitro, hvor en induserbar promoter har blitt brukt, bør transkripsjonspro-sessen bli indusert.

Det har blitt funnet at bindingen av visse DNA-bindende proteiner (for eksempel P2A) kan bli forbedret in vitro, for eksempel ved å endre egenskapene av festesetet. Alternativt kan spesifikke kofaktorer (for eksempel spesifikke vertsproteiner) være nødvendig for å øke bindingen og aktiviteten av de DNA-bindende proteiner. Fortrinnsvis bør festesetet være enkeltkjedet. Dette kan bli oppnådd på et antall forskjellige måter, for eksempel ved å bruke dobbeltkjedet DNA kan en løkke eller åpning bli innført ved festesetet. Et ikke-tilsvarende oligonukleotid kan bli innført i løpet av translasjonsreaksjonen som hybridiserer til den kodende kjede, på begge sider som ligger ved siden av festesetet. I det området som inneholder festesetet på den kodende kjede, er den tilsvarende del av det ikke-tilsvarende nukleotid ute av stand til å hybridisere, noe som gjør den kodende kjede effektivt enkeltkjedet over dette området. Bruken av en ikke-tilvarende primer utgjør et foretrukket aspekt av oppfinnelsen.

Dette ikke-tilsvarende område kan strekke seg over lengden av festeområdet eller kan strekke seg forbi dette området og kan for eksempel være ikke-tilsvarende over et område på 10 nukleotider. For eksempel, i tilfelle med P2A-festesete (TCGGA, som er til stede i sekvensen 5<1->AGCGGCATCGCC-GC GCCTCGGAGTCCTGTC-3'), kan et ikke-tilsvarende oligonukleotid inneholdende en sekvens så som 3'-TCGCCGTAGCGGCG-TAAGATTCTAGGACAG-5' bli brukt hvor området med ikke-til-svarenhet er understreket.

Alternativt kan passende primere bli brukt ved fremstilling av nukleinsyremateriale som koder biblioteket og/eller amp-lif ikas jon derav for å innføre et enkeltkjedet område ved festesetet. Dette kan bli utført ved for eksempel å bruke en primer som har et ikke-tilsvarende område til festesetet. Dersom festesetet ligger innenfor det kodende område av den DNA-bindende enhet, så bør sekvensen av denne ikke-tilsvarende del bli valgt, slik at den ikke påvirker aminosyresekvensen kodet av DNA og bør således være en stum variasjon, det vil si en variasjon i kodonet i tredje posi-sjonen, men som koder for samme aminosyre. Det har blitt funnet av foreliggende oppfinnere at forbedret festing ble observert når en ikke-tilsvarende del var til stede i templatkjeden som tilsvarer festesetet på den kodende kjede.

Alternativt dersom festesetet ligger ved enden av det kodende område og en ikke-tilsvarende primer blir brukt, kan passende primere bli valgt ut etter utvelgelsestrinnet, slik at festesetet under amplikering blir restaurert.

Alternativt dersom festesetet er dannet ved slutten av DNA, kan det dobbeltkjedede DNA i dette område bli gjort enkeltkjedet ved spaltning med en restriksjonsendonuclease som etterlater en 5' utvidelse inneholdende alt eller deler av festesetet. For eksempel etterlater enzymet Hgal et 5-baset 5'-overheng 5 nukleotider fra Hgal gjenkjennelsessetet. Dersom dette området er for lite, så kan et større område bli gjort enkeltkjedet ved å inkorporere ikke-naturlige baser i en primer for amplifikering (for eksempel deoksyuri-diner) fulgt av bruken av DNA-reparasjonsenzymer så som uracil DNA glycosylase eller T4 endonuklease for å fjerne spesifikke nukleotider og etterlate et enkeltkjedet område (Watson & Bennet (1997), BioTechniques, 23, s. 858-864).

Når oppfinnelsen blir utført ved å bruke visse cis-bindende proteiner så som P2A, eller deres funksjonelt-ekvivalente fragmenter, derivater eller varianter, selv om den DNA-bindende enhet vil assosiere kovalent med det DNA som binder denne, representerer dette kinetisk intermediat, og dersom replikasjon inntreffer, vil peptidet eller proteinet reli-gere den kodende kjede og løsne fra denne kjede og overføre dem til en ytterligere kodende sekvens med et intakt festesete. Replikasjonen kan bli unngått in vitro, men denne overføringen representerer et potensielt problem i tilfeller hvor translasjonen blir utført in vivo.

For å unngå dette, kan en mutant bli brukt som ikke løsner. Bruken av en modifisert bindende enhet som forblir kovalent festet til sitt kodende DNA i metoder ifølge oppfinnelsen, utgjør et foretrukket aspekt av oppfinnelsen. I tilfelle med P2A, kan for eksempel Y450F, som utgjør en substitusjon av tyrosin ved aminosyreposisjon 450 av A-proteinet med fenylalanin, bli brukt. Det bør imidlertid bemerkes at når translasjonsreaksjonen utføres in vitro, forutsatt at replikasjon ikke inntreffer (for eksempel ved å sikre at ingen dNTP er til stede), vil villtypeprotein forbli assosiert med det DNA som koder for det og tillater utvelgelse å bli utført.

Et bibliotek dannet som beskrevet heri kan bli brukt for ethvert bruk som konvensjonelle in vivo- eller in vitro-oppvisningsbibliotek blir brukt for. Slike anvendelser er veldokumentert i litteraturen. For eksempel kan biblioteket bli brukt for å identifisere et peptid eller protein som binder spesifikt til et målmolekyl.

Det er kjent innen faget at peptider med forskjellig stør-relse kan bli rangert i en passende tertiær struktur for å danne et domene med spesielle steriske og ladningskarakte-ristika. Et slikt domene kan ut fra sin spesielle tertiære utforming spesifikt gjenkjenne eller binde til et spesielt målmolekyl. Eksempler på slike peptider innbefatter, men er ikke begrenset til, bindende områder av proteiner og de variable bindingsområder og antistoffer. Selv små peptider uten definert tertiærstruktur kan også ha spesifikke målbindende egenskaper. Peptidene for oppvisning i biblioteket ifølge oppfinnelsen kan således være små peptider, for eksempel opp til 40 aminosyreresiduer, eksempelvis 5 til 30, foretrukket 7 til 20, og mest foretrukket 10 til 15 aminosyreresiduer, som ikke har en fast tertiærstruktur, eller kan være større peptider som danner en fast tertiærstruktur.

Alternativt kan biblioteket uttrykke oppvisningsproteiner (som utgjør deler av polypeptidet inneholdende den DNA-bindende enhet) hvor kun visse residuer blir variert i de forskjellige bibliotekdeler. For eksempel kan et protein med definert spesifisitet, så som et antistoff eller en reseptor, danne basis for et bibliotek hvor flere, for eksempel 5 til 30, fortrinnsvis 7 til 20, aminosyreposisjoner blir variert i biblioteket og oppvisningsproteiner som har end-ret spesifisitet kan bli valgt ut.

Målmolekyler kan innbefatte små kjemiske forbindelser, for eksempel hetereocykliske forbindelser eller farmasøytiske forbindelser, polypeptider, proteiner, oligonukleotider, eller ethvert materiale som har særpregede overflatekarak-teristika som kan bli spesifikt gjenkjent. Således kan for eksempel spesielle målbindende peptider eller proteiner bli identifisert som ville ha anvendelse i diagnostiske assays, for eksempel i kliniske fremgangsmåter for å undersøke nivåene av biologiske eller ikke-biologiske molekyler i men-neskekroppen, eller prøver, ekstrakter eller materiale avledet fra denne, eller i assays som undersøker nivåene av biologiske eller ikke-biologiske materialer i andre ikke-biologisk avledede materialer.

Bibliotek i henhold til oppfinnelsen har også anvendelighet i utvelgelsesprosedyrer for å identifisere forbindelser med passende biokjemiske biologiske eller strukturelle egenskaper, for eksempel for å identifisere peptider eller proteiner som har en viss biokjemisk aktivitet i et definert assay. Ved denne fremgangsmåte kan peptider eller proteiner med enzymatiske, inhibitoriske eller stimulerende egenskaper bli identifisert og som kan ha anvendelse i for eksempel det farmasøytiske området. For eksempel kan enzymatiske aktiviteter bli valgt ut ved å overvåke for eksempel øket eller senket bioaktivitet så som kjemifluoressens, nuclea-seaktivitet, fosfotransferaseaktivitet, inhibering osv. Dersom skaffelipolypeptider blir brukt med kjent aktivitet, kan varianter med endrede egenskaper eller aktivitet bli valgt ut fra biblioteket.

Slike peptider eller proteiner kan, når de en gang er identifisert fra biblioteket, bli brukt til fremstilling av forbindelser med den spesielle aktivitet, for eksempel in-hibitorer, aktivatorer eller katalysatorer for visse reaksjoner eller interaksjoner.

Generelt blir peptider eller proteiner av interesse identifisert fra biblioteket i henhold til den følgende fremgangsmåte innbefattende trinnene (i) utvelgelse, (ii) isolering og/eller rensing, (iii) utvikling, (iv) amplifikering, (v) fremstilling av et bibliotek for gjen-utvelgelse (innbefattende transkripsjon og translasjon), (vi) reutvel-gelse (og deretter det å følge trinnene (ii) til (vi) så mange ganger som nødvendig) og (vii) isolering av det genetiske materiale av interesse. Trinn (ii) og/eller (iii) og/eller (iv) kan imidlertid bli sløyfet etter behov.

Uansett hvorvidt cis-virkende eller pseudo-cis-virkende proteiner blir brukt, må utvelgelses- og isoleringstrinnene bli utført in vitro. Dersom cis-virkende bindingsproteiner eller deres funksjonelt-ekvivalente fragmenter, derivater eller varianter blir brukt, kan de gjenværende trinn bli utført in vitro eller in vivo. Imidlertid, dersom pseudo-cis-virkende proteiner eller deres funksjonelt-ekvivalente fragmenter, derivater eller varianter blir brukt, må minst deler av trinn (v), nemlig transkripsjon og translasjon, bli utført in vivo.

Utvelgelse, som må bli utført in vitro, involverer bruken av et passende assay, så som affinitetsbinding, fasefordeling eller et enzymatisk assay for å identifisere oppvisningspeptider eller proteiner av interesse som beskrevet nedenfor i større detalj. Fasefordeling (se for eksempel Garg et al., 1994, Biotech, Appl. Biochem., 20, s. 119-215) har spesiell anvendelse for å identifisere oppvisningspeptider/proteiner som fordeler seg til den organiske fase (for eksempel Triton X-114) som et resultat av variasjon innen biblioteket. Denne metode er av mer generell anven-dbarhet dersom den organiske fase, for eksempel detergent, blir modifisert til å bære passende bindingspartner for må-loppvisningspeptidet eller proteinet, for eksempel et antistoff eller et antigen.

Identifisering av endrede enzymatiske egenskaper avhenger av endrede fysiske egenskaper, for eksempel binding til et substrat eller eksponering av et tidligere utilgjengelig sete, for eksempel ved proteaseaktivitet eller fosforyle-ring.

Binding av oppvisningspeptidet eller proteinet til en passende bindingspartner kan bli identifisert på enhver passende måte, ved for eksempel affinitetsbinding og eluering eller påvisning av den enzymatiske aktivitet, for eksempel fremstilling av reaksjonsproduktet. Således kan bibliotek fremskaffet ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen bli brukt til å identifisere bindingspartnere hvor det uttrykte peptid eller protein er en av bindingspartnerne. På denne måte kan slike bibliotek gi fullstendige in vitro- alterna-tiver til teknikker så som tohybridsystemet. I et slikt system blir to hybridmolekyler dannet hvor hvert molekyl bærer en av et bindingspar (så som et enzym og et substrat) . Når disse bindingspartnere binder seg til hverandre, blir de andre funksjonelle deler av fusjonsproteinene brakt sammen. Ved passende utvelgelse av disse funksjonelle enheter av fusjonsproteinene, kan en påvisbar interaksjon bli identifisert.

Denne type system er beskrevet for eksempel av Field & Song (1989, Nature, 340, s. 245-246) hvor fusjonsproteinene inneholder forskjellige deler av GAL4 fra Saccharomyces cre-visiae, hvilke komponenter når de bringes sammen ved binding av bindingspartnerne uttrykt på fusjonsproteinene, re-konstituerer GAL4 slik at dens transkripsjonene aktivering aktivt kan bli observert. Dette utgjør således binding mellom bindingspartnerne av fusjonsproteinene. Gyuris et al.,

1993, Cell, 75, s. 791-803, beskriver på lignende måte komplementeringen av komponentene av en transkripsjonsakti-vator. Videre tar komplementering ved å bruke p-galactosidase delesjonsmutanter beskrevet av Rossi et al (1997, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 94, s. 8405-8410). Komplementering kan også bli oppnådd hvor det andre fusjonsprotein er en mer kompleks enhet, men som har trekkene beskrevet ovenfor, det vil si en partner av bindingsparet og en funksjonell enhet som interreagerer med en funksjonell enhet på det første fusjonsprotein. Et eksempel på dette er gitt av Krebber et al. (1997, J. Mol. Biol., 268, s. 607-618) hvor en ikke-infeksjonsdyktig fag blir gjort infeksjonsdyktig ved binding av et fusjonsprotein via passende bindingspartnere. Aronheim et al. (1997, Mol, Cell Biol., 17, s. 3094-3102) beskriver et system hvor den andre fusjonsproteinek-vivalent har en bindingspartner som har natur av en nukleinsyre og den funksjonelle enhet er et protein som er til stede i plasmamembranen til hvilken bindingspartneren er bundet.

Således kan det aktuelle biblioteket uttrykke et fusjonsprotein med en enhet som er ansvarlig for en bindingsinter-aksjon (alt eller deler av oppvisningspeptidet eller proteinet) og en andre enhet involvert i komplementering. Et andre fusjonsprotein (eller passende enhet) som bærer bindingspartneren og komponenten som er nødvendig for komplementering kan utgjøre en del av biblioteket eller kan bli tilsatt til biblioteket. Bindingspartneren av en eller begge av fusjonsproteinene kan bli variert i biblioteket.

Avhenging av konstruksjonen av nukleinsyremolekylene, kan det, som nevnt ovenfor, være nødvendig å utføre utvelgelsen under hybridiserende betingelser.

Biblioteket kan bli modifisert før utvelgelse, for eksempel ved å modulere foldingen av oppvisningspeptidet eller proteinet, ved å tilsette enzymer så som chaperoner (for eksempel hsp70) eller foldingsmodifikatorer, så som protein-disulfid-isomerase, oksyderingsmidler, eller enzymer som endrer den oksyderende aktivitet av det bakterielle cyto-plasma eller av translasjonsekstrakter. Videre kan både homo-oligomere og hetero-oligomere proteiner bli utvalgt. For eksempel er signalgjenkjennelsespartikkelreseptoren (SR) heterodimer av subenheter kalt SR-alfa og SR-beta og en biblioteksuttrykkende variant av kun en av subenhetene behøver være uttrykt. Variantene kan så bli undersøkt for ønskede egenskaper uavhengig av den andre subenhet eller for en egenskap som er avhengig av tidligere heterodimerisering med den andre subenhet.

Et klassisk eksempel på heterodimerisering er gitt ved de tunge og lette kjeder hos et antistoff. I dette tilfelle behøver for eksempel kun en kjede være til stede i biblioteket og den andre kjede kunne bli tilført under assayet. I tillegg til et polypeptid kan metall, porfyriner, kofaktorer, DNA, RNA, og andre molekyler alle bli tilsatt i utvelgelsestrinnet for å endre egenskapen av oppvisningspeptidet eller proteinet.

Etter utvelgelse må oppvisningspeptider eller proteiner av interesse bli fjernet fra samlingen av biblioteket (isolering) og eventuelt bli renset. I visse tilfeller vil dette ha blitt oppnådd under utvelgelse, for eksempel ved bruken av affinitetskolonner.

Utvikling av de utvalgte DNA-molekyler kan bli utført for å danne ytterligere variasjon i biblioteket som kan oppvise de ønskede egenskaper i større utstrekning. Dette har blitt utført innen den tidligere teknikk for å utvikle en fucosi-dase fra en galactosidase (se Zhang et al., (1997), PNAS USA, 94, s. 4504-4509) eller for å endre en spesifikk enzymatisk funksjon (se Crameri et al. (1997), Nature Biotechnology, 15, s. 436-438; You & Arnold (1996), Protein Eng., 9, s. 77-83).

Utvikling kan bli utført ved innføring av ytterligere nye mutasjoner ved tilfeldige steder kjemisk ved å bruke enhver av et antall prosedyrer som er kjent innen faget genetisk ved å bruke mutatorstammer av bakterier (Degnen & Cox

(1974), J. Bact., 117, s. 477-487), bakterielle stammer som innfører aminosyresubstitusjoner ved å bruke suppressor tRNA (Markiewicz et al (1994), J. Mol. Biol., 240, s. 421-4 33), ved mutagene PCR-teknikker så som regional kodon ran-domerisering (Cormack & Struhl (1993), Science, 262, s. 244-248) eller ved å bruke en av standardmetodene for å senke spesifisiteten av polymerasen brukt i en PCR-reaksjon eller revers transkriptase i NASBA. Mistilpassede primere eller megaprimerbibliotek kan bli brukt til å innføre subs-titusjoner ved spesielle punkter. De utvalgte bibliotekdeler inneholdende forskjellige uavhengige variasjoner kan også rekombinert ved å bruke DNA-stokking (Stemmer (1994), Nature, 370, s. 389-391) eller med mer tradisjonelle klo-ningsmetoder.

Etter isolering eller utvikling, dersom dette blir utført, blir de utvalgte bibliotekdeler eller utviklede bibliotekdeler amplifikert (hvor nødvendig), og et bibliotek fremstilt for gjenutvelgelse ved å bruke enhver av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor for dannelse av bibliotek. Som en følge av at et peptid eller protein er bundet til det genetiske materialet i biblioteket, kan det for å danne det genetiske materialet i en passende form for etterfølgende trinn, for eksempel transformasjon, være nødvendig å fjerne det kodende område til et forskjellig DNA-molekyl, så som en vektor. Gjenutvelgelse kan så bli utført så mange ganger som er nødvendig for å stabilisere den utvalgte populasjon ved eventuelt å øke stringensen av utvelgelsen eller ved å innføre ytterligere variasjon (for eksempel in__vitro-utvikling) .

Når utvelgelse er fullstendig, kan det genetiske materiale som koder for de utvalgte peptid eller protein bli isolert, for eksempel ved opprenskning av plasmidet eller minikromo-somet. Eventuelt kan de utvalgte bibliotekdeler bli amplifikert før isolering for eksempel ved transformasjon og dyrkning eller med PCR.

Fra det ovennevnte vil det være klart at forskjellige metoder kan bli brukt for å danne og utvelge biblioteket ifølge oppfinnelsen. Imidlertid er de følgende metoder foretrukket. Når cis-bindende proteiner blir brukt eller deres funksjonelt-ekvivalente fragmenter, derivater eller varianter for å gi den raskeste og mest effektive fremgangsmåte (som tidligere beskrevet) bør alle av trinnene bli utført in vitro. Siden ingen levende organismer i dette tilfellet er nødvendig, vil det bli forstått at hele fremgangsmåten kan utsettes for automatisering. Videre er det ikke nødven-dig å bruke betingelser og fremgangsmåter som er utvalgt for å sikre levedyktigheten av organismene.

Foretrukket blir de genetiske konstruksjoner som benyttes for å danne ekspresjonsbiblioteket konstruert ved å bruke primere (med biblioteksekvenser) som binder seg til og å sette inn biblioteksekvensene ved karboksylenden av den DNA-bindende enhet. Dette unngår kravet for hybridiseringsbetingelser under translasjon eller sirkularisering før translasjon når det brukes DNA-bindende enheter som oppfø-rer seg på lignende måte som P2A.

Det er videre foretrukket når det brukes DNA-bindende proteiner eller funksjonelt-ekvivalente fragmenter, varianter eller derivater derav som har en tendens til å løsne fra DNA ved hvilket de er kodet å mutere det DNA-bindende protein, for eksempel Y450F som beskrevet heri, slik at proteinet eller dets fragment, variant eller derivat vil binde til dette, men ikke løsne (for således å opprettholde den operasjonelle tilknytning mellom DNA og dets kodede produkt) . Ytterligere kan et ekstra orisete være nødvendig for å tillate replikasjoner. Konstruksjonen bør videre inneholde induserbare promotere.

Fortrinnsvis er den DNA-bindende enhet avledet fra P2A-proteinet eller et funksjonelt-ekvivalent fragment, variant eller derivat derav. Under translasjon kan bruken av et mistilpasset oligonukleotid være ønskelig. Tilstedeværelsen av minst en antibiotikumresistensmarkør er også foretrukket for endelig transformasjon av den utvalgte nukleinsyresek-vens i vertscellene når de en gang er isolert.

Når pseudo-cis-bindende proteiner eller deres funksjonelt-ekvivalente fragmenter, derivater eller varianter blir benyttet når biblioteket dannes, blir amplifikering av det genetiske materialet fortrinnsvis utført in vitro ved passende teknikker så som PCR. Konstruksjonene som er foretrukket er slike hvor biblioteksekvensene opptrer ved karboksylenden av det området som koder den DNA-bindende enhet for å unngå bruken av megaprimere og problemer i tilfelle spaltning av den ene kjede av DNA-materialet inntreffer. Tilstedeværelsen av gener som koder for antibiotikumresis-tensmarkører og en induserbar promoter er ofte foretrukket. Under utvelgelse er det foretrukket at amplifikering også blir utført in vitro.

Således betraktet fra et ytterligere aspekt fremskaffer oppfinnelsen en mulighet for å identifisere og/eller rense en bibliotekdel som oppviser ønskede egenskaper fra et peptid- eller protein-ekspresjonsbibliotek som definert ovenfor og som omfatter minst ett av trinnene a) utvelgelse av et bibliotek fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og b) utvelgelse og isolering av den relevante bibliotekdel. Dette kan bli utvidet til å isolere peptidet eller proteinet som oppviser den ønskede egenskap eller det DNA som koder for dette ved det ytterligere trinn å isolere peptidet, proteinet eller det kodende DNA fra den isolerte bibliotekdel.

I de tilfeller hvor den ønskede egenskap er egenskapen å binde til et målmateriale, kan målmolekylet, fortrinnsvis i renset form, bli brukt for å velge ut et spesifikt målbindende peptid eller et proteinbærende genetisk konjugat fra biblioteket på et antall forskjellige måter. Passende kan målmaterialet bli festet til et fast støttemateriale og benyttet som en affinitetsmatrise. Mange faste støttemateria-ler og fremgangsmåter for festing av molekyler direkte eller indirekte kovalent eller ikke kovalent (for eksempel med en streptavidin-biotin eller IgG-protein A kobling) er velkjent innen faget og godt beskrevet i litteraturen.

Således kan for eksempel støttematerialer i form av mikro-titerbrønner, rør, dyppestaver, partikler, fibre eller ka-pillarrør bli brukt. Foretrukket kan støttematerialet omfatte magnetiske partikler, for eksempel de superparamagne-tiske kuler som produseres av Dynal AS (Oslo, Norge og solgt under varemerket DYNABEADS).

For utvelgelse kan ekspresjonsbiblioteket bli satt i kontakt med målmaterialet festet til et fast støttemateriale. Støttematerialet kan bli vasket for å fjerne deler av biblioteket som ikke binder til målmaterialet eller kan ekst-raheres fra ekspresjonsbiblioteket ut fra hva som er passende for støttematerialet som blir benyttet. Utvalgte peptid/protein: DNA-konjugater kan så bli frigjort fra det faste støttematerialet om nødvendig ved ødeleggelse av bindingen mellom målmolekylene og det faste støttematerialet eller målmolekylene og peptid/protein:-DNA-konjugatene for etterfølgende amplifikering eller isolering av det genetiske materialet. Alternativt kan amplifikering bli utført in situ uten ødeleggelse av tallmateriale til peptid/protein: DNA- konj ugatbinding eller frigjøring av det genetiske materiale fra konjugatet.

Målmolekylet kan også bli brukt som et fritt middel ved fravær av et støttemateriale. Utvelgelse kan så bli utført ved å fjerne ikke-bundede konjugater, for eksempel ved å bruke antistoff rettet mot et område av det uttrykte peptid eller protein som er til stede på alle deler av biblioteket og som kun er tilgjengelig når de ikke er bundet til målmolekyler. Målmolekyler kan alternativt bli utstyrt med innretninger for immobilisering slik at dette kan bli brukt for å fjerne målmaterialet og bundede peptid/protein:DNA-konjugater etter blanding av målmateriale og bibliotek. Slike innretninger for immobilisering kan for eksempel ut-gjøre en partner av et koblingspar, for eksempel streptavidin-biotin, festet til målmolekylet og den andre partner festet til et støttemateriale som skal bli brukt for gjen-vinning.

Således betraktet fra enda et ytterligere aspekt fremskaffer oppfinnelsen en mulighet for å identifisere et spesifikt målbindende peptid eller protein hvor dette omfatter minst trinnene a) å utvelge et bibliotek fremstilt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen med et målmolekyl og b) å velge ut og isolere et bibliotekdel som binder til nevnte målmolekyl og c) isolere peptidet eller proteinet som binder spesifikt til nevnte målmolekyl. En fremgangsmåte for å isolere DNA som koder et spesifikt målbindende peptid eller protein er også fremskaffet hvor etter trinn b) ovenfor det DNA som uttrykker peptidet eller proteinet som binder spesifikt til nevnte målmolekyl blir isolert.

Mer enn en syklus av undersøkelse og utvelgelse kan være nødvendig for å skaffe et målbindende peptid eller protein med ønsket spesifisitet.

På lignende måte kan biblioteket bli valgt ut for å identifisere et protein eller peptid med spesielle funksjonelle attributter, eksempelvis enzymatisk aktivitet.

Et utvalgt peptid eller protein bundet til sitt kodende DNA kan bli isolert ved separasjon av det genetiske materialet, kan bli syntetisert ved transkripsjon og translasjon av det genetiske materialet som kan bli amplifikert, eller kan bli syntetisert kjemisk etter sekvensering av den passende DNA-sekvens som koder dette eller direkte sekvensering av peptidet eller proteinet. Kjemisk syntese av peptidet eller proteinet kan bli utført ved metoder velkjent innen faget som involverer cykliske sett av reaksjoner med selektiv deblokkering av de funksjonelle grupper av en terminal aminosyre og kobling av selektivt beskyttende aminosyreresiduer fulgt til slutt av fullstendig deblokkering av alle funksjonelle grupper. Syntese kan bli utført i oppløsning eller på et fast støttemateriale ved å bruke passende fast-faser kjent innen faget.

Foretrukket, dersom affiniteten av det utvalgte peptid eller protein for målmolekylet eller aktiviteten av peptidet eller proteinet ikke er signifikant påvirket behøver kun oppvisningsenheten av det uttrykte peptid eller protein bli syntetisert. Eventuelt kan det være nødvendig eller foretrukket å fremstille peptidet eller proteinet slik det fo-rekommer i polypeptidet inneholdende den DNA-bindende enhet ved dannelse av noe eller alt av sekvensen av den DNA-bindende enhet og/eller andre områder av det uttrykte peptid eller protein. Dette er spesielt aktuelt når et skaffeli-bibliotek har blitt fremstilt.

Passende målbindende peptid/protein:DNA-konjugater kan bli dannet med et markørmolekyl for anvendelse i kvalitative eller kvantitative assays for å bestemme tilstedeværelsen eller fravær av målmolekyl.

Således betraktet fra enda et ytterligere aspekt, fremskaffet oppfinnelsen en mulighet for å påvise tilstedeværelsen av et målmolekyl i en prøve hvor dette omfatter a) å sette nevnte prøve (for eksempel av biologisk, biologisk avledet eller ikke-biologisk materiale) i kontakt med en molekylær probe omfattende (i) en peptid eller protein målbindende enhet som er i stand til selektivt å finne til nevnte målmolekyl med festet kodende DNA hvor DNA-enheten er valgt fra biblioteket fremstilt ifølge oppfinnelsen og (ii) en markørenhet og b) direkte eller indirekte påvise den målbundne probe.

Bifunksjonelle molekylære prober som angitt i krav 18 (omfattende (i) og (ii) som beskrevet ovenfor) for bruk i assayet danner et ytterligere aspekt av oppfinnelsen.

I denne påvisningsmetode kan undersøkelse av bindingen av den bifunksjonelle forbindelse til ethvert av målmateria-lene til hvilket den er spesifikk og som er til stede i prøven være direkte eller indirekte. Direkte og indirekte påvisning er velkjent innen faget diagnostiske assays. Slike fremgangsmåter kan involvere separasjon av den bundede (eller ubundede) bifunksjonelle forbindelse hvorav hver kan virke som analytt. Påvisning av målmolekyl:bi-funks jonell forbindelseskonjugat kan være kvalitativ eller mer foretrukket kvantitativ og vil involvere direkte eller indirekte påvisning av markørenheten.

Assayet kan være rettet mot påvisning av et andre målmateriale med første målmateriale, hvor markørenheten på en probe for andre målmateriale blir gjenkjent av den bifunksjonelle forbindelse. Således kan en bifunksjonell forbindelse være rettet mot en probe, fortrinnsvis molekylær, som gjenkjenner et ytterligere målmateriale i hvilket tilfelle proben blir tillatt å binde til det ytterligere målmaterialet under egnede bindingsbetingelser før tilsetningen av den bifunksjonelle forbindelse som nevnt ovenfor.

For å tilsette proben, kan det spesifikke målbindende peptid/protein: DNA-konjugat inkorporere eller være konjugert til en markørenhet slik at tilstedeværelsen inne i en for-søksprøve av målmaterialet av interesse kan bli bestemt og/eller mengdebestemt.

Den peptid eller protein målbindende enhet i den bifunksjonelle forbindelse binder til målmaterialet ved hjelp av et målbindende område som utgjør noe eller alt av aminosyrere-siduene av det uttrykte peptid eller protein. Generelt vil dette tilsvare minst en del av den oppvisende enhet som tidligere definert.

Markørenheten kan være enhver enhet som er i stand til direkte eller indirekte påvirkning, for eksempel ved hjelp av sine enzymatiske egenskaper, strålingsemisjon, spredende eller absorberende egenskaper, sine magnetiske egenskaper eller utfra sin egenskap og samvirke med eller bundet til et komplementært middel for å gi en påvisbar effekt, for eksempel samvirke med et enzym for å gi et signal, gassut-vikling, lysemisjon, fargeendring, turbiditet, utfelling osv. markørenheten kan alternativt være enhver del av peptid/protein: DNA- konj ugatet som kan gjenkjennes og kan finne et ytterligere molekyl som direkte eller indirekte kan danne et signal. Således kan for eksempel et antistoff rettet mot et spesielt område av det genetiske materiale eller peptid/proteinet bli benyttet. De ovennevnte enheter er velkjent innen området diagnostiske assays.

Markørenheten i de bifunksjonelle forbindelser ifølge oppfinnelsen kan bli inkorporert i eller konjugert til peptid/protein eller DNA-enheten. Således som eksempel kan radiomerkede aminosyrer eller nukleotider bli brukt for fremstilling av peptid/proteinet eller det kodende DNA, radio-nukleidene bygget inn i peptid/proteinet, eller nukleinsy-restrukturene som virker som markørenhet. Slike merkede be-standdeler kan bli inkorporert i løpet av fremstillingen av utgangsbiblioteket eller i løpet av etterfølgende utvelgelse eller amplifikeringstrinn hvor disse blir utført.

Alternativt kan et markørmolekyl bli konjugert til peptid/proteinet eller DNA som direkte eller indirekte tillater påvisning eller måling av tilstedeværelsen av målmaterialet til hvilket peptidet eller proteinet er i stand til å binde seg. Slike markørmolekyler innbefatter for eksempel radiomarkører, kjemiske markører, for eksempel kromofore eller fluorofore materialer (eksempelvis fargestoff, så som fluoresin og rodamin) eller reagenser med høy elektrontett-het så som ferritin, hemocyanin eller kolloidalt gull.

Alternativt kan markørmolekylet være et enzym, for eksempel peroksydase eller alkalisk fosfotase, hvor tilstedeværelsen av enzymet blir synliggjort ved sin interaksjon med en passende enhet, for eksempel et substrat. Den enzymatiske aktivitet kan bli dannet ut fra det uttrykte protein eller peptid innbefattende den peptid eller protein målbindende enhet dersom målmaterialet til hvilket det binder er for eksempel en reseptor til enzymet eller et substrat for dette. Kobling av enzymer til peptider eller proteiner kan bli oppnådd ved å bruke konvensjonelle teknikker, eksempelvis ved å bruke et aktivert enzym, så som aktivert alkalisk fosfatase (Boehringer Mannheim Biochemicals).

Markørenheten kan også danne deler av et signaliserende par hvor den andre del av paret blir funnet på eller i nærhet av målmaterialet til hvilket peptidet eller proteinet binder seg, for eksempel en fluorescent forbindelse og et dem-pende fluorescent substrat. Som nevnt tidligere, kan peptid/proteinet eller DNA også bli påvist ved assosiasjon med eller binding av et ytterligere molekyl som gjenkjenner dets identitet, for eksempel et antistoff rettet mot deler av sekvensen som kan danne et målbindende område av peptid/proteinet eller et område av peptidet eller proteinet som ikke er involvert i binding av målmaterialet som eventuelt kan bli tilsatt for gjenkjennelsesformål eller i tilfelle med DNA rettet mot spesifikke nukleinsyrestrukturer. Således kan det spesifikke, målbindende område falle innenfor et større peptid eller protein, hvor delene av peptidet eller proteinet som ikke er involvert i binding av målmaterialet kan ha en strukturell eller funksjonell rolle for det uttrykte peptid eller protein, eksempelvis som en skaf-felisekvens eller kan virke som en markørenhet, eller som en sammenbindende gruppe som binder sammen det spesifikke målbindende område med en markørenhet eller en ytterligere komponent av proben, eksempelvis et bæremateriale eller et makromolekyl.

De bifunksjonelle forbindelser som er anvendelige i henhold til oppfinnelsen kan bli fremstilt ved å konjugere et mar-kørmolekyl til det resulterende passende peptid eller protein enten direkte eller via en sammenbindende enhet. Generelt vil dette være ved reaksjon med en eventuelt aktivert karboksyl eller aminf uriks jon på peptidet eller proteinet. Slike konjugeringsreaksjoner er velkjent innen den vanlige kjemikers kompetanse.

Alternativt kan markørmolekylet bli introdusert ved å ut-nytte en passende merket aminosyre i konstruksjonen av peptidet eller proteinet.

De bifunksjonelle probeforbindelser kan bli brukt for å gjenkjenne spesifikke målmaterialer av interesse i forskjellige systemer som er kjent innen faget, innbefattende diagnostiske assays som tidligere nevnt.

De følgende eksempler er gitt kun som illustrasjon under henvisning til tegningene hvor Figur 1 viser konstruksjonen av pEN21 og pEN24 konstruksjonene, og Figur 2 viser fremstillingen av DNA-molekyler inneholdende et randomisert område på 30 basepar dannet med PCR hvor 1 er en markør { X, HindiII) og spor 2 er PCR-produktet.

Eksempel 1;

Generell metode for å danne et in vitro- peptid- bibliotek og utvelgelse for et målmateriale

Materialer:

A. Plasmid eller PCR-fragment inneholdende T7-promoter, ro-bosombindende sete, P2 A-genet og T7-terminatoren. Slike plasmider har blitt beskrevet av Liu & Haggård-Ljungquist (1994, supra) eller kan bli innkjøpt fra Biotechnology Cen-tre of Oslo, Oslo Universitet (BiO).

B. En primer (bibliotekprimer) som inneholder de følgende sekvenser som er komplementære til plasmid/fragment:

- T7-promoter,

- ribosombindende sete,

- 30 tilfeldige nukleotider (XXT/G) etter første ATG startkodon, alternativt et cysteinkodon etter første startkodon og etter den tilfeldige sekvens (for begrensede peptid biblioteker) - omtrent 20 nukleotider nedstrøms fra første startkodon komplementært til den kodende sekvens for P2 A-genet.

Primere kan bli spesialsyntetisert eller innskaffet fra BiO.

C. En PCT-primer T7 promoterregion (BiO).

D. En PCR-primer i T7 terminatorområdet (mot urviseren)

(BiO).

E. Målmateriale bundet til fast støttemateriale. Passende kan dette bli utført ved å bruke biotinylert målmateriale og å binde dette til streptavidin eller avidin på et fast støttemateriale. Alternativt kan avidin i seg selv være "målmateriale" dersom avidinbindende peptider er ønsket. Streptavidin bundet til mi-krotiterbrønner eller streptavidin bundet til magnetiske partikler eller Avidinresin kan bli innkjøpt fra henholdsvis Dynal (Norge) eller Promega (USA).

F. T7 S30 ekstrakt for in vitro-koblet transkripsjon/translasjon av lineære templater kan bli innskaffet fra Promega (USA).

<*> Resten av materialet som er nødvendig er standard for enhver som arbeider med molekylærbiologiteknikker.

Metoder:

1. Ved å starte med et plasmid eller PCR-fragment som nevnt i pkt. A blir lineær PCR utført ved å tilsette bibliotekprimeren nevnt i pkt. B. Det nøyaktige oppsett for denne reaksjonen er avhengig av primeren og de samme be-traktninger som gjelder for PCR eller syklus-sekvensering gjelder også her. Dette vil danne et bibliotek med opp til IO<12> til IO<13> molekyler avhengig av effektiviteten av PCR. For å unngå primerkonkurranse i neste trinn bør de gjenværende bibliotekprimere fortrinnsvis bli fjernet ved dette punkt ved å bruke en Centricon-100-kolonne (Amicon). 2. For å amplifikere dette materiale blir 5-7 cykler av PCR med primere C og D utført. Dette blir utført ved å bruke det bibliotekprimerutvidede DNA oppdelt i 5 porsjoner. 3. En porsjon av materialet fra det dannede bibliotek (for eksempel 1/5) tilsettes til et S30 ekstrakt for lineære fragmenter inneholdende T7 RNA polymerase (F) som beskrevet i Promega bruksanvisningen. Reaksjonsblandingen inkuberes i 30 - 60 minutter ved 37°C og stoppes derpå ved å plassere røret(ne) på is. 4. Målmaterialet blir festet direkte til et fast støtte-materiale med biotin-streptavidinsystemet. Avidin koblet til Resinmatrise eller straptavidinmagnetiske kuler kan bli fremskaffet kommersielt fra henholdsvis Promega og Dynal. 5. S30-ekstraktet fortynnes 1:10 i den ønskede bindings-buffer (Sambrook et al (1989), Molecular Cloning:A laboratory manual, annen utgave, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), og peptidbiblioteket i S30-ekstraktet tillates å reagere med målmaterialet i 1 - - timer (eller over natten). Ikke-bindende materiale blir fjernet med vask 5x med 1XPBX + 0,5% Tween-20 (Sigma) i 5 minutter. Det bundne peptidprotein A-DNA-kompleks elueres fra målmaterialet med det ønskede elueringsmiddel, for eksempel biotin dersom målmaterialet er avidin og et avidinbindende peptid blir søkt. Eluering med kokende dfibO kan også bli utført for å frigjøre komplekset fra målmaterialet og samtidig frigjøre det genetiske materiale fra det ikke-genetiske materiale. 6. Det eluerte DNA konsentreres før det går inn i neste runde PCR. Dette blir utført mest passende ved å bruke en Centricon-100-kolonne og ved å følge forhandlers anbefal-inger. Det endelige volum av det eluerte DNA er 50 ^il. Alternativt kan komplekset bli renset før PCR uten separasjon av genetisk og ikke-genetisk materiale. 7. En ny PCR-reaksjon blir satt opp ved å bruke primere C og D med 30-40 cykler. 8. Hele fremgangsmåten fra trinn 3 til trinn 7 utføres igjen 4-5 ganger. 9. Etter den endelige syklus med eluering og PCR må fragmentene bli klonet for å isolere og studere individuelle fragmenter for å bestemme deres sekvenser. Dette blir ut-ført ved å spalte det endelige PCR-fragment med Xba I og BamH I og ligere dette til vektor pET-3a {Novagene} (A) spaltet med de samme enzymer. 10. Den ligerte vektor blir så transformert i E. coli. Siden det finnes mange kopier av samme sekvens, er transfor-mas jonsef f ektiviteten ikke kritisk. 11. Individuelle kloner blir skilt ut og plasmid-DNA isolert med standard fremgangsmåter. En sluttlig runde av S30-ekstrakt og utvelgelse (trinn 3-7) utføres for å for-hindre bindende materiale som kun virker kooperativt (sammen med annet bindemateriale). 12. Det endelige PCR-produkt sekvenseres over det variable område og en konsensussekvens blir fremskaffet. For å få en god konsensussekvens bør opp til 50 kloner bli sekven-sert . 13. Den utledede peptidsekvens syntetiseres og undersøkes separat for sine bindende egenskaper.

Eksempel 2

En bibliotekpopulasjon blir fremskaffet ved å bruke en randomisert baseprimer for amplifikering av A-genet. Oppvis-ningsmodulen som tilsvarer omkring 3000 basepar er vist skjematisk som følger for det lineæriserte plasmid pEE709 (A-gen satt inn i pET8c=pET3d ved en Ncol-sete etter inn-fylling)

Hvor:

T7p = T7 promoter -10

T7t = T7 terminator

RBS = ribosombindingssete

AUG = startkodon for A-proteinet

A = A-protein

P = oppvist peptid/protein

B = bibliotek kjedeprimer inneholdende tilfeldig sekvens

(L) som angitt i eksempel 1

C = PCR primer (T7p)

D = PCR primer (T7t)

I de ovennevnte diagram starter A-gen-innskuddet med GCC (andre kodon) og slutter med GCA (base 3427-29).

(Se DNA-sekvensen til Liu et al., 1993, supra).

Primerne benyttet i eksemplet er som følger:

1. Dannelse av et peptidbibliotek.

En DNA-fragmentpopulasjon med et sett av randomiserte baser blir dannet som følger: Lineær amplifikasjon (eller primerforlengelse) blir utført på det lineæriserte (Hindlll)-plasmid pEE709 ved bibliotekprimeren B. Reaksjonsblandingen på 100 ul inneholder; 0,3 ug plasmid-DNA (omkring 6xl0<10> molekyler eller 0,1 pmol), 5 jj.g bibliotekprimer DNA (omkring 7xl0<13> molekyler eller 125 pmol) og resten av ingrediensene som beskrevet for PCR-reaksjonen nedenfor. Blandingen utsettes for 5 cykler PCR som beskrevet nedenfor. Bibliotekprimeren blir fortrinnsvis fjernet ved å bruke en Centricon-100. Det bibliotekprimerutvidede DNA (bibliotek) fortynnes og oppdeles på nytt i fem 100 ul (endelig volum) porsjoner og utsettes for begrenset PCR (5 cykler) ved å bruke primere C og D. Hver reaksjonsblanding inneholder; 0,6 ug bibliotekprimerfor-lenget DNA, 125 pmol av de respektive primere C og D, 0,2 mM av hver dNTP, 50 mM KC1, 4 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl (pH 9,0 ved 25°C) , 0,1% Triton x-100 og 2,5 U Taq DNA polymerase (Promega) i et endelig volum på 100 ul. Blandingen utsettes for 35 cykler av 1 minutt ved 94°C, 2 minutter ved 42°C og 3 minutter ved 72°C i en termocykler (Perkin Eimer modell PCR1000). PCR-produktet blir renset ved fjerning av primerne (Centricon-100), fenolbehandling og etanolutfel-ling. Ved dette punkt bør biblioteket omfatte IO12-IO13 DNA-molekyler.

En alternativ bibliotek-tillempning vil enkelt være å fo-reta PCR-cykler på vektorfragment DNA ved å bruke biblio-tekprimerne B og D til å drive PCR. 2. In vitro-translasjon og utvelgelse for et avidinbindende peptid.

A. En kombinasjon av Promega's T7 S30 og S30 lineært tem-platekstrakt blir brukt for koblet transkripsjon/translasjon av lineære DNA-templater. Transkripsjonen av A-genet blir drevet av T7 RNA-polymerase fra T7-promotoren ()»10. En av de fem DNA-biblioteksett som er fenolbehandlet og utfelt med etanol blir resuspendert i 9 ul destillert vann. Til dette volum tilsettes ingrediensene (5 (il aminosyreblanding, 20 ul S30 pre-blanding, 1 ul T7 S30 og 15 (il S30 for lineære templater) av S30 bruksanvisningen (Promega) for å danne et endelig volum på 50 ul. Den koblede transkripsjon/translasjonsprosess blir tillatt å fortsette i 60 minutter (eller så lenge som nødvendig) ved 37°C.

B. Reaksjonsblandingen (50 ul) tilsettes til 50 ul Soft-Link Avidin Resin (Promega) og tillates å blande seg i 2 timer ved romtemperatur for å velge ut peptider som binder til Avidin. Resinet blir pelletert ved sentrifugering (10000 rev/min i 5 minutter.) og vaskes (5 ganger med PBS, 20 mM Na2HP04, 100 mM NaCl pH 7,5). Potensielle avidinbin-dere blir eluert med 5 mM biotin eller enkelt ved å utsette hele avidin-Resinkomplekset for PCR med primere C og D som beskrevet i pkt. IA. PCR-produktet blir adskilt fra avidin-Resinet ved sentrifugering, blir fenolbehandlet og felt ut med etanol før det blir utsatt for en ny koblet transkripsjon/translasjon og utvelgelsessyklus. Cykler av pep-tidoppvisning og utvelging kan bli gjentatt inntil den for-ventede peptidanrikning har blitt oppnådd. Polyklonale antistoff som er spesifike overfor A-proteinet kan bli brukt for å overvåke tilstedeværelsen og økningen av protein-A bæremateriale i løpet av utvelgelsen. Etter 4. rundes utvelgelse blir det endelige PCR-produkt spaltet med restrik-sjonsenzymene Xbal og BamHI og satt inn i pET-3a (spaltet med de samme enzymer) ved ligering. Etter transformasjoner blir individuelle kolonier isolert og plasmider ekstrahert for sekvensbestemmelse av innskuddet for å fremskaffe aminosyresekvensen av peptidet.

Eksempel 3.

Et peptidbibliotek ble fremstilt og undersøkt som beskrevet i eksempel, men før translasjonen (trinn 2) blir DNA-molekylene renset og så sirkularisert med T4 DNA-ligase (New England Biolabs), i henhold til forhandlers instruksjoner i samsvar med standard fremgangsmåter (se Sambrook, 1989, supra).

I dette tilfelle behøver hybridiseringsbetingelser ikke å bli opprettholdt under utvelgelse og kan således bli utført i for eksempel, 1% Triton X-100, 0,5 M KOAc eller 1% Triton X-100, 350 mM NaCl, 55 glyserol som er betingelser som er egnet for utvelgelse for SRP-reseptor-heterodimerisering eller i 1% Triton-X100, 2M urea, 100 mM NaCl, 50 mM Tris HC1 pH 7,5 eller 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris HC1 pH 7,5 hvilke betingelser er passende for un-dersøkelse av antistoff:antigeninteraksjoner.

Eksempel 4.

Demonstrasjon av in vitro-cis-virkningen av P2 DNA repli-kas jonigangssetningsprotein A.

Forsøk 1.

En lik mengde DNA av to plasmider som bærer P2 A-genet (pEE709; bærer også et amp resistensgen, Liu og Haggård-Ljungquist, 1994, supra) og P2 A-genet fusert til en strekning på seks histidiner ved den N-terminale ende av A (pEE711; bærer også et amp-resistens gen, Liu og Haggård-Ljungquist, 1994, supra) ble utsatt for en koblet transkripsjon/translasjonreaksjon i et S30-T7 ekstrakt (Promega, USA). Tilstedeværelsen av histidinstrekningen transformer-er A-proteinet til et Ni-bindende protein. Således bør His::A uttrykkende plasmid pEE711 selektivt binde til et Ni-inneholdende fast støttemateriale dersom A-proteinet er cis-virkende i S30-T7 ekstraktet. I begge plasmidkonstruksjoner er transkripsjon av A-genet under kontroll av fag T7

<j>10 promoteren. Etter translasjon ble graden av binding til en Ni-kolonne bestemt.

Materialer og metoder.

En ug DNA av pEE709- og pEE711-plasmidene ble henholdsvis tilsatt til det koblede transkripsjon/translasjonsekstrakt-sett (20 ul S30 forblanding, 5 ul aminosyreblanding og 15 ul E. coli Tl S30 ekstraktsystem for sirkulært DNA, Promega, USA). Transkripsjonen/translasjonen ble tillatt å fortsette i 60 minutter ved 37°C. Ekstraktblandingen ble for-tynnet 12 ganger i vaskebuffer (Qiagen; Buffer 11 - 50 mM Na-fosfat pH 8,0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, 1 mM PMSF) og utsatt for Ni-utvelgelse ved tilsetning til en Ni-NTA sentrifugekolonne (Qiagen, Tyskland) ekvilibrert med Buffer 1 (50 mM Na-fosfat pH 8,0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol) under ikke-denaturerende betingelser. Vask ble foretatt tre ganger med 600 ul Buffer 11 og eluering ble utført to ganger med 250 ul Buffer 111 (50 mM Na-fosfat pH 8,0, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol) som anbefalt av forhandler (se fremgangsmåte for Ni-NTA Spin kit, Qiagen, Tyskland, våren 1994). En standard bordsentrifuge ble benyttet for å sent-rifugere Ni-kolonnene i 2 minutter ved 2000 rpm under vask og eluering. Høyeffektivitet kompetante celler JM109 (Promega, USA) ble transformert med en del av det eluerte materiale og undersøkt for ampicillinresistente kolonier. Plasmider av individuelle kolonier ble isolert og typeka-rakterisert med agarosegel elektroforese.

For å bestemme fordelingen (innhold) av plasmidtypene i det eluerte materiale ble tilstedeværelsen av plasmider målt ved transformasjon av stamme JM 109 (Promega) for amp-resistens. Kolonier ble utvalgt og analysert for sin plasmid-. type (adskilt med størrelse) etter plasmidekstraksjonen fulgt av agarosegel-elektroforese. Forholdet av pEE711 (His::A) til pEE709 (A) ved fravær av Ni-kolonneutvelgelse ble også bestemt.

Resultater:

Resultatene som ble funnet er vist i tabellen nedenfor.

Forsøk 2.

I det andre forsøket ble 2 nye plasmidkonstruksjoner pEN21

(en A-gen-konstruksjon med et amp-resistensgen, se fig. 1)

og pEN24 (en His::A-gen-konstruksjon med en markør av 6 histidinresiduer og et kanamycinresistensgen, se fig. 1) utsatt for samme type forsøk som i forsøk 1 ovenfor med mo-difikajsonen indikert i materialer og metodedelen nedenfor. Ved å benytte den forskjellige antibiotiske resistens er det mulig å velge ut for de individuelle plasmidtyper direkte som bakterielle kolonier.

Materialer og metoder.

pEN21 og 24 er derivater av pET21a og pET24a (Novagen Inc. USA). pET21a- og pET24a-vektorene er forskjellige kun ved sin utvelgbare markør (ampicillin og kanamycinresistens). pEN21 og pEN24 ble konstruert ved restriksjonsspaltning av pEE709 og pEE711 med Xbal og BlpI som spalter ut A-genet og tilstøtende områder. pET21a og pET24a ble spaltet med samme restriksjonsenzymer. A-fragmentene og nye vektor-fragmenter ble isolert fra en agarosegel etter elektroforese med SpinBind kolonner (FMC). A-fragmentet fra pEE709 ble klonet i pET21a-vektoren og His-A-fragmentet ble klonet i pET24a-vektoren. Plasmidene ble inkubert i 30 minutter i

S30-ekstraktene og plasmidtypene ble bestemt med forskjellig antibiotisk resistens ved å bruke ampicillin (pEN21) og kanamycin (pEN24) plater etter transformasjonen av E.coli-stamme BK 2118 med elektroporering. Buffer 11 ble her modifisert til å inneholde 1 mM imidazol i stedet for 20 mM imidazol og proteaseinhibitoren PMSF ble utelatt, kalt Buffer 11<*>). Ni-NTA sentrifugekolonnen ble ekvilibrert med vaskebuffer (Buffer 11<*> ikke-denaturerende betingelser). Vask ble foretatt tre ganger med 600 /il Buffer 11<*> og eluering ble utført 2 ganger med 250 ul Buffer 111 som anbefalt av forhandler (se bruksanvisning for Ni-NTA Spin kit, Qiagen, Tyskland, våren 1994). En plasmidblanding med like mengder av pEN21 og pEN24 DNA som ikke hadde blitt utsatt for S30-ekstraktet, ble utsatt for Ni-utvelgelse som en kontroll.

Resultater:

Resultatene er vist i tabellen nedenfor.

I tilfelle når S30-ekstrakt ble utelatt og den rene plasmidblanding ble utsatt for Ni-kolonnen ble ingen anrikning observert.

Konklusjoner:

Som ventet var i alle forsøk forholdene av His:A/A-plasmider ved fravær av Ni-utvelgelse omtrent 1. I motsetning til dette fører forholdet av His::A/A-plasmider etter Ni-utvelgelse (omtrent 9,3 og 3,4) til anrikning av His::A-plasmidene på henholdsvis 13 og 7. For å bestemme om disse tall demonstrerer effektiv cis-virkning av det His-merkede P2 A in vitro, er det nødvendig å sammenligne disse verdier for anrikning med anrikningen som teoretisk kunne bli oppnådd ved å bruke de eksperimentelle forhold som benyttes ovenfor. For å tillate sammenligning mellom de eksperimentelle data med de teoretiske verdier målte søker ikke-spesifikk bakgrunn i elueringsmiddelfraksjonene og bestemte mengden av His::A syntetisert i transkripsjon-/translasjonsreaksjonen. Den ikke-spesifike bakgrunn som ble tilbake i prøvene ble målt ved å utføre en nikkelkolonneutvel-gelse på plasmider uten translajson i E.coli-lysat. En tredjedel av det eluerte materiale ble transformert i E.coli og de resulterende kolonier ble talt opp. Ved å bruke den målte transformasjonseffektivitet for E.coli-cellene som ble brukt, regnet søker så ut at elueringsmidlet inneholder 0,3 fmol av hvert plasmid ved fravær av His-merket P2 A-protein.

Det er beregnet at omtrent 5 fmol (3 X 10<9> molekyler) av protein A ble syntetisert i søkers standardreaksjon. Således ved å anta at hvert His::A-molekyl som ble syntetisert bandt seg til et kodende DNA-molekyl ville den oppnådde anrikning være (5 + ,3)/,3 = 18. Den gjennomsnittlige anrikning som ble oppnådd i de to forsøk var (13 + 7)/2 = 10. Således tolker søker disse resultater til å bety at P2 A-proteinet er i stand til å effektivt å fungere i cis in vitro så vel som å oppvise en strekning på seks histidiner fusert til sin N-terminale ende. Til tross for dårlig translasjonseffektivitet i foreliggende forsøk er det ventet at et bibliotek med IO<12> deler kan bli dannet. Det er videre antatt at ytterligere eller kraftigere vasking vil forbedre anrikningen for derved å assistere produksjonen av aktuelle bibliotek.

Forsøk 5.

DNA-molekyler som skal bli brukt for ekspresjonen av et peptidbibliotek ble fremstilt.

Materialer og metoder.

DNA-molekyler som skal bli brukt for å uttrykke in vitro-peptid oppvisningsbiblioteket ble fremstilt ved amplifikering av A-genet fra det lineariserte plasmid pEN21 (se fig.

1 og eksempel 4) ved å bruke de følgende primere:

[144 nukleotider, med et område på 30 randomiserte baser og et eneste Xbal-sete (små bokstaver) som tilsvarer primer B i eksempel 2 med tillegget av 9 5' nukleotider].

C: 5' AGA TCT CGA TCC CGC GAA ATT AAT ACG ACT CAC TAT ACC

G 3' [40 baser primer som er komplementær til det oppstrøms område av plasmid pEN21 som dekker T7-promoteren så vel som baser oppstrøms for T7-promoteren som tilsvarer primer C i

eksempel 2 med et tillegg av 15 5' nukleotider].

D: 5' CAA AAA ACC CCT CAA GAC CCG 3' [21 baser primer som er komplementær til en sekvens nedstrøms for T7-terminato-ren og som tilsvarer primer D i eksempel 2].

Primerne ble syntetisert i en Applied Biosystems 394 DNA/RNA syntetisator og undersøkt med polyakrylamidgel elektroforese. Bibliotekprimeren oppviste heterogenitet på gelen grunnet sin tilfeldige natur.

Primere B og D ble benyttet for å fremstille DNA-molekylene i biblioteket i en PCR-reaksjon (utført likt med PCR-reaksjonen beskrevet i eksempel 2) ved å bruke 5 ul polymerase-buffer (10x Vent pol. Buffer, New England Biolabs), 50 pmol primer B, 20 pmol primer D, 10 ng DNA-templat (pEN21), 1 ul dNTP-blanding (10 mM, New England Biolabs), 1 ul Deep Vent polymerase (New England Biolabs), alt i et totalt volum på 50 ul, med en varmstart på 94°C i 5 minutter, en tilkob-lingstemperatur på 55°C i 30 sekunder (posttilkobling ved 58°C i 2 minutter), en polymeriseringstemperatur på 74°C i 2 minutter (postpolymerisering ved 74°C i 7 minutter) i 25 runder.

Primer C blir brukt til ytterligere å amplifikere biblioteket (og fjerne heterodupleksmolekyler) i fravær av bibliotekprimeren B. Det er tilrådelig å fjerne primer B ved opprenskning før dette amplifikeringstrinn.

Resultater:

En DNA oppvisningsmodul på omtrent 300 basepar ble dannet med en randomisert sekvens på 30 baser ved den 5'-enden av A-genet (etter startkodonet ATG). PCR-produktet som utgjør biblioteket er vist i figur 2.

Claims (18)

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et peptid- eller protein-ekspres jonsbibliotek som oppviser en mangfoldig populasjon av peptider eller proteiner, hvor peptidene eller proteinene er spesifikt assosiert med det DNA som koder for dem via kovalent protein:DNA-binding, karakterisert ved at nevnte fremgangsmåte omfatter minst de følgende trinn:

1) å fremstille et amplifikerbart genetisk bibliotek av DNA-molekyler som inneholder (i) en nukleotidsekvens som koder for en aminosyresekvens hvor aminosyresekvensen binder spesifikt til nevnte kodende sekvens via kovalent protein:DNA-binding (bindende enhet), og (ii) en nukleotidsekvens som koder for en aminosyresekvens for oppvisning (oppvisningsenhet), og 2) uttrykke det genetiske bibliotek som således er dannet, hvor nevnte DNA-molekyl, når uttrykt, gir et translasjonsprodukt som inneholder oppvisningsenheten og den bindende enhet, og hvor nevnte DNA-molekyl har minst et bindingssete for den bindende enhet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at ekspresjon av det genetiske materiale er in vitro celleekspresjon med en enkel bibliotekdel som eventuelt er til stede i mer enn en kopi, uttrykt per vertscelle eller organisme.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte aminosyresekvens, som binder spesifikt til sin kodende sekvens, er et cis-virkende protein som samvirker in vitro med DNA-sekvensen som koder for dette og som etablerer en kovalent binding med sitt eget DNA-templat og ekspresjon av det genetiske materiale er in vitro celle-ekspresjon med minst en bibliotekdel som eventuelt er til stede i mer enn en kopi, uttrykt per vertscelle eller organisme.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte aminosyresekvens som binder til nevnte kodende sekvens er avledet fra et cis-virkende protein som samvirker in vitro med DNA-sekvensen som koder for dette og som etablerer en kovalent binding med sitt eget DNA-templat og ekspresjon av det genetiske materiale blir utført in vitro ved cellefri ekspresjon.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3 eller 4, karakterisert ved at nevnte cis-virkende protein er A-proteinet av bakteriofag P2 (P2 A).

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4 eller 5, karakterisert ved at nevnte ekspresjon blir utført i nærvær av et mistilpasset oligonukleotid som hybridiserer til det DNA som ligger ved siden av festesetet på begge sider, men som ikke hybridiserer i området tilsvarende festesetet.

7. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 6, karakterisert ved at nevnte aminosyresekvens for oppvisning er opp til 40 aminosyreresiduer.

8. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 7, karakterisert ved at nevnte aminosyresekvens for oppvisning er dannet ved, eller omfatter DNA-fragmenter fra, kloning.

9. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 1 til 8, karakterisert ved at nevnte bindende enhet er modifisert slik at bindingsenheten forblir kovalent bundet til nevnte kodende DNA.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at nevnte bindende enhet er avledet fra A-proteinet av bakteriofag P2 (P2 A) som har blitt modifisert ved å erstatte tyrosin ved aminosyreposisjon 450 med fenylalanin.

11. In vitro- peptid ekspresjonsbibliotek fremstilt i henhold til fremgangsmåten ifølge ethvert av kravene 1 til 10.

12. DNA-molekyl inneholdende en DNA-sekvens som koder for et peptid eller protein for ekspresjon i et bibliotek ifølge krav 11, inneholdende (i) en nukleotidsekvens som koder for en aminosyresekvens hvor aminosyresekvensen binder spesifikt til nevnte kodende sekvens via kovalent protein:DNA-binding (bindende enhet), og (ii) en nukleotidsekvens som koder for en aminosyresekvens for oppvisning (oppvisende enhet), hvor nevnte DNA-molekyl, når uttrykt, gir et translasjonsprodukt som inneholder den oppvisende enhet og bindingsenheten og hvor nevnte DNA-molekyl har minst et bindingssete for den bindende enhet.

13. DNA-vektor inneholdende en DNA-sekvens ifølge krav 12.

14. Fremgangsmåte ved identifisering og/eller opprenskning av en bibliotekdel som oppviser ønskede egenskaper fra et peptid- eller protein-ekspresjonsbibliotek som angitt i krav 11, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter minst trinnene a) å undersøke et bibliotek som angitt i krav 11, og b) velge ut og isolere den relevante bibliotekdel.

15. Fremgangsmåte ved identifisering av et spesifikt målbindende peptid eller protein, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter minst trinnene a) å undersøke et bibliotek som angitt i krav 11 med målmolekyler, og b) velge ut og isolere en bibliotekdel som binder til nevnte målmolekyl, og c) isolere peptidet eller proteinet som binder spesifikt til nevnte målmolekyl.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at ytterligere det DNA som uttrykker peptidet eller proteinet som binder spesifikt til nevnte målmolekyl, blir isolert.

17. Fremgangsmåte for å undersøke tilstedeværelse av et målmolekyl i en prøve, karakterisert ved at nevnte fremgangsmåte omfatter (a) å sette nevnte prøve i kontakt med en molekylær probe omfattende (i) en peptid- eller proteinmålbin-dende enhet som er i stand til selektivt å binde til nevnte målmolekyl, med festet kodende DNA, DNA-enheten, valgt fra biblioteket ifølge krav 11, og (ii) en reporterenhet; og (b) direkte eller indirekte påvise den målbundne probe.

18. Bifunksjonell molekylær probe for anvendelse i assay-fremgangsmåten i henhold til krav 17, omfattende (i) en peptid- eller proteinenhet som er i stand til selektivt å binde til et målmolekyl, med festet kodende DNA, DNA-enheten, valgt fra biblioteket ifølge krav 11, og (ii) en mar-kørenhet .