PT1534830E

PT1534830E - Biblioteca de expressão de péptidos in vitro

Info

Publication number: PT1534830E
Application number: PT03793896T
Authority: PT
Inventors: Duncan Mcgregor; Richard Odegrip; Kevin Fitzgerald; Rosemarie Hederer; Bill Eldridge; Chris Ullman; Philip Kuhlman; David Coomber
Original assignee: Isogenica Ltd
Priority date: 2002-09-06
Filing date: 2003-09-05
Publication date: 2011-01-31
Also published as: US8679781B2; US20120149591A1; JP4664677B2; EP1534830A1; IL166903A; EP2385118A1; NO20051685L; CN100351375C; US7842476B2; WO2004022746A1; JP2005537795A; DK1534830T3; CA2497496A1; DE60335000D1; CA2497496C; CN1681924A; ATE488586T1; KR101051245B1; US20060035232A1; AU2003260786A1

Description

DESCRIÇÃO BIBLIOTECA DE EXPRESSÃO DE PÉPTIDOS IN VITRO Domínio da Invenção A presente invenção tem por objecto, de uma forma geral, a tecnologia de ADN recombinante e, mais particularmente, processos para a construção in vitro e o rastreio de bibliotecas de ADN para as sequências de ADN que codificam moléculas activas sob o ponto de vista biológico.

Antecedentes da Invenção 0 isolamento de um gene desconhecido que codifica um péptido desejado, a partir de uma biblioteca de ADN recombinante, pode ser uma tarefa difícil. 0 uso de sondas de hibridação pode facilitar o processo, mas a sua utilização está geralmente dependente de se conhecer pelo menos uma parte da sequência do gene que codifica a proteína. Quando a sequência não é conhecida, as bibliotecas de ADN podem ser expressas num vector de expressão e têm-se utilizado anticorpos para o rastreio de placas ou colónias para o antigénio da proteína desejado. Este procedimento tem sido útil no rastreio de pequenas bibliotecas, mas raramente ocorrem sequências que estão representadas em menos do que cerca de 1 em 105 clones, como é o caso de moléculas de ADNc que ocorrem raramente ou péptidos sintéticos, que podem facilmente faltar, tornando as bibliotecas de triagem maiores do que 106 clones muito trabalhosas e difíceis. Os rastreios de bibliotecas maiores têm exigido o desenvolvimento de processos destinados a resolver o isolamento de sequências que ocorrem raramente, 1 que se baseiam na co-selecção de moléculas, em conjunto com os ADNs que as codificam. Foram desenvolvidos processos para rastrear grandes bibliotecas in vivo, tais como expressão na superfície de fagos e "péptidos em plasmidos" usando fusões de lacl de péptidos. A expressão na superfície de fagos baseia-se em bibliotecas de ADN fundido com a extremidade do terminal de N de proteínas filamentosas que revestem bacteriófagos e na sua expressão em hospedeiros bacterianos resultando na expressão de péptidos estranhos na superfície das partículas de fagos com o ADN que codifica a proteína de fusão incluída nas partículas do fago (Smith GP de 1985, Science 228: 1315-1317). Podem então seleccionar-se bibliotecas de proteínas de fusão incorporadas nos fagos, quanto aos elementos de ligação contra alvos de interesse (ligandos). Pode-se deixar então que os fagos ligados reinfectem a bactéria Escherichia coli (E. coli) e em seguida sejam amplificados e repete-se a selecção, o que resulta no enriquecimento dos elementos de ligação (Parmley, SF, e Smith, GP 1985, Gene 73: 305-318; Barrett RW et al., 1992, Analytical Biochemistry 204: 357-364 Williamson et al. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 90: 4141 — 4145; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597). A expressão do plasmido de fusão lacl baseia-se na capacidade de ligação do ADN do repressor de lac. As bibliotecas de péptidos aleatórios fundem-se com a extremidade do terminal de C da proteína repressora de lacl. A articulação do péptido de fusão lacl com o seu ADN de codificação ocorre através das sequências lacO no plasmido, formando um complexo estável de péptido-lacl-péptido. Estes complexos libertam-se das suas bactérias hospedeiras por lise celular e os péptidos de interesse são 2 isolados por purificação por afinidade num alvo receptor imobilizado. Os plasmidos assim isolados podem então ser reintroduzidos na E. coli por electroporação para amplificar a população seleccionada para mais ciclos de triagem (Cull, MG et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 89: 1865-1869).

Estes processos bacterianos estão limitados pelo tamanho da biblioteca que pode ser criada pelos processos usuais de introdução de ADN em bactérias hospedeiras, pelo potencial de toxicidade celular dos péptidos expressos introduzidos e pela incapacidade de introduzir modificações pós-translacionais ou para incorporar novos aminoácidos no péptido expresso. Já foi descrito um sistema de ribossoma totalmente in vitro com base na ligação de péptidos ao ARN que os codifica através do ribossoma (WO91/05058). A expressão dos ribossomas também tem sido utilizada para a selecção de fragmentos de anticorpos de cadeia simples Fv (scFv) (Matheakis, LC et al. Proc 1994. Natl. Acad. Sei. EUA, 91: 9022-9026; Hanes, J. e Pluckthun, A. 1997 Proc. Natl. Acad. Sei. EUA, 94: 4937-4942). Este processo sofre da menor estabilidade do material genético do ARN e da degradação acrescida provável em certas condições de selecção em que é provável que o ARN esteja presente. O processo in vitro descrito por Griffiths e Tawfik (WO 99/02671 e WO 00/40712) aborda algumas destas preocupações por compartimentação do ADN antes da expressão de péptidos, que em seguida modificam então o ADN dentro do compartimento. Os péptidos susceptiveis de modificações, resultantes da actividade enzimática de interesse, são em seguida seleccionados numa etapa posterior. No entanto, não 3 é possível nenhuma selecção directa da actividade de ligação peptídica nem dos péptidos nem do ADN, sem a modificação do ADN que codifica o péptido e sem a libertação do ADN modificado a partir do compartimento.

Outro processo da técnica anterior, a tecnologia de exibição covalente ou TEC, está descrito na patente W09837186. Este processo baseia-se na ligação covalente da proteína ao ADN para manter a vinculação do genótipo ao fenótipo, através da acção cis da proteína de reticulação. Este processo ensina que são necessários dois requisitos para a aplicação bem sucedida desta técnica. Em primeiro lugar, é necessário que as proteínas interajam in vitro com a sequência de ADN que as codifica (acção cis) e, em segundo lugar, as referidas proteínas devem estabelecer uma ligação covalente com a matriz do seu próprio ADN. Este processo sofre com o facto de o ADN estar quimicamente modificado, o que pode impedir a recuperação e identificação do péptido de ligação de interesse.

Continua a haver necessidade de processos de construção de bibliotecas de péptidos in vitro mais versáteis, para além dos processos descritos antes, que permitam uma selecção directa da actividade de ligação, bem como da actividade enzimática e que permitam uma produção eficiente de estruturas complexas de péptidos, permitindo, ao mesmo tempo, a recuperação do material genético de codificação do péptido de interesse intacto.

Sumário da invenção A presente invenção, portanto, tem por objecto um processo para produzir uma biblioteca de expressão de péptidos in vitro, compreendendo uma pluralidade de 4 péptidos, em que cada péptido está ligado a uma estrutura de ADN que codifica o péptido, processo esse que compreende as etapas de: (a) providenciar uma estrutura de ADN compreendendo: (i) uma sequência-alvo de ADN; (ii) ADN que codifica um péptido que faz parte de uma biblioteca; e (iii) ADN que codifica um péptido capaz de se ligar directa ou indirectamente à referida sequência-alvo de ADN de (ii), de forma não covalente; em que a referida estrutura de ADN e as proteínas codificadas são seleccionadas para terem actividade cis; (b) expressar uma pluralidade de estruturas de ADN, de acordo com (a) , em que as referidas estruturas de ADN codificam uma pluralidade de péptidos que são elementos da biblioteca, de forma que cada péptido expresso não esteja ligado covalentemente ao ADN a partir do qual foi produzido.

Também tem por objecto um processo para produzir uma biblioteca de expressão de péptidos in vitro, compreendendo uma pluralidade de péptidos, em que cada péptido está ligado à estrutura de ADN que codifica o péptido, que compreende as etapas de: (a) providenciar uma estrutura de ADN compreendendo: (i) o ADN que codifica um péptido que faz parte de uma biblioteca; e 5 (ii) o ADN que codifica um péptido capaz de se ligar a um agente de forma não covalente; em que a referida estrutura de ADN e a proteína codificada são seleccionadas para terem actividade cis; (b) ligar o referido agente ou um marcador de ADN capaz de se ligar ao referido agente, à referida estrutura de ADN de (a), em que o referido agente é capaz de se ligar ao péptido codificado pelo referido ADN de (ii); e (c) expressar uma pluralidade de estruturas ADN de acordo com (b), em que as referidas estruturas de ADN codificam uma pluralidade de péptidos, membros da biblioteca, de forma que, cada péptido expresso, está ligado, por via do referido agente, ao ADN a partir do qual foi produzido. A presente invenção estende-se a bibliotecas de péptidos produzidas por esses processos e a estruturas de ADN usadas nesses processos. A presente invenção também tem por objecto processos de rastreio de bibliotecas de expressão de péptidos in vitro da presente invenção. Num aspecto providencia-se um processo de identificação e/ou de purificação de um péptido que exibe as propriedades desejadas de uma biblioteca de expressão de péptidos in vitro, produzida segundo o processo de qualquer uma das reivindicações precedentes, incluindo pelo menos as etapas de (a) triagem da referida biblioteca e (b) selecção e isolamento do elemento relevante da biblioteca. Num segundo aspecto, providencia-se um processo de identificação de um péptido de ligação a um ligante específico, compreendendo o referido processo 6 pelo menos as etapas de (a) rastreio da biblioteca de expressão de péptidos in vitro produzida segundo o processo da presente invenção com moléculas de ligandos que estão eventualmente ligados a um suporte sólido; (b) selecção e isolamento de uma ligação de um elemento da biblioteca à referida molécula-alvo; e (c) isolamento do péptido que se liga especificamente à referida molécula-alvo. Num terceiro aspecto, providencia-se um processo de identificação e/ou de purificação de um péptido que tenha a capacidade de se ligar a uma sequência-alvo específica de ADN que compreende pelo menos as etapas de (a) proporcionar uma biblioteca de expressão in vitro de acordo com a presente invenção em que o referido péptido ou a proteína de (iii) é um péptido membro da biblioteca com actividade de ligação ao ADN e em que a referida sequência-alvo do ADN de (i) é a sequência-alvo de interesse; (b) seleccionar e isolar um elemento da biblioteca em que a proteína codificada se liga à referida sequência-alvo; (c) isolar o péptido que se liga à referida sequência-alvo.

Além de isolar e/ou identificar péptidos específicos das bibliotecas da presente invenção, os processos de rastreio da presente invenção podem ser usados para isolar e/ou identificar o ADN que codifica péptidos específicos da biblioteca.

Breve descrição das figuras A figura 1 apresenta uma representação esquemática de um processo pelo qual uma estrutura de ADN da presente invenção pode ser ligada ao péptido que codifica. A figura 2 apresenta uma representação esquemática de um processo da presente invenção, através do qual uma 7 proteína de ligação ao ADN pode ser convertida numa proteína de ligação ao ADN actuando como cis. A figura 3 apresenta uma representação esquemática de como a proteína de ligação ao ADN, específica da sequência-alvo, pode ser isolada de uma biblioteca da presente invenção. A figura 4 apresenta uma representação esquemática de como uma proteína da biblioteca pode ser ligada ao seu ADN de codificação através da acção cis e a utilização de uma molécula de ligação bi-específica. A figura 5 demonstra a actividade cis: mistura a 1:1 de dois ADNs de entrada de tamanhos diferentes (CK-Repa ou V5-Repa) , seleccionados contra qualquer anticorpo. 1-ADN marcador; 2- amplificação por RCP após a selecção em anticorpos CK anti-humanos; 3- amplificação por RCP após a selecção em anticorpos anti-péptido V5. A figura 6 mostra a especificidade dos clones de ligação do anticorpo anti-V5. Ensaio de rastreio por ELISA, lido a 450 nm, dos sete clones (1-7) que mostram ligação específica ao anticorpo anti-V5. As barras, em grupos de quatro, representam o sinal de ELISA dos clones rastreados, novamente da esquerda para a direita; anticorpo anti-humano da região kapa, anticorpo anti-V5, ASB e branco. Também se apresenta um controle negativo que não expressa CK nem V5 (8). A figura 7 mostra os sinais, da DO a 450 nm de ELISA do sobrenadante da cultura, recuperado após 5 ciclos de selecção contra esporos de B. globigii no exemplo 4. A. Clone le; B. = clone lf; C. = clone lg; D. = clone 8a; E. = clone 10c; F. = clone lOe; G. = controlo negativo. A figura 8 mostra os sinais da DO, a 450 nm, de péptidos isolados após 4 ciclos de selecção contra o anticorpo anti-V5 no exemplo 5. A. = P1C12; B. = P2H1; C. = P1B5; D. = P2B8. Analisou-se o péptido-fago contra anticorpos de péptidos anti-V5 e anti-ACTH. A figura 9 mostra os sinais da DO, a 450nm, de péptidos sintéticos isolados após quatro ciclos de selecção contra albumina do ovo. A. Cl =; B. = C4; C. = C6; D = C8; E. = controlo negativo. Os péptidos foram ensaiados contra albumina do ovo, anticorpo anti-V5 e placa bloqueada (plástico). A figura 10 mostra as recuperações feitas por RCP de ADN de scFv após a selecção em ASB ou ASB-mecoprop. A. scFv anti-mecoprop seleccionado em ASB, glutationa de boi 2,5 mM. B. scFv anti-mecoprop seleccionado em mecoprop-ASB, glutationa de boi 2,5 mM. C. scFv anti-mecoprop seleccionado em mecoprop-ASB, sem glutationa de boi. D. scFv anti-mecoprop seleccionado em mecoprop-ASB, sem glutationa de boi.

Breve descrição das sequências

As SEQ ID n°s 1 a 11, 19 a 23, 26 a 35 e 45 a 47 mostram os iniciadores utilizados nos exemplos. A SEQ ID NO: 12 mostra a sequência com a estrutura TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI, a SEQ ID NO: 13 mostra a sequência com a estrutura TAC-MYC-V5-REPA-CIS-ORI, a SEQ ID NO: 24 mostra a sequência com a estrutura TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408 e a SEQ ID NO: 25 mostra a sequência com a estrutura TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408. A SEQ ID NO: 14 mostra a sequência de reconhecimento do receptor-alvo de estrogénio.

As SEQ ID n°s 15 e 16 mostram o ADN e as sequências de aminoácidos do gene repA a partir do plasmido RI do grupo 9 de incompatibilidade incFII. As SEQ ID n°s 17 e 18 mostram as sequências do elemento CIS do ADN e a forma ori da sequência do mesmo sistema.

As SEQ ID n°s 36 a 39 mostram as sequências de péptidos isolados após a selecção no exemplo 5. As SEQ ID n°s 39 a 43 mostram as sequências de clones isolados no exemplo 6.

Descrição detalhada da invenção A presente invenção tem por objecto a construção e o rastreio de uma biblioteca para uma sequência de nucleótidos que codifica um péptido de interesse, in vitro. As estruturas que codificam o péptido com interesse são desenhadas de tal forma que o péptido expresso mostra actividade cis para a estrutura. A actividade cis define-se como a capacidade do péptido para se ligar ao ADN a partir do qual o péptido foi produzido, isto é, a partir da qual foi transcrito e traduzido. A expressão in vitro dos resultados da estrutura na ligação do péptido ao ADN que codifica essa mesma molécula de péptido por meio de uma interacção não covalente. Isto difere dos ensinamentos da patente WO 98/37186, que não permite a possibilidade de uma interacção não covalente in vitro entre a proteína e o ADN que a codifica e, de facto, exclui especificamente tais interacções de terem qualquer utilidade prática para o rastreio da biblioteca.

Ligação não covalente refere-se a uma associação que pode ser interrompida por processos bem conhecidos dos especialistas na matéria, tal como a adição de um dissolvente adequado ou uma mudança nas condições iónicas, por exemplo, a adição de glicina a pH baixo ou de 10 trietilamina a pH alto. No presente caso, um exemplo típico de ligação não covalente seria a interacção não covalente entre uma proteína de ligação ao ADN e uma molécula de ADN. Inversamente, quando se forma uma ligação covalente entre o ADN e o polipéptido codificado, o péptido ou a proteína exibidos não serão libertados a partir do ADN por condições iónicas e dissolventes que destroem as interacções não covalentes de proteínas de ligação ao ADN:ADN. Por exemplo, a proteína de replicação bacteriana repA liga-se de forma não covalente à sua sequência-alvo de ADN oriR e pode ser libertada a partir desta sequência-alvo de ADN, a concentrações de sal superiores a 0,2 M de KC1 (Giraldo R. & Diaz R. 1992 J. Mol. Biol. 228: 787-802). Esta concentração de sal não afectaria uma ligação covalente, que exigiria condições muito mais severas para libertar a proteína ligada covalentemente, com um risco acrescido de danos ao ADN recuperado. A presente invenção descreve a actividade cis e a ligação não covalente que permitem que o péptido ou a proteína codificados permaneçam associados às estruturas de ADN, com um semi-período de vida suficiente para permitir que os péptidos individualmente e o ADN associado que codifica esses péptidos com uma actividade de interesse, sejam separados da mistura resultante de complexos de ADN e proteínas. Por exemplo, a associação entre a proteína codificada e o seu ADN pode ter um semi-período de vida até 30 minutos, até 45 minutos, até uma hora, até 2 horas, até 6 horas ou até 12 horas. Os processos de rastreio da presente invenção podem por isso ser realizados imediatamente após a construção da biblioteca ou mais tarde, por exemplo, até um, até dois, até seis, até doze horas ou até vinte e quatro horas ou mais do que vinte e quatro horas mais tarde. 11

Surpreendentemente, portanto, a presente invenção, aqui descrita, demonstra que esses péptidos ou proteínas codificados podem ser expressos in vitro e ligar-se ao ADN que codifica o péptido, na presença de outras sequências de ADN. A presente invenção também demonstra que a ligação covalente entre proteínas e ADN não é necessária para se manter a actividade cis e que a interacção não covalente entre o ADN e a proteína de ligação é suficiente para permitir a selecção de péptidos numa expressão in vitro e num sistema de selecção.

De acordo com a presente invenção, os elementos individuais de ADN da biblioteca, cada um dos quais codifica um péptido a ser expresso na biblioteca de expressão de péptidos (péptido membro da biblioteca) são colocados numa estrutura de ADN adequada. A estrutura de ADN na qual o elemento da biblioteca de ADN é colocado inclui todas as sequências necessárias para permitir a expressão do péptido membro da biblioteca a partir da estrutura e para permitir que o péptido codificado pela estrutura se ligue à estrutura de ADN que o codifica. Cada péptido na biblioteca normalmente compreende uma proteína de fusão compreendendo o péptido membro da biblioteca fundido com um péptido envolvido na ligação da proteína de fusão à estrutura relevante de ADN. Essas proteínas de fusão podem incluir ainda outras sequências e o referido péptido da biblioteca pode ser associado ao referido péptido de ligação através de uma sequência ligante.

Uma pluralidade dessas estruturas, que codificam uma pluralidade de diferentes péptidos, membros da biblioteca, formam uma biblioteca de ADN da presente invenção. A expressão dessa biblioteca de moléculas de ADN resulta na ligação não covalente, de proteínas codificadas 12 individualmente, ao ADN que as codifica e a partir do qual foram transcritas e traduzidas, na presença de muitas outras moléculas de ADN que codificam os outros elementos da biblioteca. A sequência que codifica o membro da biblioteca de péptidos presente numa determinada proteína codificada estará portanto presente no ADN que está ligado a essa proteína. Este processo, portanto, liga o péptido membro da biblioteca, numa forma biologicamente activa (geralmente com uma actividade de ligação), à sequência de ADN desse péptido, elemento específico da biblioteca, que codifica esse péptido, permitindo a selecção de péptidos de interesse, por exemplo, devido a uma actividade particular de ligação e subsequente isolamento e identificação do ADN que codifica péptido membro da biblioteca.

Para os efeitos da presente invenção, uma biblioteca de ADN é, portanto, uma população de estruturas de ADN. Cada estrutura é composta por uma sequência de ADN que codifica um péptido a ser expresso como um péptido membro da biblioteca e cada um contém um promotor apropriado e sinais de início e de paragem da tradução. Uma biblioteca de ADN da presente invenção irá conter uma pluralidade dessas moléculas de ADN. Providencia-se uma pluralidade de estruturas de ADN, cada uma delas codificando um péptido membro da biblioteca para proporcionar uma pluralidade de membros diferentes da biblioteca. De preferência, uma biblioteca de ADN irá conter pelo menos 104 moléculas discretas de ADN. Por exemplo, uma biblioteca de ADN pode conter mais do que 106, mais do que 108, mais do que IO10, mais do que 1012 ou mais do que 1014 moléculas discretas de ADN.

Uma biblioteca de expressão de péptidos define-se como uma população de sequências peptídicas expressa a partir de 13 uma biblioteca de moléculas de ADN. Uma biblioteca de expressão de péptidos da presente invenção envolve, portanto, uma biblioteca de péptidos, que estão ligados não covalentemente ao ADN que os codifica. Por exemplo, uma biblioteca de expressão de péptidos da presente invenção pode ser uma biblioteca de pelo menos 104 proteinas discretas, cada uma com uma sequência de péptidos da biblioteca, expressa a partir de uma biblioteca de moléculas de ADN. Uma biblioteca de expressão de péptidos da presente invenção pode ser qualquer biblioteca formada pela expressão de uma biblioteca de ADN da presente invenção.

Um elemento da biblioteca de péptidos pode ser definido como uma cadeia de aminoácidos de composição variável, com pelo menos dois aminoácidos de comprimento ou parte ou a totalidade de uma proteína que ocorre naturalmente, tal como uma enzima, uma molécula de ligação tal como um receptor ou um anticorpo ou um fragmento do mesmo. Um elemento apropriado da biblioteca de péptidos pode ser um péptido tendo uma composição aleatória de aminoácidos. 0 péptido de composição variável ou aleatória pode ser flanqueado por sequências conhecidas de aminoácidos com terminais de N e/ou C para restringir a estrutura. Estas sequências conhecidas podem variar de comprimento. 0 péptido de composição variável ou aleatória pode ser inserido em várias posições numa estrutura conhecida de proteina, tal como um receptor ou um anticorpo ou outras proteinas ou os seus fragmentos. 0 péptido pode ser inserido na mesma estrutura de proteina uma ou mais de uma vez, por exemplo, duas ou mais vezes. A estrutura de ADN, de acordo com a presente invenção, pode incluir um ADN que codifica um péptido membro da 14 biblioteca e os meios para o péptido codificado se ligar à estrutura de ADN de codificação. Para além do ADN de codificação de um péptido membro da biblioteca, uma estrutura de ADN adequada, da presente invenção, compreende pelo menos uma sequência alvo de ADN e o ADN que codifica um péptido capaz de se ligar, directa ou indirectamente, à sequência-alvo de ADN.

De acordo com a presente invenção, a estrutura de ADN e as proteínas codificadas são escolhidas para ter actividade cis. Ou seja, a proteína codificada tem a capacidade de se ligar especificamente à molécula de ADN que a codifica. Por exemplo, a actividade cis pode funcionar para permitir que o péptido codificado de ligação ao ADN se liga especificamente (directa ou indirectamente) à sequência-alvo da estrutura de ADN que o codifica, em vez da sequência-alvo de outra estrutura de ADN.

Nalguns casos, a actividade cis pode ser providenciada devido à presença de um elemento de ADN que dirige a actividade cis, ou seja, que permite ou obriga a proteína codificada pela estrutura de ADN a ter actividade cis e, portanto, a ligar-se à sua sequência de codificação. Noutros casos, um elemento separado do ADN, per se não pode ser exigido quando a natureza do ADN de codificação confere, inerentemente, actividade cis ao péptido codificado.

Um elemento de ADN que dirige a actividade cis pode ser providenciado na estrutura de ADN em conjunto com o ADN que codifica um péptido que interage com esse elemento cis. Por exemplo, no caso do elemento cis do sistema de repA discutido a seguir, pode-se providenciar um fragmento de ADN de codificação da sequência repA compreendendo pelo 15 menos 20 aminoácidos do terminal C de repA, juntamente com o elemento cis do ADN. Pode ser possível conferir esta actividade cis a um péptido de ligação ao ADN que normalmente não tem uma actuação cis, incluindo na estrutura de ADN um elemento de ADN e quaisquer outras sequências necessárias para sua acção. Por exemplo, o ADN que codifica um péptido que interage com o elemento cis usado pode ser incluído na estrutura de ADN.

Alternativamente, um péptido que interage com o elemento cis pode fazer parte do péptido de ligação ao ADN. Por exemplo, o péptido de ligação ao ADN pode ser repA que compreende a sequência que interage com o elemento cis de repA. Alternativamente, o péptido de ligação ao ADN pode ligar-se ao ADN que o codifica em cis sem necessidade de um elemento cis separado.

Um elemento apropriado de ADN pode ser qualquer elemento que permita ou dirija a actividade cis. Esse elemento de ADN pode actuar, por exemplo, interagindo com o mecanismo envolvido na tradução e na transcrição da estrutura do ADN para atrasar a produção e libertar o péptido codificado.

Qualquer elemento de ADN que permita que o péptido codificado se ligue especificamente à molécula de ADN que o codifica pode ser utilizado como um elemento de ADN de acordo com a presente invenção. Um exemplo de um elemento de ADN adequado é o do sistema de repA-cis descrito com mais detalhe a seguir. Nesse sistema, a ARN-polimerase é interrompida por ansas na sequência 5' cis antes da terminação dependente de rho da transcrição. A acção do elemento de ADN permite, portanto, que o péptido de ligação 16 codificado se ligue à sequência-alvo de ADN na estrutura a partir da qual foi produzido.

De preferência, o elemento cis do ADN estará localizado na posição 3' na estrutura de ADN em relação ao péptido membro da biblioteca e ao péptido ou proteína capazes de se ligarem à sequência-alvo de ADN. Isto significa que estas sequências podem ser transcritas e traduzidas antes de a ARN-polimerase atingir a sequência de actuação cis.

De acordo com a presente invenção, o péptido de ligação pode ser ligado à estrutura de ADN, directa ou indirectamente. No caso de ligação directa, o péptido de ligação liga-se directamente e de forma não covalente à sequência-alvo de ADN. No caso de ligação indirecta, a ligação entre o péptido de ligação e a estrutura de ADN é feita por uma outra molécula. Essa molécula, por exemplo, um agente bifuncional, tal como descrito a seguir, vai associar-se tanto o péptido como à sequência-alvo de ADN.

Uma estrutura apropriada de ADN pode incluir outras sequências, por exemplo, sequências adequadas de promotores para permitir a expressão do péptido codificado.

Um exemplo de um sistema em que actividade cis existe é o da proteína de replicação do plasmido do grupo de incompatibilidade com a actuação cis, denominado Repa. Aspectos deste sistema podem ser utilizados na presente invenção, conforme se explica a seguir.

Numerosos plasmidos incluem sequências que codificam elementos repA e de ADN cis. A sequência repA e o elemento cis do ADN numa estrutura de ADN da presente invenção podem 17 ser derivados da mesma estirpe de plasmido ou podem ser derivados de diferentes estirpes de plasmido.

Acredita-se que o sistema de repA-cis actua como se mostra na figura 1. Resumidamente, a ARN-polimerase é intervalada por ansas na sequência 5'-CIS antes da terminação da transcrição dependente de rho. Isto permite a interacção temporária do péptido repA do terminal C com CIS e, possivelmente, a flexão do ADN. 0 péptido RepA, em seguida, liga-se a ori, que está a uma distância definida do aminoácido do terminal da sequência de codificação de repA (Prazkier et al. 2000 J. Bacteriology 182: 3972-3980; Praszkier e Pittard Bacteriol, J. Bacterriol. 181: 2765-2772; Masai e Arai. 1958 Nucleic Acids Res. 16: 6493-6514). A compatibilidade de uma sequência de RepA a partir de um plasmido com uma sequência cis de outro plasmido pode ser facilmente determinada através da monitorização da interacção da RepA com a sequência cis seleccionada.

Elementos apropriados de proteínas repA e sequências e elementos cis de ADN incluem os dos plasmidos do complexo lncl ou os plasmidos IncF, IncB, IncK, IncZ e IricL/M, que são parentes distantes, ao nível do ADN, mas que controlam a replicação do plasmido através da acção da proteína repA actuando como cis (Nikoletti et al. 1986 J. Bacteriol. 170: 1311-1318; Prazkier J. et al. 1991 J. Bacteriol. 173: 2393-2397). Plasmidos específicos que podem ser usados para fornecer estas sequências incluem o plasmido Rl do grupo de incompatibilidade lncll e o plasmido pMU720 de incB (descrito por Praskier J. & J. Pittard 1999 Role of CIS en replication of nlncB plasmid, J. Bacteriol. 181: 2765-2772) . O ADN e as sequências de aminoácidos de repA derivadas do plasmido Rl de lncll estão indicados nas SEQ 18 ID n°s: 15 e 16. A sequência de ADN do elemento cis de ADN do plasmido Rl de lncll é dada na SEQ ID NO: 17. Normalmente, o elemento cis tem de 150 a 200 nucleótidos de comprimento. Podem utilizar-se sequências maiores ou menores, desde que a sequência mantenha a capacidade de interagir com RepA e exiba actividade cis. Variações menores, como as substituições ou as supressões dentro da sequência cis também estão contempladas, tais como alterações nos nucleótidos 1, 5, 10 até 20 na sequência cis de tipo selvagem. O elemento cis é necessário para a actividade cis da proteina repA (Praszkier e Pittard 1999, J. Bacteriol. 181: 2765-2772) . O elemento cis do ADN deve estar por isso localizado em 3' na estrutura de ADN em relação ao ADN que codifica a sequência repA. Ao atingir a sequência cis, a ARN-polimerase será intervalada, permitindo que a proteina codificada se ligue à sequência-alvo do ADN.

Num enquadramento da presente invenção, a própria proteina de ligação ao ADN compreende RepA ou um seu fragmento ou uma sua variante capaz de se ligar ao ADN, incluindo pelo menos os 20 aminoácidos do terminal C de RepA, capazes de se ligarem ao elemento cis de ADN. Neste enquadramento, a sequência-alvo de ADN é composta por uma sequência de ori, por exemplo, a sequência oriR. Em aspectos alternativos da presente invenção, a proteina de ligação ao ADN tem origem numa proteina alternativa com as sequências-alvo relevantes do ADN reconhecidas por essa proteina de ligação incorporada na sequência. Em cada um destes enquadramentos, a ligação ADN-proteína é directa dado que o péptido codificado pela estrutura de ADN ligar-se-á directamente à estrutura de ADN de codificação. Em aspectos alternativos da presente invenção, conforme 19 descrito em mais detalhe a seguir, a ligação de ADN-proteína pode ser indirecta através da utilização de marcador péptido - marcador de ADN , agente bifuncional e/ou ligantes adequados.

Num aspecto, a mesma sequência pode, portanto, fornecer tanto o péptido capaz de se ligar à sequência-alvo de ADN como os aminoácidos do terminal C de repA. Tal sequência pode ser ou pode incluir uma sequência completa de repA ou um fragmento ou uma variante de uma sequência completa de repA que mantém a capacidade de se ligar à sequência-alvo do ADN utilizada. Sempre que repA actua como uma proteina de ligação ao ADN, tanto as sequências cis como ori (Praszkier e Pittard 1999 J. Bacteriol. 181: 2765-2772) são necessárias para a actividade cis (cis) e a ligação ao ADN (ori) . Neste aspecto, portanto, a sequência-alvo de ADN é uma sequência de ori e o péptido ou a proteina capaz de se ligar ao referido alvo é uma proteina repA. A posição de ori nas estruturas de ADN da presente invenção pode ser variada. Conforme descrito antes, as sequências repA, cis e ori apropriadas podem ser providenciadas por um ou mais plasmidos. Por exemplo, as sequências adequadas podem ter origem nos plasmidos de complexos de InCI ou de IncF, IncB, IncK, IncZ e IncL/M. A sequência de ADN de ori com origem no plasmido Rl de lncll está ilustrada na SEQ ID NO: 18. Esta sequência ou um seu fragmento pode ser incluída numa estrutura de ADN da presente invenção. Uma estrutura de ADN da presente invenção pode incluir uma sequência completa de ori ou pode incluir um seu fragmento que seja capaz de estar ligado pela proteína repA que está a ser utilizada. A proteína RepA utilizada de acordo com a presente invenção também pode incluir um fragmento ou uma variante 20 de RepA, desde que essa variante ou esse fragmento de RepA mantenha a capacidade para se ligar à sequência seleccionada de ori. Essa variante ou fragmento de RepA pode incluir substituições, por exemplo, em 1, 2, 3 até 20 aminoácidos na sequência RepA, desde que essas variantes mantenham a capacidade de se ligar à sequência de ori. Um fragmento adequado de RepA é uma sequência de ligação ori de RepA. As sequências ori incluem as que estão presentes em plasmidos do tipo selvagem, como descrito antes. Normalmente, essa sequência ori tem 170 a 220 nucleótidos de comprimento. Também podem ser utilizados fragmentos e variantes da sequência de ori de tipo selvagem, desde que essas sequências ori mantenham a capacidade de serem reconhecidas por RepA. Podem utilizar-se outros elementos da família da proteína RepA actuando como cis. Por exemplo, a família de proteínas RepA encontra-se em plasmidos com uma ampla gama de hospedeiros, isto é, pode-se encontrar um plasmido de RepA em diferentes espécies bacterianas. O isolamento de um plasmido da família de repA a partir de (por exemplo) uma bactéria termofílica, sulfofílica, halofílica ou acidofílica, proporcionaria ADN de repA-cis-ori que podia ser usado na presente invenção a temperaturas elevadas ou a temperaturas extremas de sal, pH e concentrações de enxofre. Esses membros da família RepA seriam vantajosos no isolamento de membros da biblioteca que se podem ligar a moléculas-alvo nessas condições extremas. As sequências ori apropriadas para serem usadas em combinação com proteínas seleccionadas de RepA podem ser facilmente determinadas através da monitorização da interacção da RepA com essa sequência de ori. O princípio básico da presente invenção pode ser descrito com referência ao sistema repA/cis/ori, como se mostra na figura 1. Esta mostra um exemplo de uma estrutura 21 de ADN da presente invenção. Esta estrutura inclui, desde 5' a 3', uma sequência promotora, uma sequência de codificação de um péptido membro da biblioteca, uma sequência de codificação de uma proteina RepA, um elemento cis de ADN e uma sequência de ori. Em resumo, a sequência do ADN é transcrita a partir do promotor pela ARN-polimerase até ao ARN. A função de determinação dependente de rho presente no elemento cis de ADN faz com que a ARN-polimerase seja interrompida nesta parte da sequência. Isto permite que a proteina repA e o péptido da biblioteca sejam traduzidos. A proteina repA então é capaz de se ligar à sequência de ori, que liga a proteina codificada à estrutura do ADN de codificação.

Num enquadramento preferido, as sequências de ADN membros da biblioteca fundem-se com o ADN de repA, cis e ori do plasmido Rl de IncFII (Masai H et al. 1983 Proc Natl Acad Sei USA 80: 6814-6818). Neste enquadramento, as sequências de ADN com interesse, membros da biblioteca, podem ser unidas por uma região de ADN que codifica um ligante flexível de aminoácido à extremidade 5' do ADN de repA, sob o controlo de um promotor apropriado e as sequências de tradução para transcrição/tradução in vitro. Muitos promotores adequados são conhecidos pelos especialistas na matéria, tal como o promotor araB, tac ou os promotores T7, T3 ou SP6, entre outros. O promotor deve estar a montante da sequência polipeptídica a ser expressa. A família de proteínas repA é usada aqui como exemplo e não é limitativa. Podem ser utilizadas na presente invenção outras proteínas de ligação ao ADN actuando como cis e não ligadas covalentemente. 22

Noutro enquadramento, as proteínas de ligação ao ADN não actuando como cis podem ser convertidas para terem actividade cis (ver figura 2) . Isto pode ser conseguido utilizando proteínas capazes de se ligar à sequência-alvo de ADN, directa ou indirectamente, em combinação com sequências que lhes podem conferir actividade cis. A actividade cis pode ser conferida a uma proteína de ligação que normalmente não actua em cis, incluindo na estrutura do ADN um elemento de ADN que dirige a actividade cis tal como o elemento cis do sistema de repA. Esse elemento pode ser incluído para garantir que a ligação ao ADN, pela proteína de ligação ao ADN é cis ou seja, uma proteína codificada, de ligação ao ADN que se vai ligar à estrutura de ADN a partir da qual foi transcrita e traduzida.

Num enquadramento, uma estrutura de ADN adequada pode, portanto, compreender o elemento de ADN que dirige a actividade cis (o elemento cis de ADN) do sistema de repA. Esse elemento pode ainda compreender um ADN de codificação de uma porção da extremidade do terminal C de RepA, de preferência pelo menos 20 aminoácidos, mais preferivelmente 30 aminoácidos, até 40, 50, 60 ou 70 aminoácidos da porção do terminal C de RepA, em que o referido fragmento de repA é capaz de interagir com o elemento de ADN dentro da estrutura. Noutro exemplo, as proteínas como as transposases agindo como cis, Tn5 e IS903, entre outras, podem ser utilizadas na presente invenção (McFall E. J. Bacteriol Agosto de 1986, 167: 429-432; Derbyshire KM e Grindley Key. Mol Microbiol. Set. 1996, 1: 1261-72.). As sequências de codificação de ADN da presente invenção podem compreender sequências de tipo selvagem que codificam o fragmento desejado de RepA, fragmentos de codificação de sequências degeneradas de RepA de tipo selvagem ou variantes de sequências de codificação desses fragmentos de 23

Repa que mantêm a capacidade de interagir com o elemento cis incorporado na estrutura do ADN. Essas variantes podem incluir a substituição de 1, 2, 3 ou 4 aminoácidos entre os 20 aminoácidos do terminal C de RepA. A familia de proteínas de repA é usada aqui como um exemplo não limitativo. Qualquer elemento de ADN capaz de conferir actividade cis a uma proteína que não actua como cis, pode ser utilizado.

Qualquer proteína que não actue como cis pode ser convertido desta forma. A título de exemplo e não de exclusão, o domínio de ligação do ADN do receptor de estrogénio (DLA, na terminologia inglesa DBD) pode ser convertido numa proteína de ligação ao ADN actuando como cis. O fragmento do domínio de ligação do ADN do receptor de estrogénio (aminoácidos 176-282) tem sido expresso em E. coli e tem mostrado que se liga à sequência de nucleótidos específica de HRE do receptor-alvo do estrogénio de ADN de hélice dupla, com uma afinidade similar (0,5 nM) à da molécula parental (Murdoch et al. 1990, Biochemistry 29: 8377-8385; Mader et al, 1993, DNAs Research 21: 1125-1132). Num enquadramento, o ADN que codifica esta sequência funde-se, de preferência na extremidade 3', com o ADN de codificação, de pelo menos os últimos 20 aminoácidos de repa, o elemento cis de ADN e o ADN acima da sequência de ori seguido da sequência de reconhecimento do receptor-alvo de estrógenio (5'-TCAGG TCAGA GTGAC CTGAG CTAAA ATAAC ACATT CAG-3', SEQ ID NO: 14), que substitui a sequência de reconhecimento de ori de repA. A sequência de ADN de interesse pode então unir-se, por meio de uma região de ADN que codifica um ligante flexível de aminoácido, à extremidade 5' do fragmento de ADN do receptor de estrogénio, sob o controlo de um promotor e de sequências 24 de tradução adequados para a transcrição/tradução ín vitro. A expressão deste polipéptido direcciona o DLA do receptor de estrogénio para a sua sequência-alvo, presente no local normal da sequência ori, no ADN que codifica esse polipéptido. Os complexos de ADN-proteina podem então ser isolados por captura numa proteína-alvo. Os complexos de proteínas-ADN não ligados podem ser lavados, permitindo o enriquecimento do ADN que codifica os péptidos ou as proteínas de interesse, que podem então ser recuperados por RCP e enriquecidos ainda mais realizando vários ciclos de expressão in vitro e a captura do complexo de ADN-proteina usando os processos descritos anteriormente.

Ficará claro que esta abordagem se aplica a outras proteínas de ligação do ADN, usando simplesmente o elemento cis de ADN e uma sequência de codificação de pelo menos 20 aminoácidos do terminal C de RepA ou elementos equivalentes de um sistema diferente com actuação cis nas estruturas de ADN.

Noutro enquadramento, bibliotecas de proteínas aleatórias de ligação ao ADN, tal como proteínas de dedo de zinco, proteínas de hélice-volta-hélice ou proteínas de hélice-ansa-hélice, a título de exemplo, podem ser seleccionadas para a ligação específica a uma sequência-alvo de interesse (ver figura 3) . Neste enquadramento, a sequência de reconhecimento de ori de repA pode ser substituída por uma sequência-alvo de interesse e a maioria das sequências de codificação de repA por proteínas aleatórias de dedo de zinco de uma biblioteca. As proteínas de ligação ao ADN, portanto, podem actuar tanto como péptidos membros da biblioteca, como proteínas capazes de se ligarem à sequência-alvo de ADN, neste aspecto. O ADN que codifica cada proteína de dedo de zinco pode ainda 25 unir-se, na região da extremidade 5', com uma sequência marcadora de um péptido que pode ser reconhecida por uma outra proteína de captura, tal como um anticorpo e, na extremidade 3', com o ADN de codificação de pelo menos os últimos 20 aminoácidos de RepA, o elemento cis de ADN e o ADN até a sequência de ori seguido da sequência-alvo de interesse. A expressão deste polipéptido direcciona a proteína de dedo de zinco para a sequência-alvo de interesse, presente no local normal da sequência ori, no ADN que codifica esse polipéptido. A ligação à sequência-alvo só poderá ocorrer se o domínio aleatório do dedo de zinco for capaz de se ligar à sequência de interesse. Os complexos de ADN-proteína podem então ser isolados por captura com uma proteína de ligação que reconhece o marcador do péptido no terminal N do polipéptido da proteína de fusão. O ADN não ligado pode ser eliminado por lavgem, permitindo o enriquecimento de ADN que codifica as proteínas de dedo de zinco capazes de se ligarem à sequência-alvo, que podem então ser recuperadas por RCP e ainda mais enriquecidas através da realização de mais alguns ciclos de expressão in vitro e por captura dos complexos de ADN-proteína.

Como se explicou antes, o péptido de ligação pode ligar-se directamente à sequência-alvo do ADN, por exemplo, no caso de um par de sequências-alvo - proteína de ligação ao ADN ou pode ligar-se indirectamente à sequência-alvo de ADN, por exemplo, através de um agente bifuncional e, eventualmente, um marcador de ADN (ver figura 4).

Num enquadramento, o ADN que codifica um marcador de péptido que não é capaz de se ligar directamente à sequência-alvo de ADN une-se à extremidade 5' das sequências de interesse de ADN, membros da biblioteca, 26 opcionalmente, por meio de uma região de ADN que codifica um ligante flexível de aminoácido, sob o controlo de um promotor e de sequências de tradução adequados para a transcrição/tradução in vitro. Isto forma o ADN que codifica o péptido de ligação, porque o péptido codificado está ligada indirectamente à sequência-alvo de ADN. Opcionalmente, na extremidade 3' da sequência de ADN membro da biblioteca está o ADN que codifica pelo menos os últimos 20 aminoácidos de repA e o elemento cis de ADN, mas não a sequência-alvo ori de repA. A sequência-alvo de ADN pode ser ou pode incluir um marcador de ADN. Esse marcador de ADN pode ser uma única base modificada. Por exemplo, ao preparar a estrutura da biblioteca de ADN contendo os elementos descritos, o ADN pode ser marcado na extremidade 3' com, por exemplo, sem ser limitativo, moléculas como a fluoresceína ou a biotina.

Antes da expressão in vitro, podem misturar-se os fragmentos de ADN da biblioteca com um agente bifuncional, uma função que consiste em reconhecer e ligar-se à sequência-alvo que pode estar na extremidade 5' do ADN, numa proporção de um fragmento de ADN : uma molécula bifuncional. O outro elemento funcional deste agente bifuncional é um agente de ligação que pode reconhecer e ligar-se ao marcador de péptido que pode estar codificados na extremidade 5' do fragmento de ADN. A título de exemplo, não de exclusão, o agente bifuncional pode ser composto por um fragmento Fac (Fab na terminologia inglesa) reconhecendo o marcador de biotina ou de fluoresceína no ADN e outro fragmento Fac reconhecendo o marcador do péptido codificado no ADN. É claro para os especialistas na matéria que este agente bifuncional pode ser preparado por diversos processos diferentes, tais como reticulação química dos dois elementos ou por expressão dos dois elementos como uma 27 proteína de fusão ou como um anticorpo bi-específico. Os referidos processos de criação de um agente bifuncional são dadas a título de exemplo e não de exclusão. 0 agente bifuncional pode ser ligado à estrutura de ADN antes da expressão do péptido codificado ou pode ser fornecido durante a expressão. A proteína de fusão é, então, transcrita e traduzida a partir da estrutura de ADN, enquanto está ligada ao agente bifuncional. 0 marcador do péptido é traduzido primeiro e pode ser ligado pelo segundo elemento do agente bifuncional, antes da libertação do ARN mensageiro ou da ARN-polimerase do ADN. Isto cria um complexo funcional de proteína-ADN em que tanto o polipéptido expresso como o ADN que codifica o péptido estão ligados através do agente bifuncional. A molécula do marcador do péptido liga-se assim indirectamente, mas especificamente, ao ADN-alvo (marcador) . Ao ligar a proteína à estrutura do ADN, desta forma, é possível seleccionar uma proteína com propriedades específicas, como descrito a seguir e depois identificar o ADN de codificação que está ligado a essa proteína. Usando um agente bifuncional, em vez de uma ligação covalente entre a proteína e o ADN, a estrutura de ADN pode ser mais facilmente separada da proteína sem o risco de danificar o ADN.

Os complexos de ADN-proteína podem então ser isolados pela captura de uma proteína-alvo. Os complexos de proteína-ADN não ligados podem ser eliminados por lavagem, permitindo o enriquecimento do ADN que codifica os péptidos ou as proteínas de interesse, que pode depois ser recuperado por RCP e enriquecido de novo por meio da realização de vários ciclos de expressão ín vitro e captura 28 do complexo ADN-proteína usando os processos descritos anteriormente.

Além disso, neste enquadramento, o ADN pode ser ligado directamente, por exemplo, por ligação covalente, a um agente bifuncional, tal como um polímero. Esse polímero pode conter mais do que um elemento de ligação que poderia reconhecer o marcador do péptido, permitindo a exibição polivalente de uma molécula da biblioteca de expressão de péptidos numa unidade que contém o ADN que codifica o péptido expresso. A título de exemplo, não limitativo, os referidos polímeros podem ser compostos por polietileno, bem como por outros compostos poliméricos, capazes de serem fundidos com o ADN. A estrutura de ADN da presente invenção pode assim ser fornecida ligada a esses agentes bifuncionais ou ligada a um marcador de ADN, tal como descrito antes, que é capaz de se ligar a esses agentes bifuncionais.

Em todos os enquadramentos da presente invenção, as estruturas de ADN incluem um promotor e sequências de tradução adequados para a transcrição/tradução in vitro. Pode-se utilizar qualquer promotor adequado, tal como o promotor ara B, o promotor tac, os promotores T7, T3 ou SP6, entre outros. 0 promotor é colocado de modo que fique ligado operacionalmente às sequências de ADN da presente invenção de tal forma que tais sequências sejam expressas. 0 ADN que codifica os péptidos membros da biblioteca pode ser produzido por qualquer meio adequado. Em particular, esse ADN pode incluir um ADN isolado de ADNc, obtido pela técnica de transferência de ADN e ADN sintético. 29 A estrutura de ADN também pode codificar ligantes de aminoácidos na proteína de fusão expressa. Em particular, pode-se incluir um ligante flexível de aminoácido para unir o péptido de ligação ao ADN/RepA ao péptido membro da biblioteca.

De acordo com a presente invenção, no que se refere a este enquadramento preferido, podem-se gerar bibliotecas de expressão de péptidos ou de proteínas, ligados ao ADN que os codifica e péptidos com a actividade desejada, seleccionados nas seguintes etapas:

Construção de uma biblioteca de proteínas de fusão.

Uma biblioteca de ADN de péptidos ou de proteínas pode fundir-se com o ADN de codificação de um péptido capaz de se ligar à sequência-alvo de ADN, tal como um ADN de uma proteína de ligação ao ADN que actua como cis, por meio de uma região de ADN que codifica um ligante flexível de aminoácido, sob o controlo de um promotor adequado e com uma tradução ou um sítio de ligação dos ribossomas, codões de iniciação e de paragem, de uma forma adequada para a expressão in vitro dos membros da biblioteca de péptidos e proteínas de ligação. No exemplo da proteína repA, os membros da biblioteca ADN (tal como ADN) fundem-se com o ADN da proteína de ligação ao ADN de repA ou com um seu fragmento. As sequências cis e ori podem ser incluídas na estrutura a jusante dos outros elementos. No caso de uma biblioteca de ADN, as referidas estruturas de ADN são desenhadas para serem adequadas para a transcrição e a tradução in vitro. 30

Expressão e ligação cis de proteínas de fusão da biblioteca de ADN. A fim de permitir a actividade cis, pode-se utilizar um ambiente acoplado de transcrição/tradução bacteriana tal como o sistema de extracto de S30 (Zubay, G. 1973. Ann. Rev. Genet 7: 267). A expressão do péptido, tal como o péptido-proteina de fusão de repa, membros da biblioteca de ADN, neste ambiente, resultará na ligação da proteína de fusão ao ADN que codifica essa proteína de fusão, desde que ambas as sequências cis e ori estejam presentes. Quando as bibliotecas de péptido-proteínas de fusão de repA são expressas desta forma, este processo resulta na produção de bibliotecas de complexos de proteína-ADN em que a proteína ligada ao ADN é codificada por esse fragmento de ADN a partir do qual foi expressa, permitindo assim a posterior selecção tanto dos péptidos como das proteínas de interesse e o ADN que codifica os referidos péptidos. A complexidade destas bibliotecas é aumentada pela natureza do processo in vitro, podendo ser facilmente geradas bibliotecas com pelo menos 1010-1014 fragmentos de ADN ou ainda bibliotecas maiores.

Os compostos que impedem a actividade da nuclease ou reduzem as interacções não específicas de ADN-proteína ou proteína-proteína podem ser adicionados durante esta reacção de transcrição/tradução e a ligação de cis. Exemplos de compostos apropriados incluem detergentes e proteínas de bloqueio tal como a albumina de soro bovino (ASB). 31

Selecção do péptido de interesse.

Pode-se utilizar uma biblioteca de expressão de péptidos in vitro, produzida por um processo da presente invenção, para a triagem de membros específicos da biblioteca. Por exemplo, a biblioteca pode ser rastreada para péptidos com uma determinada actividade ou uma afinidade de ligação particular. Os complexos de interesse de proteína-ADN podem ser seleccionados de uma biblioteca, por exemplo, por técnicas de afinidade ou técnicas de enriquecimento de actividade. Isto pode ser feito por meio de um ligando específico para a proteína de interesse, tal como um antigénio, se a proteína de interesse for um anticorpo. 0 ligando pode apresentar-se sobre uma superfície sólida tal como a superfície de uma placa de poços de ELISA ou em solução, por exemplo, com ligando biotinilado seguido da captura, numa superfície revestida com estreptavidina ou pérolas magnéticas, após uma biblioteca de complexos de ADN-proteínas ter sido incubada com o ligando para permitir a interacção ligando-ligando. No seguimento da incubação quer da fase sólida ou da solução, os complexos não ligados são eliminados por lavagem e os complexos ligados são isoladas por rompimento das interacções ligando-ligando, alterando o pH no poço ou por outros processos conhecidos dos especialistas na matéria, tal como a digestão da protease ou por libertação do ADN directamente dos complexos por meio de aquecimento ou de extracção com fenolclorofórmio para desnaturar a ligação do ADN de repA-ori. 0 ADN também pode ser libertado por um dos processos anteriores, directamente no tampão de RCP e amplificado. Alternativamente, o ADN pode ser amplificados directamente, sem libertação a partir dos complexos. Opcionalmente, o ADN não ligado pela ligação, por exemplo, da proteína repA, pode ser protegido contra a 32 degradação através de proteínas não específicas de ligação ao ADN, tais como histonas, a título de exemplo. Será claro para um especialista na matéria que se podem utilizar para este fim muitas outras proteínas não específicas de ligação ao ADN. Além disso, os compostos que impedem a actividade da nuclease ou reduzem as interacções do ADN não específico- -proteína ou proteína-proteína podem estar presentes durante o processo de selecção. Exemplos de compostos apropriados incluem detergentes, proteínas de bloqueio tal como se encontra no leite em pó ou albumina de soro bovino (ASB), heparina ou ácido aurintricarboxilico. A recuperação dos complexos ligados, a re-amplificaçâo do ADN ligado e a repetição do procedimento de selecção originam um enriquecimento dos clones que codificam as sequências desejadas, que podem então ser isoladas para a sequenciação e posterior clonagem e/ou expressão. Por exemplo, o ADN que codifica o péptido de interesse pode ser isolado e amplificado, por exemplo, por RCP. Num enquadramento, os ciclos repetidos de selecção e recuperação do ADN podem ser facilitados pelo uso sequencial de nidificação de iniciadores de RCP. As extremidades do ADN ficam geralmente danificadas após as múltiplas etapas de RCP. Para recuperar o ADN dessas moléculas danificadas são necessários iniciadores para serem hibridados longe das extremidades da estrutura de ADN, encurtando assim sequencialmente a estrutura em cada ciclo de selecção.

Num aspecto, a estrutura de ADN e/ou a proteína codificada pode ser configurada para incluir um marcador. Esse marcador de péptido ou ADN, por exemplo, como descrito antes, pode ser utilizado na separação e no isolamento de um membro de interesse da biblioteca. Esse marcador pode 33 também ser usado para suportar os elementos da biblioteca, por exemplo, num suporte sólido para ser usado nos processos de selecção aqui descritos.

Portanto, pode-se observar que os processos de triagem da presente invenção podem incluir a nova etapa de selecção e isolamento do péptido relevante da biblioteca, permitindo que o péptido exiba as propriedades desejadas e também que o ADN que codifica esse péptido seja identificado e purificado. A presente invenção engloba por isso péptidos e ADNs que tenham sido identificados por um processo da presente invenção. Estes péptidos e ADNs podem ser isolados e/ou purificados. Os péptidos ou os ADNs isolados por meio de um processo da presente invenção podem ser modificados, por exemplo, por eliminação, adição ou substituição de aminoácidos ou nucleótidos. Os péptidos ou ADNs modificados adequadamente podem ter uma identidade de sequências de aminoácidos ou nucleótidos de pelo menos 50 %, pelo menos 75 %, pelo menos 90 %, pelo menos 95 % ou mais com os péptidos ou ADNs isolados por meio de um processo da presente invenção. Os péptidos identificados por um processo da presente invenção podem ser modificados com a finalidade de serem libertados e/ou por causa da sua estabilidade. Por exemplo, esses péptidos podem ser peguilados (ligados a polietileno-glicol) para prolongar o semi-periodo de vida n soro ou para prevenir o ataque da protease. Os péptidos identificados por um processo da presente invenção podem ser modificados noutros sistemas de exibição tal como a exibição de fagos ou por síntese e rastreio de variantes de péptidos. Uma colecção dessas sequências modificadas pode formar uma nova biblioteca que pode ser incorporada em estruturas da presente invenção e 34 ainda pode ser rastreada para se encontrar, por exemplo, uma variante da sequência que exiba uma ligação melhorada a um ligando particular. Assim, num enquadramento, uma biblioteca de péptidos para ser utilizada nos processos da presente invenção pode ser uma biblioteca de péptidos relacionados sob o ponto de vista da estrutura.

Alternativamente, pode-se utilizar uma biblioteca de sequências de péptidos praticamente aleatória. Dentro deste enquadramento, podem-se rastrear numerosos tipos de bibliotecas de péptidos fundidos com a proteína de ligação ao ADN actuando como cis, incluindo: (i) Sequências aleatórias de péptidos codificadas por ADN sintético de comprimento variável. (ii) Anticorpos ou fragmentos de anticorpos, por exemplo fragmentos de anticorpos de cadeia simples Fv. Consistem em domínios de regiões variáveis de anticorpos de cadeia pesada e cadeia leve ligados por um péptido ligante flexível para criar uma molécula de ligação do antigénio de cadeia simples. (iii) Fragmentos aleatórios de ADNc de proteínas de ocorrência natural isoladas de uma população de células contendo uma actividade de interesse. (iii) Sequências aleatórias de péptidos inseridas numa região ou substituindo uma região de uma proteína conhecida, pelo que a sequência da proteína conhecida actua como uma estrutura, que restringe a sequência aleatória de péptidos. Muitas dessas estruturas já foram descritas, a título de exemplo, sem exclusão, a CTLA-4 (WO 00/60070), já foi utilizada como uma estrutura para bibliotecas de péptidos. 35

Noutro enquadramento, a presente invenção tem por objecto processos para rastrear uma biblioteca de ADN cujos elementos requerem mais do que uma cadeia para a sua actividade, tal como é requerido, por exemplo, pelos fragmentos de anticorpos Fac para a ligação do ligando. Neste enquadramento, o ADN do anticorpo de cadeia pesada ou leve une-se a uma sequência de nucleótidos que codifica um dominio de ligação do ADN, por exemplo, repA. Normalmente, as sequências desconhecidas da biblioteca de ADN de anticorpo para os genes quer de cadeia pesada (VP e CHI) quer de cadeia leve (VL e CL) são inseridas na região 5' do ADN de repA, para além de um promotor apropriado e as sequências de tradução. Assim, produz-se repA fundida com uma proteína codificada por um elemento da biblioteca de ADN, ligada ao ADN que codifica essa proteína. A segunda cadeia conhecida, codificando quer uma proteína de cadeia leve ou de cadeia pesada, é expressa separadamente quer: (a) a partir do mesmo fragmento de ADN contendo repA e a biblioteca de proteínas de fusão do primeiro polipéptido ou (b) a partir de um fragmento separado de ADN presente na reacção de transcrição/tradução in vitro. A cadeia desconhecida associa-se a uma biblioteca de proteínas de fusão desconhecidas que se fundem com a proteína repA e assim se ligam ao ADN por uma cadeia desconhecida. A biblioteca funcional de Fac pode então ser seleccionada por meio de um ligando específico para o anticorpo. 0 ADN identificado por um processo de rastreio da presente invenção, por exemplo, o ADN que codifica os péptidos elementos da biblioteca , pode ser clonado num 36 vector. Num enquadramento, o ADN identificado por um processo da presente invenção está ligado operacionalmente a uma sequência de controlo que é capaz de providenciar a expressão da sequência de codificação por meio da célula hospedeira, isto é, o vector é um vector de expressão. A expressão "ligado operacionalmente" refere-se à justaposição quando os componentes descritos estão numa relação que lhes permite funcionarem da maneira pretendida. Uma sequência reguladora, tal como um promotor, "ligada operacionalmente" a uma sequência de codificação está posicionada de maneira a que a expressão da sequência de codificação é conseguida em condições compatíveis com a sequência reguladora.

Esses vectores de expressão são construídos por rotina na técnica da biologia molecular e podem envolver, por exemplo, a utilização do ADN do plasmido e iniciadores, promotores, potenciadores apropriados e outros elementos, tais como, por exemplo, sinais de poliadenilação que podem ser necessários e que estão posicionados na orientação correcta, para permitir a expressão das proteínas. Outros vectores apropriados serão evidentes para os especialistas na matéria. A título de exemplo, sob este ponto de vista, pode-se fazer referência a Sambrook et al. 1989.

Os vectores podem ser, por exemplo, plasmidos, vírus ou vectores de fagos providenciados com uma origem de replicação, eventualmente um promotor para a expressão do referido ADN e, eventualmente, um regulador do promotor. Os vectores podem conter um ou mais genes marcadores, seleccionáveis, por exemplo, um gene resistente à ampicilina no caso de um plasmido bacteriano ou um gene de resistência para um vector de fungo. Os vectores podem ser usados in vitro, por exemplo, para a produção de ADN ou de 37 ARN ou podem ser usados para transfectar ou transformar uma célula hospedeira, por exemplo, uma célula hospedeira de mamífero. Os vectores podem também ser adaptados para serem utilizados in vivo, por exemplo, num processo de terapia de genes.

Os promotores e outros sinais de regulação da expressão podem ser seleccionados para serem compatíveis com a célula hospedeira para cuja expressão foram concebidos. Por exemplo, os promotores de levedura incluem os promotores GAL4 e ADH de S. cerevisiae e os promotores nmtl e adh de S. Pombe. Os promotores de mamíferos incluem o promotor de metalotioneína que pode ser induzido em resposta a metais pesados tal como cádmio. Também podem ser utilizados promotores virais tal como o promotor do antigénio T grande SV40 ou promotores de adenovírus. Todos estes promotores estão facilmente disponíveis na técnica.

Também podem ser utilizados promotores de mamíferos, tal como os promotores de β-actina. São especialmente preferidos os promotores específicos de tecidos. Também podem ser utilizados promotores virais, por exemplo, a repetição de terminal longo do vírus de leucemia de murino Moloney (RTL VLMM), o promotor RTL do vírus do sarcoma de Rous (VSR), o promotor SV40, o promotor IE do citomegalovírus (CMV) humano, o adenovírus, promotores do VHS (tal como os promotores IE de VHS) ou os promotores de VPH (vírus do papiloma humano), particularmente a região reguladora a montante (RRM) do VPH. Os promotores virais estão facilmente disponíveis na técnica. 0 vector pode ainda incluir sequências que flanqueiam os polinucleótidos de interesse que dão origem a polinucleótidos que compreendem sequências homólogas de 38 eucarióticas, sequências genómicas eucarióticas, de preferência sequências genómicas de mamíferos ou sequências genómicas virais. Isto permite a introdução dos polinucleótidos da presente invenção no genoma de células eucarióticas ou vírus por recombinação homóloga. Em particular, pode-se utilizar um vector de plasmido que compreende a cassete de expressão flanqueada por sequências virais para preparar um vector virai apropriado para libertar os polinucleótidos da presente invenção para uma célula de mamífero. Outros exemplos de vectores virais apropriados incluem os vectores virais do herpes simples e dos retrovírus incluindo lentivírus, adenovírus, dependovírus e vírus VPH. As técnicas de transferências de genes que utilizam estes vírus são conhecidas dos especialistas na matéria. Os vectores de retrovírus, por exemplo, podem ser utilizados para integrar, de forma estável, o polinucleótido, dando origem ao polinucleótido no genoma hospedeiro. Os vectores de adenovírus de replicação incompleta, pelo contrário, permanecem epissómicos e por isso permitem uma expressão temporária.

Esses vectores de expressão podem ser utilizados para identificar ligandos de interesse, isto é, moléculas que se ligam ao elemento da biblioteca de péptidos por meio de ensaios de ligação normalizados tais como ELISA ou ensaios enzimáticos em que substratos apropriados dão, por exemplo, uma alteração da cor, da emissão de luz ou da fluorescência. Podem utilizar-se outros ensaios funcionais, quando disponíveis.

Num enquadramento alternativo, pode-se clonar um ADN identificado por um processo da presente invenção num vector onde não se dá a expressão. Pode-se utilizar um 39 desses vectores para caracterizar melhor o ADN, por exemplo, por sequenciação.

Alternativamente, os ligandos de interesse podem ser identificados sem clonagem. Exemplos de processos apropriados incluem a expressão in vitro de sequências individuais de ADN recuperadas a partir de um processo de triagem da presente invenção e a sequenciação dos ADNs individuais recuperados desses processos de triagem. Essas sequências individuais de ADN podem eventualmente ser amplificadas. A presente invenção também inclui células que tenham sido modificadas para expressar um péptido identificado por um processo da presente invenção, por exemplo, introduzindo um vector de expressão, tal como descrito antes, numa célula. Essas células incluem linhas de células temporárias ou, preferencialmente linhas de células eucarióticas altamente estáveis, tal como células de mamíferos ou células de insectos, utilizando, por exemplo, um sistema de expressão de baculovírus, células eucarióticas inferiores, tal como células de leveduras ou procarióticas tal como células bacterianas. Exemplos particulares de células que podem ser modificadas pela inserção de vectores que codificam para um péptido identificado por um processo da presente invenção incluem células HEK293T de mamífero, de OHC, HeLa e COS. De preferência, a linha de células seleccionada será uma que não seja estável, mas também que permita uma glicosilação madura e a expressão do péptido na superfície da célula. A expressão pode ser conseguida em oócitos transformados. Um péptido identificado por um processo da presente invenção pode ser expresso em células de um animal transgénico não humano, de preferência um murganho. Um péptido identificado por um processo da 40 presente invenção pode também ser expresso em oócitos de Xenopus laevis ou em melanóforos.

Para que a presente invenção seja completamente compreendida, serão descritos agora alguns enquadramentos com mais detalhe, apenas a titulo de exemplo e não como uma limitação, com referência às figuras que se seguem.

Exemplos de alguns dos enquadramentos da presente invenção são dados a seguir:

Materiais e processos

Os procedimentos que se seguem, utilizados pelo requerente, estão descritos em Sambrook, J., et al., 1989 supra: análise dos produtos de digestão por enzimas de restrição em géis de agarose, purificação do ADN utilizando soluções concentradas de fenol/clorofórmio, preparação de solução salina tamponada com fosfato.

Os reagentes de utilização genérica foram comprados na SIGMA-Aldrich Ltd (Poole, Dorset, R.U.). Os oligonucleótidos foram obtidos na SIGMA-Genosys Ltd (Cambridgeshire, R.U.). Os aminoácidos e os extractos S30 foram obtidos na Promega Ltd (Southampton, Hampshire, R.U.). As ADN polimerases Deep Vent e Taq foram obtidas na New England Biolabs (Cambridgeshire, R.U.). A ADN polimerase Taqplus foi obtida na Stratagene Inc. (Amsterdam, Holanda). Os estojos de purificação em gel de ADN GeneClean foram obtidos na BIO101 (La Jolla, Califórnia, E.U.A.), os anticorpos anti-humanos de Igx na Immunologicals Direct Ltd (Oxfordshire, R.U.), o anticorpo policlonal anti-c-mic na Vector Labs Inc (Cambridgeshire R.U.) e o anticorpo anti-V5 na Abcam Ltd (Cambridgeshire 41 R.U.). 0 agente de bloqueio Superblock foi obtido na Perbio Science (Cheshire, R.U.).

Exemplo 1. Isolamento de complexos de proteína-ADN específicos actuando como cis

As estruturas de expressão in vitro foram preparadas por adição sequencial do promotor TAC, o epitopo c-mic e quer a região constante humana kapa quer o epitopo V5, à região RepA-CIS-ORI, por amplificação por RCP. Essas estruturas podem ser preparadas por muitos processos conhecidos dos especialistas nesta técnica, por exemplo, por amplificação de diferentes fragmentos de ADN seguida da junção por RCP. Neste exemplo, a matriz inicial de amplificação foi o plasmido RI que contém a região RepA-CIS-ORI (Masai, H. e Arai, K. (1988) . DNAs Res. 16, 6493- 6514) . (a) Amplificação primária. A região RepA-CIS-ORI foi amplificada por RCP a partir de uma única colónia da estirpe ECO K12 comportando o plasmido Rl utilizando 12,5 pmole de cada um dos iniciadores REPAFOR (SEQ ID 01) e ORIREV (SEQ ID 02) num mistura reaccional de 50 μΐ contendo dNTPs 0,25 mM, 2,5 unidades de ADN polimerase Taqplus Precision, lx tampão de reacção de RCP (Stratagene Inc, Amsterdam, Holanda). O iniciador REPAFOR híbrida com a extremidade 5' da região de codificação de . O iniciador ORIREV híbrida com a extremidade 3' da região de não codificação de ORI.

As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 4 minutos e 15 segundos a 94 °C seguido de 30 ciclos de 94 °C, e 45 segundos; 60 °C e 45 segundos; 72 °C e 45 segundos, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se 42 a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, controlou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.). (b) Amplificação secundária. Um μΐ (500 pg) do produto da reacção primária, purificado em gel, diluído 100 vezes, utilizando 12,5 pmole de cada um dos iniciadores CKREPFOR (SEQ ID 03) e ORIREV (SEQ ID 02) em 50 μΐ de mistura reaccional contendo dNTPs 0,25 mM, 2.5 unidades da ADN polimerase Taqplus Precision, lx tampão de reacção de RCP (Stratagene Inc, Amsterdam, Holanda). O iniciador CKREPFOR híbrida com a extremidade 5' do produto da reacção primária e fixa-se na parte 3' do ADN da região constante kapa. O iniciador ORIREV híbrida com a extremidade 3' do produto da reacção primária.

As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 2 minutos e 15 segundos a 94 °C seguido de 30 ciclos de 94 °C, durante 45 segundos; 60 °C durante 45 segundos; 72 °C durante 2 minutos, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, controlou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.). (c) Terceira amplificação. Um μΐ (500 pg) do produto da reacção primária, purificado em gel, diluído 100 vezes, foi re-amplificado utilizando 12,5 pmole de cada um dos iniciadores V5REPFOR (SEQ ID 04) e ORIREV (SEQ ID 02) em 50 μΐ de mistura reaccional contendo dNTPs 0,25 mM, 2.5 unidades da ADN polimerase Taqplus Precision, lx 43 tampão de reacção de RCP (Stratagene Inc, Amsterdam, Holanda). 0 iniciador V5REPF0R híbrida com a extremidade 5' do produto da reacção primária e fixa-se na parte 3' do ADN do epítopo V5. 0 iniciador ORIREV híbrida com a extremidade 3' do produto da reacção primária. As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 2 minutos e 15 segundos a 94 °C seguido de 30 ciclos de 94 °c, 45 segundos; 60 °C, 45 segundos; 72 °C, 2 minutos, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, controlou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.). (d) Quarta amplificação. Um μΐ (500 pg) do plasmido pCKV5, diluído 100 vezes, utilizando 12,5 pmole de cada um dos iniciadores MYCCKFOR (SEQ ID 05) e CKREV (SEQ ID 06) em 50 μΐ de mistura reaccional contendo dNTPs 0,25 mM, 2,5 unidades da ADN polimerase Taqplus Precision, lx tampão de reacção de RCP (Stratagene Inc, Amsterdam, Holanda). O palsmido pCKV5 contém o ADNc da região constante humana kapa (McGregor DP, Molloy PE, Cunningham C, e Harris WJ. 1994 Mol. Immunol. 31: 219-26) e o ADN do epítopo V5 (Southern JA, Young DF, Heaney F, Baumgartner WK, Randall RE. 1991 J. Gen. Virol. 72: 1551-7). O iniciador MYCCKFOR híbrida com a extremidade 5' do ADN da região constante kapa e fixa-se na parte 3' do ADN do epítopo MYC. O iniciador CKREV híbrida com a extremidade 3' do ADN da região constante kapa. As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 2 minutos e 15 segundos a 94 °C seguido de 30 ciclos de 94 °C, 45 44 segundos; 60 °C, 45 segundos; 72 °C, 2 minutos, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, controlou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.). (e) Quinta amplificação. Um μΐ (500 pg) do plasmido pCKV5, diluido 100 vezes, utilizando 12,5 pmole de cada um dos iniciadores MYCV5FOR (SEQ ID 07) e V5REV (SEQ ID 08) em 50 μΐ de mistura reaccional contendo dNTPs 0,25 mM, 2,5 unidades da ADN polimerase Taqplus Precision, lx tampão de reacção de RCP (Stratagene Inc, Amsterdam, Holanda). O iniciador MYCV5FOR híbrida com a extremidade 5' do ADN do epítopo V5 e fixa-se na parte 3' do ADN do epítopo MYC. O iniciador V5REV híbrida com a extremidade 3' do ADN do epítopo V5. As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 2 minutos e 15 segundos a 94 °C seguido de 30 ciclos de 94 °C, 45 segundos; 60 °C, 45 segundos; 72 °C, 30 segundos, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, controlou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.). (f) Sexta amplificação. Um μΐ (500 pg) do plasmido pTACP2A (ref), diluído 100 vezes, utilizando 12,5 pmole de cada um dos iniciadores TAC3 (SEQ ID 09) e MYCTACREV (SEQ ID 10) em 50 μΐ de mistura reaccional contendo dNTPs 0,25 mM, 2,5 unidades da ADN polimerase Taqplus Precision, lx tampão de reacção de RCP (Stratagene Inc, Amsterdam, Holanda). O iniciador TAC3 híbrida com a 45 extremidade 5' do ADN do promotor TAC. 0 iniciador MYCTACREV híbrida com a extremidade 3' do ADN do promotor TAC e fixa-se na parte 5' do ADN do epítopo MYC. As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 2 minutos e 15 segundos a 94 °C seguido de 30 ciclos de 94 °c, 45 segundos; 60 °C, 45 segundos; 72 °C, 30 segundos, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, controlou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.). (g) Primeira RCP de junção. Um μΐ (50 ng) de cada um dos produtos de reacção em (f) e (d) utilizando 50 pmole de cada um dos iniciadores TAC5 (SEQ ID 11) e CKREV (SEQ ID 06) em 50 μΐ de uma mistura reaccional contendo dNTPs 0,25 mM, 2,5 unidades de uma mistura de ADN polimerase TaqDeepVent (20:1) e lx tampão de reacção RCP (New England Biolabs, Beverly, MA, E.U.A.). O iniciador TAC5 híbrida com a extremidade 5' do produto de reacção (f) e adicionam-se 20 nucleótidos. O iniciador CKREV híbrida com a extremidade 3' do produto da reacção (d).

As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 2 minutos e 15 segundos a 94 °C seguido de 30 ciclos de 94 °C, 45 segundos; 60 °C, 45 segundos; 72 °C, 45 segundos, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °c. Fez-se a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, controlou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.). 46 (h) Segunda RCP de junção. Um μΐ (50 ng) de cada um dos produtos de reacção em (f) e (e) utilizando 50 pmole de cada um dos iniciadores TAC5 (SEQ ID 11) e V5REV (SEQ ID 08) em 50 μΐ de mistura reaccional contendo dNTPs 0,25 mM, 2,5 unidades de uma mistura de ADN polimerase TaqDeepVent (20:1) e lx tampão de reacção de RCP (New England Biolabs, Beverly, MA, E.U.A.). O iniciador TAC5 híbrida com a extremidade 5' do produto de reacção de (f) e adicionam-se 20 nucleótidos. O iniciador V5REV híbrida com a extremidade 3' do produto da (e).

As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 2 minutos e 15 segundos a 94 °C seguido de 30 ciclos de 94 °C, 45 segundos; 60 °C, 45 segundos; 72 °C, 45 segundos, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, controlou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.). (i) Terceira RCP de junção. Um μΐ (50 ng) de cada um dos produtos de reacção em (b) e (g) ou utilizando 50 pmole de cada um dos iniciadores TAC3 (SEQ ID 09) e ORIREV (SEQ ID 02) em 50 μΐ de mistura reaccional contendo dNTPs 0,25 mM, 2,5 unidades de uma mistura de ADN polimerase TaqDeepVent (20:1) e lx tampão de reacção de RCP (New England Biolabs, Beverly, MA, E.U.A.). O iniciador TAC3 híbrida, 20 nucleótidos a jusante, com a extremidade 5' do produto da reacção (g) . O iniciador ORIREV híbrida com a extremidade 3' do produto da (b). O produto da reacção em (i) é designado por TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI (SEQ ID 12) .

As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 2 minutos e 15 47 segundos a 94 °C seguido de 30 ciclos de 94 °C, 45 segundos; 60 °C, 45 segundos; 72 °C, 1 minuto, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, controlou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.). (h) Quarta RCP de junção. Um μΐ (50 ng) de cada um dos produtos de reacção em (b) e (h) ou utilizando 50 pmole de cada um dos iniciadores TAC3 (SEQ ID 09) e ORIREV (SEQ ID 02) em 50 μΐ de mistura reaccional contendo

dNTPs 0,25 mM, 2,5 unidades de uma mistura de ADN

polimerase TaqDeepVent (20:1) e lx tampão de reacção de RCP (New England Biolabs, Beverly, MA, E.U.A.). O iniciador TAC3 híbrida, 20 nucleótidos a jusante, com a extremidade 5' do produto de reacção de (g) . O iniciador ORIREV hibrida com a extremidade 3' do produto da (b). O produto da reacção em (i) é designado por TAC-MYC-V5-REPA-CIS-ORI (SEQ ID 13) .

As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 2 minutos e 15 segundos a 94 °C seguido de 30 ciclos de 94 °C, 45 segundos; 60 °C, 45 segundos; 72 °C, 1 minuto, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, controlou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.).

Preparação da reacção de transcrição/tradução in vitro. A reacção foi realizada em gelo, utilizando uma matriz linear bacteriana S30 da Promega em conjunto com o 48 estojo de reacção de transcrição/tradução in vitro como se segue:

Deixou-se reagir 20 μΐ da matriz TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI (0,5 yg do ADN da estrutura final da SEQ ID N° 12 anterior); 20 μΐ da matriz de TAC-MYCV5-REPA-CIS-ORI (0,5 yg do ADN da estrutura final SEQ ID N° 13 anterior); 20 yl da mistura completa de aminoácidos (Promega) ; 80 yl da pré-mistura S30; 60 yl da mistura S30; a 25 °C, durante 30 minutos e colocou-se em gelo, depois diluiu-se 10 vezes com tampão de bloqueio (Superblock (Perbio Ltd), 0,1 % de Tween 20, 200 yg/ml de ADN de esperma de arenque).

Captura do complexo de ADN-proteina. Revestiram-se imuno-tubos em estrela, NUNC, com 10 yg/ml de cada um dos anticorpos anti-c-myc, anti-V5 ou anticorpo anti-humano de cadeia kapa em 500 yl de SBF por tubo, durante a noite, a 4 °C. Deixou-se mais um tubo em branco como controlo negativo. Lavaram-se os tubos 2x com SBF e bloquearam-se durante 1 hora, à temperatura ambiente com Superblock/ SBF/0,1 mg/ml de ADN de esperma de arenque/0,1 % de Tween 20 e depois lavou-se 2x SBF. Adicionou-se, a cada tubo, 500 yl da mistura reaccional de transcrição/tradução diluída e incubou-se, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Lavaram-se os tubos 5 x SBF/0,1 % de Tween 20, depois 1 x 30 minutos com 2 ml de Superblock/SBF/0,1 mg/ml de ADN de esperma de arenque/0,1 % de Tween 20, depois 5xSBF. Recuperou-se o ADN com 300 yl de tampão T.E. mais 300 yl de fenol/clorofórmio, durante 5 minutos, com agitação. Centrifugou-se a 13.200 g durante 5 minutos e o ADN precipitou com 0,5 volume de acetato de amónio 7,5 M, 20 yg de glicogénio e três volumes de etanol absoluto. No seguimento da centrifugação, lavaram-se os péletes com 49 etanol a 70 %, secou-se em vácuo e suspendeu-se novamente em 20 yl de água. Tornou a amplificar-se 10 μΐ do ADN recuperado em 50 μΐ de mistura reaccional com os iniciadores TAC3 (SEQ ID 09) e ORIREV (SEQ ID 02). Fez-se a electroforese dos produtos da reacção em gel de agarose a 1 %/TAE (figura 5).

Exemplo 2. Separação do complexo de RepA-ADN

Utilizaram-se as duas estruturas de expressão in vitro (SEQ ID 12 e SEQ ID 13) já descritas no exemplo 1, numa experiência de selecção em comparação com o anticorpo anti-humano C-kapa como descrito no exemplo 1, excepto no facto de se ter recuperado o ADN e de se ter libertado de RepA utilizando um qualquer dos processos dos processos seguintes; glicina, trietilamina, fenol/clorofórmio, proteinase K e EDTA. Estes processos estão descritos a seguir.

Glicina: incubou-se o tubo com 500 μΐ de glicina 200 mM, NaCl 150 mM (pH 2,0) durante 10 minutos. Transferiu-se então o produto eluido com glicina para um tubo de Eppendorf novo e adicionou-se 50 μΐ de Tris 2M (pH 8,5).

Trietilamina: incubou-se o tubo com 500 μΐ de trietilamina 0,1 M durante 10 minutos e transferiu-se então o produto eluido com trietilamina para um tubo de Eppendorf novo e adicionou-se 250 μΐ de Tris 1 M (pH 7,4).

Fenol/Clorofórmio: como no exemplo 1 anterior.

Proteinase K: incubou-se o tubo com 500 μΐ de Tris 100 mM (pH 8,0), EDTA 10 mM (pH 8,0), SDS a 0,5 %, durante 30 50 minutos, a 37 °C. Transferiu-se então o produto eluido com proteinase K para um tubo de Eppendorf novo. EDTA: incubou-se o tubo com 250 μΐ de Tris 10 mM (pH 8,0), EDTA 1 mM, NaCl 500 mM e 250 μΐ de fenol/clorofórmio, durante 5 minutos. Transferiu-se então o produto eluido com EDTA para um tubo de Eppendorf novo.

Depois da recuperação do ADN, extraiu-se o ADN com fenol/clorofórmio, quando apropriado, seguido de uma precipitação em etanol, como descrito no exemplo 1. Voltou a amplificar-se 10 ul do ADN novamente suspenso em misturas reaccionais de 50 ul com os iniciadores TAC3 (SEQ ID 09) e CISREV (SEQ ID 019) . O iniciador CISREV hibridou 196 bases a montante do sitio de ligação de ORIREV (SEQ ID 02). Fez-se a electroforese dos produtos da reacção em gel de agarose a 1 %/TAE (dados não mostrados). Amplificou-se apenas a estrutura contendo CK-ADN (SEQ ID 12), em quantidades aproximadamente equivalentes.

Isto não só nos diz que qualquer um dos processos descritos antes, para a recuperação e a libertação do ADN de RepA, pode ser utilizado, mas este resultado também sugere que RepA interage de uma forma não covalente com o seu ADN cognato.

Exemplo 3. Detecção de ligantes específicos anti-V5 numa experiência de bloqueio de V5 utilizando a tecnologia de expressão de CIS.

As estruturas de expressão in vitro foram preparadas adicionando o promotor TAC e, quer o epítopo V5 ou uma biblioteca de 12-mer NNB, à região RepA-CIS-ORI, por meio de amplificação por RCP. Essas estruturas podem ser 51 preparadas por muitos processos conhecidos dos especialistas na matéria, por exemplo, amplificando diferentes fragmentos de ADN seguido da junção por RCP. Neste exemplo, a matriz inicial de amplificação foi o plasmido RI que contém a região RepA-CIS-ORI (Masai, H. e Arai, K. (1988) . Nucleic Acids Res. 16, 6493-6514). (a) . Amplificação primária. Amplificou-se a região

RepA-CIS-ORI por RCP a partir de uma única colónia do plasmido RI comportando a estirpe ECO K12, utilizando 12,5 pmole de cada um dos iniciadores REPAFOR (SEQ ID 01) e ORIREV408 (SEQ ID 20) numa mistura reaccional de 50 μΐ contendo dNTPs 0,25 mM, 2,5 unidades de uma mistura de ADN polimerase TaqDeepVent (20:1) e lx tampão de reacção RCP (New England Biolabs, Beverly, MA, E.U.A.). O iniciador REPAFOR híbrida com a extremidade 5' da região de codificação de RepA. O iniciador ORIREV408 hibrida a jusante da extremidade 3' da região de não codificação de ORI.

As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 4 minutos e 30 segundos a 94 °C seguido de 25 ciclos a 94 °C, 30 segundos; 60 °C, 45 segundos; 72 °C, 1 minuto, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, controlou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.). (b) . Amplificação secundária. Amplificou-se novamente um μΐ (500 pg) do produto da reacção primária, purificado em gel, diluído 100 vezes, utilizando 12,5 pmole de cada um dos iniciadores V5 (NNB)REPFOR (SEQ ID 21) e ORIREV408 (SEQ ID 20) em 50 μΐ da mistura 52 reaccional contendo dNTPs 0,25 mM, 2,5 unidades de uma mistura de ADN polimerase TaqDeepVent (20:1) e lx tampão de reacção RCP (New England Biolabs, Beverly, MA, E.U.A.). O iniciador V5(NNB)REPFOR híbrida com a extremidade 5' do produto da reacção primária e fixa-se no ADN do epítopo V5. O iniciador ORIREV408 híbrida com a extremidade 3' do produto da reacção primária.

As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 4 minutos e 30 segundos a 94 °C seguido de 25 ciclos a 94 °C, 30 segundos; 60 °C, 45 segundos; 72 °C, 1 minuto, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, controlou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.). (c) . Terceira amplificação. Amplificou-se novamente um μΐ (500 pg) do produto da reacção primária, purificado em gel, diluído 100 vezes, utilizando 12,5 pmole de cada um dos iniciadores NNBREPFOR (SEQ ID 22) e ORIREV408 (SEQ ID 20) em 50 μΐ da mistura reaccional contendo dNTPs 0,25 mM, 2,5 unidades de uma mistura de ADN polimerase TaqDeepVent (20:1) e lx tampão de reacção RCP (New England Biolabs, Beverly, MA, E.U.A.). O iniciador NNBREPFOR híbrida com a extremidade 5' do produto da reacção primária e fixa-se aleatoriamente num ADN de uma biblioteca de aminoácidos 12-mer NNB. O iniciador ORIREV408 híbrida com a extremidade 3' do produto da reacção primária.

As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 4 minutos e 30 segundos a 94 °C, seguido de 25 ciclos a 94 °C, 30 segundos; 60 °C, 45 segundos; 72 °C, 1 minuto, seguido 53 de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, isolou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.). (d) . Quarta amplificação. Amplificou-se um μΐ (500 pg) do plasmido pTACP2A (ref), diluído 100 vezes, utilizando 12,5 pmole de cada um dos iniciadores TACFARUP (SEQ ID 23) e TACREV (SEQ ID 27) em 50 μΐ de mistura reaccional contendo dNTPs 0,25 mM, 2,5 unidades da ADN polimerase TaqDeepVent (20: 1) e lx tampão de reacção RCP (New England Biolabs, Beverly, MA, E.U.A.). O iniciador TACFARUP híbrida com a extremidade 5' do ADN do promotor TAC. O iniciador TACREV híbrida com a extremidade 3' do ADN do promotor TAC.

As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 1 minutos e 45 segundos a 94 °C seguido de 25 ciclos, a 94 °C, 15 segundos; 60 °C, 30 segundos; 72 °C, 30 segundos, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, isolou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.). (e) . Primeira RCP de junção. Um μΐ (50 ng) de cada um dos produtos de reacção em (b) e (d) utilizando 50 pmole de cada um dos iniciadores TACFARUP (SEQ ID 23) e ORIREV408 (SEQ ID 20) em 50 μΐ de mistura reaccional contendo dNTPs 0,25 mM, 2,5 unidades de uma mistura de ADN polimerase TaqDeepVent (20:1) e lx tampão de reacção de RCP (New England Biolabs, Beverly, MA, E.U.A.). O iniciador TACFARUP híbrida com a extremidade 54 5' do produto de (d). 0 iniciador ORIREV480 híbrida com a extremidade 3' do produto da reacção (b) . 0 produto da reacção em (e) é designado por TAC-V5-REPA-CIS-0RI-408 (SEQ ID 24).

As reacções RCP foram realizadas num ciclizador de controlo de Eppendorf durante 1 ciclo de 1 minuto e 45 segundos, a 94 °C, seguido de 25 ciclos a 94 °C, 15 segundos; 60 °C, 30 segundos; 72 °C, 1 minuto e 30 segundos, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos de reacção num gel de agarose, isolou-se e purificaram-se os produtos do gel em 40 μΐ de água esterilizada, utilizando o estojo Geneclean II, de acordo com as instruções dos fabricantes (BiolOl, La Jolla, Califórnia, E.U.A.). (f) . Segunda RCP de junção. Um μΐ (50 ng) de cada um dos produtos de reacção em (c) e (d) utilizando 50 pmole de cada um dos iniciadores TACFARUP (SEQ ID 23) e ORIREV408 (SEQ ID 20) em 50 μΐ de mistura reaccional contendo dNTPs 0,25 mM, 2,5 unidades de uma mistura de ADN polimerase TaqDeepVent (20:1) e lx tampão de reacção de RCP (New England Biolabs, Beverly, MA, E.U.A.). O iniciador TACFARUP híbrida com a extremidade 5' do produto da (d). O iniciador ORIREV480 híbrida com a extremidade 3' do produto da (c) . As reacções de RCP realizaram-se num ciclizador controlador de Eppendorf num ciclo de 1 minutos e 45 segundos a 94 °C, seguido de 25 ciclos, a 94 °C, 15 segundos; 60 °C, 30 segundos; 72 °C, 1 minuto e 30 segundos, seguido de um ciclo único de 10 minutos a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos da reacção num gel de agarose, isolou-se e os produtos foram purificados em gel em 40 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo Geneclean II, de acordo com as instruções do fabricante. (BiolOl, La 55

Jolla, Califórnia, E.U.A.). 0 produto da reacção em (f) é designado por TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408 (SEQ ID 25).

Preparação da reacção de transcrição/tradução in vitro: A reacção foi realizada em gelo, utilizando uma matriz linear bacteriana S30 da Promega em conjunto com o estojo de reacção de transcrição/tradução in vitro como se segue:

Deixou-se reagir, a 25 °C, durante 30 minutos, 20 μΐ de uma matriz de TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408 diluída 5000 vezes (0,1 ng da estrutura final anterior do ADN -SEQ ID 24) 20 μΐ da matriz de 5 TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408 (0,5 Rg da estrutura final anterior do ADN - SEQ ID 25) 20 μΐ de uma mistura completa de aminoácidos (Promega) 80 μΐ da pré-mistura S30 Premix 60 μΐ da mistura S30 e colocou-se em gelo e depois diluiu-se 10 vezes com Marvel/SBF a 2 %.

Captura do complexo de ADN-proteína. Revestiram-se imuno-tubos em estrela, NUNC, com 10 pg/ml de anticorpo anti-V5 em 500 μΐ de SBF, durante a noite, a 4°C. Deixou-se mais um tubo em branco como controlo negativo. Lavaram-se os tubos 2x com SBF e bloquearam-se, durante 1 hora, à temperatura ambiente com tampão de bloqueio (Marvel a 2 %, Tween 20 a 0,1 %, 0,1 mg/ml de ADN de esperma de arenque) e depois lavou-se 2x SBF. Adicionou-se, a cada tubo, 1 ml da mistura reaccional de transcrição/tradução diluída e incubou-se, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Lavaram-se os tubos com 5x SBF/Tween 20 a 0,1 % e depois 5x 56 SBF. Recuperou-se o ADN com 500 μΐ de tampão TE mais 500 μΐ de fenol/clorofórmio. Centrifugou-se a 13.200 g durante 5 minutos e o ADN precipitou com 1/10 volumes de acetato de sódio 3M, 50 pg/ml de glicogénio e dois volumes de etanol absoluto. No seguimento da centrifugação, lavaram-se os péletes com etanol a 70 %, secou-se em vácuo e suspendeu-se novamente em 40 μΐ de água. Amplificou-se novamente 20 μΐ do ADN recuperado em 50 μΐ de misturas reaccionais com os iniciadores biotinilados bTAC6 (SEQ ID 26) e bCISREV (SEQ ID 19). Fez-se a electroforese dos produtos da reacção em gel de agarose a 1 %/TAE.

Clonagem do ADN recuperado no vector de expressão pDMG-K (SEQ ID 27). O produto de reacção foi purificado em gel e eluiu-se com 50 μΐ de água esterilizada utilizando um estojo de extracção com gel QIAquick, de acordo com as instruções dos fabricantes (QIAGEN Ltd West Sussex, R.U.). Tanto o produto da reacção purificado como o plasmido pDMG-K foram digeridos com 20 unidades de Ncol e Notl (New England Biolabs, Beverly, MA, E.U.A.). O plasmido cortado foi purificado em gel utilizando um estojo de extracção com gel QIAquick, de acordo com as instruções dos fabricantes (QIAGEN Ltd West Sussex, R.U.), depois tratado com 0,01 unidades de fosfatase alcalina de intestino de bezerro (Promega, Southampton, R.U.) seguido da extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol, como se descreveu antes. O ADN precipitado foi dissolvido em 20 μΐ de água. O produto da RCP cortado foi transferido para tiras revestidas com estreptavidina (Roche Diagnostics Ltd, East Sussex, R.U.) em lx TBS, 0,3 mg/ml de ASB, Tween 20 a 0,1 % e incubou-se durante 30 minutos, à temperatura ambiente, com agitação. Esta abordagem elimina o ADN de flanqueio biotinilado a montante e a jusante dos sítios Ncol e Notl site do produto da RCP e permite a recuperação 57 de pequenos fragmentos de ADN contendo a sequência do péptido seleccionado. Extraíu-se o sobrenadante com fenol/clorofórmio e precipitou com etanol, tal como descrito antes. 0 ADN precipitado foi dissolvido em 10 μΐ de água. Ligou-se o plasmido cortado e o pequeno fragmento de ADN isolado, contendo a sequência do péptido seleccionado, tendo pendentes tanto Ncol como Notl, utilizando um estojo de ligação Quick de acordo com as instruções dos fabricantes (New England Biolabs, Beverly, MA, E.U.A.) seguido da extracção com fenol/clorofórmio e precipitação com etanol, como se descreveu antes. O ADN precipitado foi dissolvido em 10 μΐ de água e foi electroporado em células TGl electrocompetentes de acordo com as instruções dos fabricantes (Stratagene, U.S.A.) e seleccionou-se em placas com 2xTY, 100 pg/ml de ampicilina e glicose a 2 %.

Rastreio, por ELISA, do anticorpo anti-V5 dos clones seleccionados. Seleccionaram-se 88 colónias em 400 μΐ de 2x TY, glicose a 2 % e 100 pg/ml de ampicilina e fizeram-se crescer durante a noite a 37 °C, com agitação a 300 rpm. Transferiu-se 50 μΐ das culturas da noite para lml de 2x TY, glicose a 2 % e 100 pg/ml de ampicilina e fizeram-se crescer durante a noite a 37 °C, com agitação a 300 rpm até a uma D.O. de 0,5. Depois centrifugaram-se as células a lOOOx g durante 10 minutos. Eliminaram-se os sobrenadantes e fez-se uma nova suspensão dos péletes em 600 μΐ de 2x TY, sacarose 0,4 M, 100 pg/ml de ampicilina e IPTG 1 mM e cresceram durante 4 horas, a 37 °C, a 300 rpm. Depois da indução centrifugaram-se as células a lOOOx g durante 10 minutos. Utilizou-se 15 μΐ dos sobrenadantes no ensaio de ELISA. Revestiram-se placas NUNC Maxisorp com 100 μΐ de 1 pg/ml em lx SBF quer do anticorpo anti-humano da região kapa, quer do anticorpo anti-V5 ou 50 pg/ml de ASB, durante 58 7 horas, à temperatura ambiente. Deixou-se mais uma placa em branco, revestida apenas com SBF. Lavaram-se os poços 2x SBF, seguido do bloqueio, durante 1 hora, à temperatura ambiente, com 300 μΐ de Marvel a 4 %, Tween 20 a 0,1 % em lx SBF. Lavaram-se os poços 2x SBF, depois adicionou-se aos poços 150 μΐ de sobrenadante e 150 μΐ de Marvel a 4 %, Tween 20 a 0,1 % em lx SBF e incubou-se, durante 1 hora, à temperatura ambiente. Depois lavaram-se os poços com 2xSBF, Tween 20 a 0,1 % e 2x SBF. O anticorpo anti-humano da região kapa do anticorpo secundário, conjugado com a peroxidase de rábano (POR) (concentração final de 1,6 yg/ml) foi diluído 500 vezes em Marvel a 4 %, Tween 20 a 0,1 %, lx SBF e adicionou-se aos poços e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Depois lavaram-se os poços com 4xSBF, Tween 20 a 0,1 % e 2x SBF. O sinal de POR foi detectado adicionando 200 μΐ de substrato de TMB. Parou-se a reacção com 100 μΐ de ácido sulfúrico 0,5 M. Leu-se a densidade óptica a 450 nm. 35 dos 88 clones foram bem expressos como se avaliou pelo sinal de POR a partir dos clones rastreados em comparação com o anticorpo anti-humano da região kapa. 7 destes 35 clones exibiram uma ligação específica ao anticorpo anti-V5, enriquecendo assim os péptidos V5 de 1 em 5000 para 1 em 5, isto é, um factor de enriquecimento da ordem de 1000 (figura 6).

Exemplo 4: Construção da biblioteca de expressão de cis, selecção e rastreio contra Bacillus globigii

Construção da biblioteca

Para gerar um ADN da biblioteca, deve ser gerado um fragmento do ADN da biblioteca de promotores e o fragmento de RepA-CIS-ori e depois devem ser ligados por digestão-ligação. Utilizou-se neste exemplo o promotor tac de um 59 vector P2A-HA, mas podiam utilizar-se muitos promotores disponíveis e que são bem conhecidos dos especialistas na matéria. A RCP inicial dos fragmentos de Rep-CIS-ori e TAC fixaram-se no sítio Bspl201 e no sítio NotI/da biblioteca aleatória, respectivamente. Prepararam-se duas misturas principais:

Amplificou-se, por RCP, 10 μΐ de ADN do plasmido P2A-HA diluído a 1:50 (25 ng/reacção) num volume de mistura reaccional de 20x50 μΐ contendo dNTPs 200 μΜ, tampão de amplificação de lxNEB polimerase (KC1 10 mM, (NH4)2S04 10 mM, Tris-HCl 20 mM, a pH 8,8, MgS04 2 mM, Triton X-

100 a 0,1 %) com 10 pmole de cada um dos iniciadores TACFARUP (SEQ ID 23) e NTERM18MER (SEQ ID 28) e 2 unidades de uma mistura de ADN polimerase Taq : ADN polimerase Deep Vent (NEB) a 20:1, durante 25 ciclos a 94 °C, de 40 segundos; a 60 °C, de 40 segundos; a 72 °C, de 60 segundos; seguido de uma extensão, de 5 minutos, a 72 °C. Fez-se a electroforese de 20 μΐ do produto da reacção em gel de agarose a 1 %/TAE e fotografou-se e a parte restante foi purificada numa coluna Qiagen em 200 μΐ de água.

Amplificou-se, por RCP, 10 μΐ de ADN de Rep-CIS-ori corrigido com Bspl20l (50 ng/reacção num volume de mistura reaccional de 10x50 μΐ contendo dNTPs 200 μΜ, tampão de amplificação de lxNEB polimerase (KC1 10 mM, (NH4)2S04 10 mM, Tris-HCl 20 mM, a pH 8,8, MgS04 2 mM, TritonX-100 a 0,1%) com 10 pmole de cada um dos iniciadores BSPREPAFOR (SEQ ID 29) e ORIREV (SEQ ID 02) e 2 unidades de uma mistura de DNA polimerase Taq: DNA polimerase Deep Vent (NEB) a 20:1, durante 30 ciclos a 94 °C, de 40 segundos; a 60 °C, de 40 segundos; a 72 °C, de 90 segundos; seguido de uma extensão, de 5 minutos, a 72 °C. Fez-se a electroforese de 20 μΐ do 60 produto da reacção em gel de agarose a 1 %/TAE e fotografou-se e a parte restante foi purificada numa coluna Qiagen em 120 μΐ de água. O produto TAC da biblioteca foi então digerido com 10 μΐ de Notl (NEB) (lOOu) durante 1 hora, a 37 °C num volume reaccional de 300 μΐ, depois purificou-se numa coluna Qiagen num volume de água de 120 μΐ. Juntaram-se então os dois produtos por restrição-ligação, como se segue: lOxtampão NEB 4 17μ1 ATP 100 mM (SIGMA) 15μ1 10 mg/ml de ASB acetilado (NEB) Ιμΐ ADN de RepA 40μ1 ADN da biblioteca de TAC 40μ1

Bspl20l (10 u/μΐ Fermentas) 5μ1

Notl (10 u/μΐ NEB) 5μ1 ADN ligase de T4 (400 u/μΐ NEB) 5μ1 Água 39μ1 A reacção realizou-se a 37 °C durante duas horas. Analisou-se 20 μΐ por electroforese em gel, amplificou-se directamente 30 μΐ por RCP em misturas reaccionais de lOx 50 μΐ e o restante foi purificado em gel e retirou-se a banda da biblioteca, purificou-se numa coluna Qiagen e amplificou-se por RCP em misturas reaccionais de 20x 50 μΐ com os iniciadores TACFAR4 (SEQ ID 30) e ORIREV (SEQ ID 02) durante 30 ciclos a 94 °C, de 40 segundos; a 60 °C, de 40 segundos; a 72 °C, de 90 segundos; seguido de uma extensão de 5 minutos a 72 °C. O ADN foi purificado em gel em 4 colunas da Qiagen e os produtos eluidos de 200 μΐ foram reunidos para as reacções de ITT/selecção. 61

Selecção do ciclo 1

Preparou-se 2 x 200 μΐ de mistura reaccional de ITT e incubou-se, à temperatura ambiente, durante 1 hora, como se segue: REACÇÃO 1 adn da biblioteca 56 μΐ (7 yg) 2,5x de tampão 80 μΐ Metionina 100 mM 2 μΐ Extracto S30 60 μΐ

Adicionou-se 1 ml de tampão de bloqueio a cada mistura reaccional (o tampão de bloqueio é constituído por Marvel a 4 %, 100 yg/ml de ADN de esperma de salmão laminado, Tween 20 a 0,1 %, 2,5 mg/ml de heparina, em TBS), centrifugou-se a 10.000 g durante 2 minutos, transferiram-se para um tubo novo, depois colocou-se em gelo.

Lavou-se, duas vezes, 100 μΐ de uma suspensão de esporos de Bacillus globigii (Bg) com 1 ml de TBS/Tween 20 a 0,1 % e suspendeu-se novamente em 100 μΐ de tampão de bloqueio. Adicionou-se então ao tampão de bloqueio e deixou-se ligar, à temperatura ambiente, durante 1 hora, enquanto se misturava.

Centrifugou-se então a mistura a 16.100 g durante 1 minuto e lavou-se, seis vezes, os péletes de esporos, com 1 ml de TBS/Tween 20 a 0,1 % misturando-se com uma pipeta e agitou-se em vórtice antes da centrifugação. Lavaram-se finalmente os peletes em 1 ml de TBS e eliminou-se o sobrenadante. 62

Eluiu-se o ADN por incubação dos esporos em 120 μΐ de acetato de sódio 0,5 M, a pH 5,5 durante 10 minutos num misturador. Centrifugaram-se os esporos a 16.100 g durante 1 minuto e neutralizou-se o sobrenadante por adição de 120 μΐ de Tris a pH 8,0 e depois extraíu-se com fenol/CHCl3 durante 5 minutos a 16.100 g. O ADN precipitou com 20 yg de um veículo de glicogénio e dois volumes e meio de etanol. Peletizou-se o ADN a 16.100 g durante 20 minutos e lavaram-se os péletes, três vezes, com 0,75 ml de etanol a 70 %, centrifugando-se durante 3 minutos a 16.100 g entre cada lavagem, depois secou-se ao ar e voltou a fazer-se uma suspensão em 20 μΐ de água.

Amplificou-se, por RCP, 10 μΐ do ADN recuperado, numa mistura reaccional de 10 x 50 μΐ com os iniciadores CISREV (SEQ ID 19) e TACFAR5 (SEQ ID 31) e uma mistura de 2 unidades de ADN polimerase Taq: ADN polimerase Deep Vent (NEB) a 20:1 durante 30 ciclos a 94°C, de 40 segundos; a 60°C, de 40 segundos; a 72 °C, de 90 segundos; seguido de uma extensão de 5 minutos a 72 °C. Purificou-se o ADN, precipitou em etanol e voltou a fazer-se uma suspensão em 10 μΐ de água. Amplificou-se mais 5 μΐ por RCP utilizando as condições anteriores, mas utilizando os iniciadores NOTRECREV2 (SEQ ID 32) e TACFAR5 (SEQ ID 31) durante 10 ciclos. O produto foi purificado utilizando um estojo de purificação por RCP da Qiagen e eluiu-se em 50 μΐ de Tris 5 mM a pH 8,0.

Restrição-Ligação

Realizou-se numa mistura reaccional de 30 μΐ, durante 1 hora, a 37 °C, para ligar novamente o ADN de RepA-CIS-ori aos péptidos recuperados, para mais um ciclo de selecção. 63

Tampão 4 ΙΟχΝΕΒ 3 μΐ ATP 100 mM (SIGMA) 1,5 μΐ 10 mg/ml de ASB acetilada (NEB) 0,3μ1 ADN de RepA 2 μΐ ADN da biblioteca de TAC 10 μΐ Bspl20l (10 u/μΐ Fermentas) 1,5 μΐ Notl (10 u/μΐ NEB) 1,5 μΐ ADN ligase de T4 (400 u/μΐ NEB) 1,5 μΐ Água 8,7 μΐ

Amplificou-se directamente, por RCP, 20 μΐ em misturas reaccionais de lOx 50 μΐ com os iniciadores TACFAR5.1 (SEQ ID 33) e ORIREV (SEQ ID 02) durante 20 ciclos a 94 °C, durante 40 segundos; a 60°C, durante 40 segundos; a 72 °C, durante 90 segundos; seguido de uma extensão de 5 minutos a 72 °C. O ADN foi purificado em gel numa coluna da Qiagen e utilizou-se o produto eluido para o ciclo 2 de reacções/selecção de ITT (58 μΐ usados no ciclo 2).

Ciclo 2 A selecção do segundo ciclo foi realizada tal como para o ciclo 1, com as seguintes alterações: utilizou-se aproximadamente 3 pg do ADN inicial. O tampão de bloqueio era composto por albumina de soro bovino a 2 %, gelatina a 1 %, 100 pg/ml de ADN de esperma de salmão laminado, 2,5 mg/ml de heparina, em TBS. Utilizou-se 10 μΐ de esporos lavados em cada selecção. As RCPs de recuperação utilizaram os iniciadores TACFAR5.2 (SEQ ID 34) e NOTRECREV2 (SEQ ID 32) . Finalmente, a RCP de recuperação utilizou os iniciadores TACFAR5.2 (SEQ ID 34) e ORIREV (SEQ ID 02) durante 10 ciclos. 64

Ciclo 3 A selecção do terceiro ciclo foi realizada tal como para o ciclo 2, com as seguintes alterações: utilizou-se inicialmente aproximadamente 2,5 yg de ADN. As RCPs de recuperação utilizaram os iniciadores TACFAR56 (SEQ ID 35) e N0TRECREV2 (SEQ ID 32) . Finalmente, a RCP de recuperação utilizou os iniciadores TACFAR6 (SEQ ID 35) e ORIREV (SEQ ID 02) durante 10 ciclos.

Ciclo 4 O ciclo 4 realizou-se tal como o ciclo 3, excepto no facto de se ter utilizado inicialmente, para a selecção, aproximadamente 2 yg de ADN. As RCPs de recuperação utilizaram os iniciadores TAC3 (SEQ ID 09) e NOTRECREV2 (SEQ ID 32) . Finalmente, a RCP de recuperação utilizou os iniciadores TAC3 (SEQ ID 09) e ORIREV (SEQ ID 02) durante 10 ciclos.

Ciclo 5 O ciclo 5 realizou-se como o ciclo 4.

Para fazer a clonagem, como fragmentos de Ncol-Notl, amplificou-se, por RCP, o ADN recuperado e armazenado do ciclo 5, com os inciadores biotinilados TAC6 (SEQ ID 26) e NOTRECREV2 (SEQ ID 32). A digestão com Notl foi seguida de purificação utilizando um estojo de purificação por RCP da Qiagen, a digestão com Ncol foi seguida de incubação numa placa revestida com estreptavidina. No seguimento da purificação com fenol/CHCl3 e precipitação em etanol, o ADN digerido foi então ligado num vector de fagemido pVIII digerido de forma semelhante em ER2738 de E.coli, depois 65 2χΤΥ, 100 yg/ml foi colocado em placas com glicose a 2 %, de ampicilina e incubado a 37 °C.

Seleccionaram-se colónias individuais para placas de 96 poços com 200 μΐ de meio de glicose a 2 %, 2xTY, 100 pg/ml de ampicilina e cresceram a 37 °C/200 rpm durante 6 horas. Transferiram-se 100 μΐ para uma placa de poços profundos contendo 100 μΐ de glicose a 2 %, 2xTY, 100 pg/ml de ampicilina mais 10 μΐ de fago auxiliar M13K07/poço e incubou-se durante 1 hora, sem agitação, a 37 °C.

Adicionou-se 500 μΐ por poço do meio 2xTY, 100 pg/ml de ampicilina/25 pg/ml de canamicina/IPTG 20 μΜ e realizou-se a incubação a 37 °C/200 rpm.

Rastreio por ELISA

Bloquearam-se placas de 96 poços, de fundo redondo com Marvel a 4 % em TBS/Tween 20 a 0,1 % em SBF, durante 1 hora, à temperatura ambiente. Centrifugaram-se as culturas de fagos seleccionadas a 3000 g, durante 5 minutos e analisou-se o sobrenadante dos fagos por ELISA. Misturou-se em cada poço 50 μΐ do sobrenadante de fagos com 5 μΐ de esporos de Bg em 50 μΐ de albumina de soro bovino a 4 %, gelatina a 1 % em TBS e incubou-se ao mesmo tempo que se agitava, à temperatura ambiente, durante 1 hora. Lavaram-se então os poços 5 x com 200 μΐ de TBS/Tween 20 a 0,1 % por centrifugação a 3000 g, durante 5 minutos entre cada lavagem antes da incubação com 0,2 μΐ/ml de anticorpo anti-M13 conjugado com peroxidase de rábano em albumina de soro bovino a 4 % e, gelatina a 1 % em TBS. Incubaram-se os esporos à temperatura ambiente, durante 1 hora, enquanto se agitava. Depois lavaram-se os poços 5 X com TBS/Tween 20 a 0,1 % e transferiram-se os esporos para uma placa fresca. Lavaram-se então os esporos uma vez com TBS, como foi 66 descrito, antes do desenvolvimento com substrato de TMB. Interrompeu-se o desenvolvimento com H2S04 0,5 M e transferiu-se a solução para uma placa nova de fundo plano, para se fazer a leitura a 450 nm. Os dados de ligação para os péptidos seleccionados estão ilustrados na figura 7.

Exemplo 5. Construção de uma biblioteca de exibição, selecção e triagem de CIS em função do anticorpo anti-V5 A construção da biblioteca foi realizada como descrito no exemplo 4.

Selecção do ciclo 1

Realizou-se uma reacção (ITT), in vitro, de transcrição/tradução de 1 x 200 pl e incubou-se à temperatura ambiente, durante 1 hora, tal como descrito no exemplo 4. Adicionou-se 1 ml de tampão de bloqueio a cada mistura reaccional (o tampão de bloqueio é constituído por leite em pó desnatado a 5 %, 100 pg/ml de ADN de esperma de salmão laminado, 2,5 mg/ml de heparina, em TBS) e depois colocou-se em gelo.

Para o primeiro ciclo da selecção da biblioteca revestiu-se um imuno-tubo NUNC Maxisorp de 70x11 mm (Life Technologies, Paisley, Scotland R.U.) com 1 ml de 10 yg/ml de anticorpo policlonal de péptido anti-V5 (Harlan-Seralab) em SBF, durante 1 hora, a 37 °C. Lavou-se o tubo três vezes com SBF (encher e esvaziar) e bloqueou-se com 3 ml de tampão de bloqueio, durante 1 hora, a 37 °C e lavou-se tal como antes. Adicionou-se complexos de proteína-ADN da biblioteca, em tampão de bloqueio e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente, em repouso. Lavou-se o tubo 67 cinco vezes com SBF/Tween 20 a 0,1 % e depois mais cinco vezes apenas com SBF.

Eluiu-se o ADN em 500 μΐ de acetato de sódio 1 M, a pH 5,2 durante 10 minutos, no misturador de sangue, neutralizou-se com 100 yl de Tris-HCl 1M, a pH 8,0 depois extraiu-se com fenol/CHCl3 durante 5 minutos a 16.000g. O ADN precipitou com 20 yg do veiculo de glicogénio, ½ volume de acetato de amónio 7,5 M e três volumes de etanol. Peletizou-se o ADN a 16.100 g, durante for 20 minutos e lavaram-se os péletes com 0,5 ml de etanol a 70 %, durante 5 minutos, a 16.100g e depois secou-se em vácuo e suspendeu-se novamente em 20 μΐ de água.

Amplificou-se, por RCP, 10 μΐ do ADN recuperado, numa mistura reaccional de 1 x 50 μΐ com os iniciadores NOT1RECREV2 (SEQ ID 32) e TACFAR4 (SEQ ID 30) e uma mistura de 2 unidades de ADN polimerase Taq: ADN polimerase Deep Vent (NEB) durante 30 ciclos a 94 °C, de 40 segundos; a 60 °C, de 40 segundos; a 72 °C, de 90 segundos; seguido de uma extensão, de 5 minutos, a 72 °C. Fez-se a electroforese de 50 μΐ do produto da reacção em gel de agarose a 1 %/TAE e fotografou-se e depois purificou-se com 10 μΐ de água. Ligou-se novamente o ADN ao ADN de RepA e voltou a amplificar-se para o ciclo dois, tal como descrito no exemplo 4, utilizando os iniciadores TACFAR5 (SEQ ID 31) e ORIREV (SEQ ID 02). A selecção do segundo ciclo foi realizada como no ciclo 1, utilizando os mesmos pares de iniciadores descritos no exemplo 4, com as seguintes alterações: reduziu-se a concentração do revestimento do anticorpo anti-V5 para 5 yg/ml. O ADN inicial foi de aproximadamente 4 yg. A selecção do terceiro ciclo foi realizada tal como 68 para o ciclo 2, com as seguintes alterações: utilizou-se aproximadamente 4 yg do ADN inicial. As RCPs de recuperação utilizaram os iniciadores TACFAR5.1 (SEQ ID 33) e NOTRECREV2 (SEQ ID 32) . Finalmente, a RCP de recuperação utilizou os iniciadores TACFAR6 (SEQ ID 35) e ORIREV (SEQ ID 02) durante 10 ciclos. O ciclo 4 realizou-se como o ciclo 3.

Para a clonagem como fragmentos de Ncol-Notl, amplificou-se, por RCP, o ADN recuperado e armazenado do ciclo 4 e o ADN recuperado do ciclo 4 com os iniciadores biotinilados TAC6 (SEQ ID 26) e NOTIREPRECREV2 (SEQ ID 32) e clonaram-se no vector do fagemido pVIII e electroporou-se em TG-1 de E.coli electrocompetente, tal como descrito no exemplo 4.

Seleccionaram-se colónias individuais para placas de 96 poços em 200 μΐ de meio de glicose a 2 %, 2xTY, 100 yg/ml de ampicilina e cresceram a 37 °C/200 rpm durante 6 horas. Transferiram-se 100 μΐ para uma placa de poços profundos contendo 100 μΐ de glicose a 2 %, 2xTY, 100 pg/ml de ampicilina mais 109 kru do fago auxiliar de fago M13K07/poço e incubou-se durante 1 hora, sem agitação, a 37 °C. Adicionou-se 400 μΐ por poço do meio 2xTY, 100 pg/ml de ampicilina/25 pg/ml de canamicina/lPTG 20 μΜ e continuou-se a amplificação dos fagos durante 16 horas, a 37 °C, enquanto se agitava a 200 rpm. Fez-se rodar as culturas bacterianas em veículos de placas microtituladoras a 2000 g, durante 10 minutos, a 4°C numa centrifugadora de bancada para transformar as bactérias em péletes e utilizou-se o sobrenadante da cultura para o ensaio por ELISA.

Revestiu-se uma placa de ELISA NUNC Maxisorp com 100 ng/poço de anticorpo de péptido anti-V5 a 100 μΐ/poço de 69 SBF, durante uma hora, a 37 °C. Lavou-se a placa com 2x200 μΐ/poço de SBF e bloqueou-se, durante 1 hora, a 37 °C com 200 μΐ/poço de ASB a 2 %/SBF e depois lavou-se com 2x200 μΐ/poço de SBF. Adicionou-se 50 μΐ do sobrenadante da cultura de fagos, a cada poço, contendo 50 μΐ/poço de ASB a 4 %/SBF e deixou-se a ligar, durante 1 hora, à temperatura ambiente. Lavou-se a placa duas vezes com 200 μΐ/poço de SBF/Tween 20 a 0,1 %, depois duas vezes com 200 μΐ/poço de SBF. Detectou-se o fago ligado com 100 μΐ/poço, de conjugado de POR-anti-M13 diluído a 1:5000 (Amersham-Pharmacia) em ASB a 2 %/SBF, durante 1 hora à temperatura ambiente e lavou-se a placa quatro vezes, tal como antes. Fez-se o desenvolvimento da placa durante 5 minutos, à temperatura ambiente com 100 μΐ/poço de tampão de substrato de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina). Parou-se a reacção com 100 μΐ/poço de H2S04 0,5 N e leu-se a 450nm. Em seguida sequenciou-se o ADN de fagemido dos clones positivos de ELISA com iniciadores normalizados paralelos e anti-paralelos pUC. A sequência destes aminoácidos, isolada, está ilustrada a seguir. Os quatro clones positivos de ELISA cresceram em 10 ml de volumes de cultura e as partículas de fagos precipitaram com PEG-NaCl e foram novamente suspensas em 1 ml de SBF e fez-se um novo teste de ELISA em 50 μΐ, tal como se descreveu antes. Os sinais de DO a 450 nm em função do anticorpo de péptido anti-V5 e anti-ACTH de controlo estão ilustrados na figura 8.

Sequências de péptidos isoladas após a selecção:

P1C12 (SEQ ID 36) CGCPTMAARVRPVLNSKH P2H1 (SEQ ID 37) MTTVPVLMISV

P1B5 (SEQ ID 38) TLSTRHHNVIDRFNLRNF

P2B8 (SEQ ID 39) SIRTLTGSTPAQFDATAD 70

Exemplo 6, Selecção de péptidos que se ligam a albumina do ovo a partir de uma biblioteca de exibição de CIS

Para qualquer metodologia de selecção é importante que as entidades seleccionadas sejam capazes de se ligarem ao alvo contra o qual foram seleccionadas, independentemente da molécula veicular associada com elas durante o processo de selecção e rastreio. Neste exemplo, os péptidos seleccionados são seleccionados e sintetizados para permitir a confirmação da ligação do alvo. Fez-se a construção da biblioteca aleatória de péptidos 12mer tal como descrito no exemplo 3. Realizaram-se quatro ciclos de selecção, tal como descrito no exemplo 4 com 100 yg/ml de albumina de ovo (SIGMA, Dorset, RU) a revestir os imuno-tubos.

Para a clonagem como fragmentos de Ncol-Notl, amplificou-se, por RCP, o ADN recuperado do ciclo 4 com os iniciadores biotinilados TAC6 (SEQ ID 26) e NOTIREPRECREV2 (SEQ ID 32) e clonaram-se num vector de fagemido pVIII e electroporou-se em TG-1 de E.coli electrocompetente, tal como descrito no exemplo 4 .

Seleccionaram-se colónias individuais para placas de 96 poços em 200 yl de meio de glicose a 2 %, 2xTY, 100 pg/ml de ampicilina e cresceram a 37 °C/200 rpm durante 6 horas. Transferiram-se 100 μΐ para uma placa de poços profundos contendo 100 μΐ de glicose a 2 %, 2xTY, 100 pg/ml de ampicilina mais 109 kru do auxiliar de fago Ml3K07/poço e incubou-se durante 1 hora, sem agitação, a 37 °C. Adicionou-se 400 μΐ por poço do meio de 2xTY, 100 pg/ml de ampicilina/25 pg/ml de canamicina/IPTG 20 μΜ e continuou-se a amplificação dos fagos durante 16 horas, a 37 °C, enquanto se agitava a 200 rpm. Fez-se rodar as culturas 71 bacterianas em veículos de placas microtituladoras a 2000 g, durante 10 minutos, a 4 °C numa centrifugadora de bancada para transformar as bactérias em péletes e utilizou-se o sobrenadante da cultura para o ensaio por ELISA.

Revestiu-se uma placa de ELISA NUNC Maxisorp com 100 yg/poço de albumina de ovo em 100 μΐ/poço de SBF, durante a noite, a 4 °C. Lavou-se a placa com 2x200 μΐ/poço de SBF e bloqueou-se, durante 1 hora, a 37 °C com 200 μΐ/poço de ASB a 2 %/SBF e depois lavou-se com 3x200 μΐ/poço de SBF. Adicionou-se 50 μΐ do sobrenadante da cultura de fagos, a cada poço, contendo 50 μΐ/poço de ASB a 4 %/SBF e deixou-se a ligar, durante 1 hora, à temperatura ambiente. Lavou-se a placa duas vezes com 200 μΐ/poço de SBF/Tween 20 a 0,1 % e depois duas vezes com 200 μΐ/poço de SBF. Detectou-se o fago ligado com 100 μΐ/poço, de conjugado de POR-anti-Ml3 diluído a 1:5000 (Amersham-Pharmacia) em ASB a 2 %/SBF, durante 1 hora à temperatura ambiente e lavou-se a placa quatro vezes, tal como antes. Fez-se o desenvolvimento da placa durante 5 minutos, à temperatura ambiente, com 100 μΐ/poço de tampão de substrato de TMB (3,3', 5,5'-tetrametilbenzidina). Parou-se a reacção com 100 μΐ/poço de H2S04 0,5 N e leu-se a 450nm. O ADN do fagemido, dos clones positivos em ELISA, foi então sequenciado com o iniciador M13REV. A sequência destes aminoácidos, isolada, está ilustrada a seguir.

Cl (SEQ ID 40) ANLWRIVLHGWW

C4 (SEQ ID 41) VSFMLLGPHRHR

C6 (SEQ ID 42) LVLHWLSLGSR

C8 (SEQ ID 43) SNQVVLILHLRP

Controlo (SEQ ID 44) AESWLHQSWIHL 72

Sintetizaram-se as sequências de péptidos, de quatro clones representativos, positivos em ELISA, (SIGMA-Genosys Ltd) com biotina adicionada ao terminal C para ajudar na detecção por ELISA. Estes péptidos foram analisados em ELISA em função de albumina de ovo, em conjunto com um péptido de controlo previamente isolado pela selecção por exibição de fago contra esporos de B.globigii. Revestiu-se uma placa de ELISA NUNC Maxisorp com 100 yg/poço de albumina de ovo em 100 μΐ/poço de SBF ou 200 ng/poço de anticorpo policlonal anti-V5, durante a noite, a 4 °C. Lavou-se a placa com 2x200 μΐ/poço de SBF e bloqueou-se, durante 1 hora, a 37 °C com 200 μΐ/poço de leite em pó desnatado a 2 %/SBF e depois lavou-se com 2x200 μΐ/poço de SBF. Adicionou-se 1 μΐ de péptidos diluídos a cada poço em 100 μΐ/poço de ASB a 2%/SBF e deixou-se a ligar, durante 1 hora, à temperatura ambiente. Lavou-se a placa duas vezes com 200 μΐ/poço de SBF/Tween 20 a 0,1 %, depois duas vezes com 200 μΐ/poço de SBF. Detectaram-se os péptidos ligados com 100 μΐ/poço, de conjugado de estreptavidina-POR diluído a 1:2000 (Pierce) em ASB a 2 %/SBF, durante 1 hora à temperatura ambiente e lavou-se a placa quatro vezes, tal como antes. Fez-se o desenvolvimento da placa durante 5 minutos, à temperatura ambiente com 100 μΐ/poço de tampão de substrato de TMB (3,3',5,5'-tetrametilbenzidina). Parou-se a reacção com 100 μΐ/poço de H2SO4 0,5 N e leu-se a 450 nm (figura 9) .

Exemplo 7, Exibição de fragmentos de um anticorpo Fv de cadeia simples (scFv) num sistema de exibição de CIS

Construiu-se uma estrutura de tac-scFv-RepA-CIS-ori por extensão e sobreposição por RCP, tal como descrito previamente no exemplo 1. Amplificou-se o ADN de scFV anti-mecoprop (Haptogen Ltd, Aberdeen, RU) num volume reaccional 73 de 50 μΐ contendo dNTPs 200 μΜ, lx tampão de amplificação de NEB polimerase (KCl 10 mM, (NH4)2S04 10 mM, Tris-HCl 20 mM a pH 8,8, MgS04 2 mM, TritonX-100 a 0,1 %) com 10 pmole de cada um dos iniciadores TACMECOFOR (SEQ ID 45) e REPAMECOBAK (SEQ ID 46) e 2 unidades de ADN polimerase Taq : ADN polimerase Deep Vent (NEB) a 20:1: durante 30 ciclos a 94 °C, de 40 segundos; a 60 °C, de 40 segundos; a 72 °C, de 80 segundos; seguido de uma extensão, de 5 minutos, a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos em gel de agarose a 1 %/TAE e purificou-se com um estojo Geneclean II em 20 μΐ de água. Fez-se a junção com o ADN de RepA-CIS-ori gerado com ORIREV408 (SEQ ID 20) e MECOREPAFOR (SEQ ID 47) e o ADN do promotor Tac gerado com TACFARUP (SEQ ID 23) e MECOTACBAK (SEQ ID 48) num volume reaccional de 50 μΐ contendo dNTPs 200 μΜ, lx tampão de amplificação de NEB polimerase (KCl 10 mM, (NH4)2S04 10 mM, Tris-HCl 20 mM a pH 8,8, MgS04 2 mM, TritonX-100 a 0,1 %) com 10 pmole de cada um dos iniciadores TAC3 (SEQ ID 09) e ORIREV (SEQ ID 02) e 2 unidades de uma mistura de ADN polimerase Taq : ADN polimerase Deep Vent (NEB) a 20:1 durante 30 ciclos de 94 °C, em 40 segundos; 60 °C, 40 segundos; 72 °C, 80 segundos; seguido de uma extensão de 5 minutos a 72 °C. Fez-se uma electroforese dos produtos num gel de agarose a 1 %/TAE e purificou-se com um estojo Geneclean II em 20 μΐ de água.

Amplificou-se novamente o ADN em 10x50 μΐ de misturas reaccionais contendo dNTPs 200 μΜ, tampão de amplificação de lxNEB polimerase (KCl lOmM, (NH4)2S04 lOmM, Tris-HCl 20 mM, a pH 8,8, MgS04 2 Mm, TritonX-100 a 0,1%) com 10 pmole de cada um dos iniciadores TAC3 (SEQ ID 09) e ORIREV (SEQ ID 02) e 2 unidades de uma mistura de ADN polimerase Taq: ADN polimerase Deep Vent (NEB) a 20:1 durante 30 ciclos a 94 °C, de 40 segundos; a 60 °C, de 40 segundos; a 72 °C, de 80 segundos; seguido de uma extensão, de 5 minutos, a 72 74 °C. Fez-se a electroforese dos produtos em gel de agarose a 1 %/TAE e purificou-se com um estojo Geneclean II em 100 yl de água. O ADN de ScFv foi então traduzido nas condições das duas reacções que se seguem: REACÇÃO 1 2 ADN DE Tac-ScFv-RepA 28 μΐ (1 pg) 28 μΐ (1 pg) 2,5x tampão 40 μΐ 40 μΐ Metionina lOmM 1 μΐ 1 μΐ h2o 1 μΐ - Extracto de S30 30 μΐ 30 μΐ

Incubaram-se as misturas reaccionais a 30 °C, durante 30 minutos e depois adicionou-se, a mistura reaccional 2, 1 μΐ de ox-glutationa 0,25 M e fez-se a incubação a 30 °C e continuou-se durante mais 30 minutos. Adicionou-se 1 ml de tampão de bloqueio a cada mistura reaccional (o tampão de bloqueio é constituído por gelatina a 1%, 100 pg/ml de ADN de esperma de salmão laminado, 2,5 mg/ml de heparina, em TBS), centrifugou-se a 10.000 g durante 2 minutos e depois colocou-se em gelo.

Revestiram-se imuno-tubos estrela NUNC com 0,5 ml de um conjugado de ASB-mecoprop a 10 pg/ml ou 10 pg/ml de ASB em SBF durante 1 hora, a 37 °C. Lavaram-se os tubos 2x com SBF, depois bloqueou-se durante 1 hora, à temperatura ambiente, com 3 ml de tampão de bloqueio num misturador de sangue, depois lavaram-se os tubos com 2x SBF.

Adicionou-se 0,5 ml de cada ITT diluído quer a um tubo revestido quer com ASB bloqueada ou um tubo revestido com ASB-mecoprop e incubou-se, à temperatura ambiente, durante 75 1 hora. Lavaram-se os tubos 5x com TBS/Tween 20 a 0,1 %, 5x com TBS.

Eluíu-se o ADN ligado, durante 10 minutos, à temperatura ambiente, com 0,5 ml de NaCl 0,5M/Tris 10 mM, a pH 8, EDTA lmM, depois extraiu-se com 0,5 mL de fenol/clorofórmio e precipitou com 20 yg de veiculo de glicogénio, ½ volume de acetato de amónio 7,5 M e três volumes de etanol. Peletizou-se o ADN a 14.000 g, durante 20 minutos e lavaram-se os péletes com 0,5 ml de etanol a 70 %, durante 5 minutos, a 14.000 g e depois secou-se em vácuo e suspendeu-se novamente em 20 μΐ de água.

Amplificou-se 10 μΐ do ADN recuperado num volume de 50 μΐ de misturas reaccionais contendo dNTPs 200 μΜ, tampão de amplificação de lxNEB polimerase (KC1 lOmM, (NH^SCh lOmM, Tris-HCl 20 mM, a pH 8,8, MgSCh 2 mM, TritonX-100 a 0,1%) com 10 pmole de cada um dos iniciadores TACMECOFOR (SEQ ID 45) e REPAMECOBAK (SEQ ID 46)e 2 unidades de uma mistura de ADN polymerase Taq: ADN polimerase Deep Vent (NEB) a 20:1 durante 30 ciclos a 94 °C, de 40 segundos; a 60 °C, de 40 segundos; a 72 °C, de 80 segundos; seguido de uma extensão, de 5 minutos, a 72 °C. Fez-se a electroforese dos produtos em gel de agarose a 1 %/TAE e fotografou-se. Observaram-se maiores quantidades de ADN a partir de selecções no anticorpo-alvo e depois com o recuperado dos tubos revestidos com ASB, indicando que os complexos funcionais de scFv-RepA-ADN estavam a ser seleccionados (figura 10).

LISTA DE SEQUÊNCIAS 76

<110> ISOGENICA LIMITED

<120> PROCESSO DE EXIBIÇÃO DE UMA BIBLIOTECA DE PÉPTIDOS

<130> N.86234C SER <150> GB 0220759.5 <151> 2002-09-06 <150> GB 0304521.8 <151> 2003-02-27 <150> GB 0304657.0 <151> 2003-02-28 <160> 48 <170> Patentin versão 3.1

<210> 1 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador < 4 0 0 > 1 actgatcttc accaaacgta tta 23

<210> 2 <211> 22 <212> ADN 77 <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador < 4 0 0 > 2 tgcatatctg tctgtccaca gg 22

<210> 3 <211> 48 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador < 4 0 0 > 3 gagcttcaac aggggagggg gaggaggatc aactgatctt caccaaac 48

<210> 4 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador < 4 0 0 > 4 ctaggactgg attcaacggg gggaggagga tcaactgatc ttcaccaaac 50

<210> 5 <211> 49 <212> ADN <213> Sequência artificial 78 < 2 2 Ο > <223> Iniciador < 4 0 0 > 5 cagaagagga tctgaatggg ggaggagggt ccactgtggc tgcaccatc 4 9

<210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <400> 6 tcccctgttg aagctctttg tg 22

<210> 7 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador < 4 0 0 > 7 cagaagagga tctgaatggg ggaggagggt ccggaaaacc 40

<210> 8 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial 79 <220> <223> Iniciador <400> 8 gctacgttga atccagtcct aggagag 27

<210> 9 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador < 4 0 0 > 9 catattgtcg ttagaacgcg gc 22

<210> 10 <211> 58 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador < 4 0 0 > 10 attcagatcc tcttctgaga tgagtttttg ttcctcgagc atggtagatc ctgtttcc 58

<210> 11 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador 80 <400> 11 cgatacctag cgttcggatc catattgtcg ttagaacgcg gc 42 <210> 12 <211> 1788 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Estrutura de ADN <400> 12 catattgtcg ttagaacgcg gctacaatta atacataacc ttatgtatea tacacatacg. 60 atttaggtga cactatagaa tacaagctta ctccccatcc ccctgttgac aattaatcat 120 ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acaggatcta 180 ccatgctcga ggaacasaaa ctcatctcag aagaggatct gaatggggga ggagggtcca 240 ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa 300 ctgcctctgt tgtgtgcctg ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga 360 aggtggataa cgccctccaa tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca 420 aggacagcac ctacagcctc agcascaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac 480 acaaagtcta cgcctgcgaa gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc aeaaagagct 540 tcaacagggg agggggagga ggatcaactg atcttcacca aacgtattac cgccaggtaa 600 agaacccgaa tccggtgttc actccccgtg aaggtgccgg aacgccgaag ttccgcgaaa 660 aaccgatgga aaaggcggtg ggcctcacct cccgttttga tttcgccatt catgfcggcgc 720 atgcccgttc ccgtggtctg cgtcggcgca tgccaccggt gctgcgtcga cgggctattg 780 atgcgctgct gcaggggctg tgtttccact atgacccgct ggccaaccgc gtccagtgtt 840 ccatcaccac actggccatt gagtgcggac tggcgacsga gtccggtgca ggaaaactct 900 ccatcacccg tgccacccgg gccctgacgt tcctgtcaga gctgggactg attacctscc 960 agacggaata tgscccgctt atcgggtgct acattccgac cgacatcacg ttcacactgg 1020 ctctgtttgc tgcccttgat gtgtctgagg atgcagtggc agetgcgcgc cgcagtcgtg 1080 ttgaatggga aaacaaacag cgcaaaaagc aggggctgga taccctgggt atggatgagc 1140 tgatagcgaa agcctggcgt tttgtgcgtg agcgtttccg cagtteccag acagagçttc 1200 agteccgtgg aataaaacgt gcccgtgcgc gtcgtgatgc gaacagagaa cgtcaggata 1260 tcgtcaccct agtgaaacgg cagctgacgc gtgaaatctc ggaaggacgc ttcactgcta 1320 atggtgaggc ggtaaaacgc gaagtggagc gtcgtgtgaa ggagcgcatg attctgtcac 1380 gtaaccgcaa ttacagccgg ctggccacag cttctccctg aaagtgatct cctcagaata 1440 atccggcctg cgccggaggc atccgcacgc ctgaagcccg ecggtgcaca aaaaaacagc 1500 gtcgcatgca aaaaacaatc tcatcatcca ccttctggag catccgattc cccctgtttt 1560 taatacaaaa tacgcctcag cgacggggaa ttttgcttat ccacatttaa ctgcaaggga 1620 cttccccata aggttacaac cgttcatgtc ataaagcgcc agccgccagt cttacagggt 1680 gcaatgtatc ttttaaacac ctgtttatat ctcctttaaa ctacttaatt acattcattt 1740 aaaaagaaaa cctattcact gcctgtcctg tggacagaca gatatgca 1788 <210> 13 81

<211> 1518 < 212 > ADN <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Estrutura de ADN <400> 13 catattgtcg ttagaacgcg gctaeaatta atacataacc ttatgtatca tacacatacg 50 atttaggtga cactatagaa tacaagctta ctccccatcc ccctgttgac aattaatcat 120 ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acaggatcts 180 ecatgctcga ggaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatggggga ggagggtceg 240 gaaaacctat cccaaaccct ctcctaggac tggattcaac ggggggagga ggatcaactg 300 atcttcacca aacgtattac cgccaggtaa agaactcgaa tccggtgttc actccccgtg 360 aaggtgccgg aacgccgaag ttccgcgeaa aaccgatgga aaaggcggtg ggcetcacct 420 cccgttttga tttcgccatt catgtggcgc atgcccgttc ccgtggtctg cgtcggcgea 480 tgccaccggt gctgcgtcga cgggctattg atgcgctgct gcaggggctg tgtttccact 540 atgacccgct ggccaaccgc gfcccagfcgtt ccatcaccac actggccatt gagtgcggac 600 tggcpcaga gtccggtgca ggaaaactct ccatcacccg tgccacccgg gccctgacgt 660 tçctgtcaga gctgggectg attacctacc agacggaata tgacccgctt atcgggtgct 720 acattccgac cgacatcacg tfccacactgg ctetgtttgc tgcccttgat gtgtctgagg 780 atgcagtgge agctgcgcgc cgeagtcgtg ttgaatggga aaacaaacag cgcaaaaagc 84Ô aggggctgga taccctgggt atggatgagc tgatagcgaa agectggcgt tttgtgcgtg 000 agcgtttccg cagttaccag acagagcttc agtcccgtgg aataaaacgt gcccgtgcgc 960 gtcgtgatgc gaacagagaa cgtcaggata tcgtcaccct agtgaaacgg cagctgacgc 1020 gtgaaatctc ggaaggacgc ttcactgcta atggtgaggc ggtaaaacgc gaagtggagc 1080 gtcgtgtgaa ggagcgcatg atfctgtcac gtaaccgcaa ttacagccgg ctggccacag 1140 cttctecctg aaagtgatct cctcagaata atccggcctg cgccggaggc atccgcacgc 1200 ctgaagcccg ccggtgcaca aaaaaacagt gtcgcatgca aaaaacaatc tcatcatcca 1260 cçttctggag catccgattc cccctgtttt taatacaaaa iacgeetcag cgacggggaa 1320 ttfctgcttat ccacatttaa ctgcaaogga cttccccata aggttacaae cgttcatgtc 1380 ataaagcgcc agccgccagt cttacagggt gcaatgtatc ttttaaacsc ctgtttatat 1440 ctcctttaaa ctacttaatt acattcattt aaaaagaaaa cctattcact gcctgtcctg 1500 tggacagaca gatatgca 1518

<210> 14 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência artificial 82 <220> <223> Sequência de reconhecimento do receptor-alvo de estrogénio < 4 0 0 > 14 tcaggtcaga gtgacctgag ctaaaataac acattcag 38 <210> 15 <211> 828 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência repA <220> <221> CDS <222> <223> (1)..(828) < 4 0 0 > 15 83 atg gta aag aac ccg aat ccg gtg ttc act ccc cgt gaa ggt gee gga 48 Met Vai Lys Asn Pro Asn Pro Val Phe Thr Pro Arg Glu Gly Ala Gly 1 ς 10 15 acg ccg aag ttc ege gaa aaa ccg atg gaa aag gcg gtg ggc etc acc 95 Thr Pro Lys Phe Arg Glu Lys Pro Met Glu Lys Ala Val Gly Leu Thr 20 25 30 tcc cgt ttt gat ttc gee att cat gtg gcg cat gee cgt tcc cgt ggt 144 Ser Arg Phe Asp Phe Ala Ile Hl s Val Ala His Ala Arg Ser Arg Gly 35 40 45 ctg cgt cgg ege atg cea ccg gtg ctg cgt cga cgg gct att gat gcg 192 leu Arg Arg Arg Het Pro Pro Val Leu Arg Arg Arg Ala Ile Asp Ala 50 55 60 ctg ctg cag ggg ctg tgt ttc cac tat gac ccg ctg gee aac ege gtc 240 Leu Leu Gin Gly leu Cys Phe Hís Tyr Asp Pro Leu Ala Asn Arg Val 65 70 75 80 cag tgt tcc ate acc aca ctg gee att gag tgc gga ctg gcg aca gag 288 Gin Cys Ser He Thr Thr Leu Ala Ile Glu Cys Gly Leu Ala Thr Glu 85 90 95 tcc ggt gea 893 aaa etc tcc ate acc cgt gee acc cgg gee ctg acg 336 Ser Gly Ala Gly Lys leu Ser Ile Thr Arg Ala Thr Arg Ala Leu Thr 100 105 110 ttc ctg tea gag ctg gga ctg att acc tac cag acg gaa tat gac ccg 384 Phe Leu Ser Glu Leu Gly Leu Ile Thr Tyr Gin Thr Glu Tyr Asp Pro 115 120 125 ctt ate ggg tgc tac att ccg acc gac ate acg ttc aca ctg gct ctg 432 Leu lie Gly Cys Tyr Ile Pro Thr Asp Ile Thr Phe Thr Leu Ala Leu 130 135 140 ttt gct gee ctt gat gtg tet gag gat gea gtg gea gct gcg ege ege 480 Phe Ala Ala leu Asp Val Ser Glu Asp Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg 145 150 155 160 agt cgt gtt gaa tgg gaa aac aaa cag ege aaa aag cag ggg ctg gat 528 Ser Arg Val Glu Trp Glu Asn Lys Gin Arg lys Lys Gin Gly Leu Asp 165 170 175 acc ctg ggt atg gat gag ctg ata gcg aaa gee tgg cgt ttt stg cgt 576 Thr Leu Gly Het Asp Glu leu Ile Ala Lys Ala Trp Arg Phe Val Arg 180 185 190 84 624 624 gag cgt ttc cgc agt tac cag aca gag ctt cag tcc cgt gga ata aaa Glu Arg Pite Arg Ser Tyr Gin Thr Glu Leu Gin Ser Arg Gly Ile Lys 195 200 205 cgt gcc cgt gcg cgt cgt gat gcg aac aga gaa cgt cag gât ate gtc Arg Ala Arg Ala Arg Arg Asp Ala Asn Arg Glu Arg Gin Asp Ile Vai 210 215 220 act cta gtg aaa cgg cag ctg acg cgt gaa ate teg gaa gga cgc ttc Thr Leu Vai Lys Arg Gin Leu Thr Arg Glu Ile Ser Glu Gly Arg Phe 225 230 235 240 act gct aat ggt gag gcg gta aaa cgc gaa 9tg gag cgt cgt gtg aag Thr Ala Asn Gly Glu Ala Vai Lys Arg Glu Vai Glu Arg Arg Vai Lys 245 250 255 gag cgc afg att ctg tca cgt aac cgc aat tac age cgg ctg gcc aca Glu Arg Het Ile Leu Ser Arg Asn Arg Asn Tyr Ser Arg leu Ala Thr 260 265 270 672 720 768 816 gct tct ccc tga 828

Ala Ser Pro 275

<210> 16 <211> 275 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência de repA < 4 0 0 > 16

Het Vai Lys Asn Pro Asn Pro Vai Phe Thr Pro Arg Glu Giy Ala Sly 1 5 10 15 Thr Pro lys Phe Arg Glu Lys Pro Met Glu Lys Ala Vai 61 y Leu Thr 20 25 30 Ser Arg Phe Asp Phe Ala Ile His Vai Ala His Ala Arg Ser Arg Sly 35 40 45 Leu Arg Arg Arg Met Pro Pro Vai leu Arg Arg Arg Ala Ile Asp Ala 50 55 60 Leu Leu Gin 61 y Leu Cys Phe His Tyr Asp Pro Leu Ala Asn Arg Vâl 65 70 75 80

< 210 > 17 <211> 172 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 Ο > <223> Elemento CIS do ADN <400> 17 aagtgatctc ctcagaataa tccggcctgc gccggaggca tcegcacgcc tgaagcccgc 60 cggtgcacaa aaaaacagcg tcgcatgcaa aaaacaatct catcatçcae cttctggagc 120 < 210 > 18 <211> 195 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Sequência ori A o o V 18 atccgattcc ccctgttttt aatacaaaat acgcctcagc gacggggaat tt 1?2 86 tgcttatcca catttaactg caagggactt ccccataagg ttacaaccgt tcatgtcata aagcgccagc cgccagfcctt acagggtgca atgtatcttt taaacacctg tttatatctc ctttaaacta cttaattaca ttcatttaaa aagaaaacct attcactgcc tgtcctgtgg acagacagat atgca

<210> 19 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <400> 19 aattccccgt cgctgaggcg 20

<210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador <400> 20 cgtaagccgg tactgattga 20

<210> 21 <211> 110 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador 87 < 4 Ο Ο > 21 cacsggaaac aggatctacc atggccggaa aacctatccc aaaccctctc ctaggactgg 60 attcaacggg gggaggagga tcagcggccg cãactgatct tcaccaaacg 110

<210> 22 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <220> <221> caracteristicas várias <222> (29) .. (30) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> caracteristicas várias <222> (32) .. (33) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> caracteristicas várias <222> (35) .. (36) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> caracteristicas várias <222> (38) .. (39) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (41)..(42) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> caracteristicas várias <222> (44) .. (45) <223> n = a, g, c ou t < 2 2 0 > <221> caracteristicas várias <222> (47) . . (48) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> caracteristicas várias <222> (50) . . (51) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> caracteristicas várias <222> (53) . . (54) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> caracteristicas várias <222> (56) . . (57) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> caracteristicas várias <222> (59) . . (60) <223> n = a, g, c ou t 89 < 2 2 Ο > <221> características várias <222> (62) .. (63) <223> η = a. g, c ou t <400> 22 cacacaggaa acaggatcta ccatggccnn bnnbnnbnnb nnbnnbnnbn nbrmbnnbnn 6Q bnnbggggga ggaggatcag cggccgcaac tgatcttcac caaacg 106

<210> 23 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciadou <400> 23 cagttgatcg gcgcgagatt 20

<210> 24 <211> 2390 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Estrutura de TAC-V5-REPA-CIS-OUI-408 <400> 24 cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt gcagggccag 60 actggaggtg gcaacgccaa tcagcaaega ctgtttgccc gccagttgtt gtgccacgcg 120 gttgggaaig taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg ttttcgcags 180 90 aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac cggcatactc 240 tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac tctcttccgg 300 gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg gctagcgatg accctgctga 360 ttggttcgct gaccatttcc ggggtgcgga acggcgttac cagaaactca gaaggttcgt 420 ccaaccaaac cgactctgac ggcagtttac gagagagatg atagggtctg cttcagtaag 4¾) ccagatgcta cacaattagg cttgtacata ttgtcgttag aacgcggcta caattaatac 540 ataaccttat gtatcataca catacgáttt aggtgacact atagaataca agcttactcc 600 ccatccccct gttgacaatt aatcatggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 660 eaatttcaca caggaaacag gatctaccat ggccggaaaa cctatcccaa accctctcct 720 aggactggat tcaacggggg gaggaggatc agcggccgca actgatcttc accaaacgtá 780 ttaccgccag gtaaagaacc cgaatccggt gtttacaccc cgtgaaggtg caggaacgct 840 gaagttctgc gaaaaactga tggaaaaggc ggtgggcttc acttcccgtt ttgatttcgc 900 cattcatgtg gcgcatgccc gttcgcgtgg tctgcgtcga cgcatgccac cagtgctgcg 960 tcgacgggct attgatgcgc tcctgcaggg gctgtgtttc cactatgacc cgctggccaa 1020 ccgcgtccag tgctccatca ccacgctggc cattgagtgc ggactggcga cggagtctgc 1080 tgccggaàaa ctctccatca cccgtgccac ccgggccctg acgttcctgt cagagctggg 1140 actgattacc taccagacgg aatatgaccc gcttateggg tgctaçattc cgaccgatat 1200 cacgttcaca tctgcactgt ttgctgccct egatgtatca gaggaggcag tggccgccgc 1260 gcgccgcagc cgtgtggtat gggaaaacaa acaacgcaaa aagcaggggc tggataccct 1320 gggcatggat gaaetgatag cgaaagcctg gcgttttgtt cgtgagcgtt ttcgcagtta 1380 tcagacagag cttaagtccc ggggaataaa gcgtgcccgt gcgcgtcgtg atgcggacag 1440 ggaacgtcag gatattgtca ccctggtgaa acggcagctg acgcgcgaaa tcgcggaagg 1500 gcgcttcact .gccaatcgtg aggcggtaaa acgcgaagtt gagcgtcgtg tgaaggagcg 1560 catgattctg tcacgtaacc gtaattacag ccggctggcc acagcttccc cctgaaagtg 1620 acctcctctg aataatccgg cctgcgccgg aggcttccgc acgtctgaag cccgacagcg 1680 cacaaaaaat cagcaccaca tacaaaaaac aaccteatca tccagcttct ggtgcatccg 1740 gccccccctg ttttcgatac aaaacacgcc tcacagacgg ggaattttgc ttatccacat 1800 taaactgcaa gggacttccc cataaggtta caaccgttca tgtcataaag cgccatccgc 1860 cagcgttaca gggtgcaatg tatcttttaa acacctgttt atatctcctt taaactactt 1920 aattacattc atttaaaaag aaaacctatt cactgcctgt cctgtggaca gacagatatg 1980 cacctcccac cgcaagcggc gggcccctac cggagccget ttagttacaa cactcagaca 2040 caaccaccag aaaaaccctg gtccagcgca gaactgaaac cacaaagccc ctccctcata 2100 actgaaaagc ggccccgccc cggcccgaag ggccggaaca gagtcgcttt taattatgaa 2160 tgttgtaact acttcatcat cgctgtcagt cttctcgctg gaagttctca gtacacgctc 2220 gtaagcggcc ctgacggccc gctaacgcgg agatacgccc cgacttcggg taaaccctcg 2280 tcgggaccac tccgaccgcg cacagaagct ctctcatggc tgaaagcggg tatggtctgg 2340 cagggctggg gatgggtaag gtgaaatcta tcaatcagta ccggcttacg 2390

<210> 25 <211> 2384 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Estrutura de TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408 <220> 91 <221> características várias <222> (695).. (696) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (698) .. (699) <223> n = a, g, c ou t < 2 2 0 > <221> características várias <222> (701) . . (702) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (704) .. (705) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (707) . . (708) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (710)..(711) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (713) . . (714) <223> n = a, g, c ou t 92 < 2 2 Ο > <221> características várias <222> (716)..(717) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (719) .. (720) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (722) . .(723) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (725) . . (726) <223> n = a, q, c ou t <220> <221> características várias <222> (728) .. (729) <223> n = a, g, c ou t <400> 25 93 cagttgatcg gcgcgagatt taatcgcegc gacaatttgc gacggcgcgt gcagggccag 60 actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt gtgccacgcg 120 gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg ttttcgcaga 180 aaegtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga tasgagacac cggcatactc 240 tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac tctcttccgg 300 gcgctatcat gccataccgc gaaaggtltt gcaccattcg gctagcgatg accctgctga 360 ttggttcgct gaccatttcc ggggtgcgga acggcgttac eagaaactca gaaggttcgt 420 ccaaccaaac cgactctgac ggcagtttac gagagagatg atagggtctg cttcagtaag 480 ccagatgcta cacaattagg cttgtacata ttgtcgttag aacgcggcta caattaatac 540 ataaccttat gtatcataca catacgattt aggtgacact atagaataca agcfctactcc 600 ccatccccct gttgacaatt aatcatggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggatãà 660 caatttcaca caggaaacag gatctaccat ggccnnbnnò nnbnnbnnbn nbnnbnnbnn 720 bnnbnnbnnb gggggaggag galcagcggc cgcaactgat cttcaccaaa cgtattaccg 780 ccaggtaeag aacccgaatc cggtgtttac accccgtgaa ggtgcaggaa cgctgaagtt 840 ctgcgaaaaa ctgatggaaa aggcggtggg cttcacttcc cgttttgatt tcgccattca 900 tgtggcgeat gcccgttcgc gtggtctgcg tcgacgcatg ccaccagtgc tgcgtcgacg 960 ggctattgat gcgctcctgc aggggctgtg tttccactat gacccgctgg ccaaccgcgt 1020 ccagtgctcc atcaccacgc tggccattga gtgcggactg gcgacggagt ctgctgccgg 1080 aaaactctcc atcacccgtg ccacccgggc cctgacgttc ctgtcagagc tgggactgat 1140 tacctaccag acggaatatg acccgcttat cgggtgctac attccgaccg atateacgtt 1200 cacatctgca ctgtttgetg ccctcgatgt atcagaggag gcagtggccg cegcgcgccg 1260 cagccgtgtg gtatgggaaa acaaacaacg caaaaagcag gggctggata ccctgggcat 1320 ggatgaactg atagcgaaag cctggcgttt tgttcgtgag cgttttcgca gttatcagac 1380 agagcttaag tcccggggaa taaagcglgc ccgtgegcgt cgtgatgcgg acagggaacg 1440 tcaggatatt gtcaccctgg tgaaacggca gctgacgcgc gaaatcgcgg aagggcgctt 1500 eactgccaat cgtgaggcgg taaaacgcga agttgagcgt cgtgtgaagg agcgcatgat 1560 tctgtcâcgt aaccgtaatt acagccggct ggccacagct tccccctgaa agtgacctcc 1620 tctgaataat ccggcctgcg ccggaggctt ccgcacgtct gaagcccgac agcgcacaaa 1680 aaatcagcac cacatacaaa aaacaacctc atcatccagc ttctggtgca tccggccccc 1740 cctgttttcg atacaaaaca cgcctcacag acggggaatt ttgcttatcc acattaaact 1800 gcaagggact tccccataag gttacaaccg ttcatgtcat aaagcgccat ccgccagcgt 1860 taeagggtgc aatgtatctt ttaaacacct gtttatatct cctttaaact acttaattac 1920 attcatttaa aaagaaaacc tattcactgc ctgtcctgtg gacagacaga tatgcacctc 1980 ccâccgcã&g cggcgggccc ctaccggagc cgetttagtt acaacactca gacacaacca 2040 ccagaaaaac cccggtccag cgcagaactg aaaccacaaa gcccctccct cataactgaa 2100 aagcggcccc gccccggccc gaagggccgg aacagagtcg cttttaatta tgaatgttgt 2160 aactacttca tcatcgctgt cagtcttctc gctggaagtt ctcagtacac gctcgtaagc 2220 ggccctgacg gcccgctaac gcggagatac gccccgactt cgggtaaacc ctcgtcggga 2280 ccactccgac cgcgcacaga agctctctca tggctgaaag cgggtatggt ctggcagggc 2340 tggggatggg taaggtgaaa tctatcaatc agtaccggct tacg 2384 <210> 26 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador 94 < 4 Ο Ο > 26 ccccatcccc ctgttgacaa ttaatc 26

<210> 27 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <400> 27 ggtagatcct gtttcctgtg tg 22

<210> 28 <211> 110 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <220> <221> caracteristicas várias <222> (37) . . (38) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> caracteristicas várias <222> (40) .. (41) <223> n = a, g, c ou t < 2 2 0 > <221> caracteristicas várias 95 <222> (43) ..(44) <223> η = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (46) .. (47) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (49) . . (50) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (52) . . (53) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (55) . . (56) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (58) . . (59) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (61) . . (62) <223> n = a, g, c ou t 96 <220> <221> características várias <222> (64)..(65) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (67) . . (68) <223> n = a, g, c ou t < 2 2 0 > <221> características várias <222> (70) . . (71) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (73) . . (74) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (76) . . (77) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (79) . . (80) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (82) .. (83) <223> n = a, g, c ou t 97 < 2 2 Ο > <221> características várias <222> (85)..(86) <223> n = a, g, c ou t <220> <221> características várias <222> (88)..(89) <223> n = a, g, c ou t <400> 28

acataccgtc atgcggccgc tgatcctcct cccccvnrwn nvnnvnnvnn vnnvnnvnnv 60 nnvnnvnnvn nvnnvnnvnn vnnvnnvnng gccatggtag atcctgtttc HO

<210> 29 <211> 49 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <400> 29 ctggagatgg catcaagggc cccaactgat cttcaccaaa cgtattacc 49

<210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador 98 <4 Ο Ο> 30 ggcgctatca tgccataccg 20 < 210 > 31 <211> 20

< 212 > ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <400> 31 accattcggc tagcgatgac 20

<210> 32 <211> 33 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <400> 32 ggtgaagatc agttgcggcc gctgatcctc ctc 33

<210> 33 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <400> 33 99 22 gattggttcg ctgaccattt cc <210> 34 <211> 21 <212> ADN A co T-1 Cs] V Sequência artificial <220> <223> Iniciador < 4 0 0 > 34 cggcgttacc agaaactcag a <210> 35 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador < 4 0 0 > 35 aaccgactct gacggcagtt <210> 36 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido < 4 0 0 > 36 100

Cys Giy Cys Pro Thr Met Ala Ala Arg Vai Arg Pro Vai Leu Ase Ser 1 5 10 15

Lys His <210> 37

<211> 11 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido <400> 37

Met Thr Thr Vai Pro Vai Leu Met IIe Ser Vai 1 5 10

<210> 38 <211> 18 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido <400> 38

Thr Leu Ser Thr Arg His His Asn Vai IIe Asp Arg Phe Aso Leu Arg 1 5 10 15

Asn Phe

<210> 39 <211> 18 <212> PRT 101 <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido <400> 39

Ser II l & Arg Thr Leu Thr Gly Ser Tftr Pro Ala Gin Phe Asp Ala Thr 5 10 15

Ala Asp

<210> 40 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido <400> 40

Ala Asn Leu Trp Arg íle Vai leu Hls Gly Trp Trp 1 5 10

<210> 41 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> Péptido <400> 41 102

Vai Ser Phe Met Leu Leu Gly Pro His Arg His Arg 1 5 10 <210> 42 <211> 11 <212> PRT A co T-1 Cs] V Sequência artificial <220> <223> Péptido < 4 0 0 > 42 Leu Vai Leu His Trp Leu Ser Leu Gly Ser Arg 1 5 10 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido < 4 0 0 > 43 Ser Asn Gin Vai Vai Leu lie Leu His Leu Arg Pro 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial 103 <220> <223> Péptido <400> 44

Ala Glu Ser Trp Leu His Gin Ser Trp lie Hls Leu 1 5 10

<210> 45 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <400> 45 caggaaacag gatctaccat gctgcaggag tcaggacctg ag 42

<210> 46 <211> 53 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <400> 46 gtttggtgaa gatcagttga tcctcctccc ccccgctcga ggaagatgga tac 53

<210> 47 <211> 53 <212> ADN <213> Sequência artificial 104 < 2 2 Ο > <223> Iniciador <400> 47 gtatccactct tcctcgagcg ggggggagga ggatcaactg atcttcacca aac 53

<210> 48 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Iniciador <400> 48 ctaggtcct gactcctgca gcatggtaga tcctgtttcc tg 42

Lisboa, 24 de Janeiro de 2011. 105

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a produção de uma biblioteca de expressão de péptidos in vitro que compreende uma pluralidade de péptidos, em que cada péptido está ligado à estrutura do ADN que codifica o péptido, caracterizado pelo facto de compreender as etapas de: (a) providenciar uma estrutura de ADN compreendendo: (i) uma sequência-alvo de ADN; (ii) o ADN que codifica um péptido que é um elemento da biblioteca; e (iii) o ADN que codifica um péptido capaz de se ligar directamente ou indirectamente, de forma não covalente à referida sequência-alvo de ADN de (i); em que a referida estrutura de ADN e a proteína codificada são seleccionadas para terem actividade cis (b) expressar uma pluralidade de estruturas de ADN, de acordo com (a) em que as referidas estruturas de ADN codificam vários péptidos elementos da biblioteca de tal modo que o péptido expresso está ligado de forma não covalente ao ADN a partir do qual foi produzido.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida estrutura de ADN compreender ainda: (iv) um elemento de ADN que dirige a actividade cis. 1
3. Processo, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a referida estrutura de ADN de (a) compreender ainda (v) o ADN que codifica um fragmento que compreende pelo menos os 20 aminoácidos do terminal C de uma proteína repA em que os referidos fragmentos são capazes de interagir com o referido elemento de ADN de (iv); em que o referido elemento de ADN de (iv) está localizado em 3' em relação ao referido ADN de (ii), (iii) e (v).
4. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de o péptido codificado pelo referido ADN de (iii) ser capaz de reconhecer e de se ligar directamente à referida sequência-alvo de ADN de (i).
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o péptido codificado pelo referido ADN de (iii) ser uma proteína repA e em que a referida sequência-alvo de ADN de (i) é ori.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5 caracterizado pelo facto de o referido ADN de (ii) estar ligado ao referido ADN de (i) e (iii) por digestão com enzimas de restrição e ligação.
7. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 3 a 6 caracterizado pelo facto de a referida repA ser seleccionada entre repA dos plasmidos do complexo IncI e repA dos plasmidos de IncF, IncB, IncK, IncZ e IncL/M. 2
8. Processo, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a referida estrutura de ADN compreender a sequência que codifica de repA, o elemento cis do ADN e o ADN de ori do plasmido RI de IncFII.
9. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de a referida proteína repA ter a sequência dada na SEQ ID NO: 16 e em que o referido elemento cis de ADN ter a sequência dada na SEQ ID NO: 17.
10. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado pelo facto de o ADN não ligado pelo polipéptido codificado pelo referido ADN de (iii) estar ligado por meio de uma proteína de ligação de ADN não específica.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de o péptido codificado pelo referido ADN de (iii) ser um domínio de ligação do ADN do receptor de estrogénio e em que a referida sequência-alvo de ADN de (i) é uma sequência-alvo do receptor de estrogénio.
12. Processo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o referido domínio de ligação do ADN compreender os aminoácidos 176 a 282 do fragmento de ligação do ADN do receptor de estrogénio e em que a referida sequência-alvo de ADN compreende a sequência-alvo do receptor de estrogénio dada na SEQ ID NO: 14.
13. Processo, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de o péptido codificado pelo 3 referido ADN de (iii) se ligar indirectamente à referida sequência-alvo de ADN de (i) por via de um agente e em que o referido agente se liga à referida sequência alvo do ADN de (i) e em que o referido agente também se liga ao péptido codificado pelo referido ADN de (iii) .
14. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de a referida sequência-alvo do ADN compreender um marcador de ADN capaz de ser ligado pelo referido agente, sendo o referido marcador seleccionado, eventualmente, entre biotina e fluoresceina.
15. Processo, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo facto de as actividades de ligação do referido agente serem conferidas por meio de dois anticorpos ou dos seus fragmentos.
16. Processo, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de uma ou ambas as referidas actividades de ligação serem conferidas por meio de um fragmento Fac.
17. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo facto de o referido agente ser providenciado antes da etapa (b).
18. Processo, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de o referido agente estar ligado à referida sequência-alvo de ADN de (i) e de ser capaz de se ligar ao péptido codificado pelo referido ADN de (iii). 4
19. Processo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo facto de o referido agente ser um polímero.
20. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o referido ADN estar sob o controlo de um promotor apropriado e as sequências de tradução permitirem a transcrição e a tradução in vitro.
21. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de o referido péptido, elemento da biblioteca, ser um anticorpo ou um seu fragmento.
22. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a referida biblioteca compreender pelo menos 104 moléculas.
23. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a referida expressão ser feita na presença de um composto que impede a actividade da nuclease ou reduz as interacções não específicas de ADN-proteína ou proteína-proteína.
24. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado pelo facto de a referida expressão ser feita num ambiente conjunto de transcrição/tradução bacteriana.
25. Processo, de acordo com a reivindicação 24 caracterizado pelo facto de o referido ambiente acoplado de transcrição/tradução bacteriana ser um sistema de extracto S30. 5
26. Processo para a produção de uma biblioteca de expressão de péptidos in vitro que compreende uma pluralidade de péptidos em que cada péptido está ligado à estrutura do ADN que codifica o péptido, caracterizado pelo facto de compreender as etapas de: (a) providenciar uma estrutura de ADN compreendendo: (i) o ADN que codifica um péptido que é um elemento da biblioteca; e (ii) o ADN que codifica um péptido capaz de se ligar a um agente; em que a referida estrutura de ADN e a proteína codificada escolhem-se de modo a terem actividade cis; (b) ligar o referido agente ou um marcador de ADN capaz de ligar o referido agente à referida estrutura de ADN de (a), em que o referido agente é capaz de se ligar ao péptido codificado pelo referido ADN de (ii); e (c) expressar uma pluralidade de estruturas de ADN de acordo com (b) , em que as referidas estruturas de ADN codificam vários péptidos elementos da biblioteca de tal modo que cada péptido expresso está ligado, por via do referido agente, ao ADN a partir do qual foi produzido.
27. Processo de identificação e/ou de purificação de um péptido caracterizado pelo facto de exibir as propriedades desejadas, a partir de uma biblioteca de expressão de péptidos in vitro, produzida de acordo com o processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, compreendendo pelo menos as 6 etapas de (a) rastreio da referida biblioteca e (b) selecção e isolamento do elemento relevante da biblioteca.
28. Processo de identificação de um péptido especifico de ligação a um ligando, caracterizado pelo facto de compreender pelo menos as etapas de (a) rastreio de uma biblioteca de expressão de péptidos, in vitro, de acordo com o processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 26, com moléculas de ligando que estão eventualmente ligadas a um suporte sólido; (b) selecção e isolamento de um elemento da biblioteca, que se ligue à referida molécula de ligando; e (c) isolamento do péptido que se liga especificamente à referida molécula de ligando.
29. Processo de acordo com a reivindicação 27 ou 28 caracterizado pelo facto de os referidos péptidos, elementos da biblioteca, serem anticorpos ou os seus fragmentos.
30. Processo de identificação e/ou purificação de um péptido com a capacidade de se ligar a uma sequência-alvo especifica de um ADN, caracterizado pelo facto de compreender pelo menos as etapas de, (a) providenciar uma biblioteca de expressão in vitro, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 26 em que o péptido codificado pelo ADN de (iii) é um péptido que faz parte da biblioteca, com uma actividade de ligação do ADN e em que a referida sequência-alvo do ADN de (i) é a sequência-alvo que interessa; 7 (b) seleccionar e isolamr um elemento da biblioteca em que a proteina codificada se liga à referida sequência-alvo; e (c) isolar o péptido que se liga à referida sequência-alvo.
31. Processo, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de os referidos péptidos, elementos da biblioteca, serem proteínas de dedo de zinco, proteínas de hélice-volta-hélice ou proteínas de hélice-ansa-hélice.
32. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 27 a 31, caracterizado pelo facto de o referido rastreio e/ou a etapa de selecção serem realizados na presença de um composto que impede a actividade da nuclease ou reduz as interacções não específicas de ADN-proteína ou proteína-proteína.
33. Processo, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo facto de o referido composto ser heparina.
34. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 27 a 33, caracterizado pelo facto de, adicionalmente, se isolar o ADN que expressa o referido péptido isolado.
35. Processo, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo facto de compreender ainda a clonagem do referido ADN num vector de expressão.
36. Processo, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo facto de compreender ainda a introdução do referido vector de expressão numa célula, in vitro.
37. Processo, de acordo com a reivindicação 35 ou 36, caracterizado pelo facto de compreender ainda a expressão do péptido codificado pelo referido ADN.
38. Biblioteca de expressão de péptidos in vitro caracterizada pelo facto de ser produzida de acordo com 0 processo de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 26.
39. Estrutura de ADN tal como descrita numa qualquer das reivindicações 1 a 26.
40. Processo, de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 30, caracterizado pelo facto de os referidos péptidos ou os péptidos que fazem parte da biblioteca estarem ligados ao polietileno-glicol. Lisboa, 24 de Janeiro de 2011. 9