KR101051245B1 - 시험관내 펩타이드 발현 라이브러리 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시험관내 펩타이드 발현 라이브러리를 제조하고 목적 펩타이드를 암호하는 뉴클레오타이드 서열을 분리하는 방법으로서, 이러한 펩타이드 또는 단백질을 이를 암호하는 DNA와 비공유 단백질:DNA 결합을 통해 특이적으로 결합시키는 것이 특징인 방법을 제공한다. 이러한 방법은 라이브러리 자체를 제조하는 방법, 이 라이브러리를 암호하는 DNA 분자를 제조하는 방법 및 발현 라이브러리의 사용방법을 의미하는 것이다.

펩타이드 발현 라이브러리, 비공유 결합, 뉴클레오타이드, 발현 벡터

Description

시험관내 펩타이드 발현 라이브러리{IN VITRO PEPTIDE EXPRESSION LIBRARY}

본 발명은 기본적으로 재조합 DNA 기술에 관한 것이고, 보다 상세하게는 생물학적 활성 분자를 암호화하는 DNA 서열의 DNA 라이브러리를 작제하고 선별하는 시험관내 방법에 관한 것이다.

재조합 DNA 라이브러리로부터 목적하는 펩타이드를 암호화하는 미지 유전자를 분리하는 공정은 힘든 작업일 수 있다. 하이브리드화 프로브(hybridisation probe)를 사용하는 방법은 이러한 공정을 용이하게 하지만, 일반적으로 단백질을 암호하는 유전자의 적어도 일부 서열을 알아야만 가능한 방법이다. 이러한 서열을 알지 못하는 경우에는 발현 벡터를 이용하여 DNA 라이브러리를 발현시킨 뒤, 항체를 사용하여 목적 단백질 항원에 대한 플라크 또는 콜로니를 선별하는 방법을 이용할 수 있다. 이러한 절차는 작은 라이브러리를 선별하는데에는 유용하게 사용되었지만, 발생율이 낮은 서열인 경우, 예컨대 10⁵ 클론 중 약 1개 미만으로 나타나는 경우(예컨대 드물게 발생되는 cDNA 또는 합성 펩타이드)에는 쉽게 놓칠 수 있어, 10⁶ 클론 보다 큰 라이브러리를 선별하는 작업은 매우 힘들고 어려운 일이다. 따라서, 이러한 대형 라이브러리의 선별에서는 드물게 발생하는 서열을 분리할 수 있도 록 설계된, 발현 분자와 함께 이를 암호화하는 DNA의 공동 선발을 기본으로 하는 방법 개발이 요구되고 있다. 이와 같이 대형 라이브러리를 선별하는 방법으로서, 파지 디스플레이 및 lacI 펩타이드 융합체를 이용하는 "플라스미드 상의 펩타이드(peptides on plasmids)"와 같은 생체내 방법이 개발되었다.

파지 디스플레이는 사상 박테리오파지 외피 단백질의 N-말단 단부에 DNA 라이브러리를 융합시키고, 이를 박테리아 숙주에서 발현시키는 것을 기본으로 하며, 이로써 융합 단백질을 암호화하는 DNA가 파지 입자에 패키징되어 파지 입자 표면에 이종 펩타이드가 디스플레이된다(Smith G.P., 1985, Science 228: 1315-1317). 파지에 혼입된 융합 단백질의 라이브러리는 그 다음 당해 표적에 대한 결합 성분(리간드)을 통해 선발될 수 있다. 결합된 파지는 그 다음 에스케리치아 콜라이(이. 콜리) 박테리아에 재감염된 후 증폭되고, 이러한 선발의 반복을 통해 결합 성분이 축적되어진다(Parmley, S.F.,& Smith, G. P. 1988., Gene 73: 305-318 ; Barrett R. W. et al., 1992, Analytical Biochemistry 204: 357-364 Williamson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 4141-4145 ; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597).

LacI 융합 플라스미드 디스플레이법은 lac 억제인자의 DNA 결합력을 기본으로 한다. 이러한 lacI 억제인자 단백질의 C-말단 단부에는 랜덤 펩타이드의 라이브러리가 융합된다. LacI-펩타이드 융합체의 이를 암호하는 DNA에 대한 결합은 플라스미드 상의 lacO 서열을 통해 일어나며, 이로써 안정된 펩타이드-LacI-펩타이드 복합체가 형성된다. 이러한 복합체는 세포 용해를 통해 숙주 박테리아로부터 방출 되고, 당해 펩타이드는 고정된 수용체 표적을 이용한 친화성 정제를 통해 분리된다. 이와 같이 분리된 플라스미드는 이.콜리에 전기침투를 통해 재주입하여 선발된 집단을 추가 선별을 위해 증폭시킨다(Cull, M. G. et al. 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89: 1865-1S69).

이러한 박테리아법은 숙주 박테리아에 DNA를 도입시키는 현행 방법에 의해 발생될 수 있는 라이브러리의 크기, 도입된 발현 펩타이드의 세포 독성의 잠재성 및 해독후 변형 도입력의 상실, 또는 발현된 펩타이드에 신규 아미노산의 혼입 가능성의 결여 등을 통해 제한된다.

또한, 리보솜을 통해 펩타이드를 이를 암호하는 RNA에 결합시키는 것을 기본으로 하는 완전 시험관내 리보솜 시스템이 개시된 바 있다(WO91/05058). 리보솜 디스플레이는 또한 단일쇄 Fv 항체 단편(scFv) 선발에 사용되기도 하였다(Matheakis, L. C. et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 9022-9026 ; Hanes, J. & Pluckthun, A. 1997 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 4937-4942). 이 방법은 RNA 유전자 물질의 안정성이 보다 낮고, RNAse가 존재할 가능성이 있는 특정 선발 조건하에서 분해될 가능성이 증가된다는 단점이 있다.

이러한 문제의 일부를 해결한 그리피스와 토우픽(Griffiths & Tawfix(WO 99/02671 및 WO 00/40712))이 개시한 시험관내 방법은 펩타이드 발현 이전에 DNA를 국재화시킨 뒤, 이 구역내에서 DNA를 변형시키는 것이다. 그 다음 단계에서, 이와 같이 목적 효소 활성의 결과로 변형을 일으킬 수 있는 펩타이드가 선발된다. 하지만, 그 펩타이드를 암호화하는 DNA 변형없이, 그리고 상기 구역에서 변형된 DNA를 방출시키지 않고는 펩타이드 및 DNA 모두에 대해 펩타이드 결합 활성을 직접 선발하는 것은 불가능하다.

또 다른 종래 기술의 방법으로서, 공유결합 디스플레이 기법, 즉 CDT가 WO9837186에 기술되어 있다. 이 방법은 가교 단백질의 시스(cis) 작용을 통해 유전자형을 표현형에 결합시키는 단백질과 DNA의 공유 결합을 기본으로 한다. 이 방법은 이 기술을 성공적으로 사용하기 위하여 2가지 조건이 필요하다는 것을 교시하고 있다. 하나는, 단백질을 암호하는 DNA 서열과 시험관내에서 상호작용하는 단백질이 필요하다는 것이고(시스 작용), 다른 하나는 이러한 단백질이 자신의 DNA 주형에 공유 결합을 형성해야 한다는 것이다. 이 방법은 DNA가 화학적으로 변형되어 목적한 결합 펩타이드의 회수와 확인을 방해할 수 있는 단점이 있다.

따라서, 전술한 방법 외에, 효소 활성 뿐만 아니라 결합 활성을 직접 선발할 수 있고 복잡한 펩타이드 구조물을 효율적으로 생산할 수 있는 한편 목적 펩타이드를 암호하는 유전자 물질을 본래 상태대로 회수할 수 있는, 보다 유용한 시험관내 펩타이드 라이브러리 작제 방법이 여전히 요구되고 있다.

발명의 개요

본 발명은 각 펩타이드가 이 펩타이드를 암호하는 DNA 작제물에 연결되어 있는 복수의 펩타이드를 함유한 시험관내 펩타이드 발현 라이브러리의 제조방법으로서,

(a) (i) DNA 표적 서열;

(ii) 라이브러리 멤버 펩타이드를 암호하는 DNA; 및

(iii) 상기 (i)의 DNA 표적 서열에 직접 또는 간접적으로 비공유 결합할 수 펩타이드를 암호하는 DNA

를 함유하는 DNA 작제물을 제공하되, 이러한 DNA 작제물과 암호화된 단백질은 시스(cis) 활성을 갖는 것으로 선택되는 단계;

(b) 상기 단계 (a)에 따라 준비된 복수의 라이브러리 멤버 펩타이드를 암호하는 복수의 DNA 작제물을 발현시켜, 발현된 각 펩타이드를 이를 생산하는 DNA에 비공유 결합시키는 단계를 포함하는 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 각 펩타이드가 이 펩타이드를 암호하는 DNA 작제물에 연결되어 있는 복수의 펩타이드를 함유한 시험관내 펩타이드 발현 라이브러리의 제조방법으로서,

(a) (i) 라이브러리 멤버 펩타이드를 암호하는 DNA; 및

(ii) 이작용기제에 비공유 결합할 수 있는 펩타이드를 암호하는 DNA

를 포함하는 DNA 작제물을 제공하되, 이러한 DNA 작제물과 암호화된 단백질을 시스-활성을 갖는 것으로 선택하는 단계;

(b) 이러한 (a)의 DNA 작제물에 이작용기제를 결합시키거나 또는 이작용기제가 결합될 수 있는 DNA 태그를 결합시키되, 상기 이작용기제는 상기 (ii)의 DNA에 의해 암호화된 펩타이드에 결합할 수 있는 것인 단계; 및

(c) 상기 (b)에 따라 제조된 복수의 DNA 작제물을 발현시켜, 이러한 DNA 작제물에서 복수의 라이브러리 멤버 펩타이드가 암호화되고, 발현된 각 펩타이드가 자신을 생성하는 DNA에 상기 이작용기제를 통해 결합되는 것인 단계를 포함하는 것이 특징인 제조방법도 제공한다.

본 발명은 이러한 방법에 의해 생성된 펩타이드 라이브러리 및 이러한 방법에 사용되는 DNA 작제물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 시험관내 펩타이드 발현 라이브러리를 선발하는 방법도 제공한다. 제1 양태로서, 본 발명은 전술한 제조방법 중 어느 한 방법에 따라 제조된 시험관내 펩타이드 발현 라이브러리로부터 원하는 성질을 나타내는 펩타이드를 확인 및/또는 정제하는 방법으로서, 최소한 (a) 상기 라이브러리를 선발하는 단계 및 (b) 관련 라이브러리 멤버를 선발하여 분리하는 단계를 포함하는 것이 특징인 방법을 제공한다. 제2 양태로서, 본 발명은 특이적 리간드 결합 펩타이드를 확인하는 방법으로서, 최소한 (a) 전술한 본 발명의 방법에 따라 생성된 시험관내 펩타이드 발현 라이브러리를, 경우에 따라 고체 지지체에 결합되어 있는 리간드 분자를 이용하여 선별하는 단계; (b) 상기 표적 분자에 결합하는 라이브러리 멤버를 선발하여 분리하는 단계; 및 (c) 상기 표적 분자에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 분리하는 단계를 포함하는 것이 특징인 방법을 제공한다. 제3 양태로서, 본 발명은 (a) 본 발명에 따라 제조된 시험관내 발현 라이브러리를 제공하되, (iii)의 펩타이드 또는 단백질은 DNA 결합 활성이 있는 라이브러리 멤버 펩타이드이고 (i)의 DNA 표적 서열은 당해의 표적 서열인 것인 단계; (b) 암호화된 단백질이 상기 표적 서열에 결합하는 라이브러리 멤버를 선발하여 분리하는 단계; 및 (c) 상기 표적 서열에 결합하는 펩타이드를 분리하는 단계를 최소한 포함하여, 특정 DNA 표적 서열에 결합하는 성질이 있는 펩타이드의 확인 및/또는 정제 방법을 제공한다.

본 발명의 라이브러리 유래의 특정 펩타이드를 분리 및/또는 확인하는 방법 외에도, 본 발명의 선별 방법은 상기 라이브러리 유래의 특정 펩타이드를 암호화하는 DNA를 분리 및/또는 확인하는 데에도 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 DNA 작제물이 이것이 암호하는 펩타이드에 결합될 수 있는 방법의 모식도이다.

도 2는 DNA 결합 단백질을 시스 작용성 DNA 결합 단백질로 변환시킬 수 있는 본 발명의 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.

도 3은 본 발명의 라이브러리로부터 표적 서열 특이적 DNA 결합 단백질을 분리할 수 있는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.

도 4는 라이브러리 단백질이 시스 작용과 이중특이적 결합 분자의 사용을 통해 자신의 암호 DNA에 결합될 수 있는 방법을 개략적으로 나타낸 모식도이다.

도 5는 각 항체에 대하여 선발된 2가지 다른 크기의 유입 DNA(CK-RepA 또는 V5-RepA)의 1:1 혼합물: 시스 활성을 입증하는 도면이다. 1 - 마커 DNA; 2 - 항인체 CK 항체에 대한 선발 후 PCR 증폭; 3 - 항V5 펩타이드 항체에 대한 선발 후 PCR 증폭.

도 6은 항V5 항체 결합 클론의 특이성을 도시한 것이다. 항V5 항체에 특이적 결합을 나타내는 7가지 클론(1-7)의 ELISA 선별은 450nm에서 판독한다. 4그룹의 막 대는 좌측에서 우측으로 다음에 대해 선별된 클론의 ELISA 시그널을 나타낸다: 항인체 카파 영역 항체, 항V5 항체, BSA 및 블랭크. 또한, CK 및 V5를 모두 발현하지 않는 음성 대조군은 (8)에 제시했다.

도 7은 실시예 4에서 비.글로비지(B.globigii) 포자에 대하여 5회 선발한 후 회수한 펩타이드들의 배양 상청액 ELISA OD 450nm 시그널을 도시한 것이다. A = 클론 1e; B = 클론 1f; C = 클론 1g; D = 클론 8a; E = 클론 10c; F = 클론 10e; G = 음성 대조군.

도 8은 실시예 5에서 항V5 항체에 대하여 4회 선발한 후 분리한 펩타이드들의 OD 450nm 시그널을 도시한 것이다. A = P1C12; B = P2H1; C = P1B5; D = P2B8. 펩타이드-파지는 항V5 펩타이드 항체 및 항ACTH 펩타이드 항체에 대해 시험했다.

도 9는 오브알부민에 대하여 4회 선발한 후 분리된 합성 펩타이드의 OD 450nm 시그널을 도시한 것이다. A = C1; B = C4; C = C6; D = C8; E = 음성 대조군. 펩타이드는 오브알부민, 항V5 항체 및 차단된 평판(플라스틱)에 대하여 시험했다.

도 10은 BSA 또는 BSA-메코프롭(mecoprop)에 대해 선발한 후의 scFv DNA의 PCR 회수물을 도시한 것이다. A = BSA, 2.5mM ox-글루타치온에서 선발된 항-메코프롭 scFv. B = 메코프롭-BSA, 2.5mM ox-글루타치온에 대해 선발된 항-메코프롭 scFv. C = ox-글루타치온 무첨가 하에 BSA에 대해 선발된 항-메코프롭 scFv. D = ox-글루타치온 무첨가하에 메소프롭-BSA에 대해 선발된 항-메코프롭 scFv.

서열에 대한 간단한 설명

서열 1 내지 11, 19 내지 23, 26 내지 35 및 45 내지 47은 실시예에서 사용된 프라이머를 나타낸 것이다.

서열 12는 TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI 작제물의 서열을 나타낸 것이고, 서열 13은 TAC-MYC-V5-REPA-CIS-ORI 작제물의 서열을 나타낸 것이다. 서열 24는 TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408 작제물의 서열을 나타내고 서열 25는 TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408 작제물의 서열을 나타낸 것이다.

서열 14는 에스트로겐 수용체 표적 인식 서열을 나타낸 것이다.

서열 15 및 16은 incFII 비화합성 그룹의 R1 플라스미드에서 유래되는 repA 유전자의 DNA 서열 및 아미노산 서열을 나타낸 것이다. 서열 17 및 18은 동일 시스템 유래의 CIS DNA 인자의 서열과 ori 서열을 나타낸 것이다.

서열 36 내지 39는 실시예 5에서 선발된 후 분리된 펩타이드 서열을 나타낸 것이다. 서열 39 내지 43은 실시예 6에서 분리된 클론의 서열을 나타낸 것이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 목적 펩타이드를 시험관내에서 암호화하는 뉴클레오타이드 서열의 라이브러리를 작제 및 선별하는 방법에 관한 것이다. 목적 펩타이드를 암호화하는 작제물은 발현된 펩타이드가 이 작제물의 시스 활성을 나타내도록 설계했다. 시스 활성이란, 펩타이드를 생성하는, 즉 전사 및 해독되는 DNA에 펩타이드가 결합하는 성질을 의미한다. 따라서, 작제물을 시험관내 발현시키면 펩타이드가 자신의 펩타이드 분자를 암호하는 DNA에 비공유 상호작용을 통해 결합하게 된다. 따라서, 본 발명은 WO98/37186의 교시인, 단백질과 이를 암호하는 DNA 사이의 시험관내 비공유 상호작용의 가능성을 허용하지 않고, 구체적으로 라이브러리 선별에 실제 사용될 때 상기의 상호작용을 사실상 배제하는 발명과는 상이하다.

비공유결합은 적당한 용매의 첨가, 이온 조건의 변화, 예컨대 낮은 pH의 글리신 첨가 또는 높은 pH의 트리에틸아민 첨가 등과 같은 당업자에게 공지된 방법을 통해 붕괴될 수 있는 결합을 의미한다. 본 발명의 경우에 비공유 결합의 일반적인 예는 DNA 결합 단백질과 DNA 분자 사이의 비공유 상호작용일 수 있다. 이와 반대로 DNA와 암호화된 폴리펩타이드 사이에 공유 결합이 형성되면 발현된 펩타이드 또는 단백질은 비공유 DNA 결합 단백질:DNA 상호작용을 붕괴시키는 이온 조건 및 용매로 인해 DNA로부터 해리되지 못할 것이다. 예를 들어, 박테리아 복제 단백질 repA는 이의 표적 DNA 서열, oriR에 비공유 결합하고 0.2M KCl 보다 높은 염 농도에서 상기 표적 DNA 서열로부터 방출될 수 있다(Giraldo R. & Diaz R., 1992 J.Mol.Biol. 228: 787-802). 이러한 염 농도는, 공유 결합된 단백질을 해리시키기 위해 회수된 DNA의 손상 위험성을 증가시킬 수 있는 보다 가혹한 조건을 필요로 하는 공유 결합에는 영향을 미치지 않을 것이다.

본 발명은 최종 단백질 DNA 복합체 혼합물로부터 각 펩타이드와 이에 결합된 목적 활성을 가진 상기 펩타이드를 암호화하는 DNA가 분리될 수 있기에 충분한 반감기 하에 DNA 작제물과 암호화된 펩타이드 또는 단백질을 결합된 상태로 유지시키는 비공유 결합 및 시스 활성에 관한 것이다. 예를 들어, 암호화된 단백질과 이의 DNA 사이의 결합은 반감기가 최고 30분, 최고 45분, 최고 1시간, 최고 2시간, 최고 6시간 또는 최고 12시간일 수 있다. 따라서, 본 발명의 선별 방법은 라이브러리 작제 직후에 수행되거나 또는 나중에, 예를 들어 최고 1시간 후, 최고 2시간 후, 최고 6시간 후, 최고 12시간 후 또는 최고 24시간 후 또는 24시간 보다 훨씬 이후에도 수행될 수 있다.

놀랍게도 본 명세서에 기술된 본 발명은 이와 같이 암호화된 펩타이드 또는 단백질이 시험관내에서 발현되어 다른 DNA 서열 존재하에서도 자신의 펩타이드를 암호화하는 DNA에 결합될 수 있음을 입증한다. 또한, 본 발명은 이러한 시스 활성을 유지하는데 있어서 단백질과 DNA 사이의 공유 결합이 필요하지 않으며 DNA와 결합 단백질 사이의 비공유 상호작용이면 시험관내 발현 및 선발 시스템에서 펩타이드를 선발하는데 충분하다는 것을 입증한다.

본 발명에 따르면, 펩타이드 발현 라이브러리에서 발현될 펩타이드(라이브러리 멤버 펩타이드)를 각각 암호하는 각 DNA 라이브러리 멤버가 적당한 DNA 작제물에 배치된다. 이와 같이 DNA 라이브러리 멤버가 배치된 DNA 작제물에는 이 작제물로부터 라이브러리 멤버 펩타이드를 발현시키고 이러한 작제물에 의해 암호화된 펩타이드를 자신을 암호화하는 DNA 작제물에 결합시키는데 필요한 모든 서열을 포함한다. 라이브러리에 포함된 각 펩타이드는 일반적으로 융합 단백질을 관련 DNA 작제물에 결합시키는데 관여하는 펩타이드에 라이브러리 멤버 펩타이드를 융합시킨 융합 단백질을 포함할 것이다. 이러한 융합 단백질은 추가 서열을 포함할 수 있고, 상기 라이브러리 펩타이드는 링커 서열을 통해 상기 결합 펩타이드에 결합될 수 있다.

이러한 복수의 여러 라이브러리 멤버 펩타이드를 암호하는 복수의 전술한 작제물이 본 발명의 DNA 라이브러리를 형성한다. 이러한 DNA 분자의 라이브러리를 발현시키면, 라이브러리의 다른 멤버를 암호화하는 다수의 다른 DNA 분자의 존재하에서 각각 암호화된 단백질이, 암호화되어 전사 및 발현되는 DNA에 비공유 결합하게 된다. 따라서, 특이적으로 암호화된 단백질에 존재하는 펩타이드 라이브러리 멤버를 암호하는 서열은 상기 단백질에 결합된 DNA에 존재할 것이다. 이러한 과정은 라이브러리 멤버 펩타이드가 생물학적 활성 형태(일반적으로 결합 활성을 보유함)로 상기 펩타이드를 암호하는 특이적 라이브러리 멤버 DNA 서열에 결합되게 하여, 예컨대 이러한 특이적 결합 활성으로 인해 목적 펩타이드를 선발하고 이어서 이러한 라이브러리 멤버 펩타이드를 암호하는 DNA를 분리 및 확인할 수 있게 한다.

본 발명의 목적상, DNA 라이브러리는 DNA 작제물 집단인 것이다. 각 작제물에는 라이브러리 멤버 펩타이드로서 발현될 펩타이드를 암호하는 DNA 서열이 포함되며, 또한 적당한 프로모터와 해독 개시 및 종결 시그널이 포함된다. 본 발명의 DNA 라이브러리는 이러한 DNA 분자를 복수개 함유할 수 있다. 복수의 DNA 작제물은 각각 라이브러리 멤버 펩타이드를 암호하여 복수의 상이한 라이브러리 멤버를 제공한다. DNA 라이브러리는 10⁴ 이상의 상이한 DNA 분자를 함유하는 것이 바람직하다. 예를 들어, DNA 라이브러리는 10⁶ 이상, 10⁸ 이상, 10¹⁰ 이상, 10¹² 이상, 또는 10¹⁴ 이상의 상이한 DNA 분자를 함유할 수 있다.

펩타이드 발현 라이브러리란, DNA 분자 라이브러리로부터 발현된 펩타이드 서열의 집단을 의미한다. 따라서, 본 발명의 펩타이드 발현 라이브러리에는 자신을 암호하는 DNA에 비공유 결합된 펩타이드의 라이브러리가 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 펩타이드 발현 라이브러리에는 DNA 분자 라이브러리에서 발현된 라이브러리 펩타이드 서열을 각각 포함하는 10⁴ 이상의 상이한 단백질의 라이브러리일 수 있다. 본 발명의 펩타이드 발현 라이브러리는 본 발명의 DNA 라이브러리의 발현에 의해 형성되는 임의의 라이브러리일 수 있다.

펩타이드 라이브러리 멤버란, 길이가 2 이상인 아미노산으로 이루어진 가변적인 조성의 아미노산 사슬이나, 또는 효소, 결합분자, 예컨대 수용체 또는 항체 또는 이의 단편과 같은 자연발생 단백질의 일부 또는 전부를 의미할 수 있다. 적당한 펩타이드 라이브러리 멤버는 랜덤한 아미노산 조성의 펩타이드일 수 있다. 이러한 가변적이거나 랜덤한 조성의 펩타이드는 구조를 억제시키기 위해 N-말단 및/또는 C-말단에 공지의 아미노산 서열을 인접시킬 수 있다. 이러한 공지의 서열은 다양한 길이를 가질 수 있다. 가변적 또는 랜덤 조성의 펩타이드는 공지 단백질 스캐폴드, 예컨대 수용체, 항체 또는 다른 단백질이나 이의 단편 중에서 다양한 위치에 삽입될 수 있다. 또한, 펩타이드는 동일한 단백질 스캐폴드에 1회 또는 1회 이상으로, 예컨대 2회 이상 삽입될 수도 있다.

본 발명에 따른 DNA 작제물은 라이브러리 멤버 펩타이드를 암호하는 DNA 및 암호화된 펩타이드를 암호성 DNA 작제물에 결합시키는 수단을 포함할 수 있다. 라이브러리 멤버 펩타이드를 암호하는 DNA 외에도 본 발명의 적당한 DNA 작제물은 최 소한 DNA 표적 서열과 이러한 DNA 표적 서열에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있는 펩타이드를 암호하는 DNA를 포함한다.

본 발명에 따르면, DNA 작제물 및 암호화된 단백질은 시스 활성이 있는 것으로 선택된다. 즉, 암호화된 단백질은 이를 암호한 DNA 분자에 특이적으로 결합하는 성질이 있다. 예를 들어, 시스 활성은 암호화된 DNA 결합 펩타이드가 다른 DNA 작제물의 표적 서열이 아닌 자신을 암호하는 DNA 작제물의 표적 서열에 특이적(직접 또는 간접적)으로 결합되게 작용할 수 있다.

몇몇 경우에 시스 활성은 시스 활성을 유도하는, 즉 DNA 작제물에 의해 암호화된 단백질이 시스 활성을 갖도록 하여 자신의 암호 서열에 결합되게 하는 DNA 인자의 존재로 인해 제공될 수 있다. 다른 몇몇 경우에서는, 별도의 DNA 인자 자체를 필요로 함이 없이, 암호성 DNA의 성질이 본래 암호화된 펩타이드에 시스 활성을 부여하는 것일 수도 있다.

시스 활성을 유도하는 DNA 인자는 이러한 시스 인자와 상호작용하는 펩타이드를 암호하는 DNA와 함께 DNA 작제물에 제공될 수 있다. 예를 들어, 앞으로 논의될 repA 시스템 유래의 시스 인자의 경우에, 이 시스 DNA 인자와 함께 repA의 C 말단 유래의 20개 이상의 아미노산을 함유하는 repA 서열의 단편을 암호하는 DNA가 제공될 수 있다. 또한, 일반적으로 시스 작용성이 아닌 DNA 결합 펩타이드에 시스 활성을 부여하는 것도 가능한데, 이것은 DNA 작제물에 상기 DNA 인자와 시스 작용에 필요한 임의의 추가 서열을 포함시킴으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, 사용된 시스 인자와 상호작용하는 펩타이드를 암호하는 DNA를 DNA 작제물에 포함시킬 수 있다.

또는, 시스 인자와 상호작용하는 펩타이드가 DNA 결합 펩타이드의 일부일 수 있다. 예를 들어, DNA 결합 펩타이드는 repA 시스 인자와 상호작용하는 서열을 포함하는 repA일 수 있다. 또는, DNA 결합 펩타이드가 별도의 시스 인자를 필요로 함이 없이 자신을 암호하는 DNA에 시스 결합할 수 있다.

적당한 DNA 인자는 시스 활성을 허용하거나 유도하는 모든 인자일 수 있다. 이러한 DNA 인자는 예를 들어 DNA 작제물의 해독과 전사에 관여하는 기구류와 상호작용을 통해 암호화된 펩타이드의 생성과 해리를 지연시킴으로써 작용할 수 있다.

암호화된 펩타이드가 자신을 암호하는 DNA 분자에 특이적으로 결합하게 하는 모든 DNA 인자는 본 발명에 따른 DNA 인자로서 사용될 수 있다. 적당한 DNA 인자의 일 예는 이하에 보다 상세하게 설명되는 repA-cis 시스템의 DNA 인자이다. 이 시스템에서, RNA 폴리머라제는 rho 의존적 전사 종결 이전에 5' cis 서열의 루프에 의해 중지된다. 이러한 DNA 인자의 작용을 통해, 암호화된 결합 펩타이드는 이를 생성하는 작제물 중의 DNA 표적 서열에 결합하게 된다.

cis DNA 인자는 DNA 작제물 중에서 라이브러리 멤버 펩타이드 및 DNA 표적 서열에 결합할 수 있는 펩타이드 또는 단백질에 대해 3'측에 위치하는 것이 바람직할 것이다. 이는, RNA 폴리머라제가 시스 작용 서열에 도달하기 전에 상기 표적 서열이 전사, 해독될 수 있음을 의미한다.

본 발명에 따르면, 결합 펩타이드는 DNA 작제물에 직접 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 직접 결합되는 경우에 결합 펩타이드는 DNA 표적 서열에 직접 비공 유 결합된다. 간접 결합되는 경우에, 결합 펩타이드와 DNA 작제물 사이에는 추가 분자가 제공된다. 이러한 분자, 예를 들어 후술되는 이작용기제는 펩타이드 및 DNA 표적 서열 모두와 결합될 것이다.

적당한 DNA 작제물은 추가 서열, 예컨대 암호화된 펩타이드의 발현을 허용하는 적당한 프로모터 서열을 포함할 수 있다.

시스 활성이 존재하는 시스템의 일 예는 repA로 불리는 시스 작용성 비화합성 그룹 플라스미드 복제 단백질 시스템이다. 이러한 시스템의 양태들은 하기 기술되는 바와 같이 본 발명에 이용될 수 있다.

repA를 암호하는 서열과 시스 DNA 인자를 포함하는 플라스미드에는 다수의 종류가 있다. 본 발명의 DNA 작제물에 존재하는 repA 서열과 시스 DNA 인자는 동일한 플라스미드 종에서 유래하거나 상이한 플라스미드 종에서 유래하는 것일 수 있다.

repA-cis 시스템은 도 1에 도시한 바와 같이 작용하는 것으로 생각된다. 간략히 설명하면, RNA 폴리머라제는 rho 의존적 전사 종결 이전에 5'-CIS 서열의 루프에 의해 중지된다. 이로써, C-말단 repA 펩타이드는 CIS와 일시적으로 상호작용하게 되고 DNA 굽힘이 일어날 수 있다. 그 다음, repA 펩타이드는 repA 암호 서열의 말단 아미노산에서 소정 거리만큼 떨어져 있는 ori에 결합한다(Prazkier et al. 2000 J. Bacteriology 182: 3972-3980 ; Praszkier and Pittard 1999 J. Bacteriol. 181 : 2765-2772; Masai and Arai. 1988 Nucleic Acids Res. 16: 6493-6514).

한 플라스미드 유래의 RepA 서열과 다른 플라스미드 유래의 cis 서열과의 화합성은 선발된 시스 서열과 RepA의 상호작용을 측정하여 쉽게 확인할 수 있다.

적당한 repA 단백질 및 서열과 시스 DNA 인자에는 IncI 복합 플라스미드 유래 것이나, IncF, IncB, IncK, IncZ 및 IncL/M 플라스미드의 것이 포함되는데, 이들은 DNA 레벨에서 관련성이 적지만, 시스 작용성 repA 단백질의 작용을 통해 플라스미드 복제를 조절한다(Nikoletti et al. 1986 J. Bacteriol. 170: 1311- 1318 ; Prazkier J. et al. 1991 J. Bacteriol. 173: 2393-2397). 이러한 서열을 제공하는데 사용될 수 있는 플라스미드의 구체예에는 IncII 비화합성 그룹의 R1 플라스미드 및 incB 플라스미드 pMU720이 포함된다(Praskier J. & Pittard J. 1999 Role of CIS in replication of an IncB plasmid. J. Bacteriol. 181: 2765- 2772). IncII의 R1 플라스미드에서 유래되는 repA의 DNA 서열 및 아미노산 서열은 서열 15와 16에 제시하였다. IncII의 R1 플라스미드에서 유래되는 시스 DNA 인자의 DNA 서열은 서열 17에 제시하였다. 일반적으로, 시스 인자는 길이가 150 내지 200개인 뉴클레오타이드이다. 이보다 짧거나 긴 서열은 이 서열이 RepA와 상호작용하는 성질을 유지하고 시스 활성을 나타내기만 한다면 사용할 수 있다. 이러한 시스 서열내의 치환이나 결실과 같은 변화가 소수인, 예컨대 야생형 시스 서열내의 1개, 5개, 10개 또는 20개 이하의 뉴클레오타이드가 변화된 서열도 사용할 수 있다.

시스 인자는 repA 단백질의 시스 활성에 필요한 인자이다(Praszkier and Pittard 1999 J.Bacteriol, 181: 2765-2772). 또한, 시스 DNA 인자는 DNA 작제물 내에서 repA 서열을 암호하는 DNA에 대해 3' 측에 위치해야 한다. 시스 서열에 도 달하면, RNA 폴리머라제는 중지되고 암호화된 단백질은 DNA 표적 서열에 결합될 것이다.

본 발명의 일 구체예에서, DNA 결합 단백질 자체는 DNA에 결합할 수 있는 RepA 또는 이의 단편이나 변형체를 포함하는 것으로서, 그 예로는 시스 DNA 인자에 결합할 수 있는 RepA의 20개 이상의 C-말단 아미노산이 있다. 일 구체예에서, DNA 표적 서열에는 ori 서열, 예컨대 oriR 서열이 포함된다. 본 발명의 다른 양태에서, DNA 결합 단백질은 이러한 결합 단백질에 의해 인식되는 관련 DNA 표적 서열이 서열 중에 포함되어 있는 다른 단백질에 의해 제공되기도 한다. 이러한 각 구체예에서, DNA-단백질 결합은 DNA 작제물에 의해 암호화된 펩타이드가 암호성 DNA 작제물에 직접 결합한다는 점에서 직접 결합이다. 이하에 보다 상세히 설명되는 또 다른 본 발명의 양태에서, 펩타이드 태그-DNA 태그, 이작용기제 및/또는 적당한 링커의 사용을 통해 DNA-단백질 결합이 간접 결합일 수도 있다.

따라서, 일 양태로서 동일 서열을 이용하여 DNA 표적 서열과 repA의 C 말단 아미노산에 결합할 수 있는 펩타이드를 제공할 수 있다. 이러한 서열은 사용된 DNA 표적 서열에 결합하는 성질을 보유하는 완전한 repA 서열이거나 이의 단편이나 변형체이거나 이러한 서열을 포함하는 것일 수 있다. repA가 DNA 결합 단백질로 작용하는 경우에는 시스 활성(cis)과 DNA 결합(ori)을 위해 cis와 ori 서열(Praszkier and Pittard 1999 J. Bacteriol. 181 : 2765-2772)이 요구된다. 따라서, 이러한 양태에서 DNA 표적 서열은 ori 서열이고 이러한 표적 서열에 결합할 수 있는 펩타이드 또는 단백질은 repA 단백질이다. 본 발명의 DNA 작제물에 포함되는 ori의 위치 는 다양할 수 있다. 전술한 바와 같이 적당한 repA, cis 및 ori 서열은 1 이상의 플라스미드에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, IncI 복합 플라스미드 또는 IncF, IncB, IncK, IncZ 및 IncL/M 플라스미드로부터 적당한 서열이 제공될 수 있다. IncII의 R1 플라스미드 유래의 ori의 DNA 서열은 서열 18에 제시하였다. 이 서열 또는 이의 단편은 본 발명의 DNA 작제물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 DNA 작제물은 완전한 ori 서열을 포함하거나 사용되는 repA 단백질이 결합될 수 있는 이의 단편을 포함할 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 RepA 단백질에는 또한 RepA의 단편이나 변형체가 포함될 수 있는데, 단 이러한 RepA 변형체 또는 단편은 선발된 ori 서열에 결합하는 성질을 유지해야만 한다. 이러한 RepA 변형체 또는 단편은 ori 서열에 결합하는 성질을 유지하기만 한다면 RepA 서열 내에, 예를 들어 1개, 2개, 3개, 최고 20개 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. RepA의 적당한 단편은 RepA의 ori 결합 서열이다. ori 서열에는 전술한 야생형 플라스미드에 존재하는 ori 서열이 포함된다. 이러한 ori 서열은 일반적으로 길이가 170 내지 220개인 뉴클레오타이드이다. 야생형 ori 서열의 단편 및 변형체도 이러한 ori 서열이 RepA에 의해 인식되는 성질을 유지하기만 한다면 사용될 수 있다. 또한, RepA 단백질계의 cis 작용성 멤버도 사용될 수 있다. 예를 들어, RepA 계의 단백질은 숙주 범위가 광범위한 플라스미드에서 찾을 수 있는데, 즉 하나의 RepA 플라스미드를 다양한 박테리아 종에서 확인할 수 있다. 예를 들어, 고온성, 친유성(sulfophilic), 호염성 또는 호산성 박테리아로부터 분리되는 repA 계 플라스미드는 승온이나 극한 염, pH 또는 황 농도에서 본 발 명에 따라 사용될 수 있는 repA-cis-ori DNA를 제공할 수 있다. 이러한 RepA 계의 멤버들은 이러한 극한 조건하에서 표적 분자에 결합할 수 있는 라이브러리 멤버를 분리하는데 유리할 것이다. 선발된 RepA 단백질과 함께 사용하기에 적당한 ori 서열은 이러한 ori 서열과 RepA의 상호작용을 측정하여 쉽게 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 기본 원리는 이하 도 1에 도시한 바와 같은 repA/cis/ori 시스템을 참조로 하여 설명될 것이다. 이것은 본 발명에 따른 DNA 작제물의 일 예이다. 이러한 작제물은 5'에서부터 3' 방향으로, 프로모터 서열, 라이브러리 멤버 펩타이드를 암호하는 서열, repA 단백질을 암호하는 서열, cis DNA 인자 및 ori 서열을 포함한다. 간략히 설명하면, DNA 서열은 RNA 폴리머라제에 의해 프로모터에서부터 RNA로 전사된다. cis DNA 인자에 존재하는 rho 의존적 종결 기능은 RNA 폴리머라제가 이 서열 부분에서 중지되게 한다. 이로써 repA 단백질과 라이브러리 펩타이드가 해독되게 된다. 그 다음, repA 단백질은 ori 서열에 결합할 수 있어서, 암호화된 단백질이 암호성 DNA 작제물에 결합하게 된다.

바람직한 일 구체예에서, 라이브러리 멤버 DNA 서열은 IncFII 플라스미드 R1의 repA, cis 및 ori DNA에 융합된다(Masai H et al. 1983 Proc Natl Acad Sci USA 80: 6814-6818). 일 구체예에서, 목적한 라이브러리 멤버 DNA 서열(들)은 융통성있는 아미노산 링커를 암호하는 DNA 영역을 통해, 시험관내 전사/해독에 적당한 프로모터 및 해독 서열의 조절하에서 repA DNA의 5'말단에 결합될 수 있다. 적당한 프로모터로서 다수가 공지되어 있는데, 그 예로서 특히 araB, tac 프로모터, T7, T3 또는 SP6 프로모터가 있다. 이러한 프로모터는 발현될 폴리펩타이드 서열의 상류에 존재해야 한다.

repA 계의 단백질은 본 발명에서 제한이 아닌 예시 목적으로 사용된 것이다. 또 다른 무관한 비공유 결합성의 시스 작용성 DNA 결합 단백질도 본 발명에 사용될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 시스작용성이 아닌 DNA 결합 단백질은 시스 활성을 갖도록 변환될 수 있다(도 2 참조). 이러한 변환은 DNA 표적 서열에 직접 또는 간접적으로 결합할 수 있는 상기 단백질을, 여기에 시스 활성을 부여할 수 있는 서열과 함께 사용함으로써 달성될 수 있다. 시스 활성은 DNA 작제물에 시스 활성을 유도하는 DNA 인자, 예컨대 repA 계의 시스 인자를 첨가함으로써, 일반적으로 시스로 작용하지 않는 결합 단백질에 부여될 수 있다. 이러한 인자는 DNA 결합 단백질에 의한 DNA 결합이 시스 작용성이도록, 즉 암호화된 DNA 결합 단백질이 이를 전사 및 해독하는 DNA 작제물에 확실하게 결합될 수 있도록 하기 위해 첨가될 수도 있다.

따라서, 일 구체예에서 적당한 DNA 작제물은 repA 계 유래의 cis 활성을 유도하는 DNA 인자(시스 DNA 인자)를 포함할 수 있다. 이러한 인자는 추가로 RepA의 C-말단 단부 일부, 바람직하게는 repA의 C-말단 부 유래의 아미노산 20개 이상, 보다 바람직하게는 아미노산 30개, 최고 40개, 50개, 60개 또는 70개를 암호하는 DNA를 포함할 수 있는데, 이러한 repA 단편은 작제물 내의 DNA 인자와 상호작용할 수 있는 것이다. 또 다른 예로서, 특히 시스작용성 트란스포사제(transposase), Tn5 및 IS903과 같은 단백질도 본 발명에 따라 사용될 수 있다(McFall E. J Bacteriol. 1986 Aug 167: 429-432; Derbyshire KM & Grindley ND. Mol Microbiol. 1996 Sep 1: 1261-72.). 본 발명의 DNA 암호 서열은 RepA의 목적 단편을 암호하는 야생형 서열, 야생형 RepA의 단편을 암호하는 축퇴성 서열 또는 DNA 작제물에 포함되는 시스 인자와 상호작용하는 성질을 유지하면서 상기 RepA 단편의 변형체를 암호하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 변형체는 RepA의 20개 아미노산 C-말단 내에 1개, 2개, 3개 또는 4개 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.

repA 계의 단백질은 본 발명에서 한정이 아닌 예시 목적으로 사용된 것이다. 본 발명에는 시스 작용성이 아닌 단백질에 시스 활성을 부여할 수 있는 모든 DNA 인자를 사용할 수 있다.

시스 작용성이 아닌 모든 단백질은 이러한 방식으로 변환될 수 있다. 예를 들어, 에스트로겐 수용체 DNA 결합 도메인(DBD)은 시스 작용성 DNA 결합 단백질로 변환될 수 있다. 에스트로겐 수용체 DNA 결합 도메인 단편(아미노산 176-282)을 이.콜리에서 발현시키면 모분자와 유사한 친화성(0.5nM)으로 특이적 이본쇄 DNA 에스트로겐 수용체 표적 HRE 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 것으로 밝혀진 바 있다(Murdoch et al. 1990, Biochemistry 29: 8377-8385 ; Mader et al. , 1993, DNAs Research 21: 1125- 1132). 일 구체예에서, 이러한 서열을 암호하는 DNA는 바람직하게는 3'-말단에서 repA의 적어도 마지막 20개 아미노산을 암호하는 DNA, 시스 DNA 인자, 및 ori 서열 이하의 DNA, 그 다음 repA ori 인식 서열 대신 치환된 에스트로겐 수용체 표적 인식 서열(5'-TCAGG TCAGA GTGAC CTGAG CTAAA ATAAC ACATT CAG-3', 서열 14)에 융합시킨다. 그 다음, 융통성이 있는 아미노산 링커를 암호하는 DNA 영역을 통해 목적 DNA 서열을, 시험관내 전사/해독에 적당한 프로모터 및 해독 서열의 조절하에서 에스트로겐 수용체 DNA 단편의 5'-말단에 결합시킬 수 있다. 이러한 폴리펩타이드가 발현되면 정상적인 ori 서열 위치에 존재하는, 상기 폴리펩타이드를 암호하는 DNA 상의 표적 서열로 에스트로겐 수용체 DBD가 유도된다. 그 다음, 표적 단백질 상의 단백질-DNA 복합체를 포획을 통해 분리할 수 있다. 결합되지 않은 단백질-DNA 복합체는 세척 제거하여 목적 펩타이드 또는 단백질을 암호하는 DNA를 농축시키고, 그 다음 PCR로 회수한 뒤 종래 기술된 방법을 이용하여 시험관내 발현과 단백질-DNA 복합체 포획을 수회 더 수행하여 더욱 농축시킬 수 있다.

이러한 방법은 단지 시스 DNA 인자와 repA의 최소한 C-말단 20개 아미노산을 암호하는 서열 또는 다른 시스 작용 시스템 유래의 동등한 인자를 DNA 작제물에 사용하여 다른 DNA 결합 단백질에도 사용할 수 있음은 자명한 것이다.

다른 구체예로서, 아연 핑거 단백질, 나선-루프-나선 단백질 또는 나선-턴-나선 단백질과 같은 무작위적 DNA 결합 단백질의 라이브러리도 목적하는 표적 서열에 대한 특이적 결합을 통해 선별될 수 있다(도 3 참조). 이 구체예에서 repA의 ori 인식 서열은 목적하는 표적 서열로 치환될 수 있고, repA 암호 서열의 대부분은 무작위적 아연 핑거 단백질의 라이브러리로 치환될 수 있다. 따라서, DNA 결합 단백질은 라이브러리 멤버 펩타이드와 이러한 구체예의 DNA 표적 서열에 결합할 수 있는 단백질로서 작용한다. 각 아연 핑거 단백질을 암호하는 DNA는 5' 말단에 추가로 항체와 같은 다른 포획 단백질에 의해 인식될 수 있는 펩타이드 태그 서열이, 3' 말단에 repA의 최소한 마지막 20개 아미노산을 암호하는 DNA, 시스 DNA 인자 및 ori 서열 이하의 DNA와 이어서 목적하는 표적 서열이 결합될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드가 발현되면 아연 핑거 단백질은 이러한 폴리펩타이드를 암호하는 DNA 상에서 일반적인 ori 서열 대신에 존재하는 목적하는 표적 서열로 유도된다. 표적 서열에 대한 결합은 무작위적 아연 핑거 도메인이 목적하는 서열에 결합할 수 있는 경우에만 일어날 것이다. 이러한 단백질-DNA 복합체는 그 다음, 융합 단백질 폴리펩타이드의 N-말단에 있는 펩타이드 태그를 인식하는 결합 단백질에 의한 포획을 통해 분리할 수 있다. 결합되지 않은 DNA는 세척 제거하여 표적 서열에 결합할 수 있는 아연 핑거 단백질을 암호하는 DNA를 농축시킬 수 있고, 그 다음 PCR로 회수한 뒤 시험관내 발현 및 단백질-DNA 복합체 포획을 수회 더 수행하여 더욱 농축시킬 수 있다.

전술한 바와 같이, 결합 펩타이드는 DNA 결합 단백질-표적 서열 쌍에서와 같이 DNA 표적 서열에 직접 결합시키거나 또는 예컨대 이작용기제 및 경우에 따라 DNA 태그를 통해 DNA 표적 서열에 간접적으로 결합시킬 수 있다(도 4 참조).

일 구체예에서, DNA 표적 서열에 직접 결합할 수 없는 펩타이드 태그를 암호하는 DNA는 시험관내 전사/해독에 적당한 프로모터 및 해독 서열의 조절하에, 경우에 따라 융통성이 있는 아미노산 링커를 암호하는 DNA 영역을 통해 목적하는 라이브러리 멤버 DNA 서열의 5'-말단에 결합된다. 이와 같이 결합되면, 암호화된 펩타이드가 DNA 표적 서열에 간접 결합된 경우와 마찬가지로 결합 펩타이드를 암호하는 DNA가 형성된다. 경우에 따라, 라이브러리 멤버 DNA 서열의 3'-말단에는 repA의 최소한 마지막 20개 아미노산을 암호하는 DNA와 시스 DNA 인자를 포함시킬 수 있으 나, repA의 ori 표적 서열은 포함시키지 않는다. 이러한 DNA 표적 서열은 DNA 태그이거나 이러한 태그를 포함할 수 있다. 이러한 DNA 태그는 하나의 변형 염기일 수 있다. 예를 들어, 전술한 인자를 함유하는 라이브러리 DNA 작제물을 제조하는 경우에, DNA의 3'-말단은 플루오레세인 또는 비오틴(이에 국한되지 않음)으로 태그화될 수 있다.

시험관내 발현에 앞서, 라이브러리 DNA 단편은, 한 작용기가 DNA의 5' 말단에 있을 수 있는 표적 서열을 인식하여 결합할 수 있는 이작용기제와, 1:1의 DNA 단편:이작용성 분자의 비율로 혼합될 수 있다. 이러한 이작용기제의 다른 작용성 인자는 DNA 단편의 5'-말단에서 암호화될 수 있는 펩타이드 태그를 인식하여 결합할 수 있는 결합제이다. 이러한 이작용기제는 상기 DNA 상의 플루오레세인 또는 비오틴 태그를 인식하는 Fab 단편과, DNA에서 암호화된 펩타이드 태그를 인식하는 다른 Fab 단편으로 구성될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 당업자라면 이러한 이작용기제가 두 인자를 화학적 가교 결합시키거나, 두 인자를 융합 단백질이나 이중특이성 항체로서 발현시키는 등의 여러 가지 다양한 방법으로 제조할 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 이러한 이작용기제의 제조방법은 한정이 아닌 예시하는 것이다.

이러한 이작용기제는 암호화된 펩타이드가 발현되기 전에 DNA 작제물에 결합되거나 발현되는 동안 제공될 수 있다.

이러한 이작용기제와 결합되면서, DNA 작제물로부터 융합 단백질이 전사 및 해독된다. 펩타이드 태그는 최초로 해독되어, DNA로부터 전령 RNA 또는 RNA 폴리머 라제가 해리되기 이전에 이작용기제의 제2 인자에 결합될 수 있다. 이와 같이 발현된 폴리펩타이드와 이 펩타이드를 암호하는 DNA가 이작용기제를 통해 결합되면 작용성 단백질-DNA 복합체가 형성되게 된다. 따라서, 펩타이드 태그 분자는 DNA 표적(태그)에 간접적이지만 특이적으로 결합된다. 이러한 방식으로 단백질을 DNA 작제물에 결합시키면 하기 기술되는 바와 같이 특정 성질을 가진 단백질을 선별하고, 그 다음 이 단백질에 결합된 암호성 DNA를 확인할 수 있다. 이와 같이 단백질과 DNA 사이에 공유 결합이 아닌 이작용기제를 사용하면, DNA 손상의 위험 없이 단백질로부터 DNA 작제물을 보다 용이하게 분리할 수 있다.

단백질-DNA 복합체는 그 다음 표적 단백질의 포획을 통해 분리할 수 있다. 결합되지 않은 단백질-DNA 복합체는 세척 제거하여 목적 펩타이드 또는 단백질을 암호하는 DNA를 농축시키고, 그 다음 PCR로 회수한 뒤 종래 기술된 방법을 이용하여 시험관내 발현과 단백질-DNA 복합체 포획을 수회 더 수행하여 더욱 농축시킬 수 있다.

또한, 이러한 구체예에서 DNA는 중합체와 같은 이작용기제에, 예를 들어 공유 결합에 의해 직접 결합될 수 있다. 이러한 중합체는 펩타이드 태그를 인식할 수 있는 1 이상의 결합 인자를 함유할 수 있어서, 표현된 펩타이드를 암호하는 DNA를 함유한 단위 내에서 펩타이드 발현 라이브러리 분자를 다수회 디스플레이할 수 있다. 이러한 중합체는 DNA에 융합될 수 있는 폴리에틸렌 뿐만 아니라 다른 중합체 화합물로 구성될 수 있다. 따라서, 본 발명의 DNA 작제물은 이러한 이작용기제에 결합되거나 이러한 이작용기제가 결합할 수 있는 전술한 DNA 태그에 결합되어 제공 될 수 있다.

본 발명의 모든 구체예에서, DNA 작제물에는 시험관내 전사/해독에 적당한 프로모터 및 해독 서열이 포함된다. 적당한 임의의 프로모터로서, araB, tac 프로모터, T7, T3 또는 SP6 프로모터 등이 사용될 수 있다. 이러한 프로모터는 본 발명의 DNA 서열에 작동가능하게 결합되어 본 발명의 서열이 발현될 수 있도록 배치한다.

라이브러리 멤버 펩타이드를 암호하는 DNA는 근본적인 모든 수단을 통해 생성될 수 있다. 구체적으로, 이러한 DNA에는 cDNA로부터 분리된 DNA, DNA 셔플링에 의해 수득된 DNA 및 합성 DNA가 포함될 수 있다.

또한, DNA 작제물은 발현된 융합 단백질 내에서 추가로 아미노산 링커를 암호할 수 있다. 구체적으로, 융통성있는 아미노산 링커가 DNA 결합 펩타이드/RepA를 라이브러리 멤버 펩타이드에 결합시키기 위해 포함될 수 있다.

본 발명에 따르면, 다음과 같은 바람직한 구체예를 참고로 하여 펩타이드 또는 단백질 발현 라이브러리를 이를 암호하는 DNA와 결합된 상태로 수득할 수 있으며, 목적 활성을 가진 펩타이드를 다음과 같은 단계를 통해 선발할 수 있다:

융합 단백질 라이브러리 작제

펩타이드 또는 단백질의 DNA 라이브러리는 융통성있는 아미노산 링커를 암호하는 DNA 영역을 통해, 적당한 프로모터의 조절하에 펩타이드 라이브러리 멤버 및 결합 단백질의 시험관내 발현에 적당한 방식으로 해독, 또는 리보솜 결합 부위, 개시 또는 종결 코돈을 보유하는, DNA 표적 서열에 결합할 수 있는 펩타이드를 암호 하는 DNA, 예컨대 시스 작용성 DNA 결합 단백질 DNA에 융합될 수 있다. repA DNA 단백질인 경우에, DNA(예, DNA) 라이브러리 멤버는 repA DNA 결합 단백질 DNA 또는 이의 단편에 융합된다. cis 서열과 ori 서열은 다른 인자들의 하류에서 작제물에 포함될 수 있다. DNA 라이브러리인 경우에, 상기 DNA 작제물은 시험관내 전사 및 해독에 적당하도록 설계한다.

DNA 라이브러리 융합 단백질의 발현 및 시스 결합

시스 활성을 허용하기 위해 S30 추출물 시스템(Zubay, G. 1973, Ann.Rev.Genet. 7:267)과 같은 커플링된 박테리아 전사/해독 환경을 사용할 수 있다. 이러한 환경에서 DNA 라이브러리 멤버 펩타이드-repA 융합 단백질과 같은 펩타이드이 발현되면, 융합 단백질이 이 융합 단백질을 암호하는 DNA에 결합하게 되고 cis 서열과 ori 서열이 모두 존재하게 된다. 펩타이드-repA 융합 단백질의 라이브러리가 이러한 방식으로 발현되게 되면, DNA에 부착된 단백질이 이를 발현하는 DNA의 단편에 의해 암호화되어, 후속으로 목적 펩타이드 또는 단백질 및 이러한 펩타이드를 암호하는 DNA이 선발될 수 있는, 단백질-DNA 복합체의 라이브러리가 생성되게 된다. 이러한 라이브러리의 복잡성은 이러한 방법을 시험관내에서 수행하므로써 향상될 수 있고, 적어도 10¹⁰ 내지 10¹⁴ DNA 단편의 라이브러리(이보다 더 큰 라이브러리는 안되지만)를 쉽게 생산할 수 있다.

뉴클레아제 활성을 억제하거나 비특이적 DNA-단백질 또는 단백질-단백질 상호작용을 감소시키는 화합물은 이러한 전사/해독 반응 및 시스 반응 동안 첨가될 수 있다. 적당한 화합물의 예에는 세정제 및 소혈청 알부민(BSA)과 같은 차단 단백질이 있다.

목적 펩타이드의 선발

본 발명의 방법에 의해 생성되는 시험관내 펩타이드 발현 라이브러리는 이 라이브러리의 특정 멤버를 선별하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 라이브러리에서 특정 활성이나 특정 결합 친화성을 가진 펩타이드를 선별할 수 있다. 목적 단백질-DNA 복합체는 예를 들어 친화성 또는 활성 농축 기술을 통해 라이브러리에서 선발될 수 있다. 이것은 목적 단백질에 특이적인 리간드, 예를 들어 목적 단백질이 항체인 경우에는 항원 등을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 리간드는 ELISA 평판 웰 표면과 같은 고체 표면에 제공되거나 또는 비오틴화된 리간드 등과 함께 용액 중에 제공된 후, 리간드-리간드 상호작용이 일어나도록 리간드와 단백질-DNA 복합체 라이브러리를 항온처리한 후에 스트렙트아비딘 코팅된 표면이나 자기 비드 상에 포획할 수 있다. 고체상이나 용액에서의 항온처리 후 미결합된 복합체는 세척하여 제거하고 결합된 복합체는 웰 중의 pH 변화 또는 프로테아제 분해와 같은 당업자에게 공지된 다른 방법을 통해 리간드-리간드 상호작용을 붕괴시키거나 또는 repA-ori DNA 결합을 변성시키는 가열이나 페놀-클로로포름 추출을 통해 복합체로부터 DNA를 직접 해리시켜 분리한다. 또한, DNA는 전술한 방법 중 한 방법에 의해 PCR 완충액으로 직접 해리된 뒤 증폭될 수 있다. 또는, DNA는 복합체에서 해리됨이 없이 직접 PCR 증폭될 수도 있다. 경우에 따라 repA 단백질에 대한 결합에만 한정되지 않는 DNA는 예컨대 히스톤과 같은 비특이적 DNA 결합 단백질에 의한 분해로부 터 보호될 수 있다. 이러한 목적에는 다양한 비특이적 DNA 결합 단백질이 사용될 수 있음을 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 또한, 뉴클레아제 활성을 차단하거나 비특이적 DNA-단백질 또는 단백질-단백질 상호작용을 감소시키는 화합물을 선발 과정 동안 제공할 수도 있다. 적당한 화합물의 예에는 세정제, 분유에서 발견되는 것과 같은 차단 단백질 또는 소혈청 알부민(BSA), 헤파린 또는 아우린트리카르복실산이 있다.

결합된 복합체를 회수하고, 결합된 DNA를 재증폭시킨 뒤 선발 절차를 반복하여 목적 서열을 암호하는 클론을 농축시킨 다음, 이를 분리하여 서열분석과, 추가 클로닝 및/또는 발현에 사용할 수 있다. 예를 들어, 목적 펩타이드를 암호하는 DNA는 분리한 뒤, 예컨대 PCR을 통해 증폭시킬 수 있다. 일 구체예에서, 선발과 DNA 회수의 반복 절차는 PCR 프라이머의 연속 네스팅(nesting)을 통해 용이해질 수 있다. DNA 말단은 일반적으로 복수의 PCR 단계 후 손상된다. 이와 같이 손상된 분자로부터 DNA를 회수하기 위하여, DNA 작제물의 말단에서 이격되어 어닐링되는 프라이머가 요구되며, 이에 따라 각 선발 절차 마다 작제물이 짧아지게 된다.

이러한 양태에서, DNA 작제물 및/또는 암호화된 단백질은 태그를 포함하도록 구성될 수 있다. 이러한 펩타이드 또는 DNA 태그(예컨대, 전술한 바와 같은 태그)는 목적 라이브러리 멤버의 분리에 사용될 수 있다. 이러한 태그는 또한 예컨대 본 명세서에 기술된 선별 방법에 사용되는 고체 지지체 상에 라이브러리 멤버를 유지시키는 데에도 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 선별 방법은 관련 라이브러리 멤버 펩타이드를 선발하여 분리하는 추가 단계를 포함하여 목적 성질을 나타내는 펩타이드와 이 펩타이드를 암호하는 DNA를 확인하고 정제할 수 있는 것이라고 볼 수 있다.

따라서, 본 발명은 전술한 본 발명의 방법에 의해 확인된 펩타이드 및 DNA도 포함한다. 이러한 펩타이드와 DNA는 분리 및/또는 정제될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 분리된 펩타이드 또는 DNA는 아미노산이나 뉴클레오타이드의 결실, 첨가 또는 치환 등을 통해 변형될 수 있다. 적당히 변형된 펩타이드 또는 DNA는 본 발명의 방법에 의해 분리된 펩타이드 또는 DNA와 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 동일성이 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상인 것일 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 확인된 펩타이드는 전달 및/또는 안정성 목적에서 변형될 수 있다. 예를 들어, 이러한 펩타이드는 혈청 반감기를 연장시키거나 프로테아제 공격을 차단하기 위해 페질화(pegylate)(폴리에틸렌글리콜에 부착)될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 확인된 펩타이드는 파지 디스플레이와 같은 다른 디스플레이 시스템에서 변형시키거나 또는 펩타이드 변형체 합성 및 선별을 통해 변형될 수 있다. 이와 같이 변형된 서열의 수집물은 본 발명의 작제물에 포함되어, 이후 특정 리간드에 개선된 결합을 나타내는 변형체 서열 등을 찾기 위해 선별될 수 있는 새로운 라이브러리를 구성할 수 있다. 즉, 일 구체예에서 본 발명의 방법에 사용되는 펩타이드 라이브러리는 구조적 관련이 있는 펩타이드의 라이브러리일 수 있다.

또는, 본질적으로 랜덤한 펩타이드 서열의 라이브러리가 사용될 수도 있다. 시스 작용성 DNA 결합 단백질에 융합된 다양한 종류의 펩타이드 라이브러리는 다음 을 포함하는 양태로서 선별될 수 있다:

(i) 가변 길이의 합성 DNA에 의해 암호화된 랜덤 펩타이드 서열.

(ii) 항체 또는 항체 단편, 예컨대 단일쇄 Fv 항체 단편. 이는 단일쇄 항원 결합 분자 형성을 위해 융통성있는 링커 펩타이드를 통해 결합된 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역 도메인으로 이루어진다.

(iii) 목적 활성을 함유하는 세포 집단에서 분리된 자연발생의 단백질의 랜덤 cDNA 단편.

(iv) 공지 단백질에 삽입되거나 공지 단백질 대신 치환되는 랜덤 펩타이드 서열. 여기서 공지 단백질 서열은 스캐폴드로서 작용하여 랜덤 펩타이드 서열을 억제한다. 이러한 스캐폴드의 다수가 개시되어 있는데, 그 예로서 펩타이드 라이브러리의 스캐폴드로서 사용된 바 있는 CTLA-4(WO 00/60070)가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

다른 구체예에서, 본 발명은 리간드 결합에 항체 Fab 단편을 필요로 하는 것처럼 멤버들이 활성에 1 이상의 사슬을 필요로 하는 DNA 라이브러리를 선별하는 방법에 관한 것이다. 이러한 구체예에서, 중쇄 또는 경쇄 항체 DNA는 repA 등의 DNA결합 도메인을 암호하는 뉴클레오타이드 서열에 결합된다. 일반적으로, 중쇄(VH 및 CH1) 또는 경쇄(VL 및 CL) 유전자의 미지의 항체 DNA 라이브러리 서열은 repA DNA의 5' 영역에 적당한 프로모터와 해독 서열 뒤에 삽입한다. 따라서, DNA 라이브러리 멤버-암호화된 단백질에 융합된 repA는 이 단백질을 암호하는 DNA에 결합되어 생성된다. 경쇄 또는 중쇄 단백질을 암호하는 제2의 공지 사슬은 다음으로부터 별 도로 발현시킨다:

(a) repA를 함유하는 동일한 DNA 단편 및 제1 폴리펩타이드 융합 단백질 라이브러리로부터, 또는

(b) 시험관내 전사/해독 반응에 존재하는 DNA의 별도 단편으로부터.

이러한 공지의 사슬을 repA 단백질에 융합된 미지 융합 단백질의 라이브러리와 혼합하여 미지 사실의 DNA에 결합시킨다. 그 다음 항체에 특이적인 리간드를 사용하여 작용성 Fab 라이브러리를 선발할 수 있다.

본 발명의 선별 방법에 의해 확인된 DNA, 예컨대 선발된 라이브러리 멤버 펩타이드를 암호하는 DNA는 벡터에 클로닝할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 확인된 DNA는 숙주 세포가 암호 서열을 발현하도록 제공할 수 있는 조절 서열에 작동가능하게 결합되며, 즉 이 벡터는 발현 벡터인 것이다. 여기서, "작동가능하게 결합된"이란 용어는 기술된 성분이 목적 방식으로 작용하도록 허용하는 관계로 위치되는 병렬 배치를 의미한다. 암호 서열에 "작동가능하게 결합된" 프로모터와 같은 조절 서열은 이 조절 서열에도 허용되는 조건하에서 암호 서열의 발현이 달성되는 방식으로 배치된다. 이러한 발현 벡터는 분자생물학 기술분야에 통상적인 방식으로 작제하며 예를 들어 단백질을 발현시키는데 필요하고 정확한 배향으로 배치된, 플라스미드 DNA, 적당한 개시인자, 프로모터, 인헨서 및 기타 다른 인자, 예컨대 폴리아데닐화 시그널 등의 사용을 포함할 수 있다. 다른 적당한 벡터는 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 이와 관련된 또 다른 예는 문헌[Sambrook et al. 1989]을 참고할 수 있다.

벡터는 복제 오리진, 경우에 따라 상기 DNA 발현을 위한 프로모터 및 경우에 따라 프로모터의 조절인자를 갖고 있기만 한다면 플라스미드, 바이러스 또는 파지 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 1 이상의 선택성 마커 유전자, 예컨대 박테리아 플라스미드인 경우에 앰피실린 내성 유전자 또는 진균 벡터용 내성 유전자 등을 포함할 수 있다. 벡터는 시험관내에서 예컨대 DNA 또는 RNA 생성에 사용되거나 숙주 세포, 예컨대 포유동물 숙주 세포의 형질감염이나 형질전환에 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 생체내에서 사용될 수 있도록, 예컨대 유전자 치료법의 방법을 통해 개조시킬 수도 있다.

프로모터 및 다른 발현 조절 시그널은 발현 설계된 숙주 세포와 화합성인 것으로 선택할 수 있다. 예를 들어, 효모 프로모터에는 S.세레비지에 GAL4 및 ADH 프로모터, S.폼베 nmt1 및 adh 프로모터가 포함된다. 포유동물 프로모터에는 카드뮴과 같은 중금속에 반응하여 유도될 수 있는 메탈로티오네인 프로모터가 있다. SV40 라지 T 항원 프로모터 또는 아데노바이러스 프로모터와 같은 바이러스 프로모터도 사용될 수 있다. 이러한 프로모터는 모두 당해 기술분야에서 쉽게 입수할 수 있다.

β-액틴 프로모터와 같은 포유동물 프로모터도 사용될 수 있다. 조직특이적 프로모터가 특히 바람직하다. 또한, 바이러스 프로모터가 사용될 수 있는데, 그 예로는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스 장말단 반복체(MMLV LTR), 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터, SV40 프로모터, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV) IE 프로모터, 아데노바이러스, HSV 프로모터(예, HSV IE 프로모터) 또는 HPV 프로모터, 특히 HPV 상류 조절 영역(URR)이 포함된다. 이러한 바이러스 프로모터들은 당해 기술분 야에서 쉽게 입수할 수 있다.

벡터는 추가로 목적 폴리뉴클레오타이드에 인접한 서열을 포함하여 진핵세포 게놈 서열, 바람직하게는 포유동물 게놈 서열 또는 바이러스 게놈 서열과 상동성인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공할 수 있다. 이에 따르면, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 상동성 재조합에 의해 진핵 세포 또는 바이러스의 게놈 내로 도입되게 된다. 구체적으로, 발현 카세트가 바이러스 서열에 인접해있는 플라스미드 벡터를 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 포유동물 세포로 전달하기에 적당한 바이러스 벡터를 제조할 수 있다. 적당한 바이러스 벡터의 다른 예에는 헤르페스 단순 바이러스 벡터와 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련 바이러스 및 HPV 바이러스가 있다. 이러한 바이러스를 이용한 유전자 전달 기법은 당해기술분야에 공지되어 있다. 예컨대, 레트로바이러스 벡터는 폴리뉴클레오타이드를 안정하게 통합시켜 숙주 세포 내에 그 폴리뉴클레오타이드를 제공하는데 사용할 수 있다. 이에 반해, 복제 결손형 아데노바이러스 벡터는 에피솜으로 남아있고, 이에 따라 일시적 발현을 일으킬 수 있다.

이러한 발현 벡터는 목적 리간드, 즉 ELISA와 같은 표준 결합 분석, 또는 적당한 기질을 제공하는 효소 분석, 예컨대 색 변화, 광 방출 또는 형광 등을 통해 펩타이드 라이브러리 멤버에 결합하는 분자를 확인하는데 사용할 수 있다. 이용가능하다면 다른 작용 분석도 사용할 수 있다.

대안적 구체예에서, 본 발명의 방법에 의해 확인된 DNA는 비발현 벡터로 클로닝될 수 있다. 이러한 벡터는 추가적으로 DNA를 특성규명하는데, 예컨대 서열분 석하는데 사용할 수 있다.

또는, 목적 리간드는 클로닝 없이 확인할 수도 있다. 여기에 적당한 방법으로는 예컨대 본 발명의 선별 방법으로부터 회수된 각 DNA 서열을 시험관내 발현시키고, 이와 같은 선별 방법으로부터 회수된 각 DNA를 서열분석하는 것을 포함한다. 이와 같은 각 DNA 서열은 경우에 따라 증폭될 수 있다.

또한, 본 발명은 예컨대 전술한 발현 벡터를 세포 중으로 도입시킴으로써, 본 발명의 방법으로 확인된 펩타이드를 발현하도록 변형시킨 세포도 포함한다. 이러한 세포에는 예컨대 바큘로바이러스 발현 시스템을 이용하는 일시적이거나, 또는 바람직하게는 안정된 고등 진핵세포주, 예컨대 포유동물 세포 또는 곤충 세포, 효모와 같은 하등 진핵세포, 또는 박테리아 세포와 같은 원핵세포가 포함된다. 본 발명의 방법으로 확인된 펩타이드를 암호하는 벡터 삽입에 의해 변형될 수 있는 세포의 구체적 예에는 포유동물 HEK293T, CHO, HeLa 및 COS 세포가 있다. 선발된 세포주는 바람직하게는 안정된 것일 뿐만 아니라 성숙 글리코실화 및 펩타이드의 세포 표면 발현을 허용하는 것이다. 발현은 형질전환된 난모세포에서 달성될 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 확인된 펩타이드는 인간을 제외한 돌연변이 동물, 바람직하게는 마우스 세포에서 발현될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법으로 확인된 펩타이드는 아프리카발톱개구리 난모세포 또는 멜라닌색소포에서도 발현될 수 있다.

본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위하여, 이하에 구체예를 첨부되는 도면을 참고로 하여 제한이 아닌 예시를 통해 보다 상세하게 설명할 것이다.

이러한 본 발명의 몇몇 구체예는 다음과 같다:

재료 및 방법

본 발명자들에 의해 사용된 다음과 같은 절차는 전술한 문헌[Sambrook, J., et al., 1989]에 기술되어 있다: 아가로스 겔에 존재하는 제한효소 분해 산물의 분석, 패놀/클로로포름 스톡 용액을 이용한 DNA 정제, 인산염 완충 식염수의 제조.

일반 용도의 시약은 시그마-알드리히 리미티드(Poole, Dorset, U.K.)에서 구입했다. 올리고뉴클레오타이드는 시그마-제노시스 리미티드(Cambridgeshire, U.K.)에서 구입하고, 아미노산 및 S30 추출물은 프로메가 리미티드(Southampton, Hampshire, U.K.)에서 구입했다. 딥 벤트(Deep Vent) 및 Taq DNA 폴리머라제는 뉴잉글랜드 바이오랩스(Cambridgeshire, U.K.)에서 구입했다. Taqplus DNA 폴리머라제는 스트라타진 인크.(Amsterdam, Netherlands)에서 구입했다. 진클린 DNA 겔 정제 키트는 BIO101(La Jolla, California, U.S.A)에서, 항인간 Igκ 항체는 임뮤놀로지컬스 다이렉트 리미티드(Oxfordshire, U.K.)에서, 항-c-myc 폴리클론은 벡터 랩스 인크(Cambridgeshire, U.K.)에서, 항V5 항체는 아브캠 리미티드(Cambridgeshire U.K.)에서, 슈퍼블록 차단체는 퍼비오 사이언스(Cheshire, U.K.)에서 구입했다.

실시예 1. 특이적 시스 작용성 단백질-DNA 복합체의 분리

TAC 프로모터, c-myc 에피토프, 인간 카파 불변부 또는 RepA-CIS-ORI 영역에 대한 V5 에피토프를 차례로 첨가하고 PCR 증폭을 이용하여 시험관내 발현 작제물을 제조했다. 이러한 작제물은 당업자에게 공지된 다수의 방법을 이용하여 제조할 수 있는데, 그 예로는 각 DNA단편을 증폭시킨 뒤 어셈블리 PCR로 조립하는 방법이 있다. 이러한 예에서, 최초의 증폭 주형으로는 RepA-CIS-ORI 영역을 함유하는 R1 플라스미드를 사용했다(Masai, H. and Arai, K.(1988), DNAs Res. 16, 6493-6514).

(a) 1차 증폭: RepA-CIS-ORI 영역은 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 Taqplus Precision DNA 폴리머라제, 1xPCR 반응 완충액(Stratagene Inc, Amsterdam, Netherlands)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 REPAFOR(서열 1) 및 ORIREV(서열 2)를 각각 12.5pmol 사용하여 플라스미드 R1을 함유한 균주 ECO K12의 한 콜로니로부터 PCR 증폭시켰다. REPAFOR 프라이머는 RepA 암호 영역의 5'-말단에 어닐링되고, ORIREV 프라어미는 비암호 ORI 영역의 3'-말단에 어닐링된다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 4분 15초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 45초; 60℃, 45초; 72℃, 45초간을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

(b) 2차 증폭: 이와 같이 겔 정제된 1차 반응 산물의 100배 희석물 1㎕(500pg)를 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 Taqplus Precision DNA 폴리머라제, 1xPCR 반응 완충액(Stratagene Inc, Amsterdam, Netherlands)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 CKREPFOR(서열 3) 및 ORIREV(서열 2)를 각각 12.5pmol 사용하여 재증폭시켰다. 이러한 CKREPFOR 프라이머는 1차 반응 산물의 5'-말단에 어닐링되고, 카 파 불변부 DNA의 3' 부분에 첨부된다. ORIREV 프라이머는 1차 반응 산물의 3'-말단에 어닐링된다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 2분 15초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 45초; 60℃, 45초; 72℃, 2분간을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

(c) 3차 증폭: 이와 같이 겔 정제된 1차 반응 산물의 100배 희석물 1㎕(500pg)를 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 Taqplus Precision DNA 폴리머라제, 1xPCR 반응 완충액(Stratagene Inc, Amsterdam, Netherlands)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 V5REPFOR(서열 4) 및 ORIREV(서열 2)를 각각 12.5pmol 사용하여 재증폭시켰다. 이러한 V5REPFOR 프라이머는 1차 반응 산물의 5'-말단에 어닐링되고, V5 에피토프 DNA의 3' 부분에 첨부된다. ORIREV 프라이머는 1차 반응 산물의 3'-말단에 어닐링된다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 2분 15초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 45초; 60℃, 45초; 72℃, 2분간을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

(d) 4차 증폭: pCKV5 플라스미드의 100배 희석물 1㎕(500pg)를 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 Taqplus Precision DNA 폴리머라제 및 1xPCR 반응 완충액(Stratagene Inc, Amsterdam, Netherlands)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 MYCCKFOR(서열 5) 및 CKREV(서열 6)를 각각 12.5pmol 사용하여 증폭시켰다. 상기 pCKV5 플라스미드는 인간 카파 불변부 cDNA(McGregor DP, Molloy PE, Cunningham C, & Harris WJ. 1994 Mol. Immunol. 31: 219-26) 및 V5 에피토프 DNA(Southern JA, Young DF, Heaney F, Baumgartner WK, Randall RE. 1991 J. Gen. Virol. 72 : 1551-7)를 함유한다. MYCCKFOR 프라이머는 카파 불변부 DNA의 5'-말단에 어닐링되고 MYC 에피토프 DNA의 3' 부분에 첨부된다. CKREV 프라이머는 카파 불변부 DNA의 3'-말단에 어닐링된다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 2분 15초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 45초; 60℃, 45초; 72℃, 2분간을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

(e) 5차 증폭: pCKV5 플라스미드의 100배 희석물 1㎕(500pg)를 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 Taqplus Precision DNA 폴리머라제 및 1xPCR 반응 완충액(Stratagene Inc, Amsterdam, Netherlands)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 MYCV5FOR(서열 7) 및 V5REV(서열 8)를 각각 12.5pmol 사용하여 증폭시켰다. 상기 MYCV5KFOR 프라이머는 V5 에피토프 DNA의 5'-말단에 어닐링되고 MYC 에피토프 DNA의 3' 부분에 첨부된다. V5REV 프라이머는 V5 에피토프 DNA의 3'-말단에 어닐링된다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 2분 15초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 45초; 60℃, 45초; 72℃, 30초간을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

(f) 6차 증폭: pTACP2A 플라스미드(ref)의 100배 희석물 1㎕(500pg)를 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 Taqplus Precision DNA 폴리머라제 및 1xPCR 반응 완충액(Stratagene Inc, Amsterdam, Netherlands)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 TAC3(서열 9) 및 MYCTACREV(서열 10)를 각각 12.5pmol 사용하여 증폭시켰다. 상기 TAC3 프라이머는 TAC 프로모터 DNA의 5'-말단에 어닐링된다. MYCTACREV 프라이머는 TAC 프로모터 DNA의 3'-말단에 어닐링되고 MYC 에피토프 DNA의 5' 부분에 첨부된다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 2분 15초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 45초; 60℃, 45초; 72℃, 30초간을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

(g) 1차 어셈블리 PCR: 단계 (f)와 (d)의 각 반응 산물 1㎕(50ng)를 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 TaqDeep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(20:1) 및 1xPCR 반응 완충액(New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프 라이머 TAC5(서열 11) 및 CKREV(서열 6)를 각각 50pmol 사용하여 증폭시켰다. 상기 TAC5 프라이머는 반응 산물 (f)의 5'-말단에 어닐링되고 20개의 뉴클레오타이드를 첨가한다. CKREV 프라이머는 반응 산물 (d)의 3'-말단에 어닐링된다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 2분 15초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 45초; 60℃, 45초; 72℃, 45초간을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

(h) 2차 어셈블리 PCR: 단계 (f)와 (e)의 각 반응 산물 1㎕(50ng)를 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 TaqDeep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(20:1) 및 1xPCR 반응 완충액(New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 TAC5(서열 11) 및 V5REV(서열 8)를 각각 50pmol 사용하여 증폭시켰다. 상기 TAC5 프라이머는 반응 산물 (f)의 5'-말단에 어닐링되고 20개의 뉴클레오타이드를 첨가한다. V5REV 프라이머는 반응 산물 (e)의 3'-말단에 어닐링된다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 2분 15초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 45초; 60℃, 45초; 72℃, 45초간을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

(i) 3차 어셈블리 PCR: 단계 (b)와 (g)의 각 반응 산물 1㎕(50ng)를 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 TaqDeep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(20:1) 및 1xPCR 반응 완충액(New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 TAC3(서열 9) 및 ORIREV(서열 2)를 각각 50pmol 사용하여 증폭시켰다. 상기 TAC3 프라이머는 반응 산물 (g)의 5'-말단에 20개의 하류 뉴클레오타이드를 어닐링한다. ORIREV 프라이머는 반응 산물 (b)의 3'-말단에 어닐링된다. 이러한 (i)의 반응 산물은 TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI(서열 12)라고 부른다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 2분 15초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 45초; 60℃, 45초; 72℃, 1분간을 30회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

(j) 4차 어셈블리 PCR: 단계 (c)와 (h)의 각 반응 산물 1㎕(50ng)를 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 TaqDeep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(20:1) 및 1xPCR 반응 완충액(New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 TAC3(서열 9) 및 ORIREV(서열 2)를 각각 50pmol 사용하여 증폭시켰다. 상기 TAC3 프라이머는 반응 산물 (h)의 5'-말단에 20개의 하류 뉴클레오타이드를 어닐링한다. ORIREV 프라이머는 반응 산물 (c)의 3'-말단에 어닐링된다. 이러한 (i)의 반응 산물은 TAC-MYC-V5-REPA-CIS-ORI(서열 13)라고 부른다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 2분 15초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 45초; 60℃, 45초; 72℃, 1분간을 30회 반복하고, 마지막으로 72 ℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

시험관내 전사/해독 반응의 준비. 반응물을 얼음위에 준비하고, 다음과 같은 시험관내 전사/해독 반응 키트에 커플링된 프로메가 박테리아 선형 주형 S30을 사용했다:

20㎕ TAC-MYC-CK-REPA-CIS-ORI 주형(최종 DNA 작제물 서열 12 0.5㎍); 20㎕ TAC-MYC-V5-REPA-CIS-ORI 주형(최종 DNA 작제물 서열 13 0.5㎍); 전체 아미노산 혼합물(프로메가) 20㎕; S30 프리믹스 80㎕; S30 믹스 60㎕.

반응은 25℃에서 30분 동안 진행시키고 얼음에 방치한 뒤 차단 완충액(Superblock(Perbio Ltd), 0.1% Tween 20, 200㎍/ml 헤링스펌 DNA)으로 10배 희석했다.

DNA-단백질 복합체 포획: NUNC 스타 임뮤노튜브에, 튜브당 500㎕ PBS 중의 10㎍/ml의 항-c-myc 항체, 항V5 항체 또는 항인간 카파쇄 항체를 4℃에서 하룻밤 동안 코팅시켰다. 추가 튜브는 음성 대조군으로서 블랭크로 남겨두었다. 이 튜브를 2x PBS로 세척하고 Superblock/PBS/0.1mg/ml 헤링스펌 DNA/0.1% Tween20을 이용하여 실온에서 1시간 동안 차단시킨 뒤, 2x PBS로 세척했다. 희석된 전사/해독 반응물 500㎕를 각 튜브에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온배양했다. 튜브를 5x PBS/0.1% Tween 20, 2ml Superblock/PBS/0.1mg/ml 헤링스펌 DNA/0.1% Tween 20(1x 30분), 그 다음 5x PBS로 세척했다. 300㎕ T.E. 완충액 + 300㎕ 페놀/클로로포름으 로 진탕하에 5분 동안 처리하여 DNA를 회수했다. 이 회수물을 13,200g에서 5분 동안 원심분리하고, DNA를 7.5M 아세트산암모늄 0.5부피, 20㎍ 글리코겐 및 무수 에탄올 3 부피량을 이용하여 침전시켰다. 원심분리 후 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 진공건조한 뒤 20㎕물에 재현탁시켰다. 회수한 DNA 10㎕를 TAC3(서열 9) 및 ORIREV(서열 2) 프라이머를 사용하는 50㎕ 반응물 중에서 재증폭시켰다. 반응 산물을 1% 아가로스/TAE 겔에서 전기영동시켰다(도 5).

실시예 2. RepA-DNA 복합체 분리

실시예 1에 기술한 바와 같이 제조한 2가지 시험관내 발현 작제물(서열 12 및 서열 13)을 사용하여 실시예 1에 기술한 바와 같은 항-인간 C-카파 항체에 대하여 선발 실험을 수행하였는데, 단 DNA는 회수하여 다음과 같은 방법 중 하나를 사용하여 RepA로부터 해리시켰다: 글리신, 트리에틸아민, 페놀/클로로포름, 프로테이나제 K 및 EDTA. 이러한 방법은 이하에 설명된다:

글리신: 튜브를 200mM 글리신, 150mM NaCl(pH 2.0)과 10분 동안 항온배양했다. 그 다음, 글리신 용출액을 새 에펜도르프 튜브로 옮기고 2M 트리스(pH 8.5) 50㎕)를 첨가했다.

트리에틸아민: 튜브를 0.1M 트리에틸아민 500㎕와 10분 동안 항온배양하고, 그 다음 트리에틸아민 용출액을 새 에펜도르프 튜브로 옮기고 1M 트리스(pH 7.4) 250㎕를 첨가했다.

페놀/클로로포름 : 상기 실시예 1에 전술한 바와 같다.

프로테이나제 K: 튜브를 100mM 트리스(pH 8.), 10mM EDTA(pH 8.0), 0.5% SES 500㎕와 37℃에서 30분 동안 항온배양했다. 그 다음, 프로테이나제 K 용출액을 새 에펜도르프 튜브로 옮겼다.

EDTA: 튜브를 10mM 트리스(pH 8.0), 1mM EDTA, 500mM NaCl 및 250㎕ 페놀/클로로포름과 5분 동안 항온배양했다. 그 다음, EDTA 용출액을 새 에펜도르프 튜브로 옮겼다.

DNA를 회수한 후, DNA를 적당하다면 페놀/클로로포름으로 추출한 뒤, 실시예 1에 기술된 바와 같이 에탄올 침전시켰다. 재현탁시킨 DNA 10㎕를 TAC3(서열 9)과 CISREV(서열 19) 프라이머를 함유한 50㎕ 반응액에서 재증폭시켰다. CISREV 프라이머는 ORIREV(서열 2)의 결합 부위 196 염기 업스트림을 어닐링시킨다. 반응 산물을 1% 아가로스/TAE 겔에서 전기영동시켰다(데이터는 제시안됨). CK-DNA 함유 작제물(서열 12)만이 대략 동등량으로 증폭되었다.

이와 같은 결과는 RepA로부터 DNA를 회수 및 해리시키는데 전술한 방법을 모두 사용할 수 있을 뿐만 아니라 RepA가 이의 동족 DNA와 비공유 방식으로 상호작용함을 암시한다.

실시예 3. CIS 디스플레이 기법을 이용한 V5 스파이킹 실험에서 특이적 항-V5 결합인자의 검출

시험관내 발현 작제물은 TAC 프로모터 및 RepA-CIS-ORI 영역에 대한 V5 에피토프 또는 12mer NNB 라이브러리를 첨가하여 PCR 증폭을 통해 제조했다. 이와 같은 작제물은 당업자에게 공지된 다수의 방법으로 제조할 수 있는데, 그 예에는 각 DNA 단편을 증폭시킨 뒤 어셈블리 PCR로 조립하는 방법이 있다. 이러한 예에서, 최초의 증폭 주형으로는 RepA-CIS-ORI 영역을 함유하는 R1 플라스미드를 사용했다(Masai, H. and Arai, K.(1988), Nucleic Acids Res. 16, 6493-6514).

(a) 1차 증폭: RepA-CIS-ORI 영역은 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 TaqDeep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(20:1), 1xPCR 반응 완충액(New England Biolabs, Beverley, MA, U.S.A.)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 REPAFOR(서열 1) 및 ORIREV408(서열 20)를 각각 12.5pmol 사용하여 플라스미드 R1을 함유한 균주 ECO K12의 한 콜로니로부터 PCR 증폭시켰다. REPAFOR 프라이머는 RepA 암호 영역의 5'-말단에 어닐링되고, ORIREV 프라이머는 비암호 ORI 영역의 3'-말단 하류에 어닐링된다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 4분 30초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 30초; 60℃, 45초; 72℃, 1분간을 25회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

(b) 2차 증폭: 이와 같이 겔 정제된 1차 반응 산물의 100배 희석물 1㎕(500pg)를 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 TaqDeep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(20:1), 1xPCR 반응 완충액(New England Biolabs, Beverley, MA, U.S.A.)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 V5(NNB)REPFOR(서열 21) 및 ORIREV408(서열 20)를 각각 12.5pmol 사용하여 재증폭시켰다. 이러한 V5(NNB)REPFOR 프라이머는 1차 반응 산물의 5'-말단에 어닐링되고, V5 에피토프 DNA에 첨부된다. ORIREV408 프라이머는 1차 반응 산물의 3'-말단에 어닐링된다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 4분 30초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 30초; 60℃, 45초; 72℃, 1분간을 25회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

(c) 3차 증폭: 겔 정제된 1차 반응 산물의 100배 희석물 1㎕(500pg)를 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 TaqDeep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(20:1), 1xPCR 반응 완충액(New England Biolabs, Beverley, MA, U.S.A.)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 NNBREPFOR(서열 22) 및 ORIREV408(서열 20)을 각각 12.5pmol 사용하여 재증폭시켰다. 이러한 NNVREPFOR 프라이머는 1차 반응 산물의 5'-말단에 어닐링되고, 랜덤 아미노산 12-mer NNB 라이브러리 DNA에 첨부된다. ORIREV408 프라이머는 1차 반응 산물의 3'-말단에 어닐링된다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 4분 30초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 30초; 60℃, 45초; 72℃, 1분간을 25회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

(d) 4차 증폭: pTACP2A 플라스미드(ref)의 100배 희석물 1㎕(500pg)를 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 TaqDeep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(20:1) 및 1xPCR 반 응 완충액(New England Biolabs, Beverley, MA, U.S.A.)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 TACFARUP(서열 23) 및 TACREV(서열 27)를 각각 12.5pmol 사용하여 증폭시켰다. 상기 TACFARUP 프라이머는 TAC 프로모터 DNA의 5'-말단에 어닐링된다. TACREV 프라이머는 TAC 프로모터 DNA의 3'-말단에 어닐링된다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 1분 45초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 15초; 60℃, 30초; 72℃, 30초간을 25회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

(e) 1차 어셈블리 PCR: 단계 (b)와 (d)의 각 반응 산물 1㎕(50ng)를 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 TaqDeep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(20:1) 및 1xPCR 반응 완충액(New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 TACFARUP(서열 23) 및 ORIREV408(서열 20)을 각각 50pmol 사용하여 증폭시켰다. 상기 TACFARUP 프라이머는 반응 산물 (d)의 5'-말단에 어닐링된다. ORIREV480 프라이머는 반응 산물 (d)의 3'-말단에 어닐링된다. 이러한 단계 (e)의 반응 산물은 TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408(서열 24)이라 부른다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 1분 45초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 15초; 60℃, 30초; 72℃, 1분 30초간을 25회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 사용하여 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다.

(h) 2차 어셈블리 PCR: 단계 (c)와 (d)의 각 반응 산물 1㎕(50ng)를 0.25mM dNTP, 2.5 유닛의 TaqDeep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(20:1) 및 1xPCR 반응 완충액(New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서 프라이머 TACFARUP(서열 23) 및 ORIREV408(서열 20)을 각각 50pmol 사용하여 증폭시켰다. 상기 TACFARUP 프라이머는 반응 산물 (d)의 5'-말단에 어닐링된다. ORIREV480 프라이머는 반응 산물 (c)의 3'-말단에 어닐링된다.

PCR 반응은 에펜도르프 매스터 사이클러에서 94℃하에 1분 45초동안 1회 유지시킨 뒤, 94℃, 15초; 60℃, 30초; 72℃, 1분 30초간을 25회 반복하고, 마지막으로 72℃, 10분 동안을 1회 유지시켜 수행했다. 반응 산물을 아가로스 겔에서 전기영동시키고, 절제한 뒤, 진클린 II 키트를 제조자의 지시에 따라(Bio101, La Jolla, California, U.S.A) 사용하여 겔로부터 산물을 정제하여 40㎕ 멸균수에 담아두었다. 이러한 단계 (f)의 반응 산물은 TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408(서열 25)이라 부른다.

시험관내 전사/해독 반응의 준비: 반응물 세트를 프로메가 박테리아 선형 주형 S30과 함께 다음과 같은 시험관내 전사/해독 반응 키트를 사용하여 얼음 위에 준비했다:

20㎕의 5000배 희석된 TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408 주형(최종 DNA 작제물 서열 24 0.1ng);

20㎕의 5 TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408 주형(최종 DNA 작제물 서열 25 0.5㎍);

전체 아미노산 혼합물(프로메가) 20㎕;

S30 프리믹스 80㎕;

S30 믹스 60㎕.

반응은 25℃에서 30분 동안 진행시키고 얼음에 방치한 뒤 2% Marvel/PBS로 10배 희석했다.

DNA-단백질 복합체 포획: NUNC 스타 임뮤노튜브에, 튜브당 500㎕ PBS 중의 10㎍/ml의 항-V5 항체를 4℃에서 하룻밤 동안 코팅시켰다. 추가 튜브는 음성 대조군으로서 블랭크로 남겨두었다. 이 튜브를 2x PBS로 세척하고 차단 완충액(2% Marvel, 0.1% Tween 20, 0.1mg/ml 헤링스펌 DNA)을 이용하여 실온에서 1시간 동안 차단시킨 뒤, 2x PBS로 세척했다. 희석된 전사/해독 반응물 1ml을 각 튜브에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온배양했다. 튜브를 5x PBS/0.1% Tween 20 및 그 다음 5x PBS로 세척했다. 500㎕ TE 완충액 + 500㎕ 페놀/클로로포름으로 DNA를 회수했다. 이 회수물을 13,200g에서 5분 동안 원심분리하고, DNA를 3M 아세트산나트륨 1/10부피, 50㎍/ml 글리코겐 및 무수 에탄올 2 부피량을 이용하여 침전시켰다. 원심분리 후 펠릿을 70% 에탄올로 세척하고 진공건조한 뒤 40㎕ 물에 재현탁시켰다. 회수한 DNA 20㎕를 비오틴화된 프라이머 bTAC6(서열 26) 및 bCISREV(서열 19)를 함유한 50㎕ 반응물 중에서 재증폭시켰다. 반응 산물을 1% 아가로스/TAE 겔에서 전기영동시켰다.

회수된 DNA의 발현 벡터 pDMG-K(서열 27)로의 클로닝.

반응 산물을 겔정제하고 QIAquick Gelextraction 키트를 제조사의 지시(QIAGEN Ltd West Sussed, U.K.)에 따라 사용하여 50㎕ 멸균수로 용출시켰다. 정제된 반응 산물과 플라스미드 pDMG-K를 모두 20 유닛의 NcoI 및 NotI(New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A.)로 절단시켰다. 절단된 플라스미드는 QIAquick Gelextraction 키트를 제조사의 지시(QIAGEN Ltd West Sussed, U.K.)에 따라 사용하여 겔 정제한 뒤, 소장 알칼리 포스파타제(Promega, Southampton, U.K.) 0.01 유닛으로 처리한 뒤, 페놀/클로로포름 추출 및 에탄올 침전을 전술한 바와 같이 수행했다. 침전된 DNA를 물 20㎕에 용해시켰다. 절단된 PCR 산물은 1x TBS, 0.3mg/ml BSA, 0.1% Tween 20에 함유된 Streptavidin 코팅된 스트립(Roche Diagnostics Ltd, East Sussex, U.K.)으로 전이시키고 실온에서 30분 동안 진탕하에 항온배양했다. 이러한 반응은 PCR 산물의 NcoI 및 NotI 부위의 인접 비오틴화된 DNA 상류 및 하류를 제거하고 선발된 펩타이드 서열을 함유하는 스몰 DNA 단편을 회수할 수 있게 한다. 상청액을 전술한 바와 같이 페놀/클로로포름 추출한 뒤 에판올 침전시켰다. 침전된 DNA를 물 10㎕에 용해시켰다. 절단된 플라스미드와, NcoI과 NotI 오버행을 보유하는 선발된 펩타이드 서열을 함유하는 분리된 스몰 DNA 단편을 Quick ligation 키트를 제조자의 지시(New England Biolabs, Beverly, MA, U.S.A)에 따라 사용하여 결찰시킨 뒤 페놀/클로로포름 추출과 에탄올 침전을 전술한 바와 같이 실시했다. 침전된 DNA를 물 10㎕에 용해시키고 제조자의 지시(Stratagene, U.S.A.)에 따라 일렉트로컴피턴트 TG1 세포로 전기침투시킨 뒤, 2xTY, 100㎍/ml 앰피실린 및 2% 글루 코스 함유 평판에서 선발했다.

선발된 클론의 항-V5 항체 ELISA 선별: 88개 콜로니를 2x TY, 2% 글루코스 및 100㎍/ml 앰피실린을 함유하는 용액 400㎕에 채취하고 37℃에서 하룻밤동안 300rpm으로 진탕하여 증식시켰다. 하룻밤 배양물 50㎕를 2x TY, 2% 글루코스 및 100㎍/ml 앰피실린을 함유하는 용액 1ml로 전이시키고 37℃에서 OD 0.5가 될 때까지 300rpm으로 진탕하여 증식시켰다. 그 다음, 세포를 1000xg로 10분 동안 원심분리했다. 상청액을 분리해내고, 펠릿을 2x TY, 0.4M 슈크로스, 100㎍/ml 앰피실린 및 1mM IPTG 함유 용액 600㎕에 재현탁시키고 37℃에서 4시간 동안 300rpm으로 진탕하에 증식시켰다. 유도 후, 세포를 1000xg에서 10분 동안 원심분리했다. 상청액 150㎕를 ELISA 시험에 사용했다. NUNC Maxisorp 평판에 항인간 카파 영역 항체 또는 항V5 항체의 1x PBS 중의 1㎍/ml 용액 또는 50㎍/ml BSA 100㎕를 실온에서 7시간 동안 코팅시켰다. 추가 평판은 PBS만으로 코팅시켜 블랭크로 남겨두었다. 웰을 2x PBS로 세척한 뒤, 상청액 150㎕와 1x PBS 중의 4% Marvel, 0.1% Tween 20을 함유하는 용액 150㎕를 웰에 첨가한 다음, 실온에서 1시간 동안 항온배양했다. 그 다음, 웰을 2x PBS, 0.1% Tween 20 및 2x PBS로 세척했다. 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)에 접합시킨 2차 항체 항인 카파 영역 항체(최종 농도 1.6㎍/ml)는 4% Marvel, 0.1% Tween 20, 1x PBS에 500배 희석하고 웰에 첨가한 뒤 실온에서 1시간 동안 항온배양했다. 그 다음, 웰을 4x PBS, 0.1% Tween 20 및 2x PBS로 세척했다. HRP 시그널은 TMB 기질 200㎕를 첨가하여 검출했다. 0.5M 황산 100㎕를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 450nm에서 흡광도를 측정했다. 항인간 카파 영역 항체에 대하 여 선별된 클론 중에서 HRP 시그널로 판단되는 발현이 양호한 클론은 88개 중 35개였다. 이러한 35개 클론 중에서 7개 클론은 항V5 항체에 대한 특이적 결합도 나타내어, V5 펩타이드를 1/5000에서 1/5, 즉 1000 농축율로 농축시켰다(도 6).

실시예 4: 바실러스 글로비기에 대한 CIS 디스플레이 라이브러리 작제, 선발 및 선별

라이브러리 작제

라이브러리 DNA를 제조하기 위해서, 프로모터 라이브러리 DNA 단편과 RepA-CIS-ori 단편을 생성시킨 뒤 이를 함께 분해-결찰에 의해 결합시켜야 한다. 이 실시에는 P2A-HA 벡터 유래의 tac 프로모터를 사용하였지만, 입수용이한 다수의 프로모터도 사용할 수 있는데, 이는 당업자에게 공지되어 있다. Rep-CIS-ori 단편과 TAC 단편의 1차 PCR을 통해 각각 Bsp120I 부위 및 랜덤 라이브러리/NotI 부위를 첨부시켰다. 2가지 마스터 혼합물은 다음과 같이 제조했다:

1:50 희석율의 P2A-HA plasmid DNA (25ng/반응물) 10㎕를 프라이머 TACFARUP (서열 23) 및 NTERM18MER(서열 28) 각 10pmol 및 20:1 Taq DNA 폴리머라제: Deep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(NEB) 2 유닛과 함께 200 μM dNTPs, 1x NEB 폴리머라제 증폭 완충액(IOmM KCl, 1OmM (NH₄)₂SO₄, 20mM Tris-HCl pH 8.8, 2mM MgS0₄, 0.1% TritonX-100)을 함유하는 20x 50㎕ 반응 부피 중에서, 94℃, 40초; 60℃, 40초; 72℃, 60초 간을 25회 반복하고; 72℃, 5분간 신장 반응시켜 PCR 증폭시켰다. 반응 산물 20㎕를 1% 아가로스/TAE 겔에서 전기영동한 뒤 사진촬영하고, 나머지는 퀴아 겐 컬럼 정제하여 200㎕ 물에 담아두었다.

Bsp120I 보정된 Rep-CIS-ori DNA(50ng/반응물) 10㎕를, 프라이머 BSPREPAFOR (서열 29) 및 ORIREV(서열 2) 각 10pmol 및 20:1 Taq DNA 폴리머라제: Deep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(NEB) 2 유닛과 함께 200 μM dNTPs, 1x NEB 폴리머라제 증폭 완충액(IOmM KCl, 1OmM (NH₄)₂SO₄, 20mM Tris-HCl pH 8.8, 2mM MgS0₄, 0.1% TritonX-100)을 함유하는 10x 50㎕ 반응 부피 중에서, 94℃, 40초; 60℃, 40초; 72℃, 90초 간을 30회 반복하고; 72℃, 5분간 신장 반응시켜 PCR 증폭시켰다. 반응 산물 20㎕를 1% 아가로스/TAE 겔에서 전기영동한 뒤 사진촬영하고, 나머지는 퀴아겐 컬럼 정제하여 120㎕ 물에 담아두었다.

라이브러리-TAC 산물을 그 다음 10㎕ NotI(NEB)(100u)로 300㎕ 반응 부피 중에서 37℃하에 1시간 동안 절단시킨 뒤, 퀴아겐 컬럼 정제를 통해 120㎕ 부피의 물에 담아두었다. 이러한 두 산물을 제한분해-결찰을 통해 다음과 같이 결합시켰다:

10x NEB 완충액 4	17㎕
100mM ATP(SIGMA)	15㎕
10mg/ml 아세틸화된 BSA(NEB)	1㎕
RepA DNA	40㎕
TAC-라이브러리 DNA	40㎕
Bsp120I(10u/㎕Fementas)	5㎕
NotI(10u/㎕NEB)	5㎕
T4 DNA 리가제(400u/㎕NEB)	5㎕
물	39㎕

반응은 37℃에서 2시간 동안 실시했다. 20㎕는 겔 전기영동으로 평가하고, 30㎕는 10x 50㎕ 반응물 중에서 직접 PCR 증폭시켰으며, 나머지는 겔 정제하였고, 라이브러리 밴드는 절제하여 퀴아겔 컬럼 정제하고, 프라이머 TACFAR4(서열 40)와 ORIREV(서열 2)를 이용하여 20x 50㎕ 반응물 중에서 94℃, 40초; 60℃, 40초; 72 ℃, 90초 간을 30회 반복하고; 72℃, 5분간 신장 반응시켜 PCR 증폭시켰다. DNA를 4개의 퀴아rps 컬럼으로 겔 정제하고 용출액 200㎕를 ITT 반응/선발을 위해 저장했다.

1차 선발

다음과 같이 2x 200㎕ ITT 반응물을 준비하여 실온에서 1시간 동안 항온배양했다:

반응물	1
라이브러리 DNA	56㎕(7㎍)
2.5x 완충액	80㎕
100mM 메티오닌	2㎕
S30 추출물	60㎕

각 반응물에 차단 완충액(TBS 중의 4% Marvel, 100㎍/ml 전단된 살먼 스펌 DNA, 0.1% Tween 20, 2.5㎎/ml 헤파린) 1ml을 첨가하고 10,000g에서 2분 동안 회전시킨 후, 새 튜브로 옮한 뒤, 얼음에 방치했다.

바실러스 글로비기(Bacillus globigii)(Bg) 포자 현탁액 100㎕를 TBS/0.1% Tween 20 1ml로 2회 세척하고 차단 완충액 100㎕에 재현탁시켰다. 이것을 그 다음 차단 완충액에 첨가하고, 혼합하면서 실온에서 1시간 동안 결합시켰다.

이 혼합물을 그 다음 16,100g에서 1분 동안 원심분리하고, 포자 펠릿을 피펫을 이용한 혼합과 볼텍싱으로 TBS/0.1% Tween 20 1ml로 6회 세척한 뒤 원심분리했다. 펠릿을 마지막으로 1ml TBS로 세척하고 상청액을 제거했다.

포자를 120㎕ 0.5M 아세트산 나트륨(pH 5.5)에 넣고 혼합기에서 10분 동안 항온배양하여 DNA를 용출시켰다. 포자를 16,100g에서 1분간 원심분리한 뒤 120㎕ Tris pH 8.0을 첨가하여 상청액을 중화시킨 다음, 페놀/CHCl₃ 추출한 뒤 16,100g에서 5분간 원심분리했다. DNA를 20㎍ 담체 글리코겐과 2½ 부피의 에탄올로 침전시켰다. DNA는 16,100g에서 20분 동안 펠릿화하고 이 펠릿을 70% 에탄올 0.75ml로 3회 세척하되 각 세척시마다 16,100g에서 3분간 원심분리했으며, 그 다음 공기 건조하고 물 20㎕에 재현탁시켰다.

회수한 DNA 10㎕를 프라이머 CISREV(서열 19) 및 TACFAR5(서열 31)와 20:1 Taq DNA 폴리머라제: Deep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(NEB) 2유닛을 함유하는 10x 50㎕ 반응물에서 94℃, 40초; 60℃, 40초; 72℃, 90초간을 30회 반복하고 그 다음 72℃에서 5분간 신장반응시켜 PCR 증폭시켰다. DNA를 정제하고 에탄올 침전한 뒤 물 10㎕에 재현탁시켰다. 5㎕는 프라이머 NOTRECREV2(서열 32) 및 TACFAR5(서열 31)를 10회 동안 사용하는 것을 제외하고는 전술한 조건하에 PCR로 추가 증폭시켰다. 그 산물을 퀴아겐 PCR 정제 키트를 사용하여 정제하고 50㎕ 5mM Tris pH 8.0으로 용출시켰다.

제한분해-결찰

추가 선발 과정을 위해 회수한 펩타이드에 RepA-CIS-ori DNA를 재부착시키기 위해 30㎕ 반응물을 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다.

10x NEB 완충액 4	3㎕
100mM ATP(SIGMA)	1.5㎕
10㎎/ml 아세틸화된 BSA(NEB)	0.3㎕
RepA DNA	2㎕
TAC-라이브러리 DNA	10㎕
Bsp120I(10u/㎕ Fermantas)	1.5㎕
NotI(10u/㎕ NEB)	1.5㎕
T4 DNA 리가제(400u/㎕ NEB)	1.5㎕
물	8.7㎕

20㎕를 프라이머 TACFAR5.1(서열 33) 및 ORIREV(서열 2)를 함유하는 10x 50㎕ 반응물 중에서 94℃, 40초; 60℃, 40초; 72℃, 90초간을 20회 반복하고 그 다음 72℃에서 5분간 신장반응시켜 PCR 증폭시켰다. DNA를 1개의 퀴아겐 컬럼을 통해 겔 정제하고 용출물을 2차 ITT 반응/선발에 사용했다(R2에는 58㎕를 사용함).

2차 선발

2차 선발은 다음을 제외하고는 1차 선발과 유사하게 수행했다: 약 3㎍의 DNA를 첨가했다. 차단 완충액은 TBS 중의 2% 소혈청 알부민, 1% 젤라틴, 100㎍/ml 전단된 살먼 스펌 DNA, 2.5mg/ml 헤파린을 사용했다. 세척된 포자 10㎕를 각 선발에 사용했다. 회수(recovery) PCR에는 TACFAR5.2(서열 34) 및 NOTRECREV2(서열 32) 프라이머를 사용했다. 마지막으로, 구조(pull-through) PCR에는 TACFAR5.2(서열 34) 및 ORIREV(서열 2) 프라이머를 10회 사용했다.

3차 선발

3차 선발은 다음을 제외하고는 2차 선발과 유사하게 수행했다: 약 2.5㎍의 DNA를 첨가했다. 회수(recovery) PCR에는 TACFAR6(서열 35) 및 NOTRECREV2(서열 32) 프라이머를 사용했다. 마지막으로, 구조(pull-through) PCR에는 TACFAR6(서열 35) 및 ORIREV(서열 2) 프라이머를 10회 사용했다.

4차 선발

4차 선발은 다음을 제외하고는 3차 선발과 유사하게 수행했다: 약 2㎍의 DNA를 첨가했다. 회수(recovery) PCR에는 TAC3(서열 9) 및 NOTRECREV2(서열 32) 프라이머를 사용했다. 마지막으로, 구조(pull-through) PCR에는 TAC3(서열 9) 및 ORIREV(서열 2) 프라이머를 10회 사용했다.

5차 선발

5차 선발은 4차 선발에서와 같이 실시했다.

5차 선발에서 회수한 DNA를, NcoI-NotI 단편으로서 클로닝하기 위해, 비오틴화된 TAC6(서열 26) 프라이머와 NOTRECREV2(서열 32)를 이용하여 PCR 증폭시켰다. NotI으로 절단한 뒤, 퀴아겐 PCR 정제 키트를 사용하여 정제했고, NcoI으로 절단한 뒤, 스트렙트아비딘이 코팅된 평판에서 항온배양했다. 페놀/CHCl₃ 정제 및 에탄올 침전 후, 절단된 DNA를 유사하게 절단된 pVIII 파지미드 벡터 내에 결찰시키고, 이를 이용하여 ER2738 이.콜리를 형질전환시킨 다음, 2% 글루코스, 2x TY, 100㎍/ml 앰피실린 평판에 평판배양한 뒤 37℃에서 하룻밤동안 항온배양했다.

각 콜로니를 96웰 평판 중의 2% 글루코스, 2x TY, 100㎍/㎖ 앰피실린 배지 200㎕에 채취하고 37℃/200rpm에서 6시간 동안 증식시켰다. 100㎕를 2% 글루코스, 2x TY, 100㎍/ml 앰피실린 배지 100㎕와 M13K07 헬퍼 파지 10㎕/웰을 함유하는 딥웰 평판으로 이동시켜 37℃에서 진탕없이 1시간 동안 항온배양했다. 2x TY, 100㎍/ml 앰피실린/25㎍/ml 카나마이신/20μM IPTG 배지를 웰당 500㎕씩 첨가하고 37℃/200rpm에서 하룻밤동안 항온배양을 수행했다.

ELISA 선별

96웰 둥근바닥 평판을 TBS 중의 4% Marvel/PBS 중의 0.1% Tween 20으로 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 채취한 파지 배양물을 3000g에서 5분 동안 원심분리 하고 파지 상청액을 ELISA로 분석했다. 각 웰마다, TBS 중의 4% 소혈청 알부민, 1% 젤라틴 중에서 Bg 포자 5㎕와 파지 상청액 50㎕를 혼합하고 실온에서 1시간 동안 진탕하면서 항온배양했다. 이 웰을 200T TBS/0.1% Tween20으로 5회 세척하되 각 세척 사이에 3000g에서 5분간 원심분리를 수행했으며, 그 다음 TBS 중의 4% 소혈청 알부민, 1% 젤라틴 중의 항-M13 양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항체 0.2㎍/ml과 항온배양했다. 포자는 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 항온배양했다. 그 다음, 웰을 TBS/0.1% Tween20으로 5회 세척하고 포자를 새 평판으로 전이시켰다. 그 다음, 포자를 전술한 바와 같이 TBS로 1회 세척한 뒤, TMB 기질로 발색시켰다. 발색은 0.5M H₂SO₄로 중지시키고, 용액은 450nm에서의 흡광도 측정을 위해 새로운 바닥이 편평한 평판으로 전이시켰다. 선발된 펩타이드들에 대한 결합 데이터는 도 7에 제시하였다.

실시예 5. 항V5 항체에 대한 CIS 디스플레이 라이브러리 작제, 선발 및 선별

라이브러리 작제는 실시예 4에 기술된 바와 같이 수행했다.

1차 선발

1x 200㎕ 시험관내 전사/해독 반응물(ITT)을 실시예 4에 기술된 바와 같이 준비하여 실온에서 1시간 동안 항온배양하였다. 각 반응물에 차단 완충액(TBS 중의 5% 탈지분유, 100㎍/ml 전단된 살먼 스펌 DNA, 2.5mg/ml 헤파린) 1ml을 첨가한 뒤, 얼음에 방치했다.

라이브러리 1차 선발을 위해, 70x11mm NUNC Maxisorp Immunotube(Life Technologies, Paisley, Scotland U.K.)를 PBS 중의 폴리클론 항-V5 펩타이드 항체(Harlan-Seralab) 10㎍/ml 용액 1ml로 37℃에서 1시간 동안 코팅시켰다. 이 튜브를 PBS로 3회 세척하고(채우고 비운다), 차단 완충액 3ml로 37℃에서 1시간 동안 차단시킨 다음 전술한 바와 같이 세척했다. 차단 완충액 중의 라이브러리 단백질-DNA 복합체를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 방치하여 항온처리했다. 이 튜브를 PBS/0.1% Tween 20으로 5회 세척한 다음 PBC만으로 추가 5회 세척했다.

DNA를 혈액 혼합기에서 500㎕ 1M 아세트산나트륨(pH 5.2)으로 10분 동안 용출시키고, 1M Tris-HCl(pH 8.0) 100㎕로 중화시킨 다음, 16,100g에서 5분 동안 페놀/CHCl₃ 추출시켰다. DNA를 담체 글리코겐 20㎍, ½부피의 7.5M 아세트산암모늄 및 3부피의 에탄올로 침전시켰다. DNA를 16,100g에서 20분 동안 펠릿화한 뒤, 이 펠릿을 0.5ml 70% 에탄올로 세척한 다음 16,100g에서 5분 동안 원심분리하고 진공건조한 다음 물 20㎕에 재현탁시켰다.

회수한 DNA 10㎕는 프라이머 NOT1RECREV2(서열 32) 및 TACFAR3(서열 30)과 20:1 Taq DNA 폴리머라제: Deep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(NEB) 2유닛을 함유하는 1x 50㎕ 반응물에서 94℃, 40초; 60℃, 40초; 72℃, 90초간을 30회 반복하고 그 다음 72℃에서 5분간 신장반응시켜 PCR 증폭시켰다. 반응 산물 50㎕를 1% 아가로스/TAE 겔에서 전기영동시키고 사진찰영한 뒤, 진클린으로 정제하여 물 10㎕에 담아두었다. DNA를 RepA DNA에 부착시키고 실시예 4에 기술된 바와 같이 2차 선발을 위해 프라이머 TACFAR5(서열 31) 및 ORIREV(서열 2)를 사용하여 재증폭시켰다.

2차 선발은 다음을 제외하고는 실시예 4에 기술된 바와 같은 프라이머 쌍을 사용하여 1차 선발에서와 같이 수행했다: 항V5 항체 코팅 농도는 5㎍/ml로 감소시켰다. DNA는 약 4㎍ 첨가했다. 3차 선발도 DNA 첨가량을 약 4㎍ 사용한 것을 제외하고는 2차 선발에서와 같이 실시했다. 회수 PCR에는 TACFAR5.1(서열 33)과 NOTRECREV2(서열 32) 프라이머를 사용했다. 마지막으로, 구조 PCR에는 TACFAR6(서열 35)과 ORIREV(서열 2) 프라이머를 10회 동안 사용했다. 4차 선발은 3차 선발에서와 같이 실시했다.

4차 선발에서 회수한 DNA를, NcoI-NotI 단편으로서 클로닝하기 위해, 실시예 4에 기술한 바와 같이 비오틴화된 TAC6(서열 26) 프라이머와 NOTRECREV2(서열 32)를 이용하여 PCR 증폭시키고 pVIII 파지미드 벡터에 클로닝한 다음, 일렉트로컴피턴트 TG-1 이.콜리에 전기침투시켰다.

각 콜로니를 96웰 평판 중의 2% 글루코스, 2x TY, 100㎍/㎖ 앰피실린 배지 200㎕에 채취하고 37℃/200rpm에서 6시간 동안 증식시켰다. 100㎕를 2% 글루코스, 2x TY, 100㎍/ml 앰피실린 배지 100㎕와 M13K07 헬퍼 파지 10⁹ kru/웰을 함유하는 딥웰 평판으로 이동시켜 37℃에서 진탕없이 1시간 동안 항온배양했다. 2x TY, 100㎍/ml 앰피실린/25㎍/ml 카나마이신/20μM IPTG 배지를 웰당 400㎕씩 첨가하고 37℃/200rpm 진탕하에 16시간동안 파지 증폭을 지속시켰다. 박테리아 배양물을 벤치탑 원심분리기에서 2000g, 4℃하에 10분 동안 미량역가 평판 담체 중에 회전시켜 박테리아를 펠릿화하고 배양 상청액은 ELISA에 사용했다.

NUNC Maxisorp ELISA 평판은 100㎕/웰 PBS 중의 항V5 펩타이드 항체 100ng/웰로 37℃에서 1시간 동안 코팅했다. 이 평판을 PBS 2x 200㎕/웰로 세척하고, 200㎕/웰 2% BSA/PBS로 37℃에서 1시간 동안 차단시킨 뒤 2x200㎕/웰 PBS로 세척했다. 파지 배양물 상청액 50㎕를, 웰당 4% BSA/PBS 50㎕를 함유하는 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 결합시켰다. 이러한 평판을 PBS/0.1% Tween 20 200㎕/웰로 2회 세척한 다음, PBS 200㎕/웰로 2회 세척했다. 결합된 파지는 2% BSA/PBS 중의 1:5000 희석율의 항-M13-HRP 접합체(Amersham-Pharmacia) 100㎕/웰로 실온에서 1시간 동안 검측하고, 이 평판을 전술한 바와 같이 4회 세척했다. TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 기질 완충액을 이용하여 실온에서 5분 동안 평판을 발색시켰다. 이 반응은 0.5N H₂SO₄ 100㎕/웰로 중지시키고 450nm에서 판독했다. ELISA 양성 클론의 파지미드 DNA를 그 다음 표준 pUC 순방향 및 역방향 서열분석 프라이머를 사용하여 서열분석했다. 분리된 클론의 아미노산 서열은 이하에 제시한 바와 같다. 4개의 ELISA 양성 클론을 10ml 배양액에서 증식시키고 파지 입자를 PEG-NaCl로 침전시키뒤, 1ml PBS에 재현탁시킨 다음 50㎕를 전술한 바와 같이 ELISA로 재시험했다. 항-V5 및 대조용 항-ACTH 펩타이드 항체에 대한 OD450nm 시그널은 도 8에 제시하였다.

선발 후 분리된 펩타이드 서열은 다음과 같다:

P1C12(서열 36)	CGCPTMAARVRPVLNSKH
P2H1(서열 37)	MTTVPVLMISV
P1B5(서열 38)	TLSTRHHNVIDRFNLRNF
P2B8(서열 39)	SIRTLTGSTPAQFDATAD

실시예 6. CIS 디스플레이 라이브러리로부터 오브알부민 결합 펩타이드의 선발

모든 선발 방법에서, 선발과 선별 과정 동안 결합되어 있는 담체 분자와 무관하게 선발된 물질이 이에 대해 선발된 표적에 결합할 수 있다는 것은 매우 중요하다. 본 실시예에서, 선발된 펩타이드는 선발한 뒤, 표적 결합 여부를 확인하게 위해 합성했다. 랜덤 12mer 펩타이드 라이브러리 작제는 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행했다. 면역튜브 위에 100㎍/ml 오브알부민(SIGMA, Dorset, UK)을 코팅시켜 실시예 4에 기술된 바와 같이 선발을 4회 실시했다.

4차 선발에서 회수한 DNA를, NcoI-NotI 단편으로서 클로닝하기 위해, 실시예 4에 기술한 바와 같이 비오틴화된 TAC6(서열 26)과 NOTRECREV2(서열 32) 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시키고 pVIII 파지미드 벡터에 클로닝한 다음, 일렉트로컴피턴트 TG-1 이.콜리에 전기침투시켰다.

각 콜로니를 96웰 평판 중의 2% 글루코스, 2x TY, 100㎍/㎖ 앰피실린 배지 200㎕에 채취하고 37℃/200rpm에서 6시간 동안 증식시켰다. 100㎕를 2% 글루코스, 2x TY, 100㎍/ml 앰피실린 배지 100㎕와 M13K07 헬퍼 파지 10⁹ kru/웰을 함유하는 딥웰 평판으로 이동시켜 37℃에서 진탕없이 1시간 동안 항온배양했다. 2x TY, 100㎍/ml 앰피실린/25㎍/ml 카나마이신/20μM IPTG 배지를 웰당 400㎕씩 첨가하고 37℃/200rpm 진탕하에 16시간동안 파지 증폭을 지속시켰다. 박테리아 배양물을 벤치탑 원심분리기에서 2000g, 4℃하에 10분 동안 미량역가 평판 담체 중에 회전시켜 박테리아를 펠릿화하고 배양 상청액은 ELISA에 사용했다.

NUNC Maxisorp ELISA 평판은 100㎕/웰 PBS 중의 항V5 펩타이드 항체 100ng/웰로 37℃에서 1시간 동안 코팅했다. 이 평판을 PBS 2x 200㎕/웰로 세척하고, 200㎕/웰 2% BSA/PBS로 37℃에서 1시간 동안 차단시킨 뒤 2x200㎕/웰 PBS로 세척했다. 파지 배양물 상청액 50㎕를, 웰당 4% BSA/PBS 50㎕를 함유하는 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 결합시켰다. 이러한 평판을 PBS/0.1% Tween 20 200㎕/웰로 2회 세척한 다음, PBS 200㎕/웰로 2회 세척했다. 결합된 파지는 2% BSA/PBS 중의 1:5000 희석율의 항-M13-HRP 접합체(Amersham-Pharmacia) 100㎕/웰로 실온에서 1시간 동안 검측하고, 이 평판을 전술한 바와 같이 4회 세척했다. TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 기질 완충액을 이용하여 실온에서 5분 동안 평판을 발색시켰다. 이 반응은 0.5N H₂SO₄ 100㎕/웰로 중지시키고 450nm에서 판독했다. ELISA 양성 클론의 파지미드 DNA를 그 다음 M13REV 프라이머로 서열분석했다. 분리된 클론의 아미노산 서열은 이하에 제시한 바와 같다.

C1(서열 40)	ANLWRIVLHGWW
C4(서열 41)	VSFMLLGPHRHR
C6(서열 42)	LVLHWLSLGSR
C8(서열 43)	SNQVVLILHLRP
대조군(서열 44)	AESWLHQSWIHL

4개의 대표적인 ELISA 양성 클론의 펩타이드 서열은 ELISA에서의 검출을 용이하게 하기 위한 C-말단에 첨가된 비오틴과 함께 합성했다(SIGMA-Genosys Ltd). 이러한 펩타이드를 상기 B.글로비기 포자에 대하여 파지 디스플레이 선발되어 분리한 바 있는 대조용 펩타이드와 함께 오브알부민에 대하여 ELISA로 시험했다. NUNC Maxisorp ELISA 평판은 100㎕/웰 PBS 중의 오브알부민 100㎍/웰, 또는 PBS 중의 항V5 폴리클론 항체 200ng/웰로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅했다. 이 평판을 PBS 2x 200㎕/웰로 세척하고, 2% 탈지분유/PBS 200㎕/웰로 37℃에서 1시간 동안 차단시킨 뒤 2x200㎕/웰 PBS로 세척했다. 희석된 펩타이드 1㎍을, 웰당 2% BSA/PBS 100㎕를 함유하는 각 웰에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 결합시켰다. 이러한 평판을 PBS/0.1% Tween20 200㎕/웰로 2회 세척한 다음, PBS 200㎕/웰로 2회 세척했다. 결합된 펩타이드는 2% BSA/PBS 중의 1:2000 희석율의 스트렙타비딘-HRP 접합체(Pierce) 100㎕/웰로 실온에서 1시간 동안 검측하고, 이 평판을 전술한 바와 같이 4회 세척했다. TMB(3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘) 기질 완충액을 이용하여 실온에서 5분 동안 평판을 발색시켰다. 이 반응은 0.5N H₂SO₄ 100㎕/웰로 중지시키고 450nm에서 판독했다(도 9).

실시예 7. CIS 디스플레이스 시스템에서의 단일쇄 Fv 항체(scFv) 단편의 디스플레이

tac-scFv-RepA-CIS-ori 작제물은 실질적으로 실시예 1에 전술한 바와 같이 PCR 오버랩 신장반응 통해 작제했다. 항-메코프롭 scFv DNA(Haptogen Ltd, Aberdeen, UK)는 200μM dNTP, 1xNEB 폴리머라제 증폭 완충액(10mM KCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 20mM Tris-HCl(pH 8.8), 2mM MgSO₄, 0.1% TritonX-100)을 함유하는 50㎕ 반응액 중에서, 프라이머 TACMECOFOR(서열 45) 및 REPAMECOBAK(서열 46) 각 10pmol과 20:1 Taq DNA 폴리머라제: Deep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(NEB) 2유닛을 이용 하여 94℃, 40초; 60℃, 40초; 72℃, 80초간을 30회 반복하고 그 다음 72℃에서 5분간 신장반응시켜 PCR 증폭시켰다. 반응 산물을 1% 아가로스/TAE 겔에서 전기영동하고 진클린 II 키트로 정제하여 물 20㎕에 담아두었다. 이것을 ORIREV408(서열 20)과 MECOREPAFOR(서열 47)로 수득한 RepA-CIS-ori DNA 및 TACFARUP(서열 23) 및 MECOTACBAK(서열 48)로 수득한 Tac 프로모터 DNA와 200㎕ dNTP, 1xNEB 폴리머라제 증폭 완충액(10mM KCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 20mM Tris-HCl(pH 8.8), 2mM MgSO₄, 0.1% TritonX-100)을 함유하는 50㎕ 반응액에서, 프라이머 TAC3(서열 9) 및 ORIREV(서열 2) 각 10pmol과 20:1 Taq DNA 폴리머라제: Deep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(NEB) 2유닛을 이용하여, 94℃, 40초; 60℃, 40초; 72℃, 80초간을 30회 반복하고 그 다음 72℃에서 5분간 신장반응시켜 조립시켰다. 산물을 1% 아가로스/TAE 겔에서 전기영동시키고, 진클린 II 킷트로 정제하여 물 20㎕에 담아두었다.

DNA를 200㎕ dNTP, 1xNEB 폴리머라제 증폭 완충액(10mM KCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 20mM Tris-HCl(pH 8.8), 2mM MgSO₄, 0.1% TritonX-100)을 함유하는 10x 50㎕ 반응액에서, 프라이머 TAC3(서열 9) 및 ORIREV(서열 2) 각 10pmol과 20:1 Taq DNA 폴리머라제: Deep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(NEB) 2유닛을 이용하여, 94℃, 40초; 60℃, 40초; 72℃, 80초간을 30회 반복하고 그 다음 72℃에서 5분간 신장반응시켜 조립시켰다. 산물을 1% 아가로스/TAE 겔에서 전기영동시키고, 진클린 II 킷트로 정제하여 물 100㎕에 담아두었다.

그 다음, ScFvDNA를 다음과 같은 2가지 반응물 조건에서 해독시켰다:

반응물	1	2
Tac-ScFv-RepA DNA	28㎕(1㎍)	28㎕(1㎍)
2.5x 완충액	40㎕	40㎕
10mM 메티오닌	1㎕	1㎕
H2O	1㎕	-
S30 추출물	30㎕	30㎕

이 반응물들을 30℃에서 30분 동안 항온배양한 뒤, 반응물 2에는 0.25M 산화 글루타치온 1㎕를 첨가하고 30℃에서 30분 동안 더 항온배양했다. 각 반응물에 차단 완충액 1ml(TBS 중의 1% 젤라틴, 100㎍/ml 전단된 살먼 스펌 DNA, 2.5mg/ml 헤파린)을 첨가하고, 10,000g에서 2분 동안 회전시킨 뒤, 얼음 상에 방치했다.

NUNC 스타 임뮤노튜브에 10㎍/ml BSA-메코프롭 접합체 또는 PBS 중의 10㎍/ml 0.5ml을 37℃에서 1시간 동안 코팅시켰다. 이 튜브를 2x PBS로 세척한 뒤, 혈액 혼합기에서 3ml 차단 완충액을 이용하여 실온하에 1시간 동안 차단시킨 다음, 2x PBS로 세척했다.

희석된 각 ITT 0.5ml을 차단된 BSA 코팅 튜브 또는 BSA-메코프롭 코팅 튜브에 첨가하고 실온에서 1시간 동안 항온배양했다. 튜브를 5x TBS/0.1% Tween 20, 5x TBS로 세척했다.

결합된 DNA는 0.5M NaCl/10mM Tris pH 8, 1mM EDTA 0.5ml로 실온에서 10분 동안 용출시킨 다음 0.5ml 페놀/클로로포름으로 추출한 뒤, 20㎍ 담체 글리코겐, ½ 부피의 7.5M 아세트산암모늄 및 3부피의 에탄올로 침전시켰다. DNA를 14,000g에서 20분 동안 펠릿화하고, 이 펠릿을 70% 에탄올 0.5ml로 14,000g에서 5분 동안 세척한 다음, 진공 건조하고 20㎕ 물에 재현탁시켰다.

회수한 DNA 10㎕를 200㎕ dNTP, 1xNEB 폴리머라제 증폭 완충액(10mM KCl, 10mM (NH₄)₂SO₄, 20mM Tris-HCl(pH 8.8), 2mM MgSO₄, 0.1% TritonX-100)을 함유하는 50㎕ 반응액에서, 프라이머 TACMECOFOR(서열 45) 및 REPAMECOBAK(서열 46) 각 10pmol과 20:1 Taq DNA 폴리머라제: Deep Vent DNA 폴리머라제 혼합물(NEB) 2유닛을 이용하여, 94℃, 40초; 60℃, 40초; 72℃, 80초간을 30회 반복하고 그 다음 72℃에서 5분간 신장반응시켜 PCR 증폭시켰다. 산물을 1% 아가로스/TAE 겔에서 전기영동시키고, 사진촬영했다. BSA 코팅된 튜브에서 회수된 것보다 다량의 DNA가 항체 표적에서의 선발에서부터 관찰되었는데, 이는 작용성 scFv-RepA-DNA 복합체가 선발되었음을 시사한다(도 10).

<110> ISOGENICAL LIMITED <120> PEPTIDE LIBRARY DISPLAY METHOD <130> N.86234C SER <150> GB 0220759.5 <151> 2002-09-06 <150> GB 0304521.8 <151> 2003-02-27 <150> GB 0304657.0 <151> 2003-02-28 <160> 51 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 1 actgatcttc accaaacgta tta 23 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 tgcatatctg tctgtccaca gg 22 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gagcttcaac aggggagggg gaggaggatc aactgatctt caccaaac 48 <210> 4 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 ctaggactgg attcaacggg gggaggagga tcaactgatc ttcaccaaac 50 <210> 5 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 cagaagagga tctgaatggg ggaggagggt ccactgtggc tgcaccatc 49 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 tcccctgttg aagctctttg tg 22 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 cagaagagga tctgaatggg ggaggagggt ccggaaaacc 40 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 gctacgttga atccagtcct aggagag 27 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 catattgtcg ttagaacgcg gc 22 <210> 10 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 attcagatcc tcttctgaga tgagtttttg ttcctcgagc atggtagatc ctgtttcc 58 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 cgatacctag cgttcggatc catattgtcg ttagaacgcg gc 42 <210> 12 <211> 1788 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA construct <400> 12 catattgtcg ttagaacgcg gctacaatta atacataacc ttatgtatca tacacatacg 60 atttaggtga cactatagaa tacaagctta ctccccatcc ccctgttgac aattaatcat 120 ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acaggatcta 180 ccatgctcga ggaacaaaaa ctcatctcag aagaggatct gaatggggga ggagggtcca 240 ctgtggctgc accatctgtc ttcatcttcc cgccatctga 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sequence <400> 15 atg gta aag aac ccg aat ccg gtg ttc act ccc cgt gaa ggt gcc gga 48 Met Val Lys Asn Pro Asn Pro Val Phe Thr Pro Arg Glu Gly Ala Gly 1 5 10 15 acg ccg aag ttc cgc gaa aaa ccg atg gaa aag gcg gtg ggc ctc acc 96 Thr Pro Lys Phe Arg Glu Lys Pro Met Glu Lys Ala Val Gly Leu Thr 20 25 30 tcc cgt ttt gat ttc gcc att cat gtg gcg cat gcc cgt tcc cgt ggt 144 Ser Arg Phe Asp Phe Ala Ile His Val Ala His Ala Arg Ser Arg Gly 35 40 45 ctg cgt cgg cgc atg cca ccg gtg ctg cgt cga cgg gct att gat gcg 192 Leu Arg Arg Arg Met Pro Pro Val Leu Arg Arg Arg Ala Ile Asp Ala 50 55 60 ctg ctg cag ggg ctg tgt ttc cac tat gac ccg ctg gcc aac cgc gtc 240 Leu Leu Gln Gly Leu Cys Phe His Tyr Asp Pro Leu Ala Asn Arg Val 65 70 75 80 cag tgt tcc atc acc aca ctg gcc att gag tgc gga ctg gcg aca gag 288 Gln Cys Ser Ile Thr Thr Leu Ala Ile Glu Cys Gly Leu Ala Thr Glu 85 90 95 tcc ggt gca gga aaa ctc tcc atc acc cgt gcc acc cgg gcc ctg acg 336 Ser Gly Ala Gly Lys Leu Ser Ile Thr Arg Ala Thr Arg Ala Leu Thr 100 105 110 ttc ctg tca gag ctg gga ctg att acc tac cag acg gaa tat gac ccg 384 Phe Leu Ser Glu Leu Gly Leu Ile Thr Tyr Gln Thr Glu Tyr Asp Pro 115 120 125 ctt atc ggg tgc tac att ccg acc gac atc acg ttc aca ctg gct ctg 432 Leu Ile Gly Cys Tyr Ile Pro Thr Asp Ile Thr Phe Thr Leu Ala Leu 130 135 140 ttt gct gcc ctt gat gtg tct gag gat gca gtg gca gct gcg cgc cgc 480 Phe Ala Ala Leu Asp Val Ser Glu Asp Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg 145 150 155 160 agt cgt gtt gaa tgg gaa aac aaa cag cgc aaa aag cag ggg ctg gat 528 Ser Arg Val Glu Trp Glu Asn Lys Gln Arg Lys Lys Gln Gly Leu Asp 165 170 175 acc ctg ggt atg gat gag ctg ata gcg aaa gcc tgg cgt ttt gtg cgt 576 Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Ile Ala Lys Ala Trp Arg Phe Val Arg 180 185 190 gag cgt ttc cgc agt tac cag aca gag ctt cag tcc cgt gga ata aaa 624 Glu Arg Phe Arg Ser Tyr Gln Thr Glu Leu Gln Ser Arg Gly Ile Lys 195 200 205 cgt gcc cgt gcg cgt cgt gat gcg aac aga gaa cgt cag gat atc gtc 672 Arg Ala Arg Ala Arg Arg Asp Ala Asn Arg Glu Arg Gln Asp Ile Val 210 215 220 acc cta gtg aaa cgg cag ctg acg cgt gaa atc tcg gaa gga cgc ttc 720 Thr Leu Val Lys Arg Gln Leu Thr Arg Glu Ile Ser Glu Gly Arg Phe 225 230 235 240 act gct aat ggt gag gcg gta aaa cgc gaa gtg gag cgt cgt gtg aag 768 Thr Ala Asn Gly Glu Ala Val Lys Arg Glu Val Glu Arg Arg Val Lys 245 250 255 gag cgc atg att ctg tca cgt aac cgc aat tac agc cgg ctg gcc aca 816 Glu Arg Met Ile Leu Ser Arg Asn Arg Asn Tyr Ser Arg Leu Ala Thr 260 265 270 gct tct ccc tga 828 Ala Ser Pro 275 <210> 16 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <400> 16 Met Val Lys Asn Pro Asn Pro Val Phe Thr Pro Arg Glu Gly Ala Gly 1 5 10 15 Thr Pro Lys Phe Arg Glu Lys Pro Met Glu Lys Ala Val Gly Leu Thr 20 25 30 Ser Arg Phe Asp Phe Ala Ile His Val Ala His Ala Arg Ser Arg Gly 35 40 45 Leu Arg Arg Arg Met Pro Pro Val Leu Arg Arg Arg Ala Ile Asp Ala 50 55 60 Leu Leu Gln Gly Leu Cys Phe His Tyr Asp Pro Leu Ala Asn Arg Val 65 70 75 80 Gln Cys Ser Ile Thr Thr Leu Ala Ile Glu Cys Gly Leu Ala Thr Glu 85 90 95 Ser Gly Ala Gly Lys Leu Ser Ile Thr Arg Ala Thr Arg Ala Leu Thr 100 105 110 Phe Leu Ser Glu Leu Gly Leu Ile Thr Tyr Gln Thr Glu Tyr Asp Pro 115 120 125 Leu Ile Gly Cys Tyr Ile Pro Thr Asp Ile Thr Phe Thr Leu Ala Leu 130 135 140 Phe Ala Ala Leu Asp Val Ser Glu Asp Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg 145 150 155 160 Ser Arg Val Glu Trp Glu Asn Lys Gln Arg Lys Lys Gln Gly Leu Asp 165 170 175 Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Ile Ala Lys Ala Trp Arg Phe Val Arg 180 185 190 Glu Arg Phe Arg Ser Tyr Gln Thr Glu Leu Gln Ser Arg Gly Ile Lys 195 200 205 Arg Ala Arg Ala Arg Arg Asp Ala Asn Arg Glu Arg Gln Asp Ile Val 210 215 220 Thr Leu Val Lys Arg Gln Leu Thr Arg Glu Ile Ser Glu Gly Arg Phe 225 230 235 240 Thr Ala Asn Gly Glu Ala Val Lys Arg Glu Val Glu Arg Arg Val Lys 245 250 255 Glu Arg Met Ile Leu Ser Arg Asn Arg Asn Tyr Ser Arg Leu Ala Thr 260 265 270 Ala Ser Pro 275 <210> 17 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 17 Met Val Lys Asn Pro Asn Pro Val Phe Thr Pro Arg Glu Gly Ala Gly 1 5 10 15 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Gln Leu Thr Arg Glu Ile Ser Glu Gly Arg Phe 225 230 235 240 Thr Ala Asn Gly Glu Ala Val Lys Arg Glu Val Glu Arg Arg Val Lys 245 250 255 Glu Arg Met Ile Leu Ser Arg Asn Arg Asn Tyr Ser Arg Leu Ala Thr 260 265 270 Ala Ser Pro 275 <210> 18 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 18 Met Val Lys Asn Pro Asn Pro Val Phe Thr Pro Arg Glu Gly Ala Gly 1 5 10 15 Thr Pro Lys Phe Arg Glu Lys Pro Met Glu Lys Ala Val Gly Leu Thr 20 25 30 Ser Arg Phe Asp Phe Ala Ile His Val Ala His Ala Arg Ser Arg Gly 35 40 45 Leu Arg Arg Arg Met Pro Pro Val Leu Arg Arg Arg Ala Ile Asp Ala 50 55 60 Leu Leu Gln Gly Leu Cys Phe His Tyr Asp Pro Leu Ala Asn Arg Val 65 70 75 80 Gln Cys Ser Ile Thr Thr Leu Ala Ile Glu Cys Gly Leu Ala Thr Glu 85 90 95 Ser Gly Ala Gly Lys Leu Ser Ile Thr Arg Ala Thr Arg Ala Leu Thr 100 105 110 Phe Leu Ser Glu Leu Gly Leu Ile Thr Tyr Gln Thr Glu Tyr Asp Pro 115 120 125 Leu Ile Gly Cys Tyr Ile Pro Thr Asp Ile Thr Phe Thr Leu Ala Leu 130 135 140 Phe Ala Ala Leu Asp Val Ser Glu Asp Ala Val Ala Ala Ala Arg Arg 145 150 155 160 Ser Arg Val Glu Trp Glu Asn Lys Gln Arg Lys Lys Gln Gly Leu Asp 165 170 175 Thr Leu Gly Met Asp Glu Leu Ile Ala Lys Ala Trp Arg Phe Val Arg 180 185 190 Glu Arg Phe Arg Ser Tyr Gln Thr Glu Leu Gln Ser Arg Gly Ile Lys 195 200 205 Arg Ala Arg Ala Arg Arg Asp Ala Asn Arg Glu Arg Gln Asp Ile Val 210 215 220 Thr Leu Val Lys Arg Gln Leu Thr Arg Glu Ile Ser Glu Gly Arg Phe 225 230 235 240 Thr Ala Asn Gly Glu Ala Val Lys Arg Glu Val Glu Arg Arg Val Lys 245 250 255 Glu Arg Met Ile Leu Ser Arg Asn Arg Asn Tyr Ser Arg Leu Ala Thr 260 265 270 Ala Ser Pro 275 <210> 19 <211> 275 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> repA sequence <400> 19 Met Val Lys Asn Pro Asn Pro Val Phe Thr Pro Arg Glu Gly Ala Gly 1 5 10 15 Thr Pro Lys Phe Arg Glu Lys Pro Met Glu Lys Ala Val Gly Leu Thr 20 25 30 Ser Arg Phe Asp Phe Ala Ile His Val Ala His Ala Arg Ser Arg Gly 35 40 45 Leu Arg Arg Arg Met Pro Pro Val Leu Arg Arg Arg Ala Ile Asp Ala 50 55 60 Leu Leu Gln Gly Leu 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tcagcggccg caactgatct tcaccaaacg 110 <210> 25 <211> 106 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (29)..(30) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (32)..(33) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (35)..(36) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (38)..(39) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (41)..(42) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (44)..(45) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (47)..(48) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (50)..(51) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (53)..(54) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (56)..(57) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (59)..(60) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (62)..(63) <223> n = a, g, c or t <400> 25 cacacaggaa acaggatcta ccatggccnn bnnbnnbnnb nnbnnbnnbn nbnnbnnbnn 60 bnnbggggga ggaggatcag cggccgcaac tgatcttcac caaacg 106 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 cagttgatcg gcgcgagatt 20 <210> 27 <211> 2390 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAC-V5-REPA-CIS-ORI-408 construct <400> 27 cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt gcagggccag 60 actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt gtgccacgcg 120 gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg ttttcgcaga 180 aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac cggcatactc 240 tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac tctcttccgg 300 gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg gctagcgatg accctgctga 360 ttggttcgct gaccatttcc ggggtgcgga acggcgttac cagaaactca gaaggttcgt 420 ccaaccaaac cgactctgac ggcagtttac gagagagatg atagggtctg cttcagtaag 480 ccagatgcta cacaattagg cttgtacata ttgtcgttag aacgcggcta caattaatac 540 ataaccttat gtatcataca catacgattt aggtgacact atagaataca agcttactcc 600 ccatccccct gttgacaatt aatcatggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 660 caatttcaca caggaaacag gatctaccat ggccggaaaa cctatcccaa accctctcct 720 aggactggat tcaacggggg gaggaggatc agcggccgca actgatcttc accaaacgta 780 ttaccgccag gtaaagaacc cgaatccggt gtttacaccc cgtgaaggtg caggaacgct 840 gaagttctgc gaaaaactga tggaaaaggc ggtgggcttc acttcccgtt ttgatttcgc 900 cattcatgtg gcgcatgccc gttcgcgtgg tctgcgtcga cgcatgccac cagtgctgcg 960 tcgacgggct attgatgcgc tcctgcaggg gctgtgtttc cactatgacc cgctggccaa 1020 ccgcgtccag tgctccatca ccacgctggc cattgagtgc ggactggcga cggagtctgc 1080 tgccggaaaa ctctccatca cccgtgccac ccgggccctg acgttcctgt cagagctggg 1140 actgattacc taccagacgg aatatgaccc gcttatcggg tgctacattc cgaccgatat 1200 cacgttcaca tctgcactgt ttgctgccct cgatgtatca gaggaggcag tggccgccgc 1260 gcgccgcagc cgtgtggtat gggaaaacaa acaacgcaaa aagcaggggc tggataccct 1320 gggcatggat gaactgatag cgaaagcctg gcgttttgtt cgtgagcgtt ttcgcagtta 1380 tcagacagag cttaagtccc ggggaataaa gcgtgcccgt gcgcgtcgtg atgcggacag 1440 ggaacgtcag gatattgtca ccctggtgaa acggcagctg acgcgcgaaa 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tatggtctgg 2340 cagggctggg gatgggtaag gtgaaatcta tcaatcagta ccggcttacg 2390 <210> 28 <211> 2384 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAC-NNB-REPA-CIS-ORI-408 construct <220> <221> misc_feature <222> (695)..(696) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (698)..(699) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (701)..(702) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (704)..(705) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (707)..(708) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (710)..(711) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (713)..(714) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (716)..(717) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (719)..(720) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (722)..(723) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (725)..(726) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (728)..(729) <223> n = a, g, c or t <400> 28 cagttgatcg gcgcgagatt taatcgccgc gacaatttgc gacggcgcgt gcagggccag 60 actggaggtg gcaacgccaa tcagcaacga ctgtttgccc gccagttgtt gtgccacgcg 120 gttgggaatg taattcagct ccgccatcgc cgcttccact ttttcccgcg ttttcgcaga 180 aacgtggctg gcctggttca ccacgcggga aacggtctga taagagacac cggcatactc 240 tgcgacatcg tataacgtta ctggtttcac attcaccacc ctgaattgac tctcttccgg 300 gcgctatcat gccataccgc gaaaggtttt gcaccattcg gctagcgatg accctgctga 360 ttggttcgct gaccatttcc ggggtgcgga acggcgttac cagaaactca gaaggttcgt 420 ccaaccaaac cgactctgac ggcagtttac gagagagatg atagggtctg cttcagtaag 480 ccagatgcta cacaattagg cttgtacata ttgtcgttag aacgcggcta caattaatac 540 ataaccttat gtatcataca catacgattt aggtgacact atagaataca agcttactcc 600 ccatccccct gttgacaatt aatcatggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa 660 caatttcaca caggaaacag gatctaccat ggccnnbnnb nnbnnbnnbn nbnnbnnbnn 720 bnnbnnbnnb gggggaggag gatcagcggc cgcaactgat cttcaccaaa cgtattaccg 780 ccaggtaaag aacccgaatc cggtgtttac accccgtgaa ggtgcaggaa cgctgaagtt 840 ctgcgaaaaa ctgatggaaa 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aaacaacctc atcatccagc ttctggtgca tccggccccc 1740 cctgttttcg atacaaaaca cgcctcacag acggggaatt ttgcttatcc acattaaact 1800 gcaagggact tccccataag gttacaaccg ttcatgtcat aaagcgccat ccgccagcgt 1860 tacagggtgc aatgtatctt ttaaacacct gtttatatct cctttaaact acttaattac 1920 attcatttaa aaagaaaacc tattcactgc ctgtcctgtg gacagacaga tatgcacctc 1980 ccaccgcaag cggcgggccc ctaccggagc cgctttagtt acaacactca gacacaacca 2040 ccagaaaaac cccggtccag cgcagaactg aaaccacaaa gcccctccct cataactgaa 2100 aagcggcccc gccccggccc gaagggccgg aacagagtcg cttttaatta tgaatgttgt 2160 aactacttca tcatcgctgt cagtcttctc gctggaagtt ctcagtacac gctcgtaagc 2220 ggccctgacg gcccgctaac gcggagatac gccccgactt cgggtaaacc ctcgtcggga 2280 ccactccgac cgcgcacaga agctctctca tggctgaaag cgggtatggt ctggcagggc 2340 tggggatggg taaggtgaaa tctatcaatc agtaccggct tacg 2384 <210> 29 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 ccccatcccc ctgttgacaa ttaatc 26 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 30 ggtagatcct gtttcctgtg tg 22 <210> 31 <211> 110 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <220> <221> misc_feature <222> (37)..(38) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (40)..(41) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (43)..(44) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (46)..(47) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (49)..(50) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (52)..(53) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (55)..(56) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (58)..(59) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (61)..(62) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (64)..(65) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (67)..(68) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (70)..(71) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (73)..(74) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (76)..(77) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (79)..(80) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (82)..(83) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (85)..(86) <223> n = a, g, c or t <220> <221> misc_feature <222> (88)..(89) <223> n = a, g, c or t <400> 31 acataccgtc atgcggccgc tgatcctcct cccccvnnvn nvnnvnnvnn vnnvnnvnnv 60 nnvnnvnnvn nvnnvnnvnn vnnvnnvnng gccatggtag atcctgtttc 110 <210> 32 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 ctggagatgg catcaagggc cccaactgat cttcaccaaa cgtattacc 49 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 ggcgctatca tgccataccg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 accattcggc tagcgatgac 20 <210> 35 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 ggtgaagatc agttgcggcc gctgatcctc ctc 33 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 gattggttcg ctgaccattt cc 22 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 cggcgttacc agaaactcag a 21 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 aaccgactct gacggcagtt 20 <210> 39 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 39 Cys Gly Cys Pro Thr Met Ala Ala Arg Val Arg Pro Val Leu Asn Ser 1 5 10 15 Lys His <210> 40 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 40 Met Thr Thr Val Pro Val Leu Met Ile Ser Val 1 5 10 <210> 41 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 41 Thr Leu Ser Thr Arg His His Asn Val Ile Asp Arg Phe Asn Leu Arg 1 5 10 15 Asn Phe <210> 42 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 42 Ser Ile Arg Thr Leu Thr Gly Ser Thr Pro Ala Gln Phe Asp Ala Thr 1 5 10 15 Ala Asp <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 43 Ala Asn Leu Trp Arg Ile Val Leu His Gly Trp Trp 1 5 10 <210> 44 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 44 Val Ser Phe Met Leu Leu Gly Pro His Arg His Arg 1 5 10 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 45 Leu Val Leu His Trp Leu Ser Leu Gly Ser Arg 1 5 10 <210> 46 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 46 Ser Asn Gln Val Val Leu Ile Leu His Leu Arg Pro 1 5 10 <210> 47 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 47 Ala Glu Ser Trp Leu His Gln Ser Trp Ile His Leu 1 5 10 <210> 48 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 48 caggaaacag gatctaccat gctgcaggag tcaggacctg ag 42 <210> 49 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 gtttggtgaa gatcagttga tcctcctccc ccccgctcga ggaagatgga tac 53 <210> 50 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 gtatccatct tcctcgagcg ggggggagga ggatcaactg atcttcacca aac 53 <210> 51 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 51 ctcaggtcct gactcctgca gcatggtaga tcctgtttcc tg 42

Claims (44)

1. 각 펩타이드가 이 펩타이드를 암호하는 DNA 작제물에 비공유 결합(non-covalently bound)되어 있는 복수의 펩타이드를 함유한 시험관내 펩타이드 발현 라이브러리의 제조방법으로서,

   (a) (i) DNA 표적 서열;

   (ii) 라이브러리 멤버 펩타이드를 암호하는 DNA; 및

   (iii) 상기 (i)의 DNA 표적 서열에 비공유 결합할 수 있는 펩타이드를 암호하는 DNA

   를 함유하는 DNA 작제물을 제공하되, 이러한 DNA 작제물과 상기 (ii)의 DNA에 의해 암호화된 펩타이드는 시스(cis) 활성을 갖는 것으로 선택되는 단계;

   (b) 상기 단계 (a)에 따라 준비된 복수의 라이브러리 멤버 펩타이드를 암호하는 복수의 DNA 작제물을 무세포(acellular) 환경에서 발현시켜, 발현된 각 펩타이드를 이를 생산한 DNA에 비공유 결합시키는 단계

   를 포함하는, 펩타이드 발현 라이브러리의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, DNA 작제물이 추가로

   (iv) 시스 활성을 유도하는 DNA 인자

   를 포함하는 것이 특징인 제조방법.
3. 제2항에 있어서, 단계 (a)의 DNA 작제물이 추가로

   (v) repA 단백질 중 최소한 C-말단 20개 아미노산을 함유하는 단편을 암호하는 DNA

   를 포함하고,

   상기 (iv)의 DNA 인자가 상기 (ii), (iii) 및 (v)의 DNA에 대해 3' 방향에 위치하는 것이 특징인 제조방법.
4. 제1항에 있어서, 단계 (iii)의 DNA에 의해 암호화된 펩타이드가 (i)의 DNA 표적 서열에 직접 비공유 결합하는 것이 특징인 제조방법.
5. 제4항에 있어서, (iii)의 DNA에 의해 암호화된 펩타이드가 repA 단백질이고 (i)의 DNA 표적 서열이 repA 단백질에 의해 인식되는 복제 기원(ori)인 것이 특징인 제조방법.
6. 제4항에 있어서, (ii)의 DNA가 제한효소 분해 및 결찰에 의해 (i) 및 (iii)의 DNA에 결합되는 것이 특징인 제조방법.
7. 제3항에 있어서, repA가 IncI 복합 플라스미드의 repA, 및 IncF, IncB, IncK, IncZ 및 IncL/M 플라스미드의 repA로 이루어진 군에서 선택되는 것이 특징인 제조방법.
8. 제5항에 있어서, DNA 작제물이 repA를 암호하는 서열, 시스 DNA 인자 및 IncFII 플라스미드 R1의 ori DNA를 포함하는 것이 특징인 제조방법.
9. 제3항에 있어서, repA 단백질은 서열 16의 서열을 포함하고, (iv) 시스 활성을 유도하는 DNA 인자는 서열 17의 서열을 포함하는 것이 특징인 제조방법.
10. 제1항에 있어서, (iii)의 DNA가 암호화하는 펩타이드에 의해 결합되지 않은 DNA에는 비특이적 DNA 결합 단백질이 결합되는 것이 특징인 제조방법.
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20. 제1항에 있어서, DNA가 시험관내 전사 및 해독을 허용하는 프로모터 및 해독 서열의 조절하에 있는 것이 특징인 제조방법.
21. 제1항에 있어서, 라이브러리 멤버 펩타이드가 항체 또는 이의 단편인 것이 특징인 제조방법.
22. 제1항에 있어서, 라이브러리가 적어도 10⁴개의 분자를 포함하는 것인 제조방법.
23. 제1항에 있어서, 발현이 뉴클레아제 활성을 억제하거나 또는 비특이적 DNA-단백질 또는 단백질-단백질 상호작용을 감소시키는 화합물의 존재하에 수행되는 것이 특징인 제조방법.
24. 제1항에 있어서, 발현이 커플링된 박테리아 전사/해독 추출물 시스템(extract system)에서 수행되는 것이 특징인 제조방법.
25. 제24항에 있어서, 커플링된 박테리아 전사/해독 추출물 시스템이 S30 추출물 시스템인 것이 특징인 제조방법.
26. 삭제
27. 제1항 내지 제10항 및 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 제조방법에 따라 생성된 시험관내 펩타이드 발현 라이브러리로부터 원하는 성질을 나타내는 펩타이드의 확인 또는 정제 방법으로서,

    (a) 상기 라이브러리를 선별하는 단계, 및

    (b) 관련 라이브러리 멤버를 선발하고 분리하는 단계

    를 포함하는 것이 특징인, 펩타이드의 확인 또는 정제 방법.
28. 특이적 리간드 결합 펩타이드를 확인하는 방법으로서,

    (a) 제1항 내지 제10항 및 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 제조방법에 따라 생성된 시험관내 펩타이드 발현 라이브러리를, 고체 지지체에 결합되거나 결합되지 않은 리간드 분자를 이용하여 선별하는 단계;

    (b) 이러한 리간드 분자에 결합하는 라이브러리 멤버를 선발하여 분리하는 단계; 및

    (c) 상기 리간드 분자에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 분리하는 단계

    를 포함하는 것이 특징인, 특이적 리간드 결합 펩타이드를 확인하는 방법.
29. 제27항에 있어서, 라이브러리 멤버 펩타이드가 항체 또는 이의 단편인 것이 특징인 방법.
30. (a) 제1항 내지 제10항 및 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 시험관내 발현 라이브러리를 제공하되, (iii)의 DNA에 의해 암호화된 펩타이드는 DNA 결합 활성이 있는 라이브러리 멤버 펩타이드이고 (i)의 DNA 표적 서열은 목적 표적 서열인 것인 단계;

    (b) 암호화된 단백질이 상기 표적 서열에 결합하는 라이브러리 멤버를 선발하여 분리하는 단계; 및

    (c) 상기 표적 서열에 결합하는 펩타이드를 분리하는 단계

    를 포함하는, 특정 DNA 표적 서열에 결합하는 성질이 있는 펩타이드의 확인 및/또는 정제 방법.
31. 제30항에 있어서, 라이브러리 멤버 펩타이드가 아연 핑거 단백질, 나선-루프-나선 단백질 또는 나선-턴-나선 단백질인 것이 특징인 방법.
32. 제27항에 있어서, 선별 및/또는 선발 단계가 뉴클레아제 활성을 억제하거나 비특이적 DNA-단백질 또는 단백질-단백질 상호작용을 감소시키는 화합물의 존재하에 수행되는 것이 특징인 방법.
33. 제32항에 있어서, 화합물이 헤파린인 것이 특징인 방법.
34. 제27항에 있어서, 분리된 펩타이드를 발현하는 DNA를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
35. 제34항에 있어서, DNA를 발현 벡터에 클로닝하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
36. 제35항에 있어서, 발현 벡터를 시험관내에서 세포 내로 도입시키는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
37. 제35항에 있어서, DNA에 의해 암호화된 펩타이드를 발현시키는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
38. 제1항 내지 제10항 및 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기재된 제조방법에 따라 생성된 시험관내 펩타이드 발현 라이브러리.
39. 제1항 내지 제10항 및 제20항 내지 제25항 중 어느 한 항에 기술된 바와 같은 DNA 작제물.
40. 제28항에 있어서, 라이브러리 멤버 펩타이드가 항체 또는 이의 단편인 것이 특징인 방법.
41. 제28항에 있어서, 선별 및/또는 선발 단계가 뉴클레아제 활성을 억제하거나 비특이적 DNA-단백질 또는 단백질-단백질 상호작용을 감소시키는 화합물의 존재하에 수행되는 것이 특징인 방법.
42. 제30항에 있어서, 선발하여 분리하는 단계가 뉴클레아제 활성을 억제하거나 비특이적 DNA-단백질 또는 단백질-단백질 상호작용을 감소시키는 화합물의 존재하에 수행되는 것이 특징인 방법.
43. 제28항에 있어서, 상기 분리된 펩타이드를 발현하는 DNA를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.
44. 제30항에 있어서, 상기 분리된 펩타이드를 발현하는 DNA를 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것이 특징인 방법.

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