CN107708720A - 含有从头结合结构域的多肽及其用途 - Google Patents

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Atchley Kors Ltd By Share Ltd
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Abstract

本文提供了特异性结合目的靶的含有从头结合结构域的多肽(DBDpp)。还提供了编码DBDpp的核酸，以及含有该核酸的载体和宿主细胞。还包括DBDpp的文库、生产和筛选此类文库的方法以及从此类文库和筛选中鉴定的DBDpp。另外提供了制备DBDpp的方法及其用途。此类用途包括但不限于亲和纯化以及诊断和治疗应用。

Description

含有从头结合结构域的多肽及其用途
相关案例
本申请要求于2015年4月6日提交的美国临时申请序列号62/143,772的优先权，其全部内容通过引用并入本文。本文提及的所有参考文献，专利和专利申请均通过引用整体并入本文。
关于序列表
本申请以电子格式提交，并附有序列表。序列表是作为名为ENC002WO2SEQUENCELISTING.TXT的文件提供的，其创建于2016年4月4日，并且其文件大小为144千字节。序列表中的信息通过引用整体并入本文。
背景
基于抗体的试剂已经加快了生物研究和发展的步伐。抗体组合物代表了制药工业中使用的最重要和成功的治疗剂和诊断剂类别之一。然而，成本，时间和效力已经促使开发替代亲和试剂。
已经出现了多种非抗体结合形式用于历史上由抗体提供的应用。尽管已经报道了非结构化的线性肽的许多成功，但是通过对肽序列施加结构约束(通常通过引入二硫键)已经获得了更稳健的结果。该约束通过固定形状的互补性和可能被掩埋并且因此不面向靶的残基(例如疏水性氨基酸)的表面呈现的更有利的热力学来提供更高的亲和力和更高的特异性(Ladner，Trends in Biotech.13(10):426-430，1995)。相反，含有二硫键的形式通常倾向于半胱氨酸的结构域内或结构域间的不恰当配对，其可能导致较低的表达，产物产量和产物质量。
在蛋白质子结构域中发现的结构已经提供了结构约束的另一个来源。已经开发了针对各种不同靶点的抗体样亲和力的结构，例如III型纤连蛋白重复(adnectin)，z-蛋白质(亲和体)，knottin，脂质运载蛋白(anticalin)和锚蛋白重复序列(DARPin)(Hey et al.，Trends in Biotech.23(10):514-422，2005)。这些结构域通常包含与抗体可变结构域中发现的框架和互补决定区(CDR)类似的两个特征：提供高热力学稳定性的结构支架和形成展示库变异性的基础的残基或环。
概述
一般而言，对于新的结合靶的试剂和组合物，特别是对于含有替代结合支架(例如非抗体支架)的此类试剂，仍然存在大量的未满足的需求。在若干实施方案中，特定目的试剂可以通过例如与抗体相比显著降低生产成本和/或可媲美的或优越的试剂，诊断和/或治疗特性来表征。本公开在若干实施方案中提供了这样的期望的试剂。例如，在若干实施方案中，本公开提供了特征在于高靶结合亲和力和特征在于非抗体结构支架的某些多肽试剂。备选地或另外地，在若干实施方案中，例如由本文公开的生产方法产生的结合靶的试剂(例如本文公开的多肽)具有包括例如高度靶特异性结合的优点。在一些实施方案中，这能够有利地用于将治疗剂(例如免疫细胞)靶向特定细胞(例如患病细胞)，从而减少或消除脱靶(off-target)效应。在一些实施方案中，本文提供的试剂例如靶特异性多肽可以用作蛋白质治疗剂以结合疾病中涉及的细胞或可溶性因子。在一些实施方案中，所提供的试剂可以用于以高度特异性纯化靶(例如蛋白质或其他靶)，这可以例如导致更高纯度和/或减少用于纯化靶的下游处理。
本文公开的本发明的若干实施方案涉及特异性结合目的靶的试剂，例如本文公开的含有从头结合结构域(de novo binding domain，DBD)的多肽(DBDpp)。还提供了编码DBDpp的核酸和含有该核酸的载体和宿主细胞，以及DBDpp文库和用于产生和筛选这样的文库的方法以及从这样的文库和/或筛选鉴定的DBDpp。还提供了包括DBDpp的DBDpp融合蛋白，以及制备DBDpp的方法和DBDpp的用途。此类用途的非限制性实例包括但不限于亲和纯化，靶分析，诊断和/或治疗应用。
在若干实施方案中，提供了以高度特异性结合目的靶的结合剂。在若干实施方案中，结合剂是非抗体剂。在若干实施方案中，结合剂是多肽。在若干实施方案中，提供了用于结合具有与SEQ ID NO:1的序列至少在一个位置不同的序列的目的靶的多肽。在若干这样的实施方案中，试剂(例如多肽)表现出与目的靶的特异性结合，该结合强于根据SEQ IDNO:1的多肽与目的靶的结合。在若干实施方案中，提供了用于结合目的靶的多肽，该多肽包含氨基酸序列，氨基酸序列包含MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:4)，其中该序列在序列上与SEQID NO:1的序列不同(例如，通过修饰SEQ ID NO:1的氨基酸序列)。在若干实施方案中，该多肽特异性结合目的靶(例如癌症标志物或与目的靶相关的其他特殊标志物)，并且多肽与目的靶的特异性结合强于根据到SEQ ID NO:1与目的靶的结合。在若干实施方案中，该多肽不含有SEQ ID NO:50的序列。
在若干实施方案中，多肽具有不同于SEQ ID NO:1的序列，因为某些选择的氨基酸位置已被修饰。在一些实施方案中，修饰包含置换。在若干实施方案中，置换是保守置换，而在一些实施方案中，置换是非保守置换。在其他实施方案中，使用保守和非保守置换的组合。在一些实施方案中，置换不包括用半胱氨酸置换(例如，不向序列添加半胱氨酸)。在一些实施方案中，其中置换不包括用脯氨酸置换(例如，不向序列添加脯氨酸)。在一些实施方案中，半胱氨酸和脯氨酸都不被置换到多肽的序列中。
本文公开的试剂可以结合各种目的靶。例如，在若干实施方案中，多肽特异性结合的目的靶是癌症抗原。在一些实施方案中，多肽特异性结合的癌症抗原是PD-L1。在若干这样的实施方案中，结合靶的多肽包含选自SEQ ID NO:38，SEQ ID NO:39，SEQ ID NO:40，SEQID NO:41，SEQ ID NO:42，SEQ ID NO:43，SEQ ID NO:44的氨基酸序列或基本上由其组成。在一些实施方案中，多肽特异性结合的癌症抗原是CD137。在一些这样的实施方案中，多肽包含选自SEQ ID NO:12，SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14，SEQ ID NO:15，SEQ ID NO:16，SEQID NO:17，SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:19的氨基酸序列或基本上由其组成。在一些实施方案中，多肽特异性结合的癌症抗原是CD123。在一些这样的实施方案中，多肽包含选自SEQID NOS：92-127的氨基酸序列或基本上由其组成。在一些实施方案中，例如通过偶联或以其他方式组合各种结合靶的多肽来靶向癌症抗原的组合。在一些实施方案中，靶向两种，三种，四种或更多种不同的癌症抗原。在一些实施方案中，多个结合靶的多肽用于增强结合单个靶(例如二聚体，三聚体等)的能力和/或容量。
在若干实施方案中另外提供了用于将参考多肽转化成具有与目的靶特异性结合的多肽的方法，该方法包括修饰来自参考多肽的多个氨基酸残基以产生多个候选结合多肽，在多个载体中包装多个候选结合多肽中以产生候选文库，并且筛选候选文库以寻找与目的靶特异性结合的候选结合多肽。在若干实施方案中，参考多肽包含非天然存在的多肽的变体并且包含通过接头肽连接的三个反向平行的α螺旋。在若干实施方案中，待修饰的氨基酸残基是溶剂可及的或溶剂不可及的氨基酸。在若干实施方案中，更大程度的溶剂可及氨基酸被修饰，而在一些实施方案中，更大程度的溶剂不可及的氨基酸被修饰。在一些实施方案中，修饰包含氨基酸置换。如上所讨论的，置换可以包括保守氨基酸置换，非保守氨基酸置换，和/或其组合。任选地，在若干实施方案中，置换不包括半胱氨酸的置换，不包含置换脯氨酸，并且在一些情况下不包含半胱氨酸或脯氨酸的置换。
在若干实施方案中，方法进一步包括鉴定候选结合多肽中的潜在免疫原性氨基酸残基并修饰至少一个潜在免疫原性氨基酸残基(例如，以降低结合目的靶的所得多肽的潜在免疫原性)。在若干实施方案中，降低免疫原性的修饰包括氨基酸置换(例如，保守和/或非保守置换)。
在若干实施方案中，提供了包含三个反平行α螺旋或基本上由其组成的从头结合结构域多肽(DBDpp)，DBDpp是合成多肽的变体，其中DBDpp免疫特异性结合与CD123至少95％相同的蛋白。在若干实施方案中，DBDpp具有约10-4M至约10-12M的解离常数(KD)。在一些实施方案中，DBDpp免疫特异性结合的靶包含CD123(SEQ ID NO:187)的氨基酸19-305。本文还提供了具有氨基酸序列MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:4)的DBDpp，并且其中Xn是天然或非天然氨基酸。此外，还提供了具有与SEQ ID NO:60至SEQ ID NO:136中的任何一个的氨基酸序列至少85％相同的氨基酸序列的DBDpp。另外的实施方案提供了融合蛋白，其结合CD123(或本文公开的其它目的靶)，并且还包含一个或多个显示对肿瘤靶的结合特异性的另外的DBDpp。
在若干实施方案中，靶结合剂(例如，对目的靶具有特异性的多肽)被标记。取决于实施方案，可以使用各种标记，包括但不限于酶标记，荧光标记，发光标记和生物发光标记。在一些实施方案中，标记是生物素部分。在若干实施方案中，可以使用链霉抗生物素蛋白部分。在一些实施方案中，使用His-标签，FLAG-标签或其他标签。在一些实施方案中，标签是萤光素酶，绿色荧光蛋白，红色荧光蛋白或其他类似的试剂。
在若干实施方案中，靶结合剂(例如多肽)与治疗剂或细胞毒性剂(例如化学治疗剂，放射治疗剂等)缀合。取决于实施方案，靶结合剂可以任选地包含药学上可接受的载体。
在若干实施方案中，提供了包含本文公开的任何靶结合剂的试剂盒(例如，治疗试剂盒，诊断试剂盒，用于研究用途的试剂盒等)。
若干实施方案还提供了编码本文公开的任何结合靶的多肽的分离的核酸分子。另外的实施方案提供了含有分离的核酸分子的载体(例如，质粒，病毒载体或非病毒载体)。若干这样的实施方案还可以包括用于表达由核酸编码的蛋白质的标准组分(例如启动子，包装组分等)。例如，在若干实施方案中，载体还包含调节由核酸分子编码的多肽的表达的另外的核苷酸序列。在若干实施方案中，另外的核酸序列是诱导型启动子。
在若干实施方案中进一步提供了包含编码本文公开的任何结合靶的多肽的核酸分子的宿主细胞。在这样的实施方案的若干实施方案中，工程改造宿主细胞(例如细胞系)以表达本文公开的结合靶的多肽。在一些实施方案中，宿主细胞表达结合靶的多肽允许产生和分离结合靶的多肽。在一些实施方案中，表达得到在细胞表面上表达和/或与细胞膜整合的结合靶的多肽。
本文还提供了与本文公开的多肽竞争结合CD123(或其他目的靶)的从头结合结构域多肽(DBDpp)。在若干实施方案中，还提供了与本文公开的多肽竞争结合其他目的靶(包括CD123，PD-L1，CD19，CD22等(或本文公开的其它靶))的多肽。提供的竞争者包括全部或部分激动剂，全部或部分拮抗剂等。可以通过竞争性结合测定鉴定那些竞争结合目的靶(或者与相同的表位，重叠的表位或者导致与目的靶结合的试剂的空间位阻或其它阻碍的非重叠的表位结合)的试剂。
本文还提供结合肿瘤的多肽(单独或由细胞表达)。在若干实施方案中，结合基于已经产生并鉴定为对由肿瘤表达的一种或多种标志物具有特异性结合的多肽。取决于实施方案，肿瘤可以是悬浮肿瘤或实体瘤。
若干实施方案还提供了嵌合抗原受体(CAR)，其中CAR包含靶向结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在若干实施方案中，靶向结构域至少部分由本文公开的结合靶的多肽构成。在若干实施方案中，细胞内信号传导结构域选自人CD3ζ结构域，41BB结构域，CD28结构域及其任意组合。取决于实施方案，共刺激信号传导区包含选自CD27，CD28，4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，与CD83特异性结合的配体及其任意组合的共刺激分子的细胞内结构域。在若干实施方案中，CAR包含包括另外的结合靶的多肽的融合蛋白。还提供了编码CAR的分离的核酸序列，其包括结合靶的多肽作为靶向区的部分(或全部)。
本文进一步提供了包含编码CAR的核酸序列的细胞，其中CAR包含由至少部分由结合目的靶的多肽构成的抗原结合结构域，跨膜结构域，和信号传导结构域。在一些实施方案中，多肽与肿瘤抗原特异性结合(并且因此起到将表达CAR的细胞递送至肿瘤的作用)。在若干实施方案中，肿瘤抗原与血液恶性肿瘤相关。在另外的实施方案中，肿瘤抗原与实体瘤相关。在一些实施方案中可以同时靶向实体瘤和血液肿瘤二者。在若干实施方案中，肿瘤抗原选自CD137，PD-L1，CD123，CTLA4，CD47，KIR，DR5，TIM3，PD1，EGFR，TCR，CD19，CD20，CD22，ROR1，间皮素，CD33/lL3Ra，cMet，PSMA，糖脂F77，EGFRvIII，GD2，NY-ESO-1，MAGE A3及其组合。取决于实施方案，表达CAR的细胞可以是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。在若干实施方案中，当多肽结合其相应的肿瘤时，细胞(无论T细胞，NK细胞还是其他细胞类型)表现出抗肿瘤免疫。
另外的实施方案提供了具有SEQ ID NO:4的序列的氨基酸，其中Xn不是半胱氨酸或脯氨酸。
在若干实施方案中还提供了产生膜结合病毒样颗粒(VLP)的哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞被工程改造以表达融合蛋白，融合蛋白包含与嵌合抗原受体(CAR)融合的从头结合结构域多肽(DBDpp)，融合蛋白在所产生的VLP(例如作为跨膜蛋白)上表达。取决于实施方案，由哺乳动物细胞产生的VLP适合用作用于抗体产生的免疫原。在一些这样的实施方案中，抗体针对从头结合结构域多肽(DBDpp)(例如，抗体结合DBDpp并且能够用于检测DBDpp，分离DBDpp等)。
本文公开的结合靶的多肽也可用于治疗背景下，例如用于治疗和/或诊断疾病，例如癌症(例如，实体瘤或血液恶性肿瘤)。因此，在一些实施方案中，提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用包含嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中CAR包含靶结合结构域，跨膜结构域和细胞内结构域(包含信号传导结构域)，其中靶结合结构域包含多肽，多肽具有氨基酸序列，氨基酸序列包含：MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:4)。在向患有癌症的受试者施用后，靶结合结构域特异性结合癌细胞表达的目的靶，并且目的靶的结合诱导免疫细胞产生细胞毒性信号，导致对癌细胞的细胞毒作用从而治疗癌症。在若干实施方案中，多肽具有不同于SEQ ID NO:1的序列(例如，多肽通过修饰SEQ ID NO:1的氨基酸序列产生)。作为不同序列的结果，多肽与目的靶的特异性结合强于根据SEQ ID NO:1的多肽与目的靶的结合。
取决于实施方案，免疫细胞可以是T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是NK细胞。其他免疫细胞和/或不同免疫细胞类型的组合可以任选使用。在一些实施方案中，细胞类型(例如NK细胞和T细胞)的组合是有利的，因为它们协同作用治疗癌症。当使用组合时，各种细胞类型能够靶向相同或不同(或重叠)的肿瘤抗原。
在其中使用T细胞的若干实施方案中，目的靶的结合刺激T细胞启动细胞内信号传导，产生细胞因子，并且脱颗粒，导致对癌细胞的细胞毒作用。另外，在若干实施方案中，T细胞响应于结合目的靶而增殖。然而，有利的是，T细胞的活性不会导致T细胞表现出与T细胞耗竭相关的表型。在其中使用T细胞的若干实施方案中，CAR的跨膜结构域包含41BB或CD28，细胞质结构域包含T细胞受体的α，β或ζ链。
在其中使用NK细胞的若干实施方案中，跨膜结构域包含CD28，并且细胞质结构域包含T细胞受体的ζ链。
在若干实施方案中，将含有CAR的免疫细胞设计成与由癌细胞表达的目的靶(例如选自CD137，PD-L1，CD123，CTLA4，CD47，KIR，DR5，TIM3，PD1，EGFR，TCR，CD19，CD20，CD22，ROR1，间皮素，CD33/lL3Ra，cMet，PSMA，糖脂F77，EGFRvIII，GD2，NY-ESO-1，MAGE A3及其组合的肿瘤抗原)结合。
在若干实施方案中，CAR进一步包含具有SEQ ID NO:4的氨基酸的第二多肽，该多肽能够特异性结合由癌细胞表达的第二目的靶，并且其中第二多肽与第二目的靶的特异性结合强于根据SEQ ID NO:1的多肽与第二目的靶的结合。在若干实施方案中，构成CAR的靶向结构域的至少一部分的多肽的产生不包括将半胱氨酸或脯氨酸置换到SEQ ID NO:1中。
在若干实施方案中，施用CAR的免疫细胞是静脉内的，但是对于给定的治疗方案，可以使用其他途径，例如动脉内，肌内，局部或其他可接受的途径。
在若干实施方案中，还提供了治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者施用包含嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中CAR包含靶结合结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，其中靶结合结构域包含具有选自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽，其中没有半胱氨酸或脯氨酸残基被置换到SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的任一个中，其中多肽特异性结合由癌细胞表达的目的靶，并且其中多肽与目的靶的特异性结合强于根据SEQ ID NO:1的多肽与目的靶的结合，其中细胞内结构域包含信号传导结构域，其中在向患有癌症的受试者施用后，靶结合结构域特异性结合由癌细胞表达的目的靶，并且其中目的靶的结合诱导免疫细胞产生细胞毒性信号，其导致对癌细胞的细胞毒作用，从而治疗癌症。如上所讨论的，取决于实施方案，免疫细胞可以是T细胞，NK细胞或其他类型的免疫细胞(或各种类型的组合)。在一个实施方案中，跨膜结构域包含41BB或CD28，其中细胞质结构域包含T细胞受体的α，β或ζ链，并且其中免疫细胞是T细胞。在一些这样的实施方案中，结合目的靶后，T细胞被刺激以启动细胞内信号传导，产生细胞因子，增殖和脱颗粒，导致对癌细胞的细胞毒作用，而T细胞不表现出与T细胞耗竭相关的表型。
进一步的实施方案提供治疗患有癌症的受试者的方法，该方法包括向受试者静脉内施用包含在T细胞上表达的嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞，其中CAR包含靶结合结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，靶结合结构域包含具有包含氨基酸序列的多肽，所述多肽包含具有SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的氨基酸序列，然而没有半胱氨酸或脯氨酸残基被置换到SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6中的任一个中，所述多肽能够以大于根据SEQ ID NO:1的多肽与目的靶的结合更大的与目的靶的结合而特异性结合由癌细胞表达的目的靶，跨膜结构域选自41BB和CD28，其中细胞内结构域包含选自T细胞受体的α，β或ζ链的信号传导结构域，其中在向患有癌症的受试者施用后，靶结合结构域特异性结合由癌细胞表达的目的靶，并且其中目的靶的结合诱导T细胞产生对癌细胞产生细胞毒作用的细胞毒性信号。在若干实施方案中，细胞毒作用是由T细胞脱颗粒所导致的。有利地，在若干实施方案中，T细胞的激活和细胞毒性活性与表现出与T细胞耗竭相关联的表型的T细胞不相关。在若干实施方案中，CAR任选进一步包含第二靶结合结构域，其包含具有与靶结合结构域不同的靶的第二多肽。在更进一步的实施方案中，可以任选地包括另外的靶向结构域以增强对标志物的结合容量，或赋予对其他标志物的结合特异性。
另外在若干实施方案中提供的是包含嵌合抗原受体(CAR)的免疫细胞用于治疗癌症的用途，其中CAR包含靶结合结构域，跨膜结构域和细胞内结构域，靶结合结构域包含具有包含氨基酸序列的多肽，所述多肽具有选自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列，其中没有半胱氨酸或脯氨酸残基被置换到SEQID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的任何一个中，其中多肽特异性结合由癌细胞表达的目的靶，并且其中多肽与目的靶的特异性结合强于根据SEQID NO:1的多肽与目的靶的结合，跨膜结构域选自41BB和CD28，其中细胞内结构域包含选自T细胞受体的α，β，或ζ链信号传导结构域，其中在向患有癌症的受试者施用后，靶结合结构域特异性结合由癌细胞表达的目的靶，并且其中目的靶的结合诱导免疫细胞产生对癌细胞产生细胞毒作用的细胞毒性信号。取决于实施方案，免疫细胞可以是T细胞或自然杀伤(NK)细胞。
除了结合结构域组合物之外，还提供了用于产生，筛选和使用其的方法，还提供了用于纯化目的靶的方法。因此，在若干实施方案中，本文提供了用于纯化目的靶的方法，包括使包含目的靶的样品与包含附着于固体支持物的多肽试剂的组合物接触，其中多肽试剂具有氨基酸序列，氨基酸序列包含MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:4)，其中多肽具有不同于SEQID NO:1的氨基酸序列，其中多肽特异性结合目的靶，其中多肽与目的靶的特异性结合强于根据SEQ ID NO:1与目的靶的结合，在允许组合物与目的靶结合的条件下进行接触，并除去未与组合物结合的一部分样品。在若干实施方案中，该方法进一步包括从目的靶解离组合物并回收目的靶。在若干实施方案中，目的靶可从组合物中洗脱，从而纯化(全部或部分)目的靶。
取决于实施方案，固体支持物可以是珠，载玻片，芯片，明胶或琼脂糖。支持物的组合可以用在某些实施方案中。在若干实施方案中，多肽试剂通过非共价缔合与固体支持物偶联，而在其他实施方案中，多肽试剂通过共价键合与固体支持物偶联。取决于实施方案，也可以使用共价和非共价缔合的组合的载体和目的靶。
在若干实施方案中，组合物的多肽试剂还包含肽标签，其中肽标签包含六组氨酸部分或FLAG标签。在一些实施方案中，组合物的多肽试剂还包含链霉抗生物素蛋白部分。取决于实施方案，可以使用其他类型的标签，例如酶，比色，生物发光和/或荧光标签。
在一些实施方案中，固体支持物包含珠，并且组合物适合用于亲和色谱以纯化目的靶。
在若干实施方案中，将编码多肽的核酸分子包装在用于转导细胞系以使细胞系表达多肽的表达载体中。这样的实施方方案允许以更大规模生产多肽用于蛋白质纯化。
在若干实施方案中还提供了用于纯化目的靶的方法，包括使包含目的靶的样品与包含与固体支持物偶联的病毒样颗粒的组合物接触，其中病毒样颗粒表达作为膜蛋白的多肽，多肽具有选自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列，其中多肽具有不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中多肽特异性结合目的靶，其中多肽与目的靶的特异性结合强于根据SEQ ID NO:1与目的靶的结合；并且在允许组合物与目的靶结合的条件下进行接触；并除去未与组合物结合的一部分样品。在若干实施方案中，其中产生多肽时，没有半胱氨酸或脯氨酸残基被置换到SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的任一个中。
在若干实施方案中，固体支持物包含珠，载玻片，芯片，明胶或琼脂糖中的一种或多种。在若干实施方案中，组合物的多肽进一步包含肽标签，其中肽标签包含六组氨酸部分或FLAG标签。如本文所讨论的，在其他实施方案中可以使用其他类型的标签。
在一些实施方案中，丢弃未与组合物结合的部分样品。在一些实施方案中，未与组合物结合的部分样品与组合物第二次接触以捕获额外的目的靶，从而提高纯化的总产率。
在若干实施方案中，方法进一步包括将未与组合物结合的样品部分与针对组合物的多肽的抗体接触，将由表达从哺乳动物细胞释放多肽的膜结合病毒样颗粒(VLP)产生的抗体工程改造以表达包含与嵌合抗原受体(CAR)融合的多肽的融合蛋白，融合蛋白在产生的VLP上表达，其中抗体适用于检测从固体支持物分离的残留多肽的测定。
不仅提供了用于纯化靶的方法(例如，从更大的样品中去除靶)，但是若干实施方案提供了用于从包含目的靶的样品去除一种或多种污染物的方法，该方法包括使包含目的靶的样品与包含与固体支持物偶联的病毒样颗粒的组合物接触，其中病毒样颗粒将多肽作为膜蛋白表达，多肽具有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6，其中没有半胱氨酸或脯氨酸残基被置换到SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的任一个中，其中多肽具有不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中多肽特异性结合待从包含目的靶的样品中去除的一种或多种污染物，其中多肽与一种或多种污染物的特异性结合强于根据SEQ ID NO:1的多肽与一种或多种污染物的结合；在允许组合物与一种或多种污染物结合的条件下进行接触；并收集未与组合物结合的一部分样品。如上所讨论的，在一些实施方案中，组合物的多肽还包含标签，如肽标签。在若干实施方案中，肽标签包含六组氨酸部分或FLAG标签。取决于实施方案，固体支持物可以包含珠，载玻片，芯片，明胶或琼脂糖，并且病毒样颗粒通过非共价缔合与固体支持物偶联。在一些实施方案中，所收集的样品部分第二次与组合物接触以从样品中除去额外的污染物。
本文还提供了用于蛋白质纯化的组合物。在若干实施方案中，提供了包含多肽试剂的亲和树脂，多肽试剂具有包含选自以下的序列的氨基酸序列：
以及其组合，并且其中氨基酸序列不是SEQ ID NO:1。
在以上列出的任何序列中，任何X位(例如“Xn”)可以是天然或非天然氨基酸；其中每个Xn是相同或不同的天然或非天然氨基酸。另外，在若干实施方案中，Z1和/或Z2可以包含约2至约30个天然或非天然氨基酸。
在若干实施方案中，多肽试剂具有通过在一个或多个残基处的氨基酸置换而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列。取决于实施方案，在一个或多个残基处的氨基酸置换可以包含保守置换或非保守置换。在若干实施方案中，也可以使用保守和非保守置换的组合。另外，在若干实施方案中，在一个或多个残基处的氨基酸置换包含在溶剂可及的残基处的置换。在一些实施方案中，在一个或多个残基处的氨基酸置换包括在溶剂不可及的残基处的置换。在一些实施方案中，可任选在溶剂可及的和溶剂不可及的残基处进行置换(无论是保守的还是非保守的)。在若干实施方案中，多肽试剂具有通过在一个或多个残基上的氨基酸缺失而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
在若干实施方案中，提供了一种制备亲和树脂的方法，该方法包括将具有包含选自以下的序列的氨基酸序列的多肽试剂附着到固体支持物：
以及其组合，并且其中氨基酸序列不是SEQ ID NO:1。在若干实施方案中，序列的X位(例如“Xn”)可以包含天然或非天然氨基酸；其中每个Xn是相同或不同的天然或非天然氨基酸；和/或其中Z1和/或Z2是2至30个天然或非天然氨基酸。在若干实施方案中，多肽试剂通过共价键合，非共价缔合或其组合附着到固体支持物。在若干实施方案中，固体支持物包含珠，载玻片，芯片，明胶或琼脂糖中的一种或多种。
在若干实施方案中，进一步提供了用于蛋白质纯化的组合物，其包含与多肽试剂偶联的固体支持物，多肽试剂具有包含选自以下的序列的氨基酸序列：
以及其组合，其中氨基酸序列不是SEQ ID NO:1。在若干实施方案中，Xn是天然或非天然氨基酸；其中每个Xn是相同或不同的天然或非天然氨基酸；和/或Z1和/或Z2是2至30个天然或非天然氨基酸。在若干实施方案中，多肽试剂具有通过在一个或多个残基处的氨基酸置换而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
取决于实施方案，在一个或多个残基处的氨基酸置换可以包含保守置换或可以包含非保守置换。在某些实施方案中，也可以使用保守和非保守置换的组合。在若干实施方案中，在一个或多个残基处的氨基酸置换包含在溶剂可及残基处的置换。在若干实施方案中，在一个或多个残基处的氨基酸置换包含在溶剂不可及的残基处的置换。一些实施方案在溶剂可及和不可及的残基处都使用置换。在若干实施方案中，多肽试剂具有通过在一个或多个残基上的氨基酸缺失而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列。取决于实施方案，固体支持物可包含珠，载玻片，芯片，明胶或琼脂糖中的一种或多种。
在若干实施方案中，本文公开的多肽能够用于蛋白质分析，例如作为可检测试剂或标签的功能。如此，在一些实施方案中，本文提供了包含缀合至可检测试剂和/或标签的多肽试剂的组合物，其中多肽试剂具有包含选自以下的序列的氨基酸序列： 以及其组合，其中氨基酸序列不是SEQ ID NO:1。在若干实施方案中，Xn是天然或非天然氨基酸；其中每个Xn是相同或不同的天然或非天然氨基酸；和/或其中Z1和/或Z2是2至30个天然或非天然氨基酸。
在若干实施方案中，可检测试剂包含发色团。在若干实施方案中，可检测试剂包含荧光染料。在若干实施方案中，可检测试剂包含放射性核素。在这样的实施方案中，可检测试剂是能够定量的。
在组合物的若干实施方案中，多肽试剂缀合至色谱珠，树脂，载玻片，芯片，明胶或琼脂糖。在若干实施方案中，标签包含多组氨酸标签，myc标签或FLAG标签。标签的组合也可以在若干实施方案中使用。在若干实施方案中，多肽试剂通过共价结合缀合至可检测试剂或标签。在组合物的若干实施方案中，多肽试剂是融合蛋白。在若干实施方案中，多肽试剂是多聚体的。
提供了特异性结合目的靶的含有从头结合结构域(DBD)的多肽(DBDpp)，以及编码所提供的DBDpp的核酸，含有核酸的载体和含有核酸和载体的宿主细胞。还提供了DBDpp文库，用于产生和筛选此类文库的方法以及从此类文库和筛选中鉴定的DBDpp。也提供DBDpp如DBDpp融合蛋白，以及制备DBDpp的方法和DBDpp的用途。这样的用途包括但不限于亲和纯化，以及诊断和治疗应用。
在一个实施方案中，提供了其氨基酸序列与具有SEQ ID NO:1的序列的参考支架不同(例如，由于氨基酸修饰)的DBDpp。参考支架是最初改造为蛋白质折叠练习的非天然存在的和无靶向的(例如，申请人所知，目前没有已知靶)反平行三螺旋束参考多肽的变体(参见Walsh et al.，PNAS 96:5486–5491(1999)，其全部内容通过引用并入本文)。已经在若干实施方案中发现并公开了含有具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的无靶参考支架的修饰的多肽能够特异性地结合目的靶。尽管不希望受理论束缚，但据信在设计DBD中，表面暴露残基(其能够被修饰)的结构约束赋予表面暴露残基特异性结合目的靶的能力。
在一个实施方案中，DBDpp试剂包含其氨基酸序列显示与SEQ ID NO:1的同源性但通过修饰一个或多个氨基酸而不同于SEQ ID NO:1的多肽。根据若干实施方案，本文提供的靶结合剂(例如DBDpp)特异性结合目的靶(例如与癌症或肿瘤相关的标志物，诸如CD123，CD137，PD-L1，CD19，CD22，NY-ESO，MAGE A3，作为非限制性实施方案)。在若干实施方案中，提供的靶结合剂(例如DBDpp)包含总计5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个与SEQ ID NO:1相比已被修饰的氨基酸残基；并且其中试剂特异性结合目的靶。在另一个实施方案中，修饰的氨基酸残基中的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个是置换。在另一个实施方案中，修饰的氨基酸残基中的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个是保守置换。在另一个实施方案中，修饰的氨基酸残基中的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个是非保守置换。在另一个实施方案中，氨基酸残基修饰中的5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个为保守置换，氨基酸残基修饰中的5至15个，5至20个，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个是非保守置换。在另外的实施方案中，置换中的1至25，1至30，1至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个位于SEQ ID NO:1的选自M1，G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，L21，G22，G23，S24，E25，A26，E27，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，Y45，K46，G47，K48，G49，N50，P51，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69，Y70，R71，H72和N73的氨基酸残基。在进一步的实施方案中，置换中的1至20，1至30或1至40个位于SEQID NO:1的选自G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69和Y70的氨基酸残基。在任选的进一步的实施方案中，DBDpp任选进一步包含氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的溶剂不可及残基的残基中的1至5，1至10，1至15，5至10或5至15个被置换，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在若干实施方案中，DBDpp包含这样的氨基酸序列，其中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的溶剂可及或溶剂不可及残基的残基中的约1至约5，约1至约10，约1至约15，约5至约10，约5至约15(或更多)被置换。在若干实施方案中，与仅有可及或仅有不可及残基的置换相比，可及和不可及残基都置换赋予更高程度的靶特异性。在另一个任选的实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的溶剂不可及残基的置换残基选自：F7，L11，I14，L18，L28，F31，I35，F38，L42，V53，L56，A60，I63和L67和Y70。在另外的实施方案中，L21和Y45也包括在置换的溶剂不可及的残基组中。在另外的实施方案中，DBDpp是融合蛋白(例如，DBDpp与另一种分子如治疗剂或诊断剂直接或间接融合，缀合或其它方式缔合，)。在一个实施方案中，DBDpp附着到固体支持物上。在另一个实施方案中，固体支持物选自：珠，载玻片，芯片，明胶和琼脂糖。在另外的实施方案中，DBDpp特异性结合选自核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子的目的靶。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，肿瘤特异性抗原(TSA)，癌症特异性抗原(CSA)和含有肽标签的蛋白质。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。还提供了编码DBDpp的核酸和含有核酸的载体。还提供了含有核酸和载体的宿主细胞(包括病毒颗粒)。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另外的实施方案中，宿主细胞是在其表面展示DBDpp的原核生物或真核生物。在进一步的实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在进一步的实施方案中，宿主细胞是在其表面上表达DBDpp融合蛋白的人免疫细胞。还提供了包含多个DBDpp的文库。
在一个实施方案中，DBDpp包含选自以下的氨基酸序列：(a)MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:4)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X55，X58，X59，X62，X65和/或X66是天然和/或非天然氨基酸残基；(b)MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO:2)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X30，X33，X34，X37，X40，X41和/或X44是天然和/或非天然氨基酸残基；(c)MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX3 9X40ELX43AYKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:3)，其中X32，X33，X36，X39，X40，X43，X57，X58，X61，X64，X65和/或X68是天然和/或非天然氨基酸残基，以及；(d)MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEX55LRX58X59AA X62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:5)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X32，X33，X36，X39，X40，X43，X55，X58，X59，X62，X65和/或X66是天然和/或非天然氨基酸残基；和(e)MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:6)，其中X5,X8,X9,X12,X15,X16,X19,X30,X33,X34,X37,X40,X41,X44,X57,X58,X61,X64,X65和/或X68是天然和/或非天然氨基酸残基，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在若干实施方案中，DBDpp包含选自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5的氨基酸序列，由其组成，或基本上由其组成。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在进一步的实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在另外的实施方案中，Xn是氨基酸的缺失(例如，任选地在序列中的空(null)位置)。在另外的实施方案中，DBDpp是融合蛋白。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的目的靶：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和含有肽标签的蛋白质。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。在另外的实施方案中，提供了包含多个DBDpp的文库。还提供了编码DBDpp的核酸和含有核酸的载体。还提供了含有核酸和载体的宿主细胞(包括病毒颗粒)。在一些实施方案中，宿主细胞是在其表面展示DBDpp的原核生物或真核生物。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在进一步的实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在进一步的实施方案中，宿主细胞是在其表面上表达一种或多种DBDpp融合蛋白的人免疫细胞(例如B细胞，T细胞，杀伤T细胞，辅助T细胞，调节性T细胞，抗原呈递细胞，自然杀伤细胞等)。在一个实施方案中，DBDpp附着到固体支持物上。在进一步的实施方案中，固体支持物选自珠，载玻片，其他基于玻璃或塑料的材料(例如过滤器或过滤装置)，过滤材料(例如玻璃纤维，钢丝绒，聚醚砜等)，芯片，明胶和琼脂糖，及其组合。
还提供了分离的DBDpp，其包含选自以下的氨基酸序列：(a)MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAAFEKEIAAFESELQAYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:9)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X50，X53，X54，X57，X60和/或X61是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和/或Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；(b)MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO:7)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X28，X31，X32，X35，X38，X39和/或X42是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和/或Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；(c)MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:8)，其中X30，X31，X34，X37，X38，X41，X52，X53，X56，X59，X60和/或X63是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和/或Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；(d)MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:10)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X30，X31，X34，X37，X38，X41，X50，X53，X54，X57，X60和/或X61是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和/或Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；以及(e)MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALX52X53EAX5 6AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:11)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X28，X31，X32，X35，X38，X39，X42，X52，X53，X56，X59，X60和/或X63是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和/或Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；并且其中DBDpp特异性地结合目的靶。在若干实施方案中，DBDpp包含选自SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11的氨基酸序列，由其组成或基本上由其组成。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在进一步的实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在另外的实施方案中，Xn是氨基酸的缺失(例如，任选地在序列中的空位置)。在其他实施方案中，Z1和/或Z2是氨基酸的缺失(例如，任选地在序列中的空位置)。在另外的实施方案中，DBDpp是融合蛋白。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的目的靶：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和含有肽标签的蛋白质。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。在另外的实施例中，提供了含有多个DBDpp的库。还提供了编码DBDpp的核酸和含有核酸的载体。还提供了包含核酸的宿主细胞，包括病毒颗粒。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在另外的实施方案中，宿主细胞是在其表面展示DBDpp的原核生物或真核生物。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上表达DBDpp融合蛋白的人免疫细胞。在一个实施方案中，DBDpp附着到固体支持物上。在另一个实施方案中，固体支持物选自：珠，载玻片，芯片，明胶和琼脂糖。
还提供了编码DBDpp例如DBDpp融合蛋白的核酸。另外提供了含有编码DBDpp(例如DBDpp融合蛋白)的核酸的载体和含有该核酸和载体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是病毒颗粒，或细菌，酵母，真菌或植物细胞。在具体的实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，哺乳动物细胞是免疫细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是人免疫细胞。在一些实施方案中，宿主细胞将DBDpp展示为细胞表面上的融合蛋白。在另一个实施方案中，宿主细胞是在细胞表面上展示DBDpp的人免疫细胞。本文另外提供了包含编码多个DBDpp的核酸的载体文库。
还提供了含有多个DBDpp的文库。在一个实施方案中，DBDpp文库包含多个含有不同氨基酸序列并且包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的DBDpp，其中总共5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个氨基酸残基(包括所列那些之间的任何数字)已被修饰；并且其中DBDpp特异性地结合目的靶。在另一个实施方案中，经修饰的氨基酸残基中的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个(包含所列那些之间的任何数字)是置换。在另一个实施方案中，修饰的氨基酸残基中的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个(包括所列出的那些之间的任何数字)是保守置换。在另一个实施方案中，修饰的氨基酸残基中的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个(包括所列那些之间的任何数字)是非保守置换。在进一步的实施方案中，氨基酸残基修饰中的5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45(包括所列那些之间的任何数字)为保守置换并且氨基酸残基修饰中的5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45(包括所列那些之间的任何数字)为非保守置换。在另外的实施方案中，置换中的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个(包括所列那些之间的任何数字)在SEQ ID NO:1的一个或更多个氨基酸残基处，氨基酸残基选自M1，G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，L21，G22，G23，S24，E25，A26，E27，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，Y45，K46，G47，K48，G49，N50，P51，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69，Y70，R71，H72和N73。在另一个实施方案中，置换中的1至20，1至30或1至40个(包括那些列出的那些之间的任何数字)在SEQ ID NO:1的一个或多个氨基酸残基处，氨基酸残基选自：G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69和Y70。在另一个实施方案中，文库包含至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个(包括所列数字之间的任何范围，例如2-10，5-25，50-100，250-1000个等)不同的特异性结合不同靶的DBDpp(或对给定靶具有差异特异性的DBDpp)。在另一个实施方案中，由文库中DBDpp结合的不同靶选自：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在另一个实施方案中，文库包含至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个(包括所列数字之间的任何范围，例如2-10，5-25，50-100，250-1000个等)不同的DBDpp，其特异性结合选自以下蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和含有肽标签的蛋白质。在另一个实施方案中，文库包含至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个(包括所列数字之间的任何范围，例如2-10，5-25，50-100，250-1000个等)不同的特异性结合本文公开的靶的DBDpp。在另外的实施方案中，文库是载体文库或宿主细胞文库。在另外的实施方案中，载体文库是宿主细胞的文库。在另一个实施方案中，宿主细胞文库包含多个在其表面上展示DBDpp的宿主细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在一些实施方案中，载体文库包含：(a)编码特异性结合不同靶的3个DBDpp的核酸；(b)编码具有与同一靶特异性结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；(c)编码具有与靶的相同表位特异性结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；(d)编码具有与靶的不同表位特异性结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；(e)编码具有与相同靶竞争结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；或(f)编码相同DBDpp序列的3个不同的核酸序列。还提供了含有载体的宿主细胞。
还提供了包含编码DBDpp的多个不同核酸序列的载体文库，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中总共1至5，5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个氨基酸残基已被修饰(或所列那些之间的任何数字)；并且其中DBDpp特异性地结合目的靶。在另一个实施方案中，由核酸序列编码的修饰的氨基酸残基中的1至5，5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个(或所列那些之间的任何数字)是置换。在另一个实施方案中，经修饰的氨基酸残基中的1至5，5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个(或所列那些之间的任何数字)是保守置换。在另一个实施方案中，编码的经修饰的氨基酸残基中的1至5，5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个(或所列那些之间的任何数字)是非保守置换。在另一个实施方案中，编码的氨基酸残基修饰中的1至5，5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个(或所列那些之间的任何数字)是保守置换，并且编码的氨基酸残基修饰中的1至5，5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个(或所列那些之间的任何数字)是非保守置换。在另外的实施方案中，编码的置换中的1至5，5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个(或所列那些之间的任何数字)在SEQ ID NO:1的氨基酸残基处，氨基酸残基选自M1，G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，L21，G22，G23，S24，E25，A26，E27，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，Y45，K46，G47，K48，G49，N50，P51，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69，Y70，R71，H72和N73中的一个或多个。在另一个实施方案中，所编码的置换中的1至20，1至30或1至40个(或所列那些之间的任何数字)在SEQIDNO:1的氨基酸残基处，氨基酸残基选自G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69和Y70中的一个或多个。在另一个实施方案中，核酸任选地编码DBDpp，其进一步包含其中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的溶剂不可及残基的残基中的1至5，5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个氨基酸残基被置换，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合不同靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸(或对于相同的靶具有改变的亲和力)。在另一个实施方案中，由文库中DBDpp结合的不同靶选自：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合选自以下的蛋白质靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白质，细胞表面蛋白质，治疗性蛋白质，TSA，CSA和含有肽标签的蛋白质。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合本文公开的靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另外的实施方案中，载体文库包含在宿主细胞(例如病毒颗粒)中。在另一个实施方案中，文库包含多个在其表面上展示DBDpp的宿主细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在一些实施方案中，载体文库包含：(a)编码特异性结合不同靶的3个DBDpp的核酸；(b)编码具有与同一靶特异性结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；(c)编码具有与靶的相同表位特异性结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；(d)编码具有与靶的不同表位特异性结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；(e)编码具有与相同靶竞争结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；或(f)编码相同DBDpp序列的3种不同的核酸序列。还提供了含有载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，载体文库包含多个编码DBDpp的不同核酸，其中编码的DBDpp包含选自以下的氨基酸序列：(a)MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:4)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X55，X58，X59，X62，X65和/或X66是天然氨基酸和/或非天然氨基酸残基；(b)MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYR HN(SEQ ID NO:2)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X30，X33，X34，X37，X40，X41和/或X44是天然氨基酸和/或非天然氨基酸残基；(c)MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:3)，其中X32，X33，X36，X39，X40，X43，X57，X58，X61，X64，X65和/或X68是天然氨基酸和/或非天然氨基酸残基；(d)MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:5)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X32，X33，X36，X39，X40，X43，X55，X58，X59，X62，X65和/或X66是天然氨基酸和/或非天然氨基酸残基；以及(e)MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:6)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X30，X33，X34，X37，X40，X41，X44，X57，X58，X61，X64，X65和/或X68是天然氨基酸和/或非天然氨基酸残基；并且其中DBDpp特异性地结合目的靶。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在另外的实施方案中，Xn是氨基酸的缺失(例如，任选地在序列中的空位置)。在另一个实施方案中，文库中的多个载体编码DBDpp融合蛋白。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合不同靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另一个实施方案中，由文库中的核酸编码的DBDpp结合的不同靶选自：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合选自以下的蛋白质靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白质，细胞表面蛋白质，治疗性蛋白质，TSA，CSA和含有肽标签的蛋白质。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合本文公开的靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另外的实施方案中，载体文库的多个载体包含在宿主细胞(例如病毒颗粒如噬菌体)，大肠杆菌，酵母和哺乳动物细胞中。在另一个实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在一些实施方案中，载体文库包含：(a)编码特异性结合不同靶的3个DBDpp的核酸；(b)编码具有与同一靶特异性结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；(c)编码具有与靶的相同表位特异性结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；(d)编码具有与靶的不同表位特异性结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；(e)编码具有与相同靶竞争结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；或(f)编码相同DBDpp序列的3个不同的核酸序列。还提供了含有载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，载体文库包含多个编码DBDpp的核酸，DBDpp包含选自以下的氨基酸序列：(a)MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAAFEKEIAAFESELQAYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:9)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X50，X53，X54，X57，X60和/或X61是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；(b)MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALRKEAAA IRDELQAYRHN(SEQ ID NO:7)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X28，X31，X32，X35，X38，X39和/或X42是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；(c)MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:8)，其中X30，X31，X34，X37，X38，X41，X52，X53，X56，X59，X60和/或X63是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；(d)MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:10)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X30，X31，X34，X37，X38，X41，X50，X53，X54，X57，X60和/或X61是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；以及(e)MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX3 5FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:11)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X28，X31，X32，X35，X38，X39，X42，X52，X53，X56，X59，X60和/或X63是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；并且其中DBDpp特异性地结合目的靶。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在另外的实施方案中，Xn是氨基酸的缺失(例如，任选地在序列中的空位置)。在另一个实施方案中，文库中的多个载体编码DBDpp融合蛋白。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合不同靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另一个实施方案中，由文库中的核酸编码的DBDpp结合的不同靶选自：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合选自以下的蛋白质靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白质，细胞表面蛋白质，治疗性蛋白质，TSA，CSA和含有肽标签的蛋白质。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合本文公开的靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另外的实施方案中，载体文库的多个载体包含在宿主细胞中。在另一个实施方案中，宿主细胞(例如病毒颗粒)在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，载体文库包含：(a)编码特异性结合不同靶的3个DBDpp的核酸；(b)编码具有与同一靶特异性结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；(c)编码具有与靶的相同表位特异性结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；(d)编码具有与靶的不同表位特异性结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；(e)编码具有与相同靶竞争结合的不同序列的3个DBDpp的核酸；或(f)编码相同DBDpp序列的3种不同的核酸序列。还提供了含有载体的宿主细胞。
根据本文提供的若干实施方案的DBDpp具有包括但不限于靶结合，体外或体内结合，连接和/或以其他方式缔合目的靶(例如，纯化靶，治疗靶，诊断靶，肽标签和血清蛋白例如人血清白蛋白(HSA)或免疫球蛋白)的能力，以及用作连接或缔合蛋白质如DBDpp融合蛋白与附加部分(例如固体支持物)的反应位点的能力和/或其他修饰的活性。本文提供的DBDpp还可以具有用于制造，纯化，配制和生物学，诊断和治疗应用的其他期望的性质和/或功能性。
在一些实施方案中，DBDpp用于结合，检测，定量，去除和/或纯化含有目的靶的样品中的所述靶。
一个非限制性实施方案提供了用于检测样品中目的靶的方法，其包括：(a)在适合于DBDpp与靶的特异性结合的条件下使样品与特异性结合靶的DBDpp接触以形成靶/DBDpp复合物，和(b)检测复合物和/或捕获的靶的存在。在一个实施方案中，DBDpp被固定在固体支持物上。
还提供了用于定量含有目的靶的样品中的所述靶的方法，其包括：(a)使样品与特异性结合靶且固定在固体支持物上的DBDpp在适合于DBDpp与靶特异性结合的条件下接触以形成靶/DBDpp复合物，和(b)检测靶/DBDpp复合物和/或捕获的靶的存在，其中产物的定量检测指示或以其他方式能够与样本中靶的数量相关联。
一些实施方案提供了从含有目的靶的样品中纯化所述靶的方法，其包括：(a)在适于DBDpp特异性结合靶的条件下，使含有目的靶的样品与特异性结合靶的DBDpp接触，和(b)回收结合的靶。在一些实施方案中，通过洗脱来回收靶。在一个实施方案中，DBDpp被固定在固体支持物上。在另一个实施方案中，通过紫外线吸收或其他可视化或基于化学的检测技术来监测结合的靶的洗脱。在一些实施方案中，提供了从样品中除去不期望的目的靶的方法，其中结合的不期望的靶被直接丢弃或被洗脱(或以其他方式被收集或分离)然后被丢弃。
另一个实施方案提供筛选DBDpp文库中特异性结合目的靶的DBDpp的方法，其包括：(a)获得多个宿主细胞(例如病毒颗粒，噬菌体，细菌和/或哺乳动物细胞)在其表面上展示DBDpp的库；(b)将多个宿主细胞与目的靶在适于靶与DBDpp的特异性结合的条件下接触；和(c)测定靶与DBDpp的结合。在一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。
在若干实施方案中，还提供了在诊断和治疗应用中使用DBDpp的方法。一个实施方案提供了治疗疾病或病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的特异性结合目的治疗靶的DBDpp(例如DBDpp融合蛋白)。在一些实施方案中，疾病或病症是癌症，免疫系统的疾病或病症或感染。还提供了治疗疾病或病症的方法，其包括将另外的治疗剂与DBDpp一起共同施用。
另外提供了用于治疗或预防癌症的方法，其包括向表达靶细胞表面上肿瘤抗原的患者(例如倾向于或患有癌症)施用DBDpp-CAR T淋巴细胞，并且其中DBDpp特异性结合抗原。
以上总结的以及下面进一步详细阐述的某些方法描述了从业者采取的某些行动；但是，应该明白，它们也可以包括另一方的这些行动的指示。因此，诸如“施用包含靶特异性结合多肽CAR的T细胞”的行为包括“指导施用包含靶特异性结合性多肽CAR的T细胞”。
附图简要说明
图1A-B.示意图描绘了DBDpp的SEQ ID NO:1衍生的同源性模型。说明结构域域的螺旋和三个面的横向视图(图1A)。说明残基E19，N末端(NT)和C末端(CT)的位置的纵向视图(图1B)。
图2A-J.DBDpp基于SEQ ID NO:1的参考支架的不同同源性模型的示意图。DBDpp的面(Face)文库(F1，F2和F3)和组合文库(C1和C2)中被靶向修饰的残基被加上黑色阴影。F1文库的纵向和横向透视图分别如图2A和图2B所示。F2文库的纵向和横向透视图分别如图2C和图2D所示。F3文库的纵向和横向透视图分别如图2E和图2F所示。C1文库的纵向和横向透视图分别如图2G和图2H所示。C2文库的纵向和横向透视图分别如图2I和图2J所示。指示每个模型的N末端(NT)和C末端(CT)。
图3A-D.图3A.根据本文公开的若干实施方案使用的噬菌体展示构建体的示意图。图3B.描绘用于产生本文公开的文库的pComb噬菌粒载体的线性载体图。这些文库是利用含有NNK或三聚体密码子的寡核苷酸通过Kunkel诱变产生的。DBDpp变体肽序列在FLAG肽标签序列和M13基因pIII之间框内表达。DBDpp在DsbA信号肽的控制下表达为N末端pIII基因融合物。图3C.描绘用于生成实施例中描述的DBDpp文库的pComb噬菌粒载体的线性载体图。DBDpp在DsbA信号肽和M13基因pIII之间框内表达。修饰的pComb噬菌粒载体与图3B所示的相同，但缺少根据本文公开的某些实施方案的FLAG肽标签序列(其中FLAG标签任选地被去除或用另一种标签替换)。图3D描绘来自比较结合测定的数据。从大肠杆菌培养物中表达和纯化N末端FLAG标签融合物。基于ELISA的结合评估表明纯化的FLAG-pb04(靶向PD-L1)以剂量依赖性方式结合PD-L1-Fc包被的微量滴定孔，而FLAG-α3D(SEQ ID 49的参考序列，具有N末端FLAG标签)表现出没有结合变化。
图4A-D.DBDpp具有新的结合特异性，并将这些新的结合特异性赋予作为融合蛋白(例如抗体-DBDpp融合蛋白)的一部分的另一分子(例如抗体)。示意图描绘了DBDpp(显示为圆圈)与抗体重链的C末端(图4A)和N末端(图4B)的重组融合。使用RSV特异性抗体(SYN)和SEQ ID NO:1的无靶向肽(DBD)或CD137特异性DBDpp(bb10)产生DBDpp-抗体融合物。DBDpp融合到N末端(bb10-SYN和DBD-SYN)或C末端(SYN-bb10和SYN-DBD)。所有四种抗体融合物都与RSV结合(图4C)。然而，bb10与抗体重链的N末端(bb10-SYN)或C末端(SYN-bb10)的融合赋予了新的对其它单特异性抗体的CD137结合特异性(图4D)。
图5A-5C.图5A.描绘了根据本文公开的若干实施方案的DBDpp-CAR融合蛋白的示意图。以举例的方式呈现了六种不同的DBDpp-CAR形式，并且旨在是说明性的而不是限制性的。细胞外DBDpp结构域可以对单个靶(例如DBDpp“A”)或多于一个靶或表位(例如DBDpp“A”和DBDpp“B”)是特异性的。显示了跨膜(TM)结构域的非限制性实例，以及源自CD3，CD28和41BB的细胞内结构域的非限制性实例。结构域任选地通过肽接头连接(以阴影显示)。图5B.描绘了膜结合(例如细胞外)DBDpp-CAR融合物的另一个示意图。图5C.描绘了可溶性DBDpp的示意图。
图6A-C.多特异性DBDpp融合物识别细胞表面靶。FACS分析表明，bb10-SYN和SYNbb10双特异性抗体以比单独的SYN(黑色轮廓)更高的水平结合(阴影直方图)激活的CEM细胞。与C末端融合(图6B)相比，bb10N末端融合观察到的较弱结合(图6A)与上述ELISA数据一致。URE1是由靶向CD137的与IgG支架融合的urelumab的可变结构域构建的重组抗体。在用PMA(50ng/ml)和伊屋诺霉素(500ng/ml)激活48小时后进行与CEM细胞的结合。用抗IgG1Fc(FITC-A)进行结合抗体的检测。
图7A-D.DBDpp赋予抗体-DBDpp融合蛋白新的生物学活性。通过配体或激动性抗体如urelumab激活CD137诱导导致细胞因子产生，抗凋亡分子表达和增强的免疫应答的信号传导级联。通过测量bb10-SYN和SYN-bb10诱导来自PBMC的细胞因子释放的能力来评估靶向CD137的DBDpp即bb10的激动潜力。以可溶性和包被塑料孔两种形式下测试了bb10融合物。将完全RPMI培养基中的PBMC加入平板并孵育过夜。然后使用ELISA测量细胞培养物上清液的TNFα和IL8。对于两个供体PBMC群体，bb10融合物以等于或高于激动性抗CD137单克隆抗体URE1的水平诱导分泌IL8和TNFα。
图8.体内稳定性对大多数生物治疗药物的临床疗效至关重要。进行bb10融合物的药代动力学测量以评估DBDpp与抗体融合配偶体相比的相对稳定性。通过分析接受单次静脉内注射(1mg/kg)融合物的CD1小鼠血清中存在的双特异性抗体的RSV和CD137两种结合来确定体内稳定性。在15分钟和48小时收集血清样品，并通过ELISA测定。N末端和C末端DBDpp融合蛋白都表现出持续的体内稳定性。如下面更详细讨论的，若干实施方案涉及具有延长的稳定性(例如，大约24小时，48小时，72小时，96小时，6天，8天，10天或更大的数量级，包括那些所列之间的时间)的DBDpp融合物。
图9.图9描绘了根据本文公开的若干实施方案生产的DBDpp的HPLC纯化。
图10.图10描绘了根据本文公开的若干实施方案生产的纯化的DBDpp的SDS-PAGE分析。泳道1是分子量标志物，泳道2对应于SEQ ID NO:58的纯化DBDpp，泳道3-9分别对应于SEQ ID NO:51-57的纯化DBDpp。
图11.图11描绘了SEQ ID NO.54的解卷积电喷雾电离质谱(ESI-MS)谱。
图12A-12P.图12A-12P描绘了与固定在固体表面上的靶向CD137的DBDpp与CD137的结合有关的数据。图12A,12C,12E,12G,12I,12K,12M和12O是SEQ ID NO:51(12A),52(12C),53(12E),54(12G),55(12I),56(12K),57(12M)和58(12O)的DBDpp的传感图。图12B,12D,12F,12H,12J,12L,12N和12P描绘了对应于SEQ ID 51(12B),52(12D),53(12F),54(12H),55(12J),56(12L),57(12N)和58(12P)的DBDpp稳定态结合数据。
图13.图13描述了从中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上清液纯化CD137蛋白质的色谱数据。
图14A-14B.分析使用DBDpp纯化的蛋白质。图14A描绘了加载有来自DBDpp纯化柱的纯化级分的考马斯染色的凝胶。泳道1是分子量标志物。泳道2是IMAC纯化的CD137蛋白质，泳道3-8是根据本文的若干实施方案来自具有各种DBDpp的柱的洗脱物。图14B是用图14A中所示的样品的相应样品进行的蛋白质印迹分析。
图15A-15D.DBDpp的热稳定性。图15A描绘了在暴露于各种升高的温度之后评估DR5scFv与PD-L1PD-L1-Fc包被的微孔板孔的结合。图15B描绘了显示升高的温度与PD-L1PD-L1导向的scFv降低的PDL1结合之间的相关性的数据。图15C显示了根据本文公开的一个实施方案的DBDpp(pb04DBDpp)在暴露于升高的温度(至多100℃)后保留了PD-L1PD-L1结合亲和力。图15D显示另外的DBDpp(pb06DBDpp)，其也显示出热稳定性并且可以在暴露于至多100℃的温度后结合PD-L1PD-L1。
图16A-16B.DBDpp的交叉反应性。图16A描绘了与DBDpp跨物种结合靶的能力有关的数据。具体而言，图16A表明，针对PD-L1的可溶性DBDpp可以以相似的结合亲和力结合人PD-L1(上迹线)以及食蟹猴PD-L1(下迹线)。图16B描绘了流式细胞术数据，证实当在T细胞，具体为嵌合抗原受体T细胞中表达时，T细胞可以识别并结合人和食蟹猴二者的PD-L1。
图17.评估DBDpp-CAR表达和靶结合。图17描绘了与各种候选DBDpp-CAR HEK-293T细胞的DBDpp-CAR表达和CD-123-Fc结合有关的数据。
图18.DBDpp介导信号转导。图18描绘了与DBDpp-CAR Jurkat细胞的表达和通过细胞内信号传导途径起作用的能力有关的数据。
图19A-19B.CD123-DBDpp-CAR T细胞响应靶结合产生细胞因子。图19A显示了与表达靶向CD123的DBDpp-CAR的T细胞产生干扰素γ(IFNγ)有关的数据。图19B描述了测量靶向CD123的DBDpp-CAR T细胞产生白细胞介素2(IL2)的类似数据。
图20A-20B.PD-L1-DBDpp-CAR T细胞响应靶结合产生细胞因子。图20A显示了与表达靶向PD-L1的DBDpp-CAR的T细胞产生干扰素γ(IFNγ)有关的数据。图20B描述了测量靶向PD-L1的DBDpp-CAR T细胞产生白细胞介素2(IL2)的类似数据。
图21.CD123-DBDpp-CAR T细胞响应于靶结合而增殖。图21描绘了与对照和靶向CD123的scFv相比，与靶向CD123的DBDpp-CAR T细胞的增殖相关的数据。
图22.PD-L1-DBDpp-CAR T细胞响应靶结合而增殖。图22描绘了与模拟条件相比，与靶向PD-L1的DBDpp-CAR T细胞的增殖有关的数据。
图23A-23B.表达DBDpp-CAR的T细胞没有比scFv经受更大程度的过度耗竭。图23A描绘了表达各种DBDpp-CAR的T细胞上三种耗竭标志物(LAG-3，PD-1和TIM3)在scFv上的那些标志物表达水平相似的情况下的表达。图23B显示与表达CD123特异性scFv的CAR T细胞(32716)相比，描绘DBDpp-CAR T细胞(表达靶向CD123的cg06DBDpp)的类似耗竭标志物表达的流式细胞术数据。
图24A-24D.表达DBDpp-CAR的T细胞响应靶结合而脱颗粒。图24A描绘了当单独培养靶向CD123的DBDpp-CAR T细胞时CD107a(作为DBDpp-CAR T细胞脱颗粒的标志物)的产生。图24B显示当DBDpp-CAR T细胞与CD123阴性K562肿瘤细胞共培养时CD107a的产生。图24C显示了靶向CD123的DBDpp-CAR T细胞与CD123阳性BDCM细胞共培养时的CD107a。图24D描绘了来自靶向CD123的DBDpp-CAR T与CD123阳性BDCM细胞的共培养物的实验重复的数据。
图25A-25D.表达PD-L1-DBDpp-CAR的T细胞响应于靶结合而脱颗粒。图25A显示了当单独培养靶向PD-L1的DBDpp-CAR T细胞(例如未激活的)时CD107a(作为DBDpp-CAR T细胞脱颗粒的标志物)的表达。图25B显示当DBDpp-CAR T细胞与PD-L1阴性K562肿瘤细胞共培养时，CD107a的测量。图25C显示当靶向PD-L1的DBDpp-CAR T细胞与PD-L1阳性SUDHL1细胞共培养时，CD107a增加。图25D描绘了来自靶向PD-L1的DBDpp-CAR T与PD-L1阳性SUDHL1细胞的共培养的实验重复的数据。
图26A-26D.表达DBDpp-CAR的T细胞介导靶特异性肿瘤细胞毒性。图26A显示了靶向CD123的DBDpp-CAR T细胞杀伤CD123阴性K562肿瘤细胞百分比的有关数据。图26B显示了靶向CD123的DBDpp-CAR T细胞与CD123阳性BDCM细胞共培养时的杀伤百分比。使用来自第一供体血液样品的T细胞产生来自图26A和26B的数据。图26C和26D显示了从第二供体收集的T细胞的类似数据。
图27A-27F.表达DBDpp-CAR的T细胞介导靶特异性肿瘤细胞毒性。图27A显示与靶向PD-L1的DBDpp-CAR T细胞杀伤PD-L1阴性K562肿瘤细胞的百分比的有关数据。表达各种靶向PD-L1的DBDpp的CAR T细胞表现出比模拟对照低的杀伤率。两个另外的供体的类似的数据显示在图27C和27E中。图27B显示当靶向PD-L1的DBDpp-CAR T细胞与PD-L1阳性SUDHL1细胞共培养时，升高的杀伤百分比。两个另外的供体的类似的数据显示在图27D和27F中。
图28A-28D.DBDpp具有降低的免疫原性潜力。由于本文公开的DBDpp是合成的，因此进行分析以鉴定潜在的免疫原性表位。DBDpp(cg06)的三维模型显示在图28A中。图28B描述了cg06，其中(三个中的)一个潜在免疫原性表位经修饰以具有更低的潜在免疫原性。图28C描绘了具有(三个中的)两个经修饰的潜在免疫原性表位的cg06。图28D描述了所有三个潜在的免疫原性表位经修饰的cg06。
图29A-29B.具有经修饰的表位的DBDpp保留功能性。图29A描绘了与表达靶向CD123的DBDpp(cg06)的变体的CAR T细胞有关的数据。即使从DBDpp序列中除去所有三个潜在的免疫原性表位，在结合CD123阳性BDCM靶细胞后，变体保留了介导信号转导的能力(激活被改造以表达萤光素酶的Jurkat细胞)(用箭头指示未修饰的cg06)。图29B显示当修饰变体结合CD123阳性KG-1a细胞时类似的功效(用箭头指示未修饰的cg06)。
图30A-30B.双标志物在肿瘤细胞上的表达。图30A描述了在K562细胞，KG1a细胞，BDCM细胞，SUDHL细胞或H460细胞上表达CD123的流式细胞术数据。图30B描述了在相同细胞系上表达PD-L1的流式细胞术数据。
图31A-31E.双特异性DBDpp-CAR T细胞。图31A显示了表达靶向CD123的DBDpp-CAR的T细胞的百分比。图31B显示了表达靶向PD-L1的DBDpp-CAR的T细胞的百分比。图31C显示了表达双特异性靶向CD123-PD-L1的DBDpp-CAR的T细胞(表达有相对于pb04DBDpp远离T细胞膜的cg06DBDpp)的百分比。图31D显示了表达双特异性靶向PD-L1-CD123的DBDpp-CAR的T细胞(表达有相对于cg06 DBDpp远离T细胞膜的pb04 DBDpp)的百分比。图31E描绘了与双特异性DBDpp的细胞内信号传导增加有关的数据。
图32.竞争性DBDpp结合测定。图32证明了竞争性结合测定的一个实施方案，即使所测试的DBDpp具有不同的一级氨基酸序列，该竞争性结合测定仍然能够用于鉴定展示共有的表位结合的DBDpp。
详述
本文使用的章节标题仅用于组织目的，并不被解释为以任何方式限制所描述的主题。
术语定义
应该理解的是，无论在何处以术语“包含”描述实施方案，还提供了以“由......组成”和/或“基本上由......组成”描述的其他类似实施方案。但是，当在权利要求中用作过渡性短语时，每一个都应该被分开解释，并且在适当的法律和事实背景下进行解释(例如，“包含”被认为是更开放的短语，而“由...组成”是更封闭的，而“基本上由...组成”则处于中间地带)。
如本文所用，除非另外指出，否则单数形式“a”，“an”和“the”包括复数参考。
如本文短语如“A和/或B”中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。类似地，在诸如“A，B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下每个实施方案：A，B和C；A，B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用，是指包含衍生自经由肽键连接的氨基酸的单元的生物聚合物；蛋白质可以由两条或更多条多肽链组成。
本文可互换使用的术语“抗体”或“免疫球蛋白”包括完整抗体和抗体片段，包括抗体的任何功能结构域，例如其抗原结合片段或单链，效应结构域，补救受体结合表位或其部分。典型的抗体包含通过二硫键相互连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)。每条重链由重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CH1，CH2和CH3组成。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域Cl组成。VH和VL区可以进一步细分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布有更保守的区域，称为框架区(FW)。每个VH和VL由三个CDR和四个FW组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FW1，CDR1，FW2，CDR2，FW3，CDR3，FW4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。本公开的非限制性类型的抗体包括典型的抗体，scFv及其组合，其中例如DBDpp共价连接(例如经由肽键或通过化学接头)至典型整个(全长)抗体的重链和/或轻链的N末端，或插入整个抗体的H链和/或L链中。
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指抗体的任何功能结构域，如其抗原结合片段或单链，其效应结构域或部分，以及其补救受体结合表位或部分。抗体片段的实例包括但不限于由抗体片段形成的Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段，线性抗体，单链抗体和多特异性抗体。如本文所用的“抗体片段”包含抗原结合位点或表位结合位点。在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白包含效应结构域或其部分。在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白包含补救受体结合表位或其部分。
如本文所用，术语“Fc区”或简称“Fc”应理解为是指免疫球蛋白链恒定区，优选免疫球蛋白重链恒定区或其部分的羧基端部分。例如，免疫球蛋白Fc区可以包含(1)CH1结构域，CH2结构域和CH3结构域，(2)CH1结构域和CH2结构域，(3)CH1结构域和CH3结构域，4)CH2结构域和CH3结构域，或(5)两个或更多个结构域和免疫球蛋白铰链区的组合。在优选的实施方案中，免疫球蛋白Fc区包含至少免疫球蛋白铰链区，CH2结构域和CH3结构域，优选缺少CH1结构域。在一个实施方案中，重链恒定区来源的免疫球蛋白的类别是IgG(Igγ)(γ亚类1，2，3或4)。可以使用其他类别的免疫球蛋白，IgA(Igα)，IgD(Igδ)，IgE(Igε)和IgM(Igμ)。在美国专利号5,541,087和5,726,044(其全部内容通过引用并入本文)中详细讨论了适当的免疫球蛋白重链恒定区的选择。据认为从某些免疫球蛋白类别和亚类选择特定免疫球蛋白重链恒定区序列以达到特定结果在本领域技术水平内。编码免疫球蛋白Fc区的DNA构建体的部分优选包含铰链结构域的至少一部分，优选Fcγ的CH3结构域的至少一部分或IgA，IgD，IgE或IgM中的任何一个中的同源结构域。此外，预期免疫球蛋白重链恒定区内的氨基酸的置换或缺失可用于实施本文公开的方法和组合物。一个实例是在上面的CH2区引入氨基酸置换以产生对Fc受体具有降低的亲和力的Fc变体(Cole，J.Immunol.159:3613(1997))。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞，嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞的裂解(或其他细胞毒作用)。为了评估目的分子的ADCC活性，可以使用本领域已知的任何体外ADCC测定，如描述于美国专利号5,500,362或5,821,337中的测定。用于此类测定的有用的效应细胞包括但不限于外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。备选地或另外地，可以在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在如在Clynes et al.PNAS 95:652-656(1998)描述的动物模型中。
本文使用的术语“单链可变片段”或“scFv”抗体是指包含通过接头肽连接的仅重链和轻链可变区的抗体形式(例如抗体片段)。在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白包含DBDpp和scFv。
术语“接头”是指位于DBDpp融合蛋白的DBDpp与另一个多肽之间的肽或其他化学键。用于偶联两个或更多个连接的DBDpp的合适接头对于本领域技术人员将是清楚的，并且本文描述了非限制性实例。
如本文所用，术语“可操作地连接”表示附接两个分子以便每个保留每个分子单独具有的至少一定水平的功能活性(假定每个分子具有功能活性)。在一个分子不具有功能活性的实施方案中，如果另一个分子保留其功能活性的至少一些水平，则其与另一分子可操作地连接在一起。可操作地连接也可以指两个非功能分子的连接。两个分子可以“可操作地连接”，无论它们直接或间接附接(例如通过接头)。
术语“特异性结合”或“具有对其的选择性亲和力”意指，相比于与替代物质，包括与靶表位无关的蛋白质，结合剂例如DBDpp更频繁，更快速，以更大的持续时间，更大的亲和力或以上述的某种组合与表位，蛋白质或靶分子发生反应或缔合。由于不同物种中同源蛋白质之间的序列同一性，在一些实施方案中，特异性结合可以包括识别多于一种物种中的蛋白质或靶的结合剂。同样，由于不同蛋白质的多肽序列的某些区域内的同源性，特异性结合可以包括识别多于一种蛋白质或靶的结合剂。应该理解的是，在某些实施方案中，特异性结合第一靶的结合剂可以或可以不特异性结合第二靶。因此，“特异性结合”不一定需要(尽管其可以包括)排他性结合，例如结合单个靶。因此，在某些实施方案中，结合剂可特异性结合多于一个靶。在某些实施方案中，多个靶可以被结合剂上的相同抗原结合位点结合。
“靶”是指可以被DBDpp如DBDpp融合蛋白或DBDpp融合蛋白的其他组分如抗体或抗体可变结构域片段结合的任何分子或分子组合。
术语“表位”和“抗原决定簇”在本文中可互换使用，并且是指能够被特定结合剂(例如DBDpp或抗体)识别并特异性结合的任何分子(例如，目的靶)的部分。当所识别的分子是多肽时，表位可由连续的氨基酸和通过蛋白质的三级折叠而并列的不连续的氨基酸和/或分子的其他化学活性表面基团(例如碳水化合物)形成。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时保留，而由三级折叠形成的表位通常在蛋白质变性后丢失。表位通常在独特的空间构象中包含至少3个氨基酸，更通常地，至少5或8-10个氨基酸。
如本文所用的“肽标签”是指作为另一蛋白质的肽序列的一部分或附接于(例如通过基因工程改造)另一蛋白质的肽序列，以提供所得融合的功能。与它们所融合的蛋白质相比，肽标签通常相对较短；举例来说，在一些实施方案中，肽标签长度为四个或更多个氨基酸，例如5，6，7，8，9，10，15，20或25个或更多个氨基酸。在一些实施方案中，DBDpp是含有肽标签的融合蛋白。在其他实施方案中，DBDpp特异性结合肽标签。具有如本文所提供的用途的许多肽标签是本领域已知的。肽标签的实例可以是DBDpp融合蛋白或由DBDpp(例如DBDpp融合蛋白)结合的靶的组分。可以是DBDpp融合蛋白或由DBDpp(例如，DBDpp融合蛋白)结合的靶的组分的肽标签的实例包括但不限于HA(血凝素)，c-myc，单纯疱疹病毒糖蛋白D(gD)，T7，GST，GFP，MBP，Strep-标签，His-标签，Myc-标签，TAP-标签和标签(EastmanKodak，Rochester，N.Y.)。同样，针对标签表位的抗体允许检测和定位在例如细胞的亲和纯化，蛋白质印迹，ELISA测定和免疫染色中的融合蛋白。
当与生物材料如核酸分子，多肽和宿主细胞结合使用时，术语“天然存在的”是指在自然界中发现并且没有被人修饰的那些生物材料。相反，当与生物材料结合使用时，“非天然的”或“合成的”是指那些不是在自然界中发现并且已经被人修饰的那些生物材料。
如本文所用，关于参考支架SEQ ID NO:1的序列(或关于其它序列)的“修饰”包括SEQ ID NO:1的相应氨基酸位置(或关于其它序列的相应位置)的序列的置换，缺失，插入和/或添加。
关于参考支架序列SEQ ID NO:1的序列(或关于其它序列)的“置换”是指在SEQ IDNO:1的相应氨基酸位置(或关于其它序列的相应位置)用不同氨基酸残基替代特定氨基酸残基。
“保守”氨基酸置换是其中一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸置换。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如赖氨酸(K)，精氨酸(R)，组氨酸(H))，酸性侧链(例如天冬氨酸(D)，谷氨酸(E))，不带电极性侧链(例如甘氨酸(G)，天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)，酪氨酸(Y)，半胱氨酸(C))，非极性侧链(例如丙氨酸(A)，缬氨酸(V)，亮氨酸(L)，异亮氨酸(I)，脯氨酸(P)，苯丙氨酸(F)，甲硫氨酸(M)，色氨酸(W)，β-支化侧链(例如苏氨酸(T)，缬氨酸(V)，异亮氨酸(I))和芳族侧链(例如酪氨酸(Y)，苯丙氨酸(F)，色氨酸(W)，组氨酸(H)。例如，苯丙氨酸置换酪氨酸是保守置换。在一个实施方案中，DBDpp的序列中的保守置换导致含有置换的DBDpp与其结合的目的靶的特异性结合。在一个实施方案中，DBDpp的序列中的保守置换不会消除含有替换的DBDpp与其结合的目的靶的结合。鉴定赋予，改变或维持选择性结合亲和力的核苷酸和氨基酸保守置换和非保守置换的方法是本领域已知的(参见例如Brummell，Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashi，Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks，PNAS 94:412-417(1997))。
“非保守”氨基酸置换是其中一个氨基酸残基被另一个具有不同侧链的氨基酸残基置换的氨基酸置换。在一个实施方案中，DBDpp的序列中的非保守置换导致含有置换的DBDpp与其结合的目的靶的特异性结合。在一个实施方案中，DBDpp序列中的非保守置换不消除含有置换的DBDpp与其结合的目的靶的结合。
“非天然氨基酸”，“氨基酸类似物”和“非标准氨基酸残基”在本文中可互换使用。可以在本文提供的DBDpp中被置换的非天然氨基酸是本领域已知的。在一个实施方案中，非天然氨基酸是可以置换脯氨酸的4-羟基脯氨酸；可以置换赖氨酸的5-羟赖氨酸；可以置换组氨酸的3-甲基组氨酸；可以置换丝氨酸的高丝氨酸；和可以置换赖氨酸的鸟氨酸。可以在DBDpp中被置换的非天然氨基酸的另外的实例包括但不限于分子如：常见氨基酸的D-异构体，2,4-二氨基丁酸，α-氨基异丁酸，A-氨基丁酸，Abu，2-氨基丁酸，γ-Abu，ε-Ahx，6-氨基己酸，Aib，2-氨基异丁酸，3-氨基丙酸，鸟氨酸，正亮氨酸，正缬氨酸，羟脯氨酸，肌氨酸，瓜氨酸，高瓜氨酸，磺基丙氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，苯基甘氨酸，环己基丙氨酸，β-丙氨酸，羊毛硫氨酸，脱氢丙氨酸，γ-氨基丁酸，硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸氟代氨基酸，设计者(designer)氨基酸如β-甲基氨基酸和Cα-甲基氨基酸，以及Nα-甲基氨基酸，或非天然氨基酸的组合。另外的非天然氨基酸可以包括4-氨基丁酸，4-氨基-3-羟基-5-苯基戊酸，4-氨基-3-羟基-6-甲基庚酸，2-噻吩基丙氨酸和/或氨基酸的D-异构体。如本文所讨论的，在若干实施方案中，非天然氨基酸或氨基酸类似物可包括从序列中缺失一个或多个氨基酸。
本文可互换使用的术语“多核苷酸”和“核酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这些术语包括但不限于DNA，RNA，cDNA(互补DNA)，mRNA(信使RNA)，rRNA(核糖体RNA)，shRNA(小发夹RNA)，snRNA(小核RNA)，snoRNA(短核仁RNA)，miRNA(微RNA)，基因组DNA，合成DNA，合成RNA和/或tRNA。
本文使用的术语“裸DNA”是指编码蛋白质例如DBDpp(例如CAR)的DNA(例如，无组蛋白的DNA)是以适当的方向克隆到合适的表达载体中用于表达的DNA(例如质粒)。可以使用的病毒载体包括但不限于SIN慢病毒载体，逆转录病毒载体，泡沫病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒(AAV)载体，杂合载体和/或质粒转座子(例如睡美人转座子系统)或基于整合酶的载体系统。可以与制造和使用DBDpp结合使用的其他载体在本文中被描述或者在本领域中以其他方式是已知的。
如本文所用的术语“载体”，“克隆载体”和“表达载体”是指核酸序列(例如，DBDpp编码序列)可以在宿主细胞中维持或扩增的载体(克隆载体)或导入宿主细胞中，以转化宿主并促进引入序列的表达(例如，转录和翻译)的载体。载体包括质粒，噬菌体，病毒等。
“宿主细胞”包括可以是或已经是编码DBDpp的核酸的接受者的个体细胞或细胞培养物。宿主细胞包括但不限于病毒颗粒，噬菌粒，细菌，酵母，植物，动物和哺乳动物细胞。宿主细胞包括单个宿主细胞的后代，并且由于天然的，意外的或故意的突变和/或改变，后代可能不一定与原始亲本细胞完全相同(在形态或总DNA补体中)。宿主细胞包括体内，体外或离体用编码DBDpp的核酸转染或感染的细胞。在一些实例中，宿主细胞能够表达并在其表面上展示DBDpp，例如在噬菌体展示中。“表达”包括转录和/或翻译。
DBDpp的“文库”是指多个独特的DBDpp，并且任选地包括结合到相同的靶但是具有不同的结合位点和/或特异性的多个DBDpp。
DBDpp的“载体文库”是指编码DBDpp的多个独特核酸(如上，任选地包括编码结合相同靶但具有不同结合位点和/或特异性的DBDpp的核酸)。
如本文所用，术语“固体支持物”，“支持物”，“基质”和“树脂”可互换使用，并且是指但不限于任何柱(或柱材料)，珠，试管，微量滴定皿，固体颗粒(例如，琼脂糖或sepharose)，微芯片(例如，硅，硅玻璃或金芯片)或膜(例如，生物或滤膜)，可以将DBDpp，抗体或其他蛋白质直接或间接地附接(例如偶联，连接或粘附)(例如通过其它结合配偶体中间体如其他抗体或蛋白A)于其上，或者其中可以嵌入DBDpp或抗体(例如通过受体或通道)。用于将多肽附接到固体支持物(例如，基质，树脂，塑料等)的试剂和技术是本领域众所周知的。合适的固体支持物包括但不限于色谱树脂或基质(例如SEPHAROSE-4FF琼脂糖珠)，塑料微量滴定皿中的孔的壁或底，基于二氧化硅的生物芯片，聚丙烯酰胺，琼脂糖，二氧化硅，硝酸纤维素，纸，塑料，尼龙，金属及其组合。DBDpp和其他组合物可以使用本领域已知的试剂和技术通过非共价缔合或通过共价键合附接在支持物材料上。在一个实施方案中，使用接头将DBDpp偶联至色谱材料。
如本文所用，术语“药学上可接受的”或“生理上可耐受的”及其语法上的变化，因为它们是指组合物，载体，稀释剂和试剂，可互换使用，并表示该材料能够施用于人而没有产生治疗上令人不快的不希望的生理作用，如恶心，头晕，胃不适等。
“调节”是指幅度，频率，程度或活性的调整或调节。在另一相关方面，可以正调节(例如，频率，程度或活性的增加)或负调节(例如，频率，程度或活性的降低)这种调节。在若干实施方案中，与施用治疗剂之前的细胞，组织或器官功能相比，称为正向或负向的调节。在另外的实施方案中，相对于正常健康的细胞，组织或器官，称为正向或负向的调节。
本文提供的DBDpp如DBDpp融合蛋白的“有效量”是足以实现具体说明的目的的量，例如引起与其中DBDpp(例如DBDpp融合蛋白)结合的靶相关的一种或多种生物学活性水平的可观察的改变。在某些实施方案中，该改变增加了靶活性的水平。在其他实施方案中，该改变降低了靶活性的水平。根据所陈述的目的，“有效量”可以根据经验和常规方式确定。术语“治疗有效量”是指DBDpp如DBDpp融合蛋白或有效“治疗”(例如减轻)受试者(哺乳动物)中的疾病或病症(的症状)的其它治疗剂的量。“预防有效量”是指在必要的剂量和时间内有效达到预期的预防效果的量。
“患者”，“受试者”，“动物”和“哺乳动物”可互换使用，并且是指哺乳动物，如人患者和非人灵长类动物，以及实验动物如兔子，大鼠和小鼠，和其他动物。动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如鸡，两栖动物和爬行动物。本文使用的“哺乳动物”是指哺乳动物类的任何成员，包括但不限于人和非人灵长类动物，如黑猩猩和其他猿和猴物种；农场动物，如牛，绵羊，猪，山羊和马；家养哺乳动物如狗和猫；实验动物包括啮齿动物如小鼠，大鼠和豚鼠等。在特定实施方案中，患者是人。该术语不表示特定的年龄或性别。因此，成年和新生儿受试者以及胚胎和胎儿，无论是男性还是女性，都被包括在这个术语的范围内。
如本文所用的术语“治疗”(“treat”、“treatment”和“treating”)是指治疗性治疗和预防(prophylactic或preventative)措施，其中目标是预防或减缓(减轻或延迟)疾病，病症或障碍的症状，并发症或生化指标，缓解症状或阻止或抑制疾病，病症或障碍的进一步发展。治疗可以是预防性的(预防或延迟疾病的发作，或预防其临床或亚临床症状的表现)，或在疾病，病症或障碍的靶向病理状况出现后的症状的治疗抑制或减轻，预防病理病症，追求或获得有益的结果，或者即使治疗最终不成功也降低个体发展病症的机会。那些需要治疗的人包括那些已经患有这种病症的人，以及那些容易患有这种病症的人或者那些人中的病症需要被预防的人。可以单独使用DBDpp融合蛋白或与另外的治疗剂联合进行治疗。
“癌症”，“肿瘤”或“恶性肿瘤”被用作同义术语，并且是指许多疾病，其特征在于细胞的不受控制，异常增殖，受影响细胞的局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位(转移)的能力，以及许多特征性结构和/或分子特征中的任何一个。如本文所用，“肿瘤”是指所有肿瘤细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，以及所有的癌前和癌细胞和组织。“癌性肿瘤”或“恶性细胞”被理解为具有特定结构性质，缺乏分化和能够侵入和转移的细胞。可以使用本文提供的DBDpp融合蛋白治疗的癌症包括但不限于乳腺癌，肺癌，脑癌，骨癌，肝癌，肾癌，结肠癌，头颈癌，卵巢癌，造血系统癌症(例如白血病)和前列腺癌。本文描述了可使用含DBDpp的抗体治疗的其他类型的癌症和肿瘤，或本领域中已知的其它类型。
术语肿瘤抗原或癌症抗原在本文中可互换使用。肿瘤和癌症抗原可以是肿瘤特异性抗原(TSA)，癌症特异性抗原(CSA)，肿瘤相关抗原(TAA)或癌症相关抗原(CAA)。TSA是肿瘤细胞特有的抗原，不会在体内的其他细胞上发生。TAA是在肿瘤和一些正常细胞上均发现的抗原。由于肿瘤的动态性质，在一些情况下，肿瘤细胞可以在某些阶段表达独特的抗原，并且在其它情况下也表达在非肿瘤细胞上也表达的抗原。因此，包含作为TAA某种标志物并不排除它被认为是TSA。可被DBDpp特异性结合的TAA和TSA的实例包括但不限于：CD19，CD20，CD22，ROR 1，间皮素，CD33/lL3Ra，cMet，PSMA，糖脂F77，EGFRvIII，GD2，NY-ESO-1TCR，MAGE A3TCR MARTI，gp100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP1，TRP2，MAGE1，MAGE3，BAGE，GAGE1，GAGE2，pi5，CEA；p53，Ras，HER-2/neu；BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，1GH-IGK，MYL-RAR；EBVA，HPV抗原E6和E7，TSP-180，MAGE4，MAGE5，MAGE6，RAGE，NY-ESO，pl85erbB2，pl80erbB3，nm-23Hl，PSA，CA 19-9，CA72-4，CAM 17.1，NuMa，K-ras，β-联蛋白，CDK4，Mum-1，p15，p16，43-9F，5T4(791Tgp72)甲胎蛋白，β-HCG，BCA225，BTAA，CA125，CA15-3\CA 27.29\BCAA，CA195，CA242，CA50，CAM43，CD68\I，CO-029，FGF5，G250，Ga733VEpCAM，HTgp-175，M344，MA50，MG7-Ag，MOV 18，NB/70K，NY-CO-1，RCAS1，SDCCAG16，TA90\Mac-2，TAAL6，TAG72，TLP和TPS。
如本文所用的术语“靶细胞”是指疾病中涉及并且可以被含有DBDpp的组合物靶向的细胞。其他靶细胞包括能够被本发明的DBDpp靶向的受试者(例如，人或动物)中的任何细胞。靶细胞可以是表达或过表达与DBDpp融合蛋白特异性结合的靶的细胞。
术语“效应细胞”是表达一种或多种FcR并进行效应功能的白细胞。优选地，所述细胞表达至少Fc(RIII)并且进行ADCC效应功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)，自然杀伤(NK)细胞，单核细胞，细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中PBMC和NK细胞在某些实施方案中是优选的。可以从其天然来源，例如从本文或本领域以其他方式已知的血液或PBMC中分离效应细胞。在具体实施方案中，效应细胞是人效应细胞。
术语“效应功能”是指分化细胞的专门免疫功能。例如，T细胞的效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
在本文中术语“T细胞”和“T淋巴细胞”是可互换的并且同义使用。实例包括但不限于幼稚T细胞，中枢记忆T细胞，效应记忆T细胞或其组合。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指哺乳动物免疫系统的细胞，包括但不限于抗原呈递细胞，B细胞，嗜碱性粒细胞，细胞毒性T细胞，树突细胞，嗜酸性粒细胞，粒细胞，辅助T细胞，白细胞，淋巴细胞，巨噬细胞，肥大细胞，记忆细胞，单核细胞，自然杀伤细胞，嗜中性粒细胞，吞噬细胞，浆细胞和T细胞。
本文使用的术语“免疫应答”是指包括但不限于先天免疫，体液免疫，细胞免疫，免疫，炎性应答，获得性(适应性)免疫，自身免疫和/或过度活跃免疫的免疫。
如本文所用的术语“转导”是指使用病毒载体将外源核酸导入细胞中。如本文所用的“转染”是指使用重组DNA技术将外源核酸引入细胞中。术语“转化”意指向宿主细胞引入“外来的”(例如，外在的，细胞外的或其他非内源的)核酸(DNA或RNA)序列，使得宿主细胞将表达引入的核酸产生期望的物质，如由引入的编码序列编码的蛋白质或酶。所引入的核酸序列也可以被称为“克隆”或“外源”基因或序列，可以包括调控或控制序列，例如起始，终止，启动子，信号，分泌或细胞遗传机制所使用的其他序列。核酸序列可以包括非功能性序列或不具有已知功能的序列。接受和表达引入的核酸(例如DNA或RNA)的宿主细胞已被“转化”并且是“转化体”或“克隆”。引入宿主细胞的DNA或RNA可以来自任何来源，包括与宿主细胞具有相同属或种的细胞，或不同属或种的细胞，或者可以是非天然发生的。
“细胞表面受体”是指能够接收信号以及这种信号穿过细胞质膜的传递的分子和分子复合物。本文提供的细胞表面受体的实例是激活的整联蛋白受体，例如转移细胞上的激活的αvβ3整联蛋白受体。如本文所用，“细胞表面受体”还包括在细胞表面上表达的分子，其含有能够结合目的靶的DBDpp。术语“受体”表示与分子(例如配体)结合或以其他方式相互作用并介导配体对细胞的作用的细胞相关蛋白。在若干实施方案中，与受体相互作用的分子是生物学活性分子。膜结合的细胞表面受体的特征在于包含细胞外配体结合结构域，跨膜结构域和通常参与信号转导的细胞内效应结构域的多结构域结构。
如本文所用的“嵌合抗原受体”或“CAR”是指工程改造的受体，其将抗原或靶特异性移植到细胞上(例如T细胞，例如幼稚T细胞，中枢记忆T细胞，效应记忆T细胞，NK细胞，NKT细胞或其组合)。CAR也被称为人工T细胞受体，嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体。
从头结合结构域多肽
术语“从头结合结构域”和DBD在本文中可互换使用，以描述共享参考支架序列的某些序列和某些结构特征的靶结合序列，其中参考支架序列为：MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQID NO:1)。术语DBDpp和DBD多肽包括单数(即，一个DBD多肽)和复数(即，多个DBD多肽)参考，除非另外明确地或通过上下文指示。DBDpp是可以特异性(非随机)结合靶分子的多肽。
已经发现并在本文的若干实施方案中公开了非天然存在的和无靶向的(申请人不知道能够结合的靶)具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的反向平行的三螺旋束可以用作参考支架平台，用于产生结合目的靶的含有从头结合结构域(DBD)的多肽(DBDpp)，并且可以用于产生DBDpp文库，其可以用于筛选具有期望功能和/或生物学活性的DBDpp。因此，在一些方面，本公开涉及DBDpp在产生具有期望性质(例如结合目的靶的能力)的DBDpp的方法；生产DBDpp文库的方法；由这种方法产生的DBDpp文库；用于筛选此类DBDpp文库以获得期望的生物学活性的方法；以及从这些文库中鉴定的DBDpp中的用途。
除非另有说明，否则所公开的组合物和方法的实践采用分子生物学的标准技术(包括重组技术，组织培养和细胞转化)，微生物学，细胞生物学，生物化学和免疫学，这些技术在现有技术范围内。这些技术通常根据制造商的说明书进行，或通常使用或常规修改已知的方法来完成，例如在Sambrook et al.(Molecular Cloning:A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))；PCRTechnology:Principles and Applications for DNA Amplification(ed.H.A.Erlich，Freeman Press，NY，N.Y.，1992)；Oligonucleotide Synthesis(Gait，ed.，1984)；AnimalCell Culture(Freshney，ed.，1987)；Handbook of Experimental Immunology(Weir etal.，eds.；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Miller，ed.，1987)；CurrentProtocols in Molecular Biology(Ausubel.，ed.，1987)；PCR Protocols:A Guide toMethods and Applications(Innis，ed.，Academic Press，San Diego，Calif.，1990)；Mattila，et al.，Nucleic Acids Res.19:967(1991)；Eckert，et al.，PCR Methods andApplications 1:17(1991)；PCR(McPherson，ed.，IRL Press，Oxford)；PCR:ThePolymerase Chain Reaction，(Mullis，ed.，1994)；Harlow，Antibodies:A LaboratoryManual，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，2nd ed.1988)和Kontermann，ed.，“TheAntibody Engineering Lab Manual”(Springer Verlag，Heidelberg/New York，2000)；Current Protocols in Immunology(Coligan，ed.，1991)；The Immunoassay Handbook(Wild，ed.，Stockton Press NY，1994)；和Methods of Immunological Analysis(Masseyeff.，ed.，Weinheim:VCH Verlags gesellschaft mbH，1993)；和Gennaro，etal.2000，Remington:the Science and Practice of Pharmacy，20th Ed.LipincottWilliams and Wilkins:Baltimore，Md.中描述的，或如本文所述的。除非提供具体的定义，否则与本文的分析化学，合成有机化学以及药物和药物化学相关的术语以及实验室程序和技术是本领域已知和使用的那些术语。另外，标准技术可用于化学合成，化学分析，重组生产，纯化，药物制备，配制，递送和患者的治疗。
在一个实施方案中，DBDpp不是源自公共记录的天然细胞配体(如2015年4月6日提交的美国临时申请序列号62/143,772的记录，并且根据申请人的知识)。在另一个实施方案中，DBDpp不是源自免疫球蛋白衍生的抗原结合结构域或另一个抗体结构域，例如恒定区，可变区，互补决定区(CDR)，框架区，Fc结构域或铰链区。在另一个实施方案中，DBDpp不包含三个CDR。在另一个实施方案中，DBDpp不包含CDR1和CDR2。在又一个实施方案中，DBDpp不包含CDR1。在又一个实施方案中，DBDpp不含有CDR2。在另一个实施方案中，DBDpp不是源自蛋白A。在另一个实施方案中，DBDpp不源自天然细菌受体。在另一个实施方案中，DBDpp不源自纤连蛋白。在另一个实施方案中，DBDpp不源自III型纤连蛋白结构域。在又一个实施方案中，DBDpp不源自knottin蛋白。在又一个实施方案中，DBDpp不源自脂质运载蛋白。在又一个实施方案中，DBDpp不源自亲和体。
序列特征
如上所示，SEQ ID NO:1的参考支架多肽含有三个反向平行的α螺旋，并且是最初工程改造为蛋白质折叠练习的非天然存在的和无靶向的多肽序列的变体。本文提供的是在SEQ ID NO:1的参考支架多肽的序列中的氨基酸残基含有某些修饰的DBDpp，其赋予DBDpp结合目的靶的能力并且DBDpp作为靶结合剂和靶向剂的用途。
在一个实施方案中，个体DBDpp具有约65至150个氨基酸，约65至125个氨基酸，约65至100个氨基酸，约65至90个氨基酸，约65至80个氨基酸，约65至70个氨基酸的长度。在一些实施方案中也考虑了DBDpp具有约75至150个氨基酸，约75至125个氨基酸，约75至100个氨基酸，约75至90个氨基酸，约75至80个氨基酸的长度。DBDpp可以是裸露的或缀合至其他分子，包括但不限于毒素和放射性同位素。在另外的实施方案中，采用更长的DBDpp，例如DBDpp长度为约150至约160个氨基酸，约160至约170个氨基酸，约170至约180个氨基酸，约180至约190个氨基酸，约190至约200个氨基酸，或所列出的那些(包括端点)之间的任何长度。
对于已知的结合蛋白，构成分子结合区的特定残基或者已经(或者理论上可以)通过实验确定。天然结合蛋白(例如抗体或蛋白A)具有促进与其已知靶结合的可识别残基。然而，与天然配体和结合蛋白不同，设计的蛋白质α3d(SEQ ID NO:49)或SEQ ID NO:1的参考支架序列不已知与另一种蛋白质(例如靶)特异性结合。因此内源性结合残基不能被用作工程改造新的结合特异性的指导。在构建与靶结合的DBDpp时，如果残基被表面暴露-表现出显著的溶剂可及性，则认为残基被认为是突变(例如，文库内的随机化)。与分离状态(面积I)相比，结构域(面积D)内残基的相对可及性表示为百分比值(％A)。具有小于约10％至11％的％A值的氨基酸残基(例如对应于SEQ ID NO:1的F7，L11，I14，L18，L21，S24，L28，F31，I35，F38，L42，Y45，G49，V53，L56，A60，I63和L67的残基)被认为是外部溶剂难及的，并被认为是SEQ ID NO:1结构的内部核心残基。相反，认为具有大于约10％至11％的％A值的SEQ ID NO:1的氨基酸残基占据具有与目的靶相互作用的更大潜力的位置。蛋白质的结合表面通常由几个氨基残基组成，这些氨基残基在三维空间中彼此相邻或彼此靠近。因此，根据本文的若干实施方案，构建文库的次要考虑是这些选择的残基在DBDpp的预测的二级和三级结构内的相对接近度。
蛋白质二级结构例如α螺旋可以根据环境变量如温度，基质或缓冲液的组成和浓度而改变。预测SEQ ID NO:1的参考多肽序列的α螺旋二级结构由螺旋1的残基G2-A20，螺旋2的残基L28-A44和螺旋3的残基E52-Y70组成。在其他实施方案中预测SEQ ID NO:1的参考多肽序列的α螺旋二级结构由螺旋1的残基W4-L21，螺旋2的残基E25-Y45和螺旋3的残基P51-Y70组成。对应于具有低溶剂可及性的α螺旋残基的参考支架的氨基酸位置是SEQ IDNO:1的F7，L11，I14，L18，L21，L28，F31，I35，F38，L42，Y45，V53，L56，A60，I63和L67。对应于溶剂可及性的α螺旋残基的参考支架的氨基酸位置是SEQ ID NO:1的G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69和Y70。对应于非α螺旋残基的参考支架的氨基酸位置如下：SEQ ID NO:1的M1，G22，G23，S24，E25，A26，E27，K46，G47，K48，G49，N50，P51，R71，H72和N73。
在一个实施方案中，DBDpp被定义为由具有一个或多个氨基酸置换的SEQ ID NO:1组成的结合靶的多肽。在一个实施方案中，DBDpp与SEQ ID NO:1的序列比对将显示大于90％的序列同一性。在其他实施方案中，DBDpp与SEQ ID NO:1的序列比对将显示大于80％的序列同一性。在其他实施方案中，DBDpp与SEQ ID NO:1的序列比对将显示大于70％的序列同一性。在其他实施方案中，DBDpp与SEQ ID NO:1的序列比对将显示大于60％的序列同一性。在其他实施方案中，DBDpp与SEQ ID NO:1的序列比对将显示大于50％的序列同一性。
在一些实施方案中，具有小于10％的％A值的DBDpp残基将保持不变，或被保守的氨基酸改变置换。在具体的实施方案中，溶剂可及(即大于10的A％)残基DBDpp具有经过诱变修饰的氨基酸序列将位于与α-螺旋二级结构相关的多肽的区域内。具有溶剂难及残基的序列SEQ ID NO:1的α螺旋位置对应于SEQ ID NO:1的F7，L11，I14，L18，L21，L28，F31，I35，F38，L42，Y45，V53，L56，A60，I63和L67。这些位置的氨基酸置换优选是保守的，可以包括非常规或非天然氨基酸。在一些实施方案中，天然氨基酸置换的选择包括L，I，V，A和F(和W，Y，M)。在一些DBDpp中，DBDpp中所含的DBD的溶剂不可及的残基与SEQ ID NO:1中的相应残基相比大于60％，70％，80％或90％或100％相同。SEQ ID NO:1的F7，L11，I14，L18，L21，L28，F31，I35，F38，L42，Y45，V53，L56，A60，I63和L67。
在一个实施方案中，DBDpp包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中总共5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个氨基酸残基已被修饰；并且其中DBDpp特异性地结合目的靶。在另一个实施方案中，修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个置换。在另一个实施方案中，修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个为保守置换。在另一个实施方案中，修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个是非保守置换。在另一个实施方案中，氨基酸残基修饰的5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个为保守置换，5至15个，5至20个，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个氨基酸残基修饰是非保守置换。在另外的实施方案中，置换中的1至25，1至30，1至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个位于SEQ IDNO:1的氨基酸残基选自M1，G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，L21，G22，G23，S24，E25，A26，E27，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，Y45，K46，G47，K48，G49，N50，P51，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69，Y70，R71，H72和N73。在另外的实施方案中，置换中的1至25，1至30，1至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个位于SEQ ID NO:1的氨基酸残基选自M1，G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，G22，G23，S24，E25，A26，E27，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，K46，G47，K48，G49，N50，P51，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69，Y70，R71，H72和N73。在进一步的实施方案中，置换中的1至20，1至30或1至40个位于SEQ ID NO:1的氨基酸残基选自G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69和Y70。在任选的进一步的实施方案中，DBDpp任选进一步包含氨基酸序列，其中1至5，1至10，1至15，5至10或5至15个残基对应于氨基酸序列SEQ ID NO:1的溶剂难及残基被置换，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另一个任选的实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的溶剂不可及残基的置换残基选自：F7，L11，I14，L18，L28，F31，I35，F38，L42，V53，L56，A60，I63和L67以及Y70。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的溶剂难及残基的置换残基选自：F7，L11，I14，L18，L21，L28，F31，I35，F38，L42，Y45，V53，L56，A60，I63和L67以及Y70。在另外的实施方案中，DBDpp是融合蛋白。在一个实施方案中，DBDpp附着到固体支持物上。在另一个实施方案中，固体支持物选自：珠，载玻片，芯片，明胶和琼脂糖。在另外的实施方案中，DBDpp特异性地结合选自核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子的目的靶。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和含肽标签的蛋白。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。还提供了编码DBDpp的核酸和含有核酸的载体。还提供了含有核酸和载体的宿主细胞(包括病毒颗粒)。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另外的实施方案中，宿主细胞是在其表面展示DBDpp的原核生物或真核生物。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上表达DBDpp融合蛋白的人免疫细胞。还提供了包含多个DBDpp的文库。
在一个实施方案中，分离的DBDpp包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列变异，其中SEQID NO:1的5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40个溶剂可及的氨基酸残基被置换，并且其中SEQ ID NO:1的1至5，1至10，1至15，5至10或5至15个溶剂不可及的残基任选被保守氨基酸置换所置换，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的置换的溶剂可及的氨基酸残基具有大于10的％A。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的置换的溶剂难及的氨基酸残基具有小于10的％A。在一个实施方案中，SEQ ID NO:1的置换的溶剂可及氨基酸残基选自：G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69和Y70。在一些实施方案中，至少3，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30或35个溶剂可及的酸残基被置换。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的至少3，5，6，7，8，9，10，15，20，25或30个溶剂可及酸残基被保守氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，SEQ IDNO:1的至少3，5，6，7，8，9，10，15，20，25或30个溶剂可及酸残基被非保守性氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，氨基酸置换不包含脯氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换不含半胱氨酸或脯氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基置换包括不多于一个半胱氨酸。在一些实施方案中，溶剂可及酸残基的1至5，1至10，5至15，5至20，5至25，5至30或5至35个被置换。在一些实施方案中，溶剂可及酸残基的5至41，10至41，15至41，20至41，25至41，30至41或35至41个被置换。在一些实施方案中，5至35个溶剂可及酸残基被保守置换所置换，并且5至35个溶剂可及酸残基被非保守置换所置换，或5至25个溶剂可及酸残基被保守置换所置换和5到25个溶剂可及酸残基被非保守置换所置换。在任选的进一步的实施方案中，DBDpp任选进一步包含氨基酸序列，其中1至5，1至10，1至15，5至10或5至15个残基对应于氨基酸序列SEQ ID NO:1的溶剂难及残基被置换，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另一个任选的实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的溶剂不可及残基的置换残基选自：F7，L11，I14，L18，L28，F31，I35，F38，L42，V53，L56，A60，I63和L67以及Y70。在另一个任选的实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的溶剂难及残基的置换残基选自：F7，L11，I14，L18，L21，L28，F31，I35，F38，L42，Y45，V53，L56，A60，I63和L67以及Y70。在另外的实施方案中，DBDpp是融合蛋白。在一个实施方案中，DBDpp附着到固体支持物上。在另一个实施方案中，固体支持物选自：珠，载玻片，芯片，明胶和琼脂糖。在另外的实施方案中，DBDpp特异性地结合选自核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子的目的靶。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和含肽标签的蛋白。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。还提供了编码DBDpp的核酸和含有核酸的载体。还提供了含有核酸和载体的宿主细胞(包括病毒颗粒)。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另外的实施方案中，宿主细胞是在其表面展示DBDpp的原核生物或真核生物。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上表达DBDpp融合蛋白的人免疫细胞。还提供了包含多个DBDpp的文库。
术语“环”是指DBD中对应于位于例如参考支架SEQ ID NO:1的螺旋1和螺旋2之间的环的序列(例如，SEQ ID NO:2-6的22-24位，以及SEQ ID NO:7-11的Z1)，和/或位于参考支架SEQ ID NO:1的螺旋2和螺旋3之间的环，例如SEQ ID NO:2-6的位置46-48和SEQ IDNO:7-11的Z2)。在具体的实施方案中，Z1和Z2环中的一个或两个是由2至5，2至10，2至15，2至20，2至25或2至30个氨基酸残基(包括端点和任何在列出的那些之间的数字)组成的。在一些实施方案中，Z1和Z2环中的一个或两个是由1，2，3，4，5，5，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16个17，18，19，20或多于20个氨基酸残基(包括端点和列出的那些之间的任何数字)组成的氨基酸序列。在另一个实施方案中，Z1和/或Z2环的至少50％，60％，70％，80％，90％或95％的氨基酸残基是甘氨酸或丝氨酸。在另外的实施方案中，Z1和/或Z2环的至少50％，60％，70％，80％，90％或95％的氨基酸残基选自甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，丙氨酸，脯氨酸，组氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，赖氨酸和精氨酸。在一个实施方案中，Z1环具有氨基酸序列GGS。在一个实施方案中，Z2环具有氨基酸序列KGKG。
在一个实施方案中，DBDpp包含以下氨基酸序列：MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41L QX44YKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO:2)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X30，X33，X34，X37，X40，X41和X44是天然和/或非天然氨基酸残基，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在一个具体的实施方案中，DBDpp不含有氨基酸序列LAAIKTRLQ(SEQ ID NO:50)。在另外的实施方案中，DBDpp是融合蛋白。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被置换的氨基酸残基被保守氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的以上氨基酸残基中至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被非保守氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，氨基酸置换不包含脯氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换不含半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换中不包括脯氨酸或半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基置换包括不多于一个半胱氨酸。在一些实施方案中，1至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换，1至12个溶剂可及酸残基被非保守置换所置换，或5至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换和5至12个溶剂可及氨基酸残基被非保守置换所置换。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自下组的目的靶：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和包含肽标签的蛋白。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。在另外的实施方案中，提供了包含多个DBDpp的文库。还提供了编码DBDpp的核酸和含有核酸的载体。还提供了含有核酸和载体的宿主细胞(包括病毒颗粒)。在一些实施方案中，宿主细胞是在其表面展示DBDpp的原核生物或真核生物。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上表达DBDpp融合蛋白的人免疫细胞。在一个实施方案中，DBDpp附着到固体支持物上。在另一个实施方案中，固体支持物选自：珠，载玻片，芯片，明胶和琼脂糖。
在一个实施方案中，DBDpp包含以下氨基酸序列：MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:3)，其中X32，X33，X36，X39，X40，X43，X57，X58，X61，X64，X65和X68是天然和/或非天然氨基酸残基，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在一个具体的实施方案中，DBDpp不含有氨基酸序列LAAIKTRLQ(SEQID NO:50)。在另外的实施方案中，DBDpp是融合蛋白。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被置换的氨基酸残基被保守氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的以上氨基酸残基的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被非保守性氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，氨基酸置换不包含脯氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换不含半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换中不包括脯氨酸或半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基置换包括不多于一个半胱氨酸。在一些实施方案中，1至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换，1至12个溶剂可及酸残基被非保守置换所置换，或5至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换和5至12个溶剂可及氨基酸残基被非保守置换所置换。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自下组的目的靶：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和包含肽标签的蛋白。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。在另外的实施方案中，提供了包含多个DBDpp的文库。还提供了编码DBDpp的核酸和含有核酸的载体。还提供了含有核酸和载体的宿主细胞(包括病毒颗粒)。在一些实施方案中，宿主细胞是在其表面展示DBDpp的原核生物或真核生物。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上表达DBDpp融合蛋白的人免疫细胞。在一个实施方案中，DBDpp附着到固体支持物上。在另一个实施方案中，固体支持物选自：珠，载玻片，芯片，明胶和琼脂糖。
在一个实施方案中，DBDpp包含以下氨基酸序列：MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:4)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X55，X58，X59，X62，X65和X66是天然和/或非天然氨基酸残基，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在一个具体的实施方案中，DBDpp不含有氨基酸序列LAAIKTRLQ(SEQ ID NO:50)。在另外的实施方案中，DBDpp是融合蛋白。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被置换的氨基酸残基被保守氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的以上氨基酸残基的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被非保守性氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，氨基酸置换不包含脯氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换不含半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换中不包括脯氨酸或半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基置换包括不多于一个半胱氨酸。在一些实施方案中，1至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换，1至12个溶剂可及酸残基被非保守置换所置换，或5至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换和5至12个溶剂可及氨基酸残基被非保守置换所置换。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自下组的目的靶：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和包含肽标签的蛋白。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。在另外的实施方案中，提供了包含多个DBDpp的文库。还提供了编码DBDpp的核酸和含有核酸的载体。还提供了含有核酸和载体的宿主细胞(包括病毒颗粒)。在一些实施方案中，宿主细胞是在其表面展示DBDpp的原核生物或真核生物。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上表达DBDpp融合蛋白的人免疫细胞。在一个实施方案中，DBDpp附着到固体支持物上。在另一个实施方案中，固体支持物选自：珠，载玻片，芯片，明胶和琼脂糖。
在一个实施方案中，DBDpp包含以下氨基酸序列：MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:5)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X32，X33，X36，X39，X40，X43，X55，X58，X59，X62，X65和X66是天然和/或非天然氨基酸残基，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在一个具体的实施方案中，DBDpp不含有氨基酸序列LAAIKTRLQ(SEQ ID NO:50)。在另外的实施方案中，DBDpp是融合蛋白。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被置换的氨基酸残基被保守氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的以上氨基酸残基的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被非保守性氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，氨基酸置换不包含脯氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换不含半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换中不包括脯氨酸或半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基置换包括不多于一个半胱氨酸。在一些实施方案中，1至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换，1至12个溶剂可及酸残基被非保守置换所置换，或5至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换和5至12个溶剂可及氨基酸残基被非保守置换所置换。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自下组的目的靶：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和包含肽标签的蛋白。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。在另外的实施方案中，提供了包含多个DBDpp的文库。还提供了编码DBDpp的核酸和含有核酸的载体。还提供了含有核酸和载体的宿主细胞(包括病毒颗粒)。在一些实施方案中，宿主细胞是在其表面展示DBDpp的原核生物或真核生物。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上表达DBDpp融合蛋白的人免疫细胞。在一个实施方案中，DBDpp附着到固体支持物上。在另一个实施方案中，固体支持物选自：珠，载玻片，芯片，明胶和琼脂糖。
在一个实施方案中，DBDpp包含以下氨基酸序列：MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:6)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X30，X33，X34，X37，X40，X41，X44，X57，X58，X61，X64，X65和X68是天然和/或非天然氨基酸残基，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在一个具体的实施方案中，DBDpp不含有氨基酸序列LAAIKTRLQ(SEQ ID NO:50)。在另外的实施方案中，DBDpp是融合蛋白。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被置换的氨基酸残基被保守氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的以上氨基酸残基的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被非保守性氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，氨基酸置换不包含脯氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换不含半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换中不包括脯氨酸或半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基置换包括不多于一个半胱氨酸。在一些实施方案中，1至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换，1至12个溶剂可及酸残基被非保守置换所置换，或5至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换和5至12个溶剂可及氨基酸残基被非保守置换所置换。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自下组的目的靶：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和包含肽标签的蛋白。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。在另外的实施方案中，提供了包含多个DBDpp的文库。还提供了编码DBDpp的核酸和含有核酸的载体。还提供了含有核酸和载体的宿主细胞(包括病毒颗粒)。在一些实施方案中，宿主细胞是在其表面展示DBDpp的原核生物或真核生物。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上表达DBDpp融合蛋白的人免疫细胞。在一个实施方案中，DBDpp附着到固体支持物上。在另一个实施方案中，固体支持物选自：珠，载玻片，芯片，明胶和琼脂糖。
还提供了分离的DBDpp，其包含以下氨基酸序列：MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO:7)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X28，X31，X32，X35，X38，X39和X42是天然和/或非天然氨基酸残基，其中Z1和Z2是2-30个天然和/或非天然氨基酸残基，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在一个具体的实施方案中，DBDpp不含有氨基酸序列LAAIKTRLQ(SEQ ID NO:50)。在另外的实施方案中，DBDpp是融合蛋白。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被置换的氨基酸残基被保守氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的以上氨基酸残基的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被非保守性氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，氨基酸置换不包含脯氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换不含半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换中不包括脯氨酸或半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基置换包括不多于一个半胱氨酸。在一些实施方案中，1至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换，1至12个溶剂可及酸残基被非保守置换所置换，或5至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换和5至12个溶剂可及氨基酸残基被非保守置换所置换。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自下组的目的靶：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和包含肽标签的蛋白。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。在另外的实施方案中，提供了包含多个DBDpp的文库。还提供了编码DBDpp的核酸和含有核酸的载体。还提供了含有核酸和载体的宿主细胞(包括病毒颗粒)。在一些实施方案中，宿主细胞是在其表面展示DBDpp的原核生物或真核生物。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上表达DBDpp融合蛋白的人免疫细胞。在一个实施方案中，DBDpp附着到固体支持物上。在另一个实施方案中，固体支持物选自：珠，载玻片，芯片，明胶和琼脂糖。
还提供了分离的DBDpp，其包含以下氨基酸序列：MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:8)，其中X30，X31，X34，X37，X38，X41，X52，X53，X56，X59，X60和X63是天然和/或非天然氨基酸残基，其中Z1和Z2是2-30个天然和/或非天然氨基酸残基，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在一个具体的实施方案中，DBDpp不含有氨基酸序列LAAIKTRLQ(SEQ ID NO:50)。在另外的实施方案中，DBDpp是融合蛋白。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被置换的氨基酸残基被保守氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的以上氨基酸残基的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被非保守性氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，氨基酸置换不包含脯氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换不含半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换中不包括脯氨酸或半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基置换包括不多于一个半胱氨酸。在一些实施方案中，1至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换，1至12个溶剂可及酸残基被非保守置换所置换，或5至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换和5至12个溶剂可及氨基酸残基被非保守置换所置换。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自下组的目的靶：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和包含肽标签的蛋白。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。在另外的实施方案中，提供了包含多个DBDpp的文库。还提供了编码DBDpp的核酸和含有核酸的载体。还提供了含有核酸和载体的宿主细胞(包括病毒颗粒)。在一些实施方案中，宿主细胞是在其表面展示DBDpp的原核生物或真核生物。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上表达DBDpp融合蛋白的人免疫细胞。在一个实施方案中，DBDpp附着到固体支持物上。在另一个实施方案中，固体支持物选自：珠，载玻片，芯片，明胶和琼脂糖。
还提供了分离的DBDpp，其包含氨基酸序列MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:10)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X30，X31，X34，X37，X38，X41，X50，X53，X54，X57，X60和X61是天然和/或非天然氨基酸残基，其中Z1和Z2是2-30个天然和/或非天然氨基酸残基，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在一个具体的实施方案中，DBDpp不含有氨基酸序列LAAIKTRLQ(SEQ ID NO:50)。在另外的实施方案中，DBDpp是融合蛋白。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被置换的氨基酸残基被保守氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，SEQ IDNO:1的以上氨基酸残基的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被非保守性氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，氨基酸置换不包含脯氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换不含半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换中不包括脯氨酸或半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基置换包括不多于一个半胱氨酸。在一些实施方案中，1至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换，1至12个溶剂可及酸残基被非保守置换所置换，或5至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换和5至12个溶剂可及氨基酸残基被非保守置换所置换。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自下组的目的靶：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和包含肽标签的蛋白。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。在另外的实施方案中，提供了包含多个DBDpp的文库。还提供了编码DBDpp的核酸和含有核酸的载体。还提供了含有核酸和载体的宿主细胞(包括病毒颗粒)。在一些实施方案中，宿主细胞是在其表面展示DBDpp的原核生物或真核生物。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上表达DBDpp融合蛋白的人免疫细胞。在一个实施方案中，DBDpp附着到固体支持物上。在另一个实施方案中，固体支持物选自：珠，载玻片，芯片，明胶和琼脂糖。
还提供了分离的DBDpp，包含以下氨基酸序列：MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:11)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X28，X31，X32，X35，X38，X39，X42，X52，X53，X56，X59，X60和X63是天然和/或非天然氨基酸残基，其中Z1和Z2是2-30个天然和/或非天然氨基酸残基，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在一个具体的实施方案中，DBDpp不含有氨基酸序列LAAIKTRLQ(SEQ ID NO:50)。在另外的实施方案中，DBDpp是融合蛋白。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被置换的氨基酸残基被保守氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，SEQ IDNO:1的以上氨基酸残基的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10个被非保守性氨基酸残基置换所置换。在一些实施方案中，氨基酸置换不包含脯氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换不含半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸置换中不包括脯氨酸或半胱氨酸。在一些实施方案中，氨基酸残基置换包括不多于一个半胱氨酸。在一些实施方案中，1至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换，1至12个溶剂可及酸残基被非保守置换所置换，或5至12个溶剂可及酸残基被保守置换所置换和5至12个溶剂可及氨基酸残基被非保守置换所置换。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自下组的目的靶：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的蛋白质：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和包含肽标签的蛋白。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。在另外的实施方案中，提供了包含多个DBDpp的文库。还提供了编码DBDpp的核酸和含有核酸的载体。还提供了含有核酸和载体的宿主细胞(包括病毒颗粒)。在一些实施方案中，宿主细胞是在其表面展示DBDpp的原核生物或真核生物。在一些实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上表达DBDpp融合蛋白的人免疫细胞。在一个实施方案中，DBDpp附着到固体支持物上。在另一个实施方案中，固体支持物选自：珠，载玻片，芯片，明胶和琼脂糖。
在一些实施方案中，DBDpp包含在SEQ ID NO:1的序列中的选自G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69和Y70的相应位置处的置换。在另外的实施方案中，DBDpp包含在SEQ ID NO:1的序列中的至少1，5，10，15，20或30个以上位置的置换。这些替换可以是保守的，非保守的，或保守和非保守置换的混合。在一些实施方案中，置换不包括添加脯氨酸或半胱氨酸。在一些实施方案中，置换包括不多于单个半胱氨酸。在一些DBDpp中，这些残基可以与SEQ ID NO:1大于90％相同。在其他DBDpp中，这些残基可以与SEQ ID NO:1大于80％相同。在其他DBDpp中，这些残基可以与SEQID NO:1大于70％相同。在其他DBDpp中，这些残基可以与SEQ ID NO:1大于60％相同。在其他DBDpp中，这些残基可以与SEQ ID NO:1大于50％相同。在其他DBDpp中，这些残基可以与SEQ ID NO:1大于40％相同。在其它DBDpp中，这些残基可以与SEQ ID NO:1大于30％相同。在其他DBDpp中，这些残基与SEQ ID NO:1大于20％相同。在其他DBDpp中，这些残基与SEQID NO:1大于10％相同。
在一些实施方案中，DBDpp包含在SEQ ID NO:1的序列中的选自M1，L21，G22，G23，S24，E25，A26，E27，Y45，K46，G47，K48，G49，N50，P51，R71，H72和N73的相应位置处的置换。
本文另外提供了DBDpp，其中氨基酸残基已从SEQ ID NO:1的相应序列的氨基末端，羧基末端或氨基末端和羧基末端二者被缺失。在一些实施方案中，DBDpp含有从对应于SEQ ID NO:1的序列的DBDpp序列的氨基末端缺失的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个氨基酸残基的序列。在一些实施方案中，DBDpp含有从对应于SEQ ID NO:1的序列的DBDpp序列的羧基末端缺失的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个氨基酸残基的序列。在一些实施方案中，DBDpp含有从对应于SEQ ID NO:1的序列的DBDpp序列的氨基末端缺失的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个氨基酸残基的序列和从对应于SEQ ID NO:1的序列的DBDpp序列的羧基末端缺失的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12个氨基酸残基的序列。在另外的实施方案中，DBDpp含有从对应于SEQ ID NO:1的序列的羧基末端缺失1-5个，1-10个或1-15个氨基酸残基的序列。在一些实施方案中，DBDpp含有从对应于SEQ ID NO:1的序列的氨基末端缺失1-5个，1-10个或1-15个氨基酸残基的序列和从对应于SEQ ID NO:1的序列的羧基末端缺失1-5个，1-10个或1-15个氨基酸残基的序列。
在一些实施方案中，DBDpp含有与参考SEQ ID NO:1中的对应序列在2种或更多类别的序列修饰(即，置换，缺失，插入和添加)中不同的序列。例如DBDpp可以包括与参考多肽序列内的相应序列相比氨基酸缺失，插入和置换的组合。在一些实施方案中，DBDpp在SEQID NO:1中所示的序列参考序列内含有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个或超过10个氨基酸缺失。在一些实施方案中，DBDpp在SEQ ID NO:1中所示的参考序列内含有1，2，3，4，5，6，7，8，9，10个或超过10个氨基酸插入。
DBDpp结合目的靶
根据一些实施方案，DBDpp能够结合到目的靶，并且在一些实施方案中，对靶的功能没有可察觉的影响。或者，在若干实施方案中，DBDpp可以结合目的靶并完全或部分抑制，拮抗，激动，阻断，增加，刺激或干扰靶的生物学活性。可将结合鉴定为激动或拮抗，并使用或常规修改本领域已知用于评估此类活性的测定，生物测定和/或动物模型来确定。
DBDpp激动剂是指以某种方式增加或增强DBDpp靶的生物学活性或具有与DBDpp靶的已知激动剂相当的生物学活性的DBDpp。在另一个实施方案中，DBDpp是其结合的靶的拮抗剂。DBDpp拮抗剂是指完全或部分阻断或以某种方式干扰DBDpp靶蛋白的生物学活性的DBDpp或具有与已知的DBDpp靶蛋白的拮抗剂或抑制剂相当的生物学活性的DBDpp拮抗剂。
像“针对靶的结合亲和力”，“与靶的结合”等的表达是指可以通过确定亲和常数直接测量的多肽的性质，例如，在给定的抗原浓度下缔合和解离的DBDpp的量。可以使用不同的方法来表征分子相互作用，例如但不限于竞争分析，平衡分析和微量热分析，以及基于表面等离子体共振相互作用的实时相互作用分析(例如使用仪器)。这些方法对于本领域技术人员来说是众所周知的，并且例如在Neri D et al.(1996)Tibtech 14:465-470和Jansson M et al.(1997)J Biol Chem272:8189-8197中描述。
给定DBDpp结合事件的亲和力要求取决于多种因素，包括但不限于：结合基质的组成和复杂性，DBDpp和靶分子二者的结合价(valency)和密度，以及DBDpp的功能应用。在一个实施方案中，DBDpp以小于或等于5×10-3M，10-3M，5×10-4M，10-4M，5×10-5M或10-5M的解离常数(KD)结合目的靶。在另外的实施方案中，DBDpp以小于或等于5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M或10-8M的KD结合目的靶。在另外的实施方案中，DBDpp以小于或等于5×10- 9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M或10-15M的KD结合目的靶。在若干实施方案中，通过本文公开的方法产生的DBDpp具有选自10-4M至10-5M，10-5M至10-6M，10-6M至10-7M，10-7M至10-8M，10-8M至10-9M，10-9M至10-10M，10-10M至10-11M以及10-11M至10-12M的解离常数。
在一个实施方案中，DBDpp以活性形式结合目的靶。在一个实施方案中，DBDpp以活性形式可逆地结合目的靶并且还以活性形式释放结合的靶。在一个实施方案中，DBDpp以天然形式结合目的靶。在具体的实施方案中，DBDpp结合具有大于或等于10-10sec-1，5×10- 9sec-1，10-9sec-1，5×10-8sec-1，10-8sec-1，5×10-7sec-1，10-7sec-1，5×10-6sec-1，10-6sec-1，5×10-5sec-1，10-5sec-1，5×10-4sec-1，10-4sec-1，5×10-3sec-1，10-3sec-1，5×10-2sec-1，10- 2sec-1，5×10-1sec-1，或10-1sec-1的解离速率或Koff。
可以在包括但不限于[pH 6.0，0.01％Tween 20]，[pH 6.0，0.1％明胶]，[pH 5.0，0.01％吐温20]，[pH9.0，0.1％吐温20]，[pH6.0，15％乙二醇，0.01％吐温20]，[pH5.0，15％乙二醇，0.01％吐温20]和[pH9.0，15％乙二醇，0.01％吐温20]的许多条件下进行结合实验以确定KD和解离速率。其中制备这些溶液的缓冲液可以容易地由本领域技术人员确定，并且主要取决于最终溶液的所需pH。低pH溶液(<pH 5.5)可以在例如柠檬酸盐缓冲液，甘氨酸-HCl缓冲液或琥珀酸缓冲液中制备。可以在例如Tris-HCl，磷酸盐缓冲液或碳酸氢钠缓冲液中制备高pH溶液。为了确定例如最佳的pH和/或盐浓度，可以使用许多条件来确定KD和解离速率。
在一个实施方案中，DBDpp以范围为0.1至10-7sec-1，10-2至10-7sec-1或0.5X 10-2至10-7sec-1的Koff特异性结合目的靶。在具体的实施方案中，DBDpp(例如DBDpp融合蛋白)以小于5X 10-2sec-1，10-2sec-1，5X 10-3sec-1，或10-3sec-1的解离速率(Koff)结合目的靶。在另外的实施方案中，DBDpp以小于5X 10-4sec-1，10-4sec-1，5X 10-5sec-1，或10-5sec-1，5X10-6sec-1，10-6sec-1，5X 10-7sec-1，或10-7sec-1的解离速率(Koff)结合目的靶。
在一个实施方案中，DBDpp以范围为103至107M-1sec-1，103至106M-1sec-1，或103至105M-1sec-1的KOn特异性结合目的靶。在其他具体的实施方案中，DBDpp(例如，DBDpp融合蛋白)以大于103M-1sec-1，5X 103M-1sec-1，104M-1sec-1，或5X 104M-1sec-1的结合速率(Kon)结合目的靶。在另外的实施方案中，DBDpp以大于105M-1sec-1，5X 105M-1sec-1，106M-1sec-1，或5X106M-1sec-1，或107M-1sec-1的Kon结合目的靶。
目的DBDpp靶
DBDpp特异性结合的目的靶可以是期望DBDpp结合的任何分子。例如，通过DBDpp特异性结合的靶可以是纯化，制造，配制，治疗，诊断或预后相关性或价值的任何靶。这里通过举例的方式提供了许多示例性靶，并且旨在是说明性的而不是限制性的。目的靶可以是天然发生的或合成的。目的靶可以是细胞外组分或细胞内组分，可溶的因子(例如酶，激素，细胞因子和生长因子，毒素，毒液，污染物等)或跨膜蛋白(例如细胞表面受体)。在一个实施方案中，由DBDpp特定地结合的目的靶本身是具有不同序列的DBDpp。
在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白特异性结合靶细胞表面上的目的靶。在另一个实施方案中，DBDpp融合蛋白特异性结合细胞表面受体。在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白特异性结合作为选自以下的家族成员的目的靶：生长因子受体，酪氨酸激酶受体，TNF家族受体，G蛋白偶联受体和趋化因子受体。在一些实施方案中，DBDpp融合蛋白结合相同家族的多个成员(例如TNF受体TRAILR1和TRAILR2)。在一些实施方案中，DBDpp融合蛋白结合来自不同家族的成员。因此，例如，在一些实施方案中，DBDpp融合蛋白能够结合生长因子受体和TNF受体或G蛋白偶联受体和趋化因子受体。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合血清蛋白或治疗性蛋白，例如抗体或抗体片段。在一些实施方案中，由DBDpp(例如DBDpp融合蛋白)结合的目的靶是人蛋白。在一个实施方案中，DBDpp(例如DBDpp融合蛋白)结合目的人蛋白靶及其猴(例如食蟹猴)，小鼠，兔，仓鼠和/或兔直系同源物。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合其为血清蛋白的目的靶。在一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自血清白蛋白(例如人血清白蛋白(HSA))，甲状腺素结合蛋白，转铁蛋白，纤维蛋白原和免疫球蛋白(例如IgG，IgE和IgM)的血清蛋白。不受理论束缚，认为DBDpp与载体蛋白的结合赋予DBDpp(或其融合物)改善的药效学特征，包括但不限于与其中载体蛋白结合序列缺失的DBDpp融合蛋白相比，改善的肿瘤靶向性，肿瘤穿透性，肿瘤内扩散性和增强的治疗活性(参见例如WO 01/45746，其内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，由DBDpp特异性结合的目的靶是疾病相关抗原。抗原可以是癌症和/或特定细胞类型(例如过度增殖细胞)和/或病原体(例如，细菌细胞(例如，结核，天花和炭疽))，病毒(例如HIV)，寄生虫(例如疟疾和利什曼病)，真菌感染，霉菌，支原体，朊病毒抗原或与免疫系统疾病相关的抗原的特征性抗原。
在另外的实施方案中，由DBDpp(例如，DBDpp融合蛋白)结合的目的靶是细菌抗原，病毒抗原，真菌抗原，支原体抗原，朊病毒抗原或寄生虫抗原(例如感染哺乳动物的一种)。在一个实施方案中，DBDpp的靶是炭疽，乙型肝炎，狂犬病，尼帕病毒，西尼罗河病毒，脑膜炎病毒或CMV。在另外的实施方案中，DBDpp特异性结合病原体。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合癌症靶。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合TSA或TAA。在一些实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的靶：PTGER4，ITGA4，CD37，CD52，CD62L(L-选凝素)，CXCR4，CD69，EVI2B(CD361)，SLC39A8，MICB，LRRC70，CLELC2B，HMHA1，LST1和CMTM6(CKLFSF6)。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合CD19(B-CLL，B-ALL，白血病，淋巴瘤，BNHL/CLL，HCST后ALL，B淋巴恶性肿瘤，B谱系恶性肿瘤)，CD20(套细胞淋巴瘤/无痛性B-NHL)，PMSA(前列腺癌)，CEA(乳腺癌，结直肠癌)，Her2/neu(肺癌，骨肉瘤，成胶质细胞瘤)，κ轻链(B-NHL和B-CLL)。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自CD47，CTLA4，DR5，KIR，LAG3，OX40，PD-L1和TIM3的靶。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合目的靶选自：PDGFRA，PDGFRB，PDGFA，PDGFB，PDGFCC，PDGFC，PDGFD，VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，VEGFC，VEGFD，神经毡蛋白2(NRP2)，betacellulin，PLGF，RET(在转染过程中重排)，TIE1，TIE2(TEK)，CA125，CD3，CD4，CD7，CD10，CD13，CD19，CD22，CD25，CD30，CD32，CD32b，CD33，CD38，FRSF5(CD40)，CD44(例如，CD44v6)，CD47，CD49e(整联蛋白α5)，CD52，CD54(ICAM)，CD55，CD64，CD74，CD80，CD90，CD117(cKit)，CD133，CD200，(prominin1)，CD147，CD166，CD200，ESA，SHH，DHH，IHH，patched 1(PTCH1)，smoothened(SMO)，WNT1，WNT2B，WNT3A，WNT4.WNT4A，WNT5A，WNT5B，WNT7B，WNT8A，WNT10A，WNT10B，WNT16B，LKP5，LRP5，LRP6，FZD1，FZD2，FZD4，FZD5，FZD6，FZD7，FZD8，Notch，Notch1，Notch3，Notch4，DLL4，Jagged，Jagged1，Jagged2，Jagged3，TNFSF1(TNFb，LTa)，TNFRSF1A(TNFR1，p55，p60)，TNFRSF1B(TNFR2)，TNFSF6(Fas配体)，TNFRSF6(Fas，CD95)，TNFRSF6B(DcR3)，TNFSF4(OX40配体)，TNFSF5(CD40配体)，TNFSF7(CD27配体，CD70)，TNFRSF7(CD27)，TNFSF8(CD30配体)，TNFSF9(41BB配体)，TNFRSF8(CD30)，TNFSF11(RANKL)，TNFRSF10A(TRAILRl，DR4)，TNFRSF10B(TRAILR2，DR5)，TNFRSF4(OX40)，TNFRSF11A(RANK)，TNFSF12(TWEAK)，TNFRSF12(TWEAKR)，TNFSF13(APRIL)，TNFSF13B(BLYS)，TNFRSF 13B(TACI)，TNFRSF13C(BAFFR)，TNFSF15(TL1A)，TNFRSF17(BCMA)，TNFRSF19L(KELT)，TNFRSF19(TROY)，TNFRSF21(DR6)，TNFRSF25(DR3)，ANG1(ANGPT1)，ANG2(ANGPT2)，ANG3(ANGPTL1)，ANG4(ANGPT4)，TIE2，IL1 alpha，IL1 beta，ILIRI，1L1R2，IL2 IL2R，IL5，IL5R，IL6，IL6R，1L8，1L8R，IL10，IL10R，IL12，IL12R，IL13，IL13R，IL15，IL15R，IL18，IL18R，IL19，IL19R，IL21，IL21R，IL23，IL23R，mif，XAG1，XAG3，REGIV，FGF1，FGF2，FGF3，FGF4，FGFR1，FGFR2，FGFR3，ALK，ALK1，ALK7，ALCAM，Artemin，Axl，TGFb，TGFb2，TGFb3，TGFBR1，IGFIIR，BMP2，BMP5，BMP6，BMPRI，GDF3，GDF8，GDF9，N-钙黏着蛋白，E-钙黏着蛋白，VE-钙黏着蛋白，EPCAM(EGP2)，NCAM，LI CAM(GDI 71)，神经节苷脂GM2，神经节苷脂GD2，降钙素，PSGR，DCC，CDCP1，CXCR2，CXCR7，CCR3，CCR4，CCR5，CCR7，CCR10，CXCR4，CXCL1，CXCL5，CXCL6，CXCL8，CXCL12，CCL2，CCL3，CCL4，CCL5，CCL11，密封蛋白1，密封蛋白2，密封蛋白3，密封蛋白4，TMEFF2，神经调节蛋白，MCSF，CSF，CSFR(fms)，GCSF，GCSFR，BCAM，HPV，hCG，SR1F，PSA，FOLR2(folatereceptor beta)，BRCA1，BRCA2，HLA-DR，ABCC3，ABCB5，HM 1.24，LFA1，LYNX，S100A8，S100A9，SCF，血管性血友病因子，Lewis Y6受体，Lewis Y，CA G250(CA9)，CRYPTO，VLA5，CTLA4，HLA-DR，MUCl，MUCl 8，黏蛋白CanAg，神经节苷脂GD3，EGFL7，PDGFRa，IL21，IGF1，IGF2，HGF，PSMA，SLAMF7，癌胚抗原(CEA)，FAP，整联蛋白avb3，整联蛋白α5β激活蛋白Blα，白三烯B4受体(LTB4R)，神经降压肽NT受体(NTR)，5T4肿瘤胚胎抗原，生腱蛋白C，MMP，MMP2，MMP7，MMP9，MMP12，MMP14，MMP26，组织蛋白酶G，组织蛋白酶H，组织蛋白酶L，SULF1，SULF2，MET，UP A，MHCL MN(CA9)，TAG-72，TM4SF1，乙酰肝素酶(HPSE)，黏结蛋白聚糖(SDCl)，肝配蛋白B2，肝配蛋白B4，T神经毡蛋白1(NRP1)，TEM1，间皮素，TGFβ1，TGFBRII，FcRn，磷脂酰丝氨酸，叶酸化合物受体(FOLR1)和松弛素2。上述靶和在此另外描述的靶是为了说明而不是限制。
在一个实施方案中，DBDpp(例如，DBDpp融合蛋白)特异性结合选自VEGF，VEGFA，VEGFR1，VEGFR2，IGF1R，整联蛋白，cMet，EGFR，ErbB2(Her2)，CD20，神经生长因子(NGR)，肝细胞生长因子受体，ErbB3(Her3)，ErbB4，前列腺特异性膜抗原的目的靶。
在一个实施方案中，由DBDpp(例如，DBDpp融合蛋白)特异性结合的目的靶是与自身免疫障碍，免疫系统的炎性或其他障碍有关或与调节免疫应答有关的抗原。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合其为免疫抑制靶的目的靶。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的免疫抑制性靶：IL1，IL1b，IL1Ra，IL5，IL6，IL6R，CD26L，CD28，CD80，FcRn，或FcγRIIB。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的免疫刺激性靶：CD25，CD28，CTLA4，PD1，B7-H1(PD-L1)，B7-H4，IL10，TGFbeta，TNFSF4(OX40配体)，TNFRSF4(OX40)，TNFSF5(CD40配体)，TNFRSF5(CD40)，TNFSF9(41BB配体)，TNFRSF9(41BB，CD137)，TNFSF14(LIGHT，HVEM配体)，TNFRSF14(HVEM)，TNFSF15(TL1A)，TNFRSF25(DR3)，TNFSF18(GITR配体)和TNFRSF18(GITR)。
在另外的实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的目的靶：IL1Rb，IL2，IL3，IL4，IL7，IL11，IL15，IL16，IL17，IL17A，IL17F，IL18，IL19，IL25，IL32，IL33，干扰素β，SCF，BCA1/CXCL13，CXCL1，CXCL2，CXCL6，CXCL13，CXCL16，C3AR，C5AR，CXCR1，CXCR2，CCR1，CCR3，CCR7，CCR8，CCR9，CCR10，ChemR23，CCL3，CCL5，CCL11，CCL13，CCL17，CCL18，CCL19，CCL20，CCL21，CCL22，CCL24，CCL25，CCL26，CCL27，MPL，GP130，TLR2，TLR3，TLR4，TLR5，TLR7，TLR8，TLR9，TREM1，TREM2，抑癌蛋白M，淋巴毒素α(LTa)，整联蛋白β7亚单位，CD49a(整联蛋白α1)，整联蛋白a5b3，MIF，ESM1，WIF1，组织蛋白酶B，组织蛋白酶D，组织蛋白酶K，组织蛋白酶S，TNFSF2(TNFa)，TNFSF3(LTb)，TNFRSF3(LTBR)，TNFSF6(Fas配体)，TNFRSF6(Fas，CD95)，TNFRSF6B(DcR3)，TNFSF8(CD30配体)，TNFRSF8(CD30)，TNFSF11(RANKL)，TNFRSF11A(RANK)，TNFRSF16(NGFR)，TNFRSF19L(RELT)，TNFRSF19(TROY)，TNFRSF21(DR6)，CD14，CD23 CD36，CD36L，CD39，CD52，CD91，CD137，CD153，CD164，CD200，CD200R，BTLA，B7-1(CD80)，B7-2(CD86)，B7h，B7-DC(PDL2)，ICOS，ICOSL，MHC，CD，B7-H2，B7-H3，B7x，SLAM，KIM-1，SLAMF2，SLAMF3，SLAMF4，SLAMF5，SLAMF6，和SLAMF7，TNFSF1A(TNF-α)，TNFRSF1A(TNFR1，p55，p60)，TNFRSF1B(TNFR2)，TNFSF7(CD27配体，CD70)，TNFRSF7(CD27)，TNFSF13B(BLYS)，TNFSF13(APRIL)，TNFRSF13B(TACI)，TNFRSF13C(BAFFR)，TNFRSF17(BCMA)，TNFSF12(TWEAK)，TNFRSF12(TWEAKR)，TNFRSF5(CD40)，IL1，IL1b，IL1R，IL2R，IL4-Ra，IL5，IL5R，IL6，IL6R，IL9，IL12，IL13，IL14，IL15，IL15R，IL17f，IL17R，IL17Rb，IL17RC，IL20，IL21，IL22RA，IL23，IL23R，IL31，TSLP，TSLPR，干扰素α，干扰素γ，B7RP1，cKit，GMCSF，GMCSFR，CTLA4，CD2，CD3，CD4，CD11a，CD18，CD20，CD22，CD30，CD40，CD86，CXCR3，CXCR4，CCR2，CCR4，CCR5，CCR8，CCL2，CXCL10，PlGF，α4整联蛋白亚单位，A4B7整联蛋白，C5，RhD，IgE和Rh。
在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的目的靶：淀粉样蛋白β(Aβ)，β淀粉样蛋白，补体因子D，PLP，ROBO4，ROBO，GDNF，NGF，LINGO，肌生成抑制素，氧化LDL，gpIIB，gpIIIa，PCSK9，因子VIII，整联蛋白α2bB3，AOC3，间皮素，DKK1，骨桥蛋白，组织蛋白酶K，TNFRSF19L(RELT)，TNFRSF19(TROY)和硬骨素。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的目的靶：CD137，CD47，CTLA4，DR5，KIR，PD-L1，PD1和TIM3。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合CD137。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合CD137并且包含选自以下的氨基酸序列：
提供了完全或部分(例如，以表位重叠)结合与上述DBDpp相同的CD137的表位的其它DBDpp和多肽。此外，还提供了与上述DBDpp完全或部分竞争结合CD137的DBDpp和多肽。还提供了编码DBDpp的核酸，以及含有核酸的载体和含有核酸和载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合CD47。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合CD47并且包含选自以下的氨基酸序列：
提供了完全或部分结合与上述DBDpp相同的CD47的表位的其它DBDpp和多肽。此外，还提供了完全或部分与上述DBDpp竞争结合CD47的DBDpp和多肽。还提供了编码DBDpp的核酸，以及含有核酸的载体和含有核酸和载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合CTLA4。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合CTLA4并且包含以下氨基酸序列：MGSWHEFHDRLQAIHERLYALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVESLRIAAAHI RQVLQAYRHN(SEQ ID NO:25)。提供了完全或部分结合与上述DBDpp相同的CTLA4的表位的其它DBDpp和多肽。此外，还提供了完全或部分与上述DBDpp竞争结合CTLA4的DBDpp和多肽。还提供了编码DBDpp的核酸，以及含有核酸的载体和含有核酸和载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合DR5。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合DR5并且包含选自以下的氨基酸序列：
提供完全或部分结合与上述DBDpp相同的DR5的表位的其它DBDpp和多肽。此外，还提供了完全或部分与上述DBDpp竞争结合DR5的DBDpp和多肽。还提供了编码DBDpp的核酸，以及含有核酸的载体和含有核酸和载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合KIR。在进一步的实施方案中，DBDpp特异性结合KIR并且包含选自以下的氨基酸序列： 提供了完全或部分结合与上述DBDpp相同的KIR的表位的其它DBDpp和多肽。此外，还提供了DBDpp和完全或部分与上述DBDpp竞争结合KIR的多肽。还提供了编码DBDpp的核酸，以及含有核酸的载体和含有核酸和载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合PD-L1。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合PD-L1并且包含选自以下的氨基酸序列： 提供了完全或部分结合与上述DBDpp相同的PD-L1的表位的其它DBDpp和多肽。此外，还提供了完全或部分与DBDpp竞争结合PD-L1的DBDpp和多肽。还提供了编码DBDpp的核酸，以及含有核酸的载体和含有核酸和载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合PD1。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合PD1且包含选自以下的氨基酸序列： 提供了完全或部分结合与上述DBDpp的相同PD1的表位的其他DBDpp和多肽。此外，还提供了与上述DBDpp完全或部分竞争结合PD1的DBDpp和多肽。还提供了编码DBDpp的核酸，以及含有核酸的载体和含有核酸和载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，DBDpp特异性结合TIM3。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合TIM3并且包含以下氨基酸序列：MGSWHEFHDRLQAIHERLYALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVESLRIAAAHIRQV LQAYRHN(SEQ ID NO:45)。提供了完全或部分结合与上述DBDpp相同的TIM3的表位的其他DBDpp和多肽。此外，还提供了完全或部分与DBDpp竞争结合TIM3的DBDpp和多肽。还提供了编码DBDpp的核酸，以及含有核酸的载体和含有核酸和载体的宿主细胞。
在另一个实施方案中，DBDpp结合存在于目的靶上的肽标签。这样的肽标签提供了用于纯化，检测和/或附接包含肽标签的目的靶的有用手段。在一个实施方案中，DBDpp特异性结合选自以下的肽标签：六组氨酸(His6)标签，myc标签或FLAG标签。其他肽标签在本文中描述或以其他方式在本领域中已知。
在另一个实施方案中，DBDpp结合的靶是从污染物混合物中纯化的受试者。在一个实施方案中，靶可以是需要从细胞裂解物或细胞培养物上清液中选择性分离的天然或重组表达的蛋白质。
DBDpp融合蛋白
“融合多肽”，“融合蛋白”，“嵌合多肽”，“嵌合蛋白”，“嵌合抗原”是由至少两个多肽和任选的接头组成的多肽，所述接头将两个多肽可操作地连接成一个连续的例如通过重组方法产生的多肽。两种多肽可以可操作地直接或间接附接。
“DBDpp融合蛋白”包含至少一个特异性结合目的靶的DBDpp。在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白包含多于一个DBDpp，其中两个或更多个DBDpp具有相同或不同的特异性。在另外的实施方案中，DBDpp融合蛋白由允许DBDpp融合蛋白结合多个靶和/或在同一靶上重复表位或不同表位的相同或不同DBDpp的串联重复组成。在另外的实施方案中，DBDpp融合蛋白包含DBDpp和含有另外结构域的多肽序列。在一些实施方案中，DBDpp融合蛋白包含DBDpp和选自以下的成员：抗体，抗体片段(例如，抗原结合结构域或其部分(例如ScFv)，效应结构域或其部分，FcRn结合结构域或其部分以及Fc或其部分)，血清蛋白(例如，白蛋白或其部分)，细胞因子，生长因子，激素，成像剂，标记剂和肽标签。在一些实施方案中，DBDpp融合蛋白包含免疫球蛋白的Fc结构域(例如，人Fc结构域)或其部分。在进一步的实施方案中，Fc结构域是变体人Fc结构域。
本文提供的DBDpp包括DBDpp融合蛋白。DBDpp和任何目的多肽可以可操作地连接以形成DBDpp融合蛋白。因此，在一些实施方案中，将DBDpp并入更大的多结构域分子复合物(例如，单体或多聚体DBDpp融合蛋白)，并且由此赋予并入的DBDpp对所得融合蛋白的功能属性。在一些实施方案中，DBDpp融合蛋白包含DBDpp和来自抗体，抗体片段，血清蛋白(例如人血清白蛋白)或血清蛋白片段，或细胞表面受体，T细胞受体(TCR)的α链，T细胞受体的β链，细胞因子，生长因子，激素或酶，或其片段的多肽序列。DBD并入多结构域和/或多功能复合物中能够常规地通过与另一种多肽重组融合，与另一种化学部分结合以及使用本领域已知的技术与另一种多肽(或其他期望的化学化合物)共价化学连接来实现。DBDpp融合蛋白能够另外含有其它任选组分，例如本文所述的接头和其他组分。
DBDpp多聚体
在一些实施方案中，DBDpp融合蛋白含有一个DBDpp。在一些实施方案中，DBDpp融合蛋白包含至少2，3，4或5个，或多于5个DBDpp。在一些实施方案中，DBDpp融合蛋白含有1-3，1-4，1-5个，或多于5个不同的DBDpp。在一些实施方案中，DBDpp融合蛋白含有至少2，3，4或5个，或多于5个不同的DBDpp。因此，DBDpp融合蛋白可以是单体DBDpp(即，含有一个DBDpp)或多聚体DBDpp(即，包含多于一个的串联的DBDpp，任选地通过接头可操作地连接)。这种多聚体DBDpp的非限制性实施方案在图5A中示出。在若干实施方案中，使用多聚体DBDpp提供增强的(例如协同的)靶结合。在另外的实施方案中，多聚体DBDpp允许使用单个DBDpp构建体靶向多于一个靶(例如，双特异性，三特异性等)。
多聚体DBDpp融合蛋白可以是DBDpp同多聚体(即，含有串联连接的多于一个的相同DBDpp，任选地通过接头(例如同二聚体，同三聚体，同四聚体等)或DBDpp异多聚体(即，含有两个或更多个DBDpp，其中存在至少两个不同的DBDpp蛋白)。取决于实施方案，包含在多聚体组合物内的单体DBDpp的数量可以变化，并且可以(至少部分地)由其中产生DBDpp的表达系统定义。然而，在一些实施方案中，融合蛋白可以包含约5至约10个DBDpp亚单位，约10至约15个亚单位，约15至约20个亚单位，约20至约25个亚单位或约25个到约30个亚单位(包括在所列出的数字之间和终点的数字)的多聚体。此外，DBDpp融合蛋白的多个串联组分可以含有相同或不同的DBDpp。在一些DBDpp融合中，DBDpp作为单体或同多聚体或异聚体如同二聚体或异二聚体，同源三聚体或异三聚体，同型四聚体或异四聚体存在。
在一个实施方案中，两个或多个DBDpp可操作地融合以形成DBDpp融合蛋白。在一个实施方案中，DBDpp的融合伴侣是相同的DBDpp。两个或更多个相同的DBDpp的连接导致多价分子，其相对于单体组合物提供不同的优点(例如，增加的结合亲和力，靶聚集和受体激活)。在另一个实施方案中，DBDpp的融合伴侣是不相同的DBDpp。两个或多个不相同DBDpp的连接导致多价和多特异性分子，其可能独立或同时结合多于一种靶抗原。
DBDpp融合蛋白可以是“单特异性的”或“多特异性的”。“多特异性的”(例如双特异性，三特异性或具有更高的多特异性)DBDpp融合蛋白识别并结合两种或更多种存在于一个或多个不同分子(例如，蛋白质，固体载体结构等)上的不同表位。
在一个实施方案中，多特异性DBDpp融合蛋白含有至少两个与目的单个靶上的至少两个不同表位结合的DBDpp。在另外的实施方案中，多特异性DBDpp融合蛋白包含至少一个特异性结合目的靶上的一个表位的DBDpp和至少一个特异性结合相同目的靶上的不同表位的赋予功能的其他结构域或序列(例如抗体片段或结构域如scFv)。在一个实施方案中，多特异性DBDpp融合蛋白包含至少一个特异性结合目的靶上的表位的DBDpp和至少一个特异性结合不同目的靶点上的表位的赋予功能的结构域或序列，例如抗体片段或结构域(例如scFv)。在其他实施方案中，DBDpp融合蛋白包含至少一个DBDpp和至少一个特异性结合固体支持物的赋予功能的其他DBDpp或结构域序列，例如抗体片段或结构域。
在另一个实施方案中，包含2个或更多个DBDpp的多聚体DBDpp融合物进而与其他异源蛋白质(或它们的亚结构域)融合，并且由此赋予融合伴侣多价和多特异性质。DBDpp的融合伴侣的实例包括但不限于抗体，抗体亚结构域(例如scFv或Fc结构域)，血清白蛋白，血清白蛋白亚结构域，细胞表面受体，T细胞受体(TCR)的α链，T细胞受体的β链，细胞表面受体亚结构域，肽，肽标签(例如FLAG或myc)，III型纤连蛋白重复序列，z结构域，弹性蛋白样多肽。DBDpp的数量和位置及其在融合蛋白内的各自位置可以变化。例如，DBDpp可以位于融合伴侣的一个或全部末端和/或散布在DBDpp融合伴侣内的异源亚单位内。
在一个实施方案中，DBDpp融合物是双特异性的并且特异性结合两种不同细胞类型的表面上表达的两种不同靶。在一个实施方案中，双特异性DBDpp融合蛋白特异性结合癌细胞靶和免疫效应细胞靶。在一个实施方案中，双特异性DBDpp融合蛋白特异性结合在癌细胞上表达的靶(例如CD19)和在T淋巴细胞表面上表达的靶(例如CD3)。
DBDpp作为抗体和抗体片段的融合物
在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白包含完整抗体或抗体片段或结构域(例如IgG1抗体，IgG3抗体，抗体可变区，CDR3，ScFv，Fc，FcRn结合结构域和其它抗体结构域)。DBDpp和DBDpp融合蛋白可以彼此和/或与抗体，抗体链，抗体片段或抗体结构域的一个或多个末端可操作地连接。
DBDpp融合蛋白的抗体组分可以是任何合适的完整免疫球蛋白或抗体片段(例如抗原结合结构域和/或效应结构域)或其片段。在一个实施方案中，DBDpp-抗体融合蛋白保留传统单克隆抗体的结构和功能特性。因此，在一些实施方案中，DBDpp-抗体融合蛋白保留表位结合特性，但有利地还通过DBDpp融合并入一种或多种另外的靶结合特异性。可用于DBDpp融合的抗体包括但不限于单克隆，多特异性，人，人源化，灵长类化和嵌合抗体。本文提供的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类别(例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或亚类。在具体的实施方案中，抗体是Fc优化的抗体。抗体可以来自或衍生自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物，或合成产生。DBDpp-抗体融合蛋白的抗体组分可以是天然来源的或重组工程改造的结果(例如噬菌体展示，异种小鼠(xenomouse)和合成的)。在某些实施方案中，抗体-DBDpp融合物的抗体组分增强半衰期，并增加或减少抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)活性。在一些实施方案中，抗体是人，鼠，驴，兔，羊，豚鼠，骆驼，美洲驼，马或鸡抗体。在具体的实施方案中，抗体是人抗体。
在一个实施方案中，DBDpp可操作地连接至抗体片段或亚结构域(例如ScFv，双抗体，EP 404,097；WO 93/111161；WO 2014/028776；和Holliger et al.，PNAS 90:6444-6448(1993)，其全部内容通过引用结合到本文中)。抗体片段或亚结构域可以是抗体的任何片段或结构域。参见例如WO 04/058820，WO 99/42077和WO 05/017148，其各自通过引用整体并入本文。例如，DBDpp融合蛋白可以包含抗体效应结构域或抗体效应结构域的衍生物，其赋予DBDpp一种或多种效应功能和/或赋予DBDpp融合蛋白结合一种或多种Fc受体的能力。在一些实施方案中，DBDpp-抗体融合蛋白含有抗体的抗原结合片段或其片段。在另外的实施方案中，DBDpp-抗体融合蛋白含有免疫球蛋白效应结构域，其包含具有由CH2和CH3结构域提供的效应功能的抗体的一个或多个CH2和/或CH3结构域。DBDpp融合物中提供效应功能并被本发明包括的其它序列对于本领域技术人员将是清楚的，并且可以常规地基于期望的效应功能选择和设计成包含在本文中的DBDpp融合蛋白中。
在一个实施方案中，本文提供的抗体-DBDpp融合物的抗体组分已经被修饰以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)(参见例如Bruhns et al.，Blood 113:3716-3725(2009)；Shields et al.，J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)；Lazar et al.，PNAS 103:4005-4010(2006)；Stavenhagen et al.，Cancer Res.，67:8882-8890(2007)；Horton et al.，Cancer Res.68:8049-8057(2008)；Zalevsky et al.，Blood 113:3735-3743(2009)；Bruckheimer，Neoplasia 11:509-517(2009)；WO2006/0201 14；Strohl，Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)和WO2004/074455，其各自通过引用整体并入本文)。包含在DBDpp-抗体融合蛋白的抗体组分中的增加ADCC的Fc序列工程改造修饰的实例包括对应于以下的一种或多种修饰：IgGl-S298A，E333A，K334A；IgGl-S239D，I332E；IgGl-S239D，A330L，I332E；IgGl-P247I，A339D或Q；具有或不具有S298D或V的IgG1-D280H，K290S；IgGl-F243L，R292P，Y300L；IgGl-F243L，R292P，Y300L，P396L和IgGl-F243L，R292P，Y300L，V305I，P396L；其中Fc区中残基的编号是Kabat等人的EU索引的编号(Kabat et al.，Sequences of proteins of Immunological Interest，1991Fifth edition)。
在一个实施方案中，DBDpp融合物含有完整抗体或其为抗原结合片段的抗体片段。在另一个实施方案中，抗体或抗体片段结合疾病相关抗原。在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白包含特异性结合癌症抗原的抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，DBDpp融合蛋白包含特异性结合特定病原体(例如，细菌细胞(例如结核，天花，炭疽))，病毒(例如HIV)，寄生虫(例如，疟疾，利什曼病)，真菌感染，霉菌，支原体，朊病毒抗原的抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，DBDpp融合蛋白包含特异性结合特定病原体(例如细菌细胞(例如肺结核，天花，炭疽))，病毒(例如HIV)，寄生虫(例如疟疾，利什曼病)，真菌感染，霉菌，支原体或朊病毒抗原的抗体或抗体片段。在另一个实施方案中，DBDpp融合蛋白包含特异性结合与免疫系统疾病或障碍相关的抗原的抗体或抗体片段。
在优选的实施方案中，含有抗体片段或结构域的DBDpp融合蛋白保留亲本抗体的活性。因此，在某些实施方案中，含有抗体片段或结构域的DBDpp融合蛋白能够诱导补体依赖性细胞毒性。在某些实施方案中，含有抗体片段或结构域的DBDpp融合蛋白能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。
因此，在一些实施方案中，DBDpp融合蛋白包含抗体片段，其给DBDpp融合蛋白赋予免疫球蛋白的生物学或生物化学特征。在一些实施方案中，与其中一种或更多DBDpp已被缺失的DBDpp融合蛋白相比，抗体片段赋予选自以下的特征：非共价二聚化的能力，定位于肿瘤部位的能力和增加的血清半衰期。在某些实施方案中，DBDpp融合蛋白至少与没有附接DBDpp的相应抗体一样稳定。在某些实施方案中，DBDpp融合蛋白比没有附接DBDpp的相应抗体更稳定。DBDpp融合蛋白稳定性可以使用已建立的方法来测量，包括例如ELISA技术。在一些实施方案中，DBDpp融合蛋白在37℃在全血(体内或离体)中稳定至少约10小时，至少约15小时，至少约20小时，至少约24小时，至少约25小时，至少约30小时，至少约35小时，至少约40小时，至少约45小时，至少约48小时，至少约50小时，至少约55小时，至少约60小时，至少约65小时，至少约70小时，至少约72小时，至少约75小时，至少约80小时，至少约85小时，至少约90小时，至少约95小时，或至少约100小时(包括所列之间的任意时间)。在一个实施方案中，DBDpp融合物含有免疫球蛋白效应结构域或影响半衰期的结构域，其对应于免疫球蛋白结构域或片段，其中一个或多个恒定区结构域的至少一部分已被改变以提供期望的生物化学特征，如，与具有相应的未改变免疫球蛋白序列的免疫球蛋白片段相比，效应功能降低或增加，非共价二聚化的能力，增加的定位于肿瘤部位的能力，减少的血清半衰期或增加的血清半衰期。恒定区结构域的这些改变可以是氨基酸置换，插入或缺失。
在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白包含赋予DBDpp融合蛋白抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的免疫球蛋白效应结构域的氨基酸序列或免疫球蛋白效应结构域的衍生物。在另外的实施方案中，DBDpp融合蛋白包含已被修饰以增加ADCC的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如Bruhns et al.,Blood 113:3716-3725(2009)；Shields et al.,J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)；Lazar et al.,PNAS103:4005-4010(2006)；Stavenhagen et al.,Cancer Res.,67:8882-8890(2007)；Horton et al.,CancerRes.68:8049-8057(2008)；Zalevsky et al.,Blood 113:3735-3743(2009)；Bruckheimer,Neoplasia 11:509-517(2009)；WO2006/020114；Strohl,Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和WO 04/074455，其内容通过引用整体并入本文)。包含在DBDpp融合蛋白中的氨基酸序列中的增加ADCC的免疫球蛋白片段工程改造修饰的实例包括具有对应于以下的一种或多种修饰的免疫球蛋白效应结构域序列：IgG1-S298A，E333A，K334A；IgG1-S239D，I332E；IgG1-S239D，A330L，I332E；IgG1-P247I，A339D或Q；具有或不具有S298D或V的IgG1-D280H，K290S；IgG1-F243L，R292P，Y300L；IgG1-F243L，R292P，Y300L，P396L；和IgG1-F243L，R292P，Y300L，V305I，P396L；其中Fc区中残基的编号是Kabat等人的EU索引的编号。(Kabat etal.，Sequences of proteins of Immunological Interest，1991Fifth edition，通过参考并入本文)。
在其他实施方案中，DBDpp融合蛋白包含已被修饰以降低ADCC的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如Idusogie et al.，J.Immunol.166:2571-2575(2001)；Sazinskyet al.，PNAS 105:20167-20172(2008)；Davis et al.，J.Rheumatol.34:2204-2210(2007)；Bolt et al.，Eur.J.Immunol.23:403-411(1993)；Alegre et al.，Transplantation57:1537-1543(1994)；Xu et al.，Cell Immunol.200:16-26(2000)；Coleet al.，Transplantation 68:563-571(1999)；Hutchins et al.，PNAS92:11980-11984(1995)；Reddy et al.，J.Immunol.164:1925-1933(2000)；WO 97/11971；WO 07/106585；US2007/0148167A1；McEarchern et al.，Blood 109:1185-1192(2007)；Strohl，Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和Kumagai et al.，J.Clin.Pharmacol.47:1489-1497(2007)，其每一个的内容通过引用整体并入本文)。包含在减少ADCC的DBDpp融合蛋白中的氨基酸序列中的免疫球蛋白片段序列工程改造的实例包括具有一个或多个对应于以下的修饰的免疫球蛋白效应结构域序列：IgG1-K326W，E333S；IgG2-E333S；IgG1-N297A；IgG1-L234A，L235A；IgG2-V234A，G237A；IgG4-L235A，G237A，E318A；IgG4-S228P，L236E；IgG2-118-260；IgG4-261-447；IgG2-H268Q，V309L，A330S，A331S；IgG1-C220S，C226S，C229S，P238S；IgG1-C226S，C229S，E233P，L234V，L235A；或IgG1-L234F，L235E，P331S；其中残基的编号是Kabat等的EU索引的编号(Kabat et al.，Sequences ofProteins of Immunological Interest，1991Fifth edition，通过参考并入本文)。
在另外的实施方案中，DBDpp融合蛋白包含向DBDpp融合蛋白赋予抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的免疫球蛋白效应结构域或免疫球蛋白效应结构域的衍生物的氨基酸序列。在另外的实施方案中，DBDpp融合蛋白包含已被修饰以增加抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)的免疫球蛋白效应结构域的序列；(参见例如Shields et al.，J.Biol.Chem.276:6591-6604(2001)；Lazar et al.，PNAS103:4005-4010(2006)；Stavenhagen et al.，Cancer Res.，67:8882-8890(2007)；Richards et al.，Mol.Cancer Ther.7:2517-2527(2008)；Horton et al.，Cancer Res.68:8049-8057(2008)，Zalevsky et al.，Blood113:3735-3743(2009)；Bruckheimer et al.，Neoplasia 11:509-517(2009)；WO 06/020114；Strohl，Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和WO 04/074455，其每一个的内容通过引用整体并入本文)。包含在DBDpp融合蛋白中的氨基酸序列中的增加ADCP的免疫球蛋白片段工程改造修饰的实例包括具有对应于以下的一个或多个修饰的免疫球蛋白效应结构域序列：IgG1-S298A，E333A，K334A；IgG1-S239D，I332E；IgG1-S239D，A330L，I332E；IgG1-P247I，A339D或Q；具有或不具有S298D或V的IgG1-D280H，K290S；IgG1-F243L，R292P，Y300L；IgG1-F243L，R292P，Y300L，P396L；IgG1-F243L，R292P，Y300L，V305I，P396L；和IgG1-G236A，S239D，I332E；其中残基的编号是Kabat等的EU索引的编号(Kabat et al.，Sequences ofProteins of Immunological Interest，1991Fifth edition，通过参考并入本文)。
在其他实施方案中，DBDpp融合蛋白包含已被修饰以降低ADCP的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如Sazinsky et al.，PNAS105:20167-20172(2008)；Davis et al.，J.Rheumatol.34:2204-2210(2007)；Bolt et al.，Eur.J.Immunol.23:403-411(1993)；Alegre et al.，Transplantation 57:1537-1543(1994)；Xu et al.，Cell Immunol.200:16-20(2000)；Cole et al.，Transplantation 68:563-571(1999)；Hutchins et al.，PNAS92:11980-11984(1995)；Reddy et al.，J.Immunol.164:1925-1933(2000)；WO 97/11971；WO 07/106585；US2007/0148167A1；McEarchern et al.，Blood 109:1185-1192(2007)；Strohl，Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和Kumagai et al.，J.Clin.Pharmacol.47:1489-1497(2007)，其各自的内容通过引用整体并入本文)。举例来说，DBDpp融合蛋白可含有抗体片段或结构域，该抗体片段或结构域含有一个或多个下列可降低ADCC的修饰：IgG1-N297A；IgG1-L234A，L235A；IgG2-V234A，G237A；IgG4-L235A，G237A，E318A；IgG4-S228P，L236E；IgG2EU序列118-260；IgG4-EU序列261-447；IgG2-H268Q，V309L，A330S，A331S；IgG1-C220S，C226S，C229S，P238S；IgG1-C226S，C229S，E233P，L234V，L235A；和IgG1-L234F，L235E，P331S；其中残基的编号是Kabat等的EU索引的编号(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，1991Fifth edition，通过参考并入本文)。
在另外的实施方案中，DBDpp融合蛋白包含向DBDpp融合蛋白赋予补体依赖性细胞毒性(CDC)的免疫球蛋白效应结构域或免疫球蛋白效应结构域的衍生物的氨基酸序列。在另外的实施方案中，DBDpp融合蛋白包含已被修饰以增加补体依赖性细胞毒性(CDC)的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如Idusogie et al.，J.Immunol.166:2571-2575(2001)；Strohl，Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和Natsume et al.，Cancer Res.68:3863-3872(2008)，其内容在此通过引用整体并入本文)。举例来说，DBDpp融合蛋白可以包含含有一个或多个增加CDC的下列修饰的抗体片段或结构域：IgG1-K326A，E333A；IgG1-K326W，E333S，IgG2-E333S；其中残基的编号是Kabat等的EU索引的编号(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，1991Fifth edition，通过参考并入本文)。
在另外的实施方案中，DBDpp融合蛋白包含免疫球蛋白效应结构域的氨基酸序列或免疫球蛋白效应结构域的衍生物，其向DBDpp融合物赋予结合FcγRIIb受体的能力。在另外的实施方案中，DBDpp融合蛋白包含已被修饰以增加对FcγRIIb受体的抑制性结合的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如Chu et al.，Mol.Immunol.45:3926-3933(2008))。包含在DBDpp融合蛋白中的氨基酸序列中的增加与抑制性FcγRIIb受体的结合的免疫球蛋白片段工程改造修饰的实例是IgG1-S267E，L328F。
在其他实施方案中，DBDpp融合蛋白包含已被修饰以降低CDC的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如WO 97/11971；WO07/106585；US 2007/0148167A1；McEarchern etal.，Blood109:1185-1192(2007)；Hayden-Ledbetter et al.，Clin.Cancer15:2739-2746(2009)；Lazar et al.，PNAS 103:4005-4010(2006)；Bruckheimer et al.，Neoplasia 11:509-517(2009)；Strohl，Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和Sazinsky et al.，PNAS105:20167-20172(2008)；其中每一个的内容是在此通过引用整体并入)。举例来说，DBDpp融合蛋白可包含含有一个或多个减少CDC的下述修饰的抗体片段或结构域：IgG1-S239D，A330L，I332E；IgG2-118-260；IgG4-261-447；IgG2-H268Q，V309L，A330S，A331S；IgG1-C226S，C229S，E233P，L234V，L235A；IgG1-L234F，L235E，P331S；和IgG1-C226S，P230S；其中残基的编号是Kabat等的EU索引的编号(Kabat et al.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，1991Fifth edition，通过参考并入本文)。
IgG的半衰期是由其对pH依赖性的与新生儿受体FcRn的结合介导的。在某些实施方案中，DBDpp融合蛋白包含免疫球蛋白效应结构域的氨基酸序列或免疫球蛋白效应结构域的衍生物，其向DBDpp融合物赋予与新生儿受体FcRn结合的能力。在某些实施方案中，DBDpp融合蛋白包含已被修饰以增强与FcRn的结合的免疫球蛋白FcRn结合结构域的序列(参见例如Petkova et al.，Int.Immunol.18:1759-1769(2006)；Dall'Acqua et al.，J.Immunol.169:5171-5180(2002)；Oganesyan et al.，Mol.Immunol.46:1750-1755(2009)；Dall'Acqua et al.，J.Biol.Chem.281:23514-23524(2006)，Hinton et al.，J.Immunol.176:346-356(2006)；Datta-Mannan et al.，Drug Metab.Dispos.35:86-94(2007)；Datta-Mannan et al.，J.Biol.Chem.282:1709-1717(2007)；WO 06/130834；Strohl，Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和Yeung et al.，J.Immunol.182:7663-7671(2009)，其全部内容通过引用并入本文)。
在另外的实施方案中，DBDpp融合蛋白包含免疫球蛋白效应结构域的序列，免疫球蛋白效应结构域已经被修饰以在pH6.0但不是pH7.4下对FcRn具有选择性亲和力。举例来说，DBDpp融合蛋白可包含含有一个或多个增加半衰期的下列修饰的抗体片段或结构域：IgG1-M252Y，S254T，T256E；IgG1-T250Q，M428L；IgG1-H433K，N434Y；IgG1-N434A；和IgG1-T307A，E380A，N434A；其中残基的编号是Kabat等的EU索引的编号(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，1991Fifth edition，通过参考并入本文)。
在其它实施方案中，DBDpp融合蛋白包含已被修饰以降低对FcRn的结合的免疫球蛋白效应结构域的序列(参见例如Petkova et al.，Int.Immunol.18:1759-1769(2006)；Datta-Mannan et al.，Drug Metab.Dispos.35:86-94(2007)；Datta-Mannan et al.，J.Biol.Chem.282:1709-1717(2007)；Strohl，Curr.Op.Biotechnol.20:685-691(2009)；和Vaccaro et al.，Nat.Biotechnol.23:1283-1288(2005)，其各自的内容通过引用整体并入本文)。举例来说，DBDpp融合蛋白可以含有抗体片段或结构域，其含有一个或多个减少半衰期的下列修饰：IgG1-M252Y，S254T，T256E；H433K，N434F，436H；IgG1-I253A；和IgG1-P257I，N434H和D376V，N434H；其中残基的编号是Kabat等的EU索引的编号(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，1991Fifth edition，通过参考并入本文)。
根据另一个实施方案，DBDpp融合蛋白包含对应于免疫球蛋白效应结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白效应结构域已经被修饰以在其序列中包含对应于选自以下的Fc区(例如，FCγ)位置的至少一个置换：238，239，246，248，249，252，254，255，256，258，265，267，268，269，270，272，276，278，280，283，285，286，289，290，292，293，294，295，296，298，301，303，305，307，309，312，315，320，322，324，326，327，329，330，331，332，333，334，335，337，338，340，360，373，376，378，382，388，389，398，414，416，419，430，434，435，437，438和439，其中Fc区中残基的编号根据EU编号系统；Kabat等人的。(Kabat et al.，Sequences ofProteins of Immunological Interest，1991Fifth edition，通过参考并入本文)。在具体实施方案中，DBDpp融合蛋白包含免疫球蛋白效应结构域衍生物的序列，其中对应于位置434的至少一个残基是选自A，W，Y，F和H的残基。根据另一个实施方案中，DBDpp融合蛋白包含具有以下各自置换S298A/E333A/K334A的免疫球蛋白效应片段衍生物的序列。在另外的实施方案中，DBDpp融合蛋白包含具有对应于K322A的置换的免疫球蛋白效应结构域衍生物。在另一个实施方案中，DBDpp融合蛋白包含具有下列置换K246H，H268D，E283L，S324G，S239D和I332E中的一种或任意组合的免疫球蛋白效应结构域衍生物的序列。根据又一个实施方案，DBDpp融合蛋白包含具有对应于D265A/N297A的置换的免疫球蛋白效应结构域衍生物的序列。
在某些实施方案中，DBDpp融合蛋白包含已使用本领域已知的技术糖基因改造或突变以增加效应功能的免疫球蛋白效应结构域的序列。例如，包含在DBDpp中的恒定区结构域序列的失活(通过点突变或其他方式)可以减少循环DBDpp融合蛋白的Fc受体结合，从而增加肿瘤定位。在其他情况下，可能是与本发明的某些实施方案一致的恒定区修饰适度补充结合并因此降低缀合的细胞毒素的血清半衰期和非特异性缔合。可以使用恒定区的其他修饰来修饰由于增加的抗原特异性或抗体柔性而允许增强的定位的二硫键或寡糖部分。修饰所得到的生理学特征，生物利用度和其他生物化学效应(例如肿瘤定位，生物分布和血清半衰期)可以使用众所周知的免疫学技术容易地测量和定量，而不需要过多的实验。
在某些实施方案中，免疫效应细胞包含免疫球蛋白或其他肽结合分子的细胞表面受体，例如免疫球蛋白恒定区的受体，并包括通常称为“Fc受体”(“FcR”)的受体类别。许多FcR已经在结构和/或功能上表征，并且是本领域已知的，包括具有与免疫球蛋白重链同种型的有限子集相互作用或与Fc结构域以不同亲和力相互作用的特异性的FcR，和/或可以在某些条件下在免疫效应细胞的有限子集上表达(例如，Kijimoto-Ochichai et al.，CellMol.Life.Sci.59:648(2002)；Davis et al.，Curr.Top.Microbiol.Immunol.266:85(2002)；Pawankar，Curr.Opin.Allerg.Clin.Immunol.1:3(2001)；Radaev et al.，Mol.Immunol.38:1073(2002)；Wurzburg et al.，Mol.Immunol.38:1063(2002)；Sulica etal.，Int.Rev.Immunol.20:371(2001)；Underhill et al.，Ann.Rev.Immunol.20:825(2002)；Coggeshall，Curr.Dir.Autoimm.5:1(2002)；Mimura et al.，Adv.Exp.Med.Biol.495:49(2001)；Baumann et al.，Adv.Exp.Med.Biol.495:219(2001)；Santoso et al.，Ital.Heart J.2:811(2001)；Novak et al.，Curr.Opin.Immunol.13:721(2001)；Fossati et al.，Eur.J.Clin.Invest.31:821(2001))，其中的每一个通过引用整体并入本文。
能够介导ADCC的细胞是免疫效应细胞的实例。其他免疫效应细胞包括自然杀伤细胞，肿瘤浸润性T淋巴细胞(TIL)，细胞毒性T淋巴细胞和粒细胞，例如包含过敏反应机制的细胞。免疫效应细胞因此包括但不限于造血来源的细胞，包括处于骨髓和淋巴谱系内的不同分化阶段的细胞，并且可以(但不一定)表达一种或多种类型的功能细胞表面FcR，如T淋巴细胞，B淋巴细胞，NK细胞，单核细胞，巨噬细胞，树突细胞，嗜中性粒细胞，嗜碱性粒细胞，嗜酸性粒细胞，肥大细胞，血小板，红细胞和前体，祖细胞(例如造血干细胞)，以及此类细胞的静止的，激活的和成熟的形式。其他免疫效应细胞可以包括能够介导免疫功能的非造血源细胞，例如内皮细胞，角质形成细胞，成纤维细胞，破骨细胞，上皮细胞和其他细胞。免疫效应细胞还可以包括介导细胞毒性或细胞抑制性事件，或者内吞，吞噬或者胞饮事件，或者影响细胞凋亡的诱导，或者影响微生物免疫或者中和微生物感染的细胞，或者介导过敏性，炎性，超敏反应和/或自身免疫反应的细胞。
DBDpp作为白蛋白融合物
编码DBDpp-白蛋白融合蛋白的核酸分子以及含有这些核酸的载体，含有这些核酸载体的宿主细胞，以及制备DBDpp-清蛋白融合蛋白并使用这些核酸，载体和/或宿主细胞也包括在本文中。本发明还包括含有DBDpp-清蛋白融合蛋白和药学上可接受的稀释剂或载体的药物制剂。这样的制剂可用于治疗，预防，改善或诊断患者，优选哺乳动物，最优选人的疾病或疾病症状的方法，包括向患者施用药物制剂的步骤。
DBDpp作为嵌合受体
除了将DBD并入可溶性多结构域蛋白之外，本发明还提供了产生细胞结合DBDpp的手段，该DBDpp包含至少一个被设计成赋予膜结合融合蛋白结合特异性的DBDpp。DBDpp受体可以由任何细胞类型表达。
在一个实施方案中，DBDpp受体融合蛋白包含嵌合抗原受体(CAR)，或DBDpp-CAR，由下列元件组成：细胞外靶向结构域，跨膜结构域和细胞质结构域，其中细胞质结构域包括信号传导结构域。在另一个实施方案中，DBDpp-CAR由细胞外靶向结构域和跨膜结构域组成。在另一个实施方案中，DBDpp-CAR包含由一个或多个DBDpp组成的细胞外结构域，其中每个DBDpp构成具有相同或不同特异性的靶特异性结合结构域。在若干实施方案中，靶特异性结构域针对本文公开的一种(或多种)癌症或肿瘤抗原，如作为非限制实例CD123，CD137，PD-L1，CD19，CD22，NY-ESO或MAGE A3。在一个实施方案中，DBDpp-CAR的细胞内结构域(例如细胞质结构域)包含CD3ζ链的细胞内结构域。在另一个实施方案中，DBDpp的细胞内信号传导结构域包含CD3ζ链的细胞内结构域的一部分。在另一个实施方案中，DBDpp-CAR的细胞内结构域包含CD3ζ链的细胞内结构域和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指包含共刺激分子的全部或部分细胞内结构域的DBDpp-CAR的一部分。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原有效应答所需的。能够赋予CAR共刺激特性的共刺激分子和这些分子的部分是本领域已知的，并且可以常规地并入到DBDpp-CAR中。此外，可并入这些胞内信号传导和共刺激结构域的截短或突变以进一步增强或减少受体信号传导。在优选的实施方案中，T细胞被遗传修饰以稳定表达DBDpp-CAR。在这样的实施方案中，DBDpp-CAR的细胞质结构域能够被设计成自身包含CD28和/或4-1BB信号传导结构域，或者与本发明上下文中有用的任何其他期望的细胞质结构域组合。在一个实施方案中，DBDpp-CAR的细胞质结构域能够被设计为进一步包含CD3-ζ的信号传导结构域。例如，如图5B中示意性所示，在一个实施方案中，DBDpp-CAR包含细胞外靶向结构域，具有穿过细胞膜(例如在T细胞或NK细胞中发现的)的跨膜结构域的细胞外蛋白质接头和细胞质结构域，任选地包含多个信号传导模块。在若干实施方案中，DBDpp-CAR也可以包含表位标签。在若干实施方案中，DBDpp-CAR的细胞质结构域可以包括但不限于CD3ζ，4-1BB和CD28信号传导模块及其组合。
细胞外结构域
取决于期望的待靶向的抗原，DBDpp-CAR可以工程改造以包括对期望的抗原靶特异的适当的抗原结合DBDpp。例如，如果CD19是要靶向的期望抗原，则可以将一个或多个结合CD19的DBDpp并入DBDpp-CAR的靶特异性结合结构域中。备选地，DBDpp-CAR可以包括多于一个的DBDpp，其赋予DBDpp-CAR多特异性或多价性。
并入DBDpp受体细胞外结构域(例如DBDpp-CAR)中的DBDpp的选择取决于待靶向的细胞的身份。例如，DBDpp-CAR可以特异性结合细胞表面蛋白，如同一细胞或另一细胞上的受体。在其他实施方案中，DBDpp-CAR特异性结合可溶性分子，例如免疫球蛋白。在其他实施方案中，由DBDpp-CAR结合的目的靶包括与病毒，细菌和寄生虫感染，免疫系统疾病和障碍(例如，自身免疫性疾病)有关的靶。
在其他实施方案中，可以选择DBDpp-CAR来识别充当靶细胞上的与癌症相关的细胞表面标志物的配体。在一些实施方案中，DBDpp-CAR能够靶向并结合肿瘤抗原(例如本文所述的TAA或其他肿瘤抗原或本领域中已知的其它肿瘤抗原)。因此，本文提供了产生DBDpp-CAR的方法，其用于产生嵌合细胞如人T细胞和自然杀伤细胞，以及这些嵌合T细胞在过继免疫治疗中的用途。
在本文提供的上下文中，“肿瘤抗原”是指特定过度增殖性障碍如癌症所共有的抗原。本文公开了可以通过DBDpp-CAR中的DBDpp特异性结合的肿瘤抗原。在一个实施方案中，DBDpp-CAR中的DBDpp特异性结合肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA对于肿瘤细胞是独特的，并且不会在体内的其他细胞上发生。TAA相关抗原对于肿瘤细胞并不是独特的，而是在不能诱导对抗原具有免疫耐受状态的条件下也在正常细胞上表达。抗原在肿瘤上的表达可以在使得免疫系统能够对抗原作出应答的条件下发生。当免疫系统不成熟并且不能应答时，TAA可以是在胎儿发育期间在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以是在正常细胞中通常以极低水平存在但在肿瘤细胞上以更高水平表达的抗原。能够通过DBDpp-CAR中的DBDpp特异性结合的TSA或TAA抗原的非限制性实例包括选自以下的成员：分化抗原如MARTl/MelanA(MARTI)，gp100(Pmel 17)，酪氨酸酶，TRP1，TRP2；肿瘤特异性多谱系抗原如MAGE1，MAGE3，BAGE，GAGE1，GAGE2，pi5；过表达的胚胎抗原例如CEA；和过表达癌基因或突变肿瘤抑制基因，如p53，Ras，HER-2/neu；由染色体易位导致的独特的肿瘤抗原，如BCR-ABL，E2A-PRL，H4-RET，1GH-IGK，MYL-RAR；病毒抗原如EB病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7；TSP-180，MAGE4，MAGE5，MAGE6，RAGE，NY-ESO，pl85erbB2，pl80erbB3，cmet，nm-23Hl，PSA，TAG72，CA 19-9，CA72-4，CAM 17.1，NuMa，K-ras，beta-Catenin，CDK4，Mum-1，p15，p16，43-9F，5T4(791Tgp72)甲胎蛋白，beta-HCG，BCA225，BTAA，CA125，CA 15-3\CA 27.29\BCAA，CA195，CA242，CA50，CAM43，CD68\I，CO-029，FGF5，G250，Ga733VEpCAM，HTgp-175，M344，MA50，MG7-Ag，MOV 18，NB/70K，NY-CO-1，RCAS1，SDCCAG16，TA90\Mac-2，TAAL6，TAG72，TLP，和TPS；神经胶质瘤相关抗原，癌胚抗原(CEA)，β-人绒毛膜促性腺激素，甲胎蛋白(AFP)，凝集素-反应性AFP，甲状腺球蛋白，RAGE-1，MN-CA IX，人端粒酶逆转录酶，RU1，RU2(AS)，肠羧酸酯酶，mut hsp70-2，MCSF，前列腺酶，前列腺特异性抗原(PSA)，PAP，NY-ESO-1，LAGE-la，p53，prostein，PSMA，Her2/neu，存活蛋白和端粒酶，前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA1)，MAGE，ELF2M，嗜中性粒细胞弹性蛋白酶，肝配蛋白B2，TACI(CD267)，BAFF-R(CD268)，BCMA(CD269)，TLR4，胰岛素生长因子(IGF)I，IGFII，IGFI受体和间皮素。
在具体的实施方案中，DBDpp-CAR的抗原结合部分(moiety)部分(portion)中的DBDpp特异性结合选自以下的靶：CD123，HVEM，BTLA，DR3，CD19，CD20，CD22，ROR 1，间皮素，CD33/lL3Ra，cMet，PSMA，糖脂F77，EGFRvIII，GD2，MY-ESO-1TCR，CD133，CD47和MAGE A3TCR。在另一个优选的实施方案中，DBDpp-CAR的抗原结合部分部分中的DBDpp特异性结合所有类别的免疫球蛋白或特定同种型，同种异型或独特型。
在一个实施方案中，DBDpp-CAR中的DBDpp特异性结合与恶性肿瘤相关的肿瘤抗原。恶性肿瘤表达许多DBDpp-CAR能够被工程改造以结合的肿瘤抗原。在一个实施方案中，DBDpp-CAR的DBDpp结合选自以下的抗原：黑素瘤中的组织特异性抗原如MART-1，酪氨酸酶和GP100和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺特异性抗原(PSA)；转化相关分子如癌基因HER2/Neu ErbB2；癌胚抗原(onco-fetal antigen)如癌胚抗原(carcinoembryonic antigen)(CEA)；B细胞淋巴瘤特异性独特型免疫球蛋白；B细胞分化抗原如CD19，CD20和CD37；骨髓细胞上的TSLPR和IL-7R和多发性骨髓瘤细胞上的癌睾丸(CT)抗原(如NY-ESO-1，LAGE-1a)，CS-1，CD38，CD138，MUC1，HM1.24，CYP1B1，SP17，PRAME，Wilms'肿瘤1(WT1)和热休克蛋白gp96。
跨膜结构域
如本文所用的“跨膜结构域”(TMD)是指细胞表面表达的DBDpp融合蛋白的区域，例如穿过质膜的DBDpp-CAR。在一些实施方案中，DBDpp-CAR的跨膜结构域是跨膜蛋白(例如I型跨膜蛋白)的跨膜区，人工疏水序列或其组合。其他跨膜结构域对于本领域技术人员将是显而易见的，并且可以结合本发明的替代实施方案使用。
DBDpp受体(例如DBDpp-CAR)可以被设计成含有与DBDpp受体的细胞外结构域融合的跨膜结构域。如上所讨论的，细胞外和跨膜结构域的融合可以使用或不使用接头完成。在一个实施方案中，使用与DBDpp-CAR中的一个结构域天然相关的跨膜结构域。在具体的实施方案中，DBDpp-CAR中的跨膜结构域是CD8跨膜结构域。在一些情况下，DBDpp-CAR的跨膜结构域包含CD8铰链结构域。在一些实施方案中，通过氨基酸置换选择或修饰跨膜结构域以促进或抑制与其他表面膜蛋白的缔合。
跨膜结构域可以来源于天然或合成来源。如果来源是天然的，则该结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。用于本文目的的特定用途的跨膜区可以来源于(即，包含至少以下成员的跨膜区)选自下组的成员：T细胞受体的α，β或ζ链；CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137和CD154。或者，跨膜结构域可以是合成的，在这种情况下，DBDpp-CAR跨膜结构域将主要包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。在进一步的实施方案中，跨膜结构域在合成跨膜结构域的每个末端包含苯丙氨酸，色氨酸和缬氨酸的三联体。
如本文所用的“细胞外间隔结构域”(ESD)是指在抗原特异性靶向区和跨膜结构域之间的亲水区。在一些实施方案中，DBDpp-CAR包含细胞外间隔结构域。在其他实施方案中，DBDpp-CAR不包含细胞外间隔结构域。细胞外间隔结构域包括但不限于抗体的Fc片段或其片段或衍生物，抗体的铰链区或其片段或衍生物，抗体的CH2区，抗体的CH3区，人工间隔区序列或其组合。细胞外间隔结构域的其他实例包括但不限于CD8a铰链和由可以小至例如IgG(例如人IgG4)的Gly3或CH1和CH3结构域的多肽制成的人工间隔区。在一些实施方案中，细胞外间隔结构域是(i)IgG4的铰链，CH2和CH3区，(ii)IgG4的铰链区，(iii)IgG4的铰链和CH2，(iv)CD8a的铰链区，(v)IgG1的铰链区，CH2和CH3区，(vi)IgG1的铰链区或(vi)IgG1的铰链区和CH2区中的任一个或多个。其他细胞外间隔结构域对于本领域技术人员而言将是显而易见的，并且可以结合本文提供的替代实施方案使用。
在一些实施方案中，使用短的寡-或多肽接头(长约1至100个氨基酸)将DBDpp-CAR的任何结构域连接在一起。接头可以由诸如甘氨酸和丝氨酸(或任何其他氨基酸)的柔性残基组成，使得相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动。可以选择接头的氨基酸序列组成以最小化DBDpp-CAR或DBDpp融合蛋白的潜在免疫原性。当期望确保两个相邻结构域不相互空间干扰时，可以使用较长的接头。在一些实施方案中，优选2至10个氨基酸的长度形成DBDpp-CAR的跨膜结构域和细胞质信号传导结构域之间的连接。在进一步的实施方案中，接头的长度为10至15个氨基酸，或15至20，或20至30，或30至60，或60至100个氨基酸(或其间所列的任何范围))。在进一步的实施方案中，接头是甘氨酸-丝氨酸双联体序列。进一步的实施方案使用衍生自人T-细胞表面糖蛋白CD8α链(例如从氨基酸位置138至182的CD8α链；Swiss-Prot登录号P01732)的铰链区的片段。进一步的实施方案使用已经(通过氨基酸置换)进一步修饰的CD8铰链区的片段，以改善表达功能或免疫原性。进一步的实施方案使用衍生自人CD28细胞外区的片段。另外的实施方案使用已经(通过氨基酸置换)进一步修饰的CD28细胞外区的片段，以改善表达功能或免疫原性。
细胞内结构域
本文使用的“细胞内信号传导结构域”(ISD)或“细胞质结构域”是指转导效应功能信号并指导细胞进行其特化功能的DBDpp-CAR部分。DBDpp-CAR的细胞质结构域(即细胞内信号传导结构域)负责激活被工程改造表达DBDpp-CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能。术语“效应功能”是指细胞的特化功能。例如，T细胞的效应功能包括细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导结构域”是指转导效应功能信号并指导细胞进行特化功能的DBDpp-CAR蛋白质的部分。虽然通常可以使用对应于天然存在的受体的完整的胞内信号传导结构域，但在许多情况下，不需要使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，只要其转导效应功能信号，可以使用这种截短部分代替完整链。术语细胞内信号传导结构域意味着包括足以转导效应功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。在一个实施方案中，DBDpp-CAR中的细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列和共同起作用以启动抗原受体接合后的信号转导的共受体序列，或具有功能能力的这些序列的任何衍生物或变体。转导效应功能信号的结构域的实例包括但不限于T细胞受体复合物的ζ链或其任何同系物(例如，η链，FcsRly和β链，MB1(Iga)链，B29(Ig)链等)，人CD3ζ链，CD3多肽(Δ，δ和ε)，syk家族酪氨酸激酶(Syk，ZAP70等)，src家族酪氨酸激酶(Lck，Fyn，Lyn等)和参与T细胞转导的其他分子如CD2，CD5和CD28。
已知仅通过TCR产生的信号不足以完全激活T细胞，并且还需要次级或共刺激信号。因此，T细胞激活可以说是由两种不同类型的细胞质信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的细胞质信号传导序列(初级细胞质信号传导序列)和以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的细胞质信号传导序列(次级细胞质信号传导序列)。
初级细胞质信号传导序列以刺激方式或抑制性方式调节TCR复合物的初级激活。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导基序。
在本发明中特别使用的含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括衍生自TCRζ，FcRγ，FcRβ，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD22，CD79a，CD79b和CD66d的那些。特别优选CAR中的细胞质信号分子包含来自CD3ζ的细胞质信号传导序列。
如本文所用的“共刺激结构域”(CSD)是指增强记忆细胞的增殖，存活和/或发育的CAR或DBDpp-CAR的部分。DBDpp-CAR可以包含一个或多个共刺激结构域。每个共刺激结构域包含例如TNFR超家族的成员的任一个或多个共刺激结构域，选自CD28，CD137(4-lBB)，CD134(OX40)，Dap10，CD27，CD2，CD5，ICAM-1，LFA-1(CD1la/CD18)，Lck，TNFR-I，TNFR-II，Fas，CD30和CD40或其组合。其他共刺激结构域(例如来自其它蛋白质)对于本领域技术人员将是显而易见的，并且可以结合本发明的替代实施方案使用。
在优选的实施方案中，DBDpp-CAR的细胞质结构域本身包含CD3-ζ信号传导结构域，或与在DBDpp-CAR的情况下有用的任何其他所需的细胞质结合域组合。例如，DBDpp-CAR的细胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区是指包含共刺激分子的细胞内结构域的CAR的一部分。共刺激分子是除了抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原有效应答所需的。此类分子的实例包括CD27，CD28，4-1BB(CD 137)，OX40，CD30，CD40，PD1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7H3，TIM1和LAG-3。
多肽接头可以位于DBDpp-CAR的相邻元件之间。例如，接头可位于相邻DBDpp之间或DBDpp与跨膜结构域之间或跨膜结构域与细胞质结构域之间或相邻细胞质结构域之间。DBDpp-CAR的细胞质信号传导部分内的细胞质信号序列可以以随机或指定的顺序相互连接。任选地，优选长度在2和10个氨基酸之间的短接头可以形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别合适的接头。
表位标签
在一些实施方案中，DBDpp融合蛋白包含肽表位标签。在一些实施方案中，肽标签选自六组氨酸(His6)标签，myc标签和FLAG标签。在另外的实施方案中，肽标签包括但不限于avitag(允许标签的生物素化和用链霉抗生物素蛋白分离)，钙调蛋白，E-标签，血凝素(HA)，S-标签，SBP-标签，softag 1，链霉抗生物素蛋白，四或多聚半胱氨酸，V5，VSV和Xpress标签。另外可以使用多组氨酸标签(不同于6个残基)。在另外的实施方案中，可以使用共价肽标签，蛋白质标签等。共价肽标签包括但不限于isopeptag(共价结合pilinC蛋白)，Spytag(共价结合SpyCatcher蛋白)和Snooptag(共价结合SnoopCatcher蛋白)。在另外的实施方案中，可以任选地使用包括但不限于生物素羧基载体蛋白(BCCP)，谷胱甘肽-S-转移酶，绿色荧光蛋白(或其它荧光团)，Halo标签，Nus标签，硫氧还蛋白和Fc标签的蛋白质标签。在其他实施方案中，可以使用多种类型的标签。在其他实施方案中，不使用标签。取决于实施方案，可以使用本文公开的细胞外，跨膜和细胞内结构域的任意组合。
接头
术语“接头”和间隔区在本文中可互换使用，是指起到连接其它独立功能结构域的功能的肽或其他化学连接。在一个实施方案中，DBDpp中的接头位于DBDpp与另外含有独立功能结构域的另一多肽组分之间。用于偶联两个或更多个连接的DBDpp的合适的接头对于本领域技术人员是清楚的，并且通常可以是本领域中用于连接肽，蛋白质或其他有机分子的任何接头。在具体的实施方案中，这种接头适合于构建打算用于药物的蛋白质或多肽。
用于在单链氨基酸序列中可操作地连接DBDpp和DBDpp融合蛋白的另外组分的合适接头包括但不限于多肽接头，例如甘氨酸接头，丝氨酸接头，混合的甘氨酸/丝氨酸接头，富含甘氨酸和富含丝氨酸的接头或由大极性多肽片段组成的接头。
在一个实施方案中，接头由大部分选自甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺和赖氨酸的氨基酸组成。在一个实施方案中，接头由大部分选自甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，苏氨酸，谷氨酰胺和赖氨酸的氨基酸组成。在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白接头由选自甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺和赖氨酸中的一种或多种氨基酸组成。在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白接头由选自甘氨酸，丙氨酸，脯氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，苏氨酸，谷氨酰胺和赖氨酸中的一种或多种氨基酸组成。在另一个实施方案中，DBDpp融合蛋白接头由大部分无空间位阻的氨基酸组成。在另一个实施方案中，其中大部分氨基酸是甘氨酸，丝氨酸和/或丙氨酸的接头。在一些实施方案中，肽接头选自聚甘氨酸(例如(Gly)5和(Gly)8，聚(Gly-Ala)和聚丙氨酸。在一些实施方案中，肽接头含有Gly-Gly-Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的序列。在一些实施方案中，肽接头含有Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser的序列。
在一个实施方案中，DBDpp融合物包含与DBDpp融合蛋白的另一个组分直接附接(即没有接头)的DBDpp。在一个实施方案中，DBDpp融合物包含至少2个，至少3个，至少4个，直接连接到DBDpp融合物的另一个组分的DBDpp。
在另一个实施方案中，DBDpp能够通过接头与DBDpp融合蛋白的另一个组分可操作地连接。DBDpp融合蛋白可以含有单个接头，多个接头或不含接头。在一个实施方案中，DBDpp融合物包含通过接头肽可操作地连接至DBDpp融合蛋白的另一组分的DBDpp。在一个实施方案中，DBDpp融合物包含通过接头肽可操作地连接至DBDpp融合蛋白的另一个组分的至少2，3，4或5个DBD。
接头可以具有任何大小或组成，只要它们能够以使得DBDpp能够结合目的靶的方式可操作地连接DBDpp即可。在一些实施方案中，接头为约1至约100个氨基酸，约1至50个氨基酸，约1至20个氨基酸，约1至15个氨基酸，约1至10个氨基酸，约1至5个氨基酸，约2至20个氨基酸，约2至15个氨基酸，约2至10个氨基酸或约2至5个氨基酸。应该清楚的是，接头的长度，柔性和/或其他性质可能对本发明的最终多肽的性质具有一些影响，包括但不限于对目的靶或一个或多个其他目的靶蛋白的亲和力，特异性或亲合力。当在DBDpp融合蛋白中使用两个或更多个接头时，这些接头可以相同或不同。在本文提供的上下文和公开内容中，本领域技术人员将能够为了可操作地连接DBDpp和DBDpp融合蛋白的其他组分的目的而常规地确定最佳接头组成和长度。
接头还可以是非肽接头，例如烷基接头或PEG接头。例如，可以使用烷基接头如-NH-(CH2)s-C(O)-，其中s＝2-20。这些烷基接头可以进一步被任何非空间位阻基团如低级烷基(例如C1-C6)低级酰基，卤素(例如Cl，Br)，CN，NH2，苯基等置换。示例性的非肽接头是PEG接头。在某些实施方案中，PEG接头具有约100至5000kDa或约100至500kDa的分子量。
用于通过化学交联偶联DBDpp和DBDpp融合蛋白组分的合适的接头包括但不限于：同双功能化学交联化合物如戊二醛，亚氨酸酯如二亚胺代己二酸二甲酯(DMA)，二亚胺代辛二酸二甲酯(DMS)和二亚胺代庚二酸二甲酯和(DMP)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯如二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DSP)和二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(DTSSP)。用于偶联用于交联的异双官能试剂的DBDpp和DBDpp融合蛋白组分的合适接头的实例包括但不限于具有一个胺反应性末端和在另一端的巯基反应性部分，或一端是NHS酯而另一端是SH-反应性基团(例如马来酰亚胺或吡啶基)的交联剂。
在另外的实施方案中，DBDpp融合蛋白中的一个或多个接头是可切割的。可切割接头的实例包括但不限于由不同类型的蛋白酶(体外或体内)识别的肽序列，如Tev，凝血酶，因子Xa，纤溶酶(血液蛋白酶)，金属蛋白酶，组织蛋白酶(例如GFLG等))和在其他有形隔室中发现的蛋白酶。
在一个实施方案中，接头是促进细胞中DBDpp或细胞毒性剂释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头(例如腙)，蛋白酶敏感的(例如，肽酶敏感的)接头，光不稳定接头，二甲基接头或含二硫化物的接头(Chari，Can.Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020；美国申请公布号20090110753；各自通过引用整体并入)，其中期望DBDpp或细胞毒性剂与融合配偶体之间的共价附接是细胞内的当组合物内化到细胞中时被切割。术语“细胞内切割”(“intracellularly cleaved”和“intracellular cleavage”)是指细胞内对DBDpp药物缀合物的代谢过程或反应，由此共价附接，即通过DBDpp和细胞毒性剂，DBDpp和融合配偶体之间，或两个DBDpp之间的接头连接被破坏，得到在细胞内解离的游离DBDpp和/或细胞毒性剂。
可以使用本文所述的技术和/或本领域中已知的其他技术来评估接头优化。在一些实施方案中，接头不破坏DBDpp结合靶分子和/或另一种DBDpp融合蛋白组分如抗体结构域或片段以结合抗原的能力。
DBDpp作为化学缀合物
促进与目的靶特异性结合的DBDpp可以与各种化合物例如荧光染料，放射性同位素，色谱组合物(例如珠，树脂，凝胶等)和化学治疗剂化学缀合。DBDpp缀合物具有包括但不限于纯化，诊断，分析，制造和治疗应用的用途。
DBD序列中固有的缺乏半胱氨酸提供了引入用于位点特异性缀合目的的独特半胱氨酸的机会。
在一些实施方案中，DBDpp(例如DBDpp融合蛋白)含有至少一个反应性残基。反应性残基是有用的，例如作为缀合物例如化疗药物附接的位点。反应性残基可以是例如半胱氨酸，赖氨酸或另一种反应性残基。因此，可以在N或C末端或在DBDpp序列内将半胱氨酸添加到DBDpp。半胱氨酸可以置换DBDpp序列中的另一个氨基酸。另外，可以将赖氨酸添加到DBDpp的任一端或DBDpp序列内和/或赖氨酸可以置换DBDpp序列中的另一个氨基酸。在一个实施方案中，反应性残基(例如半胱氨酸，赖氨酸等)位于DBD的环状序列(例如SEQ ID NO:7-11的Z1和Z2)中。在一个实施方案中，反应性残基位于DBDpp融合物的组分之间，例如在位于DBDpp与DBDpp融合蛋白的其他组分之间的接头中。反应性残基(例如半胱氨酸，赖氨酸等)也可以位于DBDpp或DBDpp融合蛋白的其他组分的序列内。在一个实施方案中，DBDpp或DBDpp融合蛋白包含至少一个，至少两个，至少三个反应性残基。在一个实施方案中，DBDpp诸如DBDpp融合蛋白包含至少一个，至少两个或至少三个半胱氨酸残基。
DBDpp的产生
可用于实施所提供的方法的DBDpp的产生可以使用本领域已知的化学合成，半合成方法和重组DNA方法的各种标准技术来进行。还提供了单独或作为多结构域融合蛋白的一部分以及作为可溶性试剂和细胞相关蛋白产生DBDpp的方法。
在若干实施方案中，DBDpp的总体产生方案包括获得参考蛋白质支架并鉴定支架内的多个残基进行修饰。取决于实施方案，参考支架可以包含具有一个或多个α-螺旋区或其他三级结构的蛋白质结构。一旦鉴定出来，可以修饰多个残基，例如通过置换氨基酸。在一些实施方案中，置换是保守的，而在其他实施方案中，进行非保守置换。在一些实施方案中，天然氨基酸(例如丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸或缬氨酸之一)被置换到参考支架的靶向位置进行修饰。在某些实施方案中，修饰不包括置换半胱氨酸或脯氨酸。在对特定实施方案中所需的所有鉴定位置进行修饰之后，可以将所得修饰的多肽(例如候选DBDpp)重组表达，例如在质粒，细菌，噬菌体或其它载体中(例如以增加每种修饰的多肽的数量)。然后可以纯化修饰的多肽并筛选以鉴定那些与特定目的靶具有特异性结合的修饰的多肽。在一些实施方案中，某些修饰的多肽将显示对于目的靶相对于参考支架的增强的结合特异性，其在一些实施方案中可能表现出对给定的目的靶的很少或不结合。在另外的实施方案中，取决于目的靶，参考支架可以与目的靶显示一些相互作用(例如非特异性相互作用)，而某些修饰的多肽将表现出至少约2倍，至少约5倍，至少约10倍，至少约20倍，至少约50倍或至少约100倍(或更多)增加对目的靶的结合特异性。任选地，参考序列和/或修饰的多肽(例如DBDpp)可以被去免疫。例如，可以鉴定和修饰具有潜在免疫原性的残基或基序，以减少或消除对DBDpp的潜在免疫应答。以下更详细地提供关于DBDpp的产生，选择和分离的各种实施方案的其他细节。
DBDpp的重组表达
在一些实施方案中，诸如DBDpp融合蛋白的DBDpp是“重组产生的”(即，使用重组DNA技术产生的)。可用于合成DBDpp融合蛋白的示例性重组方法包括但不限于基于聚合酶链式反应(PCR)的合成，多联体化(concatemerization)，无缝克隆和递归定向连接(RDL)(参见例如Meyer et al.，Biomacromolecules 3:357-367(2002)，Kurihara et al.，Biotechnol.Lett.27:665-670(2005)，Haider et al.，Mol.Pharm.2:139-150(2005)；andMcMillan et al.，32:3643-3646(1999)，其全部内容通过引用整体并入本文)。
还提供了包含编码DBDpp的多核苷酸序列的核酸。此类多核苷酸任选地还包含一种或多种表达控制元件。例如，多核苷酸可以包含一个或多个启动子或转录增强子，核糖体结合位点，转录终止信号和聚腺苷酸化信号作为表达控制元件。可将多核苷酸插入任何合适的载体内，其可包含在任何合适的用于表达的宿主细胞中。
编码DBDpp的核酸的表达通常通过将编码DBDpp的核酸与表达载体中的启动子可操作地连接来实现。典型的表达载体含有转录和翻译终止子，起始序列和可用于调节所需核酸序列表达的启动子。本领域已知的方法可用于常规构建含有编码DBDpp的核酸序列以及合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括但不限于体外重组DNA技术，合成技术和体内重组/基因重组。多核苷酸的表达可以在本领域已知的任何合适的表达宿主中进行，包括但不限于细菌细胞，酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞或哺乳动物细胞。在一个实施方案中，编码DBDpp的核酸序列与合适的启动子序列可操作地连接，使得核酸序列在宿主中被转录和/或翻译成DBDpp。用于在大肠杆菌中表达的启动子包括但不限于T7启动子。
在一个实施方案中，将包含DBDpp编码核酸的载体导入用于表达DBDpp的宿主细胞(例如噬菌粒)中。只要编码治疗剂的插入物可以被转录，载体可以保持附加型或变成染色体整合。载体可以通过标准重组DNA技术构建。载体可以是用于在原核或真核细胞中复制和表达的质粒，噬菌体，粘粒，噬菌粒，病毒或本领域已知的任何其它类型。本领域的技术人员将会理解，本领域已知的各种组分(例如表达控制元件)可以被包括在这样的载体中，包括各种转录信号，例如启动子和调节RNA聚合酶与启动子的结合的其他序列。任何已知的或证明在载体表达细胞中有效的启动子都可用于启动DBDpp的表达。合适的启动子可以是可诱导的(例如，调节的)或组成型的。合适的启动子的非限制性实例包括SV40早期启动子区，劳氏肉瘤病毒的3'长末端重复中包含的启动子，HSV-1(单纯疱疹病毒-1)胸苷激酶启动子，金属硫蛋白基因的调节序列等以及以下表现组织特异性并已用于转基因动物的动物转录控制区：在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区；在胰腺β细胞中有活性的胰岛素基因控制区，在睾丸，乳房，淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳房肿瘤病毒控制区，在肝脏中活性的白蛋白基因控制区，在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区，在肝脏中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区，在红细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区，在脑中的少突胶质细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区，在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区，和在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区。在具体的实施方案中，启动子是在淋巴样细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区。
在一个实施方案中，编码DBDpp的一种或多种核酸在组成型启动子的控制下表达，或者任选地在调节表达系统的控制下表达。合适的调控表达系统包括但不限于四环素调节的表达系统，蜕皮素诱导型表达系统，lac-开关表达系统，糖皮质激素-诱导型表达系统，温度诱导型启动子系统和金属硫蛋白金属诱导表达系统。如果编码DBDpp的几种不同的核酸包含在宿主细胞系统内，则一些核酸可以在组成型启动子的控制下表达，而其他核酸可以在调控的启动子的控制下表达。表达水平可以通过本领域已知的方法确定，包括蛋白质印迹分析和Northern印迹分析。
多种宿主表达载体系统可用于表达编码DBDpp的核酸。含有编码DBDpp的核酸(例如单独的DBD亚单位或DBDpp融合物)或其部分或片段的载体包括质粒载体，单链和双链噬菌体载体，以及单链和双链RNA或DNA病毒载体。噬菌体和病毒载体也可以使用已知的感染和转导技术以包装或包裹的病毒的形式引入宿主细胞。此外，病毒载体可能是有复制能力的，或者是复制缺陷的。或者，也可以使用无细胞翻译系统来使用衍生自DNA表达构建体的RNA产生蛋白质(参见例如WO86/05807和WO89/01036；以及美国专利号5,122,464，各自通过引用整体并入本文)。
通常，可以使用任何类型的细胞或培养的细胞系来表达本文提供的DBDpp。在一些实施方案中，用于产生工程改造宿主细胞的背景细胞系是噬菌体，细菌细胞，酵母细胞或哺乳动物细胞。各种宿主表达载体系统可用于表达DBDpp融合蛋白的编码序列。哺乳动物细胞可用作用重组质粒DNA转染的宿主细胞系统或用含有目的靶编码序列和融合多肽编码序列的粘粒DNA表达载体转染的宿主细胞系统。
细胞可以是来自生物体(包括人)的原代分离物，培养物或转化或转基因性质的细胞系。在一些实施方案中，宿主细胞是人细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是人T细胞。在一些实施方案中，宿主细胞来源于人患者。
有用的宿主细胞包括但不限于如用含有DBDpp编码序列的重组噬菌体DNA，质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌)的微生物；用含有DBDpp编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如酵母属(Saccharomyces)，毕赤酵母(Pichia))；用含有DBDpp编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的植物细胞系统或用含有DBDpp编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统。在具体的实施方案中，使用哺乳动物细胞系统来产生DBDpp。哺乳动物细胞系统通常利用含有来自哺乳动物细胞基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体。
在产生DBDpp如DBDpp融合蛋白中用作宿主细胞的原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。用于原核宿主细胞的表达载体通常含有一种或多种表型选择性标记基因(例如，编码赋予抗生素抗性或提供自养需求的蛋白质的基因)。有用的原核宿主表达载体的实例包括pKK223-3(Pharmacia，Uppsala，Sweden)，pGEM1(Promega，Wis.，USA)，pET(Novagen，Wis.，USA)和pRSET(Invitrogen，Calif.，USA)系列载体(参见例如Studier，J.Mol.Biol.219:37(1991)和Schoepfer，Gene 124:83(1993))。常用于原核宿主细胞表达载体的示例性启动子序列包括T7(Rosenberg et al.，Gene 56:125-135(1987))，β-内酰胺酶(青霉素酶)，乳糖启动子系统(Chang et al.，Nature 275:615(1978)；和Goeddel et al.，Nature281:544(1979))，色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel etal.，Nucl.Acids Res.8:4057，(1980))和tac启动子(Sambrook et al.，1990，MolecularCloning，A Laboratory Manual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，N.Y.)。
在一个实施方案中，使用真核宿主细胞系统，包括用含有DBDpp编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母细胞，例如美国专利申请60/344,169和WO03/056914中教导的表达系统(在非人真核宿主细胞中产生类人糖蛋白的方法)(其内容各自通过引用整体并入本文)。可以用于产生本发明组合物例如DBD的示例性酵母包括来自酵母属，毕赤酵母属，放线菌属和克鲁维酵母属的酵母。酵母载体通常含有来自2mu酵母质粒的复制起点序列，自主复制序列(ARS)，启动子区，聚腺苷酸化序列，转录终止序列和选择标记基因。酵母表达构建体中的启动子序列的实例包括来自金属硫蛋白，3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman，J.Biol.Chem.255：2073(1980))和其他糖酵解酶，如烯醇化酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，己糖激酶，丙酮酸脱羧酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖-6-磷酸异构酶，3-磷酸甘油酸变位酶，丙酮酸激酶，磷酸丙糖异构酶，磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶的启动子。用于酵母表达以及酵母转化操作方案的其他合适的载体和启动子是本领域已知的。参见例如Fleer，Gene 107:285-195(1991)and Hinnen，PNAS75:1929(1978)。
昆虫和植物宿主细胞培养系统也可用于产生本发明的组合物。此类宿主细胞系统包括例如感染有含有DBD编码序列的重组病毒表达载体(例如杆状病毒)的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的植物细胞系统或用含有DBD编码序列的重组质粒表达载体(例如Ti质粒)转化的植物细胞系统，包括但不限于美国专利号6,815,184；美国公布号60/365,769和60/368,047；和WO2004/057002，WO2004/024927和WO2003/078614中教导的表达系统，其每个的内容通过引用整体并入本文。
在另外的实施方案中，可以使用宿主细胞系统，包括用重组病毒表达载体(例如腺病毒，逆转录病毒，腺相关病毒，疱疹病毒，慢病毒)感染的动物细胞系统，包括经工程改造含有多个拷贝的编码DBDpp的DNA在双微染色体中稳定扩增(CHO/dhfr)或不稳定地扩增的细胞系(例如，鼠细胞系)。在一个实施方案中，包含编码DBDpp的多核苷酸的载体是多顺反子的。可用于产生这些组合物的示例性哺乳动物细胞包括293细胞(例如293T和293F)，CHO细胞，BHK细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，YO骨髓瘤细胞，P3X63小鼠骨髓瘤细胞，PER细胞，PER.C6(Crucell，Netherlands)细胞VERY，Hela细胞，COS细胞，MDCK细胞，3T3细胞，W138细胞，BT483细胞，Hs578T细胞，HTB2细胞，BT20细胞，T47D细胞，CRL7O30细胞，HsS78Bst细胞，杂交瘤细胞和其它哺乳动物细胞。用于实施本发明的另外的示例性哺乳动物宿主细胞包括但不限于T细胞。表达系统和选择方法的一些实例在下面的参考文献和其中引用的参考文献中描述：Borth et al.，Biotechnol.Bioen.71(4):266-73(2000)，于Werner et al.，Arzneimittelforschung/Drug Res.48(8):870-80(1998)，Andersen et al.，Curr.Op.Biotechnol.13:117-123(2002)，Chadd et al.，Curr.Op，Biotechnol.12:188-194(2001)，以及Giddings，Curr.Op.Biotechnol.12:450-454(2001)。表达系统和选择方法的其它实例在Logan et al.，PNAS 81:355-359(1984)，Birtner et al.MethodsEnzymol.153:51-544(1987)中描述。哺乳动物宿主细胞表达载体的转录和翻译控制序列通常来源于病毒基因组。哺乳动物表达载体中常用的启动子序列和增强子序列包括源自多瘤病毒，腺病毒2，猿猴病毒40(SV40)和人巨细胞病毒(CMV)的序列。用于哺乳动物宿主细胞的示例性市售表达载体包括pCEP4(Invitrogen)和pcDNA3(Invitrogen)。
用于将核酸引入宿主细胞(例如，哺乳动物宿主细胞)的物理方法包括磷酸钙沉淀，脂质体转染，粒子轰击，显微注射，电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是众所周知的。参见例如Sambrook et al.(2001，Molecular Cloning:ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)。
将目的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，尤其是逆转录病毒载体已经成为将基因插入哺乳动物(例如人)细胞中使用最广泛的方法。其他病毒载体可以来源于慢病毒，痘病毒，单纯疱疹病毒I，腺病毒和腺相关病毒等。参见例如美国专利号5,350,674和5,585,362，其每一个的内容在此通过引用整体并入。
用于将目的DNA和RNA多核苷酸引入宿主细胞的方法包括细胞的电穿孔，其中将电场施加到细胞以增加细胞膜的渗透性，允许化学品，药物或多核苷酸被引入到细胞中。可以使用电穿孔将含有DBDpp的DNA或RNA构建体导入哺乳动物或原核细胞。
在一个优选的实施方案中，细胞的电穿孔导致在T细胞，NK细胞，NKT细胞表面上表达DBDpp-CAR。此类表达在细胞的生命周期中可能是短暂的或稳定的。电穿孔可以用本领域已知的方法完成，包括MaxCyte和转染系统(MaxCyte，Gaithersburg，MD，USA)。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学工具包括胶体分散体系，例如大分子复合物，纳米胶囊，微球，珠和基于脂质的体系，包括水包油乳液，胶束，混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载体的示例性胶体系统是脂质体(例如人工膜囊泡)。在使用非病毒递送系统的情况下，示例性递送载体是脂质体。考虑将核酸引入宿主细胞(体外，离体或体内)使用脂质制剂。在另一方面，核酸可以与脂质结合。与脂质结合的核酸可以包封在脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂质双层内，通过与脂质体和寡核苷酸结合的连接分子附接到脂质体，包埋在脂质体中，与脂质体复合，分散在含有脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质组合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质结合。脂质，脂质/DNA或脂质/表达载体相关组合物不限于溶液中的任何特定结构。例如，它们可以以双层结构存在，如胶束，或“折叠”结构。它们也可以简单地散布在溶液中，可能形成尺寸或形状不均匀的聚集体。脂质是可以是天然存在的脂肪物质或合成脂质。例如，脂质包括天然存在于细胞质中的脂肪滴以及含有长链脂肪族烃及其衍生物(如脂肪酸，醇，胺，氨基醇和醛)的一类化合物。
适合使用的脂质可以从商业来源获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma，St.Louis，MO获得；磷酸双十六烷酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview，NY)获得；胆固醇(“Choi”)可以从Calbiochem-Behring获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其他脂质可以从Avanti Polar Lipids，Inc。(Birmingham，AL)获得。脂类在氯仿或氯仿/甲醇中的储液可以储存在约-20℃。氯仿可以用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”是包括通过产生封闭的脂质双层或聚集体形成的各种单层和多层脂质载体的通用术语。脂质体可表征为具有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发地形成。脂质组分在封闭结构形成之前经历自我重排，并在脂质双分子层之间截留水和溶解的溶质(Ghosh et al.，Glycobiology 5:505-510(1991))。然而，也包括在溶液中具有不同于正常囊泡结构的结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的不均匀聚集体存在。还考虑了lipofectamine-核酸复合物。
无论用于将外源核酸引入到宿主细胞中的方法如何，或者宿主细胞中重组核酸序列的存在都可以通过本领域已知的各种测定来常规确认。这样的测定包括，例如，本领域已知的“分子生物学”测定，例如Southern和Northern印迹，RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如通过免疫学方法(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文所述的测定来检测特定肽的存在或不存在以鉴定落入本发明范围内的试剂。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评估调控序列的功能性。通常，报道基因是不存在于受体生物体，组织或细胞中或由受体生物体，组织或细胞表达的基因，并且编码表达通过一些易于检测的性质(例如酶活性)表现的多肽。在将DNA导入受体细胞后，在合适的时间测定报道基因的表达。合适的报道基因的非限制性列表可以包括编码萤光素酶，β-半乳糖苷酶，氯霉素乙酰转移酶，分泌的碱性磷酸酶的基因或绿色荧光蛋白基因(例如，Ui-Tei et al.,FEBS Lett.479:79-82(2000))。合适的表达系统是本领域已知的并且可以使用已知技术制备或商业获得。通常，具有显示报道基因最高表达水平的最小5'侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可以常规地与报道基因连接并用于评估试剂调节启动子驱动的转录的能力。
许多选择系统可用于哺乳动物宿主-载体表达系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy et al.，Cell 22:817(1980))基因，它们可分别用于tk-，hgprt-或aprt-细胞。此外，抗代谢物抗性可以用作例如dhfr，gpt，neo，hygro，trpB，hisD，ODC(鸟氨酸脱羧酶)和谷氨酰胺合酶系统的选择的基础。
DBDpp纯化
一旦已经通过重组表达产生了DBDpp如DBDpp融合蛋白，则可以通过本领域已知的任何用于纯化重组蛋白的方法，例如通过色谱(例如离子交换色谱，亲和色谱和分级(sizing)柱色谱)，离心，差异溶解度，或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术进行纯化。在另外的实施方案中，DBDpp任选与本文所述的或本领域其他已知的异源多肽序列融合以促进纯化。更具体地，可以设想用于亲和纯化的DBDpp亲和柱的配体(例如，抗体和其他亲和基质)和任选地使用本领域已知的技术将由这些配体结合的DBDpp或DBDpp融合组合物的其它组分从DBDpp最终制剂之前的组合物中去除。
细胞缔合DBDpp的表达
在本发明的另一个实施方案中，产生DBDpp得到细胞缔合DBDpp组合物。例如，编码可操作地连接于细胞膜锚或跨膜结构域的DBDpp的重组载体的表达具有保持细胞缔合的潜力。包含嵌合抗原受体的DBDpp有意地与细胞缔合并用于它们表达于其中的细胞的情况中。一个具体的实施方案涉及已经转导以表达DBDpp嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的过继性细胞转移策略。优选地，细胞可以被遗传修饰以在其表面上稳定表达DBDpp，赋予独立于MHC的新靶特异性。
各种病毒衍生的载体可用于将病毒用于转染和整合到哺乳动物细胞基因组中的应用。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒，腺病毒，腺相关病毒，疱疹病毒和慢病毒。慢病毒载体特别适用于实现长期基因转移(例如，过继性T细胞免疫疗法)，因为它们允许转基因长期稳定整合并在子细胞中增殖。慢病毒载体相对于来自癌症-逆转录病毒如鼠白血病病毒的载体具有附加优点，因为它们可以转导非增殖细胞，如肝细胞。它们还具有免疫原性低的附加优点。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中具有功能的复制起点，启动子序列，方便的限制性内切核酸酶位点和一个或多个选择性标记(例如WO 01/96584和WO01/29058；以及美国专利号6,326,193)。几种载体启动子序列可用于表达转基因。合适的启动子的一个实例是立即早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例是EF-1a。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(SV40)早期启动子，小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)，人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子，MoMuLV启动子，禽白血病病毒启动子，EB病毒立即早期启动子，劳斯肉瘤病毒启动子，以及人基因启动子，例如但不限于肌动蛋白启动子，肌球蛋白启动子，血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。诱导型启动子包括但不限于金属硫蛋白启动子，糖皮质激素启动子，黄体酮启动子和四环素启动子。
为了评估DBDpp-CAR多肽或其部分的表达，待导入细胞的表达载体还可以含有选择性标记基因或报道基因或两者以促进从群体中鉴定和选择表达细胞通过病毒载体寻求转染或感染的细胞，在其他方面，选择性标记可以携带在分开的DNA片段上并用于共转染过程。选择性标记和报道基因二者都可以在适当的调控序列的侧翼，以便能够在宿主细胞中表达。有用的选择性标记包括例如抗生素抗性基因，例如neo等。
在扩增和遗传修饰本发明的T细胞之前，从受试者获得T细胞的来源。T细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞，骨髓，淋巴结组织，脐带血，胸腺组织，来自感染部位的组织，腹水，胸腔积液，脾脏组织和肿瘤。在本文提供的某些实施方案中，可以使用本领域可用的任何数量的T细胞系。
T细胞分离，培养，激活和扩增方法的全面讨论可以在WO2012079000中找到，其内容通过引用整体并入本文。
另外提供的是包含编码本文所述的DBDpp的核酸的宿主细胞。还提供了包含编码DBDpp的核酸序列的组合物。
如本文所用的“共表达”是指两个或更多个蛋白质编码序列的同时表达。编码序列可以是编码例如单一蛋白质或嵌合蛋白质作为单一多肽链的核酸。
DBDpp的化学合成
除了重组方法之外，还可以使用本领域已知的各种液相和固相化学方法使用所需多肽的有机化学合成来产生DBDpp。各种自动合成器是市场上可买到的并且可以根据已知的方案使用。参见例如，Tam et al.，J.Am.Chem.Soc，105:6442(1983)；Merrifield，Science232:341-347(1986)；Barany and Merrifield，The Peptides，Gross andMeienhofer，eds，Academic Press，New York，1-284；Barany et al.，Int.J.Pep.ProteinRes.，30:705 739(1987)；Kelley et al.in Genetic Engineering Principles andMethods，Setlow，J.K.，ed.Plenum Press，NY.1990，vol.12，pp.1-19；Stewart et al.，Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co.，San Francisco，1989。这些方法的一个优点是它们允许将非天然氨基酸残基并入DBDpp序列中。
可以在合成或翻译过程中或之后修饰用于本发明方法的DBDpp，例如通过糖基化，乙酰化，苄基化，磷酸化，酰胺化，聚乙二醇化，甲酰化，通过已知的保护/封闭基团的衍生作用，蛋白水解切割，与抗体分子连接，羟基化，碘化，甲基化，肉豆蔻酰化，氧化，聚乙二醇化，蛋白水解加工，磷酸化，异戊二烯化，外消旋化，硒化，硫酸化，泛素化等(参见例如Creighton，Proteins:Structures and Molecular Properties，2d Ed.(W.H.Freeman andCo.，N.Y.，1992)；Postranslational Covalent Modification of Proteins，Johnson，ed.(Academic Press，New York，1983)，pp.1-12；Seifter，Meth.Enzymol.，182:626-646(1990)；Rattan，Ann.NY Acad.Sci.，663:48-62(1992))。在特定的实施方案中，肽在N末端乙酰化和/或在C末端酰胺化。
许多化学修饰中的任一种可以通过已知技术进行，包括但不限于乙酰化，甲酰化等。此外，衍生物可以含有一种或多种非经典氨基酸。
DBDpp的群可以由多肽文库表示
DBDpp的“文库”是指多个独特的DBDpp。DBDpp的“载体文库”是指编码DBDpp的多个独特的核酸。这些DBDpp文库可用于选择和鉴定促进与特定预定靶结合的序列。
在一个实施方案中，DBDpp由不同DBDpp分子的混合群体或文库表示。DBDpp文库并不意味着对数字独特的多肽分子有任何特定的大小限制。文库可以包含少至3，5，6，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45，50，75或100个独特的DBDpp，并且可以包括大于1020个不同的DBDpp。在一些实施方案中，文库具有至多约104，105，106，107或108个独特的DBDpp。在进一步的实施方案中，该库具有至多约1012个不同的DBDpp。
在一个实施方案中，多肽变体群体基于核心残基和变体残基的序列。例如，SEQ IDNO:3变体残基用X表示，其中X可以是不依赖于序列中用X表示的任何其他残基的身份的任何氨基酸残基。在某些实施方案中，X可以包含空位置(例如在该位点不含氨基酸)。在支架氨基酸序列中，可以从所有20个天然存在的氨基酸残基中选择不同变化的氨基酸X，使得在任何给定的变体中，这20个天然存在的氨基酸残基中的任何一个可以存在于相应的X位置。取决于实施方案，每个位置的氨基酸残基的选择或多或少被随机化。也可以将从其中选择不同变化的氨基酸残基的组限制为选自20个天然存在的氨基酸残基中的19，18，17，16个或更少。例如，在一些实施方案中，变体残基不被半胱氨酸和/或脯氨酸替换。不同位置的变异性可以单独调整，在一个(意味着没有随机化)至达到所有20个氨基酸之间。可以通过仔细选择引入的脱氧核糖核苷酸碱基来获得氨基酸的较小子集的随机引入，例如可以引入密码子T(A/C)C以获得丝氨酸或酪氨酸在多肽链中的给定位置上的随机引入。同样，可以引入密码子(T/C/A/G)CC以获得多肽链中给定位置的苯丙氨酸，亮氨酸，丙氨酸和缬氨酸的随机引入。如本领域普通技术人员将理解的，可以使用脱氧核糖核苷酸碱基组合的许多替代方案来获得多肽链中给定位置的氨基酸的不同组合。可以出现在多肽链的给定位置上的一组氨基酸也可以通过在寡核苷酸合成期间引入三核苷酸而不是一次一个脱氧核糖核苷酸碱基来确定。
还提供了包含多个DBDpp的文库。在一些实施方案中，DBDpp文库包含多个不同的DBDpp，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个氨基酸残基已被修饰；并且其中DBDpp特异性地结合目的靶。在一些实施方案中，修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个是置换。在一些实施方案中，修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个为保守置换。在一些实施方案中，修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个是非保守置换。在另一个实施方案中，氨基酸残基修饰的5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个为保守置换，而氨基酸残基修饰的5至15个，5至20个，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个是非保守置换。在另外的实施方案中，置换的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个位于SEQ ID NO:1的氨基酸残基选自M1，G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，L21，G22，G23，S24，E25，A26，E27，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，Y45，K46，G47，K48，G49，N50，P51，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69，Y70，R71，H72和N73。在进一步的实施方案中，置换的1至20，1至30或1至40个位于SEQ ID NO:1的氨基酸残基选自G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69和Y70。在另一个实施方案中，文库包含特异性结合不同靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同的DBDpp。在另一个实施方案中，由文库中DBDpp结合的不同靶选自：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在进一步的实施方案中，文库包含特异性结合选自以下的蛋白质靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同的DBDpp：激素，血清蛋白质，细胞表面蛋白质，治疗性蛋白质，TSA，CSA和含有序列标签的蛋白质。在进一步的实施方案中，文库包含特异性结合本文公开的靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同的DBDpp。在另外的实施方案中，文库是载体文库或宿主细胞文库。在另外的实施方案中，载体文库是宿主细胞的文库。在另一个实施方案中，宿主细胞文库包含多个在其表面上展示DBDpp的宿主细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。
在一些实施方案中，DBDpp文库包含：(a)特异性结合不同靶的3个DBDpp；(b)具有与同一靶特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或超过10个DBDpp；(c)具有与目的靶的相同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或超过10个DBDpp；(d)具有与靶的不同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp；或(e)具有与相同靶竞争结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp。
还提供了包含多个DBDpp的文库。在一些实施方案中，DBDpp文库包含多个不同的DBDpp，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个氨基酸残基已被修饰；并且其中DBDpp特异性地结合目的靶。在一些实施方案中，修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个是置换。在一些实施方案中，修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个为保守置换。在一些实施方案中，修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个是非保守置换。在另一个实施方案中，氨基酸残基修饰的5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个为保守置换，而氨基酸残基修饰的5至15个，5至20个，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个是非保守置换。在另外的实施方案中，置换的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个位于SEQ ID NO:1的氨基酸残基选自M1，G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，L21，G22，G23，S24，E25，A26，E27，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，Y45，K46，G47，K48，G49，N50，P51，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69，Y70，R71，H72和N73。在进一步的实施方案中，置换的1至20，1至30或1至40个位于SEQ ID NO:1的氨基酸残基选自G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69和Y70。在另一个实施方案中，文库包含特异性结合不同靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同的DBDpp。在另一个实施方案中，由文库中DBDpp结合的不同靶选自：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在进一步的实施方案中，文库包含特异性结合选自以下的蛋白质靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同的DBDpp：激素，血清蛋白质，细胞表面蛋白质，治疗性蛋白质，TSA，CSA，含有肽标签的蛋白质等。在进一步的实施方案中，文库包含特异性结合本文公开的靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同的DBDpp。在另外的实施方案中，文库是载体文库或宿主细胞[包括病毒颗粒]文库。在另外的实施方案中，载体文库是宿主细胞的文库。在另一个实施方案中，宿主细胞文库包含多个在其表面上展示DBDpp的宿主细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。
在一些实施方案中，DBDpp文库包含：(a)特异性结合不同靶的3，4，5，6，7，8，9，10或超过10个DBDpp；(b)具有与同一靶特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或超过10个DBDpp；(c)具有与目的靶的相同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或超过10个DBDpp；(d)具有与靶的不同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp；或(e)具有与相同靶竞争结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp。
在另外的实施方案中，DBDpp文库含有编码DBDpp的多个不同的核酸序列，所述DBDpp包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列，其中总共5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个氨基酸残基已被修饰；并且其中DBDpp特异性地结合目的靶。在另一个实施方案中，由核酸序列编码的修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个为置换。在另一个实施方案中，修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个为保守置换。在另一个实施方案中，所编码的修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个是非保守置换。在另一个实施方案中，所编码的氨基酸残基修饰的5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个为保守置换，而编码的氨基酸残基修饰的5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个是非保守置换。在另外的实施方案中，编码的置换的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个位于SEQ ID NO:1的氨基酸残基选自M1，G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，L21，G22，G23，S24，E25，A26，E27，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，Y45，K46，G47，K48，G49，N50，P51，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69，Y70，R71，H72和N73。在进一步的实施方案中，所编码的置换的1至20，1至30或1至40个位于SEQ ID NO:1的氨基酸残基选自G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69和Y70。在另一个实施方案中，核酸任选地编码DBDpp，DBDpp进一步包含其中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的溶剂难及残基的残基的1至5，5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个被置换，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合不同靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另一个实施方案中，由文库中DBDpp结合的不同靶选自：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合选自以下的蛋白质靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白质，细胞表面蛋白质，治疗性蛋白质，TSA，CSA和含有肽标签的蛋白质。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合本文公开的靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另外的实施方案中，载体文库包含在宿主细胞(例如病毒颗粒)中。在另一个实施方案中，文库包含多个在其表面上展示DBDpp的宿主细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在一些实施方案中，DBDpp文库包含：(a)特异性结合不同靶的3，4，5，6，7，8，9，10或超过10个DBDpp；(b)具有与同一靶特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或超过10个DBDpp；(c)具有与靶的相同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或超过10个DBDpp；(d)具有与靶的不同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp；或(e)具有与相同靶竞争结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp。
还提供了编码DBDpp例如DBDpp融合蛋白的核酸。在一些实施方案中，含有核酸的宿主细胞是细菌，酵母，真菌或哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是免疫细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是人免疫细胞。在另一个实施方案中，人免疫细胞在其细胞表面上表达DBDpp。在具体的实施方案中，核酸编码DBDpp融合蛋白。在另一个实施方案中，宿主细胞在细胞表面上表达DBDpp作为融合蛋白。本文另外提供了包含多个编码DBDpp的核酸的载体文库。
在一个实施方案中，载体文库包含多个编码DBDpp的不同核酸，其中编码的DBDpp包含选自以下的氨基酸序列：(a)MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:4)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X55，X58，X59，X62，X65和X66是天然和/或非天然氨基酸残基；(b)MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO:2)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X30，X33，X34，X37，X40，X41和X44是天然和/或非天然氨基酸残基；(c)MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X4 0ELX43AYKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:3)，其中X32，X33，X36，X39，X40，X43，X57，X58，X61，X64，X65和X68是天然和/或非天然氨基酸残基，以及；(d)MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:5)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X32，X33，X36，X39，X40，X43，X55，X58，X59，X62，X65和X66是天然和/或非天然氨基酸残基；以及(e)MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:6)，其中X5,X8,X9,X12,X15,X16,X19,X30,X33,X34,X37,X40,X41,X44,X57,X58,X61,X64,X65和X68是天然和/或非天然氨基酸残基；并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，文库中的多个载体编码DBDpp融合蛋白。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合不同靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另一个实施方案中，由文库中的核酸编码的DBDpp结合的不同靶选自：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合选自以下的蛋白质靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白质，细胞表面蛋白质，治疗性蛋白质，TSA，CSA和含有肽标签的蛋白质。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合本文公开的靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另外的实施方案中，载体文库的多个载体包含在宿主细胞(例如病毒颗粒如噬菌体)，大肠杆菌，酵母和哺乳动物细胞中。在另一个实施方案中，宿主细胞在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在一些实施方案中，载体文库包含：(a)编码特异性结合不同靶的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(b)编码具有不同的特异性结合相同靶的序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(c)编码具有与靶的相同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(d)编码具有与靶的不同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(e)编码具有与相同靶竞争结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；或(f)编码相同DBDpp的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10种不同的核酸。还提供了含有载体的宿主细胞。
在一个实施方案中，载体文库包含多个编码DBDpp的核酸，DBDpp包含选自以下的氨基酸序列：(a)MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAAFEKEIAAFESELQAYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:9)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X50，X53，X54，X57，X60和X61是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；(b)MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO:7)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X28，X31，X32，X35，X38，X39和X42是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；(c)MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:8)，其中X30，X31，X34，X37，X38，X41，X52，X53，X56，X59，X60和X63是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；(d)MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:10)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X30，X31，X34，X37，X38，X41，X50，X53，X54，X57，X60和X61是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和/或Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；以及(e)MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:11)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X28，X31，X32，X35，X38，X39，X42，X52，X53，X56，X59，X60和X63是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；并且其中DBDpp特异性地结合目的靶。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，文库中的多个载体编码DBDpp融合蛋白。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合不同靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另一个实施方案中，由文库中的核酸编码的DBDpp结合的不同靶选自：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合选自以下的蛋白质靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白质，细胞表面蛋白质，治疗性蛋白质，TSA，CSA和含有肽标签的蛋白质。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合本文公开的靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另外的实施方案中，载体文库的多个载体包含在宿主细胞中。在另一个实施方案中，宿主细胞(例如病毒颗粒)在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在一些实施方案中，载体文库包含：(a)编码特异性结合不同靶的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(b)编码具有与同一靶特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(c)编码具有与靶的相同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(d)编码具有与靶的不同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(e)编码具有与相同靶竞争结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；或(f)编码相同DBDpp序列的3，4，5，6，7，8，9，10或超过10种不同的核酸序列。还提供了含有载体的宿主细胞。
在一些实施方案中，由文库中的核酸编码的4，5，10或更多个DBDpp特异性结合不同的靶。
在一个实施方案中，载体文库包含多个编码DBDpp的不同核酸序列，DBDpp包含SEQID NO:1的氨基酸序列，其中总共5至25，5至30，5至35，5至40个，5至45个，5至50个，5至55个或5至60个氨基酸残基已被修饰；并且其中DBDpp特异性地结合目的靶。在另一个实施方案中，由核酸序列编码的修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个为置换。在另一个实施方案中，修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个为保守置换。在另一个实施方案中，所编码的修饰的氨基酸残基的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45或5至50个是非保守置换。在另一个实施方案中，所编码的氨基酸残基修饰的5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个为保守置换，而编码的氨基酸残基修饰的5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个是非保守置换。在另外的实施方案中，编码的置换的5至25，5至30，5至35，5至40，5至45，5至50，5至55或5至60个位于SEQ ID NO:1的氨基酸残基选自M1，G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，L21，G22，G23，S24，E25，A26，E27，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，Y45，K46，G47，K48，G49，N50，P51，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69，Y70，R71，H72和N73。在进一步的实施方案中，所编码的置换的1至20，1至30或1至40个位于SEQ ID NO:1的氨基酸残基选自G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69和Y70。在另一个实施方案中，核酸任选地编码DBDpp，DBDpp进一步包含其中对应于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的溶剂难及残基的残基的1至5，5至15，5至20，5至25，5至30，5至35，5至40或5至45个被置换，并且其中DBDpp特异性结合目的靶。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合不同靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另一个实施方案中，由文库中DBDpp结合的不同靶选自：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合选自以下的蛋白质靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白质，细胞表面蛋白质，治疗性蛋白质，TSA，CSA和含有肽标签的蛋白质。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合本文公开的靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另外的实施方案中，载体文库包含在宿主细胞(例如病毒颗粒)中。在另一个实施方案中，文库包含多个在其表面上展示DBDpp的宿主细胞。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在一些实施方案中，载体文库包含：(a)编码特异性结合不同靶的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(b)编码具有与同一靶特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(c)编码具有与靶的相同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(d)编码具有与靶的不同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；或(e)编码具有与相同靶竞争结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；或(f)编码相同DBDpp的3，4，5，6，7，8，9，10或超过10种不同的核酸。还提供了含有载体的宿主细胞。
在一些实施方案中，载体文库包含：(a)编码特异性结合不同目的靶的3个DBDpp的核酸；(b)编码具有与相同的目的靶特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(c)编码具有与目的靶的相同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(d)编码具有与目的靶的不同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(e)编码具有与相同的目的靶竞争结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；或(f)编码相同DBDpp序列的3种不同的核酸序列。
在一个实施方案中，载体文库包含多个编码DBDpp的核酸，DBDpp包含选自以下的氨基酸：(a)MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAAFEKEIAAFESELQAYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:9)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X50，X53，X54，X57，X60和X61是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；(b)MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALRKEAAAIRDE LQAYRHN(SEQ ID NO:7)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X28，X31，X32，X35，X38，X39和X42是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；(c)MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:8)，其中X30，X31，X34，X37，X38，X41，X52，X53，X56，X59，X60和X63是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；(d)MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:10)，其中X5，X6，X9，X10，X13，X16，X17，X30，X31，X34，X37，X38，X41，X50，X53，X54，X57，X60和X61是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；以及(e)MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:11)，其中X5，X8，X9，X12，X15，X16，X19，X28，X31，X32，X35，X38，X39，X42，X52，X53，X56，X59，X60和X63是天然和/或非天然氨基酸残基，并且Z1和Z2是2至30个天然和/或非天然氨基酸残基；并且其中DBDpp特异性地结合目的靶。在另外的实施方案中，Xn是天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，Xn是半胱氨酸或脯氨酸以外的天然氨基酸残基。在另一个实施方案中，文库中的多个载体编码DBDpp融合蛋白。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合不同靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另一个实施方案中，由文库中的核酸编码的DBDpp结合的不同靶选自：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合选自以下的蛋白质靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸：免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白质，细胞表面蛋白质，治疗性蛋白质，TSA，CSA和含有肽标签的蛋白质。在另一个实施方案中，文库包含编码特异性结合本文公开的靶的至少2，3，4，5，10，25，50，75，100，250，500或1000个不同DBDpp的核酸。在另外的实施方案中，载体文库的多个载体包含在宿主细胞(包括病毒颗粒)中。在另一个实施方案中，宿主细胞(例如病毒颗粒)在其表面上展示DBDpp。在另一个实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在一些实施方案中，载体文库中编码的至少2，3，4，5或10个DBDpp特异性结合不同的靶。在一些实施方案中，DBDpp结合选自以下的目的靶：核酸，寡糖，肽，蛋白质，细胞表面抗原和小有机分子。在另一个实施方案中，目的DBDpp靶是选自免疫球蛋白，酶，激素，血清蛋白，细胞表面蛋白，治疗性蛋白，TSA，CSA和含有肽标签的蛋白质。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合本文公开的靶。还提供了含有载体文库的宿主细胞(例如病毒颗粒)文库。在一些实施方案中，文库含有多个在其表面上展示DBDpp的宿主细胞(例如病毒颗粒)。在具体的实施方案中，宿主细胞是在其表面上展示DBDpp的噬菌体。在一些实施方案中，载体文库包含：(a)编码特异性结合不同目的靶的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(b)编码具有与相同的目的靶特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(c)编码具有与目的靶的相同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(d)编码具有与目的靶的不同表位特异性结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；(e)编码具有与相同的目的靶竞争结合的不同序列的3，4，5，6，7，8，9，10或多于10个DBDpp的核酸；或(f)编码相同DBDpp序列的3，4，5，6，7，8，9，10或超过10种不同的核酸序列。
设想可以修饰DBDpp以使多肽适合于预期的特定用途，而不脱离本文提供的范围。这样的修饰可以在DBDpp的N末端或C末端包含另外的氨基酸和/或与DBDpp化学缀合或以其他方式结合DBDpp的标记或治疗剂。上面讨论的另外的氨基酸残基还可以构成具有任何所需功能的一个或多个多肽结构域，例如另一个结合功能，或者酶功能，或者金属离子螯合功能，或者荧光功能，或者其混合物。
选择、分离和鉴定DBDpp
还提供了用于从多个DBDpp(例如文库中的那些)中选择，分离和鉴定特异性结合目的靶的DBDpp的方法。在一个实施方案中，筛选DBDpp文库与结合配偶体结合的方法包括：(a)获得展示DBDpp文库的群体；(b)在适于结合的条件下使群体与目的靶接触；和(c)鉴定与靶结合的那些DBDpp。两个示例性DBDpp展示选择过程包括淘选和基于细胞的筛选选择。
在本文提供的说明性实施方案中，制备DBDpp噬菌体展示文库并筛选具有期望性质的DBDpp，所述性质包括特异性结合许多经验证的治疗和诊断靶的能力。在这些筛选中鉴定的代表性DBDpp进一步被表征和证明显示出可用于例如纯化，诊断和治疗应用的期望的性质。
展示文库
如本文所述，SEQ ID NO:1的参考支架中的置换提供了多功能分子识别平台。这样的DBDpp可以用于制备可以针对目的靶筛选的DBDpp文库的方法。这样的筛选方法可用于鉴定具有期望特性的DBDpp，例如结合目的靶的能力。用于选择靶特异性DBDpp的DBDpp群体可以是不同的形式，并且可以是但不限于蛋白质文库，核酸文库，载体文库和宿主细胞文库。
本领域已知用于制备核酸修饰的各种方法可用于制备(编码)与另一种DBDpp和/或SEQ ID NO:1的参考支架相比在一个或多个氨基酸残基处具有修饰的DBDpp。编码DBDpp的核酸可以使用本领域的标准方法获得，例如化学合成，重组方法和/或从生物来源获得。目的核酸可以置于在任何特定宿主细胞中表达所需的一种或多种元件的控制之下。各种宿主细胞可用于扩增编码DBDpp的核酸，并且可以用于在其表面上展示DBDpp的展示方法是本领域已知的并且在本文中描述的。展示方法包括但不限于噬菌体展示，细菌展示，酵母展示，核糖体展示和mRNA展示。
在一些实施方案中，(部分)随机化的DBDpp文库的产生需要在SEQ ID NO:1的参考支架序列内的特定位置的(部分)随机化。在另外的实施方案中，可以根据本文公开的方法使用和修饰其他参考序列。在一个实施方案中，用于本文提供的方法中的DBDpp文库是通过重组DNA技术产生的。具体而言，各自在特定氨基酸位置上的序列不同的编码DBDpp的核酸序列的文库，可以通过对模板序列进行定点或随机诱变来获得。可以使用本领域已知的技术，例如在编码氨基酸序列的核苷酸序列中的相应位置上选择(引入)“NNK”或“NNS”密码子，在氨基酸序列的特定位置引入随机氨基酸残基。产生此类文库的方法在本领域中是已知的，商业服务可用于生成这样的文库。确定目的位置中相关氨基酸残基的核苷酸以不同方式突变，以获得编码不同DBDpp的序列文库。
任选地通过DBD的特定溶剂暴露的氨基酸序列位置的选择性或随机突变产生文库。
在一些实施方案中，本文提供的DBDpp文库中置换的氨基酸残基位置的数字范围为5至20个氨基酸残基位置。因此，本文提供的DBDpp文库中定义的一组置换的氨基酸残基位置包含5至20个限定的置换的氨基酸残基位置，例如5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，或20个定义置换的氨基酸残基位置。在若干实施方案中，置换的氨基酸残基是天然或非天然氨基酸。在若干实施方案中，可以使用20种天然氨基酸中的任何一种。然而，在一些实施方案中，置换不导致用半胱氨酸和/或脯氨酸置换任何氨基酸。
DBDpp库可以包含任何合适数量的不同DBDpp序列。在一些实施方案中，DBDpp文库包含至少2，至少5，至少10，至少50，至少100，至少1000，至少10,000，至少105，至少106，至少107，至少108，至少109个或更多个不同的DBDpp序列(例如DBDpp融合蛋白)。
当提及不同的DBDpp序列的文库时，“置换的氨基酸残基位置”的概念是指当至少两个氨基酸残基来自DBDpp文库的不同DBDpp的酸序列彼此进行比较时，至少两个不同的氨基酸残基类型所位于的氨基酸残基位置。
在一个实施方案中，本公开包括产生在定义的5至20个置换的氨基酸残基位置中的至少一个上彼此不同的DBDpp的文库(即，集合(collection)或多个(plurality))的方法。因此，DBDpp文库内的序列在选定，限定的或随机的组中包含的任何一个或多个特定的氨基酸位置彼此不同。因此，术语“不同的序列”或“不同的DBDpp序列”是指文库中两个或更多个DBDpp之间的限定的一组氨基酸残基位置上出现序列变异或序列差异。
展示载体
分子的群体或文库展示在提供表型与基因型的偶联的典型展示载体(例如噬菌体，大肠杆菌，核糖体)上。
在一些实施方案中，文库的DBDpp被展示在噬菌体颗粒，核糖体，细菌，酵母细胞，哺乳动物细胞或任何其它合适的(微)生物的表面上，以促进筛选或选择以分离所需DBDpp序列，DBDpp序列对目的靶具有可检测的结合亲和力或可检测的体外活性。该技术的主要优点是基因型(即，包封的编码展示蛋白的DNA)和表型(即，展示的蛋白质，如本文所提供的DBDpp)的偶联，其允许从具有数以百万计的万亿多肽变体的文库以相对简单的体外测定进行基于亲和力的选择。
用于展示和选择或筛选编码这样的置换DBDpp序列置换DBDpp序列或核苷酸序列的文库并且其适用于具有期望特征的DBDpp的合适的方法、技术和宿主生物体是本领域技术人员众所周知的。这样的方法例如描述于Georgiou，Nat.Biotechnol.15:29-34(1997)；Wittrup，Curr.Opin.Biotechnol.12:395-399(2001)；Lipovsek and Pluckthun，JImmunol Methods 290:51-67(2004)；Reiersen，Nucl Acids Res，33:e10，2005；Levin，MolBioSyst，2:49-57(2006)；Bratkovic，Cell.Mol.Life.Sci.67:749-767(2010)中。例如，噬菌体文库展示的技术，和通过噬菌体展示技术来选择可以被选择作为特定蛋白质的结合物的高通量鉴定的方法，因为它是现有最稳健和多功能选择技术中的一种(Scott，Science249:386-390(1990)；Bratkovic，Cell.Mol.Life Sci.67:749-767(2010))。
另外，可以使用展示技术来改变，例如改善DBDpp的结合性质。参见，例如，Scott，Science 249:386(1990)；Devlin，Science 249:404(1990)；美国专利号5,223,409,5,733,731,5,498,530,5,432,018,5,338,665和5,922,545；WO 96/40987和WO 98/15833，其各自的内容通过引用整体并入本文。在肽噬菌体展示文库中，天然和/或非天然存在的肽序列可通过与丝状噬菌体的外壳蛋白融合而展示。如果需要的话，展示的肽可以针对目的靶亲和洗脱。保留的噬菌体可以通过连续多轮亲和纯化和再扩增来富集。可以对最佳结合的DBDpp进行测序以鉴定关键残基，并且可以创建和筛选诱变文库以进一步优化最佳结合物的序列。Lowman，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26:401-24(1997)。
噬菌体展示
典型的噬菌体展示操作方案涉及使用丝状噬菌体(噬菌粒)表面表达系统，在细菌宿主中生产噬菌体颗粒，每个颗粒展示基因文库的一个成员的基因产物作为与其一种类型的外壳蛋白质(gIII或gVIII蛋白)的融合。噬菌体颗粒文库通过选择过程被获取以结合至涉及噬菌体文库与靶的结合的固定化靶分子(“生物淘选”)，洗涤步骤以去除未结合的噬菌体DBDpp并洗脱结合颗粒。通常需要几轮淘选来选择具有所需特征的分子，包括将细菌宿主中洗脱的噬菌体再扩增并在固定的靶上进行选择。
例如，使用噬菌粒展示(Kay et al.，Phage Display of Peptides andProteins.A Laboratory Manual，B.K.Kay et al.1996)，给定的DBDpp文库可以由噬菌体集合表示，每个噬菌体编码包含与小外壳蛋白pIII融合的DBDpp文库成员的融合蛋白。这些噬菌粒可以通过电穿孔或其他手段导入合适的大肠杆菌细胞(例如TG1)。使用辅助噬菌体感染，产生展示DBDpp-融合蛋白的噬菌体(还包装噬菌粒基因组)。这些噬菌体可用于选择针对给定靶的结合物，并且可通过感染大肠杆菌TG1(Stratagene)来扩增所选噬菌体。
因此，在具体的实施方案中，DBDpp文库作为噬菌体文库提供，通过使噬菌体与目的标记靶接触来鉴定结合DBDpp，然后通过检测或选择性收集标记的结合靶来回收结合噬菌体。在一个实施方案中，使用生物素化的靶，由此产生与靶特异性结合的DBDpp的噬菌体用链霉抗生物素蛋白包被的支持物(例如磁珠)捕获。在一些实施方案中，用于产生对目的靶具有可检测的结合亲和力的一种或多种DBDpp的方法的选择步骤可以包括通过迭代进行将目的靶与本发明的DBDpp文库或与DBDpp文库的混合物(包括多个DBDpp)接触的步骤以及随后从用蛋白质接触的DBDpp文库或DBDpp文库的混合物中鉴定一个或多个对目的靶具有可检测的结合亲和力的DBDpp，来(进一步)富集DBDpp文库或DBDpp文库的混合物的对目的靶具有可检测的结合亲和力的DBDpp。选择具有通过与目的靶相互作用的可检测的体外活性的DBDpp的步骤可以包括：(a)使本发明的DBDpp文库或DBDpp文库的混合物与目的细胞因子或生长因子或细胞因子或生长因子的受体接触，和(b)从DBDpp文库或DBDpp文库的混合物中鉴定出一个或多个对目的靶具有可检测的体外活性的DBDpp。
在本文实施例中公开的说明性实施方案中，使用噬菌体展示方法展示和筛选DBDpp特异性结合目的靶的能力
在此证明，可以在噬菌体表面展示和选择DBD结构域。制备基于SEQ ID NO:1的支架并在本文实施方案中描述的DBDpp的不同文库，并进行噬菌体展示方法，以证实可以产生特异性结合包括CD137，CD47，CTLA4，DR5，KIR，PD-L1，PD1和TIM3的不同目的靶的DBDpp。
细胞展示
在一些实施方案中，文库筛选技术包括细胞表面展示系统。细胞表面展示系统可以包括原核细胞，如革兰氏阳性细胞，或真核细胞，如酵母细胞。许多细胞表面展示系统在本领域中是已知的并且可以常规地改编用于筛选DBDpp文库。例如，在Francisco et al.，PNAS90:10444-10448(1993)和Lee et al.，Trends Biotechnol 21:45-52(2003)中描述了原核系统。真核系统描述于例如Boder et al.，Nat.Biotechnol.15:553-557(1997)和Gaiet al.，Curr.Opin.Struct.Biol.17:467-473(2007)。“大肠杆菌展示”方法如肽聚糖相关的脂蛋白(PAL)融合也包括在本文中。例如，DBDpp肽可以与lac阻遏物的羧基末端融合并在大肠杆菌中表达。
本领域已知的细菌展示和酵母展示技术允许分别与α-凝集素酵母粘附受体或细菌外膜蛋白(OMP)融合在酵母细胞酿酒酵母(Boder，Nat.Biotechnol.15:553-557(1997))或细菌(大肠杆菌，肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus))(Daugherty.，1998，Wernerus，Appl.Environ.Microbiol.69(9):5328-5335(2003))表面上表达重组蛋白。。
在一些实施方案中，表达的融合蛋白还含有允许通过流式细胞术定量文库表面表达的肽标签。结合配体的间接荧光标记，抗标签标记允许通过FACS(荧光激活的细胞分选)进行细胞分选并确定相互作用的结合亲和力(Feldhaus et al.，Nat.Biotechnol.21:163-70(2003)；Wernerus et al.Appl.Environ.Microbiol.69(9):5328-35(2003))。
体外展示
还可以使用体外(也称为无细胞(cell-free或acellular))展示方法来选择，分离和鉴定结合目的靶的DBDpp。在一个实例中，随机RNA的翻译在核糖体释放之前停止，导致具有其缔合RNA的多肽文库仍附接。这种方法和相关方法统称为“核糖体展示”。其他已知方法使用肽与RNA的化学连接。参见例如Roberts et al.，PNAS94:12297-303(1997)。这种方法和相关的方法统称为“RNA-肽筛选，RNA展示和mRNA展示”。或者，体外展示方法可以使用DNA作为与表达的多肽偶联的遗传组分。称为顺式展示的方法提供了来自蛋白质-DNA复合物文库的肽的体外选择，并且描述于US7842476B2中，其内容通过引用整体并入本文。已经开发了化学衍生的肽文库，其中肽被固定在稳定的非生物材料如聚乙烯棒或溶剂可渗透的树脂上。另一种化学衍生的肽文库使用光刻法来扫描固定在载玻片上的肽。这些方法和相关方法统称为“化学肽筛选”。化学肽筛选可能是有利的，因为它允许使用D-氨基酸和其他非天然类似物以及非肽元件。生物方法和化学方法二者都在Wells，Curr.Opin.Biotechnol.3:355-362(1992)进行了综述。
选择DBDpp
生物淘选是一种已知的迭代选择和筛选方法，用于富集与选择的靶具有亲和力的分子的不同分子(例如DBDpp文库)的初始群体。允许结合与靶有亲和力的库成员。从支持物上洗去非特异性或弱结合的成员。然后从支持物上回收结合的文库成员(例如通过洗脱)。收集回收的文库成员用于进一步分析(例如筛选)或合并回收的文库成员用于另外一轮选择。
在一个实施方案中，在与噬菌体文库孵育后，将靶捕获在固体支持物上。靶的固定可以通过本领域已知的许多不同的方法进行。固体支持物的实例是微量滴定板或管(例如Maxisorp板，Maxisorp管，Nunc)或磁珠(Invitrogen)。靶可以直接包被在塑料或珠(表面激活的Dynabeads，例如Dynabeads M270Epoxy，Invitrogen)上或当靶被生物素化时通过链霉抗生物素蛋白进行包被(例如Dynabeads MyOne Streptavidin T1，Invitrogen)。
另外，靶可以通过中间亲和分子例如针对靶或靶相关肽标签的抗体或蛋白A非共价地结合到珠上。也可以使用肽标签如His-标签或任选地针对靶的抗体来捕获支持物上的靶。这些替代肽标签也与Dynabeads(Dynabeads His标签分离与拉下，Invitrogen)和蛋白A或蛋白G偶联Dynabeads(Dynabeads-Protein A/G，Invitrogen)相容。为了将靶固定在磁珠上，针对每种特定的珠类型遵循制造商的建议。
然后捕获步骤可以由将靶捕获到包被的磁珠，从而间接捕获结合到靶的噬菌体组成。靶噬菌体相互作用是在溶液中进行的。为了能够洗去非结合的噬菌体，需要将靶固定在固体支持物上。靶在可溶性生物淘选方法中的固定化与直接生物淘选操作方案中的固定化可能性相同。
传统的生物淘选操作方案由2，3到5个或更多轮选择组成，取决于靶和文库的类型。每轮选择由通常不同的步骤组成：(1)将选择的靶固定在支持物上。该步骤是可选的，因为生物淘选也可以以靶未被固定但保持在溶液中(在可溶性靶的情况下)或保持锚定在细胞上(例如膜锚定靶如受体的情况下)的形式进行，(2)将文库与靶孵育，(3)洗涤步骤以除去非特异性结合物，(4)任选地洗脱结合物和(5)扩增来自步骤(4)或步骤(3)(在步骤(4)在连续筛选轮次中被省略的情况下)的洗脱结合物。步骤1至5将重复两次，三次，四次或更多次以从初始文库特异性结合物分离。生物淘选后，通常在ELISA测定或类似测定中分析从不同轮选择中分离的结合物的靶特异性。
在一个实施方案中，筛选特异性结合目的靶的DBDpp的方法包括以下步骤：(a)使目的靶与多个DBDpp接触；和(b)鉴定特异性结合目的靶的DBDpp。使目的靶与多个DBDpp接触的步骤可以本领域已知的任何方式进行。例如，在一个实施方案中，将目的靶固定在固体支持物上并使含有多个DBDpp分子的溶液与固定的目的靶接触。这样的过程类似于亲和色谱过程，其中亲和基质包含固定的目的靶。然后可以使用本领域已知的技术(例如亲和选择)纯化对目的靶具有选择性亲和力的DBDpp。固体支持物的组成，将目的靶附着到固体支持物上的过程以及筛选和分离对目的靶具有选择性亲和力的DBDpp的试剂，条件和方法在很大程度上是常规的并且是本领域技术人员已知的。在某些情况下，在尝试确定或检测选择性亲和相互作用的存在之前，可能需要从目的靶和/或与目的靶结合的一个或多个DBDpp的混合物中洗去任何未结合的DBDpp。当目的靶结合到固体支持物上时，这种洗涤步骤可能是特别期望的。
将会理解，本文所述的方法的选择步骤可以通过通常称为选择方法的方法或通过通常称为筛选方法的方法来进行。这两种方法都设想从包括期望组分和非期望组分(例如，DBDpp文库)的原始组合中鉴定和随后分离(例如，选择步骤)所需组分(例如，DBDpp文库成员)。在选择方法的情况下，文库成员通常由一个步骤来进行分离，其中期望的特性被应用以获得期望的靶；在这样的情况下，期望的性质通常被限制于对于给定的目的靶的高亲和力性质。这样的方法通常被称为亲和选择方法，并且为了选择对目的靶具有高亲和力的DBDpp，将这样的亲和选择方法应用于DBDpp文库。在另外的实施方案中，通过调整适当的选择条件(例如短暂孵育时间或长的洗涤周期，或文库选择技术领域的技术人员已知的其它条件)筛选文库中具有期望的动力学特性的DBDpp，动力学特性诸如与给定的目的靶结合的高结合速率，或者结合至所述靶的文库成员的低解离速率。或者，在筛选方法的情况下，文库成员通常将通过其中所有文库成员或至少大量文库成员单独针对给定期望性质进行检查的步骤进行分离，并且其中具有这样保留期望性质的成员，而不具有期望性质的成员被丢弃；在这样的情况下，并且在本文提供的上下文中，期望性质可以涉及对目的靶的高亲和力，或者功能性活性，例如目的靶的活性的抑制，降低和/或阻止。因此，认为这些方法的选择步骤可以通过(亲和)选择技术或通过基于亲和力的或基于活性的功能筛选技术来完成，这两种技术均导致选择一种或多种DBDpp，其相比于该DBDpp的非选择的DBDpp具有有益效果(有利的，期望的，优异的)亲和力或活性性质。
筛选DBDpp
选择之后，可以单独分离和筛选文库的鉴定成员。
筛选与选择的不同之处在于筛选的特征在于分别(或在库(pool)中)对文库成员进行分析，而选择的特征在于对处理期间与其他成员分开的文库成员(例如保留，洗脱或洗掉)进行分析。在一个实施方案中，直接筛选文库成员的集合，而不经过选择步骤。例如，这种方法可以在亲和成熟操作方案中使用，这些操作方案是已知的并且可以常规应用。
可使用或常规修改本文所述或本领域中其他方式已知的测定和其他方法学来确定DBDpp特异性结合目的靶的能力。例如，可以如下文实施例中所述的测定，或者可以使用体外或体内结合测定，例如蛋白质印迹，放射免疫测定，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“三明治”免疫测定，免疫沉淀测定，荧光免疫测定，蛋白A免疫测定，免疫组织化学(IHC)和BIAcore分析来测定DBDpp-靶相互作用。类似地，可使用或常规修改本文所述或本领域中其他方式已知的测定和其他方法学来确定DBDpp特异性结合目的靶和改变靶生物学活性的能力。评估DBDpp在功能上影响其靶的能力的测定(例如，测量信号传导，增殖，迁移等的测定)也可以用于间接评估DBDpp-靶相互作用。此外，DBDpp可以基于它们在测量特定途径或活性的测定中的效果来鉴定。例如，测量信号传导途径(例如磷酸化研究或多聚化)，离子通道通量，细胞内cAMP水平，细胞活性如迁移，粘附，增殖或凋亡以及病毒进入，复制，出芽或整合的测定可以是用于鉴定，表征和改进DBDpp的期望属性。可以使用本领域已知的技术包括ELISA和BIAcore分析来确定DBDpp竞争性抑制另一种含有DBDpp的序列的能力。
鉴定DBDpp
当包含在DBDpp文库中的DBDpp候选物展示在合适的细胞或噬菌体或颗粒上时，可以分离并常规测定核酸编码序列。从所述细胞或噬菌体或颗粒中分离出编码该DBDpp序列的核苷酸序列是可能的。这样，所选择的DBDpp文库成员的核苷酸序列可以通过常规测序方法来测定。
特异性针对靶的DBDpp文库成员可以通过核酸测序来表征。序列信息用于对成员进行分类并去除冗余成员(即编码同一DBDpp的成员)。根据若干实施方案的DBDpp文库和文库成员(包括其中添加有表位标签的一些成员)包括但不限于下表1中所鉴定的那些。另外包括的是那些对应于SEQ ID NO:2，3，4，5，6，7，8，9，10或11中的一个或多个，其中Xn位置中的一个或多个被天然或非天然氨基酸置换。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:2，3，4，5，6，7，8，9，10或11中任一个的DBDpp不包括被置换到Xn位置中的半胱氨酸和/或脯氨酸残基。
表1——DBDpp文库和文库成员的非限制性实例
在一些实施方案中，本发明包含表1中鉴定的一个或多个序列。在其他实施方案中，本发明包含与表1中鉴定的那些序列具有60-70％，70-75％，75-80％，80-85％，85-90％，95-99％的同源性(和其中的重叠范围)的一个或多个序列。在若干实施方案中，与表1中鉴定的各个序列相比，具有这样的同源性的序列在功能上相似或相同。在若干实施方案中，本发明包含与表1中的一个或多个序列(全部或部分)竞争其各自靶的一种或多种多肽。在若干实施方案中，竞争可以通过标准竞争测定来评估。在一些实施方案中，竞争不要求竞争性多肽与表1的那些多肽竞争相同的特异性靶，而是它们可以通过结合空间抑制性表位，重叠表位等来竞争。
DBDpp的亲和力成熟
亲和力成熟策略可用于产生可用于本文的DBDpp融合蛋白的高亲和力DBDpp。
可以产生诱变文库并进行筛选以进一步优化最佳结合物的序列。Lowman,Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.26:401-24(1997)。
还可以基于已知的DBDpp序列制备特异性结合期望的靶的改进的DBDpp。例如，可以将至少一个，两个，三个，四个，五个或更多个氨基酸突变(例如保守性或非保守置换)，缺失或插入引入到已知的DBDpp序列中，并且可以筛选所得的DBDpp与期望的靶结合和生物学活性，例如拮抗靶生物学活性或激动靶生物学活性的能力。
制品
本文提供了包括试剂盒的制品。制品可以包括容器以及在容器上或与容器关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子，小瓶或注射器。容器可以由各种材料例如玻璃或塑料形成。容器容纳本公开的一种或多种DBDpp，编码DBDpp的核酸和/或载体或宿主细胞。标签或包装插页可以包括用于进行基于亲和力的筛选，检测和/或纯化的用法说明书。
还提供了含有DBDpp的试剂盒。这样的试剂盒具有包括但不限于检测或分离DBDpp特异性结合的目的靶的用途。这样的测定试剂盒可用于筛选目的靶的存在和/或定量流体(例如生物流体(例如血液，血清或滑液))中目的靶的浓度。
在一个实施方案中，考虑DBDpp测定试剂盒，其包含一个或多个特异性结合目的靶的DBDpp容器，以及任选的用于确定是否存在靶/DBDpp相互作用或不存在靶/DBDpp相互作用的检测手段。该试剂盒进一步任选地包含可以用作例如对照或标准的目的靶蛋白。DBDpp可以是游离的或在宿主细胞的表面或噬菌体的表面上表达。在具体的实施方案中，试剂盒中提供的DBDpp或目的靶是标记的。可以使用本领域已知的任何标记。在一些实施方案中，标记选自生物素，荧光发光团，酶，表位，色原体或放射性核素。在一些实施方案中，DBDpp被固定在固体支持物上。用于检测标记的检测手段取决于标记的性质，并且可以是本领域已知的任何检测手段，例如检测放射性核素的膜；产生或放大可检测信号以检测目的靶的存在的酶底物。
优选地，试剂盒进一步包含用于DBDpp的固体支持物，其可以作为单独的元件提供，或者其上固定了特异性结合目的靶的DBDpp。因此，试剂盒中特异性结合目的靶的DBDpp可以固定在固体支持物上，或者它们可以固定包含在试剂盒中的或与试剂盒分开提供的支持物上。优选地，将DBDpp包被在微量滴定板上。在一些实施方案中，检测涉及信号放大分子。当信号放大分子是酶时，试剂盒任选地进一步包括酶所需的底物和辅因子，并且其中放大分子是荧光团。试剂盒任选地进一步包括提供可检测发色团的染料前体。
试剂盒还可以包含进行测定的说明书以及其他添加剂如稳定剂，洗涤和孵育缓冲液等。试剂盒的组分将以预定的比例提供，各种试剂的相对量适当地变化以提供试剂溶液中的浓度，其基本上最大化测定的灵敏度和/或纯化目的靶的能力。特别地，试剂可以作为干粉提供，通常是冻干的，包括赋形剂，其在溶解时将提供具有适合于与待测样品结合的浓度的试剂溶液。
可以使用的用于结合测定的各种形式和技术是本领域已知的，并且包括但不限于固定到过滤器如尼龙或硝酸纤维素；二维阵列，酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，竞争性结合测定，直接和间接夹心测定，免疫沉淀测定，荧光微量测定技术(FMATTM)，LuminexTM系统测定，荧光共振能量转移(FRET)，生物发光共振能量转移(BRET)，电免疫测定，AlphaScreenTM，纳米颗粒衍生技术和表面等离子体共振(SPR)。
结合测定可以是均相的或半均相的。均相测定是将所有组分混合在一起，孵育，然后分析的测定。半均相测定是其中大部分反应以复杂混合物形式发生的测定，但是在加入最终试剂和分析之前需要洗涤步骤，与典型的逐步组装夹心测定相反，其中加入每个组分然后在下一个组分加入之前洗掉。在一些实施方案中，该测定是免疫测定。在某些实施方案中，该测定是半均相酶免疫测定(EIA)，
应用
无论是单独，作为融合蛋白，作为化学缀合物还是作为本文所述的其它实施方案，DBDpp都具有各种应用。在一些实施方案中，DBDpp被用作检测试剂，捕获试剂，分离试剂，诊断试剂或分析试剂。一些实施方案具有体内，体外和/或离体应用。在体外使用DBDpp的方法可以以不同的形式进行，如在微量滴定板中，在蛋白质阵列中，在生物传感器表面上，在组织切片上和以本领域技术人员显而易见的其他形式。同样，在体内使用DBDpp的方法可以以不同的形式使用，包括但不限于DBDpp-Fc融合蛋白，CAR细胞和DBDpp多特异性抗体。在具体的实施方案中，DBDpp如DBDpp融合蛋白被用作治疗剂。
分析和诊断应用
无论是单独，作为融合蛋白，作为化学缀合物还是作为本文所述的其他实施方案，DBDpp都具有各种应用。在一些实施方案中，DBDpp被用作各种不同样品类型中目的靶的检测试剂。
在一个实施方案中，使用DBDpp来检测涉及制造过程例如蛋白质表达和纯化的溶液中目的靶。样品可以包括但不限于水，缓冲液，同进程纯化样品，原料药物质和最终药物产品。在另外的实施方案中，DBDpp可以用于检测和/或去除样品中的杂质或污染物，例如制造中使用的供水源或水(或其它流体)。
在另一个实施方案中，DBDpp用于检测诊断样品中目的靶。样品可包括但不限于组织匀浆，细胞提取物，活检样品，血清，血浆，淋巴液，血液，血液级分，尿液，滑液，脊髓液，唾液，粘液，痰，胸膜液，乳头吸出物，呼吸道，肠道和泌尿生殖道液体，泪液，母乳，来自淋巴系统的液体，精液，脑脊髓液，器官内系统液，腹水，肿瘤囊肿液，羊水，以及培养细胞的培养基或裂解液。
在一个实施方案中，DBDpp可用于检测生物样品中因子或多种因子(例如，抗原或生物体)的存在。这里使用的术语“检测”包括定量或定性检测。在某些实施方案中，生物样品包含细胞，组织或流体。在某些实施方案中，此类组织包括正常和/或癌性组织。
本领域已知用于检测的各种形式和技术，并且包括但不限于蛋白质印迹分析，免疫组织化学，ELISA，FACS分析，酶促测定，放射自显影和本文提到的任何结合测定。
在一个实施方案中，提供了用于检测含有靶的溶液中目的靶的方法，包括：(a)使溶液与特异性结合靶的DBDpp在适于DBDpp特异性结合靶的条件下接触，和(b)检测DBDpp和靶的结合。DBDpp可以是游离的或固定的。允许足够的时间允许目的靶和DBDpp之间的结合，并且溶液或混合物中的非结合组分被去除或洗掉。然后可以例如通过检测来自作为结合复合物的一个组分的DBDpp上的标记的信号来检测DBDpp与目的靶之间的结合复合物的形成。标记可以是产生可以通过标准方法检测的信号的任何标记，例如荧光标记，放射性化合物或与底物反应产生可检测信号的酶。用于此目的的合适标记的实例在本文中描述和/或本领域中以其他方式已知。
通过使用放射性同位素，亲和标记(例如生物素，抗生物素蛋白等)，酶标记(例如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶等)，使用本领域已知的如WO 00/70023和(Harlow and Lane(1989)Antibodies，Cold Spring Harbor Laboratory，pp.1-726)中描述的方法可检测地标记结合目的靶的DBDpp。
可检测标志物或标记可以是能够直接或间接产生可测量的信号(例如放射性，显色，发光或荧光信号)的任何物质，其可用于定量结合样品中的可检测部分或标记的量。本领域已知的可检测标记包括放射性同位素，例如3H，14C，32P，35S或125I，电化学发光标记(例如与底物结合的基于钌(Ru)的催化剂等)，发光或生物发光标记(例如，铕，钒)，荧光或化学发光化合物如异硫氰酸荧光素，罗丹明或萤光素，酶(例如酶，如碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶)，比色标记如胶体金，有色玻璃或塑料珠(例如聚苯乙烯，聚丙烯，胶乳等)，顺磁性原子或磁性剂，电子致密试剂，含有荧光染料的纳米珠或微珠，纳米晶体，量子点，量子珠，纳米标签，具有荧光标记的树状聚体，微发射器，电子供体分子或分子结构，或光反射颗粒，微颗粒可以是纳米晶体或量子点。纳米晶体是吸收光子，然后以不同波长重新发射光子的物质(荧光团)。另外，另外的荧光标记或二抗可以与纳米晶体缀合。纳米晶体可以从例如Invitrogen和Evident Technologies(Troy，N.Y.)的来源商购获得。其他标签包括E)-5-[2-(甲氧基羰基)乙烯基]胞苷，其是经紫外线(UV)照射产生显示强烈的荧光信号的产物3β-D-呋喃核糖基-2,7-二氧代吡啶并[2,3-d]嘧啶的荧光分子。
竞争性抑制可以通过本领域已知的任何方法确定，例如竞争ELISA测定。据称，如果DBDpp如DBDpp融合蛋白(例如，DBDpp-Fc，DBDpp-CAR，DBDpp-scFv)或其他分子与表位的结合在某种程度上阻断其参考分子与该表位的结合，则其与“竞争性抑制”参考分子与给定表位的结合。能够据称，如本文所用，DBDpp(例如DBDpp融合蛋白)或其他分子竞争性地抑制参考分子与给定表位的结合，例如至少90％，至少80％，至少70％，至少60％，至少50％，至少40％，至少30％或至少20％。术语“竞争”，“竞争能力”和“与……竞争”是相对术语，用于描述DBDpp，例如DBDpp融合蛋白(例如，DBDpp-Fc，DBDpp CAR，DBDpp-scFv和包含DBDpp的抗体)对参考分子与靶的结合产生至少20％，至少30％，至少40％或至少50％抑制，如在本文所述的标准竞争测定中测定的，或者如在本领域已知的其它测定中测定的，包括但不限于使用以下技术的竞争测定系统：放射免疫测定(RIA)，酶免疫测定(EIA)，优选酶联免疫吸附测定(ELISA)，“夹心”免疫测定，免疫放射测定，荧光免疫测定，发光，电化学发光和免疫电泳测定。用于确定候选结合分子的结合和亲和力的方法是本领域已知的，并且包括但不限于亲和色谱，尺寸排阻色谱，平衡透析，荧光探针置换和等离子体共振。
亲和纯化
在基于亲和色谱的纯化中，靶蛋白根据其特异性且可逆地结合于通常共价偶联至色谱基质的配体的能力而被选择性分离。在一个实施方案中，DBDpp可用作来自重组来源或天然来源如生物样品(例如血清)的目的靶的亲和纯化的试剂。
在另一个实施方案中，提供了一种用于从目的靶的溶液中分离目的靶的方法。这样的方法包括：(a)使溶液在允许DBDpp结合目的靶的条件下与DBDpp接触；和(b)回收目的靶。在另一个实施方案中，提供了用于从含有目的靶的溶液中分离目的靶的方法，其包括：(a)使溶液与DBDpp在适于DBDpp与靶的特异性结合的条件下接触；和(b)将由目的靶和/或DBDpp形成的复合物与溶液的其他组分分开。在另一个实施方案中，该方法还包括以下步骤：(c)从目的靶解离DBDpp，和(d)回收解离的目的靶。
在一些实施方案中，特异性结合目的靶的DBDpp固定在珠上，然后用于亲和纯化靶蛋白。
将蛋白质共价偶联到表面的方法是本领域技术人员已知的，并且可用于将DBDpp附着到固体表面的肽标签是本领域技术人员已知的。此外，可以使用本领域已知的任何试剂或技术将DBDpp连接(即，偶联，连接或粘附)到固体表面。在一些实施方案中，固体支持物选自珠，玻璃，载玻片，芯片和明胶。因此，可以使用一系列DBDpp来使用本领域已知的技术在固体表面上制作阵列。例如，美国公布号2004/0009530公开了用于制备阵列的方法。美国公布号2004/0009530的内容在此通过引用将其全部内容并入本文。
在另一个实施方案中，DBDpp用于通过亲和色谱分离目的靶。可以使用任何常规的色谱法。在一些实施方案中，DBDpp固定在固体支持物上。可以使用本文描述的技术和试剂或本领域中已知的其他技术和试剂将DBDpp固定在固体支持物上。本文描述了合适的固体支持物或本领域已知的其他固体支持物，并且在具体的实施方案中适用于填充色谱柱。然后可以在有利于在DBDpp和目的靶之间形成复合物的条件下使固定的DBDpp上样或与溶液接触。非结合材料可以被洗掉。本领域技术人员可以容易地确定合适的洗涤条件。合适的洗涤条件的实例包括但不限于PBS/0.01％吐温20，pH7.2和1M NaCl/10mM Tris，pH7.5。Tris洗涤缓冲液可能是优选的，因为磷酸盐可以在50％乙二醇中沉淀。通常，非限制性术语洗涤缓冲液是pH7.0，任选含有0.0-1.5M NaCl，更优选1M NaCl。另外，洗涤缓冲液可以任选地含有温和的洗涤剂，例如吐温20，吐温80或NP-80。目的靶可以通过引入有利于结合复合物解离的溶液条件从DBDpp结合复合物洗脱。本领域技术人员可以容易地确定合适的洗脱溶液，包括但不限于50％乙二醇/10mM NaOAc。作为非限制性实例，有用的洗脱缓冲液含有40-60％乙二醇，优选50％乙二醇；和pH为4-7，更优选pH 4-6，最优选pH 4.5-5.5的50-100mMNaOAc。优选地，使用快速流动亲和色谱技术来将DBDpp结合到目的靶，并且洗脱纯化的目的靶。
或者，可以通过混合含有目的靶和DBDpp的溶液，然后分离目的靶和DBDpp的复合物来进行色谱分析。对于这种类型的分离，许多方法是已知的，可以常规应用。例如，DBDpp可以固定在固体支持物如珠上，然后通过过滤与溶液一起从溶液中分离出来。在另一个实例中，DBDpp可以是含有肽标签(例如聚-HIS尾或链霉抗生物素蛋白结合区)的融合蛋白，肽标签可以用于在亲和素形成复合物之后使用固定化金属亲和色谱树脂或者包被抗生物素蛋白的基材分离DBDpp。一旦分离，目的靶可以在洗脱条件下从DBDpp中释放，并以纯化形式回收。
疗法
本文的DBD可用于各种应用，包括但不限于治疗性治疗方法，其可以是体外，离体或体内方法。
作为治疗实体的应用是DBDpp的靶结合特异性的属性。在各种分子组合物(例如，DBD-抗体融合物，DBD-药物缀合物和DBD-嵌合受体)中并入DBDpp提供了各种治疗适应症和方式的应用，包括但不限于可溶性和细胞-相关组合物。
在一个实施方案中，DBDpp是可溶性融合蛋白(示意性显示在图5C中，由任选的表位标签10和靶向结构域20组成)，其与靶结合，靶与代谢，心血管，肌肉骨骼，神经系统或骨骼系统的疾病或障碍相关。在其他实施方案中，DBDpp是可溶性融合蛋白，其与靶结合，靶与酵母，真菌，病毒或细菌感染或疾病相关。在一些实施方案中，DBDpp是可溶性融合蛋白，其与靶结合，靶与免疫系统疾病或障碍相关。
还提供了用于实践本文所述治疗方法的治疗组合物。在一个实施方案中，本文提供的治疗组合物含有生理上可耐受的载体以及作为活性成分溶解或分散于其中的如本文所述的至少一种DBDpp融合物质。在另一个实施方案中，本文提供的治疗组合物含有生理上可耐受的载体以及作为活性成分溶解或分散于其中的如本文所述的至少一种DBDpp物质。在优选的实施方案中，当用于治疗目的施用于人患者时，治疗性组合物不具有免疫原性。
含有溶解或分散于其中的活性成分的药物组合物的制备在本领域中是很好理解的。典型地，这样的组合物被制备成无菌注射剂，作为液体溶液或悬浮液，水性的或非水性的。然而，也可以制备适合用于在液体中溶液或悬浮液的使用前为固体形式。该制剂也可以被乳化。因此，含有DBDpp的组合物可以采取溶液，悬浮液，片剂，胶囊，缓释制剂或粉末或其他组合物形式。在一些实施方案中，配制DBDpp组合物(例如DBDpp融合蛋白)以确保或优化体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高亲水性化合物，如果需要，制备组合物以增加跨BBB的转移，例如配制于脂质体中。对于制造脂质体的方法，参见，例如，美国专利4,522,811，5,374,548和5,399,331。脂质体可以包含选择性转运到特定细胞或器官中的一个或多个部分，从而增强靶向药物递送(参见例如Ranade，Clin.Pharmacol.29：685(1989))。
DBDpp(例如DBDpp融合蛋白)可以与其它活性成分和/或赋形剂混合，其为药学上可接受的且与活性成分相容且以适合用于本文的治疗方法的量。合适的赋形剂是例如水，盐水，右旋糖，甘油，乙醇等及其组合。另外，如果需要，组合物可以含有少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂等，它们可以增强活性成分的有效性。
治疗性DBDpp可以包括其中组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸如乙酸，酒石酸，苦杏仁酸等形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基形成)。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱如钠，钾，铵，钙或铁的氢氧化物，以及有机碱如异丙胺，三甲胺，2-乙氨基乙醇，组氨酸，普鲁卡因等。
生理上可耐受的载体是本领域已知的。液体载体的实例是除了活性成分和水之外不含有物质，或者含有生理pH值下的诸如磷酸钠的缓冲液，生理盐水或两者都含有例如磷酸盐缓冲盐水的无菌水溶液。另外，含水载体可以含有多于一种缓冲盐，以及盐如氯化钠和氯化钾，右旋糖，丙二醇，聚乙二醇和其它溶质。
除了水并排除水之外，液体组合物还可以含有液相。这种附加液相的实例是甘油，植物油例如棉籽油，有机酯例如油酸乙酯和水-油乳剂。
在一个实施方案中，治疗组合物含有DBDpp融合蛋白，其通常为总治疗组合物重量的至少0.1重量％的DBDpp融合蛋白的量。重量百分比是每个总组合物中的DBDpp融合物的重量比。因此，例如，0.1重量％是每100克总组合物中0.1克DBDpp。
含DBDpp融合蛋白的治疗组合物通常含有每毫升DBDpp融合蛋白约10微克(μg)/毫升(ml)至约100毫克(mg)/ml作为单位体积组合物的活性成分，更优选含有约1mg/ml至约10mg/ml(即，约0.1至1重量％)。
施用DBDpp(例如DBDpp融合蛋白)的剂量范围足够大以产生期望的效果，其中由靶分子介导的疾病症状得以改善。剂量不宜过大，以致引起不良副作用，如高粘滞综合症，肺水肿，充血性心力衰竭等。通常，剂量将随患者的年龄，病症，性别和疾病程度而变化，并且可由本领域技术人员确定。如果发生任何并发症，可由个体医师调整剂量。
可以通过注射或随时间通过逐渐输注肠胃外施用DBDpp(例如DBDpp融合蛋白)。尽管靶分子通常可以通过全身施用进入体内，并且因此最经常通过静脉内施用治疗组合物进行治疗，但是可能存在靶向的组织含有靶分子的可能性的其他组织和递送手段。因此，DBDpp可以通过静脉内，腹膜内，肌肉内，皮下，腔内，经皮施用，并且可以通过蠕动方式递送。DBDpp融合蛋白也可以通过气溶胶递送到气道和肺部。
含有DBDpp的治疗组合物可以按照常规静脉内施用，例如通过注射单位剂量。当涉及本文提供的治疗组合物时使用的术语“单位剂量”是指适合作为受试者的整体剂量的物理离散的单位，每个单位含有预定量的活性物质，经计算产生所需的治疗效果与所需稀释液；例如载体，或媒介。在具体的实施方案中，含有DBDpp的治疗组合物皮下施用。
在一些实施方案中，DBDpp(例如DBDpp融合蛋白)以与剂型相容的方式并以治疗有效量施用。待施用的量取决于要治疗的受试者，受试者系统利用活性成分的能力以及所需的治疗效果的程度。需要待施用的精确量的活性成分取决于从业者的判断，并且是每个个体特有的。然而，全身应用的合适剂量范围在本文中公开并取决于施用途径。合适的施用方案也是可变的，但典型的是初始施用，然后通过随后的注射或其他施用以一个或多个小时的间隔重复施用。或者，考虑足以维持血液中浓度在体内治疗所规定的范围内的连续静脉内输注。
DBDpp组合物以与良好医学实践相一致的方式配制，给药和施用。在这种情况下考虑的因素包括被治疗的具体障碍，被治疗的具体哺乳动物，个体患者的临床状况，病因，药剂递送部位，施用方法，施用时间表以及医师已知的其他因素。施用DBDpp的剂量范围足够大以产生期望的效果，其中靶分子介导的疾病症状得以改善。剂量不宜过大，以致引起不良副作用，如高粘滞综合征，肺水肿，充血性心力衰竭等。通常，剂量将随患者的年龄，病症，性别和疾病程度而变化，并且可由本领域技术人员确定。如果发生任何并发症，可由个别医师调整剂量。
对于治疗和预防用途有效的剂量方案和量(即“给药方案”)将取决于多种因素，包括疾病或障碍的原因，阶段和严重性，健康状况，身体状况，所治疗的哺乳动物的年龄，以及DBD递送的部位和方式。复合物和制剂的治疗功效和毒性可以通过细胞培养或实验动物中的标准药物，药理学和毒理学程序来确定。从这些程序获得的数据同样可以用于配制人用剂量范围。此外，治疗指数(即50％群体治疗有效的剂量除以群体50％的致死剂量(ED50/LD50))可以容易地使用已知程序来确定。剂量优选在包括几乎没有或没有毒性的ED50的浓度范围内，并且可以根据所采用的剂型，患者的敏感性和施用途径而在该范围内变化。
剂量方案还考虑到本领域已知的药物动力学参数，例如药物吸收速率，生物利用度，代谢和清除(参见例如Hidalgo-Aragones，J.Steroid Biochem.Mol.Biol.58:611-617(1996)；Groning et al.，Pharmazie51:337-341(1996)；Fotherby，Contraception 54:59-69(1996)；和Johnson et al.，J.Pharm.Sci.84:1144-1146(1995))。对于临床医师来说，确定每个治疗受试者的剂量方案是完全在现有技术范围之内的。此外，根据受试者需要和耐受的剂量和频率，可以施用单次或多次DBDpp组合物的施用。预防性和治疗性治疗的持续时间将根据所治疗的特定疾病或病症而变化。一些疾病适用于急性治疗，而另一些则需要长期的慢性治疗。DBDpp可以连续施用，或者与另外的治疗剂同时施用。
在一些实施方案中，DBDpp以约1mg/kg至约50mg/kg，约1mg/kg至约25mg/kg，约1mg/kg至约20mg/kg，约1mg/kg至约15mg/kg，约1mg/kg至约10mg/kg或约1mg/kg至约5mg/kg施用。
在另一个实施方案中，DBDpp与更多的一种或多种另外的治疗剂组合施用。
DBDpp(诸如DBDpp融合蛋白)的治疗有效量可以是这样的量，使得当以生理上可耐受的组合物施用时，足以实现约0.1微克(μg)/毫升(ml)至约100μg/ml，优选约1μg/ml至约5μg/ml，并且通常约5μg/ml的血浆浓度。换句话说，剂量可以从约0.1mg/kg到约300mg/kg，优选约0.2mg/kg到约200mg/kg，最优选约0.5mg/kg到约20mg/kg变化，每天一次或多次剂量施用，持续一天或几天。
在一个实施方案中，疾病或障碍是免疫系统的疾病或障碍，例如炎症或自身免疫性疾病。
在一些实施方案中，DBDpp是特异性结合与代谢，心血管，肌肉骨骼，神经学或骨骼系统的疾病或障碍相关的靶的可溶性蛋白。
在其他实施方案中，DBDpp是特异性结合与酵母，真菌，病毒或细菌感染或疾病相关的靶的可溶性蛋白。在一些实施方案中，DBDpp是特异性结合与免疫系统疾病或障碍相关的靶的可溶性蛋白。
在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白可用于抑制肿瘤生长，减少新血管形成，减少血管生成，诱导分化，减小肿瘤体积，和/或降低肿瘤的致瘤性。
在一些实施方案中，本文的DBDpp可用于治疗癌症。因此，在一些实施方案中，本发明提供了治疗癌症的方法，包括向患者施用治疗有效量的DBDpp(例如DBDpp融合物)。
可以治疗的癌症包括未血管化的或尚未实质血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可以包含非实体肿瘤(例如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可以包含实体瘤。待用DBDpp治疗的癌症的类型包括但不限于癌，母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤，良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤，癌和黑素瘤。成人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症也包括在内。
实体瘤例如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤和其他肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，淋巴恶性肿瘤，胰腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，甲状腺髓样癌，甲状腺乳头状癌，嗜铬细胞瘤，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，髓样癌，支气管源性癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，绒毛膜癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，睾丸肿瘤，精原细胞瘤，膀胱癌，黑素瘤和CNS肿瘤(例如神经胶质瘤(脑干胶质瘤和混合神经胶质瘤)，胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)，星形细胞瘤，CNS淋巴瘤，生殖细胞瘤，髓母细胞瘤，神经鞘瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，髓膜瘤(menangioma)，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。
在另一个实施方案中，本文所述的DBDpp可用于治疗患有血液学癌症的患者。血液学(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病，急性髓细胞性白血病，急性骨髓性白血病和成髓细胞，早幼粒细胞，骨髓单核细胞，单核细胞和红白血病)，慢性白血病(例如慢性髓细胞性(粒细胞)白血病，慢性骨髓性白血病，和慢性淋巴细胞性白血病)，真性红细胞增多症，淋巴瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤(无痛性和高级形式)，多发性骨髓瘤，原发性巨球蛋白血症，重链病，骨髓增生异常综合征，毛细胞白血病和骨髓增生异常。
在另外的实施方案中，DBDpp融合蛋白结合(1)目的细胞或组织上的靶(例如肿瘤细胞上的肿瘤抗原)和(2)效应细胞上的靶，例如T细胞受体分子。根据一个实施方案，DBDpp融合蛋白结合一个或多个靶用于将免疫应答引导至患者中的感染原，细胞，组织或其它目的位置。例如，在一些实施方案中，DBDpp特异性结合效应细胞表面上的靶。因此，在一些实施方案中，DBDpp特异性结合T细胞表面上的靶。在具体的实施方案中，DBDpp特异性结合CD3。在其他实施方案中，DBDpp特异性结合CD2。在另一个实施方案中，DBDpp特异性结合T细胞受体(TCR)。根据另外的实施方案，DBDpp特异性地结合自然杀伤细胞表面上的靶。因此，在一些实施方案中，DBDpp特异性结合NKG2D(自然杀伤2族D)受体。在另外的实施方案中，DBDpp特异性结合CD16(即FcγRIII)CD64(即FcγRI)或CD32(即FcγRII)。
在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白结合白细胞上的靶和肿瘤细胞上的肿瘤抗原。在一些实施方案中，DBDpp融合蛋白结合NKG2D。在另一个实施方案中，DBDpp融合蛋白结合NKG2D和选自ErbB2，EGFR，IGF1R，CD19，CD20，CD80和EPCAM的靶。在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白结合CD3。在具体的实施方案中，DBDpp特异性结合CD3ε。在一个实施方案中，DBDpp融合蛋白结合CD4。
在一个实施方案中，DBDpp融合物是双特异性的并且特异性结合两种不同细胞类型的表面上表达的两种不同靶。在一个实施方案中，双特异性DBDpp融合蛋白特异性结合癌细胞靶和免疫效应细胞靶。在一个实施方案中，双特异性DBDpp融合蛋白特异性结合在癌细胞上表达的靶(例如CD19)和在T淋巴细胞表面上表达的靶(例如CD3)。
在一些实施方案中，DBDpp能够模拟配体结合。在某些实施方案中，DBDpp能够例如通过竞争性结合模拟配体的生物学活性(激动剂DBDpp)或抑制配体的生物学活性(拮抗剂DBDpp)。DBDpp融合蛋白中的DBDpp也能够以其他方式影响靶，例如通过中和，阻断，稳定，聚集或交联DBDpp靶。
DBDpp药物缀合物
在另一个实施方案中，可以通过使用化学缀合将DBDpp融合蛋白与其他有机或无机分子或底物连接。在一个实施方案中，DBDpp-药物缀合物旨在通过DBDpp的靶向特异性促进细胞毒性剂的局部递送。靶向特异性和细胞毒性剂的这种组合允许药物靶向递送至肿瘤，以及其中的细胞内积聚，其中这些未缀合的药剂的全身施用可能导致对正常细胞的不可接受水平的毒性水平以及寻求的消除肿瘤细胞(Baldwin et al.，Lancet pages 603-05(1986)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic agents In Cancer Therapy:AReview，”于Monoclonal Antibodies'84:Biological And Clinical Applications，A.Pinchera et al.，(ed.s)，pp.475-506)(1985))。
细胞毒性剂包括化疗剂，生长抑制剂，毒素(例如，细菌，真菌，植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)，放射性同位素(即放射性缀合物)等。用于产生此类免疫缀合物的化疗剂包括例如甲氨蝶呤，阿霉素，多柔比星，美法仑，丝裂霉素C，苯丁酸氮芥，柔红霉素或其他嵌合剂。用于产生此类免疫缀合物的化疗剂还包括抗微管蛋白药物，例如澳瑞他汀(auristatin)，包括单甲基澳瑞他汀E(MMAE)和单甲基澳瑞他汀F(MMAF)。可根据本发明使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链，白喉毒素的非结合活性片段，外毒素A链，蓖麻毒蛋白A链，相思豆毒素A链，modeccin A链，α帚曲毒蛋白，油桐(Aleurites fordii)蛋白质，香石竹毒蛋白，美洲商陆蛋白(PAPI，PAPII和PAP-S)，苦瓜(momordica charantia)抑制剂，麻疯树毒蛋白，巴豆毒蛋白，sapaonaria officinalis抑制剂，多花白树毒蛋白，mitogellin，restrictocin，phenomycin，enomycin和tricothecenes。
在一个实施方案中，DBDpp(例如DBDpp融合蛋白)与放射性同位素缀合。在进一步的实施方案中，使用许多已知的螯合剂中的任一种或直接标记将DBDpp缀合至选自90Y，125I，131I，123I，111In，105Rh，153Sm，67Cu，67Ga，166Ho，177Lu，186Re和188Re的同位素。在其他实施方案中，DBDpp与药物，前药或淋巴因子如干扰素偶联。DBDpp和细胞毒素的偶联物可以常规地使用各种双功能蛋白质偶联剂例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯的双功能衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯HCL)，活性酯(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)，醛(例如戊二醛)，双-叠氮化合物(例如双-(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)，双重氮化合物衍生物(例如双-(对-重氮苯甲酰基)乙二胺)，二异氰酸酯(例如甲苯2,6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在具体的实施方案中，毒素通过酶可切割接头系统(例如，如以SGN-35存在的)与DBDpp融合蛋白缀合。还可以使用DBDpp和一种或多种小分子毒素(例如加利车霉素，美登木素生物碱，trichothene和CC1065)以及这些毒素的具有毒素活性的衍生物的缀合物。
在一些实施方案中，细胞毒性剂通过接头共价附接到DBDpp。在一些实施方案中，附接DBDpp和细胞毒性剂的接头可被蛋白酶切割。
作为细胞相关受体的治疗用途
在本发明的一个实施方案中，DBDpp-CAR用于将转导的T细胞重定向至由DBDpp-CAR的结合特异性限定的肿瘤靶。在一个实例中，将原代T细胞用编码CAR的慢病毒载体转导，CAR将DBD靶结合结构域与跨膜结构域和CD3-ζ，CD28，4-1BB的细胞内结构域组合。因此转导的T细胞的所得群体可以引起DBDpp-CAR介导的T细胞应答。在一个实施方案中，将T细胞遗传修饰以表达DBDpp-CAR，并将DBDpp-CAR T细胞输注至有此需要的受者。输注的细胞能够杀伤受体中的肿瘤细胞。本发明的若干实施方案是特别有利的，因为它们包括以下益处中的一种，几种或全部：(i)靶结合特异性，(ii)增强的治疗功效，(iii)减少的脱靶副作用，(iv)特定患者或患者群体的标志物的可定制性，(v)在生产和加工期间增强的稳定性，和(vi)靶向一种，两种或更多种特异性靶以增强靶向治疗的能力。
如本文所用的“遗传修饰的细胞”，“重定向的细胞”，“遗传工程改造的细胞”或“修饰的细胞”是指表达本文提供的DBDpp的细胞。在具体的实施方案中，遗传修饰的细胞表达DBDpp融合蛋白，例如DBDpp-CAR。在另一个实施方案中，遗传修饰的细胞表达并在细胞表面上展示DBDpp-CAR。
如本文所用的“由遗传修饰的细胞靶向的疾病”包括通过遗传修饰的细胞以任何方式参与任何疾病的任何细胞的靶向，而不管遗传修饰的细胞靶向患病细胞还是健康细胞以实现治疗效益。遗传修饰的细胞包括但不限于遗传修饰的T细胞，NK细胞，造血干细胞，多能胚胎干细胞或胚胎干细胞。遗传修饰的细胞表达DBDpp-CAR，其能够靶向在靶细胞表面上表达的任何抗原。
在一个实施方案中，DBDpp-CAR的DBDpp部分被设计为治疗特定的癌症。可以治疗的癌症包括没有血管化的肿瘤，或者还没有实质血管化的肿瘤以及血管化的肿瘤。癌症可以包含非实体肿瘤(例如血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可以包含实体瘤。待用DBDpp-CAR治疗的癌症的类型包括但不限于癌，母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴恶性肿瘤，良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤，癌和黑素瘤。成人肿瘤/癌症和小儿肿瘤/癌症也包括在内。
血液学(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病，急性髓细胞性白血病，急性骨髓性白血病和成髓细胞，早幼粒细胞，骨髓单核细胞，单核细胞和红白血病)，慢性白血病(例如慢性髓细胞性(粒细胞)白血病，慢性骨髓性白血病，和慢性淋巴细胞性白血病)，真性红细胞增多症，淋巴瘤，霍奇金病，非霍奇金淋巴瘤(无痛性和高级形式)，多发性骨髓瘤，原发性巨球蛋白血症，重链病，骨髓增生异常综合征，毛细胞白血病和骨髓增生异常。
实体瘤例如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤和其他肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，淋巴恶性肿瘤，胰腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，甲状腺髓样癌，甲状腺乳头状癌，嗜铬细胞瘤，皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，髓样癌，支气管源性癌，肾细胞癌，肝细胞癌，胆管癌，绒毛膜癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，睾丸肿瘤，精原细胞瘤，膀胱癌，黑素瘤和CNS肿瘤(例如神经胶质瘤(脑干胶质瘤和混合神经胶质瘤)，胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)，星形细胞瘤，CNS淋巴瘤，生殖细胞瘤，髓母细胞瘤，神经鞘瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，髓膜瘤(menangioma)，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤和脑转移瘤)。
在一个实施方案中，可以使用表达靶向CD19，CD20，CD22和ROR1的DBDpp-CAR的细胞来治疗癌症和障碍。在一个具体的实施方案中，DBD-CAR可被设计为靶向CD22以治疗B细胞淋巴瘤。在另一个实施方案中，表达DBDpp-CAR的细胞含有设计用于靶向CD19的DBDpp可用于治疗癌症和障碍，包括但不限于前B ALL(小儿适应症)，成人ALL，套细胞淋巴瘤，弥漫性大B-细胞淋巴瘤，同种异体骨髓移植后的挽救等。
如本文所用的“B细胞相关疾病”包括与B细胞相关的B细胞免疫缺陷，自身免疫疾病和/或过度/不受控制的细胞增殖(包括淋巴瘤和/或白血病)。其中DBDpp-CAR可用于治疗方法的此类疾病的实例包括但不限于系统性红斑狼疮(SLE)，糖尿病，类风湿性关节炎(RA)，反应性关节炎，多发性硬化症(MS)，寻常性天疱疮，乳糜泻，克罗恩病，炎性肠病，溃疡性结肠炎，自身免疫性甲状腺疾病，X-连锁无丙种球蛋白症(agammaglobulinaemis)，前B急性淋巴母细胞白血病，系统性红斑狼疮，普通可变免疫缺陷，慢性淋巴细胞白血病，与选择性IgA缺陷和/或IgG亚类缺陷相关的疾病，B谱系细胞淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤和/或非霍奇金淋巴瘤)，胸腺瘤免疫缺陷，短暂性低丙种球蛋白血症和/或高IgM综合征，以及病毒介导的B细胞疾病如EBV介导的淋巴细胞增生性疾病，和慢性感染其中B细胞参与病理生理学。
在一个实施方案中，DBDpp-CAR可被设计成靶向间皮素以治疗间皮瘤，胰腺癌，卵巢癌等。在一个实施方案中，可以将DBDpp-CAR设计为靶向CD33/IL3Ra以治疗急性髓细胞性白血病等。在一个实施方案中，DBDpp-CAR可被设计为靶向c-Met以治疗三阴性乳腺癌，非小细胞肺癌等。在一个实施方案中，DBDpp-CAR可以被设计为靶向PSMA以治疗前列腺癌等。在一个实施方案中，DBDpp-CAR可被设计为靶向糖脂F77以治疗前列腺癌等。在一个实施方案中，可以将DBDpp-CAR设计成靶向EGFRvIII以治疗胶质母细胞瘤等。在一个实施方案中，DBDpp-CAR可被设计为靶向GD-2以治疗神经母细胞瘤，黑素瘤等。在一个实施方案中，DBDpp-CAR可被设计为靶向NY-ESO-1以治疗骨髓瘤，肉瘤，黑素瘤等。在一个实施方案中，DBDpp-CAR可被设计为靶向MAGE A3以治疗骨髓瘤，肉瘤，黑素瘤等。然而，本发明不应被解释为仅限于本文公开的抗原靶和疾病。相反，本发明应被解释为包括任何与DBDpp-CAR可用于治疗疾病的疾病有关的抗原性靶。
在优选的实施方案中，DBDpp-CAR在T细胞中表达，并且提供了用于治疗或预防癌症的方法，包括将表达DBDpp-CAR的宿主细胞施用其中癌细胞在其癌细胞上表达肿瘤抗原的癌症患者表面，并且其中DBDpp特异性结合靶抗原。DBDpp和DBDpp-CAR结合的示例性靶抗原包括但不限于CD19，CD123，TSLPR和CD267。
DBDpp-CAR修饰的T细胞还可以用作哺乳动物离体免疫和/或体内治疗的一类疫苗。优选地，哺乳动物是人。
本文提供的DBDpp-CAR修饰的T细胞可以单独施用，或作为药物组合物与稀释剂和/或与其它组分如化疗剂，抗体，细胞因子或细胞群体组合施用。本文提供的组合物优选配制用于可以一次或多次施用的静脉内施用。
如本文所用的“抗原丢失逃逸变体”是指表现出靶抗原表达降低或丢失的细胞，所述抗原被本文提供的CAR靶向。
现在将通过根据其进行的实验的描述来说明本发明的各种实施方案。提供下面的实施例是为了便于实施所公开的实施方案，而不应被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。在这些实施例中，参考了附图。
实施例
实施例1.DBDpp的免疫原性评估
DBDpp的序列，特别是施用于受试者和/或用于纯化施用于受试者的组合物的那些DBDpp的序列优选对受试者(例如人)来说是没有抗原性的。在一些实施方案中，DBDpp的序列不含人蛋白酶体和免疫蛋白酶体的HLA-DR结合基序或切割位点。在具体的实施方案中，DBDpp序列不含通过在本说明书的申请日存在的计算机预测模型版本确定的抗原性序列。在具体的实施方案中，DBDpp序列不含由选自ProPred(参见例如Singh，Bioinformatics 17(12):1236-1237(2001))、ProPred1(Singh，Bioinformatics 19(8):1009-14(2003))、SYFPEITHI(参见例如Schuler，Immunoinf.Meth.in Mol.Biol.409(1):75-93(2007))、SMM-align(参见例如Nielsen，BMC Bioinformatics 8:238(2007))、RANKPEP(参见例如Reche，Hum Immunol 63:701–709.(2004))、或TEPITOPE(参见Sturniolo，Nat Biotechnol 17:555–561(1999))的算法所预测的MHC(I类或II类)结合位点序列，其中算法的版本和应用的数据库在本申请的申请日存在。
对α3D的氨基酸序列(MGSWAEFKQRLAAIKTRLQALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRH N(SEQ ID NO:49)的计算机分析(in silico analysis)揭示了与高亲和力(结合阈值小于6％)和混杂(存在于大于50％的相关等位基因中)T细胞表位(Singh，Bioinformatics17:1236-1237，2001)共享特征的9氨基酸序列(即，LAAIKTRLQ(SEQ ID NO:50))。该表位位于一些DBDpp文库的不变区内。因此，为了降低免疫原性的潜力，将Q19E置换引入到SEQ ID NO:49中。这种保守的和表面暴露的置换似乎不太可能显著破坏疏水核心(参见例如图1B)。所得序列(SEQ ID NO:1)的计算机分析得到较低的免疫原性评分。
实施例2.DBDpp文库设计、构建和筛选
与天然配体和结合蛋白不同，DBD的合成支架序列(即，SEQ ID NO:1)不具有已知的结合配偶体。在构建与靶结合的DBDpp时，如果认为残基被表面暴露-表现出显著的溶剂可及性，则认为残基用于突变(即文库内的随机化)。有多种方法可用于评估限定分子结构的溶剂可及性。例如，PyMOL是开发用于分子可视化和分析的开源软件包，并且可以用于使用Lee和Richards的方法(Lee et al.，J.Mol.Biol.55:379–400(1971))计算溶剂可及表面积。更具体地，使用“点溶剂”设置为1，“溶剂半径”设置为“点密度”设置为4的PyMOL(版本1.4.1)，可以计算基于模板PDB 2A3D的SEQ ID NO:1的同源模型的每个氨基酸的溶剂可及表面积。表2列出了每个残基的计算面积(平方埃)，如在结构域(面积D)中测量的，并且作为分离的氨基酸，独立于邻近残基施加的空间位阻(面积I)。与分离状态(面积I)相比，结构域(面积D)内残基的相对可及性表示为百分比值(％A)。
表2.参考支架序列(SEQ ID NO:1)的溶剂可及性
具有小于10％至11％的％A值的结构域残基(例如，SEQ ID NO:1的F7，L11，I14，L18，L21，S24，L28，F31，I35，F38，L42，Y45，G49，V53，L56，A60，I63和L67；表2A)被认为是外部溶剂相对难及的，因此被认为是DBD的内部核心残基。相反，预测具有大于10％至11％的％A值的残基(例如，SEQ ID NO:1的G2，S3，W4，A5，E6，K8，Q9，R10，A12，A13，K15，T16，R17，E19，A20，A29，A30，E32，K33，E34，A36，A37，E39，S40，E41，Q43，A44，E52，E54，A55，R57，K58，E59，A61，A62，R64，D65，E66，Q68，A69和Y70)位于与α-螺旋二级结构相关的多肽区域内并且占据具有与目的大分子靶相互作用的更大潜力的位置。这些溶剂可及的α螺旋残基被认为是文库中最大程度的置换多样性(包括保守和非保守置换)的候选者。
在一些实施方案中，参考支架序列的非α螺旋残基对应于位置SEQ ID NO:1的M1，L21，G22，G23，S24，E25，A26，E27，Y45，K46，G47，K48，G49，N50，P51，R71，H72和N73。在另外的实施方案中，参考支架序列的非α螺旋残基对应于参考支架序列的位置SEQ ID NO:1的M1，G22，G23，S24，E25，A26，E27，K46，G47，K48，G49，N50，P51，R71，H72和N73。这些残基同样被认为是文库中保守和非保守置换的候选者。
一些DBDpp文库是通过DBDpp的特定溶剂暴露的氨基酸序列位置的选择性或随机突变产生的。在一系列实验中，设计文库(本文称为“面”文库或“F文库”)，使得SEQ ID NO:1的多肽的参考支架结构的置换残基聚集在该结构域的单个面上和产生单一连续的结合表面。针对SEQ ID NO:1的多肽的结构的全部三个面(F1，F2和F3)构建面文库。由于结构域结构的不对称性，每对α螺旋(以及因此每个面)形成独特的几何拓扑结构(图1和图2)。如在参考支架中模拟的，大量靶向残基对应于大于1400平方埃的连续表面积-明显大于对非抗体结合支架的调查所测量的结合表面。(Gilbreth et al.，Curr.Opin.Struct.Biol.22:413–420(2012))。
在另一组实验中，构建本文称为“组合”文库或“C文库”的文库以鉴定可能展现与目的靶(表3和图1和2)的多面结合的DBDpp。通过组合来自在F系列文库中使用的三个螺旋中的每一个螺旋的残基来构建组合文库(C1和C2)。
在这些实验中，总共32个残基位置进行诱变。每个诱变位置存在于至少2个文库中。此外，每个诱变位置都在两个文库“体系结构”中的每一个中分别表示；F和C。
表3.DBDpp文库序列谱
DBDpp F2NNK文库构建
构建F2文库，其靶向表面2(螺旋2和3)上的12个表面暴露的残基(表3和图2C和2D)。命名为F2NNK的该文库利用含有NNK密码子的寡核苷酸通过Kunkel诱变产生。使用修饰的pComb phagmid载体(其中DBDpp在C末端融合至M13pIII的N末端)构建文库。这些DBDpp也在其N末端融合到FLAG表位标签的C末端。整个DBDpp融合蛋白处于DsbA信号肽的分泌控制之下(图3B)。
DBDpp三核苷酸亚磷酰胺文库构建
通过Kunkel诱变在与F2NNK文库相同的修饰的pComb噬菌粒载体中构建后续文库。在若干实施方案中，FLAG标签是任选的(例如参见图3C)，或者可以用另一个标签替换。使用三核苷酸亚磷酰胺(密码子)混合物构建这些文库。这些混合物设计为排除终止密码子，半胱氨酸和脯氨酸密码子，并提供剩余氨基酸的相同表示。使用如表3所示全部5个序列概况(F1，F2，F3，C1和C2)构建文库。
使用F2NNK文库进行选择
将F2NNK DBD文库用于针对重组生物素化的人4-1BB/TNFRSF9/CD137-Fc的五轮选择。对所拯救噬菌体的ELISA筛选显示95个克隆中的89个克隆结合4-1BB/CD137，平均OD是对照(IgG Fc)的5.3倍。89个克隆的结合分布(ELISA吸光度值)：CD137 0.353(0.134-0.617)，对照0.067(0.056-0.125)。个体噬菌体的测序表明所有89个克隆在核苷酸水平上是相同的。值得注意的是，这个名为bb10的克隆在SEQ ID NO:1序列的12个随机化位置中仅含有8个置换(在下面的序列中以粗体表示)：
使用F1，F2，F3，C1和C2三核苷酸亚磷酰胺文库进行选择
还使用F1，F2，F3，C1和C2三核苷酸亚磷酰胺文库进行选择。在大多数情况下，文库在用于选择之前被合并。通过组合等量的个体文库，生成Pool F(文库F1，F2和F3)和Pool C(文库C1和C2)。这些文库用于选择针对4-1BB/CD137的DBDpp结合物，以及包括CD47，CTLA4，DR5，KIR，LAG3，OX40，PD1，PD-L1和TIM3的更大组的纯化重组“靶”-Fc蛋白。(这些靶中的许多被认为是免疫调节因子(Pardoll et al.,Nat.Rev.Cancer 12:252–264(2012))。将靶与DBDpp噬菌体文库的合并库孵育后，结合的噬菌体靶复合物被捕获并用蛋白A珠与结合的噬菌体分开(靶蛋白为Fc融合物)。经过三轮选择后，通过ELISA筛选获得与选择的靶结合的拯救噬菌体克隆。
对于每个靶，通过ELISA筛选获得约90个与靶蛋白以及非特异性对照(例如IgG1-Fc)的结合的DBDpp噬菌体克隆。对显示出为非特异性对照的3倍的靶特异性结合信号的个体DBDpp克隆进行测序。在一些情况下，对于其中大多数DBDpp克隆为阳性的ELISA筛选板，整个板被测序。序列结果表明总共大约70％的DBDpp克隆在正确的阅读框中，并符合五个预期的文库序列概况之一(表3)。不符合预期概况的序列通常由失败的测序读数，移码突变，截短，多联体化或其他克隆假象组成。
DBDpp结合各种靶
表4显示了作为靶和结合数据函数的每个文库的克隆分布。三个子表合计所有序列(上表)以及靶特异性结合比等于或大于2(中表)或3(下表)的序列的分布。(其中序列由多于一个克隆表示，使用平均结合值。)在总共794个序列中，330个是独特克隆，其中278个产生高于背景3倍的ELISA信号。
表4.DBDpp克隆和独特序列的分布
表5列出了源自上述实验的示例性序列。对于每个序列，指示了靶，来源库(Lib.)，筛选发生次数(计数)和靶与背景之比(ELISA比)。在若干实施方案中，与以上描述的那些(以及本文别处)具有至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少95％或至少98％同源性的DBDpp保留显著的功能等同性。在若干实施方案中，这是有利的，因为同源性的不同可能具有某些优点，如免疫原性降低，交叉反应性增加，特异性增加等。
表5：从经筛选的文库分离的DBDpp文库克隆的序列
从大肠杆菌培养物中表达并纯化pb04(SEQ ID NO:182)和α3D(SEQ ID NO:49)的N末端FLAG标签融合物。通过ELISA评估，纯化的FLAG-pb04以剂量依赖性方式结合PD-L1-Fc包被的微量滴定孔。相反，FLAG-a3D不显示与PD-L1-Fc靶蛋白的可检测的结合(图3D)。这些结果证明参考支架序列(SEQ ID NO:1)的修饰在提供能够以新的特异性结合多种目的靶组的稳健的DBDpp源方面是有效的。
实施例3.DBDpp融合蛋白
为了评估作为结合元件的DBDpp的模块化性质，将DBDpp CD137-结合物bb10(SEQID NO:19)重新格式化为与源自RSV特异性单克隆抗体帕利珠单抗序列的抗体的重链的N或C末端的融合物(分别示意性显示在图4A和4B中)。作为比较，使用DBDpp亲本序列(SEQ ID NO:1)产生类似的融合物，其已知不显示出任何结合特异性。在用等摩尔比的独立重链-bb10融合物和轻链cDNA表达构建体瞬时转染的HEK293F悬浮细胞中产生蛋白质，并通过常规蛋白A亲和方法纯化。纯化样品的SDS-PAGE分离表明重链-bb10(DBDpp)融合蛋白的迁移与基于分子量的预测相符(数据未显示)。
SEC分析表明，bb10DBDpp抗体融合物相对于大小标准未聚集并迁移(数据未显示)。SYN-bb10和bb10-SYN融合物彼此显示出相似的迁移，都比亲本抗体跑得更快。
双特异性抗体SYN-bb10和bb10-SYN表现出与CD137和RSV的结合(图4C-D；实心方块是bb10-SYN，实心圆圈是SYN-bb10))，证明了新的结合活性被赋予亲本DBD序列并且作为N和C末端融合物DBDpp的功能得到保留。相反，无靶α-螺旋蛋白支架和SYN之间的融合(N末端融合的DBD-SYN，空心圆圈；C末端融合的SYN-DBD，空心方块)显示仅与RSV结合，但没有赋予与CD137结合。
使用两种不同的实验方法证明DBDpp，bb10与CD137的结合：ELISA(图4C-D)和FACS(图6A-C)。在这些测定中，以三种不同的形式呈递并最终识别靶抗原：直接结合于塑料(图4C-D)或原位，作为细胞膜的一部分(图6A-C)。
用SYN-bb10和bb10-SYN处理PBMC表明，除了结合之外，两种融合蛋白都能够在靶细胞中诱导下游生物学反应(图7A-D)。
体内稳定性对于大多数生物治疗剂的临床功效是至关重要的。进行bb10融合物(SYN-bb10和bb10-SYN)的药物动力学测量以评估与mAb融合配偶体相比DBDpp的相对稳定性(图8)。通过分析接受单次静脉内注射(1mg/kg)融合蛋白的CD1小鼠血清中存在的双特异性抗体的RSV和CD137结合来测定体内稳定性。在15分钟和48小时收集血清样品，并通过ELISA分析。N末端和末C末端DBDpp融合蛋白都表现出持续的体内稳定性。
实施例4.DBDpp在亲和纯化中的用途
将八个CD137结合DBDpp配体(SEQ ID NO:12-19)重新格式化为N末端六组氨酸融合蛋白。它们的加标签的序列和相应的亲本序列显示在表5中。
表5-由SEQ ID NO:12-19制备的N末端六组氨酸融合蛋白。
每种融合物在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中分开表达。细胞裂解并使用固定金属离子色谱纯化后，使用反相HPLC再次纯化每个CD137结合DBDpp配体。每个HPLC柱(20×100mmC-4，Western Analytical)用0.1％TFA:乙腈(88:12，2分钟，然后在15分钟线性梯度至58:42)洗脱。在约12分钟的主峰对应于靶配体(参见图9中的箭头)。在进一步使用之前将纯化的配体冻干。
通过电喷雾质谱(表6)和SDS-PAGE(图10)确认每个配体的身份和纯度。表6显示了基于它们的序列的每个CD137靶向DBDpp的计算分子量。表6还显示了用六组氨酸标签替换N末端甲硫氨酸之后每个DBDpp的预期分子量。表6还显示了观测分子量。对于每个CD137靶向DBDpp，除了SEQ ID NO.54，观测分子量与预期分子量很好地相关，表明纯化样品中的优势物质包括六组氨酸标签。对于SEQ ID NO:54，含甲硫氨酸的物质是主要物质。
表6-8种蛋白质SEQ ID 51-58的预期分子量和观测分子量的比较。
图10显示了具有六组氨酸标签的每个CD137靶向DBDpp的考马斯蓝染色SDS-PAGE分析。泳道1是分子量梯状标志(千道尔顿)，泳道2是SEQ ID NO:58，泳道3-9分别对应于SEQID NO:51-57。每条泳道都显示干净而精确的泳道，没有拖影，也没有证据表明泳道中有较小的泳道，这将暗示DBDpp的分解。
图11显示了根据SEQ ID NO:54的DBDpp的解卷积电喷雾质谱，其中阐明了样品中的优势物质保留具有N末端甲硫氨酸的蛋白质，与His6标签相反。
根据本文公开的若干实施方案，本文公开的用于产生加标签的DBDpp的生产方法得到作为加标签的物质运行给定生产的优势物质(例如，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％等)。如上所讨论的，取决于实施方案，可以使用不同于His6的标签。
靶蛋白CD137被构建为CD137-Fc-His6融合蛋白。通过瞬时转染HEK293细胞，并使用固定化金属离子色谱法(IMAC)从澄清的细胞上清液中纯化，然后将缓冲液交换成PBS，制备具有六组氨酸标签的(Leu24-Gln186)/rHuman Fc(Lys100-Lys329)嵌合体(SEQ ID：59)。该材料与从商业来源(RnD系统)购买的真实蛋白表现相同，并用作CD137的阳性对照。
SEQ ID：59显示如下：
LQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQDIEGRMDKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKHHHHHH
根据已建立的方法，使用生物层干涉测量术(ForteBio，Menlo Park，CA)评估8个带his标签的DBDpp配体(SEQ ID NO:51-58)与CD137靶蛋白的结合。通过蛋白A固定CD137-Fc-His6，然后在每种DBDpp配体的溶液中孵育5分钟以测量缔合(结合)阶段来构建结合测定。然后将传感器置于缓冲液中以监测解离阶段，并且在图12A，12C，12E，12G，12I，12K，12M和12O中分别显示SEQ ID No：51-58的DBDpp的完整的传感图(时间秒在X轴上，nm在Y轴上)。通过稳态分析来拟合数据，其描绘于在相应的DBDpp的图12D，12D，12F，12H，12J，12L，12N和12P中的每一个中。所显示的数据得到CD137的亲和常数在140nM-1.7μM范围内(表7)。
表7针对8个配体SEQ ID 51-59的计算的亲和常数。
使用制造商的指导原则将八个his融合蛋白中的四个在室温下偶联到NHS激活的Sepharose 4Fast Flow(GE Healthcare Life Sciences)4小时，然后洗涤，然后测定配体密度(表8)。
表8.亲和树脂的测量的配体密度
对于每个树脂，将洗涤过的树脂的一部分装入3×25mm玻璃柱(Omnifit)中并装配到BioLogic色谱仪(Bio-Rad)上。树脂用1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)以0.5mL/min的流速平衡。将含有CD137(已经加入到0.25mg/ml的浓度)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞上清液的样品施加到柱(550ug CD137-Fc-His以0.2mL/min)上，接着洗涤(用7.5ml的PBS以0.5ml/min)并洗脱(用2ml的50mM乙酸钠pH3以0.2ml/min)。在评估另一个样品的结合之前，用1ml的6M盐酸胍以0.5ml/min再生树脂，并用25柱体积的PBS以0.5ml/min重新平衡。
图13描绘了从CHO上清液中纯化CD137-Fc-His6蛋白的色谱图。在8-9mL洗脱的峰对应于洗脱的CD137-Fc-His6蛋白。该数据表明，本文公开的DBDpp甚至当输入样品包含具有干扰靶结合物相互作用的潜力的生物蛋白的复杂混合物时仍然能够成功用于从样品中高度特异性地捕获靶蛋白。
为了进一步评估结合的特异性，通过SDS-PAGE评估来自洗脱阶段的级分以证实亲和树脂能够纯化CD137，同时允许除去相当大比例的宿主细胞蛋白。图14A显示泳道1中具有分子量梯状标志的考马斯蓝染色凝胶(千道尔顿)。泳道2显示阳性对照IMAC纯化的CD137蛋白。泳道3描绘阴性对照，其是以0.25mg/mL浓度掺入CHO上清液中的CD137-Fc-His6，其代表缺乏从上清液中纯化CD137。泳道4是在用SEQ ID NO.58的DBDpp纯化后的洗脱物，泳道5是在用SEQ ID NO.51的DBDpp纯化后的洗脱物，泳道6是在用SEQ ID NO.52的DBDpp纯化后的洗脱物，泳道7是用SEQ ID NO.57的DBDpp纯化后的洗脱物，并且泳道8是在用SEQ ID NO.57的DBDpp纯化后的洗脱物。这些数据显示DBDpp特异性纯化靶蛋白，其中CD137是非限制性实例。泳道3清楚地显示泳道中的另外的蛋白质物质，其是CHO细胞上清液的蛋白质组分的结果。相比之下，泳道4-8显示干净条带，很少或没有其他蛋白质物质，其与阳性对照IMAC纯化的CD137相似。
另外，图14B所示的蛋白质印迹分析显示，进一步增强了本文所述DBDpp从含有复杂蛋白的样品中分离出特定靶蛋白的能力。泳道的布局与上面针对图14A所述的布局相同。使用抗penta-His-HRP缀合抗体(Qiagen)进行检测。如考马斯染色最初所提示的，蛋白质印迹分析证实，本文所述的DBDpp能够成功地与靶蛋白特异性结合，然后用于从复杂起始样品中特异性分离该蛋白质。泳道4-8中的每个CD137靶向DBDpp显示了即使不是更好的纯化CD137的能力，以及用固定的金属离子色谱纯化(比较泳道4-8与泳道2)。因为CD137只是一个非限制性实施方案，所以根据另外的实施方案，本文公开的DBDpp可用于从各种起始样品中纯化各种各样的靶蛋白。在一些实施方案中，起始样品是生物流体，而在其他实施方案中，其他类型的液体或气体样品构成将捕获和纯化靶蛋白的起始材料。
实施例5.DBDpp稳定性的表征
根据本文公开的实施方案进行本实施例以评估DBDpp的稳定性。
通过体外转录和翻译反应(NEB，PureExpress)表达DBDpp-6xHIS融合物(pb04和pb06)和scFv-6xHIS融合物。样品用ELISA封闭缓冲液(Thermo Fisher)稀释30倍。随后将各个样品在25℃，40℃，55℃，70℃或100℃孵育2分钟，然后迅速恢复至室温。温度升高，然后快速冷却能够引起蛋白质变性或减少靶相互作用和/或结合的蛋白质三维结构的其他破坏。在暴露于变性条件之后，蛋白质与配体(例如靶肿瘤抗原)结合的能力指示暴露于升高的温度期间增强的稳定性或暴露后重新折叠和维持功能的能力。无论如何，提高的热稳定性使得此类蛋白质在严苛的生产、储存、解冻和临床使用期间和之后保持功能是有吸引力的候选物。
将热暴露的样品在ELISA缓冲液中连续稀释，并在ELISA中测量与PD-L1-Fc的结合。用HRP缀合的兔抗6xHIS多克隆抗体(Abcam)检测结合的蛋白质。图15A描绘了DR5scFv与表达PD-L1的细胞的结合。因为这个特定的scFv没有配置成结合PD-L1，所以其作为阴性对照，并且如所期望的，不管它们暴露于何种温度，都检测不到任何DR5scFv的结合。图15B显示针对PD-L1的scFv在暴露于至多约55℃的升高的温度后将成功地结合到它的靶。然而，暴露于70℃的温度显示scFv成功结合PD-L1的能力降低，这表明scFv的热不稳定性质。将scFv加热至100℃后，完全消除了靶PD-L1的结合。
相反，DBDpp表现出改善的热稳定性。图15C描绘了即使在暴露于100℃的升高的温度之后也表现出DBDpp(在该非限制性实施方案中为pb04)与靶PD-L1结合的能力的数据。图15D展示用于DBDpp的不同非限制性实施方案(pb06)的类似数据。DBDpp在暴露于高达100℃的温度后再次保留其结合它的靶的能力。
这些数据表明根据本文公开的若干实施方案的DBDpp具有在暴露于升高的温度后抵抗变性和/或重新折叠的能力，并且仍然保持结合期望的靶的能力。如上所讨论的，这使得DBDpp成为具有吸引力的靶向部分是因为它们增加的热稳定性表明它们足够稳健以处理可能涉及比其他类型的靶向部分(例如scFv)更高温度的制造过程(或其他生产/处理操作方案)。
实施例6.DBDpp物种交叉反应性
进行本实施例以建立如本文公开的DBDpp的物种特异性。
图16A证实，如通过ELISA评估的，所选择与人PD-L1结合的可溶性DBDpp(在此非限制性实施方案中为pb04)也能够结合食蟹猴(Macaca fascicularis)的PD-L1。将人PD-L1或食蟹猴PD-L1固定在ELISA平板的分开的孔中。针对PD-L1的可溶性DBDpp(加FLAG标签的)在各自的平板中孵育以评估来自每个物种的PD-L1的结合程度。如所示，pb04 DBDpp结合人和食蟹猴PD-L1二者。图16B进一步证明，人和食蟹猴起源的PD-L1与包含在人T细胞表面表达的DBDpp(在该非限制性实施方案中为pb04)的CAR结合。如流式细胞术数据所显示的，PD-L1指导的DBDpp CAR T细胞能够结合可溶性人PD-L1和食蟹猴PD-L1(对于人为97.7％，对于食蟹猴为97.1％)。
实施例7.表达DBDpp的CAR T细胞结合靶分子
进行本实施例以建立在该非限制性实施方案中瞬时表达的包含DBDpp的CAR结合包含与SEQ ID NO:187(CD123)的残基19-305至少95％相同的氨基酸序列的肿瘤靶的能力。
使用(参见例如图5B)Lipofectamine 3000(Life Technologies)，用编码含DBDpp的CAR的pcDNA3表达载体瞬时转染293T细胞。24小时后，使用CellStripperTM收集细胞。使用荧光标记的抗FLAG抗体评估细胞的CAR表达。通过将细胞与包含与人IgG1Fc融合的CD123的细胞外结构域的Fc融合蛋白在细胞培养基中在37℃孵育30分钟，洗涤，然后用PE抗人IgG抗体检测，测量与CD123结合的含DBDpp的CAR。通过流式细胞术测定CD123结合和CAR表达(FLAG标签)。数据显示在图17中，并且每个数据点指示来自多个实验的每个DBDpp-CAR的平均FLAG表达和CD123结合。
图17总结了流式细胞术数据，数据证明，作为目的靶的非限制性实施方案，包含在人T细胞中表达的CD123结合scFv(32716)或DBDpp的CAR结合可溶性CD123。X轴是人T细胞上CAR表达的量度。Y轴表示CAR结合Fc-CD123。
实施例8.表达包含DBDpp(DBDpp-CAR)的CAR T细胞诱导细胞内信号传导
为了评估包含DBDpp(DBDpp-CAR)的CAR启动信号转导的能力，在Jurkat细胞中稳定表达含有与萤光素酶报道基因偶联的激活的T细胞核因子(NFAT)增强子的Jurkat报道细胞系。将各种CAR构建体电穿孔到Jurkat报道细胞系中。电穿孔后24小时后，通过用荧光标记的抗FLAG单克隆抗体检测来评估CAR表达。然后将表达DBDpp-CAR的Jurkat细胞与作为CD123+(BDCM，急性骨髓性白血病，作为非限制性实施方案)肿瘤细胞共培养6小时，然后通过向细胞中加入萤光素酶测定剂(Promega)和如图18所示的相对发光单位(RLU)的定量来测量NFAT介导的信号传导。
这些数据证明，在该非限制性实施方案中，DBDpp-CAR在细胞(例如人T细胞)上表达，并且当如此表达时，可以在暴露于由DBDpp结合的靶(在这个非限制性实施方案中其为Fc-CD123)后启动细胞内信号传导级联。
实施例9.在人T细胞中表达的DBDpp-CAR产生靶结合有关的细胞因子
通过表达CAR的T细胞靶的参与(engagement)能够导致细胞因子分泌。
因此，使用Lipofectamine 3000，用第三代慢病毒包装载体(pRSV-REV，pMDLg/pRRE和pMD2.G)与编码DBDpp-CAR的pELNS载体瞬时转染293T细胞。转染后六小时，改变培养基然后在转染后30和54小时收集含有慢病毒的培养基，合并，然后离心去除细胞碎片。然后等分慢病毒，并在-80℃下保存，直到用于病毒转导。使用采用补充有40U/ml IL-2的培养基中的αCD3/CD28T细胞激活珠激活的总人PBMC进行用CAR慢病毒转导人T细胞。24小时后，将2×106个PBMC每孔接种于含有1ml培养基和3ml补充有40U/ml IL-2和硫酸鱼精蛋白的慢病毒培养基的6孔组织培养板中。然后将板在32℃以1000×g离心2小时，然后37℃孵育过夜。次日，用新鲜培养基和含慢病毒的培养基重复慢病毒转导过程。在最初的细胞激活后72小时，除去T细胞激活珠，然后在补充有100U/ml IL-2的新鲜培养基中以约0.25-0.5×106个T细胞/ml培养T细胞进行扩增。每2-3天，用另外的T细胞培养基和IL-2补充T细胞，直到它们用于最初激活后7-10天的细胞因子测定(如下所述)。
通过用96孔板中每孔25,000个非靶(K562，CD123-)或靶(BDCM，CD123+)肿瘤细胞培养25,000个转导的T细胞(激活后7天)评估响应于靶抗原表达的细胞因子产生(在此非限制性实施方案中其为CD123)。24小时后，收集培养上清液并通过ELISA评估细胞因子的产生。培养上清液在ELISA前1:5稀释。类似地，通过用96孔板中每孔25,000个非靶(K562，PD-L1-)或靶(SUDHL-1，PD-L1+)肿瘤细胞培养25,000个转导的T细胞(激活后7天)来评估响应于PD-L1靶抗原表达的细胞因子产生。24小时后，收集培养上清液并通过ELISA评估细胞因子的产生。培养上清液在ELISA前1:5稀释。
图19A证明表达结合CD123的DBDpp-CAR的T细胞在用CD123+BDCM细胞而不是CD123-细胞系K562刺激后产生干扰素γ(IFNγ)。图19B证明表达结合CD123的DBDpp-CAR的T细胞在用CD123+BDCM细胞而不是CD123-细胞系K562刺激后产生白细胞介素2(IL2)。图20A证明表达结合PD-L1的DBDpp-CAR的T细胞在用PD-L1+SUDHL-1细胞刺激而不是PD-L1-细胞系K562后产生干扰素γ(IFNγ)。图20B证明表达结合PD-L1的DBDpp-CAR的T细胞在用PD-L1+SUDHL-1细胞而不是PD-L1-细胞系K562刺激后产生白细胞介素2(IL2)。
实施例10.当与表达靶的肿瘤细胞共培养时，表达DBDpp-CAR的T细胞增殖
表达结合靶的CAR的T细胞能够在可溶性靶或表达靶的肿瘤细胞接合(engagement)后增殖。
通过在24孔板中培养用1×105个经丝裂霉素-C预处理的肿瘤细胞转导的T细胞(1×105个，激活后第10天)评估响应于表达靶抗原(其中CD123是非限制性实例)的肿瘤细胞的DBDpp-CAR转导的人T细胞的增殖。肿瘤细胞包括非靶表达K562(CD123-)，中等靶表达系KG1a和MOLM-13(CD123中等)和BDCM(CD123高)。与肿瘤细胞共培养96小时后，收集转导的T细胞并计数。该方法也用于评估响应于表达PD-L1靶抗原的肿瘤细胞的T细胞增殖。肿瘤细胞包括非靶表达K562(PD-L1-)，中等靶表达株系BDCM和H460(PD-L1中等)和SUDHL-1(PD-L1高)。培养96小时后收集细胞并计数。来自这些增殖实验的数据分别显示在图21和图21中。
图21中的直方图的条代表(从左向右移动)：DBDpp-CAR T细胞单独培养，与CD123阴性K562细胞共培养，与低水平表达CD123的KG1a细胞共培养，与低水平表达CD123的MOLM-13细胞共培养，以及与高水平表达CD123的BDCM细胞共培养。如直方图条的高度所示，当与表达CD123的细胞(以中等或高水平)孵育时，T细胞增殖相应增加。这些数据表明靶向CD123的DBDpp-CAR T细胞响应于结合CD123而增殖，其媲美于或者在一些实施方案中比靶向CD123的scFv更大程度的增殖。类似地，在图22中，直方图的条代表(从左向右移动)：PD-L1-DBDpp-CAR T细胞单独培养，与PD-L1阴性K562细胞共培养，与中等水平表达PD-L1的BDCM细胞共培养，与高水平表达PDL2的SUDHL-1细胞共培养，以及与中等水平表达PD-L1的H460细胞共培养。这些数据显示了T细胞对DBDpp的靶的反应的特异性(例如，当靶不存在时限制为不反应)。因此，如上，这些数据表明靶向PD-L1的DBDpp-CAR T细胞特异性响应于结合PD-L1而增殖。如上所讨论的，CD137，CD123和PD-L1仅仅是DBDpp能够特异性结合的靶的非限制性实例，因此能够(与T细胞，NK细胞等中的CAR结合)诱导靶-特异性免疫细胞功能。
实施例11.DBDpp-CAR转导的T细胞不显示与T细胞耗竭相关的表型
T细胞持续暴露于抗原和/或炎症信号能够导致T细胞“耗竭”，其特征在于效应器功能的丧失和多种抑制性受体如LAG-3，PD-1和TIM-3的表达。这种耗竭也可能由自发性T细胞刺激通过聚集T细胞受体的抗原非依赖性机制引起。T细胞耗竭的后果可以肿瘤控制降低，因此避免过度耗竭是使用T细胞的癌症免疫疗法中的理想属性。
为了评估表达DBDpp-CAR的T细胞中潜在的不依赖抗原的耗竭，将转导的T细胞(激活后第10天)用抗CD3抗体和T细胞耗竭标志物(LAG3，PD1和TIM3)染色。图23A概述了来自若干T细胞供体的个体实验的数据。数据表明在各种结合CD123的DBDpp-CAR T细胞中，耗竭标志物的表达没有增强。图23B显示用含有scFv的CAR(顶行)或DBDpp-CAR(在该特定实验中靶向CD123的cg06)在T细胞的初始激活之后10天转导的T细胞中的LAG-3，PD1和TIM-3表达的代表性流式细胞术数据。这些数据的相似性再次证明DBDpp-CAR T细胞不上调耗竭标志物的表达，这进一步支持其在癌症免疫治疗中的功效。
实施例12.表达DBDpp-CAR的T细胞呈现靶特异性脱颗粒和肿瘤细胞毒性
T细胞，NK细胞和许多单核细胞谱系细胞的脱颗粒(所有这些都可以根据实施方案使用)。根据细胞类型，脱颗粒可导致免疫细胞中分泌颗粒的抗微生物剂，细胞毒素或其他分子的释放。分子如穿孔素(形成孔的细胞毒素)或颗粒酶(诱导靶细胞凋亡的丝氨酸蛋白酶)有助于T细胞和NK细胞杀伤肿瘤细胞(或其他细胞类型)。
为了评估表达DBDpp-CAR的T细胞的脱颗粒，在莫能菌素和PE缀合的CD107a/LAMP1存在下，将1×105个转导的T细胞(激活后第9天)在T细胞培养基中培养4小时。将T细胞单独或在2×105个非靶肿瘤细胞(K562，其为CD123-)或表达靶的肿瘤细胞(BDCM，CD123+)的存在下培养，然后洗涤并针对CD3的表达进行染色。然后通过流式细胞术评估T细胞脱颗粒，首先对CD3+SSC低细胞(非肿瘤)进行门控，然后对CD3+CD107a+细胞进行门控。符号代表来自使用多个供体的个体实验的样品。
图24A-24D总结了这些数据。图24A显示当单独培养靶向CD123的DBDpp-CAR T细胞时，与阴性对照相当的CD107a(作为DBDpp-CAR T细胞脱颗粒的标志物)的产生。图24B显示当DBDpp-CAR T细胞与CD123阴性K562肿瘤细胞共培养时，有限的CD107a表达。图24C显示当靶向CD123的DBDpp-CAR T细胞与CD123阳性BDCM细胞共培养时显著的CD107a表达，由此表明T细胞被激活，发出信号传导，并且进行脱颗粒将导致肿瘤根除。图24D描绘来自靶向CD123的DBDpp-CAR T与CD123阳性BDCM细胞的共培养物的实验重复的数据。图25A-25D显示与表达PD-L1-DBDpp-CAR的T细胞脱颗粒有关的类似数据。这些数据不仅证明DBDpp-CAR T细胞有效地脱颗粒，这些数据进一步支持表达DBDpp-CAR的T细胞的靶依赖性激活。
实施例13.DBDpp-CAR介导的肿瘤细胞毒性是靶特异性的
表达DBDpp-CAR的人T细胞的靶特异性功能延伸至包括如图26和27所述的体外肿瘤细胞的细胞毒性。这些实验使用预先装载有荧光增强配体(BATDA)的CD123+(BDCM，急性骨髓性白血病)和CD123-(K562，慢性骨髓性白血病)肿瘤细胞。表达CD123导向的DBDpp-CAR的T细胞以各种效应物与靶(E:T)的比与肿瘤细胞一起培养2小时。使用模拟(mock)培养和用CD123导向的scFv-CAR的共培养作为对照。在另外的实验组中，PD-L1+(SU-DHL-1，大细胞淋巴瘤)和PD-L1-(K562，慢性骨髓性白血病)肿瘤细胞预先装载BATDA。表达PD-L1导向的DBDpp-CAR的T细胞与肿瘤细胞一起以不同的E:T比培养2小时。使用模拟共培养物作为对照。BATDA配体由于靶细胞的细胞裂解而释放，并且在添加铕溶液(Eu)时形成发荧光并且稳定的螯合物，其使用Synergy 2(Biotek)时间分辨荧光计测量。
图26A-26D和27A-27F总结了来自这些实验的数据。图26A显示靶向CD123的DBDpp-CAR T细胞与K562细胞(无CD123表达)的共培养产生的杀伤百分比小于模拟共培养对照。相比之下，图26B证明与模拟共培养对照相比，并且，对于一些DBDpp，与用scFv靶向CD123的T细胞相比，表达靶向CD123的DBDpp-CAR的T细胞组中的每一组T细胞都更有效地杀伤CD123阳性肿瘤细胞。图26C和26D描绘了来自分开供体的细胞的类似数据。
作为另一实例，图27A-27F显示了PD-L1导向的DBDpp-CAR T细胞的杀伤百分比。如上所讨论的，当与不表达PD-L1的细胞共培养时，检测到的细胞毒性有限或没有(27A，27C，27E)。然而，当与确实表达靶标志物PD-L1的细胞共培养时，测得存在细胞毒性并且远远超过模拟共培养对照(27B，27D，27F)中检测到的细胞毒性。这些数据扩展了表达DBDpp的T细胞的功能属性，包括靶特异性肿瘤细胞杀伤。
实施例14.DBDpp结构域可以被去免疫并保留功能
许多疗法在提供有效的治疗同时有可能导致不良的副作用。在一些情况下，患者可能对治疗剂(无论是基于药物还是基于细胞)具有免疫反应。因为本文公开的DBDpp是非人蛋白质，所以进行计算机分析以鉴定潜在的免疫原性表位并消除它们而不损害DBDpp的功能特性。
cg06的氨基酸序列(SEQ ID NO:99)的计算机分析鉴定了与高亲和力(结合阈值小于6％)和混杂(存在大于50％相关等位基因)T细胞表位(Singh，Bioinformatics 17:1236-1237，2012)共享特征的三个9氨基酸序列。cg06内的特定氨基酸置换被鉴定为减少预测的T细胞表位的数字。将相应的点突变引入cg06中，单独或组合，产生一系列“去免疫”的DBDpp-CAR。
DBDpp(cg06)的三维模型显示在图28A中。图28B描绘了具有(三个中的)一个潜在免疫原性表位经修饰以具有较低的潜在免疫原性的cg06。图28C描绘了具有(三个中的)两个经修饰的潜在免疫原性表位的cg06。图28D描绘了具有所有三个经修饰的潜在免疫原性表位的cg06。
用这些去免疫化的DBDpp-CAR电穿孔Jurkat报道细胞。培养24小时后，用抗FLAG单克隆抗体染色评估Jurkat细胞上的CAR表达。将细胞与CD123+靶肿瘤细胞(具有低水平CD123表达的KG1a和具有高水平CD123表达的BDCM)共培养6小时。通过向细胞中加入萤光素酶测定剂(Promega)和相对发光单位(RLU)的定量来测量NFAT介导的信号传导。
来自这些实验的数据显示在图29A-29B中。图29A证明了当与CD123阳性BDCM细胞共培养时，去免疫化的结合CD123的DBDpp-CAR(cg06-1至cg06-6)诱导NFAT信号传导。图29B进一步证明，当与具有较低CD123表达(KG1a)的细胞共培养时，结合CD123的DBDpp-CAR也诱导NFAT信号传导-注意与图29A相比降低的RLU水平。总之，这些数据表明，可以通过DBDpp中不改变DBDpp的功能或CAR介导的细胞内信号传导的靶密度依赖性的特定氨基酸残基置换降低靶结合DBDpp的免疫原性潜力——靶呈递的程度越大，反应的程度就越大。这些数据还表明根据本文公开的若干实施方案的DBDpp可以用作治疗剂，并且如果需要，可以进行修饰以降低针对含有DBDpp-CAR的细胞(例如T细胞，NK细胞等)的免疫应答的可能性。
实施例15.双特异性DBDpp
在一些情况下，靶细胞(例如肿瘤细胞)可以表达多于一个的标志物。在一些实施方案中，DBD-CAR靶向靶细胞上的单个标志物(例如，独特的癌细胞标志物)。然而，在一些实施方案中，某些标志物不是癌细胞独特的，而是也在正常细胞上表达(尽管可能表达水平不同)。因此，在若干实施方案中，通过改造CAR以表达双特异性DBDpp，靶向两种标志物提供了增加免疫治疗剂特异性的机会。在这样的实施方案中，被最有效杀伤的靶细胞将是那些同时表达由DBDpp靶向的两种标志物的那些细胞(尽管可能仍然会发生杀伤表达标志物中的一种或另一种的细胞的情况)。为了测试这种方法，在Jurkat细胞上表达双特异性DBDpp-CAR，并且测量响应表达一个或两个靶的肿瘤细胞的细胞内信号传导。
图30A-30B定义了分别在K562(CML)；KG-1a(AML)；BDCM(AML)；SU-DHL-1(LCL)和H460(肺癌)细胞系上CD123和PD-L1的细胞表面表达。相对于在CD123阴性细胞SU-DHL和H460上观察到的高PD-L1表达，K562不表达任一靶，而KG1a和BDCM表达CD123和低水平的PD-L1。这些细胞系提供机会来确定是否可以通过包含与对PD-L1具有特异性的第二DBDpp(pb04)融合的cg06(抗CD123)的双特异性CAR来增强结合CD123的DBDpp-CAR(cg06)的细胞内信号传导。图31A证明，如通过与CAR结合的抗FLAG mAb所评估的，仅包含仅cg06(图31A)，仅pb04(图31B)，与pb04的N末端融合的cg06(cg06-pb04，图31C)和与cg06的N末端融合的pb04(9pb-04-cg06，图31D)的DBDpp-CAR可以在Jurkat NFAT报道细胞系中转导并表达。通过将各种CAR与具有不同CD123和/或PD-L1表达水平的肿瘤细胞共培养评估单特异性和双特异性CAR激活NFAT途径的能力。将细胞与靶细胞共培养6小时。通过向细胞中加入萤光素酶测定剂(Promega)并相对发光单位(RLU)的定量作为诱导的细胞内信号的量度来测量NFAT介导的信号传导。
图31E描绘了这个实验的结果。最左边的一组条和直方图显示了cg06 DBDpp针对各种细胞类型的相对杀伤效应。用这种DBDpp-CAR与高CD123+BDCM共培养后的信号传导反应最大。右边的下一组描绘了显示pb04 DBDpp针对相同细胞类型共培养后细胞内信号传导的数据。信号传导在BDCM中最高，其次是SUHDL1和H460(参考图30A-30B，这些是CD123和PD-L1表达最高的细胞系)。右边的下一组描绘了显示双特异性cg06-pb04 DBDpp(cg06比pb04更加远离T细胞膜)的细胞内信号传导的数据。最后，最右侧的组显示来自第二个双特异性DBPpp(pb04-cg06 DBDpp，其中pb04比cg06更远离T细胞膜)的细胞内信号传导。这两个组表明双特异性DBDpp-CAR确实起到促进细胞内信号传导的作用。根据若干实施方案，双特异性DBDpp-CAR显示增强的活性(BDCM细胞在pb04-cg06组中的细胞内信号传导的量级大于仅单独考虑pb04 DBDpp的量级)。因此，在若干实施方案中，包含两个DBDpp的DBDpp-CAR可协作以增强T细胞功能。在若干实施方案中，在双特异性(或其他多聚体)DBDpp-CAR中使用的各种DBDpp之间存在协同作用。
实施例16.DBDpp介导的肿瘤体内免疫治疗
在若干实施方案中，表达DBDpp-CAR的细胞在体内有效产生肿瘤细胞毒性。将进行其中癌症标志物特异性DBDpp-CAR在T细胞(或在其他实验中为NK细胞)表面上表达的实验。将使用小鼠模型，其中小鼠被基因工程改造以表达实体瘤或悬浮肿瘤，其中肿瘤细胞表达特定DBDpp-CAR针对的癌症标志物。用不表达靶向标志物的肿瘤的对照小鼠将用作对照，以及接受安慰剂T细胞治疗剂的小鼠也将用作对照。
将DBDpp-CAR细胞施用给小鼠，并随着时间评估接受各种DBDpp-CAR的小鼠的肿瘤负荷。将通过确定的方法(例如，体内成像)评估肿瘤负荷，并随时间评估死亡率。
作为接收靶特异性DBD-pp-CAR细胞的结果，在表达DBDpp特异性靶向的标志物的小鼠中肿瘤负荷将降低。与接受安慰剂的小鼠相比，这种降低将是显著的。同样，与接收具有不表达DBDpp特异性靶向的标志物的肿瘤细胞的那些小鼠相比，这种降低将是显著的。此外，与安慰剂组和具有不表达特异性靶标志物的小鼠组相比，接受靶特异性DBDpp-CAR的小鼠的死亡率会降低。该实验的结果将证明表达DBDpp-CAR的免疫细胞是有效的治疗剂并且在体内产生肿瘤细胞的靶特异性细胞毒性。
实施例17.DBDpp介导的肿瘤体内免疫治疗
如上文所讨论的，表达DBDpp-CAR的细胞在体内有效产生肿瘤细胞毒性。将进行其中癌症标志物特异性DBDpp-CAR在T细胞(或在其他实验中为NK细胞)表面上表达的实验。临床试验将证明DBDpp-CAR细胞的安全性。将进行另外的试验以将DBDpp-CAR细胞施用给患有表达DBDpp特异性靶向的标志物的肿瘤的人。
根据本领域的普通技术，DBDpp-CAR细胞将按照待测定的时间表施用。随着时间的推移将评估肿瘤进展，肿瘤负荷和死亡率。
作为接收靶特异性DBDpp-CAR细胞的结果，肿瘤进展将减缓并且整体肿瘤负荷将降低。与使用常规抗癌技术例如化学疗法或放射疗法的历史数据相比，这种降低将是显著的。与此类疗法相比，死亡率也会下降。将会有有限的脱靶细胞毒作用。该试验的结果将证明表达DBDpp-CAR的免疫细胞是有效的治疗剂并且在体内产生肿瘤细胞的靶特异性细胞毒性。
实施例18：竞争性抑制测定定义包含不同氨基酸序列的DBDpp的靶表位特异性
DBDpp可以通过各种结构和功能特性来定义，包括但不限于一级氨基酸序列，pI，熔点，靶特异性，结合亲和力和靶表位特异性。可以使用竞争性测定形式将第一DBDpp的靶表位特异性与第二DBDpp的靶表位特异性进行比较，其中在递增浓度的第二DBDpp存在下进行固定浓度的第一DBDpp与靶的结合。如果第一和第二DBDpp结合如氨基酸序列或空间上所限定的相同的表位或部分重叠的表位，则第二DBDpp将抑制(例如竞争)第一DBDpp与靶的结合。但是，如果第二DBDpp没有抑制第一DBDpp的结合，那么第二DBDpp结合不同的表位。该测定形式用于评估结合PD-L1的DBDpp(pb04)抑制第二结合PD-L1的DBDpp(pb06)的固定浓度(11.1皮摩尔/孔)的结合的能力。图32显示了可溶性pb04对可溶性加FLAG标签的pb06结合至FC-PD-L1的浓度依赖性抑制，其中pb04的IC50浓度为19皮摩尔/孔。因此，即使它们的一级氨基酸序列不同(SEQ ID NO:182和184)，pb04和pb06仍显示出共享的表位结合。该测定形式容易被改编于表征DBDpp抑制配体与DBDpp靶结合的能力。
实施例19：靶向CD123的DBDpp的产生和选择
根据以上公开的方法的若干实施方案，SEQ ID NO:1的参考序列在多个位置被修饰。在一个实验中，修饰产生对应于SEQ ID NO:6的DBDpp文库。显示对CD123的特异性的DBDpp的非限制性实例由SEQ ID NO:60-69的序列表示。
在另外的实验中，修饰产生对应于SEQ ID NO:2的DBDpp文库。显示对CD123的特异性的DBDpp的非限制性实例由SEQ ID NO:70-91的序列表示。
在另外的实验中，修饰产生对应于SEQ ID NO:4的DBDpp文库。显示对CD123的特异性的DBDpp的非限制性实例由SEQ ID NO:92-127的序列表示。
在根据本文公开的方法产生的任何文库中，取决于实施方案，在文库序列中的任何Xn位置可以被天然或非天然氨基酸置换。在一些实施方案中，半胱氨酸和/或脯氨酸不用于这样的置换。
实施例20：去免疫的靶向CD123的DBDpp的产生和选择
根据以上公开的方法的若干实施方案，SEQ ID NO:1的参考序列在多个位置被修饰。在一个实验中，修饰产生对应于SEQ ID NO:4的DBDpp文库。根据本文公开的方法，通过鉴定和修饰潜在的免疫原性残基，鉴定并去免疫所选择的文库成员。在该实验中，用S65E置换修饰SEQ ID NO:99的DBDpp得到SEQ ID NO:130，表现出降低的免疫原性。
实施例21：靶向CD123的DBDpp的去免疫
根据本文公开的方法产生并鉴定了SEQ ID NO:99的DBDpp。进一步修饰以降低DBDpp的潜在免疫原性。在该实验中，进行R17Q置换得到SEQ ID NO:128的DBDpp。此外，进行S24E置换得到SEQ ID NO:129的DBDpp。而且，根据若干实施方案，可以进行多个去免疫置换。例如，对SEQ ID NO:99进行以下修饰：(i)用R17Q，S24E置换得到SEQ ID NO:131的DBDpp，(ii)用R17Q，S24T置换得到SEQ ID NO:132的DBDpp，(iii)用R17Q，S24G置换得到SEQID NO:133的DBDpp，(iv)用R17Q，S24E，S65E置换得到SEQ ID NO:134的DBDpp，(v)用R17Q，S24T，S65E置换得到SEQ ID NO:135的DBDpp和用R17Q，S24G，S65E置换得到SEQ ID NO:136的DBDpp。
实施例22：靶向CD19的DBDpp的产生和选择
根据以上公开的方法的若干实施方案，SEQ ID NO:1的参考序列在多个位置被修饰。在一个实验中，修饰产生对应于SEQ ID NO:6的DBDpp文库。显示对CD19的特异性的DBDpp的非限制性实例由SEQ ID NO:137的序列表示。
在另外的实验中，修饰导致对应于SEQ ID NO:4的DBDpp文库。显示对CD19的特异性的DBDpp的非限制性实例由SEQ ID NO:138-166的序列表示。
在根据本文公开的方法产生的任何文库中，取决于实施方案，在文库序列中的任何Xn位置可以被天然或非天然氨基酸置换。在一些实施方案中，半胱氨酸和/或脯氨酸不用于这样的置换。
实施例23：靶向CD22的DBDpp的产生和选择
根据以上公开的方法的若干实施方案，SEQ ID NO:1的参考序列在多个位置被修饰。在一个实验中，修饰产生对应于SEQ ID NO:2的DBDpp文库。表现出对CD22的特异性的DBDpp的非限制性实例由SEQ ID NO:167-168的序列表示。
在另外的实验中，修饰产生对应于SEQ ID NO:4的DBDpp文库。显示对CD22的特异性的DBDpp的非限制性实例由SEQ ID NO:169-176的序列表示。
在根据本文公开的方法产生的任何文库中，取决于实施方案，文库序列中的任何Xn位置可以被天然或非天然氨基酸置换。在一些实施方案中，半胱氨酸和/或脯氨酸不用于这样的置换。
实施例24：靶向DR5的DBDpp的产生和选择
根据以上公开的方法的若干实施方案，SEQ ID NO:1的参考序列在多个位置被修饰。在一个实验中，修饰产生对应于SEQ ID NO:6的DBDpp文库。显示对DR5的特异性的DBDpp的非限制性实例由SEQ ID NO:177-178的序列表示。
在另外的实验中，修饰产生对应于SEQ ID NO:2的DBDpp文库。显示对DR5的特异性的DBDpp的非限制性实例由SEQ ID NO:179的序列表示。
在另外的实验中，修饰产生对应于SEQ ID NO:4的DBDpp文库。显示对DR5的特异性的DBDpp的非限制性实例由SEQ ID NO:180的序列表示。
在根据本文公开的方法产生的任何文库中，取决于实施方案，在文库序列中的任何Xn位置可以被天然或非天然氨基酸置换。在一些实施方案中，半胱氨酸和/或脯氨酸不用于这样的置换。
实施例25：靶向PD-L1的DBDpp的产生和选择
根据以上公开的方法的若干实施方案，SEQ ID NO:1的参考序列在多个位置被修饰。在一个实验中，修饰产生对应于SEQ ID NO:4的DBDpp文库。显示对PD-L1特异性的DBDpp的非限制性实例由SEQ ID NO:181-186的序列表示。
在根据本文公开的方法产生的任何文库中，取决于实施方案，在文库序列中的任何Xn位置可以被天然或非天然氨基酸置换。在一些实施方案中，半胱氨酸和/或脯氨酸不用于这样的置换。
所引用的所有出版物，专利，专利申请，互联网网站和登录号/数据库序列(包括多核苷酸和多肽序列二者)出于所有目的通过引用整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物，专利，专利申请，互联网站点或登录号/数据库序列被具体地和单独地指示为通过引用而被合并。
可以想到的是，可以进行上面公开的实施方案的具体特征和方面的各种组合或子组合，并且仍然落入一个或多个本发明内。此外，本文关于实施方案的任何特定特征，方面，方法，性质，特性，质量，属性，元素等的公开内容可以用于本文阐述的所有其他实施方案中。因此，应当理解的是，所公开的实施方案的各种特征和方面可以彼此组合或替代以便形成所公开发明的不同模式。因此，这里所公开的本发明的范围意图不应被上述具体公开的实施方案所限制。而且，尽管本发明容许各种修改和替代形式，但其具体实例已经在附图中示出并且在本文中被详细描述。然而，应该理解的是，本发明不限于所公开的特定形式或方法，相反，本发明覆盖落入各种实施方案以及所附权利要求书的精神和范围内的所有修改，等同物和替代方案。本文公开的任何方法不需要以所述的顺序进行。本文公开的方法包括从业者采取的某些行动；但是，它们也可以包括任何第三方对这些行为的指示，无论是明示还是暗示。例如，诸如“施用包含DBDpp-CAR的T细胞”的行为包括“指示施用包含DBDpp-CAR的T细胞”。另外，在本公开的特征或方面根据马库什组进行描述的情况下，本领域的技术人员将认识到，本公开还由此被描述为马库什组的任何单个成员或亚组成员。
本文公开的范围还涵盖任何和所有重叠，子范围及其组合。诸如“至多”，“至少”，“大于”，“小于”，“之间”等的语言包括所列举的数字。在诸如“约”或“近似”之类的术语之前的数字包括所列举的数字。例如，“约10纳米”包括“10纳米”。
序列表
<110> Subdomain, LLC
Arcellx, Inc.
LaFleur, David W
Hilbert, David M
<120> 含有从头结合结构域的多肽及其用途
<130> ENC.002WO2
<140> 未知
<141> 2016-03-03
<150> 62/143,772
<151> 随附
<160> 187
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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Met Gly Ser Trp Xaa Glu Phe Xaa Xaa Arg Leu Xaa Ala Ile Xaa Xaa
1 5 10 15
Arg Leu Xaa Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Xaa Leu Arg Xaa Xaa Ala Ala Xaa Ile Arg
50 55 60
Xaa Xaa Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 5
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(6)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(10)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(17)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (32)..(33)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (36)..(36)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (39)..(40)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (43)..(43)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (55)..(55)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (58)..(59)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (62)..(62)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (65)..(66)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<400> 5
Met Gly Ser Trp Xaa Xaa Phe Lys Xaa Xaa Leu Ala Xaa Ile Lys Xaa
1 5 10 15
Xaa Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Xaa
20 25 30
Xaa Glu Ile Xaa Ala Phe Xaa Xaa Glu Leu Xaa Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Xaa Leu Arg Xaa Xaa Ala Ala Xaa Ile Arg
50 55 60
Xaa Xaa Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 6
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(9)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(16)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (19)..(19)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (30)..(30)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (33)..(34)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (37)..(37)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (40)..(41)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (44)..(44)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (57)..(58)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (61)..(61)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (64)..(65)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (68)..(68)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<400> 6
Met Gly Ser Trp Xaa Glu Phe Xaa Xaa Arg Leu Xaa Ala Ile Xaa Xaa
1 5 10 15
Arg Leu Xaa Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Xaa Phe Glu
20 25 30
Xaa Xaa Ile Ala Xaa Phe Glu Xaa Xaa Leu Gln Xaa Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Xaa Xaa Glu Ala Xaa Ala Ile Xaa
50 55 60
Xaa Glu Leu Xaa Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 7
<211> 68
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(6)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(10)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(17)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸
<220>
<221> VARIANT
<222> (22)..(22)
<223> Xaa是20-30个天然和/或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (28)..(28)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (31)..(32)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (35)..(35)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (38)..(39)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是任意天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (44)..(44)
<223> Xaa是20-30个天然和/或非天然氨基酸残基
<400> 7
Met Gly Ser Trp Xaa Xaa Phe Lys Xaa Xaa Leu Ala Xaa Ile Lys Xaa
1 5 10 15
Xaa Leu Glu Ala Leu Xaa Glu Ala Glu Leu Ala Xaa Phe Glu Xaa Xaa
20 25 30
Ile Ala Xaa Phe Glu Xaa Xaa Leu Gln Xaa Tyr Xaa Asn Pro Glu Val
35 40 45
Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg Asp Glu Leu Gln Ala
50 55 60
Tyr Arg His Asn
65
<210> 8
<211> 68
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (22)..(22)
<223> Xaa是2-30个天然和/或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (30)..(31)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (34)..(34)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (37)..(38)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (41)..(41)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (44)..(44)
<223> Xaa是2-30个天然和/或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (52)..(53)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (56)..(56)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (59)..(60)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (63)..(63)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<400> 8
Met Gly Ser Trp Ala Glu Phe Lys Gln Arg Leu Ala Ala Ile Lys Thr
1 5 10 15
Arg Leu Glu Ala Leu Xaa Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Xaa Xaa Glu
20 25 30
Ile Xaa Ala Phe Xaa Xaa Glu Leu Xaa Ala Tyr Xaa Asn Pro Glu Val
35 40 45
Glu Ala Leu Xaa Xaa Glu Ala Xaa Ala Ile Xaa Xaa Glu Leu Xaa Ala
50 55 60
Tyr Arg His Asn
65
<210> 9
<211> 68
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(9)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(16)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (19)..(19)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (22)..(22)
<223> Xaa是2-30个天然和/或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (44)..(44)
<223> Xaa是2-30个天然和/或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (50)..(50)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (53)..(54)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (57)..(57)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (60)..(61)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<400> 9
Met Gly Ser Trp Xaa Glu Phe Xaa Xaa Arg Leu Xaa Ala Ile Xaa Xaa
1 5 10 15
Arg Leu Xaa Ala Leu Xaa Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu Lys Glu
20 25 30
Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Xaa Asn Pro Glu Val
35 40 45
Glu Xaa Leu Arg Xaa Xaa Ala Ala Xaa Ile Arg Xaa Xaa Leu Gln Ala
50 55 60
Tyr Arg His Asn
65
<210> 10
<211> 68
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(6)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (9)..(10)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (13)..(13)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (16)..(17)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (22)..(22)
<223> Xaa是2-30个天然和/或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (30)..(31)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (34)..(34)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (37)..(38)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (41)..(41)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (44)..(44)
<223> Xaa是2-30个天然和/或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (50)..(50)
<223> Xaa a natural and/or non-natural amino acid residue
<220>
<221> VARIANT
<222> (53)..(54)
<223> Xaa a natural and/or non-natural amino acid residue
<220>
<221> VARIANT
<222> (57)..(57)
<223> Xaa a natural and/or non-natural amino acid residue
<220>
<221> VARIANT
<222> (60)..(61)
<223> Xaa a natural and/or non-natural amino acid residue
<400> 10
Met Gly Ser Trp Xaa Xaa Phe Lys Xaa Xaa Leu Ala Xaa Ile Lys Xaa
1 5 10 15
Xaa Leu Glu Ala Leu Xaa Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Xaa Xaa Glu
20 25 30
Ile Xaa Ala Phe Xaa Xaa Glu Leu Xaa Ala Tyr Xaa Asn Pro Glu Val
35 40 45
Glu Xaa Leu Arg Xaa Xaa Ala Ala Xaa Ile Arg Xaa Xaa Leu Gln Ala
50 55 60
Tyr Arg His Asn
65
<210> 11
<211> 68
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (5)..(5)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (8)..(9)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (12)..(12)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (15)..(16)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (19)..(19)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (22)..(22)
<223> Xaa是2-30个天然和/或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (28)..(28)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (31)..(32)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (35)..(35)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (38)..(39)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (42)..(42)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (44)..(44)
<223> Xaa是2-30个天然和/或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (52)..(53)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (56)..(56)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (59)..(60)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<220>
<221> VARIANT
<222> (63)..(63)
<223> Xaa是天然或非天然氨基酸残基
<400> 11
Met Gly Ser Trp Xaa Glu Phe Xaa Xaa Arg Leu Xaa Ala Ile Xaa Xaa
1 5 10 15
Arg Leu Xaa Ala Leu Xaa Glu Ala Glu Leu Ala Xaa Phe Glu Xaa Xaa
20 25 30
Ile Ala Xaa Phe Glu Xaa Xaa Leu Gln Xaa Tyr Xaa Asn Pro Glu Val
35 40 45
Glu Ala Leu Xaa Xaa Glu Ala Xaa Ala Ile Xaa Xaa Glu Leu Xaa Ala
50 55 60
Tyr Arg His Asn
65
<210> 12
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 12
Met Gly Ser Trp Val Glu Phe Gly His Arg Leu Trp Ala Ile Asp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Lys Leu Arg Gln Arg Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
Phe Arg Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 13
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 13
Met Gly Ser Trp Val Glu Phe Ala Asn Arg Leu Trp Ala Ile Asp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Phe Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu His Leu Arg Asp Gln Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
His Lys Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 14
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 14
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Arg His Arg Leu Trp Ala Ile Asp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Gly Leu Arg Glu Ala Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
Ala Lys Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 15
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 15
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Ser Met Arg Leu Trp Ala Ile Asp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Ala Lys Ala Ala Tyr Ile Arg
50 55 60
Trp Lys Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 16
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 16
Met Gly Ser Trp Phe Glu Phe Asn His Arg Leu Trp Ala Ile Asn Glu
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Arg Leu Arg Ser Met Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
Tyr Lys Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 17
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 17
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Gly His Arg Leu Trp Ala Ile Asp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Tyr Leu Arg Glu Thr Ala Ala His Ile Arg
50 55 60
Thr Arg Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 18
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 18
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe His Tyr Arg Leu His Ala Ile Asp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Glu Leu Arg Ile Lys Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
Asp Arg Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 19
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 19
Met Gly Ser Trp Ala Glu Phe Lys Gln Arg Leu Ala Ala Ile Lys Thr
1 5 10 15
Arg Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Leu
20 25 30
Gly Glu Ile Trp Ala Phe Glu Met Glu Leu Ala Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Gly Arg Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Met Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 20
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Asp Leu Arg Leu His Ala Ile Tyr Asp
1 5 10 15
Arg Leu Val Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Arg Asp Asn Ala Ala Tyr Ile Arg
50 55 60
Gln Met Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 21
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 21
Met Gly Ser Trp Thr Glu Phe Thr Tyr Arg Leu Ser Ala Ile Glu Trp
1 5 10 15
Arg Leu Trp Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Trp Phe Glu
20 25 30
Gln Lys Ile Ala Phe Phe Glu Asp Phe Leu Gln Tyr Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Lys His Glu Ala Gly Ala Ile Leu
50 55 60
Asn Glu Leu Met Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 22
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 22
Met Gly Ser Trp Ala Glu Phe Asp His Arg Leu His Ala Ile Arg Glu
1 5 10 15
Arg Leu His Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Arg Gly Asn Ala Ala Tyr Ile Arg
50 55 60
Ala Leu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 23
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 23
Met Gly Ser Trp Thr Glu Phe Val Gly Arg Leu Ala Ala Ile Glu Phe
1 5 10 15
Arg Leu Trp Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Trp Phe Glu
20 25 30
Ala His Ile Ala Phe Phe Glu Asp Tyr Leu Gln Trp Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Glu Glu Ala Gly Ala Ile Met
50 55 60
Glu Glu Leu Lys Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 24
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 24
Met Gly Ser Trp Thr Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Glu Ala Ile Trp Val
1 5 10 15
Arg Leu Gln Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Met Phe Glu
20 25 30
Asp Arg Ile Ala His Phe Glu Trp Phe Leu Gln Gln Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu His Glu Glu Ala Ile Ala Ile Arg
50 55 60
Lys Glu Leu Ala Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 25
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Met Gly Ser Trp His Glu Phe His Asp Arg Leu Gln Ala Ile His Glu
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ser Leu Arg Ile Ala Ala Ala His Ile Arg
50 55 60
Gln Val Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 26
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Met Gly Ser Trp Asn Tyr Phe Lys Asp His Leu Ala Trp Ile Lys Asn
1 5 10 15
Ser Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala His Phe Glu
20 25 30
Thr Ala Ile Ala Ser Phe Glu Arg Gln Leu Gln Glu Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 27
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Met Gly Ser Trp Leu Tyr Phe Lys Glu His Leu Ala His Ile Lys Ala
1 5 10 15
Trp Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala His Phe Glu
20 25 30
Leu Ala Ile Ala Asp Phe Glu Tyr His Leu Gln Glu Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 28
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 28
Met Gly Ser Trp Val Tyr Phe Lys Glu His Leu Ala Trp Ile Lys Thr
1 5 10 15
Glu Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala His Phe Glu
20 25 30
His Ser Ile Ala Asp Phe Glu Met Ser Leu Gln Phe Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 29
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 29
Met Gly Ser Trp Phe Tyr Phe Lys Gln His Leu Ala Trp Ile Lys Ser
1 5 10 15
Tyr Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala His Phe Glu
20 25 30
Arg Ala Ile Ala Ala Phe Glu Gln His Leu Gln Met Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 30
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 30
Met Gly Ser Trp His Tyr Phe Lys Asp His Leu Ala Glu Ile Lys Gly
1 5 10 15
Leu Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala His Phe Glu
20 25 30
Met Ala Ile Ala Asp Phe Glu His Asn Leu Gln Tyr Tyr Lys Gly Lys
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Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 31
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 31
Met Gly Ser Trp His Tyr Phe Lys Gly His Leu Ala Glu Ile Lys Asn
1 5 10 15
His Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala His Phe Glu
20 25 30
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Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
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65 70
<210> 32
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 32
Met Gly Ser Trp Ile Tyr Phe Lys Glu His Leu Ala Tyr Ile Lys Lys
1 5 10 15
Glu Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala His Phe Glu
20 25 30
Ser Ala Ile Ala Val Phe Glu Ser Thr Leu Gln Tyr Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 33
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 33
Met Gly Ser Trp Thr Tyr Phe Lys Glu His Leu Ala Glu Ile Lys Tyr
1 5 10 15
Met Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala His Phe Glu
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Val Ala Ile Ala Asp Phe Glu Lys Met Leu Gln Tyr Tyr Lys Gly Lys
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Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 34
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 34
Met Gly Ser Trp Trp Leu Phe Lys Asp His Leu Ala Glu Ile Lys Thr
1 5 10 15
Ala Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala His Phe Glu
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Met Ala Ile Ala Ala Phe Glu Lys Gln Leu Gln Tyr Tyr Lys Gly Lys
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Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 35
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 35
Met Gly Ser Trp Ser Glu Phe Tyr Asn Arg Leu Asp Ala Ile Glu Ser
1 5 10 15
Arg Leu Leu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Leu Phe Glu
20 25 30
Ile Gln Ile Ala Arg Phe Glu Lys Val Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Gly Glu Ala Arg Ala Ile Phe
50 55 60
Ala Glu Leu Tyr Ala Tyr Arg His Asn
65 70
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 36
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Tyr Asn Arg Leu Tyr Ala Ile Glu Ile
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
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50 55 60
Val Ile Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 37
Met Gly Ser Trp Leu Trp Phe Lys Ile Phe Leu Ala Glu Ile Lys Tyr
1 5 10 15
Phe Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Asp
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Phe Glu Ile His Ala Phe His Val Glu Leu Phe Ala Tyr Lys Gly Lys
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50 55 60
Trp Asp Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 38
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 38
Met Gly Ser Trp Thr Glu Phe Gln Ser Arg Leu Asp Ala Ile His Ser
1 5 10 15
Arg Leu Arg Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
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50 55 60
His Phe Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 39
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 39
Met Gly Ser Trp Gln Glu Phe Asp Asp Arg Leu Asn Ala Ile Lys Ala
1 5 10 15
Arg Leu Gln Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Asp Leu Arg Asp Asp Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
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65 70
<210> 40
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 40
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Gln Asn Arg Leu His Ala Ile His Glu
1 5 10 15
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20 25 30
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Gly Asn Pro Glu Val Glu Leu Leu Arg Asp Asp Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
His Phe Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 41
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 41
Met Gly Ser Trp Phe Glu Phe Gln Asp Arg Leu Thr Ala Ile Asn Glu
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Thr Leu Arg Ser Asp Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
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65 70
<210> 42
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 42
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Glu Ser Arg Leu Asp Ala Ile His Glu
1 5 10 15
Arg Leu His Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Asn Leu Arg Gly Asp Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
His Phe Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 43
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 43
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Asn His Arg Leu Asp Ala Ile Ser Lys
1 5 10 15
Arg Leu Asn Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Glu Leu Arg Gly Asp Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
His Phe Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 44
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 44
Met Gly Ser Trp Phe Glu Phe Glu Asn Arg Leu His Ala Ile Val His
1 5 10 15
Arg Leu Gly Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
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Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
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Gly Asn Pro Glu Val Glu Thr Leu Arg Ala Asp Ala Ala Phe Ile Arg
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65 70
<210> 45
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Met Gly Ser Trp Val Val Phe Lys Val Asp Leu Ala Thr Ile Lys Tyr
1 5 10 15
Ile Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Glu Phe Glu
20 25 30
Gly Glu Ile Ala Gly Phe Glu Tyr Ser Leu Gln Phe Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 46
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Met Gly Ser Trp Thr Ile Phe Lys Glu Trp Leu Ala Phe Ile Lys Thr
1 5 10 15
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Gly Trp Ile Ala Ser Phe Glu Met Glu Leu Gln Lys Tyr Lys Gly Lys
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65 70
<210> 47
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Met Gly Ser Trp Val Met Phe Lys Trp Leu Leu Ala Asp Ile Lys Ser
1 5 10 15
His Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Phe Phe Glu
20 25 30
Gly Phe Ile Ala Ala Phe Glu Thr His Leu Gln Val Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 48
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 48
Met Gly Ser Trp Tyr Ala Phe Lys Asp Tyr Leu Ala Asp Ile Lys Gly
1 5 10 15
Trp Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Phe Phe Glu
20 25 30
Ile Phe Ile Ala Arg Phe Glu Leu Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
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Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 49
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 49
Met Gly Ser Trp Ala Glu Phe Lys Gln Arg Leu Ala Ala Ile Lys Thr
1 5 10 15
Arg Leu Gln Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 50
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Leu Ala Ala Ile Lys Thr Arg Leu Gln
1 5
<210> 51
<211> 84
<212> PRT
<213> 智人
<400> 51
Met Gly Ser Trp Val Glu Phe Gly His Arg Leu Trp Ala Ile Asp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Lys Leu Arg Gln Arg Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
Phe Arg Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn Gly Gly Gly Gly Ser His His
65 70 75 80
His His His His
<210> 52
<211> 84
<212> PRT
<213> 智人
<400> 52
Met Gly Ser Trp Val Glu Phe Ala Asn Arg Leu Trp Ala Ile Asp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Phe Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
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Gly Asn Pro Glu Val Glu His Leu Arg Asp Gln Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
His Lys Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn Gly Gly Gly Gly Ser His His
65 70 75 80
His His His His
<210> 53
<211> 84
<212> PRT
<213> 智人
<400> 53
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Arg His Arg Leu Trp Ala Ile Asp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
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Gly Asn Pro Glu Val Glu Gly Leu Arg Glu Ala Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
Ala Lys Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn Gly Gly Gly Gly Ser His His
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His His His His
<210> 54
<211> 84
<212> PRT
<213> 智人
<400> 54
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Ser Met Arg Leu Trp Ala Ile Asp Gln
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
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Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
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Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Ala Lys Ala Ala Tyr Ile Arg
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Trp Lys Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn Gly Gly Gly Gly Ser His His
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His His His His
<210> 55
<211> 84
<212> PRT
<213> 智人
<400> 55
Met Gly Ser Trp Phe Glu Phe Asn His Arg Leu Trp Ala Ile Asn Glu
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Gly Asn Pro Glu Val Glu Arg Leu Arg Ser Met Ala Ala Phe Ile Arg
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<210> 56
<211> 84
<212> PRT
<213> 智人
<400> 56
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Gly His Arg Leu Trp Ala Ile Asp Gln
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<213> 智人
<400> 57
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<213> 智人
<400> 58
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<213> 智人
<400> 59
Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp
50 55 60
Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu
65 70 75 80
Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp
85 90 95
Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro
100 105 110
Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys Ser Val Leu Val Asn Gly Thr
115 120 125
Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala Pro Ala Arg Glu Pro Gly His
145 150 155 160
Ser Pro Gln Asp Ile Glu Gly Arg Met Asp Lys Ser Cys Asp Lys Thr
165 170 175
His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser
180 185 190
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
195 200 205
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
210 215 220
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
225 230 235 240
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
245 250 255
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
260 265 270
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr
275 280 285
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
290 295 300
Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
305 310 315 320
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
325 330 335
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
340 345 350
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
355 360 365
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
370 375 380
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
385 390 395 400
His His His His His His
405
<210> 60
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 60
Met Gly Ser Trp Ile Glu Phe Glu Asp Arg Leu Asp Ala Ile Thr Asp
1 5 10 15
Arg Leu Trp Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Glu Phe Glu
20 25 30
His Gln Ile Ala Phe Phe Glu Glu Asp Leu Gln Trp Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu His Met Glu Ala Glu Ala Ile Met
50 55 60
Glu Glu Leu Gly Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 61
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 61
Met Gly Ser Trp Val Glu Phe Glu Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Ser Asp
1 5 10 15
Arg Leu Trp Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Phe Phe Glu
20 25 30
Asn Glu Ile Ala Ser Phe Glu Ser Asp Leu Gln Phe Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
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50 55 60
Asp Glu Leu His Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 62
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 62
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Glu Asp Arg Leu Ala Ala Ile Glu Ala
1 5 10 15
Arg Leu Trp Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Asp Phe Glu
20 25 30
Glu Glu Ile Ala Tyr Phe Glu His Gly Leu Gln Trp Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Glu Ser Glu Ala Met Ala Ile Ile
50 55 60
Asp Glu Leu His Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 63
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 63
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Glu Glu Arg Leu Asp Ala Ile Glu Asp
1 5 10 15
Arg Leu Ile Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ile Phe Glu
20 25 30
Asp Ile Ile Ala Phe Phe Glu Gln Asp Leu Gln Tyr Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Glu Met Glu Ala Glu Ala Ile Ser
50 55 60
Ile Glu Leu Asp Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 64
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 64
Met Gly Ser Trp Trp Glu Phe Glu Asp Arg Leu Trp Ala Ile Asp Arg
1 5 10 15
Arg Leu Met Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Val Phe Glu
20 25 30
Gln Met Ile Ala His Phe Glu Gln Ile Leu Gln Val Tyr Lys Gly Lys
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Met Glu Leu Ala Ala Tyr Arg His Asn
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<213> 智人
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Met Gly Ser Trp Glu Glu Phe His Glu Arg Leu Asp Ala Ile Asp Glu
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Arg Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Phe Phe Glu
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Asp Asp Ile Ala Ser Phe Glu Asp Trp Leu Gln Trp Tyr Lys Gly Lys
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Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Ser Arg Glu Ala Asp Ala Ile Asn
50 55 60
Phe Glu Leu Glu Ala Tyr Arg His Asn
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<211> 73
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<213> 智人
<400> 66
Met Gly Ser Trp Glu Glu Phe Asp Lys Arg Leu Asp Ala Ile Thr Arg
1 5 10 15
Arg Leu Met Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Glu Phe Glu
20 25 30
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<213> 智人
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<400> 68
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<400> 106
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<213> 智人
<400> 107
Met Gly Ser Trp Ile Glu Phe Glu Ser Arg Leu Trp Ala Ile Glu Asp
1 5 10 15
Arg Leu Leu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
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<213> 智人
<400> 108
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Glu Asn Arg Leu Gly Ala Ile Gly Asp
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Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
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Gly Asn Pro Glu Val Glu Trp Leu Arg Asp Glu Ala Ala Tyr Ile Arg
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 109
Met Gly Ser Trp Asn Glu Phe Tyr Asp Arg Leu Ser Ala Ile Tyr Phe
1 5 10 15
Arg Leu Gln Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu His Leu Arg Trp Tyr Ala Ala Asp Ile Arg
50 55 60
Met Ile Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 110
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 110
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Glu Tyr Arg Leu Glu Ala Ile Glu Asp
1 5 10 15
Arg Leu Trp Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Tyr Leu Arg Glu Glu Ala Ala Trp Ile Arg
50 55 60
Val Trp Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 111
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 111
Met Gly Ser Trp Val Glu Phe Glu Asn Arg Leu Glu Ala Ile Glu Asn
1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 112
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Trp Asp Arg Leu Glu Ala Ile Asp Asp
1 5 10 15
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 113
Met Gly Ser Trp Phe Glu Phe Trp Asp Arg Leu Asp Ala Ile Glu Asp
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<213> 智人
<400> 114
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<213> 智人
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<211> 73
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 117
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<211> 73
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<213> 智人
<400> 118
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<213> 智人
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<213> 智人
<400> 120
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 121
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Arg Leu Trp Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
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65 70
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 122
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 124
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 126
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<213> 智人
<400> 127
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<211> 73
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<213> 智人
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 129
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<211> 73
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<213> 智人
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 133
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Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 134
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 135
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 136
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 137
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<211> 73
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<213> 智人
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
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<211> 73
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<213> 智人
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Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
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<213> 智人
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<211> 73
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 145
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 146
Met Gly Ser Trp Trp Glu Phe Glu Ala Arg Leu Tyr Ala Ile Glu Phe
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Arg Leu Ser Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
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<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 147
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<212> PRT
<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
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<213> 智人
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<212> PRT
<213> 智人
<400> 151
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Trp Glu Arg Leu Asp Ala Ile Thr Phe
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
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<213> 智人
<400> 152
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<213> 智人
<400> 153
Met Gly Ser Trp Ile Glu Phe Glu Glu Arg Leu Tyr Ala Ile Glu Thr
1 5 10 15
Arg Leu Leu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Phe Leu Arg Val Val Ala Ala Asp Ile Arg
50 55 60
Glu Trp Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 154
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 154
Met Gly Ser Trp Ile Glu Phe Glu His Arg Leu Ser Ala Ile Asn Asp
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Asp Leu Arg Glu Trp Ala Ala Asp Ile Arg
50 55 60
Ser Leu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 155
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 155
Met Gly Ser Trp Phe Glu Phe Glu Met Arg Leu Asp Ala Ile Met Ala
1 5 10 15
Arg Leu Trp Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Asp Leu Arg Tyr Ala Ala Ala Asp Ile Arg
50 55 60
Asp Tyr Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 156
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 156
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Val Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Tyr Asp
1 5 10 15
Arg Leu Trp Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Asp Leu Arg Tyr Ala Ala Ala Asp Ile Arg
50 55 60
Asp Phe Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 157
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 157
Met Gly Ser Trp Val Glu Phe Glu Asp Arg Leu Asp Ala Ile Leu Glu
1 5 10 15
Arg Leu Trp Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Asp Leu Arg Glu Leu Ala Ala Asp Ile Arg
50 55 60
Asp Phe Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 158
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 158
Met Gly Ser Trp Phe Glu Phe Glu Glu Arg Leu Ile Ala Ile Glu Glu
1 5 10 15
Arg Leu Phe Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Tyr Leu Arg Trp Ile Ala Ala Asp Ile Arg
50 55 60
Asp Val Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 159
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 159
Met Gly Ser Trp Ile Glu Phe Ala Asp Arg Leu Asp Ala Ile Leu Asp
1 5 10 15
Arg Leu Asp Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Trp Leu Arg Glu Ile Ala Ala Asp Ile Arg
50 55 60
Ala Tyr Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 160
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 160
Met Gly Ser Trp Leu Glu Phe Glu Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Leu Asp
1 5 10 15
Arg Leu Phe Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Asp Leu Arg Glu Val Ala Ala Asp Ile Arg
50 55 60
Met Leu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 161
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 161
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe His Asp Arg Leu Asp Ala Ile Thr Asn
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Asp Leu Arg Asp Trp Ala Ala Asp Ile Arg
50 55 60
Val Trp Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 162
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 162
Met Gly Ser Trp Gln Glu Phe Glu Gln Arg Leu Asp Ala Ile Asn Trp
1 5 10 15
Arg Leu Trp Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Glu Leu Arg Glu Trp Ala Ala Asp Ile Arg
50 55 60
Ile Phe Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 163
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 163
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Tyr Ser Arg Leu Asp Ala Ile Asp Ser
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Phe Leu Arg Asp Tyr Ala Ala Glu Ile Arg
50 55 60
Arg Tyr Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 164
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 164
Met Gly Ser Trp Glu Glu Phe His Asp Arg Leu Glu Ala Ile Ser Asp
1 5 10 15
Arg Leu Trp Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Asp Leu Arg Asp Trp Ala Ala Asp Ile Arg
50 55 60
Phe Tyr Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 165
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 165
Met Gly Ser Trp Trp Glu Phe Asp Glu Arg Leu Tyr Ala Ile Glu Asp
1 5 10 15
Arg Leu Phe Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Trp Leu Arg Ile Val Ala Ala Asp Ile Arg
50 55 60
Glu Ile Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 166
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 166
Met Gly Ser Trp Glu Glu Phe Glu Tyr Arg Leu Met Ala Ile Glu Val
1 5 10 15
Arg Leu Trp Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Arg Glu Ile Ala Ala Asp Ile Arg
50 55 60
Gln Ile Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 167
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 167
Met Gly Ser Trp Val Val Phe Lys Gln Arg Leu Ala Tyr Ile Lys Asp
1 5 10 15
Leu Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Tyr Phe Glu
20 25 30
Met Ser Ile Ala Phe Phe Glu Glu Asp Leu Gln Val Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 168
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 168
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Lys Asn Asp Leu Ala Trp Ile Lys Val
1 5 10 15
His Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Tyr Phe Glu
20 25 30
Phe Arg Ile Ala His Phe Glu Asn Ala Leu Gln Tyr Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 169
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 169
Met Gly Ser Trp Val Glu Phe Tyr Asn Arg Leu Trp Ala Ile Asp His
1 5 10 15
Arg Leu His Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Val Leu Arg Tyr His Ala Ala Ser Ile Arg
50 55 60
Val Thr Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 170
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 170
Met Gly Ser Trp Ser Glu Phe Tyr Asp Arg Leu His Ala Ile His His
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Asp Thr Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
Thr Arg Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 171
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 171
Met Gly Ser Trp Lys Glu Phe His Phe Arg Leu His Ala Ile Glu His
1 5 10 15
Arg Leu Ile Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Phe Leu Arg Ala Lys Ala Ala Asn Ile Arg
50 55 60
Thr His Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 172
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 172
Met Gly Ser Trp Phe Glu Phe His Gly Arg Leu His Ala Ile Tyr Gly
1 5 10 15
Arg Leu Ser Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu His Leu Arg Ala His Ala Ala His Ile Arg
50 55 60
Asp His Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 173
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 173
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Ala Asp Arg Leu His Ala Ile His Gln
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Met Thr Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
Ser Arg Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 174
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 174
Met Gly Ser Trp Asn Glu Phe Tyr Asn Arg Leu His Ala Ile His Gln
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ser Leu Arg Gln Thr Ala Ala Tyr Ile Arg
50 55 60
Asp Arg Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 175
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 175
Met Gly Ser Trp Asn Glu Phe Ala Asp Arg Leu His Ala Ile His Gln
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ser Leu Arg Met Thr Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
Ser Arg Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 176
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 176
Met Gly Ser Trp Thr Glu Phe Ser Tyr Arg Leu Gly Ala Ile Gln Ser
1 5 10 15
Arg Leu His Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu His Leu Arg Tyr Asn Ala Ala Lys Ile Arg
50 55 60
His Phe Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 177
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 177
Met Gly Ser Trp Gln Glu Phe Thr Thr Arg Leu Glu Ala Ile Tyr His
1 5 10 15
Arg Leu Arg Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Asn Phe Glu
20 25 30
Gly Phe Ile Ala Glu Phe Glu Gly Asn Leu Gln Met Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Val His Glu Ala Tyr Ala Ile Met
50 55 60
Glu Glu Leu His Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 178
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 178
Met Gly Ser Trp Val Glu Phe Phe Asp Arg Leu Lys Ala Ile His Asp
1 5 10 15
Arg Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala His Phe Glu
20 25 30
Lys Leu Ile Ala His Phe Glu His Arg Leu Gln Asn Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Glu Lys Glu Ala Asp Ala Ile Leu
50 55 60
Tyr Glu Leu Ala Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 179
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 179
Met Gly Ser Trp Tyr Tyr Phe Lys His His Leu Ala Trp Ile Lys Met
1 5 10 15
Glu Leu Glu Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala His Phe Glu
20 25 30
Ser Ser Ile Ala Ser Phe Glu Arg Asp Leu Gln Gln Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ala Leu Arg Lys Glu Ala Ala Ala Ile Arg
50 55 60
Asp Glu Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 180
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 180
Met Gly Ser Trp Val Glu Phe His Ile Arg Leu His Ala Ile Gln Tyr
1 5 10 15
Arg Leu Tyr Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Glu Leu Arg His Trp Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
Leu Gln Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 181
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 181
Met Gly Ser Trp Asn Glu Phe His Asp Arg Leu Asn Ala Ile His Ala
1 5 10 15
Arg Leu His Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Asn Leu Arg Asp Asp Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
Arg Phe Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 182
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 182
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Thr Val Arg Leu Glu Ala Ile His Glu
1 5 10 15
Arg Leu Lys Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
Arg Phe Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 183
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 183
Met Gly Ser Trp Lys Glu Phe Asp Asp Arg Leu Asn Ala Ile Lys Ala
1 5 10 15
Arg Leu Gln Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Asp Leu Arg Asp Asp Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
Arg Phe Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 184
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 184
Met Gly Ser Trp Tyr Glu Phe Asp Asp Arg Leu Asn Ala Ile His Asp
1 5 10 15
Arg Leu Gln Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Asp Leu Arg Asp Asp Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
Arg Phe Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 185
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 185
Met Gly Ser Trp Asn Glu Phe Lys Asn Arg Leu Asp Ala Ile His Lys
1 5 10 15
Arg Leu Asn Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Asn Leu Arg Asp Asp Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
His Phe Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 186
<211> 73
<212> PRT
<213> 智人
<400> 186
Met Gly Ser Trp Thr Glu Phe Glu Gln Arg Leu Glu Ala Ile His Asn
1 5 10 15
Arg Leu Gln Ala Leu Gly Gly Ser Glu Ala Glu Leu Ala Ala Phe Glu
20 25 30
Lys Glu Ile Ala Ala Phe Glu Ser Glu Leu Gln Ala Tyr Lys Gly Lys
35 40 45
Gly Asn Pro Glu Val Glu Glu Leu Arg Asn Asp Ala Ala Phe Ile Arg
50 55 60
His Phe Leu Gln Ala Tyr Arg His Asn
65 70
<210> 187
<211> 378
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> misc_feature
<223> CD123 (白细胞介素-3受体-α)
<400> 187
Met Val Leu Leu Trp Leu Thr Leu Leu Leu Ile Ala Leu Pro Cys Leu
1 5 10 15
Leu Gln Thr Lys Glu Asp Pro Asn Pro Pro Ile Thr Asn Leu Arg Met
20 25 30
Lys Ala Lys Ala Gln Gln Leu Thr Trp Asp Leu Asn Arg Asn Val Thr
35 40 45
Asp Ile Glu Cys Val Lys Asp Ala Asp Tyr Ser Met Pro Ala Val Asn
50 55 60
Asn Ser Tyr Cys Gln Phe Gly Ala Ile Ser Leu Cys Glu Val Thr Asn
65 70 75 80
Tyr Thr Val Arg Val Ala Asn Pro Pro Phe Ser Thr Trp Ile Leu Phe
85 90 95
Pro Glu Asn Ser Gly Lys Pro Trp Ala Gly Ala Glu Asn Leu Thr Cys
100 105 110
Trp Ile His Asp Val Asp Phe Leu Ser Cys Ser Trp Ala Val Gly Pro
115 120 125
Gly Ala Pro Ala Asp Val Gln Tyr Asp Leu Tyr Leu Asn Val Ala Asn
130 135 140
Arg Arg Gln Gln Tyr Glu Cys Leu His Tyr Lys Thr Asp Ala Gln Gly
145 150 155 160
Thr Arg Ile Gly Cys Arg Phe Asp Asp Ile Ser Arg Leu Ser Ser Gly
165 170 175
Ser Gln Ser Ser His Ile Leu Val Arg Gly Arg Ser Ala Ala Phe Gly
180 185 190
Ile Pro Cys Thr Asp Lys Phe Val Val Phe Ser Gln Ile Glu Ile Leu
195 200 205
Thr Pro Pro Asn Met Thr Ala Lys Cys Asn Lys Thr His Ser Phe Met
210 215 220
His Trp Lys Met Arg Ser His Phe Asn Arg Lys Phe Arg Tyr Glu Leu
225 230 235 240
Gln Ile Gln Lys Arg Met Gln Pro Val Ile Thr Glu Gln Val Arg Asp
245 250 255
Arg Thr Ser Phe Gln Leu Leu Asn Pro Gly Thr Tyr Thr Val Gln Ile
260 265 270
Arg Ala Arg Glu Arg Val Tyr Glu Phe Leu Ser Ala Trp Ser Thr Pro
275 280 285
Gln Arg Phe Glu Cys Asp Gln Glu Glu Gly Ala Asn Thr Arg Ala Trp
290 295 300
Arg Thr Ser Leu Leu Ile Ala Leu Gly Thr Leu Leu Ala Leu Val Cys
305 310 315 320
Val Phe Val Ile Cys Arg Arg Tyr Leu Val Met Gln Arg Leu Phe Pro
325 330 335
Arg Ile Pro His Met Lys Asp Pro Ile Gly Asp Ser Phe Gln Asn Asp
340 345 350
Lys Leu Val Val Trp Glu Ala Gly Lys Ala Gly Leu Glu Glu Cys Leu
355 360 365
Val Thr Glu Val Gln Val Val Gln Lys Thr
370 375

Claims (49)

1.用于纯化目的靶的方法，包括，
将包含目的靶的样品与组合物接触，组合物包含：
附接至固体支持物的多肽试剂，其中多肽试剂具有氨基酸序列，氨基酸序列包含：
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:4)，
其中多肽具有不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列，
其中多肽特异性结合目的靶，
其中多肽与目的靶的特异性结合强于根据SEQ ID NO:1的多肽与目的靶的结合；
在允许组合物与目的靶结合的条件下进行接触；以及
去除未与组合物结合的样品部分。
2.权利要求1的方法，还包括使组合物从目的靶分离并回收目的靶。
3.权利要求1的方法，其中固体支持物包含珠，载玻片，芯片，明胶或琼脂糖。
4.权利要求1的方法，其中多肽试剂通过非共价缔合与固体支持物偶联。
5.权利要求1的方法，其中多肽试剂通过共价键合与固体支持物偶联。
6.权利要求1的方法，其中组合物的多肽试剂进一步包含肽标签，其中肽标签包含六组氨酸部分或FLAG标签。
7.权利要求1的方法，其中组合物的多肽试剂还包含链霉抗生物素蛋白部分。
8.权利要求1的方法，其中固体支持物包含珠，且组合物适合用于亲和色谱以纯化目的靶。
9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中目的靶能够从组合物中洗脱。
10.权利要求1的方法，其中编码多肽的核酸分子被包装在用于转导细胞系以使细胞系表达多肽的表达载体中。
11.用于纯化目的靶的方法，包括：
使包含目的靶的样品与包含以下成分的组合物接触：
与固体支持物偶联的病毒样颗粒，其中病毒样颗粒将多肽表达为膜蛋白，多肽具有选自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列，
其中没有半胱氨酸或脯氨酸残基被置换到SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的任何一个中，
其中多肽具有不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列，
其中多肽特异性结合目的靶，
其中多肽与目的靶的特异性结合强于根据SEQ ID NO:1的多肽与目的靶的结合；和
在允许组合物与目的靶结合的条件下进行接触；和
去除未与组合物结合的样品部分。
12.权利要求11的方法，其中固体支持物包含珠，载玻片，芯片，明胶或琼脂糖。
13.权利要求11的方法，其中组合物的多肽进一步包含肽标签，其中肽标签包含六组氨酸部分或FLAG标签。
14.权利要求11的方法，其中丢弃未与组合物结合的样品部分。
15.权利要求11的方法，其中未与组合物结合的样品部分与组合物第二次接触以捕获额外的目的靶。
16.权利要求15的方法，还包括使未与组合物结合的样品部分与针对组合物的多肽的抗体接触，
表达从哺乳动物细胞释放的多肽的膜结合病毒样颗粒(VLP)产生的抗体被工程改造以表达包含与嵌合抗原受体(CAR)融合的多肽的融合蛋白，该融合蛋白表达在产生的病毒样颗粒上，
其中抗体适合用于测定以检测从固体支持物分离的残余多肽。
17.用于从包含目的靶的样品去除一种或多种污染物的方法，包括：
使包含目的靶的样品与包含以下成分的组合物接触：
与固体支持物偶联的病毒样颗粒，其中病毒样颗粒将多肽表达为膜蛋白，多肽具有选自SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的氨基酸序列，
其中没有半胱氨酸或脯氨酸残基被置换到SEQ ID NO:2，SEQ ID NO:3，SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6中的任何一个中，
其中多肽具有不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列，
其中多肽特异性结合待从包含目的靶的样品去除的一种或多种污染物，
其中多肽与一种或多种污染物的特异性结合强于根据SEQ ID NO:1的多肽与一种或多种污染物的结合；和
在允许组合物与一种或多种污染物结合的条件下进行接触；和
收集未与组合物结合的样品部分。
18.权利要求17的方法，其中组合物的多肽进一步包含肽标签，其中肽标签包含六组氨酸部分或FLAG标签。
19.权利要求17的方法，其中固体支持物包含珠，载玻片，芯片，明胶或琼脂糖，并且病毒样颗粒通过非共价缔合与固体支持物偶联。
20.权利要求17的方法，其中所收集的样品部分与组合物第二次接触以从样品去除额外的污染物。
21.亲和树脂，其包含具有包含选自以下的序列的氨基酸序列的多肽试剂：
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO:2)；
MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:3)；
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:4)；
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:5)；
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:6)；
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO:7)；
MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:8)；
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAAFEKEIAAFESELQAYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:9)；
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:10)；和
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:11)；及其组合；
其中Xn是天然或非天然氨基酸；其中每个Xn是相同或不同的天然或非天然氨基酸；和/或
其中Z1和/或Z2是2至30个天然或非天然氨基酸；
并且其中氨基酸序列不是SEQ ID NO:1。
22.权利要求21的亲和树脂，其中多肽试剂具有通过在一个或多个残基处的氨基酸置换而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
23.权利要求22的亲和树脂，其中在一个或多个残基处的氨基酸置换包含保守置换。
24.权利要求22的亲和树脂，其中在一个或多个残基处的氨基酸置换包含非保守置换。
25.根据权利要求22-24中任一项的亲和树脂，其中在一个或多个残基处的氨基酸置换包含在溶剂可及残基处的置换。
26.根据权利要求22-24中任一项的亲和树脂，其中在一个或多个残基处的氨基酸置换包含在溶剂不可及残基处的置换。
27.权利要求21的亲和树脂，其中多肽试剂具有通过在一个或多个残基处的氨基酸缺失而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
28.制造亲和树脂的方法，包括以下步骤：
将具有包含选自以下的序列的氨基酸序列的多肽试剂连接到固体支持物上：
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO:2)；
MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:3)；
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:4)；
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:5)；
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:6)；
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO:7)；
MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:8)；
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAAFEKEIAAFESELQAYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:9)；
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:10)；和
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:11)；及其组合；
其中Xn是天然或非天然氨基酸；其中每个Xn是相同或不同的天然或非天然氨基酸；和/或
其中Z1和/或Z2是2至30个天然或非天然氨基酸；
并且其中氨基酸序列不是SEQ ID NO:1。
29.权利要求28的方法，其中多肽试剂通过共价键合附接到固体支持物上。
30.权利要求28的方法，其中多肽试剂通过非共价缔合附接到固体支持物上。
31.根据权利要求28-30中任一项的方法，其中固体支持物包含珠，载玻片，芯片，明胶或琼脂糖。
32.包含与多肽试剂偶联的固体支持物的组合物，多肽试剂具有包含选自以下的序列的氨基酸序列：
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO:2)；
MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:3)；
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:4)；
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:5)；
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:6)；
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO:7)；
MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:8)；
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAAFEKEIAAFESELQAYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:9)；
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:10)；和
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:11)；及其组合；
其中Xn是天然或非天然氨基酸；其中每个Xn是相同或不同的天然或非天然氨基酸；和/或
其中Z1和/或Z2是2至30个天然或非天然氨基酸；
并且其中氨基酸序列不是SEQ ID NO:1。
33.权利要求32的组合物，其中多肽试剂具有通过在一个或多个残基处的氨基酸置换而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
34.权利要求33的组合物，其中在一个或多个残基处的氨基酸置换包含保守置换。
35.权利要求33的组合物，其中在一个或多个残基处的氨基酸置换包含非保守置换。
36.根据权利要求33-35中任一项的组合物，其中在一个或多个残基处的氨基酸置换包含在溶剂可及残基处的置换。
37.根据权利要求33-35中任一项的组合物，其中在一个或多个残基处的氨基酸置换包含在溶剂不可及残基处的置换。
38.权利要求33的组合物，其中多肽试剂具有通过在一个或多个残基处的氨基酸缺失而不同于SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
39.根据权利要求32至38中任一项的组合物，其中固体支持物包含珠，载玻片，芯片，明胶或琼脂糖。
40.包含缀合至可检测试剂和/或标签的多肽试剂的组合物，
其中多肽试剂具有包含选自以下的序列的氨基酸序列：
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO:2)；
MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:3)；
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:4)；
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN(SEQ ID NO:5)；
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN(SEQ ID NO:6)；
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN(SEQ ID NO:7)；
MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:8)；
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAAFEKEIAAFESELQAYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:9)；
MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN(SEQ ID NO:10)；和
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN(SEQ ID NO:11)；及其组合；
其中Xn是天然或非天然氨基酸；其中每个Xn是相同或不同的天然或非天然氨基酸；和/或
其中Z1和/或Z2是2至30个天然或非天然氨基酸；
并且其中氨基酸序列不是SEQ ID NO:1。
41.权利要求40的组合物，其中可检测试剂包含发色团。
42.权利要求40的组合物，其中可检测试剂包含荧光染料。
43.权利要求40的组合物，其中可检测试剂包含放射性核素。
44.根据权利要求40-43中任一项的组合物，其中可检测试剂是能够定量的。
45.根据权利要求40-44中任一项的组合物，其中多肽试剂与色谱珠，树脂，载玻片，芯片，明胶或琼脂糖缀合。
46.权利要求40的组合物，其中标签包含聚组胺酸标签，myc标签或FLAG标签。
47.权利要求40的组合物，其中多肽试剂通过共价结合与可检测试剂或标签缀合。
48.根据权利要求40-47中任一项的组合物，其中多肽试剂是融合蛋白。
49.根据权利要求40-48中任一项的组合物，其中多肽试剂是多聚体的。
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