CN112823022A - 结合bcma、nkg2d和cd16的多特异性结合蛋白以及使用方法 - Google Patents

结合bcma、nkg2d和cd16的多特异性结合蛋白以及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明描述了结合并杀死人癌细胞的多特异性结合蛋白，以及可用于治疗癌症的药物组合物和治疗方法。所述癌症可以是表达B细胞成熟抗原(BCMA)的癌症。与抗BCMA单克隆抗体相比，本文提供的多特异性结合蛋白表现出高效能和靶细胞的最大裂解。

Description

结合BCMA、NKG2D和CD16的多特异性结合蛋白以及使用方法
相关申请
本申请要求2018年8月8日提交的美国序列号62/716,207的优先权的权益，所述序列号以引用的方式整体并入本文。
序列表
本说明书与序列表的计算机可读形式(CRF)副本一起提交。2019年8月8日创建的CRF题为14247-425-228_ST25.txt，其大小为137，008字节，以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本发明涉及与NKG2D、CD16和B细胞成熟抗原(BCMA)结合的多特异性结合蛋白。与抗BCMA单克隆抗体相比，这些多特异性结合蛋白表现出高效能和靶细胞的最大裂解，并且可用于杀死表达BCMA的人癌细胞。
背景技术
尽管用于治疗此疾病的实质性研究成果和科学进展在文献中已有报道，但癌症仍然是重要的健康问题。一些最常诊断出的癌症包括前列腺癌、乳腺癌和肺癌。前列腺癌是男性中最常见的癌症形式。乳腺癌仍然是女性死亡的主要原因。这些癌症的目前治疗选择并非对所有患者都有效且/或可能具有实质性不良副作用。使用现有的治疗选择来治疗其他类型的癌症仍然具有挑战性。
癌症免疫疗法是理想的，因为它们具有高度特异性并且可利用患者自身免疫系统促进对癌细胞的破坏。融合蛋白(诸如双特异性T细胞接合体)是文献中所述的癌症免疫疗法，其与肿瘤细胞和T细胞结合以促进对肿瘤细胞的破坏。与某些肿瘤相关抗原和某些免疫细胞结合的抗体已描述于文献中。参见例如WO 2016/134371和WO 2015/095412。
自然杀伤(NK)细胞是先天免疫系统的组分并且在循环淋巴细胞中占约15％。NK细胞浸润几乎所有组织并且初始特征为其能够有效杀死肿瘤细胞而无需预先致敏。活化的NK细胞通过类似于细胞毒性T细胞的方式，即经由包含穿孔素和颗粒酶的溶细胞颗粒以及经由死亡受体通路来杀死靶细胞。活化的NK细胞还分泌促进其他白细胞募集到靶组织的炎性细胞因子，诸如IFN-γ和趋化因子。
NK细胞通过其表面上的多种活化性及抑制性受体来响应于信号。例如，当NK细胞遇到健康的自身细胞时，其活性通过杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的活化而受到抑制。可替代地，当NK细胞遇到外来细胞或癌细胞时，其经由其活化性受体(例如NKG2D、NCR、DNAM1)而活化。NK细胞还通过一些免疫球蛋白的恒定区通过其表面上的CD16受体而活化。NK细胞对活化的总体敏感性取决于刺激性及抑制性信号的总和。
BCMA是属于TNF受体超家族的跨膜蛋白。其特异性地与肿瘤坏死因子(配体)超家族成员13b(TNFSF13B/TALL-1/BAFF)结合，导致NF-κB和MAPK8/JNK活化。它的表达限于B细胞谱系并且已表明对B细胞发育和自身免疫反应是至关重要的。BCMA还与各种TRAF家族成员结合，并因此可转导用于细胞存活和增殖的信号。BCMA与多种癌症相关，诸如多发性骨髓瘤、淋巴瘤和白血病。本发明提供了某些优势，以改善表达BCMA的癌症的治疗。
发明内容
本发明提供了多特异性结合蛋白，其与BCMA(例如癌细胞上的BCMA)以及在例如自然杀伤细胞上表达的NKG2D受体和CD16受体结合。此类蛋白质可接合不止一种NK活化受体，并且可阻断天然配体与NKG2D的结合。在某些实施方案中，所述蛋白质可激动人和其他物种诸如啮齿动物和食蟹猴中的NK细胞。在某些实施方案中，所述蛋白质可激动人和其他物种诸如啮齿动物和食蟹猴中的细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，所述蛋白质激动人NK细胞。在一些实施方案中，所述蛋白质激动人细胞毒性T细胞。下文进一步详细描述了本发明的各个方面和实施方案。
因此，本发明的一个方面提供了一种蛋白质，其包含(a)第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含结合NKG2D的单链可变片段(scFv)；(b)结合B细胞成熟抗原(BCMA)的第二抗原结合位点；以及(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，本公开的蛋白还包含结合BCMA的额外的抗原结合位点。在某些实施方案中，本公开中所述的蛋白质的第二抗原结合位点是结合BCMA的Fab片段。在某些实施方案中，本公开中所述的蛋白质的第二抗原结合位点和额外的抗原结合位点是结合BCMA的Fab片段。
在某些实施方案中，本公开中所述的蛋白质的第二抗原结合位点和额外的抗原结合位点是结合BCMA的scFv。在某些实施方案中，结合NKG2D的scFv的重链可变结构域位于scFv的轻链可变结构域的N末端或C末端。在某些实施方案中，轻链可变结构域位于结合NKG2D的scFv的重链可变结构域的N末端。
在某些实施方案中，与NKG2D结合的scFv连接到足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，与NKG2D结合的scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接到足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，与NKG2D结合的scFv经由包含SEQ ID NO：168的氨基酸序列的柔性接头连接到足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分的C末端或结合CD16的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，将Fc结构域的C末端与结合NKG2D的scFv的VL结构域(例如SEQ IDNO：98)的N末端连接的柔性接头具有SEQ ID NO：168的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体Fc结构域的C末端连接到结合NKG2D的scFv的轻链可变结构域的N末端。
在某些实施方案中，在结合NKG2D的scFv内，在scFv的重链可变结构域与scFv的轻链可变结构域之间形成二硫桥。在某些实施方案中，在来自重链可变结构域的C44与来自轻链可变结构域的C100之间形成二硫桥。
在某些实施方案中，在结合NKG2D的scFv内，重链可变结构域经由柔性接头连接到轻链可变结构域。在某些实施方案中，所述柔性接头包含(GlyGlyGlyGlySer)n((G4S)n；SEQID NO：198)，其中n是1-10之间的整数。在某些实施方案中，所述柔性接头具有SEQ ID NO：167的氨基酸序列。
在某些实施方案中，第二抗原结合位点和额外的抗原结合位点scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接到足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，第二抗原结合位点和额外的抗原结合位点scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接到抗体Fc结构域。
在某些实施方案中，在第二抗原结合位点和/或额外的抗原结合位点的重链可变结构域与轻链可变结构域之间形成二硫桥。在某些实施方案中，在来自重链可变结构域的C44与来自轻链可变结构域的C100之间形成二硫桥。
在某些实施方案中，结合NKG2D的scFv包含位于重链可变结构域的N末端的轻链可变结构域，其中所述轻链可变结构域经由包含SEQ ID NO：167的氨基酸序列的柔性接头连接到scFv的重链可变结构域，并且结合NKG2D的scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接到抗体Fc结构域。
在某些实施方案中，本发明的蛋白质包含含有结合NKG2D的scFv的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含：
(a)包含分别由SEQ ID NO：190、96和191的氨基酸序列表示的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(b)包含分别由SEQ ID NO：190、96和193的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(c)包含分别由SEQ ID NO：95、96和97的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(d)包含分别由SEQ ID NO：188、88和189的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：91、92和93的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(e)包含分别由SEQ ID NO：185、104和192的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：107、108和109的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(f)包含分别由SEQ ID NO：185、72和159的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：75、76和77的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(g)包含分别由SEQ ID NO：186、80和187的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：83、84和85的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(h)包含分别由SEQ ID NO：190、96和194的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(i)包含分别由SEQ ID NO：190、96和195的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(j)包含分别由SEQ ID NO：190、96和196的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(k)包含分别由SEQ ID NO：190、96和197的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；或
(1)包含分别由SEQ ID NO：190、96和160的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；以及
结合BCMA的第二抗原结合位点和/或额外的抗原结合位点，其包含：
(a)包含分别由SEQ ID NO：149、150和151的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：153、154和155的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(b)包含分别由SEQ ID NO：115、116和117的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：120、121和123的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(c)包含分别由SEQ ID NO：125、126和127的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：129、130和131的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(d)包含分别由SEQ ID NO：133、134和135的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：137、138和139的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(e)包含分别由SEQ ID NO：141、142和143的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：145、146和147的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；或
(f)包含分别由SEQ ID NO：115、116和117的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：120、121和122的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含SEQ ID NO：162的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含含有SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163和SEQ ID NO：165的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含与SEQ ID NO：162的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含与SEQ ID NO：162的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含与SEQ ID NO：162的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含与SEQ ID NO：162的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的氨基酸序列，并且还包含SEQ ID NO：163和SEQ IDNO：165。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：94的氨基酸序列具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：94具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少90％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：94具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少95％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：94具有至少98％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少98％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：94具有至少99％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少99％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ IDNO：94具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：169具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少90％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：169具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少95％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：169具有至少98％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少98％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：169具有至少99％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少99％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：169具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：171具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少90％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：171具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少95％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：171具有至少98％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少98％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：171具有至少99％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少99％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：171具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：173具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少90％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：173具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少95％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：173具有至少98％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少98％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：173具有至少99％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少99％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：173具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：175具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少90％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：175具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少95％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：175具有至少98％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少98％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：175具有至少99％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少99％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：175具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：177具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少90％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：177具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少95％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：177具有至少98％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少98％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：177具有至少99％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少99％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：177具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：179具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少90％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：179具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少95％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：179具有至少98％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少98％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：179具有至少99％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少99％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合NKG2D的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQID NO：179具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第二抗原结合位点，所述第二抗原结合位点包含与SEQ ID NO：148具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：152具有至少90％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：148具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：152具有至少95％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：148具有至少98％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：152具有至少98％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：148具有至少99％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：152具有至少99％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：148具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：152具有同一性的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第二抗原结合位点，所述第二抗原结合位点包含与SEQ ID NO：114具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：119具有至少90％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：114具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：119具有至少95％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：114具有至少98％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：119具有至少98％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：114具有至少99％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：119具有至少99％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：114具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：119具有同一性的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第二抗原结合位点，所述第二抗原结合位点包含与SEQ ID NO：124具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：128具有至少90％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：124具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：128具有至少95％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：124具有至少98％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：128具有至少98％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：124具有至少99％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：128具有至少99％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：124具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：128具有同一性的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第二抗原结合位点，所述第二抗原结合位点包含与SEQ ID NO：132具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：136具有至少90％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：132具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：136具有至少95％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：132具有至少98％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：136具有至少98％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：132具有至少99％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：136具有至少99％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：132具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：136具有同一性的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第二抗原结合位点，所述第二抗原结合位点包含与SEQ ID NO：140具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：144具有至少90％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：140具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：144具有至少95％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：140具有至少98％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：144具有至少98％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：140具有至少99％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：144具有至少99％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：140具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：144具有同一性的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第二抗原结合位点，所述第二抗原结合位点包含与SEQ ID NO：114具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：118具有至少90％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：114具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：118具有至少95％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：114具有至少98％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：118具有至少98％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：114具有至少99％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：118具有至少99％同一性的轻链可变结构域。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含结合BCMA的第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：114具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：118具有同一性的轻链可变结构域。
在某些实施方案中，所述蛋白质还包含结合BCMA的额外的抗原结合位点。在某些实施方案中，所述额外的抗原结合位点包含结合BCMA的第二抗原结合位点的重链可变结构域的相同的CDR1、CDR2和CDR3以及轻链可变结构域的相同的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施方案中，所述额外的抗原结合位点包含与结合BCMA的第二抗原结合位点的重链可变结构域具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的重链可变结构域，以及与结合BCMA的第二抗原结合位点的轻链可变结构域具有至少90％同一性(例如至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的轻链可变结构域。在某些实施方案中，所述额外的抗原结合位点包含与结合BCMA的第二抗原结合位点的重链可变结构域具有同一性的重链可变结构域，以及与结合BCMA的第二抗原结合位点的轻链可变结构域具有同一性的轻链可变结构域。
本文公开的蛋白质包含足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，本文公开的蛋白质包含抗体Fc结构域。抗体Fc结构域可结合CD16。在某些实施方案中，本文公开的蛋白质包含保留抗体Fc结构域与CD16的结合亲和力(即足以结合CD16)的抗体Fc结构域的一部分。在某些实施方案中，本文公开的蛋白质包含结合CD16的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，结合CD16的第三抗原结合位点包含Fab片段。在某些实施方案中，结合CD16的第三抗原结合位点包含scFV。
在某些实施方案中，与NKG2D结合的scFv连接到足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，与NKG2D结合的scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接到足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，与NKG2D结合的scFv经由柔性接头连接到足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分的C末端或结合CD16的第三抗原结合位点。在某些实施方案中，所述柔性接头包含SEQ ID NO：168的氨基酸序列。在某些实施方案中，足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分的C末端或结合CD16的第三抗原结合位点连接到结合NKG2D的scFv的轻链可变结构域的N末端。在某些实施方案中，将足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分的C末端或结合CD16的第三抗原结合位点与结合NKG2D的scFv的VL结构域(例如SEQ ID NO：98)的N末端连接的柔性接头具有SEQ ID NO：168的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本文公开的蛋白质包含抗体Fc结构域。在某些实施方案中，与NKG2D结合的scFv连接到抗体Fc结构域。在某些实施方案中，与NKG2D结合的scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接到抗体Fc结构域。在某些实施方案中，与NKG2D结合的scFv经由柔性接头连接到抗体Fc结构域的C末端。在某些实施方案中，所述柔性接头包含SEQ ID NO：168的氨基酸序列。在某些实施方案中，抗体Fc结构域的C末端连接到结合NKG2D的scFv的轻链可变结构域的N末端。在某些实施方案中，将Fc结构域的C末端与结合NKG2D的scFv的VL结构域(例如SEQ ID NO：98)的N末端连接的柔性接头具有SEQ ID NO：168的氨基酸序列。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含抗体Fc结构域，所述抗体Fc结构域包含人IgG1抗体的铰链和CH2结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含Fc结构域，所述Fc结构域包含与人IgG1抗体的氨基酸234-332具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含Fc结构域，所述Fc结构域包含与人IgG1抗体的氨基酸234-332具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含Fc结构域，所述Fc结构域包含与人IgG1抗体的氨基酸234-332具有至少98％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含Fc结构域，所述Fc结构域包含与人IgG1抗体的Fc结构域具有至少90％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含Fc结构域，所述Fc结构域包含与人IgG1抗体的Fc结构域具有至少95％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含Fc结构域，所述Fc结构域包含与人IgG1抗体的Fc结构域具有至少98％同一性的氨基酸序列。在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含Fc结构域，所述Fc结构域包含与人IgG1的Fc结构域具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在选自由以下组成的组的一个或多个位置处不同：Q347、Y349、T350、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和K439。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含含有Q347R、D399V和F405T取代的人IgG1的Fc结构域。本公开的蛋白质包含含有Q347R、D399V和F405T取代的Fc结构域，所述Fc结构域连接到结合NKG2D的scFv。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含含有K360E和K409W取代的人IgG1的Fc结构域。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质包含含有K360E和K409W取代的Fc结构域，所述Fc结构域连接到第二抗原结合位点。
在某些实施方案中，第一抗原结合位点以2nM至120nM的KD与NKG2D结合，如通过表面等离子体共振所测量。在某些实施方案中，蛋白质以2nM至120nM的KD与NKG2D结合，如通过表面等离子体共振所测量。
还提供了包含这些蛋白质中的至少一种的制剂；包含至少一种或多种表达这些蛋白质的核酸的细胞；以及使用这些蛋白质增强肿瘤细胞死亡的方法。
在本发明的另一方面，本公开提供了一种治疗癌症的方法，其中向有需要的患者施用本公开的蛋白质或包含本公开的蛋白质的制剂。在一些实施方案中，癌症表达BCMA。在一些实施方案中，癌症的至少20％的细胞表达BCMA。在一些实施方案中，癌症的至少50％的细胞表达BCMA。在一些实施方案中，癌症的至少80％的细胞表达BCMA。
在某些实施方案中，本公开的蛋白质用于治疗选自多发性骨髓瘤、急性粒单核细胞白血病、T细胞淋巴瘤、急性单核细胞白血病和滤泡性淋巴瘤的癌症。
附图说明
图1A-图1B示出了示例性三特异性抗体(TriNKET)，其包括结合NKG2D的scFv第一抗原结合位点、结合BCMA的第二抗原结合位点、结合BCMA的额外的肿瘤相关抗原结合位点以及结合CD16的异二聚抗体恒定区。这些抗体形式在本文中称为F4-TriNKET。图1A示出了呈Fab形式的两个BCMA结合位点。图1B示出了呈scFv形式的两个BCMA结合位点。
图2示出了示例性TriNKET，其包含结合NKG2D的scFv第一抗原结合位点、结合BCMA的第二抗原结合位点以及异二聚抗体恒定区。所述抗体形式在本文中称为F3-TriNKET。
图3示出了与抗BCMA mAb相比，靶向BCMA的TriNKET(NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA(简称NKG2D-F4-TriNKET-BCMA)介导BCMA阳性KMS12-PE骨髓瘤细胞的更有效裂解。
图4示出了与抗BCMA mAb相比，靶向BCMA的TriNKET介导BCMA阳性MM.1R骨髓瘤细胞的更有效裂解。
图5示出了靶向BCMA的抗体和TriNKET一起孵育随时间稳定地增加了KMS12-PE骨髓瘤细胞上的总表面BCMA表达。
图6示出了靶向BCMA的抗体和TriNKET一起孵育随时间稳定地增加了MM.1R骨髓瘤细胞上的总表面BCMA表达。
图7示出了延长与二价TriNKET的孵育时间显著提高了与KMS12-PE骨髓瘤细胞结合的TriNKET的量。
图8示出了延长与二价TriNKET的孵育时间显著提高了与MM.1R细胞结合的TriNKET的量。
图9示出了在长期纯化的NK杀伤测定中，二价TriNKET(F4形式)优于二价靶向BCMA的mAb和单价TriNKET。
图10示出了BCMA-TriNKET在使用新鲜PBMC效应细胞进行的长期细胞毒性测定中保留了功效。
图11示出了靶向BCMA的TriNKET与在KHYG-1细胞上表达的NKG2D的弱(检测限以下)结合。
图12示出了二价靶向BCMA的TriNKET(F4形式)的结合极少超出mAb Fc与转导表达CD16的KHYG-1细胞的结合。
图13A-图13F示出了在全血中，超出背景(虚线边界，白色)的靶向BCMA的TriNKET(实体边界，深灰色)与NK细胞(图13A)、CD8+T细胞(图13B)和CD4+T细胞(图13C)不显著结合。接近与B细胞(图13D)、单核细胞(图13E)和粒细胞(图13F)的IgG1对照(点边界，浅灰色)结合主要是Fc受体介导的。
图14示出了CD8+效应T细胞的纯度和靶表达。如图所示，使用ConA刺激产生并使用IL-15培养的CD8+效应T细胞具有高纯度(CD3+CD8+细胞＞99％)，并且都表达NKG2D但不表达CD16。
图15A-图15B示出了在DELFIA测定中的KMS12-PE细胞的细胞裂解。使用来源于两个健康供体的人原代CD8+效应T细胞和KMS12-PE靶细胞进行DELFIA细胞毒性测定。图15A描绘了来源于供体1的细胞的结果并且图15B描绘了来源于供体2的细胞的结果。如图所示，当与活化的CD8+T细胞共培养时，NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA增强了KMS12-PE细胞的裂解，但在不存在效应细胞的情况下不增强。亲本抗BCMA mAb或不相关的TriNKET不能增强来自任一供体的CD8+T细胞的裂解。
图16A-图16B示出了在BCMA阳性靶细胞系存在的情况下，在抗BCMA TriNKET或单克隆抗体存在的情况下4小时内的人NK细胞的活化。图16A描绘了以KMS12-PE细胞(低BCMA表达)作为靶细胞的结果。图16B描绘了以H929(高BCMA表达)作为靶细胞的结果。如图所示，针对高BCMA表达和低BCMA表达的细胞，F4-TriNKET以亚纳摩尔EC50值触发了脱粒和IFNγ产生的增加。与BCMA单克隆抗体相比，F4 TriNKET在最大程度上刺激了较大比例的NK细胞，并增强了针对两种细胞系的效能。
具体实施方式
本发明提供了结合BCMA、NKG2D受体和CD16受体的多特异性结合蛋白。所述多特异性结合蛋白可结合癌细胞上的BCMA以及自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以活化自然杀伤细胞。所述多特异性结合蛋白还可结合癌细胞上的BCMA以及细胞毒性T细胞上的NKG2D受体和CD16受体以活化细胞毒性T细胞。本文还提供了包含此类多特异性结合蛋白的药物组合物，以及使用此类多特异性蛋白和药物组合物的治疗方法，包括用于治疗癌症。本发明的各方面列出在下文各章节中；然而，一个特定章节中所述的本发明的方面不限于任何特定章节。
为促进对本发明的理解，下文定义了多个术语和短语。
除非上下文不适当，否则如本文所用，术语“一个(种)”意指“一个(种)或多个(种)”并且包括复数。
如本文所用，术语“抗原结合位点”是指参与抗原结合的免疫球蛋白分子的部分。在人抗体中，抗原结合位点由重链(“H”)和轻链(“L”)的N末端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度发散的延伸称为“高变区”，它们插置在称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼区段之间。因此，术语“FR”是指天然存在于免疫球蛋白中的高变区之间以及与高变区相邻的氨基酸序列。在人抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区彼此相对布置在三维空间中以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合抗原的三维表面互补，并且重链和轻链中的每一种的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。在某些动物诸如骆驼和软骨鱼中，抗原结合位点由提供“单结构域抗体”的单一抗体链形成。抗原结合位点可存在于完整抗体中、存在于保留抗原结合表面的抗体的抗原结合片段中，或存在于重组多肽诸如scFv中，其使用肽接头将单个多肽中的重链可变结构域连接到轻链可变结构域。本文公开的重链或轻链可变区中的所有氨基酸位置都根据Kabat编号进行编号。
如本文所用，术语“肿瘤相关抗原”意指任何与癌症相关的抗原，包括但不限于蛋白质、糖蛋白、神经节苷脂、碳水化合物、脂质。此类抗原可在恶性细胞上或肿瘤微环境，诸如肿瘤相关血管、细胞外基质、间充质基质或免疫浸润中表达。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指待通过本文所述的方法和组合物治疗的生物体。此类生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如鼠、猿猴、马、牛、猪、犬、猫等)，并且更优选地包括人。
如本文所用，术语“有效量”是指足以实现有益或所需结果的剂(例如本发明的蛋白质)的量。当与治疗剂结合使用时，所述术语是指足以在疾病或病症的治疗中提供治疗益处或足以延迟或最小化与疾病或病症相关的一种或多种症状的此类剂的量。有效量可以一次或多次施用、施加或给药来施用并且不意图限于具体制剂或施用途径。如本文所用，术语“治疗”包括导致病状、疾病、病症等的改善或改良其症状的任何作用，例如减轻、减少、调节、改良或消除。
如本文所用，术语“药物组合物”是指活性剂与惰性或活性载剂的组合，所述组合使得所述组合物特别适用于体内或离体的诊断或治疗用途。
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指标准药物载剂中的任何一种，诸如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂(例如像油/水或水/油乳剂)和各种类型的湿润剂。组合物还可包括稳定剂和防腐剂。关于载剂、稳定剂和佐剂的实例，参见例如Martin，Remington’sPharmaceutical Sciences，第15版，Mack Publ.Co.，Easton，PA[1975]。
如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物的任何药学上可接受的盐(例如酸或碱)，在向受试者施用时能够提供本发明的化合物或其活性代谢物或残余物。如本领域技术人员所知的，本发明化合物的“盐”可来源于无机或有机酸和碱。示例性酸包括但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、对甲苯磺酸、酒石酸、乙酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸，诸如草酸，虽然本身不是药学上可接受的，但可用于制备在获得本发明的化合物及其药学上可接受的酸加成盐中用作中间体的盐。
示例性碱包括但不限于碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化物、氨和式NW4 +化合物，其中W是C1-4烷基等。
示例性盐包括但不限于：乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐等。盐的其他实例包括与合适阳离子诸如Na+、NH4 +和NW4 +(其中W是C1-4烷基)等化合的本发明化合物的阴离子。
就治疗用途而言，本发明化合物的盐预期是药学上可接受的。然而，非药学上可接受的酸和碱的盐也可适用于例如制备或纯化药学上可接受的化合物。
贯穿本说明书，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，或在过程和方法被描述为具有、包括或包含具体步骤的情况下，另外考虑存在基本上由所列组分组成或由所列组分组成的本发明的组合物，并且存在基本上由所列处理步骤组成或由所列处理步骤组成的根据本发明的过程和方法。
一般来说，除非另外规定，否则指定百分比的组合物以重量计。此外，如果变量未附定义，则以变量的先前定义为准。
I.蛋白质
本发明提供了多特异性结合蛋白，其与癌细胞上的BCMA以及自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体结合以活化自然杀伤细胞。多特异性结合蛋白用于本文所述的药物组合物和治疗方法。多特异性结合蛋白与自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体的结合增强了自然杀伤细胞对癌细胞的破坏的活性。多特异性结合蛋白与癌细胞上的BCMA的结合使癌细胞与自然杀伤细胞接近，这促进自然杀伤细胞对癌细胞的直接和间接破坏。
本文提供的多特异性结合蛋白还可结合癌细胞上的BCMA以及细胞毒性T细胞上的NKG2D受体和CD16受体以活化细胞毒性T细胞。多特异性结合蛋白可用于本文所述的药物组合物和治疗方法。多特异性结合蛋白与细胞毒性T细胞上的NKG2D受体和CD16受体的结合增强了细胞毒性T细胞对癌细胞破坏的活性。多特异性结合蛋白与癌细胞上的BCMA的结合使癌细胞与细胞毒性T细胞接近，这促进了细胞毒性T细胞对癌细胞的破坏。
下文提供了示例性多特异性结合蛋白的进一步描述。
多特异性结合蛋白的第一组分与表达NKG2D受体的细胞结合，所述表达NKG2D受体的细胞可包括但不限于NK细胞、NKT细胞、γδT细胞和CD8+αβ T细胞。在NKG2D结合后，多特异性结合蛋白可阻断天然配体(诸如ULBP6和MICA)与NKG2D结合并活化NKG2D受体。
多特异性结合蛋白的第二组分与表达BCMA的细胞结合，所述表达BCMA的细胞可包括但不限于多发性骨髓瘤和B细胞恶性肿瘤。
多特异性结合蛋白的第三组分与表达CD16的细胞结合，CD16是白细胞(包括自然杀伤细胞、细胞毒性T细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和滤泡树突状细胞)表面上的Fc受体。
本文所述的多特异性结合蛋白可采取各种形式。图1A示出了具有两个结合BCMA的抗原结合位点的F4 TriNKET，其中两个结合BCMA的抗原结合位点均是Fab片段。F4TriNKET(Fab)包含含有scFv的结合NKG2D的第一抗原结合位点；结合BCMA的第二抗原结合位点；结合BCMA的额外的抗原结合位点；以及结合CD16的异二聚抗体恒定区。F4 TriNKET(Fab)是异二聚体多特异性抗体，其包含四种肽：第一免疫球蛋白重链、第二免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链(图1A)。第一免疫球蛋白重链从N末端到C末端包括连接到形成第一(VH-CH1)结构域的重链恒定区1(CH1)的重链可变结构域(VH)以及第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域，其中第一(VH-CH1)结构域与第一轻链配对以形成结合BCMA的第一Fab，并且其中(VH-CH1)结构域经由接头或铰链连接到第一Fc(图1A)。第二免疫球蛋白重链从N末端到C末端包括第二(VH-CH1)结构域、第二Fc(铰链-CH2-CH3)结构域以及由配对并结合NKG2D的VH和VL组成的单链可变片段(scFv)，其中第二Fc结构域在其N末端经由接头或铰链连接到第二(VH-CH1)结构域，并在其C末端经由接头或铰链连接到结合NKG2D的scFV，并且其中第二(VH-CH1)结构域与第二轻链配对以形成结合BCMA的第二Fab(图1A)。
F4 TriNKET(scFv)是异二聚体多特异性抗体，其包含两种肽：第一免疫球蛋白重链和第二免疫球蛋白重链(图1B)。第一免疫球蛋白重链从N末端到C末端包括结合BCMA的第一scFv以及第一Fc(铰链-CH2-CH3)结构域，其中结合BCMA的第一scFv经由接头或铰链连接到第一Fc(图1B)。第二免疫球蛋白重链从N末端到C末端包括结合BCMA的第二scFv、第二Fc(铰链-CH2-CH3)结构域以及结合NKG2D的scFv，其中第二Fc结构域在其N末端经由接头或铰链连接到结合BCMA的第二scFv结构域，并在其C末端经由接头或铰链连接到结合NKG2D的scFV(图1B)。
称为“NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA”的TriNKET可以是指图1A(NKG2D-结合-F4(Fab)-TriNKET-BCMA)或图1B(NKG2D-结合-F4(scFv)-TriNKET-BCMA)中描述的TriNKET。例如，TriNKET“A49-F4-TRINKET-BCMA”是指具有“NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA”形式并具有包含A49的VH和VL的NKG-2D结合结构域的TriNKET(参见下文表1)。
在一些实施方案中，上文所述的单链可变片段(scFv)经由铰链序列连接到抗体恒定结构域。在一些实施方案中，铰链包含氨基酸Ala-Ser。在一些其他实施方案中，铰链包含氨基酸Ala-Ser和Thr-Lys-Gly。铰链序列可提供与靶抗原结合的柔性以及柔性与最佳几何形状之间的平衡。
在一些实施方案中，上文所述的单链可变片段(scFv)包括重链可变结构域和轻链可变结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域与轻链可变结构域形成二硫桥以增强scFv的稳定性。例如，可在重链可变结构域的C44残基与轻链可变结构域的C100残基之间形成二硫桥。在一些实施方案中，重链可变结构域经由柔性接头连接到轻链可变结构域。可使用任何适合的接头，例如(G4S)4接头。在scFv的一些实施方案中，重链可变结构域位于轻链可变结构域的N末端。在scFv的一些实施方案中，重链可变结构域位于轻链可变结构域的C末端。
多特异性结合蛋白可提供BCMA的二价或单价接合。多特异性蛋白对BCMA的二价接合可使癌细胞表面上的BCMA稳定，并增强NK细胞对癌细胞的细胞毒性。多特异性蛋白对BCMA的二价接合可赋予多特异性蛋白与癌细胞的更强结合，从而促进NK细胞对癌细胞，特别是对表达低水平BCMA的癌细胞的更强细胞毒性反应。本文提供的多特异性蛋白对BCMA的二价接合还可增强细胞毒性T细胞对癌细胞的细胞毒性。多特异性蛋白对BCMA的二价接合可赋予多特异性蛋白与癌细胞的更强结合，从而促进细胞毒性T细胞对癌细胞的更强细胞毒性反应。
在Fc结构域内，CD16结合由铰链区和CH2结构域介导。例如，在人IgG1内，与CD16的相互作用主要集中在CH2结构域中的氨基酸残基Asp 265-Glu 269、Asn 297-Thr299、Ala327-Ile 332、Leu 234-Ser 239和碳水化合物残基N-乙酰基-D-葡糖胺(参见Sondermann等，Nature，406(6793)：267-273)。基于已知的结构域，可选择突变以增强或降低对CD16的结合亲和力，诸如通过使用噬菌体展示文库或酵母表面展示cDNA文库，或可基于相互作用的已知三维结构来设计突变。
在一些实施方案中，抗体恒定结构域包含IgG抗体例如人IgG1抗体的CH2结构域和CH3结构域。在一些实施方案中，在抗体恒定结构域中引入突变以实现与另一抗体恒定结构域的异二聚化。例如，如果抗体恒定结构域来源于人IgG1的恒定结构域，则所述抗体恒定结构域可包含与人IgG1抗体的氨基酸234-332具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在选自由以下组成的组的一个或多个位置处不同：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和K439。本文公开的Fc结构域或铰链区中的所有氨基酸位置均根据EU编号进行编号。
在一些实施方案中，抗体恒定结构域可包含与人IgG1抗体的氨基酸234-332具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且不同之处在于选自由以下组成的组的一个或多个取代：Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E。
下文列出的是连接到抗体恒定区的scFv的实例，所述抗体恒定区还包括使两条多肽链异二聚化的突变。包含来自NKG2D的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的scFv用于制备本公开的多特异性蛋白。每个序列表示包含VL-(G4S)4-VH-铰链(AS)-Fc的异二聚化突变(带下划线)。VL和VH包含100VL-44VH S-S桥(带下划线)，并且可来自任何靶向肿瘤或NKG2D结合的抗体。弯管式铰链区序列处包括Ala-Ser(AS，加粗和带下划线)以在柔性与最佳几何形状之间进行平衡。在某些实施方案中，可在铰链处将额外的序列Thr-Lys-Gly添加到AS序列中。(G4S)4接头在下文段落中所列的序列中带有下划线。
本公开的TriNKET是NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA，A49-F4-TriNKET-BCMA，其包含含有SEQ ID NO：162的序列的第一多肽(F4-BCMAFc-AJ链B-NKG2D结合scFv)、含有SEQ IDNO：163的序列的第二多肽(抗BCMA HC铰链Fc)和分别含有SEQ ID NO：165的序列的第三多肽和第四多肽(抗BCMA-全LC)。
第一多肽(即F4-BCMAFc-AJ链B-NKG2D结合scFv(SEQ ID NO：162))和第三多肽(即抗BCMA-全LC)形成第一靶向BCMA的Fab片段(包括含有重链可变结构域(VH)(SEQ ID NO：148)和CH1结构域的重链部分，以及含有轻链可变结构域(SEQ ID NO：152)和轻链恒定结构域的轻链部分)。F4-BCMAFc-AJ链B-NKG2D结合scFv包含连接到Fc结构域(铰链-CH2-CH3)的重链部分(VH-CH1)，所述结构域在Fc的C末端连接到结合NKG2D的单链可变片段(scFv)。结合NKG2D的scFv由SEQ ID NO：161的氨基酸序列表示，并且包括经由(G4S)4接头连接到重链可变结构域(VH)(SEQ ID NO：94)的轻链可变结构域(VL)(SEQ ID NO：98)。如SEQ ID NO：162中所示，使用短的SGSGGGGS接头(SEQ ID NO：168)将Fc结构域的C末端连接到VL(SEQ IDNO：98)结构域的N末端。
NKG2D结合scFv
Figure BDA0003011301110000161
F4-BCMAFc-AJ链B-NKG2D结合scFv
Figure BDA0003011301110000171
NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA中的scFv包括使用(G4S)4接头连接到重链可变结构域的NKG2D结合位点的轻链可变结构域(表示为(VL(G4S)4VH))。将scFv(SEQ ID NO：162)的轻链和重链可变结构域连接为VL-(G4S)4-VH；VL和VH包含100VL-44VH S-S桥(分别由G100C和G44C取代产生)(半胱氨酸残基以粗斜体下划线表示)。(G4S)4是SEQ ID NO：161和SEQ IDNO：162中的斜体GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：164)的序列。SEQ ID NO：162中的Fc结构域包含S354C取代，其与另一Fc结构域(下文所述的SEQ ID NO：163)中的Y349C取代形成二硫键。SEQ ID NO：162中的Fc结构域包括Q347R、D399V和F405T取代。
第二多肽(即抗BCMA VH-CH1-Fc)和第四多肽(即抗BCMA-全LC)形成第二BCMA结合的Fab片段。抗BCMA VH-CH1-Fc包括含有重链可变结构域(SEQ ID NO：148)和CH1结构域的重链部分，其中所述重链可变结构域连接到CH1结构域，并且CH1结构域连接到Fc结构域。抗BCMA-全LC包括含有轻链可变结构域(SEQ ID NO：152)和轻链恒定结构域的轻链部分。
抗BCMA VH-CH1-Fc
Figure BDA0003011301110000172
SEQ ID NO：163表示第二抗BCMA Fab片段的重链部分，其包含BCMA结合位点的重链可变结构域(SEQ ID NO：148)以及连接到Fc结构域(铰链-CH2-CH3)的CH1结构域。SEQ IDNO：163中的Fc结构域包括Y349C取代，其与连接到NKG2D结合的scFv(SEQ ID NO：162)的Fc的CH3结构域中的S354C取代形成二硫键。在SEQ ID NO：163中，Fc结构域还包括K360E和K409W取代。
SEQ ID NO：165表示Fab片段的轻链部分，其包含BCMA结合位点的轻链可变结构域(SEQ ID NO：152)和轻链恒定结构域。
抗BCMA-全LC
Figure BDA0003011301110000173
在一个示例性实施方案中，连接到NKG2D结合的scFv片段的Fc结构域包含K360E和K409W的突变，并且连接到BCMA Fab片段的Fc结构域包含用于形成异二聚体的匹配突变Q347R、D399V和F405T。
在一个示例性实施方案中，连接到NKG2D结合的scFv的Fc结构域包括CH3结构域中的Y349C取代，其与连接到BCMA结合的Fab片段的Fc上的S354C取代形成二硫键。
F3 TriNKET是异二聚体多特异性抗体，其包含三种肽：第一免疫球蛋白重链、第二免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链(图2)。第一免疫球蛋白重链从N末端到C末端包括结合NKG2D的scFv以及第一Fc(CH2-CH3)结构域，其中结合NKG2D的scFv经由接头或铰链连接到第一Fc(图2)。第二免疫球蛋白重链从N末端到C末端包括(VH-CH1)结构域和第二Fc(CH2-CH3)结构域，其中第二Fc结构域在其N末端经由接头或铰链连接到(VH-CH1)结构域，并且其中(VH-CH1)结构域与轻链配对以形成结合BCMA的Fab(图2)。称为“NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA”的TriNKET可以是指图2中描述的TriNKET。本公开的另一示例性TriNKET是NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA，其序列描述于下文中(CDR(Kabat编号)以下划线表示)。
示例性NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA包括BCMA结合的Fab片段，其包括含有重链可变结构域(SEQ ID NO：148)和CH1结构域的重链部分，以及含有轻链可变结构域(SEQ IDNO：152)和轻链恒定结构域的轻链部分，其中所述重链可变结构域连接到CH1结构域，并且CH1结构域连接到Fc结构域。NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA还包含连接到Fc结构域(SEQ IDNO：166)的NKG2D结合的scFv。
SEQ ID NO：163表示如图2中所示的NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA的示例性第二免疫球蛋白重链，包括抗BCMA Fab片段的重链部分，所述重链部分包含BCMA结合位点的重链可变结构域(SEQ ID NO：148)和连接到Fc结构域的CH1结构域。SEQ ID NO：163中的Fc结构域包括Y349C取代，其与连接到NKG2D结合的scFv(SEQ ID NO：166)的Fc的CH3结构域中的S354C取代形成二硫键，以形成NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA。在SEQ ID NO：163中，Fc结构域还包括K360E和K409W取代。
在NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA的示例性第一免疫球蛋白重链中，NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA中的scFv包括使用(G4S)4接头(SEQ ID NO：164)连接到重链可变结构域的NKG2D结合位点的轻链可变结构域(表示为(VL(G4S)4VH))，其连接到Fc结构域。在NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA中，将scFv(SEQ ID NO：161)的轻链和重链可变结构域连接为VL-(G4S)4-VH；VL和VH包含100VL-44VH S-S桥(分别由G100C和G44C取代产生)(半胱氨酸残基以粗斜体下划线表示)；并且VH经由Ala-Ser连接到Fc结构域。
SEQ ID NO：166表示经由包含Ala-Ser的铰链连接到Fc结构域的NKG2D结合的scFv的完整序列(scFv-Fc)。连接到scFv的Fc结构域包括Q347R、D399V和F405T取代。
F3-NKG2D结合scFv，-Fc-AJ链B[VL(G4S)4VH)]
Figure BDA0003011301110000181
在NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA的示例性实施方案中，连接到NKG2D结合的scFv片段的第一免疫球蛋白重链的Fc结构域包含K360E和K409W的突变，并且连接到BCMA Fab片段的第二免疫球蛋白重链的Fc结构域包含用于形成异二聚体的匹配突变Q347R、D399V和F405T。
在NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA的示例性实施方案中，连接到NKG2D结合的scFv的第一免疫球蛋白重链的Fc结构域包括CH3结构域中的Y349C取代，其与连接到BCMA结合的Fab片段的第二免疫球蛋白重链的Fc结构域上的S354C取代形成二硫键。
多特异性结合蛋白可与表达NKG2D受体的细胞结合，所述表达NKG2D受体的细胞可包括但不限于NK细胞、γδT细胞和CD8+αβ T细胞。在NKG2D结合后，多特异性结合蛋白可阻断天然配体(诸如ULBP6和MICA)与NKG2D结合并活化NKG2D受体。
多特异性结合蛋白与表达CD16的细胞结合，CD16是白细胞(包括自然杀伤细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和滤泡树突状细胞)表面上的Fc受体。
本公开的蛋白质以10nM或更小的KD的亲和力与NKG2D结合，例如约10nM、约9nM、约8nM、约7nM、约6nM、约5nM、约4.5nM、约4nM、约3.5nM、约3nM、约2.5nM、约2nM、约1.5nM、约1nM、约0.5nM与约1nM之间、约1nM与约2nM之间、约2nM与3nM之间、约3nM与4nM之间、约4nM与约5nM之间、约5nM与约6nM之间、约6nM与约7nM之间、约7nM与约8nM之间、约8nM与约9nM之间、约9nM与约10nM之间、约1nM与约10nM之间、约2nM与约10nM之间、约3nM与约10nM之间、约4nM与约10nM之间、约5nM与约10nM之间、约6nM与约10nM之间、约7nM与约10nM之间或约8nM与约10nM之间。
在与自然杀伤细胞上的NKG2D受体和CD16受体以及癌细胞上的肿瘤相关抗原结合后，多特异性结合蛋白可接合不止一种NK活化受体，并且可阻断天然配体与NKG2D的结合。在某些实施方案中，所述蛋白质可激动人中的NK细胞。在一些实施方案中，所述蛋白质可激动人和其他物种诸如啮齿动物和食蟹猴中的NK细胞。
与细胞毒性T细胞上的NKG2D受体和CD16受体以及癌细胞上的肿瘤相关抗原结合后，多特异性结合蛋白可接合不止一种活化受体，并且可阻断天然配体与NKG2D的结合。在某些实施方案中，所述蛋白质可激动人中的细胞毒性T细胞。在一些实施方案中，所述蛋白质可激动人和其他物种诸如啮齿动物和食蟹猴中的细胞毒性T细胞。
NKG2D结合位点
表1列出了可与NKG2D结合的呈组合的重链可变结构域和轻链可变结构域的肽序列。在一些实施方案中，重链可变结构域和轻链可变结构域以Fab形式排列。在一些实施方案中，重链可变结构域和轻链可变结构域融合在一起以形成scFv。
NKG2D结合结构域可在其与NKG2D的结合亲和力方面变化，然而其可活化表达NKG2D的细胞，诸如NK细胞和细胞毒性T细胞。
除非另外指出，否则表1中提供的CDR序列是在Kabat下测定的。
Figure BDA0003011301110000191
Figure BDA0003011301110000201
Figure BDA0003011301110000211
Figure BDA0003011301110000221
Figure BDA0003011301110000231
Figure BDA0003011301110000241
Figure BDA0003011301110000251
Figure BDA0003011301110000261
Figure BDA0003011301110000271
Figure BDA0003011301110000281
可替代地，由SEQ ID NO：110表示的重链可变结构域可与由SEQ ID NO：111表示的轻链可变结构域配对，以形成可与NKG2D结合的抗原结合位点，如US 9，273，136中所说明。
SEQ ID NO：110
Figure BDA0003011301110000282
SEQ ID NO：111
Figure BDA0003011301110000283
可替代地，由SEQ ID NO：112表示的重链可变结构域可与由SEQ ID NO：113表示的轻链可变结构域配对，以形成可与NKG2D结合的抗原结合位点，如US 7，879，985中所说明。
SEQ ID NO：112
Figure BDA0003011301110000284
SEQ ID NO：113
Figure BDA0003011301110000285
肿瘤相关抗原结合位点
本公开提供一种BCMA结合位点，其中重链可变结构域和轻链可变结构域。在一些实施方案中，BCMA结合位点经由铰链连接到本文公开的蛋白质的足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的抗原结合位点。本文公开的蛋白质可提供BCMA的单价或二价接合，并具有一个或两个BCMA结合位点。在一些实施方案中，本文公开的蛋白质具有两个BCMA结合位点，每个BCMA结合位点经由铰链连接到本文公开的蛋白质的足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的抗原结合位点。
表2列出了可与BCMA结合的呈组合的重链可变结构域和轻链可变结构域的肽序列。
Figure BDA0003011301110000286
Figure BDA0003011301110000291
Figure BDA0003011301110000301
可替代地，BCMA结合结构域可包括如下文83A10和MAB42中所列的重链可变结构域和轻链可变结构域。
83A10重链可变结构域(SEQ ID NO：157)：
Figure BDA0003011301110000302
83A10轻链可变结构域(SEQ ID NO：158)：
Figure BDA0003011301110000303
可替代地，可与BCMA结合的新型抗原结合位点可通过筛选与由SEQ ID NO：156定义的氨基酸序列的结合来鉴定。
SEQ ID NO：156
Figure BDA0003011301110000304
在Fc结构域内，CD16结合由铰链区和CH2结构域介导。例如，在人IgG1内，与CD16的相互作用主要集中在CH2结构域中的氨基酸残基Asp 265-Glu 269、Asn 297-Thr299、Ala327-Ile 332、Leu 234-Ser 239和碳水化合物残基N-乙酰基-D-葡糖胺(参见Sondermann等，Nature，406(6793)∶267-273)。基于已知的结构域，可选择突变以增强或降低对CD16的结合亲和力，诸如通过使用噬菌体展示文库或酵母表面展示cDNA文库，或可基于相互作用的已知三维结构来设计突变。
异二聚体抗体重链的组装可通过在同一细胞中表达两种不同抗体重链序列来完成，这可导致每条抗体重链的同二聚体的组装以及异二聚体的组装。促进异二聚体的优先组装可通过将不同突变掺入每个抗体重链恒定区的CH3结构域中来完成，如US13/494870、US16/028850、US11/533709、US12/875015、US13/289934、US14/773418、US12/811207、US13/866756、US14/647480和US14/830336中所示。例如，可在基于人IgG1的CH3结构域中进行突变并将不同的氨基酸取代对掺入第一多肽和第二多肽内，从而允许这两条链彼此选择性地异二聚化。下文所说明的氨基酸取代位置均根据如Kabat中的EU索引编号。
在一种情况下，第一多肽中的氨基酸取代使用选自精氨酸(R)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)或色氨酸(W)的较大氨基酸替换原始氨基酸，并且第二多肽中的至少一个氨基酸取代使用选自丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)或缬氨酸(V)的较小氨基酸替换原始氨基酸，以使较大氨基酸取代(突起)适合较小氨基酸取代(空腔)的表面。例如，一个多肽可掺入T366W取代，并且另一个多肽可掺入三个取代，包括T366S、L368A和Y407V。
本发明的抗体重链可变结构域可任选地偶联到与抗体恒定区(诸如IgG恒定区，包括铰链、具有或不具有CH1结构域的CH2和CH3结构域)具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，恒定区的氨基酸序列与人抗体恒定区(诸如人IgG1恒定区、IgG2恒定区、IgG3恒定区或IgG4恒定区)具有至少90％同一性。在一些其他实施方案中，恒定区的氨基酸序列与来自另一哺乳动物，诸如兔、狗、猫、小鼠或马的抗体恒定区具有至少90％同一性。与人IgG1恒定区相比，可将一个或多个突变掺入恒定区中，例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和/或K439处。示例性取代包括例如Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D和K439E。
在某些实施方案中，可掺入人IgG1恒定区的CH1中的突变可在氨基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171和/或V173处。在某些实施方案中，可掺入人IgG1恒定区的CK中的突变可在氨基酸E123、F116、S176、V163、S174和/或T164处。
氨基酸取代可选自表3中所示的以下取代组。
Figure BDA0003011301110000311
Figure BDA0003011301110000321
可替代地，氨基酸取代可选自表4中所示的以下取代组。
表4
第一多肽 第二多肽
第1组 K409W D399V/F405T
第2组 Y349S E357W
第3组 K360E Q347R
第4组 K3 60E/K409W Q347R/D399V/F405T
第5组 Q347E/K360E/K409W Q347R/D399V/F405T
第6组 Y349S/K409W E357W/D399V/F405T
可替代地，氨基酸取代可选自表5中所示的以下取代组。
表5
第一多肽 第二多肽
第1组 T366K/L351K L351D/L368E
第2组 T366K/L351K L351D/Y349E
第3组 T366K/L351K L351D/Y349D
第4组 T366K/L351K L351D/Y349E/L368E
第5组 T366K/L351K L351D/Y349D/L368E
第6组 E356K/D399K K392D/K409D
可替代地，每条多肽链中的至少一个氨基酸取代可选自表6。
Figure BDA0003011301110000322
可替代地，至少一个氨基酸取代可选自表7中的以下取代组，其中第一多肽列中指示的位置被任何已知带负电的氨基酸替换，并且第二多肽列中指示的位置被任何已知带正电的氨基酸替换。
表7
第一多肽 第二多肽
K392、K370、K409或K439 D399、E356或E357
可替代地，至少一个氨基酸取代可选自表8中的以下组，其中第一多肽列中指示的位置被任何已知带正电的氨基酸替换，并且第二多肽列中指示的位置被任何已知带负电的氨基酸替换。
表8
第一多肽 第二多肽
D399、E356或E357 K409、K439、K370或K392
可替代地，氨基酸取代可选自表9中的以下组。
表9
第一多肽 第二多肽
T350V、L351Y、F405A和Y407V T350V、T366L、K392L和T394W
可替代地或另外地，可通过在第一或第二多肽链中的任一条上引入S354C并在相反的多肽链中引入Y349C(其在两个多肽的界面内形成人工二硫桥)来提高异多聚体蛋白的结构稳定性。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与位置T366处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与选自由T366、L368和Y407组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与选自由T366、L368和Y407组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与位置T366处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与选自由E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与选自由Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与选自由Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与选自由E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405和T411组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与选自由L351、D399、S400和Y407组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与选自由T366、N390、K392、K409和T411组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与选自由T366、N390、K392、K409和T411组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与选自由L351、D399、S400和Y407组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与选自由Q347、Y349、K360和K409组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与选自由Q347、E357、D399和F405组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与选自由Q347、E357、D399和F405组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与选自由Y349、K360、Q347和K409组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与选自由K370、K392、K409和K439组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与选自由D356、E357和D399组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与选自由D356、E357和D399组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与选自由K370、K392、K409和K439组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与选自由L351、E356、T366和D399组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与选自由Y349、L351、L368、K392和K409组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与选自由Y349、L351、L368、K392和K409组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与选自由L351、E356、T366和D399组成的组的一个或多个位置处的IgG1恒定区的氨基酸序列不同。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于S354C取代，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于Y349C取代。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于Y349C取代，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于S354C取代。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于K360E和K409W取代，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于O347R、D399V和F405T取代。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于O347R、D399V和F405T取代，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于K360E和K409W取代。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于T366W取代，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于T366S、T368A和Y407V取代。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于T366S、T368A和Y407V取代，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于T366W取代。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于T350V、L351Y、F405A和Y407V取代，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于T350V、T366L、K392L和T394W取代。
在一些实施方案中，抗体恒定区的一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于T350V、T366L、K392L和T394W取代，并且其中抗体恒定区的另一条多肽链的氨基酸序列与IgG1恒定区的氨基酸序列不同之处在于T350V、L351Y、F405A和Y407V取代。
上文所述的多特异性蛋白可使用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术制备。例如，可将编码第一免疫球蛋白重链的第一核酸序列克隆到第一表达载体中；可将编码第二免疫球蛋白重链的第二核酸序列克隆到第二表达载体中；可将编码免疫球蛋白轻链的第三核酸序列克隆到第三表达载体中；并且可将第一、第二和第三表达载体一起稳定地转染到宿主细胞中以产生多聚体蛋白。
为实现多特异性蛋白的最高产量，可探索第一、第二和第三表达载体的不同比率以确定转染到宿主细胞中的最佳比率。转染后，可使用本领域已知的方法诸如有限稀释、ELISA、FACS、显微术或Clonepix分离单个克隆用于产生细胞库。
克隆可在适用于生物反应器放大的条件下进行培养并保持多特异性蛋白的表达。多特异性蛋白可使用本领域中已知的方法，包括离心、深度过滤、细胞裂解、匀浆、冻融、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换色谱、疏水性相互作用交换色谱和混合模式色谱进行分离和纯化。
II.多特异性蛋白的特征
包含NKG2D结合的scFv和BCMA结合结构域的本公开的多特异性结合蛋白(例如，NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA或NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA)在减少肿瘤生长和杀死癌细胞方面更有效。例如，靶向表达BCMA肿瘤/癌细胞的本公开的多特异性结合蛋白比抗BCMA单克隆抗体MAB42更有效。与抗BCMA单克隆抗体MAB42相比，本公开的NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA的TriNKET在促进表达BCMA的人癌细胞系的NK介导的细胞裂解方面更有效。
NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA显示与表达NKG2D的细胞的弱结合。然而，与MAB42抗BCMA mAb相比，本文所述的包含NKG2D结合结构域的多特异性结合蛋白(例如NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA或NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA)在靶细胞的效能和最大裂解方面表现出显著优势。
因此，与单克隆抗体相比，本文所述的多特异性结合蛋白(例如NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA或NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA)在治疗表达BCMA的癌症方面是有利的。
III.治疗应用
本文公开的蛋白质可用于活化细胞毒性T细胞或自然杀伤细胞。在一些实施方案中，本文提供通过使细胞毒性T细胞暴露于本文公开的蛋白质来活化细胞毒性T细胞的方法。在一些实施方案中，本文提供通过使自然杀伤细胞暴露于本文公开的蛋白质来活化自然杀伤细胞的方法。
因此，本文提供通过在细胞毒性T细胞或自然杀伤细胞存在的情况下使肿瘤细胞暴露于本文公开的蛋白质来增强肿瘤细胞死亡的方法。在一些实施方案中，本文提供通过在细胞毒性T细胞存在的情况下使肿瘤细胞暴露于本文公开的蛋白质来增强肿瘤细胞死亡的方法。在一些实施方案中，本文提供通过在自然杀伤细胞存在的情况下使肿瘤细胞暴露于本文公开的蛋白质来增强肿瘤细胞死亡的方法。
本文还提供通过向受试者施用本文公开的蛋白质或本文公开的制剂来增强受试者中针对表达BCMA的癌细胞的免疫反应的方法。
本发明提供使用本文所述的多特异性结合蛋白和/或本文所述的药物组合物来治疗癌症的方法。通过向有需要的患者施用治疗有效量的本文所述的多特异性结合蛋白，所述方法可用于治疗多种癌症。在一些实施方案中，可通过本文公开的表达BCMA的蛋白质来治疗癌症。
治疗方法可根据待治疗的癌症来表征。例如，在某些实施方案中，癌症是乳腺癌、卵巢癌、食道癌、膀胱癌或胃癌、唾液管癌、唾液管癌、肺腺癌或侵袭性形式的子宫癌，诸如子宫浆液性子宫内膜癌。
在某些其他实施方案中，通过本文所述的多特异性结合蛋白和/或本文所述的药物组合物待治疗的癌症是脑癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、直肠癌、肾癌、胃癌、睾丸癌或子宫癌。而在其他实施方案中，癌症是鳞状细胞癌、腺癌、小细胞癌、黑色素瘤、神经母细胞瘤、肉瘤(例如血管肉瘤或软骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、胆道癌、甲状腺癌、肢端雀斑痣样黑色素瘤、光化性角化病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓系白血病、腺样囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鳞癌、肛管癌、肛门癌、肛门直肠癌、星形细胞肿瘤、巴多林腺癌(bartholin gland carcinoma)、基底细胞癌、胆癌、骨癌、骨髓癌、支气管癌、支气管腺癌、类癌、胆管癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓系白血病、透明细胞癌、结缔组织癌、囊腺瘤、消化系统癌、十二指肠癌、内分泌系统癌、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、内皮细胞癌、室管膜癌、上皮细胞癌、尤文氏肉瘤(Ewing’s sarcoma)、眼和眼眶癌、女性生殖器癌、局灶性结节性增生、胆囊癌、胃窦癌、胃底癌、胃泌素瘤、胶质母细胞瘤、胰高血糖素瘤、心脏癌、血管母细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝胆癌、肝细胞癌、霍奇金病(Hodgkin’s disease)、回肠癌、胰岛素瘤、上皮内瘤变、上皮间鳞状细胞瘤、肝内胆管癌、浸润性鳞状细胞癌、空肠癌、关节癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、骨盆癌、大细胞癌、大肠癌、平滑肌肉瘤、雀斑恶性黑色素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌、恶性黑色素瘤、恶性间皮瘤、髓母细胞瘤、髓上皮瘤、脑膜癌、间皮癌、转移性癌、口腔癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤、肌肉癌、鼻腔癌、神经系统癌、神经上皮腺癌结节性黑色素瘤、非上皮性皮肤癌、非霍奇金淋巴瘤、燕麦细胞癌、少突胶质细胞癌、口腔癌、骨肉瘤、乳头状浆液性腺癌、阴茎癌、咽癌、垂体瘤、浆细胞瘤、假性肉瘤、肺母细胞瘤、直肠癌、肾细胞癌、呼吸系统癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌、窦癌、皮肤癌、小细胞癌、小肠癌、平滑肌癌、软组织癌、生长抑制素分泌性肿瘤、脊柱癌、鳞状细胞癌、横纹肌癌、间皮下癌、浅表扩散性黑色素瘤、T细胞白血病、舌癌、未分化性瘤、输尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿系统癌、宫颈癌、子宫体癌、葡萄膜黑色素瘤、阴道癌、疣状癌、血管活性肠肽瘤(VIPoma)、外阴癌、高分化癌或威尔姆斯(Wilms)肿瘤。
在某些其他实施方案中，通过本文所述的多特异性结合蛋白和/或本文所述的药物组合物待治疗的癌症是非霍奇金淋巴瘤，诸如B细胞淋巴瘤或T细胞淋巴瘤。在某些实施方案中，非霍奇金淋巴瘤是B细胞淋巴瘤，诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤、原发性纵隔B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、结外边缘区B细胞淋巴瘤、结节边缘区B细胞淋巴瘤、脾边缘区B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkittlymphoma)、淋巴浆细胞性淋巴瘤、毛细胞白血病或原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤。在某些其他实施方案中，非霍奇金淋巴瘤是T细胞淋巴瘤，诸如前体T淋巴母细胞性淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤、结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤、肠病型T细胞淋巴瘤、皮下脂膜炎样T细胞淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤或外周T细胞淋巴瘤。
在某些实施方案中，通过本文所述的多特异性结合蛋白和/或本文所述的药物组合物待治疗的癌症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在某些实施方案中，所述DLBCL是生发中心B细胞(GCB)DLBCL。在某些实施方案中，所述DLBCL是活化B细胞(ABC)DLBCL。
在某些实施方案中，通过本文所述的多特异性结合蛋白和/或本文所述的药物组合物待治疗的癌症是多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤或急性髓系白血病。在某些实施方案中，所述癌症是多发性骨髓瘤。在某些实施方案中，所述癌症是慢性淋巴细胞性白血病。在某些实施方案中，所述癌症是急性髓系白血病。
待治疗的癌症可根据在癌细胞表面上表达的特定抗原的存在来表征。在某些实施方案中，除了BCMA外，癌细胞可表达以下一者或多者：CD2、CD19、CD20、CD30、CD38、CD40、CD52、CD70、EGFR/ERBB1、IGF1R、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4、MUC1、cMET、SLAMF7、PSCA、MICA、MICB、TRAILR1、TRAILR2、MAGE-A3、B7.1、B7.2、CTLA4和PD1。
IV.组合疗法
本发明的另一方面提供了组合疗法。本文所述的多特异性结合蛋白可与额外的治疗剂组合使用以治疗癌症。
可在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的示例性治疗剂包括例如放射、丝裂霉素、维甲酸、利铂莫司汀(ribomustin)、吉西他滨(gemcitabine)、长春新碱(vincristine)、依托泊苷(etoposide)、克拉屈滨(cladribine)、二溴甘露醇、甲氨喋呤、阿霉素(doxorubicin)、卡波醌(carboquone)、喷司他丁(pentostatin)、二胺硝吖啶(nitracrine)、净司他丁(zinostatin)、西曲瑞克(cetrorelix)、来曲唑(letrozole)、雷替曲塞(raltitrexed)、道诺霉素(daunorubicin)、法倔唑(fadrozole)、福莫司汀(fotemustine)、胸腺法新(thymalfasin)、索布佐生(sobuzoxane)、奈达铂(nedaplatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、比卡鲁胺(bicalutamide)、长春瑞滨(vinorelbine)、维司力农(vesnarinone)、氨鲁米特(aminoglutethimide)、安吖啶(amsacrine)、丙谷胺(proglumide)、依利醋铵(elliptinium acetate)、酮色林(ketanserin)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依曲替酯(etretinate)、异维甲酸(isotretinoin)、链脲菌素(streptozocin)、尼莫司汀(nimustine)、长春地辛(vindesine)、氟他胺(flutamide)、得罗净利(drogenil)、布缩宫素(butocin)、卡莫氟(carmofur)、雷佐生(razoxane)、西佐喃(sizofilan)、卡铂(carboplatin)、二溴卫矛醇(mitolactol)、喃氟啶(tegafur)、异环磷酰胺(ifosfamide)、泼尼莫司汀(prednimustine)、毕西巴尼(picibanil)、左旋咪唑(levamisole)、替尼泊苷(teniposide)、英丙舒凡(improsulfan)、依诺他滨(enocitabine)、麦角乙脲(lisuride)、羟甲烯龙(oxymetholone)、他莫昔芬(tamoxifen)、孕酮、美雄烷(mepitiostane)、环硫雄醇(epitiostanol)、福美司坦(formestane)、干扰素-α、干扰素-2α、干扰素-β、干扰素-γ(IFN-γ)、集落刺激因子1、集落刺激因子2、地尼白介素(denileukin diftitox)、白介素2、促黄体激素释放因子和上述剂的变体，其可表现与其同源受体的差异结合或增加或减少的血清半衰期。
对于某些癌症，例如多发性骨髓瘤，额外的疗法可以是来那度胺(lenalidomide)、泊马度胺(pomalidomide)、沙利度胺(thalidomide)、硼替佐米(bortezomib)、地塞米松(dexamethasone)、环磷酰胺、阿霉素、卡非佐米(carfilzomib)、伊沙佐米(iaxizomib)、顺铂、阿霉素、依托泊苷、抗CD38抗体(诸如达雷木单抗(daratumumab)、帕比司他(panobinostat)和埃罗妥珠单抗(elotuzumab))中的一种或多种，它们可以是单独的、上文列出的组合中的一种或任何其他组合。
可在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的额外类别的剂是免疫检查点抑制剂。示例性免疫检查点抑制剂包括抑制以下一者或多者的剂：(i)细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)，(ii)程序性细胞死亡蛋白1(PD1)，(iii)PDL1，(iv)LAG3，(v)B7-H3，(vi)B7-H4和(vii)TIM3。CTLA4抑制剂伊匹单抗(ipilimumab)已由美国食品和药物管理局批准用于治疗黑色素瘤。
而可在治疗癌症中用作组合疗法的一部分的其他剂是靶向非检查点靶点的单克隆抗体剂(例如赫赛汀(herceptin))和非细胞毒性剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)。
而其他类别抗癌剂包括例如：(i)选自以下的抑制剂：ALK抑制剂、ATR抑制剂、A2A拮抗剂、碱基切除修复抑制剂、Bcr-Abl酪氨酸激酶抑制剂、布鲁顿氏(Bruton)酪氨酸激酶抑制剂、CDC7抑制剂、CHK1抑制剂、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂、DNA-PK抑制剂、DNA-PK和mTOR两者的抑制剂、DNMT1抑制剂、DNMT1抑制剂加2-氯-脱氧腺苷、HDAC抑制剂、刺猬信号通路抑制剂、IDO抑制剂、JAK抑制剂、mTOR抑制剂、MEK抑制剂、MELK抑制剂、MTH1抑制剂、PARP抑制剂、磷酸肌醇3-激酶抑制剂、PARP1和DHODH两者的抑制剂、蛋白酶体抑制剂、拓朴异构酶II抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂、VEGFR抑制剂和WEE1抑制剂；(ii)OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS的激动剂；以及(iii)选自IL-12、IL-15、GM-CSF和G-CSF的细胞因子。
本发明的蛋白质还可用作手术移除原发灶的辅助手段。
可选择多特异性结合蛋白和额外的治疗剂的量以及施用的相对时间以便达到所需的组合治疗效果。例如，当向需要此类施用的患者施用组合疗法时，组合中的治疗剂或包含治疗剂的一种或多种药物组合物可以任何顺序(例如像依次、并行、一起、同时等)施用。此外，例如可在额外的治疗剂发挥其预防或治疗作用期间施用多特异性结合蛋白，反之亦然。
V.药物组合物
本公开的特征还在于包含治疗有效量的本文所述的蛋白质的药物组合物。可配制组合物以用于多种药物递送系统。组合物中还可包含一种或多种生理学上可接受的赋形剂或载剂以进行适当配制。在本公开中使用的合适的制剂见于Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack Publishing Company，Philadelphia，Pa.，第17版，1985。关于药物递送方法的简要综述，参见例如Langer(Science 249：1527-1533，1990)。
本公开的静脉内药物递送制剂可包含在袋、笔或注射器中。在某些实施方案中，袋可连接到包含管和/或针的通道。在某些实施方案中，制剂可以是冻干制剂或液体制剂。在某些实施方案中，制剂可经冷冻干燥(冻干)并包含在约12-60个小瓶中。在某些实施方案中，制剂可经冷冻干燥并且45mg冷冻干燥制剂可包含在一个小瓶中。在某些实施方案中，约40mg至约100mg冷冻干燥制剂可包含在一个小瓶中。在某些实施方案中，将来自12、27或45个小瓶的冷冻干燥制剂组合以在静脉内药物制剂中获得治疗剂量的蛋白质。在某些实施方案中，制剂可以是液体制剂并且以约250mg/小瓶至约1000mg/小瓶储存。在某些实施方案中，制剂可以是液体制剂并且以约600mg/小瓶储存。在某些实施方案中，制剂可以是液体制剂并且以约250mg/小瓶储存。
所述蛋白质可存在于液体水性药物制剂中，所述液体水性药物制剂在形成制剂的缓冲溶液中包括治疗有效量的蛋白质。
这些组合物可通过常规灭菌技术来灭菌，或可进行无菌过滤。可将所得的水性溶液包装用于原样使用，或冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水性载剂组合。制剂的pH通常在3与11之间，更优选地在5与9之间或在6与8之间，并且最优选地在7与8之间，诸如7至7.5。呈固体形式的所得组合物可以多个单次剂量单位包装，每个单次剂量单位包含固定量的一种或多种上述剂。呈固体形式的组合物还可以灵活的数量包装在容器中。
在某些实施方案中，本公开提供一种具有延长的保质期的制剂，其包括本公开的蛋白质与以下物质的组合：甘露醇、一水合柠檬酸、柠檬酸钠、二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、氯化钠、聚山梨酯80、水和氢氧化钠。
在某些实施方案中，制备在pH缓冲溶液中包含本公开的蛋白质的水性制剂。本发明的缓冲液的pH范围可以是约4至约8，例如约4.5至约6.0或约4.8至约5.5，或pH可以是约5.0至约5.2。上述pH的中间范围也意图成为本公开的一部分。例如，意图包括使用任何上述值的组合作为上限和/或下限的值的范围。将pH控制在此范围内的缓冲液的实例包括乙酸盐(例如乙酸钠)、琥珀酸盐(诸如琥珀酸钠)、葡萄糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲液。
在某些实施方案中，制剂包括缓冲系统，所述缓冲系统包含柠檬酸盐和磷酸盐以将pH保持在约4至约8的范围内。在某些实施方案中，pH范围可以是约4.5至约6.0，或约pH4.8至约5.5，或pH范围为约5.0至约5.2。在某些实施方案中，缓冲系统包含一水合柠檬酸、柠檬酸钠、二水合磷酸氢二钠和/或二水合磷酸二氢钠。在某些实施方案中，缓冲系统包含约1.3mg/mL柠檬酸(例如1.305mg/mL)、约0.3mg/mL柠檬酸钠(例如0.305mg/mL)、约1.5mg/mL二水合磷酸氢二钠(例如1.53mg/mL)、约0.9mg/mL二水合磷酸二氢钠(例如0.86)和约6.2mg/mL氯化钠(例如6.165mg/mL)。在某些实施方案中，缓冲系统包含1-1.5mg/mL柠檬酸、0.25至0.5mg/mL柠檬酸钠、1.25至1.75mg/mL二水合磷酸氢二钠、0.7至1.1mg/mL二水合磷酸二氢钠以及6.0至6.4mg/mL氯化钠。在某些实施方案中，使用氢氧化钠调节制剂的pH。
制剂中还可包含多元醇，其充当张力修饰剂并可稳定抗体。将多元醇以可相对于制剂所需的等渗性而改变的量加入到制剂中。在某些实施方案中，水性制剂可以是等渗的。多元醇的添加量还可相对于多元醇的分子量而改变。例如，与二糖(诸如海藻糖)相比，可添加较少量的单糖(例如甘露醇)。在某些实施方案中，可作为张度剂用于制剂中的多元醇是甘露醇。在某些实施方案中，甘露醇的浓度可以是约5至约20mg/mL。在某些实施方案中，甘露醇的浓度可以是约7.5至15mg/mL。在某些实施方案中，甘露醇的浓度可以是约10-14mg/mL。在某些实施方案中，甘露醇的浓度可以是约12mg/mL。在某些实施方案中，制剂中可包含多元醇山梨糖醇。
还可将洗涤剂或表面活性剂加入到制剂中。示例性洗涤剂包括非离子型洗涤剂，诸如聚山梨酯(例如聚山梨酯20、80等)或泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)。添加的洗涤剂的量使得其减少配制的抗体的聚集和/或使制剂中微粒的形成最小化和/或减少吸附。在某些实施方案中，制剂可包含为聚山梨酯的表面活性剂。在某些实施方案中，制剂可包含洗涤剂聚山梨酯80或Tween80。Tween80是用于描述聚氧乙烯(20)脱水山梨糖醇单油酸酯的术语(参见Fiedler，Lexikon der Hifsstoffe，Editio Cantor Verlag Aulendorf，第4版，1996)。在某些实施方案中，制剂可包含约0.1mg/mL与约10mg/mL之间或约0.5mg/mL与约5mg/mL之间的聚山梨酯80。在某些实施方案中，在制剂中可添加约0.1％聚山梨酯80。
在实施方案中，将本公开的蛋白产物配制为液体制剂。液体制剂可以10mg/mL浓度呈现在USP/Ph Eur I型50R小瓶中，所述小瓶使用橡胶塞封闭并使用铝压接密封盖密封。塞子可由符合USP和Ph Eur的弹性体制成。在某些实施方案中，小瓶可填充有61.2mL蛋白产物溶液，以允许60mL的可提取体积。在某些实施方案中，液体制剂可使用0.9％盐水溶液稀释。
在某些实施方案中，本公开的液体制剂可与稳定水平的糖组合制备为10mg/mL浓度的溶液。在某些实施方案中，液体制剂可在水性载剂中制备。在某些实施方案中，可以不大于可能导致不期望的或不适合静脉内施用的黏度的量添加稳定剂。在某些实施方案中，糖可以是二糖，例如蔗糖。在某些实施方案中，液体制剂还可包含缓冲剂、表面活性剂和防腐剂中的一种或多种。
在某些实施方案中，液体制剂的pH可通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定。在某些实施方案中，药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方案中，碱可以是氢氧化钠。
除聚集以外，脱酰胺作用是肽和蛋白质的常见产物变异，其可能发生在发酵、收获/细胞澄清、纯化、药物物质/药物产物储存期间以及样品分析期间。脱酰胺作用是从蛋白质中损失NH3，以形成可进行水解的琥珀酰亚胺中间体。琥珀酰亚胺中间体导致亲本肽质量减少17道尔顿(dalton)。随后的水解导致质量增加18道尔顿。琥珀酰亚胺中间体由于在水性条件下的不稳定性而难以分离。因此，脱酰胺作用通常可检测为质量增加1道尔顿。天冬酰胺的脱酰胺作用产生天冬氨酸或异天冬氨酸。影响脱酰胺作用速率的参数包括pH、温度、溶剂介电常数、离子强度、一级序列、局部多肽构象和三级结构。肽链中与Asn相邻的氨基酸残基影响脱酰胺作用速率。蛋白质序列中的Asn后的Gly和Ser导致脱酰胺作用的敏感性更高。
在某些实施方案中，本公开的液体制剂可在pH和湿度条件下保存以防止蛋白产物的脱氨基作用。
本文感兴趣的水性载剂是药学上可接受的(对于向人施用而言是安全且无毒的)并且对制备液体制剂有用的水性载剂。说明性载剂包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏(Ringer)溶液或右旋糖溶液。
可将防腐剂任选地加入到本文的制剂中以减少细菌作用。防腐剂的添加可例如促进多次使用(多剂量)制剂的生产。
静脉内(IV)制剂在特定情况下可以是优选的施用途径，诸如当患者在移植后在医院经由IV途径接受所有药物时。在某些实施方案中，在施用前将液体制剂使用0.9％氯化钠溶液稀释。在某些实施方案中，用于注射的稀释药物产物是等渗的并且适用于通过静脉内输注来施用。
在某些实施方案中，可以10mM至200mM的量添加盐或缓冲液组分。盐和/或缓冲液是药学上可接受的并且来源于各种已知酸(无机和有机的)与“碱形成”金属或胺。在某些实施方案中，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，缓冲液可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液，在此情况下，钠、钾或铵离子可用作抗衡离子。
可将防腐剂任选地加入到本文的制剂中以减少细菌作用。防腐剂的添加可例如促进多次使用(多剂量)制剂的生产。
本文感兴趣的水性载剂是药学上可接受的(对于向人施用而言是安全且无毒的)并且对制备液体制剂有用的水性载剂。说明性载剂包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。
本公开的蛋白质可存在于包含蛋白质和冻干保护剂的冻干制剂中。冻干保护剂可以是糖，例如二糖。在某些实施方案中，冻干保护剂可以是蔗糖或麦芽糖。冻干制剂还可包含缓冲剂、表面活性剂、增体剂和/或防腐剂中的一种或多种。
用于稳定冻干药物产物的蔗糖或麦芽糖的量可以是蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比为至少1∶2。在某些实施方案中，蛋白质与蔗糖或麦芽糖的重量比可以是1∶2至1∶5。
在某些实施方案中，在冻干前，制剂的pH可通过添加药学上可接受的酸和/或碱来设定。在某些实施方案中，药学上可接受的酸可以是盐酸。在某些实施方案中，碱可以是氢氧化钠。
在冻干前，可将包含本公开蛋白质的溶液的pH调节在6与8之间。在某些实施方案中，冻干药物产物的pH范围可以是7至8。
在某些实施方案中，可以10mM至200mM的量添加盐或缓冲液组分。盐和/或缓冲液是药学上可接受的并且来源于各种已知酸(无机和有机的)“碱形成”金属或胺。在某些实施方案中，缓冲液可以是磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，缓冲液可以是甘氨酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐缓冲液，在此情况下，钠、钾或铵离子可用作抗衡离子。
在某些实施方案中，可添加“增体剂”。“增体剂”是一种化合物，其增加冻干混合物的质量并有助于冻干滤饼的物理结构(例如促进保持开放的孔结构的基本上均一的冻干滤饼的产生)。说明性增体剂包括甘露醇、甘氨酸、聚乙二醇和山梨糖醇。本发明的冻干制剂可包含此类增体剂。
可将防腐剂任选地加入到本文的制剂中以减少细菌作用。防腐剂的添加可例如促进多次使用(多剂量)制剂的生产。
在某些实施方案中，冻干药物产物可用水性载剂复原。本文感兴趣的水性载剂是药学上可接受的(例如对于向人施用而言是安全且无毒的)并且对冻干后制备液体制剂有用的水性载剂。说明性稀释剂包括无菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)、无菌盐水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。
在某些实施方案中，本公开的冻干药物产物使用无菌注射用水、USP(SWFI)或0.9％氯化钠注射液USP复原。在复原期间，将冻干粉末溶解成溶液。
在某些实施方案中，本公开的冻干蛋白产物用约4.5mL注射用水复原并使用0.9％盐水溶液(氯化钠溶液)稀释。
本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可变化，以便获得对于特定患者、组合物和施用模式有效达到所需治疗反应而对患者不具有毒性的活性成分的量。
对于每个患者，特定剂量可以是均一剂量，例如50-5000mg蛋白质。可替代地，可根据患者的大致体重或表面积调整患者的剂量。确定适当剂量的其他因素可包括待治疗或预防的疾病或病状、疾病的严重性、施用途径以及患者的年龄、性别和医学病状。本领域技术人员按常规方式，特别是根据本文公开的剂量信息和测定，进一步改进为确定适当的治疗剂量所必需的计算。还可通过使用确定剂量的已知测定，结合使用适当的剂量-反应数据来确定剂量。可在监测疾病进展时调节个别患者的剂量。可测量患者中可靶向的构建体或复合物的血液水平，以了解是否需要调节剂量以达到或保持有效浓度。药物基因组学可用于确定哪些可靶向的构建体和/或复合物及其剂量最可能对给定个体有效(Schmitz等，Clinica Chimica Acta 308：43-53，2001；Steimer等，Clinica Chimica Acta 308：33-41，2001)。
一般来说，基于体重的剂量是每千克体重约0.01μg至约100mg，诸如每千克体重约0.01μg至约100mg、每千克体重约0.01 μg至约50mg、每千克体重约0.01 μg至约10mg、每千克体重约0.01 μg至约1mg、每千克体重约0.01μg至约100μg、每千克体重约0.01μg至约50μg、每千克体重约0.01μg至约10μg、每千克体重约0.01μg至约1μg、每千克体重约0.01 μg至约0.1μg、每千克体重约0.1μg至约100mg、每千克体重约0.1μg至约50mg、每千克体重约0.1μg至约10mg、每千克体重约0.1μg至约1 mg、每千克体重约0.1μg至约100μg、每千克体重约0.1μg至约10μg、每千克体重约0.1μg至约1 μg、每千克体重约1μg至约100mg、每千克体重约1μg至约50mg、每千克体重约1μg至约10mg、每千克体重约1μg至约1mg、每千克体重约1μg至约100μg、每千克体重约1μg至约50μg、每千克体重约1μg至约10μg、每千克体重约10μg至约100mg、每千克体重约10μg至约50mg、每千克体重约10μg至约10mg、每千克体重约10μg至约1mg、每千克体重约10μg至约100μg、每千克体重约10μg至约50μg、每千克体重约50μg至约100mg、每千克体重约50μg至约50mg、每千克体重约50μg至约10mg、每千克体重约50μg至约1mg、每千克体重约50μg至约100μg、每千克体重约100μg至约100mg、每千克体重约100μg至约50mg、每千克体重约100μg至约10mg、每千克体重约100μg至约1mg、每千克体重约1mg至约100mg、每千克体重约1mg至约50mg、每千克体重约1mg至约10mg、每千克体重约10mg至约100mg、每千克体重约10mg至约50mg、每千克体重约50mg至约100mg。
可每天、每周、每月或每年给予剂量一次或多次，或者甚至每2年至20年一次。本领域的普通技术人员可根据所测量的可靶向的构建体或复合物在体液或组织中的滞留时间和浓度容易地估计给药的重复率。本发明的施用可以是静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、胸膜内、鞘内、腔内、通过导管灌注或直接病灶内注射。这可每天一次或多次、每周一次或多次、每月一次或多次以及每年一次或多次施用。
上文的描述描述了本发明的多个方面和实施方案。本专利申请具体考虑了方面和实施方案的所有组合和排列。
实施例
现已大体上描述本发明，通过参考以下实施例将更容易理解本发明，包括所述实施例仅出于说明本发明的某些方面和实施方案的目的并且不意图限制本发明。
实施例1-原代人NK细胞细胞毒性测定：
使用密度梯度离心从人外周血沉棕黄层中分离外周血单核细胞(PBMC)。将分离的PBMC洗涤并制备用于NK细胞的分离。使用带有磁珠的负选择技术分离NK细胞，分离的NK细胞的纯度通常＞90％CD3-CD56+。将分离的NK细胞静置过夜，第二天在细胞毒性测定中使用静置的NK细胞。
DELFIA细胞毒性测定：
从培养物中收获表达BCMA的人癌细胞系，将细胞使用HBS洗涤，并以106/mL重悬于生长培养基中以使用BATDA试剂(Perkin Elmer AD0116)标记。按照制造商的说明来标记靶细胞。标记后，将细胞使用HBS洗涤3次，并以0.5-1.0×105/mL重悬于培养基中。为了制备背景孔，将标记细胞的等分试样放在一边，并且将细胞从培养基中旋转出来。小心地将100μl培养基一式三份加入到孔中以避免干扰沉淀的细胞。将100μl BATDA标记的细胞加入到96孔板的每个孔中。保存用于从靶细胞中自发释放的孔，并且通过添加1％Triton-X来制备以最大程度裂解靶细胞的孔。在培养基中稀释单克隆抗体或针对BCMA的TriNKET(NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA)，并且向每个孔中加入50μl稀释的mAb或TriNKET。从培养物中收获静置的NK细胞，洗涤并根据所需的E∶T比率以105-2.0×106/mL重悬于培养基中。将50μl NK细胞加入到平板的每个孔中，以使培养物体积总计达到200μl。在进行测定前，在37℃下将平板使用5％CO2孵育2-3小时。
培养2-3小时后，将平板从培养箱中移出，并通过在200g下离心5分钟来沉淀细胞。将20μl培养物上清液转移到制造商提供的干净微孔板中，向每个孔中加入200μl室温的铕溶液。将平板避光并在平板振荡器上以250rpm孵育15分钟。使用Victor 3或SpectraMaxi3X仪器读取平板。如下计算特异性裂解％：特异性裂解％＝((实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放))*100％。
基于FACS的长期细胞毒性测定：
在嘌呤霉素选择后从停旋的培养物中收获表达BCMA并转导以稳定地表达NucLight Green(Essen BioScience 4475)的人癌细胞系，并以105/mL重悬于培养基中。将100μl靶细胞加入到96孔板的每个孔中。将NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA TriNKET在培养基中稀释，并将每种各50μl加入到重复的孔中。从培养物中收获静置过夜的纯化的人NK，洗涤并以4×105/mL重悬于培养基中。对于1∶1的效应细胞：靶细胞(E∶T)的比率，将50μl NK细胞加入到所有孔中，只有靶标的对照(其接受100μl培养基)除外。为了将新鲜处理的PBMC用作效应子，相比之下使用10∶1的E∶T比率。将平板在37℃下使用5％CO2孵育30小时。
共培养后，将细胞染色，固定并通过流式细胞术分析。检测到剩余靶细胞在FITC通道中发生强移位，其中使用活性染色排除死细胞。通过与只有靶标的对照样品比较来输出绿色事件的数量并且计算杀伤％。包括计数珠以确保记录的体积相当。
实施例2-TriNKET与NKG2D阳性细胞结合的评估
TriNKET在人全血中的结合
将100μl肝素化的人全血加入到每个管/孔中。将直接标记的TriNKET(NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA)或mAb直接加入到全血中，还添加直接缀合的mAb的混合物用于免疫表型分析，并将样品在室温下孵育20分钟。对于直接标记的NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA或mAb，在孵育后将2mL 1xRBC裂解/固定缓冲液加入到每个样品中。将样品在室温下孵育15分钟。在裂解后将样品洗涤一次，然后制备用于分析。
图3和图4示出了在抗BCMA TriNKET(NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA)或抗BCMA单克隆抗体存在的情况下，2小时内的BCMA阳性靶细胞系的人NK细胞裂解。分别将具有低和高BCMA表达的KMS12-PE细胞(图3)和MM.1R细胞(图4)用作靶细胞。NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA针对KMS12-PE和MM.1R细胞均表现出亚纳摩尔EC50值。与抗BCMA单克隆抗体(MAB42)相比，NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA提供针对两种细胞系(KMS12-PE细胞(图3)和MM.1R细胞(图4))的更大的最大特异性裂解和效能。
通过TriNKET的BCMA表面稳定
将KMS12-PE或MM.1R细胞与抗BCMA单克隆抗体(MAB42)、二价TriNKET(NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA)或单价TriNKET(A49-DB-TriNKET-BCMA)一起孵育。A49-DB-TriNKET-BCMA是TriNKET，其中第一抗原结合位点包含结合NKG2D的Fab并且第二抗原结合位点包含结合BCMA的Fab，它们各自连接到Fc结构域，从而形成二价抗体(WO2018/148566)。
为了评估总表面BCMA，使用100μg/mL的饱和浓度，而选择100ng/mL的饱和浓度来研究亚饱和表面的稳定。将每个样品分成三份，其中将等分试样各自放置在冰上20分钟，在37℃下进行2小时或在37℃下进行24小时。孵育期后，洗涤细胞并使用抗人IgG二抗检测结合的TriNKET。染色后，将细胞固定并在4℃下储存，在研究结束时分析所有样品。
TriNKET稳定表面BCMA
图5示出了在孵育指定时间后，使用A49-DB-TriNKET-BCMA或BCMA单克隆抗体(MAB42)对KMS12-PE细胞上的表面BCMA进行的染色。BCMAmAb和TriNKET均能够在孵育后快速地稳定表面BCMA并在24小时内维持增加的表达。图6示出了在先天较高的表达BCMA的细胞系MM.1R上观察到相同的作用。
在A49-DB-TriNKET-BCMA和抗BCMA mAb(MAB42)的亚饱和浓度下，还观察到在更长孵育时间下BCMA靶细胞结合的显著改善。图7示出了由抗BCMA mAb(MAB42)和二价TriNKET(NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA)提供的狂热结合促进与KMS12-PE细胞上的BCMA的结合的快速和持续增加，而使用单价TriNKET(A49-DB-TriNKET-BCMA)时，仅观察到结合的有限改善。图8示出了MM.1R细胞上的类似模式。
实施例3-二价TriNKET介导优异的长期细胞毒性
在二价TriNKET(NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA)存在的情况下，将纯化的人NK耗竭表达BCMA的KMS12-PE细胞的能力与抗BCMA单克隆抗体MAB42的能力进行比较。图9示出了通过纯化的人NK细胞(E∶T比率为1∶1)，静置的NK介导的KMS12-PE细胞的耗竭，如在20小时后通过流式细胞术所检测。二价BCMA TriNKET(NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA)比单克隆抗体或单价TriNKET(A49-DB-TriNKET-BCMA)产生更有效的杀伤。使用E∶T比率为10∶1的PBMC而不是纯化的NK产生类似的结果(图10)。与任一TriNKET形式相比，抗BCMA mAb降低了两种效应细胞类型的最大杀伤和效能。
BCMA TriNKET与细胞上的NKG2D具有极弱的结合相互作用
使用KHYG-1人NK细胞系以评估TriNKET NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA的NKG2D结合。使用转导以表达CD16-F158V的KHYG-1细胞来研究Fc CD16结合的贡献。将TriNKET稀释，并与KHYG-1细胞一起孵育。使用荧光团缀合的抗人IgG二抗检测TriNKET的结合。通过流式细胞术分析细胞并报告中值荧光强度(“MFI”)。
研究了TriNKET与表达NKG2D细胞结合的能力。如图11所示，几乎没有观察到TriNKET(NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA和NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA)与表达NKG2D但不表达CD16的KHYG-1细胞的结合。相反，当在转导KHYG-1细胞以表达CD16的高亲和力变体的情境下时，NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA能够以仅比抗BCMA单克隆抗体MAB42略高的MFI水平与细胞结合(图12)。然而，NKG2D-结合-F3-TriNKET-BCMA能够以更高的MFI与表达CD16的KHYG-1细胞结合(图12)。TriNKET不与表达NKG2D的细胞结合由TriNKET不能与全血中的NKG2D阳性NK细胞(图13A)或CD8+T细胞(图13B)结合进一步证明。TriNKET能够以与IgG1对照结合相当的水平与全血中的B细胞(图13D)、单核细胞(图13E)和粒细胞(图13F)结合。
实施例4-TriNKET触发BCMA+肿瘤细胞的CD8+T细胞裂解
原代入CD8+T细胞细胞毒性测定：
原代人CD8+效应T细胞产生：使用密度梯度离心从人外周血沉棕黄层中分离PBMC。在37℃下，将分离的PBMC使用1μg/ml伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激18小时。然后去除ConA并在37℃下将细胞与25单位/ml IL-2一起培养4天。使用带有磁珠的负选择技术纯化CD8+T细胞，然后在37℃下在含有10ng/ml IL-15的培养基中培养6-13天。
原代人CD8+效应T细胞表征：通过流式细胞术对上文产生的人CD8+效应T细胞的CD8+T细胞纯度以及NKG2D和CD16表达进行分析。使用针对CD3、CD8、NKG2D和CD16的荧光团缀合抗体对细胞进行染色，然后通过流式细胞术进行分析。
短期CD8+效应T细胞DELFIA细胞毒性测定：从培养物中收获表达感兴趣的靶标BCMA的人多发性骨髓瘤KMS12-PE细胞。将细胞洗涤并以106/mL重悬于生长培养基中以使用BATDA试剂(Perkin Elmer AD0116)标记。按照制造商的说明来标记靶细胞。标记后，将细胞使用HBS洗涤三次，并以0.5×105/mL重悬于培养基中。将100μl BATDA标记的细胞加入到96孔板的每个孔中。保存用于从靶细胞中自发释放的孔，并且通过添加1％Triton-X来制备以最大程度裂解靶细胞的孔。在培养基中稀释TriNKET和mAb并以50μL/孔加入到平板中。从培养物中收获CD8+效应T细胞，洗涤并以5×106/mL重悬于培养基中(E∶T比率＝50∶1)。然后将50μl CD8+T细胞加入到平板的每个孔中，以使培养物体积总计达到200μl。在进行测定前，将平板在37℃下使用5％CO2孵育3.5小时。孵育后，将平板从培养箱中移出并通过在500g下离心5分钟来沉淀细胞。然后将20μl培养物上清液转移到制造商提供的干净微孔板中，向每个孔中加入200μl室温的铕溶液。将平板避光并在平板振荡器上以250rpm孵育15分钟。使用SpectraMax i3X仪器读取平板。
如下计算特异性裂解％：特异性裂解％＝((实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放))*100％。
用于细胞毒性测定的CD8+效应T细胞的表征
如图14所示，使用ConA刺激产生并使用IL-15培养的CD8+效应T细胞具有高纯度(CD3+CD8+细胞＞99％)，并且都表达NKG2D但不表达CD16。
当与活化的CD8+T细胞共培养时，NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA增强了KMS12-PE细胞的裂解
DELFIA测定中的KMS12-PE细胞的细胞裂解：在来自供体1(图15A)和供体2(图15B)的IL-15刺激的CD8+T细胞存在或不存在的情况下，在KMS12-PE靶细胞的培养物中添加60nM的NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA、抗BCMA mAb或不相关的TriNKET。在不存在TriNKET/mAb的情况下，与KMS12-PE细胞共培养的活化的CD8+T细胞作为背景T细胞杀伤。
图15A-图15B示出了使用来源于两个健康供体的人原代CD8+效应T细胞以及KMS12-PE靶细胞的DELFIA细胞毒性测定的结果。如图所示，当与活化的CD8+T细胞共培养时，NKG2D-结合-F4-TriNKET-BCMA增强了KMS12-PE细胞的裂解，但在不存在效应细胞的情况下不增强。亲本抗BCMA mAb或不相关的TriNKET不能增强来自任一供体的CD8+T细胞的裂解。
实施例5-TriNKET刺激的NK细胞活化
人纯化的NK细胞的共培养活化：从培养物中收获表达BCMA的人癌细胞系，并将细胞调节至1×106个细胞/mL。在培养基中稀释TriNKET/mAb。从培养物中收获静置的NK细胞并洗涤。将纯化的NK细胞以1×106个细胞/mL重悬，使E：T为1∶1。所有的共培养物都补充有hIL-2、布雷菲德菌素A(Brefeldin-A)、莫能菌素(monensin)和荧光团缀合的抗CD107a并孵育4小时。使用透化/洗涤缓冲液和荧光团缀合的抗IFNγ固定后，实现活的NK细胞的细胞内染色。
图16A-图16B示出了在BCMA阳性靶细胞系存在的情况下，在抗BCMA TriNKET或单克隆抗体存在的情况下4小时内的人NK细胞的活化。在图16A中，将KMS12-PE细胞(低BCMA表达)用作靶细胞。如图所示，与抗BCMA mAb相比，靶向BCMA的TriNKET在与BCMA阳性KMS12-PE骨髓瘤细胞共培养中介导更显著的人NK细胞的活化。在图16B中，将H929(高BCMA表达)用作靶细胞。如图所示，与抗BCMA mAb相比，靶向BCMA的TriNKET在与BCMA阳性H929骨髓瘤细胞共培养中介导更显著的人NK细胞的活化。因此，针对高BCMA表达和低BCMA表达的细胞，F4-TriNKET以亚纳摩尔EC50值触发了脱粒和IFNγ产生的增加。与BCMA单克隆抗体相比，F4TriNKET在最大程度上刺激了较大比例的NK细胞，并增强了针对两种细胞系的效能。
示例性实施方案
实施方案1：一种蛋白质，其包含：(a)第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含结合NKG2D的单链可变片段(scFv)；结合NKG2D的所述scFv包含重链可变结构域和轻链可变结构域；(b)结合B细胞成熟抗原(BCMA)的第二抗原结合位点；以及(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。
实施方案2：根据实施方案1所述的蛋白质，其还包含结合BCMA的额外的抗原结合位点。
实施方案3：根据实施方案1或2所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点是Fab片段。
实施方案4：根据实施方案1-3中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点和所述额外的抗原结合位点是Fab片段。
实施方案5：根据实施方案1或2所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点和所述额外的抗原结合位点是scFv，所述scFv各自包含重链可变结构域和轻链可变结构域。
实施方案6：根据实施方案1-5中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的scFv的重链可变结构域位于结合NKG2D的scFv的轻链可变结构域的N末端或C末端。
实施方案7：根据实施方案6所述的蛋白质，其中结合NKG2D的scFv的轻链可变结构域位于结合NKG2D的scFv的重链可变结构域的N末端。
实施方案8：根据实施方案1-7中任一项所述的蛋白质，其中与NKG2D结合的scFv连接到足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。
实施方案9：根据实施方案8所述的蛋白质，其中与NKG2D结合的scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接到足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。
实施方案10：根据实施方案8所述的蛋白质，其中与NKG2D结合的scFv经由包含SEQID NO：168的氨基酸序列的柔性接头连接到足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分的C末端或结合CD16的第三抗原结合位点。
实施方案11：根据实施方案10所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域的C末端连接到结合NKG2D的scFv的轻链可变结构域的N末端。
实施方案12：根据实施方案1-11中任一项所述的蛋白质，其中在结合NKG2D的scFv内，在scFv的重链可变结构域与scFv的轻链可变结构域之间形成二硫桥。
实施方案13：根据实施方案12所述的蛋白质，其中在来自所述重链可变结构域的C44与来自所述轻链可变结构域的C100之间形成二硫桥。
实施方案14：根据实施方案1-13中任一项所述的蛋白质，其中在结合NKG2D的scFv内，所述重链可变结构域经由柔性接头连接到所述轻链可变结构域。
实施方案15：根据实施方案14所述的蛋白质，其中所述柔性接头包含(GlyGlyGlyGlySer)n(SEQ ID NO：198)，其中n是1-10之间的整数。
实施方案16：根据实施方案5至15中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点和所述额外的抗原结合位点scFv各自经由包含Ala-Ser的铰链连接到足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。
实施方案17：根据实施方案5至16中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点和所述额外的抗原结合位点scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接到所述抗体Fc结构域。
实施方案18：根据实施方案16或17所述的蛋白质，其中在所述第二抗原结合位点、所述额外的抗原结合位点或两者的重链可变结构域与轻链可变结构域之间形成二硫桥。
实施方案19：根据实施方案18所述的蛋白质，其中在所述第二抗原结合位点、所述额外的抗原结合位点或两者的重链可变结构域的C44与轻链可变结构域的C100之间形成二硫桥。
实施方案20：根据实施方案1至19中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的scFv的轻链可变结构域位于结合NKG2D的scFv的重链可变结构域的N末端，其中结合NKG2D的scFv的轻链可变结构域经由由SEQ ID NO：167的氨基酸序列组成的柔性接头连接到结合NKG2D的scFv的重链可变结构域，并且结合NKG2D的scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接到所述抗体Fc结构域。
实施方案21：根据实施方案1-20中任一项所述的蛋白质，其中所述结合NKG2D的scFv包含：(a)包含分别由SEQ ID NO：190、96和191的氨基酸序列表示的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(b)包含分别由SEQ ID NO：190、96和193的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、 CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(c)包含分别由SEQ ID NO：95、96和97的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(d)包含分别由SEQ ID NO：188、88和189的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQID NO：91、92和93的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(e)包含分别由SEQ ID NO：185、104和192的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：107、108和109的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(f)包含分别由SEQ ID NO：185、72和159的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：75、76和77的氨基酸序列表示的CDR1、、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(g)包含分别由SEQ ID NO：186、80和187的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ IDNO：83、84和85的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(h)包含分别由SEQ ID NO：190、96和194的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(i)包含分别由SEQ ID NO：190、96和195的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(i)包含分别由SEQ ID NO：190、96和196的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(k)包含分别由SEQ ID NO：190、96和197的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；或(l)包含分别由SEQ ID NO：190、96和160的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域。
实施方案22：实施方案，根据实施方案1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的scFv包含与SEQ ID NO：94的氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变结构域。
实施方案23：根据实施方案1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的scFv包含与SEQ ID NO：94具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少90％同一性的轻链可变结构域。
实施方案24：根据实施方案1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的scFv包含与SEQ ID NO：94具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少95％同一性的轻链可变结构域。
实施方案25：根据实施方案1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的scFv包含与SEQ ID NO：94具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案26：根据实施方案1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的scFv包含与SEQ ID NO：169具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案27：根据实施方案1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的scFv包含与SEQ ID NO：171具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案28：根据实施方案1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的scFv包含与SEQ ID NO：173具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案29：根据实施方案1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的scFv包含与SEQ ID NO：175具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案30：根据实施方案1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的scFv包含与SEQ ID NO：177具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案31：根据实施方案1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的scFv包含与SEQ ID NO：179具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案32：根据实施方案1-31中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点包含：(a)包含分别由SEQ ID NO：149、150和151的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：153、154和155的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(b)包含分别由SEQ ID NO：115、116和117的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ IDNO：120、121和123的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(c)包含分别由SEQ ID NO：125、126和127的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：129、130和131的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(d)包含分别由SEQ ID NO：133、134和135的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：137、138和139的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(e)包含分别由SEQ ID NO：141、142和143的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ IDNO：145、146和147的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；或(f)包含分别由SEQ ID NO：115、116和117的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：120、121和122的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域。
实施方案33：根据实施方案1-32中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点包含：(a)与SEQ ID NO：148具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：152具有至少90％同一性的轻链可变结构域；(b)与SEQ ID NO：148具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：152具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或(c)与SEQ ID NO：148具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：152具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案34：根据实施方案1-32中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点包含：(a)与SEQ ID NO：114具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：119具有至少90％同一性的轻链可变结构域；(b)与SEQ ID NO：114具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：119具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或(c)与SEQ ID NO：114具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：119具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案35：根据实施方案1-32中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点包含：(a)与SEQ ID NO：124具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：128具有至少90％同一性的轻链可变结构域；(b)与SEQ ID NO：124具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：128具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或(c)与SEQ ID NO：124具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：128具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案36：根据实施方案1-32中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点包含：(a)与SEQ ID NO：132具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：136具有至少90％同一性的轻链可变结构域；(b)与SEQ ID NO：132具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：136具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或(c)与SEQ ID NO：132具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：136具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案37：根据实施方案1-32中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点包含：(a)与SEQ ID NO：140具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：144具有至少90％同一性的轻链可变结构域；(b)与SEQ ID NO：140具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：144具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或(c)与SEQ ID NO：140具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：144具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案38：根据实施方案1-32中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点包含：(a)与SEQ ID NO：114具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：118具有至少90％同一性的轻链可变结构域；(b)与SEQ ID NO：114具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：118具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或(c)与SEQ ID NO：114具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：118具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案39：根据实施方案2-38中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述额外的抗原结合位点包含：(a)包含分别由SEQ ID NO：149、150和151的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：153、154和155的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(b)包含分别由SEQ ID NO：115、116和117的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：120、121和123的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(c)包含分别由SEQ ID NO：125、126和127的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：129、130和131的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(d)包含分别由SEQ ID NO：133、134和135的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：137、138和139的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；(e)包含分别由SEQ ID NO：141、142和143的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：145、146和147的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；或(f)包含分别由SEQ ID NO：115、116和117的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：120、121和122的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域。
实施方案40：根据实施方案2-38中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述额外的抗原结合位点包含：(a)与SEQ ID NO：148具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：152具有至少90％同一性的轻链可变结构域；(b)与SEQ ID NO：148具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：152具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或(c)与SEQ ID NO：148具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：152具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案41：根据实施方案2-38中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述额外的抗原结合位点包含：(a)与SEQ ID NO：114具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：119具有至少90％同一性的轻链可变结构域；(b)与SEQ ID NO：114具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：119具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或(c)与SEQ ID NO：114具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：119具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案42：根据实施方案2-38中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述额外的抗原结合位点包含：(a)与SEQ ID NO：124具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：128具有至少90％同一性的轻链可变结构域；(b)与SEQ ID NO：124具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：128具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或(c)与SEQ ID NO：124具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：128具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案43：根据实施方案2-38中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述额外的抗原结合位点包含：(a)与SEQ ID NO：132具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：136具有至少90％同一性的轻链可变结构域；(b)与SEQ ID NO：132具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：136具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或(c)与SEQ ID NO：132具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：136具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案44：根据实施方案2-38中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述额外的抗原结合位点包含：(a)与SEQ ID NO：140具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：144具有至少90％同一性的轻链可变结构域；(b)与SEQ ID NO：140具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：144具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或(c)与SEQ ID NO：140具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：144具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案45：根据实施方案2-38中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述额外的抗原结合位点包含：(a)与SEQ ID NO：114具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：118具有至少90％同一性的轻链可变结构域；(b)与SEQ ID NO：114具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：118具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或(c)与SEQ ID NO：114具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：118具有同一性的轻链可变结构域。
实施方案46：根据实施方案1-45中任一项所述的蛋白质，其中足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点是包含人IgG1抗体的铰链和CH2结构域的抗体Fc结构域。
实施方案47：根据实施方案1-45中任一项所述的蛋白质，其中足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点是包含与人IgG1抗体的氨基酸234-332具有至少90％同一性的氨基酸序列的抗体Fc结构域。
实施方案48：根据实施方案46或47所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域包含与人IgG1的Fc结构域具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在选自由以下组成的组的一个或多个位置处不同：Q347、Y349、T350、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和K439。
实施方案49：根据实施方案48所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域是包含Q347R、D399V和F405T取代的人IgG1的Fc结构域。
实施方案50：根据实施方案49所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域连接到结合NKG2D的scFv。
实施方案51：根据实施方案48所述的蛋白质，其中所述Fc结构域是包含K360E和K409W取代的人IgG1的Fc结构域。
实施方案52：根据实施方案51所述的蛋白质，其中所述Fc结构域连接到所述第二抗原结合位点。
实施方案53：根据实施方案1-33和46-52中任一项所述的蛋白质，其包含SEQ IDNO：162的氨基酸序列。
实施方案54：根据实施方案1-33和46-52中任一项所述的蛋白质，其包含含有SEQID NO：162、SEQ ID NO：163和SEQ ID NO：165的氨基酸序列。
实施方案55：根据实施方案1-33和46-52中任一项所述的蛋白质，其包含与SEQ IDNO：162的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
实施方案56：根据实施方案1-33和46-52中任一项所述的蛋白质，其包含与SEQ IDNO：162的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
实施方案57：根据实施方案1-33和46-52中任一项所述的蛋白质，其包含与SEQ IDNO：162的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列。
实施方案58：根据实施方案1-33和46-52中任一项所述的蛋白质，其包含与SEQ IDNO：162的氨基酸序列具有至少90％至少95％或至少99％同一性的氨基酸序列，其还包含SEQ ID NO：163和SEQ ID NO：165。
实施方案59：根据实施方案1-58中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质以2nM至120nM的KD与NKG2D结合，如通过表面等离子体共振所测量。
实施方案60：根据实施方案1-59中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质在结合后活化自然杀伤细胞或细胞毒性T细胞。
实施方案61：一种制剂，其包含根据前述实施方案中任一项所述的蛋白质和药学上可接受的载剂。
实施方案62：一种细胞，其包含一种或多种编码根据实施方案1-60中任一项所述的蛋白质的核酸。
实施方案63：一种增强肿瘤的细胞死亡的方法，其包括在自然杀伤细胞或细胞毒性T细胞存在的情况下，使所述肿瘤暴露于根据实施方案1-60中任一项所述的蛋白质。
实施方案64：一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用根据实施方案1-60中任一项所述的蛋白质或根据实施方案61所述的制剂。
实施方案65：如实施方案64所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤和急性髓系白血病。
实施方案66：如实施方案64或65所述的方法，其中所述癌症表达BCMA。
实施方案67：一种激动细胞毒性T细胞的方法，其包括使所述细胞毒性T细胞暴露于根据实施方案1-60中任一项所述的蛋白质。
实施方案68：一种激动自然杀伤细胞的方法，其包括使所述自然杀伤细胞暴露于根据实施方案1-60中任一项所述的蛋白质。
以引用的方式并入
本文所提及的专利文件和科学文章中的每一种的全部公开内容出于所有目的以引用的方式并入。
等效物
在不脱离本发明的精神或基本特征的情况下，本发明可以其他具体形式来实施。因此，前述实施方案应在所有方面都被视为说明性的，而非是对本文所述的本发明的限制。因此，本发明的范围由所附权利要求而非由前述描述所指示，并且属于权利要求的等效性含义和范围内的所有变化都意图涵盖在其中。
序列表
<110> 蜻蜓治疗公司(Dragonfly Therapeutics, Inc.)
<120> 结合BCMA、NKG2D和CD16的多特异性结合蛋白以及使用方法
<130> 14247-425-228
<140> TBA
<141> 2019-08-08
<150> 62/716,207
<151> 2018-08-08
<160> 198
<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 克隆ADI-27743轻链可变区
<400> 13
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<223> 克隆ADI-28153重链可变区
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
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Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
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Arg Ala Arg Gly Pro Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
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<211> 107
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-28153轻链可变区
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Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
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<223> 克隆ADI-28226(C26)重链可变区
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Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
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20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-28226(C26)轻链可变区
<400> 17
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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65 70 75 80
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<220>
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1 5 10 15
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-28154轻链可变区
<400> 19
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<223> 克隆ADI-29399轻链可变区
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29401轻链可变区
<400> 23
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1 5 10 15
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<220>
<223> 克隆ADI-29403重链可变区
<400> 24
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
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<223> 克隆ADI-29407重链可变区
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29419重链可变区
<400> 30
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
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100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 31
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29419轻链可变区
<400> 31
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Ser Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 32
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29421重链可变区
<400> 32
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29421轻链可变区
<400> 33
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1 5 10 15
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20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29424重链可变区
<400> 34
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100 105 110
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115
<210> 35
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29424轻链可变区
<400> 35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29425重链可变区
<400> 36
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29425轻链可变区
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29426重链可变区
<400> 38
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
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35 40 45
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Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
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100 105 110
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115
<210> 39
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29426轻链可变区
<400> 39
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 40
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29429重链可变区
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29429轻链可变区
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Leu Tyr Ser Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29447(F47)重链可变区
<400> 42
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29447(F47)轻链可变区
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Phe Ile Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
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<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27727重链可变区
<400> 44
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27727-VH的CDR1(非Kabat)
<400> 45
Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 46
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27727-VH的CDR2
<400> 46
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 47
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27727-VH的CDR3(非Kabat)
<400> 47
Ala Arg Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 48
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27727轻链可变区
<400> 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27727-VL的CDR1
<400> 49
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 50
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27727-VL的CDR2
<400> 50
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 51
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27727-VL的CDR3
<400> 51
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr
1 5
<210> 52
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29443(F43)重链可变区
<400> 52
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 53
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29443(F43)-VH的CDR1(非Kabat)
<400> 53
Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 54
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29443(F43)-VH的CDR2
<400> 54
Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 55
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29443(F43)-VH的CDR3(非Kabat)
<400> 55
Ala Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29443(F43)轻链可变区
<400> 56
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Thr Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29443(F43)-VL的CDR1
<400> 57
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29443(F43)-VL的CDR2
<400> 58
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29443(F43)-VL的CDR3
<400> 59
Gln Gln Phe Asp Thr Trp Pro Pro Thr
1 5
<210> 60
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29404(F04)重链可变区
<400> 60
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 61
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29404(F04)轻链可变区
<400> 61
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Glu Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 62
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-28200重链可变区
<400> 62
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Arg Lys Ala Ser Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-28200-VH的CDR1(非Kabat)
<400> 63
Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 64
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-28200-VH的CDR2
<400> 64
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 65
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-28200-VH的CDR3
<400> 65
Ala Arg Arg Gly Arg Lys Ala Ser Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 66
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-28200轻链可变区
<400> 66
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-28200-VL的CDR1
<400> 67
Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 68
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-28200-VL的CDR2
<400> 68
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 69
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-28200-VL的CDR3
<400> 69
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 70
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29379(E79)重链可变区
<400> 70
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Thr Thr His Asp Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29379(E79)-VH的CDR1(非Kabat)
<400> 71
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 72
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29379(E79)-VH的CDR2
<400> 72
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 73
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29379(E79)-VH的CDR3(非Kabat)
<400> 73
Ala Arg Gly Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Thr Thr His Asp Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29379(E79)轻链可变区
<400> 74
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29379(E79)–VL的CDR1
<400> 75
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29379(E79)–VL的CDR2
<400> 76
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29379(E79)–VL的CDR3
<400> 77
Gln Gln Tyr Asp Asp Trp Pro Phe Thr
1 5
<210> 78
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29463(F63)重链可变区
<400> 78
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 79
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29463(F63)-VH的CDR1(非Kabat)
<400> 79
Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 80
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29463(F63)-VH的CDR2
<400> 80
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29463(F63)-VH的CDR3
<400> 81
Ala Arg Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 82
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29463(F63)轻链可变区
<400> 82
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asp Tyr Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29463(F63)-VL的CDR1
<400> 83
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29463(F63)-VL的CDR2
<400> 84
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29463(F63)-VL的CDR3
<400> 85
Gln Gln Asp Asp Tyr Trp Pro Pro Thr
1 5
<210> 86
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)重链可变区
<400> 86
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 87
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)-VH的CDR1(非Kabat)
<400> 87
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 88
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)-VH的CDR2
<400> 88
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 89
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)-VH的CDR3(非Kabat)
<400> 89
Ala Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 90
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)轻链可变区
<400> 90
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)–VL的CDR1
<400> 91
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)–VL的CDR2
<400> 92
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)–VL的CDR3
<400> 93
Gln Gln Gly Val Ser Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 94
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27749(A49)重链可变区
<400> 94
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 95
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)、A49MI、A49MQ、A49ML、A49MF、A49MV-VH的CDR1(非Kabat)
<400> 95
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 96
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)、A49MI、A49MQ、A49ML、A49MF、A49MV-VH的CDR2
<400> 96
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 97
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)-VH的CDR3(非Kabat)
<400> 97
Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 98
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27749(A49)、A49MQ、A49MF、A49MV、A49-共有序列
轻链可变区
<400> 98
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 99
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)、A49MI、A49MQ、A49ML、A49MF、A49MV、A49-共有序列–VL的CDR1
<400> 99
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)、A49MI、A49MQ、A49ML、A49MF、A49MV、A49-共有序列-VL的CDR2
<400> 100
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 101
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)、A49MI、A49MQ、A49ML、A49MF、A49MV、A49-共有序列-VL的CDR3
<400> 101
Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 102
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29378(E78)重链可变区
<400> 102
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gly Ala Gly Phe Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Tyr Tyr Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 103
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29378(E78)-VH的CDR1(非Kabat)
<400> 103
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 104
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29378(E78)-VH的CDR2
<400> 104
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 105
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29378(E78)-VH的CDR3(非Kabat)
<400> 105
Ala Arg Glu Gly Ala Gly Phe Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Tyr Tyr Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 106
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29378(E78)轻链可变区
<400> 106
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 107
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29378(E78)–VL的CDR1
<400> 107
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 108
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29378(E78)–VL的CDR2
<400> 108
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29378(E78)–VL的CDR3
<400> 109
Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Phe Thr
1 5
<210> 110
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变结构域
<400> 110
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 111
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变结构域
<400> 111
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 112
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重链可变结构域
<400> 112
Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Asp Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly His Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Asn Trp Asp Asp Ala Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 113
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻链可变结构域
<400> 113
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 114
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/776649重链可变结构域中的第1克隆
<400> 114
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Pro Asp Tyr
20 25 30
Tyr Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Thr Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Ser Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 115
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/776649–VH中的第1克隆的CDR1
<400> 115
Asp Tyr Tyr Ile Asn
1 5
<210> 116
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/776649–VH中的第1克隆的CDR2
<400> 116
Trp Ile Tyr Phe Ala Ser Gly Asn Ser Glu Tyr Asn Gln Lys Phe Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 117
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/776649–VH中的第1克隆的CDR3
<400> 117
Leu Tyr Asp Tyr Asp Trp Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 118
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/776649轻链可变结构域中的第1克隆
<400> 118
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Glu Thr
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 119
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/776649轻链可变结构域中的第1克隆
<400> 119
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Ser Ile Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 120
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/776649–VL中的第1克隆的CDR1
<400> 120
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His
1 5 10 15
<210> 121
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/776649–VL中的第1克隆的CDR2
<400> 121
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 122
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/776649–VL中的第1克隆的CDR3
<400> 122
Ala Glu Thr Ser His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 123
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/776649–VL中的第1克隆的CDR3
<400> 123
Ser Gln Ser Ser Ile Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 124
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCT/US15/64269重链可变结构域中的第2克隆
<400> 124
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 125
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCT/US15/64269–VH中的第2克隆的CDR1
<400> 125
Asp Tyr Ser Ile Asn
1 5
<210> 126
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCT/US15/64269–VH中的第2克隆的CDR2
<400> 126
Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg
1 5 10 15
<210> 127
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCT/US15/64269–VH中的第2克隆的CDR3
<400> 127
Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 128
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCT/US15/64269轻链可变结构域中的第2克隆
<400> 128
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 129
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCT/US15/64269–VL中的第2克隆的CDR1
<400> 129
Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His
1 5 10 15
<210> 130
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCT/US15/64269–VL中的第2克隆的CDR2
<400> 130
Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr
1 5
<210> 131
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PCT/US15/64269–VL中的第2克隆的CDR3
<400> 131
Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr
1 5
<210> 132
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/122,391重链可变结构域中的第3克隆
<400> 132
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 133
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/122,391–VH中的第3克隆的CDR1
<400> 133
Asn Tyr Trp Met His
1 5
<210> 134
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/122,391–VH中的第3克隆的CDR2
<400> 134
Ala Thr Tyr Arg Gly His Ser Asp Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 135
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/122,391–VH中的第3克隆的CDR3
<400> 135
Gly Ala Ile Tyr Asn Gly Tyr Asp Val Leu Asp Asn
1 5 10
<210> 136
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/122,391轻链可变结构域中的第3克隆
<400> 136
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 137
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/122,391–VL中的第3克隆的CDR1
<400> 137
Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 138
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/122,391–VL中的第3克隆的CDR2
<400> 138
Tyr Thr Ser Asn Leu His Ser
1 5
<210> 139
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US14/122,391–VL中的第3克隆的CDR3
<400> 139
Gln Gln Tyr Arg Lys Leu Pro Trp Thr
1 5
<210> 140
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US20170051068重链可变结构域中的第4克隆
<400> 140
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Phe Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg His Asp Gly Ala Thr Ala Gly Leu Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 141
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US20170051068–VH中的第4克隆的CDR1
<400> 141
Ser Ser Ser Tyr Phe Trp Gly
1 5
<210> 142
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US20170051068–VH中的第4克隆的CDR2
<400> 142
Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ile Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 143
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US20170051068–VH中的第4克隆的CDR3
<400> 143
His Asp Gly Ala Thr Ala Gly Leu Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 144
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US20170051068轻链可变结构域中的第4克隆
<400> 144
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Gln Ala Pro Val Val Val Val Tyr
35 40 45
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His
85 90 95
Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 145
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US20170051068–VL中的第4克隆的CDR1
<400> 145
Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His
1 5 10
<210> 146
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US20170051068–VL中的第4克隆的CDR2
<400> 146
Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser
1 5
<210> 147
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> US20170051068–VL中的第4克隆的CDR3
<400> 147
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val
1 5 10
<210> 148
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> WO2017021450重链可变结构域中的第5克隆(Mab42)
<400> 148
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Pro Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Leu Gly Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 149
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> WO2017021450–VH中的第5克隆(Mab42)的CDR1
<400> 149
Asp Asn Ala Met Gly
1 5
<210> 150
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> WO2017021450–VH中的第5克隆(Mab42)的CDR2
<400> 150
Ala Ile Ser Gly Pro Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 151
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> WO2017021450–VH中的第5克隆(Mab42)的CDR3
<400> 151
Val Leu Gly Trp Phe Asp Tyr
1 5
<210> 152
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> WO2017021450轻链可变结构域中的第5克隆(Mab42)
<400> 152
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Glu
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile His Ser Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Tyr Pro Pro
85 90 95
Asp Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 153
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> WO2017021450–VL中的第5克隆(Mab42)的CDR1
<400> 153
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Glu Tyr Leu Ser Trp
1 5 10
<210> 154
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> WO2017021450–VL中的第5克隆(Mab42)的CDR2
<400> 154
His Ser Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 155
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> WO2017021450–VL中的第5克隆(Mab42)的CDR3
<400> 155
Gln Gln Tyr Gly Tyr Pro Pro Asp Phe Thr
1 5 10
<210> 156
<211> 184
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> BCMA结合结构域
<400> 156
Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser
1 5 10 15
Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr
20 25 30
Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser
35 40 45
Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu
50 55 60
Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile
65 70 75 80
Asn Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu
85 90 95
Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu
100 105 110
Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys
115 120 125
Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe
130 135 140
Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys
145 150 155 160
Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu
165 170 175
Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg
180
<210> 157
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 83A10重链可变结构域
<400> 157
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Leu Gly Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 158
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 83A10轻链可变结构域
<400> 158
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Tyr Pro Pro
85 90 95
Asp Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 159
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29379(E79)–VH的CDR3
<400> 159
Gly Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Thr Thr His Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 160
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49-共有序列–VH的CDR3
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa=Met、Leu、Ile、Val、Gln或Phe
<400> 160
Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 161
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> NKG2D结合scFv
<400> 161
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser
145 150 155 160
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 162
<211> 702
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> Fc结构域(F4-BCMAFc-AJ链B-NKG2D结合scFv)的C末端
<400> 162
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Pro Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Leu Gly Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ser
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val
450 455 460
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
465 470 475 480
Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
485 490 495
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro
500 505 510
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
515 520 525
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly
530 535 540
Val Ser Phe Pro Arg Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
545 550 555 560
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
565 570 575
Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
580 585 590
Lys Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
595 600 605
Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys
610 615 620
Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr
625 630 635 640
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
645 650 655
Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
660 665 670
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp
675 680 685
Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
690 695 700
<210> 163
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA VH-CH1-Fc
<400> 163
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Pro Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Leu Gly Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Glu Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Trp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
<210> 164
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头序列
<400> 164
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 165
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗BCMA-全LC
<400> 165
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Glu
20 25 30
Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile His Ser Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ala Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Tyr Pro Pro
85 90 95
Asp Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys
115 120 125
Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg
130 135 140
Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn
145 150 155 160
Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser
165 170 175
Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys
180 185 190
Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr
195 200 205
Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 166
<211> 477
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> F3-NKG2D结合scFv-Fc-AJ链B [VL(G4S)4VH)]
<400> 166
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser
145 150 155 160
Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Val Ser
165 170 175
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
210 215 220
Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp Gly
225 230 235 240
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Asp Lys Thr His Thr
245 250 255
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
260 265 270
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
275 280 285
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
290 295 300
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
305 310 315 320
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
325 330 335
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
340 345 350
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
355 360 365
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Arg Val Tyr Thr Leu Pro Pro
370 375 380
Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
385 390 395 400
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
405 410 415
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Val Ser Asp
420 425 430
Gly Ser Phe Thr Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
435 440 445
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
450 455 460
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
465 470 475
<210> 167
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头序列
<400> 167
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser
20
<210> 168
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头序列
<400> 168
Ser Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 169
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49MI重链可变区
<400> 169
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 170
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49MI-VH的CDR3(非Kabat)
<400> 170
Ala Arg Gly Ala Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 171
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49MQ重链可变区
<400> 171
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Pro Gln Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 172
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49MQ-VH的CDR3(非Kabat)
<400> 172
Ala Arg Gly Ala Pro Gln Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 173
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49ML重链可变区
<400> 173
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 174
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49ML-VH的CDR3(非Kabat)
<400> 174
Ala Arg Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 175
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49MF重链可变区
<400> 175
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Pro Phe Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 176
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49MF-VH的CDR3(非Kabat)
<400> 176
Ala Arg Gly Ala Pro Phe Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 177
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49MV重链可变区
<400> 177
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Pro Val Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 178
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49MV-VH的CDR3(非Kabat)
<400> 178
Ala Arg Gly Ala Pro Val Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 179
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49-共有序列重链可变区
<220>
<221> misc_feature
<222> (102)..(102)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 179
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 180
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49-共有序列-VH的CDR3(非Kabat)
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa=Met、Leu、Ile、Val、Gln或Phe
<400> 180
Ala Arg Gly Ala Pro Xaa Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 181
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27727、28200–VH的CDR1
<400> 181
Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 182
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27727-VH的CDR3
<400> 182
Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 183
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29443(F43)-VH的CDR1
<400> 183
Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5
<210> 184
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29443(F43)-VH的CDR3
<400> 184
Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 185
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29379(E79)、29378(E78)-VH的CDR1
<400> 185
Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 186
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29463(F63)-VH的CDR1
<400> 186
Gly Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 187
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-29463(F63)-VH的CDR3
<400> 187
Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 188
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)-VH的CDR1
<400> 188
Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 189
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)-VH的CDR3
<400> 189
Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 190
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)、A49MI、A49ML、A49MV、A49-共有序列-VH的CDR1
<400> 190
Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 191
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆ADI-27744(A44)–VH的CDR3
<400> 191
Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 192
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆29378(E78)–VH的CDR3
<400> 192
Glu Gly Ala Gly Phe Ala Tyr Gly Met Asp Tyr Tyr Tyr Met Asp Val
1 5 10 15
<210> 193
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49MI–VH的CDR3
<400> 193
Gly Ala Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 194
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49MQ-VH的CDR3
<400> 194
Gly Ala Pro Gln Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 195
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49ML-VH的CDR3
<400> 195
Gly Ala Pro Leu Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 196
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49MF-VH的CDR3
<400> 196
Gly Ala Pro Phe Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 197
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 克隆A49MV-VH的CDR3
<400> 197
Gly Ala Pro Val Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 198
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头序列
<220>
<221> 重复
<222> (1)..(5)
<223> 氨基酸可以重复1-10次
<400> 198
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5

Claims (57)

1.一种蛋白质，其包含：
(a)第一抗原结合位点，所述第一抗原结合位点包含结合NKG2D的单链可变片段(scFv)；
(b)结合B细胞成熟抗原(BCMA)的第二抗原结合位点；和
(c)足以结合CD16的抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其还包含结合BCMA的额外的抗原结合位点。
3.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点是Fab片段。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点和所述额外的抗原结合位点是Fab片段。
5.根据权利要求1或2所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点和所述额外的抗原结合位点是scFv。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的所述scFv的重链可变结构域位于所述scFv的轻链可变结构域的N末端或C末端。
7.根据权利要求6所述的蛋白质，其中所述轻链可变结构域位于结合NKG2D的所述scFv的重链可变结构域的N末端。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白质，其中与NKG2D结合的所述scFv连接到足以结合CD16的所述抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。
9.根据权利要求8所述的蛋白质，其中与NKG2D结合的所述scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接到足以结合CD16的所述抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。
10.根据权利要求8所述的蛋白质，其中与NKG2D结合的所述scFv经由包含SEQ ID NO：168的氨基酸序列的柔性接头连接到足以结合CD16的所述抗体Fc结构域或其部分的C末端或结合CD16的第三抗原结合位点。
11.根据权利要求10所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域的C末端连接到结合NKG2D的所述scFv的轻链可变结构域的N末端。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的蛋白质，其中在结合NKG2D的所述scFv内，在所述scFv的重链可变结构域与所述scFv的轻链可变结构域之间形成二硫桥。
13.根据权利要求12所述的蛋白质，其中在来自所述重链可变结构域的C44与来自所述轻链可变结构域的C100之间形成所述二硫桥。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的蛋白质，其中在结合NKG2D的所述scFv内，所述重链可变结构域经由柔性接头连接到所述轻链可变结构域。
15.根据权利要求14所述的蛋白质，其中所述柔性接头包含(GlyGlyGlyGlySer)n(G4S)n)(SEQ ID NO：198)，其中n是1-10之间的整数。
16.根据权利要求5至15中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点和所述额外的抗原结合位点scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接到足以结合CD16的所述抗体Fc结构域或其部分或结合CD16的第三抗原结合位点。
17.根据权利要求5至16中任一项所述的蛋白质，其中所述第二抗原结合位点和所述额外的抗原结合位点scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接到所述抗体Fc结构域。
18.根据权利要求16或17所述的蛋白质，其中在所述第二抗原结合位点和/或所述额外的抗原结合位点的重链可变结构域与轻链可变结构域之间形成二硫桥。
19.根据权利要求18所述的蛋白质，其中在来自所述重链可变结构域的C44与来自所述轻链可变结构域的C100之间形成所述二硫桥。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的所述scFv包含位于重链可变结构域的N末端的轻链可变结构域，其中所述轻链可变结构域经由由SEQ ID NO：167的氨基酸序列组成的柔性接头连接到所述scFv的重链可变结构域，并且结合NKG2D的所述scFv经由包含Ala-Ser的铰链连接到所述抗体Fc结构域。
21.根据权利要求1-20中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的所述第一抗原结合位点包含：
(a)包含分别由SEQ ID NO：190、96和191的氨基酸序列表示的互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ IDNO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(b)包含分别由SEQ ID NO：190、96和193的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(c)包含分别由SEQ ID NO：95、96和97的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(d)包含分别由SEQ ID NO：188、88和189的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：91、92和93的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(e)包含分别由SEQ ID NO：185、104和192的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：107、108和109的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(f)包含分别由SEQ ID NO：185、72和159的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：75、76和77的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(g)包含分别由SEQ ID NO：186、80和187的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：83、84和85的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(h)包含分别由SEQ ID NO：190、96和194的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(i)包含分别由SEQ ID NO：190、96和195的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(j)包含分别由SEQ ID NO：190、96和196的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(k)包含分别由SEQ ID NO：190、96和197的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；或
(l)包含分别由SEQ ID NO：190、96和160的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：99、100和101的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：94的氨基酸序列具有至少90％同一性的重链可变结构域。
23.根据权利要求1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：94具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少90％同一性的轻链可变结构域。
24.根据权利要求1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：94具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有至少95％同一性的轻链可变结构域。
25.根据权利要求1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：94具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
26.根据权利要求1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：169具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
27.根据权利要求1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：171具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
28.根据权利要求1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：173具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
29.根据权利要求1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：175具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
30.根据权利要求1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：177具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
31.根据权利要求1-21中任一项所述的蛋白质，其中结合NKG2D的所述第一抗原结合位点包含与SEQ ID NO：179具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：98具有同一性的轻链可变结构域。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点和/或所述额外的抗原结合位点包含：
(a)包含分别由SEQ ID NO：149、150和151的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：153、154和155的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(b)包含分别由SEQ ID NO：115、116和117的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：120、121和123的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(c)包含分别由SEQ ID NO：125、126和127的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：129、130和131的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(d)包含分别由SEQ ID NO：133、134和135的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：137、138和139的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；
(e)包含分别由SEQ ID NO：141、142和143的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：145、146和147的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域；或
(f)包含分别由SEQ ID NO：115、116和117的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变结构域；以及包含分别由SEQ ID NO：120、121和122的氨基酸序列表示的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变结构域。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点和/或所述额外的抗原结合位点包含：
(a)与SEQ ID NO：148具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：152具有至少90％同一性的轻链可变结构域；
(b)与SEQ ID NO：148具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：152具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或
(c)与SEQ ID NO：148具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：152具有同一性的轻链可变结构域。
34.根据权利要求1-32中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点和/或所述额外的抗原结合位点包含：
(a)与SEQ ID NO：114具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：119具有至少90％同一性的轻链可变结构域；
(b)与SEQ ID NO：114具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：119具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或
(c)与SEQ ID NO：114具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：119具有同一性的轻链可变结构域。
35.根据权利要求1-32中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点和/或所述额外的抗原结合位点包含：
(a)与SEQ ID NO：124具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：128具有至少90％同一性的轻链可变结构域；
(b)与SEQ ID NO：124具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：128具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或
(c)与SEQ ID NO：124具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：128具有同一性的轻链可变结构域。
36.根据权利要求1-32中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点和/或所述额外的抗原结合位点包含：
(a)与SEQ ID NO：132具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：136具有至少90％同一性的轻链可变结构域；
(b)与SEQ ID NO：132具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：136具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或
(c)与SEQ ID NO：132具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：136具有同一性的轻链可变结构域。
37.根据权利要求1-32中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点和/或所述额外的抗原结合位点包含：
(a)与SEQ ID NO：140具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：144具有至少90％同一性的轻链可变结构域；
(b)与SEQ ID NO：140具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：144具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或
(c)与SEQ ID NO：140具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：144具有同一性的轻链可变结构域。
38.根据权利要求1-32中任一项所述的蛋白质，其中结合BCMA的所述第二抗原结合位点和/或所述额外的抗原结合位点包含：
(a)与SEQ ID NO：114具有至少90％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：118具有至少90％同一性的轻链可变结构域；
(b)与SEQ ID NO：114具有至少95％同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：118具有至少95％同一性的轻链可变结构域；或
(c)与SEQ ID NO：114具有同一性的重链可变结构域以及与SEQ ID NO：118具有同一性的轻链可变结构域。
39.根据权利要求1-38中任一项所述的蛋白质，其中所述抗体Fc结构域包含人IgG1抗体的铰链和CH2结构域。
40.根据权利要求39所述的蛋白质，其中所述Fc结构域包含与人IgG1抗体的氨基酸234-332具有至少90％同一性的氨基酸序列。
41.根据权利要求39或40所述的蛋白质，其中所述Fc结构域包含与人IgG1的Fc结构域具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且在选自由以下组成的组的一个或多个位置处不同：Q347、Y349、T350、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411和K439。
42.根据权利要求1-41中任一项所述的蛋白质，其中所述Fc结构域是包含Q347R、D399V和F405T取代的人IgG1的Fc结构域。
43.根据权利要求42所述的蛋白质，其中包含所述取代的所述Fc结构域连接到结合NKG2D的所述scFv。
44.根据权利要求1-43中任一项所述的蛋白质，其中所述Fc结构域是包含K360E和K409W取代的人IgG1的Fc结构域。
45.根据权利要求44所述的蛋白质，其中包含所述取代的所述Fc结构域连接到所述第二抗原结合位点。
46.根据权利要求1-33和39-45中任一项所述的蛋白质，其包含SEQ ID NO：162的氨基酸序列。
47.根据权利要求1-33和39-45中任一项所述的蛋白质，其包含含有SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：163和SEQ ID NO：165的氨基酸序列。
48.根据权利要求1-33和39-45中任一项所述的蛋白质，其包含与SEQ ID NO：162的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
49.根据权利要求1-33和39-45中任一项所述的蛋白质，其包含与SEQ ID NO：162的氨基酸序列具有至少95％同一性的氨基酸序列。
50.根据权利要求1-33和39-45中任一项所述的蛋白质，其包含与SEQ ID NO：162的氨基酸序列具有至少99％同一性的氨基酸序列。
51.根据权利要求1-33和39-45中任一项所述的蛋白质，其包含与SEQ ID NO：162的氨基酸序列具有至少90％、至少95％或至少99％同一性的氨基酸序列，其还包含SEQ ID NO：163和SEQ ID NO：165。
52.根据权利要求1-50中任一项所述的蛋白质，其中所述蛋白质以2nM至120nM的KD与NKG2D结合，如通过表面等离子体共振所测量。
53.一种制剂，其包含根据前述权利要求中任一项所述的蛋白质和药学上可接受的载剂。
54.一种细胞，其包含一种或多种编码根据权利要求1-52中任一项所述的蛋白质的核酸。
55.一种直接和/或间接增强肿瘤细胞死亡的方法，所述方法包括使肿瘤和自然杀伤细胞暴露于根据权利要求1-52中任一项所述的蛋白质。
56.一种治疗癌症的方法，其中所述方法包括向患者施用根据权利要求1-52中任一项所述的蛋白质或根据权利要求53所述的制剂。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：多发性骨髓瘤、急性淋巴母细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤和急性髓系白血病。
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