TW202019479A - 結合bcma、nkg2d及cd16之多特異性結合蛋白及使用方法 - Google Patents

Abstract

本發明描述多特異性結合蛋白，其結合至表現B細胞成熟抗原(BCMA)之人類癌細胞且殺死該等細胞，以及適用於治療表現BCMA之癌症的醫藥組合物及治療方法。本發明係關於多特異性結合蛋白，其結合至表現BCMA之人類癌細胞且殺死該等細胞，且相較於抗BCMA單株抗體，其呈現對標靶細胞之高效能及最大溶胞性。

Description

結合BCMA、NKG2D及CD16之多特異性結合蛋白及使用方法

本發明係關於多特異性結合蛋白，其結合至表現B細胞成熟抗原(BCMA)之人類癌細胞且殺死該等細胞，且相較於抗BCMA單株抗體，呈現對標靶細胞之高效能及最大溶解。

儘管用於治療此疾病之實質性研究成果及科學進展在文獻中已有報導，但癌症仍為重大的健康問題。一些最常診斷出之癌症包括前列腺癌、乳癌及肺癌。前列腺癌為男性中最常見之癌症形式。乳癌仍為女性死亡之主要原因。此等癌症之當前治療選擇並非對所有患者均有效及/或可能具有實質性有害副作用。治療其他類型之癌症對於使用現存治療選擇來說亦仍具有挑戰性。

癌症免疫療法由於其具高度特異性且可利用患者自身免疫系統促進對癌細胞之破壞而為所需的。融合蛋白(諸如雙特異性T細胞接合體)為文獻中所述之癌症免疫療法，其結合至腫瘤細胞及T細胞以促進對腫瘤細胞之破壞。結合至某些腫瘤相關抗原及結合至某些免疫細胞的抗體已描述於文獻中。參見例如WO 2016/134371及WO 2015/095412。

自然殺手(natural killer，NK)細胞為先天免疫系統之組分且在循環淋巴球中佔約15%。NK細胞浸潤幾乎所有組織且初始特徵為其能夠有效殺死腫瘤細胞而無需預先致敏。活化NK細胞藉由類似於胞毒型T細胞(亦即，經由含有穿孔蛋白及顆粒酶的溶細胞顆粒)的方式以及經由死亡受體路徑殺死標靶細胞。活化NK細胞亦分泌促進將其它白血球募集至標靶組織的炎性細胞介素，諸如IFN-γ及趨化因子。

NK細胞經由其表面上之多種活化及抑制受體回應於信號。舉例而言，當NK細胞遇到健康的自身細胞時，其活性經由殺手細胞免疫球蛋白樣受體(killer-cell immunoglobulin-like receptor，KIR)之活化而受到抑制。或者，當NK細胞遇到外來細胞或癌細胞時，其經由其活化受體(例如NKG2D、NCR、DNAM1)而活化。NK細胞亦藉由一些免疫球蛋白之恆定區經由其表面上之CD16受體而活化。NK細胞對活化之總體敏感性視刺激性及抑制性信號的總和而定。

BCMA為屬於TNF受體超家族之跨膜蛋白。其特異性地結合至腫瘤壞死因子(配位體)超家族成員13b (TNFSF13B/TALL-1/BAFF)，致使NF-κB及MAPK8/JNK活化。其表現限於B細胞譜系且已展示出對B細胞發育及自身免疫反應為至關重要的。BCMA亦結合至各種TRAF家族成員，且因此可轉導用於細胞存活及增殖之信號。BCMA與多種癌症相關，諸如多發性骨髓瘤、淋巴瘤及白血病。本發明提供某些改善治療表現BCMA之癌症的優勢。

本發明提供多特異性結合蛋白，其結合至癌細胞上之BCMA及結合至自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體。此類蛋白可接合超過一種NK活化受體，且可阻斷將天然配位體結合至NKG2D。在某些實施例中，蛋白可激動人類及其他物種(諸如嚙齒動物及食蟹獼猴)中之NK細胞。下文進一步詳細描述本發明之各個態樣及實施例。

因此，本發明之一個態樣提供一種蛋白質，其包含(a)  第一抗原結合位點，其包含結合NKG2D之單序列可變片段(single-chain variable fragment，scFv)；(b) 結合B細胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)之第二抗原結合位點；及(c)足以結合CD16之抗體Fc域或其部分，或結合CD16之第三抗原結合位點。在某些實施例中，本發明之蛋白進一步包含結合BCMA之額外抗原結合位點。在某些實施例中，本發明中所述之蛋白質的第二抗原結合位點為結合BCMA之Fab片段。在某些實施例中，本發明中所述之蛋白質的第二及額外抗原結合位點為結合BCMA之Fab片段。

在某些實施例中，本發明中所述之蛋白質的第二及額外抗原結合位點為結合BCMA之scFv。在某些實施例中，結合NKG2D之scFv的重鏈可變域位於scFv之輕鏈可變域的N端或C端。在某些實施例中，輕鏈可變域位於結合NKG2D之scFv的重鏈可變域的N端。

在某些實施例中，結合至NKG2D之scFv連接至足以結合CD16之抗體Fc域或其部分，或結合CD16之第三抗原結合位點。在某些實施例中，結合至NKG2D之scFv經由包含Ala-Ser之鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體Fc域或其部分，或結合CD16之第三抗原結合位點。在某些實施例中，結合至NKG2D之scFv經由包含GlyGlyGlyGlySer (G4S)之可撓性連接子連接至足以結合CD16之抗體Fc域或其部分的C端，或結合CD16之第三抗原結合位點。在某些實施例中，抗體Fc域之C端連接至結合NKG2D之scFv的輕鏈可變域的N端。

在某些實施例中，在結合NKG2D之scFv內，二硫橋鍵形成於scFv之重鏈可變域與scFv之輕鏈可變域之間。在某些實施例中，二硫鍵橋形成於來自重鏈可變域之C44與來自輕鏈可變域之C100之間。

在某些實施例中，在結合NKG2D之scFv內，重鏈可變域經由可撓性連接子連接至輕鏈可變域。在某些實施例中，可撓性連接子包含(GlyGlyGlyGlySer)₄ ，亦即(G4S)₄ (SEQ ID NO:167)。

在某些實施例中，第二及額外抗原結合位點scFv經由包含Ala-Ser之鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體Fc域或其部分，或結合CD16之第三抗原結合位點。在某些實施例中，第二及額外抗原結合位點scFv經由包含Ala-Ser之鉸鏈連接至抗體Fc域。

在某些實施例中，二硫橋鍵形成於第二抗原結合位點及/或額外抗原結合位點之重鏈可變域與輕鏈可變域之間。在某些實施例中，二硫鍵橋形成於來自重鏈可變域之C44與來自輕鏈可變域之C100之間。

在某些實施例中，結合NKG2D之scFv包含位於重鏈可變域之N端的輕鏈可變域，其中輕鏈可變域經由可撓性連接子(G4S)₄ (SEQ ID NO:167)連接至scFv之重鏈可變域，且結合NKG2D之scFv經由包含Ala-Ser之鉸鏈連接至抗體Fc域。

在另一態樣中，本發明提供一種蛋白質，其包含SEQ ID NO:162之胺基酸序列。

在另一態樣中，本發明提供一種蛋白質，其包含SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163及SEQ ID NO:165的胺基酸序列。

在另一態樣中，本發明提供一種蛋白質，其包含與SEQ ID NO:162之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。

在另一態樣中，本發明提供一種蛋白質，其包含與SEQ ID NO:162之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。

在另一態樣中，本發明提供一種蛋白質，其包含與SEQ ID NO:162之胺基酸序列至少99%一致的胺基酸序列。

在另一態樣中，本發明提供一種蛋白質，其包含與SEQ ID NO:162之胺基酸序列至少90%、至少95%或至少99%一致的胺基酸序列，其進一步包含SEQ ID NO:163及SEQ ID NO:165。

本發明之蛋白包括結合NKG2D之第一抗原結合位點，且第一抗原結合位點包含與SEQ ID NO:94之胺基酸序列至少90%一致的重鏈可變域。

本發明之蛋白包括結合NKG2D之第一抗原結合位點，且第一抗原結合位點包含與SEQ ID NO:94至少90%一致的重鏈可變域及與SEQ ID NO:98至少90%一致的輕鏈可變域。

本發明之蛋白包括結合NKG2D之第一抗原結合位點，且第一抗原結合位點包含與SEQ ID NO:94至少95%一致的重鏈可變域及與SEQ ID NO:98至少95%一致的輕鏈可變域。

本發明之蛋白包括結合NKG2D之第一抗原結合位點，第一抗原結合位點包含與SEQ ID NO:94一致的重鏈可變域及與SEQ ID NO:98一致的輕鏈可變域。

本發明之蛋白包括抗體Fc域，抗體Fc域包含人類IgG1抗體之鉸鏈及CH2域。

本發明之蛋白包括Fc域，Fc域包含與人類IgG1抗體之胺基酸234至 332至少90%一致的胺基酸序列。

本發明之蛋白包括Fc域，Fc域包含與人類IgG1之至少90%一致的胺基酸序列，且Fc域在一或多個選自由以下組成之群的位置處不同：Q347、Y349、T350、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、K439。

本發明之蛋白包括包含Q347R、D399V及F405T取代的人類IgG1之Fc域。本發明之蛋白包括連接至結合本發明之蛋白質的NKG2D之scFv的Fc域，Fc域包含Q347R、D399V及F405T取代。

本發明之蛋白包括包含K360E及K409W取代的人類IgG1之Fc域。

本發明之蛋白包括連接至第二抗原結合位點的Fc域，Fc域包含K360E及K409W取代。

本發明之蛋白質以10 nM或更低之K_D 的親和力結合至NKG2D。

亦提供含有此等蛋白質中之一者的調配物；含有表現此等蛋白之一或多種核酸的細胞；及使用此等蛋白促進腫瘤細胞死亡的方法。

在本發明之另一態樣中，本發明提供一種治療癌症之方法，其中向有需要之患者投與本發明之蛋白質或包含本發明之蛋白質的調配物。

在某些實施例中，本發明之蛋白係用於治療選自多發性骨髓瘤、急性骨髓單核細胞性白血病、T細胞淋巴瘤、急性單核細胞性白血病及濾泡性淋巴瘤之癌症。

相關申請案 本申請案主張2018年8月8日申請之美國編號第62/716,207的優先權，其以全文引用之方式併入本文中。

本發明提供多特異性結合蛋白，其結合癌細胞上之BCMA及自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體以活化自然殺手細胞；包含此類多特異性結合蛋白的醫藥組合物；及使用此類多特異性蛋白及醫藥組合物的治療方法，包括治療對癌症的治療方法。本發明之各種態樣係闡述於如下各章節中；然而，一個特定章節中所述之本發明態樣不限於任何特定章節。

為促進對本發明之理解，下文定義多個術語及片語。

除非上下文不適當，否則如本文所使用，術語「一(a及an)」意謂「一或多個」且包括複數個。

如本文所使用，術語「抗原結合位點」係指參與抗原結合之免疫球蛋白分子的部分。在人類抗體中，抗原結合位點係由重鏈(「H」)及輕鏈(「L」)之N端可變(「V」)區的胺基酸殘基形成。重鏈及輕鏈之V區內的三個高度分散區段稱為「高變區」，其插入於稱為「構架區」或「FR」之更保守側接區段之間。因此，術語「FR」係指天然發現於免疫球蛋白中之高變區之間及與高變區鄰接的胺基酸序列。在人類抗體分子中，輕鏈之三個高變區及重鏈之三個高變區相對於彼此安置於三維空間中以形成抗原結合表面。抗原結合表面與結合抗原之三維表面互補，且將重鏈及輕鏈中之每一者的三個高變區稱為「互補決定區」或「CDR」。在某些動物(諸如駱駝及軟骨魚)中，抗原結合位點係由提供「單域抗體」之單一抗體鏈形成。抗原結合位點可存在於完整抗體中、保留抗原結合表面之抗體的抗原結合片段中，或重組多肽中，諸如scFv，其使用肽連接子將單一多肽中之重鏈可變域連接至輕鏈可變域。本文所揭示之重鏈或輕鏈可變區中的所有胺基酸位置係根據Kabat編號法編號。

如本文所使用，術語「腫瘤相關之抗原」意謂任何與癌症相關之抗原，包括(但不限於)蛋白、醣蛋白、神經節苷脂、碳水化合物、脂質。此類抗原可表現於惡性細胞上或腫瘤微環境中，諸如腫瘤相關血管、細胞外基質、間葉細胞基質或免疫浸潤上。

如本文所使用，術語「個體」及「患者」係指藉由本文所述之方法及組合物治療的生物體。此類生物體較佳包括(但不限於)哺乳動物(例如鼠類、猿猴、馬、牛、豬、狗、貓及其類似物)，且更佳包括人類。

如本文所使用，術語「有效量」係指足以實現有益或所需結果之化合物(例如本發明之化合物)的量。有效量可以一或多次投與、施加或給藥來投與且不欲限於特定調配物或投與途徑。如本文所使用，術語「治療」包括引起對病狀、疾病、病症及其類似者之改善或減緩其症狀的任何作用，例如減輕、減少、調節、減緩或消除。

如本文所使用，術語「醫藥組合物」係指活性劑與惰性或活性載劑之組合，此組合使得組合物特別適用於活體內或活體外診斷或治療用途。

如本文所使用，術語「醫藥學上可接受之載劑」係指任一種標準醫藥載劑，諸如磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(例如諸如油/水或水/油乳液)及各種類型的濕潤劑。組合物亦可包括穩定劑及防腐劑。關於載劑、穩定劑及佐劑之實例，參見例如Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 第15版, Mack Publ公司, Easton, PA [1975]。

如本文所使用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指本發明化合物之任何醫藥學上可接受的鹽(例如酸或鹼)，其在投與個體時能夠得到本發明之化合物或活性代謝物或其殘餘物。如熟習此項技術者所知，本發明化合物之「鹽」可源於無機酸或有機酸及鹼。例示性酸包括(但不限於)氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、過氯酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水楊酸、丁二酸、甲苯對磺酸、酒石酸、乙酸、檸檬酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸及其類似物。其他酸，諸如草酸，儘管本身為醫藥學上不可接受的，但可用於製備適用作中間物的鹽以獲得本發明之化合物及其醫藥學上可接受之酸加成鹽。

例示性鹼包括(但不限於)鹼金屬(例如鈉)氫氧化物、鹼土金屬(例如鎂)氫氧化物、氨及式NW₄ ⁺ 化合物，其中W為C_{1 - 4} 烷基，及其類似物。

例示性鹽包括(但不限於)：乙酸鹽、己二酸鹽、褐藻酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、環戊烷丙酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、反丁烯二酸鹽、氟庚酸鹽、甘油磷酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘化物、2-羥基乙烷磺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、乙二酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、苯基丙酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、丁二酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽、十一烷酸鹽及其類似物。鹽之其他實例包括本發明化合物之陰離子與適合陽離子(諸如Na⁺ 、NH₄ ⁺ 及NW₄ ⁺ (其中W為C_{1 - 4} 烷基))的化合物，及其類似物。

在治療用途中，預期本發明化合物之鹽為醫藥學上可接受的。然而，醫藥學上不可接受之酸與鹼之鹽亦可用於例如製備或純化醫藥學上可接受之化合物中。

在通篇說明書中，在組合物描述為具有、包括或包含特定組分的情況下，或在製程及方法描述為具有、包括或包含特定步驟的情況下，另外預期存在基本上由所列組分組成或由所列組分組成的本發明之組合物，且存在基本上由所列處理步驟組成或由所列處理步驟組成的根據本發明之製程及方法。

一般而言，除非另外規定，否則指定百分比之組合物以重量計。此外，若變數未附定義，則以該變數之先前定義為準。I . 蛋白

本發明提供結合癌細胞上之BCMA及自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體的多特異性結合蛋白以活化自然殺手細胞。多特異性結合蛋白適用於本文所述之醫藥組合物及治療方法。多特異性結合蛋白與自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體的結合增強了自然殺手細胞對癌細胞之破壞的活性。多特異性結合蛋白與癌細胞上之BCMA的結合使癌細胞與自然殺手細胞接近，其促進自然殺手細胞直接及間接地破壞癌細胞。下文提供對例示性多特異性結合蛋白之進一步描述。

多特異性結合蛋白之第一組分結合至表現NKG2D受體之細胞，其可包括(但不限於) NK細胞、NKT細胞、γδ T細胞及CD8+ αβ T細胞。NKG2D結合後，多特異性結合蛋白可阻斷天然配位體(諸如ULBP6及MICA)結合至NKG2D及活化NKG2D受體。

多特異性結合蛋白之第二組分結合至表現BCMA細胞，其可包括(但不限於)多發性骨髓瘤及B細胞惡性病。

多特異性結合蛋白之第三組分結合至表現CD16之細胞，白血球(包括自然殺手細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、嗜伊紅血球、肥大細胞及濾泡性樹突狀細胞)表面上之Fc受體。

本文所述之多特異性結合蛋白可呈多種形式。舉例而言，一種形式涉及包括第一免疫球蛋白重鏈、第二免疫球蛋白重鏈及免疫球蛋白輕鏈之雜二聚多特異性抗體(圖1)。第一免疫球蛋白重鏈包括經由連接子或抗體鉸鏈融合於Fab片段的第一Fc (鉸鏈CH2-CH3)域，Fab片段由重鏈可變域及輕鏈可變域構成，重鏈可變域及輕鏈可變域配對且結合BCMA (圖1A及圖2)。第二免疫球蛋白重鏈包括經由連接子或抗體鉸鏈融合於單鏈可變片段(scFv)之第二Fc (鉸鏈CH2-CH3)域，單鏈可變片段由重鏈可變域及輕鏈可變域構成，重鏈可變域及輕鏈可變域配對且結合NKG2D抗原(圖1A至圖1B及圖2)。

在一些實施例中，上文所述之單鏈可變片段(scFv)經由鉸鏈序列連接至抗體恆定域。在一些實施例中，鉸鏈包含胺基酸Ala-Ser。在一些其他實施例中，鉸鏈包含胺基酸Ala-Ser及Thr-Lys-Gly。鉸鏈序列可提供結合至標靶抗原的可撓性，及可撓性與最佳幾何結構之間的平衡。

在一些實施例中，上文所述之單鏈可變片段(scFv)包括重鏈可變域及輕鏈可變域。在一些實施例中，重鏈可變域與輕鏈可變域形成二硫橋鍵，以增強scFv之穩定性。舉例而言，可在重鏈可變域之C44殘基與輕鏈可變域之C100殘基之間形成二硫橋鍵。在一些實施例中，重鏈可變域經由可撓性連接子連接至輕鏈可變域。可使用任何適合之連接子，例如(G4S)₄ 連接子。在scFv之一些實施例中，重鏈可變域位於輕鏈可變域的N端。在scFv之一些實施例中，重鏈可變域位於輕鏈可變域的C端。

多特異性結合蛋白可提供BCMA之二價或單價接合。藉由多特異性蛋白之BCMA二價接合可使癌細胞表面上之BCMA穩定，且增強NK細胞對癌細胞之細胞毒性。BCMA藉由多特異性蛋白之二價接合可賦予多特異性蛋白與癌細胞之較強結合，藉此促進NK細胞對癌細胞，尤其對表現低BCMA量之癌細胞的較強細胞毒性反應。

在Fc域內，CD16結合係由鉸鏈區及CH2域介導。舉例而言，在人類IgG1內，與CD16之相互作用主要集中於CH2域中之胺基酸殘基Asp 265-Glu 269、Asn 297-Thr 299、Ala 327-Ile 332、Leu 234-Ser 239，及碳水化合物殘基N-乙醯基-D-葡糖胺(參見Sondermann等人, Nature, 406 (6793):267-273)。基於已知域，可選擇突變以增大或減小對CD16之結合親和力，諸如藉由使用噬菌體呈現文庫或酵母表面呈現cDNA文庫，或可基於相互作用之已知三維結構來設計。

在一些實施例中，抗體恆定域包含IgG抗體(例如人類IgG1抗體)之CH2域及CH3域。在一些實施例中，在抗體恆定域中引入突變使得能夠與另一抗體恆定域發生雜二聚。舉例而言，若抗體恆定域來源於人類IgG1之恆定域，則抗體恆定域可包含與人類IgG1抗體之胺基酸234-332至少90%一致的胺基酸序列，且在一或多個選自由以下組成之群的位置處不同：Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及K439。本文所揭示之Fc域或鉸鏈區中的所有胺基酸位置均根據EU編號法加以編號。

在一些實施例中，抗體恆定域可包含與人類IgG1抗體之胺基酸234至332至少90%一致的胺基酸序列，且不同之處在於一或多個選自由以下組成之群的取代：Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D及K439E。

下文列舉連接至抗體恆定區之scFv的實例，該抗體恆定區亦包括使得對兩個多肽鏈進行雜二聚的突變。含有來自NKG2D之重鏈可變域(V_H )及輕鏈可變域(V_L )的scFv用於製備本發明之多特異性蛋白。各序列表示含有V_L -(G4S)₄ -V_H -鉸鏈(AS)-Fc之雜二聚突變(帶下劃線)。V_L 及V_H 含有100 V_L -44V_H S-S橋鍵(帶下劃線)，且可來自任何腫瘤靶向或NKG2D結合抗體。彎管式鉸鏈區序列處包括Ala-Ser (AS，加粗&帶下劃線)，以在可撓性與最佳幾何結構之間進行平衡。在某些實施例中，額外序列Thr-Lys-Gly可在鉸鏈處添加至AS序列。(G4S)₄ 連接子在以下段落中所列之序列中帶下劃線。

本發明之TriNKET為包含以下之NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA：包含SEQ ID NO:162之序列的第一多肽(F4-BCMAFc-AJ鏈B-NKG2D結合性scFv)、包含SEQ ID NO:163之序列的第二多肽(抗BCMA HC鉸鏈Fc)及各自包含SEQ ID NO:165之序列的第三多肽及第四多肽(抗BCMA-全LC)。

F4-BCMAFc-AJ鏈B-NKG2D結合性scFv (SEQ ID NO:162)包括連接至Fc域(鉸鏈CH2-CH3)之靶向BCMA的Fab片段(包括重鏈部分及輕鏈部分，重鏈部分包含重鏈可變域(V_H ) (SEQ ID NO:159)及CH1域，且輕鏈部分包含輕鏈可變域(SEQ ID NO:160)及輕鏈恆定域)，靶向BCMA的Fab片段在Fc之C端連接至結合NKG2D之單鏈可變片段(scFv)。結合NKG2D之scFv由SEQ ID NO:161之胺基酸序列表示，且包括經由(G4S)₄ 連接子連接至重鏈可變域(V_H ) (SEQ ID NO:94)之輕鏈可變域(V_L ) (SEQ ID NO:98)。如SEQ ID NO:162中所表示，Fc域之C端使用短SGSGGGGS連接子(SEQ ID NO:168)連接至V_L (SEQ ID NO:98)域的N端。 NKG2D 結合性 scFv

F4 - BCMAFc - AJ 鏈 B - NKG2D 結合性 scFv

NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA中之scFv包括用(G4S)₄ 連接子連接至重鏈可變域之NKG2D結合位點的輕鏈可變域(表示為(V_L (G4S)₄ V_H ))。將scFv (SEQ ID NO:162)之輕鏈與重鏈可變域連接為V_L -(G4S)₄ -V_H ；V_L 及V_H 含有100V_L -44V_H S-S橋鍵(分別由G100C及G44C取代產生) (半胱胺酸殘基以粗斜體下加線表示)。(G4S)₄ 為SEQ ID NO:161及SEQ ID NO:162中之呈斜體GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:164)的序列。SEQ ID NO:162中之Fc域包含S354C取代，其在另一Fc域(下文描述之SEQ ID NO:163)中形成具有Y349C取代之二硫鍵。SEQ ID NO:162中之Fc域包括Q347R、D399V及F405T取代。

第二BCMA結合性Fab片段包括包含重鏈可變域(SEQ ID NO:159)及CH1域之重鏈部分，及包含輕鏈可變域(SEQ ID NO:160)及輕鏈恆定域之輕鏈部分，其中重鏈可變域連接至CH1域，且CH1域連接至Fc域。 抗 BCMA V_H - CH1 - Fc

SEQ ID NO:163表示第二抗BCMA之Fab片段的重鏈部分，其包含BCMA結合位點之重鏈可變域(SEQ ID NO:159)及連接至Fc域(鉸鏈CH2-CH3)之CH1域。SEQ ID NO:163中之Fc域包括Y349C取代，其在連接至NKG2D結合性scFv (SEQ ID NO:162)的Fc之CH3域中形成具有S354C取代之二硫鍵。在SEQ ID NO:163中，Fc域亦包括K360E及K409W取代。

SEQ ID NO:165表示Fab片段之輕鏈部分，Fab片段之輕鏈部分包含BCMA結合位點之輕鏈可變域(SEQ ID NO:160)及輕鏈恆定域。 抗 BCMA 全 LC

在一例示性實施例中，連接至NKG2D結合性scFv片段之Fc域包含K360E及K409W之突變，且連接至BCMA Fab片段之Fc域包含用於形成雜二聚體之匹配突變Q347R、D399V及F405T。

在一例示性實施例中，連接至NKG2D結合性scFv之Fc域包括CH3域中之Y349C取代，其在連接至BCMA結合性Fab片段之Fc上形成具有S354C取代之二硫鍵。

本發明之另一TriNKET為NKG2D結合性F3-TriNKET-BCMA，其序列描述於下文中(CDR (Kabat編號法)以下加線表示)。

NKGE2結合性F3-TriNKET-BCMA包括BCMA結合性Fab片段，BCMA結合性Fab片段包括重鏈部分及輕鏈部分，重鏈部分包含重鏈可變域(SEQ ID NO:159)及CH1域，且輕鏈部分包含輕鏈可變域(SEQ ID NO:160)及輕鏈恆定域，其中重鏈可變域連接至CH1域，且CH1域連接至Fc域。NKG2D結合性F3-TriNKET-BCMA亦包含連接至Fc域(SEQ ID NO:166)的NKG2D結合性scFv。

SEQ ID NO:163表示抗BCMA Fab片段之重鏈部分，其包含BCMA結合位點之重鏈可變域(SEQ ID NO:159)及連接至Fc域之CH1域。SEQ ID NO:163中之Fc域包括Y349C取代，其在連接至NKG2D結合性scFv (SEQ ID NO:166)的Fc之CH3域中形成具有S354C取代之二硫鍵，以用於形成NKG2D結合性F3-TriNKET-BCMA。在SEQ ID NO:163中，Fc域亦包括K360E及K409W取代。

NKG2D結合性F3-TriNKET-BCMA中之scFv包括用(G4S)₄ 連接子(SEQ ID NO:164)連接至重鏈可變域之NKG2D結合位點的輕鏈可變域(表示為(V_L (G4S)₄ V_H ))，其連接至Fc域。在NKG2D結合性F3-TriNKET-BCMA中，將scFv (SEQ ID NO:161)之輕鏈與重鏈可變域連接為V_L -(G4S)₄ -V_H ；V_L 及V_H 含有100V_L - 44V_H S-S橋鍵(分別由G100C及G44C取代產生) (半胱胺酸殘基以粗斜體下加線表示)；且V_H 經由Ala-Ser連接至Fc域。

SEQ ID NO:166表示經由包含Ala-Ser之鉸鏈連接至Fc域的NKG2D結合性scFv之完整序列(scFv-Fc)。連接至scFv之Fc域包括Q347R、D399V及F405T取代。 F3 - NKG2D 結合性 scFv - Fc - AJ 鏈 B [ V_L ( G4S ) ₄ V_H )]

在一例示性實施例中，連接至NKG2D結合性scFv片段的Fc域(呈F3形式)包含K360E及K409W之突變，且連接至BCMA Fab片段之Fc域包含用於形成雜二聚體之匹配突變Q347R、D399V及F405T。

在一例示性實施例中，連接至NKG2D結合性scFv的Fc域(呈F3形式)包括CH3域中之Y349C取代，其在連接至BCMA結合性Fab片段之Fc上形成具有S354C取代之二硫鍵。

多特異性結合蛋白可結合至表現NKG2D受體之細胞，其可包括(但不限於) NK細胞、γδ T細胞及CD8⁺ αβ T細胞。NKG2D結合後，多特異性結合蛋白可阻斷天然配位體(諸如ULBP6及MICA)結合至NKG2D及活化NKG2D受體。

多特異性結合蛋白結合至表現CD16之細胞，白血球(包括自然殺手細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、嗜伊紅血球、肥大細胞及濾泡性樹突狀細胞)表面上之Fc受體。

本發明之蛋白質以10 nM或更低之K_D 的親和力結合至NKG2D，例如約10 nM、約9 nM、約8 nM、約7 nM、約6 nM、約5 nM、約4.5 nM、約4 nM、約3.5 nM、約3 nM、約2.5 nM、約2 nM、約1.5 nM、約1 nM、約0.5 nM至約1 nM、約1 nM至約2 nM、約2 nM至3 nM、約3 nM至4 nM、約4 nM至約5 nM、約5 nM至約6 nM、約6 nM至約7 nM、約7 nM至約8 nM、約8 nM至約9 nM、約9 nM至約10 nM、約1 nM至約10 nM、約2 nM至約10 nM、約3 nM至約10 nM、約4 nM至約10 nM、約5 nM至約10 nM、約6 nM至約10 nM、約7 nM至約10 nM或約8 nM至約10 nM之間。

在結合至自然殺手細胞上之NKG2D受體及CD16受體及癌細胞上之腫瘤相關抗原後，多特異性結合蛋白可接合超過一種NK活化受體，且可阻斷天然配位體結合至NKG2D。在某些實施例中，蛋白可促效人類中之NK細胞。在一些實施例中，蛋白可促效人類及其他物種(諸如嚙齒動物及食蟹獼猴)中之NK細胞。 NKG2D 結合位點

表1列舉可結合至NKG2D之成組合的重鏈可變域及輕鏈可變域之肽序列。在一些實施例中，重鏈可變域及輕鏈可變域以Fab形式排列。在一些實施例中，重鏈可變域及輕鏈可變域一起融合形成scFv。

NKG2D結合域可改變對NKG2D之結合親和力，然而其皆活化人類NKG2D及NK細胞。

或者，由SEQ ID NO:110表示之重鏈可變域可與由SEQ ID NO:111表示之輕鏈可變域配對，以形成可結合至NKG2D之抗原結合位點，如US 9,273,136中所說明。

或者，由SEQ ID NO:112表示之重鏈可變域可與由SEQ ID NO:113表示之輕鏈可變域配對，以形成可結合至NKG2D之抗原結合位點，如US 7,879,985中所說明。

腫瘤相關抗原結合位點

本發明提供一種BCMA結合位點，其中包括重鏈可變域及輕鏈可變域。表2列舉可結合至BCMA之成組合的重鏈可變域及輕鏈可變域之肽序列。

或者，BCMA結合域可包括如下文在83A10及MAB42中所列之重鏈可變域及輕鏈可變域。 83A10重鏈可變域(SEQ ID NO:157)：

83A10輕鏈可變域(SEQ ID NO:158)：

MAB42重鏈可變域(SEQ ID NO:159)

MAB42輕鏈可變域(SEQ ID NO:160)

或者，可結合至BCMA之新穎抗原結合位點可藉由篩選結合至由SEQ ID NO:156定義之胺基酸序列來鑑別。 SEQ ID NO:156

在Fc域內，CD16結合係由鉸鏈區及CH2域介導。舉例而言，在人類IgG1內，與CD16之相互作用主要集中於CH2域中之胺基酸殘基Asp 265-Glu 269、Asn 297-Thr 299、Ala 327-Ile 332、Leu 234-Ser 239，及碳水化合物殘基N-乙醯基-D-葡糖胺(參見Sondermann等人, Nature, 406 (6793):267-273)。基於已知域，突變可經選擇以增大或減小對CD16之結合親和力，諸如藉由使用噬菌體呈現文庫或酵母表面呈現cDNA文庫，或可基於相互作用之已知三維結構來設計。

雜二聚抗體重鏈之組裝可藉由在同一細胞中表現兩種不同抗體重鏈序列來完成，從而可引起對各抗體重鏈之均二聚體的組裝以及雜二聚體的組裝。促進雜二聚體之較佳組裝可藉由將不同突變併入各抗體重鏈恆定區之CH3域中來完成，如US13/494870、US16/028850、US11/533709、US12/875015、US13/289934、US14/773418、US12/811207、US13/866756、US14/647480及US14/830336中所示。舉例而言，可在基於人類IgG1之CH3域中產生突變且將不同的胺基酸取代對併入第一多肽及第二多肽中，第一多肽及第二多肽允許此兩條鏈彼此選擇性地雜二聚。下文所說明之胺基酸取代位置皆根據如Kabat中之EU索引編號。

在一種情形下，第一多肽中之胺基酸取代係用選自精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)或色胺酸(W)之較大胺基酸置換原始胺基酸，且第二多肽中之至少一個胺基酸取代係用選自丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)或纈胺酸(V)之較小胺基酸置換原始胺基酸，使得較大胺基酸取代(隆凸)配合較小胺基酸取代(空腔)之表面。舉例而言，一個多肽可併入T366W取代，且另一個多肽可併入三個取代，包括T366S、L368A及Y407V。

本發明之抗體重鏈可變域可視情況與抗體恆定區(諸如IgG恆定區，包括鉸鏈、具有或不具有CH1域之CH2及CH3域)至少90%一致的胺基酸序列耦接。在一些實施例中，恆定區之胺基酸序列與人類抗體恆定區(諸如人類IgG1恆定區、IgG2恆定區、IgG3恆定區或IgG4恆定區)至少90%一致。在一些其他實施例中，恆定區之胺基酸序列與來自另一哺乳動物，諸如兔、狗、貓、小鼠或馬之抗體恆定區至少90%一致。相較於人類IgG1恆定區，可在恆定區中併入一或多個突變，例如在Q347、Y349、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411及/或K439處。例示性取代包括例如Q347E、Q347R、Y349S、Y349K、Y349T、Y349D、Y349E、Y349C、T350V、L351K、L351D、L351Y、S354C、E356K、E357Q、E357L、E357W、K360E、K360W、Q362E、S364K、S364E、S364H、S364D、T366V、T366I、T366L、T366M、T366K、T366W、T366S、L368E、L368A、L368D、K370S、N390D、N390E、K392L、K392M、K392V、K392F、K392D、K392E、T394F、T394W、D399R、D399K、D399V、S400K、S400R、D401K、F405A、F405T、Y407A、Y407I、Y407V、K409F、K409W、K409D、T411D、T411E、K439D及K439E。

在某些實施例中，可併入人類IgG1恆定區之CH1中的突變可在胺基酸V125、F126、P127、T135、T139、A140、F170、P171及/或V173處。在某些實施例中，可併入人類IgG1恆定區之C_κ 中的突變可在胺基酸E123、F116、S176、V163、S174及/或T164處。

胺基酸取代可選自表3中所示之以下取代組。

或者，胺基酸取代可選自表4中所示之以下取代組。

或者，胺基酸取代可選自表5中所示之以下取代組。

或者，各多肽鏈中之至少一個胺基酸取代可選自表6。

或者，至少一個胺基酸取代可選自表7中之以下取代組，其中第一多肽行中指示之位置經任何已知帶負電的胺基酸置換，且第二多肽行中指示之位置經任何已知帶正電的胺基酸置換。

或者，至少一個胺基酸取代可選自表8中之以下組，其中第一多肽行中所指示之位置經任何已知帶負電的胺基酸置換，且第二多肽行中所指示之位置經任何已知帶負電的胺基酸置換。

或者，胺基酸取代可選自表9中之以下組。

替代地或另外，雜多聚體蛋白之結構穩定性可藉由在第一或第二多肽鏈中之任一者上引入S354C且在相對的多肽鏈中引入Y349C (其在兩個多肽之界面內形成人造二硫橋鍵)來增大。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈的胺基酸序列不同於T366位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列不同於一或多個選自由T366、L368及Y407組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由T366、L368及Y407組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列不同於T366位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405及T411組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈的胺基酸序列不同於選自由Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405及T411組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由Y349、E357、S364、L368、K370、T394、D401、F405及T411組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由E357、K360、Q362、S364、L368、K370、T394、D401、F405及T411組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由L351、D399、S400及Y407組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由T366、N390、K392、K409及T411組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由T366、N390、K392、K409及T411組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由L351、D399、S400及Y407組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由Q347、Y349、K360及K409組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由Q347、E357、D399及F405組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由Q347、E357、D399及F405組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由Y349、K360、Q347及K409組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由K370、K392、K409及K439組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由D356、E357及D399組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由D356、E357及D399組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由K370、K392、K409及K439組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由L351、E356、T366及D399組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由Y349、L351、L368、K392及K409組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由Y349、L351、L368、K392及K409組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈的胺基酸序列不同於一或多個選自由L351、E356、T366及D399組成之群的位置處之IgG1恆定區的胺基酸序列。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於S354C取代，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於Y349C取代。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於Y349C取代，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於S354C取代。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於K360E及K409W取代，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於O347R、D399V及F405T取代。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於O347R、D399V及F405T取代，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於K360E及K409W取代。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於T366W取代，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於T366S、T368A及Y407V取代。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於T366S、T368A及Y407V取代，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於T366W取代。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於T350V、L351Y、F405A及Y407V取代，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於T350V、T366L、K392L及T394W取代。

在一些實施例中，抗體恆定區之一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於T350V、T366L、K392L及T394W取代，且其中抗體恆定區之另一個多肽鏈之胺基酸序列與IgG1恆定區之胺基酸序列不同之處在於T350V、L351Y、F405A及Y407V取代。

上文所述之多特異性蛋白可使用熟習此項技術者熟知的重組DNA技術製得。舉例而言，可將編碼第一免疫球蛋白重鏈之第一核酸序列純系化至第一表現載體中；可將編碼第二免疫球蛋白重鏈之第二核酸序列純系化至第二表現載體中；可將編碼免疫球蛋白輕鏈之第三核酸序列純系化至第三表現載體中；且可將第一、第二及第三表現載體一起穩定轉染至宿主細胞中以產生多聚蛋白。

為實現多特異性蛋白之最高產量，可探索第一、第二及第三表現載體之不同比率以確定轉染至宿主細胞中之最佳比率。轉染之後，可使用此項技術中已知之方法(諸如有限稀釋、ELISA、FACS、顯微術或Clonepix)分離出單一純系用於產生細胞庫。

可將純系在適用於生物反應器等比放大之條件下培養且維持多特異性蛋白之表現。多特異性蛋白可使用此項技術中已知之方法分離及純化，包括離心、深度過濾、細胞溶解、均質化、冷凍-解凍、親和純化、凝膠過濾、離子交換層析、疏水性相互作用交換層析及混合模式層析。II . 多特異性蛋白之特徵

包括NKG2D結合性scFv及BCMA結合域之本發明的多特異性結合蛋白(例如，NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA或NKG2D結合性F3-TriNKET-BCMA)較有效地降低腫瘤生長及殺死癌細胞。舉例而言，靶向表現BCMA腫瘤/癌細胞之本發明的多特異性結合蛋白與抗BCMA單株抗體MAB42相比較為有效。本發明之NKG2D-F4-TriNKET-BCMA與抗BCMA單株抗體MAB42相比較為有效地促進表現BCMA之人類癌細胞株的NK介導之細胞溶解。

NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA展示與表現NKG2D之細胞的弱結合。然而，相較於MAB42抗BCMA mAb，本文所述之多特異性結合蛋白，包括NKG2D結合域(例如NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA或NKG2D結合性F3-TriNKET-BCMA)在對標靶細胞之效能及最大溶解方面展現出顯著優勢。

因此，相較於單株抗體，本文所述之多特異性結合蛋白(例如NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA或NKG2D結合性F3-TriNKET-BCMA)在治療表現BCMAa之癌症方面為有利的。III . 治療應用

本文所揭示之蛋白可用於活化細胞毒性T細胞或自然殺手細胞。在一些實施例中，本文提供藉由將細胞毒性T細胞暴露於本文所揭示之蛋白來活化細胞毒性T細胞的方法。在一些實施例中，本文提供藉由將自然殺手細胞暴露於本文所揭示之蛋白來活化自然殺手細胞的方法。

因此，本文提供藉由在細胞毒性T細胞或自然殺手細胞存在下將腫瘤細胞暴露於本文所揭示之蛋白來促進腫瘤細胞死亡的方法。在一些實施例中，本文提供藉由在細胞毒性T細胞存在下將腫瘤細胞暴露於本文所揭示之蛋白來促進腫瘤細胞死亡的方法。在一些實施例中，本文提供藉由在自然殺手細胞存在下將腫瘤細胞暴露於本文所揭示之蛋白來促進腫瘤細胞死亡的方法。

本文亦提供藉由向個體投與本文所揭示之蛋白質或本文所揭示之調配物來增強個體中應對表現BCMA之癌細胞的免疫反應的方法。

本發明提供使用本文所述之多特異性結合蛋白及/或本文所述之醫藥組合物來治療癌症的方法。該等方法可用於藉由向對其有需要之患者投與治療有效量之本文所述的多特異性結合蛋白來治療多種癌症。在一些實施例中，可藉由本文所揭示之表現BCMA的蛋白治療癌症。

治療方法可根據待治療之癌症表徵。舉例而言，在某些實施例中，癌症為乳癌、卵巢癌、食道癌、膀胱癌或胃癌、唾液腺管癌、肺腺癌或子宮癌之侵襲性形式，諸如子宮漿液性子宮內膜癌。

在某些其他實施例中，癌症為腦癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、食道癌、白血病、肺癌、肝癌、黑素瘤、卵巢癌、胰臟癌、直腸癌、腎癌、胃癌、睪丸癌或子宮癌。在又其他實施例中，癌症為鱗狀細胞癌、腺癌、小細胞癌、黑素瘤、神經母細胞瘤、肉瘤(例如，血管肉瘤或軟骨肉瘤)、喉癌、腮腺癌、膽道癌、甲狀腺癌、肢端小痣性黑素瘤、光化性角化症、急性淋巴球性白血病、急性骨髓白血病、腺樣囊性癌、腺瘤、腺肉瘤、腺鱗癌、肛管癌、肛門癌、肛腸癌、星形細胞瘤、大前庭腺癌、基底細胞癌、膽癌、骨癌、骨髓癌、支氣管癌、支氣管腺癌、類癌、膽管癌、軟骨肉瘤、脈絡叢乳頭狀瘤/癌、慢性淋巴球性白血病、慢性骨髓白血病、透明細胞癌、結締組織癌、結締組織癌、囊腺瘤、消化系統癌、十二指腸癌、內分泌系統癌、內真皮竇瘤、子宮內膜增生、子宮內膜基質肉瘤、子宮內膜樣腺癌、內皮細胞癌、室管膜癌、上皮細胞癌、尤文氏(Ewing)肉瘤、眼眶癌、女性生殖器癌、病灶性結節性增生、膽囊癌、胃竇癌、胃底癌、胃泌素瘤、神經膠母細胞瘤、升糖素瘤、心臟癌、血管母細胞瘤、血管內皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝膽癌、肝細胞癌、霍奇金氏(Hodgkin)病、迴腸癌、胰島素瘤、上皮內瘤、上皮間鱗狀細胞瘤、肝內膽管癌、侵襲性鱗狀細胞癌、空腸癌、關節癌、卡波西氏(Kaposi)肉瘤、骨盆癌、大細胞癌、大腸癌、平滑肌肉瘤、惡性雀斑樣癌、黑色素瘤、淋巴瘤、男性生殖器癌、惡性黑色素瘤、惡性間內皮瘤、神經管胚細胞瘤、髓上皮瘤、腦膜癌、間皮癌、轉移性癌、口腔癌、黏液表皮樣癌瘤、多發性骨髓瘤、肌肉癌、鼻腔癌、神經系統癌、神經上皮腺節狀黑素瘤、非上皮皮膚癌、非霍奇金氏淋巴瘤、燕麥細胞癌、寡樹突神經膠質細胞癌、口腔癌、骨肉瘤、乳頭狀漿液性腺癌、陰莖癌、咽癌、垂體腫瘤、漿細胞瘤、假性肉瘤、肺母細胞瘤、直腸癌、腎細胞癌、呼吸系統癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、漿液性癌、竇癌、皮膚癌、小細胞癌、小腸癌、平滑肌癌、軟組織癌、生長抑制素分泌腫瘤、脊柱癌、鱗狀細胞癌、橫紋肌癌、間皮下癌、淺表擴散黑素瘤、T細胞白血病、舌癌、未分化性瘤、尿管癌、尿道癌、膀胱癌、泌尿系統癌、子宮頸癌、子宮體癌症、葡萄膜黑素瘤、陰道癌、疣癌、血管活性腸肽瘤、外陰癌、分化癌或威爾姆斯(Wilms)腫瘤。

在某些其他實施例中，癌症為非霍奇金氏淋巴瘤，諸如B細胞淋巴瘤或T細胞淋巴瘤。在某些實施例中，非霍奇金氏淋巴瘤為B細胞淋巴瘤，諸如彌漫性大B細胞淋巴瘤、原發縱隔B細胞淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、小淋巴球性淋巴瘤、套細胞淋巴瘤、邊緣區B細胞淋巴瘤、結外邊緣區B細胞淋巴瘤、結邊緣區B細胞淋巴瘤、脾邊緣區B細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、淋巴漿細胞性淋巴瘤、毛細胞白血病，或原發中樞神經系統(central nervous system，CNS)淋巴瘤。在某些其他實施例中，非霍奇金氏淋巴瘤為T細胞淋巴瘤，諸如前體T淋巴母細胞性淋巴瘤、外周T細胞淋巴瘤、皮膚T細胞淋巴瘤、血管免疫母細胞T細胞淋巴瘤、結外自然殺手/T細胞淋巴瘤、腸病型T細胞淋巴瘤、皮下脂層炎樣T細胞淋巴瘤、多形性大細胞淋巴瘤或外周T細胞淋巴瘤。

待治療之癌症可根據表現於癌細胞表面上之特定抗原的存在來表徵。在某些實施例中，除BCMA外，癌細胞可表現以下其中之一或多者：CD2、CD19、CD20、CD30、CD38、CD40、CD52、CD70、EGFR/ERBB1、IGF1R、HER3/ERBB3、HER4/ERBB4、MUC1、cMET、SLAMF7、PSCA、MICA、MICB、TRAILR1、TRAILR2、MAGE-A3、B7.1、B7.2、CTLA4及PD1。IV. 組合療法

本發明之另一態樣提供了組合療法。本文所述之多特異性結合蛋白可與額外治療劑組合使用以治療癌症。

可作為組合療法之一部分用於治療癌症的例示性治療劑包括例如輻射、絲裂黴素(mitomycin)、維甲酸(tretinoin)、利鉑莫司汀(ribomustin)、吉西他濱(gemcitabine)、長春新鹼(vincristine)、依託泊苷(etoposide)、克拉屈濱(cladribine)、二溴甘露醇(mitobronitol)、甲胺喋呤(methotrexate)、多柔比星(doxorubicin)、卡波醌(carboquone)、噴司他汀(pentostatin)、二胺硝吖啶(nitracrine)、淨司他丁(zinostatin)、西曲瑞克(cetrorelix)、來曲唑(letrozole)、雷替曲塞(raltitrexed)、道諾黴素(daunorubicin)、法屈唑(fadrozole)、福莫司汀(fotemustine)、胸腺法新(thymalfasin)、索布佐生(sobuzoxane)、奈達鉑(nedaplatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、比卡魯胺(bicalutamide)、長春瑞賓(vinorelbine)、維司力農(vesnarinone)、胺魯米特(aminoglutethimide)、安吖啶(amsacrine)、丙穀胺(proglumide)、依利醋銨(elliptinium acetate)、酮色林(ketanserin)、脫氧氟尿苷(doxifluridine)、依曲替酯(etretinate)、異維甲酸(isotretinoin)、鏈脲菌素(streptozocin)、尼莫司汀(nimustine)、長春地辛(vindesine)、氟他胺(flutamide)、得羅淨利(drogenil)、布妥辛(butocin)、卡莫氟(carmofur)、雷佐生(razoxane)、西佐喃(sizofilan)、卡鉑(carboplatin)、二溴衛矛醇(mitolactol)、喃氟啶(tegafur)、異環磷醯胺(ifosfamide)、潑尼氮芥(prednimustine)、畢西巴尼(picibanil)、左旋咪唑(levamisole)、替尼泊苷(teniposide)、英丙舒凡(improsulfan)、依諾他濱(enocitabine)、麥角乙脲(lisuride)、羥次甲氫龍(oxymetholone)、他莫昔芬(tamoxifen)、孕酮(progesterone)、美雄烷(mepitiostane)、環硫雄醇(epitiostanol)、福美司坦(formestane)、干擾素-α、干擾素-2α、干擾素-β、干擾素-γ (IFN-γ)、群落刺激因子-1、群落刺激因子-2、地尼白介素(denileukin diftitox)、介白素-2、促黃體素釋放因子及前述藥劑之變異體，其可展現對其同源受體的差異結合，及延長或縮短的血清半衰期。

可在癌症治療中用作一部分組合療法之額外類別的藥劑為免疫檢查點抑制劑。例示性免疫檢查點抑制劑包括抑制以下之一或多者的藥劑：(i)細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (CTLA4)，(ii)計劃性細胞死亡蛋白1 (PD1)，(iii) PDL1，(iv) LAG3，(v) B7-H3，(vi) B7-H4及(vii) TIM3。CTLA4抑制劑伊派利單抗(ipilimumab)已由美國食品藥物管理局批准用於治療黑素瘤。

可在治療癌症中用作一部分組合療法之又其他藥劑為靶向非檢查點標靶之單株抗體藥劑(例如赫賽汀(herceptin))及非細胞毒性劑(例如酪胺酸激酶抑制劑)。

又其他類別抗癌劑包括：例如(i)選自以下之抑制劑：ALK抑制劑、ATR抑制劑、A2A拮抗劑、鹼基切除修復抑制劑、Bcr-Abl酪胺酸激酶抑制劑、布魯頓氏(Bruton)酪胺酸激酶抑制劑、CDC7抑制劑、CHK1抑制劑、週期蛋白依賴型激酶抑制劑、DNA-PK抑制劑、DNA-PK與mTOR之抑制劑、DNMT1抑制劑、DNMT1抑制劑 + 2-氯-脫氧腺苷、HDAC抑制劑、豪豬(Hedgehog)信號傳導路徑抑制劑、IDO抑制劑、JAK抑制劑、mTOR抑制劑、MEK抑制劑、MELK抑制劑、MTH1抑制劑、PARP抑制劑、磷酸肌醇3-激酶抑制劑、PARP1與DHODH之抑制劑、蛋白酶體抑制劑、拓樸異構酶-II抑制劑、酪胺酸激酶抑制劑、VEGFR抑制劑及WEE1抑制劑；(ii) OX40、CD137、CD40、GITR、CD27、HVEM、TNFRSF25或ICOS之促效劑；及(iii)選自IL-12、IL-15、GM-CSF及G-CSF之細胞介素。

本發明之蛋白亦可用作手術移除原發病灶的佐劑。

可選擇多特異性結合蛋白及額外治療劑之量及相對投與時序以便實現所需的組合治療效果。舉例而言，當向需要此類投與之患者投與組合療法時，組合中的治療劑或包含治療劑之一或多種醫藥組合物可以任何次序(諸如依序、並行、一起、同時及其類似者)投與。此外，舉例而言，可在額外治療劑發揮其預防或治療效果期間投與多特異性結合蛋白，或反之亦然。V . 醫藥組合物

本發明的特徵亦在於醫藥組合物，其含有治療有效量之本文所述之蛋白質。組合物可經調配以用於多種藥物遞送系統。為了正確調配，組合物中亦可包括一或多種生理學上可接受之賦形劑或載劑。適用於本發明之調配物可見於Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 第17版, 1985。關於藥物遞送方法之簡要綜述，參見例如Langer (Science 249:1527-1533, 1990)。

本發明之靜脈內藥物遞送調配物可包含於袋、筆或注射器中。在某些實施例中，袋可連接至包含管及/或針之通道。在某些實施例中，調配物可為凍乾調配物或液體調配物。在某些實施例中，調配物可冷凍乾燥(凍乾)且包含於約12至60個小瓶中。在某些實施例中，調配物可經冷凍乾燥且在一個小瓶中可含有約45 mg冷凍乾燥調配物。在某些實施例中，一個小瓶中可含有約40 mg至約100 mg冷凍乾燥調配物。在某些實施例中，將來自12、27或45個小瓶之凍乾調配物合併以在靜脈內藥物調配物中獲得治療劑量之蛋白質。在某些實施例中，調配物可為液體調配物且以約250毫克/瓶至約1000毫克/瓶儲存。在某些實施例中，調配物可為液體調配物且以約600毫克/瓶儲存。在某些實施例中，調配物可為液體調配物且以約250毫克/瓶儲存。

蛋白可存在於液體醫藥調配物中，包括治療有效量之蛋白於緩衝溶液中形成調配物。

此等組合物可藉由習知滅菌技術滅菌，或可經無菌過濾。所得水溶液可封裝以便按原樣使用或凍乾，凍乾製劑在投與之前與無菌水性載劑組合。製劑之pH通常將在3與11之間，更佳為5與9之間或在6與8之間，且最佳在7與8之間，諸如7至7.5。呈固體形式之所得組合物可封裝於多個單次劑量單位中，各含有固定量之一或多種上述試劑。呈固體形式之組合物亦可以靈活的數量封裝於容器中。。

在某些實施例中，本發明提供存放期延長的調配物，其包括本發明之蛋白與以下之組合：甘露糖醇、單水合檸檬酸、檸檬酸鈉、二水合磷酸二鈉、二水合磷酸二氫鈉、氯化鈉、聚山梨醇酯80、水及氫氧化鈉。

在某些實施例中，製備包括本發明之蛋白於pH緩衝溶液中之水性調配物。本發明之緩衝液的pH可為約4至約8，例如約4.5至約6.0，或約4.8至約5.5範圍內之pH，或pH可為約5.0至約5.2。上文所述之pH值範圍中間的範圍亦意欲為本發明之一部分。舉例而言，意欲包括使用任何上述值之組合作為上限及/或下限之值的範圍。將pH控制在此範圍內之緩衝液的實例包括乙酸鹽(例如乙酸鈉)、丁二酸鹽(諸如丁二酸鈉)、葡糖酸鹽、組胺酸、檸檬酸鹽及其他有機酸緩衝液。

在某些實施例中，調配物包括緩衝系統，其含有檸檬酸鹽及磷酸鹽以將pH維持在約4至約8的範圍內。在某些實施例中，pH範圍可為約4.5至約6.0，或約pH 4.8至約5.5，或pH在約5.0至約5.2之範圍內。在某些實施例中，緩衝系統包括單水合檸檬酸、檸檬酸鈉、二水合磷酸二鈉及/或二水合磷酸二氫鈉。在某些實施例中，緩衝系統包括約1.3 mg/mL檸檬酸(例如1.305 mg/mL)、約0.3 mg/mL檸檬酸鈉(例如0.305 mg/mL)、約1.5 mg/mL二水合磷酸二鈉(例如1.53 mg/mL)、約0.9 mg/mL二水合磷酸二氫鈉(例如0.86)及約6.2 mg/mL氯化鈉(例如6.165 mg/mL)。在某些實施例中，緩衝系統包括1至1.5 mg/mL檸檬酸、0.25至0.5 mg/mL檸檬酸鈉、1.25至1.75 mg/mL二水合磷酸氫二鈉、0.7至1.1 mg/mL二水合磷酸二氫鈉及6.0至6.4 mg/mL氯化鈉。在某些實施例中，調配物之pH係用氫氧化鈉調節。

調配物中亦可包括充當張力劑且可使抗體穩定化的多元醇。添加至調配物中之多元醇的量可根據調配物之所需等張性而改變。在某些實施例中，水性調配物可具有等張性。多元醇添加量亦可根據多元醇之分子量來改變。舉例而言，相較於二醣(諸如海藻糖)，可降低單醣(例如甘露糖醇)的添加量。在某些實施例中，可作為張力劑用於調配物中之多元醇為甘露糖醇。在某些實施例中，甘露糖醇濃度可為約5至約20 mg/mL。在某些實施例中，甘露糖醇之濃度可為約7.5至15 mg/mL。在某些實施例中，甘露糖醇之濃度可為約10至14 mg/mL。在某些實施例中，甘露糖醇之濃度可為12 mg/mL。在某些實施例中，調配物中可包括多元醇山梨糖醇。

亦可將清潔劑或界面活性劑添加至調配物中。例示性清潔劑包括非離子型清潔劑，諸如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、80等)或泊洛沙姆(poloxamer)(例如泊洛沙姆188)。清潔劑之添加量係使得其降低所調配之抗體的聚集及/或使在調配物中微粒之形成降至最低及/或減少吸附。在某些實施例中，調配物可包括界面活性劑聚山梨醇酯。在某些實施例中，調配物可含有清潔劑聚山梨醇酯80或Tween 80。Tween 80為用於描述聚氧化乙烯(20)山梨糖醇單油酸酯之術語(參見Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 第4版, 1996年)。在某些實施例中，調配物可含有約0.1 mg/mL與約10 mg/mL之間，或約0.5 mg/mL與約5 mg/mL之間的聚山梨醇酯80。在某些實施例中，調配物中可添加約0.1%聚山梨醇酯80。

在實施例中，將本發明之蛋白產物調配為液體調配物。液體調配物可以10 mg/mL濃度存在於USP/Ph Eur I型50R小瓶中，小瓶係用橡膠塞封閉且用鋁褶密封蓋密封。塞子可由符合USP及Ph Eur之彈性體製得。在某些實施例中，可將小瓶用61.2 mL蛋白產物溶液填充，以便能萃取出60 mL體積。在某些實施例中，液體調配物可用0.9%鹽水溶液稀釋。

在某些實施例中，本發明之液體調配物可與穩定量之糖組合製備為10 mg/mL濃度溶液。在某些實施例中，液體調配物可在水性載劑中製備。在某些實施例中，穩定劑可以不大於可能引起靜脈內投與非所需或不適合之黏度的量添加。在某些實施例中，糖可為雙醣，例如蔗糖。在某些實施例中，液體調配物亦可包括緩衝劑、界面活性劑及防腐劑中之一或多者。

在某些實施例中，液體調配物之pH值可藉由添加醫藥學上可接受之酸及/或鹼來設定。在某些實施例中，醫藥學上可接受之酸可為鹽酸。在某些實施例中，鹼可為氫氧化鈉。

除聚集之外，脫醯胺作用為肽及蛋白在醱酵、收集/細胞澄清、純化、藥物物質/藥品儲存期間及在樣品分析期間可能產生的常見產物變異體。脫醯胺作用為自蛋白損失NH₃ ，從而形成可經歷水解的丁二醯亞胺中間物。丁二醯亞胺中間物引起親本肽質量減少17道爾頓(dalton)。後續水解引起質量增加18道爾頓。丁二醯亞胺中間物由於在水性條件下不穩定而難以分離。因此，脫醯胺作用通常可偵測為質量增加1道爾頓。天冬醯胺之脫醯胺作用產生天冬胺酸或異天冬胺酸。影響脫醯胺作用之速率的參數包括pH、溫度、溶劑介電常數、離子強度、一級序列、局部多肽構形及三級結構。與肽鏈中之Asn相鄰繁榮胺基酸殘基影響脫醯胺作用速率。蛋白序列中之Asn之後的Gly及Ser致使脫醯胺作用之敏感性更高。

在某些實施例中，本發明之液體調配物可在pH及濕度條件下保存，以防止蛋白產物脫胺作用。

本文所關注之水性載劑為醫藥學上可接受的(對於向人類投與而言為安全及無毒的)且適用於製備液體調配物的水性載劑。說明性載劑包括無菌注射用水(sterile water for injection，SWFI)、抑菌注射用水(bacteriostatic water for injection，BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏(Ringer)溶液或右旋糖溶液。

防腐劑可視情況添加至本文中之調配物中以減少細菌作用。防腐劑之添加可例如促進生產多次使用(多次劑量)之調配物。

在特定情況下，諸如當患者移植之後在醫院經由IV途徑接受所有藥物時，靜脈內(IV)調配物可為較佳投與途徑。在某些實施例中，將液體調配物在投與之前用0.9%氯化鈉溶液稀釋。在某些實施例中，用於注射之經稀釋藥品具有等張性且適用於藉由靜脈內輸注來投與。

在某些實施例中，鹽或緩衝液組分可以10 mM至200 mM之量添加。鹽及/或緩衝液係醫藥學上可接受的且來源於多種已知酸(無機及有機)與「鹼性」金屬或胺。在某些實施例中，緩衝液可為磷酸鹽緩衝液。在某些實施例中，緩衝液可為甘胺酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩衝液，在此情況下，鈉、鉀或銨離子可充當相對離子。

防腐劑可視情況添加至本文之調配物中以減少細菌作用。防腐劑之添加可例如促進生產多次使用(多次劑量)之調配物。

本文所關注之水性載劑為醫藥學上可接受的(對於向人類投與而言為安全及無毒的)且適用於製備液體調配物的水性載劑。說明性載劑包括無菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。

本發明之蛋白可存在於包括蛋白質及凍乾保護劑之凍乾調配物中。凍乾保護劑可為糖，例如雙醣。在某些實施例中，凍乾保護劑可為蔗糖或麥芽糖。凍乾調配物亦可包括緩衝劑、界面活性劑、增積劑及/或防腐劑中之一或多者。

可用於穩定凍乾藥品之蔗糖或麥芽糖的量可為蛋白與蔗糖或麥芽糖之重量比為至少1:2。在某些實施例中，蛋白與蔗糖或麥芽糖之重量比可為1:2至1:5。

在某些實施例中，在凍乾之前調配物的pH可藉由添加醫藥學上可接受之酸及/或鹼來設定。在某些實施例中，醫藥學上可接受之酸可為鹽酸。在某些實施例中，醫藥學上可接受之鹼可為氫氧化鈉。

在凍乾之前，含有本發明之蛋白之溶液的pH可調節在6至8之間。在某些實施例中，凍乾藥品之pH範圍可為7至8。

在某些實施例中，鹽或緩衝液組分可以10 mM至200 mM之量添加。鹽及/或緩衝液係醫藥學上可接受的且來源於多種已知酸(無機及有機)與「鹼性」金屬或胺。在某些實施例中，緩衝液可為磷酸鹽緩衝液。在某些實施例中，緩衝液可為甘胺酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸鹽緩衝液，在此情況下，鈉、鉀或銨離子可充當相對離子。

在某些實施例中，可添加「增積劑」。「增積劑」為一種化合物，其使凍乾混合物的質量增加且促成凍乾濾餅之物理結構(例如促進基本上均一凍乾濾餅之產生，餅維持開放的孔隙結構)。說明性增積劑包括甘露糖醇、甘胺酸、聚乙二醇及山梨糖醇。本發明之凍乾調配物可含有此類增積劑。

防腐劑可視情況添加至本文之調配物中以減少細菌作用。防腐劑之添加可例如促進生產多次使用(多次劑量)之調配物。

在某些實施例中，凍乾藥品可由水性載劑構成。本文所關注之水性載劑為醫藥學上可接受的(例如對於向人類投與而言為安全及無毒)且適用於在凍乾之後製備液體調配物的水性載劑。說明性稀釋劑包括無菌注射用水(SWFI)、抑菌注射用水(BWFI)、pH緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝鹽水)、無菌鹽水溶液、林格氏溶液或右旋糖溶液。

在某些實施例中，本發明之凍乾藥品係用無菌注射用水、USP (SWFI)或0.9%氯化鈉注射液USP復原。在復原期間，將凍乾粉末溶解成溶液。

在某些實施例中，本發明之凍乾蛋白產物係用約4.5 mL注射用水復原及用0.9%鹽水溶液(氯化鈉溶液)稀釋。

本發明之醫藥組合物中的活性成分之實際劑量水準可變化，以使得活性成分之量有效實現針對特定患者、組合物及投與模式之所需治療反應而對患者無毒性。

對於各患者而言，特定劑量可為均一劑量，例如50 mg至5000 mg蛋白。或者，可根據患者之大致體重或表面積定製患者之劑量。決定適當劑量之其他因素可包括待治療或預防之疾病或病狀、疾病之嚴重程度、投與途徑及患者之年齡、性別及醫學病狀。熟習此項技術者依常規方式，尤其根據劑量資訊及本文所揭示之分析，進一步改進為確定適當治療劑量所必需的計算。亦可經由使用確定劑量的已知分析，結合使用適當的劑量反應資料來確定劑量。可在監測疾病進展時調節個別患者的劑量。可量測患者中可靶向之構築體或複合物之血液量，以瞭解是否需要調節劑量以達到或維持有效濃度。藥物基因體學可用於確定哪些可靶向之構築體及/或複合物及其劑量最可能對既定個體有效(Schmitz等人,Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer等人,Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001)。

一般而言，基於體重之劑量為每公斤體重約0.01 μg至約100 mg，諸如約每公斤體重0.01 μg至約100 mg、每公斤體重約0.01 μg至約50 mg、每公斤體重約0.01 μg至約10 mg、每公斤體重約0.01 μg至約1 mg、每公斤體重約0.01 μg至約100 μg、每公斤體重約0.01 μg至約50 μg、每公斤體重約0.01 μg至約10 μg、每公斤體重約0.01 μg至約1 μg、每公斤體重約0.01 μg至約0.1 μg、每公斤體重約0.1 μg至約100 mg、每公斤體重約0.1 μg至約50 mg、每公斤體重約0.1 μg至約10 mg、每公斤體重約0.1 μg至約1 mg、每公斤體重約0.1 μg至約100 μg、每公斤體重約0.1 μg至約10 μg、每公斤體重約0.1 μg至約1 μg、每公斤體重約1 μg至約100 mg、每公斤體重約1 μg至約50 mg、每公斤體重約1 μg至約10 mg、每公斤體重約1 μg至約1 mg、每公斤體重約1 μg至約100 μg、每公斤體重約1 μg至約50 μg、每公斤體重約1 μg至約10 μg、每公斤體重約10 μg至約100 mg、每公斤體重約10 μg至約50 mg、每公斤體重約10 μg至約10 mg、每公斤體重約10 μg至約1 mg、每公斤體重約10 μg至約100 μg、每公斤體重約10 μg至約50 μg、每公斤體重約50 μg至約100 mg、每公斤體重約50μg至約50 mg、每公斤體重約50 μg至約10 mg、每公斤體重約50 μg至約1 mg、每公斤體重約50 μg至約100 μg、每公斤體重約100 μg至約100 mg、每公斤體重約100 μg至約50 mg、每公斤體重約100 μg至約10 mg、每公斤體重約100 μg至約1 mg、每公斤體重約1 mg至約100 mg、每公斤體重約1 mg至約50 mg、每公斤體重約1 mg至約10 mg、每公斤體重約10 mg至約100 mg、每公斤體重約10 mg至約50 mg、每公斤體重約50 mg至約100 mg。

可每日、每週、每月或每年給與劑量一次或多次，或甚至每2年至20年一次。一般熟習此項技術者可容易地基於體液或組織中之可靶向之構築體或複合物的滯留時間及濃度估算給藥之重複率。本發明之投與可為靜脈內、動脈內、腹膜內、肌肉內、皮下、胸膜內、鞘內、腔內、經由導管灌注或直接病灶內注射。此可每日投與一或多次、每週一或多次、每月一或多次及每年一或多次。

以上說明描述了本發明之多個態樣及實施例。本專利申請案特別涵蓋態樣及實施例之所有組合及排列。 實例

現已大體描述了本發明，將參考以下實例更容易地理解本發明，實例僅出於說明本發明之某些態樣及實施例的目的包括在內且不意欲限制本發明。實例 1 初級人類 NK 細胞細胞毒性分析：

使用密度梯度離心將周邊血液單核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)自人類周邊血液白血球層分離。洗滌經分離之PBMC且製備用於NK細胞之分離。使用磁珠負向選擇技術分離出NK細胞，經分離之NK細胞純度通常＞90% CD3^- CD56⁺ 。將經分離之NK細胞靜置隔夜，第二天在細胞毒性分析中使用經靜置之NK細胞。DELFIA 細胞毒性分析：

自培養物收集表現BCMA之人類癌細胞株，用HBS洗滌細胞，且以10⁶ /mL再懸浮於生長培養基中以便用BATDA試劑(Perkin Elmer AD0116)標記。遵循製造商說明書來標記標靶細胞。標記之後，用HBS洗滌細胞3次，且以0.5至1.0×10⁵ /mL再懸浮於培養基中。為製備背景孔，將經標記細胞之等分試樣置於一旁，且將細胞自培養基中離心出來。將100 µl培養基一式三份小心地添加至孔中，以避免干擾粒狀細胞。將100 µl經BATDA標記之細胞添加至96孔培養盤的各孔中。保存孔以用於自標靶細胞自發釋放，且藉由添加1%之Triton-X製備用於最大溶解標靶細胞的孔。在培養基中稀釋單株抗體或針對BCMA之TriNKET (NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA)，且向各孔中添加50 µl之經稀釋之mAb或TriNKET。自培養物收集經靜置之NK細胞，洗滌細胞且將細胞視所需E:T比率以10⁵ 至2.0×10⁶ mL再懸浮於培養基中。向培養盤之各孔中添加50 µl之NK細胞，以產生總共200 µl培養物體積。在37℃下，用5% CO2培育培養盤2至3小時，隨後進行分析。

培養2至3小時之後，將培養盤自培育箱中移出，且藉由在200 g下離心5分鐘使細胞成粒狀。將20 µl培養上清液轉移至由製造商提供之乾淨的微量培養盤中，向各孔中添加200 µl室溫的銪溶液。將培養盤避光且在培養盤振盪器上以250 rpm培育15分鐘。使用Victor 3或SpectraMax i3X儀器讀取培養盤。如下計算特異性溶解%：特異性溶解%=((實驗釋放-自發釋放)/(最大釋放-自發釋放))*100%。 基於 FACS 之長期細胞毒性分析：

表現BCMA之人類癌細胞株且轉導以在自離心之培養物收集嘌呤黴素選擇後穩定地表現NucLight Green (Essen BioScience 4475)，且以10⁵ /mL再懸浮於培養基中。將100 µl標靶細胞添加至96孔培養盤之各孔中。NKG2D結合性F4-TriNKETL-BCMA TriNKET在培養基中稀釋，且向雙份孔中各添加50 µl。將靜置隔夜的經純化之人類NK自培養基收集，洗滌且以4×10⁵ /mL再懸浮於培養基中。對於效應細胞:標靶細胞(E:T)比率為1:1，將50 µl NK細胞添加至所有孔，除僅含標靶之對照組(其接受100 µl培養基)以外。對於新鮮處理之PBMC用作效應細胞，取而代之使用10:1之E:T比率。在37℃下，將培養盤用5% CO₂ 培育30小時。

共同培養之後，將細胞染色，固定且藉由流式細胞量測術分析。使用FITC通道中之強位移來偵測剩餘標靶細胞，用生存力染色排除死亡細胞。輸出綠色事件之數目且藉由與僅含標靶之對照組樣品比較來計算殺死率%。包括對珠粒計數以確保所記錄體積相當。實例 2 評估結合至 NKG2D 陽性細胞之 TriNKET

KHYG-1人類NK細胞株係用於評估TriNKET NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA之NKG2D結合。使用經轉導以表現CD16-F158V之KHYG-1細胞來研究對Fc CD16結合之作用。稀釋TriNKET，且將其與KHYG-1細胞一起培育。使用結合螢光團之抗人類IgG二級抗體偵測TriNKET的結合。藉由流式細胞量測術分析細胞且報導MFI。 TriNKET 在人類全血中之結合

向各管/孔添加100 µl之經肝素化人類全血。直接將經直接標記之TriNKET (NKG2D結合性F4-TriNKET -BCMA)或mAb添加至全血中，亦添加直接結合之mAb的混合物用於免疫表型分型，且將樣品在室溫下培育20分鐘。對於經直接標記之NKG2D結合性F4-TriNKETK-BCMA或mAb而言，在培育之後，向各樣品中添加2 mL 1×RBC溶解/固定緩衝液。將樣品在室溫下培育15分鐘。在溶解之後洗滌樣品一次，隨後製備用於分析。

圖3及圖4展示在抗BCMA TriNKET (NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA)或抗BCMA單株抗體存在下，在2小時內BCMA陽性標靶細胞株之人類NK細胞溶解。分別將具有低及高BCMA表現之KMS12-PE細胞(圖3)及MM.1R細胞(圖4)用作標靶細胞。NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA展示針對KMS12-PE與MM.1R細胞之次奈莫耳EC₅₀ 值。相較於抗BCMA單株抗體(MAB42)，NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA提供針對兩種細胞株(KMS12-PE細胞(圖3)及MM.1R細胞(圖4))之更大的最大特異性溶解及效能。 藉由 TriNKET 之 BCMA 表面穩定性

KMS12-PE或MM.1R細胞與抗BCMA單株抗體(MAB42)、二價TriNKET (NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA)或單價TriNKET (A49-DB-TriNKET-BCMA)一起培育。A49-DB-TriNKET-BCMA為TriNKET，其中第一抗原結合位點包含結合NKG2D之Fab且第二抗原結合位點包含結合BCMA之Fab，其各自連接至Fc域，形成二價抗體。

為評估總表面BCMA，使用100 µg/mL之飽和濃度，而選擇100 ng/mL來研究次飽和表面穩定。將各樣品分成三份，且將等分試樣各置放於冰上20分鐘，在37℃下持續2小時或37℃下持續24小時。培育期之後，洗滌細胞且使用抗人類IgG二級抗體偵測經結合之TriNKET。在染色之後，固定細胞且在4℃下儲存，在研究結束時分析所有樣品。 TriNKET 使表面 BCMA 穩定

圖5展示在培育指定時間之後，用A49-DB-TriNKET-BCMA或BCMA單株抗體(MAB42)對KMS12-PE細胞上之表面BCMA染色。BCMA mAb與TriNKET均能夠在培育之後快速地穩定表面BCMA且在24小時期間維持表現之增加。圖6展示在先天較高之表現BCMA的細胞株MM.1R上觀測到相同作用。

在飽和濃度之A49-DB-TriNKET-BCMA及抗BCMA mAb (MAB42)下，亦觀測到在較長培育時間下BCMA標靶細胞結合之顯著改良。圖7展示藉由抗BCMA mAb (MAB42)及二價TriNKET (NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA)提供之親合結合促進與KMS12-PE細胞上之BCMA的結合快速且持續增加，而對於單價TriNKET (A49-DB-TriNKET-BCMA)觀測到結合僅有限改良。圖8展示MM.1R細胞上之類似模式。實例 3 二價 TriNKET 介導優良的長期細胞毒性

在二價TriNKET (NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA)存在下，將經純化之人類NK消損表現BCMA之KMS12-PE細胞的能力與抗BCMA單株抗體MAB42之能力相比較。圖9展示藉由經純化之人類NK細胞(E:T比率為1:1)使經靜置NK介導耗盡KMS12-PE細胞，如在20小時之後藉由流式細胞量測術偵測。二價BCMA TriNKET (NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA)比單株抗體或單價TriNKET (A49-DB-TriNKET-BCMA)產生更有效之殺死率。使用E:T比率為10:1之PBMC而非純化之NK得到類似的結果(圖10)。相較於TriNKET形式，抗BCMA mAb在兩種效應細胞類型下降低了最大殺死率及效能。 BCMA TriNKET 與細胞上之 NKG2D 具有極弱的結合相互作用

研究TriNKET結合表現NKG2D細胞之能力。如圖中11所示，觀測到TriNKET (NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA及NKG2D結合性F3-TriNKET-BCMA)與表現NKG2D而非CD16之KHYG-1細胞幾乎無結合。相比之下，當在KHYG-1細胞經轉導以表現CD16之高親和力變異體的情形下，NKG2D結合性F4-TriNKET-BCMA能夠以僅略高於抗BCMA單株抗體MAB42的MFI之水準結合細胞(圖12)。然而，NKG2D結合性F3-TriNKET-BCMA能夠以較高MFI結合至表現CD16之KHYG-1細胞(圖12)。TriNKET不與表現NKG2D之細胞結合進一步明顯體現為TriNKET不能在全血中結合NKG2D陽性NK細胞(圖13A)或CD8+ T細胞(圖13B)。TriNKET能夠在全血中以與IgG1對照組結合相當之水準結合B細胞(圖13D)、單核細胞(圖13E)及粒細胞(圖13F)。實例 4 TriNKET 觸發 BCMA + 腫瘤細胞之 CD8 + T 細胞溶解 初級人類 CD8 + T 細胞細胞毒性分析 ：

初級人類CD8+效應T細胞產生：使用密度梯度離心將人類PBMC自人類周邊血液白血球層分離。在37℃下，將經分離之PBMC用1 μg/ml刀豆球蛋白A (ConA)刺激18小時。隨後移除ConA且在37℃下將細胞用25單位/ml IL-2培養4天。使用具有磁性珠粒之陰性選擇技術純化CD8+ T細胞，隨後在37℃下在含有10 ng/ml IL-15之培養基中培養6至13天。

初級人類 CD8 + 效應 T 細胞表徵： 藉由流式細胞量測術對上文所產生之人類CD8+效應T細胞進行CD8+ T細胞純度以及NKG2D及CD16表現分析。用針對CD3、CD8、NKG2D及CD16之螢光團結合抗體染色細胞，隨後藉由流式細胞量測術分析。

短期 CD8 + 效應 T 細胞 DELFIA 細胞毒性分析 ： 自培養物收集表現相關標靶，BCMA之人類多發性骨髓瘤KMS12-PE細胞。洗滌細胞且以106/mL再懸浮於生長培養基中，用於BATDA試劑(Perkin Elmer AD0116)標記。遵循製造商說明書來標記標靶細胞。在標記之後，用HBS洗滌細胞三次，且以0.5×10⁵ /mL再懸浮於培養基中。將100 µl經BATDA標記之細胞添加至96孔培養盤的各孔中。保存孔以用於自標靶細胞自發釋放，且藉由添加1%之Triton-X製備使得標靶細胞具有最大溶解的孔。在培養基中稀釋TriNKET及mAb且以50 µL/孔添加至培養盤中。自培養物收集CD8+效應T細胞，洗滌且以5×10⁶ /mL再懸浮於培養基中(E:T比率=50:1)。隨後向培養盤之各孔中添加50 µl的CD8+ T細胞，得到總共200 µl的培養物體積。在37℃下，將培養盤用5% CO₂ 培育3.5小時，隨後進行分析。在培育之後，將培養盤自培育箱移除且藉由在500 g下離心5分鐘使細胞成粒狀。隨後將20 µl培養上清液轉移至由製造商提供之潔淨微量培養盤中，向各孔中添加200 µl室溫銪溶液。將培養盤避光且在培養盤振盪器上以250 rpm培育15分鐘。使用SpectraMax i3X儀器讀取培養盤。

如下計算特異性溶解%：特異性溶解%=((實驗釋放-自發釋放)/(最大釋放-自發釋放))*100%。 細胞毒性分析中所用之 CD8 + 效應 T 細胞的表徵

如圖14所示，用ConA刺激產生且用IL-15培養之CD8+效應T細胞具有高純度(CD3+CD8+細胞＞99% )，且所有表現NKG2D但不表現CD16。 當與經活化之 CD8 + T 細胞共同培養時 ， BCMA - F4 - TRINKET - A49 增強了 KMS12 - PE 細胞之溶解

在DELFIA分析中之KMS12-PE細胞的細胞溶解：在來自供體1 (圖15A)及供體2 (圖15B)之經IL-15刺激的CD8+ T細胞存在或不存在下，在KMS12-PE標靶細胞之培養物中添加60 nM之BCMA-F4-TRINKET-A49、抗BCMA mAb或不相關之TriNKET 。在無TriNKET/mAb存在下，與KMS12-PE細胞共同培養之活化CD8+ T細胞以背景T細胞殺死率包括在內。

圖15A至15B展示用來源於兩個健康供體及KMS12-PE標靶細胞之人類初級CD8+效應T細胞的DELFIA細胞毒性分析之結果。如所示，當與經活化之CD8+ T細胞共同培養時，BCMA-F4-TRINKET-A49增強KMS12-PE細胞之溶解，但在不存在效應細胞之情況下不會增強。親本抗BCMA mAb或不相關之TriNKET不能增強來自任一供體之CD8+ T細胞的溶解。實例 5 TriNKET 刺激之 NK 細胞活化

人類純化之NK細胞的共同培養活化：自培養物收集表現BCMA之人類癌細胞株，且將細胞調節至1×10⁶ 個細胞/mL。在培養基中稀釋TriNKET/mAb。自培養物收集經靜置之NK細胞且洗滌。將經純化之NK細胞以1×10⁶ 個細胞/mL再懸浮，得到E:T為1:1。所有共同培養物補充有hIL-2、Brefeldin-A、莫能菌素(monensin)及螢光團結合之抗CD107a且培育4小時。使用滲透/洗滌緩衝液及螢光團結合之抗IFNγ固定之後，實現活NK細胞之細胞內染色。

圖16A至16B展示在4小時內人類NK細胞在BCMA陽性標靶細胞株存在下，在抗BCMA TriNKET或單株抗體存在下活化。在圖16A中，將KMS12-PE細胞(低BCMA表現)用作標靶細胞。如所示，相較於抗BCMA mAb，靶向BCMA之TriNKET介導與BCMA陽性KMS12-PE骨髓瘤細胞共同培養比之人類NK細胞的較顯著活化。在圖16B中，H929 (高BCMA表現)用作標靶細胞。如所示，相較於抗BCMA mAb，靶向BCMA之TriNKET介導與BCMA陽性H929骨髓瘤細胞共同培養之人類NK細胞的較顯著活化。因此，針對高BCMA表現與低BCMA表現細胞，F4-TriNKET用次奈莫耳EC50值觸發脫粒及IFNγ產生之增加。相較於BCMA單株抗體，F4 TriNKET在最大程度上刺激佔較大比例之NK細胞，增強了針對兩種細胞株之效能。 以引用之方式併入

本文所提及之專利文獻及科學文章中之每一者的全部揭示內容出於所有目的以引用之方式併入。 等效物

本發明可在不偏離其精神或基本特徵之情況下以其他特定形式來實施。因此，前述實施例應在所有方面中視為說明性的而非限制本文所述之本發明。因此，本發明之範疇由隨附申請專利範圍而非前述描述指示，且本文意欲涵蓋申請專利範圍等效物之意義及範圍內之所有變化。

圖 1A 至 圖 1B 繪示了例示性三特異性抗體(TriNKET)，其包括結合NKG2D之scFv第一抗原結合位點、結合BCMA之第二抗原結合位點、結合BCMA之額外腫瘤相關抗原結合位點及結合CD16之雜二聚抗體恆定區。此等抗體形式在本文中稱為F4-TriNKET。圖 1A 繪示了呈Fab形式之兩個BCMA結合位點。圖 1B 繪示了呈scFv形式之兩個BCMA結合位點。

圖 2 繪示了例示性TriNKET，其含有結合NKG2D之scFv第一抗原結合位點、結合BCMA之第二抗原結合位點及雜二聚抗體恆定區。抗體形式在本文中稱為F3-TriNKET。

圖 3 展示靶向BCMA之TriNKET (NKG2D結合性F4- TriNKET-BCMA (呈短NKG2D-F4- TriNKET-BCMA)比抗BCMA mAb介導對BCMA陽性KMS12-PE骨髓瘤細胞之更有效溶解。

圖 4 展示靶向BCMA之TriNKET比抗BCMA mAb介導對BCMA陽性MM.1R骨髓瘤細胞更有效溶解。

圖 5 展示與靶向BCMA之抗體及TriNKET一起培育使KMS12-PE骨髓瘤細胞總表面上之BCMA表現隨時間穩定增加。

圖 6 展示與靶向BCMA之抗體及TriNKET一起培育使MM.1R骨髓瘤細胞總表面上之BCMA表現隨時間穩定增加。

圖 7 展示延長與二價TriNKET之培育時間顯著提高了結合至KMS12-PE骨髓瘤細胞之TriNKET的量。

圖 8 展示延長與二價TriNKET培育時間顯著提高了結合至MM.1R細胞之TriNKET的量。

圖 9 展示在長期純化之NK殺死率分析中二價TriNKET (F4形式)勝過二價靶向BCMA mAb及單價之TriNKET。

圖 10 展示BCMA-TriNKET用新鮮PBMC效應細胞之長期細胞毒性分析中保持功效。

圖 11 展示對靶向BCMA之TriNKET與表現於KHYG-1細胞上之NKG2D的弱(低於偵測極限)結合。

圖 12 展示對二價靶向BCMA之TriNKET (F4形式)的結合極少超出結合至經轉導以表現CD16之KHYG-1細胞的mAb Fc。

圖 13A 至 圖 13F 展示在全血中，將超出背景(虛線邊界，白色)的靶向BCMA之TriNKET (實體邊界，深灰色)與NK細胞(圖 13A )、CD8+ T細胞(圖 13B )及CD4+ T細胞(圖 13C )不顯著結合。接近結合至B細胞(圖 13D )、單核細胞(圖 13E )及粒細胞(圖 13F )之IgG1對照(點邊界，淺灰色)主要為Fc受體介導。

圖 14 展示CD8+效應T細胞之純度及標靶表現。如所示，用ConA刺激產生且用IL-15培養之CD8+效應T細胞具有高純度(CD3+CD8+細胞＞99%)，且所有表現NKG2D但不表現CD16。

圖 15A 至 圖 15B 展示在DELFIA分析中之KMS12-PE細胞的細胞溶解。使用來源於兩個健康供體及KMS12-PE標靶細胞之人類初級CD8+效應T細胞進行DELFIA細胞毒性分析。圖 15A 描繪來源於供體1之細胞的結果及圖 15B 描繪來源於供體2之細胞的結果。如所示，當與經活化之CD8+ T細胞共同培養時，BCMA-F4-TRINKET-A49增強了KMS12-PE細胞之溶解，但在不存在效應細胞之情況下不會增強。親本抗BCMA mAb或不相關之TriNKET不能增強來自任一供體之CD8+ T細胞的溶解。

圖 16A 至 圖 16B 展示在4小時內人類NK細胞在BCMA陽性標靶細胞株存在下，在抗BCMA TriNKET或單株抗體存在下活化。圖 16A 描繪KMS12-PE細胞(低BCMA表現)作為標靶細胞之結果。圖 16B 描繪H929 (高BCMA表現)作為標靶細胞之結果。如所示，針對高BCMA表現細胞與低BCMA表現細胞，F4-TriNKET以次奈莫耳EC50值觸發了脫粒及IFNγ產生之增加。相較於BCMA單株抗體，F4 TriNKET在最大程度上刺激了佔較大比例之NK細胞，增強了針對兩種細胞株之效能。

Claims (43)

1. 一種蛋白質，其包含： (a)   第一抗原結合位點，其包含結合NKG2D之單鏈可變片段(single-chain variable fragment，scFv)； (b)   結合B細胞成熟抗原(B-cell maturation antigen，BCMA)之第二抗原結合位點；及 (c)   足以結合CD16之抗體Fc域或其部分，或結合CD16之第三抗原結合位點。
2. 如請求項1之蛋白質，其進一步包含結合BCMA之額外抗原結合位點。
3. 如請求項1或2之蛋白質，其中結合BCMA之第二抗原結合位點為Fab片段。
4. 如請求項1至3中任一項之蛋白質，其中結合BCMA之第二及額外抗原結合位點為Fab片段。
5. 如請求項1或2之蛋白質，其中結合BCMA之第二及額外抗原結合位點為scFv。
6. 如請求項1至5中任一項之蛋白質，其中結合NKG2D之scFv的重鏈可變域位於scFv之輕鏈可變域的N端或C端。
7. 如請求項6之蛋白質，其中該輕鏈可變域位於結合NKG2D之scFv之重鏈可變域的N端。
8. 如請求項1至7中任一項之蛋白質，其中結合至NKG2D之scFv係連接至足以結合CD16之抗體Fc域或其部分，或結合CD16之第三抗原結合位點。
9. 如請求項8之蛋白質，其中結合至NKG2D之scFv係經由包含Ala-Ser之鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體Fc域或其部分，或結合CD16之第三抗原結合位點。
10. 如請求項8之蛋白質，其中結合至NKG2D之scFv係經由包含SGSGGGGS之可撓性連接子連接至足以結合CD16之抗體Fc域或其部分的C端，或結合CD16之第三抗原結合位點。
11. 如請求項10之蛋白質，其中抗體Fc域之C端連接至結合NKG2D之scFv之輕鏈可變域的N端。
12. 如請求項1至11中任一項之蛋白質，其中在結合NKG2D之scFv內，於scFv之重鏈可變域與scFv之輕鏈可變域之間形成二硫橋鍵。
13. 如請求項12之蛋白質，其中於來自重鏈可變域之C44與來自輕鏈可變域之C100之間形成二硫橋鍵。
14. 如請求項1至13中任一項之蛋白質，其中在結合NKG2D之scFv內，該重鏈可變域經由可撓性連接子連接至輕鏈可變域。
15. 如請求項14之蛋白質，其中該可撓性連接子包含(GlyGlyGlyGlySer)₄ (G4S)₄ )。
16. 如請求項5至15中任一項之蛋白質，其中第二及額外抗原結合位點scFv係經由包含Ala-Ser之鉸鏈連接至足以結合CD16之抗體Fc域或其部分，或結合CD16之第三抗原結合位點。
17. 如請求項5至16中任一項之蛋白質，其中第二及額外抗原結合位點scFv係經由包含Ala-Ser之鉸鏈連接至抗體Fc域。
18. 如請求項16或17之蛋白質，其中於第二抗原結合位點及/或額外抗原結合位點之重鏈可變域與該輕鏈可變域之間形成二硫橋鍵。
19. 如請求項18之蛋白質，其中於來自重鏈可變域之C44與來自輕鏈可變域之C100之間形成二硫橋鍵。
20. 如請求項1至19中任一項之蛋白質，其中結合NKG2D之scFv包含位於重鏈可變域之N端的輕鏈可變域，其中輕鏈可變域經由可撓性連接子(GlyGlyGlyGlySer)₄ (G4S)₄ )連接至scFv之重鏈可變域，且結合NKG2D之scFv經由包含Ala-Ser之鉸鏈連接至抗體Fc域。
21. 一種蛋白質，其包含SEQ ID NO:162之胺基酸序列。
22. 一種蛋白質，其包含SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163及SEQ ID NO:165之胺基酸序列。
23. 一種蛋白質，其包含與SEQ ID NO:162之胺基酸序列至少90%一致的胺基酸序列。
24. 一種蛋白質，其包含與SEQ ID NO:162之胺基酸序列至少95%一致的胺基酸序列。
25. 一種蛋白質，其包含與SEQ ID NO:162之胺基酸序列至少99%一致的胺基酸序列。
26. 一種蛋白質，其包含與SEQ ID NO:162之胺基酸序列至少90%、至少95%或至少99%一致的胺基酸序列，其進一步包含SEQ ID NO:163及SEQ ID NO:165。
27. 如請求項1至20中任一項之蛋白質，其中結合NKG2D之第一抗原結合位點包含與SEQ ID NO:94之胺基酸序列至少90%一致的重鏈可變域。
28. 如請求項1至20中任一項之蛋白質，其中結合NKG2D之第一抗原結合位點包含與SEQ ID NO:94至少90%一致的重鏈可變域及與SEQ ID NO:98至少90%一致的輕鏈可變域。
29. 如請求項1至20中任一項之蛋白質，其中結合NKG2D之第一抗原結合位點包含與SEQ ID NO:94至少95%一致的重鏈可變域及與SEQ ID NO:98至少95%一致的輕鏈可變域。
30. 如請求項1至20中任一項之蛋白質，其中結合NKG2D之第一抗原結合位點包含與SEQ ID NO:94一致的重鏈可變域及與SEQ ID NO:98一致的輕鏈可變域。
31. 如請求項1至20及26至30中任一項之蛋白質，其中抗體Fc域包含人類IgG1抗體之鉸鏈及CH2域。
32. 如請求項31之蛋白質，其中Fc域包含與人類IgG1抗體之胺基酸234-332至少90%一致的胺基酸序列。
33. 如請求項31或32之蛋白質，其中Fc域包含與人類IgG1之Fc域至少90%一致的胺基酸序列，且該Fc域在一或多個選自由以下組成之群的位置處不同：Q347、Y349、T350、L351、S354、E356、E357、K360、Q362、S364、T366、L368、K370、N390、K392、T394、D399、S400、D401、F405、Y407、K409、T411、K439。
34. 如請求項1至20及26至32中任一項之蛋白質，其中Fc域為包含Q347R、D399V及F405T取代的人類IgG1之Fc域。
35. 如請求項34之蛋白質，其中包含該等取代之Fc域係連接至結合NKG2D之scFv。
36. 如請求項1至20及26至32中任一項之蛋白質，其中Fc域為包含K360E及K409W取代的人類IgG1之Fc域。
37. 如請求項36之蛋白質，其中包含該等取代之Fc域係連接至第二抗原結合位點。
38. 如請求項1至37中任一項之蛋白質，其中該蛋白質以10 nM或更低之K_D 的親和力結合至NKG2D。
39. 一種調配物，其包含如前述請求項中任一項之蛋白質及醫藥學上可接受之載劑。
40. 一種細胞，其包含一或多種表現如請求項1至38中任一項之蛋白質的核酸。
41. 一種直接及/或間接促進腫瘤細胞死亡之方法，該方法包括使腫瘤及自然殺手細胞暴露於如請求項1至38中任一項之蛋白質。
42. 一種治療癌症之方法，其中該方法包括向患者投與如請求項1至38中任一項之蛋白質或如請求項39之調配物。
43. 如請求項42之方法，其中該癌症係選自由以下組成之群：多發性骨髓瘤、急性淋巴母細胞白血病、慢性淋巴球性白血病、B細胞淋巴瘤及急性骨髓白血病。

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