JP2023532973A - 多官能直交タンパク質キメラ - Google Patents

多官能直交タンパク質キメラ Download PDF

Info

Publication number
JP2023532973A
JP2023532973A JP2023500094A JP2023500094A JP2023532973A JP 2023532973 A JP2023532973 A JP 2023532973A JP 2023500094 A JP2023500094 A JP 2023500094A JP 2023500094 A JP2023500094 A JP 2023500094A JP 2023532973 A JP2023532973 A JP 2023532973A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cells
polypeptide
domain
protein
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2023500094A
Other languages
English (en)
Inventor
ムケルジー，シッダールタ
マフムード アリ，アブドラ
バーク，アラン
ボロット，フローレンス
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Columbia University of New York
Original Assignee
Columbia University of New York
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Columbia University of New York filed Critical Columbia University of New York
Publication of JP2023532973A publication Critical patent/JP2023532973A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本明細書で示されるのは、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよびＩｇＧ２ヒンジドメインを単独で、またはＩｇＧ２ Ｆｃドメインと共に使用する改変ヘテロダイマーまたはヘテロトリマータンパク質である。ヘテロダイマーおよびヘテロトリマータンパク質は、系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、免疫細胞（例えば、ナチュラルキラー細胞）上で発現される分子に結合するポリペプチドおよび／または別のタイプの免疫細胞（Ｔ細胞）上で発現される分子に結合するポリペプチドをさらに含み得る。また、本明細書で開示されるのは、タンパク質をコードする核酸、核酸を含むベクター、組成物、および治療の方法である。【選択図】図９Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は２０２０年７月３日出願の米国特許仮出願第６３／０４７，９３８号、２０２０年７月１０日出願の同第６３／０５０，３４６号、２０２０年９月８日出願の同第６３／０７５，３８８号、２０２１年２月３日出願の同第６３／１４５，０８３号、および２０２１年５月１７日出願の同第６３／１８９，４１２号に対する優先権を主張する。これら全ての仮出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子申請された配列表を含み、この配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
ほとんどの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の白血病細胞で提示されるＣＤ３３は、免疫療法のための魅力的な標的であり、それに対し既存の治療法が期待される働きをしない、標的集団である。ＣＤ３３に対するモノクローナル抗体をＤＮＡ切断細胞傷害性カリチアマイシンと融合した薬剤であるゲムツズマブオゾガマイシンは、２０００～２０１０年の間に、最初のＡＭＬ再発後の患者に利用できたが、その後、明確な利益もなく、患者の死亡率が増大したため使用中止になった（Ｌｏｗｅｎｂｕｒｇ ｅｔ ａｌ．２０１０）。２０１７年に、それは、原発性ＣＤ３３＋ＡＭＬのために市場に再導入され、ＤＮＡ合成を妨げるＤＮＡインターカレーターであるシトシンアラビノシドおよびダウノルビシンと組み合わせて生存期間中央値が中程度に改善された。単剤療法として、それは、転帰を改善しない（Ｒｅｎｎｅｖｉｌｌｅ ｅｔ ａｌ．２０１４）。現在第１相臨床試験中である二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は、ＣＤ３３＋ＡＭＬをＣＤ３＋Ｔ細胞に向ける（Ｋｒｕｐｋａ ｅｔ ａｌ．２０１４）。ＣＤ３＋Ｔ細胞を介して破壊するためにＣＤ１９＋Ｂ細胞を標的にするブリナツモマブなどのＢ細胞悪性腫瘍のために認可されたものを含むＢｉＴＥは、一度に数週間にわたり継続的な注入が数ヶ月間反復されるような低い生物学的利用度を有し、免疫療法に対する代替手法の必要性を生じる（Ｎａｎｂａｋｈｓｈ ｅｔ ａｌ．２０１４）。
ＡＭＬを含む多くの悪性腫瘍は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞傷害性応答の活性低下に関連している。ＵＬＢＰ１などのＮＫ活性化リガンドの発現は、生存と正に相関するが、それを通常は上方制御するはずの条件下でもＡＭＬにおいて発現が低下されることが知られている（Ｅｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．２０１４）。ＮＫ受容体２Ｂ４のリガンドであるＣＤ４８は、ＡＭＬ１－ＥＴＯなどの融合タンパク質を発現しているＡＭＬ細胞の表面上で下方制御される（Ｍａｓｔａｇｌｉｏ ｅｔ ａｌ．２０１８）。逆に、ＰＤ－Ｌ２などのＮＫ阻害リガンドは、発現上昇される（Ｄｕｌｐｈｙ ｅｔ ａｌ．２０１６）。ＡＭＬは、場合によっては、ＮＫ細胞の成熟を調節不全にし、ならびにＮＫＧ２Ｄなどの受容体の可溶性またはエキソソーム結合リガンドでＮＫ細胞を「混乱させる」ことが知られている（Ｍｕｎｄｙ－Ｂｏｓｓｅ ｅｔ ａｌ．２０１４）。少ない数のＣＤ１１ｂ＋ＣＤ２７＋ＮＫ細胞により確認されるＮＫ成熟の抑制は、ＡＭＬ負荷の増大と共により強力になる（Ｓｔｒｉｎｇａｒｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１４）。ＮＫ細胞の活性化－阻害のバランス（細胞傷害機能は、ＮＫ細胞上での阻害性のおよび活性化する受容体の発現および関与に依存する）は、ＡＭＬにより高頻度に妨害され、活性化受容体の表面発現を低減し、ＮＫＧ２Ａなどの阻害性受容体の発現を増大させる（Ｏｒｌｅａｎｓ－Ｌｉｎｄｓａｙ ｅｔ ａｌ．２００１）。エキソソームまたは可溶性リガンドの場合には、ＮＫ細胞は、適切な標的を見つけるのが困難であり、白血病細胞の表面上の天然リガンドに依存せずにＮＫ細胞傷害性応答を利用する方法が開発できれば、治療的機会を示す。
Ｔ細胞およびＮＫ細胞は同様に、ＡＭＬの状況下では機能が低下している。原発芽細胞およびＨＬ６０などのＡＭＬ細胞株の両方は、細胞溶解活性に影響を与えることなく、またはこれらの細胞死を引き起こすことなく、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の成長を抑制する能力を示した（ＬｅＤｉｅｕ ｅｔ ａｌ．２００９）。患者のより包括的な選別は、循環中のＴ細胞が、活性の増大なしに大きく増大し、他のものは特に、Ｔ調節細胞の増大した比率を示すことを示唆した（Ｓｈｅｎｇｈｕｉ ｅｔ ａｌ．２０１１；Ｓｃｈｎｏｆｆｅｉｌ ｅｔ ａｌ．２０１５）。上昇したＰＤ１発現と相関する、記憶Ｔ細胞側へのシフトは、この場合も、細胞傷害性Ｔ細胞の活性または「枯渇」の障害を示唆しないことを示した（Ｃｈａｍｕｌｅａｕ ｅｔ ａｌ．２００８）。いくつかのＡＭＬで発現上昇される、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼおよびアルギナーゼＩＩを介したトリプトファンおよびアルギニンの分解はまた、Ｔ細胞の不十分な増殖および活性化の一因であり、骨髄性悪性腫瘍による免疫回避の有用な血清指標として機能し得る（Ｔｈｏｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１８）。炎症性の状況もまた、Ｔ細胞活性からのＡＭＬの逃避に関連付けられているが、特異的相互作用の予測および治療可能性は、予測されていなかった（Ｂｅｎｃｉ ｅｔ ａｌ．２０１６；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１９）。結局のところ、それにより骨髄芽球が免疫除去を回避する方法－免疫調節亜集団を調節し、細胞傷害性を抑制し、自らをマスクする－は、広範囲にわたり異なり予測が困難である。
現在、転帰が、現時点での標準治療である強い化学療法を受けることができない高齢患者において特に、極めて不十分なままであり、５～１０ヶ月の生存期間中央値である、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの疾患のために新規手法が必要とされている（Ｄｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５）。
本開示は、改変タンパク質または多官能直交タンパク質キメラを提供する。
多重特異性または多官能特性タンパク質は、これらの薬剤のそれぞれに対する相互作用および親和性の特異性に基づいて、２種以上の異なる種類の薬剤（タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは細胞）に同時に結合できる生体分子である。
例えば、片方が免疫細胞（例えば、ＴまたはＮＫ）に対する特異性を有しおよびもう一方が癌細胞に対する特異性を有する、２種の異なるモノクローナル抗体から遺伝的に改変された二重特異性または二官能性抗体が、腫瘍殺作用を強化するために使用される。従来、これらの多重特異性タンパク質は、融合タンパク質として作成されているが、このような融合タンパク質は、結合部位の立体阻害のために非機能性になる場合がある。合成生物学における最近の進歩は、ＤＮＡの２つの逆平行鎖間で観察されるものと類似の、水素結合に基づく非共有結合相互作用を介して直交するタンパク質ヘテロダイマーを生成できる、合成ポリペプチドの作製を可能にした。
本明細書で示されるのは、改善された多重特異性または多官能性またはヘテロまたはヘテロダイマーまたはヘテロトリマータンパク質であり、これは、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスおよび単独でもしくはＩｇＧ２ Ｆｃドメインと共にＩｇＧ２ヒンジドメインを含む非天然起源ポリペプチドドメインを使用する。これらの多官能性タンパク質は、以前に記載された多官能性タンパク質よりも改善された特性を示す。その１つとして、ＩｇＧ配列の使用は、タンパク質をより安定にするジスルフィド共有結合の形成を可能にする。これらの多官能性タンパク質は、抗体様特性を有し、Ｆｃドメインを介して身体の補体系を結合する。さらに、これらの多官能性タンパク質は、抗体と同様に、身体中で容易に破壊されない。さらに、これらのタンパク質は抗体様であるため、標準的な、以前に開示された二重特異性タンパク質よりも、免疫原性が少なく、より良好な薬物動態学を有する。
本明細書で例示される改変タンパク質が存在するが、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスおよび単独でまたはＩｇＧ２ Ｆｃドメインと共にＩｇＧ２ヒンジドメインを含む非天然起源ポリペプチドドメインの革新的使用は、優れた結合および細胞傷害特性も有する他の特異性を有する改変タンパク質を構築するように拡張できる。これらの改変タンパク質は、癌および腫瘍細胞により発現されるおよび／または過剰発現される任意の系統特異的細胞表面抗原または他の抗原を結合する抗原結合フラグメントまたは他の部分、および免疫細胞上で発現される分子に結合する、任意のポリペプチドを含み得る。
本明細書で例示されるのは、ＮＫ細胞を骨髄細胞と係合させるために、ＣＤ３３タンパク質（骨髄細胞上に存在する）を結合するモノクローナル抗体の抗原認識ドメインとヘテロダイマーを作るためにタンパク質ＵＬＢＰ１のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを用いるヘテロダイマー二重特異性タンパク質である。図１、２および１０を参照されたい。
また、本明細書で例示されるのは、Ｔ細胞を骨髄細胞と係合させるために、ＣＤ３タンパク質（Ｔ細胞上に存在する）およびＣＤ３３タンパク質（骨髄細胞上に存在する）を結合するモノクローナル抗体の抗原認識ドメインを用いるヘテロダイマー二重特異性タンパク質である。図１、２および１０を参照されたい。
また本明細書で例示されるのは、ＮＫ細胞を骨髄細胞と係合させるために、ＣＤ３３タンパク質（骨髄細胞上に存在する）を結合するモノクローナル抗体の抗原認識ドメインとヘテロダイマーを作るためにＣＤ１６タンパク質（ＮＫ細胞上に存在する）を結合するモノクローナル抗体の抗原認識ドメインを用いるヘテロダイマー二重特異性タンパク質である。図２３を参照されたい。
本明細書で例示される改変タンパク質は、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を結合する抗原結合フラグメントまたは他の部分を利用するが、本開示は、癌および腫瘍細胞により発現されるおよび／または過剰発現される他の抗原を認識する抗原結合フラグメントまたは他の部分を含む改変タンパク質を包含する。本開示はまた、免疫細胞上に発現される他の分子に結合するポリペプチドを含む改変タンパク質も含む。
これらの例示されるヘテロダイマータンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジドメインを含む。図１Ａおよび２３Ａを参照されたい。
また本明細書で示されるのは、ＩｇＧ２ヒンジドメインおよびＩｇＧ２ Ｆｃドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン）を含む例示されるヘテロダイマータンパク質である。図１Ｂおよび２３Ｂを参照されたい。
３種以上のポリペプチドを含む多官能性タンパク質も、構築できる。これらのタンパク質は、各ヘテロダイマーＸ、ＹまたはＺのモノマーをリンカーおよび標的結合ドメインに融合されたモノマーｂと組み合わせることにより形成できる。この概略図は、三重特異性タンパク質を示すが、四重特異性タンパク質ならびに５重以上の特異性を含む改変タンパク質を、本明細書の概略図および方法で示すように構築できる。図９を参照されたい。
これらの合成分子の用途は、３種以上のシグナルを同時に活性化および／または不活性化することによる、治療標的化、遺伝子編集、診断、経路操作を含む。
本開示は、改変ヘテロダイマータンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は：系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよび第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチドを含み、第１および第２のポリペプチドは、共有結合ダイマー化ドメインを介して共有結合される。
いくつかの実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は：系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよび第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；およびＴ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチドを含み、第１および第２のポリペプチドは、共有結合ダイマー化ドメインを介して共有結合される。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド中のアミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインは、６ＤＭＰｂおよび６ＤＭＰａからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第１の共有結合ダイマー化ドメインおよび／または第２の共有結合ダイマー化ドメインは、ＩｇＧ２ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１の共有結合ダイマー化ドメインおよび／または第２の共有結合ダイマー化ドメインは、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインをさらに含む。
いくつかの実施形態では、系統特異的細胞表面抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ１９、または本明細書で記載の系統特異的細胞表面抗原のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞上で発現される分子は、ＮＫＧ２Ｄであり得、ＮＫ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、またはそれらの変異体またはフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢの外部ドメインである。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞上で発現される分子は、ＣＤ１６であり、ＮＫ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、ＣＤ１６のモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞上で発現される分子は、ＣＤ３であり、Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、ＣＤ３のモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
本開示はまた、３種のポリペプチドを含む改変ヘテロトリマータンパク質、または４種以上のポリペプチドを含む改変タンパク質、４種のポリペプチドを含む、５種のポリペプチドを含む、６種のポリペプチドを含む、または７種以上のポリペプチドを含む、改変ヘテロトリマータンパク質を提供し、改変ヘテロタンパク質は、改変タンパク質中の他のそれぞれに対する結合ドメインを有する追加のポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、改変ヘテロダイマータンパク質は：Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン（ａ１）、および第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン（ｂ１）および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチド；ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン（ｃ１）、および第３の共有結合ダイマー化ドメインを含む第３のポリペプチド；およびアミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む３個の非天然起源ポリペプチドドメインを含む第４のポリペプチドを含み、各ドメインは、ａ１、ｂ１およびｃ１（ａ２、ｂ２およびｃ２）の結合ドメイン、および第４、第５および第６の共有結合ダイマー化ドメインであり、第１および第２および第３および第４のポリペプチドは、共有結合ダイマー化ドメインを介して共有結合される。
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチド中のアミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインは、６ＤＭＰｂおよび６ＤＭＰａからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、第１の共有結合ダイマー化ドメイン、第２の共有結合ダイマー化ドメイン、第３の共有結合ダイマー化ドメイン、第４の共有結合ダイマー化ドメイン、第５の共有結合ダイマー化ドメイン、および／または第６の共有結合ダイマー化ドメインは、ＩｇＧ２ヒンジドメインを含む。いくつかの実施形態では、１種または複数の共有結合ダイマー化ドメインは、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインをさらに含む。
いくつかの実施形態では、系統特異的細胞表面抗原は、ＣＤ３３、ＣＤ１９、または本明細書で記載の系統特異的細胞表面抗原のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞上で発現される分子は、ＮＫＧ２Ｄであり得、ＮＫ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、またはそれらの変異体またはフラグメントである。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢの外部ドメインである。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞上で発現される分子は、ＣＤ１６であり得、Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、ＣＤ１６のモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞上で発現される分子は、ＣＤ３であり、Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、ＣＤ３のモノクローナル抗体である。
いくつかの実施形態では、第３のポリペプチドは、ケモカインまたはサイトカインタンパク質であり、これは、免疫応答を高める。ケモカインまたはサイトカインタンパク質は、ＣＸＣＬ１４、ＧＣＳＦを含むＣＸＣＬ、ならびにＩＬ２およびＩＬ１６を含むインターロイキンを含むがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）である。
特定の実施形態では、第１および第２および第３の改変ヘテロダイマータンパク質中の第１のポリペプチドは、配列番号１（図３）と少なくとも８０％または少なくとも９０％同一のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、改変ヘテロダイマータンパク質中の第１のポリペプチドは、配列番号４（図６）と少なくとも８０％または少なくとも９０％同一のアミノ酸を含む。
特定の実施形態では、第１の改変ヘテロダイマー中の第２のポリペプチドは、配列番号２（図４）と少なくとも８０％または少なくとも９０％同一のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質中の第２のポリペプチドは、配列番号５（図７）と少なくとも８０％または少なくとも９０％同一のアミノ酸を含む。
特定の実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質中の第２のポリペプチドは、配列番号３（図５）と少なくとも８０％または少なくとも９０％同一のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質中の第２のポリペプチドは、配列番号６（図８）と少なくとも８０％または少なくとも９０％同一のアミノ酸を含む。
特定の実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質中の第２のポリペプチドは、配列番号２６（図２３Ａ）と少なくとも８０％または少なくとも９０％同一のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質中の第２のポリペプチドは、配列番号２７（図２３Ｂ）と少なくとも８０％または少なくとも９０％同一のアミノ酸を含む。
本開示は、いずれかの改変タンパク質を含む組成物、またはいずれかの改変タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
本開示はまた、第１の改変ヘテロダイマータンパク質をコードする核酸分子を提供する。改変ダイマータンパク質は、本明細書で記載の（ｉ）系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよび第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；および（ｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチドを含み得る。
本開示はまた、第２の改変ヘテロダイマータンパク質をコードする核酸分子も提供する。改変ダイマータンパク質は、本明細書で記載の（ｉ）系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよび第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；および（ｉｉ）Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチドを含み得る。
本開示はまた、第３の改変ヘテロダイマータンパク質をコードする核酸分子も提供する。改変ダイマータンパク質は、本明細書で記載の（ｉ）系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよび第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；および（ｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチドを含み得る。
本開示はまた、改変トリマータンパク質をコードする核酸分子も提供する。改変ヘテロダイマータンパク質は、本明細書で記載の、（ｉ）Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；（ｉｉ）系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよび第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチド；（ｉｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第３のポリペプチド；および（ｉｖ）アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む３個の非天然起源ポリペプチドドメインを含む第４のポリペプチドを含み、各ドメインは、ａ１、ｂ１およびｃ１（ａ２、ｂ２およびｃ２）の結合ドメイン、および第４、第５および第６の共有結合ダイマー化ドメインである。
本開示は、いずれかの本発明の核酸分子を含むベクター、またはいずれかの本発明の核酸分子を含む組成物を提供する。
本開示は、本発明のベクターまたは核酸分子を含む細胞を提供する。
本開示は、本明細書で記載の（ｉ）系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよび第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；および（ｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチドをコードする少なくとも１種のベクターを含む組成物を提供する。
本開示は、本明細書で記載の（ｉ）系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよび第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；および（ｉｉ）Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチドをコードする少なくとも１種のベクターを含む組成物を提供する。
本開示は、本明細書で記載の、（ｉ）Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；（ｉｉ）系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよび第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチド；（ｉｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第３のポリペプチド；および（ｉｖ）アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む３個の非天然起源ポリペプチドドメインを含む第４のポリペプチドをコードする少なくとも１種のベクターを含む組成物を提供し、各ドメインは、ａ１、ｂ１およびｃ１（ａ２、ｂ２およびｃ２）の結合ドメイン、および第４、第５および第６の共有結合ダイマー化ドメインである。
本開示は、いずれかの改変タンパク質、いずれかの核酸分子、いずれかの本発明のベクター、および／または、いずれかの本発明の細胞を含む組成物を提供する。
また本開示により包含されるのは、いずれかの改変タンパク質、いずれかの核酸分子、いずれかの本発明のベクター、いずれかの本発明の細胞、および／または、いずれかの本発明の組成物を含むキットである。
本開示は、対象の癌を治療する方法を提供し、方法は、本明細書で開示または記載の、有効量のいずれかの改変タンパク質、いずれかの核酸分子、いずれかの本発明のベクター、いずれかの本発明の細胞、および／または、いずれかの本組成物を対象に投与することを含む。
本開示は、対象の造血器悪性腫瘍を治療する方法を提供し、方法は、本明細書で開示または記載の、有効量のいずれかの改変タンパク質、いずれかの核酸分子、いずれかの本発明のベクター、いずれかの本発明の細胞、および／または、いずれかの本発明の組成物を対象に投与することを含む。
造血器悪性腫瘍は、骨髄悪性腫瘍であり得る。
造血器悪性腫瘍は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫であり得る。
造血器悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、または慢性リンパ性白血病であり得る。
本発明を説明するために、本発明の特定の実施形態が図面で示される。しかしながら、本発明は、図面で示される実施形態の正確な配置および手段に限定されるものではない。
種々の結合タンパク質の概略図である。図１Ａは、改変タンパク質で使用されるＩｇＧ２ヒンジドメインのみを有する抗ＣＤ３３、抗ＣＤ３、およびＮＫＧ２Ｄ結合タンパク質の概略図である。図１Ｂは、改変タンパク質で使用されるＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ Ｆｃドメインの両方を有する抗ＣＤ３３、抗ＣＤ３、およびＮＫＧ２Ｄ結合タンパク質の概略図である。 免疫細胞を癌細胞に結合する二官能性タンパク質ダイマーの概略図である。 ＩｇＧ２ヒンジドメインのみを有する抗ＣＤ３３構築物のアミノ酸配列である（配列番号１）。 ＩｇＧ２ヒンジドメインのみを有するＵＬＢＰ１構築物のアミノ酸配列である（配列番号２）。 ＩｇＧ２ヒンジドメインのみを有する抗ＣＤ３構築物のアミノ酸配列である（配列番号３）。 ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ Ｆｃドメインの両方を有する抗ＣＤ３３構築物のアミノ酸配列である（配列番号４）。 ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ Ｆｃドメインの両方を有するＵＬＢＰ１構築物のアミノ酸配列である（配列番号５）。 ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ Ｆｃドメインの両方を有する抗ＣＤ３構築物のアミノ酸配列である（配列番号６）。 改変ヘテロトリマータンパク質の概略図である。 ＩｇＧ２ヒンジおよび６ＤＭＰａ／ｂヘテロダイマー化構造を有する改変ヘテロダイマータンパク質の概略図である。図１０Ａは、抗ＣＤ３３／抗ＣＤ３ヘテロダイマータンパク質である。図１０Ｂは、抗ＣＤ３３／ＵＬＰＢ１ヘテロダイマータンパク質である。 この試験で使用された発現ベクターのプラスミドマップである。図１１Ａは、ａＣＤ３３－６ＤＭＰａ－ヒンジ発現ベクターのマップである。図１１Ｂは、ＵＬＢＰ１－６ＤＭＰｂ－ヒンジ発現ベクターのマップである。図１１Ｃは、ａＣＤ３－６ＤＭＰｂ発現ベクターのマップである。 抗ＣＤ３３－ＵＬＢＰ１キメラ１および２プラスミドを遺伝子導入した２９３Ｔ細胞での抗ＣＤ３３／ＵＬＢＰ改変タンパク質の発現および精製を示す免疫ブロットである。図１２Ａは、細胞における発現を示す。図１２Ｂは、上清における発現および精製を示す。 は、ＣＨＯ細胞でのヒンジベース構築物の発現および精製を示す免疫ブロットである。タンパク質は、上清中に分泌され、コバルト－レジンおよびイミダゾールによる溶出を用いて６ｘＨｉｓ精製できる。 抗ＣＤ３３構築物単独でまたは改変ヘテロダイマータンパク質の１種と共にインキュベートしたＨＬ－６０細胞のＦＡＣＳプロットを示す。図１４Ａは、抗ＦＬＡＧ抗体との共インキュベーションを示す。図１４Ｂは、抗ＭＹＣ抗体との共インキュベーションを示す。 ＨＬ－６０細胞に対する改変ヘテロダイマータンパク質の結合実験をまとめた表である。 ジャーカット細胞に対する改変ヘテロダイマータンパク質の結合実験をまとめた表である。 ＰＭＢＣに対する改変ヘテロダイマータンパク質の結合実験をまとめた表である。 ＭＯＬＭ１４細胞および抗ＣＤ３３／抗ＣＤ３改変ヘテロダイマータンパク質を用いる細胞傷害性アッセイの結果を示す。図１８Ａは、フローサイトメトリーゲーティングスキームを示す代表的ドットプロットである。Ｓｉｎｇｌｅ ｄＴｏｍａｔｏ＋（ＭＯＬＭ１４）細胞がゲート制御され、死滅した％特異的細胞が、ＤＡＰＩ＋でもあるｄＴｏｍａｔｏ＋細胞の合計％として評価される。図１８Ｂは、抗ＣＤ３３／抗ＣＤ３改変ヘテロダイマータンパク質を用いるＭＯＬＭ１４細胞における細胞傷害性の結果のグラフである。 ＨＬ６０細胞および抗ＣＤ３３／抗ＣＤ３改変ヘテロダイマータンパク質を用いる細胞傷害性アッセイの結果を示す。図１９Ａは、フローサイトメトリーゲーティングスキームを示す代表的ドットプロットである。Ｓｉｎｇｌｅ ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ＋（ＨＬ－６０）細胞がゲート制御され、死滅した％特異的細胞が、ＤＡＰＩ＋でもあるＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ＋細胞の合計％として評価される。図１９Ｂは、抗ＣＤ３３／抗ＣＤ３改変ヘテロダイマータンパク質を用いるＨＬ－６０細胞における細胞傷害性アッセイの結果を示すグラフである。 抗ＣＤ３３／抗ＣＤ３改変ヘテロダイマータンパク質を用いるＨＬ－６０細胞における細胞傷害性アッセイの追加の結果を、モノマーと比較して示すグラフである。 タンパク質の滴定（すなわち、抗ＣＤ３３／抗ＣＤ３改変ヘテロダイマータンパク質の増大）を用いるＨＬ－６０細胞における用量依存性細胞傷害性アッセイの結果を示すグラフである。 エフェクター滴定（すなわち、エフェクター／標的比率の増大）を用いるＨＬ－６０細胞における用量依存性細胞傷害性アッセイの結果を示すグラフである。 抗ＣＤ１６構築物のアミノ酸配列を示す。図２３Ａは、ＩｇＧ２ヒンジドメインのみを有する抗ＣＤ１６構築物のアミノ酸配列である（配列番号２６）。図２３Ｂは、ＩｇＧ２ヒンジおよびＩｇＧ２ Ｆｃドメインの両方を有する抗ＣＤ１６構築物のアミノ酸配列である（配列番号２７）。 抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３改変ヘテロダイマータンパク質のインビボ抗腫瘍活性の結果を示す。図２４Ａは、実験の略図である。図２４Ｂは、ＦＦｌｕｃ－ｄｔｏｍａｔｏ形質導入ＭＯＬＭ１４の増殖を監視するために使用した生物発光画像法（ＢＬＩ）の画像である。図２４Ｃは、ＭＯＬＭ１４単独、無負荷Ｔ細胞または抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３改変ヘテロダイマータンパク質負荷Ｔ細胞で治療したマウスにおけるＢＬＩの定量化のグラフである。図２４Ｄは、カプランマイヤー生存プロットである。抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３改変ヘテロダイマータンパク質負荷Ｔ細胞で治療したマウスは、２種の対照群（治療なし、または無負荷Ｔ細胞）より良好に生存した。ログランク検定 ＊ｐ＜０．０５。
定義
本明細書で使用される場合、用語「改変タンパク質」または「改変ヘテロダイマータンパク質」または「改変ヘテロトリマータンパク質」または「改変ヘテロタンパク質」または「多官能性タンパク質」または「多官能直交タンパク質キメラ」または「タンパク質キメラ」などは、少なくとも２種の異なるタンパク質由来のタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを指す。１つのドメインは、融合タンパク質のアミノ末端（Ｎ末端）部またはカルボキシ末端（末端）部に位置し得る。本明細書で提供されるいずれのタンパク質も、当該技術分野において既知の任意の方法により作製され得る。例えば、本明細書で提供されるタンパク質は、組換えタンパク質発現および精製により作製され得、これは、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質に特に好適である。組換えタンパク質発現および精製のための方法は良く知られており、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２））に記載のものを含み、この文献の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
用語「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は、本明細書では同じ意味で用いられ、ペプチド（アミド）結合により一緒に連結されたアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、任意の大きさ、構造、または機能のタンパク質、ペプチドおよびポリペプチドを指す。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸長である。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個別のタンパク質または一群のタンパク質を指し得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチド中の１種または複数のアミノ酸は、例えば、炭水化物基、ヒドロキシル基、ホスフェート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、機能化、または他の改変用リンカー、などの化学物質の付加により改変され得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドはまた、単一分子であっても、複数分子の複合体であってもよい。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然起源タンパク質またはペプチドの適切なフラグメントであり得る。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然起源、組換え、または合成、またはこれらの任意の組み合わせであってよい。
用語「対象」、「個体」、および「患者」は同じ意味で用いられ、脊椎動物、好ましくはヒトなどの哺乳動物を指す。哺乳動物は、限定されないが、ヒト霊長類、非ヒト霊長類、あるいはネズミ、ウシ、ウマ、イヌまたはネコ種を含む。本開示の場合、用語「対象」はまた、インビトロまたはエクスビボで培養できる、あるいはインビボで操作できる組織または細胞を包含する。用語「対象」は、用語「生物」と同じ意味で用いられてよい。
用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」は同じ意味で用いられる。これらは、任意の長さのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、あるいはこれらの類似体であるヌクレオチドの重合型を指す。ポリヌクレオチドの例は、限定されないが、遺伝子または遺伝子フラグメントのコードまたは非コード領域、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含む。ポリヌクレオチド内の１つまたは複数のヌクレオチドは、さらに修飾されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドはまた、標識剤との複合化によるなどにより、重合化後に修飾され得る。
用語「ハイブリダイゼーション」は、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定化される複合体を形成する、反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック塩基対形成、フーグステイン結合、またはいずれかの他の配列特異的様式によって生じ得る。複合体は、二本鎖構造を形成する２本鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一自己ハイブリダイゼーション鎖、またはこれらのいずれかの組み合わせを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、ＰＣＲの開始、または酵素によるポリヌクレオチドの切断などの、さらに広範な工程におけるステップを構成し得る。所定の配列とハイブリダイズできる配列は、所定配列の「相補体」と呼ばれる。
用語の「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するために、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば外来遺伝子）を宿主細胞に導入できるビークルを意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ、およびウィルスを含むが、これらに限定されない。ベクターは典型的には、感染性物質を含み、その中に外来性ＤＮＡが挿入される。１つのセグメントのＤＮＡを別のセグメントのＤＮＡ中に挿入する一般的方法は、制限酵素部位と呼ばれる特定の部位（特定のヌクレオチド群）でＤＮＡを切断する制限酵素と呼ばれる酵素の使用を含む。「カセット」は、ＤＮＡコード配列または明確な制限酵素部位でベクター中に挿入できる発現産物をコードするＤＮＡのセグメントを指す。カセットの制限酵素部位は、適切な読み枠中にカセットの挿入を保証するように設計される。一般に、外来性ＤＮＡは、ベクターＤＮＡの１種または複数の制限酵素部位で挿入され、その後、感染性ベクターＤＮＡと共に、ベクターにより宿主細胞中に運ばれる。発現ベクターなどの挿入されたまたは付加されたＤＮＡを有するＤＮＡのセグメントまたは配列は、「ＤＮＡ構築物」または「遺伝子構築物」とも呼ばれてよい。ベクターの一般的な種類は「プラスミド」であり、それは一般に、追加の（外来の）ＤＮＡを容易に受け入れることができ、好適な宿主細胞に容易に導入できる、通常は細菌起源の、二本鎖ＤＮＡの自立型分子である。プラスミドベクターは多くの場合、コーディングＤＮＡおよびプロモーターＤＮＡを含有し、外来性ＤＮＡの挿入に好適な１個または複数の制限酵素部位を有する。コーディングＤＮＡは、特定のタンパク質または酵素のための特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡは、コーディングＤＮＡの発現を開始させる、調節する、あるいは、媒介するまたは制御するＤＮＡ配列である。プロモーターＤＮＡおよびコーディングＤＮＡは、同じ遺伝子由来であっても、異なる遺伝子由来であってもよく、さらに同じまたは異なる生物由来であってもよい。プラスミドおよび真菌のベクターを含む多数のベクターが、様々な真核生物および原核生物の宿主での複製および／または発現について記載されている。非限定的例は、本明細書で開示もしくは引用されるか、あるいは、当業者に既知の方法を使用するための、ｐＫＫプラスミド（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）、ｐＵＣプラスミド、ｐＥＴプラスミド（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ｐＲＳＥＴもしくはｐＲＥＰプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、またはｐＭＡＬプラスミド（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）、および多くの適切な宿主細胞を含む。組換えクローニングベクターは多くの場合、クローニングまたは発現のための１つまたは複数の複製系、宿主中での選択のための１つまたは複数のマーカー、例えば抗生物質耐性、および１つまたは複数の発現カセットを含む。
用語「組換え発現ベクター」は、構築物がｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするヌクレオチド配列を含み、かつベクターが細胞内で発現されるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを有するのに十分な条件下で細胞と接触する場合に、宿主細胞によるｍＲＮＡ、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現を可能にする遺伝子改変されたオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド構築物を意味する。本開示のベクターは、総じて天然起源ではない。ベクターの要素は、天然起源であり得る。本開示の非天然起源組換え発現ベクターは、ヌクレオチドのいずれかのタイプを含んでよく、限定されないが、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、それは一本鎖または二本鎖であってよく、合成されるか一部は天然源から得られ、また、天然の、非天然の、または改変されたヌクレオチドを含んでもよい。
本明細書で使用される「遺伝子導入」、「形質転換」、または「形質導入」は、物理的または化学的方法による宿主細胞中への１個または複数の外来性ポリヌクレオチドの導入を指す。
「抗体」、「抗体のフラグメント」、「抗体フラグメント」、「抗体の機能的フラグメント」、または「抗原結合部分」は同じ意味で用いられ、特定抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数のフラグメントまたは部分を意味する（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００５）２３（９）：１１２６）。本発明の抗体は、抗体および／またはそのフラグメントであり得る。抗体フラグメントはＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｆｃ、またはバリアント、および／または混合物を含む。抗体は、キメラ、ヒト化、単鎖、または二重特異的であり得る。すべての抗体アイソタイプは、本開示によって包含され、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含む。適切なＩｇＧサブタイプはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む。抗体軽鎖または重鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域によって中断されるフレームワークからなる。本抗体または抗原結合部分のＣＤＲは、非ヒトまたはヒト起源由来であり得る。本発明の抗体または抗原結合部分のフレームワークは、ヒト、ヒト化、非ヒト（例えば、ヒトにおける抗原性を低下するように改変されたマウスフレームワーク）、または合成フレームワーク（例えば、コンセンサス配列）であってよい。
本発明の抗体または抗原結合部分は、約１０－７Ｍ未満、約１０－８Ｍ未満、約１０－９Ｍ未満、約１０－１０Ｍ未満、約１０－１１Ｍ未満、または約１０－１２Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）で特異的に結合できる。本開示による抗体の親和性は、従来技術を用いて容易に測定できる（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９４９）５１：６６０、および米国特許第５，２８３，１７３号、同第５，４６８，６１４号、または同等文献）。
核酸配列によってコードされる改変タンパク質の抗原認識部分は、いずれかの系統抗原特異的抗原結合抗体フラグメントを含み得る。抗体フラグメントは、１つまたは複数のＣＤＲ、可変領域（またはこの一部）、定常領域（またはこの一部）、または上記のいずれかの組み合わせを含み得る。
用語「宿主細胞」は、細胞による物質の産生、例えば、遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列、タンパク質または酵素の細胞による発現のために、何らかの方法で選択、改変、形質転換、増殖、使用または操作される、任意の生物の任意の細胞を意味する。宿主細胞は、本明細書で記載のスクリーニングまたは他のアッセイのためにさらに使用できる。
用語「細胞系統」は、共通祖先を有し、識別可能な細胞の同一タイプから特定の識別可能／機能性細胞へと発達している細胞を指す。本明細書で使用される細胞系統は、限定されないが、呼吸器、前立腺、乳房、腎臓、腸、神経、骨格、血管、肝臓、造血、筋肉または心臓の細胞系統を含む。
用語「阻害」は、系統特異的抗原の遺伝子発現または機能に関連して使用される場合、系統特異的抗原の遺伝子発現の量または機能における低減を指し、ここで阻害は遺伝子発現または機能に対する干渉の結果である。阻害は完全であり得、その場合検出可能な発現または機能がなく、または阻害は部分的であり得る。部分的阻害は、ほとんど完全な阻害からほとんど阻害がない範囲であり得る。
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、などは、疾患の少なくとも１種の症状を遅らせる、緩和する、改善するまたは軽減する、または疾患をその開始後に逆転させることを指す。
状態、障害または病状の「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、下記を含む：
（１）状態、障害または病状に罹患し得るまたはそれに罹りやすいが、状態、障害または病状の臨床的症状または無症候性症状をまだ経験せずまたは示していない人で発生しつつある状態、障害または病状の臨床症状の出現を防止するまたは遅らせること；
（２）状態、障害または病状を抑制すること、すなわち、疾患の発症またはその再発（維持療法の場合）またはその少なくとも１つの臨床症状、徴候、または検査を抑える、軽減するまたは遅らせること；または
（３）疾患を緩和すること、すなわち、状態、障害または病状または少なくとも１つのその臨床的症状または無症候性症状の退行を生じさせること。
治療される対象に対する利益は、統計的に有意である、または少なくとも患者もしくは医師に知覚できることのいずれかである。
用語「防ぐ（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「防止（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」等は、明らかな疾患の開始前に作用して、疾患の発症を防止すること、または疾患の程度を最小限に抑えること、または疾患の発症の過程を遅らせることを指す。
「免疫応答」は、宿主において、目的の組成物またはワクチンに対する細胞および／または抗体媒介免疫応答の発生を指す。このような応答は通常、対象が目的の組成物またはワクチン中に含まれる、特に抗原または複数抗原に向けられた抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞を産生することからなる。
「治療的有効量」または「有効量」は、状態、障害または病状の治療のために動物に投与される場合、このような治療に影響を及ぼすのに十分な化合物または薬剤の量を意味する。「治療的有効量」は、化合物、疾患およびその重症度ならびに、治療される動物の年齢、体重、健康状態および応答性に応じて変化する。
本明細書で開示の組成物は、本明細書で記載される化合物の「治療的有効量」または「予防的有効量」を含み得る。「治療的有効量」は、必要な服用量で、必要な期間に、所望の治療結果を達成するために効果的な量を指す。抗体または抗体部分の治療的有効量は、病態、年齢、性別、および個人の体重、ならびに個人の所望の応答を誘発する抗体または抗体部分の能力などの因子に応じて変わってもよい。治療的有効量は、化合物のなんらかの毒性のまたは有害な作用が、治療上有益な作用によって凌駕される量でもある。「予防的有効量」は、必要な服用量で、所望の予防結果を達成するのに必要な用量および時間で効果的な量を指す。通常、予防的投与は疾患の前に、または初期段階で対象において使用されるので、予防的有効量は、治療的有効量未満であろう。
本開示によって提供される組成物をそのまま治療に使用することは可能であるが、医薬製剤、例えば、意図される投与経路および標準的な医薬慣行に関して選択される適切な医薬賦形剤、希釈剤または担体と混合してそれを投与することが好ましい場合がある。従って、一態様では、本開示は、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤および／または担体と組み合わせて、少なくとも１種の活性組成物、またはその薬学的に許容可能な誘導体その誘導体を含む、医薬組成物または製剤を提供する。賦形剤、希釈剤および／または担体は、製剤の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに対して有害でないという意味で「許容可能」でなくてはならない。
本開示の組成物は、ヒトまたは獣医学での使用に好都合な任意の方式で投与するために処方できる。本発明は従って、ヒトまたは獣医学での使用に適合された本発明の産物を含む医薬組成物をその範囲内に含む。
本明細書で使用される場合、用語「医薬組成物」は、疾患または障害の治療および／または予防の状況で、対象に投与できる組成物を指す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、有効成分、例えば、本発明の融合ポリペプチド、核酸分子、ベクター、薬剤、など、および必要に応じ薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤および／または担体を含む。
治療用途に対して許容可能な賦形剤、希釈剤、および担体は、医薬品技術分野において周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｉｔ．２００５）に記載される。医薬賦形剤、希釈剤、および担体の選択は、意図される投与経路および標準的薬務に関して選択できる。
本明細書で使用される場合、表現「薬学的に許容可能な」は、ヒトに投与される場合、例えば、生理学的に許容でき、アレルギー性または急性胃蠕動、眩暈などの類似の好ましくない反応を通常は生じない、「一般に安全と認められる」分子実体および組成物を指す。好ましくは、本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な」は、哺乳動物、より好ましくは動物、さらに限定すれば、ヒトで使用するために、連邦または州政府の規制当局によって承認される、あるいは米国薬局方または他の一般的に認められる薬局方に収載されていることを意味する。
治療製剤の投与量は、疾患の性質、患者の病歴、投与頻度、投与方式、宿主からの薬剤の排出、などに応じて、広範に変化する。初期の投与量は、より多くてよく、その後、より少ない維持用量が続く。用量は、週１回、隔週で低頻度に投与されてもよく、または有効投与量を維持するために少量に分割し、毎日、半週毎、等で投与されてもよい。場合によっては、経口投与は、静脈内に投与される場合よりも、高用量を必要とするあろう。場合によっては、局所投与は、有効局所投与量を提供するために、数日または数週の間の、必要に応じ、１日数回の適用を含む。
用語「担体」は、本化合物が一緒に投与される希釈剤、補助剤、賦形剤、または溶媒を指す。このような医薬担体は、ピーナッツオイル、大豆油、鉱物油、オリーブ油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、または人工起源のものを含む、水および油などの、無菌の液体であってよい。水または生理食塩水水溶液ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液が、特に注射溶液のために、担体として、好ましくは採用される。あるいは、担体は、限定されないが１種または複数の結合剤（圧縮ピル用）、流動促進剤、カプセル化剤、風味剤、および着色剤を含む、固形剤形担体であり得る。好適な医薬担体は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。
本明細書で使用する場合、用語「薬剤」は、効果を生じる物質または効果を生じることができる物質を意味し、限定されないが、化学薬品、医薬品、生物製剤、小有機分子、抗体、核酸、ペプチドおよびタンパク質を含む。
用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、当業者により定められた特定の値に対する許容可能な誤差範囲内にあることを意味し、これは、その値が測定または決定される方法、すなわち、測定システムの制約、すなわち、医薬製剤などの、特定の目的に必要とされる精度、に一部には依存するであろう。例えば、「約（ａｂｏｕｔ）」は、当該技術分野における慣行に従って、１または１を越える標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約（ａｂｏｕｔ）」は、与えられた値の最大で２０％、好ましくは最大で１０％、より好ましくは最大で５％、およびさらにより好ましくは最大で１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生体系またはプロセスに対して、この用語は、その値の１０倍以内の範囲、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内の範囲を意味し得る。特定の値が本出願および請求項の範囲で記述される場合、別に定める場合を除き、特定の値に対する許容可能な誤差範囲内を意味する用語「約（ａｂｏｕｔ）」が前提とされるべきである。
一般的方法
本開示の実施は、他に指示がない限り、当該技術の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生物化学、および免疫学の従来技術を使用する。このような技術は文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）で十分に説明されている。
本開示は、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を発現している細胞の細胞死を引き起こすことができる系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメントを含む薬剤を提供する。系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を結合する抗原結合フラグメントと、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＴ細胞などの免疫細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドの組み合わせを含む免疫療法は、造血器悪性腫瘍に対する効果的な治療方法を提供するはずである。
本開示は、（ｉ）系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を結合する抗原結合フラグメント、および（ｉｉ）免疫細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドを含む（またはこれらから基本的になる、またはこれらからなる）第１および第３の改変ヘテロダイマータンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、分子は、ＵＬＢＰである。いくつかの実施形態では、分子は、ＣＤ１６である。
本開示は、（ｉ）系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を結合する抗原結合フラグメント、および（ｉｉ）Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドを含む（またはこれらから基本的になる、またはこれらからなる）第２の改変ヘテロダイマータンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、分子は、ＣＤ３である。
本開示は、（ｉ）系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を結合する抗原結合フラグメント、および（ｉｉ）免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）に結合するポリペプチド、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３）上で発現される分子を結合するポリペプチドを含む（またはこれらから基本的になる、またはこれらからなる）改変ヘテロダイマータンパク質をさらに提供する。図２、９および１０を参照されたい。
本組成物および方法は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞などの、ＮＫＧ２Ｄ含有免疫エフェクター細胞の活性化を助け得る。本組成物および方法は、細胞傷害性（例えば、腫瘍細胞などの疾患細胞の細胞死をもたらす）を誘導し得る、疾患細胞（腫瘍細胞など）に対する細胞性免疫応答を高めるまたは促し得る。本組成物および方法は、限定されないが、次の１種または複数を含む、対象の免疫応答を高め得る：ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の発現上昇；Ｔ細胞（例えば、γδＴ細胞）機能の上方制御；ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞機能の上方制御；およびＢ細胞機能の上方制御）。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、およびＢ細胞機能の１種または複数の上方制御は、癌進行を抑制または低減できる活性の強化および／または授与を含む。
いくつかの実施形態では、癌進行の抑制は、例えば、腫瘍細胞アポトーシスの直接誘導、固有の宿主抗腫瘍応答の刺激による腫瘍細胞溶解、固有の宿主抗腫瘍応答の刺激による腫瘍細胞アポトーシスの誘導、腫瘍細胞転移の抑制、腫瘍細胞増殖の抑制、および腫瘍細胞の老化の誘導による、腫瘍細胞溶解により達成され得る。
本開示はまた、本発明の改変タンパク質、薬剤または組成物をコードする１種または複数の核酸（ポリヌクレオチド）分子も提供する。
本開示の他の態様は、本明細書で提供される核酸（またはポリヌクレオチド）分子のいずれかを含むベクターを提供する。また、本開示の範囲内にあるのは、本明細書で記載の核酸によりコードされるポリヌクレオチドおよびこのようなポリヌクレオチドを発現している細胞である。
いくつかの実施形態では、細胞は、造血器悪性腫瘍を有する患者から得ることができる。いくつかの実施形態では、細胞は、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋）などの、造血細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、例えば、本明細書で提供される改変タンパク質の組換え発現および精製のために、提供される。細胞は、組換えタンパク質発現に好適な任意の細胞、例えば、改変タンパク質（例えば、本明細書で記載の１種または複数のベクターで形質転換されたまたはそれを遺伝子導入された細胞、またはゲノム改変、例えば、本明細書で提供されるタンパク質を発現するもの、を有する細胞）を発現しているまたは発現できる遺伝子構築物またはベクターを含む細胞を含む。細胞を形質転換する、細胞を遺伝的に改変する、および遺伝子およびこのような細胞中でタンパク質を発現させるための方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２０１２））およびＦｒｉｅｄｍａｎ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ：Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ＲＮＡ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１ｓｔ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（２００６）によって提供される方法を含む。
さらに、本開示は、本発明の薬剤、ポリペプチド、核酸（またはポリヌクレオチド）分子、ベクター、細胞、および／または組成物を含む医薬組成物を提供する。
本開示はまた、造血器悪性腫瘍を治療する方法も提供する。方法は、いずれかの開示される改変タンパク質または改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドの有効量を、それを必要としている対象に投与することを含み得る。方法は、本発明の薬剤もしくは組成物、または薬剤（例えば、ポリペプチドの組み合わせ）をコードするポリヌクレオチドまたは組成物の有効量を、それを必要としている対象に投与することを含み得る。
本開示の別の態様は、造血器悪性腫瘍（または血液学的新生物）を治療するための方法を提供し、方法は、いずれかの開示される改変タンパク質または改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドの有効量を、それを必要としている対象に投与することを含む。方法は、本発明の薬剤もしくは組成物、または薬剤（例えば、ポリペプチドの組み合わせ）をコードするポリヌクレオチドまたは組成物の有効量を、それを必要としている対象に投与することを含み得る。
本開示はまた、骨髄性悪性腫瘍などの造血器悪性腫瘍を治療するために改変タンパク質を使用する方法にも関する。
また、本開示の範囲内に入るのは、本発明の薬剤、ポリペプチド、核酸（またはポリヌクレオチド）分子、ベクター、細胞、および／または組成物を含むキットである。
改変ヘテロタンパク質
本開示は、改変ヘテロタンパク質を提供する。
一実施形態では、本開示は、（ｉ）系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を結合する抗原結合フラグメント、および（ｉｉ）免疫細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドを含む（またはこれらから基本的になる、またはこれらからなる）第１および第３の改変ヘテロダイマータンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。いくつかの実施形態では、分子は、ＵＬＢＰである。いくつかの実施形態では、分子は、ＣＤ１６である。
さらなる実施形態では、本開示は、（ｉ）系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を結合する抗原結合フラグメント、および（ｉｉ）Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドを含む（またはこれらから基本的になる、またはこれらからなる）第２の改変ヘテロダイマータンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、分子は、ＣＤ３である。
またさらなる実施形態では、本開示は、（ｉ）系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を結合する抗原結合フラグメント、および（ｉｉ）免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）に結合するポリペプチド、および（ｉｉｉ）Ｔ細胞（例えば、ＣＤ３）上で発現される分子を結合するポリペプチドを含む（またはこれらから基本的になる、またはこれらからなる）改変ヘテロダイマータンパク質を提供する。
いくつかの実施形態では、第３のポリペプチドは、ケモカインまたはサイトカインタンパク質であり、これは、免疫応答を高める。ケモカインまたはサイトカインタンパク質は、ＣＸＣＬ１４、ＧＣＳＦを含むＣＸＣＬ、ならびにＩＬ２およびＩＬ１６を含むインターロイキンを含むがこれらに限定されない。
いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、２型系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）である系統特異的細胞表面抗原を結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、１型系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ１９）である系統特異的細胞表面抗原を結合する。いくつかの実施形態では、抗原結合フラグメントは、癌および／または腫瘍細胞により発現されるまたは過剰発現される抗原を結合する。
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｒａｅｔ１ａ、Ｒａｅｔ１ｂ、Ｒａｅｔ１ｃ、Ｒａｅｔ１ｄ、Ｒａｅｔ１ｅ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃ、またはＨＣＭＶ ＵＬ１８、それらの同族体、それらの変異体、またはそれらのフラグメントであり得る。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｒａｅｔ１ａ、Ｒａｅｔ１ｂ、Ｒａｅｔ１ｃ、Ｒａｅｔ１ｄ、Ｒａｅｔ１ｅ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃ、ＨＣＭＶ ＵＬ１８、それらの同族体、それらの変異体、またはそれらのフラグメントの外部ドメインであり得る。
特定の実施形態では、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｒａｅｔ１ａ、Ｒａｅｔ１ｂ、Ｒａｅｔ１ｃ、Ｒａｅｔ１ｄ、Ｒａｅｔ１ｅ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃ、またはＨＣＭＶ ＵＬ１８のフラグメントは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｒａｅｔ１ａ、Ｒａｅｔ１ｂ、Ｒａｅｔ１ｃ、Ｒａｅｔ１ｄ、Ｒａｅｔ１ｅ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃ、またはＨＣＭＶ ＵＬ１８の外部ドメインを含む。特定の実施形態では、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｒａｅｔ１ａ、Ｒａｅｔ１ｂ、Ｒａｅｔ１ｃ、Ｒａｅｔ１ｄ、Ｒａｅｔ１ｅ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃ、またはＨＣＭＶ ＵＬ１８のフラグメントは、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｒａｅｔ１ａ、Ｒａｅｔ１ｂ、Ｒａｅｔ１ｃ、Ｒａｅｔ１ｄ、Ｒａｅｔ１ｅ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃ、ＨＣＭＶ ＵＬ１８、それらの同族体、それらの変異体、またはそのフラグメントの外部ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、ＮＫ細胞の細胞表面マーカーの抗体である。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ１６である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
特定の実施形態では、Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、Ｔ細胞の細胞表面マーカーの抗体である。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、ＣＤ３である。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
特定の実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、本明細書で記載の（ｉ）系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよび第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；および（ｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチドを含む。図１および１０Ｂを参照されたい。
特定の実施形態では、抗原結合フラグメントは、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ（ｂｉ－ｓｃＦｖ）、三価ｓｃＦｖ（ｔｒｉ－ｓｃＦｖ）、Ｆｄ、ｄＡｂフラグメント、単離ＣＤＲ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域（ＶＨ）、および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
いくつかの実施形態では、１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインは、６ＤＭＰａである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１９）。いくつかの実施形態では、１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインは、６ＤＭＰｂである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１９）。
いくつかの実施形態では、共有結合ダイマー化ドメインは、ＩｇＧ２ヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、共有結合ダイマー化ドメインは、ＩｇＧ２ドメインおよびＩｇＧ２ Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインである。
第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、機能的部分（系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、およびＮＫ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド）を任意の順序で配置するように設計できる。特定の実施形態では、系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメントは、融合ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に配置される。特定の実施形態では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、融合ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に配置される。
いくつかの実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合するｓｃＦｖ、およびＵＬＢＰ１（またはＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、またはＭＩＣＢ）の外部ドメインを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＵＬＢＰ１（またはＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、またはＭＩＣＢ）の外部ドメイン、および系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合するｓｃＦｖを含む。
第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、シグナル配列、および／または１種または複数のリンカーをさらに含み得る。融合ポリペプチドでは、これらの機能的部分は、連続的にまたは非連続的に（例えば、それらは、リンカーにより分離され得る）共有結合で連結され得る。リンカーは、最大で５０、最大で４０、最大で３０、最大で２０、最大で１８、最大で１５、最大で１２、最大で１１、または最大で１０のアミノ酸残基長を有し得る。特定の実施形態では、リンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０～２０、８～１０、８～１２、８～１５、８～２０、または８～３０のアミノ酸残基長を有する。特定の実施形態では、リンカーは、約７～１０、７～１２、７～１５、７～２０、または７～３０のアミノ酸残基長を有する。
１つのタイプの誘導体化タンパク質は、２個以上のポリペプチド（の同じタイプまたは異なるタイプ）を架橋させることにより生成される。好適な架橋剤は、適切なスペーサーで分離された２つの別個の反応性基を有する、ヘテロ二官能性のもの（例えば、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二官能性のもの（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）を含む。それによりタンパク質が誘導体化され得る（または標識され得る）有用な検出可能薬剤としては、蛍光剤、種々の酵素、補欠分子団、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。非限定的な、蛍光検出可能薬剤の例は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、およびフィコエリトリンを含む。ポリペプチドはまた、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素で誘導体化できる。ポリペプチドはまた、補欠分子団（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン）で誘導体化できる。
第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、誘導体化され得るまたは別の機能的分子に連結され得る。例えば、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、抗体または抗体フラグメント、検出可能薬剤、免疫抑制剤、細胞傷害薬、医薬品、別の分子（ストレプトアビジンコア部またはポリヒスチジンタグなど）との結合を媒介できるタンパク質またはペプチド、アミノ酸リンカー、シグナル配列、免疫原性担体、またはグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌プロテインＡ などのタンパク質精製に有用なリガンドなどの１種または複数の他の分子実体に機能的に連結できる（化学的結合、遺伝子融合、非共有結合相互作用により）。細胞傷害薬は、放射性同位元素、化学療法剤、酵素的に活性な細菌、真菌、植物、または動物起源毒素、およびそれらのフラグメントなどの毒素を含んでよいる。
第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、限定されないが、ポリヒスチジン（例えば、６ヒスチジン残基）、マルトース結合タンパク質、ＧＳＴ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤血球凝集素、またはアルカリフォスファターゼ、分泌シグナルペプチド（例えば、プレプロトリプシン（ｐｒｅｐｒｏｔｒｙｐｓｉｎ）シグナル配列）、Ｍｙｃ、および／またはＦＬＡＧを含む、ポリペプチド産生および／または検出に有用なフラグメント（例えば、タグ）をさらに含み得る。
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１（図３）および配列番号２（図４）または配列番号４（図６）および配列番号５（図７）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）。
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＩＬ２分泌性シグナル配列：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）（図３、４、６および８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）シグナル配列を含む。
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、Ｍｙｃ：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号８）（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数のタグを含む。
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＦＬＡＧ：ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１４）（図４および７）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数のタグを含む。
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、米国特許出願公開第２０１３００７８２４１号で開示される抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖと、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖを含む。
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含み、抗原結合フラグメントは、配列番号９（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）軽鎖可変領域（ＶＬ）含む。
抗ＣＤ３３軽鎖可変領域（ＶＬ）（配列番号９）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含み、抗原結合フラグメントは、配列番号１０（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）重鎖可変領域（ＶＨ）含む。
抗ＣＤ３３重鎖可変領域（ＶＨ）（配列番号１０）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＳＳＳＡ
特定の実施形態では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、野生型ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、またはＨＣＭＶ ＵＬ１８（ヒトＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、またはＨＣＭＶ ＵＬ１８を含む）の完全長もしくはフラグメント、またはＲａｅｔ１ａ、Ｒａｅｔ１ｂ、Ｒａｅｔ１ｃ、Ｒａｅｔ１ｄ、Ｒａｅｔ１ｅ、Ｈ６０ｂ、Ｈ６０ｃのヒト同族体の完全長もしくはフラグメントのアミノ酸配列と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）。
一実施形態では、ヒトＵＬＢＰ１は、ユニプロット受入番号Ｑ９ＢＺＭ６を有する。一実施形態では、外部ドメインヒトＵＬＢＰ１は、Ｑ９ＢＺＭ６－１のアミノ酸残基２７～２１６を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）。
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１５（図４および７）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）ＵＬＢＰ１外部ドメインを含む。
ＵＬＢＰ１外部ドメイン（Ｑ９ＢＺＭ６－１の２７～２１６ａａ）（配列番号１５）：
ＷＶＤＴＨＣＬＣＹＤＦＩＩＴＰＫＳＲＰＥＰＱＷＣＥＶＱＧＬＶＤＥＲＰＦＬＨＹＤＣＶＮＨＫＡＫＡＦＡＳＬＧＫＫＶＮＶＴＫＴＷＥＥＱＴＥＴＬＲＤＶＶＤＦＬＫＧＱＬＬＤＩＱＶＥＮＬＩＰＩＥＰＬＴＬＱＡＲＭＳＣＥＨＥＡＨＧＨＧＲＧＳＷＱＦＬＦＮＧＱＫＦＬＬＦＤＳＮＮＲＫＷＴＡＬＨＰＧＡＫＫＭＴＥＫＷＥＫＮＲＤＶＴＭＦＦＱＫＩＳＬＧＤＣＫＭＷＬＥＥＦＬＭＹＷＥＱＭＬＤＰＴＫＰＰＳＬＡＰＧ
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１２（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１～５個のαヘリックスを含む１種または複数の非天然起源ポリペプチドドメインを含む。
６ＤＭＰａ（配列番号１２）：
ＧＴＫＥＤＩＬＥＲＱＲＫＩＩＥＲＡＱＥＩＨＲＲＱＱＥＩＬＥＥＬＥＲＩＩＲＫＰＧＳＳＥＥＡＭＫＲＭＬＫＬＬＥＥＳＬＲＬＬＫＥＬＬＥＬＳＥＥＳＡＱＬＬＹＥＱＲ
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１６（図４および７）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１～５個のαヘリックスを含む１種または複数の非天然起源ポリペプチドドメインを含む。
６ＤＭＰｂ（配列番号１６）：
ＴＥＫＲＬＬＥＥＡＥＲＡＨＲＥＱＫＥＩＩＫＫＡＱＥＬＨＲＲＬＥＥＩＶＲＱＳＧＳＳＥＥＡＫＫＥＡＫＫＩＬＥＥＩＲＥＬＳＫＲＳＬＥＬＬＲＥＩＬＹＬＳＱＥＱＫＧＳＬＶＰＲ
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジ：ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１３）（図３、４、６、および７）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数の共有結合ダイマー化ＩｇＧ２ヒンジドメインを含む。
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１９（図６および７）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数の共有結合ダイマー化ＩｇＧ２ Ｆｃメインを含む。
ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン（配列番号１９）：
ＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１１：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（図３、４、６、および７）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数のリンカーを含む。
さらなる実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、Ｈｉｓ６タグ（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号２０）を含む。
特定の実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、本明細書で記載の（ｉ）系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよび第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；および（ｉｉ）Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチドを含む。
特定の実施形態では、抗原結合フラグメントは、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ（ｂｉ－ｓｃＦｖ）、三価ｓｃＦｖ（ｔｒｉ－ｓｃＦｖ）、Ｆｄ、ｄＡｂフラグメント、単離ＣＤＲ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域（ＶＨ）、および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
いくつかの実施形態では、１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインは、６ＤＭＰａである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１９）。いくつかの実施形態では、１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインは、６ＤＭＰｂである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１９）。
いくつかの実施形態では、共有結合ダイマー化ドメインは、ＩｇＧ２ヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、共有結合ダイマー化ドメインは、ＩｇＧ２ドメインおよびＩｇＧ２ Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインである。
第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、任意の順序で機能的部分（系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、およびＴ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド）を配置するように設計できる。特定の実施形態では、系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメントは、融合ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に配置される。特定の実施形態では、Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、融合ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に配置される。
いくつかの実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合するｓｃＦｖ、およびＴ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド（例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体）を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド（例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体）、および系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合するｓｃＦｖを含む。
第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、シグナル配列、および／または１種または複数のリンカーをさらに含み得る。第２の改変ヘテロダイマーでは、これらの機能的部分は、連続的にまたは非連続的に（例えば、それらは、リンカーにより分離され得る）共有結合で連結され得る。リンカーは、最大で５０、最大で４０、最大で３０、最大で２０、最大で１８、最大で１５、最大で１２、最大で１１、または最大で１０のアミノ酸残基長を有し得る。特定の実施形態では、リンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０～２０、８～１０、８～１２、８～１５、８～２０、または８～３０のアミノ酸残基長を有する。特定の実施形態では、リンカーは、約７～１０、７～１２、７～１５、７～２０、または７～３０のアミノ酸残基長を有する。
１つのタイプの誘導体化タンパク質は、２個以上のポリペプチド（の同じタイプまたは異なるタイプ）を架橋させることにより生成される。好適な架橋剤は、適切なスペーサーで分離された２つの別個の反応性基を有する、ヘテロ二官能性のもの（例えば、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二官能性のもの（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）を含む。それによりタンパク質が誘導体化され得る（または標識され得る）有用な検出可能薬剤としては、蛍光剤、種々の酵素、補欠分子団、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。非限定的な、蛍光検出可能薬剤の例は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、およびフィコエリトリンを含む。ポリペプチドはまた、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素で誘導体化できる。ポリペプチドはまた、補欠分子団（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン）で誘導体化できる。
第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、誘導体化され得るまたは別の機能的分子に連結され得る。例えば、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、抗体または抗体フラグメント、検出可能薬剤、免疫抑制剤、細胞傷害薬、医薬品、別の分子（ストレプトアビジンコア部またはポリヒスチジンタグなど）との結合を媒介できるタンパク質またはペプチド、アミノ酸リンカー、シグナル配列、免疫原性担体、またはグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌プロテインＡなどのタンパク質精製に有用なリガンドなどの１種または複数の他の分子実体に機能的に連結できる（化学的結合、遺伝子融合、非共有結合相互作用、などにより）。細胞傷害薬は、放射性同位元素、化学療法剤、酵素的に活性な細菌、真菌、植物、または動物起源毒素、およびそれらのフラグメントなどの毒素を含む。
第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、限定されないが、ポリヒスチジン（例えば、６ヒスチジン残基）、マルトース結合タンパク質、ＧＳＴ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤血球凝集素、またはアルカリフォスファターゼ、分泌シグナルペプチド（例えば、プレプロトリプシン（ｐｒｅｐｒｏｔｒｙｐｓｉｎ）シグナル配列）、Ｍｙｃ、および／またはＦＬＡＧを含む、ポリペプチド産生および／または検出に有用なフラグメント（例えば、タグ）をさらに含み得る。
一実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１（図３）および配列番号３（図５）または配列番号４（図６）および配列番号６（図８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）。
一実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＩＬ２分泌性シグナル配列：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）（図３、５、６および８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）シグナル配列を含む。
一実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、Ｍｙｃ：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号８）（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数のタグを含む。
一実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＦＬＡＧ：ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１４）（図５および８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数のタグを含む。
一実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、米国特許出願公開第２０１３００７８２４１号で開示される抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖと、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖを含む。
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＣＤ３３に結合する抗原結合フラグメントを含み、抗原結合フラグメントは、配列番号９（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
抗ＣＤ３３軽鎖可変領域（ＶＬ）（配列番号９）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ
一実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含み、抗原結合フラグメントは、配列番号１０（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
抗ＣＤ３３重鎖可変領域（ＶＨ）（配列番号１０）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＳＳＳＡ
特定の実施形態では、Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、配列番号１７および１８のアミノ酸配列と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）。
一実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＣＤ３を結合する抗原結合フラグメントを含み、抗原結合フラグメントは、配列番号１７（図５および８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
抗ＣＤ３重鎖可変領域（ＶＨ）（配列番号１７）：
ＤＩＫＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳ
一実施形態では、第１の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＣＤ３を結合する抗原結合フラグメントを含み、抗原結合フラグメントは、配列番号１８（図５および８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
抗ＣＤ３軽鎖可変領域（ＶＨ）（配列番号１８）：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＧＫＶＴＭＴＣＲＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＶＡＳＧＶＰＹＲＦＴＳＹＳＬＴＩＳＳＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ
一実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１２（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１～５個のαヘリックスを含む１種または複数の非天然起源ポリペプチドドメインを含む。
６ＤＭＰａ（配列番号１２）：
ＧＴＫＥＤＩＬＥＲＱＲＫＩＩＥＲＡＱＥＩＨＲＲＱＱＥＩＬＥＥＬＥＲＩＩＲＫＰＧＳＳＥＥＡＭＫＲＭＬＫＬＬＥＥＳＬＲＬＬＫＥＬＬＥＬＳＥＥＳＡＱＬＬＹＥＱＲ
一実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１６（図５および８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１～５個のαヘリックスを含む１種または複数の非天然起源ポリペプチドドメインを含む。
６ＤＭＰｂ（配列番号１６）：
ＴＥＫＲＬＬＥＥＡＥＲＡＨＲＥＱＫＥＩＩＫＫＡＱＥＬＨＲＲＬＥＥＩＶＲＱＳＧＳＳＥＥＡＫＫＥＡＫＫＩＬＥＥＩＲＥＬＳＫＲＳＬＥＬＬＲＥＩＬＹＬＳＱＥＱＫＧＳＬＶＰＲ
一実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジ：ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１３）（図３、５、６、および８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数の共有結合ダイマー化ＩｇＧ２ヒンジドメインを含む。
一実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１９（図６および８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数の共有結合ダイマー化ＩｇＧ２ Ｆｃドメインを含む。
ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン（配列番号１９）：
ＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
一実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１１：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（図３～８）または配列番号２１：ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ（図５および８、ＣＤ３ ＶＨ－ＶＬリンカー）または配列番号２２：ＳＧＳＧＳＧ（図５および８、ＣＤ３－ＶＬ内のリンカー）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数のリンカーを含む。
さらなる実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、Ｈｉｓ６タグ（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号２０）を含む。
特定の実施形態では、本開示は、本明細書で記載の、（ｉ）系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよび第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；および（ｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子に結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチドを含む、第３の改変ヘテロダイマータンパク質を提供する。図２３を参照されたい。
特定の実施形態では、抗原結合フラグメントは、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ（ｂｉ－ｓｃＦｖ）、三価ｓｃＦｖ（ｔｒｉ－ｓｃＦｖ）、Ｆｄ、ｄＡｂフラグメント、単離ＣＤＲ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域（ＶＨ）、および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
いくつかの実施形態では、１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインは、６ＤＭＰａである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１９）。いくつかの実施形態では、１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインは、６ＤＭＰｂである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１９）。
いくつかの実施形態では、共有結合ダイマー化ドメインは、ＩｇＧ２ヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、共有結合ダイマー化ドメインは、ＩｇＧ２ドメインおよびＩｇＧ２ Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインである。
第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、任意の順序で機能的部分（系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、およびＮＫ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド）を配置するように設計できる。特定の実施形態では、系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメントは、融合ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に配置される。特定の実施形態では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、融合ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に配置される。
いくつかの実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合するｓｃＦｖ、およびＮＫ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド（例えば、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体）を含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＮＫ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド（例えば、抗ＣＤ１６モノクローナル抗体）、および系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合するｓｃＦｖを含む。
第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、シグナル配列、および／または１種または複数のリンカーをさらに含み得る。融合ポリペプチドでは、これらの機能的部分は、連続的にまたは非連続的に（例えば、それらは、リンカーにより分離され得る）共有結合で連結され得る。リンカーは、最大で５０、最大で４０、最大で３０、最大で２０、最大で１８、最大で１５、最大で１２、最大で１１、または最大で１０のアミノ酸残基長を有し得る。特定の実施形態では、リンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０～２０、８～１０、８～１２、８～１５、８～２０、または８～３０のアミノ酸残基長を有する。特定の実施形態では、リンカーは、約７～１０、７～１２、７～１５、７～２０、または７～３０のアミノ酸残基長を有する。
１つのタイプの誘導体化タンパク質は、２個以上のポリペプチド（同じタイプのまたは異なるタイプの）を架橋させることにより生成される。好適な架橋剤は、適切なスペーサーで分離された２つの別個の反応性基を有する、ヘテロ二官能性のもの（例えば、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二官能性のもの（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）を含む。それによりタンパク質が誘導体化され得る（または標識され得る）有用な検出可能薬剤としては、蛍光剤、種々の酵素、補欠分子団、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。非限定的な、蛍光検出可能薬剤の例は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、およびフィコエリトリンを含む。ポリペプチドはまた、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出可能な酵素で誘導体化できる。ポリペプチドはまた、補欠分子団（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン）で誘導体化できる。
第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、誘導体化され得または別の機能的分子に連結され得る。例えば、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、抗体または抗体フラグメント、検出可能薬剤、免疫抑制剤、細胞傷害薬、医薬品、別の分子（ストレプトアビジンコア部またはポリヒスチジンタグなど）との結合を媒介できるタンパク質またはペプチド、アミノ酸リンカー、シグナル配列、免疫原性担体、またはグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌プロテインＡなどのタンパク質精製に有用なリガンドなどの１種または複数の他の分子実体に機能的に連結され得る（化学的結合、遺伝子融合、非共有結合相互作用により）。細胞傷害薬は、放射性同位元素、化学療法剤、酵素的に活性な細菌、真菌、植物、または動物起源毒素、およびそれらのフラグメントなどの毒素を含んでよい。
第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、限定されないが、ポリヒスチジン（例えば、６ヒスチジン残基）、マルトース結合タンパク質、ＧＳＴ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤血球凝集素、またはアルカリフォスファターゼ、分泌シグナルペプチド（例えば、プレプロトリプシン（ｐｒｅｐｒｏｔｒｙｐｓｉｎ）シグナル配列）、Ｍｙｃ、および／またはＦＬＡＧを含む、ポリペプチド産生および／または検出に有用なフラグメント（例えば、タグ）をさらに含み得る。
一実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１（図３）および配列番号２６（図２３Ａ）または配列番号４（図６）および配列番号２７（図２３Ｂ）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）。
一実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＩＬ２分泌性シグナル配列：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）（図３、４、および２３）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）シグナル配列を含む。
一実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、Ｍｙｃ：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号８）（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数のタグを含む。
一実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＦＬＡＧ：ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１４）（図２３）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数のタグを含む。
一実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、米国特許出願公開第２０１３００７８２４１号で開示される抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖと、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖを含む。
一実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含み、抗原結合フラグメントは、配列番号９（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
抗ＣＤ３３軽鎖可変領域（ＶＬ）（配列番号９）：
ＥＩＶＬＴＱＳＰＧＳＬＡＶＳＰＧＥＲＶＴＭＳＣＫＳＳＱＳＶＦＦＳＳＳＱＫＮＹＬＡＷＹＱＱＩＰＧＱＳＰＲＬＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＰＥＤＬＡＩＹＹＣＨＱＹＬＳＳＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ
一実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含み、抗原結合フラグメントは、配列番号１０（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
抗ＣＤ３３重鎖可変領域（ＶＨ）（配列番号１０）：
ＱＶＱＬＱＱＰＧＡＥＶＶＫＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＹＩＨＷＩＫＱＴＰＧＱＧＬＥＷＶＧＶＩＹＰＧＮＤＤＩＳＹＮＱＫＦＱＧＫＡＴＬＴＡＤＫＳＳＴＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＥＶＲＬＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＳＳＳＡ
特定の実施形態では、ＮＫ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、配列番号２８および２９のアミノ酸配列と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）。
一実施形態では、第２の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＣＤ１６を結合する抗原結合フラグメントを含み、抗原結合フラグメントは、配列番号２８（図２３）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
抗ＣＤ１６重鎖可変領域（ＶＨ）（配列番号２８）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＲＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＤＤＹＧＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＧＩＮＷＮＧＧＳＴＧＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＳＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＲＳＬＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＲ
一実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＣＤ１６を結合する抗原結合フラグメントを含み、抗原結合フラグメントは、配列番号２９（図２３）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
抗ＣＤ１６軽鎖可変領域（ＶＨ）（配列番号２９）：
ＳＳＥＬＴＱＤＰＡＶＳＶＡＬＧＱＴＶＲＩＴＣＱＧＤＳＬＲＳＹＹＡＳＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＧＫＮＮＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＳＳＧＮＴＡＳＬＴＩＴＧＡＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＮＳＲＤＳＳＧＮＨＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＧ
一実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１２（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１～５個のαヘリックスを含む１種または複数の非天然起源ポリペプチドドメインを含む。
６ＤＭＰａ（配列番号１２）：
ＧＴＫＥＤＩＬＥＲＱＲＫＩＩＥＲＡＱＥＩＨＲＲＱＱＥＩＬＥＥＬＥＲＩＩＲＫＰＧＳＳＥＥＡＭＫＲＭＬＫＬＬＥＥＳＬＲＬＬＫＥＬＬＥＬＳＥＥＳＡＱＬＬＹＥＱＲ
一実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１６（図２３）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１～５個のαヘリックスを含む１種または複数の非天然起源ポリペプチドドメインを含む。
６ＤＭＰｂ（配列番号１６）：
ＴＥＫＲＬＬＥＥＡＥＲＡＨＲＥＱＫＥＩＩＫＫＡＱＥＬＨＲＲＬＥＥＩＶＲＱＳＧＳＳＥＥＡＫＫＥＡＫＫＩＬＥＥＩＲＥＬＳＫＲＳＬＥＬＬＲＥＩＬＹＬＳＱＥＱＫＧＳＬＶＰＲ
一実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジ：ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１３）（図３および２３）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数の共有結合ダイマー化ＩｇＧ２ヒンジドメインを含む。
一実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１９（図６および２３）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数の共有結合ダイマー化ＩｇＧ２ Ｆｃメインを含む。
ＩｇＧ２ Ｆｃドメイン（配列番号１９）：
ＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
一実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、配列番号１１：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（図３、６、および２３）または配列番号３０：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（図２３、ＣＤ１６ ＶＨ－ＶＬリンカー）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数のリンカーを含む。
さらなる実施形態では、第３の改変ヘテロダイマータンパク質は、Ｈｉｓ６タグ（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号２０）を含む。
特定の実施形態では、改変ヘテロダイマータンパク質は、本明細書で記載の、（ｉ）Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン（ａ１）、および第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；（ｉｉ）系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン（ｂ１）および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチド；（ｉｉｉ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン（ｃ１）、および第３の共有結合ダイマー化ドメインを含む第３のポリペプチド；および（ｉｖ）アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む３個の非天然起源ポリペプチドドメインを含む第４のポリペプチドを含み、各ドメインは、ａ１、ｂ１およびｃ１（ａ２、ｂ２およびｃ２）の結合ドメイン、および第４、第５および第６の共有結合ダイマー化ドメインである。
特定の実施形態では、抗原結合フラグメントは、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ（ｂｉ－ｓｃＦｖ）、三価ｓｃＦｖ（ｔｒｉ－ｓｃＦｖ）、Ｆｄ、ｄＡｂフラグメント、単離ＣＤＲ、ディアボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、重鎖可変領域（ＶＨ）、および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
いくつかの実施形態では、１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインは、６ＤＭＰａである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１９）。いくつかの実施形態では、１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインは、６ＤＭＰｂである（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．２０１９）。
いくつかの実施形態では、共有結合ダイマー化ドメインは、ＩｇＧ２ヒンジドメインである。いくつかの実施形態では、共有結合ダイマー化ドメインは、ＩｇＧ２ドメインおよびＩｇＧ２ Ｆｃドメインである。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインである。
改変ヘテロダイマータンパク質は、任意の順序で機能的部分（系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、およびＮＫ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、およびＴ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド）を配置するように設計できる。特定の実施形態では、Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、融合ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に配置される。特定の実施形態では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、融合ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端に配置される。
いくつかの実施形態では、改変ヘテロダイマータンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へ、Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合するｓｃＦｖ、およびＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、またはＭＩＣＢの外部ドメインまたはＣＤ１６を結合するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端へ、ＵＬＢＰ１（またはＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、またはＭＩＣＢ）の外部ドメイン、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３またはＣＤ１９）に結合するｓｃＦｖおよびＴ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドを含む。
改変ヘテロダイマータンパク質は、シグナル配列、および／または１種または複数のリンカーをさらに含み得る。融合ポリペプチドでは、これらの機能的部分は、連続的にまたは非連続的に（例えば、それらは、リンカー（例えば、リンカーアミノ酸残基）により分離され得る）共有結合で連結され得る。リンカーは、最大で５０、最大で４０、最大で３０、最大で２０、最大で１８、最大で１５、最大で１２、最大で１１、または最大で１０のアミノ酸残基長を有し得る。特定の実施形態では、リンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０～２０、８～１０、８～１２、８～１５、８～２０、または８～３０のアミノ酸残基長を有する。特定の実施形態では、リンカーは、約７～１０、７～１２、７～１５、７～２０、または７～３０のアミノ酸残基長を有する。
１つのタイプの誘導体化タンパク質は、２個以上のポリペプチド（同じタイプのまたは異なるタイプの）を架橋させることにより生成される。好適な架橋剤は、適切なスペーサーで分離された２つの別個の反応性基を有する、ヘテロ二官能性のもの（例えば、ｍ－マレイミドベンゾイル－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル）またはホモ二官能性のもの（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）を含む。それによりタンパク質が誘導体化され得る（または標識され得る）有用な検出可能薬剤としては、蛍光剤、種々の酵素、補欠分子団、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。非限定的な、蛍光検出可能薬剤の例は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、およびフィコエリトリンを含む。ポリペプチドはまた、アルカリフォスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼなどの、検出可能な酵素で誘導体化できる。ポリペプチドはまた、補欠分子団（例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチン）で誘導体化できる。
改変ヘテロトリマータンパク質は、誘導体化または別の機能的分子に連結できる。例えば、ヘテロトリマータンパク質は、抗体または抗体フラグメント、検出可能薬剤、免疫抑制剤、細胞傷害薬、医薬品、別の分子（ストレプトアビジンコア部またはポリヒスチジンタグなど）との結合を媒介できるタンパク質またはペプチド、アミノ酸リンカー、シグナル配列、免疫原性担体、またはグルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ、ヒスチジンタグ、およびブドウ球菌プロテインＡなどのタンパク質精製に有用なリガンドなどの、１種または複数の他の分子実体に機能的に連結できる（化学的結合、遺伝子融合、非共有結合相互作用、などにより）。細胞傷害薬は、放射性同位元素、化学療法剤、酵素的に活性な細菌、真菌、植物、または動物起源毒素、およびそれらのフラグメントなどの毒素を含んでよい。
改変ヘテロトリマータンパク質は、限定されないが、ポリヒスチジン（例えば、６ヒスチジン残基）、マルトース結合タンパク質、ＧＳＴ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤血球凝集素、またはアルカリフォスファターゼ、分泌シグナルペプチド（例えば、プレプロトリプシン（ｐｒｅｐｒｏｔｒｙｐｓｉｎ）シグナル配列）、Ｍｙｃ、および／またはＦＬＡＧを含む、ポリペプチド産生および／または検出に有用なフラグメント（例えば、タグ）をさらに含み得る。
一実施形態では、改変ヘテロトリマータンパク質は、ＩＬ２分泌性シグナル配列：ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＳＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号７）（図３～８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数のシグナル配列を含む。
一実施形態では、改変ヘテロトリマータンパク質は、Ｍｙｃ：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号８）（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数のタグを含む。
一実施形態では、改変ヘテロトリマータンパク質は、ＦＬＡＧ：ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１４）（図４、５、７および８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数のタグを含む。
一実施形態では、改変ヘテロトリマータンパク質は、配列番号１５（図４および７）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）ＵＬＢＰ１外部ドメインを含む。
一実施形態では、改変ヘテロトリマータンパク質は、米国特許出願公開第２０１３００７８２４１号で開示される抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖと、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）抗ＣＤ３３ ｓｃＦｖを含む。
特定の実施形態では、ＮＫ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、配列番号２８および２９（図２３）のアミノ酸配列と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）。
一実施形態では、改変ヘテロトリマータンパク質は、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含み、抗原結合フラグメントは、配列番号９（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一実施形態では、改変ヘテロトリマータンパク質は、ＣＤ３３を結合する抗原結合フラグメントを含み、抗原結合フラグメントは、配列番号１０（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
特定の実施形態では、Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、配列番号１７および１８（図５および８）のアミノ酸配列と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）。
一実施形態では、改変ヘテロトリマータンパク質は、配列番号１２（図３および６）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１～５個のαヘリックスを含む１種または複数の非天然起源ポリペプチドドメインを含む。
一実施形態では、改変ヘテロトリマータンパク質は、配列番号１６（図５および８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１～５個のαヘリックスを含む１種または複数の非天然起源ポリペプチドドメインを含む。
一実施形態では、改変ヘテロトリマータンパク質は、ＩｇＧ２ヒンジ：ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１３）（図３～８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数の共有結合ダイマー化ＩｇＧ２ヒンジドメインを含む。
一実施形態では、改変ヘテロトリマータンパク質は、配列番号１９（図６～８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数の共有結合ダイマー化ＩｇＧ２ Ｆｃメインを含む。
一実施形態では、改変ヘテロトリマータンパク質は、配列番号１１：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（図３、５、６、および８）または配列番号２１：ＧＧＧＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧまたは配列番号２２：ＳＧＳＧＳＧ（図５および８）と、少なくともまたは約５０％、少なくとも約５５％、少なくともまたは約６０％、少なくともまたは約７０％、少なくともまたは約７５％、少なくともまたは約８０％、少なくともまたは約８１％、少なくともまたは約８２％、少なくともまたは約８３％、少なくともまたは約８４％、少なくともまたは約８５％、少なくともまたは約８６％、少なくともまたは約８７％、少なくともまたは約８８％、少なくともまたは約８９％、少なくともまたは約９０％、少なくともまたは約９１％、少なくともまたは約９２％、少なくともまたは約９３％、少なくともまたは約９４％、少なくともまたは約９５％、少なくともまたは約９６％、少なくともまたは約９７％、少なくともまたは約９８％、少なくともまたは約９９％、または約１００％同一であるアミノ酸配列を含む（または基本的にそれからなる、またはそれからなる）１種または複数のリンカーを含む。
さらなる実施形態では、改変ヘテロトリマータンパク質は、Ｈｉｓ６タグ（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号２０）を含む。
いくつかの実施形態では、第３のポリペプチドは、ケモカインまたはサイトカインタンパク質であり、これは、免疫応答を高める。ケモカインまたはサイトカインタンパク質は、ＣＸＣＬ１４、ＧＣＳＦを含むＣＸＣＬ、ならびにＩＬ２およびＩＬ１６を含むインターロイキンを含むがこれらに限定されない。
本明細書で示されるのは、開示される改変タンパク質が、ＨＬ６０およびＭＯＬＭ細胞などの、ＣＤ３３を発現している細胞に結合すること、およびそれらに対し細胞傷害性であることである。また示されることは、ＣＤ３３発現が細胞中で増大されると、改変タンパク質の結合効率が高まることである。さらに、改変タンパク質の細胞傷害性は、ＣＤ３３発現が増大される、ＭＯＬＭなどの細胞において高まる。
特定の実施形態では、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を結合する抗原結合フラグメントは、野生型抗原結合フラグメントの誘導体、または改変型、またはバリアントである。
特定の実施形態では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、野生型ポリペプチドのフラグメントの誘導体、または改変型、またはバリアントである。
特定の実施形態では、Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、野生型ポリペプチドのフラグメントの誘導体、または改変型、またはバリアントである。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、１種または複数の遺伝的および／または化学的改変により得られる、任意のペプチド、疑似ペプチド（非生化学的要素を組み込んだペプチド）または野生型タンパク質とは異なるタンパク質もしくはペプチドを意味する。遺伝的および／または化学的改変は、考慮されるタンパク質またはペプチドの１個または複数の残基の何らかの変異、置換、欠失、付加、および／または改変を意味すると理解され得る。化学的改変は、化学反応によりまたはタンパク質の任意の数の残基への生物学的なまたは非生物学的な分子の化学的グラフト化により生成されるペプチドまたはタンパク質のなんらかの改変を指し得る。
本発明のポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸またはペプチドのバリアント、類似体、オルソログ、同族体および誘導体を含み得る。本発明のポリペプチドまたはペプチドは、アミノ酸の１種または複数の類似体（例えば、非天然起源アミノ酸、非血縁生体系で天然にのみ生ずるアミノ酸、改変アミノ酸、などを含む）、置換された結合、ならびに当該技術分野において既知の他の改変を有するペプチドを含み得る。本発明のポリペプチドまたはペプチドは、ペプトイドなどの、ペプチド模倣体を含み得る。本発明のポリペプチドまたはペプチドは、例えば、グリコシル化、アシル化（例えば、アセチル化、ホルミル化、ミリストイル化、パルミチン酸化、リポイル化）、アルキル化（例えば、メチル化）、イソプレニル化またはプレニル化（例えば、ファルネシル化、ゲラニルゲラニル化）、硫酸化、アミド化、ヒドロキシル化、スクシニル化、などにより改変された１種または複数のアミノ酸残基を含み得る。本発明のポリペプチドおよび薬剤は、例えば、ポリカーボン鎖またはコレステロール誘導体などの複合糖にまたは親油性化合物にグリコシル化、スルホン化、および／またはリン酸化および／またはグラフト化され得る。
系統特異的細胞表面抗原
本開示の態様は、例えば、標的癌細胞上の、系統特異的細胞表面抗原を標的とする薬剤を提供する。このような薬剤は、系統特異的細胞表面抗原を結合しかつ標的にする抗原結合フラグメントを含み得る。いくつかの事例では、抗原結合フラグメントは、系統特異的抗原に特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり得る。本明細書で使用される場合、用語「系統特異的細胞表面抗原」および「細胞表面系統特異的抗原」は同じ意味で用いられ、細胞の表面に十分存在し、細胞系統の１種または複数の集団と関連する任意の抗原を指す。例えば、抗原は細胞系統の１種または複数の集団に存在し得、他の細胞集団の細胞表面上では非存在であり得る（または低減された量で存在し得る）。
一般的に、系統特異的細胞表面抗原は、抗原および／または抗原を提示する細胞集団が宿主生物の生存および／または発達に必要とされるかどうかなどの多くの要因に基づき分類できる。系統特異的抗原の例示的なタイプのまとめを下表１に示す。
Figure 2023532973000002
１型クラスの系統特異的抗原は、卵巣、精巣、前立腺、乳房、子宮内膜、および膵臓を含む、幅広い様々な異なる組織で発現され得る。いくつかの実施形態では、薬剤は、１型抗原である細胞表面系統特異的抗原を標的にする。
いくつかの実施形態では、薬剤は、２型抗原である細胞表面系統特異的抗原を標的にする。例えば、ＣＤ３３は、正常骨髄細胞ならびに急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞の両方で発現される２型抗原である（Ｄｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５）。
多種多様な抗原が、本開示の方法および組成物によって標的にされ得る。これらの抗原に対するモノクローナル抗体は、市販品を購入でき、または前述のように、目的の抗原による動物の免疫に続く標準的なモノクローナル抗体方法論、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、標準的な方法を用いて作製され得る。抗体または抗体をコードする核酸は、いずれかの標準的なＤＮＡまたはタンパク質塩基配列決定技術を用いて配列決定され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で記載される方法および組成物を用いて標的にされる細胞表面系統特異的抗原は、白血球または白血球の亜集団の細胞表面系統特異的抗原である。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原は骨髄細胞に関連する抗原である。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原は、表面抗原分類抗原（ＣＤ）である。ＣＤ抗原の例としては、限定されないが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ１ｅ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８ａ、ＣＤ８ｂ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｄ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１７、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ３２ｃ、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４５ＲＣ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６０ａ、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４ａ、ＣＤ６５、ＣＤ６５ｓ、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６Ｆ、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７５Ｓ、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｃ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ｅ、ＣＤ８５Ｆ、ＣＤ８５Ｇ、ＣＤ８５Ｈ、ＣＤ８５Ｉ、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１０、ＣＤ１１１、ＣＤ１１２、ＣＤ１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤ１２７、ＣＤ１２９、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤ１５０、ＣＤ１５２、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６ａ、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ｂ１、ＣＤ１５８ｂ２、ＣＤ１５８ｄ、ＣＤ１５８ｅ１／ｅ２、ＣＤ１５８ｆ、ＣＤ１５８ｇ、ＣＤ１５８ｈ、ＣＤ１５８ｉ、ＣＤ１５８ｊ、ＣＤ１５８ｋ、ＣＤ１５９ａ、ＣＤ１５９ｃ、ＣＤ１６０、ＣＤ１６１、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ１６７ａ、ＣＤ１６８、ＣＤ１６９、ＣＤ１７０、ＣＤ１７１、ＣＤ１７２ａ、ＣＤ１７２ｂ、ＣＤ１７２ｇ、ＣＤ１７３、ＣＤ１７４、ＣＤ１７５、ＣＤ１７５ｓ、ＣＤ１７６、ＣＤ１７７、ＣＤ１７８、ＣＤ１７９ａ、ＣＤ１７９ｂ、ＣＤ１８０、ＣＤ１８１、ＣＤ１８２、ＣＤ１８３、ＣＤ１８４、ＣＤ１８５、ＣＤ１８６、ＣＤ１９１、ＣＤ１９２、ＣＤ１９３、ＣＤ１９４、ＣＤ１９５、ＣＤ１９６、ＣＤ１９７、ＣＤｗ１９８、ＣＤｗ１９９、ＣＤ２００、ＣＤ２０１、ＣＤ２０２ｂ、ＣＤ２０３ｃ、ＣＤ２０４、ＣＤ２０５、ＣＤ２０６、ＣＤ２０７、ＣＤ２０８、ＣＤ２０９、ＣＤ２１０ａ、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ２１２、ＣＤ２１３ａ１、ＣＤ２１３ａ２、ＣＤ２１５、ＣＤ２１７、ＣＤ２１８ａ、ＣＤ２１８ｂ、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２２、ＣＤ２２３、ＣＤ２２４、ＣＤ２２５、ＣＤ２２６、ＣＤ２２７、ＣＤ２２８、ＣＤ２２９、ＣＤ２３０、ＣＤ２３１、ＣＤ２３２、ＣＤ２３３、ＣＤ２３４、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２３５ｂ、ＣＤ２３６、ＣＤ２３６Ｒ、ＣＤ２３８、ＣＤ２３９、ＣＤ２４０、ＣＤ２４１、ＣＤ２４２、ＣＤ２４３、ＣＤ２４４、ＣＤ２４５、ＣＤ２４６、ＣＤ２４７、ＣＤ２４８、ＣＤ２４９、ＣＤ２５２、ＣＤ２５３、ＣＤ２５４、ＣＤ２５６、ＣＤ２５７、ＣＤ２５８、ＣＤ２６１、ＣＤ２６２、ＣＤ２６３、ＣＤ２６４、ＣＤ２６５、ＣＤ２６６、ＣＤ２６７、ＣＤ２６８、ＣＤ２６９、ＣＤ２７０、ＣＤ２７１、ＣＤ２７２、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ＣＤ２７５、ＣＤ２７６、ＣＤ２７７、ＣＤ２７８、ＣＤ２７９、ＣＤ２８０、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３、ＣＤ２８４、ＣＤ２８６、ＣＤ２８８、ＣＤ２８９、ＣＤ２９０、ＣＤ２９２、ＣＤｗ２９３、ＣＤ２９４、ＣＤ２９５、ＣＤ２９６、ＣＤ２９７、ＣＤ２９８、ＣＤ２９９、ＣＤ３００ａ、ＣＤ３００ｃ、ＣＤ３００ｅ、ＣＤ３０１、ＣＤ３０２、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４、ＣＤ３０５、３０６、ＣＤ３０７ａ、ＣＤ３０７ｂ、ＣＤ３０７ｃ、Ｄ３０７ｄ、ＣＤ３０７ｅ、ＣＤ３０９、ＣＤ３１２、ＣＤ３１４、ＣＤ３１５、ＣＤ３１６、ＣＤ３１７、ＣＤ３１８、ＣＤ３１９、ＣＤ３２０、ＣＤ３２１、ＣＤ３２２、ＣＤ３２４、ＣＤ３２５、ＣＤ３２６、ＣＤ３２７、ＣＤ３２８、ＣＤ３２９、ＣＤ３３１、ＣＤ３３２、ＣＤ３３３、ＣＤ３３４、ＣＤ３３５、ＣＤ３３６、ＣＤ３３７、ＣＤ３３８、ＣＤ３３９、ＣＤ３４０、ＣＤ３４４、ＣＤ３４９、ＣＤ３５０、ＣＤ３５１、ＣＤ３５２、ＣＤ３５３、ＣＤ３５４、ＣＤ３５５、ＣＤ３５７、ＣＤ３５８、ＣＤ３５９、ＣＤ３６０、ＣＤ３６１、ＣＤ３６２、およびＣＤ３６３が挙げられる。
いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原はＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１１、ＣＤ１２３、ＣＤ５６、ＣＤ３４、ＣＤ１４、ＣＤ３３、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ４１、ＣＤ６１、ＣＤ６２、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ１４６、ＣＤ３２６、ＬＭＰ２、ＣＤ２２、ＣＤ５２、ＣＤ１０、ＣＤ３／ＴＣＲ、ＣＤ７９／ＢＣＲ、およびＣＤ２６である。いくつかの実施形態では、細胞表面系統特異的抗原は、ＣＤ３３またはＣＤ１９である。
代わりに、または追加して、細胞表面系統特異的抗原は、癌抗原、例えば、癌細胞上で差次的に提示される細胞表面系統特異的抗原であり得る。いくつかの実施形態では、癌抗原は、組織または細胞系統に特異的な抗原である。癌の特定タイプと関連する細胞表面系統特異的抗原の例としては、限定されないが、ＣＤ２０、ＣＤ２２（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５２（Ｂ細胞ＣＬＬ）、ＣＤ３３（急性骨髄性白血病（ＡＭＬ））、ＣＤ１０（ｇｐ１００）（共通（前駆Ｂ細胞）急性リンパ性白血病および悪性骨髄腫）、ＣＤ３／Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（Ｔ細胞リンパ腫および白血病）、ＣＤ７９／Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）（Ｂ細胞リンパ腫および白血病）、ＣＤ２６（上皮性およびリンパ性悪性腫瘍）、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、およびＨＬＡ－ＤＱ（リンパ性悪性腫瘍）、ＣＤ３０７ｅおよびＢＣＭＡ（骨髄腫）、ＲＣＡＳ１（婦人科癌、胆管腺癌、および膵臓の導管腺癌）、クローディン３、ＴＭＰＲＳＳ３およびＨＥＲ２（卵巣癌）、ＨＥＲ２（乳癌）、ならびに前立腺特異的膜抗原が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞表面抗原ＣＤ３３は、ＡＭＬ細胞と関連する。
特定の実施形態では、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を結合する抗原結合フラグメントは、最大でまたは約５００、最大でまたは約４９０、最大でまたは約４８０、最大でまたは約４７０、最大でまたは約４６０、最大でまたは約４５０、最大でまたは約４４０、最大でまたは約４３０、最大でまたは約４２０、最大でまたは約４１０、最大でまたは約４００、最大でまたは約３９０、最大でまたは約３８０、最大でまたは約３７０、最大でまたは約３６０、最大でまたは約３５０、最大でまたは約３４０、最大でまたは約３３０、最大でまたは約３２０、最大でまたは約３１０、最大でまたは約２００、最大でまたは約１９０、最大でまたは約１８０、最大でまたは約１７０、最大でまたは約１６０、最大でまたは約１５０、最大でまたは約１４０、最大でまたは約１３０、最大でまたは約１２０、最大でまたは約１１０、最大でまたは約１００、最大でまたは約９０、最大でまたは約８０、最大でまたは約７０、最大でまたは約６０、最大でまたは約５０、最大でまたは約４０、最大でまたは約３０、最大でまたは約２０、最大でまたは約１５、または最大でまたは約１０のアミノ酸残基長を有する。特定の実施形態では、系統特異的細胞表面抗原（例えば、ＣＤ３３）を結合する抗原結合フラグメントは、約１００～２００、８０～２１０、８０～２５０、１５０～２５０、１００～３０、５０～２００、１５０～２５０、１５０～３００、３００～４００、２００～４００、４００～５００、または１５０～１９０のアミノ酸残基長を有する。
ＮＫ細胞表面受容体結合ペプチド
特定の実施形態では、本発明の融合ポリペプチドまたは組成物は、Ｃ型レクチン様受容体（例えば、ＮＫＧ２Ｄ）などの、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子に結合するポリペプチドを含む。
Ｃ型レクチン様ＮＫ細胞受容体は、ナチュラルキラー細胞の表面上で発現される受容体であり得る。このタイプの例示的ＮＫ細胞受容体としては、限定されないが、ＮＫＧ２Ｄ（ジェンバンク受入番号ＢＣ０３９８３６）、デクチン１（ジェンバンク受入番号ＡＪ３１２３７３またはＡＪ３１２３７２）、マスト細胞機能関連抗原（ジェンバンク受入番号ＡＦ０９７３５８）、ＨＮＫＲ－Ｐ１Ａ（ジェンバンク受入番号Ｕ１１２７６）、ＬＬＴ１（ジェンバンク受入番号ＡＦ１３３２９９）、ＣＤ６９（ジェンバンク受入番号ＮＭ＿００１７８１）、ＣＤ６９同族体、ＣＤ７２（ジェンバンク受入番号ＮＭ＿００１７８２）、ＣＤ９４（ジェンバンク受入番号ＮＭ＿００２２６２またはＮＭ＿００７３３４）、ＫＬＲＦ１（ジェンバンク受入番号ＮＭ＿０１６５２３）、酸化ＬＤＬ受容体または（ジェンバンク受入番号ＮＭ００２５４３）、ＣＬＥＣ－１、ＣＬＥＣ－２（ジェンバンク受入番号ＮＭ０１６５０９）、ＮＫＧ２Ｃ（ジェンバンク受入番号ＡＪ００１６８４）、ＮＫＧ２Ａ（ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１８１２）、ＮＫＧ２Ｅ（ジェンバンク受入番号ＡＦ４６１１５７）、ＷＵＧＳＣ：Ｈ＿ＤＪ０７０１Ｏ１６．２、または骨髄ＤＡＰ１２会合レクチン（ＭＤＬ－１；ジェンバンク受入番号ＡＪ２７１６８４）が挙げられる。特定の実施形態では、ＮＫ細胞受容体は、ヒトＮＫＧ２ＤまたはヒトＮＫＧ２Ｃである。
本明細書で使用される場合、用語「ナチュラルキラーグループ２Ｄ」、「ＮＫＧ２Ｄ」および「ＮＫＧ２Ｄ受容体」は、ＫＬＲＫ１としても知られ、多数の種類の免疫細胞、特に、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、いくつかのＣＤ４＋Ｔ細胞、およびγδＴ細胞上で見出される活性化細胞表面分子を指す。用語ＮＫＧ２ＤおよびＮＫＧ２Ｄ受容体は、ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体のバリアント、アイソフォーム、および同族体を含む（例えば、Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００２）３（１２）：１１４２－９に記載されるアイソフォームを参照されたい）。ＮＫＧ２Ｄは、細胞外Ｃ型（すなわち、Ｃａ２＋結合）レクチン様ドメインを有するがＣａ２＋結合部位を欠く、２型膜貫通タンパク質である。それは、ＤＡＰ１０またＤＡＰ１２などのアダプタータンパク質とヘテロダイマーを形成でき、限定されないが、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、およびＵＬＢＰ６を含むタンパク質リガンドを認識する。
特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの作動薬である。特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの拮抗薬である。特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ペプチドは、ＮＫＧ２Ｄの拮抗薬でも作動薬でもない。
ＮＫ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄ細胞表面受容体のリガンドなどの、ＮＫ細胞表面受容体のリガンドであり得る。ＮＫＧ２Ｄのためのリガンド（またはＮＫＧ２Ｄリガンド）の非限定的例は、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢなどのＭＨＣクラスＩ鎖関連（ＭＩＣ）抗原、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、などのＵＬ１６結合タンパク質（ＵＬＢＰ）を含む（Ｂａｈｒａｍ Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）７６：１－６０；Ｃｅｒｗｅｎｋａ ａｎｄ Ｌａｎｉｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．（２００１）１８１：１５８－１６９；Ｃｏｓｍａｎ，ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１）１４：１２３－１３３；Ｋｕｂｉｎ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２００１）３１：１４２８－１４３７）。マウスＮＫＧ２Ｄリガンドは、例えば、レチノイン酸早期誘導性－１遺伝子産物（ＲＡＥ－１）およびマイナー組織適合抗原Ｈ６０を含む。ＮＫ細胞は、免疫調節性ポリペプチドリガンドとＮＫ細胞表面上の受容体の相互作用により調節され得る。例えば、ＮＫ細胞活性を調節できるＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンドは、ｍｕＣＣＬ２１などのケモカイン、およびＭＨＣクラスＩ鎖関連抗原などのストレス誘導性ポリペプチドリガンド、およびＵＬＬ１６結合タンパク質を含む。マウスＨ６０マイナー組織適合抗原ペプチドも、ＮＫＧ２Ｄ受容体に結合することが報告されている。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０００）１９９（１）：８－１４；Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００２）１７（５）：５９３－６０３，ａｎｄ Ｆａｒａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，（２００２）１００（６）：１９３５－１９４７を参照されたい。本明細書で使用される場合、「ＮＫＧ２Ｄリガンド」という用語は、ＮＫＧ２Ｄ受容体に特異的に結合する結合相手を指す。例示的リガンドは、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、およびＭＩＣおよびＵＬＢＰタンパク質の可溶型などのそれらの機能性フラグメントを含む。表２は、例示的ＮＫＧ２Ｄ結合タンパク質およびドメインを列挙する。
Figure 2023532973000003
ＭＩＣおよびＵＬＢＰタンパク質は、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、αβＣＤ８＋Ｔ細胞、およびγδＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、免疫エフェクター細胞上のＣ型レクチン様活性化受容体ナチュラルキラーグループ２Ｄ（ＮＫＧ２Ｄ）に結合するリガンドとして働く。
本明細書で使用される場合、「ＵＬＢＰタンパク質」という用語は、Ｎ末端シグナル配列、中央に配置されるα－１およびα－２ドメイン、およびグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカードメインまたは膜貫通ドメインであり得るＣ末端細胞膜会合ドメインを含む、プロセスされていないタンパク質の特徴的構成を有するＭＨＣクラスＩ関連分子のメンバーを指す。ＵＬＢＰタンパク質のいくつかの種は、細胞質ドメインを有する。通常、ＵＬＢＰタンパク質は、ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢタンパク質に対する低いアミノ酸配列同一性を有する。ＵＬＢＰファミリーメンバーは、エフェクター細胞受容体ＮＫＧ２Ｄのリガンドであり、ＮＫ細胞を活性化することが知られている。本明細書で使用される場合、「ＵＬＢＰタンパク質」は、ヒトＵＬＢＰタンパク質の活性バリアント、アイソフォーム、および同族体種を含み、かつＮＫＧ２Ｄ受容体結合活性を有するフラグメントを含む。
本明細書で使用される場合、「ＵＬＢＰ１」という用語は、「レチノイン酸早期転写物１タンパク質」または「ＲＡＥＴ１」とも呼ばれ、ＭＨＣクラスＩファミリーのメンバーを指し、ヒトＵＬＢＰ１のバリアント、アイソフォーム、および同族体種を含む。タンパク質は、受容体ＮＫＧ２Ｄのリガンドとして機能する。ＵＬＢＰ１タンパク質は、一次ＮＫ細胞中の複数のシグナル伝達経路を活性化する。ＵＬＢＰ１中のＣ末端膜結合ドメインは、ＧＰＩドメインを含む。ＵＬＢＰ１は、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢと低い相同性があり、ＵＬＢＰ２およびＵＬＢＰ３に対する約５５％～６０％のアミノ酸配列同一性を有する。ヒトＵＬＢＰ１の例示的配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０７９４９４．１として入手可能である。ヒトＵＬＢＰ１のＤＮＡおよびタンパク質配列は、Ｃｏｓｍａｎらの、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１）１４（２）：１２３－１３３、欧州バイオインフォマティクス研究所、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃａｍｐｕｓ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＣＢ１０ １ＳＤ，ＵＫのＥＭＢＬデータベースのＤＮＡ受入番号ＡＦ３０４３７７により報告されている。
本明細書で使用される場合、「ＵＬＢＰ２」という用語は、「レチノイン酸早期転写物１Ｈタンパク質」または「ＲＡＥＴ１Ｈ」とも呼ばれ、ＭＨＣクラスＩファミリーのメンバーを指し、ヒトＵＬＢＰ２のバリアント、アイソフォーム、および同族体種を含む。このタンパク質は、受容体ＮＫＧ２Ｄのリガンドとして機能する。ＵＬＢＰ２は、一次ＮＫ細胞中の複数のシグナル伝達経路を活性化する。ＵＬＢＰ２のＣ末端膜結合ドメインは、ＧＰＩドメインを含む。ＵＬＢＰ２は、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢと低い相同性があり、ＵＬＢＰ１およびＵＬＢＰ３に対する約５５％および６０％のアミノ酸配列同一性を有する。ヒトＵＬＢＰ２の例示的配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０７９４９３．１として入手可能である。ヒトＵＬＢＰ２のＤＮＡおよびタンパク質配列は、Ｃｏｓｍａｎらの、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１）１４（２）：１２３－１３３、欧州バイオインフォマティクス研究所、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃａｍｐｕｓ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＣＢ１０ １ＳＤ，ＵＫのＥＭＢＬデータベースのＤＮＡ受入番号ＡＦ３０４３７８により報告されている。
本明細書で使用される場合、「ＵＬＢＰ３」という用語は、「レチノイン酸早期転写物１Ｎタンパク質」または「ＲＡＥＴ１Ｎ」とも呼ばれ、ＭＨＣクラスＩファミリーのメンバーを指し、ヒトＵＬＢＰ３のバリアント、アイソフォーム、および同族体種を含む。タンパク質は、受容体ＮＫＧ２Ｄのリガンドとして機能する。ＵＬＢＰ２のＣ末端膜結合ドメインは、ＧＰＩアンカードメインを含む。ＵＬＢＰ３は、一次ＮＫ細胞中の複数のシグナル伝達経路を活性化する。ＵＬＢＰ３は、ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢと低い相同性がある。ヒトＵＬＢＰ３の例示的配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０７８７９４．１として入手可能である。ヒトＵＬＢＰ３のＤＮＡおよびタンパク質配列は、Ｃｏｓｍａｎらの、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ（２００１）１４（２）：１２３－１３３、欧州バイオインフォマティクス研究所、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｔｒｕｓｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃａｍｐｕｓ，Ｈｉｎｘｔｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ ＣＢ１０ １ＳＤ，ＵＫのＥＭＢＬデータベースのＤＮＡ受入番号ＡＦ３０４３７９により報告されている。
本明細書で使用される場合、「ＵＬＢＰ４」という用語は、「レチノイン酸早期転写物１Ｅタンパク質」または「ＲＡＥＴ１Ｅ」とも呼ばれ、ＭＨＣクラスＩファミリーのメンバーを指し、ヒトＵＬＢＰ４のバリアント、アイソフォーム、および同族体種を含む。タンパク質は、受容体ＮＫＧ２Ｄのリガンドとして機能する。ＵＬＢＰ４のＣ末端領域は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む（例えば、米国特許出願公開第２００９０２７４６９９号を参照されたい）。ＵＬＢＰ４は、その受容体ＮＫＧ２Ｄへの結合を介してＮＫ細胞の活性化に関与し、ＮＫ媒介溶解を誘導する（例えば、Ｋｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（２００９）１１４（２）：３１０－１７を参照されたい）。ＵＬＢＰ４は、ＵＬＢＰ１およびＵＬＢＰ２よりＵＬＢＰ３に対しより高い配列同一性を有する。ヒトＵＬＢＰ４の例示的配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１２３０２５４．１；ＮＰ ００１２３０２５６．１；ＮＰ ００１２３０２５７．１；およびＮＰ ６３１９０４．１として入手可能である。
本明細書で使用される場合、「ＵＬＢＰ５」という用語は、「レチノイン酸早期転写物１Ｇタンパク質」または「ＲＡＥＴ１Ｇ」とも呼ばれ、ＭＨＣクラスＩファミリーのメンバーを指し、ヒトＵＬＢＰ５のバリアント、アイソフォーム、および同族体種を含む。このタンパク質のＣ末端領域は、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含む。ＵＬＢＰ５は、その受容体ＮＫＧ２Ｄへの結合を介してＮＫ細胞の活性化およびＮＫ細胞媒介細胞傷害性に関与する。ヒトＵＬＢＰ５の例示的配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿００１００１７８８．２として入手可能である。
本明細書で使用される場合、「ＵＬＢＰ６」という用語は、「レチノイン酸早期転写物１Ｌタンパク質」または「ＲＡＥＴ１Ｌ」とも呼ばれ、ＭＨＣクラスＩファミリーのメンバーを指し、ヒトＵＬＢＰ６のバリアント、アイソフォーム、および同族体種を含む。ＵＬＢＰ６は、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、およびＵＬＢＰ３と同様に、ＧＰＩアンカードメインを含む。ＵＬＢＰ６は、その受容体ＮＫＧ２Ｄへの結合を介してＮＫ細胞の活性化およびＮＫ細胞媒介細胞傷害性に関与する。ヒトＵＬＢＰ６の例示的配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿５７０９７０．２として入手可能である。
ＭＩＣＡおよびＭＩＣＢと同様に、ＵＬＢＰタンパク質の既知の機能は、ＮＫＧ２Ｄ受容体への結合およびＮＫ細胞活性の活性化である。
ＭＩＣＡは、ＭＨＣクラスＩ鎖関連遺伝子Ａタンパク質（ＭＩＣＡ）であり、ヒトＭＩＣＡのバリアント、アイソフォーム、および同族体を含み、機能性ＭＩＣＡ活性を有するＭＩＣＡのフラグメントを含む。ＭＩＣＡタンパク質は、３個の細胞外Ｉｇ様ドメイン（すなわち、α－１、α－２およびα－３）、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。このタンパク質は、胃上皮の細胞、内皮細胞および線維芽細胞および角化細胞の細胞質および単球中で低レベルで発現される。ＭＩＣＡの例示的配列は、ＮＣＢＩ受入番号ＮＰ＿０００２３８．１として入手可能である。他の例示的ＭＩＣＡ配列は、米国特許出願公開第２０１１０３１１５６１号で見つけることができる。
ＭＩＣＢは、ＭＨＣクラスＩ鎖関連遺伝子Ｂタンパク質（ＭＩＣＢ）であり、ヒトＭＩＣＢのバリアント、アイソフォーム、および同族体を含み、機能性ＭＩＣＢ活性を有するＭＩＣＢのフラグメントを含む。ＭＩＣＢは、ＭＩＣＡに対する約８４％の配列同一性を有する。ＭＩＣＢタンパク質は、３個の細胞外Ｉｇ様ドメイン（すなわち、α－１、α－２およびα－３）、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。ＭＩＣＢの例示的配列は、ユニプロットＫＢ受入番号Ｑ２９９８０．１として入手可能である。他の例示的ＭＩＣＢ配列は、米国特許出願公開第２０１１０３１１５６１号で見つけることができる。
ＮＫＧ２Ｄリガンド（ＮＫＧ２Ｄ受容体のリガンド）はまた、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体またはそのフラグメント（例えば、抗原結合部分またはそのフラグメント）を含み得、限定されないが、ＮＫＧ２Ｄを特異的に認識する、またはそれに特異的に結合する抗体の全てまたは一部を含む。このような抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよい。抗体はまた、ＮＫＧ２Ｄを結合できる免疫グロブリン鎖を含む、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、およびハイブリッド抗体などのバリアント抗体であり得る。特定の実施形態では、抗体は、単鎖可変フラグメントを含む。特定の実施形態では、抗体は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，８７９，９８５号で示されるように、１６Ｆ１６、１６Ｆ３１、ＭＳ、または２１Ｆ２である、抗体フラグメントは、本明細書で考察される任意の好適なフラグメントであり得る。
特定の実施形態では、ヘテロタンパク質または組成物は、ＣＤ１６であるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子に結合するポリペプチドを含む。
このようなポリペプチドは、ＮＫ細胞上で発現される分子を結合しかつ標的にする抗原結合フラグメントを含み得る。いくつかの事例では、抗原結合フラグメントは、ＮＫ細胞上で発現される分子特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり得る。
多種多様な抗原が、本開示の方法および組成物によって標的にされ得る。これらの抗原に対するモノクローナル抗体は、市販品を購入でき、または前述のように、目的の抗原による動物の免疫に続く標準的なモノクローナル抗体方法論、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、標準的な方法を用いて作製され得る。抗体または抗体をコードする核酸は、いずれかの標準的なＤＮＡまたはタンパク質塩基配列決定技術を用いて配列決定され得る。
特定の実施形態では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、最大でまたは約５００、最大でまたは約４９０、最大でまたは約４８０、最大でまたは約４７０、最大でまたは約４６０、最大でまたは約４５０、最大でまたは約４４０、最大でまたは約４３０、最大でまたは約４２０、最大でまたは約４１０、最大でまたは約４００、最大でまたは約３９０、最大でまたは約３８０、最大でまたは約３７０、最大でまたは約３６０、最大でまたは約３５０、最大でまたは約３４０、最大でまたは約３３０、最大でまたは約３２０、最大でまたは約３１０、最大でまたは約２００、最大でまたは約１９０、最大でまたは約１８０、最大でまたは約１７０、最大でまたは約１６０、最大でまたは約１５０、最大でまたは約１４０、最大でまたは約１３０、最大でまたは約１２０、最大でまたは約１１０、最大でまたは約１００、最大でまたは約９０、最大でまたは約８０、最大でまたは約７０、最大でまたは約６０、最大でまたは約５０、最大でまたは約４０、最大でまたは約３０、最大でまたは約２０、最大でまたは約１５、または最大でまたは約１０のアミノ酸残基長を有する。特定の実施形態では、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチドは、約１００～２００、８０～２１０、８０～２５０、１５０～２５０、１００～３０、５０～２００、１５０～２５０、１５０～３００、または１５０～１９０のアミノ酸残基長を有する。
Ｔ細胞上で発現される分子
本開示の態様は、Ｔ細胞上で発現される分子を標的にする薬剤を提供する。このような薬剤は、Ｔ細胞上で発現される分子を結合し標的にする抗原結合フラグメントを含み得る。いくつかの事例では、抗原結合フラグメントは、Ｔ細胞上で発現される分子に特異的に結合する単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり得る。
多種多様な抗原が、本開示の方法および組成物によって標的にされ得る。これらの抗原に対するモノクローナル抗体は、市販品を購入でき、または前述のように、目的の抗原による動物の免疫に続く標準的なモノクローナル抗体方法論、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５６：４９５の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、標準的な方法を用いて作製され得る。抗体または抗体をコードする核酸は、いずれかの標準的なＤＮＡまたはタンパク質塩基配列決定技術を用いて配列決定され得る。
特定の実施形態では、細胞株上で発現される分子（例えば、ＣＤ３）を結合する抗原結合フラグメントは、最大でまたは約５００、最大でまたは約４９０、最大でまたは約４８０、最大でまたは約４７０、最大でまたは約４６０、最大でまたは約４５０、最大でまたは約４４０、最大でまたは約４３０、最大でまたは約４２０、最大でまたは約４１０、最大でまたは約４００、最大でまたは約３９０、最大でまたは約３８０、最大でまたは約３７０、最大でまたは約３６０、最大でまたは約３５０、最大でまたは約３４０、最大でまたは約３３０、最大でまたは約３２０、最大でまたは約３１０、最大でまたは約２００、最大でまたは約１９０、最大でまたは約１８０、最大でまたは約１７０、最大でまたは約１６０、最大でまたは約１５０、最大でまたは約１４０、最大でまたは約１３０、最大でまたは約１２０、最大でまたは約１１０、最大でまたは約１００、最大でまたは約９０、最大でまたは約８０、最大でまたは約７０、最大でまたは約６０、最大でまたは約５０、最大でまたは約４０、最大でまたは約３０、最大でまたは約２０、最大でまたは約１５、または最大でまたは約１０のアミノ酸残基長を有する。特定の実施形態では、Ｔ細胞上で発現される分子（例えば、ＣＤ３）を結合する抗原結合フラグメントは、約１００～２００、８０～２１０、８０～２５０、１５０～２５０、１００～３０、５０～２００、１５０～２５０、１５０～３００、３００～４００、２００～４００、４００～５００、または１５０～１９０のアミノ酸残基長を有する。
非天然起源ポリペプチドドメイン
本開示の態様は、４個のヘリックスに基づく６ＤＭＰヘテロダイマー手法を用いる－いくつかのヘテロダイマーデザインでは、各タンパク質モノマーは、２個のヘリックスを有し、他のデザインでは、３対１で有し、これは、ヘリックスに沿って４つの結合ネットワークを作り、最終的にこのネットワークを形成するヘテロダイマーのみが有利となる。６ＤＭＰヘテロダイマー化ネットワークは、３個の水素結合ネットワークおよび１個の疎水性コアを生成する。４個のヘリックスは、２つのタンパク質配列に分離され、それぞれが２個のヘリックスに寄与する。高度に特異的な４個のヘリックス構造は、そのパートナータンパク質間でヘテロダイマーのみを形成する。それは、核内プロセスの促進に有用であることが知られているが、細胞間相互作用の促進物質として試験されたことはない。
いくつかの実施形態では、１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインは、６ＤＭＰａである（配列番号１２）。いくつかの実施形態では、１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインは、６ＤＭＰｂである（配列番号１６）。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｈｅｎら、２０１９を参照されたい。
抗原結合フラグメント
抗原結合フラグメントは、抗体フラグメントであり得る。抗体または抗体フラグメントは、それらが結合できる限り、いずれの免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ）およびサブクラスであってもよい。特定の実施形態では、抗体フラグメントは、抗原結合部分を有する。特定の実施形態では、抗原フラグメントは、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）’、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、二価ｓｃＦｖ（ｂｉ－ｓｃＦｖ）、三価ｓｃＦｖ（ｔｒｉ－ｓｃＦｖ）、Ｆｄ、ｄＡｂフラグメント（例えば、Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（１９８９）３４１：５４４－５４６）、単離ＣＤＲ、ディアボディ、アフィボディ、トリアボディ、テトラボディ、直鎖抗体、単鎖抗体分子を含む。組換え法または合成リンカーを使って、抗体フラグメントを連結することにより産生される単鎖抗体も、本開示に包含される。Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８８），２４２：４２３－４２６．Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８８），８５：５８７９－５８８３．抗体フラグメントは、完全な抗体の一部だけを含み、通常、完全な抗体の抗原結合部位を含み、それにより抗原を結合する能力を保持する。本発明により包含される抗体フラグメントの例としては、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、および重鎖定常ドメイン（ＣＨ）を有する、Ｆａｂフラグメント；ＣＨドメインのＣ末端に１個または複数のシステイン残基を有するＦａｂフラグメントである、Ｆａｂ’フラグメント；ＶＨおよびＣＨドメインを有するＦｄフラグメント；ＶＨおよびＣＨドメインおよびＣＨドメインのＣ末端に１個または複数のシステイン残基を有するＦｄ’フラグメント；抗体の単一アームのＶＬおよびＣＨドメインを有するＦｖフラグメント；ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４１：５４４－５４６）；単離されたＣＤＲ領域；ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２個のＦａｂ’フラグメントを含む二価のフラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；単鎖抗体分子（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２４２：４２３－４２６；およびＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９８８）８５：５８７９－５８８３）；同じポリペプチド鎖中のＶＬドメインに連結されたＶＨドメインを含む、２個の抗原結合部位を有するディアボディ（例えば、ＷＯ９３／１１１６１；Ｗｈｉｔｌｏｗ ｅｔ ａｌ．およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：６４４４－６４４８を参照）；三重ヘリックスの高アフィニティペプチドであるアフィボディ（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ，ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００８）２７５：２６６８－２６７６を参照）、および相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に抗原結合領域の１対を形成する１対のタンデム型Ｆｄセグメント（ＶＨ－ＣＨ１－ＶＨ－ＣＨ１）を含む直鎖抗体（Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．（１９９５）８（１０）：１０５７－１０６２；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，６４１，８７０；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．８，５８０，７５５）が挙げられる。
任意の抗体またはその抗原結合フラグメントを、本明細書で記載される系統特異的細胞表面抗原を標的にする薬剤を構築するために使用できる。このような抗体または抗原結合フラグメントは、従来法、例えば、ハイブリドーマ技術または組換え技術によって調製できる。
例えば、目的の系統特異的抗原に特異的な抗体は、従来のハイブリドーマ技術によって作製できる。ＫＬＨなどの担体タンパク質に結合され得る系統特異的抗原を使用して、その複合体に結合する抗体を生成するために宿主動物を免疫できる。宿主動物の免疫接種の経路または計画は通常、本明細書でさらに記載されるように、抗体刺激および産生のために確立された従来技術に従う。マウス抗体、ヒト化抗体、およびヒト抗体の産生のための一般的技術は、当技術分野において既知であり、本明細書で記載される。ヒトを含む任意の哺乳動物対象またはそれに由来する抗体産生細胞が、ヒトを含む哺乳動物のハイブリドーマ細胞株の産生のためのベースとなるように操作されてよいことが企図される。通常、宿主動物は、本明細書で記載されるようなものを含む、ある量の免疫原を腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内、および／または皮内で接種される。
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７の、またはＢｕｃｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ，（１９８２）１８：３７７－３８１によって改良された一般的な体細胞ハイブリドーマ技術を用いて、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製できる。利用可能な骨髄腫株は、限定されないが、Ｘ６３－Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡから入手されるものを含み、ハイブリダイゼーションに使用され得る。一般に、本技術は、ポリエチレングリコールなどの融合因子を用いて、または当業者に良く知られている電気的方法によって、骨髄腫細胞とリンパ球を融合することを含む。融合後に、細胞を、融合培地から分離し、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択増殖培地中で増殖させて、ハイブリダイズされていない親細胞を取り除く。血清を補充したまたは無補充の本明細書で開示される培地のいずれかを、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用できる。細胞融合技術とは別の選択肢として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して本明細書で記載のＴＣＲ様モノクローナル抗体を産生し得る。ハイブリドーマを拡張し、および必要に応じてサブクローニングし、上清を、従来の免疫アッセイ方法（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、または蛍光イムノアッセイ）により抗免疫原活性についてアッセイする。
抗体源として使用され得るハイブリドーマは、系統特異的抗原に結合できるモノクローナル抗体を産生する親ハイブリドーマの子孫細胞であるすべての派生物を包含する。このような抗体を産生するハイブリドーマは、既知の方法を用いてインビトロまたはインビボで増殖され得る。モノクローナル抗体は、必要に応じて、硫酸アンモニウム沈殿法、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外ろ過などの従来の免疫グロブリン精製法によって、培地または体液から分離され得る。望ましくない活性は、存在する場合、例えば、固相に付着された免疫原からなる吸着剤上に調製物を通し、所望の抗体を免疫原から溶出または放出させることによって、取り除くことができる。二官能剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介する複合体化）、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ＲおよびＲ１が異なるアルキル基である）を用いて免疫される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、またはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートされた標的アミノ酸配列を含む標的抗原またはフラグメントでの宿主細胞の免疫は、抗体の集団（例えば、モノクローナル抗体）を生じ得る。
必要に応じて、目的の抗体（例えば、ハイブリドーマによって産生された）は、配列決定され、次にポリヌクレオチド配列は発現または増殖用ベクター中にクローン化され得る。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中のベクターに維持され、宿主細胞は次に、拡張され、将来の使用のために凍結され得る。あるいは、ポリヌクレオチド配列は、抗体を「ヒト化する」ため、あるいは抗体の親和性（親和性成熟）または他の特性を改善するための遺伝子操作に使用され得る。例えば、定常領域を、抗体が臨床試験またはヒトの治療で使用される場合、免疫応答を回避するためにさらに似ているヒト定常領域へと操作し得る。抗体配列を遺伝的に操作して系統特異的抗原に対する高い親和性を得ることが望ましい場合がある。１つまたは複数のポリヌクレオチド変化を抗体に対し実行し、標的抗原に対するその結合特異性をなお維持できることは、当業者に明らかであろう。
他の実施形態では、完全なヒト抗体を、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作されている市販マウスを用いて得ることができる。より望ましい（例えば、完全なヒト抗体）またはより強い免疫応答を生じるように設計される遺伝子導入動物もまた、ヒト化抗体またはヒト抗体の生成のために使用され得る。このような技術の例は、Ａｍｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）のＨｕＭＡｂ－Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ Ｍｏｕｓｅ（商標）である。別の選択肢では、抗体は、ファージディスプレイまたは酵母技術による組換えによって作製され得る。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，５８０，７１７号、同第５，７３３，７４３号、および同第６，２６５，１５０号、ならびにＷｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４）１２：４３３－４５５を参照されたい。あるいは、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９０）３４８：５５２－５５３）を使用して、未免疫ドナー由来の免疫グロブリン可変（Ｖ）領域遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体および抗体フラグメントを産生できる。
インタクト抗体（完全長抗体）の抗原結合フラグメントは、定型化された方法によって調製できる。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって産生でき、Ｆａｂは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成できる。
ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、および二重特異的抗体などの、遺伝的に改変された抗体は、例えば従来の組換え技術によって産生できる。一例では、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法を用いて容易に単離および配列決定できる（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源として機能する。単離されると、ＤＮＡは、１個または複数の発現ベクター中に配置され得、これは次いで大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはさもなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞中に遺伝子導入されて、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得る。例えば、国際公開第８７／０４４６２号を参照されたい。ＤＮＡは次に、例えば、相同なマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常領域をコードする配列で置換することにより、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８４）８１：６８５１、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を共有結合させることにより、改変されてよい。そのようにして、標的抗原の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体などの、遺伝的に改変された抗体を、作製できる。
「キメラ抗体」の産生のために開発された技術は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：６８５１；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１２：６０４；ａｎｄ Ｔａｋｅｄａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（１９８４）３１４：４５２を参照されたい。
ヒト化抗体を構築するための方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，（１９８９）８６：１００２９－１００３３を参照されたい。一例では、親の非ヒト抗体の可変領域ＶＨおよびＶＬが、当該技術分野において既知の方法による三次元分子モデル分析に供される。次に、正確なＣＤＲ構造の形成に重要であると予測されるフレームワークアミノ酸残基を、同じ分子モデル分析を用いて特定する。並行して、親非ヒト抗体と相同であるアミノ酸配列を有するヒトＶＨおよびＶＬ鎖を、検索クエリとして親ＶＨおよびＶＬ配列を用いて、いずれかの抗体遺伝子データベースから特定する。ヒトＶＨおよびＶＬアクセプター遺伝子をその後、選択する。
選択されたヒトアクセプター遺伝子内のＣＤＲ領域を、親の非ヒト抗体由来のＣＤＲ領域またはその機能的バリアントで置換できる。必要に応じて、ＣＤＲ領域との相互作用において重要であると予測される親鎖のフレームワーク領域内の残基（上記記述を参照）を使用して、ヒトアクセプター遺伝子中の相当する残基と置換できる。
単鎖抗体は、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を連結することにより組換え技術を介して作製できる。好ましくは、フレキシブルリンカーが、２つの可変領域の間に組み込まれる。あるいは、単鎖抗体の産生のために報告されている技術（米国特許第４，９４６，７７８号および同第４，７０４，６９２号）を、ファージまたは酵母ｓｃＦｖライブラリーを作製するために適応でき、系統特異的抗原に特異的なｓｃＦｖクローンを、定型的な手順に従ってライブラリーから特定できる。陽性クローンを、さらなるスクリーニングに供して、系統特異的抗原を結合するものを特定できる。
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０）８７：２２６４－６８，の、改良されたＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９３）９０：５８７３－７７のアルゴリズムを用いて決定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９０）２１５：４０３－１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施して、本開示のタンパク質分子に相同的なアミノ酸配列を得ることができる。ギャップが２つの配列の間に存在する場合、ギャップＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（１９９７）２５（１７）：３３８９－３４０２で報告されているように使用できる。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータが、使用されてよい。
核酸およびベクター
本開示は、開示ポリペプチド、改変タンパク質または薬剤のいずれかをコードする核酸／ポリヌクレオチドを提供する。例えば、本明細書で記載のタンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチドは、例えば、組換え発現および精製のために提供される。いくつかの実施形態では、単離ポリヌクレオチドは、融合タンパク質または薬剤をコードする１種または複数の配列を含む。核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得る。核酸は、直鎖状または環状（プラスミドなどの）であり得る。核酸は、一本鎖、二本鎖であってよく、非核酸分子の連結により分岐されるまたは改変されてよい。核酸は、組換え技術により産生された核酸を含む。
特定の実施形態では、開示される改変されたタンパク質をコードする核酸は、コドン最適化される。コドン最適化の方法は、当技術分野において既知である。
特定の実施形態では、ａＣＤ３３－６ＤＭＰａ－ヒンジポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２３と少なくとも７０％同一である核酸配列（例えば、配列番号２３のアミノ酸配列と、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。
特定の実施形態では、ＵＬＢＰ１－６ＤＭＰｂ－ヒンジをコードする核酸は、配列番号２４と少なくとも７０％同一である核酸配列（例えば、配列番号２４のアミノ酸配列と、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。
特定の実施形態では、ａＣＤ３－６ＤＭＰｂポリペプチドをコードする核酸は、配列番号２５と少なくとも７０％同一である核酸配列（例えば、配列番号２５のアミノ酸配列と、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である核酸配列）を有する。
特定の実施形態では、核酸は、細胞中で融合ポリペプチドまたは薬剤を発現させるために効果的な隣接する調節配列と共に、開示されるポリペプチドまたは薬剤のためのコード配列を含むプラスミドＤＮＡである。隣接する調節配列の例は、転写を開始するのに十分なプロモーター配列および転写または翻訳の終止により遺伝子産物を終わらせるのに十分なターミネーター配列である。好適な転写または翻訳エンハンサーをベクター中に含めて、融合ポリペプチドまたは薬剤の発現をさらに支援できる。
いくつかの実施形態では、本明細書で記載の改変されたタンパク質のいずれかをコードするベクターは、例えば、組換え発現および精製のために提供される。いくつかの実施形態では、ベクターは、単離ポリヌクレオチド、例えば、本明細書で記載のものを含むか、または含むように改変される。通常、ベクターは、プロモーターに動作可能に連結された改変ポリペプチドまたはタンパク質または薬剤をコードする配列を含み、それにより改変されたタンパク質（または薬剤）は、宿主細胞中で発現される。
核酸は、発現ベクター中に含まれ得る。従って、例えば、１つの核酸配列が、１種または複数のポリペプチドを発現するための種々の発現ベクターのいずれか１個中に含まれてよく、２種以上の核酸が、１個の発現ベクター中に含まれてよい。あるいは、１個の遺伝子または核酸の一部が、別々のベクター中に含まれ得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、限定されないが、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０の誘導体、細菌性プラスミド、ファージＤＮＡ；バキュロウィルス、酵母プラスミド、プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせ由来のベクター、およびウィルスＤＮＡの誘導体）を含む。
本開示のベクターは、哺乳動物発現ベクターを用いる哺乳動物細胞中での１つまたは複数の配列の発現を駆動できる。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８７）３２９：８４０）、およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．（１９８７）６：１８７）を含む。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は通常、１つまたは複数の調節エレメントによって提供される。例えば、よく使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウィルス２、サイトメガロウィルス、サルウィルス４０、ならびに本明細書で開示される、および当該技術分野において既知の他のものに由来する。原核細胞および真核細胞の両方のための他の適切な発現系に関しては、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９の第１６章と第１７章、を参照されたい。
本開示のベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指示し得る（例えば、組織特異的調節エレメントが、核酸を発現させるために使用される）。このような調節エレメントは、組織特異的または細胞型特異的であり得るプロモーターを含む。用語「組織特異的」はプロモーターに適用される場合、目的のヌクレオチド配列の選択的発現を特定のタイプの組織に指示でき、異なるタイプの組織では目的の同じヌクレオチド配列の発現を相対的に欠く、プロモーターを指す。用語「細胞型特異的」はプロモーターに適用される場合、目的のヌクレオチド配列の選択的発現を特定の細胞型に指示でき、同じ組織内の異なる型の細胞では目的の同じヌクレオチド配列の発現を相対的に欠くプロモーターを指す。用語「細胞型特異的」はプロモーターに適用される場合、単一組織内の領域で目的のヌクレオチド配列の選択的発現を促進できるプロモーターも意味する。プロモーターの細胞型特異性は、当該技術分野において良く知られた方法、例えば、免疫組織化学染色を用いて評価され得る。
従来のウィルスおよび非ウィルスに基づく遺伝子移入方法を使用して、核酸を哺乳動物細胞または標的組織に導入できる。このよう方法を使用して、培養中の、または対象の細胞に本発明の薬剤／ポリペプチドをコードする核酸を投与できる。非ウィルス送達系は、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書で記載されるベクターの転写物）、ネイキッド核酸、および送達担体と複合体化された核酸を含む。ウィルスベクター送達システムは、ＤＮＡおよびＲＮＡウィルスを含み、これらは、細胞に送達後、エピソーム性のまたは統合されたゲノムを有する。
ウィルスベクターは、患者に直接的に投与され得る（インビボ）か、それらはインビトロまたはエクスビボで細胞を操作するために使用でき、改変された細胞が患者に投与され得る。一実施形態では、本開示は、限定されないが、遺伝子移送のためにレトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス、アデノ関連ウィルスおよび単純ヘルペスウィルスを含む、ウィルスをベースとした系を利用する。さらに、本開示は、レトロウィルスまたはレンチウィルスなどの、宿主ゲノム中での統合が可能なベクターを提供する。
本開示のベクターは、対象中の真核細胞に送達され得る。
本明細書で記載されるキメラタンパク質のいずれかは、組換え技術などの定型的方法によって調製できる。本明細書のキメラタンパク質を調製する方法は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合する抗原結合フラグメントおよびポリペプチドを含む、キメラタンパク質のそれぞれのフラグメント／ドメイン／を含むポリペプチドをコードする核酸の生成を含む。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質の構成要素のそれぞれをコードする核酸は、組換え技術を用いて共に連結される。
改変タンパク質の構成要素のそれぞれの配列は、当該技術分野において既知の様々な供給源のいずれか１種から定型的な技術、例えば、ＰＣＲ増幅によって得ることができる。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質の構成要素の１つまたは複数の配列は、ヒト細胞から得られる。あるいは、キメラタンパク質の１つまたは複数の構成要素の配列は、合成されてよい。それぞれの構成要素の配列（例えば、フラグメント／ドメイン／部分）を、ＰＣＲ増幅またはライゲーションなどの方法を用いて、直接的にまたは間接的に（例えば、ペプチドリンカーをコードする核酸を用いて）連結してキメラタンパク質をコードする核酸配列を形成できる。あるいは、キメラタンパク質をコードする核酸は、合成され得る。いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡである。他の実施形態では、核酸は、ＲＮＡである。
構成要素それぞれの配列を連結する前または後における、キメラタンパク質の１つまたは複数の構成要素（例えば、抗原結合フラグメントなど）内の１個または複数の残基の変異。いくつかの実施形態では、改変タンパク質の構成要素における１種または複数の変異が、標的に対する構成要素（例えば、標的抗原に対する抗原結合フラグメント）の親和性を調節する（増大させるまたは低下させる）および／または構成要素の活性を調節するために作製され得る。
本明細書で記載される改変タンパク質のいずれかは、従来技術による発現のために適切な免疫細胞中に導入できる。
改変タンパク質を発現させるために、改変タンパク質の安定なまたは一過性の発現のための発現ベクターが、本明細書で記載の従来法により構築され得る。例えば、キメラタンパク質をコードする核酸は、適切なプロモーターに操作可能な連結状態にあるウィルスベクターなどの、適切な発現ベクター中にクローニングされ得る。核酸およびベクターを、適切な条件下で制限酵素と接触させて、互いに対を形成しリガーゼで連結され得る各分子上の相補端を形成し得る。あるいは、合成核酸リンカーを、改変タンパク質をコードする核酸の末端に連結できる。合成リンカーは、ベクター中の特定の制限部位に対応する核酸配列を含み得る。発現ベクター／プラスミド／ウィルスベクターの選択は、キメラタンパク質発現のための宿主細胞のタイプに依存するが、真核細胞中での統合および複製に適しているべきである。
様々なプロモーターが、本明細書で記載される改変タンパク質の発現のために使用されてよく、限定されないが、サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）中初期プロモーター、ラウス肉腫ＬＴＲ、ＨＩＶ－ＬＴＲ、ＨＴＬＶ－１ ＬＴＲ、モロニーマウス白血病ウィルス（ＭＭＬＶ）ＬＴＲ、骨髄増殖性肉腫ウィルス（ＭＰＳＶ）ＬＴＲ、脾フォーカス形成ウィルス（ＳＦＦＶ）ＬＴＲなどのウィルスＬＴＲ、サルウィルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、単純ヘルペスｔｋウィルスプロモーター、ＥＦ１－αイントロンを含有または非含有伸長因子１－α（ＥＦ１－α）プロモーターを含む。キメラタンパク質の発現用の追加プロモーターは、任意の常時活性型のプロモーターを含む。あるいは、任意の調節可能プロモーターが、その発現が調節され得るように、使用されてよい。
さらに、ベクターは、例えば、次記の一部または全てを含み得る：宿主細胞中の安定なまたは一過性の形質移入体の選択のためのネオマイシン遺伝子などの、選択可能マーカー遺伝子；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの最初期遺伝子由来のエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡ安定性のためのＳＶ４０由来の転写終止およびＲＮＡプロセッシングシグナル；高発現遺伝子様α－グロビンまたはβ－グロビン由来のｍＲＮＡ安定性および翻訳効率のための５’－および３’－非翻訳領域；適切なエピソーム複製のためのＳＶ４０ポリオーマ複製起点およびＣｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、汎用複数クローニング部位クローニング部位；センスおよびアンチセンスＲＮＡのインビトロ転写のためのＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーター；起動されると、ベクターを保持する細胞の死滅を引き起こす「自殺スイッチ」または「自殺遺伝子」（例えば、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ｉＣａｓｐ９などの誘導型カスパーゼ）、およびキメラタンパク質の発現を評価するためのレポーター遺伝子。以下のセクションＶＩを参照されたい。適切なベクターおよび導入遺伝子を含むベクターを作製するための方法は、当該技術分野においてよく知られており利用可能である。キメラタンパク質の発現のためのベクターの調製の例は、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０１０６４４９号で見つけることができる。
いくつかの実施形態では、改変タンパク質または上記改変タンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、上記改変タンパク質をコードする核酸は、ＤＮＡベクターである。いくつかの実施形態では、改変タンパク質をコードする核酸は、ＲＮＡ分子である。
本明細書で記載される改変タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターのいずれかはまた、本開示の範囲内に入る。このようなベクターは、適切な方法によって宿主細胞中に送達され得る。ベクターを細胞に送達する方法は、当該技術分野において周知であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはトランスポゾンエレクトロポレーション、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはトランスポゾンを送達するリポソームまたはナノ粒子などの遺伝子導入試薬；機械的変形によるＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはトランスポゾンまたはタンパク質の送達（例えば、Ｓｈａｒｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０１３）１１０（６）：２０８２－２０８７を参照）；またはウィルス形質導入を含み得る。いくつかの実施形態では、キメラタンパク質の発現のためのベクターは、ウィルス形質導入によって宿主細胞に送達される。送達のための例示的なウィルス法は、限定されないが、組換えレトロウィルス（例えば、国際公開第９０／０７９３６号、同９４／０３６２２号、同９３／２５６９８号、同９３／２５２３４号、同９３／１１２３０号、同９３／１０２１８号、同９１／０２８０５号、米国特許第５，２１９，７４０号および同第４，７７７，１２７号、ＧＢ特許第２，２００，６５１号、および欧州特許第０３４５２４２号を参照）、アルファウィルスベースベクター、およびアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、国際公開第９４／１２６４９号、同９３／０３７６９号、同９３／１９１９１号、同９４／２８９３８号、同９５／１１９８４号および同９５／００６５５号を参照）を含む。いくつかの実施形態では、発現用ベクターは、レトロウィルスである。いくつかの実施形態では、発現用ベクターは、レンチウィルスである。いくつかの実施形態では、発現用ベクターは、アデノ随伴ウィルスである。
改変タンパク質をコードするベクターがウィルスベクターを用いて宿主細胞に導入される例では、細胞に感染できかつベクターを有するウィルス粒子が、当該技術分野において知られておりかつ例えば、国際公開第１９９１／００２８０５Ａ２号、同１９９８／００９２７１Ａ１号、および米国特許第６，１９４，１９１号で見つけることができる、いずれかの方法により産生され得る。ウィルス粒子は、細胞培養上清から収集され、ウィルス粒子を細胞と接触させる前に単離および／または精製され得る。
治療的方法
本開示改変タンパク質のいずれかは、造血器悪性腫瘍などの状態を治療するために、対象に投与され得る。さらに、本開示の改変タンパク質をコードする核酸／ポリヌクレオチド／ベクターのいずれかは、造血器悪性腫瘍などの状態を治療するために、対象に投与され得る。さらに、開示される改変タンパク質または開示される改変タンパク質をコードする核酸／ポリヌクレオチド／ベクターのいずれかは、造血器悪性腫瘍などの状態を治療するために、対象に投与され得る。本明細書で使用される場合、「対象」、「個体」、および「患者」は同じ意味で用いられ、脊椎動物、好ましくはヒトなどの哺乳動物を指す。哺乳動物は、限定されないが、ヒト霊長類、非ヒト霊長類、あるいはネズミ、ウシ、ウマ、イヌまたはネコ種を含む。いくつかの実施形態では、対象は、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者である。
いくつかの実施形態では、本発明のベクター、改変タンパク質または薬剤は、薬学的に許容可能な担体と混合されて医薬組成物を形成し得、これもまた本開示の範囲内にある。
本開示は、癌細胞に対して免疫応答を誘発するために好適なワクチンを提供する。本発明のワクチンを哺乳動物に投与することにより腫瘍増殖を阻害する方法も、記載される。
本組成物は、任意の好適な型の細胞に送達され得る、または任意の好適な型の細胞と接触するように投与され得る。細胞は、真核細胞であり得る。細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞または非ヒト哺乳動物細胞（例えば、非ヒト霊長類細胞）であってよい。これらは、米国ティッシュ・カルチャー・コレクションから得ることができる多数の細胞株を含む。特定の実施形態では、細胞は、腫瘍細胞である。
特定の実施形態では、細胞は、対象（例えば、哺乳動物）中に存在する。哺乳動物は、ヒトまたは非ヒト霊長類であり得る。非ヒト霊長類としては、限定されないが、チンパンジー、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが挙げられる。
特定の実施形態では、細胞は、取り出され、一次の、二次の、不死化されたまたは形質転換された状態で組織培養にて維持され得る。特定の実施形態では、細胞は、培養細胞または入手源（例えば、組織、臓器、対象など）から得られた新鮮な細胞である。哺乳動物細胞は、一次または二次であり得る。これは、それが、動物組織から得られた後の比較的短時間の間、培養物中で維持されたことを意味する。
本明細書で記載される方法を実施するために、本組成物の有効量が、治療を必要としている対象に投与され得る。本明細書で使用される場合、用語「有効量」は、用語「治療的有効量」と同じ意味で用いられ、それを必要としている対象への投与時に目的の活性を生ずるのに十分であるベクター、改変タンパク質、薬剤、または医薬組成物のその量を指す。本開示の文脈では、用語「有効量」は、本開示の方法によって治療される障害の少なくとも１つの症状の出現を遅延させる、進行を阻止する、緩和または軽減するのに十分である、ベクター、改変タンパク質、薬剤、または医薬組成物のその量を意味する。
有効量は、当業者により理解されるように、治療される特定の症状、症状の重篤度、個別患者の年齢、身体的状態、身長、性別および体重を含むパラメータ、治療期間、併用療法（実施される場合）の性質、投与の特定経路ならびに医療関係者の知識および見解における要因などに依存して変化する。いくつかの実施形態では、有効量は、対象におけるいずれかの疾患または障害の症状を軽減し、緩和し、回復し、改善し、低減し、または進行を遅延させる。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、造血器悪性腫瘍を有するヒト患者である。
いくつかの実施形態では、本組成物は、標的細胞（例えば、癌細胞）の数を少なくとも２０％、例えば、５０％、８０％、１００％、２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、１００倍またはそれより多く低減するのに有効な量で対象に投与される。
一実施形態では、本組成物は、初期投与量として対象（例えば、ヒト患者）に投与される。本組成物の１回または複数回のその後の投与は、以前の投与後に、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または２日の間隔で患者に提供され得る。本組成物の２回以上の投与量は、週当り、例えば、薬剤の２回、３回、４回、またはそれより多い投与で対象に投与できる。対象は、本組成物の週当り２回以上の投与、続いて薬剤の投与のない１週間、および最後に１回または複数回の追加の投与（例えば、本組成物の週当り２回以上の投与）を受けてもよい。本組成物は、２、３、４、５、６、７、８週、またはそれより多い週の間、１週当り３回の投与のため１日おきに投与され得る。
本開示の状況で、本明細書で記述される疾患症状のいずれかに関する限りにおいて、用語「治療する」、「治療」、および同様の用語は、このような状態と関連する少なくとも１つの症状を緩和または軽減する、あるいはこのような状態の進行を遅延または回復させることを意味する。本開示の意味内で、用語「治療する」はまた、発症（すなわち、疾患の臨床症状の前の期間）を停止させる、遅延させる、および／または疾患を発症するまたは悪化させるリスクを低減することも意味する。例えば、癌との関連で、用語「治療する」は、患者の腫瘍負荷量を除去するまたは低減する、あるいは転移を防止する、遅延する、または抑制することを意味し得る。
いくつかの実施形態では、本発明の改変タンパク質融合体は、標的を死滅させるために、細胞表面系統特異的抗原を発現する標的細胞を認識する（結合する）。
本発明の治療的方法の有効性は、当該技術分野におけるいずれか既知の方法によって評価され得、熟練医療専門家には自明であろう。例えば、治療の有効性は、対象の生存により、または対象あるいはその組織もしくは試料中の癌負荷量により評価され得る。いくつかの実施形態では、治療の有効性は、細胞の特定の集団または系統に属する細胞の数を定量することによって評価される。いくつかの実施形態では、治療の有効性は、細胞表面系統特異的抗原を提示する細胞の数を定量することによって評価される。
本組成物は、第２の療法と組み合わせて、対象に投与され得る。本組成物は、第２の療法の投与の前に投与され得る。いくつかの実施形態では、本組成物は、第２の療法の投与の少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月前、またはそれより前に投与される。
いくつかの実施形態では、第２の療法は、本組成物の投与の前に投与される。いくつかの実施形態では、第２の療法は、本組成物の投与の少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１１週、１２週、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月前、またはそれより前に投与される。
いくつかの実施形態では、本組成物および第２の療法は、実質的に同時に投与される。いくつかの実施形態では、本組成物が投与され、患者は、一定期間にわたり評価され、その後、第２の療法が投与される。いくつかの実施形態では、第２の療法が投与され、患者は、一定期間にわたり評価され、その後、本組成物が投与される。
また、本開示の範囲内に、本組成物の複数の投与（例えば、投与量）も含まれる。いくつかの実施形態では、本組成物は、１回対象に投与される。いくつかの実施形態では、本組成物は、２回以上（例えば、少なくとも２、３、４、５回、またはそれより多い回数）対象に投与される。いくつかの実施形態では、本組成物は、一定間隔で、例えば、６ヶ月ごとに、対象に投与される。
いくつかの実施形態では、対象は、造血器悪性腫瘍または血液学的新生物を有するヒト対象である。本明細書で使用される場合、造血器悪性腫瘍は、造血細胞（例えば、前駆体および幹細胞を含む血液細胞）を含む悪性異常を指す。造血器悪性腫瘍の例としては、限定されないが、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、白血病、または多発性骨髄腫が挙げられる。白血病としては、急性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病または慢性リンパ性白血病、および慢性リンパ性白血病が挙げられる。
造血器悪性腫瘍または新生物は、限定されないが、骨髄性悪性腫瘍、リンパ悪性腫瘍、悪性組織球症およびマスト細胞白血病を含む。
造血器悪性腫瘍は、骨髄悪性腫瘍であり得、骨髄性悪性腫瘍は、限定されないが、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患（ＭＤ／ＭＰＤ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む。
特定の実施形態では、骨髄性悪性腫瘍は、造血細胞の増殖における障害に関連する状態を指す。特定の実施形態では、骨髄性悪性腫瘍は、慢性および急性状態を含む骨髄血液系統を冒すクローン血液疾患を指す。骨髄性悪性腫瘍は、骨髄増殖性新生物、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病を含む。骨髄増殖性新生物は、原発性骨髄線維症（ＰＭＦ）、または本態性血小板血症（ＥＴ）であり得る。骨髄異形成症候群は、環状鉄芽球および血小板血症を有する不応性貧血（ＲＡＲＳ－Ｔ）であり得る。造血器悪性腫瘍は、限定されないが、骨髄増殖性疾患（ＭＰＤ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患（ＭＤ／ＭＰＤ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む。
リンパ悪性腫瘍は、限定されないが、Ｔ／ＮＫ細胞腫瘍、Ｂ細胞腫瘍およびホジキン病を含む。
いくつかの実施形態では、白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。ＡＭＬは、主要な分化および増殖制御経路を中断させる継続的に獲得された重大な遺伝子変化を有する形質転換細胞を起源とする、異質でクローン性の腫瘍疾患として特徴付けられる（Ｄｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１５）。ＣＤ３３糖タンパク質は、大部分の骨髄性白血病細胞で、ならびに正常骨髄および単球前駆体で発現され、ＡＭＬ療法の魅力的な標的であると考えられている（Ｌａｓｚｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ．（２０１４）２８（４）：１４３－５３）。抗ＣＤ３３モノクローナル抗体ベースの治療法を用いる臨床試験は、標準的な化学療法と組み合わされた場合、ＡＭＬ患者のサブセットで生存の改善を示したが、これらの効果は、安全性および有効性の懸念も伴った。
代わりに、または追加して、本明細書で記載される方法は、限定されないが、肺癌、耳、鼻、および咽頭癌、結腸癌、メラノーマ、膵臓癌、乳癌、前立腺癌、乳癌、卵巣癌、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、乳癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼の癌、頭頸部癌、胃癌、上皮内新生物、腎臓癌、咽頭癌、肝臓癌、線維腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば、唇、舌、口、および咽頭）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、腎臓癌、呼吸器系の癌、肉腫、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮癌、泌尿器系の癌、ならびに他の癌腫および肉腫を含む、非血液癌を治療するために使用され得る。
癌腫は、上皮由来の癌である。本開示の方法による治療が意図される癌腫としては、限定されないが、腺房癌腫、小葉癌腫、濾胞状腺癌腫（腺嚢癌腫、腺筋上皮腫、篩状癌腫および円柱腫とも呼ばれる）、腺腫性癌腫、腺癌腫、副腎皮質癌腫、肺胞癌腫、肺胞細胞癌腫（細気管支癌腫、肺胞細胞腫瘍および肺腺腫症とも呼ばれる）、基底細胞癌腫（ｂａｓａｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、基底細胞癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｂａｓｏｃｅｌｌｕｌａｒｅ）（バサローマ、またはバシローマ、および毛母癌腫とも呼ばれる）、類基底細胞癌腫、基底扁平上皮癌腫、乳癌腫、気管支肺胞上皮癌腫、細気管支癌腫、気管支原性癌腫、大脳様癌腫、胆管細胞癌腫（胆管癌腫および胆管細胞癌腫とも呼ばれる）、絨毛癌腫、膠様癌腫、面皰癌腫、子宮体部癌腫、篩状癌腫、鎧状癌腫、皮膚癌腫、円柱上皮癌腫、円柱細胞癌腫、腺管癌腫、硬性癌腫、胚性癌腫、脳様癌腫、上眼球癌腫、類表皮癌腫、腺様上皮癌腫、繊維癌腫、膠様癌腫、膠様癌腫、巨細胞癌腫、巨細胞癌腫、腺癌腫、顆粒膜細胞癌腫、毛母癌腫、血様癌腫、肝細胞癌腫（肝細胞腫、悪性肝細胞癌腫および肝臓癌腫とも呼ばれる）、ヒュルトレ細胞癌腫、硝子様癌腫、副腎様癌腫、乳児胎児性癌腫、上皮内癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ｓｉｔｕ）、表皮内癌腫、上皮内癌腫（ｉｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、クロムペッヘル癌腫、クルチツキー細胞癌腫、レンズ状癌腫（ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、レンズ状癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｌｅｎｔｉｃｕｌａｒｅ）、脂肪性癌腫、リンパ上皮癌腫、乳腺癌腫、髄様癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｄｕｌｌａｒｅ）、髄様癌腫（ｍｅｄｕｌｌａｒｙ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、黒色癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｅｌａｎｏｄｅｓ）、黒色癌腫（ｍｅｌａｎｏｔｉｃ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液性癌腫、粘液分泌癌腫、粘液細胞癌、粘表皮癌腫、粘液癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｕｃｏｓｕｍ）、粘液性癌腫（ｍｕｃｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、粘液腫様癌腫、上咽頭癌腫、黒色癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｎｉｇｒｕｍ）、燕麦細胞癌腫、骨化性癌腫、類骨癌腫、卵巣癌腫、乳頭癌腫、門脈周囲癌腫、前浸潤癌腫、前立腺癌腫、腎臓の腎細胞癌腫（腎臓腺癌腫および副腎様癌腫とも呼ばれる）、予備細胞癌腫、肉腫様癌腫、シュナイダー癌腫（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒｉａｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、硬性癌腫、陰嚢癌腫、印環細胞癌腫、単純癌腫、小細胞癌腫、ソラノイド癌腫、回転楕円面細胞癌腫、紡錘細胞癌腫、海綿様癌腫、扁平上皮癌腫（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮細胞癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、紐癌腫、毛細管拡張性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｔｉｃｕｍ）、毛細管拡張性癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔｏｄｅｓ）、移行上皮癌腫、結節癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、結節癌腫（ｔｕｂｅｒｏｕｓ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、疣状癌腫、絨毛癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｖｉｌｏｓｕｍ）が挙げられる。
肉腫は、骨および軟組織に生じる間葉性新生物である。種々の型の肉腫が認められており、これらは、脂肪肉腫（粘液様脂肪肉腫および多形性脂肪肉腫など）、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍（悪性神経鞘腫、神経線維肉腫、または神経原性肉腫とも呼ばれる）、ユーイング腫瘍（骨のユーイング肉腫、骨外（すなわち、非骨）ユーイング肉腫、および原始神経外胚葉性腫瘍［ＰＮＥＴ］を含む）、滑膜肉腫、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａｓ）、血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、カポジ肉腫、血管内皮腫、線維肉腫、類腱腫（侵襲性線維腫症とも呼ばれる）、隆起性皮膚線維肉腫（ＤＦＳＰ）、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、血管外皮細胞腫、悪性間葉腫、胞状軟部肉腫、類上皮肉腫、明細胞肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）（ＧＩ間質肉腫としても知られている）、骨肉腫（骨原性肉腫としても知られている）－骨格および骨外、ならびに軟骨肉腫を含む。
いくつかの実施形態では、治療される癌は、難治性癌であり得る。「難治性癌」は、本明細書で使用される場合、処方される標準治療に対して抵抗性である癌である。これらの癌は、最初は治療に応答性であるように見え（およびその後再発する）、またはそれらは、治療に完全に非応答性である場合もある。通常の標準治療は、癌型、および対象における進行度合いに応じて変わる。それは化学療法、または手術、または放射線照射、あるいはこれらの併用であり得る。当業者は、このような標準治療を承知している。難治性癌について本開示に従い治療される対象は従って、これらの癌に対し別の治療を既に受けたことがあり得る。あるいは、癌がおそらく難治性である場合（例えば、癌細胞の分析または対象の病歴を考慮して）、対象は、別の治療を以前に受けていない場合がある。難治性癌の例は、限定されないが、白血病、メラノーマ、腎細胞癌腫、結腸癌、肝臓癌（肝癌）、膵臓癌、非ホジキンリンパ腫および肺癌を含む。
本明細書で記載の本発明のベクター、改変タンパク質または薬剤のいずれかは、医薬組成物として、薬学的に許容可能な担体または賦形剤中で投与され得る。
本開示の組成物および／または細胞と関連して使用される表現「薬学的に許容可能な」は、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与される場合、生理学的に耐容性であり、不都合な反応を一般的に生じないような組成物の分子実体または他の原料を指す。好ましくは、本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な」は、哺乳動物、より好ましくはヒトで使用するために、連邦または州政府の規制当局によって承認されている、あるいは米国薬局方または他の一般的に認められている薬局方に収載されていることを意味する。「許容可能な」は、担体が組成物の有効成分（例えば、核酸、ベクター、細胞、または治療用抗体）と適合性であり、組成物が投与される被検体に負の影響を及ぼさないことを意味する。本方法で使用される医薬組成物および／または細胞のいずれかは、凍結乾燥された配合物または水溶液の形態で薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤を含み得る。
緩衝液を含む、薬学的に許容可能な担体は、当該技術分野において良く知られており、リン酸、クエン酸、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；アミノ酸；疎水性ポリマー；モノサッカライド；ジサッカライド；他の炭水化物；金属錯体；および／または非イオン性界面活性剤を含み得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒを参照されたい。
キット
また、本開示の範囲内に、本発明の改変タンパク質、薬剤、ベクターおよび／または組成物の使用のためのキットも含まれる。このようなキットは、本発明の改変タンパク質、薬剤、ベクター、および／または組成物を含む１種または複数の容器を含み得る。
本開示のいくつかの態様は、本発明の改変タンパク質または薬剤を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本発明の改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、組換えタンパク質の発現のためのベクターを含み、ベクターは、本発明の改変タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、本発明の改変タンパク質を発現するための遺伝子構築物を含む、細胞を含む。いくつかの実施形態では、キットは、賦形剤およびキットを使用するための説明書を含む。いくつかの実施形態では、賦形剤は、薬学的に許容可能な賦形剤である。
いくつかの実施形態では、キットは、本明細書で記載される方法のいずれかでの使用のための使用説明書を含み得る。含まれる使用説明書は、対象において目的の活性を達成するための、対象への医薬組成物の投与の説明を含み得る。キットは、対象が本治療を必要とするかどうかを特定することに基づく治療に適した対象の選択についての説明をさらに含む。いくつかの実施形態では、説明書は、治療を必要とする対象に第１および第２の医薬組成物を投与することに関する説明を含む。
本明細書で記載される医薬組成物の使用に関する説明書は通常、目的の治療のための投与量、投与計画、および投与経路についての情報を含む。容器は、単位用量、大量包装（例えば、複数回投与用包装）または分割単位用量であり得る。本開示のキットに添付される使用説明書は一般的には、ラベルまたは添付文書に記載された説明である。ラベルまたは添付文書は、医薬組成物が対象における疾患または障害を治療する、発症を遅延させる、および／または緩和するために使用されることを示す。
本明細書で提供されるキットは、適切に包装されている。適切な包装は、限定されないが、バイアル、ボトル、ジャー、フレキシブルパッケージングなどを含む。吸入器、鼻腔投与デバイス、または注入容器などの特定のデバイスと併せて使用するための包装もまた考えられる。キットは、無菌のアクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺可能な栓を有する静脈用溶液バッグまたはバイアルであり得る）。容器もまた、無菌アクセスポートを有し得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、上記キットの内容物を含む製品を提供する。
いくつかの実施形態では、製剤の個別成分を、１つの容器で提供できる。あるいは、製剤の成分を２個以上の容器に別々に収容して提供するのが望ましい場合がある。異なる成分を、例えば、キットと共に提供される説明書に従って、組み合わせることができる。成分は、例えば、医薬組成物を調製するおよび投与するために、本明細書で記載の方法に従って組み合わせることができる。
本発明の改変されたタンパク質、薬剤、ベクター、または組成物は、任意の形態、例えば、液体の、乾燥されたまたは凍結乾燥された形態で提供できる。
実施例
本発明の好ましい実施形態をより完全に説明するために提示される、次記の非限定的実施例を参照することにより、本発明は、より良く理解されるであろう。これらの実施例は、いかなる観点からも、本発明の広い範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
実施例１－改変ヘテロダイマータンパク質の構築
最初に、ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターを、ａＣＤ３３－ＵＬＢＰ１改変ヘテロダイマータンパク質のために使用した。全ての構築物は、完成したタンパク質の細胞上清への排出を誘発するためにＮ末端ＩＬ２分泌シグナル、ならびに精製および標識を促進するためにＣ末端ｍｙｃタグおよび６ｘＨｉｓタグを利用した。２つの構築物では、ＵＬＢＰ１がＩＬ２シグナルに隣接して続き、その後に、リンカーおよび次に、ａＣＤ３３のＶＨおよびＶＬ領域が続く。別の構築物では、１つの方向が好ましいかどうかを決定するために、ａＣＤ３３がＵＬＢＰ１に先行する。さらに、ａＣＤ３３－ｓｃＦｖまたはＵＬＢＰ１単独について構築物を開発した。
Ｍｉｒｕｓ ＴｒａｎｓＩＴ－２９３遺伝子導入試薬を介する発現が、遺伝子導入ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞の上清中の６ｘＨｉｓタグ付きタンパク質の精製後にＭｙｃについてのウェスタンブロット検出、ならびに細胞質タンパク質のＭｙｃ検出を用いて確認された。実施例２および図１２を参照されたい。
６ＤＭＰａ－モノマーを、上に列挙される抗ＣＤ３３、ＧＦＰ、および関連タグ（６ｘＨｉｓおよびｍｙｃ）に融合した。６ＤＭＰｂモノマーを、ＵＰＢＰ１、ＲＦＰ、および６ｘＨｉｓおよびＦＬＡＧタグに融合して、６ＤＭＰａ－ｍｙｃとは無関係に精製を促進した（および別の共免疫沈降実験を可能にした）。
ＵＬＢＰ１－６ＤＭＰｂ構築物のものに適合するタグを有する、６ＤＭＰｂに抗ＣＤ３を付着させる改変タンパク質をコードするｐｃＤＮＡ３．１プラスミドも、作製した（図１０）。この手法では、ＣＤ３＋Ｔ細胞は、関連エフェクター細胞としてＮＫ細胞を置換し、従って６ＤＭＰｂが、抗ＣＤ３促進物質を抗ＣＤ３３ターゲティング部分に結合するために付着された。抗ＣＤ３配列を、ＡｍｇｅｎのＣＤ３－ＣＤ１９ ＢｉＴＥブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）から取得し、以前に使用した同じリンカー（Ｋｕｆｅｒ ｅｔ ａｌ．２０１７）を介して６ＤＭＰｂに融合した。これを、ａＣＤ３３－６ＤＭＰａと共発現させ共免疫沈降させて、ヘテロダイマー化を確認した。構築物を、細菌またはレンチウィルスベクターに挿入して、上述の高産物タンパク質発現法を作り出した。
これらのデザインに対する最新の改変は、ＩｇＧ２のヒンジ領域を含んだ。１２個の総残基にわたり４個のジスルフィド架橋を形成する４個のシステイン残基を有して、６ＤＭＰベースキメラのＣ末端に付加されたヒンジ領域は、ヘテロダイマーの結合を強化し解離を妨げると予測された（Ｗｙｐｙｃｈ ｅｔ ａｌ．２００８）。同一のＩｇＧ２ヒンジが従って、６ＤＭＰａ／ｂに続きおよび精製タグに先行して各構築物に付加された（図１および１０）。構築物は、このヒンジを直接に付加する、またはこのヒンジを短いリンカーの後に付加するようにデザインされた。
全ての構築物を、モンゴルキヌゲネズミ（チャイニーズハムスター）中での発現のためにコドン最適化された、アンピシリン耐性を有するｐｃＤＮＡ３．４－ＴＯＰＯベクターから発現させた。図１１を参照されたい。
ポリペプチド／タンパク質を発現させるために、アミノ酸配列を逆翻訳して、ＤＮＡ配列を得て、これをその後、コドン最適化した（配列番号２３～２５）。
タンパク質を、リポフェクタミン３０００を用いて製造業者のプロトコルの修正版に従い発現させた。
・ａＣＤ３３－６ＤＭＰａ－ヒンジを、ａＣＤ３－６ＤＭＰｂ－ヒンジまたはＵＬＢＰ１－６ＤＭＰｂ－ヒンジと同じディッシュで共発現させた。
・タンパク質を、１５ｃｍの組織培養物処理したディッシュ中のＣＨＯ－Ｋ１細胞で産生した。
１０～１２ｘ１０６個の細胞を、３７℃、５％ＣＯ２下で遺伝子導入の前日に培養した。
プレート当りの試薬体積は、以下の通りであった：
１３５ｕｌのリポフェクタミン３０００
４０ｕｇの各プラスミド（ａＣＤ３３－６ＤＭＰａ－ヒンジおよびａＣＤ３－６ＤＭＰｂ－ヒンジ）
１６０ｕｇのＰ３０００試薬（２ｕＬ／ｕｇ ＤＮＡ）
上清を、遺伝子導入の３～４日後に収集した
・細胞培養上清を、ＴＡＬＯＮ Ｍｅｔａｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｒｅａｓｏｎ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ）を用いて、のＨｉｓタグ含有タンパク質（ａＣＤ３３－６ＤＭＰａ－ヒンジおよびａＣＤ３－６ＤＭＰｂ－ヒンジ）について精製した。
４００ｕＬの懸濁レジン（２００ｕＬのペレット化レジン）を、２０ｍＬの上清当り使用した
典型的には、５個のプレートを、一度に使用し、２つの５０ｍＬバッチを得、それぞれは、５００ｕＬの洗浄され平衡化されたレジンを受けた
製造業者のプロトコルに従い、ＨｉｓＴＡＬＯＮ緩衝液の代わりに次の緩衝液を使用した：
洗浄剤緩衝液：ＴＢＳＴ－トリス ２０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、０．１％ツイーン２０；
平衡化緩衝液：トリス ２０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、５ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのＰＭＳＦ；
溶出緩衝液：ＮａＣｌ １５０ｍＭ、１ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４－７Ｈ２Ｏ、１５０ｍＭのイミダゾール
上清およびレジンを、洗浄および溶出の前に４℃で３０分間回転させた
・５００ｕＬのダイマー結合ビーズを、最終体積約７．５ｍＬに溶出緩衝液で３ｘ溶出した
７．５ｍＬのタンパク質含有溶出緩衝液を、ＰＢＳで２０ｍＬの最終体積に希釈した
２０ｍＬのタンパク質含有緩衝液を、製造業者のプロトコルに従い、Ｐｉｅｒｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ＰＥＳ（３０ｋ分画分子量、５～２０ｍＬサイズ）を用いて濃縮した。
濃縮後に、試料を、ＰＢＳで１０～２０ｍＬに再度希釈し、もう一度濃縮した。
３０ｋ分画分子量カットオフは、大部分のダイマーを上段チャンバー中に保持するのに十分に大きいが、より小さいモノマーのほとんどを廃棄用下段チャンバーに通過させる。
・濃縮タンパク質を、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用いて定量した。
試料を、ＰＢＳで０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、使用するまで－２０℃で凍結した。
上記プロトコルを用いて、第３の改変ヘテロダイマータンパク質が、図３および２３Ａ、および図５および２３Ｂに示す構築物を用いて作製される。
実施例２－改変ヘテロダイマータンパク質の発現
２９３Ｔ細胞中での抗ＣＤ３３－ＵＬＢＰ１改変ヘテロダイマータンパク質の発現を、下記のプロトコルを用いて試験した。モック遺伝子導入された（プラスミドなし）または抗ＣＤ３３－ＵＬＢＰ１キメラ１および２プラスミドを遺伝子導入された２９３Ｔ細胞（実施例１に記載されるように）、および細胞ペレットを、２Ｘ ＳＤＳゲルローディングバッファー中で溶解した。溶解物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードし、分離されたタンパク質を、ナイロン膜に転写した。膜を、抗ＭＹＣ抗体で調べてＣＤ３３－ＵＬＢＰ１を検出し、抗βアクチンで調べてアクチンタンパク質（ローディング対照）を検出した。膜をまた、蛍光色素コンジュゲート二次抗体で調べて（抗ＭＹＣを検出する赤色、抗βアクチンを検出する緑色）、一次抗体を検出した。
図１２Ａに示すように、遺伝子導入細胞由来の溶解物をロードしたレーンは、ヘテロダイマータンパク質を示す検出可能なｍｙｃタンパク質を有した。
２９３Ｔ細胞の上清中の抗ＣＤ３３－ＵＬＢＰ１改変ヘテロダイマータンパク質の発現も、下記のプロトコルを用いて試験した。モック遺伝子導入された（プラスミドなし）または抗ＣＤ３３－ＵＬＢＰ１キメラ１および２プラスミドを遺伝子導入された２９３Ｔ細胞の上清を、Ｔａｌｏｎビーズを用いるアフィニティー精製に供した。溶解試料、通過画分、および精製タンパク質（溶離液）を次に、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで分離し、ナイロン膜に転写した。膜を、抗ＭＹＣ抗体で調べて、検出した。膜をまた、蛍光色素コンジュゲート二次抗体（抗ＭＹＣを検出する赤色）で調べて一次抗体を検出した。図１２Ｂに再度示すように、遺伝子導入細胞由来の上清をロードしたレーンは、ヘテロダイマータンパク質を示す検出可能なｍｙｃタンパク質を有した。
実施例１に列挙され記載されたキメラを遺伝子導入したＣＨＯ－Ｋ１細胞由来の細胞培養上清またはＴＡＬＯＮレジンからの溶出液を、２Ｘ ＳＤＳローディングバッファーに加え、加熱し、ＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで泳動させた。タンパク質を、ＰＶＤＦ膜に転写し、抗ＭＹＣ抗体で調べて抗ＣＤ３３－６ＤＭＰａ－ヒンジ－ＭｙｃＨｉｓを検出し、および抗ＦＬＡＧ抗体で調べてＵＬＢＰ１－６ＤＭＰｂ－ヒンジ－ＦＬＡＧＨｉｓまたは抗ＣＤ３－６ＤＭＰｂ－ＦＬＡＧＨｉｓを検出した。蛍光色素コンジュゲート二次抗体を用いて、抗Ｍｙｃおよび抗ＦＬＡＧ抗体を検出した（それぞれ、緑色および赤色）。
図１３に示すように、細胞は、ヘテロダイマータンパク質を示す検出可能なｍｙｃまたはフラグタンパク質を有した。
実施例３－結合実験
改変ヘテロダイマータンパク質の結合を、下記のプロトコルを用いて試験した：
５０ｕＬのＦＡＣＳバッファー中の再懸濁した５０ｋ細胞
５０ｕＬの改変ヘテロダイマータンパク質を加え、３０分間インキュベートした
洗浄
抗ＭＹＣ－ＦＩＴＣまたは抗ＦＬＡＧーＰＥ中で再懸濁し、３０分インキュベートした
結果は、精製された改変ヘテロダイマータンパク質とインキュベートし、その後、抗ＦＬＡＧ ＦＩＴＣ抗体とインキュベートしたＨＬ６０細胞において、両構築物の結合が存在したことを示した（図１４Ａ）。ＨＬ６０細胞が構築物とインキュベートされ、その後、抗ＭＹＣ ＦＩＴＣ抗体とインキュベートされた場合、９９％超の結合が、各構築物ならびにＣＤ３３構築物単独で認められ、ＣＤ３３構築物が細胞表面ＣＤ３３に十分に結合し、かつＣＤ３またはＵＬＢＰコンジュゲートにより破壊されなかったことを示す（図１４Ｂ）。
類似の結果を、改変タンパク質のＨＬ６０細胞、ジャーカット細胞およびＰＭＢＣに対する結合に関し図１５～１７にまとめる。
実施例４－改変ヘテロダイマータンパク質の細胞傷害活性
改変ヘテロダイマータンパク質のＮＫおよびＣＤ３インビトロ細胞傷害活性を、下記の一般プロトコルを用いて評価した：
１．凍結ヒトＰＢＭＣから、ＣＤ３＋細胞傷害性Ｔ細胞を、ＲＥＡｌｅａｓｅ ＣＤ３ ＭｉｃｒｏＢｅａｄキットを用いて選択した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ活性化剤 ＣＤ３／ＣＤ２８を直後に使用して、Ｔ細胞を１週間活性化した。
２．選択および活性化の１週間後に、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを、Ｔ細胞から取り出した。
３．ＭＯＬＭ１４－ｄＴｏｍａｔｏ－ルシフェラーゼ細胞（ＡＭＬ細胞株）およびＴ細胞を、計数した（上記を参照）。ＲＰＭＩ（＋２０％ウシ胎仔血清、１％ペニシリンス－トレプトマイシン）中、１：５（１０，０００個のＭＯＬＭ１４細胞と５０，０００個のＴ細胞）の比率で共培養した。
４．新たに解凍したキメラタンパク質（例えば、種々の濃度の抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３改変ヘテロダイマー）を、各ウェルに加えた。
５．３７℃、５％ＣＯ２下で一晩培養した。
６．プレートを遠心分離し（５００ｒｐｍ、５分）、上清を除去した。
７．２００ｕＬのＦＡＣＳバッファー（１％ＦＢＳ、１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳ）で洗浄した。
８．プレートを遠心分離し（５００ｒｐｍ、５分）、上清を除去した。
９．１００ｕＬのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁し、０．１ｕｇ／ｍＬの最終濃度へとＤＡＰＩを加えた。
１０．ＦＡＣＳ分析に進めた；単細胞にゲートを設定し、標的細胞を、ＰＥ＋ＤＡＰＩ＋（ＰＥチャネルのＭＯＬＭ１４ ＡＭＬ細胞中のｄＴｏｍａｔｏ、ＤＡＰＩチャネルの死細胞）として特定した。図１８Ａを参照されたい。
１１．ベースラインとして ＭＯＬＭ１４およびＴ 細胞（ダイマーなし）を含むウェルを考慮して、Ｔ細胞＋ダイマー群のＰＥ＋細胞中のＤＡＰＩ＋細胞の％を比較した。％細胞死を、下記の式に従って、ダイマー治療なしで共インキュベートしたＴ細胞およびＭＯＬＭ１４細胞を含む対照群に正規化した：
［（Ｔ細胞およびダイマーからの死）－（Ｔ細胞単独からの死）］／［１００－（Ｔ細胞単独からの死）］＊１００
一実験では、ＭＯＬＭ１４－ｄＴｏｍａｔｏ細胞を、５：１比率のＴ細胞（エフェクター）を含む、種々の量の抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３ヘテロダイマー（１０ｎｇ、１００ｎｇ、１μｇおよび１０μｇ）、ならびに対照（ヘテロダイマーなし、Ｔ細胞なし）および１０μｇのヘテロダイマーのみ、および５：１のＴ細胞のみと２４時間インキュベーションした。
図１８Ｂに示すように、細胞傷害性は、対照、ダイマー単独でまたはＴ細胞単独に比べて、Ｔ細胞（エフェクター細胞）を含む全ての投与量のヘテロダイマーで認められ、抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３ヘテロダイマーは、用量依存的にエフェクターＴ細胞によるＣＤ３３発現標的細胞（ＭＯＬＭ１４）の殺作用を高めた。
上記プロトコルを用いたさらなる実験では、ＰＢＭＣから選択された活性化Ｔ細胞（ＣＤ３＋）を、３種の濃度での抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３ヘテロダイマーの存在下で、１６時間ＣｅｌｌＴｒａｃｅ ＶｉｏｌｅｔＤ３３発現ＨＬ－６０標的細胞と共インキュベートした。インキュベーション後に、細胞を、７－ＡＡＤ細胞生存率測定用試薬で染色し、フローサイトメトリーを用いて解析した。図１９Ａを参照されたい。％細胞死を、下記の式に従い、ダイマー治療なしで共インキュベートされたＴ細胞およびＨＬ－６０細胞を含む対照群に正規化した：
［（Ｔ細胞およびダイマーからの死）－（Ｔ細胞単独からの死）］／［１００－（Ｔ細胞単独からの死）］＊１００
図１９Ｂに示すように、抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３ヘテロダイマーは、用量依存的にエフェクターＴ細胞によるＣＤ３３発現標的細胞（ＨＬ６０）の殺作用を高める。
追加の細胞毒性アッセイを、以下のように実施した。ＡＭＬ細胞（ＨＬ－６０）を、２４時間Ｔ細胞を含みまたは含まずにモノマーのＣＤ３もしくはＣＤ３３または抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３３ヘテロダイマーと共インキュベートし、生存率を、記載されるように７ＡＡＤを用いる生死染色およびフローサイトメトリーを用いて測定した。図２０の結果は、ヘテロダイマーは、ＡＭＬ細胞に対するエフェクター細胞（Ｔ細胞）細胞傷害活性を高めたが、モノマーは高めなかったことを示す。
さらなる用量依存性細胞毒性アッセイを、以下のように実施した：ＡＭＬ細胞（ＨＬ－６０）を、２４時間Ｔ細胞を含みまたは含まずに、示された量（３、３０、３００または３００００ｎｇのヘテロダイマー）の抗ＣＤ３－抗ＣＤ３３ヘテロダイマーと共インキュベートし、生存率を、記載されるように７ＡＡＤを用いる生死染色およびフローサイトメトリーを用いて測定した。
ＡＭＬ細胞に対するヘテロダイマーのエフェクター細胞の細胞傷害活性の用量依存性強化が認められた。３～３０００ｎｇでの抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３ヘテロダイマー単独（Ｔ細胞なし）による細胞傷害性の明らかな増大はなく、抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３ヘテロダイマーは単独で細胞傷害性を示さず、かつ細胞毒性効果はＴ細胞機能の強化により媒介されることを示唆する。図２１を参照されたい。
別の用量依存性細胞毒性アッセイを、以下のように実施した：ＡＭＬ細胞（ＨＬ－６０）を、２４時間各種比率のＴ細胞（エフェクター）（１：１、２：１、５：１、および１０：１のエフェクター：標的）を含む３００ｎｇの抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３ヘテロダイマーと共インキュベートし、生存率を、記載されるように７ＡＡＤを用いる生死染色およびフローサイトメトリーを用いて測定した。
細胞傷害性の用量依存性増大が、３００ｎｇのヘテロダイマーを用いて、５：１の比率のエフェクター：標的まで認められた。５：１および１０：１のエフェクター：標的の比率の間の細胞傷害性の明確な増大はなく、おそらく最大細胞傷害性に到達したためである。図２２を参照されたい。
全ての上記データは、ヘテロダイマーが機能的に活性であり、かつＡＭＬ細胞に対するＴ細胞細胞傷害性機能を高めたことを示唆する。このデータはまた、ヘテロダイマーの細胞傷害性が、ＭＯＬＭ１４細胞などのＣＤ３３のより高い発現を示す細胞中で増大されることも示す。図１９Ｂ対図１８Ｂを参照されたい。
実施例５－改変ヘテロダイマータンパク質のインビボ抗腫瘍活性
抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３改変ヘテロダイマータンパク質のインビボ活性を、下記のプロトコルを用いてマウスで試験した：全てのマウスは、２ｘ１０５個のＭＯＬＭ１４－ｄＴｏｍａｔｏ－ルシフェラーゼ細胞（ＡＭＬ細胞株）を受け、その後２日目に、下記のスケジュールに従い、１つの群は治療を受けず、１つの群は無負荷Ｔ細胞を受け（「無負荷Ｔ細胞」）、および１つの群は抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３改変ヘテロダイマータンパク質（Ｂｉｔｅ）を受けた（「負荷されたＴ細胞」）。
２日目：１００ｕｇの抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３改変ヘテロダイマータンパク質を含むまたは含まない１０００万個のＴ細胞；
６日目および１１日目：２００ｕｇの抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３改変ヘテロダイマータンパク質を含むまたは含まない２０００万個のＴ細胞；
１５日目および２０日目：４００ｕｇの抗ＣＤ３３－抗ＣＤ３改変ヘテロダイマータンパク質を含むまたは含まない４０００万個のＴ細胞。
７、１７および２４日目での、ＦＦｌｕｃ－ｄｔｏｍａｔｏ形質導入ＭＯＬＭ１４の増殖を監視するための生物発光画像法（ＢＬＩ）。図２４Ａを参照されたい。
マウスは、脊柱後湾、著しい体重減少、ひだ状皮膜（ｒｕｆｆｌｅｄ ｃｏａｔ）、四肢麻痺などの白血病関連の症状が１つまたは複数観察された場合、分析のために中断された。
図２４ＢおよびＣに示すように、負荷Ｔ細胞で治療されたマウスは、７日目および１７日目に、より少ない腫瘍量を有した。
さらに、負荷Ｔ細胞で治療されたマウスは、２種の対照群（治療なし、または無負荷Ｔ細胞）より良好に生存した。カプランマイヤー生存プロットを、各マウスについてＭＯＬＭ１４注入の日を開始日として、および死亡／中断の日を終了日として作成した。図２４Ｄを参照されたい。

参考文献
Ｂｅｎｃｉ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｕｍｏｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ａ Ｍｕｌｔｉｇｅｎｉｃ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ Ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ．” Ｃｅｌｌ．１６７（６）：１５４０－５４．２０１６．
Ｃｈａｍｕｌｅａｕ，ｅｔ ａｌ．“Ｈｉｇｈ ＩＮＤＯ（ｉｎｄｏｌｅａｍｉｎｅ ２，３－ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）ｍＲＮＡ ｌｅｖｅｌ ｉｎ ｂｌａｓｔｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉｃ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｐｒｅｄｉｃｔｓ ｐｏｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ．” Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．９３（１２）：１８９４－８．２００８．
Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒｓ．” Ｎａｔｕｒｅ ５６５：１０６－１１１．２０１９．
Ｄｏｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ（２０１５）３７３：１１３６．
Ｄｕｌｐｈｙ，ｅｔ ａｌ．Ａ．“Ｕｎｄｅｒｇｒｏｕｎｄ ａｄａｐｔａｔｉｏｎ ｔｏ ａ ｈｏｓｔｉｌｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｓ．ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ．” Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（９４）：１－１５．２０１６．
Ｅｌｉａｓ，ｅｔ ａｌ．“Ｉｍｍｕｎｅ ｅｖａｓｉｏｎ ｂｙ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．” Ｂｌｏｏｄ １２３（１０）：１５３５－４３．２０１４．
Ｋｒｕｐｋａ，ｅｔ ａｌ．“ＣＤ３３ ｔａｒｇｅｔ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ＡＭＬ ｂｌａｓｔｓ ｉｎ ｌｏｎｇ－ｔｅｒｍ ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｂｙ ｔｈｅ ｂｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ－ｅｎｇａｇｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＡＭＧ ３３０．” Ｂｌｏｏｄ．１２３：３５６－３６５．２０１４．
Ｋｕｆｅｒ，ｅｔ ａｌ．“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉ－ＣＤ３，ａｎｔｉ－ＣＤ１９ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｂ－ｃｅｌｌ ｒｅｌａｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．” Ｐａｔｅｎｔ ＣＡ２５２２５８６．２０１７．
Ｌｅ Ｄｉｅｕ，ｅｔ ａｌ．“Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＡＭＬ）ｐａｔｉｅｎｔｓ ａｔ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｈａｖｅ ａｂｎｏｒｍａｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｇｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｆｏｒｍ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｎａｐｓｅｓ ｗｉｔｈ ＡＭＬ ｂｌａｓｔｓ．” Ｂｌｏｏｄ １１４（１８）：３９０９－１６．２００９．
Ｌｏｗｅｎｂｅｒｇ，ｅｔ ａｌ．Ｄｕｔｃｈ－Ｂｅｌｇｉａｎ Ｈｅｍａｔｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ（ＨＯＶＯＮ）．，Ｇｅｒｍａｎ Ａｕｓｔｒｉａｎ ＡＭＬ Ｓｔｕｄｙ Ｇｒｏｕｐ（ＡＭＬＳＧ）．，Ｓｗｉｓｓ Ｇｒｏｕｐ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐ（ＳＡＫＫ）．“Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ ａｓ ｐｏｓｔｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｉｎ ＡＭＬ ａｔ ６０ ｙｅａｒｓ ｏｆ ａｇｅ ｏｒ ｍｏｒｅ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａ ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ ｐｈａｓｅ ３ ｓｔｕｄｙ．” Ｂｌｏｏｄ．１１５（１３）：２５８６－９１．２０１０．
Ｍａｓｔａｇｌｉｏ，ｅｔ ａｌ．“Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｌｉｇａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｉｍｐａｃｔｓ ｓｕｒｖｉｖａｌ ａｎｄ ｒｅｌａｐｓｅ ａｆｔｅｒ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ”．Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖ．２（４）：３３５－３４６．２０１８．
Ｍｕｎｄｙ－Ｂｏｓｓｅ，ｅｔ ａｌ．“Ａｃｕｔｅ Ｍｙｅｌｏｉｄ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ａｌｔｅｒｓ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｃｅｌｌ Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．” Ｂｌｏｏｄ．１２４（２１）：７５４．２０１４．
Ｎａｎｂａｋｈｓｈ，ｅｔ ａｌ．“ｃ－Ｍｙｃ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＮＫＧ２Ｄ ｌｉｇａｎｄｓ ＵＬＢＰ１／２／３ ｉｎ ＡＭＬ ａｎｄ ｍｏｄｕｌａｔｅｓ ｔｈｅｉｒ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ＮＫ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｌｙｓｉｓ”．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏ．１２３（２３）：３５８５－３５９６．２０１４．
Ｏｒｌｅａｎｓ－Ｌｉｎｄｓａｙ，ｅｔ ａｌ．“Ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋａｅｍｉａ ｃｅｌｌｓ ｓｅｃｒｅｔｅ ａ ｓｏｌｕｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｔｈａｔ ｉｎｈｉｂｉｔｓ Ｔ ａｎｄ ＮＫ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｂｕｔ ｎｏｔ ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ ｆｕｎｃｔｉｏｎ－ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｌｅｕｋａｅｍｉａ．” Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６（３）：４０３－１１．２００１．
Ｒｅｎｎｅｖｉｌｌｅ，ｅｔ ａｌ．“Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ｇｅｎｅ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｌｅｓｉｏｎｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＳＮＰ－ａｒｒａｙ ｋａｒｙｏｔｙｐｉｎｇ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｘｔ ｏｆ ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ＡＬＦＡ－０７０１ ｔｒｉａｌ．” Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．５（４）：９１６－９３２．２０１４．
Ｓｃｈｎｏｒｆｅｉｌ，ｅｔ ａｌ．“Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｌｙ ｎｏｔ ｉｍｐａｉｒｅｄ ｉｎ ＡＭＬ：ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ＰＤ－１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｓ ｏｎｌｙ ｓｅｅｎ ａｔ ｔｉｍｅ ｏｆ ｒｅｌａｐｓｅ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｈｉｆｔ ｔｏｗａｒｄｓ ｔｈｅ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ．” Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．８：９３．２０１５．
Ｓｈｅｎｇｈｕｉ，ｅｔ ａｌ．“Ｅｌｅｖａｔｅｄ ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ ｏｆ ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）ＣＤ１２７ｌｏ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｏ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．” Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．１２９（６）：１３７３－８１．２０１１．
Ｓｔｒｉｎｇａｒｉｓ，ｅｔ ａｌ．“Ｌｅｕｋｅｍｉａ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｆｅｃｔｓ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｆａｉｌｕｒｅ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｃｕｔｅ ｍｙｅｌｏｉｄ ｌｅｕｋｅｍｉａ．” Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．９９（５）：８３６－４７．２０１４．
Ｔｈｏｒｓｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ．” Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．４８（４）：８１２－３０．２０１８．
Ｗｙｐｙｃｈ．，ｅｔ ａｌ．“Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ２ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｓｏｆｏｒｍｓ．” Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８３：１６１９４－２０５．２００８．

Claims (24)

  1. 改変ヘテロダイマータンパク質であって、
    （ａ）系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよび第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；および
    （ｂ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチド
    を含み、
    前記第１および第２のポリペプチドが、前記共有結合ダイマー化ドメインを介して共有結合される、改変ヘテロダイマータンパク質。
  2. ＮＫ細胞上で発現される前記分子が、ＮＫＧ２Ｄであり、かつＮＫ細胞上で発現される分子を結合する前記ポリペプチドが、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、またはそれらの変異体またはフラグメントである、請求項１に記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  3. ＮＫ細胞上で発現される分子を結合する前記ポリペプチドが、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢの外部ドメインである、請求項２に記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  4. ＮＫ細胞上で発現される前記分子が、ＣＤ１６であり、かつＴ細胞上で発現される分子を結合する前記ポリペプチドが、ＣＤ１６のモノクローナル抗体である、請求項１に記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  5. 改変ヘテロダイマータンパク質であって、
    （ａ）系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインおよび第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド；および
    （ｂ）Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン、および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチド
    を含み、
    前記第１および第２のポリペプチドが、前記共有結合ダイマー化ドメインを介して共有結合される、改変ヘテロダイマータンパク質。
  6. Ｔ細胞上で発現される前記分子が、ＣＤ３であり、かつＴ細胞上で発現される分子を結合する前記ポリペプチドが、ＣＤ３のモノクローナル抗体である、請求項５に記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  7. 前記第１の共有結合ダイマー化ドメインおよび／または前記第２のダイマー化ドメインが、ＩｇＧ２ヒンジドメインを含む、請求項１～６のいずれかに記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  8. 前記第１の共有結合ダイマー化ドメインおよび／または前記第２のダイマー化ドメインが、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインをさらに含む、請求項７に記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  9. 前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチド中のアミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む前記非天然起源ポリペプチドドメインが、それぞれ、６ＤＭＰａおよび６ＤＭＰｂを含む、請求項１～８のいずれかに記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  10. 前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチド中のアミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む前記非天然起源ポリペプチドドメインが、それぞれ、６ＤＭＰｂおよび６ＤＭＰａを含む、請求項１～８のいずれかに記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  11. 前記系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ３３である、請求項１～１０のいずれかに記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  12. 前記抗原結合フラグメントが、単鎖抗体フラグメントである、請求項１～１１のいずれかに記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  13. 請求項１～１２に記載の改変ヘテロダイマータンパク質をコードする少なくとも１種のベクターを含む組成物。
  14. 請求項１３に記載の前記組成物を含むキット。
  15. 請求項１３に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象において造血器悪性腫瘍を治療する方法。
  16. 改変ヘテロダイマータンパク質であって、
    （ａ）Ｔ細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン（ａ１）、および第１の共有結合ダイマー化ドメインを含む第１のポリペプチド、
    （ｂ）系統特異的細胞表面抗原を結合する抗原結合フラグメント、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン（ｂ１）および第２の共有結合ダイマー化ドメインを含む第２のポリペプチド；
    （ｃ）ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で発現される分子を結合するポリペプチド、アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメイン（ｃ１）、および第３の共有結合ダイマー化ドメインを含む第３のポリペプチド；および
    （ｄ）アミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む３個の非天然起源ポリペプチドドメインを含む第４のポリペプチドであって、各ドメインが、ａ１、ｂ１およびｃ１（ａ２、ｂ２およびｃ２）の結合ドメイン、および第４、第５および第６の共有結合ダイマー化ドメインである、第４のポリペプチド
    を含み、
    前記第１および第２および第３および第４のポリペプチドが、前記共有結合ダイマー化ドメインを介して共有結合される、改変ヘテロダイマータンパク質。
  17. Ｔ細胞上で発現される前記分子が、ＣＤ３であり、Ｔおよび細胞上で発現される分子を結合する前記ポリペプチドが、ＣＤ３のモノクローナル抗体であり、前記系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ３３であり、およびＮＫ細胞上で発現される前記分子が、ＮＫＧ２Ｄである、請求項１６に記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  18. Ｔ細胞上で発現される前記分子が、ＣＤ３であり、かつＴ細胞上で発現される分子を結合する前記ポリペプチドが、ＣＤ３のモノクローナル抗体であり、前記系統特異的細胞表面抗原が、ＣＤ３３であり、およびＮＫ細胞上で発現される前記分子が、ＣＤ１６であり、およびＮＫ細胞上で発現される分子を結合する前記ポリペプチドが、ＣＤ１６のモノクローナル抗体である、請求項１６に記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  19. 前記第１のダイマー化ドメインおよび／または前記第２のダイマー化ドメインおよび／または前記第３のダイマー化ドメインおよび／または前記第４のダイマー化ドメインおよび／または前記第５のダイマー化ドメインおよび／または前記第６のダイマー化ドメインが、ＩｇＧ２ヒンジドメインを含む、請求項１６～１８のいずれかに記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  20. 前記第１のダイマー化ドメインおよび／または前記第２のダイマー化ドメインおよび／または前記第３のダイマー化ドメインおよび／または前記第４のダイマー化ドメインおよび／または前記第５のダイマー化ドメインおよび／または前記第６のダイマー化ドメインが、ＩｇＧ２ Ｆｃドメインをさらに含む、請求項１９に記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  21. 前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチド中のアミノ酸リンカーにより連結された１～５個のαヘリックスを含む非天然起源ポリペプチドドメインが、６ＤＭＰａおよび６ＤＭＰｂからなる群から選択される、請求項１６～２０のいずれかに記載の改変ヘテロダイマータンパク質。
  22. 請求項１６～２１に記載の改変ヘテロダイマータンパク質をコードする少なくとも１種のベクターを含む組成物。
  23. 請求項２２に記載の組成物を含むキット。
  24. 請求項２２に記載の組成物の有効量を対象に投与することを含む、前記対象において造血器悪性腫瘍を治療する方法。

JP2023500094A 2020-07-03 2021-07-06 多官能直交タンパク質キメラ Pending JP2023532973A (ja)

Applications Claiming Priority (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063047938P 2020-07-03 2020-07-03
US63/047,938 2020-07-03
US202063050346P 2020-07-10 2020-07-10
US63/050,346 2020-07-10
US202063075388P 2020-09-08 2020-09-08
US63/075,388 2020-09-08
US202163145083P 2021-02-03 2021-02-03
US63/145,083 2021-02-03
US202163189412P 2021-05-17 2021-05-17
US63/189,412 2021-05-17
PCT/US2021/040538 WO2022006564A1 (en) 2020-07-03 2021-07-06 Polyfunctional orthogonal protein chimeras

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2023532973A true JP2023532973A (ja) 2023-08-01

Family

ID=79317829

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023500094A Pending JP2023532973A (ja) 2020-07-03 2021-07-06 多官能直交タンパク質キメラ

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230391866A1 (ja)
EP (1) EP4175656A1 (ja)
JP (1) JP2023532973A (ja)
KR (1) KR20230047112A (ja)
CN (1) CN116261567A (ja)
AU (1) AU2021299573A1 (ja)
IL (1) IL299672A (ja)
WO (1) WO2022006564A1 (ja)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6480907B2 (ja) * 2013-03-15 2019-03-13 メモリアル スローン ケタリング キャンサー センター 多量体化技術
PL3280432T3 (pl) * 2015-04-06 2021-09-27 Subdomain, Llc Domena wiążąca de novo zawierająca polipeptydy i jej zastosowania
US11370826B2 (en) * 2016-02-09 2022-06-28 Bracco Suisse Sa Recombinant chimeric protein for selectins targeting
WO2019127215A1 (en) * 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific chimeric receptors comprising an nkg2d domain and methods of use thereof
CA3125748A1 (en) * 2019-01-07 2020-07-16 Thomas Jefferson University Multi-functional fusion proteins and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP4175656A1 (en) 2023-05-10
IL299672A (en) 2023-03-01
WO2022006564A1 (en) 2022-01-06
US20230391866A1 (en) 2023-12-07
KR20230047112A (ko) 2023-04-06
AU2021299573A1 (en) 2023-02-23
CN116261567A (zh) 2023-06-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10912799B2 (en) Compositions and methods for inhibition of lineage specific antigens
WO2014165818A2 (en) Compositions and methods for preventing and treating prostate cancer
JP6974348B2 (ja) がん処置のためのカドヘリン−１７特異的抗体及び細胞傷害性細胞
WO2020150478A1 (en) Compositions and methods for inhibition of lineage specific antigens
US20220306739A1 (en) Materials and methods for modulating an immune response
US20210284731A1 (en) Methods and materials for modulating an immune response
KR102624213B1 (ko) 항-her2 어피바디 및 이를 스위치 분자로 이용하는 스위처블 키메라 항원 수용체
US20230391866A1 (en) Polyfunctional orthogonal protein chimeras
US20220305056A1 (en) Chimeric antigen receptor system and uses thereof
AU2021267893A1 (en) Anti-tumor associated antigen antibodies and uses thereof
US20210393685A1 (en) Anti-cd33 and nkg2d ligand chimeras for treatment of myeloid malignancies
CA3184819A1 (en) Polyfunctional orthogonal protein chimeras
WO2024102604A1 (en) Anti-5t4 antibodies and uses thereof
WO2024076864A2 (en) Anti-ror1 antibodies and uses thereof
WO2023177974A2 (en) Anti-mesothelin antibodies and uses thereof
WO2024091870A2 (en) Anti-egfrviii antibodies and uses thereof
WO2023154626A2 (en) Anti-il13ra2 antibodies and uses thereof
KR20220155588A (ko) Gpc3 car-t 세포 조성물 및 이의 제조 및 사용 방법
CN117192118A (zh) 一种抗cldn 18.2和cd47的双特异性抗体治疗疾病的用途

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20230306