KR20230047112A - 다작용성 직교성 단백질 키메라 - Google Patents

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KR20230047112A
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시드하르타 무케르지
압둘라 마흐무드 알리
앨런 버크
플로렌스 보로트
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더 트러스티스 오브 콜롬비아 유니버시티 인 더 시티 오브 뉴욕
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Abstract

아미노산 링커 및 IgG2 힌지 도메인에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인을 단독으로 또는 IgG2 Fc 도메인과 함께 사용하는 조작된 이형이량체 또는 이형삼량체 단백질이 본 명세서에 개시된다. 이형이량체 및 이형삼량체 단백질은 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 면역 세포(예를 들어, 자연살해 세포) 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드 및/또는 면역 세포(예를 들어, T 세포)의 다른 유형 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드를 추가로 포함할 수 있다. 또한 단백질을 암호화하는 핵산, 핵산을 포함하는 벡터, 조성물 및 치료 방법이 본 명세서에 개시된다.

Description

다작용성 직교성 단백질 키메라
관련출원에 대한 상호참조
본 출원은 2020년 7월 3일자로 출원된 미국 가출원 특허 제63/047,938호, 2020년 7월 10일자로 출원된 제63/050,346호, 2020년 9월 8일자로 출원된 제63/075,388호, 2021년 2월 3일자로 출원된 제63/145,083호 및 2021년 5월 17일자로 출원된 제63/189,412호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 모두는 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
서열목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용되는 서열목록을 포함한다.
대부분의 급성 골수성 백혈병(AML) 백혈병 세포에 제시된 CD33은 면역요법에 대해 매력적인 표적이며, 기존 치료법이 효과가 없는 표적 집단을 나타낸다. CD33에 대한 단클론성 항체를 DNA-절단 세포독성 칼리케아마이신과 융합시키는 약물인 젬투주맙 오조가미신은 2000년과 2010 사이의 첫 번째 AML 재발 후에 환자에 대해 이용 가능하였고, 이후에, 눈에 띄는 이점 없이 환자 사망률의 증가로 인해 중단되었다(Lowenburg et al. 2010). 2017년에, 이는 DNA 합성을 방지하는 DNA 삽입제인 사이토신 아라비노사이드 및 다우노루비신과 조합하여 중위 생존이 완만하게 개선된 원발성 CD33+ AML에 대한 시판을 위해 재도입되었다. 단일요법으로서, 이는 결과를 개선시키지 않는다(Renneville et al. 2014). 현재 I상 임상 시험 중인 이중특이성 T-세포 관여자(BiTE)는 CD33+ AML를 CD3+ T-세포에 표적화한다(Krupka et al. 2014). CD3+ T-세포를 통한 파괴를 위해 CD19+ B-세포를 표적화하는 블리나투모맙과 같이 B-세포 악성 종양용으로 승인된 것을 포함하는 BiTE는 이들이 한 번에 몇 주 동안 지속적으로 주입되고, 수개월 동안 반복되어, 면역요법에 대한 대안의 접근에 대한 요구를 촉발한다는 점에서 이러한 낮은 생체이용률을 갖는다(Nanbakhsh et al. 2014).
AML을 포함하는 다수의 악성종양은 자연살해(NK) 세포독성 반응의 감소된 활성과 연관된다. NK-활성화 리간드, 예컨대, ULBP1의 발현은 생존과 양의 상관관계가 있지만, 정상적으로는 이를 상향조절하는 조건에서조차 AML의 발현을 낮추는 것으로 알려져 있다(Elias et al. 2014). NK 수용체 2B4의 리간드인 CD48은 AML1-ETO와 같은 융합 단백질을 발현시키는 AML 세포 상에서 하향조절된다(Mastaglio et al. 2018). 대조적으로, NK-저해 리간드, 예컨대, PD-L2는 상향조절된다(Dulphy et al. 2016). AML은 일부 경우에 NK 세포의 성숙을 조절하지 못할 뿐만 아니라 NKG2D와 같은 수용체의 가용성 또는 엑소좀-결합 리간드로 NK 세포를 "분산"시키는 것으로 나타났다(Mundy-Bosse et al. 2014). 적은 수의 CD11b+CD27+ NK 세포로 나타나는 NK 성숙의 억제는 AML 부담이 증가함에 따라 더 강력하게 된다(Stringaris et al. 2014). NK 세포의 활성화(저해 균형 - 세포독성 기능은 NK 세포 상에서 저해 및 활성화 수용체의 발현 및 관여에 따름)는 AML에 의해 빈번하게 방해되어, 활성화 수용체 표면 발현을 감소시키고, NKG2A와 같은 수용체 저해의 발현을 증가시킨다(Orleans-Lindsay et al. 2001). 엑소좀 또는 가용성 리간드의 경우에, NK 세포는 적절한 표적을 찾기 위해 애쓰며, 백혈병 세포 표면 상의 천연 리간드에 의존하지 않고 NK 세포독성 반응을 활용하는 방법을 개발할 수 있다면, 치료적 기회를 나타낸다.
T-세포 및 NK 세포는 둘 다 AML 상황에서 감소된 기능을 가졌다. 1차 아세포와 HL60과 같은 AML 세포주는 둘 다 세포용해 활성에 영향을 미치거나 이들 세포의 사멸을 야기하는 일 없이 T-세포 및 NK-세포의 성장을 억제하는 능력을 입증하였다(LeDieu et al. 2009). 환자의 더 포괄적인 선별은 순환에서 T-세포가 활성의 증가 없이 크게 증가되고, 나머지는 특히 T-조절 세포 비율을 증가시켰다는 것을 주목하였다는 것을 시사하였다(Shenghui et al. 2011; Schnoffeil et al. 2015). 상승된 PD-1 발현과 상관관계가 있는 기억 T-세포로 향하는 이동은 세포독성 T-세포의 활성 또는 "고갈"의 손상을 시사하지 않는다는 것이 다시 한번 입증되었다(Chamuleau et al. 2008). 일부 AML에서 상향조절된 인돌아민 2,3-다이옥시게나제 및 아르기나제 II를 통한 트립토판 및 아르기닌의 분해는 또한 T-세포의 불량한 증식 및 활성화에 기여하고, 골수성 악성종양의 면역회피의 유용한 혈청 지표로서 작용할 수 있다(Thorsson et al. 2018). 염증 위치는 또한 T-세포 활성으로부터의 AML 탈출과 연관되지만, 특정 상호작용의 예측 및 치료 잠재력은 이용된 적이 없었다(Benci et al. 2016; Chen et al. 2019). 궁극적으로, 골수성 아세포가 면역 제거(면역 하위집단을 조절하고, 세포독성을 저해하며, 그 자체를 마스킹함)를 피하는 방법은 크게 변하며, 예측이 어렵다.
현재, 특히 현재의 표준치료인 강력한 화학요법을 받을 수 없는 노인 환자에서, 결과가 불량하게 남아있고, 중위 생존이 단지 5 내지 10개월인 급성 골수성 백혈병(AML)과 같은 질환에 대해 신규한 접근이 요구된다(Dohner et al. 2015).
본 개시내용은 조작된 단백질 또는 다작용성 직교성(polyfunctional orthogonal) 단백질 키메라를 제공한다.
다중특이성 또는 다작용성 단백질은 이들 제제 각각에 대한 상호작용의 특이성 및 친화도에 기반하여 둘 이상의 상이한 유형의 제제(단백질, DNA, RNA 또는 세포)에 동시에 관여할 수 있는 생체분자이다.
예를 들어, 하나는 면역 세포(예를 들어, T 또는 NK)에 대해 특이성을 갖고 다른 하나는 암 세포에 대해 특이성을 갖는 두 상이한 단클론성 항체로부터 유전자 조작된 이중특이성 또는 이작용성 항체는 종양 사멸을 향상시키는 데 사용 중이다. 전통적으로, 이들 다중특이성 단백질은 융합 단백질로서 생성되지만, 이러한 융합 단백질은 관여 부위의 입체 저해로 인해 비작용성으로 제공될 수 있다. 합성 생물학에서의 최근의 진보는 DNA의 두 역평행(anti-parallel) 가닥 사이에서 관찰되는 것과 유사하게 수소 결합에 기반한 비공유 상호작용을 통해 형성된 직교성 단백질 이형이량체(heterodimer)의 생성을 가능하게 하는 합성 폴리펩타이드의 생성을 가능하게 하였다.
아미노산 링커 및 IgG2 힌지 도메인에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인을 단독으로 또는 IgG2 Fc 도메인과 함께 사용하는 개선된 다중특이성 또는 다작용성 또는 헤테로 또는 이형이량체 또는 이형삼량체 단백질을 본 명세서에 나타낸다. 이들 다작용성 단백질은 앞서 기재한 다작용성 단백질보다 개선된 특성을 나타낸다. 우선, IgG 서열의 사용은 단백질을 더 안정하게 만드는 공유 이황화결합의 형성을 가능하게 한다. 이들 다작용성 단백질은 항체-유사 단백질을 갖고, Fc 도메인을 통해 신체의 보체 시스템에 관여한다. 더 나아가, 항체와 같은 이들 다작용성 단백질은 신체에서 용이하게 파괴되지 않는다. 추가적으로, 이들 단백질은 항체-유사이기 때문에, 덜 면역원성이며, 표준의 앞서 개시한 이중특이성 단백질보다 더 양호한 약물동태학을 갖는다.
본 명세서에 예시된 조작된 단백질이 있지만, 아미노산 링커 및 IgG2 힌지 도메인에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 단독으로 또는 IgG2 Fc 도메인과 함께 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인의 혁신적인 사용은 또한 우수한 결합 및 세포독성 특성을 갖는 다른 특이성을 갖는 조작된 단백질을 작제하도록 확장될 수 있다. 이들 조작된 단백질은 임의의 계통-특이적 세포 표면 항원 또는 암 및 종양 세포에 의해 발현 및/또는 과발현되는 다른 항원에 결합하는 항원-결합 단편 또는 다른 모이어티, 및 면역 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 임의의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
NK 세포를 골수성 세포에 관여시키기 위해, CD33 단백질(골수성 세포 상에 존재함)에 결합하는 단클론성 항체의 항원 인식 도메인을 갖는 이형이량체를 생성하도록 단백질 ULBP1의 NKG2D 결합 도메인을 이용하는 이형이량체 이중특이성 단백질이 본 명세서에 예시된다. 도 1, 도 2 및 도 10을 참조한다.
또한, T-세포를 골수성 세포와 관여시키기 위해 CD3 단백질(T 세포 상에 존재함) 및 CD33 단백질(골수성 세포 상에 존재함)에 결합하는 단클론성 항체의 항원 인식 도메인을 이용하는 이형이량체 이중특이성 단백질이 본 명세서에 예시된다. 도 1, 도 2 및 도 10을 참조한다.
NK 세포를 골수성 세포에 관여시키기 위해, CD33 단백질(골수성 세포 상에 존재함)에 결합하는 단클론성 항체의 항원 인식 도메인을 갖는 이형이량체를 생성하도록 CD16 단백질(NK 세포 상에 존재함)에 결합하는 단클론성 항체의 항원 인식 도메인을 이용하는 이형이량체 이중특이성 단백질이 또한 본 명세서에 예시된다. 도 23을 참조한다.
본 명세서에 예시된 조작된 단백질은 계통 특이적 세포 표면 항원(예를 들어, CD33)에 결합하는 항원-결합 단편 또는 다른 모이어티를 이용하지만, 본 개시내용은 암 및 종양 세포에 의해 발현 및/또는 과발현된 다른 항원을 인식하는 항원-결합 단편 또는 다른 모이어티를 포함하는 조작된 단백질을 포함한다. 본 개시내용은 또한 면역 세포 상에서 발현된 다른 분자에 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 단백질을 포함한다.
이들 예시된 이형이량체 단백질은 IgG2 힌지 도메인을 포함한다. 도 1A 및 도 23A를 참조한다.
또한 IgG2 힌지 도메인 및 IgG2 Fc 도메인(CH2 및 CH3 도메인)을 포함하는 예시된 이형이량체 단백질이 본 명세서에 도시되어 있다. 도 1B 및 도 23B를 참조한다.
2개 초과의 폴리펩타이드를 포함하는 다작용성 단백질이 또한 작제될 수 있다. 이들 단백질은 각각의 이형이량체 X, Y 또는 Z의 단량체 a를 표적 결합 도메인에 융합된 링커 및 단량체 b와 조합함으로써 형성될 수 있다. 이 개략도는 삼중특이성 단백질을 나타내지만, 사중특이성 단백질뿐만 아니라 4개 초과를 포함하는 조작된 단백질은 본 명세서의 개략도 및 방법에 나타낸 바와 같이 작제될 수 있다. 도 9를 참조한다.
이들 합성 분자의 효용은 치료적 표적화, 유전자 편집, 진단, 둘 이상의 신호를 동시에 활성화 또는 비활성화에 의한 경로 조작을 포함한다.
본 개시내용은 조작된 이형이량체 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 자연살해(NK) 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하되; 제1 및 제2 폴리펩타이드는 공유 이량체화 도메인을 통해 공유 결합된다.
일부 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함하되; 제1 및 제2 폴리펩타이드는 공유 이량체화 도메인을 통해 공유 결합된다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드 및 제2 폴리펩타이드에서 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 쇄는 6DMPb 및 6DMPa로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1 공유 이량체화 도메인 및/또는 제2 공유 이량체화 도메인은 IgG2 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 공유 이량체화 도메인 및/또는 제2 공유 이량체화 도메인은 IgG2 Fc 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 계통 특이적 세포-표면 항원은 CD33, CD19, 또는 명세서에 기재된 임의의 계통 특이적 세포-표면 항원일 수 있다.
일부 실시형태에서, NK 세포 상에서 발현되는 분자는 NKG2D일 수 있고, NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA, MICB 또는 이들의 돌연변이체 또는 단편이다. 일부 실시형태에서, NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA 또는 MICB의 엑토도메인이다.
일부 실시형태에서, NK 세포 상에서 발현되는 분자는 CD16이고, NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 CD16의 단클론성 항체이다.
일부 실시형태에서, T 세포 상에서 발현되는 분자는 CD3이고, T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 CD3의 단클론성 항체이다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 단일쇄 항체 단편(scFv)이다.
본 개시내용은 또한 3개의 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 이형이량체 단백질 또는 3개 초과의 폴리펩타이드를 포함하거나, 4개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 5개의 폴리펩타이드를 포함하거나, 6개의 폴리펩타이드를 포함하거나 또는 6개 초과의 폴리펩타이드를 포함하는 조작된 단백질을 제공하되, 조작된 헤테로 단백질은 조작된 단백질에서 다른 폴리펩타이드 각각에 대해 결합 도메인을 갖는 추가적인 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은 T 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커(a1)에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커(b1)에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드; 자연살해(NK) 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커(c1)에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제3 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 3개의 비천연 유래 폴리펩타이드를 포함하는 제4 폴리펩타이드를 포함하되, 각각의 도메인은 a1, b1 및 c1(a2, b2 및 c2), 및 제4, 제5 및 제6 공유 이량체화 도메인의 결합 도메인이고; 제1 및 제2 및 제3 및 제4 폴리펩타이드는 공유 이량체화 도메인을 통해 공유 결합된다.
일부 실시형태에서, 제1 폴리펩타이드, 제2 폴리펩타이드, 제3 폴리펩타이드 및 제4 폴리펩타이드에서 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 쇄는 6DMPb 및 6DMPa로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 제1 공유 이량체화 도메인, 제2 공유 이량체화 도메인, 제3 공유 이량체화 도메인, 제4 공유 이량체화 도메인, 제5 공유 이량체화 도메인 및/또는 제6 공유 이량체화 도메인은 IgG2 힌지 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 공유 이량체화 도메인은 IgG2 Fc 도메인을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 계통 특이적 세포-표면 항원은 CD33, CD19, 또는 명세서에 기재된 임의의 계통 특이적 세포-표면 항원일 수 있다.
일부 실시형태에서, NK 세포 상에서 발현되는 분자는 NKG2D일 수 있고, NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA, MICB 또는 이들의 돌연변이체 또는 단편이다. 일부 실시형태에서, NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA 또는 MICB의 엑토도메인이다.
일부 실시형태에서, NK 세포 상에서 발현된 분자는 CD16일 수 있고, T 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 CD16의 단클론성 항체이다.
일부 실시형태에서, T 세포 상에서 발현되는 분자는 CD3이고, T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 CD3의 단클론성 항체이다.
일부 실시형태에서, 제3 폴리펩타이드는 면역 반응을 증가시키는 케모카인 또는 사이토카인 단백질이다. 케모카인 또는 사이토카인 단백질은 CXCL14를 포함하는 CXCL, GCSF, 및 IL2 및 IL16을 포함하는 인터류킨을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 단일쇄 항체 단편(scFv)이다.
특정 실시형태에서, 제1 및 제2 및 제3 조작된 이형이량체 단백질에서 제1 폴리펩타이드는 서열번호 1에 대해 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(도 3). 일부 실시형태에서, 조작된 이형이량체 단백질에서 제1 폴리펩타이드는 서열번호 4에 대해 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(도 6).
특정 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체에서 제2 폴리펩타이드는 서열번호 2에 대해 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(도 4). 일부 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질에서 제2 폴리펩타이드는 서열번호 5에 대해 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(도 7).
특정 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질에서 제2 폴리펩타이드는 서열번호 3에 대해 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(도 5). 일부 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질에서 제2 폴리펩타이드는 서열번호 6에 대해 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(도 8).
특정 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질에서 제2 폴리펩타이드는 서열번호 26에 대해 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(도 23A). 일부 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질에서 제2 폴리펩타이드는 서열번호 27에 대해 적어도 80% 또는 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(도 23B).
본 개시내용은 임의의 조작된 단백질, 또는 임의의 조작된 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 제1 조작된 이형이량체 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 조작된 이량체 단백질은 (i) 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (ii) 자연살해(NK) 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 제2 조작된 이형이량체 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 조작된 이량체 단백질은 (i) 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (ii) T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 제3 조작된 이형이량체 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 조작된 이량체 단백질은 (i) 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (ii) 자연살해(NK) 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 조작된 삼량체 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 조작된 이형삼량체 단백질은 (i) T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편인 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (ii) 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및 (iii) 자연살해(NK) 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및 (iv) 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 3개의 비천연 유래 폴리펩타이드를 포함하는 제4 폴리펩타이드를 포함할 수 있되, 각각의 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같이 a1, b1 및 c1의 결합 도메인(a2, b2 및 c2), 및 제4, 제5 및 제6 공유 이량체화 도메인이다.
본 개시내용은 임의의 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터 또는 임의의 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 본 벡터 또는 핵산 분자를 포함하는 세포를 제공한다.
본 개시내용은 (i) 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (ii) 자연살해(NK) 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 (i) 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (ii) T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 (i) T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편인 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및 (ii) 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드; 및 (iii) 자연살해(NK) 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및 (iv) 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 3개의 비천연 유래 폴리펩타이드를 포함하는 제4 폴리펩타이드를 암호화하는 적어도 하나의 벡터를 포함하는 조성물을 제공하되, 각각의 도메인은 본 명세서에 기재된 바와 같이 a1, b1 및 c1의 결합 도메인(a2, b2 및 c2), 및 제4, 제5 및 제6 공유 이량체화 도메인이다.
본 개시내용은 임의의 조작된 단백질, 임의의 핵산 분자, 임의의 본 벡터 및/또는 임의의 본 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한 임의의 조작된 단백질, 임의의 핵산 분자, 임의의 본 벡터, 임의의 본 세포 및/또는 임의의 본 조성물을 포함하는 키트가 본 개시내용에 의해 포함된다.
본 개시내용은 유효량의 본 명세서에 개시되거나 기재된 임의의 조작된 단백질, 임의의 핵산 분자, 임의의 본 벡터, 임의의 본 세포 및/또는 임의의 본 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 유효량의 본 명세서에 개시되거나 기재된 임의의 조작된 단백질, 임의의 핵산 분자, 임의의 본 벡터, 임의의 본 세포 및/또는 임의의 본 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 조혈성 악성종양을 치료하는 방법을 제공한다.
조혈성 악성종양은 골수성 악성종양일 수 있다.
조혈성 악성종양은 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종일 수 있다.
조혈성 악성종양은 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병 또는 만성 림프아구성 백혈병일 수 있다.
본 발명을 설명하는 목적을 위해, 본 발명의 특정 실시형태를 도면에서 도시한다. 그러나, 본 발명은 도면에 도시된 실시형태의 정확한 배열 및 수단으로 제한되지 않는다.
도 1은 다양한 결합 단백질의 개략도이다. 도 1A는 조작된 단백질에서 사용되는 IgG2 힌지 도메인만을 갖는 항-CD33, 항-CD3 및 NKG2D 결합 단백질의 개략도이다. 도 1B는 조작된 단백질에서 사용되는 IgG2 힌지와 IgG2 Fc 도메인을 둘 다 갖는 항-CD33, 항-CD3 및 NKG2D 결합 단백질의 개략도이다.
도 2는 면역 세포를 암 세포와 관여시키는 이작용성 단백질 이량체의 개략도이다.
도 3은 IgG2 힌지 도메인만을 갖는 항-CD33 작제물의 아미노산 서열(서열번호 1)이다.
도 4는 IgG2 힌지 도메인만을 갖는 ULBP1 작제물의 아미노산 서열(서열번호 2)이다.
도 5는 IgG2 힌지 도메인만을 갖는 항-CD3 작제물의 아미노산 서열(서열번호 3)이다.
도 6은 IgG2 힌지와 IgG2 Fc 도메인을 둘 다 갖는 항-CD33 작제물의 아미노산 서열(서열번호 4)이다.
도 7은 IgG2 힌지와 IgG2 Fc 도메인을 둘 다 갖는 ULBP1 작제물의 아미노산 서열(서열번호 5)이다.
도 8은 IgG2 힌지와 IgG2 Fc 도메인을 둘 다 갖는 항-CD3 작제물의 아미노산 서열(서열번호 6)이다.
도 9는 조작된 이형삼량체 단백질의 개략도이다.
도 10은 IgG2-힌지 및 6DMPa/b 이형이량체화 구조를 갖는 조작된 이형이량체 단백질의 개략도이다. 도 10A는 항-CD33/항-CD3 이형이량체 단백질이다. 도 10B는 항-CD33/ULPB1 이형이량체 단백질이다.
도 11은 연구에서 사용되는 발현 벡터의 플라스미드 맵이다. 도 11A는 aCD33-6DMPa-힌지 발현 벡터의 맵이다. 도 11B는 ULBP1-6DMPb-힌지 발현 벡터의 맵이다. 도 11C는 aCD3-6DMPb 발현 벡터의 맵이다.
도 12는 항-CD33-ULBP1 키메라 1 및 2 플라스미드로 형질감염된293T 세포에서 항-CD33/ULBP 조작 단백질의 발현 및 정제를 나타내는 면역블롯이다. 도 12A는 세포에서의 발현을 나타낸다. 도 12B는 상청액 중의 발현 및 정제를 나타낸다.
도 13은 CHO 세포에서 힌지-기반 작제물의 발현 및 정제를 나타내는 면역블롯이다. 단백질은 상청액에 분비되고, 코발트-수지 및 이미다졸에 의한 용리를 이용하여 6xHis-정제될 수 있다.
도 14는 항-CD33 작제물 단독 또는 조작된 이형이량체 단백질 중 하나와 함께 인큐베이션된 HL-60 세포의 FACS 플롯을 나타낸다. 도 14A는 항-FLAG 항체와 함께 공동 인큐베이션을 나타낸다. 도 14B는 항-MYC 항체와 함께 공동 인큐베이션을 나타낸다.
도 15는 HL-60 세포에 대한 조작된 이형이량체 단백질의 결합 실험을 요약하는 표이다.
도 16은 Jurkat 세포에 대한 조작된 이형이량체 단백질의 결합 실험을 요약하는 표이다.
도 17은 PMBC에 대한 조작된 이형이량체 단백질의 결합 실험을 요약하는 표이다.
도 18은 MOLM14 세포 및 항-CD33/항-CD3 조작된 이형이량체 단백질을 이용하는 세포독성 분석의 결과를 도시한다. 도 18A는 유세포분석 개폐 도식을 보여주는 대표적인 도트 플롯이다. 단일 dTomato+(MOLM14) 세포는 개폐되고, 사멸된 특정 세포%는 또한 DAPI+인 dTomato+ 세포의 총 %로서 평가된다. 도 18B는 항-CD33/항-CD3 조작된 이형이량체 단백질을 이용하는 MOLM14 세포에서의 세포독성 결과의 그래프이다.
도 19는 HL60 세포 및 항-CD33/항-CD3 조작된 이형이량체 단백질을 이용하는 세포독성 분석의 결과를 도시한다. 도 19A는 유세포분석 개폐 도식을 보여주는 대표적인 도트 플롯이다. 단일 CellTrace Violet+(HL-60) 세포는 개폐되고, 사멸된 특정 세포%는 또한 DAPI+인 CellTrace Violet+ 세포의 총 %로서 평가된다. 도 19B는 항-CD33/항-CD3 조작된 이형이량체 단백질을 이용하는 HL-60 세포에서 세포독성 분석의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 20은 단량체와 비교할 때 항-CD33/항-CD3 조작된 이형이량체 단백질을 이용하는 HL-60 세포에서의 세포독성 분석의 추가적인 결과를 나타내는 그래프이다.
도 21은 HL-60 세포에서 단백질 적정을 이용하는 용량 의존적 세포독성 결과(즉, 항-CD33/항-CD3 조작된 이형이량체 단백질의 증가)를 나타내는 그래프이다.
도 22는 HL-60 세포에서 효과기 적정을 이용하는 용량 의존적 세포독성 분석 결과(즉, 효과기/표적비의 증가)를 나타내는 그래프이다.
도 23은 항-CD16 작제물의 아미노산 서열이다. 도 23A는 IgG2 힌지 도메인만을 갖는 항-CD16 작제물의 아미노산 서열(서열번호 26)이다. 도 23B는 IgG2 힌지와 IgG2 Fc 도메인을 둘 다 갖는 항-CD16 작제물의 아미노산 서열(서열번호 27)이다.
도 24는 항-CD33-항-CD3 조작된 이형이량체 단백질의 생체내 항-종양 활성 결과를 도시한다. 도 24A는 실험의 개략도이다. 도 24B는 FFluc-dtomato 형질도입된 MOLM14의 성장을 모니터링하기 위해 사용된 생물발광 영상화(BLI) 이미지이다. 도 24C는 MOLM14 단독, 비로딩 T 세포 또는 항-CD33-항-CD3 조작된 이형이량체 단백질 로딩된 T 세포로 처리된 마우스에서의 BLI의 정량화 그래프이다. 도 24D는 Kaplan-Meier 생존 플롯이다. 항-CD33-항-CD3 조작된 이형이량체 단백질 로딩 T 세포로 처리한 마우스는 2개의 대조군(처리 없음 또는 비로딩 T 세포)보다 더 양호한 생존을 갖는다. Log-순위 검정 *p <0.05.
정의
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "조작된 단백질" 또는 "조작된 이형이량체 단백질" 또는 "조작된 이형삼량체 단백질" 또는 "조작된 헤테로 단백질" 또는 "다작용성 단백질" 또는 "다작용성 직교성 단백질 키메라" 또는 "단백질 키메라" 등은 적어도 두 상이한 단백질로부터의 단백질 도메인을 포함하는 혼성 폴리펩타이드를 지칭한다. 하나의 도메인은 융합 단백질의 아미노-말단(N-말단)에 또는 융합 단백질의 카복시-말단(C-말단) 부분에 위치될 수 있다. 본 명세서에 제공된 임의의 단백질은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제공된 단백질은 펩타이드 링커를 포함하는 융합 단백질에 특히 적합한 재조합 단백질 발현 및 정제를 통해 생성될 수 있다. 재조합 단백질 발현 및 정제에 대한 방법은 잘 공지되어 있으며, 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))]에 의해 기재된 것을 포함하고, 이들의 전문은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
용어 "단백질", "펩타이드" 및 "폴리펩타이드"는 본 명세서에서 상호 호환적으로 사용되고, 펩타이드(아마이드) 결합에 의해 함께 연결된 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 임의의 크기, 구조 또는 기능의 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 지칭한다. 전형적으로, 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 적어도 3개의 아미노산 길이일 수 있다. 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 개개 단백질 또는 단백질의 수집물을 지칭할 수 있다. 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드에서 아미노산 중 하나 이상은, 예를 들어, 화학적 독립체, 예컨대, 탄수화물기, 하이드록실기, 인산염기, 파네실기, 아이소파네실기, 지방산기, 접합을 위한 링커, 작용화 또는 다른 변형 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 또한 단일 분자일 수 있거나, 또는 다중-분자 복합체일 수 있다. 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 단지 천연 유래 단백질 또는 펩타이드의 단편일 수 있다. 단백질, 펩타이드 또는 폴리펩타이드는 천연 유래, 재조합 또는 합성 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 상호 호환적으로 사용되고, 척추동물, 바람직하게는 인간과 같은 포유류를 지칭한다. 포유류는 인간 영장류, 비-인간 영장류 또는 뮤린, 소, 말, 개 또는 고양이 종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 개시내용과 관련하여, 용어 "대상체"는 또한 시험관내 또는 생체외에서 배양되거나 생체내에서 조작될 수 있는 조직 및 세포를 포함한다. 용어 "대상체"는 용어 "유기체"와 상호 호환적으로 사용될 수 있다.
용어 "폴리뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드", "뉴클레오타이드 서열", "핵산" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호 호환적으로 사용된다. 이들은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 다형체 형태, 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중 하나 또는 이들의 유사체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드의 예는 유전자 또는 유전자 단편의 암호화 또는 비암호화 영역, 엑손, 인트론, 전령 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 마이크로-RNA(miRNA), 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드 내의 하나 이상의 뉴클레오타이드는 추가로 변형될 수 있다. 뉴클레오타이드의 서열은 비-뉴클레오타이드 성분에 의해 가로막힐 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 또한 중합 후에, 예컨대, 표지 제제와의 접합에 의해 변형될 수 있다.
용어 "혼성화"는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드가 반응되어 뉴클레오타이드 잔기의 염기 사이의 수소 결합을 통해 안정화되는 복합체를 형성하는 반응을 지칭한다. 수소 결합은 왓슨 크릭(Watson Crick) 염기쌍, 후그스테인(Hoogstein) 결합에 의해, 또는 임의의 다른 서열 특이적 방식으로 발생될 수 있다. 복합체는 듀플렉스 구조를 형성하는 두 가닥, 다중-가닥 복합체를 형성하는 3개 이상의 가닥, 단일 자기-혼성화 가닥 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 혼성화 반응은 더 광대한 방법, 예컨대, PCR의 개시, 또는 효소에 의한 폴리뉴클레오타이드의 절단에서 단계를 구성할 수 있다. 주어진 서열에 의하 혼성화할 수 있는 서열은 주어진 서열의 "보체"로서 지칭된다.
용어 "벡터", "클로닝 벡터" 및 "발현 벡터"는 숙주를 형질전환시키고 도입된 서열의 발현(예를 들어, 전사 및 번역)을 촉진시키기 위해 DNA 또는 RNA 서열(예를 들어, 외래 유전자)이 숙주 세포 내로 도입될 수 있는 비히클을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 및 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 벡터는 전형적으로 외래 DNA가 삽입된 전달 가능한 제제의 DNA를 포함한다. DNA의 하나의 세그먼트를 DNA의 다른 세그먼트에 삽입하는 통상적인 방법은 제한 부위로 불리는 특정 부위(뉴클레오타이드의 특정 기)에서 DNA를 절단하는 제한 효소로 불리는 효소의 사용을 수반한다. "카세트"는 정해진 제한 부위에서 벡터에 삽입될 수 있는 발현 생성물에 대해 암호화하는 DNA 암호화 서열 또는 DNA의 세그먼트를 지칭한다. 카세트 제한 부위는 적절한 판독 프레임에서 카세트의 삽입을 보장하도록 설계된다. 일반적으로, 외래 DNA는 벡터 DNA의 하나 이상의 제한 부위에서 삽입되고, 이어서, 전달 가능한 벡터 DNA와 함께 숙주 세포에 벡터에 의해 운반된다. 삽입 또는 첨가된 DNA를 갖는 DNA의 세그먼트 또는 서열, 예컨대, 발현 벡터는 또한 "DNA 작제물" 또는 "유전자 작제물"로 불릴 수 있다. 공통 유형의 벡터는 "플라스미드"이고, 이는 일반적으로 추가적인(외래) DNA를 용이하게 수용할 수 있고 적합한 숙주 세포에 용이하게 도입될 수 있는 보통 박테리아 기원의 이중-가닥 DNA의 자기-함유 분자이다. 플라스미드 벡터는 종종 암호화 DNA 및 프로모터 DNA를 함유하고, 외래 DNA를 삽입하는 데 적합한 하나 이상의 제한 부위를 갖는다. 암호화 DNA는 특정 단백질 또는 효소에 대해 특정 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA는 암호화 DNA의 발현을 개시하거나, 조절하거나, 달리 매개하거나 제어하는 DNA 서열이다. 프로모터 DNA 및 암호화 DNA는 동일한 유전자로부터 또는 상이한 유전자로부터 유래될 수 있고, 동일한 또는 상이한 유기체로부터 유래될 수 있다. 플라스미드 및 진균 벡터를 포함하는 매우 다수의 벡터는 다양한 진핵 및 원핵 숙주에서 복제 및/또는 발현을 위해 기재되었다. 비제한적 예는 pKK 플라스미드(Clonetech), pUC 플라스미드, pET 플라스미드(Novagen, Inc., 위스콘신주 메디슨 소재), pRSET 또는 pREP 플라스미드(Invitrogen, 캘리포니아주 샌디에이고 소재), 또는 pMAL 플라스미드(New England Biolabs, 매사추세츠주 비버리 소재), 및 본 명세서에 개시되건 또는 인용되거나 또는 달리 당업자에게 알려진 방법을 이용하는 다수의 적절한 숙주 세포를 포함한다. 재조합 클로닝 벡터는 종종 클로닝 또는 발현을 위한 하나 이상의 복제 시스템, 숙주에서 선택을 위한 하나 이상의 마커, 예를 들어, 항생제 내성 및 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 것이다.
용어 "재조합 발현 벡터"는 작제물이 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 때, 숙주 세포에 의한 mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드의 발현을 허용하는 유전자 변형 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 의미하고, mRNA, 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드가 세포 내에서 발현되게 하는 데 충분한 조건 하에서 벡터는 세포와 접촉된다. 본 개시내용의 벡터는 전체로서 천연 유래가 아니다. 벡터의 일부는 천연 유래일 수 있다. 본 개시내용의 비천연 유래 재조합 발현 벡터는 단일-가닥 또는 이중-가닥이고, 천연 공급원으로부터 부분적으로 합성되거나 얻을 수 있고, 천연, 비천연 또는 변경된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있는, DNA 및 RNA를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 유형의 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "형질감염", "형질전환" 또는 "형질도입"은 물리적 또는 화학적 방법을 이용하는 것에 의한 숙주 세포 내로의 하나 이상의 외인성 폴리뉴클레오타이드의 도입을 지칭한다.
"항체", "항체의 단편", "항체 단편", "항체의 기능성 단편" 또는 "항원-결합 부분"은 특정 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편 또는 부분을 의미하기 위해 상호 호환적으로 사용된다(Holliger et al., Nat. Biotech. (2005) 23(9): 1126). 본 항체는 항체 및/또는 이의 단편일 수 있다. 항체 단편은 Fab, F(ab')2, scFv, 이황화 연결된 Fv, Fc 또는 변이체 및/도는 혼합물을 포함한다. 항체는 키메라, 인간화, 단일쇄 또는 이중특이성일 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM을 포함하는 모든 항체 아이소타입은 본 개시내용에 포함된다. 적합한 IgG 하위유형은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 항체 경쇄 또는 중쇄 가변 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 지칭되는 3개의 초가변 영역에 의해 가로막힌 프레임워크 영역으로 이루어진다. 본 항체 또는 항원-결합 부분의 CDR은 비-인간 또는 인간 공급원으로부터 유래될 수 있다. 본 항체 또는 항원-결합 부분의 프레임워크는 인간, 인간화, 비-인간(예를 들어, 인간에서 항원성을 감소시키도록 변형된 뮤린 프레임워크), 또는 합성 프레임워크(예를 들어, 공통 서열)일 수 있다.
본 항체 또는 항원-결합 부분은 약 10-7M 미만, 약 10-8M 미만, 약 10-9M 미만, 약 10-10M 미만, 약 10-11M 미만 또는 약 10-12M 미만의 해리 상수(KD)로 특이적으로 결합할 수 있다. 본 개시내용에 따른 항체의 친화도는 통상적인 기법을 이용하여 용이하게 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Scatchard et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. (1949) 51:660]; 및 미국 특허 제5,283,173호, 제5,468,614호, 또는 균등물).
핵산 서열에 의해 암호화된 조작된 단백질의 항원 인식 모이어티는 임의의 계통 항원-특이적, 항원-결합 항체 단편을 포함할 수 있다. 항체 단편은 하나 이상의 CDR, 가변 영역(또는 이의 일부), 불변 영역(또는 이의 일부) 또는 임의의 앞서 언급한 것의 조합물을 포함할 수 있다.
용어 "숙주 세포"는 세포에 의한 물질의 생산, 예를 들어, 유전자, DNA 또는 RNA 서열, 단백질 또는 효소의 세포에 의한 발현을 위해 임의의 방법으로 선택되거나, 변형되거나, 형질전환되거나, 성장되거나 또는 조작된 임의의 유기체의 세포를 의미한다. 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 선별 또는 다른 분석을 위해 추가로 사용될 수 있다.
용어 "세포 계통"은 공통 혈통을 갖고 동일 유형의 식별 가능한 세포로부터 특정 식별 가능한/기능화 세포로 발생되는 세포를 지칭한다. 본 명세서에서 사용되는 세포 계통은 호흡기, 전립선, 췌장, 유방, 신장, 장, 신경, 골격, 혈관, 간, 조혈, 근육 또는 심장 세포 계통을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "저해"는 계통 특이적 항원의 유전자 발현 또는 기능과 관련하여 사용될 때 계통 특이적 항원의 유전자 발현 또는 기능 수준의 감소를 지칭하며, 여기서, 저해는 유전자 발현 또는 기능에 의한 방해의 결과이다. 저해는 검출 가능한 발현 또는 기능이 없는 경우에 완전할 수 있거나, 부분적일 수 있다. 부분적 저해는 거의 완전한 저해로부터 저해가 거의 없음까지의 범위일 수 있다.
용어 "치료하다", "치료" 등은 질환의 개시 후에 질환의 증상 중 적어도 하나를 늦추거나, 완화시키거나 또는 호전시키거나 또는 경감시키거나, 또는 질환을 반전시키는 것을 의미하는 것을 지칭한다.
상태, 장애 또는 병태를 "치료하는" 또는 "치료"는 하기를 포함한다:
(1) 상태, 장애 또는 병태를 앓거나 이런 경향이 있을 수 있지만 상태, 장애 또는 병태의 임상 증상을 아직 경험하지 않거나 또는 나타내지 않는 사람에서 발생되는 상태, 장애 또는 병태의 임상 증상의 출현을 예방하거나 또는 지연시키는 것; 또는
(2) 상태, 장애 또는 병태를 저해하는 것, 즉, (유지 치료의 경우에) 질환 또는 이의 재발의 발생 또는 적어도 하나의 임상 증상, 징후 또는 시험을 저지하거나, 감소시키거나 또는 지연시키는 것; 또는
(3) 질환을 완화시키는 것, 즉, 상태, 장애 또는 병태 또는 이의 임상적 또는 하위 임상적 증상 또는 징후 중 적어도 하나의 퇴행을 야기하는 것.
대상체가 치료되는 것의 이점은 통계학적으로 유의하거나 또는 환자 또는 의사가 적어도 인식 가능하다.
용어 "예방하다", "예방" 등은 질환이 발생하는 것을 방지하거나 또는 질환 정도를 최소화하거나 또는 이의 발생 과정을 늦추기 위한 명백한 질환 발병 전의 작용을 지칭한다.
"면역 반응"은 관심 조성물 또는 백신에 대한 세포 및/또는 항체-매개 면역 반응의 숙주에서의 발생을 지칭한다. 이러한 반응은 보통 관심 조성물 또는 백신에 포함된 항원 또는 항원들에 특이적으로 향하는 대상체 생산 항체, B 세포, 헬퍼 T 세포, 억제자 T 세포, 조절 T 세포 및/또는 세포독성 T 세포로 이루어진다.
"치료적 유효량" 또는 "유효량"은 상태, 장애 또는 병태를 치료하기 위해 동물에게 투여될 때 이러한 치료에 영향을 미치기에 충분한 화합물 또는 제제의 양을 의미한다. "치료적 유효량"은 화합물, 질환 및 이의 중증도 및 치료될 동물의 연령, 체중, 신체 상태 및 반응에 따라 다를 것이다.
본 명세서에 개시된 조성물은 "치료적 유효량" 또는 "예방적 유효량"의 본 명세서에 기재된 화합물을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 목적하는 치료적 결과를 달성하는 데 필요한 투약량에서 필요한 일정 기간 동안의 효과적인 양을 지칭한다. 치료적 유효량의 항체 또는 항체 부분은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중과 같은 인자, 및 개체에서 목적하는 반응을 유발하는 항체 또는 항체 일부의 능력에 따라 다를 수 있다. 치료적 유효량은 또한 치료적으로 유리한 효과가 화합물의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 것이다. "예방적 유효량"은 목적하는 예방적 결과를 달성하는 데 필요한 투약량에서 필요한 일정 기간 동안의 효과적인 양을 지칭한다. 전형적으로, 예방적 용량은 대상체에서 질환 전에 또는 질환의 초기 병기에서 사용되기 때문에, 예방적 유효량은 치료적 유효량보다 더 적을 것이다.
요법을 위해 본 개시내용에 의해 제공되는 조성물을 그대로 사용할 수 있지만, 약제학적 제형에서, 예를 들어, 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 실행에 관해 선택된 적합한 약제학적 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합하여 이를 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 일 양상에서, 본 개시내용은 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체와 함께 적어도 하나의 활성 조성물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 유도체를 포함하는 약제학적 조성물 또는 제형을 제공한다. 부형제, 희석제 및/또는 담체는 제형의 다른 성분과 양립 가능하며 이의 수용자에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용 가능"하여야 한다.
본 개시내용의 조성물은 인간 또는 수의학적 의학에서 사용하기 위한 임의의 편리한 방법으로 투여를 위해 제형화될 수 있다. 따라서 본 발명은 이의 범주 내에서 인간 또는 수의학적 의학에서 사용하는 데 적합한 본 발명의 생성물을 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적 조성물"은 질환 또는 장애의 치료 및/또는 예방과 관련하여 대상체에게 투여될 수 있는 조성물을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 활성 성분, 예를 들어, 본 발명의 융합 폴리펩타이드, 핵산 분자, 벡터, 제제 등 및 선택적으로 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 및/또는 담체를 포함한다.
치료 용도를 위한 허용 가능한 부형제, 희석제 및 담체는 약제 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy. Lippincott Williams & Wilkins (A. R. Gennaro edit. 2005)]에 기재되어 있다. 약제학적 부형제, 희석제 및 담체의 선택은 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 실행과 관련하여 선택될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 어구 "약제학적으로 허용 가능한"은 "일반적으로 안전한 것으로 간주되는(generally regarded as safe)", 예를 들어, 생리적으로 용인 가능하고 인간에게 투여될 때 알레르기 또는 유사한 뜻 밖의 반응, 예컨대, 위 경련, 현기증 등을 전형적으로 생성하지 않는 분자 독립체 및 조성물을 지칭한다. 바람직하게는, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 동물, 더 구체적으로는 인간에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식되는 약전에 열거된 것을 의미한다.
치료 제형의 투약량은 질환의 특성, 환자의 의학적 병력, 투여 빈도, 투여 방식, 숙주로부터의 제제의 제거 등에 따라 크게 다를 것이다. 개시 용량은 더 클 수 있고, 더 적은 유지 용량이 이어질 수 있다. 용량은 유효 투약 수준을 유지하기 위해 매주 또는 격주로 드물게 투여될 수 있거나, 더 적은 용량으로 분획화되고, 매일, 주 2회 등으로 투여될 수 있다. 일부 경우에, 경구 투여는 정맥내로 투여된다면 보다 고용량을 필요로 할 것이다. 일부 경우에, 국소 투여는 필요하다면 유효 국소 용량을 제공하기 위해 며칠 또는 몇 주 동안 1일에 여러 번의 적용을 포함할 것이다.
용어 "담체"는 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원, 예컨대, 낙화생유, 대두유, 광유, 참깨유 등을 포함하는 오일 및 물과 같은 멸균 액체일 수 있다. 물 또는 수용액 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 바람직하게는 담체로서, 특히 주사 가능한 용액에 대해 사용된다. 대안적으로, 담체는 (압축된 알약에 대해) 결합제, 활택제, 캡슐화제, 향미제 및 착색제 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 담체의 고체 투약 형태일 수 있다. 적합한 약제학적 담체는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martin]에 기재되어 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "제제"는 효과를 생성하거나 생성할 수 있고 화학물질, 약제, 생물제제, 작은 유기 분자, 항체, 핵산, 펩타이드 및 단백질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 물질을 의미한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 값이 측정되거나 결정되는 방법, 즉, 측정 시스템의 제한, 즉, 특정 목적, 예컨대, 약제학적 제형에 필요한 정밀도에 부분적으로 따르는 당업자에 의해 결정되는 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 이내를 의미한다. 예를 들어, "약"은 당업계의 실행에 따라 1 이내 또는 1 초과이 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더 바람직하게는 최대 5%, 더욱 더 바람직하게는 최대 1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정에 관해, 상기 용어는 값의 10배 이내, 바람직하게는 5배, 더 바람직하게는 2배 이내를 의미한다. 본 출원 및 청구범위에서 특정 값이 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"은 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위가 추정되어야 한다는 것을 의미한다.
일반적 기법
본 개시내용의 실행은, 달리 표시되지 않는 한, 당업자의 기술 이내인 분자 생물학(재조합 기법을 포함), 미생물, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984≫; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986≫; Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986)]과 같은 문헌에서 완전하게 설명된다.
본 개시내용은 계통 특이적 세포-표면 항원을 발현시키는 세포의 세포사를 야기할 수 있는 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33)에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하는 제제를 제공한다. 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33)에 결합하는 항원-결합 단편과 자연살해(NK) 세포 및/또는 T 세포와 같은 면역 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드의 조합에 관한 면역요법은 조혈성 악성종양에 대한 효능있는 치료 방법을 제공할 것이다.
본 개시내용은 (i) 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33)에 결합하는 항원-결합 단편; 및 (ii) 면역 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는 (또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 제1 및 제3 조작된 이형이량체 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 자연살해(NK) 세포이다. 일부 실시형태에서, 분자는 ULBP이다. 일부 실시형태에서, 분자는 CD16이다.
본 개시내용은 (i) 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33)에 결합하는 항원-결합 단편; 및 (ii) T 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는 (또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 제2 조작된 이형이량체 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 분자는 CD3이다.
본 개시내용은 추가로 (i) 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33)에 결합하는 항원-결합 단편; 및 (ii) 면역 세포(예를 들어, NK 세포)에 결합하는 폴리펩타이드; 및 (iii) T 세포(예를 들어, CD3) 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 조작된 이형삼량체 단백질을 제공한다.
도 2, 도 9 및 도 10을 참조한다.
본 조성물 및 방법은 NKG2D-보유 면역 효과기 세포, 예컨대, 자연살해 (NK) 세포 및/또는 CD8+ T 세포 활성화를 도울 수 있다. 본 조성물 및 방법은 세포독성을 유도할 수 있는 질환 세포(예컨대, 종양 세포)에 대해 세포 면역 반응을 향상시키거나 촉발시킬 수 있다(예를 들어, 종양 세포와 같은 질환 세포의 사멸로 끝남). 본 조성물 및 방법은 다음 중 하나 이상을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 대상체의 면역 반응을 향상시킬 수 있다: 자연살해(NK) 세포의 상향조절; T 세포(예를 들어, 감마 델타 T 세포, 알파 베타 T 세포) 기능의 상향조절; T(NKT) 세포 기능의 상향조절; 및 B 세포 기능의 상향조절. 일부 실시형태에서, NK 세포, T 세포, 자연살해 T(NKT) 세포 및 B 세포 기능 중 하나 이상의 상향조절은 암 진행을 저해 또는 감소시킬 수 있는 활성의 향상 및/또는 자질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 암 진행의 저해는, 예를 들어, 종양 세포의 세포자멸사의 직접 유도, 고유 숙주 항종양 반응의 자극을 통한 종양 세포의 세포용해 유도, 고유 숙주 항종양 반응의 자극을 통한 종양 세포의 세포자멸사 유도, 종양 세포 전이의 저해, 종양 세포 증식의 저해 및 종양 세포에서의 노화의 유도에 의해, 종양 세포의 세포용해에 의해 달성될 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 발명의 조작된 단백질, 제제 또는 조성물을 암호화하는 하나 이상의 핵산(폴리뉴클레오타이드)을 제공한다.
본 개시내용의 다른 양상은 본 명세서에 제공된 임의의 핵산(또는 폴리뉴클레오타이드) 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 또한, 본 명세서에 기재된 핵산에 의해 암호화된 폴리뉴클레오타이드 및 이러한 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 세포는 본 개시내용의 범주 이내이다.
일부 실시형태에서, 세포는 조혈성 악성종양을 갖는 환자로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 조혈 세포, 예컨대, 조혈모세포(예를 들어, CD34+)이다. 일부 실시형태에서, 세포는, 예를 들어, 본 명세서에 제공된 조작된 단백질의 재조합 발현 및 정제를 위해, 제공된다. 세포는 재조합 단백질 발현에 적합하나 임의의 세포, 예를 들어, 조작된 단백질을 발현시키거나 발현시킬 수 있는 유전자 작제물 또는 벡터를 포함하는 세포(예를 들어, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포 또는 게놈 변형을 갖는 세포, 예를 들어, 본 명세서에 제공된 단백질을 발현시키는 것)를 포함한다. 세포를 형질전환시키고, 세포를 유전자 변형시키고, 이러한 세포에서 유전자 및 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌[Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)) 및 Friedman and Rossi, Gene Transfer: Delivery and Expression of DNA and RNA, A Laboratory Manual (1st ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2006))]에 의해 제공된 것을 포함한다.
추가로, 본 개시내용은 본 제제, 폴리펩타이드, 핵산(또는 폴리뉴클레오타이드) 분자, 벡터, 세포 및/또는 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 개시내용은 또한 조혈성 악성종양을 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효량의 임의의 개시된 조작된 단백질 또는 조작된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 유효량의 본 발명의 제제 또는 조성물, 또는 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 폴리펩타이드의 조합물) 또는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 다른 양상은 조혈성 악성종양(또는 조혈신생물)을 치료하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 임의의 개시된 조작된 단백질 또는 조작된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 유효량의 본 발명의 제제 또는 조성물, 또는 제제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 폴리펩타이드의 조합물) 또는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 개시내용은 또한 조혈성 악성종양, 예컨대, 골수성 악성종양을 치료하기 위해 조작된 단백질을 이용하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명의 제제, 폴리펩타이드, 핵산(또는 폴리뉴클레오타이드) 분자, 벡터, 세포 및/또는 조성물을 포함하는 키트는 본 개시내용의 범주 이내이다.
조작된 헤테로 단백질
본 개시내용은 조작된 헤테로 단백질을 제공한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33)에 결합하는 항원-결합 단편; 및 (ii) 면역 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는 (또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 제1 및 제3 조작된 이형이량체 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 면역 세포는 자연살해(NK) 세포이다. 일부 실시형태에서, 분자는 ULBP이다. 일부 실시형태에서, 분자는 CD16이다.
추가 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33)에 결합하는 항원-결합 단편; 및 (ii) T 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는 (또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 제2 조작된 이형이량체 단백질을 제공한다. 일부 실시형태에서, 분자는 CD3이다.
또한 추가 실시형태에서, 본 개시내용은 (i) 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33)에 결합하는 항원-결합 단편; 및 (ii) 면역 세포(예를 들어, NK 세포)에 결합하는 폴리펩타이드; 및 (iii) T 세포(예를 들어, CD3) 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 조작된 이형삼량체 단백질을 제공한다.
일부 실시형태에서, 제3 폴리펩타이드는 면역 반응을 증가시키는 케모카인 또는 사이토카인 단백질이다. 케모카인 또는 사이토카인 단백질은 CXCL14를 포함하는 CXCL, GCSF, 및 IL2 및 IL16을 포함하는 인터류킨을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 2형 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33)인 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 1형 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD19)인 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합한다. 일부 실시형태에서, 항원-결합 단편은 암 및/또는 종양 세포에 의해 발현 또는 과발현된 항원에 결합한다.
자연살해(NK) 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA, MICB, Raet1a, Raet1b, Raet1c, Raet1d, Raet1e, H60b, H60c 또는 HCMV UL18의 단편, 이들의 상동체, 이들의 돌연변이체, 또는 이들의 단편일 수 있다. 자연살해(NK) 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA, MICB, Raet1a, Raet1b, Raet1c, Raet1d, Raet1e, H60b, H60c, HCMV UL18의 엑토도메인, 이들의 상동체, 이들의 돌연변이체, 또는 이들의 단편일 수 있다.
특정 실시형태에서, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA, MICB, Raet1a, Raet1b, Raet1c, Raet1d, Raet1e, H60b, H60c 또는 HCMV UL18의 단편은 ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA, MICB, Raet1a, Raet1b, Raet1c, Raet1d, Raet1e, H60b, H60c 또는 HCMV UL18의 엑토도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA, MICB, Raet1a, Raet1b, Raet1c, Raet1d, Raet1e, H60b, H60c 또는 HCMV UL18의 단편은 ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA, MICB, Raet1a, Raet1b, Raet1c, Raet1d, Raet1e, H60b, H60c, HCMV UL18의 엑토도메인, 이들의 상동체, 이들의 돌연변이체, 또는 이들의 단편을 포함한다.
일부 실시형태에서, NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 NK 세포의 세포 표면 마커의 항체이다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 마커는 CD16이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단클론성 항체이다.
특정 실시형태에서, T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 T 세포의 세포 표면 마커의 항체이다. 일부 실시형태에서, 세포 표면 마커는 CD3이다. 일부 실시형태에서, 항체는 단클론성 항체이다.
특정 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 (i) 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및 (ii) 자연살해(NK) 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함한다. 도 1 및 도 10B를 참조한다.
특정 실시형태에서, 항원-결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', F(ab)', Fv, 이황화연결된 Fv, 단일 쇄 Fv(scFv), 2가 scFv(bi-scFv), 3가 scFv(tri-scFv), Fd, dAb 단편, 단리된 CDR, 다이어바디(diabody), 트라이어바디(triabody), 테트라바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, scFv는 중쇄 가변 영역(VH), 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인은 6DMPa이다(Chen et al. 2019). 일부 실시형태에서, 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인은 6DMPb이다(Chen et al. 2019).
일부 실시형태에서, 공유 이량체화 도메인은 IgG2 힌지 도메인이다. 일부 실시형태에서, 공유 이량체화 도메인은 IgG2 도메인 및 IgG2 Fc 도메인이다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 CH2 및 CH3 도메인이다.
제1 조작된 이형이량체 단백질은 기능성 모이어티(계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 및 NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드)를 임의의 순서로 배치하도록 설계될 수 있다. 특정 실시형태에서, 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편은 융합 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 위치된다. 특정 실시형태에서, 자연살해(NK) 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 C-말단 또는 N-말단에 위치된다.
일부 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 N-말단에서 C-말단까지, 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33 또는 CD19)에 결합하는 scFv, 및 ULBP1의 엑토도메인(또는 ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA 또는 MICB의 엑토도메인)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는, N 말단에서 C 말단까지, ULBP1의 엑토도메인(또는 ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA 또는 MICB의 엑토도메인), 및 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33 또는 CD19)에 결합하는 scFv를 포함한다.
제1 조작된 이형이량체 단백질은 신호 서열, 및/또는 하나 이상의 링커를 추가로 포함할 수 있다. 융합 폴리펩타이드에서, 이들 기능성 모이어티는 지속적으로 또는 비지속적으로 공유적으로 결찰될 수 있다(예를 들어, 이들은 링커에 의해 분리될 수 있다). 링커는 최대 50, 최대 40, 최대 30, 최대 20, 최대 18, 최대 15, 최대 12, 최대 11 또는 최대 10개의 아미노산 잔기 길이를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 링커는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 내지 20, 8 내지 10, 8 내지 12, 8 내지 15, 8 내지 20 또는 8 내지 30개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 링커는 약 7 내지 10, 7 내지 12, 7 내지 15, 7 내지 20, 또는 7 내지 30개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다.
유도체화된 단백질의 한 가지 유형은 (동일한 유형의 또는 상이한 유형의) 둘 이상의 폴리펩타이드를 가교함으로써 생성된다. 적합한 가교제는 적절한 스페이서(예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터) 또는 동형이작용성(예를 들어, 다이석신이미딜 수베레이트)에 의해 분리되는 2개의 별개의 반응기를 갖는 이형이작용성인 것을 포함한다. 단백질과 함께 유도체화(또는 표지)될 수 있는 유용한 검출 가능한 제제는 형광 제제, 다양한 효소, 보결분자단, 발광 물질, 생물 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 비제한적인, 예시적 형광 검출 가능 제제는 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민 및 피코에리트린을 포함한다. 폴리펩타이드는 또한 검출 가능한 효소, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, 겨자무 과산화효소, 베타-갈락토시다제, 아세틸콜린에스터라제, 글루코스 옥시다제 등에 의해 유도체화될 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 보결분자단(예를 들어, 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴)에 의해 유도체화될 수 있다.
제1 조작된 이형이량체 단백질은 다른 작용성 분자로 유도체화되거나 이에 연결될 수 있다. 예를 들어, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 하나 이상의 다른 분자 독립체, 예컨대, 항체 또는 항체 단편, 검출 가능한 제제, 면역억제제, 세포독성제, 약제학적 제제, 다른 분자(예컨대, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드, 아미노산 링커, 신호 서열, 면역원성 담체 또는 단백질 정제에서 유용한 리간드, 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 히스티딘 태그 및 스타필로코커스 단백질 A에 (화학 결합, 유전적 융합, 비공유 상호작용에 의해) 기능적으로 연결될 수 있다. 세포독성제는 방사성 동위원소, 화학치료제, 및 독소, 예컨대, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 및 이들의 단편을 포함할 수 있다.
제1 조작된 이형이량체 단백질은 폴리-히스티딘(예를 들어, 6개의 히스티딘 잔기), 말토스 결합 단백질, GST, 녹색 형광 단백질(GFP), 혈구응집소 또는 알칼리성 포스파타제, 분비 신호 펩타이드(예를 들어, 프레프로트립신 신호 서열), Myc 및/또는 FLAG를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 폴리펩타이드 생산 및/또는 검출에 유용한 단편(예를 들어, 태그)를 더 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 1(도 3) 및 서열번호 2(도 4) 또는 서열번호 4(도 6) 및 서열번호 5(도 7)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다).
일 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 IL2 분비 신호 서열: MYRMQLLSCIALSLALVTNS(서열번호 7)(도 3, 도 4, 도 6 및 도 8)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 신호 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 Myc: EQKLISEEDL(서열번호 8)(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 태그를 포함한다.
일 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 FLAG: DYKDDDDK(서열번호 14)(도 4 및 도 7)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 태그를 포함한다.
일 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 미국 특허 공해 제20130078241호에 개시된 항-CD33 scFv에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 항-CD33 scFv를 포함한다.
일 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하며, 항원-결합 단편은 서열번호 9(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
항-CD33 경쇄 가변 영역(VL)(서열번호 9):
Figure pct00001
일 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하며, 항원-결합 단편은 서열번호 10(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다:
항-CD33 중쇄 가변 영역(VH)(서열번호 10):
Figure pct00002
특정 실시형태에서, 자연살해(NK) 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 야생형 ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA, MICB 또는 HCMV UL18(인간 ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA, MICB 또는 HCMV UL18을 포함함)의, 또는 Raet1a, Raet1b, Raet1c, Raet1d, Raet1e, H60b, H60c의 인간 상동체의 전장 또는 단편의, 전장 아미노산 서열 또는 단편에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다).
일 실시형태에서, 인간 ULBP1은 UniProt 수탁번호 Q9BZM6을 갖는다. 일 실시형태에서, 엑토도메인 인간 ULBP1은 Q9BZM6-1의 아미노산 잔기 27 내지 216을 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다).
일 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 15(도 4 및 도 7)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) ULBP1 엑토도메인을 포함한다:
ULBP1 엑토도메인(Q9BZM6-1의 27 내지 216)(서열번호 15):
Figure pct00003
일 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 12(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 하나 이상의 비천연 유래 폴리펩타이드를 포함한다.
6DMPa(서열번호 12):
Figure pct00004
일 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 16(도 4 및 도 7)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 하나 이상의 비천연 유래 폴리펩타이드를 포함한다.
6DMPb(서열번호 16):
Figure pct00005
일 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 IgG2 힌지: ERKCCVECPPCP(서열번호 13)(도 3, 도 4, 도 6 및 도 7)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 공유 이량체화 IgG2 힌지 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 19(도 6 및 도 7)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 공유 이량체화 IgG2 Fc 도메인을 포함한다.
IgG2 Fc 도메인(서열번호 19):
Figure pct00006
일 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 11: GGGGSGGGGSGGGGS(도 3, 도 4, 도 6 및 도 7)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 링커를 포함한다.
추가 실시형태에서, 제1 조작된 이형이량체 단백질은 His6 태그(HHHHHH; 서열번호 20)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 (i) 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및 (ii) T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함한다.
특정 실시형태에서, 항원-결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', F(ab)', Fv, 이황화연결된 Fv, 단일 쇄 Fv(scFv), 2가 scFv(bi-scFv), 3가 scFv(tri-scFv), Fd, dAb 단편, 단리된 CDR, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, scFv는 중쇄 가변 영역(VH), 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인은 6DMPa이다(Chen et al. 2019). 일부 실시형태에서, 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인은 6DMPb이다(Chen et al. 2019).
일부 실시형태에서, 공유 이량체화 도메인은 IgG2 힌지 도메인이다. 일부 실시형태에서, 공유 이량체화 도메인은 IgG2 도메인 및 IgG2 Fc 도메인이다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 CH2 및 CH3 도메인이다.
제2 조작된 이형이량체 단백질은 기능성 모이어티(계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 및 T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드)를 임의의 순서로 배치하도록 설계될 수 있다. 특정 실시형태에서, 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편은 융합 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 위치된다. 특정 실시형태에서, T 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 C-말단 또는 N-말단에 위치된다.
일부 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은, N-말단에서 C-말단까지, 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33 또는 CD19)에 결합하는 scFv, 및 T 세포 상에서 발현되는 분자(예를 들어, 항-CD3 단클론성 항체)에 결합하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는, N 말단에서 C 말단까지, T 세포 상에서 발현되는 분자(예를 들어, 항-CD3 단클론성 항체)에 결합하는 폴리펩타이드 및 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33 또는 CD19)에 결합하는 scFv를 포함한다.
제2 조작된 이형이량체 단백질은 신호 서열, 및/또는 하나 이상의 링커를 추가로 포함할 수 있다. 제2 조작된 이형이량체에서, 이들 기능성 모이어티는 지속적으로 또는 비지속적으로 공유적으로 결찰될 수 있다(예를 들어, 이들은 링커에 의해 분리될 수 있다). 링커는 최대 50, 최대 40, 최대 30, 최대 20, 최대 18, 최대 15, 최대 12, 최대 11 또는 최대 10개의 아미노산 잔기 길이를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 링커는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 내지 20, 8 내지 10, 8 내지 12, 8 내지 15, 8 내지 20 또는 8 내지 30개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 링커는 약 7 내지 10, 7 내지 12, 7 내지 15, 7 내지 20, 또는 7 내지 30개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다.
유도체화된 단백질의 한 가지 유형은 (동일한 유형의 또는 상이한 유형의) 둘 이상의 폴리펩타이드를 가교함으로써 생성된다. 적합한 가교제는 적절한 스페이서(예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터) 또는 동형이작용성(예를 들어, 다이석신이미딜 수베레이트)에 의해 분리되는 2개의 별개의 반응기를 갖는 이형이작용성인 것을 포함한다. 단백질과 함께 유도체화(또는 표지)될 수 있는 유용한 검출 가능한 제제는 형광 제제, 다양한 효소, 보결분자단, 발광 물질, 생물 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 비제한적인, 예시적 형광 검출 가능 제제는 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민 및 피코에리트린을 포함한다. 폴리펩타이드는 또한 검출 가능한 효소, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, 겨자무 과산화효소, 베타-갈락토시다제, 아세틸콜린에스터라제, 글루코스 옥시다제 등에 의해 유도체화될 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 보결분자단(예를 들어, 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴)에 의해 유도체화될 수 있다.
제2 조작된 이형이량체 단백질은 다른 작용성 분자로 유도체화되거나 이에 연결될 수 있다. 예를 들어, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 하나 이상의 다른 분자 독립체, 예컨대, 항체 또는 항체 단편, 검출 가능한 제제, 면역억제제, 세포독성제, 약제학적 제제, 다른 분자(예컨대, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드, 아미노산 링커, 신호 서열, 면역원성 담체 또는 단백질 정제에서 유용한 리간드, 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 히스티딘 태그 및 스타필로코커스 단백질 A에 (화학 결합, 유전적 융합, 비공유 상호작용 등에 의해) 기능적으로 연결될 수 있다. 세포독성제는 방사성 동위원소, 화학치료제, 및 독소, 예컨대, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 및 이들의 단편을 포함할 수 있다.
제2 조작된 이형이량체 단백질은 폴리-히스티딘(예를 들어, 6개의 히스티딘 잔기), 말토스 결합 단백질, GST, 녹색 형광 단백질(GFP), 혈구응집소 또는 알칼리성 포스파타제, 분비 신호 펩타이드(예를 들어, 프레프로트립신 신호 서열), Myc 및/또는 FLAG를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 폴리펩타이드 생산 및/또는 검출에 유용한 단편(예를 들어, 태그)를 더 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 1(도 3) 및 서열번호 3(도 5) 또는 서열번호 4(도 6) 및 서열번호 6(도 8)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다).
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 IL2 분비 신호 서열: MYRMQLLSCIALSLALVTNS(서열번호 7)(도 3, 도 5, 도 6 및 도 8)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 신호 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 Myc: EQKLISEEDL(서열번호 8)(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 태그를 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 FLAG: DYKDDDDK(서열번호 14)(도 5 및 도 8)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 태그를 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 미국 특허 공해 제20130078241호에 개시된 항-CD33 scFv에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 항-CD33 scFv를 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하며, 항원-결합 단편은 서열번호 9(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
항-CD33 경쇄 가변 영역(VL)(서열번호 9):
Figure pct00007
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하며, 항원-결합 단편은 서열번호 10(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다:
항-CD33 중쇄 가변 영역(VH)(서열번호 10):
Figure pct00008
특정 실시형태에서, T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 서열번호 17 및 18의 아미노산 서열에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다).
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 CD3에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하며, 항원-결합 단편은 서열번호 17(도 5 및 도 8)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다:
항-CD3 중쇄 가변 영역(VH)(서열번호 17):
Figure pct00009
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 CD3에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하며, 항원-결합 단편은 서열번호 18(도 5 및 도 8)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다:
항-CD3 경쇄 가변 영역(VH)(서열번호 18):
Figure pct00010
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 12(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 하나 이상의 비천연 유래 폴리펩타이드를 포함한다.
6DMPa (서열번호 12):
Figure pct00011
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 16(도 5 및 도 8)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 하나 이상의 비천연 유래 폴리펩타이드를 포함한다.
6DMPb (서열번호 16):
Figure pct00012
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 IgG2 힌지: ERKCCVECPPCP(서열번호 13)(도 3, 도 5, 도 6 및 도 8)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 공유 이량체화 IgG2 힌지 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 19(도 6 및 도 8)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 공유 이량체화 IgG2 Fc 도메인을 포함한다.
IgG2 Fc 도메인(서열번호 19):
Figure pct00013
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 11 GGGGSGGGGSGGGGS(도 3 내지 도 8)에 대해 또는 서열번호 21 GGSGGSGGSGGSGG(도 5 및 도 8, CD3 VH-VL 링커)에 대해 또는 서열번호 22 SGSGSG (도 5 및 도 8, CD3-VL 내의 링커)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 링커를 포함한다.
추가 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 His6 태그(HHHHHH; 서열번호 20)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 본개시내용은 (i) 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및 (ii) 자연살해(NK) 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는, 제2 폴리펩타이드를 포함하는 제3의 조작된 이형이량체 단백질을 제공한다. 도 23을 참조한다.
특정 실시형태에서, 항원-결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', F(ab)', Fv, 이황화연결된 Fv, 단일 쇄 Fv(scFv), 2가 scFv(bi-scFv), 3가 scFv(tri-scFv), Fd, dAb 단편, 단리된 CDR, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, scFv는 중쇄 가변 영역(VH), 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인은 6DMPa이다(Chen et al. 2019). 일부 실시형태에서, 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인은 6DMPb이다(Chen et al. 2019).
일부 실시형태에서, 공유 이량체화 도메인은 IgG2 힌지 도메인이다. 일부 실시형태에서, 공유 이량체화 도메인은 IgG2 도메인 및 IgG2 Fc 도메인이다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 CH2 및 CH3 도메인이다.
제3 조작된 이형이량체 단백질은 기능성 모이어티(계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 및 NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드)를 임의의 순서로 배치하도록 설계될 수 있다. 특정 실시형태에서, 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편은 융합 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 위치된다. 특정 실시형태에서, 자연살해(NK) 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 C-말단 또는 N-말단에 위치된다.
일부 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은, N-말단에서 C-말단까지, 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33 또는 CD19)에 결합하는 scFv, 및 NK 세포 상에서 발현되는 분자(예를 들어, 항-CD16 단클론성 항체)에 결합하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는, N 말단에서 C 말단까지, NK 세포 상에서 발현되는 분자(예를 들어, 항-CD16 단클론성 항체)에 결합하는 폴리펩타이드 및 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33 또는 CD19)에 결합하는 scFv를 포함한다.
제3 조작된 이형이량체 단백질은 신호 서열, 및/또는 하나 이상의 링커를 추가로 포함할 수 있다. 융합 폴리펩타이드에서, 이들 기능성 모이어티는 지속적으로 또는 비지속적으로 공유적으로 결찰될 수 있다(예를 들어, 이들은 링커에 의해 분리될 수 있다). 링커는 최대 50, 최대 40, 최대 30, 최대 20, 최대 18, 최대 15, 최대 12, 최대 11 또는 최대 10개의 아미노산 잔기 길이를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 링커는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 내지 20, 8 내지 10, 8 내지 12, 8 내지 15, 8 내지 20 또는 8 내지 30개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 링커는 약 7 내지 10, 7 내지 12, 7 내지 15, 7 내지 20, 또는 7 내지 30개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다.
유도체화된 단백질의 한 가지 유형은 (동일한 유형의 또는 상이한 유형의) 둘 이상의 폴리펩타이드를 가교함으로써 생성된다. 적합한 가교제는 적절한 스페이서(예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터) 또는 동형이작용성(예를 들어, 다이석신이미딜 수베레이트)에 의해 분리되는 2개의 별개의 반응기를 갖는 이형이작용성인 것을 포함한다. 단백질과 함께 유도체화(또는 표지)될 수 있는 유용한 검출 가능한 제제는 형광 제제, 다양한 효소, 보결분자단, 발광 물질, 생물 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 비제한적인, 예시적 형광 검출 가능 제제는 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민 및 피코에리트린을 포함한다. 폴리펩타이드는 또한 검출 가능한 효소, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, 겨자무 과산화효소, 베타-갈락토시다제, 아세틸콜린에스터라제, 글루코스 옥시다제 등에 의해 유도체화될 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 보결분자단(예를 들어, 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴)에 의해 유도체화될 수 있다.
제3 조작된 이형이량체 단백질은 다른 작용성 분자로 유도체화되거나 이에 연결될 수 있다. 예를 들어, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 하나 이상의 다른 분자 독립체, 예컨대, 항체 또는 항체 단편, 검출 가능한 제제, 면역억제제, 세포독성제, 약제학적 제제, 다른 분자(예컨대, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드, 아미노산 링커, 신호 서열, 면역원성 담체 또는 단백질 정제에서 유용한 리간드, 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 히스티딘 태그 및 스타필로코커스 단백질 A에 (화학 결합, 유전적 융합, 비공유 상호작용에 의해) 기능적으로 연결될 수 있다. 세포독성제는 방사성 동위원소, 화학치료제, 및 독소, 예컨대, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 및 이들의 단편을 포함할 수 있다.
제3 조작된 이형이량체 단백질은 폴리-히스티딘(예를 들어, 6개의 히스티딘 잔기), 말토스 결합 단백질, GST, 녹색 형광 단백질(GFP), 혈구응집소 또는 알칼리성 포스파타제, 분비 신호 펩타이드(예를 들어, 프레프로트립신 신호 서열), Myc 및/또는 FLAG를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 폴리펩타이드 생산 및/또는 검출에 유용한 단편(예를 들어, 태그)를 더 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 1(도 3) 및 서열번호 26(도 23A) 또는 서열번호 4(도 6) 및 서열번호 27(도 23B)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다).
일 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 IL2 분비 신호 서열: MYRMQLLSCIALSLALVTNS(서열번호 7)(도 3, 도 4 및 도 23)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 신호 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 Myc: EQKLISEEDL(서열번호 8)(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 태그를 포함한다.
일 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 FLAG: DYKDDDDK(서열번호 14)(도 23)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 태그를 포함한다.
일 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 미국 특허 공해 제20130078241호에 개시된 항-CD33 scFv에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 항-CD33 scFv를 포함한다.
일 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하며, 항원-결합 단편은 서열번호 9(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
항-CD33 경쇄 가변 영역(VL)(서열번호 9):
Figure pct00014
일 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하며, 항원-결합 단편은 서열번호 10에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다(도 3 및 도 6):
항-CD33 중쇄 가변 영역(VH)(서열번호 10):
Figure pct00015
특정 실시형태에서, NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 서열번호 28 및 29의 아미노산 서열에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다).
일 실시형태에서, 제2 조작된 이형이량체 단백질은 CD16에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하며, 항원-결합 단편은 서열번호 28(도 23)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다:
항-CD16 중쇄 가변 영역 (VH) (서열번호 28):
Figure pct00016
일 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 CD16에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하며, 항원-결합 단편은 서열번호 29(도 23)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
항-CD16 경쇄 가변 영역 (VH) (서열번호 29):
Figure pct00017
일 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 12(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 하나 이상의 비천연 유래 폴리펩타이드를 포함한다.
6DMPa (서열번호 12):
Figure pct00018
일 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 16(도 23)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 하나 이상의 비천연 유래 폴리펩타이드를 포함한다.
6DMPb (서열번호 16):
Figure pct00019
일 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 IgG2 힌지: ERKCCVECPPCP(서열번호 13)(도 3 및 도 23)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 공유 이량체화 IgG2 힌지 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 19(도 6 및 도 23)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 공유 이량체화 IgG2 Fc 도메인을 포함한다.
IgG2 Fc 도메인(서열번호 19):
Figure pct00020
일 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 서열번호 11 GGGGSGGGGSGGGGS(도 3, 도 6, 및 도 23)에 대해 또는 서열번호 30 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(도 23, CD16 VH-VL 링커)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 링커를 포함한다.
추가 실시형태에서, 제3 조작된 이형이량체 단백질은 His6 태그(HHHHHH; 서열번호 20)를 포함한다.
특정 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은: (i) T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커(a1)에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는, 제1 폴리펩타이드; 및 (ii) 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커(b1)에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 및 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는, 제2 폴리펩타이드; 및 (iii) 자연살해(NK) 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커(c1)에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제3 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는, 제3 폴리펩타이드, 및 (iv) 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 3개의 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인을 포함하는, 제4 폴리펩타이드를 포함하되, 각각의 도메인은 a1, b1 및 c1의 결합 도메인(a2, b2 및 c2), 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 제4, 제5 및 제6 공유 이량체화 도메인이다.
특정 실시형태에서, 항원-결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', F(ab)', Fv, 이황화연결된 Fv, 단일 쇄 Fv(scFv), 2가 scFv(bi-scFv), 3가 scFv(tri-scFv), Fd, dAb 단편, 단리된 CDR, 다이어바디, 트라이어바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일 쇄 항체 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, scFv는 중쇄 가변 영역(VH), 및 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인은 6DMPa이다(Chen et al. 2019). 일부 실시형태에서, 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인은 6DMPb이다(Chen et al. 2019).
일부 실시형태에서, 공유 이량체화 도메인은 IgG2 힌지 도메인이다. 일부 실시형태에서, 공유 이량체화 도메인은 IgG2 도메인 및 IgG2 Fc 도메인이다. 일부 실시형태에서, Fc 도메인은 CH2 및 CH3 도메인이다.
조작된 이형삼량체 단백질은 기능성 모이어티(계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 및 NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드 및 T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드)를 임의의 순서로 배치하도록 설계될 수 있다. 특정 실시형태에서, T 세포 상에서 발현되는 분자 항원-결합 단편에 결합하는 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 위치된다. 특정 실시형태에서, 자연살해(NK) 세포 상에서 발현된 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 C-말단 또는 N-말단에 위치된다.
일부 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은, N-말단에서 C-말단까지, T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33 또는 CD19)에 결합하는 scFv 및 ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA 또는 MICB)의 엑토도메인 또는 CD16에 결합하는 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 융합 폴리펩타이드는, N 말단에서 C 말단까지, ULBP1의 엑토도메인(또는 ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA 또는 MICB의 엑토도메인), 및 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33 또는 CD19)에 결합하는 scFv 및 T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드를 포함한다.
조작된 이형삼량체 단백질은 신호 서열, 및/또는 하나 이상의 링커를 추가로 포함할 수 있다. 융합 폴리펩타이드에서, 이들 기능성 모이어티는 지속적으로 또는 비지속적으로 공유적으로 결찰될 수 있다(예를 들어, 이들은 링커(예를 들어, 링커 아미노산 잔기)에 의해 분리될 수 있다). 링커는 최대 50, 최대 40, 최대 30, 최대 20, 최대 18, 최대 15, 최대 12, 최대 11 또는 최대 10개의 아미노산 잔기 길이를 가질 수 있다. 특정 실시형태에서, 링커는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 내지 20, 8 내지 10, 8 내지 12, 8 내지 15, 8 내지 20 또는 8 내지 30개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 링커는 약 7 내지 10, 7 내지 12, 7 내지 15, 7 내지 20, 또는 7 내지 30개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다.
유도체화된 단백질의 한 가지 유형은 (동일한 유형의 또는 상이한 유형의) 둘 이상의 폴리펩타이드를 가교함으로써 생성된다. 적합한 가교제는 적절한 스페이서(예를 들어, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시석신이미드 에스터) 또는 동형이작용성(예를 들어, 다이석신이미딜 수베레이트)에 의해 분리되는 2개의 별개의 반응기를 갖는 이형이작용성인 것을 포함한다. 단백질과 함께 유도체화(또는 표지)될 수 있는 유용한 검출 가능한 제제는 형광 제제, 다양한 효소, 보결분자단, 발광 물질, 생물 발광 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 비제한적인, 예시적 형광 검출 가능 제제는 플루오레세인, 플루오레세인 아이소티오사이아네이트, 로다민 및 피코에리트린을 포함한다. 폴리펩타이드는 또한 검출 가능한 효소, 예컨대, 알칼리성 포스파타제, 겨자무 과산화효소, 베타-갈락토시다제, 아세틸콜린에스터라제, 글루코스 옥시다제 등에 의해 유도체화될 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 보결분자단(예를 들어, 스트렙타비딘/바이오틴 및 아비딘/바이오틴)에 의해 유도체화될 수 있다.
조작된 이형삼량체 단백질은 다른 작용성 분자로 유도체화되거나 이에 연결될 수 있다. 예를 들어, 이형삼량체 단백질은 하나 이상의 다른 분자 독립체, 예컨대, 항체 또는 항체 단편, 검출 가능한 제제, 면역억제제, 세포독성제, 약제학적 제제, 다른 분자(예컨대, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그)와의 회합을 매개할 수 있는 단백질 또는 펩타이드, 아미노산 링커, 신호 서열, 면역원성 담체 또는 단백질 정제에서 유용한 리간드, 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제, 히스티딘 태그 및 스타필로코커스 단백질 A에 (화학 결합, 유전적 융합, 비공유 상호작용 등에 의해) 기능적으로 연결될 수 있다. 세포독성제는 방사성 동위원소, 화학치료제, 및 독소, 예컨대, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소, 및 이들의 단편을 포함할 수 있다.
조작된 이형삼량체 단백질은 폴리-히스티딘(예를 들어, 6개의 히스티딘 잔기), 말토스 결합 단백질, GST, 녹색 형광 단백질(GFP), 혈구응집소 또는 알칼리성 포스파타제, 분비 신호 펩타이드(예를 들어, 프레프로트립신 신호 서열), Myc 및/또는 FLAG를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 폴리펩타이드 생산 및/또는 검출에 유용한 단편(예를 들어, 태그)를 더 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은 IL2 분비 신호 서열: MYRMQLLSCIALSLALVTNS(서열번호 7)(도 3 내지 도 8)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 신호 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은 Myc: EQKLISEEDL(서열번호 8)(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 태그를 포함한다.
일 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은 FLAG: DYKDDDDK(서열번호 14)(도 4, 도 5, 도 7 및 도 8)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 태그를 포함한다.
일 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은 서열번호 15(도 4 및 도 7)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) ULBP1 엑토도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은 미국 특허 공해 제20130078241호에 개시된 항-CD33 scFv에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 항-CD33 scFv를 포함한다.
특정 실시형태에서, NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 서열번호 28 및 29의 아미노산 서열(도 23)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다).
일 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하며, 항원-결합 단편은 서열번호 9(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은 CD33에 결합하는 항원-결합 단편을 포함하며, 항원-결합 단편은 서열번호 10(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 중쇄 가변 영역(VH)을 포함한다:
특정 실시형태에서, T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 서열번호 17 및 18(도 5 및 도 8)의 아미노산 서열에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진다).
일 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은 서열번호 12(도 3 및 도 6)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 하나 이상의 비천연 유래 폴리펩타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은 서열번호 16(도 5 및 도 8)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 하나 이상의 비천연 유래 폴리펩타이드를 포함한다.
일 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은 IgG2 힌지: ERKCCVECPPCP(서열번호 13)(도 3 내지 도 8)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 공유 이량체화 IgG2 힌지 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은 서열번호 19(도 6 내지 도 8)에 대해 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 공유 이량체화 IgG2 Fc 도메인을 포함한다.
일 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은 서열번호 11 GGGGSGGGGSGGGGS(도 3, 도 5, 도 6 및 도 8)에 대해 또는 서열번호 21GGGGGSGGSGGSGG에 대해 또는 서열번호 22 SGSGSG에 대해(도 5 및 도 8) 적어도 또는 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 또는 약 60%, 적어도 또는 약 70%, 적어도 또는 약 75%, 적어도 또는 약 80%, 적어도 또는 약 81%, 적어도 또는 약 82%, 적어도 또는 약 83%, 적어도 또는 약 84%, 적어도 또는 약 85%, 적어도 또는 약 86%, 적어도 또는 약 87%, 적어도 또는 약 88%, 적어도 또는 약 89%, 적어도 또는 약 90%, 적어도 또는 약 91%, 적어도 또는 약 92%, 적어도 또는 약 93%, 적어도 또는 약 94%, 적어도 또는 약 95%, 적어도 또는 약 96%, 적어도 또는 약 97%, 적어도 또는 약 98%, 적어도 또는 약 99%, 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는(또는 이들로 본질적으로 이루어지거나, 이루어진) 하나 이상의 링커를 포함한다.
추가 실시형태에서, 조작된 이형삼량체 단백질은 His6 태그(HHHHHH; 서열번호 20)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제3 폴리펩타이드는 면역 반응을 증가시키는 케모카인 또는 사이토카인 단백질이다. 케모카인 또는 사이토카인 단백질은 CXCL14를 포함하는 CXCL, GCSF, 및 IL2 및 IL16을 포함하는 인터류킨을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
개시된 조작된 단백질은 CD33을 발현시키는 세포, 예컨대, HL60 및 MOLM 세포에 결합하고 이에 대해 세포독성이라는 것이 본 명세서에 제시되어 있다. 또한 CD33 발현이 세포에서 증가될 때, 조작된 단백질의 결합 효율이 증가한다는 것이 제시되어 있다. 추가적으로, 조작된 단백질의 세포독성은 CD33 발현이 증가된 MOLM과 같은 세포에서 증가된다.
특정 실시형태에서, 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33)에 결합하는 항원-결합 단편은 야생형 항원-결합 단편의 유도체 또는 변형된 형태 또는 변이체이다.
특정 실시형태에서, 자연살해(NK) 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 야생형 폴리펩타이드 단편의 유도체 또는 변형된 형태 또는 변이체이다.
특정 실시형태에서, T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 야생형 폴리펩타이드 단편의 유도체 또는 변형된 형태 또는 변이체이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 변이체라는 용어는 또한 하나 이상의 유전적 및/또는 화학적 변형에 의해 얻어지는 야생형 단백질 또는 펩타이드와 상이한 임의의 펩타이드, 슈도펩타이드(비-생화학적 요소를 혼입하는 펩타이드) 또는 단백질을 의미한다. 유전적 및/또는 화학적 변형은 고려되는 단백질 또는 펩타이드의 하나 이상의 잔기의 임의의 돌연변이, 치환, 결실, 첨가 및/또는 변형을 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 화학적 변형은 화학적 반응에 의해 또는 단백질의 임의의 수의 잔기 상에 생물학적 또는 비-생물학적 분자(들)의 화학적 접합에 의해 생성된 펩타이드 또는 단백질의 임의의 변형을 지칭할 수 있다.
본 발명 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 아미노산 또는 펩타이드의 변이체, 유사체, 오솔로그, 상동체 및 유도체를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 아미노산(예를 들어, 비-천연 유래 아미노산, 관련없는 생물계에서만 생기는 아미노산, 변형된 아미노산 등을 포함)의 하나 이상의 유사체, 치환된 결합뿐만 아니라 당업계에 알려진 다른 변형을 갖는 펩타이드를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 펩타이드는 펩타이드 모방체(peptidomimetic), 예컨대, 펩토이드(peptoid)를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 또는 펩타이드는, 예를 들어, 글리코실화, 아실화(예를 들어, 아세틸화, 폼일화, 미리스토일화, 팔미토일화, 리포일화), 알킬화(예를 들어, 메틸화), 아이소프렌일화 또는 프렌일화(예를 들어, 파네실화, 게라닐게라닐화), 황산화, 아마이드화, 하이드록실화, 석신일화 등에 의해 변형된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드 및 제제는 복합당에 또는 친유성 화합물, 예를 들어, 폴리카본 사슬 또는 콜레스테롤 유도체에 글리코실화, 설폰일화 및/또는 인산화 및/또는 접합될 수 있다.
계통-특이적 세포-표면 항원
본 개시내용의 양상은, 예를 들어, 표적 암 세포 상에서 계통 특이적 세포-표면 항원을 표적화하는 제제를 제공한다. 이러한 제제는 계통-특이적 세포-표면 항원에 결합하고 이를 표적화하는 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 항원-결합 단편은 계통-특이적 항원에 특이적으로 결합하는 단일 쇄 항체(scFv)일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "계통-특이적 세포-표면 항원" 및 "세포-표면 계통-특이적 항원"은 상호 호환적으로 사용될 수 있고, 세포 표면 상에 충분히 존재하며 세포 계통(들)의 하나 이상의 집단과 연관되는 임의의 항원을 지칭한다. 예를 들어, 항원은 세포 계통(들)의 하나 이상의 집단 상에 존재하고, 다른 세포 집단의 세포 표면 상에 존재하지 않을 수 있다(또는 감소된 수준으로 존재한다).
일반적으로, 계통-특이적 세포-표면 항원은, 항원 및/또는 항원을 제시하는 세포 집단이 숙주 유기체의 생존 및/또는 발생에 필요한지의 여부 같은 다수의 인자에 기반하여 분류될 수 있다. 예시적인 유형의 계통-특이적 항원의 요약을 아래의 표 1에 제공한다.
Figure pct00021
1형 부류의 계통 특이적 항원은 난소, 고환, 전립선, 유방, 자궁내막 및 췌장을 포함하는 매우 다양한 상이한 조직에서 발현될 수 있다. 일부 실시형태에서, 제제는 1형 항원인 세포-표면 계통-특이적 항원을 표적화한다.
일부 실시형태에서, 제제는 2형 항원인 세포-표면 계통-특이적 항원을 표적화한다. 예를 들어, CD33은 정상 골수성 세포에서뿐만 아니라 급성 골수성 백혈병(AML) 세포에서 발현되는 2형 항원이다(Dohner et al.2015).
본 개시내용의 방법 및 조성물에 의해 매우 다양한 항원이 표적화될 수 있다. 이들 항원에 대한 단클론성 항체는 상업적으로 구매되거나, 관심 항원에 의한 동물의 면역화 다음에 위에서 논의한 바와 같은 통상적인 단클론성 항체 방법, 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature (1975) 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기법을 포함하는 표준 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 항체 또는 항체를 암호화하는 핵산은 임의의 표준 DNA 또는 단백질 서열분석 기법을 이용하여 서열분석될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물을 이용하여 표적화되는 세포-표면 계통 특이적 항원은 백혈구 또는 백혈구의 하위집단의 세포-표면 계통 특이적 항원이다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원은 골수성 세포와 연관된 항원이다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원은 분화 항원의 클러스터(CD)이다. CD 항원의 예는 CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, CD1e, CD2, CD3, CD3d, CD3e, CD3g, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8a, CD8b, CD9, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD11d, CDw12, CD13, CD14, CD15, CD16, CD16b, CD17, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD26, CD27, CD28, CD29, CD30, CD31, CD32a, CD32b, CD32c, CD33, CD34, CD35, CD36, CD37, CD38, CD39, CD40, CD41, CD42a, CD42b, CD42c, CD42d, CD43, CD44, CD45, CD45RA, CD45RB, CD45RC, CD45RO, CD46, CD47, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD50, CD51, CD52, CD53, CD54, CD55, CD56, CD57, CD58, CD59, CD60a, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD63, CD64a, CD65, CD65s, CD66a, CD66b, CD66c, CD66F, CD68, CD69, CD70, CD71, CD72, CD73, CD74, CD75, CD75S, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85A, CD85C, CD85D, CD85E, CD85F, CD85G, CD85H, CD85I, CD85J, CD85K, CD86, CD87, CD88, CD89, CD90, CD91, CD92, CD93, CD94, CD95, CD96, CD97, CD98, CD99, CD99R, CD100, CD101, CD102, CD103, CD104, CD105, CD106, CD107a, CD107b, CD108, CD109, CD110, CD111, CD112, CD113, CD114, CD115, CD116, CD117, CD118, CD119, CD120a, CD120b, CD121a, CD121b, CD121a, CD121b, CD122, CD123, CD124, CD125, CD126, CD127, CD129, CD130, CD131, CD132, CD133, CD134, CD135, CD136, CD137, CD138, CD139, CD140a, CD140b, CD141, CD142, CD143, CD144, CDw145, CD146, CD147, CD148, CD150, CD152, CD152, CD153, CD154, CD155, CD156a, CD156b, CD156c, CD157, CD158b1, CD158b2, CD158d, CD158e1/e2, CD158f, CD158g, CD158h, CD158i, CD158j, CD158k, CD159a, CD159c, CD160, CD161, CD163, CD164, CD165, CD166, CD167a, CD168, CD169, CD170, CD171, CD172a, CD172b, CD172g, CD173, CD174, CD175, CD175s, CD176, CD177, CD178, CD179a, CD179b, CD180, CD181, CD182, CD183, CD184, CD185, CD186, CD191, CD192, CD193, CD194, CD195, CD196, CD197, CDw198, CDw199, CD200, CD201, CD202b, CD203c, CD204, CD205, CD206, CD207, CD208, CD209, CD210a, CDw210b, CD212, CD213a1, CD213a2, CD215, CD217, CD218a, CD218b, CD220, CD221, CD222, CD223, CD224, CD225, CD226, CD227, CD228, CD229, CD230, CD231, CD232, CD233, CD234, CD235a, CD235b, CD236, CD236R, CD238, CD239, CD240, CD241, CD242, CD243, CD244, CD245, CD246, CD247, CD248, CD249, CD252, CD253, CD254, CD256, CD257, CD258, CD261, CD262, CD263, CD264, CD265, CD266, CD267, CD268, CD269, CD270, CD271, CD272, CD273, CD274, CD275, CD276, CD277, CD278, CD279, CD280, CD281, CD282, CD283, CD284, CD286, CD288, CD289, CD290, CD292, CDw293, CD294, CD295, CD296, CD297, CD298, CD299, CD300a, CD300c, CD300e, CD301, CD302, CD303, CD304, CD305, 306, CD307a, CD307b, CD307c, D307d, CD307e, CD309, CD312, CD314, CD315, CD316, CD317, CD318, CD319, CD320, CD321, CD322, CD324, CD325, CD326, CD327, CD328, CD329, CD331, CD332, CD333, CD334, CD335, CD336, CD337, CD338, CD339, CD340, CD344, CD349, CD350, CD351, CD352, CD353, CD354, CD355, CD357, CD358, CD359, CD360, CD361, CD362 및 CD363을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 세포-표면 계통-특이적 항원은 CD19, CD20, CD11, CD123, CD56, CD34, CD14, CD33, CD66b, CD41, CD61, CD62, CD235a, CD146, CD326, LMP2, CD22, CD52, CD10, CD3/TCR, CD79/BCR 및 CD26이다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 계통 특이적 항원은 CD33 또는 CD19이다.
대안적으로 또는 추가로, 세포-표면 계통-특이적 항원은 암 항원, 예를 들어, 암세포 상에 차별적으로 존재하는 세포-표면 계통-특이적 항원일 수 있다. 일부 실시형태에서, 암 항원은 조직 또는 세포 계통에 특이적인 항원이다. 특정 암 유형과 연관된 계통-특이적 세포-표면 항원의 예는 CD20, CD22(비호지킨 림프종, B-세포 림프종, 만성 림프구 백혈병(CLL)), CD52(B-세포 CLL), CD33(급성 골수성 백혈병(AML)), CD10(gp100)(공통(프레-B) 급성 림프구성 백혈병 및 악성 흑색종), CD3/T-세포 수용체(TCR)(T-세포 림프종 및 백혈병), CD79/B-세포 수용체(BCR)(B-세포 림프종 및 백혈병), CD26(상피 및 림프모양 악성종양), 인간 백혈구 항원(HLA)-DR, HLA-DP 및 HLA-DQ(림프모양 악성종양), CD307e 및 BCMA(골수종), RCAS1(부인과 암종, 담도성 선암종 및 췌장의 관 선암종), Claudin3, TMPRSS3 및 Her2(난소암), Her2(유방암)뿐만 아니라 전립선 특이적 막 항원을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 항원은 CD33이고, AML 세포와 연관된다.
특정 실시형태에서, 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33)에 결합하는 항원-결합 단편은 최대 약 500, 최대 또는 약 490, 최대 또는 약 480, 최대 또는 약 470, 최대 또는 약 460, 최대 또는 약 450, 최대 또는 약 440, 최대 또는 약 430, 최대 또는 약 420, 최대 또는 약 410, 최대 또는 약 400, 최대 또는 약 390, 최대 또는 약 380, 최대 또는 약 370, 최대 또는 약 360, 최대 또는 약 350, 최대 또는 약 340, 최대 또는 약 330, 최대 또는 약 320, 최대 또는 약 310, 최대 또는 약 200, 최대 또는 약 190, 최대 또는 약 180, 최대 또는 약 170, 최대 또는 약 160, 최대 또는 약 150, 최대 또는 약 140, 최대 또는 약 130, 최대 또는 약 120, 최대 또는 약 110, 최대 또는 약 100, 최대 또는 약 90, 최대 또는 약 80, 최대 또는 약 70, 최대 또는 약 60, 최대 또는 약 50, 최대 또는 약 40, 최대 또는 약 30, 최대 또는 약 20, 최대 또는 약 15, 또는 최대 약 10개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD33)에 결합하는 항원-결합 단편은 약 100 내지 200, 80 내지 210, 80 내지 250, 150 내지 250, 100 내지 30, 50 내지 200, 150 내지 250, 150 내지 300, 300 내지 400, 200 내지 400, 400 내지 500 또는 150 내지 190개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다.
NK 세포 표면 수용체-결합 펩타이드
특정 실시형태에서, 본 발명의 융합 폴리펩타이드 또는 조성물은 자연살해(NK) 세포, 예컨대, C-형 렉틴-융사 수용체(예를 들어, NKG2D) 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드를 포함한다.
C-형 렉틴-유사 NK 세포 수용체는 자연살해 세포 표면 상에서 발현되는 수용체일 수 있다. 본 유형의 예시적인 NK 세포 수용체는 NKG2D(GENBANK 수탁번호 BC039836), Dectin-1(GENBANK 수탁번호 AJ312373 또는 AJ312372), 비만 세포 기능-연관 항원(GENBANK 수탁번호 AF097358), HNKR-P1A(GENBANK 수탁번호 U11276), LLT1(GENBANK 수탁번호 AF133299), CD69(GENBANK 수탁번호 NM_001781), CD69 상동체, CD72(GENBANK 수탁번호 NM_001782), CD94(GENBANK 수탁번호 NM_002262 또는 NM_007334), KLRF1(GENBANK 수탁번호 NM_016523), 산화된 LDL 수용체(GENBANK 수탁번호 NM 002543), CLEC-1, CLEC-2(GENBANK 수탁번호 NM 016509), NKG2C(GENBANK 수탁번호 AJ001684), NKG2A(GENBANK 수탁번호 AF461812), NKG2E(GENBANK 수탁번호 AF461157), WUGSC:H_DJ0701O16.2 또는 골수성 DAP12-연관 렉틴(MDL-1; GENBANK 수탁번호 AJ271684)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 실시형태에서, NK 세포 수용체는 인간 NKG2D 또는 인간 NKG2C이다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 KLRK1로도 알려진 "자연살해 그룹 2D", "NKG2D" 및 "NKG2D 수용체"와 같은 용어는 면역 세포, 특히 NK 세포, CD8+ T 세포, 일부 CD4+ T 세포 및 감마 델타 T 세포의 수많은 유형 상에서 발견된 활성화 세포 표면 분자를 지칭한다. 용어 NKG2D 및 NKG2D 수용체는 인간 NKG2D 수용체의 변이체, 아이소폼 및 상동체를 포함한다(예를 들어, 문헌[Diefenbach et al., Nat Immunol. (2002) 3(12):1142-9]에 기재된 아이소폼). NKG2D는 세포외 C-형(즉, Ca2+-결합) 렉틴-유사 도메인을 갖지만 Ca2+ 결합 부위를 결여하는 II형 막관통 단백질이다. 이는 DAP10 또는 DAP12와 같은 어댑터 단백질과의 이형이량체를 형성할 수 있고, MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 및 ULBP6을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 단백질 리간드를 인식한다.
특정 실시형태에서, NKG2D-결합 펩타이드는 NKG2D의 작용제이다. 특정 실시형태에서, NKG2D-결합 펩타이드는 NKG2D의 길항제이다. 특정 실시형태에서, NKG2D-결합 펩타이드는 NKG2D의 길항제도 아니고 작용제도 아니다.
NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 NK 세포 표면 수용체에 대한 리간드, 예컨대, NKG2D 세포 표면 수용체에 대한 리간드일 수 있다. NKG2D에 대한 리간드(또는 NKG2D 리간드)의 비제한적 예는 MHC 클래스 I 사슬-관련(MIC) 항원, 예컨대, MICA 및 MICB, UL16 결합 단백질(ULBP), 예컨대, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6 등을 포함한다(Bahram Adv. Immunol. (2000) 76:1-60; Cerwenka and Lanier Immunol. Rev. (2001) 181:158-169; Cosman, et al. Immunity (2001) 14:123-133; Kubin, et al. Eur. J. Immunol. (2001) 31:1428-1437). 뮤린 NKG2D 리간드는, 예를 들어, 레틴산 초기 유도성-1 유전자 산물(RAE-1) 및 주조직적합 항원 펩타이드 H60을 포함한다. NK 세포는 NK 세포 표면 상의 수용체와 면역조절 폴리펩타이드 리간드의 상호작용에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, NK 세포 활성을 조절할 수 있는 NKG2D 수용체에 대한 리간드는 케모카인, 예컨대, muCCL21, 및 스트레스-유도성 폴리펩타이드 리간드, 예컨대, MHC 클래스 I 사슬-관련 항원 및 ULL16 결합 단백질을 포함한다. 뮤린 H60 주조직적합 항원 펩타이드는 마찬가지로 NKG2D 수용체에 결합하는 것으로 보고된다. 예를 들어, 문헌[Robertson et al. Cell Immunol. (2000) 199(1):8-14; Choi et al. Immunity (2002) 17(5):593-603, 및 Farag et al., Blood, (2002) 100(6):1935-1947]을 참조한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "NKG2D 리간드"는 NKG2D 수용체에 특이적으로 결합하는 결합 상대를 지칭한다. 예시적인 리간드는 MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBPS, ULBP6, 및 이들의 기능성 단편, 예컨대, MIC 및 ULBP 단백질의 가용성 형태를 포함한다.
표 2는 예시적인 NKG2D 결합 단백질 및 도메인을 열거한다.
Figure pct00022
MIC 및 ULBP 단백질은 NK 세포, NKT 세포, 알파 베타 CD8+ T 세포 및 감마 델타 CD8+ T 세포를 포함하는 면역 효과기 세포 상에서 C-형 렉틴-유사 활성화 수용체 자연 살해 그룹 2D(NKG2D)에 결합하는 리간드로서 작용한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "ULBP 단백질"은 N-말단의 신호 서열, 중앙에 위치된 알파-1 및 알파-2 도메인, 및 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 고정 도메인 또는 막관통 도메인일 수 있는 C-말단의 세포막 결합 도메인을 포함하는 비가공 단백질에 대한 특징적 조직화를 갖는 MHC 클래스 I-관련 분자의 구성원을 지칭한다. ULBP 단백질의 일부 종은 세포질 도메인을 갖는다. 일반적으로, ULBP 단백질은 MICA/MICB 단백질에 대해 약한 아미노산 서열 동일성을 갖는다. ULBP 패밀리 구성원은 효과기 세포 수용체 NKG2D에 대한 리간드이고, NK 세포를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "ULBP 단백질"은 인간 ULBP 단백질의 활성 변이체, 아이소폼 및 종 상동체를 포함하고, NKG2D 수용체 결합 활성을 갖는 단편을 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "레틴산 초기 전사체 1 단백질" 또는 "RAET1"로도 기재되는 "ULBP1"이라는 용어는 인간 ULBP1의 변이체, 아이소폼 및 종 상동체를 포함하는 MHC 클래스 I 패밀리의 구성원을 지칭한다. 단백질은 수용체 NKG2D에 대한 리간드로서 작용한다. ULBP1 단백질은 1차 NK 세포에서 다중 신호전달 경로를 활성화시킨다. ULBP1에서 C 말단의 막 결합 도메인은 GPI 도메인을 포함한다. ULBP1은 MICA 및 MICB와 약하게 상동성이고, ULBP2 및 ULBP3에 대해 약 55% 내지 60%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 인간 ULBP1의 예시적인 서열은 NCBI 수탁번호 NP_079494.1로서 이용 가능하다. 인간 ULBP1에 대한 DNA 및 단백질 서열은 문헌[Cosman et al., Immunity (2001) 14(2):123-133, DNA Accession No. AF304377 in the EMBL database of the European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK]에 의해 보고되었다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "레틴산 초기 전사체 1H 단백질" 또는 "RAET1H"로도 기재되는 "ULBP2"이라는 용어는 인간 ULBP2의 변이체, 아이소폼 및 종 상동체를 포함하는 MHC 클래스 I 패밀리의 구성원을 지칭한다. 단백질은 수용체 NKG2D에 대한 리간드로서 작용한다. ULBP2는 1차 NK 세포에서 다중 신호전달 경로를 활성화시킨다. ULBP2에서 C 말단의 막 결합 도메인은 GPI 도메인을 포함한다. ULBP2는 MICA 및 MICB와 약하게 상동성이고, ULBP1 및 ULBP3에 대해 약 55% 및 60%의 아미노산 서열 동일성을 갖는다. 인간 ULBP2의 예시적인 서열은 NCBI 수탁번호 NP_079493.1로서 이용 가능하다. 인간 ULBP2에 대한 DNA 및 단백질 서열은 문헌[Cosman et al., Immunity (2001) 14(2):123-133, DNA Accession No. AF304378 in the EMBL database of the European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK]에 의해 보고되었다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "레틴산 초기 전사체 1N 단백질" 또는 "RAET1N"으로도 기재되는 "ULBP3"이라는 용어는 인간 ULBP3의 변이체, 아이소폼 및 종 상동체를 포함하는 MHC 클래스 I 패밀리의 구성원을 지칭한다. 단백질은 수용체 NKG2D에 대한 리간드로서 작용한다. ULBP2에서 C 말단의 막 결합 도메인은 GPI 고정 도메인을 포함한다. ULBP3은 1차 NK 세포에서 다중 신호전달 경로를 활성화시킨다. ULBP3은 MICA 및 MICB와 약하게 상동성이다. 인간 ULBP3의 예시적인 서열은 NCBI 수탁번호 NP_078794.1로서 이용 가능하다. 인간 ULBP3에 대한 DNA 및 단백질 서열은 문헌[Cosman et al., Immunity (2001) 14(2):123-133, DNA Accession No. AF304379 in the EMBL database of the European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK]에 의해 보고되었다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "레틴산 초기 전사체 1E 단백질" 또는 "RAET1E"로도 기재되는 "ULBP4"라는 용어는 인간 ULBP4의 변이체, 아이소폼 및 종 상동체를 포함하는 MHC 클래스 I 패밀리의 구성원을 지칭한다. 단백질은 수용체 NKG2D에 대한 리간드로서 작용한다. ULBP4의 C 말단 영역은 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 공개 US20090274699). ULBP4는 수용체 NKG2D에 대한 결합을 통해 NK 세포를 활성화시키는 데 관련되고, NK-매개 용해를 유도한다(예를 들어, 문헌[Kong et al., Blood (2009) 114(2):310-17] 참조). ULBP4는 ULBP1 및 ULBP2보다 ULBP3에 대해 더 높은 서열 동일성을 갖는다. 인간 ULBP4의 예시적인 아미노산 서열은 NCBI 수탁번호 NP_001230254.1; NP 001230256.1; NP 001230257.1; 및 NP 631904.1로서 이용 가능하다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "레틴산 초기 전사체 1G 단백질" 또는 "RAET1G"로도 기재되는 "ULBP5"라는 용어는 인간 ULBP5의 변이체, 아이소폼 및 종 상동체를 포함하는 MHC 클래스 I 패밀리의 구성원을 지칭한다. 단백질의 C-말단 영역은 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 갖는다. ULBP5는 수용체 NKG2D에 대한 결합을 통해 NK 세포 및 NK 세포-매개 세포독성을 활성화시키는 것에 관련된다. 인간 ULBP5의 예시적인 서열은 NCBI 수탁번호 NP_001001788.2로서 이용 가능하다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "레틴산 초기 전사체 1L 단백질" 또는 "RAET1L"로도 기재되는 "ULBP6"이라는 용어는 인간 ULBP6의 변이체, 아이소폼 및 종 상동체를 포함하는 MHC 클래스 I 패밀리의 구성원을 지칭한다. ULBP6은 ULBP1, ULBP2 및 ULBP3과 유사한 GPI 고정 도메인을 포함한다. ULBP6은 수용체 NKG2D에 대한 결합을 통해 NK 세포 및 NK 세포 매개 세포독성을 활성화시키는 것에 관련된다. 인간 ULBP6의 예시적인 서열은 NCBI 수탁번호 NP_570970.2로서 이용 가능하다.
MICA 및 MICB와 같이, ULBP 단백질의 알려진 기능은 NKG2D 수용체에 대한 결합 및 NK 세포 활성의 활성화이다.
MICA는 인간 MICA의 변이체, 아이소폼 및 상동체를 포함하는 MHC 클래스 I 사슬-관련 유전자 A 단백질(MICA)이고, 기능성 MICA 활성을 갖는 MICA의 단편을 포함한다. MICA 단백질은 3개의 세포외 Ig-유사 도메인, 즉, 알파-1, 알파-2 및 알파-3, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. 단백질은 위 상피, 내피세포 및 섬유아세포의 세포에서 그리고 각질세포 및 단핵구의 세포질에서 낮은 수준으로 발현된다. MICA의 예시적인 서열은 NCBI 수탁번호 NP_000238.1로서 이용 가능하다. 다른 예시적인 MICA 서열은 미국 특허 공개 제20110311561호에서 찾을 수 있다.
MICB는 인간 MICB의 변이체, 아이소폼 및 상동체를 포함하는 MHC 클래스 I 사슬-관련 유전자 B 단백질(MICB)이고, 기능성 MICB 활성을 갖는 MICB의 단편을 포함한다. MICB는 MICA에 대해 약 84%의 서열 동일성을 갖는다. MICB 단백질은 3개의 세포외 Ig-유사 도메인, 즉, 알파-1, 알파-2 및 알파-3, 막관통 도메인 및 세포내 도메인을 포함한다. MICB의 예시적인 서열은 UniProtKB 수탁번호 Q29980.1로서 이용 가능하다. 다른 예시적인 MICB 서열은 미국 특허 공개 제20110311561호에서 찾을 수 있다.
NKG2D 리간드(NKG2D 수용체에 대한 리간드)는 또한 NKG2D를 특이적으로 인식하거나 이에 결합하는 항체의 모두 또는 일부를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 항-NKG2D 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 항원-결합 부분 또는 이의 단편)을 포함할 수 있다. 이러한 항체는 단클론성 또는 다클론성 항체일 수 있다. 항체는 또한 변이체 항체, 예컨대, 키메라 항체, 인간화된 항체, 단일 쇄 항체 및 NKG2D에 결합할 수 있는 면역글로불린 사슬을 포함하는 혼성 항체일 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체는 단일 쇄 가변 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체는 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 미국 특허 제7,879,985호에 제시된 바와 같은 16F16, 16F31, MS 또는 21F2이다. 항체 단편은 본 명세서에 논의되는 바와 같은 임의의 적합한 단편일 수 있다.
특정 실시형태에서, 헤테로 단백질 또는 조성물은 CD16인 자연살해(NK) 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드를 포함한다.
이러한 폴리펩타이드는 NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하고 이를 표적화하는 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 항원-결합 단편은 NK 세포 상에서 발현되는 분자에 특이적으로 결합하는 단일 쇄 항체(scFv)일 수 있다.
본 개시내용의 방법 및 조성물에 의해 매우 다양한 항원이 표적화될 수 있다. 이들 항원에 대한 단클론성 항체는 상업적으로 구매되거나, 관심 항원에 의한 동물의 면역화 다음에 위에서 논의한 바와 같은 통상적인 단클론성 항체 방법, 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature (1975) 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기법을 포함하는 표준 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 항체 또는 항체를 암호화하는 핵산은 임의의 표준 DNA 또는 단백질 서열분석 기법을 이용하여 서열분석될 수 있다.
특정 실시형태에서, 자연살해(NK) 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 최대 약 500, 최대 또는 약 490, 최대 또는 약 480, 최대 또는 약 470, 최대 또는 약 460, 최대 또는 약 450, 최대 또는 약 440, 최대 또는 약 430, 최대 또는 약 420, 최대 또는 약 410, 최대 또는 약 400, 최대 또는 약 390, 최대 또는 약 380, 최대 또는 약 370, 최대 또는 약 360, 최대 또는 약 350, 최대 또는 약 340, 최대 또는 약 330, 최대 또는 약 320, 최대 또는 약 310, 최대 또는 약 200, 최대 또는 약 190, 최대 또는 약 180, 최대 또는 약 170, 최대 또는 약 160, 최대 또는 약 150, 최대 또는 약 140, 최대 또는 약 130, 최대 또는 약 120, 최대 또는 약 110, 최대 또는 약 100, 최대 또는 약 90, 최대 또는 약 80, 최대 또는 약 70, 최대 또는 약 60, 최대 또는 약 50, 최대 또는 약 40, 최대 또는 약 30, 최대 또는 약 20, 최대 또는 약 15 또는 최대 약 10개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, 자연살해(NK) 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드는 약 100 내지 200, 80 내지 210, 80 내지 250, 150 내지 250, 100 내지 30, 50 내지 200, 150 내지 250, 150 내지 300 또는 150 내지 190개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다.
T 세포 상에서 발현된 분자
본 개시내용의 양상은 T 세포 상에서 발현되는 분자를 표적화하는 제제를 제공한다. 이러한 제제는 T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하고 이를 표적화하는 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 항원-결합 단편은 T 세포 상에서 발현되는 분자에 특이적으로 결합하는 단일 쇄 항체(scFv)일 수 있다.
본 개시내용의 방법 및 조성물에 의해 매우 다양한 항원이 표적화될 수 있다. 이들 항원에 대한 단클론성 항체는 상업적으로 구매되거나, 관심 항원에 의한 동물의 면역화 다음에 위에서 논의한 바와 같은 통상적인 단클론성 항체 방법, 예를 들어, 문헌[Kohler and Milstein, Nature (1975) 256: 495]의 표준 체세포 혼성화 기법을 포함하는 표준 기법을 이용하여 생성될 수 있다. 항체 또는 항체를 암호화하는 핵산은 임의의 표준 DNA 또는 단백질 서열분석 기법을 이용하여 서열분석될 수 있다.
특정 실시형태에서, T 세포 계통 특이적 세포-표면 항원(예를 들어, CD3)상에서 발현되는 분자에 결합하는 항원-결합 단편은 최대 약 500, 최대 또는 약 490, 최대 또는 약 480, 최대 또는 약 470, 최대 또는 약 460, 최대 또는 약 450, 최대 또는 약 440, 최대 또는 약 430, 최대 또는 약 420, 최대 또는 약 410, 최대 또는 약 400, 최대 또는 약 390, 최대 또는 약 380, 최대 또는 약 370, 최대 또는 약 360, 최대 또는 약 350, 최대 또는 약 340, 최대 또는 약 330, 최대 또는 약 320, 최대 또는 약 310, 최대 또는 약 200, 최대 또는 약 190, 최대 또는 약 180, 최대 또는 약 170, 최대 또는 약 160, 최대 또는 약 150, 최대 또는 약 140, 최대 또는 약 130, 최대 또는 약 120, 최대 또는 약 110, 최대 또는 약 100, 최대 또는 약 90, 최대 또는 약 80, 최대 또는 약 70, 최대 또는 약 60, 최대 또는 약 50, 최대 또는 약 40, 최대 또는 약 30, 최대 또는 약 20, 최대 또는 약 15, 또는 최대 약 10개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다. 특정 실시형태에서, T 세포 상에서 발현되는 분자 (예를 들어, CD3)에 결합하는 항원-결합 단편은 약 100 내지 200, 80 내지 210, 80 내지 250, 150 내지 250, 100 내지 30, 50 내지 200, 150 내지 250, 150 내지 300, 300 내지 400, 200 내지 400, 400 내지 500 또는 150 내지 190개의 아미노산 잔기 길이를 갖는다.
비천연 유래 폴리펩타이드 도메인
본 개시내용의 양상은 네트워크를 형성하는 이형이량체만을 궁극적으로 선호하는 나선을 따라서 4개의 결합 네트워크를 생성하는 4개의 나선에 기반한 6DMP 이형이량체 접근을 사용한다(일부 이형이량체 설계에서, 각각의 단백질 단량체는 2개의 나선을 갖고, 다른 것에서, 3-대-1을 가짐). 6DMP 이형이량체화 네트워크는 3개의 수소결합 네트워크 및 1개의 소수성 코어를 생성한다. 4개의 나선은 2개의 단백질 서열로 분리되고, 각각은 2개의 나선에 기여한다. 상당히 특이적인 4개-나선 구조는 이의 상대 단백질 사이에서 이형이량체만을 형성한다. 이는 핵내(intranuclear) 과정을 용이하게 하는 데 유용한 것으로 알려져 있지만 세포-대-세포 상호작용의 촉진자로서 시험된 적이 없다.
일부 실시형태에서, 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인은 6DMPa(서열번호 12)이다. 일부 실시형태에서, 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인은 6DMPb(서열번호 16)이다.
본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용되는 문헌[Chen et al. 2019]을 참조한다.
항원-결합 단편
항원-결합 단편은 항체 단편일 수 있다. 항체 또는 항체 단편은, 이들이 결합할 수 있다면, 임의의 면역글로불린 부류(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM) 및 하위부류일 수 있다. 특정 실시형태에서, 항체 단편은 항원-결합 부분을 갖는다. 특정 실시형태에서, 항체 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', F(ab)', Fv, a 이황화연결된 Fv, 단일 쇄 Fv(scFv), 2가 scFv(bi-scFv), 3가 scFv(tri-scFv), Fd, dAb 단편(예를 들어, Ward et al., Nature, (1989) 341:544-546), 단리된 CDR, 다이어바디, 어피바디(affibody), 트라이어바디, 테트라바디, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 재조합 방법 또는 합성 링커를 이용하여 항체 단편을 결합시킴으로써 생성된 단일쇄 항체는 또한 본 개시내용에 의해 포괄된다. 문헌[Bird et al. Science, (1988), 242:423-426. Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1988), 85:5879-5883]. 항체 단편은 일반적으로 무손상 항체의 항원 결합 부위를 포함하고 따라서 항원에 결합하는 능력을 보유하는 무손상 항체의 일부만을 포함한다. 본 발명에 의해 포괄되는 항체 단편의 예는 경쇄 가변 도메인(VL), 경쇄 불변 도메인(CL), 중쇄 가변 도메인(VH) 및 중쇄 불변 도메인(CH)을 갖는, Fab 단편; CH 도메인의 C-말단에서 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fab 단편인 Fab' 단편; VH 및 CH 도메인을 갖는 Fd 단편; VH 및 CH 도메인 및 CH 도메인의 C-말단에서 하나 이상의 시스테인 잔기를 갖는 Fd' 단편; 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 갖는 Fv 단편; VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward et al., Nature (1989) 341:544-546); 단리된 CDR 영역; 힌지 영역에서 이황화 브리지에 의해 연결된 2개의 Fab' 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; 단일 쇄 항체 분자(Bird et al., Science (1988) 242:423-426; 및 Huston et al., PNAS (1988) 85:5879-5883; 동일한 폴리펩타이드 쇄에서 VL 도메인에 연결된 VH 도메인을 포함하는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 다이어바디(예를 들어, Whitlow 등에 대한 WO 93/11161 및 문헌[Hollinger et al., PNAS (1993) 90:6444-6448]; 삼중 나선 고친화도 펩타이드인 어피바디(예를 들어, 문헌[Nygren, "FEBS Journal (2008) 275:2668-2676]), 및 상보성 경쇄 폴리펩타이드와 함께, 항원 결합 영역의 쌍을 형성하는 탠덤 Fd 세그먼트의 쌍(VH-CH1-VH-CH1)을 포함하는 선형 항체(문헌[Zapata et al., Protein Eng. (1995) 8(10):1057-1062]; 미국 특허 제5,641,870호; 미국 특허 제8,580,755호)를 포함한다.
임의의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 본 명세서에 기재된 바와 같은 계통-특이적 세포-표면 항원을 표적화하는 제제를 작제하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 항체 또는 항원-결합 단편은 통상적인 방법, 예를 들어, 하이브리도마 기술 또는 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다.
예를 들어, 관심 계통-특이적 항원에 특이적인 항체는 통상적인 하이브리도마 기술에 의해 생성될 수 있다. KLH와 같은 담체 단백질에 결합될 수 있는 계통-특이적 항원은 해당 복합체에 대한 항체 결합을 생성하기 위해 숙주 동물을 면역화시키는 데 사용될 수 있다. 숙주 동물의 면역화 경로 및 스케줄은 본 명세서에 추가로 기재된 바와 같이 항체 자극 및 생산을 위한 확립되고 통상적인 기법을 따른다. 마우스, 인간화 및 인간 항체의 생산을 위한 일반적인 기법은 당업계에 공지되어 있고, 본 명세서에 기재되어 있다. 인간 하이브리도마 세포주를 비롯한, 인간을 포함하는 임의의 포유류 대상체 또는 이로부터의 항체 생성 세포가 포유류 생산을 위한 기반으로서 작용하도록 조작될 수 있다는 것이 상정된다. 전형적으로, 숙주 동물은 본 명세서에 기재된 바와 같이 포함하는 면역원의 양이 복강내, 근육내, 경구, 피하, 족저내 및/또는 진피내로 접종된다.
하이브리도마는, 문헌[Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497]의 일반적 체세포 혼성화 기법을 이용하여 또는 문헌[Buck, et al., In Vitro, (1982)18:377-381]에 의해 변형된 바와 같이, 림프구 및 불멸 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. X63-Ag8.653 및 미국 캘리포니아주 샌디에이고에 소재한 Salk Institute, Cell Distribution Center로부터의 골수종 계통을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 이용 가능한 골수종 계통이 혼성화에서 사용될 수 있다. 일반적으로, 기법은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 후소겐(fusogen)을 이용하거나, 또는 당업자에게 잘 공지된 전기적 수단에 의해 골수종 세포 및 림프모양 세포를 융합시키는 것을 수반한다. 융합 후에, 세포를 배지로부터 분리시키고, 비혼성화된 모 세포를 제거하기 위해 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘(HAT) 배지와 같은 선택 성장 배지에서 성장시켰다. 혈청의 보충 유무와 상관없이 본 명세서에 기재된 임의의 배지는 단클론성 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양시키는 데 사용될 수 있다. 세포 융합 기법에 대한 다른 대안으로서, EBV 불멸 B 세포는 본 명세서에 기재된 TCR-유사 단클론성 항체를 생성하는 데 사용될 수 있다. 하이브리도마는 원한다면, 확장 및 서브클로닝되고, 상청액은 통상적인 면역분석 절차(예를 들어, 방사면역측정법, 효소 면역분석 또는 형광 면역분석)에 의해 항-면역원 활성에 대해 분석된다.
항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 계통-특이적 항원에 결합할 수 있는 단클론성 항체를 생산하는 모 하이브리도마의 모든 유도체, 자손 세포를 포괄한다. 이러한 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 절차를 이용하여 시험관내에서 또는 생체내에서 성장될 수 있다. 단클론성 항체는 배양 배지 또는 체액으로부터, 원한다면 통상적인 면역글로불린 정제 절차, 예컨대, 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피 및 한외여과에 의해 단리될 수 있다. 원치않는 활성이 존재하는 경우에는, 예를 들어, 고상에 부착된 면역원으로 이루어진 흡착제 위로 제제를 실행하고 면역원의 목적하는 항체를 방출함으로써, 제거될 수 있다. 이작용성 또는 유도체화제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 설포석신이미드 에스터(시스테인 잔기를 통한 접합), N-하이드록시석신이미드(라이신 잔기를 통함), 글루타르알데하이드, 석신 무수물, SOCl 또는 R1N=C=NR(여기서, R 및 R1은 상이한 알킬기임)을 이용하여 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 저해제에 접합된 표적 아미노산 서열을 포함하는 표적 항원 또는 단편에 의한 숙주 동물의 면역화는 항체(예를 들어, 단클론성 항체)의 집단을 수득할 수 있다.
원한다면, 관심 항원(예를 들어, 하이브리도마에 의해 생산됨)은 서열분석될 수 있고, 이어서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 발현 또는 증식을 위해 벡터에 클로닝될 수 있다. 관심 항체를 암호화하는 서열은 숙주 세포 내 벡터에서 유지될 수 있고, 이어서, 숙주 세포는 확장되며, 장래의 사용을 위해 냉동될 수 있다. 대안에서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 항체를 "인간화"하기 위해 또는 친화도(친화도 성숙) 또는 항체의 다른 특징을 개선시키기 위해 유전자 조작에 사용될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역은 항체가 임상 시험 및 인간 치료에서 사용되는 경우 면역 반응을 피하기 위해 인간 불변 영역과 더 비슷하게 되도록 조작될 수 있다. 계통-특이적 항원에 대해 더 큰 친화도를 얻기 위해 항체 서열을 유전자 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 변화가 항체에 대해 이루어질 수 있고 표적 항원에 대한 이의 결합 특이성을 여전히 유지할 수 있다는 것은 당업자에게 분명할 것이다.
다른 실시형태에서, 완전 인간 항체는 특정 인간 면역글로불린 단백질을 발현시키도록 조작된 상업적으로 입수 가능한 마우스를 이용함으로써 얻어질 수 있다. 더 바람직한(예를 들어, 완전 인간 항체) 또는 더 강한 면역 반응을 생성하도록 설계된 유전자이식 동물은 또한 인간화된 또는 인간 황체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 Amgen, Inc.(캘리포니아주 프리몬트 소재)로부터의 XenomouseRTM 및 Medarex, Inc.(뉴저지주 프린스턴 소재)로부터의 HuMAb-MouseRTM 및 TC MouseRTM이다. 다른 대안에서, 항체는 파지 디스플레이 또는 효모 기술에 의해 재조합적으로 생성될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,565,332호; 제5,580,717호; 제5,733,743호; 및 제6,265,150호; 및 문헌[Winter et al., Annu. Rev. Immunol. (1994) 12:433-455]을 참조한다. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술(McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-553)은 비면역화된 공여자로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터의 인간 항체 및 항체 단편을 생성하기 위해 사용될 수 있다.
무손상 항체(전장 항체)의 항원-결합 단편은 일상적인 방법을 통해 제조될 수 있다. 예를 들어, F(ab')2 단편은 항체 분자, 및 F(ab')2 단편의 이황화 브리지를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편의 펩신 분해에 의해 생산될 수 있다.
유전자 조작된 항체, 예컨대, 인간화된 항체, 키메라 항체, 단일쇄 항체, 및 이중 특이성 항체는, 예를 들어, 통상적인 재조합 기술을 통해 생산될 수 있다. 일례에서, 표적 항원에 특이적인 단클론성 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여(예를 들어, 단클론성 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용함으로써) 용이하게 단리 및 서열분석될 수 있다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. 일단 단리되면, DNA는 하나 이상의 발현 벡터에 위치될 수 있고, 이어서, 이는 재조합 숙주 세포에서 단클론성 항체의 합성을 얻기 위해 이콜라이 세포, 유인원 COS 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 달리 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염된다. 예를 들어, PCT 공개 WO 87/04462를 참조한다. 이어서, DNA는, 예를 들어, 상동성 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 암호화 서열을 치환함으로써(Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (1984) 81:6851), 또는 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열의 모두 또는 일부를 면역글로불린 암호화 서열에 공유 결합시킴으로써, 변형될 수 있다. 해당 방식에서, 표적 항원의 결합 특이성을 갖는 유전자 조작된 항체, 예컨대, "키메라" 또는 "혼성체" 항체가 제조될 수 있다.
"키메라 항체"의 생산에 대해 개발된 기법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81:6851; Neuberger et al. Nature (1984) 312:604; 및 Takeda et al. Nature (1984) 314:452]을 참조한다.
인간화된 항체를 작제하기 위한 방법은 또한 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, (1989) 86:10029-10033]을 참조한다. 일례로서, 모 비-인간 항체의 가변 영역인 VH 및 VL은 당업계에 공지된 방법에 따라 3차원 분자 모델링 분석을 실시하였다. 다음에, 정확한 CDR 구조의 형성에 중요한 것으로 예측된 프레임워크 아미노산 잔기는 동일한 분자 모델링 분석을 이용하여 확인된다. 동시에, 모 비-인간 항체의 아미노산 서열과 상동성인 아미노산 서열을 갖는 인간 VH 및 VL 쇄는 검색 질의로서 모 VH 및 VL 서열을 이용하여 임의의 항체 유전자 데이터베이스로부터 확인된다. 이어서, 인간 VH 및 VL 수용자 유전자가 선택된다.
선택된 인간 수용자 유전자 내의 CDR 영역은 모 비-인간 항체 또는 이의 기능성 변이체로부터의 CDR 영역으로 대체될 수 있다. 필요한 경우, CDR 영역과 상호작용하는 데 중요한 것으로 예측되는 모 쇄의 프레임워크 영역 내의 잔기(위의 설명을 참조)는 인간 수용자 유전자 내 대응하는 잔기를 치환하는 데 사용될 수 있다.
단일쇄 항체는 중쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 경쇄 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 연결함으로써 재조합 기술을 통해 제조될 수 있다. 바람직하게는, 가요성 링커는 두 가변 영역 사이에 혼입될 수 있다. 대안적으로, 단일 쇄 항체의 생산에 대해 기재된 기법(미국 특허 제4,946,778 및 4,704,692)은 파지 또는 효모 scFv 라이브러리를 생산하는 데 적합할 수 있고, 계통-특이적 항원에 특이적인 scFv 클론은 일상적인 절차 후 라이브러리로부터 확인될 수 있다. 양성 클론은 계통-특이적 항원에 결합하는 것을 확인하기 위해 추가적인 선별이 실시될 수 있다.
두 아미노산 서열의 "동일성 백분율"은 문헌[Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90:5873-77]에서와 같이 변형된 문헌[Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:2264-68]의 알고리즘을 이용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul, et al. J. Mol. Biol. (1990) 215:403-10]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 혼입된다. BLAST 단백질 검색은 본 개시내용의 단백질 분자에 상동성인 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램, 점수=50, 단어 길이=3에 의해 수행될 수 있다. 두 서열 사이에 갭이 존재하는 경우, Gapped BLAST가 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. (1997) 25(17):3389-3402]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용할 때, 각 프로그램의 디폴트 파라미터(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)가 사용될 수 있다.
핵산 및 벡터
본 개시내용은 임의의 개시된 폴리펩타이드, 조작된 단백질 또는 제제를 암호화하는 핵산/폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 예를 들어, 임의의 본 명세서에 기재된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 재조합 발현 및 정제가 제공된다. 일부 실시형태에서, 단리된 폴리뉴클레오타이드는 융합 단백질 또는 제제를 암호화하는 하나 이상의 서열을 포함한다. 핵산은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 또는 DNA/RNA 혼성체일 수 있다. 핵산은 선형 또는 원형(예컨대, 플라스미드)일 수 있다. 핵산은 단일가닥, 이중가닥, 분지형이거나, 비-핵산 분자의 결찰에 의해 변형될 수 있다. 핵산은 재조합 기술에 의해 생성된 핵산을 포함한다.
특정 실시형태에서, 개시된 조작된 단백질을 암호화하는 핵산은 코돈 최적화된다. 코돈 최적화를 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다.
특정 실시형태에서, aCD33-6DMPa-힌지 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 23에 대해 적어도 70% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 23의 핵산 서열에 대해 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 갖는다.
특정 실시형태에서, 폴리펩타이드 ULBP1-6DMPb-힌지를 암호화하는 핵산은 서열번호 24에 대해 적어도 70% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 24의 핵산 서열에 대해 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 갖는다.
특정 실시형태에서, aCD3-6DMPb 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 25에 대해 적어도 70% 동일한 핵산 서열(예를 들어, 서열번호 25의 핵산 서열에 대해 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일한 핵산 서열)을 갖는다.
특정 실시형태에서, 핵산은 세포에서 융합 폴리펩타이드 또는 제제의 발현을 야기하는 데 효과적인 측접 조절 서열과 함께 개시된 폴리펩타이드 또는 제제에 대한 암호화 서열을 포함하는 플라스미드 DNA이다. 측접 조절 서열의 예는 전사 또는 번역의 종결에 의해, 전사를 개시하는 데 충분한 프로모터 서열 및 유전자 산물을 종결시키는 데 충분한 종결자 서열이다. 적합한 전사 또는 번역 인핸서는 융합 폴리펩타이드 또는 제제의 발현을 추가로 보조하기 위해 벡터에 포함될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 조작된 단백질을 암호화하는 벡터는, 예를 들어, 재조합 발현 및 정제를 제공한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 단리된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 것을 포함하거나 포함하도록 조작된다. 전형적으로, 벡터는 숙주 세포에서 발현되도록 프로모터에 작동 가능하게 연결된 조작된 폴리펩타이드 또는 단백질 또는 제제를 암호화하는 서열을 포함한다.
핵산은 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 핵산 서열은 하나 이상의 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 다양한 발현 벡터 중 어느 하나에 포함될 수 있고, 하나 초과의 핵산은 하나의 발현 벡터에 포함될 수 있다. 대안적으로, 하나의 유전자 또는 핵산 부분은 별개의 벡터에 포함될 수 있다. 일부 실시형태에서, 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열(예를 들어, SV40, 박테리아 플라스미드, 파지 DNA의 유도체; 바큘로바이러스, 효소 플라스미드, 플라스미드와 파지 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터, 및 바이러스 DNA의 유도체)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 개시내용의 벡터는 포유류 발현 벡터를 이용하여 포유류 세포에서 하나 이상의 서열의 발현을 유도할 수 있다. 포유류 발현 벡터의 예는 pCDM8(Seed, Nature (1987) 329:840) 및 pMT2PC(Kaufman, et al., EMBO J. (1987) 6:187)을 포함한다. 포유류 세포에서 사용될 때, 발현 벡터의 대조군 기능은 전형적으로 하나 이상의 조절 요소에 의해 제공된다. 예를 들어, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2, 거대세포바이러스, 유인원 바이러스 40 및 본 명세서에 개시되고 당업계 공지된 다른 것으로부터 유래된다. 원핵 세포와 진핵 세포 둘 다에 대한 다른 적합한 발현 시스템에 대해, 예를 들어, 문헌[Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]을 참조한다.
본 개시내용의 벡터는 특정 세포 유형에서 핵산 발현을 우선적으로 지시할 수 있다(예를 들어, 핵산을 발현시키기 위해 조직-특이적 조절 요소가 사용된다). 이러한 조절 요소는 조직 특이적 또는 세포 유형 특이적일 수 있는 프로모터를 포함한다. 용어 "조직 특이적"은 프로모터에 적용되는 경우에, 상이한 유형의 조직에서 동일한 관심 뉴클레오타이드 서열 발현의 상대적 부재 하에 특정 유형의 조직에 대해 관심 뉴클레오타이드 서열의 선택적 발현을 지시할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 용어 "세포 유형 특이적"은 프로모터에 적용되는 경우에, 동일 조직 내의 상이한 유형의 세포에서 동일한 관심 뉴클레오타이드 서열 발현의 상대적 부재 하에 특정 유형의 세포에서 관심 뉴클레오타이드 서열의 선택적 발현을 지시할 수 있는 프로모터를 지칭한다. 용어 "세포 유형 특이적"은 프로모터에 적용되는 경우에 또한 단일 조직 내의 관심 뉴클레오타이드 서열의 선택적 발현을 촉진시킬 수 있는 프로모터를 의미한다. 프로모터의 세포 유형 특이성은 당업계에 잘 공지된 방법, 예를 들어, 면역조직학적 염색을 이용하여 평가될 수 있다.
통상적인 바이러스 및 비바이러스 기반 유전자 전달 방법은 포유류 세포 또는 표적 조직에서 핵산을 도입하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법은 배양물에서 또는 대상체에서 세포에 본 발명의 제제/폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 투여하는 데 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, RNA(예를 들어, 본 명세서에 기재된 벡터의 전사체), 네이키드 핵산, 및 전달 비히클과 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이는 세포에 전달 후 에피솜 또는 통합된 게놈 중 하나를 갖는다.
바이러스 벡터는 환자에(생체내에서) 직접적으로 투여될 수 있거나, 이들은 변형된 세포기 환자에 투여될 수 있는 경우에 시험관내 또는 생체외에서 세포를 조작하는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 개시내용은 유전자 전달을 위해 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 및 단순포진 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 바이러스 기반 시스템을 이용한다. 더 나아가, 본 개시내용은 레트로바이러스 또는 렌티바이러스와 같은 숙주 게놈에 통합될 수 있는 벡터를 제공한다.
본 개시내용의 벡터는 대상체에서 진핵 세포에 전달될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 키메라 단백질은 일상적인 방법, 예컨대, 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 본 명세서의 키메라 단백질을 제조하는 방법은 자연살해(NK) 세포 상에서 발현된 분자에 결합되는 항원-결합 단편 및 폴리펩타이드를 포함하는, 키메라 단백질의 단편/도메인/모이어티를 각각 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산의 생성에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질의 성분 각각을 암호화하는 핵산은 재조합 기술을 이용하여 함께 결합된다.
조작된 단백질 성분 각각의 서열은 일상적인 기술, 예를 들어, 당업계에 공지된 다양한 공급원 중 어느 하나로부터의 PCR 증폭을 통해 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질 성분 중 하나 이상의 서열은 인간 세포로부터 얻어진다. 대안적으로, 키메라 단백질의 하나 이상의 성분의 서열이 합성될 수 있다. 각각의 성분(예를 들어, 단편/도메인/모이어티)의 서열은 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 펩타이드 링커를 암호화하는 핵산 서열을 이용하여) 결합되어 PCR 증폭 또는 결찰과 같은 방법을 이용하여 키메라 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 형성한다. 대안적으로, 키메라 단백질을 암호화하는 핵산이 합성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산은 DNA이다. 다른 실시형태에서, 핵산은 RNA이다.
각각의 성분의 서열에 결합하기 전 또는 후의 키메라 단백질 성분(예를 들어, 항원-결합 단편 등) 중 하나 이상 내에서 하나 이상의 잔기의 돌연변이. 일부 실시형태에서, 조작된 단백질 성분에서의 하나 이상의 돌연변이는 표적에 대한 성분(예를 들어, 표적 항원에 대한 항원-결합 단편)의 친화도를 조절(증가 또는 감소)하고/하거나 성분 활성을 조절하도록 생성될 수 있다.
통상적인 기술을 통해 발현을 위한 적합한 세포에 임의의 본 명세서에 기재된 조작된 단백질이 도입될 수 있다.
조작된 단백질을 발현시키기 위해, 조작된 단백질의 안정적인 또는 일시적 발현을 위한 발현 벡터는 본 명세서에 기재된 바와 같은 통상적인 방법을 통해 작제될 수 있다. 예를 들어, 키메라 단백질을 암호화하는 핵산은 적합한 프로모터에 대한 작동 가능한 결합에서 적합한 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터에 클로닝될 수 있다. 핵산 및 벡터는 서로 짝지어지고 결찰효소에 의해 결합될 수 있는 각 분자 상의 상보성 단부를 생성하기 위해 적합한 조건 하에 제한 효소와 접촉될 수 있다. 대안적으로, 합성 핵산 링커는 조작된 단백질을 암호화하는 핵산의 말단에 결찰될 수 있다. 합성 링커는 벡터 내 특정 제한 부위에 대응하는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터/플라스미드/바이러스 벡터의 선택은 키메라 단백질의 발현을 위해 숙주 세포 유형에 따를 것이지만, 진핵 세포에서의 통합 및 복제에 적합하여야 한다.
다양한 프로모터가 거대세포바이러스(CMV) 급초기 프로모터, 바이러스 LTR, 예컨대, 라우스 육종 바이러스 LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, 말로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) LTR, 골수증식 육종 바이러스(MPSV) LTR, 비장 병소-형성 바이러스(SFFV) LTR, 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 단순포진 tk 바이러스 프로모터, EF1-α 인트론 유무와 상관없이 연장인자 1-알파(EF1-α) 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 본 명세서에 기재된 조작된 단백질의 발현을 위해 사용될 수 있다. 키메라 단백질의 발현을 위한 추가적인 프로모터는 임의의 구성적으로 활성인 프로모터를 포함한다. 대안적으로, 임의의 조절 가능한 프로모터가 사용될 수 있으므로, 이의 발현은 조절될 수 있다.
추가적으로, 벡터는, 예를 들어, 다음 중 일부 또는 모두를 포함할 수 있다: 선택 가능한 마커 유전자, 예컨대, 숙주 세포에서 안정적 또는 일시적인 형질감염의 선택을 위한 네오마이신 유전자; 고수준의 전사를 위한 인간 CMV의 급초기 유전자로부터의 인핸서/프로모터 서열; mRNA 안정성을 위한 SV40으로부터의 전사 종결 및 RNA 가공 신호; 글로빈 또는 β-글로빈과 같은 고도로 발현된 유전자로부터의 mRNA 안정성 및 번역 효율을 위한 5'-및 3'-비번역 영역; 적절한 에피솜 복제를 위한 SV40 폴리오마 복제기점 및 ColE1; 내부 리보손 결합 부위(IRES); 다기능 다중 클로닝 부위; 센스 및 안티센스 RNA의 시험관내 전사를 위한 T7 및 SP6 RNA 프로모터; 촉발될 때 벡터를 지니는 세포가 사멸되게 하는 "자살 스위치" 또는 "자살 유전자"(예를 들어, HSV 티미딘 키나제, 유도성 카스파제, 예컨대, iCasp9), 및 키메라 단백질의 발현을 평가하기 위한 리포터 유전자. 아래의 VI 부문을 참조한다. 이식유전자를 포함하는 벡터를 생산하기 위한 적합한 벡터 및 방법은 잘 공지되어 있고, 당업계에서 이용 가능하다. 키메라 단백질의 발현을 위한 벡터 제조의 예는, 예를 들어, US2014/0106449에서 찾을 수 있다.
일부 실시형태에서, 조작된 단백질 또는 상기 조작된 단백질을 암호화하는 핵산은 DNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 상기 조작된 단백질을 암호화하는 핵산은 DNA 벡터이다. 일부 실시형태에서, 조작된 단백질을 암호화하는 핵산은 RNA 분자이다.
본 명세서에 기재된 조작된 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 임의의 벡터가 또한 본 개시내용의 범주 이내이다. 이러한 벡터는 적합한 방법에 의해 숙주 세포에 전달될 수 있다. 면역 세포에 벡터를 전달하는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고, DNA, RNA, 또는 트랜스포존 전기천공법, DNA, RNA 또는 트랜스포존을 전달하기 위해 리포솜 또는 나노입자 같은 형질감염 시약; 기계적 변형에 의한 DNA, RNA 또는 트랜스포존 또는 단백질의 전달(예를 들어, 문헌[Sharei et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2013) 110(6):2082-2087]); 또는 바이러스 형질도입을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 단백질의 발현을 위한 벡터는 바이러스 형질도입에 의해 숙주 세포에 전달된다. 전달을 위한 예시적인 바이러스 방법은 재조합 레트로바이러스(예를 들어 PCT 공개 번호 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; 미국 특허 제5,219,740호 및 제4,777,127호; 영국 특허 제2,200,651호; 및 유럽 특허 제0 345 242호), 알파바이러스 기반 벡터, 및 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터(예를 들어, PCT 공개 번호 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참조)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 발현을 위한 벡터는 레트로바이러스이다. 일부 실시형태에서, 발현을 위한 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 실시형태에서, 발현을 위한 벡터는 아데노-연관 바이러스이다.
조작된 단백질을 암호화하는 벡터가 바이러스 벡터를 이용하여 숙주 세포에 도입된 예에서, 세포를 감염시킬 수 있고 벡터를 지니는 바이러스 입자는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 생산될 수 있고, 예를 들어, PCT 출원 공개 번호 WO 1991/002805A2, WO 1998/009271 A1 및 미국 특허 제6,194,191호에서 찾을 수 있다. 바이러스 입자는 세포 배양물 상청액으로부터 채취되고, 바이러스 입자를 세포와 접촉시키기 전에 단리 및/또는 정제될 수 있다.
치료 방법
임의의 개시된 조작된 단백질은 조혈성 악성종양과 같은 병태를 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 추가적으로, 개시된 조작된 단백질을 암호화하는 임의의 핵산/폴리뉴클레오타이드/벡터는 조혈성 악성종양과 같은 병태를 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 추가적으로, 임의의 개시된 조작된 단백질 또는 개시된 조작된 단백질을 암호화하는 핵산/폴리뉴클레오타이드/벡터를 포함하는 임의의 조성물 또는 약제학적 조성물은 조혈성 악성종양과 같은 병태를 치료하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "대상체", "개체" 및 "환자"는 상호 호환적으로 사용되고, 척추동물, 바람직하게는 인간과 같은 포유류를 지칭한다. 포유류는 인간 영장류, 비-인간 영장류 또는 뮤린, 소, 말, 개 또는 고양이 종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 조혈성 악성종양을 갖는 인간 환자이다.
일부 실시형태에서, 본 벡터, 조작된 단백질 또는 제제는 또한 본 개시내용의 범주 내에 있는 약제학적 조성물을 형성하기 위해 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합될 수 있다.
본 개시내용은 암세포에 대해 면역 반응을 유발하는 데 적합한 백신을 제공한다. 본 발명의 백신을 포유류에 투여함으로써 종양 성장을 저해하는 방법이 또한 기재된다.
본 조성물은 임의의 적합한 유형의 세포에 전달되거나, 이와 접촉되도록 투여될 수 있다. 세포는 진핵 세포일 수 있다. 세포는 포유류 세포, 예컨대, 인간 세포 또는 비인간 포유류 세포(예를 들어, 비-인간 영장류 세포)일 수 있다. 이들은 미국 미생물 보존센터(American Tissue Culture Collection)로부터 얻을 수 있는 다수의 세포주를 포함한다.　특정 실시형태에서, 세포는 종양 세포이다.
특정 실시형태에서, 세포는 대상체(예를 들어, 포유류)에 존재한다. 포유류는 인간 또는 비-인간 영장류일 수 있다. 비-인간 영장류는 침팬지, 사이노몰거스 원숭이, 스파이더 원숭이 및 마카크, 예를 들어, 레서스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 세포는 제거될 수 있고, 1차, 2차, 불멸 또는 형질전환 상태에서 조직 배양물에서 유지될 수 있다.　특정 실시형태에서, 세포는 배양된 세포 또는 공급원(예를 들어, 조직, 기관, 대상체 등)으로부터 새로 얻은 세포이다. 포유류 세포는 1차 또는 2차일 수 있고, 이는 동물 조직으로부터 얻은 후에 상대적으로 단시간 동안 배양물에서 유지되었다는 것을 의미한다.
본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위해, 유효량의 본 발명의 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "유효량"은 용어 "치료적 유효량"과 상호 호환적으로 사용될 수 있고, 이를 필요로 하는 대상체에 투여 시 목적하는 활성을 초래하기에 충분한 벡터, 조작된 단백질, 제제 또는 약제학적 조성물의 해당량을 지칭한다. 본 개시내용의 문맥 내에서, 용어 "유효량"은 본 개시내용의 방법에 의해 치료되는 장애의 징후를 지연시키거나, 진행을 저지하거나, 적어도 하나의 증상을 완화 또는 경감하기에 충분한 벡터, 조작된 단백질, 제제 또는 약제학적 조성물의 양을 지칭한다.
유효량은, 당업자가 인식할 바와 같이 의료 종사자의 지식 및 기술 내에서 치료 중인 특정 병태, 병태의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기, 성별 및 체중을 비롯한 개개 환자 파라미터, 치료의 지속기간, 병행 요법의 특성(존재하는 경우), 구체적 투여 경로 등의 인자에 따라 다르다. 일부 실시형태에서, 유효량은 증상을 경감, 완화, 호전, 개선, 감소시키거나, 대상체에서 임의의 질환 또는 장애의 진행을 지연시킨다. 일부 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 조혈성 악성종양을 갖는 인간 환자이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 표적 세포(예를 들어, 암 세포)의 수를 적어도 20%, 예를 들어, 50%, 80%, 100%, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 이상만큼 감소시키기 위한 유효량으로 대상체에게 투여된다.
일 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 대상체(예를 들어, 인간 환자)에 개시 용량으로서 투여된다. 본 발명의 조성물의 1회 이상의 후속 투여는 이전의 투여 후 15일, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2일의 간격으로 환자에게 제공될 수 있다. 본 발명이 조성물의 1회 초과의 용량은 주당, 예를 들어, 2, 3, 4회 이상의 제제의 투여로 대상체에게 투여될 수 있다. 대상체는 주당 1회 초과 용량의 본 발명의 조성물 다음에, 제제의 투여 없이 1주, 최종적으로, 그 다음에 1회 이상의 추가 용량의 본 발명의 조성물(예를 들어, 주당 본 발명의 조성물의 1회 초과의 투여)을 받을 수 있다. 본 발명의 조성물은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 이상 동안 주당 3회의 투여로 격일로 투여될 수 있다.
본 명세서에 열거된 임의의 질환 병태에 관한 한 본 개시내용과 관련하여, 용어 "치료하다", "치료" 등은 이러한 병태와 연관된 적어도 하나의 증상을 경감 또는 완화시키거나, 또는 이러한 병태의 진행을 늦추거나 반전시키는 것을 의미한다. 본 개시내용의 의미 내에서, 용어 "치료하다"는 또한 발병(즉, 질환의 임상적 징후 전의 기간)을 저지, 지연시키고/시키거나 질환이 발생 또는 악화될 위험을 감소시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 암과 관련하여 용어 "치료하다"는 환자의 종양 부담을 제거 또는 감소시키거나, 전이를 예방, 지연 또는 저해하는 것을 의미할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조작된 단백질 융합체는 사멸을 표적화하기 위한 세포-표면 계통 특이적 항원을 발현시키는 표적 세포를 인식(결합)한다.
본 치료적 방법의 효능은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있고, 당업자에게 분명할 것이다. 예를 들어, 치료 효능은 대상체의 생존, 대상체 또는 이의 조직 또는 샘플에서의 암 부담에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 요법의 효능은 세포의 특정 집단 또는 계통에 속하는 세포 수를 정량화함으로써 평가된다. 일부 실시형태에서, 요법의 효능은 세포-표면 계통-특이적 항원을 제시하는 세포 수를 정량화함으로써 평가된다.
본 조성물은 2차 요법과 병용하여 대상체에게 투여될 수 있다. 본 조성물은 2차 요법의 투여 전에 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 2차 요법의 투여 전 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 이상에 투여된다.
일부 실시형태에서, 2차 요법은 본 발명의 조성물의 투여 전에 투여된다. 일부 실시형태에서, 2차 요법은 본 발명의 조성물의 투여 전 적어도 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월 이상에 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 2차 요법은 실질적으로 동시에 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물이 투여되며, 환자는 일정 시간 동안 평가되고, 이후에 2차 요법이 투여된다. 일부 실시형태에서, 2차 요법이 투여되며, 환자는 일정 시간 동안 평가되고, 이후에 본 발명의 조성물이 투여된다.
또한 본 발명의 조성물의 다회 투여(예를 들어, 용량)는 본 개시내용의 범주 이내이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 대상체에게 1회 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 대상체에게 1회 이상(예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5회 이상) 투여된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 규칙적 간격으로, 예를 들어, 6개월마다 대상체에게 투여된다.
일부 실시형태에서, 대상체는 조혈성 악성종양 또는 혈액 신생물을 갖는 인간 대상체이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이 조혈성 악성종양은 조혈 세포(예를 들어, 선조 세포 및 줄기 세포를 포함하는 혈액 세포)를 수반하는 악성 이상을 지칭한다. 조혈성 악성종양의 예는 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 백혈병 또는 다발성 골수종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 백혈병은 급성 골수성 백혈병, 급성 림프모양 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프모구 백혈병 또는 만성 림프모구 백혈병 및 만성 림프모양 백혈병을 포함한다.
혈액 악성종양 또는 신생물은 골수성 악성종양, 림프 악성종양, 악성 조직구증 및 비만세포 백혈병을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
조혈성 악성종양은 골수성 악성종양일 수 있되, 골수성 악성종양은 골수증식성 장애(MPD), 골수이형성 증후군(MDS), 골수이형성/골수증식성 장애(MD/MPD) 및 급성 골수성 백혈병(AML)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 골수성 악성종양은 조혈 세포의 증식에서 결함과 연관된 병태를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 골수성 악성종양은 만성 및 급성 병태를 포함하는 골수성 혈액 계통에 영향을 미치는 클론 혈액 질환을 지칭한다. 골수성 악성종양은 골수증식성 신생물, 골수이형성 증후군 및 급성 골수성 백혈병을 포함한다. 골수증식성 신생물은 원발성 골수섬유화증(PMF) 또는 본태성 혈소판 증가증(ET)일 수 있다. 골수이형성 증후군은 환상철적혈모구 및 혈소판증가증(RARS-T)을 수반한 난치성 빈혈일 수 있다. 골수성 악성종양은 골수증식성 장애(MPD), 골수이형성 증후군(MDS), 골수이형성/골수증식성 장애(MD/MPD) 및 급성 골수성 백혈병(AML)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
림프 악성종양은 T/NK 세포 종양, B 세포 종양 및 호지킨병을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 백혈병은 급성 골수성 백혈병(AML)이다. AML은 중요한 분화 및 성장-조절 경로를 붕괴시키는 계속해서 획득되는 중요한 유전적 변화를 갖는 형질전환 세포로부터 유래된 이종성, 클론, 신생물 질환으로서 특성규명된다(Dohner et al. 2015). CD33 당단백질은 대다수의 골수모양 백혈병 세포뿐만 아니라 정상 골수모양 및 단핵구 전구체 상에서 발현되고, AML 요법에 대한 매력적인 표적인 것으로 간주되었다(Laszlo et al., Blood Rev. (2014) 28(4):143-53). 항-CD33 단클론성 항체 기반 요법을 이용하는 임상 시험은 표준 화학요법과 조합될 때 AML 환자 서브세트에서 개선된 생존을 나타냈지만, 이들 효과는 또한 안전성 및 효능 우려를 수반하였다.
대안적으로 또는 추가로, 본 명세서에 기재된 방법은 폐암; 귀, 코 및 인후암; 결장암; 흑색종; 췌장암; 유선암; 전립선암; 유방암; 난소암; 기저세포 암종; 담도암; 방광암; 뼈암; 유방암; 자궁경부암; 융모암; 결장 및 직장암; 결합 조직암; 소화계통의 암; 자궁내막암; 식도암; 눈암; 두경부암; 위암; 상피내 신생물; 신장암; 후두암; 간암; 섬유종, 신경아세포종; 구강암(예를 들어, 입술, 혀, 구강 및 인두); 난소암; 췌장암; 전립선암; 망막아세포종; 횡문근육종; 직장암; 신세포암; 호흡계의 암; 육종; 피부암; 위암; 고환암; 갑상선암; 자궁암; 비뇨기 계통의 암뿐만 아니라 기타 암종 및 육종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 비조혈 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
암종은 상피 유래의 암이다. 본 개시내용의 방법에 의한 치료가 의도되는 암종은 샘꽈리 세포 암종, 엽상 암종, 폐포 선암종(또한 샘낭암종, 샘근상피종, 사상형 암종 및 원주종으로 불림), 샘암종, 선암종, 부신피질 암종, 폐포암, 폐포상피암(세기관지성 암종, 폐포 세포 종양 및 폐샘종증으로도 불림), 기저 세포 암종, 기저세포암종(기저세포암, 또는 기저세포종양 및 모상암으로도 불림), 기저세포모양 암종, 바다편평세포 암종, 유방 암종, 세기관지폐포암, 세기관지성 암종, 기관지유래 암종, 대뇌모양 암종, 담관세포암종(담관종 및 담관암종으로 불림), 융모암종, 콜로이드질 암종, 면포암종, 자궁체부암종, 사상형 암종, 흉부 갑옷 암종, 피각 암종, 원통형 암종, 원주세포 암종, 관암종, 듀럼 암종, 배아 암종, 뇌양 암종, 안구상 암종, 표피모양암종, 상피 아데노이드 암종, 궤양 암종, 섬유성 암종, 젤라틴모양 암종, 젤라틴양 암종, 거대세포암종, 거상세포, 샘암종, 과립막 세포암, 털바탕질 암종, 혈액모양 암종, 간세포 암종(간세포암, 악성 간세포암 및 간암종으로도 불림), 휘르틀레 세포 암종, 유리질 암종, 고신장형 암종, 유아 배아 암종, 제자리암종, 표피내모반 암종, 상피내 암종, 크롬페처 암종, 쿨치스키(Kulchitzky)-세포 암종, 렌티큘러 암종, 수정체양 암종, 지방종성 암종, 림프상피종 암종, 유방염 암종, 수질 암종, 속질 암종, 모반 암종, 멜라닌 암종, 점액성 암종, 비성암종, 점액세포암종, 점막표피모양암종, 점액질 암종, 점액 암종, 점액종, 비인두암종, 니그럼 암종, 귀리세포 암종, 골화성 암종, 유골암종, 난소암종, 유두상 암종, 간문맥 암종, 침습전 암종, 전립선 암종, 신장의 신세포 암종(신장의 선암종 및 신장형 암종으로도 불림), 예비세포 암종, 육종성 암종, 시나이더 암종, 경성암종, 음낭암종, 반지세포암종, 단순암, 소세포 암종, 솔라노이드 암종, 구형 세포 암종, 방추상 세포 암종, 해면체 암종, 편평 암종, 편평 세포 암종, 스트링 암종, 혈관확장 암종, 모세혈관확장상 암종, 이행세포 암종, 결절 암종, 결절성 암종, 사마귀모양 암종, 융모상암종을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
육종은 뼈 및 연조직에서 생기는 중간엽 신생물이다. 상이한 유형의 육종이 인식되고, 이들은 하기를 포함한다: 지방육종(점액성 지방육종 및 다형성 지방육종을 포함), 평활근육종, 횡문근육종, 악성 말초신경집 종양(악성 신경초종, 신경섬유종증, 또는 신경성 육종으로도 불림), 유잉 종양(뼈의 유잉 육종, 연부조직(즉, 비-뼈) 유잉 육종, 및 원시 신경외배엽 종양[PNET]을 포함), 활액 육종, 맥관육종, 혈관육종, 림프관육종, 카포시 육종, 혈관내피종, 섬유육종, 데스모이드 종양(공격성 섬유종증으로도 불림), 융기피부섬유육종(DFSP), 악성 섬유 조직구종(MFH), 주피세포종, 악성 중간엽종, 포상 연부육종, 상피모양 육종, 투명세포 육종, 결합조직성 소세포 종양, 위장관 기질 종양(GIST)(GI 기질 육종으로도 알려짐), 골육종(골원성 육종으로도 알려짐)-골격 및 연부조직 및 연골육종.
일부 실시형태에서, 치료될 암은 난치성 암일 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 "난치성 암"은 처방된 표준 치료에 대해 내성이 있는 암이다. 이들 암은 초기에 치료에 반응성인 것으로 나타날 수 있거나(이후에 재발됨), 또는 이들은 치료에 완전히 비반응성일 수 있다. 보통의 표준 요법은 암 유형 및 대상체에서의 진행 정도에 따라 다를 것이다. 이는 화학요법, 또는 수술 또는 방사선, 또는 이들의 조합일 수 있다. 당업자는 이러한 표준 치료를 인식한다. 따라서 난치성 암에 대해 본 개시내용에 따라 치료 중인 대상체는 이미 이들의 암에 대한 다른 치료에 노출된 적이 있을 수 있다. 대안적으로, 암이 난치성일 가능성이 있다면(예를 들어, 암세포 분석 또는 대상체의 병력을 고려하여), 대상체는 다른 치료에 아직 노출된 적이 없을 수 있다. 난치성 암의 예는 백혈병, 흑색종, 콩팥세포암종, 결장암, 간(간장)암, 췌장암, 비호지킨 림프종 및 폐암을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
임의의 본 벡터, 본 명세서에 기재된 조작된 단백질 또는 제제는 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제에 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및/또는 세포와 관련하여 사용될 때 어구 "약제학적으로 허용 가능한"은 생리적으로 용인 가능하고 포유류(예를 들어, 인간)에 투여될 때 뜻밖의 반응을 전형적으로 생성하지 않는 이러한 조성물의 분자 독립체 및 기타 성분을 지칭한다. 바람직하게는, 본 명세서에 사용되는 바와 같은 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전 또는 포유류, 더 구체적으로는 인간에서 사용하기 위한 다른 일반적으로 인식되는 약전에 열거된 것을 의미한다. "허용 가능한"은 담체가 조성물의 활성 성분(예를 들어, 핵산, 벡터, 세포 또는 치료적 항체)에 적합하고 조성물(들)이 투여된 대상체에 부정적으로 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다. 본 방법에서 사용될 임의의 약제학적 조성물 및/또는 세포는 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정제를 포함할 수 있다.
완충제를 포함하는 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당업계에 잘 공지되어 있으며, 인산염, 시트르산염 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제; 저분자량 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 아미노산; 소수성 중합체; 단당류; 이당류; 및 기타 탄수화물; 금속 착물; 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]을 참조한다.
키트
또한 본 발명의 조작된 단백질, 제제, 벡터 및/또는 조성물의 사용을 위한 키트는 본 개시내용의 범주 이내이다. 이러한 키트는 본 발명의 조작된 단백질, 제제, 벡터 및/또는 조성물을 포함하는 하나 이상의 용기를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 일부 양상은 본 발명의 조작된 단백질 또는 제제를 포함하는 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본 발명의 조작된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 재조합 단백질 발현을 위한 벡터를 포함하되, 벡터는 본 발명의 조작된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 본 발명의 조작된 단백질을 발현시키기 위한 유전자 작제물을 포함하는 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 부형제 및 키트를 이용하기 위한 지침을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부형제는 약제학적으로 허용 가능한 부형제이다.
일부 실시형태에서, 키트는 본 명세서에 기재된 임의의 방법에서 사용하기 위한 지침을 포함할 수 있다. 포함된 지침은 대상체에서 의도된 활성을 달성하기 위한 약제학적 조성물의 투여의 설명을 포함할 수 있다. 키트는 대상체가 치료를 필요로 하는지의 여부에 기반하여 치료에 적합한 대상체를 선택하는 것의 설명을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 지침은 치료를 필요로 하는 대상체에게 약제학적 조성물을 투여하는 것의 설명을 포함한다.
본 명세서에 기재된 약제학적 조성물의 사용에 관한 지침은 일반적으로 의도된 치료를 위한 투약량, 투약 스케줄 및 투여 경로로서 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다회 용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에서 공급된 지침은 전형적으로는 라벨 또는 패키지 삽입물 상에 기재된 지침이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 약제학적 조성물이 대상체에서의 질환 또는 장애를 치료하고/하거나 발병을 지연시키고/시키거나, 완화시킨다는 것을 나타낸다.
본 명세서에 제공된 키트는 적합한 패키징에 있다. 적합한 패키징은 바이알, 보틀, 단지, 가요성 패키징 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특정 장치, 예컨대, 흡입기, 비강 투여 장치 또는 주입 장치와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 상정된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백(bag) 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 상기 기재한 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
일부 실시형태에서, 제형의 개개 성분은 하나의 용기에 제공될 수 있다. 대안적으로, 둘 이상의 용기에 제형 성분을 별개로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 상이한 성분은, 예를 들어, 키트와 함께 제공되는 지침에 따라 합쳐질 수 있다. 성분은, 예를 들어, 약제학적 조성물을 제조하고 투여하기 위해, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 합쳐질 수 있다.
본 발명의 조작된 단백질, 제제, 벡터 또는 조성물은 임의의 형태로, 예를 들어, 액체, 건조 또는 동결건조 형태로 제공될 수 있다.
실시예
본 발명은 본 발명의 바람직한 실시형태를 더욱 완전하게 설명하기 위해 제시되는 다음의 비제한적 실시예를 참조로 하여 더욱 양호하게 이해될 수 있다. 이들은 어떤 방법으로 본 발명의 광범위한 범주를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다.
실시예 1- 조작된 이형이량체 단백질의 작제
처음에, aCD33-ULBP1 조작된 이형이량체 단백질에 대해 pcDNA3.1 발현 벡터를 사용하였다. 모든 작제물은 세포 상청액에 완전 단백질의 수송을 촉발하기 위해 N-말단의 IL-2 분비 신호를 이용하고, 정제 및 표지를 용이하게 하기 위해 C-말단의 myc- 및 6xHis-태그를 이용하였다. 두 작제물에서, ULBP1은 즉시 IL-2 신호에 따른 후에, 링커가 이어지고, 이어서, aCD33의 VH 및 VL 영역이 이어졌다. 다른 작제물에서, 하나의 배향이 바람직한지의 여부를 결정하기 위해, aCD33는 ULBP1보다 선행한다. 추가적으로, 작제물은 aCD33-scFV 또는 ULBP1 단독을 위해 개발되었다.
형질감염된 HEK-293T 세포의 상청액에서 6xHis-태그 단백질의 정제 후 Myc의 웨스턴 블롯 프로빙뿐만 아니라 세포 단백질의 Myc 프로빙을 이용하여 Mirus TransIT-293 형질감염 시약을 통한 발현을 확인하였다. 실시예 2 및 도 12를 참조한다.
6DMPa-단량체를 상기 열거한 항-CD33, GFP 및 결합된 태그(6xHis 및 myc)에 융합시켰다. 6DMPa-myc의 정제를 독립적으로 용이하게 하기 위해(별개의 공동-면역침전 실험을 가능하게 하기 위해) 6DMPb 단량체를 UPBP1, RFP 및 6xHis 및 FLAG 태그에 융합시켰다.
ULBP1-6DMPb 작제물과 매칭되는 태그를 이용하여, 항-CD3을 6DMPb에 부착시키는 조작된 단백질을 암호화하는 pcDNA3.1 플라스미드를 생성하였다(도 10). 이 접근에서, CD3+ T-세포를 관련 효과기 세포로서 NK 세포로 대체하였고, 따라서 항-CD3 촉진자를 항-CD33 표적화 모이어티에 결합하기 위해 6DMPb를 부착하였다. Amgen CD3-CD19 BiTE 블리노투모맙으로부터 항-CD3 서열을 취하고, 이전에 사용한 동일한 링커를 통해 6DMPb에 융합시켰다(Kufer et al. 2017). 이를 aCD33-6DMPa와 함께 공동 발현시키고, 공동 면역침전시켜 이형이량체화를 확인하였다. 상기 언급한 바와 같은 고출력 단백질 발현 방법을 생성하기 위해 작제물을 박테리아 또는 렌티바이러스 벡터에 클로닝시켰다.
이들 설계에 대한 마지막 변형은 IgG2의 힌지 영역을 포함하였다. 총 12개 잔기의 폭으로 4개의 이황화 브리지를 생성하는 4개의 시스테인 잔기에 의해, 6DMP-기반 키메라의 C-말단에 첨가된 힌지 영역은 이형이량체의 결합을 향상시키고 해리를 방지하는 것으로 예상되었다(Wypych et al. 2008). 따라서 6DMPa/b 다음에 그리고 정제 태그 앞에 동일한 IgG2-힌지를 각 작제물에 첨가하였다(도 1 및 도 10). 이 힌지를 직접 첨가하거나 이 힌지를 짧은 링커 다음에 첨가한 작제물을 설계하였다.
암피실린 내성을 갖는 pcDNA3.4-TOPO 벡터로부터 모든 작제물을 발현시키고, 크리세툴루스 그리세우스(Cricetulus griseus)(중국 햄스터)에서 발현을 위해 코돈-최적화시켰다. 도 11을 참조한다.
폴리펩타이드/단백질을 발현시키기 위해, DNA 서열을 얻기 위해 아미노산 서열을 역번역하고, 이어서, 코돈 최적화시켰다(서열번호 23 내지 25).
Lipofectamine 3000을 이용하여 제조업자 프로토콜의 수정된 버전에 따라 단백질을 발현시켰다.
Figure pct00023
aCD33-6DMPa-힌지를 aCD3-6DMPb-힌지 또는 ULBP1-6DMPb-힌지와 동일한 접시에서 공동-발현시켰다
Figure pct00024
단백질은 15-cm 조직-배양물 처리 접시에서 CHO-K1 세포를 생성하였다
10 내지 12×106개의 세포를 형질감염 전날, 37℃ 5% CO2에서 배양시켰다
플레이트당 시약 용적은 다음과 같았다:
135㎕ Lipofectamine 3000
40㎍의 각 플라스미드(aCD33-6DMPa-힌지 및 aCD3-6DMPb-힌지)
160㎍ P3000 시약(2㎕/㎍ DNA)
형질감염 후 3 내지 4일에 상청액을 수집하였다
Figure pct00025
TALON Metal Affinity Reason(TaKaRa Bio)을 이용하여 His-태그 함유 단백질(aCD33-6DMPa-힌지 및 aCD3-6DMPb-힌지)에 대해 세포 배양물 상청액을 정제하였다
400㎕의 현탁 수지(200㎕의 펠릿 수지)를 20㎖ 상청액마다 사용하였다
전형적으로, 5개의 플레이트를 한꺼번에 사용하여, 2개의 50-㎖ 배취(batch)를 생성하고, 각각은 500㎕의 세척 및 평형상태 수지를 받았다
제조업자의 프로토콜에 따랐고, HisTALON 완충제 대신에 다음의 완충제를 이용하였다:
세척 완충제: TBST-Tris 20mM, NaCl 150mM, 0.1% Tween-20;
평형 완충제: Tris 20mM, NaCl 150mM, 5mM 이미다졸, 1mM PMSF;
용리 완충제: NaCl 150mM, 1mM KH2PO4, 3mM Na2HPO4-7H2O, 150mM 이미다졸
세척 및 용리 전에 4degC에서 30분 동안 상청액 및 수지를 회전시켰다
Figure pct00026
500㎕의 이량체-결합된 비드를 용리 완충제를 이용하여 대략 7.5㎖의 최종 용적으로 3× 용리시켰다
7.5㎖의 단백질-함유 용리 완충제를 PBS를 이용하여 20㎖ 최종 용적으로 희석시켰다
제조업자 프로토콜에 따라 Pierce Protein Concentrator PES(30k MWCO, 5 내지 20㎖ 크기)를 이용하여 20㎖의 단백질-함유 완충제를 농축시켰다
농축 후에, 샘플을 PBS로 다시 한 번 10 내지 20㎖로 희석시키고, 한 번 더 농축시켰다
30k MWCO 컷오프는 상부 챔프에서 대부분의 이량체를 유지할 만큼 충분히 크지만, 대부분의 더 작은 단량체가 하부 챔버를 통과하여 폐기되는 것을 가능하게 한다
Figure pct00027
Bio-Rad 단백질 분석을 이용하여 농축 단백질을 정량화하였다
PBS를 이용하여 샘플을 0.5mg/㎖로 희석시키고, 사용까지 -20C에서 냉동시켰다
상기 프로토콜을 이용하여, 도 3 및 도 23A, 및 도 5 및 도 23B에 나타낸 작제물로 제3 조작된 이형이량체 단백질을 생성한다.
실시예 2- 조작된 이형이량체 단백질의 발현
293T 세포에서의 항-CD33-ULBP1 조작된 이형이량체 단백질의 발현을 다음의 프로토콜을 이용하여 시험하였다. 293T 세포를 모의 형질감염시키거나(플라스미드 없음) 또는 항-CD33-ULBP1 키메라 1 및 2 플라스미드(실시예 1에 기재한 바와 같음)로 형질감염시켰고, 세포 펠릿을 2× SDS 겔 로딩 완충제에서 용해시켰다. 용해물을 SDS-PAGE 겔 상에 로딩시키고, 분리된 단백질을 나일론 막에 옮겼다. 막을 CD33-ULBP1을 검출하기 위해 항-MYC 항체로 프로빙하고, 액틴 단백질(로딩 대조군)을 검출하기 위해 항-베타 액틴으로 프로빙하였다. 1차 항체를 검출하기 위해 형광색소 접합 2차 항체(항-MYC를 검출하기 위해서는 적색; 항-베타 액틴을 검출하기 위해서는 녹색)로 막을 프로빙하였다.
도 12A에 나타낸 바와 같이, 형질감염 세포로부터의 용해물로 로딩된 레인은 이형이량체 단백질을 나타내는 검출 가능한 myc 단백질을 가졌다.
다음의 프로토콜을 이용하여 293T 세포의 상청액에서 항-CD33-ULBP1 조작된 이형이량체 단백질의 발현을 또한 시험하였다. 모의 형질감염(플라스미드 없음) 또는 항-CD33-ULBP1 키메라 1 및 2 플라스미드로 형질감염된 293T 세포의 상청액을 Talon 비드를 이용하는 친화도 정제로 처리하였다. 이어서, 유입, 통과액 및 정제 단백질(Elute)을 SDS-PAGE 겔 상에서 분리시키고, 나일론 막에 전달하였다. 검출을 위해 막을 항-MYC 항체로 프로빙하였다. 1차 항체를 검출하기 위해 형광색소 접합 2차 항체(항-MYC를 검출하기 위해서 적색)로 막을 프로빙하였다. 다시 도 12B에 나타낸 바와 같이, 형질감염 세포로부터의 상청액이 로딩된 레인은 이형이량체 단백질을 나타내는 검출 가능한 myc 단백질을 가졌다.
실시예 1에 열거 및 기재한 바와 같이 키메라로 형질감염된 CHO-K1 세포로부터 TALON 수지로부터의 세포 배양물 상청액 또는 용리액을 2× SDS 로딩 완충제에 첨가하고, 가열하고, SDS Page 겔 상에서 실행하였다. 단백질을 PVDF 막에 옮기고, 항-CD33-6DMPa-힌지-MycHis을 검출하기 위하 항-myc 항체로 프로빙하고, ULBP1-6DMPb-힌지-FLAGHis 또는 항-CD3-6DMPb-힌지-FLAGHis을 검출하기 위해 항-FLAG 항체로 프로빙하였다. 항Myc 및 항FLAG 항체(각각 녹색 및 적색)를 프로빙하기 위해 형광색소-접합 2차 항체를 사용하였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 세포는 이형이량체 단백질을 나타내는 검출 가능한 myc 또는 플래그 단백질을 가졌다.
실시예 3- 결합 실험
다음의 프로토콜을 이용하여 조작된 이형이량체 단백질의 결합을 시험하였다:
50㎕ FACS 완충제 중 50k개의 세포를 재현탁시켰다
50㎕의 조작된 이형이량체 단백질을 첨가하고, 30분 동안 인큐베이션시켰다
세척한다
항-MYC-FITC 또는 항-FLAG-PE 중에서 재현탁시키고, 30분 동안 인큐베이션시켰다.
결과는 정제된 조작된 이형이량체 단백질과 함께 인큐베이션되고, 이어서, 항-FLAG FITC 항체와 함께 인큐베이션된 HL60 세포에서, 작제물 둘 다의 결합이 있었다는 것을 나타냈다(도 14A). HL60 세포를 작제물 및, 이어서, 항-MYC FITC 항체와 함께 인큐베이션시켰을 때, 각 작제물뿐만 아니라 CD33 작제물 단독에 대해 99% 이상의 결합이 보였고, CD33 작제물이 세포 표면 CD33 웰에 결합되고 CD3 또는 ULBP 접합체에 의해 붕괴되지 않았다는 것을 나타낸다(도 14B).
HL60 세포, Jurkat 세포 및 PMBC에 대한 조작된 단백질의 결합에 대해 도 15 내지 도 17에 유사한 결과를 요약한다.
실시예 4- 조작된 이형이량체 단백질의 세포독성 활성
다음의 일반적 프로토콜을 이용하여 조작된 이형이량체 단백질의 NK 및 CD3 시험관내 세포독성 활성을 평가하였다:
1. 냉동시킨 인간 PBMC로부터, REAlease CD3 MicroBead 키트(Miltenyi)를 이용하여 CD3+ 세포독성 T-세포를 선택하였다. 1주 동안 T-세포를 활성화시킨 직후에 Dynabeads 인간 T-활성체 CD3/CD28를 사용한다.
2. 선택 및 활성화 1주 후에, T-세포로부터 Dynabeads를 제거하였다.
3. MOLM14-dTomato-루시퍼라제 세포(AML 세포주) 및 T-세포를 계수하였다(상기 참조). 1:5(10,000개의 MOLM14 세포와 함께 50,000개의 T-세포)의 비로 RPMI(+20% 소태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신)에서 공동 배양시켰다.
4. 각각의 웰에 새로 해동시킨 키메라 단백질을 첨가하였다(예를 들어, 다양한 농도의 항-CD33-항-CD3 조작된 이형이량체)
5. 37℃, 5% CO2에서 밤새 배양시켰다.
6. 플레이트(500rpm, 5분)를 교반시키고, 상청액을 제거하였다.
7. 200㎕ FACS 완충제(1% FBS, 1mM EDTA가 있는 PBS)로 세척하였다
8. 플레이트(500rpm, 5분)를 교반시키고, 상청액을 제거하였다.
9. 100㎕ FACS 완충제에서 재현탁시키고, DAPI를 0.1ug/㎖의 최종 농도로 첨가하였다
10. FACS 분석을 진행하고; 단세포에 대해 개폐하고, 표적 세포를 PE+DAPI+로서 확인하였다(PE 채널에서 MOLM14 AML 세포의 dTomato, DAPI 채널에서 사멸 세포) 도 18A를 참조한다.
11. 기준선으로서 MOLM14 및 T-세포(이량체 없음)가 있는 웰을 고려하여, T-세포+이량체 그룹에서의 PE+ 세포 중 DAPI+ 세포%와 비교하였다. 세포사멸%를 아래의 식에 따라 이량체 처리 없이 공동 인큐베이션시킨 T-세포 및 MOLM14 세포가 있는 대조군에 대해 정규화시켰다:
[(T-세포 및 이량체로부터의 사멸) - (T-세포 단독으로부터의 사멸)] / [ 100 - (T-세포 단독으로부터의 사멸) ] *100
하나의 실험에서, MOLM14-dTomato 세포를 다양한 양의 항-CD33-항-CD3 이형이량체(10ng, 100ng, 1㎍ 및 10㎍)와 5:1 비의 T-세포(효과기)뿐만 아니라 대조군(이형이량체 없음, T 세포 없음)과 함께 인큐베이션시키고, 10㎍의 이형이량체 단독 및 5:1의 T 세포 단독과 함께 24시간 동안 인큐베이션시켰다.
도 18B에 나타낸 바와 같이, 대조군, 이량체 단독 또는 T 세포 단독과 비교할 때 T 세포(효과기 세포)와 함께 이형이량체 용량 모두에 대해 세포독성이 보였고, 항-CD33-항-CD3 이형이량체는 효과기 T-세포에 의한 CD33-발현 표적 세포(MOLM14)의 사멸을 용량 의존적 방식으로 향상시켰다.
상기 프로토콜을 이용하는 추가 실험에서, PBMC로부터 선택된 활성화된 T-세포(CD3+)를 항-CD33-항-CD3 이형이량체의 존재 하에 3가지 농도에서 16시간 동안 CellTrace Violet CD33 발현 HL-60 표적 세포와 함께 공동 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 세포를 7-AAD 생존도 염료로 염색하고, 유세포분석을 이용하여 분석하였다. 도 19A를 참조한다. 세포사멸 백분율(%)을 아래의 식에 따라 이량체 처리 없이 공동 인큐베이션시킨 T-세포 및 HL-60 세포가 있는 대조군에 대해 정규화시켰다:
[(T-세포 및 이량체로부터의 사멸) - (T-세포 단독으로부터의 사멸)] / [ 100 - (T-세포 단독으로부터의 사멸) ] *100
도 19B에 나타낸 바와 같이, 항-CD33-항-CD3 이형이량체는 효과기 T-세포에 의한CD33-발현 표적 세포(HL60)의 사멸을 용량 의존적 방식으로 향상시킨다.
추가적인 세포독성 분석을 다음과 같이 수행하였다: AML 세포(HL-60)를 T-세포 유무와 상관없이 24시간 동안 CD3 또는 CD33의 단량체와 함께 또는 항-CD33-항-CD33 이형이량체와 함께 공동인큐베이션시키고, 기재한 바와 같이 7AAD 및 유세포분석을 이용하여 생/사 염색에 의해 생존도를 측정하였다. 도 20의 결과는 이형이량체가 AML 세포 상에서 효과기 세포(T-세포)의 세포독성 활성을 향상시켰지만, 단량체는 향상시키지 않았다는 것을 나타낸다.
추가적인 용량 의존적 세포독성 분석을 다음과 같이 수행하였다: AML 세포(HL-60)를 T-세포 유무와 상관없이 24시간 동안 표시된 양의 항-CD3-항-CD33 이형이량체(3, 30, 300 또는 30000ng의 이형이량체)와 함께 공동 인큐베이션시켰고, 기재한 바와 같이 7AAD 및 유세포분석을 이용하여 생/사 염색에 의해 생존도를 측정하였다.
AML 세포 상의 이형이량체의 효과기 세포의 세포독성 활성의 용량 의존적 향상이 보였다. 3 내지 3000ng의 항-CD33-항-CD3 이형이량체 단독(T-세포 없음)에 의한 세포독성의 주목할 만한 증가는 없었고, 이는 항-CD33-항-CD3 이형이량체가 단독으로 세포독성을 나타내지 않으며, T-세포 기능의 향상을 통해 세포독성 효과가 매개된다는 것을 시사한다. 도 21를 참조한다.
다른 용량 의존적 세포독성 분석을 다음과 같이 수행하였다: AML 세포(HL-60)를 300ng의 항-CD33-항-CD3 이형이량체와 다양한 비의 T-세포(효과기)(1:1, 2:1, 5:1 및 10:1 효과기 대 표적)와 함께 24시간 동안 인큐베이션시키고, 기재한 바와 같이 7AAD 및 유세포분석을 이용하여 생/사 염색에 의해 생존도를 측정하였다.
300ng의 이형이량체를 이용하여 효과기 대 표적의 5:1 비까지 세포독성의 용량 의존적 증가가 보였다. 효과기 대 표적의 5:1 내지 10:1 비로 세포독성의 주목할 만한 증가는 없었는데, 이는 최대 세포독성에 도달되었기 때문일 가능성이 있다. 도 22를 참조한다
위의 모든 데이터는 이형이량체가 기능적으로 활성이고, AML 세포로 향하는 T-세포의 세포독성 기능을 향상시켰다는 것을 시사한다. 데이터는 또한 이형이량체의 세포독성이 MOLM14 세포와 같은 CD33의 더 높은 발현을 나타내는 세포에서 증가된다는 것을 나타낸다. 도 18B 대 도 19B를 참조한다.
실시예 5- 조작된 이형이량체 단백질의 생체내 항-종양 활성
다음의 프로토콜을 이용하여 마우스에서 항-CD33-항-CD3 조작된 이형이량체 단백질의 생체내 활성을 시험하였다. 모든 마우스는 2×105 MOLM14-dTomato-루시퍼라제 세포(AML 세포주)를 받았고, 이어서, 제2일에, 아래의 스케줄 다음에, 하나의 그룹은 처리를 받지 않았고, 하나의 그룹은 비로딩 T 세포("비로딩 T 세포")를 받았고, 하나의 그룹 T 세포는 항-CD33-항-CD3 조작된 이형이량체 단백질(Bite)("로딩된 T 세포")이 로딩되었다.
제2일: 100㎍r 항-CD33-항-CD3 조작된 이형이량체 단백질 유무와 상관없이 1천만개의 T 세포;
제6일 및 제11일: 200㎍r 항-CD33-항-CD3 조작된 이형이량체 단백질 유무와 상관없이 2천만개의 T 세포
제15일 및 제20일: 400㎍r 항-CD33-항-CD3 조작된 이형이량체 단백질 유무와 상관없이 4천만개의 T 세포.
제7일, 제17일 및 제24일에 FFluc-dtomato 형질도입된 MOLM14의 성장을 모니터링하기 위한 생물발광 영상화(BLI). 도 24A를 참조한다.
하나 이상의 백혈병-관련 증상, 예컨대, 굽은등, 유의한 체중 감소, 주름진 외피 및 사지 마비가 관찰되었을 때, 분석을 위해 마우스를 퇴출시켰다.
도 24B 및 도 24C에 나타낸 바와 같이, 로딩된 T 세포로 처리한 마우스는 제7일 및 제17일에 더 낮은 종양 부담을 가졌다.
추가적으로, 로딩된 T 세포로 처리한 마우스는 2개의 대조군(처리 없음 또는 비로딩 T 세포)보다 더 양호한 생존을 가졌다. 개시일을 MOLM14 주사일로 사용하고 종료일을 각 마우스에 대해 사망일/퇴출일로 사용하여 카플란-마이어 생존 플롯을 생성하였다. 도 24D를 참조한다.
Figure pct00028
Figure pct00029
SEQUENCE LISTING <110> The Trustees of Columbia University in the City of New York <120> Polyfunctional Orthogonal Protein Chimeras <130> WO/2022/006564 <140> PCT/US2021/040538 <141> 2022-01-06 <150> US 63/047,938 <151> 2020-07-03 <150> US 63/050,346 <151> 2020-07-10 <150> US 63/075,388 <151> 2020-09-08 <150> US 63/145,083 <151> 2021-02-03 <150> US 63/189,412 <151> 2021-05-17 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 393 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Protein <400> 1 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Val Phe Phe Ser Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 50 55 60 Ile Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg 65 70 75 80 Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 85 90 95 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr 100 105 110 Tyr Cys His Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu Ile Lys Arg Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser 130 135 140 Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala 145 150 155 160 Glu Val Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser 165 170 175 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro 180 185 190 Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp 195 200 205 Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp 210 215 220 Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu 225 230 235 240 Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe 245 250 255 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Ser 260 265 270 Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 275 280 285 Gly Thr Lys Glu Asp Ile Leu Glu Arg Gln Arg Lys Ile Ile Glu Arg 290 295 300 Ala Gln Glu Ile His Arg Arg Gln Gln Glu Ile Leu Glu Glu Leu Glu 305 310 315 320 Arg Ile Ile Arg Lys Pro Gly Ser Ser Glu Glu Ala Met Lys Arg Met 325 330 335 Leu Lys Leu Leu Glu Glu Ser Leu Arg Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu 340 345 350 Leu Ser Glu Glu Ser Ala Gln Leu Leu Tyr Glu Gln Arg Glu Arg Lys 355 360 365 Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu 370 375 380 Glu Asp Leu His His His His His His 385 390 <210> 2 <211> 333 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Engineered Protein <400> 2 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Trp Val Asp Thr His Cys Leu Cys Tyr Asp Phe Ile 20 25 30 Ile Thr Pro Lys Ser Arg Pro Glu Pro Gln Trp Cys Glu Val Gln Gly 35 40 45 Leu Val Asp Glu Arg Pro Phe Leu His Tyr Asp Cys Val Asn His Lys 50 55 60 Ala Lys Ala Phe Ala Ser Leu Gly Lys Lys Val Asn Val Thr Lys Thr 65 70 75 80 Trp Glu Glu Gln Thr Glu Thr Leu Arg Asp Val Val Asp Phe Leu Lys 85 90 95 Gly Gln Leu Leu Asp Ile Gln Val Glu Asn Leu Ile Pro Ile Glu Pro 100 105 110 Leu Thr Leu 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PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 20 His His His His His His 1 5 <210> 21 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 21 Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 <210> 22 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 22 Ser Gly Ser Gly Ser Gly 1 5 <210> 23 <211> 1188 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 23 gccccatgta cagaatgcag ctgctgagct gtatcgccct gtctctggcc ctggtcacca 60 actctgagat cgtgctgaca cagagccctg gcagcctggc tgtttctcct ggcgagcgag 120 tgaccatgag ctgcaagtct agccagagcg tgttcttcag cagcagccag aagaactacc 180 tggcctggta tcagcagatc cccggacagt ctccccggct gctgatctat tgggccagca 240 caagagaaag cggcgtgccc gatagattca caggctctgg cagcggcacc gacttcaccc 300 tgacaatcag tagcgtgcag cccgaggacc tggccatcta ctactgtcac cagtacctga 360 gcagccggac ctttggccag ggcaccaagc tggaaatcaa gagaggcagc acaagcggca 420 gcggaaagcc tggatctggc gagggctcta caaaaggcca ggttcagctg caacagcctg 480 gcgccgaagt tgtgaaacct ggcgcctctg tgaagatgtc ctgcaaggcc agcggctaca 540 ccttcaccag ctactacatc cactggatca agcagacccc aggccaaggc ctggaatggg 600 tcggagtgat ctaccccggc aacgacgaca tcagctacaa ccagaagttc cagggcaaag 660 ccacactgac cgccgacaag tccagcacca cagcctacat gcagctgtcc agcctgacca 720 gcgaagatag cgccgtgtac tactgcgcca gagaagtgcg gctgcggtac tttgatgtgt 780 ggggccaggg aaccaccgtg accgtttcta gctcatcttc tgctggcggc ggaggaagcg 840 gaggcggagg ttctggtggt ggtggctctg gaacaaaaga ggacatcctg gaacggcaga 900 ggaagatcat cgagcgggcc caagagatcc acagacggca gcaagagatt ctggaagaac 960 tggaacggat catcagaaag cccggcagca gcgaagaggc catgaagaga atgctgaagc 1020 tgctggaaga gagcctgaga ctgctgaaag aactgctgga actgagcgag gaaagcgccc 1080 agctgctgta cgagcagagg gaaagaaagt gctgcgtgga atgccctcct tgtcctgagc 1140 agaagctgat ctccgaagag gacctgcach caccatcacc accactga 1188 <210> 24 <211> 1053 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 24 gccaccatgt acagaatgca gctgctgagc tgtatcgccc tgtctctggc cctggtcacc 60 aatagctggg tcgacaccca ctgcctgtgc tacgacttca tcatcacccc taagagcaga 120 cccgagcctc agtggtgcga agtgcaagga ctggtggacg agaggccctt cctgcactac 180 gattgcgtga accacaaggc caaggccttt gccagcctgg gcaagaaagt gaacgtgacc 240 aagacctggg aagaacagac cgagacactg cgcgacgtgg tggattttct gaagggccag 300 ctgctggaca tccaggtgga aaatctgatc cccatcgagc ccctgacact gcaggccaga 360 atgtcttgtg aacacgaggc ccacggccac ggcagaggat cttggcagtt cctgttcaac 420 ggccagaagt tcctgctgtt cgacagcaac aaccggaagt ggaccgctct gcatcctggc 480 gccaagaaaa tgaccgagaa gtgggagaag aaccgggacg tgaccatgtt cttccagaag 540 atctccctgg gcgactgcaa gatgtggctg gaagagttcc tgatgtactg ggagcagatg 600 ctggacccca ccaagcctcc atctcttgca cctggcggag gcggaggatc tggtggcgga 660 ggaagcggtg gcggcggatc tacagaaaag cggctgctgg aagaagccga gagagcccac 720 agagagcaga aagagatcat caagaaggcc caagagctgc accgcagact ggaagagatt 780 gtgcggcaga gcggcagctc tgaggaagcc aagaaagagg ccaagaagat cctcgaagag 840 atccgcgagc tgagcaagcg gagtctggaa ctgctgagag agatcctgta cctgagccaa 900 gaacagaaag gcagcctggt gcctagaggc ggcggtggaa gtggcggtgg tggatcaggc 960 ggcggaggct ctgagagaaa gtgctgcgtt gagtgccctc cttgtcctga ctacaaggac 1020 gacgacgaca agcaccacca ccatcaccac tga 1053 <210> 25 <211> 1121 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polynucleotide <400> 25 gccaccatgt acagaatgca gctgctgagc tgtatcgccc tgtctctggc cctggtcacc 60 aacagcgata tcaagctgca gcagtctggc gccgaactgg ctagacctgg cgcctctgtg 120 aagatgagct gcaagaccag cggctacacc ttcaccagat acaccatgca ctgggtcaag 180 cagaggccag gccaaggact gggactcgag tggatcggct acatcaaccc csagcagagg 240 ctacaccaac tacaaccaga agttcaagga caaggccaca ctgacctacc gacaagagca 300 gcagcacagc ctacatgcag ctgagcagcc tgaccagcga agatagcgcc gtgtactact 360 gcgcccggta ctacgacgat cactactgcc tggattactg gggccagggc acaaccctga 420 cagtgtcatc tgtggaaggc ggctctggtg gcagcggagg ttctggtgga tctggcggag 480 tggacgacat ccagctgaca cagagccctg ccatcatgtc tgctagccct ggcggcaaag 540 tgaccatgac ctgtagagcc agcagcagcg tgtcctacat gaactggtat cagcagaagt 600 ccggcacaag ccccaagcgg tggatctacg atacaagcaa ggtggccagc ggcgtgccct 660 acagattttc tggctctggc agcggcacca gctactccct gacaatcagc agcatggaag 720 ccgaggatgc cgccacctac tactgccagc agtggtccag caatcccctg acatttggag 780 ccggcaccaa gctggaactg aaaggcggcg gaggaagcgg aggcggagga tccggtggtg 840 gcggatctac agagaagaga ctgctggaag aggccgagag agcccacaga gagcagaaag 900 agatcatcaa gaaggcccaa gagctgcacc gcagactgga agagattgtg cggcagagcg 960 gcagctctga ggaagccaag aaagaggcca agaagatcct cgaagagatc cgcgagctga 1020 gcaagcggag tctggaactg ctgagagaga tcctgtacct gagccaagaa cagaaaggca 1080 gcctggtgcc tcgggactac aaggacgacg acgacaagtg a 1121 <210> 26 <211> 388 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 26 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val 20 25 30 Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 35 40 45 Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr 65 70 75 80 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 85 90 95 Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu 145 150 155 160 Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg 165 170 175 Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn 195 200 205 Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly 210 215 220 Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala 225 230 235 240 Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe 245 250 255 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 260 265 270 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Glu Lys Arg Leu Leu Glu Glu 275 280 285 Ala Glu Arg Ala His Arg Glu Gln Lys Glu Ile Ile Lys Lys Ala Gln 290 295 300 Glu Leu His Arg Arg Leu Glu Glu Ile Val Arg Gln Ser Gly Ser Ser 305 310 315 320 Glu Glu Ala Lys Lys Glu Ala Lys Lys Ile Leu Glu Glu Ile Arg Glu 325 330 335 Leu Ser Lys Arg Ser Leu Glu Leu Leu Arg Glu Ile Leu Tyr Leu Ser 340 345 350 Gln Glu Gln Lys Gly Ser Leu Val Pro Arg Glu Arg Lys Cys Cys Val 355 360 365 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys His His 370 375 380 His His His His 385 <210> 27 <211> 603 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 27 Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu 1 5 10 15 Val Thr Asn Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val 20 25 30 Arg Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr 35 40 45 Phe Asp Asp Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 50 55 60 Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr 65 70 75 80 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys 85 90 95 Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 100 105 110 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 130 135 140 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser Glu 145 150 155 160 Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Arg 165 170 175 Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr 180 185 190 Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys Asn 195 200 205 Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly 210 215 220 Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu Ala 225 230 235 240 Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His Val Val Phe 245 250 255 Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 260 265 270 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Glu Lys Arg Leu Leu Glu Glu 275 280 285 Ala Glu Arg Ala His Arg Glu Gln Lys Glu Ile Ile Lys Lys Ala Gln 290 295 300 Glu Leu His Arg Arg Leu Glu Glu Ile Val Arg Gln Ser Gly Ser Ser 305 310 315 320 Glu Glu Ala Lys Lys Glu Ala Lys Lys Ile Leu Glu Glu Ile Arg Glu 325 330 335 Leu Ser Lys Arg Ser Leu Glu Leu Leu Arg Glu Ile Leu Tyr Leu Ser 340 345 350 Gln Glu Gln Lys Gly Ser Leu Val Pro Arg Glu Arg Lys Cys Cys Val 355 360 365 Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe 370 375 380 Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 385 390 395 400 Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val 405 410 415 Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr 420 425 430 Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val 435 440 445 Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 450 455 460 Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser 465 470 475 480 Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro 485 490 495 Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val 500 505 510 Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly 515 520 525 Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp 530 535 540 Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp 545 550 555 560 Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His 565 570 575 Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Asp Tyr 580 585 590 Lys Asp Asp Asp Lys His His His His His His 595 600 <210> 28 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Trp Asn Gly Gly Ser Thr Gly Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Arg Ser Leu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Arg 115 <210> 29 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 29 Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln 1 5 10 15 Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala 20 25 30 Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr 35 40 45 Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Arg Asp Ser Ser Gly Asn His 85 90 95 Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Gly 100 105 <210> 30 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic polypeptide <400> 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20

Claims (24)

  1. 조작된 이형이량체 단백질로서,
    (a) 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및
    (b) 자연살해(NK) 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드
    를 포함하되,
    상기 제1 및 제2 폴리펩타이드는 상기 공유 이량체화 도메인을 통해 공유결합된, 조작된 이형이량체 단백질.
  2. 제1항에 있어서, NK 세포 상에서 발현되는 상기 분자는 NKG2D이고, NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 상기 폴리펩타이드는 ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA, MICB 또는 이들의 돌연변이체 또는 단편인, 조작된 이형이량체 단백질.
  3. 제2항에 있어서, NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 상기 폴리펩타이드는 ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5, ULBP6, MICA 또는 MICB의 엑토도메인인, 조작된 이형이량체 단백질.
  4. 제1항에 있어서, NK 세포 상에서 발현되는 상기 분자는 CD16이고, T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 상기 폴리펩타이드는 CD16의 단클론성 항체인, 조작된 이형이량체 단백질.
  5. 조작된 이형이량체 단백질로서,
    (a) 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드; 및
    (b) T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드
    를 포함하되,
    상기 제1 및 제2 폴리펩타이드는 상기 공유 이량체화 도메인을 통해 공유결합된, 조작된 이형이량체 단백질.
  6. 제5항에 있어서, T 세포 상에서 발현되는 상기 분자는 CD3이고, T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 상기 폴리펩타이드는 CD3의 단클론성 항체인, 조작된 이형이량체 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 공유 이량체화 도메인 및/또는 상기 제2 공유 이량체화 도메인은 IgG2 힌지 도메인을 포함하는, 조작된 이형이량체 단백질.
  8. 제7항에 있어서, 상기 제1 공유 이량체화 도메인 및/또는 상기 제2 공유 이량체화 도메인은 IgG2 Fc 도메인을 더 포함하는, 조작된 이형이량체 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 및 상기 제2 폴리펩타이드에서 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 상기 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인은 각각 6DMPa 및 6DMPb를 포함하는, 조작된 이형이량체 단백질.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 및 상기 제2 폴리펩타이드에서 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 상기 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인은 각각 6DMPb 및 6DMPa를 포함하는, 조작된 이형이량체 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 계통 특이적 세포-표면 항원은 CD33인, 조작된 이형이량체 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 단일쇄 항체 단편(scFv)인, 조작된 이형이량체 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항의 조작된 이형이량체 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 벡터를 포함하는 조성물.
  14. 제13항의 조성물을 포함하는 키트.
  15. 대상체의 조혈성 악성종양을 치료하는 방법으로서, 유효량의 제13항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 조작된 이형삼량체 단백질로서,
    (a) T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커(a1)에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제1 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드;
    (b) 계통 특이적 세포-표면 항원에 결합하는 항원-결합 단편, 아미노산 링커(b1)에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제2 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드;
    (c) 자연살해(NK) 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 폴리펩타이드, 아미노산 링커(c1)에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인 및 제3 공유 이량체화 도메인을 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및
    (d) 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 나선을 포함하는 3개의 비천연 유래 폴리펩타이드 도메인을 포함하되, 각각의 도메인은 a1, b1 및 c1의 결합 도메인(a2, b2 및 c2), 및 제4, 제5 및 제6 공유 이량체화 도메인인 제4 폴리펩타이드
    를 포함하되,
    상기 제1 및 제2 및 제3 및 제4 폴리펩타이드는 상기 공유 이량체화 도메인을 통해 공유결합된, 조작된 이형삼량체 단백질.
  17. 제16항에 있어서, T 세포 상에서 발현되는 상기 분자는 CD3이고, T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 상기 폴리펩타이드는 CD3의 단클론성 항체이고, 상기 계통 특이적 세포-표면 항원은 CD33이고, NK 세포 상에서 발현되는 상기 분자는 NKG2D인, 조작된 이형이량체 단백질.
  18. 제16항에 있어서, T 세포 상에서 발현되는 상기 분자는 CD3이고, T 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 상기 폴리펩타이드는 CD3의 단클론성 항체이고, 상기 계통 특이적 세포-표면 항원은 CD33이고, NK 세포 상에서 발현되는 상기 분자는 CD16이며, NK 세포 상에서 발현되는 분자에 결합하는 상기 폴리펩타이드는 CD16의 단클론성 항체인, 조작된 이형이량체 단백질.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 이량체화 도메인 및/또는 상기 제2 이량체화 도메인 및/또는 상기 제3 이량체화 도메인 및/또는 상기 제4 이량체화 도메인 및/또는 상기 제5 이량체화 도메인 및/또는 상기 제6 이량체화 도메인은 IgG2 힌지 도메인을 포함하는, 조작된 이형삼량체 단백질.
  20. 제19항에 있어서, 상기 제1 이량체화 도메인 및/또는 상기 제2 이량체화 도메인 및/또는 상기 제3 이량체화 도메인 및/또는 상기 제4 이량체화 도메인 및/또는 상기 제5 이량체화 도메인 및/또는 상기 제6 이량체화 도메인은 IgG2 Fc 도메인을 더 포함하는, 조작된 이형삼량체 단백질.
  21. 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 폴리펩타이드 및 상기 제2 폴리펩타이드 및 상기 제3 폴리펩타이드 및 상기 제4 폴리펩타이드에서 아미노산 링커에 의해 연결된 1 내지 5개의 알파 나선을 포함하는 상기 비-천연 유래 폴리펩타이드 도메인은 각각 6DMPa 및 6DMPb로 이루어진 군으로부터 선택된, 조작된 이형삼량체 단백질.
  22. 제16항 내지 제21항의 조작된 이형삼량체 단백질을 암호화하는 적어도 하나의 벡터를 포함하는, 조성물.
  23. 제22항의 조성물을 포함하는, 키트.
  24. 대상체의 조혈성 악성종양을 치료하는 방법으로서,
    유효량의 제22항의 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 조혈성 악성종양을 치료하는 방법.
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