BR112020014140A2 - inibidores de dna-pk - Google Patents

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BR112020014140A2
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BR
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alkyl
dna
cell
cells
fact
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BR112020014140-2A
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Marc Saul Weinberg
Diego Sebastian D'ASTOLFO
Sudipta Mahajan
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Vertex Pharmaceuticals Incorporated
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Abstract

A presente invenção refere-se a compostos úteis como inibidores de DNA-PK. A invenção também fornece composições farmaceuticamente aceitáveis compreendendo os referidos compostos e métodos de uso das composições no tratamento de várias doenças, condições ou distúrbios.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INIBIDORES DE DNA-PK".
PEDIDOS RELACIONADOS
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. Nº. US 62/618.598, depositado em 17 de janeiro de 2018, que é incorporado por referência neste documento na sua totalidade.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é pelo presente incorporada para referência na sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 15 de janeiro de 2019, tem o nome 14390-686 Sequence Listing_ST25.txt e tem 8 KB de tamanho.
CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO
[003] A presente invenção refere-se a compostos úteis como inibidores da proteína quinase dependente de DNA (DNA-PK). A invenção também fornece composições farmaceuticamente aceitáveis compreendendo os compostos da invenção e métodos de uso das composições no tratamento de câncer e para aumentar a eficiência da edição do genoma, administrando um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma a uma célula.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[004] A radiação ionizante (IR) induz uma variedade de danos no DNA, dos quais as quebras de filamento duplo (DSBs) são as mais citotóxicas. Essas DSBs podem levar à morte celular por apoptose e/ou catástrofe mitótica se não forem rápida e completamente reparadas. Além da IR, certos agentes quimioterapêuticos, incluindo inibidores da topoisomerase II, bleomicina e doxorrubicina, também causam DSBs. Essas lesões de DNA desencadeiam um conjunto complexo de sinais através da rede de resposta a danos no DNA que funcionam para reparar o DNA danificado e manter a viabilidade celular e a estabilidade genômica. Nas células de mamíferos, a via de reparo predominante para as DSBs é a Via de Junção de Extremidade Não Homóloga (NHEJ). Essa via funciona independentemente da fase do ciclo celular e não requer um modelo para religar as extremidades quebradas do DNA. A NHEJ requer coordenação de muitas proteínas e vias de sinalização. O mecanismo principal da NHEJ consiste no heterodímero Ku70/80 e na subunidade catalítica da proteína quinase dependente de DNA (DNA-PKcs ou DNA-PK), que juntos compõem o complexo enzimático DNA-PK ativo. As DNA-PKcs é um membro da família de fosfatidilinositol 3-quinase relacionada à quinase (PIKK) da proteína quinase serina/treonina que também inclui ataxia telangiectasia mutada (ATM), ataxia telangiectasia e Rad3-relacionada (ATR), mTOR e quatro isoformas PI3K. No entanto, enquanto as DNA-PKcs estão na mesma família de proteína quinase que a ATM e a ATR, essas últimas quinases funcionam para reparar os danos no DNA pela via da recombinação homóloga (HR) e estão restritas às fases S e G2 do ciclo celular. Enquanto a ATM também é recrutada para sítios de DSBs, a ATR é recrutada para sítios de quebras de DNA de filamento simples.
[005] Pensa-se que a NHEJ proceda através de três etapas principais: reconhecimento das DSBs, processamento de DNA para remover extremidades não ligáveis ou outras formas de dano nos terminais e finalmente a ligação das extremidades do DNA. O reconhecimento da DSB é realizado pela ligação do heterodímero Ku às extremidades irregulares do DNA, seguido pelo recrutamento de duas moléculas de DNA-PKcs aos lados adjacentes da DSB; isso serve para proteger os terminais quebrados até que enzimas de processamento adicionais sejam recrutadas. Dados recentes apoiam a hipótese de que as DNA-PKcs fosforila a enzima de processamento Artemis e também a si mesma para preparar as extremidades do DNA para processamento adicional. Em alguns casos, a DNA polimerase pode ser necessária para sintetizar novas extremidades antes da etapa de ligação. Acredita-se que a autofosforilação das DNA-PKcs induza uma mudança conformacional que abre a cavidade central de ligação ao DNA, libera DNA-PKcs do DNA e facilita a religação final das extremidades do DNA.
[006] Já se sabe há algum tempo que os camundongos DNA-PK-/- são hipersensíveis aos efeitos da IR e que alguns inibidores não seletivos de moléculas pequenas de DNA-PKcs podem radiossensibilizar uma variedade de tipos de células tumorais em um amplo conjunto de origens genéticas. Embora seja esperado que a inibição da DNA-PK sensibilize radialmente as células normais até certo ponto, isso foi observado em menor grau do que nas células tumorais, provavelmente devido ao fato de que as células tumorais têm níveis basais mais altos de estresse de replicação endógena e danos ao DNA (estresse de replicação induzido por oncogene) e mecanismos de reparo do DNA são menos eficientes nas células tumorais. Mais importante ainda, uma janela terapêutica aprimorada com maior economia de tecido normal será concedida a partir da combinação de um inibidor de DNA-PK com avanços recentes na entrega de precisão da IR focalizada, incluindo RT-guia de imagem (IGRT) e RT com intensidade modulada (IMRT)
[007] A inibição da atividade de DNA-PK induz efeitos nas células cicláveis e não cicláveis. Isso é altamente significativo, pois a maioria das células de um tumor sólido não está se replicando ativamente em nenhum momento, o que limita a eficácia de muitos agentes direcionados ao ciclo celular. Igualmente intrigantes são os relatórios recentes que sugerem uma forte conexão entre a inibição da via NHEJ e a capacidade de matar células tronco de câncer tradicionalmente radiorresistente (CSCs). Foi demonstrado em algumas células tumorais que as DSBs nas CSCs dormentes ativam predominantemente o reparo do DNA pela via NHEJ; acredita-se que as CSCs estejam geralmente na fase quiescente do ciclo celular. Isso pode explicar por que metade dos pacientes com câncer pode apresentar recidiva local ou distante do tumor, apesar do tratamento, pois as estratégias atuais não são capazes de atingir efetivamente as CSCs. Um inibidor de DNA-PK pode ter a capacidade de sensibilizar essas células progenitoras metastáticas potenciais aos efeitos da IR e selecionar agentes quimioterapêuticos indutores de DSB.
[008] Dado o envolvimento da DNA-PK nos processos de reparo do DNA, uma aplicação de drogas inibidoras específicas de DNA-PK iria atuar tais como agentes que aumentariam a eficácia da quimioterapia e radioterapia do câncer. Por conseguinte, seria desejável desenvolver compostos úteis tais como inibidores de DNA-PK.
[009] Além disso, são necessárias tecnologias precisas de direcionamento de genoma para permitir a engenharia sistemática de variações genéticas. O uso de sistemas de edição de genoma, especificamente a tecnologia de edição de genoma baseada em endonucleases com Repetições Palindrômicas Regulares Curtas Intercaladas Regulares em Cluster (CRISPR), cresceu exponencialmente nos últimos anos. O sistema imunológico inato bacteriano CRISPR-Cas9 do tipo II emergiu tal como uma ferramenta eficaz de edição de genoma para modificação direcionada do genoma humano (Wiedenheft, B. 2012; Hsu, P.D. eta. 2014). Recentemente, os sistemas de edição do genoma de CRISPR-Cpf foram descritos. A edição do genoma baseado na endonuclease CRISPR depende, em parte, das vias de junção não homóloga (NHEJ) e de reparo direcionado à homologia (HDR) para reparar as quebras de filamento duplo do DNA. Mecanismo de reparo celular favorece NHEJ sobre HDR.
[0010] Embora a obtenção de inserções ou exclusões (indels) da NHEJ seja de até 70% eficaz em alguns relatórios, a eficiência de HDR permanece desafiadora, com taxas inferiores a 1%.
[0011] Por conseguinte, existe uma necessidade de aumentar a eficiência da edição de genoma, em particular a eficiência de HDR. Outra aplicação de drogas inibidoras específicas de DNA-PK seria atuar tais como agentes que aumentariam a eficácia dos sistemas de edição de genoma.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0012] Verificou-se que os compostos desta invenção e suas composições farmaceuticamente aceitáveis são eficazes tais como inibidores de DNA-PK. Por conseguinte, a invenção apresenta compostos com a fórmula geral: I, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, em que cada um de R1, R2, X, Anel A, Anel B e Anel C é tais como definido em outra parte aqui.
[0013] A invenção também fornece composições farmacêuticas que incluem um composto de fórmula I e um transportador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável. Estes compostos e composições farmacêuticas são úteis para tratar ou diminuir a gravidade do câncer.
[0014] Os compostos e composições fornecidos por esta invenção também são úteis para o estudo de DNA-PK em fenômenos biológicos e patológicos; o estudo das vias de transdução de sinal intracelular mediadas por essas quinases; e a avaliação comparativa de novos inibidores de quinase.
[0015] A presente invenção também pode melhorar a eficiência de HDR suprimindo enzimas NHEJ, tal como DNA-PK, usando inibidores de DNA-PK.
[0016] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para editar uma ou mais regiões genômicas alvo, o método inclui administrar as uma ou mais células que têm uma ou mais regiões genômicas alvo, um sistema de edição de genoma e um composto representado pela fórmula I: I ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que cada um de R1, R2, X, Anel A, Anel B e Anel C independentemente é tais como definido em outra parte aqui.
[0017] Em algumas modalidades, a descrição também fornece um método para reparar uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas alvo por meio de uma via de reparo direcionado por homologia (HDR), o método inclui administrar as uma ou mais células que têm um ou mais regiões genôminas alvo, um sistema de edição de genoma e um composto representado pela fórmula I ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[0018] O sistema de edição de genoma interage com um ácido nucleico das regiões genômicas alvo, resultando em uma quebra de DNA e em que a quebra de DNA é reparada pelo menos em parte através de uma via HDR.
[0019] Em algumas modalidades, a descrição também fornece um método para inibir ou suprimir o reparo de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas alvo através de uma via NHEJ, o método inclui administrar as uma ou mais células que têm uma ou mais regiões genômicas alvo, um sistema de edição de genoma e um composto representado pela fórmula I ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[0020] O sistema de edição de genoma interage com um ácido nucleico de uma ou mais regiões genômicas alvo, resultando em uma quebra de DNA e em que o reparo da quebra de DNA através de uma via NHEJ é inibido ou suprimido.
[0021] Em algumas modalidades, a descrição também fornece um método para modificar a expressão de um ou mais genes ou proteínas, o método inclui administrar às uma ou mais células que compreendem uma ou mais regiões genômicas alvo, um sistema de edição de genoma e um composto representado pela fórmula I ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[0022] O sistema de edição de genoma interage com um ácido (s) nucleico da uma ou mais regiões genômicas alvo de um ou mais gene (s) alvo, resultando na edição de uma ou mais regiões genômicas alvo e em que a edição modifica a expressão de um gene (s) e/ou proteína (s) a jusante associada ao gene (s) alvo.
[0023] Em algumas modalidades, é fornecido um kit ou composição para editar uma ou mais regiões genômicas alvo. Em algumas modalidades, o kit ou composição inclui um sistema de edição de genoma; e um composto representado pela fórmula I ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[0024] Outras características, objetos e vantagens da invenção são evidentes na descrição detalhada a seguir. Deve ser entendido, no entanto, que a descrição detalhada, embora indique modalidades e aspectos da invenção, é dada apenas a título ilustrativo, e não limitativ o. Várias alterações e modificações dentro do escopo da invenção serão evidentes para os especialistas na técnica a partir da descrição detalhada.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0025] A Figura 1 representa o projeto dos ensaios de edição de gene.
[0026] A Figura 2 é um gráfico que mostra as taxas de edição de gene em BECs tratadas com um inibidor de DNA-PK.
[0027] As Figuras 3A e 3B são gráficos que mostram as taxas de edição de gene após o tratamento com inibidor de DNA-PK em células CD34+ de dois doadores diferentes.
[0028] A Figura 4 é um gráfico que mostra as taxas de edição de gene em iPSCs tratadas com um inibidor de DNA-PK.
[0029] A Figura 5 é um gráfico que mostra a cinética de edição de gene em BECs no ECmax do inibidor de DNA-PK.
[0030] A Figura 6 é um gráfico que mostra a cinética de edição de gene em BECs no EC50 do inibidor de DNA-PK.
[0031] A Figura 7 é um gráfico de barras mostrando taxas de HDR para componentes de edição de gene entregues por transfecção mediada por lipídios em BECs.
[0032] A Figura 8 é um gráfico que mostra as taxas de edição de gene em CD34+ tratadas com um inibidor de DNA-PK.
[0033] A Figura 9 é um gráfico que mostra as taxas de edição de gene em CD34+ tratadas com um inibidor de DNA-PK.
[0034] A Figura 10 é um gráfico que mostra as taxas de edição de gene em CD34+ tratadas com um inibidor de DNA-PK.
[0035] A Figura 11 representa o projeto de uma estratégia de edição de gene para executar o Reparo Orientado por Homologia (HDR) usando CRISPR-Cas9 usando doadores de AAV.
[0036] A Figura 12 é um gráfico que mostra a edição precisa do gene por HDR mediada por doadores de AAV, CRISPR-Cas9 e um inibidor seletivo de DNA-PK.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições e Terminologia Geral
[0037] Conforme usado neste documento, as seguintes definições serão aplicadas, salvo indicação em contrário. Para os fins desta invenção, os elementos químicos são identificados de acordo com a Tabela Periódica dos Elementos, versão CAS, e o Handbook of Chemistry and Physics, 75ª Ed. 1994. Além disso, os princípios gerais da química orgânica são descritos em "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito: 1999, e "March's Advanced Organic Chemistry", 5a Ed., Smith, M.B. e March, J., eds. John Wiley & Sons, Nova Iorque: 2001, cujo conteúdo total é aqui incorporado por referência. Geralmente, as nomenclaturas utilizadas em conexão com as técnicas de cultura de células e tecidos, biologia molecular e química e hibridização de proteínas e oligo- ou polinucleotídeos aqui descritas são aquelas bem conhecidas e comumente usadas na técnica. Técnicas padrão são usadas para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos e cultura e transformação de tecidos (por exemplo, eletroporação, lipofecção). As reações enzimáticas e as técnicas de purificação são realizadas de acordo com as especificações do fabricante, ou tais como comumente realizadas na técnica, ou tais como aqui descritas. As técnicas e procedimentos anteriores são geralmente realizados de acordo com métodos convencionais bem conhecidos na área e conforme descrito em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e discutidas ao longo desta descrição. Vide, por exemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).
[0038] Como aqui descrito, os compostos da invenção podem opcionalmente ser substituídos por um ou mais substituintes, tais como são geralmente ilustrados acima, ou tais como exemplificados por classes, subclasses e espécies particulares da invenção. Será apreciado que a frase "opcionalmente substituído" é usada de forma intercambiável com a frase "substituído ou não substituído". Em geral, o termo "substituído", precedido pelo termo "opcionalmente" ou não, refere-se à substituição de um ou mais radicais de hidrogênio em uma determinada estrutura pelo radical de um substituinte especificado. Salvo indicação em contrário, um grupo opcionalmente substituído pode ter um substituinte em cada posição substituível do grupo. Quando mais de uma posição em uma dada estrutura pode ser substituída por mais de um substituinte selecionado a partir de um grupo especificado, o substituinte pode ser o mesmo ou diferente em cada posição.
[0039] Como aqui descrito, quando o termo "opcionalmente substituído" precede uma lista, o referido termo refere-se a todos os grupos substituíveis subsequentes nessa lista. Por exemplo, se X é halogênio; C1-3 alquil ou fenil opcionalmente substituído; X pode ser alquil opcionalmente substituído ou fenil opcionalmente substituído. Da mesma forma, se o termo "opcionalmente substituído" seguir uma lista, o referido termo também se refere a todos os grupos substituíveis na lista anterior, a menos que indicado de outra forma. Por exemplo: se X é halogênio, C1-3 alquil ou fenila, em que X é opcionalmente substituído por JX, então C1-3 alquil e fenil podem ser opcionalmente substituídos por JX, tal como é evidente para um versado na técnica, grupos tais como H, halogênio, NO2, CN, NH2, OH ou OCF3 não seriam incluídos porque não são grupos substituíveis. Tais como também é aparente para um especialista, um anel heteroaril ou heterocíclico contendo um grupo NH pode ser opcionalmente substituído substituindo o átomo de hidrogênio pelo substituinte. Se um radical ou estrutura substituinte não for identificado ou definido tais como "opcionalmente substituído", o radical ou estrutura substituinte não será substituído.
[0040] As combinações de substituintes previstos por esta invenção são preferivelmente aquelas que resultam na formação de compostos estáveis ou quimicamente viáveis. O termo "estável", conforme usado aqui, refere-se a compostos que não são substancialmente alterados quando submetidos a condições para permitir sua produção, detecção e, preferivelmente, sua recuperação, purificação e uso para um ou mais dos objetivos aqui descritos. Em algumas modalidades, um composto estável ou composto quimicamente viável é aquele que não é substancialmente alterado quando mantido a uma temperatura de 40°C ou menos, na ausência de umidade ou outras condições quimicamente reativas, por pelo menos uma semana.
[0041] O termo "alquila" ou "grupo alquila", tal como aqui utilizado, significa uma cadeia hidrocarboneto de cadeia linear (isto é, não ramificada) ou ramificada, substituída ou não substituída que é completamente saturada. Salvo indicação em contrário, os grupos alquila contêm 1-8 átomos de carbono. Em algumas modalidades, os grupos alquila contêm 1-6 átomos de carbono e, em outras modalidades, os grupos alquila contêm 1-4 átomos de carbono (representados tais como "C1-4 alquil"). Em outras modalidades, os grupos alquil são caracterizados tais como "C0-4 alquila", representando uma ligação covalente ou uma cadeia C1-4 alquila. Exemplos de grupos alquil incluem metila, etila, propila, butila, isopropila, isobutila, sec-butil e terc-butila. O termo "alquileno", como usado aqui, representa um grupo hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificada divalente saturada e é exemplificado por metileno, etileno, isopropileno e similares. O termo "alquilideno", como usado aqui, representa um grupo de ligação alquila de cadeia linear divalente. O termo "alquenila", como usado aqui, representa um grupo hidrocarboneto monovalentes de cadeia linear ou ramificada contendo uma ou mais ligações duplas carbono-carbono. O termo "alquinila", como usado aqui, representa um grupo hidrocarboneto monovalente de cadeia linear ou ramificada contendo uma ou mais ligações triplas carbono-carbono.
[0042] O termo "cicloalquila" (ou "carbociclo") refere-se a um hidrocarboneto C3-C8 monocíclico ou hidrocarboneto C8-C12 bicíclico que é completamente saturado e tem um único ponto de ligação ao resto da molécula e em que qualquer anel individual no referido sistema de anel bicíclico tem 3-7 membros. Grupos cicloalquila adequados incluem, mas não estão limitados a, ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila, ciclo- hexila e ciclo-heptila.
[0043] O termo "heterociclo", "heterociclila", "heterocicloalquila" ou
"heterocíclico", conforme aqui utilizado, refere-se a um sistema de anéis monocíclicos, bicíclicos ou tricíclicos no qual pelo menos um anel no sistema contém um ou mais heteroátomos, que é igual ou diferente e que é completamente saturado ou que contém uma ou mais unidades de insaturação, mas que não é aromático e que tem um único ponto de ligação ao restante da molécula. Em algumas modalidades, o grupo "heterociclo", "heterociclila", "heterocicloalquil" ou "heterocíclico" tem três a catorze membros no anel, nos quais um ou mais membros no anel é um heteroátomo selecionado independentemente a partir de oxigênio, enxofre, nitrogênio ou fósforo, e cada anel no sistema contém 3 a 8 membros.
[0044] Exemplos de anéis heterocíclicos incluem, entre outros, os seguintes monociclos: 2-tetra-hidrofuranila, 3-tetra-hidrofuranila, 2-tetra-hidrotiofenila, 3-tetra-hidrotiofenila, 2-morfolino, 3-morfolino, 4-morfolino, 2-tiomorfolino, 3-tiomorfolino, 4-tiomorfolino, 1-pirrolidinila, 2-pirrolidinila, 3-pirrolidinila, 1-tetra-hidropiperazinila, 2-tetra- hidropiperazinila, 3-tetra-hidropiperazinila, 1-piperidinila, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 1-pirazolinila, 3-pirazolinila, 4-pirazolinila, 5-pirazolinila, 1- piperidinila, 2-piperidinila, 3-piperidinila, 4-piperidinila, 2-tiazolidinila, 3- tiazolidinila, 4-tiazolidinila, 1-imidazolidinila, 2-imidazolidinila, 4-imidazolidinila, 5-imidazolidinila; e os seguintes biciclos: 3-1H- benzimidazol-2-ona, 3-(1-alquil)-benzimidazol-2-ona, indolinila, tetra- hidroquinolinila, tetra-hidroisoquinolinila, benzotiolano, benzoditiano, e 1,3-di-hidro-imidazol-2-ona.
[0045] O termo "heteroátomo" significa um ou mais de oxigênio, enxofre, nitrogênio ou fósforo, incluindo qualquer forma oxidada de nitrogênio, enxofre ou fósforo; a forma quaternizada de qualquer nitrogênio básico; ou um nitrogênio substituível de um anel heterocíclico, por exemplo, N (como em 3,4-di-hidro-2H-pirrolil), NH (como em pirrolidinil) ou NR+ (como em pirrolidinil N-substituído).
[0046] O termo "insaturado", como usado aqui, significa que uma porção tem uma ou mais unidades de insaturação.
[0047] O termo "alcóxi" ou "tioalquila", conforme usado aqui, refere- se a um grupo alquila, conforme definido anteriormente, ligado à cadeia de carbono principal através de um átomo de oxigênio ("alcóxi") ou enxofre ("tioalquila").
[0048] Os termos "haloalquil", "haloalquenila" e "haloalcóxi" significam alquila, alquenila ou alcóxi, conforme o caso, substituídos por um ou mais átomos de halogênio. O termo "halogênio" significa F, Cl, Br ou I.
[0049] O termo "arila" usado sozinho ou tais como parte de uma porção maior tais como em "aralquila", "aralcóxi" ou "ariloxialquila" refere-se a um sistema de anel carbocíclico monocíclico, bicíclico ou tricíclico com um total de seis a catorze membros do anel, em que o referido sistema de anel tem um único ponto de ligação ao resto da molécula, pelo menos um anel no sistema é aromático e em que cada anel no sistema contém 4 a 7 membros do anel. O termo "arila" pode ser usado de forma intercambiável com o termo "anel arila". Exemplos de anéis arila incluem fenila, naftila e antraceno.
[0050] O termo "heteroarila", usado sozinho ou tais como parte de uma porção maior tais como em "heteroaralquila" ou "heteroarilalcóxi", refere-se a um sistema de anel monocíclico, bicíclico e tricíclico com um total de cinco a catorze membros no anel, em que o referido sistema de anéis tem um único ponto de ligação ao resto da molécula, pelo menos um anel no sistema é aromático, pelo menos um anel no sistema contém um ou mais heteroátomos independentemente selecionados a partir de nitrogênio, oxigênio, enxofre ou fósforo, e em que cada anel no sistema contém 4 a 7 membros do anel. O termo "heteroarila" pode ser usado de forma intercambiável com o termo "anel heteroarila" ou o termo "heteroaromático".
[0051] Outros exemplos de anéis heteroarila incluem os seguintes monociclos: 2-furanila, 3-furanila, N-imidazolila, 2-imidazolila, 4-imidazolila, 5-imidazolila, 3-isoxazolila, 4-isoxazolila, 5-isoxazolila, 2- oxazolila, 4-oxazolila, 5-oxazolila, N-pirrolila, 2-pirrolila, 3-pirrolila, 2-piridila, 3-piridila, 4-piridila, 2-pirimidinila, 4-pirimidinila, 5-pirimidinila, piridazinila (por exemplo, 3-piridazinil), 2-tiazolila, 4-tiazolila, 5-tiazolila, tetrazolil (por exemplo, 5-tetrazolil), triazolila (por exemplo, 2-triazolila e 5-triazolil), 2-thienila, 3-tienila, pirazolila (por exemplo, 2-pirazolil), isotiazolila, 1,2,3-oxadiazolila, 1,2,5-oxadiazolila, 1,2,4-oxadiazolila, 1,2,3-triazolila, 1,2,3-tiadiazolila, 1,3,4-tiadiazolila, 1,2,5-tiadiazolila, pirazinila, 1,3,5-triazinila, e os seguintes biciclos: benzimidazolila, benzofurila, benzotiofenila, indolila (por exemplo, 2-indolil), purinila, quinolinila (por exemplo, 2-quinolinila, 3-quinolinila, 4-quinolinil), e isoquinolinila (por exemplo, 1-isoquinolinila, 3-isoquinolinila, ou 4- isoquinolinil).
[0052] Como descrito aqui, uma ligação desenhada a partir de um substituinte para o centro de um anel dentro de um sistema de anéis múltiplos (como mostrado abaixo) representa a substituição do substituinte em qualquer posição substituível em qualquer um dos anéis dentro do sistema de anéis múltiplos. Por exemplo, a Estrutura a representa uma possível substituição em qualquer uma das posições mostradas na Estrutura b.
X X X X N X N X H
X X Estrutura a Estrutura b
[0053] Isso também se aplica a vários sistemas de anéis fundidos a sistemas de anéis opcionais (que seriam representados por linhas pontilhadas). Por exemplo, na Estrutura c, X é um substituinte opcional tanto para o anel A quanto para o anel B.
A B X Estrutura c
[0054] Se, no entanto, dois anéis em um sistema de anéis múltiplos, cada um com diferentes substituintes desenhados do centro de cada anel, então, a menos que especificado de outra forma, cada substituinte representa apenas a substituição no anel ao qual está ligado. Por exemplo, na Estrutura d, Y é opcionalmente um substituinte apenas para o anel A e X é um substituinte opcional apenas para o anel B.
Y
A B X Estrutura d
[0055] O termo "grupo protetor", como usado aqui, representa aqueles grupos destinados a proteger um grupo funcional, tais como, por exemplo, álcool, amina, carboxila, carbonila, etc., contra reações indesejáveis durante procedimentos sintéticos. Grupos de proteção comumente usados são descritos em Greene e Wuts, Protective Groups In Organic Synthesis, 3a Edition (John Wiley & Sons, New York, 1999), que é incorporado aqui por referência. Exemplos de grupos protetores de nitrogênio incluem grupos acila, aroila, ou grupos carbamila tais como formila, acetila, propionila, pivaloila, t-butilacetila, 2-cloroacetila, 2-bromoacetila, trifluoroacetila, tricloroacetila, phthalila, o- nitrofenoxiacetila, -clorobutirila, benzoila, 4-clorobenzoila, 4- bromobenzoila, 4-nitrobenzoila e chiral auxiliaries tais como protetores ou não protetores D, L ou D, L-aminoácidos tais como alanine, leucine, fenilalanine e os similares; grupos sulfonila tais como benzenossulfonila, p-toluenesulfonila e os similares; grupos carbamato tais como benziloxicarbonila, p-clorobenziloxicarbonila, p- metoxibenziloxicarbonila, p-nitrobenziloxicarbonila, 2-
nitrobenziloxicarbonila, p-bromobenziloxicarbonila, 3,4- dimetoxibenziloxicarbonila, 3,5-dimetoxibenziloxicarbonila, 2,4- dimetoxibenziloxicarbonila, 4-metoxibenziloxicarbonila, 2-nitro-4,5- dimetoxibenziloxicarbonila, 3,4,5-trimetoxibenziloxicarbonila, 1-(p- bifenilil)-1-metiletoxicarbonila, ,-dimetil-3,5- dimetoxibenziloxicarbonila, benz-hidriloxicarbonila, t-butiloxicarbonila, di-isopropilmetoxicarbonila, isopropiloxicarbonila, etoxicarbonila, metoxicarbonila, alliloxicarbonila, 2,2,2,-tricloroetoxicarbonila, fenoxicarbonila, 4-nitrofenóxi carbonila, fluorenil-9-metoxicarbonila, clicopentiloxicarbonila, adamantiloxicarbonila, clico-hexiloxicarbonila, feniltiocarbonila e os similares, grupos arilalquil tais como benzila, trifenilmetila, benziloximetila e os similares e grupos silila tais como trimetilsilila e os similares. Grupos N-protetores preferidos são formila, acetila, benzoila, pivaloila, t-butilacetila, alanila, fenilsulfonila, benzila, t- butiloxicarbonil (Boc) e benziloxicarbonila (Cbz). Examplos de grupos protetores hidroxila incluem éteres, tais como tetra-hidropiranila, tert butila, benzila, alila e os similares; silila éteres tais como trimetila silila, trietila silila, triisopropilsilila, terc-butila difenila silila e os similares; éteres tais como acetila, trifluoroacetila e os similares; e carbonatos. Grupos protetores hidroxila também incluem aqueles apropriados para a proteção de fenóis.
[0056] A menos que seja descrito ou declarado de outra forma, as estruturas recitadas neste documento devem incluir todas as formas isoméricas (por exemplo, enantioméricas, diastereoméricas e geométricas (ou conformacionais)) da estrutura; por exemplo, as configurações R e S para cada centro assimétrico, (Z) e (E) isômeros de ligação dupla, e (Z) e (E) isômeros conformacionais. Portanto, isômeros estereoquímicos únicos, bem como misturas enantioméricas, diastereoméricas e geométricas (ou conformacionais) dos presentes compostos estão dentro do escopo da invenção. Os compostos que foram desenhados com centros estereoquímicos definidos, geralmente através do uso de uma ligação tracejada ( ) ou em negrito ( ), são estereoquimicamente puros, mas com a estereoquímica absoluta ainda indefinida. Tais compostos podem ter a configuração R ou S. Nos casos em que a configuração absoluta foi determinada, o centro (s) quiral é rotulado (R) ou (S) no desenho.
[0057] Salvo indicação em contrário, todas as formas tautoméricas dos compostos da invenção estão dentro do escopo da invenção. Além disso, salvo indicação em contrário, as estruturas aqui representadas também devem incluir compostos que diferem apenas na presença de um ou mais átomos isotopicamente enriquecidos. Por exemplo, compostos com as presentes estruturas, exceto a substituição de hidrogênio por deutério ou trítio, ou a substituição de um carbono por 13 14 um carbono enriquecido em C ou C estão dentro do escopo desta invenção. Tais compostos são úteis, por exemplo, tais como ferramentas analíticas, sondas em ensaios biológicos ou tais como inibidores de DNA-PK com um perfil terapêutico melhorado. Descrição dos Compostos
[0058] Em um aspecto, a invenção apresenta compostos tendo a fórmula (III-E-1) ou (III-E-2), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, (III-E-1) ou (III-E-2)
[0059] X é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila.
[0060] Y é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila.
[0061] R3 é hidrogênio, C1-4 alquila ou OC1-2 alquila.
[0062] R1 é um anel heteroaromático de 6 membros contendo um ou dois átomos de nitrogênio em que o anel heteroaromático pode ser substituído por 0, 1, 2 ou 3 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em halo, CN, C1-C4 alquila, C1-C4-haloalquila, C3-C4-cicloalquila, OR6, C(=O)OR6, C(=O)NR7R6 e NR4R5.
[0063] Cada C1-C4-alquila e C1-C4-haloalquila é substituído por 0, 1 ou 2 grupos OR6.
[0064] Cada R6 e R7 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C1- C4-haloalquila.
[0065] Cada R4 e R5 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C(=O)C1-C4 alquila.
[0066] R4 e R5, juntos com o átomo de N ao qual estão ligados, formam um anel heterocíclico compreendendo 0 ou 1 átomo de O ou N adicional, em que o referido anel heterocíclico pode ser substituído por C1-C4 alquila ou OR6.
[0067] O anel B é selecionado a partir do grupo que consiste em: , e ; em que W é N ou CR7; e Z é O ou S; em que R7 é H ou C1- C4 alquila.
[0068] Em outro aspecto, R1 é um anel heteroaromático de 6 membros contendo um ou dois átomos de nitrogênio em que o anel heteroaromático pode ser substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1- C4-alquila, C1-C4-haloalquila, C(=O)NHR6 e NR4R5.
[0069] R6 é C1-C4 alquila.
[0070] Cada R4 e R5 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C(=O)C1-C4 alquila.
[0071] R4 e R5, juntos com o átomo de N ao qual estão ligados, formam um anel heterocíclico compreendendo 0 ou 1 átomo de N adicional, em que o referido anel heterocíclico pode ser substituído por C1-C4 alquila.
[0072] O anel B é selecionado a partir do grupo que consiste em: , , e ;
[0073] W é N ou CR7; e Z é O ou S; em que R7 é H ou C1-C4-alquila.
[0074] Em uma modalidade, os compostos têm a fórmula (III-E-1).
[0075] Em uma modalidade, X é O.
[0076] Em outra modalidade, X é NH.
[0077] Em uma modalidade, Y é O.
[0078] Em outra modalidade, Y é NH.
[0079] Em uma outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH e R3 é hidrogênio.
[0080] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C4-alquila, C1-C4-haloalquila, C(=O)NHR2' e NR4R5.
[0081] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por um substituinte R2 selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C4- alquila, C1-C4-haloalquila, C(=O)NHR2' e NR4R5.
[0082] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por um substituinte R2 selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C4- alquil e C(=O)NHR2'.
[0083] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por um substituinte R2 selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C2- alquil e C(=O)NHC1-C2-alquila.
[0084] Em outra modalidade, X é O, Y é NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por um substituinte R2 selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C2-alquil e C(=O)NHC1-C2-alquila.
[0085] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C4-alquila, C1-C4-haloalquila, C(=O)NHR6 e NR4R5; O anel B é selecionado a partir do grupo que consiste em: , , e ; W é N ou CR3; e Z é O ou S; em que R3 é H ou C1-C4 alquila.
[0086] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C4-alquila, C1-C4-haloalquila, C(=O)NHR6 e NR4R5; O anel B é W é N ou CR3; e Z é O ou S; em que R3 é H ou C1-C4 alquila.
[0087] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C4-alquila, C1-C4-haloalquila, C(=O)NHR6 e NR4R5; O anel B é
; W é N; e Z é O ou S.
[0088] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C4-alquil e C(=O)NHR6; O anel B é ; W é N; e Z é O ou S.
[0089] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C2-alquila e C(=O)NH C1-C2-alquila; O anel B é ; W é N; e Z é O ou S.
[0090] Em outra modalidade, os compostos têm a fórmula (III-E-2).
[0091] Em outra modalidade, X é NH.
[0092] Em uma modalidade, Y é O.
[0093] Em outra modalidade, Y é NH.
[0094] Em uma outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, e R3 é hidrogênio.
[0095] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C4-alquila, C1-C4-haloalquila, C(=O)NHR6 e NR4R5.
[0096] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por um substituinte R2 selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C4- alquila, C1-C4-haloalquila, C(=O)NHR6 e NR4R5.
[0097] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel pirimidina que é substituído por um substituinte R2 selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C4- alquil e C(=O)NHR6.
[0098] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel pirimidina que é substituído por um substituinte R2 selecionado dentre o grupo consistindo em C1-C2-alquil e C(=O)NHC1-C2-alquila.
[0099] Em outra modalidade, X é O, Y é NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por um substituinte R2 selecionado a partir do grupo que consiste em C1-C2-alquil e C(=O)NHC1-C2-alquila.
[00100] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C4-alquila, C1-C4-haloalquila, C(=O)NHR2' e NR4R5; O anel B é selecionado a partir do grupo que consiste em: , , e ; W é N ou CR3; e Z é O ou S; em que R3 é H ou C1-C4 alquila.
[00101] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C4-alquila, C1-C4-haloalquila, C(=O)NHR6 e NR4R5; O anel B é ; W é N ou CR3; e Z é O ou S; em que R3 é H ou C1-C4 alquila.
[00102] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C4-alquila, C1-C4-haloalquila, C(=O)NHR2' e NR4R5; O anel B é ; W é N; e Z é O ou S.
[00103] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C4-alquil e C(=O)NHR6; O anel B é ; W é N; e Z é O ou S.
[00104] Em outra modalidade, X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C2-alquil e C(=O)NH C1-C2-alquila; O anel B é ; W é N; e Z é O ou S.
[00105] Em uma modalidade de compostos com a fórmula (III-E-1) ou (III-E-2), é , , , ou .
[00106] Em outra modalidade, é .
[00107] Em outra modalidade, a invenção apresenta um composto selecionado a partir do grupo de compostos listados na Tabela 1.
[00108] Em outra modalidade, a invenção apresenta um composto selecionado a partir do grupo de compostos listados na Tabela 2. Composições, Formulações e Administração de Compostos
[00109] Em outra modalidade, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer uma das fórmulas aqui descritas e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade adicional, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto da Tabela 1. Em uma modalidade adicional, a composição compreende adicionalmente um agente terapêutico adicional.
[00110] De acordo com outra modalidade, a invenção fornece uma composição compreendendo um composto desta invenção ou um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo e um transportador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a quantidade de composto em uma composição desta invenção é tal que é eficaz para inibir mensuravelmente uma DNA-PK em uma amostra biológica ou em um paciente. Em outra modalidade, a quantidade de composto nas composições desta invenção é tal que é eficaz para inibir mensuravelmente a DNA-PK. Em uma modalidade, a composição desta invenção é formulada para administração a um paciente em necessidade de tal composição. Em uma outra modalidade, a composição desta invenção é formulada para administração oral a um paciente.
[00111] O termo "paciente", tal como aqui utilizado, significa um animal, preferivelmente um mamífero, e mais preferivelmente um humano.
[00112] O termo "agente" é usado aqui para denotar um composto químico, uma molécula pequena, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica ou um extrato feito de materiais biológicos.
[00113] Como usado neste documento, "tratamento" ou "tratar" ou "paliação" ou "melhora" são usados de forma intercambiável. Estes termos se referem a uma abordagem para obter resultados benéficos ou desejados, incluindo, mas não se limitando a, um benefício terapêutico e/ou um benefício profilático. Por benefício terapêutico entende-se qualquer melhoria terapeuticamente relevante ou efeito sobre uma ou mais doenças, condições ou sintomas sob tratamento. Para benefício profilático, as composições podem ser administradas a um objeto em risco de desenvolver uma doença, condição ou sintoma específico, ou a um objeto que relata um ou mais dos sintomas fisiológicos de uma doença, mesmo que a doença, condição ou sintoma pode ainda não ter sido manifestado. Estes termos também significam o tratamento de uma doença em um mamífero, por exemplo, em um humano, incluindo (a) inibição da doença, isto é, impedindo ou prevenindo seu desenvolvimento; (b) aliviando a doença, isto é, causando regressão do estado da doença; ou (c) curando a doença.
[00114] O termo "quantidade eficaz" ou "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de um agente que é suficiente para efetuar resultados benéficos ou desejados. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar dependendo de um ou mais dos seguintes: o objeto e a condição da doença a ser tratada, o peso e a idade do objeto, a gravidade da condição da doença, o modo de administração e similares, que podem ser facilmente determinados por um versado na técnica. O termo também se aplica a uma dose que fornecerá uma imagem para detecção por qualquer um dos métodos de imagem aqui descritos. A dose específica pode variar dependendo de um ou mais dos seguintes: o agente específico escolhido, o regime de dosagem a ser seguido, se é administrado em combinação com outros compostos, o tempo de administração, o tecido a ser fotografado e o sistema de entrega física em que é transportado.
[00115] Como usado neste documento, "administrar" refere-se ao contato, injeção, distribuição, entrega ou aplicação de um inibidor de DNA-PK a um objeto, um sistema de edição genômica e/ou um inibidor de DNA-PK a uma célula ou objeto. Em algumas modalidades, a administração está em contato com um sistema de edição genômica e/ou um inibidor de DNA-PK com uma célula (s). Em algumas modalidades, a administração está entregando um sistema de edição genômica e/ou um inibidor de DNA-PK a uma célula (s). Em algumas modalidades, a administração está aplicando um sistema de edição genômica e/ou um inibidor de DNA-PK a uma célula. Em algumas modalidades, a administração está injetando um sistema de edição genômica e/ou um inibidor de DNA-PK a uma célula. A administração pode ocorrer in vivo, ex vivo ou in vitro. A administração de um sistema de edição genômica e um inibidor de DNA-PK a uma célula pode ser feita simultânea ou sequencialmente.
[00116] O termo "adquirido" em referência a uma condição ou doença aqui utilizada significa um distúrbio ou condição médica que se desenvolve pós-fetal; em contraste com um distúrbio congênito, que está presente no nascimento. Um distúrbio congênito pode ser antecedente a um distúrbio adquirido.
[00117] Os termos condição ou doença "congênita" ou "herdada" são um distúrbio genético encontrado no genoma de um objeto que está presente em um objeto ao nascer. O "genoma", conforme usado neste documento, inclui todo o material genético no núcleo e no citoplasma e inclui ainda o genoma mitocondrial e o genoma ribossômico. O congênito ou herdado pode ser expresso a qualquer momento durante a vida do objeto, por exemplo, no nascimento ou na idade adulta.
[00118] O termo "distúrbio genético" ou "doença genética" inclui mutações herdadas ou adquiridas no genoma de um objeto que causa ou pode causar doença.
[00119] Os termos "polimorfismos" ou "variações genéticas" significam diferentes formas de um gene em um locus genético.
[00120] Também será apreciado que alguns dos compostos da presente invenção podem existir em forma livre para tratamento, ou quando apropriado, tal como um derivado farmaceuticamente aceitável do mesmo. De acordo com a presente invenção, um derivado aceitável do ponto de vista farmacêutico inclui, mas não está limitado a, pró- drogas, sais, ésteres, sais, sais de tais ésteres aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, ou qualquer outro aduto ou derivado que, após administração a um paciente em necessidade, seja capaz de fornecer, direta ou indiretamente, um composto tal como aqui descrito de outra forma, ou um metabolito ou resíduo do mesmo. Como usado aqui, o termo "metabólito ativo inibitório ou resíduo do mesmo" significa que um metabolito ou resíduo do mesmo é também um inibidor da DNA-PK.
[00121] Como usado aqui, o termo "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se aos sais que são, dentro do escopo de um julgamento médico seguro, adequados para uso em contato com tecidos de seres humanos e animais inferiores, sem toxicidade, irritação, resposta alérgica indevida e similar.
[00122] Sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na área.
Por exemplo, S.
M.
Berge et al., descrevem sais farmaceuticamente aceitáveis em detalhes em J.
Pharmaceutical Sciences, 66: 1-19, 1977, que é aqui incorporado por referência.
Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos desta invenção incluem aqueles derivados de ácidos e bases inorgânicos e orgânicos adequados.
Exemplos de sais de adição de ácido não tóxico farmaceuticamente aceitáveis são os sais de um grupo amino formado com ácidos inorgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico e ácido perclórico ou com ácidos orgânicos, tais como ácido acético, ácido oxálico, ácido maleico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico ou ácido malônico ou usando outros métodos utilizados na técnica, tais como troca iônica.
Outros sais aceitáveis farmaceuticamente incluem adipato, alginato, ascorbato, aspartato, benzenossulfonato, benzoato, bissulfato, borato, butirato, cânfora, canforossulfonato, citrato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato de sódio, glifosato de sódio, glifosato de sódio, glifosato de sódio, glifosato de fosfato de sódio hexanoato, hidroiodeto, 2-hidróxi-etanossulfonato, lactobionato, lactato, laurato, lauril sulfato, malato, maleato, malonato, metanossulfonato, 2- naftalenossulfonato, nicotinato, nitrato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, estearato, succinato, sulfato, tartrato, tiocianato, p- toluenossulfonato, sais de valerato e similares.
Os sais derivados de bases apropriadas incluem sais de metais alcalinos, metais alcalinoterrosos, amônio e N+(C1-4 alquil)4. Esta invenção também prevê a quaternização de qualquer grupo básico contendo nitrogênio dos compostos aqui descritos.
Produtos solúveis em água ou dispersíveis em óleo ou podem ser obtidos por essa quaternização.
Os sais de metais alcalinos ou alcalinoterrosos representativos incluem sódio, lítio, potássio, cálcio, magnésio e similares.
Outros sais aceitáveis farmaceuticamente incluem, quando apropriado, cátions amônio não tóxico, amônio quaternário e amina formados utilizando-se íons tais como halogeneto, hidróxido, carboxilato, sulfato, fosfato, nitrato, C1-8 sulfonato e sulfonato de arila.
[00123] Como descrito acima, as composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção compreendem adicionalmente um transportador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável, que, tal como aqui utilizado, inclui todo e qualquer solvente, diluente ou outro veículo líquido, auxiliar de dispersão ou suspensão, agentes surfactantes, agentes isotônicos, agentes espessantes ou emulsificantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubrificantes e similares, conforme adequado à forma de dosagem específica desejada. Em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21ª edição, 2005, ed. D.B. Troy, Lippincott Williams & Wilkins, Filadélfia, e Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick e J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nova Iorque, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência, são descritos vários veículos utilizados na formulação de composições farmaceuticamente aceitáveis e técnicas conhecidas para a sua preparação. Exceto na medida em que qualquer meio veículo convencional seja incompatível com os compostos da invenção, tal como produzindo qualquer efeito biológico indesejável ou interagindo de maneira deletéria com qualquer outro componente da composição farmaceuticamente aceitável, seu uso é contemplado tais como dentro do escopo desta invenção.
[00124] Alguns exemplos de materiais que podem servir tais como veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a, permutadores de íons, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tais como albumina sérica humana, substâncias tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico ou sorbato de potássio, misturas parciais de glicerídeos de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, poliacrilatos, ceras, polímeros em bloco de polietileno-polioxipropileno, gordura de lã, açúcares tais como lactose, glicose e sacarose; amidos tais como amido de milho e amido de batata; celulose e seus derivados tais como carboximetil celulose de sódio, etil celulose e acetato de celulose; tragacanto em pó; malte; gelatina; talco; excipientes tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios; óleos tais como óleo de amendoim, óleo de semente de algodão; óleo de cártamo; óleo de gergelim; azeite; óleo de milho e óleo de soja; glicóis; tal um propileno glicol ou polietileno glicol; ésteres tais como oleato de etila e laurato de etila; ágar; agentes tamponantes tais como hidróxido de magnésio e hidróxido de alumínio; ácido algínico; água livre de pirogênio; salina isotônica; solução de Ringer; álcool etílico e soluções tampão de fosfato, bem como outros lubrificantes compatíveis não tóxicos, tais como lauril sulfato de sódio e estearato de magnésio, bem como agentes corantes, agentes de liberação, agentes de revestimento, agentes adoçantes, aromatizantes e perfumadores, conservantes e antioxidantes também podem estar presente na composição, de acordo com o julgamento do formulador.
[00125] As composições da presente invenção podem ser administradas por via oral, parentérica, por spray de inalação, topicamente, retal, nasal, bucal, vaginal ou via reservatório implantado. O termo "parenteral", conforme aqui utilizado, inclui técnicas de injeção ou infusão subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrassinovial, intraesternal, intratecal, intraocular, intra-hepática, intralesional, epidural, intraespinhal e intracraniana. Preferivelmente, as composições são administradas por via oral, intraperitoneal ou intravenosa. As formas injetáveis estéreis das composições desta invenção podem ser suspensões aquosas ou oleaginosas. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com técnicas conhecidas na técnica utilizando agentes dispersantes ou umectantes e agentes de suspensão adequados. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente parentericamente aceitável não tóxico, por exemplo, tal como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregues estão água, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente empregues tais como solvente ou meio de suspensão.
[00126] Para este fim, qualquer óleo fixo suave pode ser empregue, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Os ácidos graxos, tal como o ácido oleico e seus derivados de glicerídeos, são úteis na preparação de injetáveis, assim tais como os óleos naturais aceitáveis farmaceuticamente, tal como o azeite ou o óleo de mamona, especialmente em suas versões polioxietiladas. Estas soluções ou suspensões oleosas também podem conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, tais como carboximetil celulose ou agentes dispersantes similares que são comumente usados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis, incluindo emulsões e suspensões. Outros surfactantes comumente usados, tais como Tweens, Spans e outros agentes emulsificantes ou intensificadores de biodisponibilidade que são comumente usados na fabricação de formas sólidas, líquidas ou outras formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis também podem ser utilizados para os propósitos da formulação.
[00127] As composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção podem ser administradas por via oral em qualquer forma de dosagem aceitável por via oral, incluindo, entre outras, cápsulas,
comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. No caso de comprimidos para uso oral, os veículos comumente usados incluem lactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, também são normalmente adicionados. Para administração oral em forma de cápsula, diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando são necessárias suspensões aquosas para uso oral, o ingrediente ativo é combinado com agentes emulsificantes e de suspensão. Se desejado, certos agentes adoçantes, aromatizantes ou corantes também podem ser adicionados.
[00128] Alternativamente, as composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção podem ser administradas na forma de supositórios para administração retal. Estes podem ser preparados misturando o agente com um excipiente não irritante adequado que é sólido à temperatura ambiente, mas líquido à temperatura retal e, portanto, derrete no reto para liberar a droga. Tais materiais incluem manteiga de cacau, cera de abelha e polietileno glicóis.
[00129] As composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção também podem ser administradas topicamente, especialmente quando o objetivo do tratamento inclui áreas ou órgãos facilmente acessíveis por aplicação tópica, incluindo doenças dos olhos, pele ou trato intestinal inferior. Formulações tópicas adequadas são prontamente preparadas para cada uma dessas áreas ou órgãos.
[00130] A aplicação tópica para o trato intestinal inferior pode ser realizada em uma formulação de supositório retal (vide acima) ou em uma formulação adequada de enema. Também podem ser utilizados adesivos topicamente transdérmicos.
[00131] Para aplicações tópicas, as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas em uma pomada adequada contendo o componente ativo suspenso ou dissolvido em um ou mais veículos. Os veículos para administração tópica dos compostos desta invenção incluem, mas não estão limitados a, óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, propilenoglicol, polioxietileno, composto de polioxipropileno, cera emulsificante e água. Alternativamente, as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas em uma loção ou creme adequado contendo os componentes ativos suspensos ou dissolvidos em um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Os veículos adequados incluem, mas não estão limitados a, óleo mineral, monoestearato de sorbitano, polissorbato 60, cera de ésteres cetílicos, álcool cetearílico, 2 octildodecanol, álcool benzílico e água.
[00132] Para uso oftálmico, as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas, por exemplo, tais como suspensões micronizadas em solução salina estéril isotônica, com pH ajustado ou outra solução aquosa, ou, preferivelmente, tais como soluções em solução salina estéril isotônica, com pH ajustado ou outra solução aquosa, com ou sem conservante, tais como cloreto de benzilalcônio. Alternativamente, para usos oftálmicos, as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas em uma pomada tais como petrolato. As composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção também podem ser administradas por aerossol nasal ou inalação. Tais composições são preparadas de acordo com técnicas bem conhecidas na técnica de formulação farmacêutica e podem ser preparadas tais como soluções em solução salina, empregando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para aumentar a biodisponibilidade, fluorocarbonetos e/ou outros agentes solubilizantes ou dispersantes convencionais.
[00133] Mais preferivelmente, as composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção são formuladas para administração oral.
[00134] As formas de dosagem líquidas para administração oral incluem, mas não estão limitadas a, emulsões, microemulsões,
soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além dos compostos ativos, as formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertes comumente usados na técnica, tais como, por exemplo, água ou outros solventes, agentes solubilizantes e emulsificantes, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etila, acetato de etila, álcool benzílico, benzoato de benzila, propileno glicol, 1,3-butileno glicol, dimetilformamida, óleos (em especial sementes de algodão, amendoim, milho, germe, azeitona, mamona e óleos de gergelim), glicerol, álcool tetra-hidrofurfurílico, polietileno glicóis e ésteres de sorbitano, ácidos etílicos e suas misturas. Além dos diluentes inertes, as composições orais também podem incluir adjuvantes, tais como agentes umectantes, agentes emulsificantes e de suspensão, adoçantes, aromatizantes e perfumadores.
[00135] Preparações injetáveis, por exemplo, suspensões aquosas ou oleaginosas injetáveis estéreis podem ser formuladas de acordo com a técnica conhecida usando agentes dispersantes ou umectantes e agentes de suspensão adequados. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução, suspensão ou emulsão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, tal como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregues estão água, solução de Ringer, U.S.P. e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos fixos estéreis são convencionalmente empregues tais como solvente ou meio de suspensão. Para este fim, qualquer óleo fixo suave pode ser empregue, incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos, tal como o ácido oleico, são utilizados na preparação de injetáveis.
[00136] As formulações injetáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias ou pela incorporação de agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que podem ser dissolvidas ou dispersas em água estéril ou outro meio injetável estéril antes de usar.
[00137] A fim de prolongar o efeito de um composto da presente invenção, é frequentemente desejável retardar a absorção do composto a partir de injeção subcutânea ou intramuscular. Isto pode ser conseguido pelo uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com baixa solubilidade em água. A taxa de absorção do composto depende então da sua taxa de dissolução que, por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e da forma cristalina. Alternativamente, a dissolução ou suspensão do composto em um veículo oleoso realiza a absorção retardada de uma forma de composto administrada parentericamente. As formas de depósito injetável são feitas através da formação de matrizes microencapsuladas do composto em polímeros biodegradáveis, tais como polilactídeo-poliglicolídeo. Dependendo da proporção de composto para polímero e da natureza do polímero específico empregue, a taxa de liberação do composto pode ser controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli (ortoésteres) e poli (anidridos). As formulações injetáveis de depósito também são preparadas prendendo o composto em lipossomos ou microemulsões que são compatíveis com os tecidos do corpo.
[00138] As composições para administração retal ou vaginal são preferivelmente supositórios que podem ser preparados misturando os compostos desta invenção com excipientes ou veículos não irritantes adequados, tais como manteiga de cacau, polietilenoglicol ou uma cera de supositório que são sólidos à temperatura ambiente, mas líquidos à temperatura corporal e, portanto, derrete no reto ou na cavidade vaginal e libera o composto ativo.
[00139] As formas de dosagem sólidas para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Em tais formas de dosagem sólidas, o composto ativo é misturado com pelo menos um excipiente ou veículo inerte, farmaceuticamente aceitável, tais como citrato de sódio ou fosfato dicálcico e/ou a) preenchedores ou extensores, tais como amidos, lactose, sacarose, glicose, manitol e ácido silícico, b) aglutinantes como, por exemplo, carboximetil celulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidinona, sacarose e acácia, c) umectantes tais como glicerol, d) agentes desintegrantes, tais como ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou tapioca, ácido algínico, certos silicatos e carbonato de sódio; e) agentes retardadores de solução, tais como parafina; f) aceleradores de absorção, tais como compostos de amônio quaternário; g) agentes umectantes, tais como, por exemplo, álcool cetílico e monoestearato de glicerol; h) absorventes tais como caulino e argila de bentonita, e i) lubrificantes tais como talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietileno glicóis sólidos, lauril sulfato de sódio e suas misturas. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, a forma de dosagem também pode compreender agentes tamponantes.
[00140] Composições sólidas de um tipo similar também podem ser empregues tais como preenchedores em cápsulas de gelatina mole e dura usando excipientes tais como lactose ou açúcar de leite, bem como polietileno glicóis de alto peso molecular e similares. As formas farmacêuticas sólidas de comprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e conchas, tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Eles podem opcionalmente conter agentes opacificantes e também podem ter uma composição que libera apenas o ingrediente (s) ativo, ou preferivelmente, em uma determinada parte do trato intestinal, opcionalmente, de maneira retardada. Exemplos de composições de incorporação que podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras. Composições sólidas de um tipo similar também podem ser empregues tais como preenchedores em cápsulas de gelatina mole e dura, usando excipientes tais como lactose ou açúcar de leite, bem como polietileno glicóis de alto peso molecular e similares.
[00141] Os compostos ativos também podem estar na forma microencapsulada com um ou mais excipientes, tais como observado acima. As formas de dosagem sólida de comprimidos, drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos podem ser preparadas com revestimentos e invólucros, tais como revestimentos entéricos, revestimentos de controle de liberação e outros revestimentos bem conhecidos na área de formulação farmacêutica. Em tais formas de dosagem sólidas, o composto ativo pode ser misturado com pelo menos um diluente inerte, tais como sacarose, lactose ou amido. Tais formas de dosagem podem também compreender, tal como é prática normal, substâncias adicionais que não sejam diluentes inertes, por exemplo, lubrificantes para comprimidos e outros auxiliares para comprimidos, tais como estearato de magnésio e celulose microcristalina. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de dosagem também podem compreender agentes tamponantes. Eles podem opcionalmente conter agentes opacificantes e também podem ter uma composição que libera apenas o ingrediente (s) ativo, ou preferivelmente, em uma determinada parte do trato intestinal, opcionalmente, de maneira retardada. Exemplos de composições de incorporação que podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras.
[00142] As formas de dosagem para administração tópica ou transdérmica de um composto desta invenção incluem pomadas, pastas, cremes, loções, géis, pós, soluções, sprays, inalantes ou adesivos. O componente ativo é misturado em condições estéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável e com qualquer conservante ou tampão necessário, conforme necessário. Formulações oftálmicas,
gotas para os ouvidos e colírios também são contemplados tais como estando dentro do escopo desta invenção. Além disso, a presente invenção contempla o uso de adesivos transdérmicos, que têm a vantagem adicional de fornecer a entrega controlada de um composto ao corpo. Tais formas de dosagem podem ser feitas dissolvendo ou dispensando o composto no meio apropriado. Os intensificadores de absorção também podem ser usados para aumentar o fluxo do composto através da pele. A taxa pode ser controlada fornecendo uma membrana de controle de taxa ou dispersando o composto em uma matriz polimérica ou gel.
[00143] Os compostos da invenção são preferivelmente formulados na forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade da dosagem. A expressão "forma de unidade de dosagem", tais como aqui utilizada, refere-se a uma unidade de agente fisicamente discreta apropriada para o paciente a ser tratado. Será entendido, no entanto, que o uso diário total dos compostos e composições da presente invenção será decidido pelo médico assistente dentro do escopo do julgamento médico correto. O nível de dose eficaz específico para qualquer paciente ou organismo em particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo o distúrbio que está sendo tratado e a gravidade do distúrbio; a atividade do composto específico empregue; a composição específica empregue; a idade, peso corporal, estado geral de saúde, sexo e dieta do paciente; o tempo de administração, via de administração e taxa de excreção do composto específico empregue; a duração do tratamento; drogas utilizadas em combinação ou coincidentes com o composto específico empregue e fatores similares bem conhecidos nas técnicas médicas.
[00144] A quantidade dos compostos da presente invenção que podem ser combinados com os materiais veículos para produzir uma composição em uma forma de dosagem única variará dependendo do hospedeiro tratado, o modo particular de administração. Preferivelmente, as composições devem ser formuladas de modo que uma dosagem entre 0,01 - 100 mg/kg de peso corporal/dia do inibidor possa ser administrada a um paciente que recebe essas composições.
[00145] Dependendo da condição proliferativa específica ou câncer a ser tratado, agentes terapêuticos adicionais, que são normalmente administrados para tratar ou prevenir essa condição, também podem estar presentes nas composições desta invenção. Como usado aqui, agentes terapêuticos adicionais que são normalmente administrados para tratar ou prevenir uma condição proliferativa ou câncer em particular são conhecidos tais como "apropriados para a doença ou condição em tratamento". Exemplos de agentes terapêuticos adicionais são fornecidos infra.
[00146] A quantidade de agente terapêutico adicional presente nas composições desta invenção não será mais do que a quantidade que seria normalmente administrada em uma composição compreendendo esse agente terapêutico como o único agente ativo. Preferivelmente, a quantidade de agente terapêutico adicional nas composições presentemente divulgadas variará de cerca de 50% a 100% da quantidade normalmente presente em uma composição compreendendo esse agente tal como o único agente terapeuticamente ativo. Usos dos Compostos e Composições
[00147] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos métodos para sensibilizar uma célula para um agente terapêutico ou um estado de doença que induz uma lesão de DNA compreendendo a etapa de contatar a célula com um ou mais inibidores de DNA-PK aqui descritos, tais como os de fórmula (III-E-1) ou (III-E-2), ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00148] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos métodos de potenciar um regime terapêutico para tratamento de câncer,
compreendendo a etapa de administrar a um indivíduo em necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de inibidores de DNA-PK aqui descritos, tais como os de fórmula (III-E-1) ou (III-E-2) ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Em um aspecto, o regime terapêutico para o tratamento do câncer inclui terapia de radiação.
[00149] Os inibidores de DNA-PK aqui descritos são úteis nos casos em que a terapia de radiação é indicada para aumentar o benefício terapêutico de tal tratamento. Além disso, a radioterapia é frequentemente indicada como adjuvante à cirurgia no tratamento do câncer. O objetivo da terapia de radiação no cenário adjuvante é reduzir o risco de recorrência e aumentar a sobrevida livre de doença quando o tumor primário tiver sido controlado. A radioterapia adjuvante é indicada em várias doenças, incluindo câncer de cólon, reto, pulmão, gastroesofágico e mama, conforme descrito abaixo.
[00150] Em algumas modalidades, outro agente quimioterápico anticâncer com um inibidor de DNA-PK descrito neste documento é usado em um regime terapêutico para o tratamento de câncer, com ou sem terapia de radiação. A combinação de um inibidor de DNA-PK aqui descrito com outros agentes pode potencializar o protocolo quimioterapêutico. Por exemplo, o inibidor de DNA-PK aqui descrito pode ser administrado com etoposídeo ou bleomicina, agentes conhecidos por causar a quebra do filamento de DNA.
[00151] Em algumas modalidades, ainda são descritos métodos para a radiossensibilização de células tumorais utilizando um composto de um inibidor de DNA-PK descrito neste documento. Um inibidor de DNA- PK que pode "radiossensibilizar" uma célula, tal como aqui utilizado, é definido tal como uma molécula, de preferência uma molécula de baixo peso molecular, administrada a animais em quantidade terapeuticamente eficaz para aumentar a sensibilidade das células à radiação eletromagnética e/ou promover o tratamento de doenças tratáveis com radiação eletromagnética (por exemplo, raios X). Doenças tratáveis com radiação eletromagnética incluem doenças neoplásicas, tumores benignos e malignos e células cancerígenas.
[00152] Em algumas modalidades, também são fornecidos neste documento métodos para o tratamento de câncer em um animal que inclui a administração ao animal de uma quantidade eficaz de uma DNA- PK aqui descrito. Em algumas modalidades, são ainda fornecidos aqui métodos para inibir o crescimento de células cancerígenas, incluindo processos de proliferação celular, invasividade e metástase em sistemas biológicos. Tais métodos incluem o uso de um inibidor de DNA- PK aqui descrito tal como um inibidor do crescimento de células cancerígenas. Em algumas modalidades específicas, os métodos são empregues para inibir ou reduzir o crescimento de células cancerígenas, invasividade, metástase ou incidência de tumores em animais vivos, tais como mamíferos. Os inibidores de DNA-PK aqui descritos podem ser utilizados, isoladamente ou em combinação com o uso de IR ou um ou mais agentes quimioterapêuticos, no tratamento de câncer ou na inibição do crescimento de células cancerígenas. Em algumas modalidades, esses métodos são adaptáveis para uso em sistemas de ensaio, por exemplo, analisando o crescimento de células cancerígenas e suas propriedades, bem como identificando compostos que afetam o crescimento de células cancerígenas.
[00153] Tumores ou neoplasias incluem crescimentos de células de tecido nos quais a multiplicação das células é descontrolada e progressiva. Alguns desses crescimentos são benignos, mas outros são denominados "malignos" e podem levar à morte do organismo. Neoplasias malignas ou "cânceres" são diferenciados de crescimentos benignos, pois, além de exibirem proliferação celular agressiva, podem invadir os tecidos circundantes e fazer metástases. Além disso, as neoplasias malignas são caracterizadas por apresentarem uma maior perda de diferenciação (maior "desdiferenciação") e sua organização em relação uma à outra e aos tecidos circundantes. Essa propriedade também é chamada de "anaplasia".
[00154] As neoplasias tratáveis pela presente invenção também incluem tumores sólidos, isto é, carcinomas e sarcomas. Os carcinomas incluem aquelas neoplasias malignas derivadas de células epiteliais que se infiltram (invadem) os tecidos circundantes e dão origem a metástases. Adenocarcinomas são carcinomas derivados de tecido glandular ou de tecidos que formam estruturas glandulares reconhecíveis. Outra categoria ampla de cânceres inclui sarcomas, que são tumores cujas células são incorporadas a uma substância fibrilar ou homogênea tal como o tecido conjuntivo embrionário. Os inibidores de DNA-PK aqui descritos também podem permitir o tratamento de cânceres dos sistemas mieloide ou linfóide, incluindo leucemias, linfomas e outros cânceres que normalmente não se apresentam tal como uma massa tumoral, mas são distribuídos nos sistemas vasculares ou linforeticulares.
[00155] A atividade de DNA-PK pode ser associada a várias formas de câncer em, por exemplo, oncologia adulta e pediátrica, crescimento de tumores/malignidades sólidas, carcinoma mixóide e de células redondas, tumores localmente avançados, câncer metastático, sarcomas de tecidos moles humanos, incluindo sarcoma de Ewing, metástases de câncer, incluindo metástases linfáticas, carcinoma de células escamosas, particularmente cabeça e pescoço, carcinoma de células escamosas do esôfago, carcinoma oral, neoplasias das células sanguíneas, incluindo mieloma múltiplo, leucemias, incluindo leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia não linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielocítica crônica e leucemia de células pilosas, linfomas de efusão (linfomas baseados em cavidades corporais), câncer de pulmão de linfoma tímico, incluindo carcinoma de pequenas células do pulmão, linfoma cutâneo de células T, linfoma de Hodgkin, linfoma não Hodgkin, câncer do córtex adrenal, tumores produtores de ACTH, câncer de células não pequenas, câncer de mama, incluindo carcinoma de pequenas células e carcinoma ductal, cânceres gastrointestinais, incluindo câncer de estômago, câncer de cólon, câncer colorretal, pólipos associados a neoplasia colorretal, câncer de pâncreas, câncer de fígado, cânceres urológicos, incluindo câncer de bexiga, incluindo tumores da bexiga primários superficiais, carcinoma de células transicionais invasivas da bexiga, e câncer de bexiga invasivo de músculo, câncer de próstata, malignidades do trato genital feminino, incluindo carcinoma ovariano, neoplasias epiteliais peritoneais primárias, carcinoma cervical, câncer de endométrio uterino, câncer vaginal, câncer de vulva, câncer uterino e tumores sólidos no folículo ovariano, malignidades do trato genital masculino, incluindo câncer testicular e câncer do pênis, câncer renal, incluindo carcinoma de células renais, câncer cerebral, incluindo tumores intrínsecos do cérebro, neuroblastoma, tumores astrocitários do cérebro, gliomas, invasão metastática de células tumorais no sistema nervoso central, câncer ósseo, incluindo osteomas e osteossarcomas, câncer de pele, incluindo melanoma maligno, progressão tumoral de queratinócitos da pele humana, câncer de células escamosas, câncer de tireóide, retinoblastoma, neuroblastoma, derrame peritoneal, derrame pleural maligno, mesotelioma, tumores de Wilms, câncer de vesícula biliar, neoplasias trofoblásticas, hemangiopericitoma e sarcoma de Kaposi. Métodos para potencializar o tratamento dessas e de outras formas de câncer também são descritos aqui.
[00156] Também são aqui fornecidos métodos para inibir a atividade de DNA-PK em uma amostra biológica que inclui contatar a amostra biológica com um composto ou composição da invenção. O termo "amostra biológica", tal como aqui utilizado, significa uma amostra fora de um organismo vivo e inclui, sem limitação, culturas celulares ou extratos dos mesmos; material de biópsia obtido de um mamífero ou de seus extratos; e sangue, saliva, urina, fezes, sêmen, lágrimas ou outros fluidos corporais ou extratos deles. A inibição da atividade de quinase, particularmente a atividade de DNA-PK, em uma amostra biológica é útil para uma variedade de propósitos conhecidos por um especialista na técnica. Exemplos de tais propósitos incluem, mas não estão limitados a, armazenamento de amostras biológicas e ensaios biológicos. Em uma modalidade, o método de inibição da atividade de DNA-PK em uma amostra biológica é limitado a métodos não terapêuticos.
[00157] Em algumas modalidades, esta descrição fornece métodos, composições e kits para editar um genoma alvo, por exemplo, corrigindo uma mutação. Tais métodos, composições e kits podem aumentar a eficiência da edição do genoma pelo uso de um inibidor de DNA-PK.
[00158] Um sistema de edição genômica pode estimular ou induzir uma quebra (s) de DNA, tais como DSB (s) no local desejado no genoma (ou região genômica alvo). A criação da clivagem do DNA solicita que as enzimas celulares reparem o sítio de quebra através da via NHEJ propensa a erros ou através da via HDR sem erros. Em NHEJ, a lesão de DNA é reparada pela fusão das duas extremidades da quebra de DNA em uma série de processos enzimáticos que envolvem o heterodímero Ku70/80 e enzimas da proteína-quinase dependente de DNA (DNA-PK). O mecanismo de reparo envolve amarrar e alinhar duas extremidades de DNA, ressecção, alongamento e ligação (Rouet et al.; Dexheimer T. DNA repair pathways e mechanisms. In: Mathews L, Cabarcas S, Hurt E, editores. DNA repair of cancer stem cells. Dordrecht: Springer; 2013. p. 19–32.) resultando na formação de pequenas mutações de inserção ou exclusão (indels) no sítio de quebra. Os indels introduzidos na sequência de codificação de um gene podem causar um códon de parada prematuro ou mutações de deslocamento de quadro que levam à produção de proteínas truncadas não funcionais. O mecanismo da via HDR é menos compreendido e envolve um conjunto diferente de proteínas de reparo, tal como Rad51, que estimulam a invasão de filamentos por um modelo de reparo de doadores para inserção de base ou substituição de genes. Portanto, HDR permite a introdução de um modelo de DNA exógeno para obter o resultado desejado da edição de DNA dentro de um genoma e pode ser uma estratégia poderosa para modelagem de doenças translacionais e edição terapêutica de genoma para restaurar a função do gene.
[00159] Das duas vias de reparo do DNA, NHEJ ocorre com uma frequência muito mais alta e relatórios de mais de 70% de eficiência podem ser alcançados mesmo em neurônios (Swiech et al., "In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR- Cas9," Nat Biotechnol. janeiro de 2015;33(1):102-62014). Entretanto, a correção do gene HDR ocorre em frequência muito baixa e durante as fases S e G2 quando a replicação do DNA é concluída e os cromatídeos irmãos estão disponíveis para servir tais como modelos de reparo (Heyer et al., Regulation of homologous recombination in eukaryotes. Annual Review of Genetics 44:113–139, 2010). Uma vez que NHEJ ocorre durante todo o ciclo celular, em competição e é favorecido por HDR durante as fases S e G2, a inserção direcionada pela via HDR permanece um desafio e um foco de estudos contínuos.
[00160] A proteína-quinase do DNA (DNA-PK) desempenha um papel em vários processos de reparo do DNA. A DNA-PK participa do reparo de quebra de filamento duplo do DNA através da ativação da via de junção de extremidade não homóloga (NHEJ). Pensa-se que NHEJ procede através de três etapas: reconhecimento das DSBs, processamento de DNA para remover extremidades não ligáveis ou outras formas de danos nos terminais e, finalmente, a ligação das extremidades do DNA. O reconhecimento da DSB é realizado pela ligação do heterodímero Ku às extremidades irregulares do DNA, seguido pelo recrutamento de duas moléculas da subunidade catalítica da proteína quinase dependente de DNA (DNA-PKcs) aos lados adjacentes da DSB; isso serve para proteger os terminais quebrados até que enzimas de processamento adicionais sejam recrutadas. Dados recentes apoiam a hipótese de que as DNA-PKcs fosforila a enzima de processamento Artemis e também a si mesma para preparar as extremidades do DNA para processamento adicional. Em alguns casos, a DNA polimerase pode ser necessária para sintetizar novas extremidades antes da etapa de ligação. Acredita-se que a autofosforilação das DNA-PKcs induza uma mudança conformacional que abre a cavidade central de ligação ao DNA, libera DNA-PKcs do DNA e facilita a religação final das extremidades do DNA.
[00161] Em algumas modalidades, esta descrição fornece métodos, composições e kits para aprimorar a edição de gene, aumentando particularmente a eficiência do reparo de quebra (s) de DNA através de uma via HDR, ou a eficiência de inibir ou suprimir o reparo de quebra de DNA (s) através de uma via NHEJ, em sistemas de edição de genoma, incluindo reparo de HDR baseado em CRISPR em células. Embora não esteja vinculado a uma teoria específica, acredita-se que um sistema de edição de genoma administrado a uma célula interage com um ácido nucleico do gene alvo, resultando em ou causando uma quebra de DNA; essa quebra de DNA é reparada por várias vias de reparo, por exemplo, HDR, e um inibidor de DNA-PK administrado a uma célula inibe, bloqueia ou suprime uma via de reparo NHEJ, e a frequência ou eficiência da via de reparo de DNA HDR pode ser aumentada ou promovida.
[00162] A interação entre um sistema de edição de genoma e um ácido nucleico do gene alvo pode ser hibridização de pelo menos parte do sistema de edição de genoma com o ácido nucléico do gene alvo ou qualquer outro reconhecimento do ácido (s) nucléico do gene alvo pelo sistema de edição de gene. Em algumas modalidades, essa interação é uma interação proteína-DNA ou hibridização entre pares de bases.
[00163] Em algumas modalidades, esta descrição fornece métodos para editar uma ou mais regiões genômicas alvo em uma célula (s), administrando na célula (s) um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK. A edição pode ocorrer simultânea ou sequencialmente. A edição de uma ou mais regiões genômicas alvo inclui qualquer tipo de manipulação genética ou engenharia do genoma de uma célula. Em algumas modalidades, a edição de uma ou mais regiões genômicas alvo pode incluir inserções, deleções ou substituições de regiões genômicas em uma célula (s). As regiões genômicas compreendem o material genético de uma célula (s), tais como DNA, RNA, polinucleotídeos e oligonucleotídeos. As regiões genômicas em uma célula (s) também compreendem os genomas das mitocôndrias ou cloroplastos contidos em uma célula (s).
[00164] Em algumas modalidades, as inserções, deleções ou substituições podem estar em uma região genômica codificante ou não codificante, em regiões intrônicas ou exônicas, ou em qualquer combinação das mesmas, incluindo segmentos sobrepostos ou não sobrepostos das mesmas. Tal como aqui utilizado, uma "região não codificante" refere-se a regiões genômicas que não codificam uma sequência de aminoácidos. Por exemplo, regiões não codificantes incluem íntrons. As regiões codificantes referem-se às regiões genômicas que codificam uma sequência de aminoácidos. Por exemplo, regiões codificantes incluem éxons.
[00165] Em algumas modalidades, a edição de uma ou mais regiões genômicas alvo pode ocorrer em qualquer uma ou mais regiões alvo em um genoma de uma célula (s). Em algumas modalidades, a edição de uma ou mais regiões genômicas alvo pode ocorrer, por exemplo, em um éxon, um íntron, um sítio de início da transcrição, em uma região promotora, uma região potenciadora, uma região silenciadora, uma região isolante, um antirepressor, um elemento regulador pós-tradução, um sinal de poliadenilação (por exemplo, poli A mínimo), uma região conservada, um sítio de ligação ao fator de transcrição ou qualquer combinação dos mesmos.
[00166] Em algumas modalidades, a administração a uma célula com um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição genômica resulta em maior eficiência de edição de genoma direcionado em comparação a condições nas quais um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição genômica não é administrado a uma célula. Em algumas modalidades, a eficiência de edição aumentada é de cerca de 1 vez, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, em comparação a uma condição na qual um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma não são administrados a uma célula, ou em comparação a uma condição na qual apenas um sistema de edição de genoma e não um inibidor de DNA-PK é administrado a uma célula (s). A eficiência da edição genômica pode ser medida por qualquer método conhecido na área, por exemplo, por qualquer método que determine a frequência da integração polinucleotídica direcionada ou medindo a frequência da mutagênese direcionada. As integrações de polinucleotídeos direcionadas também podem resultar em alteração ou substituição de uma sequência em um genoma, cromossomo ou em uma região de interesse na cromatina celular. As integrações de polinucleotídeos direcionadas podem resultar em mutações direcionadas, incluindo, mas não limitadas a, mutações pontuais (ou seja, conversão de um único par de bases em um par de bases diferente), substituições (ou seja, conversão de uma pluralidade de pares de bases em uma sequência diferente de comprimento idêntico), inserções ou um ou mais pares de bases, deleções de um ou mais pares de bases e qualquer combinação das alterações de sequência mencionadas acima.
[00167] Em algumas modalidades, os métodos de edição de uma ou mais regiões genômicas alvo em uma célula (s) envolvem a administração na célula (s) de um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, as células são sincronizadas na fase do ciclo celular S ou G2. A sincronização da célula (s) na fase do ciclo celular S ou G2 pode ser alcançada por qualquer método conhecido na área. Como um exemplo não limitativo, os agentes que podem ser usados para sincronizar uma célula na fase do ciclo celular S ou G2 incluem afidicolina, diroxiureia, lovastatina, mimosina, nocodazol, timidina ou qualquer combinação dos mesmos. (Vide, Lin et al. "Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery", Elife. 15 de dez de 2014; 3). Em algumas modalidades, os agentes para sincronização celular podem ser administrados a qualquer momento durante o processo de edição de gene. Em algumas modalidades, uma célula (s) pode ser sincronizada na fase S ou G2 do ciclo celular antes, durante ou depois de administrar a uma célula, um sistema de edição de genoma e/ou um inibidor de DNA-PK.
[00168] Em algumas modalidades, os métodos de edição de uma ou mais regiões genômicas alvo em uma célula (s), administrando à célula (s) um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK resultam em maior sobrevivência celular em comparação a condições em que um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK não foram administrados a uma célula (s) ou em comparação a condições em que apenas um sistema de edição de gene é contatado ou administrado em uma célula (s) e não em um inibidor de DNA-PK.
[00169] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos métodos para reparar uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas alvo por meio de uma via HDR. A administração a uma célula (s) de um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK resulta em uma quebra de DNA de uma região alvo do genoma, e a quebra de DNA é subsequentemente reparada, pelo menos em parte, através de uma via HDR. Esses métodos resultam em quantidades aumentadas de reparo mediado por HDR (por exemplo, via HDR) em uma ou mais regiões genômicas alvo, resultando em maior eficiência do reparo mediado por HDR em comparação a as condições nas quais um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição genômica não são administrados a uma célula (s). Em algumas modalidades, a eficiência do reparo mediado pela via HDR da quebra de DNA é de cerca de uma vez, duas vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, em comparação a uma condição na qual um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma não são administrados a uma célula (s), ou em comparação a uma condição na qual apenas um sistema de edição de genoma e não um inibidor de DNA-PK é administrado a uma célula (s). A eficiência do reparo mediado pela via HDR pode ser medida por qualquer método conhecido na área, por exemplo, determinando a frequência de integração de polinucleotídeo alvo ou medindo a frequência da mutagênese alvo.
[00170] Em algumas modalidades, os métodos aqui apresentados fornecem o reparo da quebra de DNA aumentando a eficiência da via HDR.
[00171] A via HDR pode ser "canônica" ou "alternativa". "HDR" (reparo direcionado à homologia) refere-se a uma forma especializada de reparo de DNA que ocorre, por exemplo, durante o reparo de quebras de filamento duplo ou um nick de DNA em uma célula (s). HDR de quebras de filamento duplo é geralmente baseado na homologia da sequência de nucleotídeo, usa uma molécula "doadora" para moldar o reparo de uma molécula "alvo" (por exemplo, a que sofreu a quebra do filamento duplo) e pode levar à transferência de informações genéticas do doador para o alvo. HDR canônico de quebras de filamento duplo é geralmente baseado em BRCA2 e RAD51 e normalmente emprega uma molécula doadora de dsDNA. HDR não canônico ou "alternativo" é um mecanismo de HDR suprimido pelos genes BRCA2, RAD51 e/ou relacionados à funcionalidade. HDR alternativo pode usar uma molécula doadora de ssDNA ou dsDNA cortado. Vide, por exemplo, WO
2014172458.
[00172] Em algumas modalidades, os métodos para reparar uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas alvo por meio de uma via HDR, administrando às células um sistema de edição de genoma e um resultado de inibidor de DNA-PK em maior sobrevivência celular em comparação a condições nas quais um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK não são administrados a uma célula ou em comparação a condições nas quais apenas um sistema de edição de gene é administrado a uma célula e não a um inibidor de DNA-PK.
[00173] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos métodos para inibir ou suprimir o reparo mediado por NHEJ de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas alvo em uma célula (s). Em algumas modalidades, a inibição ou supressão do reparo mediado por NHEJ de uma quebra de DNA é realizada inibindo ou suprimindo a via do NHEJ. A via NHEJ pode ser clássica ("canônica") ou uma via NHEJ alternativa (alt-NHEJ ou junção de extremidade mediada por micro- homologia (MMEJ)). A via NHEJ ou a via alt-NHEJ é suprimida em uma célula, administrando a uma célula um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK.
[00174] A via de reparo de NHEJ clássica é uma via de reparo de quebra de filamento duplo de DNA, na qual as extremidades da quebra de filamento duplo são ligadas sem homologia extensa. O reparo clássico do NHEJ usa vários fatores, incluindo heterodímero DNA
KU70/80 (KU), XRCC4, Ligase IV, e subunidade catalítica da proteína quinase de DNA (DNA-PKcs). Alt-NHEJ é outra via para reparar quebras de filamento duplo. Alt-NHEJ usa uma sequência micro-homóloga de 5 a 25 pares de bases durante o alinhamento das extremidades quebradas antes de unir as extremidades quebradas. Alt-NHEJ é amplamente independente do heterodímero KU70/80 (KU), XRCC4, Ligase IV, subunidade catalítica da proteína quinase de DNA (DNA- PKcs), RAD52 e ERCC1. Vide, Bennardo et al., "Alternative-NHEJ is a Mechanistically Distinct Pathway of Mammalian Chromosome Break Repair," PLOS Genetics, 27 de junho de 2008.
[00175] Em algumas modalidades, os métodos para inibir ou suprimir o reparo mediado por NHEJ de uma quebra de DNA através da via NHEJ em uma ou mais regiões genômicas alvo em uma célula (s) inibindo ou suprimindo a via NHEJ através da administração a uma célula (s) de um sistema de edição genômica e um inibidor de DNA --- PK resultam em maior eficiência na inibição ou supressão do reparo mediado por NHEJ da quebra de DNA em comparação a uma célula (s) que não recebeu um sistema de edição genômica e um inibidor de DNA- PK, ou em comparação a uma condição em que uma célula (s) recebe um sistema de edição genômica e não um inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, a eficiência aumentada de inibir ou suprimir o reparo de uma quebra de DNA através da via NHEJ contatando uma célula (s) com um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma é de aproximadamente 1, 2, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, em comparação a uma condição na qual um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma não são administrados a uma célula (s) ou em comparação a uma condição na qual apenas um sistema de edição de genoma e não um inibidor de DNA-PK é administrado a uma célula (s). A eficiência que inibe ou suprime o reparo de uma quebra de DNA pela via NHEJ pode ser medida por qualquer método conhecido na área, por exemplo, determinando a frequência da integração de polinucleotídeos direcionados ou medindo a frequência da mutagênese direcionada.
[00176] Em algumas modalidades, os métodos para inibir ou suprimir o reparo mediado por NHEJ de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas alvo em uma célula (s), inibindo ou suprimindo a via NHEJ pela administração a uma célula (s) de um sistema de edição genômica e um inibidor de DNA-PK resultam em maior sobrevivência celular em comparação a condições em que um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK não foram contatados ou administrados a uma célula ou em comparação a condições em que apenas um sistema de edição de gene é contatado ou administrado em uma célula (s) e não em um inibidor de DNA-PK.
[00177] A quebra de DNA pode ser uma quebra de filamento duplo (DSB) ou duas quebras de filamento simples (por exemplo, dois nicks de DNA). A DSB pode ser terminada sem corte ou ter uma saliência 5' ou 3'; se os filamentos estiverem separados demais, as saliências continuarão a se unir e existirão tais como dois nicks, não uma DSB.
[00178] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos métodos para modificar a expressão de um ou mais genes (um gene (s) alvo) e/ou proteínas correspondentes ou a jusante, administrando a uma célula (s) um sistema de edição de genoma e um Inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma pode criar, por exemplo, inserções, deleções, substituições, modificações ou interrupções em uma região genômica alvo de um gene alvo da célula (s), resultando na expressão modificada do gene (s) alvo. Em algumas modalidades, a inserção, deleções, substituição, modificação ou interrupção podem resultar na expressão direcionada de uma proteína específica, ou grupo de proteínas, ou proteínas a jusante. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma pode criar inserções, deleções ou substituições em regiões não codificantes ou regiões codificantes. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma pode criar inserções, deleções, substituições, modificações ou interrupções em uma região promotora, região potenciadora e/ou qualquer outro elemento regulador de gene, incluindo um éxon, um íntron, um sítio de início de transcrição, uma região silenciadora, uma região isolante, um antirrepressor, um elemento regulador pós- tradução, um sinal de poliadenilação (por exemplo, poli A mínimo), uma região conservada, um sítio de ligação ao fator de transcrição ou quaisquer combinações dos mesmos. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma pode criar inserções, deleções, substituições, modificações ou interrupções em mais de uma região alvo, simultânea ou sequencialmente. Em algumas modalidades, a administração a uma célula com um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK pode permitir a expressão de genes modificados direcionados na célula (s). Essa expressão gênica modificada direcionada pode levar à expressão de proteínas específicas e proteínas a jusante.
[00179] Em algumas modalidades, a expressão de um gene e/ou proteína a jusante é aumentada em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1, 1,5 vez, duas vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, 5 vezes ou 10 vezes em comparação a uma condição na qual um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma não é administrado a uma célula ou é comparado a uma condição na qual apenas um sistema de edição de genoma e não um inibidor de DNA-PK é administrado a uma célula.
[00180] Em algumas modalidades, a expressão gênica de um gene e/ou proteína a jusante diminui em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em comparação a uma condição na qual um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma não são administrados a uma célula ou em comparação a uma condição na qual apenas um sistema de edição de genoma e não um inibidor de DNA-PK é administrado a uma célula (s).
[00181] A célula dos métodos aqui mencionados pode ser qualquer célula. Em algumas modalidades, a célula é uma célula vertebrada. Em algumas modalidades, a célula vertebrada é uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula vertebrada é uma célula humana.
[00182] A célula pode ser qualquer tipo de célula em qualquer estágio do desenvolvimento. Em algumas modalidades, a célula pode ser uma célula diferenciada, uma célula tronco totipotente, uma célula tronco pluripotente, uma célula tronco embrionária, uma célula germinativa embrionária, uma célula tronco adulta, uma célula precursora, uma célula tronco pluripotente induzida ou qualquer combinação das mesmas. Uma célula diferenciada é uma célula especializada que desempenha uma função específica em um tecido. Uma célula tronco totipotente é uma célula indiferenciada de um embrião, feto ou adulto que pode se dividir por períodos prolongados e tem a capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de célula de qualquer uma das três camadas germinativas de um organismo. Uma célula tronco pluripotente é uma célula indiferenciada de um embrião, feto ou adulto que pode se dividir por períodos prolongados e tem a capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de célula de um organismo, exceto tecido extraembrionário ou placenta. Uma célula tronco embrionária é uma célula tronco indiferenciada que é encontrada na massa celular interna de um embrião e tem a capacidade de se diferenciar em qualquer tipo de célula de qualquer uma das três camadas germinativas. Uma célula germinativa embrionária é uma célula embrionária que pode dar origem a células reprodutivas, tais como espermatozóides ou óvulos. Uma célula tronco adulta é uma célula indiferenciada encontrada em tecido diferenciado, capaz de se autorrenovar e pode se diferenciar em qualquer uma das células do tecido em que reside. Uma célula precursora ou progenitora é uma célula parcialmente diferenciada que tipicamente só pode se diferenciar em um tipo de célula (por exemplo, uma célula unipotente). Uma célula tronco pluripotente induzida é um tipo de célula tronco pluripotente que é gerada a partir de uma célula adulta diferenciada ou parcialmente diferenciada. Vide, por exemplo, WO/2010/017562.
[00183] Conforme usado neste documento, a forma singular "a", "o", "um" e "uma" incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo suas misturas. Por exemplo, "uma ou mais células" e "uma célula (s)" são usadas aqui de forma intercambiável. Da mesma forma, "uma ou mais regiões genômicas alvo" e "uma região (s) genômica alvo" são aqui utilizadas indiferentemente.
[00184] Os termos "aproximadamente" e "cerca de" são usados aqui de forma intercambiável. O termo "aproximadamente" ou "cerca de", aplicado a um ou mais valores de interesse, refere-se a um valor similar a um valor de referência indicado. Em certas modalidades, o termo "aproximadamente" ou "cerca de" refere-se a uma faixa de valores que se enquadra em 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou menos em qualquer direção (maior ou menor que) do valor de referência indicado, salvo indicação em contrário ou evidente do contexto (exceto quando esse número exceder 100% de um valor possível).
[00185] Os termos "polinucleotídeo", "nucleotídeo", "sequência de nucleotídeo", "ácido nucleico" e "oligonucleotídeo" são usados de forma intercambiável. Referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxirribonucleotídeos (DNA) ou ribonucleotídeos (RNA), ou seus análogos. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tridimensional e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. A seguir, são apresentados exemplos não limitativos de polinucleotídeos: regiões codificadoras ou não codificantes de um gene ou fragmento de gene, loci (locus) definidos a partir da análise de ligação, éxons, íntrons, RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência, RNA ribossômico, RNA interferentes curtos (siRNA), RNA de gancho curto (shRNA), micro-RNA (miRNA), ribozimas, cDNA, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, RNA isolado de qualquer sequência, sondas de ácido nucleico, e iniciadores. Um polinucleotídeo pode compreender um ou mais nucleotídeos modificados, tais como nucleotídeos metilados e análogos de nucleotídeos. Se presentes, modificações na estrutura nucleotídica podem ser transmitidas antes ou após a montagem do polímero. A sequência de nucleotídeo pode ser interrompida por componentes não nucleotídeos. Um polinucleotídeo pode ser modificado adicionalmente após polimerização, tal como por conjugação com um componente de marcação. O termo "ssDNA" significa uma molécula de DNA de filamento simples. O termo "ssODN" significa oligodesoxinucleotídeos de cadeia simples.
[00186] O termo "nucleotídeos de ocorrência natural" referido neste documento inclui desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos. O termo "nucleotídeos modificados" aqui referido inclui nucleotídeos com grupos de açúcar modificados ou substituídos e similares. O termo "ligações de oligonucleotídeos" aqui referido inclui ligações de oligonucleotídeos, tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforosselerloato, fosforodiselenoato, fosforananotioato, fosforaniladato, fosforonmidato e similares. Um oligonucleotídeo pode incluir um marcador para detecção, se desejado.
[00187] O termo "RNA sintético" refere-se ao RNA que é manipulado geneticamente ou que não ocorre naturalmente.
[00188] Como aqui utilizado, o termo "tipo selvagem" é um termo da técnica compreendido por pessoas versadas e significa a forma típica de um organismo, cepa, gene ou característica, uma vez que ocorre na natureza tais como distinto das formas mutantes ou variantes.
[00189] Os termos "ocorrência não natural" ou "manipulados geneticamente" são usados de forma intercambiável e indicam o envolvimento da mão do homem. Os termos, quando se referem a moléculas de ácido nucleico ou polipeptídeos, significam que a molécula de ácido nucleico ou o polipeptídeo está pelo menos substancialmente livre de pelo menos um outro componente com o qual eles estão naturalmente associados à natureza e tais como encontrados na natureza.
[00190] "Complementaridade" refere-se à capacidade de um ácido nucleico para formar ligações de hidrogênio com outro ácido nucleico pelo tradicional Watson-Crick ou por outros tipos não tradicionais. Uma complementaridade percentual indica a porcentagem de resíduos em uma molécula de ácido nucleico que pode formar ligações de hidrogênio (por exemplo, emparelhamento de bases Watson-Crick) com uma segunda sequência de ácido nucleico (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10 em 10 sendo 50%, 60%, 70%, 80%, 90% e 100% complementares). "Perfeitamente complementar" significa que todos os resíduos contíguos de uma sequência de ácido nucleico se ligarão ao hidrogênio com o mesmo número de resíduos contíguos em uma segunda sequência de ácido nucleico. "Substancialmente complementar", conforme usado aqui, refere-se a um grau de complementaridade que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%. 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% em uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais nucleotídeos, ou refere-se a dois ácidos nucleicos que hibridizam sob condições rigorosas.
[00191] Como usado aqui, "expressão" refere-se ao processo pelo qual um polinucleotídeo é transcrito a partir de um modelo de DNA (como em mRNA ou outro transcrito de RNA) e/ou o processo pelo qual um mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. Transcritos e polipeptídeos codificados podem ser coletivamente referidos como "produto genético". Se o polinucleotídeo for derivado do DNA genômico, a expressão pode incluir a emenda do mRNA em uma célula eucariótica.
[00192] Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína" são usados aqui de forma intercambiável para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácido que foi modificado; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação, tais como conjugação com um componente de marcação. Como usado aqui, o termo "aminoácido" inclui aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e os isômeros ópticos D ou L, e análogos de aminoácidos e peptidomiméticos.
[00193] Um "vetor viral" é definido tal como um vírus produzido por recombinação ou partícula viral que compreende um polinucleotídeo a ser entregue em uma célula hospedeira, in vivo, ex vivo ou in vitro. Exemplos de vetores virais incluem vetores retrovirais, vetores adenovirais, vetores de vírus adenoassociados, vetores adenovirais, vetores lentivirais, vetores virais de herpes simplex e vetores virais quiméricos e similares. Em algumas modalidades em que a transferência de genes é mediada por um vetor retroviral, um construto de vetor refere-se ao polinucleotídeo que compreende o genoma retroviral ou parte dele.
[00194] Algumas modalidades da descrição referem-se a sistemas de vetores compreendendo um ou mais vetores, ou vetores como tais. Os vetores podem ser projetados para expressão de transcrições de CRISPR (por exemplo, transcrições de ácidos nucleicos, proteínas ou enzimas) em células procarióticas ou eucarióticas. Por exemplo, transcrições de CRISPR podem ser expressas em células bacterianas tais como Escherichia coli, células de inseto (usando vetores de expressão de baculovírus), células de levedura ou células de mamífero.
[00195] As células podem ser células primárias, células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), células tronco embrionárias (hESCs), células tronco adultas, células progenitoras ou linhagens celulares. "Células primárias" são células retiradas diretamente do tecido vivo e colocadas in vitro para crescimento. As células primárias têm poucas duplicações populacionais e uma vida útil finita para duplicações populacionais in vitro. "Células tronco", "células tronco embrionárias" e "células tronco pluripotentes induzidas" são células não especializadas e indiferenciadas, capazes de se autorrenovar e com potencial para se diferenciar em células de diferentes tipos com função especializada. "Linhagens celulares" incluem culturas celulares derivadas de um tipo de célula ou de um conjunto de células do mesmo tipo que podem proliferar indefinidamente. Exemplos não limitativos de linhagens celulares de mamíferos podem incluir células CD34, células 293, células HEK, células CHO, células BHK, células CV-1, células Jurkat, células HeLa ou quaisquer variantes das mesmas.
[00196] Em algumas modalidades, um vetor é capaz de direcionar a expressão de uma ou mais sequências em células de mamíferos usando um vetor de expressão em mamíferos. Exemplos de vetores de expressão em mamíferos incluem pCDM8 e pMT2PC. Quando utilizadas em células de mamíferos, as funções de controle do vetor de expressão são normalmente fornecidas por um ou mais elementos reguladores. Por exemplo, os promotores comumente usados são derivados de polioma, adenovírus 2, citomegalovírus, vírus símio 40 e outros descritos aqui e conhecidos na área. Outros promotores podem incluir, por exemplo, promotor EF1 ou promotor EF1 alfa. Para outros sistemas de expressão adequados para células procarióticas e eucarióticas, vide, por exemplo, os capítulos 16 e 17 de Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2 a ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989.
[00197] Conforme usado neste documento, os termos "marcador" ou "marcado" se referem à incorporação de um marcador detectável, por exemplo, pela incorporação de um aminoácido radiomarcado ou ligação a um polipeptídeo de porções biotinila que podem ser detectadas pela avidina marcada (por exemplo, estreptavidina contendo um marcador fluorescente ou atividade enzimática que pode ser detectada por métodos ópticos ou calorimétricos). Em certas situações, o rótulo ou marcador também pode ser terapêutico. Vários métodos de marcação de polipeptídeos e glicoproteínas são conhecidos na área e podem ser utilizados. Exemplos de rótulos para polipeptídeos incluem, entre outros, radioisótopos ou radionuclídeos (por exemplo, 3H, 14C, 15 N, 35N, 35 90 99 111 125 131 S, Y, Tc, In, I, I), rótulos fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantanídeos), rótulos enzimáticos (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, p-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), grupos quimioluminescentes, biotinila, epítopos polipeptídicos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, sequências de pares de zíperes de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação de metal, marcadores de epítopo). Em algumas modalidades, os rótulos são fixados por braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir o impedimento potencial estérico. O termo "agente farmacêutico ou droga", conforme aqui utilizado, refere-se a um composto ou composição química capaz de induzir um efeito terapêutico desejado quando administrado adequadamente a um paciente.
[00198] Como usado aqui, "substancialmente puro" significa que uma espécie de objeto é a espécie predominante presente (isto é, em uma base molar é mais abundante do que qualquer outra espécie individual na composição). Em algumas modalidades, uma porção substancialmente purificada é uma composição em que as espécies objetos compreendem pelo menos cerca de 50% (em base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes.
[00199] Geralmente, uma composição substancialmente pura compreenderá mais de cerca de 80% de todas as espécies macromoleculares presentes na composição. Em algumas modalidades, uma composição substancialmente pura compreenderá mais de cerca de 85%, 90%, 95% e 99% de todas as espécies macromoleculares presentes na composição. Em algumas modalidades, a espécie objeto é purificada para homogeneidade essencial (espécies contaminantes não são detectadas na composição por métodos de detecção convencionais), em que a composição consiste essencialmente em uma única espécie macromolecular. Sistema de Edição de Genoma
[00200] Vários tipos de sistemas de manipulação genética de genoma podem ser usados. Os termos "sistema de edição de genoma", "sistema de edição de gene" e similares, são usados de forma intercambiável neste documento e se referem a um sistema ou tecnologia que edita um gene alvo ou a função ou expressão do mesmo. Um sistema de edição de genoma compreende: pelo menos um componente de endonuclease, permitindo a clivagem de uma região (s) genômica alvo (ou sequência (s) alvo); e pelo menos um elemento de direcionamento de genoma que traz ou direciona o componente de endonuclease a uma região (s) genômica. Exemplos de elemento de direcionamento do genoma incluem um domínio de ligação ao DNA (por exemplo, proteína de ligação ao DNA do dedo de zinco ou um domínio de ligação ao DNA TALE), elementos de RNA guia (por exemplo, RNA guia de CRISPR) e elementos de DNA guia (por exemplo, DNA guia de NgAgo). Os elementos programáveis de direcionamento de genoma e endonuclease permitem a edição precisa do genoma, introduzindo quebras de DNA, tais como quebras de filamento duplo (DSBs) em locais genômicos específicos. As DSBs subsequentemente recrutam máquinas de reparo endógenas para união final não homóloga (NHEJ) ou reparo dirigido por homologia (HDR) ao sítio da DSB para mediar a edição do genoma. O "componente de endonuclease" compreende uma endonuclease ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica essa endonuclease.
[00201] O termo "endonuclease" refere-se a qualquer enzima de tipo selvagem, mutante, variante ou manipulada capaz de catalisar a hidrólise (clivagem) de uma ligação entre ácidos nucleicos dentro de uma molécula de DNA ou RNA. As endonucleases podem reconhecer e clivar uma molécula de DNA ou RNA em suas regiões genômicas alvo. Exemplos de endonucleases incluem uma endonuclease de homing; enzima de restrição tais como FokI; uma nuclease quimérica de dedo de zinco (ZFN) resultante da fusão de domínios de dedo de zinco manipulados com o domínio catalítico de uma enzima de restrição tais como FokI; Enzimas Cas e enzimas Cpf. Endonucleases químicas nas quais um cutelo químico ou peptídico é conjugado a um polímero de ácidos nucleicos ou a outro DNA que reconhece uma sequência alvo específica, direcionando assim a atividade de clivagem a uma sequência específica, estão compreendidas no termo "endonuclease". Exemplos de endonucleases químicas incluem nucleases sintéticas tais como conjugados de ortofenantrolina, uma molécula de clivagem de DNA e oligonucleotídeos formadores de tríplex (TFOs).
[00202] Por "variante", entende-se uma proteína recombinante obtida pela substituição de pelo menos um resíduo na sequência de aminoácidos da proteína original por um aminoácido diferente.
[00203] Em algumas modalidades, endonucleases tais como ZFNs, TALENs e/ou meganucleases compreendem um domínio de clivagem e/ou semidomínio de clivagem. O domínio de clivagem pode ser homólogo ou heterólogo ao domínio de ligação ao DNA. Por exemplo, um domínio de ligação ao DNA do dedo de zinco e um domínio de clivagem de uma nuclease ou um domínio de ligação ao DNA de meganuclease e um domínio de clivagem de uma nuclease diferente podem ser usados. Domínios de clivagem heterólogos podem ser obtidos a partir de qualquer endonuclease ou exonuclease. Endonucleases exemplares a partir das quais um domínio de clivagem pode ser derivado incluem, mas não estão limitadas a, endonucleases de restrição e endonucleases de homing. Vide, por exemplo, WO2013/130824. As enzimas adicionais que clivam o DNA são conhecidas (por exemplo, Nuclease S1; nuclease de feijão mungo; DNase I pancreática; nuclease microcócica; endonuclease HO de levedura; vide também Linn et al. (Eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Uma ou mais dessas enzimas (ou fragmentos funcionais das mesmas) podem ser usadas tais como fonte de domínios de clivagem e semidomínios de clivagem.
[00204] Um semidomínio de clivagem pode ser derivado de qualquer nuclease ou porção da mesma, tal como estabelecido acima, que requer dimerização para a atividade de clivagem. Em algumas modalidades, são necessárias duas proteínas de fusão para a clivagem se as proteínas de fusão compreenderem semidomínios de clivagem. Em algumas modalidades, uma única proteína compreendendo dois semidomínios de clivagem pode ser usada. Em algumas modalidades, os dois semidomínios de clivagem podem ser derivados da mesma endonuclease (ou fragmentos funcionais da mesma). Em algumas modalidades, cada semidomínio de clivagem pode ser derivado de uma endonuclease diferente (ou fragmentos funcionais da mesma). Além disso, os sítios alvo para as duas proteínas de fusão são preferivelmente dispostos, um em relação ao outro, de modo que a ligação das duas proteínas de fusão aos seus respectivos sítios alvo coloca os semidomínios de clivagem em uma orientação espacial um para o outro, permitindo que os semidomínios de clivagem formem um domínio de clivagem funcional, por exemplo, por dimerização. Assim, em certas modalidades, as bordas próximas dos sítios alvo são separadas por 5- 50 nucleotídeos, 5-8 nucleotídeos ou por 15-18 nucleotídeos. Note-se que qualquer número integral de nucleotídeos ou pares de nucleotídeos pode intervir entre dois sítios alvo (por exemplo, de 2 a 50 pares de nucleotídeos ou mais). Em algumas modalidades, o sítio de clivagem fica entre os sítios alvo.
[00205] As endonucleases de restrição (enzimas de restrição) estão presentes em muitas espécies e são capazes de ligação específica a sequências de DNA (em um sítio de reconhecimento) e clivagem de DNA no local ou próximo ao sítio de ligação. Certas enzimas de restrição (por exemplo, Tipo IIS) clivam o DNA em sítios removidos do sítio de reconhecimento e têm domínios de ligação e clivagem separáveis. Por exemplo, a enzima Tipo IIS Fok I catalisa a clivagem do DNA em filamento duplo. Vide, por exemplo, as patentes U.S. 5.356.802;
5.436.150 e 5.487.994; bem como Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764- 2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982
[00206] Em algumas modalidades, o componente de endonuclease compreende uma proteína (s) de fusão que inclui um domínio de clivagem (ou semidomínio de clivagem) de pelo menos uma enzima de restrição Tipo IIS e um ou mais domínios de ligação de dedo de zinco, que podem ou podem não ser projetado. Uma enzima de restrição exemplar do tipo IIS, cujo domínio de clivagem é separável do domínio de ligação, é Fok I. Essa enzima específica é ativa tal como um dímero. Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575. A porção da enzima Fok I usada em tais proteínas de fusão é considerada um semidomínio de clivagem. Assim, para a clivagem de filamento duplo direcionada e/ou substituição direcionada de sequências celulares usando fusões de zinco dedo ou TALE-Fok I, duas proteínas de fusão, cada uma compreendendo um semidomínio de clivagem FokI, podem ser usadas para reconstituir um domínio de clivagem cataliticamente ativo. Alternativamente, uma única molécula polipeptídica contendo um domínio de ligação de dedo de zinco e dois semidomínios de clivagem de Fok I também pode ser utilizada.
[00207] As enzimas de restrição do tipo IIS exemplares são descritas na Publicação Internacional WO 07/014275, aqui incorporada na sua totalidade. Enzimas de restrição adicionais também contêm domínios de ligação e clivagem separáveis, e estes são contemplados pela descrição. Vide, por exemplo, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31: 418-420.
[00208] Em certas modalidades, o domínio de clivagem compreende um ou mais semidomínios de clivagem manipulados (também referidos como mutantes do domínio de dimerização) que minimizam ou impedem a homodimerização, tais como descrito, por exemplo, nas Publicações de Patente U.S. Nºs. 20050064474 e 20060188987 e WO 2013/130824. Exemplos de semidomínios de clivagem manipulados de Fok I que formam heterodímeros obrigatórios incluem um par no qual um primeiro semidomínio de clivagem inclui mutações nos resíduos de aminoácidos nas posições 490 e 538 de Fok I e um segundo semidomínio de clivagem inclui mutações nos resíduos de aminoácido 486 e 499. Vide,
por exemplo, a Publicação de Patente U.S. Nº. 2008/0131962 e 2011/0201055. Os semidomínios de clivagem manipulados aqui descritos podem ser preparados usando qualquer método adequado, por exemplo, por mutagênese dirigida a sítio de semidomínios de clivagem de tipo selvagem (Fok I), tais como descrito nas Publicações de Patente U.S. Nºs. 20050064474 e 20080131962.
[00209] O termo "editar", "edita", "edição" e similares se referem a qualquer tipo de manipulação genética, alteração, modificação ou modulação (em cada caso que inclui, mas não se limita a, por meio de knockout genético, marcação de genes, interrupção de genes, mutação de genes, inserção de genes, exclusão de genes, ativação de genes, silenciamento de genes ou knock-in de genes).
[00210] Conforme usado neste documento, "modificação genética", "edição de genoma", "modificação de genoma", "modificação de gene" e "edição de gene", referem-se a qualquer adição, exclusão, knockout, knockin, marcação, mutação, ativação, silenciamento, modificação e/ou interrupção de genes para os nucleotídeos de uma célula. A célula neste contexto pode ser in vitro, in vivo ou ex vivo.
[00211] Por "região genômica alvo", "gene alvo", "alvo de DNA", "sequência alvo de DNA", "sequência alvo", "sequência de nucleotídeo alvo", "sítio alvo", "alvo", "sítio de interesse", "sítio de reconhecimento", "sítio de reconhecimento de polinucleotídeo", "sequência de reconhecimento", "sítio de clivagem" pretende significar uma sequência de polinucleotídeo que é reconhecida e clivada por um sistema de edição de genoma. Estes termos referem-se a uma localização distinta do DNA, preferivelmente uma localização genômica, na qual uma quebra de DNA (clivagem) deve ser induzida pelo sistema de edição do genoma.
[00212] A edição acima mencionada, incluindo manipulação, alteração, modificação e modulação, pode ocorrer simultânea ou sequencialmente. Qualquer sistema de edição de genoma conhecido na área pode ser usado. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é um sistema baseado em meganuclease, um sistema baseado em nuclease de dedo de zinco (ZFN), um sistema baseado em Nuclease baseada em Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALEN), um sistema baseado em CRISPR, ou sistema baseado em NgAgo.
[00213] Baseado em meganuclease, baseado em ZFN e baseado em TALEN, cada um compreende pelo menos um domínio de ligação a DNA ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência (s) de ácido nucleico que codifica o domínio de ligação a DNA e obtém direcionamento ou reconhecimento específico de uma região (s) genômica alvo através de interações proteína-DNA. Um sistema baseado em CRISPR compreende pelo menos um elemento de RNA guia ou um ácido nucleico que compreende uma sequência de ácidos nucleicos que codificam o elemento de RNA guia e alcança direcionamento ou reconhecimento específico de uma região genômica alvo via pares de bases diretamente com o DNA da região (s) genômica alvo. Um sistema baseado em NgAgo compreende pelo menos um elemento de DNA guia ou um ácido nucleico que compreende uma sequência (s) de ácido nucleico que codifica o elemento guia de DNA e atinge direcionamento ou reconhecimento específico de uma região genômica alvo por pares de bases diretamente com o DNA da região (s) genômica alvo.
[00214] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é um sistema baseado em meganuclease. Um sistema baseado em meganucleases emprega meganucleases que são endonucleases com grandes sítios de reconhecimento (> 14pb), e seus domínios de ligação ao DNA também são responsáveis pela clivagem das sequências alvo. O domínio de ligação ao DNA das meganucleases pode ter uma sequência alvo de DNA de filamento duplo de 12 a 45 pb. Em algumas modalidades, a meganuclease é uma enzima dimérica, em que cada domínio de meganuclease está em um monômero ou uma enzima monomérica compreendendo os dois domínios em um único polipeptídeo. Não apenas as meganucleases de tipo selvagem, mas também várias variantes de meganucleases foram geradas pela manipulação de proteínas para cobrir uma miríade de combinações únicas de sequências. Em algumas modalidades, meganucleases quiméricas com um sítio de reconhecimento composto por um semissítio de meganuclease A e um semissítio de proteína B também podem ser usadas. Exemplos específicos de tais meganucleases quiméricas compreendendo os domínios proteicos de I-DmoI e I-CreI. Exemplos de meganucleases incluem endonucleases de homing da família LAGLIDADG.
[00215] A meganuclease LAGLIDADG pode ser I-SceI, I-ChuI, I-CreI, I-CsmI, PI-SceI, PI-TliI, PI-MtuI, I-CeuI, I-SceII, I-SceIII, HO, PI-CivI, PI- CtrI, PI-AaeI, PI-BsuI, PI-DhaI, PI-DraI, PI-MavI, PI-MchI, PI-MfuI, PI- MflI, PI-MgaI, PI-MgoI, PI- MinI, PI-MkaI, PI-MleI, PI-MmaI, PI-MshI, PI- MsmI, PI-MthI, PI-MtuI, PI-MxeI, PI-NpuI, PI-PfuI, PI-RmaI, PI-SpbI, PI- SspI, PI-FacI, PI-MjaI, PI-PhoI, PI-TagI, PI-ThyI, PI-TkoI, PI-TspI ou I- MsoI; ou pode ser um mutante funcional ou uma variante do mesmo, seja homodimérico, heterodimérico ou monomérico. Em algumas modalidades, a meganuclease LAGLIDADG é um derivado de I-CreI. Em algumas modalidades, a meganuclease LAGLIDADG compartilha pelo menos 80% de similaridade com a meganuclease LAGLIDADG de I-CreI natural. Em algumas modalidades, a meganuclease LAGLIDADG compartilha pelo menos 80% de similaridade com os resíduos 1-152 da meganuclease LAGLIDADG de I-CreI natural. Em algumas modalidades, a meganuclease LAGLIDADG pode consistir em dois monômeros que compartilham pelo menos 80% de similaridade com os resíduos 1-152 da meganuclease LAGLIDADG de I-CreI natural ligados entre si, com ou sem um peptídeo de ligação.
[00216] A "meganuclease LAGLIDADG" refere-se a uma endonuclease de homing da família LAGLIDADG, conforme definido em
Stoddard et al (Stoddard, 2005), ou uma variante manipulada que compreende um polipeptídeo que compartilha pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 97,5%, 99% ou mais de identidade ou semelhança com a referida endonuclease de homing natural. Tais meganucleases LAGLIDADG manipuladas podem ser derivadas de meganucleases monoméricas ou diméricas. Quando derivadas de meganucleases diméricas, essas meganucleases LAGLIDADG manipuladas podem ser endonucleases de cadeia única ou diméricas.
[00217] Por "I-CreI" entende-se a meganuclease de I-CreI natural de tipo selvagem tendo a sequência do código de acesso pdb 1g9y.
[00218] As funções de reconhecimento e clivagem de DNA de meganucleases são geralmente entrelaçadas em um único domínio. Diferentemente das meganulceases, os domínios de ligação ao DNA dos sistemas baseados em ZFN e TALEN são distintos dos da endonuclease para a função de clivagem. O sistema baseado em ZFN compreende: pelo menos uma proteína de dedo de zinco ou uma variante da mesma, ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a proteína mais fina de zinco ou variante da mesma como seu domínio de ligação ao DNA; e um elemento de endonuclease, tal como nuclease de dedo de zinco (ZFN) ou domínio de clivagem de Fok1. A proteína de dedo de zinco (ZFP) não ocorre naturalmente, pois é projetada para se ligar a um sítio alvo de sua escolha. Vide, por exemplo, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20: 135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct Biol. 10:411-416; Patente U.S. Nos. 6.453.242; 6.534.261; 6.599.692;
6.503.717; 6.689.558; 7.030.215; 6.794.136; 7.067.317; 7.262.054;
7.070.934; 7.361.635; 7.253.273; e Publicação de Patente U.S. Nºs. 2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.
[00219] Um domínio de ligação de dedo de zinco manipulado pode ter uma nova especificidade de ligação, em comparação a uma proteína de dedo de zinco de ocorrência natural. Os métodos de manipulação incluem, entre outros, projeto racional e vários tipos de seleção. O projeto racional inclui, por exemplo, o uso de bancos de dados compreendendo sequências de nucleotídeos tripletos (ou quadrupletos) e sequências individuais de aminoácidos de dedo de zinco, nas quais cada sequência de nucleotídeo tripletos ou quadrupletos está associada a uma ou mais sequências de aminoácidos de dedos de zinco que se ligam à sequência de tripleto específico ou de quadrupleto. Vide, por exemplo, as patentes U.S. 6.453.242 e 6.534.261, incorporadas por referência aqui na sua totalidade.
[00220] Vários tipos de métodos de seleção podem ser usados com os métodos aqui. Métodos de seleção exemplares, incluindo exibição de fagos e sistemas de dois híbridos, são descritos nas Patentes US
5.789.538; 5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.410.248; 6.140.466;
6.200.759; e 6.242.568; bem como WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 e GB 2.338.237. Além disso, o aprimoramento da especificidade de ligação para domínios de ligação de dedo de zinco foi descrito, por exemplo, no documento WO 02/077227. Além disso, conforme descrito nestas e outras referências, os domínios de dedo de zinco e/ou proteínas de dedo de zinco multidedos podem ser ligados entre si usando quaisquer sequências ligantes adequadas, incluindo, por exemplo, ligantes de 5 ou mais aminoácidos de comprimento. Vide também as Patentes U.S. Nºs. 6.479.626; 6.903.185; e 7.153.949 para sequências ligantes exemplares de 6 ou mais aminoácidos de comprimento. As proteínas aqui descritas podem incluir qualquer combinação de ligantes adequados entre os dedos de zinco individuais da proteína. Seleção de sítios alvo; ZFPs e métodos para o projeto e construção de proteínas de fusão (e polinucleotídeos que as codificam)
são conhecidos dos especialistas na técnica e descritos em detalhes nas Patentes U.S. Nºs. 6.140.0815; 789.538; 6.453.242; 6.534.261;
5.925.523; 6.007.988; 6.013.453; 6.200.759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496.
[00221] Além disso, conforme descrito nestas e em outras referências, os domínios de dedos de zinco e/ou proteínas de dedos de zinco multidedos podem ser ligados entre si usando quaisquer sequências de ligação adequadas, incluindo, por exemplo, ligantes de 5 ou mais aminoácidos de comprimento. Vide também as Patentes U.S. Nºs. 6.479.626; 6.903.185; e 7.153.949 para sequências ligantes exemplares de 6 ou mais aminoácidos de comprimento. As proteínas aqui descritas podem incluir qualquer combinação de ligantes adequados entre os dedos de zinco individuais da proteína.
[00222] Um sistema de Nuclease Baseado em Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALEN) refere-se a um sistema de edição de genoma que emprega um ou mais domínio de ligação ao DNA de Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALE) e um elemento de endonuclease, tal como o domínio de clivagem Fok1. O domínio de ligação a TALE-DNA compreende uma ou mais unidades de repetição TALE, cada uma tendo 30-38 (como 31, 32, 33, 34, 35 ou 36) aminoácidos de comprimento. O domínio de ligação a TALE-DNA pode empregar uma proteína TALE de comprimento total ou fragmento da mesma, ou uma variante da mesma. O domínio de ligação a TALE- DNA pode ser fundido ou ligado ao domínio da endonuclease por um ligante.
[00223] Os termos "sistema baseado em CRISPR", "sistema de edição de gene baseado em CRISPR", "edição de genoma CRISPR", "edição de gene CRISPR", "edição de genoma baseado em endonuclease CRISPR" e similares são usados de forma intercambiável aqui, e coletivamente se referem a um sistema de edição de genoma que compreende um ou mais elementos de RNA guias; e um ou mais elementos de endonuclease guiados por RNA. O elemento de RNA guia compreende um RNA direcionador compreendendo uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo nas uma ou mais regiões genômicas alvo ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência (s) de nucleotídeo que codifica o RNA direcionador. O elemento de endonuclease guiado por RNA compreende uma endonuclease que é guiada ou trazida para uma região genômica alvo por um elemento de RNA guia; ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica essa endonuclease. Exemplos desse sistema de edição de gene baseado em CRISPR incluem sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas ou um sistema CRISPR-Cpf.
[00224] Como usado aqui, os termos "elemento RNA guia", "RNA guia", "gRNA", "molécula de gRNA" e "RNA guia sintético" são usados de forma intercambiável e referem-se à sequência polinucleotídica que compreende um RNA direcionador que hibridiza com uma sequência nucleica alvo ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência (s) de nucleotídeos que codificam o RNA alvo. Um RNA direcionador do gRNA compreende um domínio de direcionamento que inclui uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar à sequência de nucleotídeo em uma região genômica alvo. A frase "substancialmente complementar" significa um grau de complementaridade que é pelo menos 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%. 95%, 97%, 98%, 99% ou 100% em uma região de 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais nucleotídeos, ou refere-se a dois ácidos nucleicos que hibridizam sob condições rigorosas.
[00225] Um elemento de RNA guia pode ainda compreender um RNA ativador que é capaz de hibridizar com o RNA direcionador ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica o RNA ativador. O RNA ativador e o RNA alvo podem ser separados ou fundidos tal como um único ácido nucleico através de uma sequência de loop de ligação para formar uma única molécula de gRNA. Uma molécula de gRNA pode compreender um número de domínios. Por exemplo, esse gRNA compreende, por exemplo, de 5' a 3': um domínio de direcionamento (que é complementar a um ácido nucleico alvo); um primeiro domínio de complementaridade; um domínio de ligação; um segundo domínio de complementaridade (que é complementar ao primeiro domínio de complementaridade); um domínio proximal; e um opcional, um domínio de cauda. Vide WO2015048557.
[00226] Um "primeiro domínio de complementaridade" tem complementaridade substancial com o segundo domínio de complementaridade e pode formar uma região dúplex sob pelo menos algumas condições fisiológicas.
[00227] Um "domínio de ligação" serve para vincular o primeiro domínio de complementaridade com o segundo domínio de complementaridade de um gRNA unimolecular. O domínio de ligação pode ligar o primeiro e o segundo domínios de complementaridade de forma covalente ou não covalente.
[00228] Um "domínio proximal" pode ter 3-25 nucleotídeos de comprimento ou 5-20 nucleotídeos de comprimento. O domínio proximal pode compartilhar homologia ou ser derivado de um domínio proximal de ocorrência natural.
[00229] Um "domínio de cauda" pode estar ausente ou ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos de comprimento. O domínio da cauda pode incluir sequências que são complementares entre si e que, em pelo menos algumas condições fisiológicas, formam uma região dúplex.
[00230] O elemento RNA guia pode formar um complexo com uma endonuclease do elemento guiado por RNA, tal como a endonuclease Cas ("complexo de gRNA/nuclease"). Um exemplo de complexo gRNA/nuclease é um complexo CRISPR tal como descrito abaixo em relação a um sistema baseado em CRISR. Em algumas modalidades, o complexo CRISPR compreende uma endonuclease do sistema de endonuclease guiada por RNA que é complexado com o RNA direcionador. Em algumas modalidades, o complexo CRISPR compreende uma endonuclease do sistema de endonuclease guiada por RNA que é complexado com o RNA direcionador e o RNA ativador.
[00231] O domínio de direcionamento do RNA direcionador promove direcionamento ou homing específico de um complexo de gRNA/nuclease a uma sequência de nucleotídeo alvo. Em algumas modalidades, o domínio de direcionamento pode ser de 10 a 30 pb, tais como 15 a 25 pb, 18 a 22 pb ou 20 pb.
[00232] Os métodos para projetar gRNAs são conhecidos na área, incluindo métodos para selecionar, projetar e validar o domínio alvo. Vide, por exemplo, WO2015048577, Mali et al., 2013 SCIENCE 339(6121): 823-826; Hsu et al., 2013 NATBIOTECHNOL, 31(9): 827-32; Fu et al., 2014 NATBTOTECHNOL, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574; Heigwer et al., 2014 NAT METHODS 11 (2): 122-3. doi: l 0.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216; Bae et al., 2014 BIOTNFORMATICS PubMed PMID: 24463181; Xiao A et al., 2014 BIOINFORMATICS Pub Med PMID: 24389662.
[00233] Em algumas modalidades, endonucleases guiadas por RNA, tal como uma enzima ou proteína Cas (por exemplo, proteína Cas9 tipo II) ou enzima ou proteína Cpf (por exemplo, proteína Cpf1) podem ser usadas. Em algumas modalidades, uma versão modificada dessa enzima ou proteína Cas ou Cpf também pode ser usada.
[00234] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas. O sistema CRISPR-Cas compreende: (a) pelo menos um elemento de RNA guia ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica o elemento de RNA guia, o elemento de RNA guia compreendendo um RNA direcionador que inclui uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo em uma ou mais regiões genômicas alvo e um RNA ativador que inclui uma sequência de nucleotídeo capaz de hibridizar com o RNA direcionador; e (b) um elemento de proteína Cas compreendendo uma proteína Cas ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a proteína Cas. O RNA direcionador e os RNAs ativadores podem ser separados ou fundidos em um único RNA.
[00235] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR inclui sistemas CRISPR de Classe 1 e/ou CRISPR de Classe 2. Os sistemas de Classe 1 empregam várias proteínas Cas juntamente com os RNAs CRISPR (crRNA) tais como RNA direcionador para construir uma endonuclease funcional. Os sistemas CRISPR de Classe 2 empregam uma única proteína Cas e um crRNA tal como RNA direcionador. Os sistemas CRISPR de Classe 2, incluindo o sistema baseado em Cas9 do tipo II, compreendem uma proteína Cas única para mediar a clivagem, em vez do complexo de multissubunidades empregue pelos sistemas de Classe 1. O sistema baseado em CRISPR também inclui o sistema CRISPR de Classe II, Tipo V, que emprega uma proteína Cpf1 e um crRNA tal como RNA direcionador.
[00236] A proteína Cas é uma nuclease de duplo filamentada associada a CRISPR (Cas). Em algumas modalidades, o sistema CRISPR-Cas compreende uma proteína Cas9. Em algumas modalidades, a proteína Cas9 é SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 ou D10A nickase. O termo "proteína Cas", tal como a proteína Cas9, inclui a proteína Cas do tipo selvagem ou seus derivados funcionais (como versões truncadas ou variantes da proteína Cas do tipo selvagem com uma atividade de nuclease).
[00237] Em algumas modalidades, proteínas Cas9 de espécies diferentes de S. pyogenes e S. thermophiles podem ser usadas. Outras espécies de proteínas Cas9 podem ser obtidas e utilizadas aqui incluem: Acidovorax avenae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Actinobacillus succinogenes, Actinobacillus suis, Actinomyces sp.,cycliphilus denitrificans, Aminomonas paucivorans, Bacillus cereus; Bacillus smithii, Bacillus thuringiensis, Bacteroides sp., Blastopirellula marina, Bradyrhizobium sp., Brevibacillus laterosporus, Campylobacter coli, Campylobacter jejuni, Campylobacter lari, Candidatus Puniceispirillum, Clostridium cellulolyticum, Clostridium perfingens, Corynebacterium accolens, Corynebacterium dolichum, Corynebacterium matruchotii, Dinoroseobacter shibae, Eubacterium dolichum, gamma proteobacterium, Gluconacetobacter diazotrophicus, Haemoplzilus parainfluenzae, Haemophilus sputorum, Helicobacter canadensis, Helicohacter cinaedi, Helicobacter mustelae, llyobacter polytropus, Kingella kingae, lactobacillus crispatus, listeria ivanovii, listeria monocytogenes, listeriaceae bacterium, Metilocystis sp.,Metilosinus trichosporium, Mobiluncus mulieris, Neisseria bacilliformis, Neisseria cinerea, Neisseria flavescens, Neisseria lactamica, Neisseria sp., Neisseria wadsworthii, Nitrosomonas sp., Parvibaculum lavamentivorans, Pasteurella multocida, Phascolarctobacterium succinatutells, Ralstonia syzygii, Rhodopseudomonas palustris, Rhodovulum sp., Simonsiella muelleri, Sphingomonas sp., Sporolactobacillus vineae, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus sp., Subdoligranulum sp., Tistrella mobilis, Treponema sp., ou Verminephrobacter eiseniae.
[00238] Em algumas modalidades, um ou mais elementos de um sistema baseado em CRISPR são derivados de um sistema CRISPR de tipo I, tipo II ou tipo III
[00239] Em algumas modalidades, um ou mais elementos de um sistema baseado em CRISPR são derivados de um organismo específico que compreende um sistema CRISPR endógeno, tais como Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus, Francisella tularensis, Prevotella sp., Acidaminococcus sp. e Lachnospiraceae sp. Em geral, um sistema baseado em CRISPR é caracterizado por elementos que promovem a formação de um complexo CRISPR nas regiões genômicas alvo ou no sítio de uma sequência alvo (também conhecido tais como protoespaçador no contexto de um sistema CRISPR endógeno). No contexto da formação de um complexo CRISPR, "sequência alvo" refere-se a uma sequência na qual uma sequência guia é projetada para ter complementaridade substancial, onde a hibridização entre uma sequência alvo e uma sequência guia promove a formação de um complexo CRISPR. A complementaridade total não é necessariamente requerida, desde que haja complementaridade suficiente para causar hibridização e promover a formação de um complexo CRISPR. Uma sequência alvo pode compreender qualquer polinucleotídeo, tal como polinucleotídeos de DNA ou RNA. Em algumas modalidades, uma sequência alvo está localizada no núcleo ou citoplasma de uma célula. Em algumas modalidades, a sequência alvo pode estar dentro de uma organela de uma célula (s) eucariótica, por exemplo, mitocôndria ou cloroplasto.
[00240] Uma sequência ou modelo que pode ser usada para recombinação no locus direcionado compreendendo as sequências alvo é referida tal como um "modelo de edição" ou "polinucleotídeo de edição" ou "sequência de edição". Um polinucleotídeo de modelo exógeno pode ser referido tal como um modelo de edição ou modelo de doador. Em algumas modalidades, o DNA de filamento simples e o DNA de filamento duplo de origem sintética ou biológica podem ser usados. A título de exemplo não limitativo, os modelos de edição adequados incluem ssODN, dsODN, produtos de PCR, plasmídeos e vírus incluindo AAV, Adenovírus, Retrovírus, lentivírus, etc. Também são possíveis modelos de edição adicionais. Em algumas modalidades, a recombinação é recombinação homóloga.
[00241] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas9. O RNA alvo do sistema CRISPR-Cas9 compreende um RNA de direcionamento de CRISPR (crRNA) e o RNA ativador do sistema CRISPR-Cas 9 compreende um RNA CRISPR com ativação trans (tracRNA). O elemento da proteína Cas do sistema CRISPR-Cas9 emprega uma proteína Cas9. O crRNA e o tracrRNA podem ser separados ou combinados em um único construto de RNA por meio de uma sequência de loop ligante. Esse construto de RNA combinado é chamado de RNA de guia único (sgRNA; ou RNA guia).
[00242] No que diz respeito às informações gerais sobre os sistemas CRISPR-Cas, seus componentes e entrega de tais componentes, incluindo métodos, materiais, veículos de entrega, vetores, partículas, AAV e sua fabricação e uso, incluindo quantidades e formulações, podem ser encontrados em: Patentes U.S. Nºs. 9.999.641, 8.993.233,
8.945.839, 8.932.814, 8.906.616, 8.895.308, 8.889.418, 8.889.356,
8.871.445, 8.865.406, 8.795.965, 8.771.945 e 8.697.359; Publicações de Patentes U.S. US 2014-0310830, US 2014-0287938 A1, US 2014- 0273234 A1, US2014-0273232 A1, US 2014-0273231, US 2014- 0256046 A1, US 2014-0248702 A1, US 2014-0242700 A1, US 2014 - 0242699 A1, US 2014-0242664 A1, US 2014-0234972 A1, US 2014- 0227787 A1, US 2014-0189896 A1, US 2014-0186958, US 2014- 0186919 A1, US 2014-0186843 A1, US 2014-0179770 A1 e US 2014- 0179006 A1, US 2014-0170753; Patentes europeias EP 2 784 162 B1 e EP 2 771 468 B1; Pedidos de patente europeia EP 2 771 468 (EP13818570,7), EP 2 764 103 (EP13824232,6) e EP 2 784 162 (EP14170383,5); e Publicações de Patente PCT, e Publicações de
Patente PCT WO 2014/093661, WO 2014/093694, WO 2014/093595, WO 2014/093718, WO 2014/093709, WO 2014/093622, WO 2014/093635, WO 2014/093655, WO 2014/093712, WO2014/093701, WO2014/018423, WO 2014/204723, WO 2014/204724, WO 2014/204725, WO 2014/204726, WO 2014/204727, WO 2014/204728, WO 2014/204729 e WO2016/028682.
[00243] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cpf. O "sistema CRISPR-Cpf" compreende: (a) pelo menos um elemento de RNA guia ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica o elemento de RNA guia, o RNA guia compreendendo um RNA alvo tendo uma sequência de nucleotídeo complementar a uma sequência de nucleotídeo em um local do ácido nucleico alvo; e (b) um elemento de proteína Cpf ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica o elemento de proteína Cpf.
[00244] Um exemplo de um elemento de proteína Cpf inclui nucleases de Cpf1, tais como Francisella Cpf1 (FnCpf1) e quaisquer variantes das mesmas. Vide, por exemplo, Zetsche et al., "Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system," Cell, 163(3): páginas 759-71; e Fonfara et al., "The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA," Nature 532 (7600): páginas, 517-21. PAM preferido de Cpf1 é 5'-TTN, diferente daquele de Cas9 (3'-NGG) tanto na localização genômica quanto no conteúdo de GC. O sistema CRISPR-Cpf pode não empregar um RNA ativador (tracrRNA). Ambos Cpf1 e seus RNAs guia são em geral menores que seus pares SpCas9. O locus Cpf1 contém um domínio alfa/beta misto, um RuvC-I seguido por uma região helicoidal, um RuvC-II e um domínio em forma de dedo de zinco. A proteína Cpf1 tem um domínio de endonuclease do tipo RuvC que é similar ao domínio RuvC de Cas9. Além disso, Cpf1 não tem um domínio de endonuclease
HNH, e o terminal N de Cpf1 não tem o lobo de reconhecimento alfa- helicoidal de Cas9. Os locais Cpf1 codificam proteínas Cas1, Cas2 e Cas4 mais similares aos tipos I e III do que dos sistemas do tipo II. As proteínas da família Cpf1 podem ser encontradas em muitas espécies bacterianas.
[00245] Sem estar vinculado a uma teoria específica, o sistema CRISPR-Cpf emprega um complexo Cpf1-crRNA que cliva DNA ou RNA alvo pela identificação de um motivo protoespaçador adjacente 5'-YTN- 3' (onde "Y" é uma pirimidina e "N" é qualquer nucleobase) ou 5'-TTN-3 em contraste com o PAM rico em G direcionado por Cas9. Após a identificação do PAM, Cpf1 introduz uma quebra de filamento duplo do DNA do tipo extremidade pegajosa, com 4 ou 5 saliências de nucleotídeos.
[00246] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é um sistema baseado em NgAgo. O sistema baseado em NgAgo compreende pelo menos um elemento guia de DNA ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o elemento guia de DNA; e uma endonuclease guiada por DNA. O sistema baseado em NgAgo emprega DNA tais como elemento guia. Seu princípio de funcionamento é similar ao da tecnologia CRISPR- Cas9, mas seu elemento guia é um segmento de DNA guia (dDNA), em vez de gRNA na tecnologia CRISPR-Cas9. Um exemplo de endonuclease guiada por DNA é uma endonuclease Argonaute (NgAgo) de Natronobacterium gregoryi. Vide, por exemplo, Feng Gao et al. "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute", Nature Biotechnology, (2016): doi:10.1038/nbt.3547.
[00247] Por "ligante", "ligante de peptídeo", "ligante peptídico" ou "espaçador de peptídeo", pretende-se significar uma sequência de peptídeo que permite a conexão de diferentes monômeros em uma proteína de fusão e a adoção da conformação correta para a referida atividade da proteína de fusão e que não altera a atividade de nenhum dos monômeros. Os ligantes de peptídeo podem ter vários tamanhos de 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 a 50 aminoácidos tal como uma faixa indicativa não limitativa ou qualquer valor intermediário dentro dessa faixa. Inibidores de DNA-PK para Aumentar Eficiência de Edição Genômica
[00248] A eficiência de edição de genoma direcionada pode ser aumentada através da administração a uma célula com um ou mais compostos (por exemplo, inibidores de DNA-PK) aqui descritos e um sistema de edição de genoma. Os sistemas de edição de genoma adequados para uso incluem, por exemplo, um sistema baseado em meganuclease, um sistema baseado em nuclease de dedo de zinco (ZFN), um sistema de Nuclease baseado em Efetor do tipo Ativador de Transcrição (TALEN), um sistema baseado em CRISPR ou sistema baseado em NgAgo. Os métodos, composições e kits da descrição fornecem inibidores de DNA-PK e/ou um sistema de edição de genoma para aumentar a eficiência da edição de genoma. Em algumas modalidades, a eficiência da edição do genoma de HDR é aumentada após a administração a uma célula (s) com um inibidor de DNA-PK.
[00249] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é um sistema de edição de genoma baseado em CRISPR. O sistema de edição de genoma baseado em CRISPR pode ser um sistema CRISPR-Cas ou variantes do mesmo. O sistema CRISPR-Cas pode usar quaisquer endonucleases de Cas, tais como endonucleases de Cas 9 e suas variantes. Exemplos de endonucleases de Cas 9 incluem endonucleases de Cas9 ou variantes das mesmas, tais como SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 ou CasD10A nickase. A endonuclease Cas pode ser do tipo selvagem, manipulada ou um mutante de nickase, ou qualquer variação dos mesmos.
[00250] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma baseado em CRISPR inclui uma sequência CRISPR, uma sequência cr (tracr) de ativação trans, uma sequência guia e uma endonuclease Cas ou quaisquer combinações das mesmas.
[00251] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma baseado em CRISPR inclui um RNA compreendendo uma sequência CRISPR (crRNA), um RNA compreendendo uma sequência cr (tracr) de ativação trans (tracrRNA) e uma endonuclease Cas ou qualquer combinação das mesmas
[00252] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma baseado em CRISPR inclui uma sequência de sequência CRISPR, uma sequência guia e uma endonuclease Cas ou uma endonuclease Cpf, ou qualquer combinação das mesmas.
[00253] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cpf. A nuclease Cpf é uma endonuclease do sistema CRISPR-Cas de Classe 2. Cpf é uma endonuclease guiada por RNA único. A nuclease Cpf pode ser do tipo selvagem, manipulada geneticamente ou um mutante de nickase, ou qualquer variação das mesmas. Vide, por exemplo, Zetsche et al., "CPF1 is a single RNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System", Cell, 163(3): 759-71. Em algumas modalidades, a nuclease Cpf é uma endonuclease Cpf 1.
[00254] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é um sistema baseado em meganuclease. A edição do genoma baseado em meganucleases utiliza endonucleases específicas de sequência que reconhecem grandes sítios alvo de DNA (por exemplo, tipicamente cerca de 12 pb). Vide, por exemplo, U.S. 9.365.964. As meganucleases podem clivar sequências cromossômicas únicas sem afetar a integridade geral do genoma. Em algumas modalidades, a meganuclease pode ser uma endonuclease de homing. Em algumas modalidades, a meganuclease pode ser uma endonuclease de íntron ou uma endonuclease de inteína. As endonucleases de homing podem pertencer à família LAGLIDADG. As meganucleases podem ser do tipo selvagem, manipuladas ou mutantes de nickase.
[00255] Em algumas modalidades, o sistema de edição de gene é um sistema baseado em nuclease de dedo de zinco (ZFN). O ZFN é uma enzima de restrição artificial projetada com base na fusão entre um domínio de ligação ao DNA do dedo zinco e um domínio de clivagem do DNA. Vide, por exemplo, US 9.145.565.
[00256] Em algumas modalidades, o sistema de edição de gene é uma Nuclease baseada em Efetor do tipo Ativador de Transcrição (TALEN). Os TALENs são enzimas de restrição manipuladas que são produzidas pela fusão de um domínio de ligação ao DNA efetor de TAL a um domínio de clivagem de DNA. Vide, por exemplo, US 9.181.535.
[00257] Em algumas modalidades, o sistema de edição de gene é um sistema baseado em Argonaute. Os sistemas de edição de gene baseados em Argonaute incluem uma endonuclease derivada de Argonaute e um ssDNA fosforilado em 5'. Em algumas modalidades, o ssDNA fosforilado pode ter 10 a 40 nucleotídeos, 15 a 30 nucleotídeos ou 18 a 30 nucleotídeos (por exemplo, cerca de 24 nucleotídeos) de comprimento. Em algumas modalidades, a endonuclease Argonaute pode ser qualquer endonuclease. Em algumas modalidades, a endonuclease Argonaute é derivada de Thermus thermophiles (TtAgo), Pyrococcus furiosus (PfAgo) ou Natronobacterium gregoryi (NgAgo). Em algumas modalidades, Natrobacterium gregoryi (NgAgo) é a cepa 2 (isto é, N. gregoryi SP2). Em algumas modalidades, a endonuclease Argonaute é NgAgo. Vide, por exemplo, Gao et al., "DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute," Nature Biotechnology, maio de 2016
[00258] Os inibidores de DNA-PK podem ser qualquer inibidor de DNA-PK. O inibidor de DNA-PK pode ser qualquer composto ou substância que cause inibição de uma DNA-PK. O inibidor de DNA-PK pode ser um composto, molécula pequena, anticorpo ou sequência de nucleotídeo. Em algumas modalidades, os inibidores de DNA-PK são compostos representados pela Fórmula (III-E-1) ou (III-E-2).
[00259] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para editar uma ou mais regiões genômicas alvo, o método inclui administrar uma ou mais células que têm uma ou mais regiões genômicas alvo, um sistema de edição de genoma e um composto representado pela Formula (III-E-1) ou (III-E-2): (III-E-1) ou (III-E-2) em que:
[00260] X é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila;
[00261] Y é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila;
[00262] R3 é hidrogênio, C1-4 alquil ou OC1-2 alquila;
[00263] R1 é um anel heteroaromático de 6 membros contendo um ou dois átomos de nitrogênio em que o anel heteroaromático pode ser substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C4 alquila, C1-C4- haloalquila, C(=O)NHR2' e NR4R5; em que
[00264] R2' é C1-C4 alquila,
[00265] Cada R4 e R5 é independentemente H, C1-C4 alquil ou C(=O)C1-C4 alquila; ou
[00266] R4 e R5, juntos com o átomo de N ao qual estão ligados, formam um anel heterocíclico compreendendo 0 ou 1 átomo de N adicional, em que o referido anel heterocíclico pode ser substituído por C1-C4 alquila; e
[00267] O anel B é selecionado a partir do grupo que consiste em:
, , e ; em que W é N ou CR3; e Z é O ou S; em que R3 é H ou C1- C4 alquila.
[00268] Em algumas modalidades, a descrição fornece um método para editar uma ou mais regiões genômicas alvo, o método inclui administrar uma ou mais células que têm uma ou mais regiões genômicas alvo, um sistema de edição de genoma e um composto representado pela Formula (III-E-1) ou (III-E-2), ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00269] Em algumas modalidades, a descrição também fornece um método para reparar uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas alvo por meio de uma via de reparo direcionado por homologia (HDR), o método inclui administrar as uma ou mais células que têm uma ou mais alvos regiões genômicas, um sistema de edição de genoma e um composto representado pela Fórmula (III-E-1) ou (III- E-2), ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00270] O sistema de edição de genoma interage com um ácido nucleico das regiões genômicas alvo, resultando em uma quebra de DNA, e em que a quebra de DNA é reparada pelo menos em parte através de uma via HDR.
[00271] Em algumas modalidades, a descrição também fornece um método para inibir ou suprimir o reparo de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas alvo através de uma via NHEJ, o método inclui administrar as uma ou mais células que têm uma ou mais regiões genômicas alvo, um sistema de edição de genoma e um composto representado pela Fórmula (III-E-1) ou (III-E-2), ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00272] O sistema de edição de genoma interage com um ácido nucleico de uma ou mais regiões genômicas alvo, resultando em uma quebra de DNA e em que o reparo da quebra de DNA através de uma via NHEJ é inibido ou suprimido.
[00273] Em algumas modalidades, a descrição também fornece um método para modificar a expressão de um ou mais genes ou proteínas, o método inclui administrar às uma ou mais células que compreendem uma ou mais regiões genômicas alvo, um sistema de edição de genoma e um composto representado pela fórmula (III-E-1) ou (III-E-2), ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00274] O sistema de edição de genoma interage com um ácido nucleico de uma ou mais regiões genômicas alvo de um ou mais genes alvo, resultando na edição de uma ou mais regiões genômicas alvo e em que a edição modifica a expressão de um gene (s) e/ou proteína (s) a jusante associados ao gene (s) alvo.
[00275] Em algumas modalidades, a quebra de DNA inclui uma quebra de filamento duplo de DNA (DSB).
[00276] Em algumas modalidades, a eficiência do reparo da quebra de DNA nas regiões genômicas alvo em uma ou mais células através de uma via HDR é aumentada em comparação à de célula idêntica ou células, mas sem o composto.
[00277] Em algumas modalidades, a eficiência de inibir ou suprimir o reparo da quebra de DNA nas regiões genômicas alvo nas uma ou mais células através de uma via NHEJ é aumentada em comparação à célula ou células idênticas, mas sem o composto.
[00278] Em algumas modalidades, a eficiência é aumentada em pelo menos duas vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 100 vezes em comparação à célula idêntica ou células, mas sem composto.
[00279] Em algumas modalidades, a eficiência é medida pela frequência da integração de polinucleotídeos direcionados. Em algumas modalidades, a eficiência é medida pela frequência da mutagênese direcionada. Em algumas modalidades, a mutagênese direcionada compreende mutações pontuais, deleções e/ou inserções.
[00280] Em algumas modalidades, a expressão de um gene (s) e/ou proteína (s) a jusante associados ao gene (s) alvo é aumentada em comparação ao nível de expressão da linha de base nas uma ou mais células antes da administração. Por exemplo, a referida expressão é aumentada em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, uma vez, 1,5 vez, duas vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, 5 vezes ou 10 vezes em comparação ao nível de expressão da linha de base nas uma ou mais células antes da administração.
[00281] Em algumas modalidades, a expressão de um gene (s) e/ou proteína (s) a jusante associados ao gene (s) alvo é diminuída em comparação ao nível de expressão da linha de base nas uma ou mais células antes da administração. Por exemplo, a expressão do gene diminui em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, ou 99% em comparação ao nível de expressão da linha de base em uma ou mais células antes da administração.
[00282] Em algumas modalidades, a expressão de um gene (s) e/ou proteína (s) a jusante associados ao gene (s) alvo é substancialmente eliminada nas uma ou mais células.
[00283] Em algumas modalidades, a célula é sincronizada na fase do ciclo celular S ou G2.
[00284] Em algumas modalidades, as uma ou mais células que são administradas ou contatadas com o referido composto aumentaram a sobrevivência em comparação às uma ou mais células que não foram administradas ou contatadas com o referido composto.
[00285] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma e o composto são administrados nas uma ou mais células simultaneamente. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma e o composto são administrados nas uma ou mais células sequencialmente. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é administrado nas uma ou mais células antes do composto. Em algumas modalidades, o composto é administrado nas uma ou mais células antes do sistema de edição do genoma.
[00286] Em algumas modalidades, as uma ou mais células são células cultivadas. Em algumas modalidades, as uma ou mais células são células in vivo dentro de um organismo. Em algumas modalidades, as uma ou mais células são células ex vivo de um organismo.
[00287] Em algumas modalidades, o organismo é um mamífero. Em algumas modalidades, o organismo é um humano.
[00288] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma e o composto são administrados por uma mesma via. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma e o composto são administrados por uma rota diferente. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é administrado por via intravenosa e o composto é administrado por via oral.
[00289] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é selecionado a partir de um sistema baseado em meganuclease, um sistema baseado em nuclease de dedo de zinco (ZFN), um sistema de Nuclease baseado em Efetor do tipo Ativador de Transcrição (TALEN), um sistema baseado em CRISPR ou um sistema baseado em NgAgo.
[00290] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é um sistema baseado em CRISPR. Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas ou um sistema CRISPR-Cpf.
[00291] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas e em que o sistema CRISPR-Cas inclui: (a) pelo menos um elemento de RNA guia que inclui: (i) um RNA direcionador que inclui uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo nas uma ou mais regiões genômicas alvo ou um ácido nucleico que inclui uma sequência de nucleotídeo que codifica o RNA direcionador; (ii) e um RNA ativador que inclui uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com o RNA direcionador ou um ácido nucleico que inclui uma sequência de nucleotídeo que codifica o RNA ativador; e (b) um elemento de proteína Cas que inclui uma proteína Cas ou um ácido nucleico que inclui uma sequência de nucleotídeo que codifica a proteína Cas.
[00292] Em algumas modalidades, o RNA alvo e o RNA ativador são fundidos tal como uma única molécula.
[00293] Em algumas modalidades, a proteína Cas é uma proteína Cas9 do Tipo II. Em algumas modalidades, a proteína Cas9 é uma nickase SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI- dCas9 ou D10A ou qualquer combinação das mesmas.
[00294] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cpf e o sistema CRISPR-Cpf inclui: (a) pelo menos um elemento de RNA guia ou um ácido nucleico que inclui uma sequência de nucleotídeo que codifica o elemento de RNA guia, o RNA guia que inclui um RNA direcionador que inclui uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo nas uma ou mais regiões genômicas alvo; e (b) um elemento de proteína Cpf que inclui uma proteína Cpf ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a proteína Cpf.
[00295] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é entregue por um ou mais vetores.
[00296] Em algumas modalidades, os um ou mais vetores são selecionados a partir de vetores virais, plasmídeos ou ssDNAs.
[00297] Em algumas modalidades, os vetores virais são selecionados a partir de vetores virais retrovirais, lentivirais, adenovirais, adenoassociados e herpes simplex.
[00298] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é entregue por RNA sintético.
[00299] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é entregue por uma nanoformulação.
[00300] Em algumas modalidades, um kit ou composição é fornecido para editar uma ou mais regiões genômicas alvo. Em algumas modalidades, o kit ou composição inclui um sistema de edição de genoma; e um composto representado pela fórmula (III-E-1) ou (III-E-2), ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00301] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma do kit ou composição é um sistema baseado em meganuclease, um sistema baseado em nuclease de dedo de zinco (ZFN), um sistema de Nuclease Baseado em Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALEN), um sistema baseado em CRISPR sistema ou sistema baseado em NgAgo. Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma do kit ou composição é um sistema baseado em CRISPR. Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR do kit ou composição é um sistema CRISPR-Cas ou um sistema CRISPR-Cpf.
[00302] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR do kit ou composição é um sistema CRISPR-Cas e em que o sistema CRISPR-Cas inclui: (a) pelo menos um elemento de RNA guia que inclui: (i) um RNA direcionador que inclui uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo nas uma ou mais regiões genômicas alvo ou um ácido nucleico que inclui uma sequência de nucleotídeo que codifica o RNA direcionador; (ii) e um RNA ativador que inclui uma sequência de nucleotídeo capaz de hibridizar com o RNA direcionador ou um ácido nucleico que inclui uma sequência de nucleotídeo que codifica o RNA ativador; e (b) um elemento de proteína Cas que inclui uma proteína Cas ou um ácido nucleico que inclui uma sequência de nucleotídeo que codifica a proteína Cas.
[00303] Em algumas modalidades, a proteína Cas do kit ou composição é uma proteína Cas9 do Tipo II. Em algumas modalidades, a proteína Cas9 do kit ou composição é uma SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 ou D10A nickase, ou qualquer combinação das mesmas.
[00304] Em algumas modalidades, o sistema baseado em CRISPR do kit ou composição é um sistema CRISPR-Cpf e em que o sistema CRISPR-Cpf inclui: (a) um RNA direcionador que inclui uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo nas uma ou mais regiões genômicas alvo, ou um ácido nucleico que inclui uma sequência de nucleotídeo que codifica o RNA direcionador; e (b) um elemento de proteína Cpf que inclui uma proteína Cpf ou um ácido nucleico que inclui uma sequência de nucleotídeo que codifica a proteína Cpf.
[00305] Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma do kit ou composição é incluído ou empacotado em um ou mais vetores. Em algumas modalidades, os um ou mais vetores são selecionados a partir de vetores virais, plasmídeos ou ssDNAs. Em algumas modalidades, os vetores virais são selecionados a partir do grupo que consiste em vetores virais retrovirais, lentivirais, adenovirais, adenoassociados e herpes simplex.
[00306] Em algumas modalidades, a eficiência de edição do genoma aumentada é de cerca de uma vez, duas vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, em comparação a uma condição na qual um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma não são administrados a uma célula (s), ou em comparação a uma condição em que apenas um sistema de edição de genoma e não um inibidor de DNA-PK é administrado a uma célula (s).
[00307] Uso de Inibidores de DNA-PK e Sistema de Edição de Genoma, Kits e Composições dos Mesmos
[00308] A edição de genoma, na qual regiões genômicas específicas são alteradas com precisão, tem grande potencial terapêutico.
[00309] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos métodos para editar uma ou mais regiões genômicas alvo, para reparar uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas alvo através de uma via HDR, para inibir ou suprimir o reparo mediado por NHEJ de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas alvo, e para modificar a expressão de um ou mais genes ou proteínas através da administração a uma célula (s) de um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK.
[00310] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos métodos para modificar a expressão de um ou mais genes ou proteínas, compreendendo a administração de uma ou mais células que compreendem uma ou mais regiões genômicas alvo, um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK aqui descrito, em que o sistema de edição de genoma interage com um ácido nucleico de uma ou mais regiões genômicas alvo de um ou mais gene(s) alvo, resultando na edição de uma ou mais regiões genômicas alvo e em que a edição modifica a expressão de um gene (s) e/ou proteína (s) a jusante associados ao gene (s) alvo.
[00311] O sistema de edição de genoma pode ser qualquer sistema de edição de genoma que pode editar uma região genômica alvo em uma célula (s). Exemplos de sistemas de edição de genoma são descritos em detalhes acima e podem incluir, por exemplo, um sistema baseado em meganucleases, um sistema baseado em nuclease de dedo de zinco (ZFN), um sistema de Nuclease Baseado em Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALEN), um sistema baseado em CRISPR ou sistema baseado em NgAgo
[00312] Edição de uma ou mais regiões genômicas alvo inclui qualquer tipo de manipulação ou engenharia genética do genoma de uma célula. A edição de uma ou mais regiões genômicas alvo pode incluir inserções, deleções ou substituições de regiões genômicas em uma célula (s) realizada por uma ou mais endonucleases. As regiões genômicas compreendem o material genético de uma célula (s), tais como DNA, RNA, polinucleotídeos e oligonucleotídeos. As regiões genômicas em uma célula (s) também compreendem os genomas das mitocôndrias ou cloroplastos contidos em uma célula (s).
[00313] Em algumas modalidades, são aqui fornecidos métodos de tratamento de um objeto com uma doença ou condição que precisa editar uma ou mais regiões genômicas alvo em uma célula (s) do objeto, compreendendo administrar as uma ou mais células, um sistema de edição genômica e um inibidor de DNA-PK.
[00314] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos são usados para modificar a expressão de um gene, uma molécula de RNA, uma proteína, um grupo de proteínas, ou proteínas a jusante em uma via. Essa modificação pode ser usada para tratar uma doença, uma disfunção, uma homeostase orgânica anormal, adquirida ou herdada ou devido ao processo de envelhecimento. Como usado aqui, o termo "modificar" ou "modificação" inclui modular, aprimorar, diminuir, aumentar, inserir, excluir, knockout, knockin e similares.
[00315] Uma pessoa versada na técnica entende que doenças, adquiridas ou herdadas, ou obtidas de outra forma, envolvem uma desregulação dos mecanismos homeostáticos, incluindo o envolvimento da função de genes ou proteínas. Para este fim, um especialista na técnica pode usar os métodos aqui fornecidos para modular, modificar, aprimorar, diminuir ou fornecer uma função genética de outro modo em um objeto.
[00316] Modificação da expressão do gene e consequente expressão da proteína em uma célula (s) podem ser alcançadas pelos métodos aqui fornecidos, por exemplo, por edição específica (por exemplo, substituição, inserção ou exclusão, qualquer combinação dos mesmos) de uma sequência de ácido nucleico em qualquer de um éxon, um íntron, um sítio de início de transcrição, uma região promotora, uma região potenciadora, uma região silenciadora, uma região isolante, um antirrepressor, um elemento regulador pós-traducional, um sinal de poliadenilação (por exemplo, poli A mínimo), uma região conservada, um sítio de ligação ao fator de transcrição ou qualquer combinação dos mesmos.
[00317] Em algumas modalidades, os métodos, kits e composições aqui fornecidos são usados para tratar um objeto que tem câncer. O método para tratar um objeto tendo um câncer ou condição relacionada ao câncer compreende administrar a uma célula do objeto um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma. A administração do inibidor de DNA-PK e o sistema de edição de genoma podem ser in vivo ou ex vivo.
[00318] O câncer pode ser de qualquer tipo de câncer. O câncer inclui tumores sólidos tais como mama, ovário, próstata, pulmão, rim, gástrico, cólon, testicular, cabeça e pescoço, pâncreas, cérebro, melanoma e outros tumores de órgãos de tecidos e cânceres das células sanguíneas, tais como linfomas e leucemias, incluindo leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crônica, leucemia linfocítica de células T e linfomas de células B. Os cânceres podem incluir melanoma, leucemia, astocitoma, glioblastoma, linfoma, glioma, linfoma de Hodgkins, leucemia linfocítica crônica e câncer de pâncreas, mama, tireóide, ovário, útero, testículo, hipófise, rim, estômago, esôfago e reto.
[00319] Em algumas modalidades, os métodos, kits e composições aqui fornecidos são utilizados para tratar um objeto com um ou mais dos seguintes cânceres: Leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cânceres relacionados à AIDS, Linfoma relacionado à Aids, Câncer anal, Câncer de apêndice,
Astrocitoma, cerebelo ou cerebral infantil, Carcinoma basocelular, Câncer de duto biliar, extra-hepático (vide colangiocarcinoma), Câncer de bexiga, Tumor ósseo, osteossarcoma/histiocitoma fibroso maligno, Glioma de tronco cerebral, Câncer cerebral, Tumor cerebral, astrocitoma cerebelar, Tumor cerebral, astrocitoma cerebral/glioma maligno, Tumor cerebral, ependimoma, Tumor cerebral, meduloblastoma, Tumor cerebral, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentorial, Tumor cerebral, via visual e glioma hipotalâmico, Câncer de mama, Adenomas/carcinoides brônquicos, Linfoma de Burkitt, tumor carcinóide, infância, tumor carcinóide gastrointestinal, carcinoma de primário desconhecido, linfoma do sistema nervoso central, primário, astrocitoma cerebral, infância, astrocitoma cerebral/ glioma maligno, infância, câncer do colo do útero, cânceres da infância, condrossarcoma, leucemia linfocítica crônica, leucemia mieloide crônica, distúrbios mieloproliferativos crônicos, câncer de cólon, linfoma cutâneo de células T, tumor desmoplásico de pequenas células redondas, Câncer endometrial, Ependimoma, Hemangioendotelioma eopitelioide (HEH), Câncer de esôfago, sarcoma de Ewing na família de tumores Ewing, tumor extracraniano de células germinativas, tumor extragonadal de células germinativas, câncer de duto biliar extrahepático, câncer ocular, melanoma intraocular, câncer ocular, retinoblastoma, câncer de vesícula biliar, câncer gástrico (estômago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal (GIST), tumor de células germinativas: tumor trofoblástico gestacional extracraniano, extragonadal ou ovariano, glioma do tronco cerebral, Glioma, astrocitoma cerebral infantil, Glioma, via visual infantil e hipotalâmica, carcinoide gástrico, leucemia de células pilosas, Câncer de cabeça e pescoço, Câncer de coração, Câncer hepatocelular (fígado), Linfoma de Hodgkin, câncer de hipofaringe, glioma da via hipotalâmica e visual, infância, melanoma intraocular,
carcinoma de células das ilhotas (pâncreas endócrino), sarcoma de Kaposi, câncer de rim (câncer de células renais), câncer de laringe, leucemias, leucemia, linfoblástica aguda (também chamada leucemia linfocítica aguda), Leucemia, mieloide aguda (também chamada leucemia mieloide aguda), Leucemia, linfocítica crônica (também chamada leucemia linfocítica crônica), Leucemia, mieloide crônica (também chamada leucemia mieloide crônica), Leucemia, células pilosas, câncer de lábio e cavidade oral, lipossarcoma, câncer de fígado (primário), câncer de pulmão, células não pequenas, câncer de pulmão, células pequenas, linfomas, linfoma relacionado à AIDS, linfoma de Burkitt, linfoma cutâneo de células T, linfomas de Hodgkin e linfomas de não Hodgkin (uma classificação antiga de todos os linfomas, exceto os de Hodgkin) Macroglobulinemia do sistema nervoso central primário, Waldenström, Câncer de mama masculino, Histiocitoma fibroso maligno do osso/osteossarcoma, Meduloblastoma, Melanoma infantil, intraocular (olho), câncer de células de Merkel, mesotelioma, mesotelioma maligno adulto, câncer de pescoço escamoso metastático infantil com primário oculto, câncer de boca, síndrome da neoplasia endócrina múltipla, mieloma múltiplo/neoplasia das células plasmáticas, micoses fungóides, doenças mielodisplásicas/mieloproliferativas, Leucemia mieloide, leucemia mieloide crônica, leucemia mieloide aguda em adultos, mieloma agudo infantil, múltiplo (câncer da medula óssea), distúrbios mieloproliferativos, mixoma crônico, câncer de cavidade nasal e seio paranasal, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, linfoma não- Hodgkin, Câncer de pulmão de células não pequenas, Oligodendroglioma, Câncer bucal, Câncer de orofaringe, Osteossarcoma/histiocitoma fibroso maligno dos ossos, Câncer de ovário, Câncer epitelial de ovário (tumor epitelial-estroma de superfície), Tumor de células germinativas de ovário, tumor de ovário de malignidade potencialmente baixa, Câncer pancreático, Câncer pancreático de células das ilhotas, Câncer de cavidade nasal e seio paranasal, câncer de da paratireoide, câncer de pênis, câncer de faringe, Feocromocitoma, Astrocitoma pineal, Germinoma pineal, Pineoblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supratentorial, Adenoma pituitário, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiplo, blastoma pleuropulmonar, linfoma do sistema nervoso central primário, câncer de próstata, câncer retal, carcinoma de células renais (câncer de rim), câncer renal de pelve e ureter, câncer de células transicionais, Retinoblastoma, Rabdomiossarcoma, Câncer de glândula salivar, Sarcoma, Família de Ewing de tumores, Sarcoma de Kaposi, Sarcoma de tecidos moles, Sarcoma uterino, Síndrome de Sézary, Câncer de pele (não melanoma), Câncer de pele (melanoma), Carcinoma de pele, Célula de Merkel, Câncer de pulmão de pequenas células, Câncer de intestino delgado, Sarcoma de tecidos moles, Carcinoma de células escamosas – vide câncer de pele (não melanoma), câncer de pescoço escamoso com primário oculto, metastático, Câncer de estômago, Tumor neuroectodérmico supratentorial primitivo, Linfoma de células T cutâneo (Micose fungóide e síndrome de Sézary), Câncer testicular, Câncer de garganta, Timoma, Timoma e carcinoma tímico, Câncer de tireoide, Câncer de tireoide, Câncer renal de células transicionais da pelve e ureter, Tumor trofoblástico gestacional, Carcinoma de sítio primário desconhecido do adulto, Câncer de sítio primário desconhecido de, infância, renal de pélvis e ureter, câncer de células transicionais, câncer da uretra, câncer uterino, câncer endometrial, sarcoma uterino, câncer vaginal, via visual e glioma hipotalâmico, câncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenström, ou tumor de Wilms (câncer de rim).
[00320] Em algumas modalidades, genes alvo exemplares associados ao câncer incluem ABL1, ABL2, ACSL3, AF15Q14, AF1Q, AF3p21, AF5q31, AKAP9, A T1, AKT2, ALDH2, AL, AL017, APC, ARHGEF12, ARHH, ARID1A, ARID2, ARNT, ASPSCR1, ASXL1, ATF1,
ATIC, ATM, ATRX, AXIN1, BAP1, BCL10, BCL11A, BCL11B, BCL2, BCL3, BCL5, BCL6, BCL7A, BCL9, BCOR, BCR, BHD, BIRC3, BLM, BMPRIA, BRCA1, BRCA2, BRD3, BRD4, BRIPI, BTG1, BUB1B, C12orf9, C15orf21, C15orf55, C16orf75, C2orf44, CAMTA1, CANT1, CARD11, CARS, CBFA2T1, CBFA2T3, C.BFB, CBL, CBLB, CBLC, CCDC6, CCNB1IP1, CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CD273, CD274, CD74, CD79A, CD79B, CDH1, CDH11, CDK12, CDK4, CDK6, CD N2A, CD N2a (pl4), CD N2C, CDX2, CEBPA, CEP1, CHCHD7, CHEK2, CHIC2, CHNl, CIC, Cin A, CLTC, CLTCL1, CMKOR1, CNOT3, COL1 Al, COPEB, COX6C, CREB1, CREB3L1, CREB3L, CREBBP, CRLF2, CRTC3, CTNNB1, CYLD, D10S170, DAXX, DDB2, DDIT3, DDX10, DDX5, DDX6, DEK, D1CER1, DNM2, DNMT3A, DUX4, EBFI, ECT2L, EGFR, E1F4A2, ELF4, ELK4, ELKS, ELL, ELN, EML4, EP300, EPS 15, ERBB2, ERCC2, ERCC3, ERCC4, ERCC5, ERG, ETV1, ETV4, ETV5, ETV6, EVI1, EWSR1, EXT1, EXT2, EZH2, EZR, FACL6, FAM22A, FAM22B, FAM46C, 1ANCA, EANCC, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FBXOl 1, FBXW7, FCGR2B, FEV, FGFR1, FGFRIOP, FGFR2, FGFR3, FTI, FIIIT, FIP1L1, FLU, FLJ27352, FLT3, FNBP1, FOXL2, FOXOIA, FOX03A, FOXP1, FSTL3, FUBP1, FUS, FVT1, GAS7, GATA1, GATA2, GATA3, GMPS, GNA11, GNAQ, GNAS, GOLGA5, GOPC, GPC3, GPHN, GRAF, H3F3A, IICMOGT-1, IIEAB, HERPUD1, IIEY1, IIIP1, HIST1IT3B, IIIST1II4I, IILF, HLXB9, HMGA1, HMGA2, HNRNPA2BI, HOOK3, HOXA11, HOXA13, HOXA9, HOXC11, HOXC13, HOXD11, HOXD13, HRAS, IIRPT2, HSPCA, HSPCB, IDH1, IDH2, IGH, IGK, IGL, IKZF1, IL2, TL21R, IL6ST, IL7R, IRF4, IRTA1, ITK, JAK1, JAK2, JAK3, JAZF1, JUN, KCNJ5, KDM5A, KDM5C, KDM6A, KDR, KIAA1549, KIF5B, KIT, KLF4, KLK2, KRAS, KTN1, LAF4, LASP1, LCK, LCP1, LCX, LHFP, LIFR, LMO1, LM02, LPP, LRIG3, LYL1, MADH4, MAF, MAFB, MALT1, MAML2, MAP2KL, MAP2K2, ΜλΡ2Κ4, MAX, MDM2, MDM4, MDS1, MDS2, MECT1, MED12, MEN1, MET,
MITF, MKL1, MLF1, MLII1, MLL, MLL2, MLL3, MLLT1, MLLT10, MLLT2, MLLT3, MLLT4, MLLT6, MLLT7, MN1, MPL, MSF, MSH2, MSH6, MSI2, MSN, MTCP1, MUC1, MUTYH, MYB, MYC, MYCL1, MYCN, MYD88, MYH11, MYH9, MYST4, NACA, NBS1, NCOA1, NCOA2, NCOA4, NDRG1, NF1, NF2, NFE2L2, NFIB, NFKB2, NIN, NKX2-1, NONO, NOTCH1, NOTCH2, NPM1, NR4A3, NRAS, NSDl, NT5C2, NTRK1, NTRK3, NUMAl, NUP214, NUP98, OLIG2, OMD, P2RY8, PAFAH1B2, PALB 2, PAX3, PAX5, PAX7, PAX8, PBRM1, PBX1, PCM1, PCSK7, PDE4DIP, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PERI, PIIF6, PHOX2B, PICALM, PIK3CA, PIK3R1, PIM1, PLAG 1, PML, PMS1, PMS2, PMX1, PNUTL1, POT1, POU2AF1, POU5F1, PPARG, PPP2R1A, PRCC, PRDM1, PRDM16, PRF1, PRKAR1 A, PRO1073, PSIP2, PTCH, PTEN, PTPN11, RAB5EP, RAC1, RAD51L1, RAF1, RALGDS, RANBP17, RAPIGDSI, RARA, RBI, RBM15, RECQL4, REL, RET, RNF43, ROS1, RPL10, RPL22, RPL5, RPN1, RUNDC2A, RUNX1, RUNXBP2, SBDS, SDC4, SDH5, SDHB, SDHC, SDHD, SEPT6, SET, SETBP1, SETD2, SF3B1, SFPQ, SFRS3, SH2B3, SH3GL1, SIL, SLC34A2, SLC45A3, SMARCA4, SMARCB1, SMARCE1, SMO, SOCS1, SOX2, SRGAP3, SRSF2, SSI8, SS18L1, SSH3BP1, SSX1, SSX2, SSX4, STAT3, STK11, STL, SUFU, SIJZ12, SYK, TAF15, TALI, TAL2, TCEA1, TCF1, TCF12, TCF3, TCF7L2, TCLA1, TCL6, TERT, TET2, TFE3, TFEB, TFG, TFPT, TFRC, THRAP3, TIF1, TLX1, TLX3, TMPRSS2, TNFAIP3, TNFRSF14, TNFRSF17, TNFRSF6, TOPI, TP53, TPM3, TPM4, TPR, TRA, TRAF7, TRB, TRD, TRIM27, TRIM33, TRIP11, TSC1, TSC2, TSHR, TTL, U2AF1, USP6, VHL, VTUA, WAS, WHSC1, WHSC1L1, WIF1, WRN, WT1, WTX, WWTR1, XPA, XPC, XPOl, YWHAE, ZNF145, ZNF198, ZNF278, ZNF331, ZNF384, ZNF521, ZNF9, ZRSR2 ou qualquer combinação dos mesmos.
[00321] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos são usados para tratar um objeto que tem um distúrbio herdado. O método para tratar um objeto com uma doença ou condição genética ou distúrbio herdado, compreende administrar a uma célula (s) do objeto um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de genoma. A administração ou o inibidor de DNA-PK e o sistema de edição de genoma podem ser in vivo ou ex vivo.
[00322] O distúrbio herdado pode resultar de mutações ou duplicações em regiões cromossômicas (por exemplo, de mutações pontuais, deleções, inserções, desvio de quadro, duplicações ou deleções cromossômicas). O distúrbio herdado pode ser qualquer distúrbio herdado.
[00323] Em algumas modalidades, o distúrbio herdado é síndrome de exclusão 22q11.2, síndrome de Angelman, doença de Canavan, doença de Charcot-Marie–Tooth, daltonismo, Cri du chat, síndrome de Down, distrofia muscular de Duchenne, hemocromatose, hemofilia, síndrome de Klinefelter, Neurofibromatose, Fenilcetonúria, doença renal policística, síndrome de Prader-Willi, doença falciforme, atrofia muscular espinhal, atrofia muscular espinhal, doença de Tay-Sachs, síndrome de Turner, hemoglobinopatia ou qualquer combinação das mesmas.
[00324] Em algumas modalidades, o distúrbio herdado é síndrome de exclusão 1p36, síndrome de exclusão 18p, deficiência de 21- hidroxilase, 47 XXX (síndrome do triplo X), 47 XXY (síndrome de Klinefelter), porfiria com deficiência de 5-ALA desidratase, deficiência de ALA desidratase, Porfiria por deficiência de desidratase 5- aminolevulínica, síndrome de deleção 5p, Cri du chat (síndrome AKA 5p-), ataxia telangiectasia (AKA A-T), deficiência de alfa 1-antitripsina (AAT), aceruloplasminemia, acondrogênese tipo II (ACG2), acondroplasia (ACH), Deficiência de beta-glucosidase ácida, doença de Gaucher (qualquer tipo, por exemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3), acrocefalossindactilia (Apert), síndrome de Apert, acrocefalossindactilia (qualquer tipo, por exemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3, tipo) 5), Síndrome de Pfeiffer, Acrocefalia, doença de Gaucher cerebral aguda, porfiria aguda intermitente, deficiência de ACY2, doença de Alzheimer (DA),
craniossinostose do tipo Adelaide, síndrome de Muenke, Polipose Adenomatosa Coli, polipose adenomatosa familiar, Polipose Adenomatosa do colo, polipose adenomatosa familiar (ADP), deficiência de adenilossuccinato-liase, distúrbios da glândula suprarrenal, síndrome adrenogenital, adrenoleucodistrofia, síndrome de insensibilidade androgênica (AIS), alcaptonúria (AKU), porfiria ALA desidratase, porfiria ALA-D, deficiência de ALA desidratase, síndrome de Alagille, alcaptonúria, doença de Alexander, alcaptonúria, ocronose alcaptonúrica, alcaptonúria, doença inibidora da alfa-1 proteinase, enfisema relacionado à alfa-1, deficiência de alfa-galactosidase A, doença de Fabry, síndrome de Alström, doença de Alexander (ALX), amelogênese imperfeita, deficiência de ácido amino levulínico desidratase, deficiência de Aminoacilase 2, doença de Canavan, doença de Anderson-Fabry e síndrome de insensibilidade a androgênio, Anemia, sideroblástica hereditária, anemia esplênica sideroblástica ligada ao X e/ou anemia familiar, Angioqueratoma Cutâneo Disseminado, Angioqueratoma disseminado, Angiomatose da retina, doença de von Hippel-Lindau, resistência à APC, tipo Leiden, trombofilia de Leiden fator V, síndrome de Apert, deficiência de AR, síndrome de insensibilidade a androgênio, doença de Charcot-Marie-Tooth (qualquer tipo, por exemplo, CMT1, CMTX, CMT2, CMT4, CMT grave de início precoce), Aracnodactilia, Síndrome de Marfan, ARNSHL, surdez não sindrômica (autossômica recessiva, autossômica dominante, ligada ao X ou mitocôndrias), artroftalmopatia progressiva hereditária, síndrome de Stickler (por exemplo, COL2A1, COL11A1, COL11A2, COL9A1), congênita multiplexada por artrocalasia, síndrome de Ehlers – Danlos (por exemplo, tipo de hipermobilidade, tipo de artrocalasia, tipo clássico, tipo vascular, tipo de cifoscoliose, tipo de dermatosparaxia) Deficiência de Asp, deficiência de Aspa, deficiência de Aspartoacilase, ataxia telangiectasia, Síndrome de Demência-Ataxia-Perda de Uso da Mão,
síndrome de Rett, ALS juvenil autossômica dominante, síndrome opitz G/BBB autossômica dominante, forma autossômica recessiva de ALS juvenil tipo 3, esclerose lateral amiotrófica (qualquer tipo; por exemplo, ALS1, ALS2, ALS3, ALS4, ALS5, ALS5, ALS6, ALS7, ALS8, ALS9, ALS10, ALS11, ALS12, ALS13, ALS14, ALS15, ALS16, ALS17, ALS18, ALS19, ALS20, ALS21, ALS22, FTDALS1, FTDALS2, FTDALS2, FTDALS2, IBMPFD2), perda auditiva não sindrômica autossômica recessiva, Comprometimento Auditivo Neurossensorial Autossômico Recessivo e Bócio, síndrome de Pendred, Doença de Alexander (AxD), Síndrome de Ayerza, síndrome de Ayerza, hipertensão arterial pulmonar familiar, variante B da hexosaminidase GM 2 gangliosidose, doença de Sandhoff, distúrbio relacionado a BANF, neurofibromatose (qualquer tipo, por exemplo, NF1, NF2, schwannomatose), síndrome de Beare-Stevenson cútis gyrata, peritonite paroxística benigna, síndrome de Benjamin, beta-talassemia, deficiência de BH4, deficiência de tetra- hidrobiopterina, Neurofibromatose acústica bilateral, deficiência de biotinidase, câncer de bexiga, distúrbios hemorrágicos, trombofilia Leiden de fator V, síndrome de Bloch-Sulzberger, incontinência pigmentar, síndrome de Bloom, doenças ósseas, doença de Bourneville, esclerose tuberosa, doenças cerebrais, doença de príon, câncer de mama, Síndrome Birt–Hogg–Dubé, doença dos ossos quebradiços, osteogênese imperfeita, síndrome do Polegar-hálux largo, síndrome de Rubinstein-Taybi, diabetes de bronze, hemocromatose, cirrose bronzeada, atrofia muscular bulboespinhal, atrofia muscular espinhal e bulbar ligada ao X, síndrome de Burger-Grutz, deficiência de lipoproteína lipase, síndrome CADASIL familiar, distúrbio granulomatoso crônica de CGD, displasia campomélica, síndrome da família do câncer, câncer colorretal não poliposo hereditário, câncer de mama, câncer de bexiga, Deficiência de Carboxilase, Deficiência de biotinidase de início tardio múltipla, Síndrome do choro de gato,
Síndrome cardiofacial de Caylor, Deficiência de ceramida trihexosidase, Angiomatose cerebelorreletinal, doença familiar de von Hippel-Lindau, Arteriopatia cerebral, síndrome de CADASI, ateriopatia dominante autossômica cerebral, síndrome de CADASIL, Hiperamonemia cerebroatrófica, síndrome de Rett, síndrome cerebrosídeo lipidose, doença de Charcot, síndrome de CHARGE, Condrodistrofia, síndrome de Condrodistrofia, Condrodistrofia com surdez neurossensorial, displasia otospondilomegaepifiseal, Condrogênese imperfecta, síndrome hiperuricêmica de coreoatetose e automutilação, síndrome de Lesch-Nyhan, Galactosemia clássica, galactosemia, fenda labial e palatina, síndrome de Stickler, crânio de trevo com nanismo tanatofórico, displasia tanatofórica (por exemplo, tipo 1 ou tipo 2), síndrome de Coffin-Lowry (CLS), síndrome de Cockayne, síndrome de Coffin-Lowry, colagenopatia tipos II e XI, não polipose familiar, câncer colorretal não polipose hereditário, câncer de cólon familiar, polipose adenomatosa familiar, câncer colorretal, deficiência completa de HPRT, síndrome de Lesch-Nyhan, deficiência completa de hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase, neuropatia por compressão, neuropatia hereditária com risco de paralisia por pressão, doença do tecido conectivo, síndrome facial por anomalia conotruncal, anemia de Cooley, beta-talassemia, doença de armazenamento de cobre, doença de Wilson, doença de transporte de cobre, doença de Menkes, coproporfiria, coproporfiria hereditária, deficiência de coproporfirinogênio oxidase, síndrome de Cowden, síndrome de CPX, disartrose craniofacial, síndrome de Crouzon, Disostose craniofacial, síndrome de Crouzon, doença de Crohn, fibrostenose, síndrome de Crouzon, síndrome de Crouzon com acantose nigricans, síndrome de Crouzonodermoesquelético, síndrome de Crouzonodermoesquelético, síndrome de Cockayne (CS), síndrome de Cockayne (CS), síndrome de Cowden, síndrome de Curschmann-Batten-Steinert, Síndrome cútis girata de Beare-Stevenson, deficiência de D-glicerato desidrogenase, hiperoxalúria, primária, síndrome de metáfise dappled, displasia espondiloepimetafisária, tipo Strudwick, tipo Demência de Alzheimer (DAT), hipercalciúria genética, doença de Dent, distrofia muscular (por exemplo, tipos Duchenne e Beck), Surdez com bócio, síndrome de Pendred, síndrome da surdez-retinose pigmentar, síndrome de Usher, doença de deficiência, fenilalanina hidroxilase, doenças nervosas degenerativas, síndrome de Grouchy 1, síndrome de De Grouchy, síndrome de Dejerine-Sottas, porfiria por deficiência de delta- aminolevulinato desidratase, demência, síndrome de CADASIL, leucodistrofia desmielinogênica, Doença de Alexander, tipo Dermatosparático de síndrome de Ehlers-Danlos, Dermatosparaxia, incapacidades de desenvolvimento herdadas, neuropatia motora hereditária distal (dHMN), neuropatia motora hereditária distal (por exemplo, DHMN-V), deficiência de DHTR, síndrome de insensibilidade a andrógeno, esclerose difusa de corpo globóide, doença de Krabbe, síndrome de Di George, deficiência do receptor de di-idrotestosterona, síndrome de insensibilidade a andrógeno, neuropatia motora hereditária distal, distrofia miotônica (tipo 1 ou tipo 2), atrofia muscular espinhal distal (qualquer tipo, incluindo, por exemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3, tipo 4, tipo 5, tipo 6), distrofia muscular de Duchenne/Becker, nanismo (qualquer tipo, egacondroplástico, acondroplasia, displasia tanatofórica), síndrome de atrofia retinianasurdez por nanismo, síndrome de Cockayne, leucodistrofia dismielinogênica, doença de Alexander, distrofia miotônica, síndrome de distrofia retinite pigmentosa- disostose, síndrome de Usher, doença de alzheimer familiar de início precoce (EOFAD), doença de Alzheimer (incluindo, por exemplo, tipo 1, tipo 2, tipo 3, ou tipo 4) Doença de Ekman-Lobstein, osteogênese imperfeita, neuropatia por aprisionamento, neuropatia hereditária com risco de paralisia por pressão, protoporfiria eritropoiética (PPE), anemia eritroblástica, beta-talassemia, protoporfiria eritrohepática, deficiência de sintetase eritroide 5-aminolevulinada, anemia sideroblástica ligada ao X, câncer ocular, retinoblastoma FA - ataxia de Friedreich, ataxia de Friedreich, FA, anemia por fanconi, lesões e distúrbios faciais, trombofilia de Leiden fator V, FALS, esclerose lateral amiotrófica, neuroma acústico familiar, polipose adenomatosa familiar, doença de Alzheimer familiar (DAF), esclerose lateral amiotrófica familiar, esclerose lateral amiotrófica, desautonomia familiar, hipertrigliceridoma familiar induzida por gordura, deficiência de lipoproteína lipase, familiar, hemocromatose familiar, hemocromatose, deficiência de LPL, deficiência de lipoproteína lipase, familiar, câncer de cólon não polipose familiar, câncer colorretal não polipose hereditária, polisserosite paroxística familiar, PCT familiar, porfiria cutânea tardia, neuropatia familiar sensível à pressão, neuropatia hereditária com risco de paralisia por pressão, hipertensão pulmonar prinária familiar (FPPH), leucoencefalopatia vascular familiar, síndrome de CADASIL, PAF, polipose adenomatosa familiar, DF, disautonomia familiar, deficiência de ferrocelatase, doença de ferroportina, hemocromatose (qualquer tipo, por exemplo, tipo 1, tipo 2A, tipo 2B, tipo 3, tipo 4, hemocromatose neonatal, acaeruloplasminaemia, atransferrinaemia congênita, síndrome graciosa), Síndrome da febre periódica, febre familiar do Mediterrâneo (FMF), síndrome FG, sinostose coronal associada a FGFR3, degeneração fibrinóide de astrócitos, doença de Alexander, doença fibrocística do pâncreas, doença seguidora, síndrome fra(X), síndrome X frágil, Fragilitas ossium, osteogênese imperfeita, síndrome de FRAXA, ataxia de Friedreich (FRDA), deficiência de G6PD, doença por deficiência de galactoquinase, galactosemia, doença por deficiência de galactose-1-fosfato uridil-transferase, galactosemia, doença por galactosilceramidase, Doença de Krabbe, lipidose de Galactosilceramida, doença de Krabbe, deficiência de galactosilcerebrosidase, galactosilsfingosina lipidose, deficiência de GALC, deficiência de GALT, galactosemia, doença tipo Gaucher, doença pseudo-Gaucher, deficiência de GBA, distúrbios genéticos do cérebro, enfisema genético, hemocromatose genética, hemocromatose, hepatite de células gigantes, neonatal, hemocromatose neonatal, deficiência de GLA, glioblastoma, retina, retinoblastoma, Glioma, retina, retinoblastoma, leucodistrofia de células globoides (GCL, GLD), doença de Krabbe, leucoencefalopatia de células globoides, deficiência de glucocerebrosidase, Glucocerebrosidose, Lipidose de glucosil cerebrosídeo, Deficiência de glucosilceramidase, Deficiência de glucosilceramida beta-glucosidase, Lipidose de glucosilceramida, Acidúria glicérica, hiperoxaluria, primária, encefalopatia por glicina, hiperglicemia não cetótica, acidúria glicólica, hiperoxalúria, primária, GM2 gangliosidose, doença de Tay-Sachs, síndrome de surdez de Goiter, síndrome de Pendred, síndrome de Graefe-Usher, síndrome de Usher, síndrome de Gronblad-Strandberg, pseudoxantoma elástico, Hemocromatose, hemocromatose, síndrome de Hallgren, síndrome de Usher, ictiose do tipo Harlequin, doença Hb S, hipocondroplasia (HCH), coproporfiria hereditária (HCP), Malformações da cabeça e do cérebro, Distúrbios auditivos e surdez, Problemas auditivos em crianças, HEF2A, HEF2B, Hematoporfiria, porfiria, Deficiência de heme sintetase, Hemocromatose, doença da hemoglobina M, metemoglobinemia tipo beta-globina, doença da hemoglobina S, hemofilia, porfiria hepatoeritropoiética (HEP), deficiência hepática de AGT, hiperoxalúria, primária, Síndrome de degeneração hepatolenticular, doença de Wilson, artro-oftalmopatia hereditária, síndrome de Stickler, lipidose distópica hereditária, hemocromatose hereditária (HHC), hemocromatose, telangiectasia hemorrágica hereditária (HHT), miopatia do corpo de inclusão hereditária, regeneração do músculo esquelético, anemia de carga de ferro hereditária, Anemia sideroblástica ligada ao X, neuropatia motora e sensitiva hereditária, neuronopatia motora hereditária, tipo V, neuropatia motora hereditária distal, exostoses múltiplas hereditárias, câncer colorretal não polipose hereditária, síndrome da febre periódica hereditária, Polipose Coli Hereditária, Polipose adenomatosa familiar, Polipose adenomatosa familiar, Resistência hereditária à proteína C ativada, trombofilia de Leiden fator V, neuropatia hereditária sensorial e autônoma tipo III, disautonomia familiar, paraplegia espástica hereditária, paralisia espástica hereditária ascendente de início infantil, ataxia espinhal hereditária, ataxia de Friedreich, esclerose espinhal hereditária, ataxia de Friedreich, anemia de Herrick, OSMED heterozigoto, síndrome de Weissenbacher-Zweymüller, displasia otospondilomegaepifisária heterozigótica, síndrome de Weissenbacher-Zweymüller, deficiência de HexA, doença de Tay-Sachs, deficiência de hexosamidase A, doença de Tay-Sachs, deficiência da subunidade alfa hexosaminidase (qualquer variante, por exemplo, variante A, variante B), doença de Tay- Sachs, hemocromatose associada a HFE, hemocromatose, HGPS, Progéria, doença de Hippel-Lindau, doença de von Hippel-Lindau, hemocromatose (HLAH), neuropatia motora hereditária distal (HMN V), câncer colorretal hereditário não polipose (HNPCC), neuropatia hereditária com risco de paralisia por pressão (HNPP), homocistinúria, deficiência de oxidase do ácido homogentísico, alcaptonúria, acidura homogentísica, alcaptonúria, porfiria homozigótica cutânea tardia, porfiria hepatoeritropiética, hiperoxalúria, primária (HP1), hiperoxalúria (HP2), hiperfenilalaninemia (HPA), Deficiência de hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase - HPRT, síndrome de Lesch-Nyhan, HSAN tipo III, disautonomia familiar, disautonomia familiar (HSAN3), neuropatia sensorial hereditária (qualquer tipo, por exemplo, HSN-1, HSN-II, HSN- III), disautonomia familiar, dermatosparaxia humana, doença de Huntington, síndrome de progéria de Hutchinson-Gilford, progéria,
hiperandrogenismo, tipo não clássico devido a deficiência 21- hidroxilase, hiperquilomicronemia, deficiência de lipoproteína lipase familiar, familiar, Hiperglicinemia com cetoacidose e leucopenia, acidemia propiônica, hiperlipoproteinemia de tipo I, deficiência de lipoproteína lipase, hiperoxalúria familiar, hiperfenilalaninemia primária, hiperfenilalaninemia, hiperfenilalaninemia, Hipocondrodisplasia, Hipochondroplasia, Hipochondrogênese, Hipocondroplasia, anemia hipocrômica, Anemia sideroblástica ligada ao X, deficiência de hipoxantina fosforribosiltransferase (HPRT), síndrome de Lesch-Nyhan, paralisia espástica hereditária ascendente de início infantil (IAHSP), síndrome de CIF, imunodeficiência, síndrome de anomalias faciais e instabilidade centrômero, hemocromatose idiopática, hemocromatose, tipo 3, hemocromatose neonatal idiopática, hemocromatose, neonatal, hipertensão pulmonar idiopática, distúrbios do sistema imunológico, imunodeficiência combinada grave ligada ao X, Incontinentia pigmenti, doença de Gaucher cerebral infantil, doença de Gaucher infantil, paralisia espástica hereditária ascendente com início na infância, Infertilidade, enfisema herdado, tendência herdada a paralisia por pressão, neuropatia hereditária com risco de paralisia por pressão, síndrome de Insley-Astley, displasia otospondilomegaepifisária, síndrome de porfiria aguda intermitente, porfiria intermitente aguda, síndrome de pigmentação de polipose cutânea intestinal, Síndrome de Peutz-Jeghers, incontinência pigmentar (IP), distúrbio de armazenamento de ferro, hemocromatose, isodicêntrica 15, isodicêntrica 15, surdez isolada, surdez não sindrômica, síndrome de Jackson-Weiss, síndrome de Joubert, esclerose lateral primária juvenil (JPLS), esclerose lateral amiotrófica juvenil, gota juvenil, coreoatetose, síndrome de retardo mental, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de hiperuricemia juvenil, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Jackson- Weiss (JWS), atrofia muscular espinhal e bulbar, atrofia muscular espinhal e bulbar de Kennedy, atrofia muscular espinhal e bulbar, histocitose de Querasina, lipoidose de Querasina, tesaurismose de Querasina, glicinemia cetótica, acidemia propiônica, hiperglicinemia cetótica, acidemia propiônica, doenças renais, hiperoxalúria, primário, displasia de Kniest, doença de Krabbe, doença de Kugelberg-Welander, atrofia muscular espinhal, demência lacunar, síndrome de CADASIL, acondrogênese de Langer-Saldino, displasia de Langer-Saldino, doença de Alzheimer de início tardio, doença de Krabbe de início tardio (LOKD), doença de Krabbe, distúrbios de aprendizagem, dificuldade de aprendizagem, lentiginose perioral, síndrome de Peutz-Jeghers, síndrome de Lesch-Nyhan, leucodistrofias, leucodistrofia com fibras de Rosenthal, doença de Alexander, leucodistrofia, espongiforme, síndrome de Li-Fraumeni (LFS), síndrome de Li-Fraumeni, deficiência de lipase D, deficiência de lipoproteína lipase, deficiência familiar de LIPD, deficiência de lipoproteína lipase, lipidose familiar, cerebrosídeo, lipidose, gangliosídeo infantil, doença Tay-Sachs, histiocitose lipídica (tipo querasina), deficiência de lipoproteína lipase, doenças hepáticas familiares, galactosemia, doença de Lou Gehrig, síndrome de Louis-Bar, ataxia telangiectasia, síndrome de Lynch, câncer colorretal não polipose hereditário, deficiência de lisil-hidroxilase, doença de Machado-Joseph, ataxia espinocerebelar (qualquer tipo, por exemplo SCA1, SCA2, SCA3, SCA18, SCA20, SCA21, SCA23, SCA26, SCA28, SCA29), Câncer de mama masculino, câncer de mama, Distúrbios genitais masculinos, Neoplasia maligna da mama, câncer de mama, tumor maligno da mama, câncer de mama, tumor maligno de bexiga urinária, câncer de bexiga, câncer mamário, câncer de mama, síndrome de Marfan, síndrome de Marcador X, síndrome de X frágil, síndrome de Martin-Bell, síndrome de X frágil, síndrome de McCune-Albright, síndrome de McLeod, síndrome de MEDNIK, anemia mediterrânea, beta-talassemia, nanismo mega- epifisário, displasia otospondilomega-epifisária, síndrome de Menkea,
doença de Menkes, doença de Menkes, retardo mental com anormalidades osteocartilaginosas, síndrome de Coffin-Lowry, distúrbios metabólicos, nanismo metatrópico, tipo II, displasia Kniest, displasia metatrópica tipo II, Metemoglobinemia (qualquer tipo, por exemplo, congênita, tipo de globina beta, metemoglobinemia congênita tipo II), acidemia metilmalônica, síndrome de Marfan (MFS), MHAM, síndrome de Cowden, micro síndrome, microcefalia, MMA, acidemia metilmalônica, doença de Menkes (AKA MK ou MNK), síndrome da monossomia 1p36, doença dos neurônios motores, esclerose lateral amiotrófica, esclerose lateral amiotrófica, distúrbios do movimento, síndrome de Mowat-Wilson, mucopolissacaridose (MPS I), mucoviscidose, Demência por multi-infarto, síndrome de CADASIL, deficiência múltipla de carboxilase, início tardio, deficiência de biotinidase, síndrome de hamartoma múltiplo, síndrome de Cowden, neurofibromatose múltipla, distrofia muscular (qualquer tipo, incluindo, por exemplo, tipo Duchenne e Becker), miotonia atrófica, distrofia miotônica, Miotonia distrófica, síndrome de Nance-Insley, displasia otospondilomegaepifisária, condrodisplasia de Nance-Sweeney, displasia otospondilomegaepifisária, NBIA1, neurodegeneração associada ao pantotenato-quinase, síndrome de Neill-Dingwall, Síndrome de Cockayne, Neuroblastoma, retina, retinoblastoma, neurodegeneração com acúmulo de ferro no cérebro tipo 1, neurodegeneração associada a pantotenato quinase, doenças neurológicas, distúrbios neuromusculares, neuronopatia motora hereditária distal, Niemann-Pick, doença de Niemann-Pick, síndrome de Noack, hiperglicinemia não cetótica, encefalopatia por glicina, doença de Gaucher não neuronopática, hiperfenillalaninemia não fenilcetonúrica, deficiência de tetra-hidrobiopterina, surdez não- sindrômica, síndrome de Noonan, doença de Norrbottnian Gaucher, Ocronose, alcaptonúria, Artrite Ocronótica, alcaptonúria, síndrome de
Ogden, osteogênese imperfeita (OI), doença de Osler-Weber-Rendu, telangiectasia hemorrágica hereditária, OSMED, displasia otospondilomegaepifisária, osteogênese imperfeita, osteopsatirose, osteogênese imperfeita, osteosclerose congênita, Displasia otoespondilo-megaepifisária, displasia otoespondilomegaepifisária, displasia otospondilomegaepifisária, Oxalose, hiperoxalúria primária, Oxalúria, primária, hiperoxalúria, primária, neurodegeneração associada a pantotenato quinase, deficiência de Patau, (Trisomy 13), deficiência de PBGD, porfiria intermitente aguda, deficiência de PCC, acidemia propiônica, porfiria cutânea tardia (PCT), doença PDM, síndrome de Pendred, Doença periódica, Febre mediterrânea, Peritonite periódica familiar, sSíndrome de lentiginose periorterial, Síndrome de Peutz-Jeghers, distúrbios do nervo periférico, disautonomia familiar, Neurofibromatose periférica, Atrofia muscular peroneal, peroxissoma alanina: deficiência de glioxilato aminotransferase, hiperoxalúria, síndrome primária de Peutz-Jeghers, doença de deficiência de fenilalanina hidroxilase, Feocromocitoma, doença de von Hippel-Lindau, síndrome de Pierre Robin com condrodisplasia fetal, síndrome de Weissenbacher-Zweymüller, cirrose pigmentar, hemocromatose, síndrome de Peutz-Jeghers (PJS), neurodegeneração associada a pantotenato quinase (PKAN), PKU, fenilcetonúria, plumboporfiria, porfiria por deficiência de ALA, PMA, doença renal policística, displasia fibrosa poliostótica, síndrome de McCune – Albright, polipose adenomatosa familiar, polipose intestinal hamartomatosa, síndrome de pólipos e manchas, síndrome de Peutz-Jeghers, deficiência de porfobilinogênio sintase, porfiria por deficiência de ALA, distúrbio da porfirina, deficiência de PPOX, porfiria variegata, síndrome de Prader- Labhart-Willi, síndrome de Prader-Willi, demência pré-senil e senil, discinesia ciliar primária (PCD), hemocromatose primária, hemocromatose, síndrome da hiperuricemia primária, síndrome de
Lesch-Nyhan, demência primária degenerativa senil, procolágeno tipo EDS VII, mutante, progéria, Síndrome de Progéria Hutchinson Gilford, síndrome do tipo Progéria, síndrome de Cockayne, nanismo progeroide, síndrome de Cockayne, coreia progressiva, hereditária crônica (Huntington), doença de Huntington, osteogênese imperfeita deformando progressivamente com esclera normal, Osteogênese imperfeita (qualquer tipo, por exemplo Tipo I, Tipo II, Tipo III, Tipo IV, Tipo V, Tipo VI, Tipo VII, Tipo VIII), distrofia miotônica proximal (PROMM), acidemia propiônica, deficiência de propionil-CoA carboxilase, deficiência de proteína C, deficiência de proteína S, protoporfiria, deficiência de protoporfirinogênio oxidase, porfiria variegata, distrofia miotônica proximal, distrofia miotônica 2, miopatia miotônica proximal, doença de pseudo-Gaucher, pseudoxantoma elástico, psicosina lipidose, doença de Krabbe, hipertensão arterial pulmonar, hipertensão pulmonar, pseudoxantoma elástico (PXE), pseudoxantoma elástico, retinoblastoma (Rb), doença de Recklinghausen, polisserosite recorrente, distúrbios da retina, síndrome da surdez e retinite pigmentosa, síndrome de Usher, retinoblastoma, síndrome de Rett, RFALS tipo 3, síndrome de Ricker, síndrome de Riley- Day, disautonomia familiar, síndrome de Roussy-Levy, Síndrome de Rubinstein-Taybi (RSTS), síndrome de Rett (RTS), síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome de Sack- Barabas, doença de SADDAN facilidade, síndrome da família de sarcoma de Li e Fraumeni, síndrome de Li-Fraumeni, síndrome de SBLA (sarcoma, mama, leucemia e síndrome da glândula adrenal), síndrome de Li-Fraumeni, atrofia muscular espinhal e bulbar (SBMA), Schwannoma, acústico, bilateral, neurofibromatose tipo II, síndrome de Schwartz-Jampel, imunodeficiência combinada grave ligada ao X (SCIDX1), SED congênita, displasia espondiloepifisária congênita, SED Strudwick, displasia espondiloepimetafisária, tipo Strudwick, displasia espondiloepifisária congênita (SEDc), displasia espondiloepimetafisária (SEMD), SEMD tipo Strudwick, demência senil, acondroplasia grave com atraso no desenvolvimento e acantose nigricans, doença de SADDAN, síndrome de Shprintzen, síndrome de retardo mental ligado ao X Siderius causada por mutações no gene PHF8, síndrome do esqueleto-cérebro-pele, distúrbios de pigmentação da pele, atrofia da musculatura espinhal (SMA), displasia espondilo-meta-epifisária (SMED) (qualquer tipo, Tipo Studwick, tipo 1), síndrome de Smith-Lemli- Opitz, síndrome de Smith Magenis, porfiria genética sul-africana, paralisia espástica ascendente de início infantil, paralisia espástica hereditária ascendente de início infantil, distúrbios da fala e da comunicação, esfingolipidose, Tay-Sachs, Doença de Tay-Sachs, atrofia muscular espinhal e bulbar, atrofia muscular espinhal, atrofia muscular espinhal, tipo V distal, neuropatia motora hereditária distal, atrofia muscular espinhal distal com predominância de membro superior, neuropatia motora hereditária distal, ataxia espinocerebelosa, displasia congênita espondiloefifisária, displasia espondiloepifisária congênita, colagenopatia (qualquer tipo, por exemplo, tipos II e XI), displasia espondiloepimetafisária, displasia espondilometafisária (SMD), displasia espondiloepimetafisária, degeneração esponjosa do sistema nervoso central, degeneração esponjosa do cérebro, degeneração esponjosa de substância branca na infância, hipertensão pulmonar prinária esporádica, síndrome SSB, síndrome do cabelo de aço, doença de Menkes, doença de Steinert, distrofia miotônica, síndrome da distrofia miotônica de Steinert, distrofia miotônica, síndrome de Stickler, derrame, síndrome de CADASIL, síndrome de Strudwick, doença de Gaucher neuronopática subaguda, porfiria genética sueca, porfiria aguda intermitente, porfiria aguda intermitente, displasia da cartilagem do ‘queijo suíço', displasia de Kniest, Doença de Tay-Sachs, TD - nanismo tanatofórico, displasia tanatofórica, TD com fêmures retos e crânio de trevo, displasia tanatofórica Tipo 2, Telangiectasia, cerebelo-oculocutânea, ataxia telangiectasia, síndrome da feminização testicular, síndrome da insensibilidade a androgênio, tetra-hidrobiopterina, síndrome da feminização testicular (TFM), síndrome de insensibilidade a androgênio, talassemia intermediária, beta-talassemia, Talassemia maior, beta-talassemia, displasia tanatofórica, trombofilia por deficiência de cofator para proteína C ativada, tipo Leiden, fator V trombofilia de Leiden, doença da tireoide, neuropatia do tomate, neuropatia hereditária com risco de paralisia por pressão, deficiência total de HPRT, síndrome de Lesch-Nyhan, Deficiência total de hipoxantina-guanina fosforibosil transferase, síndrome de Lesch-Nyhan, síndrome de Treacher Collins, Trias fragilitis ossium (ossos moles e frágeis), síndrome do triplo X, síndrome do Triplo X, trissomia 21Trissomia X, síndrome de Troisier-Hanot-Chauffard, hemocromatose, doença de Tay-Sachs (TSD), Complexo de Esclerose Tuberosa (TSC), Esclerose Tuberosa, Síndrome tipo Turner, Síndrome de Noonan, doença por deficiência de UDP-galactose-4-epimerase, galactosemia, doença por deficiência de UDP glicose 4-epimerase, galactosemia, deficiência de UDP glicose hexose-1-fosfato uridililtransferase, galactosemia, surdez indiferenciada, surdez não sindrômica, deficiência de UPS, porfiria intermitente aguda, câncer de bexiga urinária, câncer de bexiga, deficiência de UROD, deficiência de uroporfirinogênio descarboxilase, deficiência de uroporfirinogênio sintase, porfiria aguda intermitente, síndrome de Usher, deficiência de UTP hexose-1-fosfato uridililtransferase, galactosemia, síndrome de Van Bogaert-Bertrand, síndrome de Van der Hoeve, síndrome Velocardiofacial, síndrome VHL, doença de von Hippel-Lindau, comprometimento da visão e cegueira, síndrome de Alström, doença de von Bogaert-Bertrand, doença de von Hippel-Lindau, doença de von Recklenhausen-Applebaum, hemocromatose, doença de von
Recklinghausen, neurofibromatose tipo I, doença de Vrolik, osteogênese imperfeita, síndrome de Waardenburg, Síndrome de Warburg Sjo Fledelius, Micro síndrome, Doença de Wilson (WD), Síndrome de Weissenbacher-Zweymüller, Doença de Werdnig- Hoffmann, atrofia muscular espinhal, Síndrome de Williams, Doença de Wilson, Doença de Wilson, Doença de Wilson, Síndrome de Wolf- Hirschhorn, Doença periódica de Wolff, Síndrome de Weissenbacher- Zweymüller (WZS), Xeroderma pigmentoso, retardo mental ligado ao X e macro-orquidismo, síndrome do X frágil, hiperuricemia primária ligada ao X, síndrome de Lesch-Nyhan, imunodeficiência combinada grave ligada ao X, anemia sideroblástica ligada ao X, atrofia muscular espinhal-bulbar ligada ao X, atrofia muscular espinhal-bulbar ligada, defeito enzimático da acidúria úrica ligada ao X, síndrome de Lesch- Nyhan, X-SCID, imunodeficiência combinada grave ligada ao X, anemia sideroblástica ligada ao X (XLSA), X-SCID, imunodeficiência combinada grave ligada ao X, anemia sideroblástica ligada ao X (XLSA), XSCID, imunodeficiência combinada grave ligada ao X, síndrome XXX, síndrome do triplo X, síndrome XXXX, síndrome XXXXX, XXXXX, síndrome XXY, trissomia XXY, síndrome de Klinefelter, síndrome XYY, distúrbios da repetição tripla ou qualquer combinação dos mesmos.
[00325] Nas modalidades, um modulador de controle pós- transcricional específico é direcionado para modulação, modificação, aprimoramento ou diminuição da atividade pela administração de um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição genômica. Por exemplo, moduladores de controle pós-transcricionais podem incluir PARN, PAN, CPSF, CstF, PAP, PABP, PAB2, CFI, CFII, RNA trifosfatase, RNA gluaniltransferase, RNA metiltransferase, SAM sintase, enzima E2R conjugadora de ubiquitina, proteínas SR SFRS1 a SFR11, proteínas hnRNP (por exemplo HNRNPA0, HNRNPA1, HNRNPA1L1, HNRNPA1L2, HNRNPA2, HNRNPA2B1, HNRNPAB, HNRNPB1,
HNRNPC, HNRNPCL1, HNRNPD, HNRPDL, HNRNPF, HNRNHP1, HNRNPH2, HNRNPH3, HNRNPK, HNRNPL, HNRNPLL, HNRNPM, HNRNPR, HNRNPU, HNRNPUL1, HNRNPUL2, HNRNPUL3, ADAR, Mex 67, MtR2, Nab2, helicase dead-box, elF4A, elF4B, elF4E, elF4G, GEF, GCN2, PKR, HRI, PERK, eEF1, eEF2, GCN, eRF3, proteínas de ligação a ARE, EXRN1, DCP1, DCP2, RCK/p54, CPEB, eIF4E, microRNAS e siRNAs, DICER, proteínas Ago, proteínas de degradação de mRNA não mediadas não sentido, UPF3A, UPF3BeIF4A3, MLN51, Y14/MAGOH, MG-1, SMG-5, SMG-6, SMG-7 ou qualquer combinação dos mesmos.
[00326] Em algumas modalidades, as vias genéticas associadas ao ciclo celular são moduladas, aprimoradas ou diminuídas em atividade pela administração de um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição genômica. Vias e genes exemplares associados ao ciclo celular incluem ATM, PMS2, FAS-L, MRE11, MLH1, FasR, NBS1, MSH6, Trail-L, RAD50, MSH2, Trail-R, 53BP1, RFC, TNF-Ct, P53, PCNA, TNF-R1, CHKE, MSH3, FADD, E2F1, MutS, homólogo, TRADD, PML, MutL, homólogo, R1P1, FANCD2, exonuclease, MyD88, SMC1, DNA, polimerase, delta, IRAK, BLM1, (POLD1, POLD2, POLD3, NIL, BRCA1 e, POLD4, -genes, IKK, H2AX, codificação, subunidades), NFΚβ, ATR, Topoisomerase, 1, ΙκΒα, RPA, Topoisomerase, 2, IAP, ATRIP, RNAseHl, Caspase, 3, RAD9, Ligase, 1, Caspase, 6, RAD1, DNA, polimerase, 1, Caspase, 7, HUS, DNA, polimerase, 3, Caspase, 8, RAD17, Primase, Caspase, 10, RFC, Helicase, HDAC1, CHK1, filamento único, ligação, HDAC2, TLK1, proteínas, citocromo, C, CDC25, Bxl-xL, STAT3, STAT5, DFF45, Vcl-2, ENDO-G, PI3K, Akt, Calpaína, Bad, Bax, proteólise mediada por ubiquitina, Hipóxia, Proliferação Celular, HIF-loc, MAPK, El, HERC1, TRAF6, HIF-β, MAPKK, E2, UBE2Q, MEKK1, Refl, MAPKKK, E3, UBE2R, COP!, HSP90, c-Met, UBLE1A, UBE2S, PIFH2, VEGF, HGF, UBLE1B,
UBE2U, cIAP, PAS, ER, S1/2, UBLEIC, UBE2W, PIAS, ARNT, ATK, UBE2A, UBE2Z, SYVN, VHL, PKCs, UBE2B, AFC, LLC, N, NHLRC1, HLF, Paxilina, UBE2C, UBE1, AIRE, EPF, FAK, UBE2A, E6AP, MGRN1, VDU2, Aducina, UBE2E, UBE3B, BRCA1, SUMORESUME, PYK1, UBE2F, Smurf, FANCL, SENP1, RB, UBE2G1, Itch, MIDI, Calcineurina, A, RBI, UBE2G2, HERC2, Cdc20, RACK1, Raf-1, UBE2I, HERC3, Cdh1, PTB, A-Raf, UBE2J1, HERC4, Apcl, Hur, B-raf, UBE2J2, UBE4A, Apc2, PHD2, MEK1/2, UBE2L3, UBE4B, Apc3, SSAT2, ERK1/2, UBE2L6, CHIP, Apc4, SSAT1, Ets, UBE2M, CYC4, Apc5, GSK3, Elkl, UB2N, PPR19, Apc6, CBP, SAP1, UBE20, UIP5, Apc7, FOX04, cPLA2, WWPI, Mdm2, Apc8, FlH-1, WWP2, Parkin, Apc9, TRIP, 12, Trim32, Ape, 10, NEED4, Trim37, Ape, 11, ARF-BP1, SIAH-1, Ape, 12, EDD1, PML, Célula, sobrevivência, Célula, ciclo, parada, SMADI, P21, SMAD5, BAX, SAMD8, MDR, LEF1, DRAIL, IGFBP3, TCF3, GADD45, TCF4, P300, HAT1, PI3, Akt, GF1 ou qualquer combinação dos mesmos.
[00327] Em algumas modalidades, os genes associados à angiogênese são modulados, aprimorados ou diminuídos em atividade pela administração de um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição genômica a uma célula. Genes e vias genéticas exemplares associados à angiogênese e condições relacionadas à angiogênese incluem VEGF, VEGFR2, SHC, E2F7, VEGFB, VEGFR3, PI3, VEGFC, Nrp1, PIP3, EGFDIP3, DAG, GRB2, SOS, Akt, PB, PKC, Ras, RAF1, DAG, eNOS, NO, ERK1, ER2, cPLA2, ME1, MEK2 ou qualquer combinação dos mesmos.
[00328] Em algumas modalidades, as vias genéticas e/ou genes associados à função mitocondrial são modulados, aprimorados ou diminuídos em atividade pela administração de um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição genômica em uma célula. Genes e vias genéticas exemplares associados à função mitocondrial incluem Malato desidrogenase Aminotransferase, Hidratase, Desacilase, Desidrogenase, Carboxilase, Carboxilase, Mutase, oxidação de ácidos graxos, Oxidação de leucina, distúrbios de isoleucina (via enximátiva, deficiências da via de oxidação)aminotransferase aminotransferase, cadeia ramificada OCTN2, cadeia ramificada, FATP1 -6 aminotrasferase 2, aminotrasferase 2 , CPT-1 mitocondrial mitocondrial, CACT Isobutiltil-CoA 2-metilbutilil-CoA, CPT-II dehidrogenase, Dehidrogenase, SCAD (Complexo de cadeia ramificada (cadeia ramificada, MCAD cetoácido, cetoácido, VLCAD dehidrogenase, dehidrogenase, complexo ETF-DH)), Alpha-ETF Hidratase, Hidratase, Beta-ETF HMG-CoA-liase 2-metil-3-OH- SCHAD butiril-CoA, LCHAD desidrogenase, MTP 3-Oxotiolase, LKAT, DECR 1, HMGCS2, HMGCL ou qualquer combinação dos mesmos.
[00329] Em algumas modalidades, as vias genéticas e/ou os genes associados ao dano ao DNA ou à instabilidade genômica são modulados, aumentados ou diminuídos em atividade. Genes e vias genéticas exemplares associados a vias e/ou genes relacionados a danos no DNA e instabilidade genômica incluem 53BP1, BLM, MBD2, DNA, ligase, 4, MDC1, H2AX, XLF, SMC1, 53BP1, Rad50, P53, P53, Artemis, Rad27, TdT, APE1, PMS2, APE2, UvrA, RecA, MLH1, NEIL1, UvrB, SSB, MSH6, NEIL2, UvrC, Mrell, MSH2, NEIL3, XPC, Rad50, RFC, XRCC1, Rad23B, Nbsl, PCNA, PNKP, CEN2, CtIP, MSH3, Tdpl, DDB1, RPA, MutS, APTX, XPE, Rad51, MutL, DNA, polimerase β CSA, Rad52, DNA polimerase δ, CSB, Rad54, Topoisomerase, 1, DNA, TFT1H, BRCA1, Topoisomerase, 2, PCNA, XPB, BRCA2, RNAseHl, FEN1, XPD, Exol, Ligase 1, RFC, XPA, BLM, DNA, polimerase, 1, PAR, 1, RPA, Topllla, DNA, Ligl, XPG, GEN1, Primase, Lig3, ERCC1 Yenl Helicase, UNG, XPF, Slxl, SSBs, MUTY DNA polimerase δ, Slx4, SMUG DNA polimerase ε, Mus8, MBD4, Emel, Dssl, ASH1L, SETD4, DQT1L, SETD5, EHMT1, SETD6, EHMT2, SETD7, EZH1, SETD8, EZH2,
SETD9, MLL, SETDB1, MLL2, SETDB2, MLL3, SETMAR, MLL4, SMYD, 1, MLL5, SMYD2, NSD, 1, SMYD3, PRDM2, SMYD4, SET, SMYD5, SETBP1, SUV39H1, SETD 1A, SUV39H2, SETD 1B, SUV420H1, SETD2, SUV420 H2, SETD3 ou qualquer combinação dos mesmos.
[00330] Em algumas modalidades, os genes que codificam para fatores de transcrição de mamíferos são modulados, aprimorados, diminuídos ou fornecidos a uma célula. Exemplos de fatores de transcrição humana incluem AFF4, AFF3, AFF2, AFF1, AR, TFAP2B, TFAP2D, TFAP2C, TFAP2E, TFAP2A, JARID2, KDM5D, ARID4A, ARID4B, KDM5A, ARID3A, KDM5B, KDM5C, ARID5B, ARID3B, ARID2, ARID5A, ARID3C, ARID1A, ARID1B, HIF1A, NPAS1, NPAS3, NPAS4, MLXIPL, ARNTL2, MXD1, AHRR, TFE3, HES2, MNT, TCF3, SREBF1, TFAP4, TCFL5, LYL1, USF2, TFEC, AHR, MLX, MYF6, MYF5, SIM1, TFEB, HAND1, HES1, ID2, MYCL1, ID3, TCF21, MXI1, SOHLH2, MYOG, TWIST1, NEUROG3, BHLHE41, NEUROD4, MXD4, BHLHE23, TCF15, MAX, ID1, MYOD1, ARNTL, BHLHE40, MYCN, CLOCK, HEY2, MYC, ASCL1, TCF12, ARNT, HES6, FERD3L, MSGN1, USF1, TAL1, NEUROD1, TCF23, HEYL, HAND2, NEUROD6, HEY1, SOHLH1, MESP1, PTF1A, ATOH8, NPAS2, NEUROD2, NHLH1, ID4, ATOH1, ARNT2, HES3, MLXIP, ASCL3, KIAA2018, OLIG3, NHLH2, NEUROG2, MSC, HES7, ATOH7, BHLHA15, BHLHE22, NEUROG1, FIGLA, ASCL2, OLIG1, TAL2, MITF, SCXB, HELT, ASCL4, MESP2, HES4, SCXA, TCF4, HES5, SREBF2, BHLHA9, OLIG2, MXD3, TWIST2, LOC388553, C13orf38-SOHLH2, CEBPE, XBP1, BATF3, CREB5, CEBPG, ATF3, ATF7, CEBPB, CEBPD, CEBPA, CBFB, CAMTA2, CAMTA1, EBF4, EBF3, EBF1, EBF2, NR2F6, NR2F1, NR2F2, GRHL2, TFCP2L1, GRHL1, TFCP2, UBP1, GRHL3, YBX2, CSDE1, CSDA, YBX1, LIN28A, CARHSP1, CSDC2, LIN28B, NFIX, NFIC, NFIB, NHIA, CUX2, ONECUT2, CUX1, ONECUT1, SATB1, ONECUT3, SATB2,
DMRT3, DMRT1, DMRTC2, DMRTA2, DMRTB1, DMRT2, DMRTA1, E2F2, E2F1, E2F3, TFDP2, E2F8, E2F5, E2F7, E2F6, TFDP3, TFDP1, E2F4, NR1H3, NR1H2, ETV1, ETV7, SPI1, ELF4, ETV2, ERF, ELF2, ELK3, ETV3, ELF1, SPDEF, ELK1, ETS1, EHF, ELF5, ETV6, SPIB, FLI1, GABPA, ERG, ETS2, ELF3, FEV, SPIC, ETV4, ETV5, FOXN3, FOXC1, FOXJ2, FOXF1, FOXN1, FOXM1, FOXP1, FOXO3, FOXA2, FOXP2, FOXJ1, FOXP4, FOXF2, FOXN4, FOXK2, FOXO1, FOXH1, FOXQ1, FOXK1, FOXI1, FOXD4, FOXA3, FOXN2, FOXB1, FOXG1, FOXR1, FOXL1, FOXC2, FOXE1, FOXS1, FOXL2, FOXO4, FOXD4L1, FOXD4L4, FOXD2, FOXI2, FOXE3, FOXD3, FOXD4L3, FOXR2, FOXJ3, FOXO6, FOXB2, FOXD4L5, FOXD4L6, FOXD4L2, KIAA0415, FOXA1, FOXP3, GCM2, GCM1, NR3C1, GTF2IRD1, GTF2I, GTF2IRD2B, GTF2IRD2, SOX8, SOX30, PMS1, CIC, TCF7, TOX4, SOX10, HMGXB4, HBP1, TFAM, UBTF, WHSC1, SOX6, HMGXB3, BBX, TOX2, SOX4, SOX21, SOX9, SOX15, SOX5, SOX3, LEF1, HMG20A, SOX13, TCF7L2, SSRP1, TCF7L1, SOX17, SOX14, PINX1, SOX7, SOX11, SOX12, SOX2, SOX1, SRY, SOX18, UBTFL1, UBTFL2, TOX, HMGB1, HMGB2, PBRM1, TOX3, SMARCE1, HMG20B, HMGB3, HMGA2, HMGA1, ARX, HOXA11, MEOX1, DLX6, ISL1, HOXC8, BARX2, ALX4, GSC2, DLX3, PITX1, HOXA9, HOXA10, LHX5, LASS4, ZFHX4, SIX4, VSX1, ADNP, RHOXF1, MEIS3, PBX4, DLX5, HOXA1, HOXA2, HOXA3, HOXA5, HOXA6, HOXA13, EVX1, NOBOX, MEOX2, LHX2, LHX6, LHX3, TLX1, PITX3, HOXB6, HNF1B, DLX4, SEBOX, VTN, PHOX2B, NKX3-2, DBX1, NANOG, IRX4, CDX1, TLX2, DLX2, VAX2, PRRX1, TGIF2, VSX2, NKX2-3, HOXB8, HOXB5, HOXB7, HOXB3, HOXB1, MSX2, LHX4, HOXA7, HOXC13, HOXC11, HOXC12, ESX1, BARHL1, NKX2-4, NKX2-2, SIX1, HOXD1, HOXD3, HOXD9, HOXD10, HOXD11, HOXD13, MNX1, CDX4, BARX1, RHOXF2, LHX1, GSC, MEIS2, RAX, EMX1, NKX2-8, NKX2-1, HLX, LMX1B, SIX3, LBX1, PDX1, LASS5, ZFHX3, BARHL2, LHX9, LASS2, MEIS1, DLX1,
HMBOX1, ZEB1, VAX1, NKX6-2, VENTX, HHEX, TGIF2LX, LASS3, ALX3, HOXB13, IRX6, ISL2, PKNOX1, LHX8, LMX1A, EN1, MSX1, NKX6-1, HESX1, PITX2, TLX3, EN2, UNCX, GBX1, NKX6-3, ZHX1, HDX, PHOX2A, PKNOX2, CDX2, DRGX, NKX3-1, PBX3, PRRX2, GBX2, SHOX2, GSX1, HOXD4, HOXD12, EMX2, IRX1, IRX2, SIX2, HOXB9, HOPX, OTP, LASS6, HOXC5, HOXB2, RAX2, EVX2, ZHX3, PROP1, ISX, HOXD8, TGIF2LY, IRX5, SIX5, TGIF1, IRX3, ZHX2, LBX2, NKX2-6, ALX1, GSX2, HOXC9, HOXC10, HOXB4, NKX2-5, SIX6, MIXL1, DBX2, PBX1, SHOX, ARGFX, HMX3, HMX2, BSX, HOXA4, DMBX1, HOXC6, HOXC4, RHOXF2B, PBX2, DUXA, DPRX, LEUTX, NOTO, HOMEZ, HMX1, DUX4L5, DUX4L2, DUX4L3, DUX4L6, NKX1- 1, HNF1A, HSF4, HSFY2, HSFX1, HSFX2, HSFY1, HSF1, LCORL, LCOR, IRF6, IRF1, IRF3, IRF5, IRF4, IRF8, IRF2, IRF7, IRF9, MBD3, BAZ2B, MBD4, SETDB2, MBD1, MECP2, SETDB1, MBD2, BAZ2A, SMAD7, SMAD5, SMAD7, SMAD5, SMAD9, SMAD6, SMAD4, SMAD3, SMAD1, SMAD2, ZZZ3, RCOR1, CDC5L, MYBL2, DNAJC2, TADA2A, RCOR3, MYB, TERF2, DMTF1, DNAJC1, NCOR1, TERF1, MIER3, MYSM1, SNAPC4, RCOR2, TADA2B, MYBL1, TERF1P2, NCOR2, CCDC79, SMARCC1, SMARCC2, TTF1, C11orf9, NFYA, NFYC, NFYB, NRF1, NR4A3, NR4A1, NR4A2, ESR1, NR0B2, NR0B1, PREB, EAF2, SPZ1, TP63, TP73, TP53, PAX6, PAX7, PAX2, PAX4, PAX8, PAX1, PAX3, PAX5, PAX9, SUB1, POU2F2, POU1F1, POU4F3, POU6F2, POU2F3, POU2F1, POU4F2, POU4F1, POU6F1, POU3F2, POU3F1, POU3F4, POU3F3, POU5F1, PPU5F1B, PPARD, PPARG, PPARA, PGR, PROX1, PROX2, NR2E1, NR5A2, NR2C1, NR5A1, NR6A1, ESRRA, NR2C2, RFX3, RFX2, RFX4, RFX1, RFX5, RFX7, RFX6, RFX8, NFATC3, NFKB2, NFATC4, NFATC2, NFAT5, RELB, NFKB1, NFATC1, REL, RELA, RORA, RORC, NR1D2, RORB, RUNX3, RUNX1, SP100, SP140, GMEB2, SP110, AIRE, GMEB1, DEAF1, SP140L, LOC729991-MEF2B, MEF2A, SRF, MEF2D, MEF2B, STAT1, STAT5A,
STAT4, STAT6, STAT3, STAT2, STAT5B, TBX21, TBX5, TBX15, TBX18, TBX2, TBX4, TBX22, TBX3, TBR1, TBX19, TBX6, EOMES, T, TBX20, TBX10, MGA, TBX1, TEAD3, TEAD2, TEAD1, TEAD4, CREBL2, NFE2L3, CREB3L3, FOSL2, NFE2L1, CREM, DBP, CREB3, HLF, BACH2, ATF2, NFE2L2, ATF6, CREB1, ATF1, NFE2, FOSB, ATF4, NRL, JUND, JDP2, CREB3L4, BATF, BACH1, CREB3L1, NFIL3, TEF, BATF2, ATF5, FOS, JUNB, DDIT3, FOSL1, JUN, MAF, CREB3L2, MAFA, MAFF, MAFG, MAFK, MAFB, ATF6B, CRX, OTX1, OTX2, THAP3, THAP10, THAP1, PRKRIR, THAP8, THAP9, THAP11, THF2, THAP6, THAP4, THAP5, THAP7, NR1H4, NR2E3, RARB, HNF4A, VDR, ESRRB, THRA, NR1D1, RARA, ESR2, NR1I3, NR1I2, THRB, NR3C2, HNF4G, RARG, RXRA, ESRRG, RXRB, TSC22D1, TSC22D3, TSC22D4, TSC22D2, TULP3, TULP2, TULP1, TULP4, TUB, ZBTB33, ZBTB32, ZBTB11, MYNN, ZBTB25, PATZ1, ZBTB16, ZBTB24, BCL6, ZBTB47, ZBTB17, ZBTB45, GZF1, ZBTB1, ZBTB46, ZBTB8A, ZBTB7B, BCL6B, ZBTB49, ZBTB43, HIC2, ZBTB26, ZNF131, ZNF295, ZBTB4, ZBTB34, ZBTB38, HIC1, ZBTB41, ZBTB7A, ZNF238, ZBTB42, ZBTB2, ZBTB20, ZBTB40, ZBTB7C, ZBTB37, ZBTB3, ZBTB6, ZBTB44, ZFP161, ZBTB12, ZBTB48, ZBTB10, ZBED4, ZBED3, ZBED2, C11orf95, ZBED1, IKZF5, ZNF821, ZNF451, ZNF195, ZFX, ZNF263, ZNF200, HIVEP2, WIZ, ZNF582, SNAI2, ZFP64, IKZF2, ZIC2, ZNF800, PRDM1, PRDM6, ZFP112, ZNF275, ZNF76, ZFAT, KLF6, ZFY, ZXDC, GLI2, ZNF532, ZNF37A, ZNF510, ZNF506, ZNF324, ZNF671, ZNF416, ZNF586, ZNF446, ZNF8, ZNF264, REST, MECOM, ZNF213, ZNF343, ZNF302, ZNF268, ZNF10, HIVEP1, ZNF184, MZF1, SALL4, ZNF516, KLF8, KLF5, ZNF629, ZNF423, CTCF, ZNF500, ZNF174, SALL1, MAS, ZNF419, OVOL3, ZNF175, ZNF14, ZNF574, ZNF85, SP4, ZKSCAN1, GLI3, GLIS3, KLF3, PRDM4, GLI1, PRDM13, ZNF142, PRDM2, ZNF684, ZNF541, KLF7, PLAGL1, ZNF430, ZLF12, KLF9, ZNF410, BCL11A, EGR1, ZFP30, TSHZ3, ZNF549, ZSCAN18, ZNF211, ZNF639,
ZSCAN20, GTF3A, ZNF205, ZNF644, EGR2, IKZF4, CTCFL, ZNF831, SNAI1, ZNF576, ZNF45, TRERF1, ZNF391, RREB1,, ZNF133, OVOL2, ZNF436, PLAGL2, GLIS2, ZNF384, ZNF484, HIVEP3, BCL11B, KLF2, ZNF780B, FEZF1, KLF16, ZSCAN10, ZNF557, ZNF337, PRDM12, ZNF317, ZNF426, ZNF331, ZNF236, ZNF341, ZNF227, ZNF141, ZNF304, ZSCAN5A, ZNF132, ZNF20, EGR4, ZNF670, VEZF1, KLF4, ZFP37, ZNF189, ZNF193, ZNF280D, PRDM5, ZNF740, ZIC5, ZSCAN29, ZNF710, ZNF434, ZNF287, ZIM3, PRDM15, ZFP14, ZNF787, ZNF473, ZNF614, PRDM16, ZNF697, ZNF687, OSR1, ZNF514, ZNF660, ZNF300, RBAK, ZNF92, ZNF157, ZNF182, ZNF41, ZNF711, PRDM14, ZNF7, ZNF214, ZNF215, SALL3, ZNF827, ZNF547, ZNF773, ZNF776, ZNF256, ZSCAN1, ZNF837, PRDM8, ZNF117, ZIC1, FEZF2, ZNF599, ZNF18, ZLF10, ZKSCAN2, ZNF689, ZIC3, ZNF19, ZSCAN12, ZNF276, ZNF283, ZNF221, ZNF225, ZNF230, ZNF222, ZNF234, ZNF233, ZNF235, ZNF362, ZNF208, ZNF714, ZNF394, ZNF333, ZNF382, IKZF3, ZNF577, ZNF653, ZNF75A, GFI1, ZNF281, ZNF496, ZNF2, ZNF513, ZNF148, KLF15, ZNF691, ZNF589, PRDM9, ZNF12, SP8, OSR2, ZNF367, ZNF22, GFI1B, ZNF219, SALL2, ZNF319, ZNF202, ZNF143, ZNF3, ZSCAN21, ZNF606, SP2, ZNF91, ZNF23, ZNF226, ZNF229, ZFN180, ZNF668, ZNF646, ZNF641, ZNF610, ZNF528, ZNF701, ZNF526, ZNF146, ZNF444, ZNF83, ZNF558, ZNF232, E4F1, ZNF597, INSM2, ZNF30, ZNF507, ZNF354A, ZEB2, ZNF32, KLF13, ZFPM2, ZNF764, ZNF768, ZNF35, ZNF778, ZNF212, ZNF282, PRDM10, SP7, SCRT1, ZNF16, ZNF296, ZNF160, ZNF415, ZNF672, ZNF692, ZNF439, ZNF440, ZNF581, ZNF524, ZNF562, ZNF561, ZNF584, ZNF274, ZIK1, ZNF540, ZNF570, KLF17, ZNF217, ZNF57, ZNF556, ZNF554, KLF11, HINFP, ZNF24, ZNF596, OVOL1, SP3, ZNF621, ZNF680, BNC2, ZNF483, ZNF449, INSM1, ZNF417, ZNF791, ZNF80, GLIS1, ZNF497, KLF14, ZNF266, ZIC4, ZNF408, ZNF519, ZNF25, ZNF77, ZNF169, ZNF613, ZNF683, ZNF135,
ZSCAN2, ZNF575, ZNF491, ZNF620, ZNF619, ZNF354C, ZNF114, ZNF366, ZNF454, ZNF543, ZNF354B, ZNF223, ZNF713, ZNF852, ZNF552, ZNF42, ZNF664, EGR3, ZFPM1, ZNF784, ZNF648, FIZ1, ZNF771, TSHZ1, ZNF48, ZNF816, ZNF571, ZSCAN4, ZNF594, ZFP3, ZNF443, ZNF792, ZNF572, ZNF707, ZNF746, ZNF322A, ZNF467, ZNF678, ZFP41, HKR1, PLAG1, ZNF329, ZNF101, ZNF716, ZNF708, ZSCAN22, ZNF662, ZNF320, ZNF623, ZNF530, ZNF285, ZFP1, WT1, ZFP90, ZNF479, ZNF445, ZNF74, SP1, SNAI3, ZNF696, IKZF1, ZNF267, ZNF566, ZNF224, ZNF529, ZNF284, ZNF749, ZNF17, ZNF555, ZNF75D, ZNF501, ZNF197, ZNF396, ZNF91, ZNF732, ZNF397, ZSCAN30, ZNF546, ZNF286A, ZKSCAN4, ZNF70, ZNF643, ZNF642, ZSCAN23, ZNF490, ZNF626, ZNF793, ZNF383, ZNF669, ZNF559, ZNF177, ZNF548, MTF1, ZNF322B, ZNF563, ZNF292, ZNF567, SP6, ZNF573, ZNF527, ZNF33A, ZNF600, ZKSCAN3, ZNF676, ZNF699, ZNF250, ZNF79, ZNF681, ZNF766, ZNF107, ZNF471, ZNF836, ZNF493, ZNF167, ZNF565, ZNF34, ZNF781, ZNF140, ZNF774, ZNF658, ZNF765, ZNF124, ZNF569, ZNF777, ZNF775, ZNF799, ZNF782, ZNF846, ZNF136, ZKSCAN5, ZNF502, ZFP62, ZNF33B, ZNF512B, ZNF431, ZNF418, ZNF700, ZNF239, ZSCAN16, ZFP28, ZNF705A, ZNF585A, ZNF138, ZNF429, ZNF470, ZNF100, ZNF398, ZNF498, ZNF441, ZNF420, ZNF763, ZNF679, ZNF682, ZNF772, ZNF257, ZNF785, ZSCAN5B, ZNF165, ZNF655, ZNF98, ZNF786, ZNF517, ZNF675, ZNF860, ZNF628, ZNF665, ZNF624, ZNF841, ZNF615, ZNF350, ZNF432, ZNF433, ZNF460, ZNF81, ZNF780A, ZNF461, ZNF181, ZNF781, LOC100287841, ZNF44, ZNF790, ZNF677, ZNF823, ZNF311, ZNF347, ZNF71, ZNF121, ZNF335, ZNF560, ZNF273, ZNF84, ZNF667, ZNF649, ZNF248, ZNF544, ZNF770, ZNF737, ZNF251, ZNF607, ZNF334, ZXDA, ZNF485, ZIM2, PEG3, ZNF192, ZNF442, ZNF813, ZNF26, ZNF69, ZNF583, ZNF568, ZXDB, ZNF480, ZNF587, ZNF808, ZNF43, ZNF28, ZNF627, ZNF789, ZNF536, ZNF534, ZNF652, ZNF521, ZNF358, ZFP2, SP5, ZNF814, ZNF551, ZNF805,
ZSCAN5C, ZNF468, ZNF616, ZFP57, ZNF155, ZNF783, ZNF425, ZNF580, ZNF611, ZNF254, ZNF625, ZNF134, ZNF845, ZNF99, ZNF253, ZNF90, ZNF93, ZNF486, REPIN1, LOC100131539, ZNF705D, LOC100132396, ZNF705G, SCRT2, ZNF407, SP9, ZNF579, ZNF880, ZNF630, ZNF844, ZNF469, ZNF717, ZNF865, ZNF492, ZNF688, YY2, ZNF878, ZNF879, ZNF736, ZNF323, ZNF709, ZNF512, ZNF585B, ZNF154, ZNF324B, ZNF564, ZFP82, GLI4, ZNF674, ZNF345, ZNF550, KLF1, YY1, MYST2, ST18, L3MBTL4, MYT1L, MYT1, L3MBTL1, MTA3, GATA1, TRPS1, GATA3, GATA5, GATA4, GATA6, GATAD2B, GATAD1, GATA2, MTA1, ZGLP1, MTA2, RERE, C16orf5, LITAF, PIAS1, PIAS2, PIAS4, ZMIZ1, ZMIZ2, PIAS3, RNF38, NFX1, NFXL1 ou qualquer combinação dos mesmos.
[00331] Em algumas modalidades, as células são manipuladas (por exemplo, convertidas ou diferenciadas) de um tipo de célula para outra. Em algumas modalidades, uma célula pancreática é manipulada em uma célula de ilhota beta. Em algumas modalidades, um fibroblasto é manipulado em uma célula iPS. Em algumas modalidades, um pré- adipócito é manipulado em uma célula adiposa marrom. Outras células exemplares incluem, por exemplo, células do músculo, células neurais, leucócitos e linfócitos.
[00332] Em algumas modalidades, a célula é uma célula doente ou portadora de mutante. Tais células podem ser manipuladas para tratar a doença, por exemplo, para corrigir uma mutação, ou para alterar o fenótipo da célula, por exemplo, para inibir o crescimento de uma célula cancerígena. Por exemplo, uma célula está associada a uma ou mais doenças ou condições aqui descritas.
[00333] Em algumas modalidades, a célula manipulada é uma célula normal.
[00334] Em algumas modalidades, a célula manipulada é uma célula tronco ou célula progenitora (por exemplo, célula iPS, embrionária, hematopoiética, adiposa, de linhagem germinativa, pulmão, ou células tronco ou progenitoras neurais). Em algumas modalidades, a célula manipulada pode ser uma célula de qualquer uma das três camadas germinativas (isto é, mesodérmica, endodérmica ou ectodérmica). Em algumas modalidades, a célula manipulada pode ser de um tecido extraembrionário, por exemplo, da placenta.
[00335] Em algumas modalidades, a célula sendo manipulada é selecionada a partir de fibroblastos, precursores monocíticos, células B, células exócrinas, progenitores pancreáticos, progenitores endócrinos, hepatoblastos, mioblastos ou pré-adipócitos. Em algumas modalidades, a célula é manipulada (por exemplo, convertida ou diferenciada) em células musculares, células eritroide-megacariocíticas, eosinófilos, células iPS, macrófagos, células T, células beta das ilhotas, neurônios, cardiomiócitos, células sanguíneas, progenitores endócrinos, progenitores exócrinos, células ductais, células acinares, células alfa, células beta, células delta, células PP, hepatócitos, colangiocitos, angioblastos, mesoangioblastos ou adipócitos marrons.
[00336] Em algumas modalidades, a célula é uma célula muscular, célula eritroide-megacariocítica, eosinófilo, célula iPS, macrófago, célula T, células das ilhotas beta, neurônio, cardiomiócito, célula sanguínea, progenitor endócrino, progenitor exócrino, célula ductal, célula acinar, célula alfa, célula beta, célula delta, célula PP, hepatócito, colangiocito ou adipócito branco ou marrom.
[00337] Em algumas modalidades, a célula é uma célula precursora, uma célula pluripotente, uma célula totipotente, uma célula tronco adulta, uma célula de massa interna, uma célula tronco embrionária ou uma célula iPS.
[00338] Em algumas modalidades, a célula manipulada é uma célula cancerígena. Em algumas modalidades, a célula cancerígena pode ser uma célula de câncer de pulmão, uma célula de câncer de mama, uma célula de câncer de pele, uma célula de câncer de cérebro, uma célula de câncer de pâncreas, uma célula de câncer hematopoiética, uma célula de câncer de fígado, uma célula de câncer de rim, uma célula de câncer de ovário, célula de câncer de próstata, célula de câncer de pele.
[00339] Em algumas modalidades, a célula é uma célula muscular, célula eritroide-megacariocítica, eosinófilo, célula iPS, macrófago, célula T, célula beta das ilhotas, neurônio, cardiomiócito, célula sanguínea, progenitor endócrino, progenitor exócrino, célula ductal, célula acinar, célula alfa, célula beta, célula delta, célula PP, hepatócito, colangiocito ou adipócito branco ou marrom. Administração de Inibidores de DNA-PK e Sistema de Edição de Gene a uma Célula (s)
[00340] A administração a uma célula (s) de um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK pode ser realizada por qualquer método conhecido na área. A administração pode ser in vitro, ex vivo ou in vivo. A administração a uma célula (s) de um sistema de edição de genoma e um inibidor de DNA-PK pode ocorrer simultânea ou sequencialmente. Em algumas modalidades, a administração resulta no inibidor de DNA-PK e nos componentes do sistema de edição de genoma entrando na membrana celular. Em algumas modalidades, a administração resulta no inibidor de DNA-PK e nos componentes do sistema de edição de genoma entrando no núcleo da célula. Em algumas modalidades, a administração inclui incubar a célula na presença do inibidor de DNA-PK e do sistema de edição de genoma.
[00341] O sistema de edição de gene pode ser administrado a uma célula (s) por qualquer método conhecido na área. Por exemplo, qualquer método de entrega de ácido nucleico ou proteína conhecido na área pode ser usado. O sistema de edição de gene é administrado (por exemplo, entregue) a uma célula por meio de um ácido nucleico que codifica os componentes do sistema de edição de gene. O sistema de edição de gene pode ser administrado a uma célula por vetores virais ou vetores não virais. Em algumas modalidades, vetores virais são usados. Os vetores virais podem ser retrovirais (por exemplo, leucemia murina, HIV ou lentiviral) ou vírus de DNA (por exemplo, adenovírus, herpes simples e adenoassociado). Em algumas modalidades, métodos de transfecção (por exemplo, métodos de entrega não virais) são usados para introduzir o sistema de edição de genoma em uma célula. Os métodos de transfecção incluem o contato da célula com DEAE- Dextran, fosfato de cálcio, lipossomas ou eletroporação de um plasmídeo na célula. Métodos adicionais de entrega não viral incluem eletroporação, lipofecção, microinjeção, biolística, virossomas, lipossomas, imunolipossomos, policátion ou conjugados de lipídios: ácidos nucleicos, DNA nu, RNA nu, virions artificiais e captação de DNA aprimorada por agente. A sonoporação utilizando, por exemplo, o sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) também pode ser utilizada para a entrega de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, um ou mais ácidos nucleicos são entregues como mRNA. Em algumas modalidades, os mRNAs limitados são usados para aumentar a eficiência da tradução e/ou a estabilidade do mRNA. Em algumas modalidades, são utilizadas tampas ARCA (análogo de tampa antirreversa) ou variantes das mesmas. Vide patentes US7074596 e US8153773.
[00342] Em modalidades, a endonuclease (por exemplo, Cas, Cpf1 e similares) e o gRNA, são transcritos a partir do DNA.
[00343] Em modalidades, a endonuclease (por exemplo, Cas, Cpf1 e similares) é transcrita a partir do DNA e o gRNA é fornecido como RNA.
[00344] Em modalidades, a endonuclease (por exemplo, Cas, Cpf1 e similares) e o gRNA são fornecidos como RNA.
[00345] Em modalidades, a endonuclease (por exemplo, Cas, Cpf1 e similares) é fornecida como uma proteína e o gRNA é fornecido como DNA.
[00346] Em modalidades, a endonuclease (por exemplo, Cas, Cpf1 e similares) é fornecida como proteína e o gRNA é fornecido como RNA.
[00347] Os sistemas adicionais de entrega de ácido nucleico incluem os fornecidos pela Amaxa Biosystems (Cologne, Germany), Maxcyte, Inc. (Rockville, Mariland), BTX Molecular Delivery Systems (Holliston, MA) e Copernicus Therapeutics Inc, (vide por exemplo, US6008336). A lipofecção é descrita, por exemplo, nas patentes US 5.049.386;
4.946.787; e 4.897.355) e os reagentes de lipofecção são vendidos comercialmente (por exemplo, Transfectam™ e Lipofectin™ e Lipofectamine™ RNAiMAX). Lipídios catiônicos e neutros que são adequados para lipofecção eficiente de reconhecimento de receptor de polinucleotídeos incluem os de Feigner, WO 91/17424, WO 91/16024. A entrega pode ser nas células (administração ex vivo) ou nos tecidos alvo (administração in vivo).
[00348] A preparação de complexos lipídio:ácido nucleico, incluindo lipossomas direcionados, tais como complexos imunolipídicos, é bem conhecida dos versados na técnica (Vide, por exemplo, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710- 722 (1995)
[00349] Métodos adicionais de entrega incluem o uso de empacotar os ácidos nucleicos a serem entregues nos veículos de entrega EnGeneIC (EDVs). Estes EDVs são entregues especificamente aos tecidos alvo usando anticorpos biespecíficos, onde um braço do anticorpo tem especificidade para o tecido alvo e o outro tem especificidade para o EDV. O anticorpo leva os EDVs à superfície da célula alvo e, em seguida, o EDV é trazido para a célula por endocitose. Uma vez na célula, o conteúdo é liberado (vide MacDiarmid et al (2009) Nature Biotechnology 27(7):643) Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-
4820 (1992); Pat. U.S. Nºs. 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975,
4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028 e 4.946.787).
[00350] Em algumas modalidades, a transfecção pode ser transitória na qual o sistema de edição de genoma transfectado contendo plasmídeo entra no núcleo, mas não se torna incorporado no genoma da célula durante a replicação. A transfecção pode ser estável, na qual o plasmídeo transfectado será integrado a uma região genômica da célula.
[00351] Em algumas modalidades em que a expressão transitória é usada, sistemas baseados em adenovirais podem ser usados. Os vetores baseados em adenovirais são capazes de uma eficiência de transdução muito alta em muitos tipos de células e não requerem divisão celular. Com tais vetores, altas titulações e altos níveis de expressão foram obtidos. Esse vetor pode ser produzido em grandes quantidades em um sistema relativamente simples. Os vetores de vírus adenoassociados ("AAV") também são usados para transduzir células com ácidos nucleicos alvo, por exemplo, na produção in vitro de ácidos nucleicos e peptídeos, e para procedimentos de terapia gênica in vivo e ex vivo (Vide, por exemplo, Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); e Samulski et al., J. Virol 63:03822-3828 (1989). A construção de vetores AAV recombinantes é descrita em várias publicações, incluindo a Patente U.S. Nº. 5.173.414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); e Samulski et al., J. Virol 63:03822-3828 (1989).
[00352] Em algumas modalidades, a administração a uma célula (s) de um inibidor de DNA-PK é realizada cultivando uma célula (s) isolada na presença do inibidor de DNA-PK e qualquer meio adequado que permita o que inibidor de DNA-PK entre na membrana celular e/ou no núcleo celular.
[00353] Em algumas modalidades, os inibidores de DNA-PK são administrados a uma célula (s) in vitro, in vivo ou ex vivo. Em alguma modalidade, o inibidor de DNA-PK é contatado com uma célula por cerca de 5 horas, 10 horas, 15 horas, 20 horas, 21 horas, 22 horas, 23 horas, 23 horas, 24 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, 45 horas, 50 horas, 55 horas, 60 horas, 65 horas, 70 horas, 85 horas, 90 horas, 100 horas, 125 horas, 150 horas, 200 horas ou por qualquer período intermediário. Em algumas modalidades, o inibidor de DNA-PK é contatado com uma célula por cerca de 1,5 semana, 2,0 semanas, 2,5 semanas, 3,0 semanas, 3,5 semanas, 4 semanas ou qualquer período de tempo intermediário. O inibidor de DNA-PK pode ser readministrado com alterações no meio de cultura de células. O inibidor de DNA-PK pode ser contatado com a célula antes, durante ou após a introdução dos componentes do sistema de edição de genoma.
[00354] Em algumas modalidades, o inibidor de DNA-PK é administrado a uma célula (s) a uma concentração de cerca de 0,1 µM, 0,25 µM, 0,5 µM, 0,75 µM, 1,0 µM, 1,25 µM, 1,50 µM, 1,75 µM, 2,0 µM, 2,5 µM, 3,0 µM, 3,5 µM, 4,0 µM, 4,5 µM, 5,0 µM, 5,5 µM, 6,0 µM, 6,5 µM, 7,0 µM, 7,5 µM, 8,0 µM, 8,5 µM, 9,0 µM, 9,5 µM, 10 µM, 10,5 µM, 11,0 µM, 11,5 µM, 12 µM ou qualquer concentração intermediária. A concentração de inibidor de DNA-PK pode ser modificada durante o curso da administração.
[00355] Em algumas modalidades, os componentes de edição de gene são entregues em uma célula (s) por um ou mais vetores ou na forma de RNA, mRNA ou no caso do componente de endonuclease tais como proteína purificada ou mRNA (por exemplo, proteína Cas9). Os um ou mais vetores podem incluir vetores virais, plasmídeos ou ssDNAs. Vetores virais podem incluir vetores virais retrovirais, lentivirais, adenovirais, adenoassociados e herpes simplex, ou qualquer combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, os componentes de edição de gene são entregues via RNA ou RNA sintético.
[00356] [00365] Em algumas modalidades, a administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula, juntamente com um sistema de edição de gene, resulta em quantidades aumentadas de resultado de edição de gene de reparo direcionado homólogo em comparação a uma condição de linha de base na qual a célula não é administrada comum inibidor de DNA-PK.
Em algumas modalidades, a administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula (s) juntamente com um sistema de edição de gene resulta na supressão de indels (de NHEJ) no alvo ou fora do alvo.
Em algumas modalidades, a administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula (s) junto com um sistema de edição de gene resulta em aumento ou diminuição da expressão de um gene de interesse.
A administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula, juntamente com um sistema de edição de gene, pode resultar na expressão de um gene não endógeno para uma célula.
Em algumas modalidades, a administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula (s) juntamente com um sistema de edição de gene, resulta na remoção completa ou parcial, ou na modificação de um gene de uma célula (s). Em algumas modalidades, a administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula (s) juntamente com o sistema de edição de gene, resulta na remoção completa ou parcial, ou na modificação de um íntron e/ou éxon em uma célula (s). Em algumas modalidades, a administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula (s) juntamente com o sistema de edição de gene resulta na remoção completa ou parcial, ou em uma modificação de uma região não codificante em uma célula (s). Em algumas modalidades, a administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula, juntamente com o sistema (s) de edição de gene, resulta em remoção simultânea ou sequencial, completa ou parcial, ou em uma modificação de uma região genética codificante e/ou não codificante em uma célula (s). Em algumas modalidades, a administração dos inibidores de DNA-PK a uma célula, juntamente com o sistema de edição de gene, resulta na remoção simultânea ou sequencial, completa ou parcial, ou em uma modificação de uma região genética codificante e/ou não codificante em uma célula (s), incluindo DNA ou RNA extracromossômico. O DNA extracromossômico pode ser DNA mitocondrial, DNA de cloroplasto, DNA circular extracromossômico ou DNA extracromossômico viral.
[00357] Em algumas modalidades, a administração de inibidores de DNA-PK a uma célula juntamente com o sistema de edição de genoma resulta em aumento da expressão ou diminuição da expressão de um gene de interesse. Em algumas modalidades, o aumento ou diminuição na expressão de um gene de interesse pode estar em cerca de ou entre 2,5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou entre, 90% em comparação a uma condição de linha de base na qual a célula não recebe um inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, o aumento ou diminuição de um gene de interesse pode estar em cerca de ou entre 0,5 vez, 1,0 vez, 1,5 vez, 2,0 vezes, 2,5 vezes, 2,5 vezes, 3,0 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, 5 vezes ou 10 vezes em comparação ao nível de expressão da linha de base em que a célula não recebe um inibidor de DNA-PK.
[00358] Em algumas modalidades, a administração de inibidores de DNA-PK a uma célula junto com um sistema de edição de genoma resulta em um aumento na edição de genoma. Em algumas modalidades, o aumento na edição do genoma pode ser de cerca de 2,5%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% em comparação a um condição de linha de base na qual a célula não recebe um inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, o aumento na edição do genoma pode ser de cerca de 0,5 vez, 1,0 vez, 1,5 vez, 2,0 vezes, 2,5 vezes, 2,5 vezes, 3,0 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, 5 vezes ou 10 vezes em comparação ao nível de expressão da linha de base em que a célula não recebe um inibidor de DNA-PK.
[00359] Em algumas modalidades, a administração de um inibidor de DNA-PK e um sistema de edição de gene a uma população de células resulta em maior sobrevivência celular em comparação a uma condição de linha de base na qual uma população de células é administrada apenas com um sistema de edição de gene e não administrada com um inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, o inibidor de DNA-PK que resulta em maior sobrevivência celular é um composto de fórmula (III-E-1) ou (III-E-2), ou sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.
[00360] Em algumas modalidades, a célula é sincronizada na fase do ciclo celular S ou G2, antes, depois ou durante a administração do inibidor de DNA-PK. Em algumas modalidades, a célula é sincronizada na fase do ciclo celular S ou G2, antes, depois ou durante a introdução dos componentes de edição de gene. A sincronização da célula na fase do ciclo celular S ou G2 pode ser alcançada por qualquer método conhecido na área. Como um exemplo não limitativo, os agentes que podem ser usados para sincronizar uma célula na fase do ciclo celular S ou G2 incluem afidicolina, hidroxiureia, lovastatina, mimosina, nocodazol, timidina ou qualquer combinação dos mesmos. (Vide Lin et al. Elife. 15 de dezembro de 2014; 32014). Em algumas modalidades, os agentes para sincronização celular podem ser administrados a qualquer momento durante o processo de edição de gene.
[00361] Em algumas modalidades, o inibidor de DNA-PK e/ou o sistema de edição de genoma podem ser incluídos em um recipiente, embalagem ou dispensador, juntamente com instruções de uso. Em algumas modalidades, o agente inibidor de DNA-PK e/ou o sistema de edição de genoma incluído em um recipiente, embalagem ou dispensador, juntamente com instruções de uso, é um kit.
[00362] Em algumas modalidades, os inibidores de DNA-PK e/ou o sistema de edição de genoma são incluídos em um kit com instruções de uso. O kit pode conter qualquer sistema de edição de genoma e/ou inibidor de DNA-PK e instruções de uso. Em algumas modalidades, o inibidor de DNA-PK é qualquer um dos compostos representados pela Fórmula Estrutural (III-E-1) ou (III-E-2). Em algumas modalidades, o sistema de edição de genoma é um selecionado a partir de um sistema baseado em meganuclease, um sistema baseado em nuclease de dedo de zinco (ZFN), um sistema de Nuclease Baseado em Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALEN), um sistema baseado em CRISPR ou um sistema baseado em NgAgo. O sistema de edição de genoma pode ser fornecido no kit de qualquer forma, por exemplo, tal como um plasmídeo, vetor, DNA ou RNA.
[00363] Em algumas modalidades, o inibidor de DNA-PK e/ou um sistema de edição de genoma é administrado in vivo. O inibidor de DNA- PK e o sistema de edição de gene são formulados para serem compatíveis com a via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração são descritos acima.
[00364] Em algumas modalidades, a formulação também pode conter mais de um composto ativo conforme necessário para a indicação específica a ser tratada, por exemplo, aqueles com atividades complementares que não se afetam adversamente. Alternativamente, ou em adição, a composição pode compreender um agente que aprimora sua função, tais como, por exemplo, um agente citotóxico, citocina, agente quimioterapêutico ou agente inibidor de crescimento. Tais moléculas estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida.
[00365] Em algumas modalidades, o agente inibidor de DNA-PK e/ou o sistema de edição de genoma são administrados em terapia combinada, isto é, combinados com outros agentes, por exemplo, agentes terapêuticos, que são úteis no tratamento de condições ou distúrbios patológicos, tais como várias formas de câncer e doenças inflamatórias. O termo "em combinação", neste contexto, significa que os agentes são administrados de maneira substancialmente contemporânea, simultânea ou sequencialmente. Se administrado sequencialmente, no início da administração do segundo composto, o primeiro dos dois compostos é preferivelmente ainda detectável em concentrações efetivas no sítio do tratamento. Métodos de Triagem de Edição de Genoma
[00366] Qualquer método conhecido na área pode ser usado para rastrear células quanto à eficiência de edição do genoma, incluindo a eficiência de NHEJ e/ou HDR. Por exemplo, os métodos de triagem podem incluir amplificação baseada em PCR de regiões direcionadas seguido por sequenciamento ou sequenciamento profundo das regiões amplificadas para confirmar a edição do genoma. A genotipagem por PCR permite a quantificação e classificação de compostos na estimulação de HDR. Outros métodos de triagem podem incluir o sequenciamento de próxima geração. Vide, por exemplo, Bell et al., "A high-throughput screening strategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generation sequencing," BMC Genomics, 15:1002 (2014).
[00367] Os iniciadores de PCR podem ser manipulados geneticamente para amplificar seletivamente as regiões genéticas não modificadas e modificadas, resultando em amplicons de diferentes comprimentos, dependendo do status da modificação genética. Os amplicons podem então ser resolvidos em um gel, e a eficiência de HDR estimada por densitometria usando um Bio-Imager. Alternativamente, uma nova tecnologia de PCR, a PCR por gotículas rápidas digital (DDPCR) pode ser usada para medir simultaneamente eventos de HDR e NHEJ em amostras editadas pelo genoma. Vide, por exemplo, Miyaoka et al., "Systematic quantification of HDR e NHEJ reveals effectrs of locus, nuclease, e cell type on genome-editin", Scientific Reports, 6, 2016. Outros métodos que podem ser usados para rastrear células quanto a modificações genômicas, incluindo sequenciamento de Sanger, sequenciamento profundo e RT-PCR. Preparação de Compostos da Invenção
[00368] Como usado aqui, todas as abreviações, símbolos e convenções são consistentes com as utilizadas na literatura científica contemporânea. Vide, por exemplo, Janet S. Dodd, ed., The ACS Style Guide: A Manual for Authors e Editors, 2a Ed., Washington, D.C.: American Chemical Society, 1997. As seguintes definições descrevem os termos e abreviações aqui utilizados: BPin éster de pinacol boronato Brine uma solução saturada de NaCl em água DCM diclorometano DIAD di-isopropilazodicarboxilato DIEA di-isopropiletilamina DMA dimetilacetamida DMF dimetilformamida DMSO dimetilsulfóxido DTT ditiotreitol ESMS espectrometria de massa por eletropulverização Et2O etil éter EtOAc acetato de etila EtOH álcool etílico HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanossulfônico HPLC cromatografia líquida de alto desempenho IPA isopropanol LAH hidreto de lítio alumínio LC-MS espectrometria de massa por cromatografia líquida LDA di-isoproiletilamida de lítio Me metil MeOH metanol MsCl cloreto de metanosulfonila MTBE metil t-butil éter
NMP N-metilpirrolidina Pd2(dba)3 tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio(0) Pd(dppf)Cl2 1,1' bis(difenilfosfino)-ferroceno dicloro-paládio PG grupo protetor Ph fenila (rac)-BINAP 2,2'-bis(difenilfosfino)-1,1'-binaftil racêmico RockPhos di-terc-butil(2',4',6'-triisopropil-3,6-dimetóxi-[1,1'-bifenil]-2- il)fosfina RT ou rt temperatura ambiente SFC cromatografia fluida supercrítica SPhos 2-diclico-hexilfosfino-2',6'-dimetoxibifenil TBAI iodeto de tetrabutilamônio tBu butil terciário THF tetra-hidrofurano TEA trietilamina TMEDA tetrametiletilenodiamina VPhos [3-(2-diclico-hexilfosfanilfenil)-2,4-dimetóxi-fenil]sulfonilo- xissódio Procedimentos Sintéticos Gerais
[00369] Em geral, os compostos desta invenção podem ser preparados por métodos aqui descritos ou por outros métodos conhecidos dos versados na técnica.
Exemplo 1. Preparação geral dos compostos de fórmula G
[00370] Os compostos de fórmula (III-E-1) ou (III-E-2), em que X é NH podem ser preparados conforme descrito abaixo no Esquema 1. Consequentemente, como mostrado na etapa 1-i do Esquema 1, compostos heteroarila da fórmula A podem reagir com morfolina ou um análogo da morfolina aquecendo a mistura em um solvente polar, não prótico para produzir compostos da fórmula B. Utilizando um acoplamento do tipo Buchwald/Hartwig auxiliado por ligando de fosfina catalisado por paládio, como mostrado na etapa 1-ii do Esquema 1, um composto de fórmula B pode ser reagido com aminociclohexanos de fórmula C para produzir compostos de fórmula D, em que R1 e R2 são tal como aqui descritos em outro lugar. Em um exemplo, quando meso ciclo-hexano-1,4-diaminas monoprotegidas da fórmula E são preparadas, a remoção do grupo protetor forma compostos da fórmula F, como mostrado na etapa 1-iii do Esquema 1. A amina livre resultante pode ser reagida com várias porções tendo grupos reativos para aminas (por exemplo, R1a-L, onde L é um grupo de saída, tais como cloro, bromo, iodo, toluenossulfonato, metanossulfonato ou trifluorometanossulfonato; ou onde L é uma porção contendo carbonila reativa, tal como um éster ativo ou um grupo isocianato) para produzir um composto de fórmula G, como mostrado na etapa 1-iv do Esquema
1. Exemplo 2. Preparação Geral dos compostos de fórmula M, N, R e S
[00371] Compostos de (III-E-1) ou (III-E-2), em que X é O podem ser preparados tais como descrito abaixo nos Esquemas 2a e 2b. Por conseguinte, como mostrado na etapa 2-i do Esquema 2a, o grupo hidroxila de compostos heteroaril de fórmula H pode ser protegido para produzir compostos de fórmula J, que podem então ser reagidos com morfolina ou um análogo de morfolina aquecendo a mistura em um solvente polar, não prótico para produzir compostos de fórmula K após a remoção do grupo protetor, como mostrado nas etapas 2-ii e 2-iii do Esquema 2a. Posteriormente, como mostrado na etapa 2-iv do Esquema 2a, um composto de fórmula K pode ser reagido com um composto de fórmula L sob condições suficientes para afetar o deslocamento SN2 de seu grupo de saída (por exemplo, onde L é um grupo de saída tais como cloro, bromo, iodo, toluenossulfonato, metanossulfonato ou trifluorometanossulfonato) para produzir um composto de fórmula M ou fórmula N, dependendo de R1 ou R2 ser hidrogênio. Nos casos em que R1 ou R2 são porções protegidas de nitrogênio ou oxigênio, os compostos da invenção podem ser produzidos por remoção do grupo protetor e subsequente manipulação sintética da amina/álcool livre resultante.
[00372] Alternativamente, como mostrado no Esquema 2b, o grupo hidroxila de um composto de fórmula O pode reagir com um composto de fórmula L para produzir um brometo de bicicloheteroaril fundido de fórmula P, que pode ser reagido posteriormente com morfolina ou um análogo de morfolina para produzir um composto de fórmula M ou fórmula N.
[00373] Alternativamente, como mostrado no Esquema 2c, os compostos da invenção nos quais o Anel B é um anel di-hidropirano podem ser preparados reagindo compostos da fórmula Q com dialquil (3,6-di-hidro-2H-piran-4-il)boronatos para produzir compostos de fórmula R. Os compostos de fórmula R podem então ser reduzidos subsequentemente para formar compostos de fórmula S.
Exemplo 3. Preparação de (4-((7-morfolinoquinoxalin-5-il)amino)ciclo- hexil)carbamato (Composto 6) e N1-(7-morfolinoquinoxalin-5-il)-N4- (pirimidin-2-il)ciclo-hexano-1,4-diamina (Composto 18)
[00374] Como mostrado na etapa 3-i do Esquema 3, a uma solução de 3-bromo-5-fluoro-benzeno-1,2-diamina (composto 1001, 1,11 g, 5,41 mmols) em metanol (11 mL) foi adicionado oxaldeído (1,57 mL de 40% p/v, 10,8 mmols). A mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente sob nitrogênio. Após duas horas, um sólido amarelo se precipitou. A mistura de reação foi diluída com água (20 mL), agitada por mais 5 minutos, filtrada e o sólido coletado seco sob alto vácuo para produzir 5-bromo-7-fluoroquinoxalina (composto 1002, 868 mg, 70,6% de rendimento): 1H-RMN (300 MHz, DMSO-d6) δ 9,06 (s, 2H), 8,36 (dd, J = 8,5, 2,7 Hz, 1H), 8,00 (dd, J = 9,2, 2,7 Hz, 1H); ESMS (M+H+) = 227,14.
[00375] Como mostrado na etapa 3-ii do Esquema 3, a uma solução de 5-bromo-7-fluoroquinoxalina (4,5 g, 19,8 mmols) em NMP (67,5 mL) foi adicionada morfolina (3,1 mL, 35,6 mmols). A mistura de reação foi aquecida a 140°C e agitada por 15 horas. Após o resfriamento, a mistura foi vertida em água (200 mL), extraída com acetato de etila (2 x 100 mL), seca sobre sulfato de magnésio, filtrada, evaporada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica-gel de pressão média (10 a 80% EtOAc/gradiente de hexanos) para fornecer 4-(8- bromoquinoxalin-6-il)morfolina (composto 1003, 3,86 g, 66% de rendimento) como um sólido amarelo: 1H-RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ 8,82 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 8,73 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 8,12 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 7,27 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,87-3,69 (m, 4H), 3,44-3,34 (m, 4H); ESMS (M+H+) = 227,14.
[00376] Como mostrado na etapa 3-iii do Esquema 3, uma mistura de 4-(8-bromoquinoxalin-6-il)morfolina (1,57 g, 5,34 mmols), terc-butil- N-(4-aminociclohexil)carbamato (1,37 g, 6,40 mmols), (rac)-BINAP (664 mg, 1,07 mmol), carbonato de césio (5,22 g, 16,0 mmols) e Pd2(dba)3 (489 mg, 0,534 mmol) em tolueno (50 mL) foi aquecida a 100°C por 12 horas. Após arrefecimento, a mistura foi diluída com acetato de etila (150 mL) e água (25 mL), depois filtrada através de terra de diatomáceas que foi subsequentemente lavada com acetato de etila. Os orgânicos combinados foram lavados com salmoura, secos sobre sulfato de sódio, concentrados sob pressão reduzida e purificados por cromatografia em sílica-gel de pressão média (gradiente de EtOAc/hexanos de 0 a 60%) para fornecer terc-butil (-4-((7- morfolinoquinoxalina)-5-il)amino)ciclo-hexil)carbamato (composto 1004, 1,83 g, rendimento de 83,2%): 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,65 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,35 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,60 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,34 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,11 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,60 (s, 1H), 3,97-3,86 (m, 4H), 3,67 (s, 2H), 3,41-3,25 (m, 4H), 1,85 (d, J = 3,0 Hz, 5H), 1,74-1,57 (m, 3H), 1,45 (s, 9H)
[00377] Como mostrado na etapa 3-iv do Esquema 3, a uma solução de terc-butil (-4-((7-morfolinoquinoxalin-5-il)amino)ciclo-hexil)carbamato
(900 mg, 2,00 mmols) em diclorometano (16 mL) foi adicionado ácido trifluoroacético (3 mL, 38,9 mmols). A mistura de reação preta resultante foi agitada sob uma atmosfera de nitrogênio à temperatura ambiente durante duas horas. Bicarbonato de sódio aquoso saturado (150 mL) foi lentamente adicionado até a cor passar de preto para laranja. A mistura foi extraída com diclorometano (2 x 100 mL) e os orgânicos combinados lavados com salmoura (50 mL), secos sobre sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida para fornecer -N1-(7- morfolinoquinoxalin-5-il)ciclo-hexano-1,4-diamina, trifluoroacetato (composto 1005): 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,36 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,59 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,34 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,20 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 3,95-3,84 (m, 4H), 3,69 (s, 1H), 3,41-3,25 (m, 4H), 2,93 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 2,09-1,87 (m, 2H), 1,90-1,68 (m, 6H), 1,58 (dd, J = 11,2, 8,7 Hz, 2H); ESMS (M+H+) = 328,34. Este composto foi utilizado tal como é sem purificação adicional.
[00378] Como mostrado na etapa 3-v do Esquema 3, à solução de N1-(7-morfolinoquinoxalin-5-il)ciclo-hexano-1,4-diamina (25 mg, 0,07 mmol) e di-isopropiletilamina (18,0 mg, 24,3 µL, 0,14 mmol) em diclorometano (750 µL) foi adicionado cloroformiato de etila (11,4 mg, 10,0 µL, 0,105 mmol). A mistura de reação foi agitada por 12 horas, diluída com diclorometano (10 mL), lavada com bicarbonato de sódio aquoso saturado (5 mL), seca sobre sulfato de sódio e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia preparativa por HPLC usando um gradiente de 10-90% de acetonitrila/água (0,1% de TFA) tal como eluente para fornecer etil (4- ((7-morfolinoquinoxalin-5-il)amino)ciclo-hexil)carbamato (composto 6, 14 mg, 50% de rendimento): 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,65 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,36 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,61 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,35 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,10 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,72 (s, 1H), 4,12 (q, J = 7,0 Hz), 2H), 3,96-3,82 (m, 4H), 3,68 (s, 2H), 3,42-3,23 (m, 4H), 1,93-1,78 (m,
6H), 1,69 (dd, J = 15,0, 6,3 Hz, 2H) 1,25 (t, J = 7,1 Hz, 3H); ESMS (M+H+) = 400,17.
[00379] Como mostrado na etapa 3-vi do Esquema 3, uma mistura de N1-(7-morfolinoquinoxalin-5-il)ciclo-hexano-1,4-diamina (185 mg, 0,56 mmol), 2-bromopirimidina (93 mg, 0,58 mmol) e trietilamina (143 mg, 197 µL, 1,41 mmol) em 1-metilpirrolidin-2-ona (3 mL) foi aquecida a 130°C e agitada por 15 horas. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a mistura foi diluída com acetato de etila (70 mL) e metil terc- butil éter (20 mL), lavada com água (3 x 20 mL), lavada com salmoura (15 mL), seca sobre sulfato de sódio, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica-gel de média pressão (gradiente de 10 a 100% EtOAc/hexanos) para fornecer N1-(7-morfolinoquinoxalin- 5-il)-N4-(pirimidin-2-il)ciclo-hexano-1,4-diamina (composto 18, 102 mg, 45% de rendimento): 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,65 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,37 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,27 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,60 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,51 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 6,36 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,15 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 5,20 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 4,04 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 3,96-3,82 (m, 4H), 3,70 (s, 1H), 3,39-3,24 (m, 4H), 1,94 (dd, J = 13,7, 4,4 Hz, 6H), 1,78 (dt, J = 28,8, 16,1 Hz, 2H); ESMS (M+H+) = 328,34.
Exemplo 4. Preparação de 1-(4-((7-(8-oxa-3-azabiciclo[3.2.1]octan-3- il)quinoxalin-5-il)amino)ciclo-hexila)-3-etilureia (Composto 22) \
[00380] Como mostrado na etapa 4-i do Esquema 4, a uma solução de 5-bromo-7-fluoroquinoxalina (composto 1002, 150 mg, 0,66 mmol) em NMP (2,3 mL) foi adicionado 8-oxa-3-azabiciclo[3.2.1]octano (178 mg, 1,2 mmol) à temperatura ambiente. A mistura de reação foi selada em um frasco de micro-ondas e aquecida a 180°C por 20 minutos. Depois de arrefecer até à TA e verter em água, a fase aquosa foi extraída com EtOAc (3x). Os extratos combinados foram secos sobre MgSO4, filtrados, concentrados sob pressão reduzida e purificados por cromatografia em sílica-gel de pressão média (gradiente de 0 a 100% EtOAc/hexanos) para fornecer 3-(8-bromoquinoxalin-6-il)-8-oxa-3- azabiciclo[3.2.1]octano (composto 1006, 87 mg, 41% de rendimento) como um óleo laranja escuro: ESMS (M+H+) = 320,07.
[00381] Como mostrado na etapa 4-ii do Esquema 4, uma solução desgaseificada de 3-(8-bromoquinoxalin-6-il)-8-oxa-3- azabiciclo[3.2.1]octano (261 mg, 0,815 mmol), N-(4- aminociclohexil)carbamato de terc-butila (210 mg, 0,98 mmol), rac- BINAP (102 mg, 0,163 mmol), Cs2CO3 (797 mg, 2,45 mmols) e
Pd2(dba)3 (75 mg, 0,0815 mmol) em tolueno (10,5 mL) foi aquecida a 100°C (temperatura do banho de óleo) em um tubo de micro-ondas selado por 15 horas. Após o resfriamento, a mistura foi aplicada diretamente a uma coluna de cromatografia e purificada por cromatografia em sílica-gel de média pressão (gradiente de EtOAc de 0 a 100%/hexanos) para fornecer terc-butil (4-((7-(8-oxa-3- azabiciclo[3.2.1]octan-3-il)quinoxalin-5-il)amino)ciclo-hexil)carbamato (composto 1007, 141 mg, rendimento de 36%) como um sólido branco: 1 H-RMN (400 MHz, CDCl3) d 8,49 (s, 1H), 8,23 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 6,48 (s, 1H), 6,18 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,06 (s, 1H), 4,52 (s, 1H), 4,47 (s, 2H), 3,60 (s, 2H), 3,45 (d, J = 11,6 Hz, 2H), 3,14-3,12 (m, 2H), 1,96-1,84 (m, 4H), 1,79 (s, 5H) 1,54 (s, 3H) e 1,38 (s, 9H) ppm; ESMS (M+H+) = 453,96.
[00382] Como mostrado na etapa 4-iii do Esquema 4, a uma solução do composto 1007 (141 mg, 0,295 mmol) em CH2Cl2 (2,5 mL) foi adicionado TFA (656 mg, 443 μL, 5,75 mmols) à RT. A solução preta resultante foi agitada durante 2 horas e depois a reação foi arrefecida bruscamente pela adição de NaHCO3 saturado até a cor preta gradualmente se transformar em uma cor laranja. A mistura de reação foi extraída com CH2Cl2 (3x) e os extratos orgânicos combinados foram secos sobre Na2SO4 e evaporados até a secura para fornecer trifluoroacetato N1-(7-(8-oxa-3-azabicyclo[3.2.1]octan-3-il)quinoxalin-5- il)ciclo-hexano-1,4-diamina (composto 1008): ESMS (M+H+) = 354,20. Este material foi utilizado em reações subsequentes sem qualquer purificação adicional.
[00383] Como mostrado na etapa 4-iv do Esquema 4, a uma solução do composto 1008 (45 mg, 0,071 mmol) e DIEA (36,5 mg, 49,0 μL, 0,28 mmol) em CH2Cl2 (1,4 mL) foi adicionado isocianato de etila (20 mg, 0,28 mmol) à RT. A solução foi agitada a essa temperatura por 15 horas e depois aplicada diretamente a uma coluna de cromatografia e purificada por cromatografia em sílica-gel de pressão média (gradiente de EtOAc/hexanos de 0 a 100%) para fornecer 1-(4-((7-(8-oxa-3- azabiciclo[3.2.1]octan-3-il)quinoxalin-5-il)amino)ciclo-hexil)-3-etilureia (composto 22, 8 mg, 27% de rendimento) como um sólido branco: 1H- RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,54 (s, 1H), 8,22 (s, 1H), 6,43 (s, 1H), 6,19 (s, 1H), 6,02 (s, 1H), 4,47 (s, 2H), 4,38 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,28 (s, 1H), 3,74 (s, 1H), 3,60 (s, 1H), 3,42 (s, 4H), 3,14-3,09 (m, 4H), 2,05-1,87 (m, 3H), 1,79 (s, 3H), 1. 55 (d, J = 7,1 Hz, 2H) e 1,21-1,05 (m, 5H) ppm; ESMS (M+H+) = 425,35. Exemplo 5. Preparação de N1-(6-morfolinobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4- il)-N4-(pirimidin-2-il)ciclo-hexano-1,4-diamina (Composto 23)
[00384] Como mostrado na etapa 5-i do Esquema 5, uma mistura de terc-butil ((cis)-4-aminociclohexil)carbamato (composto 1009, 490 mg, 2,3 mmols), 2-cloropirimidina (262 mg, 2,3 mmols)) e TEA (463 mg, 637 µL, 4,6 mmols) em DMF (10 mL) foi submetida à irradiação por micro- ondas por 20 minutos a 150°C. A mistura de reação foi diluída com EtOAc, lavada com H2O, seca sobre Na2SO4, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica-gel de pressão média (gradiente de 0 a 50% EtOAc/hexanos) para fornecer terc-butil ((cis)-4-
(pirimidin-2-ilamino)ciclo-hexil)carbamato (composto 1010) como um sólido branco: 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,28 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,53 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,12 (s, 1H), 4,56 (s, 1H), 3,99 (dq, J = 7,0, 3,5 Hz, 1H), 3,65 (s, 1H), 1,83 (tq, J = 10,2, 3,6 Hz, 5H), 1,66 (s, 8H), 8,13- 7,91 (m, 3H), 1,47 (s, 9H).
[00385] Como mostrado na etapa 5-ii do Esquema 5, HCl (3 mL, 4M em THF, 12 mmols) foi adicionado ao composto 1010. A mistura foi agitada por 30 minutos e concentrada sob pressão reduzida para produzir Cloridrato de (cis)-N1-(pirimidin-2-il)ciclo-hexano-1,4-diamina (composto 1011). Este material foi utilizado em reações subsequentes tal como é sem purificação adicional.
[00386] Como mostrado na etapa 5-iii do Esquema 5, uma mistura de 4-bromo-6-morfolinobenzo[c][1,2,5]oxadiazol (composto 1012, 147 mg, 0,5 mmol), cloridrato de (cis)-N1-(pirimidin-2-il)ciclo-hexano-1,4- diamina (120 mg, 0,6 mmol), (rac)-BINAP (32 mg, 0,05 mmol), Pd2(dba)3 (24 mg, 0,026 mmol), e carbonato de césio (506 mg, 1,55 mmol) em tolueno (5 mL) foi lavada com nitrogênio gasoso e agitada durante a noite a 90°C sob uma atmosfera de nitrogênio. A mistura foi filtrada através de uma camada de terra de diatomáceas, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica-gel de pressão média (gradiente de EtOAc/hexanos de 0 a 80%) para fornecer (cis)-N1-(6- morfolinobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-il)-N4-(pirimidin-2-il)ciclo-hexano-1,4- diamina (composto 23) como um sólido laranja: 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,20 (d, J = 4,9 Hz, 2H), 6,46 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 6,05 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 5,82 (s, 1H), 5,24 (s, 1H), 4,82 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 3,98 (s, 1H), 3,85-3,72 (m, 4H), 3,60 (s, 1H), 3,23-3,06 (m, 4H), 1,95-1,62 (m, 8H).
Exemplo 6. Preparação de 5-metóxi-N-((cis)-4-((7-morfolinoquinoxalin- 5-il)óxi)ciclo-hexil)pirimidin-2-amina (Composto 134)
[00387] Como mostrado na etapa 6-i do Esquema 6, a uma mistura de 5-bromo-2-fluoro-pirimidina (1 g, 5,651 mmols) em iPrOH (10 mL) foi adicionado TEA (1,143 g, 1,574 mL, 11,30 mmols) e trans-4-aminociclo- hexan-1-ol (650,8 mg, 5,661 mmols). A mistura foi submetida a micro- ondas durante 20 minutos a 150°C, concentrada sob pressão reduzida, diluída com EtOAc, lavada com água e seca sobre Na2SO4. Após a remoção dos voláteis sob pressão reduzida, o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica-gel de média pressão (gradiente de EtOAc 0- 80%/hexanos) para fornecer (trans)-4-((5-bromopirimidin-2- il)amino)ciclo-hexanol (composto 1013, 1,2 g): 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,28 (s, 2H), 5,03 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,91-3,49 (m, 2H), 2,31- 1,90 (m, 4H), 1,56-1,19 (m, 4H).
[00388] Como mostrado na etapa 6-ii do Esquema 6, ao composto
1013 (1,2 g, 4,41 mmols) em DCM (20 mL) foi adicionado TEA (1,134 g, 1,84 mL, 13,2 mmols) e MsCl (505 mg, 341 µL, 4,41 mmols). A mistura de reação foi agitada por uma hora, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica-gel de pressão média (gradiente de EtOAc/hexanos de 0 a 80%) para fornecer trans-4-((5- bromopirimidin-2-il)amino) metanossulfonato de ciclo-hexila (composto 1014): 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,29 (s, 2H), 5,03 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,70 (tt, J = 10,6, 3,9 Hz, 1H), 3,80 (dtt, J = 11,2, 7,6, 3,7 Hz, 1H), 3,04 (s, 3H), 2,30-2,12 (m, 4H), 1,93-1,69 (m, 2H), 1,51-1,33 (m, 2H).
[00389] Como mostrado na etapa 6-iii do Esquema 6, a uma solução de 2-amino-3-nitrofenol (5,00 g, 32,4 mmols) em dioxano (50 mL) foi adicionado bromo (6,22 g, 2,01 mL, 38,9 mmols). A mistura foi agitada durante duas horas e um precipitado foi formado, o qual foi recolhido e lavado com dioxano e éter. O sólido amarelo resultante tratado com uma solução saturada de NaHCO3, que foi extraída com EtOAc (3x). Os orgânicos combinados foram secos sobre Na2SO4, filtrados e concentrados sob pressão reduzida para produzir 2-amino-5-bromo-3- nitrofenol (composto 1015) como um sólido marrom. Este material foi realizado tal como em reações subsequentes sem purificação adicional.
[00390] Como mostrado na etapa 6-iv do Esquema 6, a uma solução de 2-amino-5-bromo-3-nitrofenol (7,5 g, 31,8 mmols) em acetato de etila (60 mL) foi adicionado níquel de Raney™ (1,90 g, 214 µL, 32,4 mmols) e a mistura de reação foi agitada por duas horas sob uma atmosfera de H2 a 30 psi. Após filtrar e secar sobre Na2SO4, a mistura foi concentrada sob pressão reduzida para fornecer 2,3-diamino-5-bromofenol (composto 1016), que foi utilizada tal como é nas reações subsequentes sem purificação adicional.
[00391] Como mostrado na etapa 6-v do Esquema 6, 2,3-diamino-5- bromofenol (6,0 g, 29,5 mmols) foi dissolvido em metanol e a esta solução foi adicionado glioxal (3,77 g, 2,98 mL, 64,9 mmols) e agitada durante a noite. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida até um volume mínimo e o sólido bronzeado resultante coletado por filtração e seco sob alto vácuo para produzir 7- bromoquinoxalin-5-ol (composto 1017), que foi usado como é nas reações subsequentes sem purificação adicional.
[00392] Como mostrado na etapa 6-vi do Esquema 6, a uma solução de 7-bromoquinoxalin-5-ol (2,0 g, 8,89 mmols) em DCM (20 mL) foi adicionado imidazol (1,82 g, 26,7 mmols) e cloreto de terc- butildimetilsilila (1,34 g, 1,65 mL, 8,89 mmols). A mistura de reação foi agitada durante a noite à RT, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica-gel de pressão média (gradiente de EtOAc de 0 a 20%/hexanos) para fornecer 7-bromo-5-((terc- butildimetilsilil)óxi)quinoxalina (composto 1018) como um óleo incolor: 1 H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,69 (q, J = 1,8 Hz, 2H), 7,80 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,22 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 0,96 (s, 9H), 0,81 (s, 7H).
[00393] Como mostrado na etapa 6-vii do Esquema 6, uma mistura de 7-bromo-5-((terc-butildimetilsilil)óxi)quinoxalina (700 mg, 2,06 mmols), morfolina (270 mg, 270 µL, 3,09 mmols)), Pd2(dba)3 (94,50 mg, 0,1032 mmol), (rac)-BINAP (129 mg, 0,206 mmol), carbonato de césio (2,02 g, 6,19 mmols) em tolueno (7 mL) foi lavada com nitrogênio por 10 minutos. A mistura foi então aquecida durante a noite a 100°C. Após o resfriamento, a mistura de reação foi diluída com EtOAc, filtrada através de uma camada de terra de diatomáceas, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica-gel de média pressão (gradiente de 0 a 30% EtOAc/hexanos) para fornecer 7- morfolinoquinoxalin-5-ol. Este composto (450 mg, 1,3 mmol) foi dissolvido em THF (20 mL) e fluoreto de tetra-n-butilamônio (539 mg, 2,06 mmols) foi adicionado. A mistura de reação foi agitada por 0,5 hora, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica-gel de pressão média (gradiente de EtOAc de 0 a 100%/hexanos)
para fornecer 7-morfolinoquinoxalin-5-ol (composto 1019) como um sólido amarelo: 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,75 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,46 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,70 (d, J = 41,8 Hz, 1H), 7,01 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 4,12-3,78 (m, 4H), 3,51-3,24 (m, 4H).
[00394] Como mostrado na etapa 6-viii do Esquema 6, uma solução de 7-morfolinoquinoxalin-5-ol (100 mg, 0,432 mmol), metanossulfonato de (trans)-4-((5-bromopirimidin-2-il)amino)ciclo-hexila (composto 1014, 303 mg, 0,865 mmol) e CsCO3 (282 mg, 0,865 mmol) em dioxano (1,0 mL foi agitado por 16 horas a 105ºC.) Após o resfriamento, a mistura de reação foi diluída com EtOAc, filtrada através de terra de diatomáceas, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica-gel de média pressão (gradiente de 0 a 5% de MeOH/DCM) para produzir 5-bromo-N-((cis)-4-((7-morfolinoquinoxalin-5-il)óxi)ciclo- hexil)pirimidin-2-amina (composto 1020, 110 mg) como uma espuma amarela: 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,29 (s, 2H), 6,98 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,29 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,81 (s, 1H), 4,04-3,84 (m, 4H), 3,42- 3,31 (m, 4H), 2,22 (s, 2H), 1,92 (d, J = 4,9 Hz, 6H).
[00395] Como mostrado na etapa 6-ix do Esquema 6, a uma mistura 5-bromo-N-((cis)-4-((7-morfolinoquinoxalin-5-il)óxi)ciclo-hexila)pirimidin-2- amina (75 mg, 0,155 mmol), carbonato de césio (101 mg, 0,309 mmol), dímero de cloreto de alilpaládio (II) (0,28 mg, 0,0015 mmol), RockPhos (2,17 mg, 0,0046 mmol) e MeOH (9,9 mg, 12,5 µL, 0,31 mmol) em tolueno (2 mL) foi lavada com nitrogênio gasoso e aquecida a 100°C por 18 horas. A mistura de reação foi diluída com EtOAc, filtrada através de uma camada de terra de diatomáceas e concentrada sob pressão reduzida. A purificação por cromatografia em sílica-gel de pressão média (gradiente de 0-8% de MeOH/DCM) produziu 5-metóxi-N-((cis)- 4-((7-morfolinoquinoxalin-5-il)óxi)ciclo-hexil)pirimidin-2-amina (composto 134, 43 mg): 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9
Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,07 (s, 2H), 6,96 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,01 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,80 (q, J = 5,6, 4,2 Hz, 1H), 4,03 -3,87 (m, 5H), 3,80 (s, 3H), 3,42-3,27 (m, 4H), 2,29-2,10 (m, 2H), 1,99-1,82 (m, 6H). Exemplo 7. Preparação de 4-(8-(((trans)-4-(pirimidin-2-iloxi)ciclo- hexil)óxi)quinoxalin-6-il)morfolina (Composto 34) e 4-(8-(((cis)-4- (pirimidin-2-iloxi)ciclo-hexil)óxi)-quinoxalin-6-il)morfolina (Composto 42)
[00396] Como mostrado na etapa 7-i do Esquema 7, a uma solução de 1,4-dioxaspiro[4.5]decan-8-ol (composto 1021, 1,0 g, 6,32 mmols) em DMF (10 mL) foi adicionado NaH (370 mg, 9,25 mmols). A mistura de reação foi agitada por 20 minutos antes da adição de 2- cloropirimidina (869 mg, 7,59 mmols). A mistura foi agitada durante 30 minutos à temperatura ambiente e depois aquecida a 100°C durante 9 horas. Após o resfriamento, a mistura foi diluída com EtOAc, lavada com H2O, seca sobre Na2SO4, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica-gel de pressão média (0-40% EtOAc/hexanos) para produzir 2-(1,4-dioxaspiro[4.5]decan-8- iloxi)pirimidina (composto 1022) como um óleo incolor: 1H-RMN (300 MHz, clorofórmio-d) δ 8,52 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,92 (t, J = 4,8 Hz), 1H), 5,15 (ddd, J = 10,7, 6,5, 4,2 Hz, 1H), 4,05-3,87 (m, 4H), 2,14-1,85 (m, 6H), 1,79-1,65 (m, 2H); ESMS (M+H+) = 237,12.
[00397] Como mostrado na etapa 7-ii do Esquema 7, a 2-(1,4- dioxaspiro[4.5]decan-8-ilóxi)pirimidina (620 mg, 2,624 mmols) foi adicionado HCl (4,0 mL de 6 M, 8,86 mmols) e a mistura de reação foi agitada por duas horas. O pH da mistura foi neutralizado com solução sat. de NaHCO3 (aq) e a mistura foi concentrada sob pressão reduzida tal como um azeótropo de metanol. Ao resíduo foi adicionado DCM (30 mL) para produzir um precipitado, seguido de agitação por mais 20 minutos. Os sólidos foram removidos por filtração e o licor mãe foi concentrado sob pressão reduzida. O resíduo resultante foi dissolvido em metanol e borohidreto de sódio (151 mg, 3,99 mmols) foi adicionado como um sólido. A mistura foi agitada durante uma hora e a reação foi arrefecida bruscamente com HCl (6M, 0,70 mL). A agitação continuou até a evolução do gás cessar. O pH da mistura foi ajustado para cerca de 8 com hidróxido de sódio a 1N e extraído com EtOAc (20 mL). Os orgânicos foram secos sobre sulfato de sódio e concentrados sob pressão reduzida para produzir 4-(pirimidin-2-ilóxi)ciclo-hexanol (composto 1023, 248 mg, 64% de rendimento) tal como uma mistura dos isômeros (cis)- e (trans)-. Uma alíquota de 12 mg da amostra foi purificada por cromatografia em fase reversa pré-operatória por HPLC (gradiente de 10-90% de CH3CN/água contendo 0,1% de TFA) para separar os isômeros: (trans)-4-pirimidin-2-iloxiciclohexanol - 1H-RMN (300 MHz, clorofórmio-d) δ 8,54 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,95 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,05 (tt, J = 9,4, 4,0 Hz, 1H), 3,91-3,75 (m, 1H), 2,26-1,99 (m, 4H), 1,76-1,41 (m, 4H); ESMS (M+H+) = 195,07, (cis)-4-pirimidin-2- iloxiciclohexanol - 1H-RMN (300 MHz, clorofórmio-d) δ 8,62 (d, J = 4,9 Hz, 2H), 7,04 (t, J = 4,9 Hz, 1H), 5,21 (tt, J = 5,3, 2,6 Hz, 1H), 4,56 (s, 1H), 3,85 (p, J = 5,9 Hz, 1H), 2,17-2,02 (m, 2H), 1,88- 1,67 (m, 6H); ESMS (M+H+) = 195,07. O material restante foi utilizado em reações subsequentes tal como a mistura cis/trans.
[00398] Como mostrado na etapa 7-iii do Esquema 7, a uma solução de uma mistura cis/trans de 4-pirimidin-2-iloxiciclohexanol (244 mg, 1,256 mmol) e trietilamina (350 µL, 2,51 mmols) em diclorometano (5 mL) foi adicionado cloreto de metanossulfonil (145 µL, 1,87 mmol). A mistura de reação foi agitada por duas horas, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica-gel de pressão média (gradiente de EtOAc a 0% a 20%/diclorometano) para fornecer metanossulfonato de 4-pirimidin-2-iloxiciclohexil) (composto 1024, 239 mg, rendimento de 70%) tal como uma mistura de isômeros cis/trans: 1 H-RMN (300 MHz, clorofórmio-d) ô 8,51 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,93 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,13 (dq, J = 9,9, 3,0 Hz, 1H), 4,87 (p, J = 3,8 Hz, 1H), 3,04 (d, J = 2,4 Hz, 3H), 2,28-1,99 (m, 4H), 1,99-1,74 (m 4H); ESMS (M+H+) = 273,52.
[00399] Como mostrado na etapa 7-iv do Esquema 7, uma mistura de metanossulfonato de (4-pirimidin-2-iloxiciclohexil) (105 mg, 0,386 mmol), 7-morfolinoquinoxalin-5-ol (178,3 mg, 0,7712 mmol), e Cs2CO3 (125,6 mg, 0,3856 mmol) em dioxano (1,5 mL) foi selado em um tubo de micro-ondas de 5 mL e aquecido a 110°C por 14 horas usando um banho de óleo. A mistura de reação foi arrefecida até à temperatura ambiente, diluída com EtOAc e filtrada através de terra de diatomáceas que foi subsequentemente lavada com acetato de etila. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e o resíduo purificado por HPLC preparativa de fase reversa (10-90% de CH3CN/gradiente de água contendo 0,1% de TFA). As frações contendo uma mistura de isômeros cis e trans foram posteriormente purificadas via SFC usando uma coluna OJ quiral e eluindo com 40% de MeOH em CO2 para fornecer 21 mg de 4-(8-(((trans)-4-(pirimidin-2-iloxi))ciclo-hexil)óxi)quinoxalin-6-il)morfolina (composto 34): 1H-RMN (300 MHz, clorofórmio-d) δ 8,69 (dd, J = 3,4, 1,9 Hz, 1H), 8,62 (dd, J = 3,6, 1,9 Hz, 1H), 8,51 (dd, J = 4,8, 2,2 Hz, 2H), 7,01-6,83 (m, 3H), 5,18 (tt, J = 7,0, 3,4 Hz, 1H), 4,79 (tt, J = 6,9), 3,1 Hz, 1H), 4,00-3,85 (m, 4H), 3,34 (dq, J = 4,8, 2,6 Hz, 4H), 2,44-2,16 (m, 4H),
1,92 (tdd, J = 16,4, 7,7, 2,8 Hz, 4H); ESMS (M+H+) = 408,56 e 22 mg de 4-(8-(((cis)-4-(pirimidin-2-iloxi)ciclo-hexil)óxi)-quinoxalin-6-il)morfolina (composto 42): 1H-RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) ô 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,52 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 7,01-6,87 (m, 3H), 5,17 (ddt, J = 8,7, 6,7, 3,4 Hz, 1H), 4,76-4,58 (m, 1H), 4,00-3,87 (m, 4H), 3,40-3,27 (m, 4H), 2,43 -2,22 (m, 4H), 2,05-1,87 (m, 2H), 1,86-1,71 (m, 2H); ESMS (M+H+) = 408,56. Exemplo 8. N-[(cis)-4-[7-(3,6-di-hidro-2H-piran-4-il)quinoxalin-5- il]oxiciclohexil]pirimidin-2-amina (Composto 36)
[00400] Como mostrado na etapa 8-i do Esquema 8, a uma mistura de 7-bromoquinoxalin-5-ol (composto 1018, 200 mg, 0,89 mmol) e carbonato de césio (579 mg, 1,78 mmol) em NMP (4,0 mL) foi adicionado (trans)-4-(pirimidin-2-ilamino)ciclohexilmetanossulfonato (composto 1014, 241,1 mg, 0,8887 mmol). A mistura foi agitada por 18 horas a 90°C, altura em que foi adicionado mais 0,5 eq do composto 1014 (241 mg, 0,89 mmol). Após agitação a 90°C por mais 6 horas, a mistura de reação foi diluída com EtOAc, lavada com H2O, seca sobre Na2SO4, concentrada e purificada por cromatografia em sílica-gel de pressão média (0-5% de MeOH/DCM) para fornecer N-((cis)-4-((7- bromoquinoxalin-5-il)óxi)ciclo-hexil)pirimidin-2-amina (composto 1025): 1 H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 9,01-8,77 (m, 2H), 8,29 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 7,89 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,25 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,53 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,43- 5,22 (m, 1H), 4,79 (td, J = 5,2, 2,5 Hz, 1H), 4,18-3,95 (m, 1H), 3,51 (s, 1H), 2,22 (td, J = 10,2, 9,6, 5,4 Hz, 2H), 2,09-1,86 (m, 6H).
[00401] Como mostrado na etapa 8-ii do Esquema 8, uma mistura de N-((cis)-4-((7-bromoquinoxalin-5-il)óxi)ciclo-hexil)pirimidin-2-amina (composto 1025, 52 mg, 0,1299 mmol), Pd(dppf)Cl2 (10,61 mg, 0,01299 mmol), 2-(3,6-di-hidro-2H-piran-4-il)-4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolano (composto 1026, 27,3 mg, 0,13 mmol), Na2CO3 (195 µL de solução a 2M (aq), 0,39 mmol) em DMF (1 mL) foi lavada com nitrogênio gasoso por 10 minutos.
A mistura foi submetida à radiação de micro-ondas por 20 min a 150°C.
Após o resfriamento, a mistura foi diluída com EtOAc, lavada com H2O, seca sobre Na2SO4, concentrada sob pressão reduzida e purificada por cromatografia em sílica-gel de média pressão (0-5% de MeOH/DCM) para fornecer N-[(cis)-4-[7-(3,6- di-hidro-2H-piran-4-il)quinoxalin-5-il]oxiciclohexil]pirimidin-2-amina (composto 36) como um sólido esbranquiçado: 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,94-8,76 (m, 2H), 8,29 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 7,67 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,53 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 6,37 (tt, J = 3,1, 1,5 Hz, 1H), 5,30 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,87 (dt, J = 7,5, 3,6 Hz, 1H), 4,43 (q, J = 2,8 Hz, 2H), 4,02 (t, J = 5,5 Hz, 3H), 2,68 (dqd, J = 6,0, 3,4, 3,0, 1,8 Hz, 2H), 2,35-2,11 (m, 2H), 2,07-1,84 (m, 6H); ESMS (M+H+) = 404,2. Exemplo 9. N-((cis)-4-((7-morfolinoquinoxalin-5-il)óxi)ciclo- hexil)pirimidin-2-amina (Composto 28)
[00402] Como mostrado na etapa 9-i do Esquema 9, 7- bromoquinoxalin-5-ol (composto 1017, 5,4 g, 24,0 mmols), 2-((trans)-4- hidroxiciclohexil) isoindolina-1,3-diona (5,607 g, 22,86 mmols) e trifenilfosfina (8,994 g, 7,945 mL, 34,29 mmols) foram dissolvidos em THF anidro e o frasco foi resfriado em um banho de gelo. DIAD (6,93 g, 6,64 mL, 34,3 mmols) foi adicionado gota a gota e a reação foi agitada a 0°C por 5 minutos, depois aquecida à temperatura ambiente e agitada por 18 horas. A mistura de reação foi concentrada sob pressão reduzida, o resíduo foi tratado com Et2O e agitado por 0,5 hora à temperatura ambiente, os precipitados foram filtrados, o filtrado concentrado sob pressão reduzida e o resíduo purificado por cromatografia em sílica-gel de pressão média (0-50% Gradiente de EtOAc/hexanos) para produzir 2-[(cis)-4-(7-bromoquinoxalin-5-il)oxiciclohexil]isoindolina-1,3-diona (composto 1028, 6,2 g, 60% de rendimento): 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,95 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,86 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,88-7,80 (m, 2H), 7,77-7,68 (m, 2H), 7,31 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 4,96 (t, J = 2,9 Hz, 1H), 4,29 (tt, J = 12,5, 3,8 Hz, 1H), 2,88 (qd, J = 12,9, 3,6 Hz, 2H), 2,54-2,32 (m, 2H), 1,94-1,61 (m, 4H).
[00403] Como mostrado na etapa 9-ii do Esquema 9, em um frasco de fundo redondo equipado com um condensador, uma mistura de 2-[4- (7-bromoquinoxalin-5-il)oxiciclohexil]isoindolina-1,3-diona (6,2 g, 12,34 mmols), morfolina (1,61 g, 1,62 mL, 18,5 mmols) e Cs2CO3 (12,06 g, 37,0 mmols) em tolueno anidro (73 mL) foi tratada com rac-BINAP (768,4 mg, 1,234 mmol) e Pd2(dba)3 (565 mg, 0,617 mmol). A mistura de reação foi aquecida a 110°C por 18 horas. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a mistura foi filtrada através de terra de diatomáceas e concentrada sob pressão reduzida. O resíduo foi triturado com Et2O e os sólidos coletados por filtração e lavados com Et2O para produzir 2-((cis)-4-((7-morfolinoquinoxalin-5-il)óxi)ciclo- hexil)isoindolina-1,3-diona (composto 1029, 4,2 g) como um sólido amarelo. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida e purificado por cromatografia em sílica-gel de pressão média (gradiente de 0-100% EtOAc/hexanos) para produzir 300 mg adicionais do composto 1029: 1 H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,76-8,63 (m, 2H), 7,85 (dd, J = 5,4, 3,1 Hz, 2H), 7,79-7,60 (m, 2H), 7,09 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,06 (t, J = 2,8 Hz, 1H), 4,27 (tt, J = 12,3, 3,8 Hz, 1H), 4,02-3,85 (m, 4H), 3,49-3,27 (m, 4H), 3,03-2,75 (m, 2H), 2,37 (d, J = 14,0 Hz, 2H), 1,83-1,56 (m, 4H).
[00404] Como mostrado na etapa 9-iii do Esquema 9, a uma suspensão de 2-[(cis)-4-(7-morfolinoquinoxalin-5-il)oxiciclohexil] isoindolina-1,3-diona (2,3 g, 5,02 mmols) em MeOH (25 mL) foi adicionada hidrazina (321 mg, 315 µL, 10,0 mmols) e a mistura de reação foi agitada por 18 horas à temperatura ambiente, durante este tempo a suspensão inicial se tornou homogênea, seguida pelo aparecimento de um precipitado. Et2O (30 mL) foi adicionado e a mistura de reação foi agitada por mais 30 minutos. Os precipitados foram removidos por filtração, o filtrado concentrado sob pressão reduzida, o resíduo tratado com DCM (30 mL) e quaisquer sólidos restantes removidos por filtração. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para fornecer (cis)-4-((7-morfolinoquinoxalin-5-il)óxi)ciclo-hexanamina (composto 1030), que foi usado tais como nas reações subsequentes: 1 H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,00-4,67 (m, 3H), 4,03-3,81 (m, 4H), 3,49 (s, 1H), 3,43-3,25 (m, 4H), 2,88 (q, J = 6,2 Hz, 2H), 2,36-1,96 (m, 6H).
[00405] Como mostrado na etapa 9-iv do Esquema 9, a uma solução de (cis) 4-(7-morfolinoquinoxalin-5-il)oxiciclo-hexanamina (415 mg, 1,264 mmol) e 2-metilsulfonilpirimidina (400 mg, 2,53 mmols)) foi adicionado DIEA (490 mg, 661 µL, 3,79 mmols) e a mistura de reação foi selada em um vaso e aquecida a 100°C por 16 horas. Após esse tempo, os voláteis foram removidos sob uma corrente de gás nitrogênio e o resíduo bruto dissolvido em quantidade mínima de DCM. A purificação por cromatografia em sílica-gel de pressão média (0-10% de MeOH/DCM, 1% de Et3N] produziu N-((cis)-4-((7-morfolinoquinoxalin-5- il)óxi)ciclo-hexil)pirimidin-2-amina contendo cloridrato de trietilamina tal como impureza. Produto dissolvido em DCM e agitado com uma amina suportada em sílica (Silabond amine® 40-63 µm). A mistura sequestrante foi filtrada, concentrada sob pressão reduzida e seca sob alto vácuo para fornecer N-((cis)-4-((7-morfolinoquinoxalin-5-il)óxi)ciclo- hexil)pirimidin-2-amina (Composto 28, 435 mg): 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,27 (s, 1H), 8,26 (s, 1H), 6,94 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,50 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 4,78 (s, 1H), 4,08 - 3,97 (m, 1H), 3,94 - 3,86 (m, 4H), 3,37 - 3,28 (m, 4H), 2,20 (d, J = 9,1 Hz, 2H), 1,95 - 1,85 (m, 6H). Exemplo 10. Preparação de N-[4-[7-(6-oxa-3-azabiciclo[3.1.1]heptan-3- il)quinoxalin-5-il]oxiciclohexil]pirimidin-2-amina (Composto 291) Esquema 10a
[00406] A uma mistura de 7-bromoquinoxalin-5-ol (47,53 g, 211,2 mmols), 2-(4-hidroxiciclohexil)isoindolina-1,3-diona (52,41 g, 213,7 mmols) e PPh3 (87,31 g, 332,9 mmols) em THF (740 mL) a 21°C foi adicionado terc-butil (NZ)-N-terc-butoxicarboniliminocarbamato (DTBAD) (79,51 g, 328,0 mmols) em porções ao longo de 40 min, de modo a manter a temperatura abaixo de 30°C e a mistura de reação resultante foi agitada à temperatura ambiente durante mais 20 horas.
[00407] A reação foi evaporada in vácuo. O óleo viscoso residual marrom-avermelhado foi dissolvido em CH2Cl2 e filtrado através de um plugue de sílica em uma coluna de vidro usando pressão de ar aplicada (o plugue foi feito com 1 L de sílica seca suspensa em CH2Cl2). O plugue foi eluído com CH2Cl2, as frações foram combinadas e evaporadas in vácuo para fornecer um óleo/espuma viscoso marrom-avermelhada, que foi então dissolvida em 700 mL de MeOH antes da precipitação. A mistura foi agitada à temperatura ambiente por uma hora, filtrada, lavada com MeOH frio (500 mL) e Et2O (100 mL), depois seca sob vácuo para produzir um sólido castanho claro que foi suspenso em 300 mL de MeOH e levado ao refluxo por 10 minutos. A suspensão foi resfriada à temperatura ambiente e filtrada, lavada com mais MeOH e Et2O (4:1) e seca sob vácuo para fornecer 2-[4-(7-bromoquinoxalin-5-il)oxiciclohexil] isoindolina-1,3-diona (58,43 g, 126,6 mmols, 59,94%). 1H-RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,96 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,86 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,89 - 7,82 (m, 2H), 7,78 - 7,67 (m, 2H), 7,30 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,95 (s, 1H), 4,29 (tt, J = 12,5, 3,7 Hz, 1H), 2,87 (qd, J = 13,1, 3,5 Hz, 2H), 2,44 (d, J = 15,2 Hz, 2H), 1,80 (t, J = 14,1 Hz, 2H), 1,67 (d, 2H). ESI-MS m/z calc. 451,05316, encontrado 452,19 (M + 1) +; Tempo de retenção: 0,92 minutos.
Esquema 10b
[00408] Uma mistura de 2-[4-(7-bromoquinoxalin-5-il)oxiciclohexil] isoindolina-1,3-diona (1 g, 2,211 mmols), 6-oxa-3- azabiciclo[3.1.1]heptano HCl (180 mg, 1,328 mmol), carbonato de césio (2,161 g, 6,633 mmols), Pd2(dba)3 (202,5 mg, 0,2211 mmol) e rac- BINAP (275,3 mg, 0,4422 mmol) em dioxano (5 mL) foi agitada durante a noite a 70°C, depois aquecida em um reator de micro-ondas por 15 min a 150°C. A reação foi então diluída com cloreto de metileno, filtrada através de Celite e concentrada. A cromatografia em coluna flash em sílica-gel (0-5% de MeOH/DCM) produziu 2-[4-[7-(6-oxa-3- azabiciclo[3.1.1]heptan-3-il)quinoxalin-5-il]oxiciclohexil] isoindolina-1,3- diona (750 mg, 72,1%) como um sólido amarelo que foi levado para a próxima reação.
Esquema 10c
[00409] A uma solução de 2-[4-[7-(6-oxa-3-azabiciclo[3.1.1]heptan- 3-il) quin oxalin-5-il]oxiciclohexil]isoindolina-1,3-diona (800 mg, 1,700 mmol) em EtOH (10 mL) foi adicionado hidrazina monohidratada (85,10 mg, 83,35 µL, 1,700 mmol) e a reação foi agitada ao refluxo durante a noite, depois concentrada, diluída com DCM e filtrada. O filtrado foi concentrado e purificado em um cartucho de 40 g de sílica-gel com 0- 50% (20% de NH3/MeOH) para produzir 4-[7-(6-oxa-3- azabiciclo[3.1.1]heptan-3-il)quinoxalin-5-il]oxiciclo-hexanamina (450 mg, 77,8%) como um sólido amarelo. 1H-RMN (300 MHz, Clorofórmio- d) ∂ 8,65 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,53 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,83 (q, J = 2,6 Hz, 2H), 4,83 (t, J = 6,0 Hz, 4H), 3,87 - 3,60 (m, 5H), 3,34 (dt, J = 8,7, 6,6 Hz, 1H), 3,01 - 2,83 (m, 1H), 2,23 (dq, J = 11,3, 5,8, 4,8 Hz, 2H), 2,07 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 1,92-1,62 (m, 6H).
Esquema 10d
[00410] Uma mistura de 4-[7-(6-oxa-3-azabiciclo[3.1.1]heptan-3- il)quinoxalin-5-il]oxiciclo-hexanamina (190 mg, 0,5581 mmol), 2- fluoropirimidina (60 mg, 0,6118 mmol) e DIEA (200 µL, 1,148 mmol) em 2-propanol (2 mL) foi aquecida em um reator de micro-ondas por 20 minutos a 150°C. A mistura de reação foi concentrada e depois purificada de 12 g de cartucho de sílica-gel com 0-6% de MeOH/DCM para produzir N-[4-[7-(6-oxa-3-azabiciclo[3.1.1]heptan-3-il)quinoxalin-5- il]oxiciclohexil]pirimidin-2-amina (120,2 mg, 48,9%) como um sólido amarelo. Massa + 1: 419,23; Tempo de retenção: 0,72; Anotação de RMN: 1H-RMN (400 MHz, clorofórmio-d) δ 8,42 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,30 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,04 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,65 - 6,56 (m, 2H), 6,28 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 4,99 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,60 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 3,79 (dd, J = 8,2, 4,0 Hz, 0H), 3,62 - 3,38 (m, 4H), 3,17 - 3,03 (m, 1H), 2,07 - 1,90 (m, 2H), 1,89 - 1,59 (m, 7H). Exemplo 11. Preparação de 4-metil-N-[4-[(6-morfolino-2,1,3- benzoxadiazol-4-il)óxi] ciclo-hexil]pirimidin-2-amina (Composto 665)
[00411] Uma mistura de 4,6-dibromo-2,1,3-benzoxadiazol (3 g, 10,80 mmols) e N-(4-hidroxiciclohexil)carbamato de terc-butila (2,5 g, 11,61 mmols) foi dissolvida em THF (60 mL) e arrefecida a -30°C. À mistura foi adicionado gota a gota bis(trimetilsilil)amida de sódio (NaHMDS, 23 mL de 1 M, 23,00 mmols) durante 10 minutos e a solução se tornou azul escuro. A mistura foi agitada durante 30 minutos -20 a 0°C e 30 minutos à rt. LC-MS mostrou o pico desejado do produto apenas sem material de partida. Resfriada para 0°C, temperada e com solução de ácido cítrico a 10%, extraída com EtOAc, seca sobre Na2SO4 e concentrada. Purificada por 0-40% de EtOAc/heptano. Recuperado 1,9 g (42%) de terc-butil ((1s,4s)-4-((6-bromobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-il)óxi)ciclo- hexil)carbamato (C17H22BrN3O4).
[00412] Uma mistura de terc-butil N-[4-[(6-morfolino-2,1,3- benzoxadiazol-4-il)óxi]ciclo-hexil]carbamato (2,6 g, 6,306 mmols), carbonato de césio (4 g, 12,28 mmols), diacetoxipaládio (140 mg, 0,6236 mmol), RuPhos (580 mg, 1,243 mmol) e morfolina (900 µL, 10,32 mmols) em dioxano (30 mL) foi purgada com N2 por 5 minutos. A mistura foi agitada durante 3 h a 90°C. LC-MS mostrou o produto desejado. A mistura foi diluída com DCM, filtrada através de uma camada de celite, concentrada e purificada com um cartucho de 80 g de sílica-gel eluindo com 0-80% de EtOAc/heptano, recuperando o terc-butil N-[4-[(6-morfolino-2,1,3- benzoxadiazol-4-il)óxi]ciclo-hexil]carbamato (2,1 g, 80%). 1H-RMN (400 MHz, Clorofórmio-d) δ 6,42 (dd, J = 12,3, 1,7 Hz, 2H), 4,86 (s, 1H), 4,58 (s, 1H), 4,00 - 3,86 (m, 4H), 3,38 - 3,18 (m, 4H), 2,28 - 2,08 (m, 2H), 1,94 - 1,62 (m, 6H), 1,42 (s, 9H). Terc-butil N-[4-[(6-morfolino-2,1,3-benzoxadiazol-4-il)óxi]ciclo-hexil] carbamato
[00413] A uma solução de terc-butil N-[4-[(6-morfolino-2,1,3- benzoxadiazol-4-il)óxi]ciclo-hexil]carbamato (3,5 g, 8,363 mmols) em DCM (30 mL) foi adicionado TFA (aproximadamente 953,6 mg, 644,3 µL, 8,363 mmols) e agitada por uma hora. A mistura foi concentrada e purificada com 40 g de cartucho de sílica-gel eluindo com 0-10% (7N de NH3/MeOH/DCM). Recuperado 4-[(6-morfolino-2,1,3-benzoxadiazol-4- il)óxi]ciclo-hexanamina (2,5 g, 94%) ESI-MS m/z calc. 318,1692, encontrado 319,2 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,55 minutos.
[00414] Um frasco de micro-ondas foi carregado com 4-[(6-morfolino- 2,1,3-benzoxadiazol-4-il)óxi]ciclo-hexanamina (1 g, 3,141 mmols), 2- cloro-4-metil-pirimidina (600 mg, 4,667 mmols), RockPhos G3 (80 mg, 0,3175 mmol) e dioxano (10 mL). NaOtBu (4 mL de 2 M, 8,000 mmols) foi adicionado à mistura.
A mistura foi agitada por 15 minutos a 70°C.
LC - MS mostrou uma conversão, rendendo 4-metil-N-[4-[(6-morfolino- 2,1,3-benzoxadiazol-4-il)óxi]ciclo-hexil]pirimidin-2-amina.
A mistura foi diluída com DCM, filtrada através de uma camada de celite, concentrada e purificada com cartucho de 40 g de sílica-gel eluindo com 0-10% de MeOH/DCM.
O produto foi recuperado.
O produto foi triturado com Et2O e seco sob vácuo. 4-metil-N-[4-[(6-morfolino-2,1,3-benzoxadiazol-4- il)óxi]ciclo-hexil]pirimidin-2-amina (795,3 mg, 59%), 1H-RMN (400 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,16 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 6,49 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,47 - 6,40 (m, 2H), 5,07 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,95 (s, 1H), 3,9 6 - 3,85 (m, 4H), 3,32 - 3,24 (m, 4H), 2,34 (s, 3H), 2,25 - 2,08 (m, 2H), 2,04 - 1,74 (m, 6H). ESI-MS m/z calc. 410,20663, encontrado 411,3 (M + 1) +; Tempo de retenção: 0,63 minutos.
Preparação de N-metil-2-((4-((6-morfolinobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4- il)óxi)ciclo-hexil)amino)pirimidina-4-carboxamida (Composto (666))
[00415] A uma mistura de 4,6-dibromo-2,1,3-benzoxadiazol (1 g, 3,598 mmols), (4-metoxifenil) metanol (500 µL, 4,010 mmols) em THF (20 mL) a -78 foi adicionado gota a gota NaHMDS (4 mL de 1 M, 4.000 mmols). A solução se tornou azul. A mistura foi agitada a -78°C durante 30 minutos. A mistura foi deixada aquecer até à RT e foi atirada durante uma hora à RT. LC-MS mostrou um pico de produto e nenhum material de partida. A TLC mostrou um ponto ligeiramente menos polar que o material de partida. A reação foi arrefecida bruscamente com NH4Cl sat., extraída com EtOAc, lavada com H2O e seca sobre Na2SO4, concentrada. O produto foi purificado com 40 g de cartucho de sílica-gel eluindo com 0-30% de EtOAc, recuperando 6-bromo-4-[(4- metoxifenil)metóxi]-2,1,3-benzoxadiazol (850 mg, 70%) como um sólido ligeiramente amarelo. 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,48 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 7,38 - 7,19 (m, 2H), 6,94 - 6,74 (m, 2H), 6,57 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 5,11 (s, 2H), 3,68 (d, J = 9,4 Hz, 3H).
[00416] Uma mistura de 6-bromo-4-[(4-metoxifenil)metóxi]-2,1,3- benzoxadiazol (830 mg, 2,476 mmols), carbonato de césio (2,4 g, 7,366 mmols), Pd(OAc)2 (50 mg, 0,2227 mmol), rac-BINAP (300 mg, 0,4818 mmol) e morfolina (300 µL, 3,440 mmols) em dioxano (10 mL) foi borbulhada com N2 por 10 minutos. A mistura foi aquecida a 80°C. A mistura foi agitada durante 4,5 h a 80°C. LC-MS mostrou um produto limpo. A mistura foi resfriada à rt, diluída com DCM, filtrada através de uma camada de celite e concentrada. O produto foi purificado com 4 g de cartucho de sílica-gel com 0-70% de EtOAc/DCM, recuperado 4-[(4- metoxifenil)metóxi]-6-morfolino-2,1,3-benzoxadiazol (750 mg, 89%). 1H- RMN (300 MHz, CDCl3) δ 7,42 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 7,03 - 6,87 (m, 2H), 6,48 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 6,40 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 5,30 (d, J = 13,5 Hz, 2H), 3,99 - 3,75 (m, 7H), 3,31 - 3,17 (m, 4H).
[00417] Uma solução de 4-[(4-metoxifenil)metóxi]-6-morfolino-2,1,3- benzoxadiazol (750 mg, 2,197 mmols) em DCM (10 mL) foi adicionado
TFA (2 mL, 25,96 mmols)) e agitada por uma hora. A mistura foi concentrada e o produto purificado com 12 g de cartucho de sílica-gel eluindo com 0-10% de MeOH/DCM. 6-morfolino-2,1,3-benzoxadiazol-4- ol (400 mg, 82%) é recuperado como uma espuma amarela.
[00418] Uma mistura de 6-morfolino-2,1,3-benzoxadiazol-4-ol (50 mg, 0,2260 mmol), [4-[[4-(metilcarbamoil)pirimidin-2-il]amino] DMF, hexil]metanossulfonato (240 mg, 0,7308 mmol) e carbonato de césio (250 mg, 0,7673 mmol) em DMF (1 mL) foi agitada durante a noite a 80°C. LC - MS mostrou o produto desejado. A mistura foi diluída com DCM e H2O, extraída com DCM, seca sobre Na2SO4, concentrada. O produto foi purificado com um cartucho de 4 g de sílica-gel eluindo com 0-5% de MeOH/DCM, recuperando o produto desejado N-metil-2-((4- ((6-morfolinobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-il)óxi)ciclo- hexil)amino)pirimidina-4-carboxamida (41,8 mg, 39%). 1H-RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,50 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H), 7,34 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 6,50 (d, J = 1,3 Hz, 1H), 6,43 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 5,21 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,96 (s, 1H), 4,04 (s, 1H), 3,94 - 3,81 (m, 4H), 3,33 - 3,17 (m, 4H), 3,01 (t, J = 9,9 Hz, 3H), 2,19 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 2,06 - 1,78 (m, 6H). ESI-MS m/z calc. 453,21246, encontrado 454,39 (M+1)+; Tempo de retenção: 0,72 minutos.
[00419] As tabelas 1 e 2 fornecem dados de caracterização analítica para certos compostos de fórmula (III-E-1 e III-E-2) (células em branco indicam que o teste não foi realizado).
Tabela 1. 1H RMN (300 MHz, a menos que Comp.
ESMS Estrutura do Composto indicado de outra forma) Nº. (M+H) Picos RMN dados como valores δ (CDCl3) δ 8,65 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,37 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,27 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,60 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,51 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 6,36 18 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,15 (d, J = 7,8 406,48 Hz, 1H), 5,20 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 4,04 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 3,96 - 3,82 (m, 4H), 3,70 (s, 1H), 3,39 - 3,24 (m, 4H), 1,94 (dd, J = 13,7, 4,4 Hz, 6H), 1,78 (dt, J = 28,8, 16,1 Hz, 2H)
(CDCl3) δ 8,20 (d, J = 4,9 Hz, 2H), 6,46 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 6,05 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 5,82 (s, 1H), 5,24 (s, 23 396,2 1H), 4,82 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 3,98 (s, 1H), 3,85 - 3,72 (m, 4H), 3,60 (s, 1H), 3,23 - 3,06 (m, 4H), 1,95 - 1,62 (m, 8H). [2]
(400 MHz, CDCl3) δ 8,65 (s, 1H), 8,37 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,08 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,41 (t, J = 7,7 Hz, 1H), 6,61 (s, 1H), 6,58 - 6,53 (m, 1H), 24 405,59 6,46 - 6,30 (m, 2H), 6,15 (d, J = 7,3 Hz, 1H), 4,56 (s, 1H), 3,98 - 3,78 (m, 5H), 3,76 - 3,61 (m, 1H), 3,42 - 3,24 (m, 4H), 1,97 (d, J = 29,6 Hz, 6H), 1,86 - 1,66 (m, 2H)
(CDCl3) δ 8,65 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,36 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,98 (dd, J = 2,8, 1,5 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 7,79 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 6,62 (d, J = 2,4 27 Hz, 1H), 6,37 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,17 406,58 (s, 1H), 8,69 - 8,61 (m, 1H), 4,60 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 4,08 - 3,83 (m, 5H), 8,71 - 8,57 (m, 1H), 3,73 (t, J = 6,9 Hz, 1H), 3,40 - 3,25 (m, 4H), 1,96 (h, J = 4,9 Hz, 6H), 1,77 (q, J = 7,4, 6,1 Hz, 2H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,77 - 8,59 (m, 2H), 8,29 (d, J = 4,9 Hz, 2H), 7,01 - 28 6,87 (m, 2H), 6,61 - 6,48 (m, 1H), 4,82 407,3 (s, 1H), 4,05 (s, 1H), 3,93 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,35 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 2,23 (d, J = 13,1 Hz, 2H), 2,05 - 1,82 (m, 6H)
(DMSO-d6) δ 12,65 (s, 1H), 8,69 (d, J = 2,0 Hz, 2H), 8,43 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,00 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 6,54 (d, J = 2,5 29 450,61 Hz, 1H), 6,48 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,17 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,06 (s, 1H), 3,77 (dd, J = 5,9, 3,8 Hz, 4H), 3,29 (s, 5H), 2,04 - 1,46 (m, 8H)
(CDCl3) δ 8,66 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,58 (s, 1H), 8,37 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,13 (s, 2H), 6,63 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,37 30 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,14 (d, J = 7,6 Hz, 406,52 1H), 3,96 - 3,86 (m, 4H), 3,76 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 3,54 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,39 - 3,29 (m, 4H), 2,02 - 1,86 (m, 6H), 1,76 (q, J = 8,9, 8,3 Hz, 2H)
(CDCl3) δ 8,78 (d, J = 1,3 Hz, 1H), 8,66 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,37 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,91 (d, J = 1,3 Hz, 1H), 6,62 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,37 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 32 464,6 6,16 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 5,13 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,10 (s, 1H), 3,99 - 3,86 (m, 7H), 3,76 (s, 1H), 3,39 - 3,28 (m, 4H), 1,98 (h, J = 4,8 Hz, 6H), 1,80 (t, J = 8,7 Hz, 2H)
(CDCl3) δ 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,99 (dd, J = 2,8, 1,5 Hz, 1H), 7,94 - 7,85 (m, 1H), 7,79 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 7,14 (d, J 33 407,3 = 1,0 Hz, 1H), 7,03 - 6,87 (m, 2H), 4,82 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,70 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,03 - 3,86 (m, 4H), 3,51 (s, 1H), 3,43 - 3,30 (m, 4H), 2,35 - 1,81 (m, 8H)
(CDCl3) δ 8,69 (dd, J = 3,4, 1,9 Hz, 1H), 8,62 (dd, J = 3,6, 1,9 Hz, 1H), 8,51 (dd, J = 4,8, 2,2 Hz, 2H), 7,01 - 6,83 (m, 34 3H), 5,18 (tt, J = 7,0, 3,4 Hz, 1H), 4,79 408,5 (tt, J = 6,9, 3,1 Hz, 1H), 4,00 - 3,85 (m, 4H), 3,34 (dq, J = 4,8, 2,6 Hz, 4H), 2,44 - 2,16 (m, 4H), 1,92 (tdd, J = 16,4, 7,7, 2,8 Hz, 4H)
(CDCl3) δ 8,94 - 8,76 (m, 2H), 8,29 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 7,67 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,53 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 6,37 (tt, J = 3,1, 36 1,5 Hz, 1H), 5,30 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 404,2 4,87 (dt, J = 7,5, 3,6 Hz, 1H), 4,43 (q, J = 2,8 Hz, 2H), 4,02 (t, J = 5,5 Hz, 3H), 2,68 (dqd, J = 6,0, 3,4, 3,0, 1,8 Hz, 2H), 2,35 - 2,11 (m, 2H), 2,07 - 1,84 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,18 (dd, J = 3,7, 37 0,8 Hz, 2H), 7,01 - 6,85 (m, 2H), 5,37 - 425,25 5,20 (m, 1H), 4,79 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,02 - 3,85 (m, 4H), 3,43 - 3,29 (m, 4H), 2,31 - 2,15 (m, 2H), 2,02 - 1,85 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,61 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,55 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,20 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,87 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,81 (d, J 38 = 2,5 Hz, 1H), 6,46 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 407,25 4,95 (s, 1H), 4,45 (tt, J = 10,7, 3,6 Hz, 1H), 3,95 - 3,77 (m, 5H), 3,32 - 3,19 (m, 4H), 2,34 - 2,10 (m, 4H), 1,82 (dt, J = 12,9, 10,0 Hz, 2H), 1,45 - 1,20 (m, 2H)
(CDCl3) δ 8,72 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,37 (s, 1H), 6,98 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,5 Hz, 39 441,28 1H), 6,36 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 4,91 - 4,76 (m, 1H), 4,00 - 3,88 (m, 4H), 3,45 - 3,24 (m, 4H), 2,34 - 2,17 (m, 2H), 2,03 - 1,84 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 7,00 - 6,87 (m, 2H), 6,64 (d, J = 40 441,3 9,3 Hz, 1H), 4,89 - 4,76 (m, 2H), 4,11 - 4,03 (m, 1H), 4,00 - 3,83 (m, 4H), 3,40 - 3,24 (m, 4H), 2,23 (dq, J = 12,9, 6,3, 5,6 Hz, 2H), 2,02 - 1,79 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,55 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,58 (d, J = 23,6 Hz, 41 2H), 6,89 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,84 (d, J 421,43 = 2,5 Hz, 1H), 4,73 (s, 2H), 3,93 - 3,72 (m, 5H), 3,34 - 3,18 (m, 4H), 2,29 (s, 3H), 2,15 (m, 2H), 1,84 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,52 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 7,01 - 6,87 (m, 3H), 5,17 (ddt, J = 42 408,56 8,7, 6,7, 3,4 Hz, 1H), 4,76 - 4,58 (m, 1H), 4,00 - 3,87 (m, 4H), 3,40 - 3,27 (m, 4H), 2,43 - 2,22 (m, 4H), 2,05 - 1,87 (m, 2H), 1,86 - 1,71 (m, 2H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,54 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 8,47 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 6,99 (d, J 44 = 2,4 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 432,6 5,81 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,84 (dt, J = 5,3, 2,8 Hz, 1H), 4,13 - 4,05 (m, 1H), 4,00 - 3,84 (m, 4H), 3,43 - 3,30 (m, 4H), 2,32 - 2,17 (m, 2H), 2,02 - 1,85 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,29 (s, 2H), 6,98 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,5 Hz, 45 485,26 1H), 5,29 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,81 (s, 1H), 4,04 - 3,84 (m, 4H), 3,42 - 3,31 (m, 4H), 2,22 (s, 2H), 1,92 (d, J = 4,9 Hz, 6H)
(CDCl3) δ 8,63 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,52 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 8,37 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,92 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 6,62 (d, J 46 407,57 = 2,4 Hz, 1H), 6,38 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,16 (s, 1H), 5,27 (s, 1H), 4,06 - 3,78 (m, 4H), 3,64 (s, 1H), 3,48 - 3,20 (m, 4H), 2,14 (s, 2H), 2,04 - 1,80 (m, 4H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,99 (s, 1H), 6,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,89 (d, J 49 425,39 = 2,3 Hz, 1H), 6,20 (s, 1H), 5,19 (bs, 1H), 4,81 (bs, 1H), 3,96 - 3,84 (m, 4H), 3,40 - 3,27 (m, 4H), 2,29 - 2,14 (m, 2H), 1,99 - 1,81 (m, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,30 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 50 425,39 6,89 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,84 (s, 1H), 5,42 (s, 1H), 4,81 (s, 1H), 3,99 - 3,82 (m, 4H), 3,39 - 3,24 (m, 4H), 2,31 - 2,19 (m, 2H), 2,08 - 1,72 (m, 8H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,30 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 51 425,33 6,89 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,84 (s, 1H), 5,42 (s, 1H), 4,81 (s, 1H), 3,99 - 3,82 (m, 4H), 3,39 - 3,24 (m, 4H), 2,31 - 2,19 (m, 2H), 2,08 - 1,72 (m, 8H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,68 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 6,93 (s, 1H), 6,90 (s, 1H), 6,28 (s, 1H), 5,06 (d, 52 435,19 J = 7,9 Hz, 1H), 4,77 (s, 1H), 4,06 (bs, 1H), 3,97 - 3,84 (m, 4H), 3,38 - 3,25 (m, 4H), 2,27 (s, 6H), 2,18 - 2,09 (m, 2H), 1,94 - 1,83 (m, 7H)
(CDCl3) δ,9 Hz, 1H), 8,28 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,85 (t, J = 1,9 Hz, 2H), 6,51 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,29 (d, J = 6,3 Hz, 53 1H), 4,80 (dq, J = 5,5, 2,8 Hz, 1H), 4,57 433,25 (d, J = 3,9 Hz, 2H), 4,02 (t, J = 6,2 Hz, 1H), 3,54 - 3,43 (m, 2H), 3,19 (dd, J = 11,6, 2,6 Hz, 2H), 2,27 - 2,14 (m, 2H), 2,08 - 1,85 (m, 10H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,45 (d, J = 7,8 Hz, 2H), 7,02 - 6,81 (m, 2H), 4,78 (ddd, J = 54 437,27 7,3, 5,6, 3,1 Hz, 1H), 4,66 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,01 - 3,78 (m, 7H), 3,41 - 3,25 (m, 4H), 2,30 - 2,08 (m, 2H), 1,94 (h, J = 8,8, 8,2 Hz, 6H)
(CDCl3) δ 8,73 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,42 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 6,96 (dd, J = 19,6, 2,5 Hz, 2H), 55 432,3 6,65 (d, J = 9,3 Hz, 1H), 5,40 (s, 1H), 4,86 (s, 1H), 3,94 (dd, J = 5,9, 3,8 Hz, 4H), 3,37 (dd, J = 6,0, 3,7 Hz, 4H), 2,27 (d, J = 12,7 Hz, 2H), 2,05 - 1,80 (m,6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,36 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,54 (dd, J = 8,8, 2,2 Hz, 59 1H), 6,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J 431,19 = 2,4 Hz, 1H), 6,37 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 5,11 (s, 1H), 4,80 (s, 1H), 3,94 (s, 1H), 3,94 - 3,79 (m, 4H), 3,38 - 3,25 (m, 4H), 2,32 - 2,12 (m, 2H), 2,02 - 1,78 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,06 - 6,88 (m, 3H), 6,80 (dd, J = 9,4, 6,3 Hz, 1H), 4,97 - 60 425,23 4,71 (m, 2H), 4,14 (q, J = 7,1 Hz, 1H), 4,01 - 3,85 (m, 4H), 3,44 - 3,24 (m, 4H), 2,23 (d, J = 10,7 Hz, 2H), 1,96 (dt, J = 11,0, 7,6 Hz, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,87 (s, 1H), 5,78 - 5,64 61 (m, 1H), 4,73 (s, 1H), 4,01 (s, 1H), 3,97 397,15 - 3,78 (m, 4H), 3,43 - 3,18 (m, 4H), 2,26 - 2,05 (m, 2H), 1,98 - 1,73 (m, 6H), 1,36 - 1,26 (m, 1H), 1,01 - 0,92 (m, 2H), 0,78 - 0,67 (m, 2H)
(CDCl3) δ 8,53 (s, 1H), 8,29 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,92 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,85 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,52 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 5,25 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,79 (s, 63 463,54 1H), 4,07 (d, J = 20,4 Hz, 1H), 3,98 - 3,85 (m, 4H), 3,43 - 3,21 (m, 4H), 3,05 - 2,83 (m, 2H), 2,30 - 2,14 (m, 1H), 2,03 - 1,71 (m, 7H), 1,45 (dq, J = 14,5, 7,3 Hz, 2H), 0,98 (t, J = 7,3 Hz, 3H)
(CDCl3) δ 8,55 (s, 1H), 8,29 (d, J = 1,5 Hz, 2H), 7,05 - 6,93 (m, 1H), 6,85 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,49 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 64 4,80 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 4,03 - 3,81 (m, 541,26 5H), 3,45 - 3,27 (m, 4H), 2,98 (dd, J = 8,5, 7,0 Hz, 2H), 2,32 - 2,09 (m, 2H), 2,00 - 1,71 (m, 8H), 1,56 - 1,34 (m, 2H), 0,98 (td, J = 7,3, 3,3 Hz, 3H)
(CDCl3) δ 8,76 - 8,66 (m, 3H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,99 - 6,87 (m, 2H), 5,71 65 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,81 (s, 1H), 4,11 450,49 (s, 1H), 3,92 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 3,34 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 2,22 (d, J = 10,2 Hz, 2H), 2,02 - 1,85 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,77 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 8,72 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 7,12 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,92 (s, 1H), 4,18 - 4,08 (m, 2H), 3,93 (t, J = 4,9 66 495,23 Hz, 4H), 3,85 - 3,76 (m, 2H), 3,60 (q, J = 7,0 Hz, 2H), 3,47 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 2,26 (d, J = 13,3 Hz, 2H), 2,07 (t, J = 10,5 Hz, 2H), 2,01 - 1,72 (m, 2H), 1,26 (t, J = 7,0 Hz, 4H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,02 (s, 1H), 6,94 (dd, J = 12,2, 2,5 Hz, 2H), 5,32 (s, 2H), 67 450,3 4,87 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,79 (s, 1H), 4,01 - 3,86 (m, 4H), 3,36 (q, J = 5,4, 4,7 Hz, 4H), 2,83 (s, 6H), 2,19 (s, 2H), 1,92 (d, J = 4,8 Hz, 6H)
(CDCl3) δ 9,05 (s, 1H), 8,88 - 8,71 (m, 3H), 8,49 (s, 1H), 7,06 (d, J = 2,3 Hz, 69 1H), 6,96 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 4,85 (s, 451,21 1H), 4,17 (s, 1H), 3,93 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,42 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 2,25 - 2,10 (m, 2H), 1,95 (d, J = 11,9 Hz, 4H)
(CDCl3) δ 8,79 - 8,64 (m, 3H), 8,59 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,99 - 6,88 (m, 2H), 6,19 (q, J = 4,7 Hz, 1H), 5,90 (d, J = 8,2 Hz, 71 1H), 4,81 (dq, J = 5,3, 2,7 Hz, 1H), 4,08 464,4 (qd, J = 8,2, 6,5, 2,3 Hz, 1H), 3,97 - 3,87 (m, 4H), 3,39 - 3,29 (m, 4H), 2,93 (d, J = 4,8 Hz, 3H), 2,27 - 2,14 (m, 2H), 2,06 - 1,79 (m, 6H)
(CDCl3) δ 3,97 - 3,87 (m, 4H), 3,39 - 3,29 (m, 4H), 3,10 (s, 6H), 2,22 (dt, J = 11,3, 5,1 Hz, 2H), 1,94 (dd, J = 8,3, 3,9 72 Hz, 6H), 4,12 - 4,01 (m, 1H), 8,70 (d, J 478,39 = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,46 (s, 2H), 7,00 - 6,87 (m, 2H), 5,57 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,81 (dq, J = 5,1, 2,4 Hz, 1H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,19 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,70 (dd, J = 84 431,19 5,1, 1,2 Hz, 1H), 6,56 (s, 1H), 4,87 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,80 (s, 1H), 3,96 - 3,88 (m, 4H), 3,85 (s, 1H), 3,38 - 3,28 (m, 4H), 2,28 - 2,14 (m, 2H), 2,00 - 1,85 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,57 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,20 (dd, J = 5,0, 1,9 Hz, 1H), 7,57 (dd, J = 7,6, 1,9 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,85 (d, J 87 = 2,5 Hz, 1H), 6,51 (dd, J = 7,6, 4,9 Hz, 431,2 1H), 5,12 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 4,83 - 4,71 (m, 0H), 4,24 - 4,03 (m, 1H), 3,92 - 3,77 (m, 4H), 3,35 - 3,19 (m, 4H), 2,28 - 2,10 (m, 2H), 1,88 (td, J = 8,3, 6,8, 3,9 Hz, 6H)
(metanol-d4) δ 8,69 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 8,59 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 8,53 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,19 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 7,15 93 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 2,4 Hz, 451,21 1H), 4,95 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 4,10 (s, 1H), 3,95 - 3,82 (m, 4H), 3,47 - 3,37 (m, 4H), 2,20 (d, J = 10,1 Hz, 2H), 2,04 - 1,81 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,68 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,29 (s, 2H), 6,98 - 6,87 (m, 2H), 5,36 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 94 437,44 4,79 (q, J = 5,2, 4,0 Hz, 1H), 4,52 (s, 2H), 4,01 (dd, J = 8,1, 4,3 Hz, 1H), 3,95 - 3,84 (m, 4H), 3,39 - 3,28 (m, 4H), 2,25 - 2,12 (m, 2H), 1,99 - 1,82 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,73 (s, 1H), 8,68 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,99 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,85 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,69 (d, J = 2,5 Hz, 104 443,38 1H), 4,76 (s, 1H), 3,84 (dd, J = 5,9, 3,9 Hz, 4H), 3,38 (dd, J = 6,0, 3,9 Hz, 4H), 2,15 (d, J = 11,1 Hz, 2H), 1,96 - 1,67 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,49 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 7,77 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 16,1, 2,5 Hz, 2H), 5,03 (d, J = 7,9 108 478,26 Hz, 1H), 4,81 (td, J = 5,3, 2,6 Hz, 1H), 4,09 - 3,98 (m, 1H), 3,98 - 3,87 (m, 4H), 3,39 - 3,26 (m, 4H), 3,19 (s, 3H), 3,12 (s, 3H), 2,22 (dt, J = 11,2, 4,9 Hz, 2H), 2,02 - 1,82 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,10 (d, J = 0,5 Hz, 2H), 6,97 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,13 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 109 447,02 4,80 (s, 1H), 4,06 - 3,86 (m, 5H), 3,35 (dd, J = 5,9, 3,8 Hz, 4H), 2,27 - 2,14 (m, 2H), 1,92 (d, J = 5,1 Hz, 6H), 1,79 - 1,44 (m, 6H), 1,28 (t, J = 7,1 Hz, 1H), 1,03 - 0,83 (m, 2H), 0,68 - 0,51 (m, 2H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,07 (s, 2H), 6,97 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,6 Hz, 134 1H), 4,99 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,81 (d, J 437,3 = 5,9 Hz, 1H), 3,93 (dd, J = 6,0, 3,7 Hz, 5H), 3,81 (s, 3H), 3,45 - 3,24 (m, 4H), 2,21 (d, J = 8,6 Hz, 2H), 2,05 - 1,78 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,19 (s, 2H), 6,96 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,12 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,81 (d, J 135 479,2 = 5,6 Hz, 1H), 4,09 - 3,85 (m, 5H), 3,63 - 3,41 (m, 4H), 3,43 - 3,26 (m, 4H), 2,69 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 2,33 - 2,13 (m, 2H), 2,03 - 1,83 (m, 6H), 1,21 (t, J = 7,0 Hz, 3H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,74 (d, J = 1,9 Hz, 2H), 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,03 (dd, J = 8,9, 2,0 Hz, 1H), 6,97 (d, J = 2,4 Hz, 139 1H), 6,92 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,37 (d, J 450,17 = 8,9 Hz, 1H), 6,05 (s, 1H), 4,81 (s, 1H), 3,99 - 3,88 (m, 4H), 3,84 (s, 1H), 3,39 - 3,27 (m, 4H), 2,31 - 2,17 (m, 2H), 2,08 - 1,98 (m, 2H), 1,98 - 1,82 (m, 4H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,53 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,88 (dd, J = 8,8, 2,4 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J 140 449,19 = 2,4 Hz, 1H), 6,39 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 5,61 (s, 2H), 4,97 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,02 - 3,82 (m, 5H), 3,42 - 3,26 (m, 4H), 2,27 - 2,14 (m, 2H), 2,00 - 1,81 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,14 (d, J = 0,8 Hz, 142 2H), 7,01 - 6,90 (m, 2H), 4,81 (td, J = 421,2 5,6, 2,7 Hz, 1H), 4,08 - 3,84 (m, 5H), 3,43 - 3,26 (m, 4H), 2,25 - 2,10 (m, 5H), 2,02 - 1,83 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,02 (s, 2H), 6,95 (dd, J = 11,8, 2,5 Hz, 2H), 4,81 (s, 2H), 4,08 - 3,85 (m, 5H), 3,41 - 3,30 (m, 4H), 2,20 (d, J = 10,1 Hz, 2H), 1,95 (d, J = 143 19,7 Hz, 6H), 1H RMN (300 MHz, 422,25 Metanol-d4) ? 8,68 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,56 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,93 (s, 2H), 7,11 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 3,96 - 3,71 (m, 5H), 3,37 (dd, J = 5,8, 3,9 Hz, 4H), 2,27 - 2,04 (m, 2H), 1,98 - 1,74 (m, 6H). [2]
(400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,47 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,84 (dd, J = 8,7, 2,4 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J 144 = 2,4 Hz, 1H), 6,37 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 463,2 5,94 (d, J = 3,9 Hz, 1H), 4,92 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,79 (s, 1H), 3,98 - 3,84 (m, 5H), 3,39 - 3,26 (m, 4H), 2,98 (d, J = 4,8 Hz, 3H), 2,27 - 2,12 (m, 2H), 1,97 - 1,83 (m, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,20 (s, 1H), 7,61 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 6,95 (d, J 145 = 2,4 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 477,2 6,43 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,81 (s, 1H), 3,98 - 3,81 (m, 5H), 3,40 - 3,27 (m, 4H), 3,09 (s, 6H), 2,27 - 2,15 (m, 2H), 1,99 - 1,83 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,76 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,99 (dd, J = 8,8, 2,2 Hz, 1H), 6,97 146 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,5 Hz, 464,17 1H), 6,38 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 5,13 (s, 1H), 4,82 (s, 1H), 4,11 - 3,73 (m, 8H), 3,44 - 3,27 (m, 4H), 2,30 - 2,17 (m, 2H), 2,07 - 1,79 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,94 (s, 2H), 6,99 - 6,90 (m, 2H), 4,82 (s, 1H), 4,05 - 3,87 152 464,21 (m, 5H), 3,44 (q, J = 6,3 Hz, 1H), 3,39 - 3,26 (m, 4H), 2,23 (d, J = 12,4 Hz, 2H), 2,03 - 1,82 (m, 6H), 1,23 (d, J = 6,3 Hz, 6H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,02 - 6,89 (m, 2H), 155 4,83 (s, 1H), 4,08 - 3,87 (m, 5H), 3,44 - 478,3 3,33 (m, 4H), 3,27 (d, J = 26,0 Hz, 4H), 2,23 (d, J = 9,8 Hz, 2H), 2,05 - 1,80 (m, 6H), 1,14 (s, 6H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,41 (s, 2H), 6,97 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 2,5 Hz, 158 1H), 5,32 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,82 (s, 1H), 4,07 (s, 1H), 4,00 - 3,88 (m, 4H), 3,43 - 3,29 (m, 4H), 2,22 (s, 2H), 2,06 - 1,81 (m, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,46 (dd, J = 8,5, 2,3 Hz, 160 1H), 6,94 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J 436,2 = 2,4 Hz, 1H), 6,39 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,77 (s, 1H), 4,53 (s, 2H), 3,95 - 3,87 (m, 5H), 3,36 - 3,32 (m, 4H), 2,25 - 2,12 (m, 2H), 1,90 (d, J = 4,4 Hz, 6H)
(CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,26 (s, 2H), 6,95 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,6 Hz, 161 1H), 5,23 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,80 (d, J 451,28 = 5,8 Hz, 1H), 4,26 (s, 2H), 4,03 (s, 1H), 3,97 - 3,85 (m, 4H), 3,44 - 3,21 (m, 7H), 2,32 - 2,09 (m, 2H), 2,06 - 1,70 (m, 6H)
(DMSO-d6) δ 8,81 - 8,64 (m, 3H), 8,58 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 7,76 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,84 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 162 492,29 4,92 (s, 1H), 3,98 - 3,84 (m, 1H), 4,05 (dq, J = 13,5, 6,7 Hz, 1H), 3,79 (d, J = 9,6 Hz, 4H), 3,32 (d, J = 8,2 Hz, 4H), 2,06 (d, J = 11,8 Hz, 2H), 1,96 - 1,66 (m, 6H), 1,14 (d, J = 6,6 Hz, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,52 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,35 (dd, J = 8,8, 2,5 Hz, 1H), 6,86 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,80 (d, J 164 484,12 = 2,5 Hz, 1H), 6,20 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,68 (s, 1H), 4,47 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 3,92 - 3,80 (m, 4H), 3,74 (s, 1H), 3,34 - 3,14 (m, 4H), 2,18 - 2,02 (m, 2H), 1,94 - 1,67 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 6,96 (q, J = 2,6 Hz, 2H), 5,75 (d, J = 6,5 Hz, 187 492,26 1H), 4,82 (s, 1H), 4,65 (s, 1H), 3,93 (dd, J = 5,9, 3,8 Hz, 4H), 3,63 (s, 4H), 3,36 (dd, J = 6,1, 3,7 Hz, 4H), 2,14 (s, 2H), 1,95 (d, J = 31,2 Hz, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 8,32 (s, 1H), 7,56 (d, J = 6,7 Hz, 1H), 6,96 (d, J 189 = 2,2 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 474,147 6,40 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 4,96 (s, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,01 - 3,84 (m, 5H), 3,42 - 3,24 (m, 4H), 2,21 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 1,92 (d, J = 6,4 Hz, 6H)
(CDCl3) δ 8,52 (s, 1H), 8,29 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,90 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,85 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,52 (t, J = 4,8 Hz, 190 1H), 5,36 (s, 1H), 4,79 (dq, J = 5,6, 2,9 Hz, 1H), 4,04 (dp, J = 8,0, 3,8 Hz, 1H), 3,97 - 3,85 (m, 4H), 3,38 - 3,26 (m, 4H), 2,70 (s, 3H), 2,29 - 2,11 (m, 2H), 2,00 - 1,78 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,52 (s, 1H), 8,29 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,90 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,85 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,53 (t, J = 4,8 Hz, 191 1H), 5,42 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,80 (dq, 421,24 J = 5,9, 2,9 Hz, 1H), 4,11 - 3,98 (m, 1H), 3,91 (dd, J = 5,9, 3,8 Hz, 4H), 3,42 - 3,21 (m, 4H), 2,71 (s, 3H), 2,31 - 2,07 (m, 2H), 2,04 - 1,77 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,95 (s, 2H), 7,05 - 193 6,88 (m, 2H), 4,92 (s, 1H), 4,79 (s, 1H), 524,21 3,93 (t, J = 4,8 Hz, 5H), 3,60 - 3,44 (m, 4H), 3,37 (d, J = 10,5 Hz, 9H), 2,20 (d, J = 6,9 Hz, 2H), 1,91 (d, J = 4,6 Hz, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,28 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 6,97 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,74 - 5,58 (m, 1H), 5,16 194 437,23 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,82 (dq, J = 5,4, 2,7 Hz, 1H), 4,06 - 3,85 (m, 7H), 3,70 (d, J = 14,0 Hz, 1H), 3,42 - 3,28 (m, 4H), 2,30 - 2,16 (m, 2H), 1,99 - 1,75 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,43 (dd, J = 8,6, 7,2 Hz, 1H), 7,02 - 6,86 (m, 3H), 6,55 195 431,22 (dd, J = 8,6, 0,8 Hz, 1H), 4,80 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 4,10 - 3,81 (m, 5H), 3,47 - 3,25 (m, 4H), 2,30 - 2,11 (m, 2H), 1,99 - 1,81 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,61 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 7,41 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 7,05 - 196 463,27 6,87 (m, 2H), 6,65 (s, 1H), 4,86 (s, 1H), 4,04 - 3,87 (m, 7H), 3,74 (s, 1H), 3,43 - 3,27 (m, 4H), 2,21 (d, J = 10,8 Hz, 2H), 1,98 (d, J = 23,5 Hz, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,13 - 8,04 (m, 1H), 7,67 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 197 6,99 - 6,93 (m, 2H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 421,69 1H), 6,33 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 4,77 (s, 1H), 3,99 - 3,65 (m, 7H), 3,39 - 3,27 (m, 4H), 2,25 - 2,10 (m, 2H), 1,96 - 1,82 (m, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 8,57 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 7,89 (dd, J = 8,9, 2,3 Hz, 1H), 6,95 (s, 1H), 6,90 (s, 1H), 6,62 (d, 198 J = 9,0 Hz, 1H), 5,99 (d, J = 7,7 Hz, 532,11 1H), 4,78 (s, 1H), 4,18 (s, 1H), 4,03 - 3,81 (m, 4H), 3,76 - 3,60 (m, 4H), 3,42 - 3,25 (m, 4H), 2,62 - 2,44 (m, 4H), 2,36 (s, 3H), 2,29 - 2,14 (m, 2H), 1,99 - 1,84 (m, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,73 - 8,65 (m, 3H), 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 199 5,93 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,79 (s, 1H), 533,01 4,23 - 4,09 (m, 1H), 3,97 - 3,88 (m, 8H), 3,40 - 3,25 (m, 4H), 2,53 - 2,42 (m, 4H), 2,34 (s, 3H), 2,26 - 2,18 (m, 2H), 1,97 - 1,83 (m, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,51 - 7,42 (m, 2H), 6,98 - 6,85 (m, 3H), 6,07 200 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,77 (s, 1H), 4,25 - 549,17 4,11 (m, 1H), 3,99 - 3,85 (m, 4H), 3,40 - 3,27 (m, 4H), 3,26 - 3,14 (m, 4H), 2,67 - 2,52 (m, 4H), 2,36 (s, 3H), 2,28 - 2,13 (m, 2H), 1,98 - 1,84 (m, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 9,47 (s, 1H), 8,68 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 8,56 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 8,21 - 8,11 (m, 1H), 6,97 - 6,85 (m, 201 549,1 4H), 4,82 (s, 1H), 4,23 - 4,07 (m, 1H), 3,96 - 3,87 (m, 4H), 3,38 - 3,29 (m, 4H), 3,03 (s, 4H), 2,65 (s, 4H), 2,37 - 2,25 (m, 5H), 2,02 - 1,84 (m, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,27 (dd, J = 4,7, 1,9 Hz, 1H), 8,19 (s, 1H), 8,11 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 202 464,13 1H), 6,92 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,51 (dd, J = 7,4, 4,9 Hz, 1H), 4,76 (s, 1H), 4,30 (s, 1H), 4,02 - 3,90 (m, 4H), 3,88 (s, 3H), 3,41 - 3,26 (m, 4H), 2,29 - 2,11 (m, 2H), 2,11 - 1,85 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,15 (s, 1H), 6,93 203 (dd, J = 17,9, 2,5 Hz, 2H), 6,43 (d, J = 432,58 6,1 Hz, 1H), 5,20 (s, 1H), 4,82 (s, 1H), 4,00 - 3,82 (m, 4H), 3,44 - 3,25 (m, 4H), 2,23 (d, J = 11,2 Hz, 2H), 1,91 (s, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,09 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 16,1, 2,5 Hz, 2H), 204 6,15 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,10 (d, J = 8,0 421,65 Hz, 1H), 4,81 (td, J = 5,5, 2,7 Hz, 1H), 3,97 - 3,87 (m, 4H), 3,49 (s, 1H), 3,39 - 3,27 (m, 4H), 2,49 (s, 3H), 2,27 - 2,14 (m, 2H), 2,03 - 1,80 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (dd, J = 5,3, 1,9 Hz, 1H), 8,19 - 8,06 (m, 1H), 6,99 - 6,84 (m, 2H), 5,34 - 5,21 (m, 205 1H), 4,76 (d, J = 9,7 Hz, 3H), 3,92 (t, J 436,63 = 4,9 Hz, 4H), 3,81 (s, 1H), 3,33 (dd, J = 5,7, 4,1 Hz, 4H), 2,87 (d, J = 5,2 Hz, 3H), 2,19 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 1,88 (dd, J = 13,3, 5,1 Hz, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 7,09 (dd, J = 8,9, 3,0 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,90 (d, J 206 436,18 = 2,5 Hz, 1H), 6,37 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,77 (s, 1H), 4,29 (bs, 1H), 3,98 - 3,87 (m, 4H), 3,85 - 3,79 (m, 1H), 3,77 (s, 3H), 3,41 - 3,24 (m, 4H), 2,27 - 2,12 (m, 2H), 1,97 - 1,79 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,44 (s, 1H), 6,98 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,5 Hz, 207 1H), 6,82 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 5,56 (d, J = 30,8 Hz, 1H), 4,83 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,04 (s, 2H), 3,97 - 3,84 (m, 4H), 3,44 - 3,29 (m, 4H), 2,23 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 2,02 - 1,77 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,16 (s, 2H), 7,00 - 6,84 (m, 2H), 5,32 (s, 1H), 4,81 (s, 1H), 208 435,6 4,03 (s, 1H), 3,96 - 3,85 (m, 4H), 3,43 - 3,32 (m, 4H), 2,49 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 2,21 (d, J = 8,8 Hz, 2H), 2,06 - 1,75 (m, 6H), 1,21 (t, J = 7,6 Hz, 3H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,18 (s, 2H), 7,01 - 6,88 (m, 2H), 5,30 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 209 4,81 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 4,02 (s, 1H), 3,96 - 3,85 (m, 4H), 3,42 - 3,29 (m, 4H), 2,78 (p, J = 6,9 Hz, 1H), 2,31 - 2,14 (m, 2H), 2,01 - 1,83 (m, 6H), 1,25 (d, J = 6,9 Hz, 6H)
(400 MHz, metanol-d4) δ 8,69 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,57 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,92 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 7,17 - 7,10 (m, 210 2H), 7,02 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 6,90 (d, J 450,17 = 2,5 Hz, 1H), 4,93 (s, 1H), 3,93 - 3,87 (m, 4H), 3,84 - 3,79 (m, 1H), 3,44 - 3,37 (m, 4H), 2,24 - 2,15 (m, 2H), 1,97 - 1,82 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,25 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 17,1, 2,5 Hz, 2H), 5,64 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 5,00 (d, J = 8,1 215 451,21 Hz, 1H), 4,80 (dq, J = 5,5, 2,7 Hz, 1H), 4,33 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 3,97 - 3,87 (m, 4H), 3,71 (s, 1H), 3,38 - 3,29 (m, 4H), 2,27 - 2,14 (m, 2H), 2,03 - 1,80 (m, 6H), 1,37 (t, J = 7,1 Hz, 3H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,03 (s, 219 471,06 1H), 5,00 (s, 1H), 4,79 (s, 1H), 3,92 (d, J = 9,3 Hz, 7H), 3,41 - 3,25 (m, 4H), 2,28 - 2,13 (m, 2H), 1,92 (d, J = 18,6 Hz, 6H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,94 (dd, J = 15,2, 2,5 Hz, 2H), 6,07 (s, 1H), 4,82 (dt, J = 223 435,18 5,8, 3,0 Hz, 1H), 4,02 - 3,83 (m, 4H), 3,77 - 3,57 (m, 1H), 3,43 - 3,28 (m, 4H), 2,52 (s, 3H), 2,37 (s, 3H), 2,30 - 2,16 (m, 2H), 2,05 - 1,78 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,72 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,27 (s, 1H), 6,98 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,6 Hz, 224 475,02 1H), 6,44 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,84 (s, 1H), 3,93 (dd, J = 6,0, 3,7 Hz, 4H), 3,43 - 3,25 (m, 4H), 2,23 (s, 2H), 2,08 - 1,83 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,49 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 16,7, 2,5 Hz, 2H), 225 6,45 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 5,01 (s, 1H), 451,16 4,81 (s, 1H), 4,39 (d, J = 0,9 Hz, 2H), 3,97 - 3,87 (m, 4H), 3,49 (s, 3H), 3,39 - 3,29 (m, 4H), 2,22 (d, J = 9,4 Hz, 2H), 1,99 - 1,87 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 4,75 (d, J 226 = 5,6 Hz, 1H), 4,66 (s, 1H), 4,32 (s, 463,18 1H), 4,00 - 3,83 (m, 4H), 3,43 - 3,22 (m, 4H), 2,46 (d, J = 15,1 Hz, 5H), 2,36 (s, 3H), 2,19 (q, J = 6,3, 3,9 Hz, 2H), 1,12 (t, J = 7,6 Hz, 3H)
(CDCl3) δ 8,72 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,33 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,04 - 6,87 (m, 2H), 5,15 (s, 1H), 4,82 (dq, J = 5,2, 2,6 Hz, 1H), 4,24 (dt, 227 453,2 J = 8,3, 4,7 Hz, 1H), 4,03 - 3,86 (m, 4H), 3,44 - 3,28 (m, 4H), 2,74 (qd, J = 7,6, 2,3 Hz, 2H), 2,24 (dq, J = 9,6, 4,6 Hz, 2H), 2,09 - 1,85 (m, 6H), 1,29 (t, J = 7,6 Hz, 3H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,06 (s, 2H), 7,01 - 6,86 (m, 2H), 5,00 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 233 451,2 4,80 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 4,10 - 3,82 (m, 7H), 3,42 - 3,26 (m, 5H), 2,20 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 2,01 - 1,80 (m, 6H), 1,39 (t, J = 7,0 Hz, 3H)
(CDCl3) δ 8,72 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,60 (t, J = 1,9 Hz, 2H), 6,97 (d, J = 2,5 Hz, 234 1H), 6,91 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,70 (d, J 432,17 = 1,2 Hz, 1H), 4,85 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 3,98 - 3,84 (m, 4H), 3,42 - 3,26 (m, 4H), 2,33 - 2,17 (m, 2H), 2,01 - 1,77 (m, 5H)
(CDCl3) δ 8,68 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,59 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,36 (s, 2H), 6,97 - 235 6,86 (m, 2H), 5,53 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 505,04 4,96 - 4,72 (m, 3H), 4,09 - 3,86 (m, 5H), 3,33 (dd, J = 5,8, 4,0 Hz, 4H), 2,28 - 2,10 (m, 2H), 1,98 - 1,78 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,68 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,59 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,36 (s, 2H), 6,97 - 236 6,86 (m, 2H), 5,53 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 505,17 4,96 - 4,72 (m, 3H), 4,09 - 3,86 (m, 5H), 3,33 (dd, J = 5,8, 4,0 Hz, 4H), 2,28 - 2,10 (m, 2H), 1,98 - 1,78 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,31 (s, 2H), 6,99 - 6,87 (m, 2H), 5,34 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 237 451,16 4,87 - 4,73 (m, 2H), 4,06 - 3,87 (m, 6H), 3,38 - 3,29 (m, 4H), 2,20 (q, J = 5,8 Hz, 2H), 2,04 - 1,84 (m, 6H), 1,51 (d, J = 6,5 Hz, 3H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,52 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 241 6,90 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,23 (d, J = 8,7 445,54 Hz, 1H), 5,09 (s, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,00 - 3,78 (m, 5H), 3,40 - 3,24 (m, 4H), 2,56 (s, 3H), 2,29 - 2,14 (m, 2H), 2,01 - 1,80 (m, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,30 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,37 (s, 1H), 6,96 (d, J = 242 2,3 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 445,54 4,79 (s, 1H), 4,74 (s, 1H), 4,28 (s, 1H), 4,01 - 3,83 (m, 4H), 3,40 - 3,25 (m, 4H), 2,30 - 2,17 (m, 2H), 2,11 (s, 3H), 1,99 - 1,87 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,69 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 5,36 (s, 1H), 4,03 (s, 1H), 1,57 (s, 6H), 2,02 - 1,80 (m, 243 465,2 6H), 8,42 (s, 2H), 6,99 - 6,87 (m, 2H), 4,80 (s, 1H), 3,92 (dd, J = 6,0, 3,7 Hz, 4H), 3,39 - 3,29 (m, 4H), 2,20 (d, J = 9,0 Hz, 2H)
(CDCl3) δ 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,53 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,84 (dd, J = 18,2, 2,5 Hz, 2H), 5,26 (s, 1H), 4,78 (d, J = 245 467,14 8,0 Hz, 1H), 4,68 (d, J = 5,6 Hz, 1H), 3,82 (t, J = 4,0 Hz, 10H), 3,30 - 3,15 (m, 4H), 2,10 (q, J = 6,2, 5,7 Hz, 2H), 1,94 - 1,69 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,54 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,06 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 6,94 - 6,78 (m, 2H), 6,32 (d, J = 246 421,23 5,0 Hz, 1H), 5,09 (s, 1H), 4,70 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 3,95 (s, 1H), 3,91 - 3,77 (m, 5H), 3,37 - 3,13 (m, 4H), 2,20 - 2,00 (m, 2H), 1,94 - 1,71 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,64 (t, J = 2,4 Hz, 1H), 8,05 (s, 2H), 7,04 - 6,87 (m, 2H), 5,20 (s, 1H), 4,80 (s, 1H), 247 465,1 4,30 (p, J = 6,1 Hz, 1H), 4,05 - 3,81 (m, 4H), 3,44 - 3,27 (m, 4H), 2,22 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 1,93 (d, J = 4,6 Hz, 6H), 1,33 (d, J = 6,1 Hz, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,15 - 8,04 (m, 1H), 7,46 - 7,39 (m, 1H), 6,97 254 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 2,5 Hz, 406,57 1H), 6,60 - 6,52 (m, 1H), 6,41 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,68 (s, 1H), 3,98 - 3,85 (m, 5H), 3,41 - 3,30 (m, 4H), 2,27 - 2,15 (m, 2H), 1,97 - 1,86 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,80 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 7,47 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 7,02 - 256 420,1 6,86 (m, 2H), 4,80 (s, 1H), 4,27 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 4,00 - 3,72 (m, 7H), 3,35 (dd, J = 6,0, 3,8 Hz, 4H), 2,23 (s, 2H), 2,02 - 1,80 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (dd, J = 1,9, 0,7 Hz, 1H), 7,99 - 7,88 (m, 1H), 7,02 - 6,87 (m, 2H), 6,34 (d, J = 257 437,1 8,4 Hz, 1H), 4,78 (s, 1H), 4,40 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,03 - 3,75 (m, 5H), 3,35 (dd, J = 6,0, 3,7 Hz, 4H), 2,18 (s, 5H), 2,03 - 1,81 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 14,5, 2,5 Hz, 2H), 6,79 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 6,64 (d, J = 9,4 Hz, 1H), 4,80 (d, J = 5,5 260 437,24 Hz, 1H), 4,27 (d, J = 7,5 Hz, 1H), 4,14 (s, 1H), 4,02 (s, 3H), 3,98 - 3,88 (m, 4H), 3,42 - 3,29 (m, 4H), 2,31 - 2,12 (m, 2H), 1,95 (ddd, J = 17,2, 9,2, 6,0 Hz, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 15,5, 2,5 Hz, 2H), 5,30 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 5,16 (s, 1H), 263 480,22 4,95 (s, 1H), -0,17 - -0,23 (m, 0H), 4,80 (s, 1H), 3,92 (dd, J = 5,9, 3,7 Hz, 4H), 3,74 (s, 1H), 3,57 (dd, J = 5,6, 4,6 Hz, 2H), 3,50 - 3,29 (m, 9H), 2,20 (d, J = 9,1 Hz, 2H), 1,93 (d, J = 13,1 Hz, 6H)
(CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,76 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 7,02 - 6,86 (m, 2H), 5,66 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 4,80 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 264 494,1 4,63 (s, 1H), 3,97 - 3,84 (m, 5H), 1,30 - 1,20 (m, 1H), 3,64 (s, 2H), 3,38 - 3,28 (m, 4H), 1,37 (s, 6H), 5,16 - 4,86 (m, 1H), 2,24 - 2,13 (m, 2H), 1,96 - 1,82 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,47 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 16,7, 2,5 Hz, 2H), 265 6,17 (t, J = 0,9 Hz, 1H), 4,95 (s, 1H), 421,18 4,81 (td, J = 5,3, 2,5 Hz, 1H), 4,07 - 3,83 (m, 5H), 3,39 - 3,29 (m, 4H), 2,34 (s, 3H), 2,21 (dt, J = 11,1, 5,1 Hz, 2H), 2,04 - 1,76 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,03 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 18,6, 2,5 Hz, 2H), 267 6,13 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 5,09 (s, 1H), 447,11 4,79 (s, 1H), 4,03 - 3,78 (m, 5H), 3,34 (dd, J = 6,0, 3,8 Hz, 4H), 2,20 (d, J = 8,1 Hz, 2H), 1,96 (s, 7H), 1,10 (d, J = 2,8 Hz, 2H), 1,00 (d, J = 8,0 Hz, 2H)
(CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,95 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 6,92 (dd, J = 17,9, 2,5 Hz, 2H), 268 437,19 5,99 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 5,01 (s, 1H), 4,79 (dt, J = 6,9, 3,4 Hz, 1H), 3,91 (d, J = 8,7 Hz, 8H), 3,43 - 3,25 (m, 4H), 2,32 - 2,09 (m, 2H), 2,05 - 1,74 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,70 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 6,92 (dd, J = 14,4, 2,5 Hz, 2H), 269 4,86 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,75 (dt, J = 468,13 8,6, 4,0 Hz, 1H), 3,97 - 3,87 (m, 5H), 3,38 - 3,28 (m, 4H), 3,14 (d, J = 2,2 Hz, 6H), 2,24 - 2,07 (m, 2H), 2,02 - 1,79 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,04 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 7,94 (dd, J = 4,7, 1,3 Hz, 1H), 7,11 (dd, J 272 406,53 = 8,3, 4,7 Hz, 1H), 7,00 - 6,84 (m, 3H), 4,78 (s, 1H), 3,98 - 3,88 (m, 4H), 3,85 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,38 - 3,28 (m, 4H), 2,27 - 2,15 (m, 2H), 1,97 - 1,84 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,18 (d, J = 6,3 Hz, 2H), 6,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J 273 = 2,4 Hz, 1H), 6,51 - 6,42 (m, 2H), 4,79 406,57 (s, 1H), 4,47 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 3,98 - 3,86 (m, 4H), 3,56 (s, 1H), 3,39 - 3,26 (m, 4H), 2,27 - 2,15 (m, 2H), 2,01 - 1,79 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,54 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,93 - 6,77 (m, 2H), 5,20 (s, 1H), 4,78 - 4,60 (m, 2H), 3,92 - 275 3,79 (m, 5H), 3,64 (s, 0H), 3,51 (t, J = 5,1 519,2 Hz, 4H), 3,36 - 3,16 (m, 4H), 2,40 (t, J = 5,1 Hz, 4H), 2,27 (d, J = 4,8 Hz, 6H), 2,16 - 2,02 (m, 2H), 1,81 (q, J = 8,1, 5,7 Hz, 6H)
(CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,87 (s, 276 451,53 1H), 5,13 (s, 1H), 4,76 (s, 1H), 4,04 (s, 1H), 3,98 - 3,89 (m, 4H), 3,87 (s, 3H), 3,41 - 3,23 (m, 4H), 2,25 (s, 3H), 2,23 - 2,09 (m, 2H), 1,99 - 1,80 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,17 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 6,94 (dd, J = 15,8, 2,5 Hz, 2H), 277 5,31 (s, 1H), 4,83 (dp, J = 4,6, 2,5 Hz, 459,08 1H), 4,22 (qt, J = 8,5, 4,9 Hz, 1H), 4,03 - 3,87 (m, 4H), 3,39 - 3,29 (m, 4H), 2,25 (td, J = 7,9, 6,6, 3,9 Hz, 2H), 2,09 - 1,80 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,93 - 7,74 (m, 2H), 7,04 - 6,82 (m, 2H), 4,80 (s, 1H), 4,50 282 421,2 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 3,93 (dd, J = 6,4, 3,4 Hz, 5H), 3,41 - 3,25 (m, 4H), 2,51 - 2,33 (m, 3H), 2,23 (s, 2H), 2,04 - 1,82 (m, 6H)
(CDCl3) δ 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,55 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,88 (dd, J = 5,3, 0,7 Hz, 1H), 6,95 - 6,79 (m, 2H), 6,32 283 (ddd, J = 5,2, 1,5, 0,7 Hz, 1H), 6,12 (dt, 420,2 J = 1,6, 0,8 Hz, 1H), 4,71 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 4,40 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,98 - 3,67 (m, 4H), 3,35 - 3,17 (m, 4H), 2,15 (s, 4H), 1,83 (d, J = 5,2 Hz, 5H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,08 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 285 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,30 (s, 1H), 420,57 6,28 (dd, J = 5,7, 2,2 Hz, 1H), 4,78 (s, 1H), 4,19 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 3,97 - 3,82 (m, 4H), 3,53 (s, 1H), 3,40 - 3,24 (m, 4H), 2,41 (s, 3H), 2,27 - 2,11 (m, 2H), 1,92 - 1,84 (m, 6H)
(400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 286 6,15 (s, 2H), 4,77 (s, 1H), 4,12 (d, J = 7,8 434,56 Hz, 1H), 3,99 - 3,81 (m, 4H), 3,53 (s, 1H), 3,40 - 3,23 (m, 4H), 2,36 (d, J = 14,5 Hz, 6H), 2,25 - 2,14 (m, 2H), 1,89 (t, J = 7,8 Hz, 6H)
Tabela 2. Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,33 (s, 1H), 6,94 (dd, J = 14,3, 2,5 Hz, 2H), 5,80 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 5,42 (d, J = 8,1 Hz, 287 478,3 1H), 4,88 - 4,74 (m, 1H), 4,08 (s, 2H), 3,99 - 3,86 (m, 4H), 3,50 (s, 3H), 3,42 - 3,28 (m, 4H), 3,01 (dd, J = 18,4, 5,0 Hz, 3H), 2,54 (s, 3H), 2,28 - 2,08 (m, 2H), 2,03 - 1,79 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, Clorofórmio -d) δ 8,42 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,30 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,04 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 6,65 - 6,56 (m, 2H), 419,23 6,28 (t, J = 4,8 Hz, 1H), 4,99 291
[1] (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,60 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 3,79 (dd, J = 8,2, 4,0 Hz, 0H), 3,62 - 3,38 (m, 4H), 3,17 - 3,03 (m, 1H), 2,07 - 1,90 (m, 2H), 1,89 - 1,59 (m, 7H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio -d) δ 8,10 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 7,36 - 7,28 (m, 1H), 6,65 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,13 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,81 (d, J = 8,0 Hz, 294 410,35 1H), 4,00 - 3,80 (m, 6H), 3,80 - 3,56 (m, 1H), 3,29 (dd, J = 5,8, 3,8 Hz, 4H), 3,02 - 2,84 (m, 2H), 2,48 (s, 3H), 2,36 (td, J = 11,4, 10,9, 2,5 Hz, 2H), 2,14 - 1,98 (m, 2H), 1,70 - 1,46 (m, 2H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,98 - 8,78 (m, 2H), 8,33 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,67 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,30 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 6,49 - 6,31 (m, 1H), 5,07 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 295 450,2 4,87 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,43 (q, J = 2,8 Hz, 2H), 4,24 (s, 1H), 4,02 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 2,71 (dtd, J = 13,1, 7,7, 2,7 Hz, 4H), 2,26 (dt, J = 10,4, 5,3 Hz, 2H), 1,97 (d, J = 5,3 Hz, 6H), 1,28 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,49 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,02 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 6,78 (dd, J = 10,1, 2,5 Hz, 2H), 6,08 (d, J = 6,0 Hz, 297 447 1H), 4,96 (s, 1H), 4,74 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,49 (d, J = 2,3 Hz, 2H), 3,41 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 3,12 (dd, J = 11,6, 2,5 Hz, 2H), 2,43 (s, 3H), 2,14 (dd, J = 9,6, 4,9 Hz, 2H), 1,98 - 1,68 (m, 10H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,65 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,53 (dt, J = 8,1, 1,0 Hz, 1H), 7,35 (ddd, J = 8,1, 6,8, 1,1 Hz, 1H), 298 459,4 7,20 (dt, J = 8,5, 0,9 Hz, 1H), 7,07 - 6,89 (m, 3H), 4,79 (td, J = 6,1, 3,1 Hz, 1H), 4,02 - 3,91 (m, 4H), 3,87 (s, 3H), 3,43 - 3,25 (m, 4H), 2,34 - 2,15 (m, 2H), 2,10 - 1,88 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,79 (s, 1H), 7,23 (s, 1H), 6,95 (dd, J = 14,0, 2,5 Hz, 2H), 5,23 (d, J 308 478,64 = 8,1 Hz, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,09 (s, 1H), 3,94 (dd, J = 6,1, 3,6 Hz, 4H), 3,43 - 3,23 (m, 4H), 3,02 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,43 (s, 3H), 2,31 - 2,12 (m, 2H), 1,95 (p, J = 10,0 Hz, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,54 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,85 (s, 2H), 6,30 (s, 1H), 5,06 (d, J = 16,2 Hz, 1H), 4,85 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 4,44 - 4,30 (m, 309 477,54 2H), 4,14 (q, J = 7,1 Hz, 1H), 3,89 - 3,60 (m, 5H), 3,50 (s, 3H), 3,35 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 2,49 (s, 3H), 2,24 (d, J = 8,7 Hz, 2H), 2,08 (d, J = 7,7 Hz, 2H), 1,92 (q, J = 9,6, 6,9 Hz, 6H), 1,28 (t, J = 7,1 Hz, 2H).
1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,65 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,57 (d, J = 3,2 Hz, 1H), 7,35 - 7,28 (m, 2H), 6,97 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 312 437,33 2,4 Hz, 1H), 5,23 (s, 1H), 4,76 (s, 1H), 4,20 (s, 1H), 4,01 (s, 3H), 3,98 - 3,84 (m, 4H), 3,44 - 3,29 (m, 4H), 2,27 - 2,14 (m, 2H), 2,05 - 1,85 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,66 (s, 1H), 6,94 (dd, J = 14,9, 2,4 Hz, 2H), 4,84 - 314 435,32 4,74 (m, 1H), 4,47 (s, 1H), 4,02 - 3,87 (m, 4H), 3,87 - 3,75 (m, 1H), 3,47 - 3,21 (m, 4H), 2,38 (d, J = 4,0 Hz, 6H), 2,26 - 2,13 (m, 2H), 2,01 - 1,78 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,59 - 8,46 (m, 2H), 7,98 (s, 1H), 7,18 (s, 1H), 6,85 (s, 2H), 4,85 315 476,23 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 3,90 - 3,62 (m, 5H), 3,35 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 3,03 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,27 (s, 2H), 2,13 - 1,80 (m, 7H), 10,58(s, 2H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,14 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 6,50 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,43 (d, J = 1,6 316 411,34 Hz, 1H), 6,21 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 4,98 (s, 1H), 4,01 - 3,81 (m, 5H), 3,37 - 3,18 (m, 5H), 2,54 (s, 3H), 2,20 (d, J = 9,1 Hz, 3H), 2,05 - 1,71 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 - 8,41 (m, 2H), 7,79 (s, 1H), 7,33 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 6,85 (q, 317 476,55 J = 2,6 Hz, 3H), 4,85 (d, J = 6,3 Hz, 4H), 4,08 (s, 0H), 3,88 - 3,58 (m, 5H), 3,35 (q, J = 6,8 Hz, 1H), 3,03 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,36 - 2,13 (m, 2H), 2,15 - 1,84 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,56 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,33 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,85 (s, 2H), 5,07 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,86 (d, 318 465,3 J = 6,4 Hz, 4H), 4,23 (s, 2H), 3,90 - 3,62 (m, 4H), 3,35 (q, J = 7,1 Hz, 1H), 2,73 (qd, J = 7,6, 2,3 Hz, 2H), 2,27 (d, J = 10,1 Hz, 3H), 2,12 - 1,82 (m, 6H), 1,28 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,83 (dt, J = 6,4, 1,4 Hz, 2H), 8,51 (d, J = 4,7 Hz, 1H), 7,78 (s, 1H), 7,68 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 7,34 (dd, J = 4,9, 0,9 Hz, 1H), 6,38 (s, 1H), 5,32 319 461,38 (d, J = 0,9 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,43 (q, J = 2,8 Hz, 2H), 4,17 - 3,94 (m, 3H), 3,03 (dd, J = 5,1, 1,0 Hz, 3H), 2,76 - 2,59 (m, 2H), 2,23 (d, J = 12,7 Hz, 2H), 1,98 (d, J = 7,7 Hz, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,81 - 8,67 (m, 2H), 8,42 (s, 1H), 7,89 (s, 1H), 7,58 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,09 (s, 1H), 6,28 (dq, J = 3,0, 1,6 Hz, 1H), 4,81 (s, 321 461,63 1H), 4,33 (q, J = 2,8 Hz, 2H), 3,92 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 2,93 (d, J = 5,1 Hz, 3H), 2,67 - 2,48 (m, 2H), 2,18 (d, J = 11,3 Hz, 2H), 1,98 - 1,73 (m, 6H).
323 435,33 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,79 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 6,97 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,13 (dd, J = 5,9, 2,1 Hz, 1H), 5,87 (d, J = 2,0 Hz, 324 450,35 1H), 4,87 - 4,70 (m, 1H), 4,32 (q, J = 7,1 Hz, 2H), 4,21 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,05 - 3,81 (m, 4H), 3,60 - 3,45 (m, 1H), 3,45 - 3,24 (m, 4H), 2,33 - 2,10 (m, 2H), 2,02 - 1,77 (m, 6H), 1,39 (t, J = 7,1 Hz, 3H). [2]
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 332 465,36 333 435,33 334 451,36
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 335 421,37 336 446,35 1H RMN (300 MHz, DMSO- d6) δ 8,73 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,59 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,25 (m, 1H), 7,14 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,89 - 6,78 340 474,48 (m, 3H), 5,47 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 4,94 (m, 1H), 4,29 (s, 2H), 3,79 (m, 4H), 3,51 (m, 1H), 3,06 (s, 3H), 2,09 (m, 2H), 1,81 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, DMSO- d6) δ 8,72 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,58 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,17 (s, 2H), 7,15 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 341 465,57 2,3 Hz, 1H), 6,06 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,92 (m, 1H), 4,77 (s, 1H), 3,79 (m, 4H), 3,50 (m, 1H), 3,30 (m, 4H), 2,02 (m, 2H), 1,80 (m, 6H), 1,42 (s, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,38 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 14,5, 351 478,38 2,4 Hz, 2H), 6,68 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 5,28 (s, 1H), 4,79 (s, 1H), 4,22 - 3,86 (m, 5H), 3,34 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,17 - 2,97 (m, 6H), 2,20 (s, 2H), 1,91 (d, J = 5,1 Hz, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,91 - 8,75 (m, 2H), 8,11 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 7,68 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 6,37 (tt, J = 3,0, 1,5 Hz, 1H), 6,16 (d, J = 6,0 Hz, 352 418,5 1H), 4,99 (s, 1H), 4,88 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,43 (q, J = 2,8 Hz, 2H), 4,02 (t, J = 5,4 Hz, 2H), 3,85 (s, 1H), 2,77 - 2,64 (m, 2H), 2,51 (s, 3H), 2,23 (d, J = 13,2 Hz, 2H), 2,03 - 1,82 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,67 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,54 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,11 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 6,85 (s, 2H), 6,16 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 5,00 (s, 353 433,62 1H), 4,85 (d, J = 6,5 Hz, 3H), 3,93 - 3,57 (m, 5H), 3,35 (q, J = 7,1 Hz, 1H), 2,62 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 2,50 (s, 3H), 2,24 (d, J = 8,9 Hz, 2H), 2,01 - 1,81 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, DMSO- d6) δ 8,73 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 8,58 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,47 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 2,4 Hz, 354 407,56 1H), 6,99 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,65 (m, 1H), 4,94 (m, 1H), 3,79 (m, 4H), 3,55 (m, 1H), 3,35 (m, 4H), 2,03 (m, 2H), 1,78 (m, 6H).
366 475,56
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,71 (s, 1H), 6,94 (dd, J = 14,6, 2,5 Hz, 2H), 5,09 (d, J = 7,7 Hz, 369 436,5 1H), 4,80 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,29 (s, 2H), 4,01 - 3,84 (m, 4H), 3,45 - 3,28 (m, 4H), 2,49 (s, 3H), 2,21 (q, J = 6,1 Hz, 2H), 1,95 (dt, J = 10,0, 4,1 Hz, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,70 (d, J = 5,0 Hz, 2H), 6,97 (d, J = 1,6 Hz, 1H), 373 421,51 6,92 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 4,81 (s, 1H), 4,65 (s, 1H), 3,99 - 3,85 (m, 5H), 3,40 - 3,30 (m, 4H), 2,37 (s, 3H), 2,28 - 2,16 (m, 2H), 2,01 - 1,82 (m, 6H).
374 441,45
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,81 - 8,67 (m, 2H), 8,01 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 7,46 (dd, J = 1,7, 0,7 Hz, 1H), 6,98 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,06 (d, J = 6,0 Hz, 375 420,57 1H), 4,80 (d, J = 38,5 Hz, 2H), 4,13 - 3,97 (m, 3H), 3,51 (td, J = 11,3, 3,5 Hz, 2H), 2,99 - 2,80 (m, 1H), 2,41 (s, 3H), 2,21 - 2,03 (m, 2H), 1,94 - 1,70 (m, 7H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,07 (s, 1H), 6,93 (dd, J = 17,0, 2,5 Hz, 2H), 4,98 - 4,71 (m, 2H), 376 455,33 4,17 (s, 1H), 4,00 (s, 3H), 3,92 (dd, J = 5,8, 3,9 Hz, 4H), 3,42 - 3,26 (m, 4H), 2,22 (d, J = 9,5 Hz, 2H), 1,93 (dd, J = 6,1, 2,4 Hz, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,95 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 6,92 (dd, J = 16,9, 2,5 Hz, 2H), 4,98 (s, 1H), 377 512,36 4,81 - 4,66 (m, 2H), 4,16 (s, 1H), 3,97 - 3,87 (m, 4H), 3,46 (d, J = 6,1 Hz, 2H). 3,39 - 3,29 (m, 4H), 2,19 (d, J = 12,5 Hz, 2H), 1,91 (d, J = 5,4 Hz, 6H), 1,26 (s, 6H), 0,94 - 0,83 (m, 1H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,69 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,00 - 7,91 (m, 1H), 6,92 (dd, J = 17,2, 2,5 Hz, 2H), 4,87 - 4,64 (m, 2H), 4,59 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,16 (ddt, J = 9,7, 6,8, 3,7 380 498,36 Hz, 2H), 4,01 - 3,85 (m, 4H), 3,75 (d, J = 11,2 Hz, 1H), 3,58 (dd, J = 10,9, 7,0 Hz, 1H), 3,48 - 3,23 (m, 4H), 2,36 - 2,07 (m, 2H), 1,91 (d, J = 5,5 Hz, 6H), 1,28 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 0,97 - 0,78 (m, 1H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,00 (s, 1H), 6,92 (dd, J = 16,5, 2,5 Hz, 2H), 4,92 (s, 1H), 4,77 (s, 1H), 4,64 (d, J = 8,5 Hz, 382 498,32 1H), 4,16 (s, 1H), 4,03 - 3,82 (m, 4H), 3,65 (q, J = 5,8, 5,4 Hz, 2H), 3,56 (ddd, J = 5,6, 4,7, 1,0 Hz, 2H), 3,48 - 3,21 (m, 7H), 2,19 (d, J = 10,1 Hz, 2H), 1,91 (d, J = 5,4 Hz, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,49 (s, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,4 Hz, 386 480,41 1H), 5,25 (s, 1H), 4,72 (s, 1H), 4,18 (s, 1H), 3,96 - 3,87 (m, 4H), 3,77 (s, 3H), 3,39 - 3,30 (m, 4H), 3,10 (s, 6H), 2,21 - 2,12 (m, 2H), 2,02 - 1,85 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,49 (s, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,4 Hz, 387 466,4 1H), 5,25 (s, 1H), 4,72 (s, 1H), 4,18 (s, 1H), 3,96 - 3,87 (m, 4H), 3,77 (s, 3H), 3,39 - 3,30 (m, 4H), 3,10 (s, 6H), 2,21 - 2,12 (m, 2H), 2,02 - 1,85 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,04 (s, 1H), 6,94 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 5,15 (d, J = 8,4 Hz, 388 480,41 1H), 4,75 (s, 1H), 4,14 (s, 1H), 3,97 - 3,83 (m, 4H), 3,59 (s, 3H), 3,38 - 3,28 (m, 4H), 3,09 (s, 6H), 2,25 - 2,13 (m, 2H), 2,00 - 1,83 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, DMSO- d6) δ 8,73 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,58 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,10 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 7,97 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 7,38 (dd, J = 9,0, 2,7 393 450,58 Hz, 1H), 7,16 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,84 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 4,96 (m, 1H), 3,79 (m, 4H), 3,66 (m, 1H), 3,3 (m, 4H), 2,14 - 1,95 (m, 2H), 1,81 (m, 5H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, DMSO- d6) δ 8,72 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,58 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,54 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,14 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 2,3 Hz, 394 493,61 1H), 6,48 (d, J = 7,7 Hz, 1H), 6,30 - 6,18 (m, 2H), 4,92 (m, 1H), 3,79 (m, 4H), 3,74 (s, 3H), 3,66 (s, 3H), 3,55 (m, 1H), 3,34 (m, 4H), 2,03 (m, 2H), 1,78 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,53 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,13 (d, J = 5,3 Hz, 1H), 6,84 (dd, J = 20,0, 2,4 Hz, 2H), 5,40 (d, J = 8,2 395 441,2 Hz, 1H), 4,72 (s, 1H), 4,31 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 3,83 (dd, J = 5,8, 3,8 Hz, 4H), 3,26 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 2,14 (d, J = 12,3 Hz, 2H), 1,95 - 1,68 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,54 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,72 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 2,5 Hz, 396 455,2 1H), 5,03 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,71 (s, 1H), 4,16 (s, 2H), 3,83 (q, J = 3,9, 3,1 Hz, 7H), 3,32 - 3,21 (m, 4H), 2,13 (d, J = 11,2 Hz, 2H), 1,83 (t, J = 6,5 Hz, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,89 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 7,02 - 6,88 (m, 2H), 397 422,5 5,79 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,61 (s, 2H), 4,08 - 3,88 (m, 5H), 3,35 (dd, J = 5,6, 4,1 Hz, 4H), 2,27 - 2,09 (m, 2H), 1,91 (d, J = 5,0 Hz, 6H).
1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,08 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 399 435,35 6,23 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 4,87 (s, 1H), 4,69 (s, 1H), 4,00 - 3,83 (m, 4H), 3,45 - 3,24 (m, 4H), 2,98 (s, 3H), 2,50 (s, 3H), 2,45 - 2,30 (m, 2H), 1,92 - 1,64 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,51 (s, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,4 Hz, 401 471,32 1H), 5,56 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,75 (s, 1H), 4,25 (s, 1H), 3,96 - 3,89 (m, 4H), 3,88 (s, 3H), 3,47 - 3,23 (m, 4H), 2,29 - 2,06 (m, 2H), 2,06 - 1,78 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,14 (s, 1H), 6,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,5 Hz, 402 471,36 1H), 5,52 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 4,79 (s, 1H), 4,18 (s, 1H), 3,96 - 3,89 (m, 4H), 3,89 (s, 3H), 3,41 - 3,27 (m, 4H), 2,31 - 2,14 (m, 2H), 2,03 - 1,83 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, DMSO- d6) δ 8,72 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,57 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H), 7,15 (d, J 404 480,56 = 2,5 Hz, 1H), 7,01 (s, 1H), 6,84 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 4,94 (m, 1H), 3,75 (m, 8H), 3,34 (m, 4H), 2,05 (m, 2H), 1,86 - 1,70 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, DMSO- d6) δ 8,72 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,57 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,01 (m, 1H), 7,14 (s, 1H), 7,01 - 6,90 (m, 1H), 405 480,56 6,82 (m, 2H), 6,71 (m, 1H), 5,70 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,91 (m, 1H), 3,79 (m, 4H), 3,34 (m, 5H), 2,74 (d, J = 4,6 Hz, 3H), 2,02 (m, 2H), 1,76 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, DMSO- d6) δ 8,72 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,58 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,27 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 7,46 (dd, J = 8,4, 7,1 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,10 (dd, J = 7,1, 0,9 406 463,68 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,75 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 6,68 (dd, J = 8,4, 0,9 Hz, 1H), 4,91 (m, 1H), 4,14 (m, 1H), 3,80 (m, 4H), 3,35 (m, 4H), 2,82 (d, J = 4,9 Hz, 3H), 2,03 (m, 2H), 1,93 - 1,73 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) rotomers, δ 9,07 (m, 1H), 8,89 (m, 1H), 8,75 (m, 1H), 7,47 (m, 1H), 407 536,49 6,96 (s, 1H), 4,95 (m, 1H), 3,97 (m, 4H), 3,82 (m, 4H), 3,38 (s, 3H), 2,24 (m, 8H), 1,60 (s, 9H).
1H RMN (300 MHz, DMSO- d6) δ 8,72 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,57 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,13 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,94 (t, J = 8,0 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 408 435,6 6,26 - 6,14 (m, 2H), 6,10 - 6,03 (m, 1H), 5,57 (d, J = 7,8 Hz, 1H), 4,90 (m, 1H), 3,79 (m, 4H), 3,66 (s, 3H), 3,33 (m, 4H), 2,03 (m, 2H), 1,77 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,47 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 6,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 409 441,29 5,47 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,31 - 4,19 (m, 1H), 4,02 - 3,79 (m, 4H), 3,48 - 3,24 (m, 4H), 2,32 - 2,17 (m, 2H), 2,09 - 1,79 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,81 - 8,55 (m, 3H), 6,94 (dd, J = 17,2, 2,5 Hz, 2H), 6,65 (d, J = 1,1 417 475,36 Hz, 1H), 4,84 (td, J = 5,1, 2,4 Hz, 1H), 4,01 - 3,86 (m, 4H), 3,42 - 3,29 (m, 4H), 2,35 - 2,11 (m, 2H), 2,05 - 1,82 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,49 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,04 - 6,89 (m, 2H), 6,81 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 418 475,4 5,54 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,80 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,17 - 3,98 (m, 1H), 3,98 - 3,87 (m, 4H), 3,42 - 3,31 (m, 4H), 2,33 - 2,12 (m, 2H), 2,06 - 1,72 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) rotomers δ 8,82 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 8,74 (m, 1H), 8,00 (m, 1H), 419 450,38 7,55 - 7,47 (m, 1H), 7,25 (m, 1H), 7,14 (m, 1H), 7,05 (m, 1H), 3,97 (m, 5H), 3,47 (m, 5H), 2,30 (s, 2H), 2,0 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, DMSO- d6) δ 8,73 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,58 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,27 - 6,96 (m, 4H), 420 467,48 6,83 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 4,92 (m, 1H), 3,85 - 3,74 (m, 4H), 3,45 (m, 1H), 3,34 (m, 4H), 2,05 (m, 2H), 1,76 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, DMSO- d6) δ 8,93 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,80 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,20 (s, 1H), 7,13 - 421 523,58 6,85 (m, 4H), 4,92 (m, 1H), 3,86 - 3,79 (m, 4H), 3,32 (m, 5H), 2,09 (m, 2H), 1,90 - 1,73 (m, 6H), 1,55 (s, 9H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,72 - 8,52 (m, 3H), 8,38 (s, 1H), 6,87 (dd, J = 15,7, 2,5 Hz, 2H), 5,50 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 422 432,5 4,79 (p, J = 3,5 Hz, 1H), 4,20 (dp, J = 14,0, 5,2, 4,7 Hz, 1H), 3,90 - 3,76 (m, 4H), 3,32 - 3,22 (m, 4H), 2,29 - 2,07 (m, 2H), 1,99 - 1,71 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,52 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,46 - 8,35 (m, 1H), 6,84 (dd, J = 16,8, 2,5 Hz, 2H), 6,28 - 6,20 (m, 1H), 424 437,3 5,08 (s, 1H), 4,72 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 4,58 - 4,43 (m, 2H), 3,93 - 3,77 (m, 4H), 3,34 - 3,19 (m, 4H), 2,14 (dd, J = 9,6, 5,4 Hz, 2H), 1,93 - 1,73 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,94 - 8,63 (m, 2H), 8,07 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 7,45 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 7,14 - 6,87 (m, 3H), 427 474,33 4,84 (m, 1H), 3,99 - 3,87 (m, 4H), 3,62 - 3,48 (m, 1H), 3,35 (dt, J = 42,8, 4,8 Hz, 4H), 2,32 - 2,14 (m, 2H), 1,91 (d, J = 17,8 Hz, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,81 - 8,64 (m, 2H), 8,20 (s, 2H), 7,08 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,90 - 4,82 428 475,41 (m, 1H), 4,42 (m, 1H), 3,98 - 3,88 (m, 4H), 3,57 (m, 1H), 3,45 - 3,26 (m, 4H), 2,33 - 2,18 (m, 2H), 2,04 - 1,82 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,42 (m, 1H), 8,16 - 8,08 (m, 1H), 7,20 (s, 429 474,37 1H), 7,04 - 6,98 (m, 1H), 6,94 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,84 (m, 1H), 4,01 - 3,87 (m, 4H), 3,54 (m, 1H), 3,42 - 3,26 (m, 4H), 2,33 - 2,19 (m, 2H), 2,08 - 1,80 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,15 (s, 2H), 7,03 - 6,85 (m, 2H), 5,09 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,78 (s, 430 533,47 1H), 3,92 (dd, J = 5,9, 3,7 Hz, 5H), 3,40 - 3,24 (m, 4H), 2,71 - 2,33 (m, 8H), 2,30 (s, 3H), 2,20 (s, 2H), 1,91 (d, J = 5,0 Hz, 6H), 1,26 (d, J = 3,1 Hz, 4H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 436 449,44 4,88 - 4,70 (m, 2H), 4,32 (s, 1H), 3,98 - 3,85 (m, 4H), 3,41 - 3,27 (m, 4H), 2,53 (s, 3H), 2,40 (s, 3H), 2,26 - 2,14 (m, 2H), 1,99 (s, 3H), 1,94 - 1,88 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,72 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,28 (s, 1H), 7,72 (s, 1H), 6,94 (dd, J = 438 437,3 16,4, 2,5 Hz, 2H), 5,45 (d, J = 8,2 Hz, 1H), 4,76 (d, J = 6,6 Hz, 1H), 4,26 (s, 1H), 4,01 - 3,85 (m, 7H), 3,44 - 3,28 (m, 4H), 2,30 - 2,11 (m, 2H), 2,08 - 1,82 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,14 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 6,98 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,17 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 439 435,44 5,05 (s, 1H), 4,01 - 3,70 (m, 5H), 3,42 - 3,25 (m, 4H), 2,77 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 2,32 - 2,16 (m, 2H), 2,04 - 1,80 (m, 6H), 1,32 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,81 (d, J = 6,3 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,6 Hz, 440 436,22 1H), 6,24 (d, J = 6,2 Hz, 1H), 5,92 (s, 1H), 4,80 (m, 1H), 3,98 (s, 3H), 3,95 - 3,87 (m, 4H), 3,54 (m, 1H), 3,38 - 3,28 (m, 4H), 2,23 (m, 2H), 2,00 - 1,81 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) rotomers, δ 8,80 (d, 1H), 8,73 (d, 1H), 7,73 (s, 1H), 7,16 - 6,99 (m, 441 434,35 3H), 4,91 (m, 1H), 3,95 (m, 4H), 3,55 (m, 1H), 3,37 (m, 4H), 2,73 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 2,29 (m, 2H), 2,13 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,89 (dd, J = 5,0, 1,4 Hz, 1H), 7,19 - 7,10 (m, 1H), 7,03 - 6,95 (m, 2H), 442 420,4 6,92 (d, J = 2,6 Hz, 1H), 4,80 (m, 1H), 3,96 - 3,87 (m, 4H), 3,79 (m, 1H), 3,51 (m, 1H), 3,38 - 3,29 (m, 4H), 2,51 (m, 3H), 2,25 (m, 2H), 2,00 - 1,87 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,01 (s, 1H), 7,89 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 7,03 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 443 420,36 6,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 4,78 (m, 1H), 3,98 - 3,86 (m, 4H), 3,61 (m, 2H), 3,39 - 3,28 (m, 4H), 2,30 - 2,15 (m, 5H), 1,93 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,03 (dd, J = 2,7, 0,9 Hz, 1H), 7,12 - 7,00 (m, 2H), 6,95 (d, J = 2,5 Hz, 444 420,28 1H), 6,90 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 4,79 (m, 1H), 4,08 - 3,87 (m, 5H), 3,49 (m, 1H), 3,38 - 3,28 (m, 4H), 2,53 (s, 3H), 2,21 (m, 2H), 1,84 (d, J = 6,8 Hz, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,65 (m, 1H), 8,40 (m, 1H), 7,50 (dd, J = 4,5, 2,2 Hz, 1H), 7,03 (s, 445 436,43 1H), 6,92 (s, 1H), 6,80 (m, 2H), 4,76 (m, 1H), 4,08 (s, 3H), 3,93 (m, 5H), 3,49 (m, 1H), 3,42 - 3,30 (m, 4H), 2,20 (m, 2H), 1,92 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,71 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 7,65 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 2,4 Hz, 446 436,17 1H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,55 (t, J = 2,4 Hz, 1H), 4,79 (m, 1H), 4,13 (m, 1H), 3,92 (m, 4H), 3,85 (s, 3H), 3,48 (m, 1H), 3,38 - 3,29 (m, 4H), 2,22 (m, 2H), 1,98 - 1,88 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,70 (s, 1H), 7,15 (m, 1H), 6,96 (d, J = 447 436,34 2,4 Hz, 1H), 6,92 (m, 1H), 6,64 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,80 (m, 1H), 3,90 (m, 7H), 3,45 - 3,26 (m, 5H), 2,24 - 2,12 (m, 2H), 1,98 - 1,81 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,78 (dd, J = 4,0, 2,0 Hz, 1H), 8,66 (d, J = 2,1 Hz, 1H), 8,55 (s, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,02 (d, J 448 421,39 = 2,5 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 4,88 (m, 1H), 3,93 (m, 4H), 3,55 (m, 1H), 3,40 (m, 4H), 3,29 (m, 1H), 2,58 (s, 3H), 2,28 (m, 2H), 2,07 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) rotomers, δ 8,85 (d, 1H), 8,67 d, 1H), 7,92 (d, 1H), 7,07 - 6,96 (m, 449 435,35 2H), 4,91 (m, 1H), 4,01 - 3,88 (m, 4H), 3,53 - 3,24 (m, 5H), 2,87 (s, 3H), 2,64 (s, 3H), 2,04 - 1,76 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,21 (d, J = 9,2 450 421,36 Hz, 1H), 6,99 - 6,87 (m, 3H), 4,87 (m, 1H), 3,98 - 3,82 (m, 5H), 3,39 - 3,29 (m, 4H), 2,51 (s, 3H), 2,30 - 2,22 (m, 2H), 2,11 - 1,84 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) rotomers, δ 8,92 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,77 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 451 421,56 8,30 (m, 2H), 7,02 - 6,90 (m, 2H), 4,86 (m, 1H), 3,94 (m, 4H), 3,52 - 3,26 (m, 5H), 2,78 (s, 3H), 2,26 (d, J = 11,8 Hz, 2H), 1,90 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,69 (s, 1H), 8,62 (s, 1H), 7,89 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 6,94 (s, 1H), 6,89 (s, 1H), 5,64 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 453 450,43 4,87 - 4,66 (m, 2H), 3,98 - 3,83 (m, 4H), 3,44 - 3,24 (m, 4H), 3,13 (s, 6H), 2,26 - 2,10 (m, 2H), 2,04 - 1,75 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,61 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,52 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H), 6,86 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,80 (d, J = 2,2 Hz, 454 436,34 1H), 5,62 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,83 (s, 1H), 4,69 (s, 1H), 3,91 - 3,74 (m, 4H), 3,36 - 3,10 (m, 4H), 2,86 (d, J = 5,0 Hz, 3H), 2,22 - 2,03 (m, 2H), 1,91 - 1,72 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,05 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,39 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 455 447,41 5,13 (bd, 1H), 4,76 (s, 1H), 4,10 - 3,96 (m, 1H), 3,95 - 3,83 (m, 4H), 3,40 - 3,24 (m, 4H), 2,26 - 2,09 (m, 2H), 1,97 - 1,76 (m, 7H), 1,10 - 1,00 (m, 2H), 1,00 - 0,91 (m, 2H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,72 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,23 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 6,97 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 456 465,29 5,04 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,81 (s, 1H), 4,21 (s, 1H), 4,02 - 3,82 (m, 4H), 3,44 - 3,26 (m, 4H), 2,33 - 2,10 (m, 3H), 2,06 - 1,82 (m, 6H), 1,19 - 1,11 (m, 2H), 1,06 - 0,97 (m, 2H).
1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,21 (d, J = 51H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,21 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,5 Hz, 457 437,38 1H), 6,90 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,45 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 5,33 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 4,85 - 4,74 (m, 1H), 4,56 (s, 2H), 4,12 - 4,00 (m, 1H), 3,95 - 3,86 (m, 4H), 3,66 (s, 1H), 3,39 - 3,27 (m, 4H), 2,18 (dd, J = 14,1, 8,4 Hz, 2H), 2,01 - 1,83 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,95 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 463 453,4 4,78 (s, 1H), 4,23 (d, J = 3,8 Hz, 1H), 3,99 - 3,82 (m, 4H), 3,42 - 3,25 (m, 4H), 2,45 (d, J = 0,6 Hz, 3H), 2,30 (d, J = 2,8 Hz, 3H), 2,26 - 2,14 (m, 2H), 1,99 - 1,86 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,86 (d, J = 2,7 Hz, 1H), 7,78 (s, 1H), 6,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, 465 420,19 J = 2,5 Hz, 1H), 6,78 (t, J = 2,1 Hz, 1H), 4,78 (m, 1H), 4,00 - 3,86 (m, 4H), 3,50 (s, 1H), 3,38 - 3,28 (m, 4H), 2,28 (s, 3H), 2,25 - 2,14 (m, 2H), 1,95 - 1,85 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,95 (s, 1H), 6,94 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,00 (d, J = 7,9 Hz, 467 435,35 1H), 4,83 - 4,74 (m, 1H), 4,07 - 3,96 (m, 1H), 3,96 - 3,87 (m, 4H), 3,38 - 3,28 (m, 4H), 2,29 (s, 3H), 2,22 - 2,12 (m, 2H), 2,07 (s, 3H), 1,93 - 1,85 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,03 (s, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,4 Hz, 469 454,3 1H), 4,77 (s, 1H), 4,67 (s, 1H), 4,60 (s, 1H), 4,16 (s, 1H), 4,00 - 3,82 (m, 4H), 3,41 - 3,25 (m, 4H), 3,04 (d, J = 5,0 Hz, 3H), 2,28 - 2,11 (m, 2H), 1,99 - 1,84 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,54 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,42 (s, 1H), 7,91 (d, J = 13,5 Hz, 1H), 6,93 - 6,78 (m, 2H), 4,71 (s, 471 421,35 1H), 4,57 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,22 (s, 1H), 3,91 - 3,78 (m, 4H), 3,33 - 3,19 (m, 4H), 2,16 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 1,96 (s, 3H), 1,91 - 1,77 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,54 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,10 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 6,92 - 6,77 (m, 2H), 5,36 (dd, J = 7,9, 0,9 Hz, 472 534,2 1H), 4,71 (q, J = 5,2, 4,2 Hz, 2H), 3,97 - 3,69 (m, 7H), 3,58 - 3,37 (m, 4H), 3,30 - 3,03 (m, 6H), 2,22 - 2,04 (m, 2H), 1,93 - 1,73 (m, 6H), 1,52 (dtd, J = 12,8, 8,9, 3,8 Hz, 2H), 1,28 - 1,16 (m, 3H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 1,5 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 474 523,31 4,82 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 4,77 (s, 1H), 4,15 (s, 1H), 3,96 - 3,85 (m, 4H), 3,76 - 3,65 (m, 4H), 3,38 - 3,26 (m, 4H), 2,59 - 2,45 (m, 4H), 2,34 (s, 3H), 2,27 - 2,13 (m, 2H), 1,96 - 1,85 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,03 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,97 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 476 439,4 6,92 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,18 - 5,04 (m, 1H), 4,80 (s, 1H), 3,99 - 3,90 (m, 5H), 3,40 - 3,32 (m, 4H), 2,36 (d, J = 2,4 Hz, 3H), 2,23 - 2,15 (m, 2H), 1,95 - 1,85 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,26 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 477 439,36 5,07 (d, J = 7,2 Hz, 1H), 4,80 (s, 1H), 4,30 - 4,13 (m, 1H), 3,98 - 3,83 (m, 4H), 3,38 - 3,26 (m, 4H), 2,36 (d, J = 2,8 Hz, 3H), 2,29 - 2,16 (m, 2H), 1,97 - 1,85 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,64 (t, J = 9,6 Hz, 1H), 8,53 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,02 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 478 424 6,07 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 4,91 (s, 1H), 4,73 (s, 1H), 3,83 (dd, J = 17,8, 12,9 Hz, 5H), 3,25 (dd, J = 17,8, 13,0 Hz, 4H), 2,14 (dd, J = 8,9, 5,0 Hz, 2H), 1,91 - 1,76 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,18 (s, 2H), 6,99 - 6,87 (m, 2H), 5,16 (d, 481 451,41 J = 8,1 Hz, 1H), 4,78 (s, 1H), 4,03 - 3,87 (m, 5H), 3,80 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 3,39 - 3,29 (m, 4H), 2,67 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 2,26 - 2,14 (m, 2H), 1,90 (t, J = 6,5 Hz, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,65 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 482 454,35 5,14 (s, 1H), 4,90 (s, 1H), 4,76 (s, 1H), 4,01 - 3,87 (m, 5H), 3,39 - 3,31 (m, 4H), 3,01 (d, J = 5,0 Hz, 3H), 2,23 - 2,12 (m, 2H), 1,99 - 1,81 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,20 (s, 2H), 6,96 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 485 441,29 1H), 5,27 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 4,79 (s, 1H), 4,01 - 3,84 (m, 5H), 3,40 - 3,25 (m, 4H), 2,25 - 2,12 (m, 2H), 1,97 - 1,82 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,54 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,49 (s, 1H), 8,08 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 2,5 Hz, 486 407 1H), 6,24 (dd, J = 6,0, 1,1 Hz, 1H), 4,88 (s, 1H), 4,78 - 4,67 (m, 1H), 3,87 - 3,82 (m, 4H), 3,25 (dd, J = 13,6, 8,8 Hz, 4H), 2,15 (dd, J = 8,8, 5,1 Hz, 2H), 1,90 - 1,78 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,68 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,85 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 489 450,34 5,81 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 4,92 (s, 1H), 4,75 (s, 1H), 4,02 (s, 1H), 3,97 - 3,86 (m, 4H), 3,32 (dd, J = 17,6, 12,8 Hz, 4H), 3,04 (s, 6H), 2,18 (dd, J = 24,2, 17,3 Hz, 2H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,87 (d, J = 0,7 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 490 435,35 4,78 (s, 1H), 4,67 (s, 1H), 4,41 - 4,28 (m, 1H), 3,96 - 3,88 (m, 4H), 3,38 - 3,30 (m, 4H), 2,52 (s, 3H), 2,28 - 2,16 (m, 2H), 2,00 (s, 3H), 1,98 - 1,90 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 8,42 (s, 1H), 6,95 (s, 1H), 6,90 (s, 1H), 4,79 (s, 2H), 491 435,35 4,28 (s, 1H), 3,98 - 3,86 (m, 4H), 3,40 - 3,28 (m, 4H), 2,42 (s, 3H), 2,30 - 2,16 (m, 2H), 2,02 (s, 3H), 1,99 - 1,89 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,20 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 6,97 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 5,47 (d, J = 1,0 Hz, 492 506,2 1H), 4,76 (d, J = 23,9 Hz, 2H), 4,12 - 3,75 (m, 7H), 3,41 - 3,28 (m, 4H), 3,20 (ddd, J = 13,2, 9,6, 3,2 Hz, 2H), 2,20 (d, J = 6,9 Hz, 2H), 1,91 (d, J = 5,2 Hz, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,54 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,82 (d, J = 3,4 Hz, 1H), 6,88 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 2,5 Hz, 494 439,23 1H), 4,96 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,72 (d, J = 3,1 Hz, 1H), 4,18 (s, 1H), 3,90 - 3,78 (m, 4H), 3,35 - 3,19 (m, 4H), 2,41 (d, J = 0,9 Hz, 3H), 2,13 (q, J = 6,4 Hz, 2H), 1,84 (t, J = 6,3 Hz, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,19 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 16,4, 2,5 Hz, 2H), 5,42 (d, J = 1,0 Hz, 1H), 4,87 - 4,67 (m, 2H), 499 535,24 4,01 - 3,77 (m, 5H), 3,61 (dt, J = 27,3, 5,1 Hz, 6H), 3,41 - 3,26 (m, 4H), 2,73 (t, J = 5,3 Hz, 1H), 2,59 (ddd, J = 6,2, 5,0, 3,7 Hz, 6H), 2,19 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 1,89 (t, J = 5,2 Hz, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,55 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,93 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 6,85 (dd, J = 16,5, 2,5 Hz, 2H), 4,74 (ddd, J = 21,7, 7,5, 3,9 Hz, 2H), 4,09 511 510,2 (p, J = 7,7, 7,2 Hz, 1H), 3,92 - 3,79 (m, 4H), 3,71 (dd, J = 5,7, 3,7 Hz, 4H), 3,57 (dd, J = 5,7, 3,7 Hz, 4H), 3,34 - 3,20 (m, 4H), 2,15 (td, J = 11,0, 10,0, 6,2 Hz, 2H), 1,94 - 1,79 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,99 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 7,00 - 6,85 (m, 2H), 4,77 (d, J = 6,6 Hz, 2H), 512 468,27 4,14 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 4,03 - 3,87 (m, 4H), 3,78 - 3,64 (m, 1H), 3,43 - 3,28 (m, 4H), 3,15 (d, J = 2,5 Hz, 6H), 2,98 - 2,84 (m, 1H), 2,20 (d, J = 11,9 Hz, 2H), 1,94 (p, J = 5,8, 5,3 Hz, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,31 (s, 1H), 8,30 (s, 1H), 6,93 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,64 - 6,54 (m, 2H), 5,38 (d, 525 379,26 J = 5,1 Hz, 1H), 5,17 - 5,07 (m, 1H), 4,68 - 4,56 (m, 1H), 3,95 - 3,85 (m, 4H), 3,35 - 3,27 (m, 4H), 2,94 (ddd, J = 13,4, 8,2, 5,1 Hz, 2H), 2,59 (ddd, J = 13,9, 7,0, 4,5 Hz, 2H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,64 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,39 (dd, J = 2,7, 0,5 Hz, 1H), 8,04 (d, J = 3,4 Hz, 1H), 6,97 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,5 531 425,19 Hz, 1H), 5,15 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,83 (dq, J = 5,1, 2,6 Hz, 1H), 4,25 (dd, J = 8,1, 4,6 Hz, 1H), 3,98 - 3,88 (m, 4H), 3,39 - 3,28 (m, 4H), 2,34 - 2,17 (m, 2H), 2,03 - 1,84 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,13 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 532 441,29 6,54 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 5,36 (s, 1H), 4,79 (s, 1H), 4,03 (s, 1H), 3,97 - 3,84 (m, 4H), 3,41 - 3,23 (m, 4H), 2,26 - 2,12 (m, 2H), 1,98 - 1,81 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,99 (s, 1H), 6,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,22 (d, J = 5,9 Hz, 533 441,25 1H), 5,22 (s, 1H), 4,81 (s, 1H), 4,03 (dt, J = 12,1, 6,2 Hz, 1H), 3,94 - 3,86 (m, 4H), 3,40 - 3,26 (m, 4H), 2,27 - 2,13 (m, 2H), 1,90 (t, J = 17,4 Hz, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (s, 1H), 8,61 (s, 1H), 7,89 (d, J = 5,5 Hz, 1H), 6,95 (s, 1H), 6,89 (s, 1H), 534 492,39 5,71 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 4,76 (s, 2H), 4,01 - 3,81 (m, 5H), 3,74 (s, 8H), 3,41 - 3,26 (m, 4H), 2,26 - 2,12 (m, 2H), 1,98 - 1,81 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,88 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 535 505,35 5,67 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 4,84 - 4,63 (m, 2H), 3,99 - 3,83 (m, 5H), 3,82 - 3,73 (m, 4H), 3,37 - 3,27 (m, 4H), 2,49 - 2,40 (m, 4H), 2,33 (s, 3H), 2,23 - 2,11 (m, 2H), 1,96 - 1,82 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,7 Hz, 1H), 8,18 (s, 1H), 6,95 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,90 (s, 1H), 5,42 (s, 1H), 4,78 (s, 1H), 4,71 537 505,35 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 3,98 - 3,87 (m, 4H), 3,83 (s, 1H), 3,65 - 3,48 (m, 4H), 3,41 - 3,24 (m, 4H), 2,54 - 2,42 (m, 4H), 2,33 (s, 3H), 2,25 - 2,11 (m, 2H), 1,97 - 1,82 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,76 - 1,97 (m, 6 H), 2,15 - 2,26 (m, 2 H), 3,31 - 3,35 (m, 4 H), 3,43 (s, 3 H), 3,61 - 3,72 (m, 539 481,3 3 H), 3,90 - 3,93 (m, 4 H), 4,45 - 4,48 (m, 2 H), 4,76 - 4,82 (m, 1 H), 4,94 (d, J = 7,1 Hz, 1 H), 5,73 (s, 1 H), 6,89 (d, J = 2).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,90 (d, J = 6,0 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,92 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 5,89 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 547 505,4 4,96 (s, 1H), 4,77 (s, 1H), 4,08 - 3,98 (m, 1H), 3,96 - 3,87 (m, 4H), 3,70 - 3,53 (m, 4H), 3,43 - 3,27 (m, 4H), 2,53 - 2,42 (m, 4H), 2,35 (s, 3H), 2,25 - 2,13 (m, 2H), 2,00 - 1,85 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,93 (d, J = 5,9 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,91 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 548 492,39 5,87 (d, J = 6,1 Hz, 1H), 4,97 (s, 1H), 4,77 (s, 1H), 4,02 (s, 1H), 3,97 - 3,88 (m, 4H), 3,83 - 3,70 (m, 4H), 3,63 - 3,52 (m, 4H), 3,39 - 3,27 (m, 4H), 2,25 - 2,12 (m, 2H), 2,01 - 1,85 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 17,8, 2,5 Hz, 2H), 5,07 (s, 1H), 4,78 (d, J = 6,2 Hz, 553 480,19 1H), 4,68 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,03 - 3,90 (m, 4H), 3,87 (s, 3H), 3,71 (s, 1H), 3,42 - 3,28 (m, 4H), 3,13 (s, 6H), 2,27 - 2,00 (m, 2H), 2,00 - 1,79 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,84 - 1,99 (m, 6 H), 2,11 - 2,25 (m, 2 H), 3,32 - 3,36 (m, 4 H), 3,43 (s, 3 H), 3,70 - 3,73 (m, 558 481,3 2 H), 3,90 - 3,93 (m, 4 H), 3,96 - 4,07 (m, 1 H), 4,41 - 4,44 (m, 2 H), 4,72 - 4,80 (m, 1 H), 5,10 (br, s, 1 H), 6,06 (d, J = 5,6 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,55 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,47 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,93 (s, 1H), 6,86 - 6,72 (m, 2H), 5,25 (s, 565 479,1 1H), 4,66 (s, 1H), 4,05 - 3,90 (m, 1H), 3,86 - 3,71 (m, 7H), 3,30 - 3,09 (m, 4H), 2,27 (d, J = 2,2 Hz, 3H), 2,04 (d, J = 9,2 Hz, 2H), 1,75 (d, J = 4,8 Hz, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,74 (s, 1H), 7,00 - 6,89 (m, 2H), 4,91 (s, 1H), 4,76 (d, J = 6,1 Hz, 567 504,1 1H), 4,04 - 3,93 (m, 5H), 3,43 - 3,28 (m, 4H), 2,26 - 2,14 (m, 2H), 2,08 (d, J = 0,8 Hz, 3H), 2,00 - 1,92 (m, 6H), 1,69 (d, J = 21,2 Hz, 10H).
1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,82 - 1,99 (m, 6 H), 2,14 - 2,28 (m, 2 H), 3,32 - 3,35 (m, 4 H), 3,80 - 3,88 (m, 1 H), 3,90 - 572 472,2 3,93 (m, 4 H), 4,70 - 4,83 (m, 2 H), 6,37 (d, J = 8,8 Hz, 1 H), 6,38 (t, J = 73,8 Hz, 1 H), 6,90 (d, J = 2,3 Hz, 1 H), 6,95 (d, J = 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,52 (s, 6 H), 1,73 (br s, 1 H), 1,85 - 1,96 (m, 6 H), 2,11 - 2,25 (m, 2 H), 3,30 - 3,36 (m, 4 H), 573 464,3 3,88 - 4,00 (m, 5 H), 4,55 (d, J = 8,1 Hz, 1 H), 4,74 - 4,81 (m, 1 H), 6,52 (s, 1 H), 6,57 (dd, J = 5,4, 1,4 Hz, 1 H), 6,90 (d,
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,99 (s, 2H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,4 Hz, 574 437,42 1H), 4,78 (s, 1H), 4,01 - 3,84 (m, 7H), 3,41 (s, 2H), 3,37 - 3,27 (m, 4H), 2,26 - 2,14 (m, 2H), 1,93 - 1,81 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,57 (s, 1H), 8,13 (s, 2H), 6,98 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 575 407,35 6,91 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 4,86 - 4,73 (m, 1H), 3,95 - 3,88 (m, 4H), 3,56 - 3,49 (m, 1H), 3,39 - 3,31 (m, 4H), 2,30 - 2,18 (m, 2H), 1,97 - 1,84 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,13 (s, 1H), 7,01 - 6,87 (m, 2H), 4,81 (s, 576 450,13 1H), 4,57 (s, 2H), 4,06 (s, 1H), 3,99 - 3,87 (m, 4H), 3,35 (dd, J = 5,9, 3,8 Hz, 4H), 2,45 (s, 3H), 2,20 (d, J = 8,0 Hz, 2H), 1,93 (d, J = 5,1 Hz, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,02 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 7,87 (d, J = 1,5 Hz, 577 437,25 1H), 6,94 (dd, J = 16,2, 2,5 Hz, 2H), 4,89 - 4,71 (m, 2H), 4,65 (s, 2H), 4,06 - 3,85 (m, 4H), 3,40 - 3,27 (m, 4H), 2,23 (dt, J = 11,5, 5,5 Hz, 2H), 2,04 - 1,80 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,68 (s, 1H), 8,61 (s, 1H), 8,07 (s, 2H), 6,94 (s, 1H), 6,90 (s, 1H), 4,96 (d, J = 8,1 Hz, 1H), 4,78 (s, 1H), 4,02 - 579 505,53 3,81 (m, 5H), 3,47 - 3,19 (m, 5H), 3,19 - 2,83 (m, 4H), 2,76 - 2,52 (m, 3H), 2,37 (s, 3H), 2,26 - 2,11 (m, 2H), 2,03 - 1,82 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,83 ñ 1,96 (m, 6 H), 2,14 - 2,26 (m, 2 H), 3,30 - 3,36 (m, 4 H), 3,41 (s, 3 H), 3,87 ñ 3,95 582 450,3 (m, 5 H), 4,36 (s, 2 H), 4,59 - 4,89 (m, 2 H), 6,38 (s, 1 H), 6,48 (d, J = 5,2 Hz, 1 H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 6,95 (d, J = 2,4
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,84 - 2,00 (m, 6 H), 2,09 - 2,24 (m, 2 H), 3,30 - 3,37 (m, 4 H), 3,64 - 3,74 (m, 1 H), 3,78 (s, 583 466,3 3 H), 3,89 - 3,95 (m, 7 H), 4,71 - 4,79 (m, 1 H), 5,88 (d, J = 8,3 Hz, 1 H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1 H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,86 - 2,04 (m, 6 H), 2,12 - 2,26 (m, 2 H), 3,28 - 3,39 (m, 4 H), 3,88 - 3,96 (m, 4 H), 4,26 (br 584 436,3 s, 1 H), 4,62 (s, 2 H), 4,69 - 4,78 (m, 1 H), 5,56 (br s, 1 H), 6,50 (t, J = 5,3 Hz, 1 H), 6,90 (d, J = 1,9 Hz, 1 H), 6,93 (d, J 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,88 ñ 2,01 (m, 6 H), 2,10 (s, 3 H), 2,15 - 2,25 (m, 2 H), 3,30 - 3,37 (m, 4 H), 3,89 ñ 3,95 (m, 4 586 420,3 H), 4,25 (br s, 2 H), 4,71 - 4,78 (m, 1 H), 6,51 (dd, J = 6,8, 5,4 Hz, 1 H), 6,90 (d, J = 2,3 Hz, 1 H), 6,94 (d, J = 2,3 Hz, 1
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,82 - 1,98 (m, 6 H), 2,12 - 2,26 (m, 2 H), 3,25 - 3,43 (m, 4 H), 3,82 - 3,98 (m, 5 H), 4,80 (br 587 474,2 s, 2 H), 6,52 (d, J = 8,4 Hz, 1 H), 6,87 - 6,93 (m, 2 H), 6,95 - 7,00 (m, 1 H), 7,50 (t, J = 7,9 Hz, 1 H), 8,63 (d, J = 1,2 Hz, 1 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,38 (t, J = 7,0 Hz, 3 H), 1,83 - 2,00 (m, 6 H), 2,11 - 2,24 (m, 2 H), 3,30 - 3,37 (m, 4 H), 3,75 - 588 450,3 3,85 (m, 1 H), 3,89 - 3,94 (m, 4 H), 4,25 (q, J = 7,0 Hz, 2 H), 4,42 - 4,54 (m, 1 H), 4,72 - 4,79 (m, 1 H), 5,94 (d, J = 7,7 H 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,86 - 1,99 (m, 6 H), 2,16 - 2,27 (m, 2 H), 3,31 - 3,36 (m, 4 H), 3,88 - 3,95 (m, 5 H), 4,77 - 589 474,2 4,84 (m, 1 H), 4,90 (br s, 1 H), 6,55 (s, 1 H), 6,72 (d, J = 5,0 Hz, 1 H), 6,91 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 8.
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,82 - 1,98 (m, 6 H), 2,10 - 2,22 (m, 2 H), 3,31 - 3,35 (m, 4 H), 3,41 - 3,45 (m, 4 H), 3,69 - 590 491,3 3,82 (m, 5 H), 3,90 - 3,93 (m, 4 H), 4,43 (d, J = 7,7 Hz, 1 H), 4,70 - 4,77 (m, 1 H), 5,81 (d, J = 8,0 Hz, 1 H), 5,90 (d, J = 8,0 H 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,88 - 2,00 (m, 6 H), 2,13 - 2,28 (m, 2 H), 3,29 - 3,38 (m, 4 H), 3,88 - 3,95 (m, 4 H), 4,21 (br 591 424,2 s, 1 H), 4,62 - 4,84 (m, 2 H), 6,45 - 6,54 (m, 1 H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 7,07 - 7,18 (m, 1 H).
1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,84 - 2,03 (m, 6 H), 2,11 - 2,24 (m, 2 H), 3,30 - 3,37 (m, 4 H), 3,84 (s, 3 H), 3,89 - 3,95 (m, 592 436,3 4 H), 4,17 - 4,29 (m, 1 H), 4,67 - 4,76 (m, 1 H), 5,08 (d, J = 7,4 Hz, 1 H), 6,50 (dd, J = 7,3, 5,2 Hz, 1 H), 6,82 (d, J = 7,4 Hz
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,86 - 2,00 (m, 6 H), 2,13 - 2,26 (m, 2 H), 3,30 - 3,38 (m, 4 H), 3,88 - 3,97 (m, 4 H), 4,22 - 593 474,2 4,35 (m, 1 H), 4,73 - 4,80 (m, 1 H), 4,89 - 4,99 (m, 1 H), 6,60 (dd, J = 7,1, 5,1 Hz, 1 H), 6,91 (d, J = 2,3 Hz, 1 H), 6,96 (d, J = 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,85 - 2,00 (m, 6 H), 2,11 - 2,28 (m, 2 H), 3,29 - 3,39 (m, 4 H), 3,87 - 3,97 (m, 4 H), 4,06 - 594 442,2 4,18 (m, 1 H), 4,56 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 4,73 - 4,81 (m, 1 H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 6,95 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 7,05 (ddd, J = 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,88 - 2,02 (m, 6 H), 2,08 (s, 3 H), 2,15 (s, 3 H), 2,14 - 2,24 (m, 2 H), 3,31 - 3,36 (m, 4 H), 595 434,3 3,89 - 3,95 (m, 4 H), 4,03 - 4,16 (m, 1 H), 4,23 (br s, 1 H), 4,69 - 4,77 (m, 1 H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 6,94 (d, J = 2,4 Hz
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,07 - 6,87 (m, 2H), 6,02 (s, 1H), 4,83 (d, J 597 449,23 = 5,5 Hz, 1H), 4,03 - 3,81 (m, 5H), 3,44 - 3,25 (m, 4H), 2,72 - 2,57 (m, 1H), 2,51 (s, 3H), 2,29 - 2,11 (m, 2H), 2,05 - 1,72 (m, 6H), 1,27 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,54 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,93 - 6,72 (m, 3H), 6,55 (s, 1H), 4,71 (s, 598 450,23 1H), 4,01 (s, 1H), 3,92 - 3,76 (m, 4H), 3,34 - 3,18 (m, 4H), 2,98 (s, 6H), 2,07 (d, J = 24,1 Hz, 2H), 1,87 (d, J = 9,2 Hz, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 7,00 - 6,85 (m, 2H), 5,44 (d, J = 8,5 Hz, 600 464,26 1H), 4,78 (s, 1H), 3,93 (t, J = 4,8 Hz, 4H), 3,35 (t, J = 4,9 Hz, 4H), 3,06 - 2,91 (m, 1H), 2,15 (d, J = 26,6 Hz, 2H), 1,89 (s, 6H), 1,30 - 0,94 (m, 4H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,06 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 6,98 - 6,86 (m, 2H), 6,58 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 4,81 (dq, J = 5,5, 2,7 Hz, 601 461,32 1H), 4,52 (s, 1H), 4,17 (d, J = 5,0 Hz, 1H), 4,01 - 3,87 (m, 4H), 3,67 (dq, J = 8,9, 8,1 Hz, 1H), 3,43 - 3,30 (m, 4H), 2,47 - 2,29 (m, 4H), 2,22 (dt, J = 11,9, 5,5 Hz, 2H), 2,05 - 1,82 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,04 - 6,92 (m, 2H), 4,82 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 3,93 (dd, J = 5,9, 3,8 602 464,1 Hz, 4H), 3,65 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 3,44 - 3,29 (m, 4H), 3,08 (s, 6H), 2,39 (s, 3H), 2,21 (d, J = 14,4 Hz, 2H), 1,92 (dt, J = 17,0, 10,7 Hz, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,18 (s, 1H), 603 450,1 7,02 - 6,86 (m, 2H), 4,81 (s, 2H), 4,00 - 3,76 (m, 5H), 3,42 - 3,26 (m, 4H), 3,07 (s, 6H), 2,20 (q, J = 6,3, 5,8 Hz, 2H), 2,01 - 1,79 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,53 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,87 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,81 (d, J = 2,6 Hz, 604 452,1 1H), 4,71 (s, 1H), 3,94 - 3,72 (m, 7H), 3,25 (dd, J = 5,8, 3,8 Hz, 4H), 2,29 (d, J = 10,4 Hz, 3H), 2,21 - 2,02 (m, 2H), 1,93 - 1,71 (m, 6H).
605 482,3 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,79 (d, J = 2,9 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 17,8, 2,5 Hz, 2H), 5,19 - 5,07 (m, 607 469,08 1H), 4,80 (dt, J = 6,7, 3,4 Hz, 1H), 4,32 (q, J = 7,1 Hz, 3H), 3,98 - 3,87 (m, 4H), 3,41 - 3,29 (m, 4H), 2,30 - 2,13 (m, 2H), 2,03 - 1,84 (m, 6H), 1,41 (t, J = 7,1 Hz, 3H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 2,0 Hz, 1H), 6,94 (dd, J = 18,9, 2,5 Hz, 2H), 5,42 (d, J 608 468,63 = 8,4 Hz, 1H), 4,79 (s, 1H), 4,22 - 4,06 (m, 1H), 4,03 - 3,89 (m, 10H), 3,42 - 3,22 (m, 4H), 2,19 (m, 2H), 2,01 - 1,79 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,72 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,03 - 6,84 (m, 2H), 5,66 (d, J = 9,1 Hz, 609 471,87 1H), 4,82 (s, 1H), 4,09 - 3,84 (m, 7H), 3,35 (dd, J = 5,5, 3,6 Hz, 4H), 2,20 (s, 2H), 1,91 (d, J = 6,4 Hz, 6H).
1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,83 - 1,96 (m, 6 H), 2,14 - 2,24 (m, 2 H), 3,31 - 3,35 (m, 4 H), 3,44 (s, 3 H), 3,69 - 3,72 (m, 612 481,3 2 H), 3,89 - 3,95 (m, 5 H), 4,06 - 4,09 (m, 2 H), 4,74 - 4,83 (m, 1 H), 5,04 - 5,15 (m, 1 H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1 H), 6,94 (d, 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,83 - 1,95 (m, 6 H), 2,12 - 2,26 (m, 2 H), 3,30 - 3,40 (m, 4 H), 3,85 - 3,96 (m, 5 H), 4,55 - 614 424,2 4,68 (m, 1 H), 4,74 - 4,82 (m, 1 H), 6,10 (dd, J = 7,7, 1,8 Hz, 1 H), 6,18 (dd, J = 8,0, 1,8 Hz, 1 H), 6,90 (d, J = 1,8 Hz, 1 H), 6
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,82 - 2,10 (m, 7 H), 2,14 - 2,29 (m, 2 H), 3,26 - 3,40 (m, 4 H), 3,82 - 4,05 (m, 5 H), 4,64 (s, 615 436,3 2 H), 4,75 - 4,84 (m, 1 H), 4,85 - 5,13 (m, 1 H), 6,46 (s, 1 H), 6,51 (d, J = 5,3 Hz, 1 H), 6,90 (d, J = 1,7 Hz, 1 H), 6,94 (d, 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,95 (dd, J = 16,6, 2,5 Hz, 2H), 6,30 (s, 616 465,1 1H), 5,02 (s, 1H), 4,82 (s, 1H), 4,38 (d, J = 0,9 Hz, 2H), 3,99 - 3,83 (m, 5H), 3,39 - 3,24 (m, 4H), 2,49 (s, 3H), 2,33 - 2,11 (m, 2H), 1,91 (q, J = 9,0, 6,9 Hz, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,55 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,86 (dd, J = 16,5, 2,5 Hz, 2H), 5,94 (s, 1H), 4,73 (s, 1H), 3,85 (dd, 618 463,13 J = 5,9, 3,7 Hz, 4H), 3,35 - 3,20 (m, 4H), 2,67 - 2,51 (m, 2H), 2,26 (s, 3H), 2,09 (d, J = 36,8 Hz, 3H), 1,94 - 1,59 (m, 6H), 0,91 (t, J = 7,4 Hz, 3H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,81 - 1,98 (m, 6 H), 2,13 - 2,25 (m, 2 H), 3,29 - 3,38 (m, 4 H), 3,75 - 3,85 (m, 1 H), 3,88 - 622 424,2 3,96 (m, 4 H), 4,56 - 4,71 (m, 1 H), 4,75 - 4,83 (m, 1 H), 6,36 (dd, J = 9,1, 3,3 Hz, 1 H), 6,90 (d, J = 1,9 Hz, 1 H), 6,95 (d, J = 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,80 - 1,98 (m, 6 H), 2,13 - 2,23 (m, 2 H), 2,38 (s, 3 H), 3,25 - 3,37 (m, 4 H), 3,62 - 3,77 (m, 1 623 420,3 H), 3,88 - 3,97 (m, 4 H), 4,76 - 4,83 (m, 1 H), 6,23 (d, J = 7,9 Hz, 1 H), 6,43 (d, J = 7,3 Hz, 1 H), 6,91 (d, J = 2,5 Hz, 1 H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,81 - 1,95 (m, 6 H), 2,11 - 2,26 (m, 2 H), 3,31 - 3,35 (m, 4 H), 3,44 (s, 3 H), 3,69 - 3,73 (m, 625 480,3 2 H), 3,76 - 3,84 (m, 1 H), 3,89 - 3,93 (m, 4 H), 4,04 - 4,08 (m, 2 H), 4,44 (br s, 1 H), 4,74 - 4,81 (m, 1 H), 6,37 (d, J = 8,9 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,81 - 1,98 (m, 6 H), 2,12 - 2,25 (m, 2 H), 2,37 - 2,48 (m, 3 H), 2,58 - 2,77 (m, 4 H), 3,04 - 626 504,3 3,16 (m, 4 H), 3,28 - 3,37 (m, 4 H), 3,77 - 3,85 (m, 1 H), 3,87 - 3,97 (m, 4 H), 4,32 - 4,51 (m, 1 H), 4,73 - 4,83 (m, 1 H), 6,38 (
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,81 - 2,03 (m, 7 H), 2,12 - 2,28 (m, 2 H), 3,28 - 3,39 (m, 4 H), 3,81 (s, 3 H), 3,87 - 3,98 (m, 627 436,3 5 H), 4,76 - 4,84 (m, 1 H), 5,87 (d, J = 1,5 Hz, 1 H), 6,21 (dd, J = 5,9, 1,5 Hz, 1 H), 6,91 (d, J = 1,7 Hz, 1 H), 6,95 (d, J = 1 1H RMN (300 MHz, CDCl3) δ 8,62 (s, 1H), 8,54 (s, 1H), 8,15 - 7,93 (m, 1H), 7,40 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 6,88 (s, 1H), 6,84 (s, 1H), 6,34 (d, J 629 518,4 = 8,6 Hz, 1H), 4,83 - 4,56 (m, 2H), 4,40 - 4,22 (m, 1H), 4,00 - 3,62 (m, 5H), 3,47 - 3,04 (m, 7H), 2,24 - 2,02 (m, 2H), 1,96 - 1,70 (m, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,68 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,59 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 8,06 (s, 1H), 7,55 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,94 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,2 Hz, 630 504,22 1H), 6,41 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 4,88 (dd, J = 13,4, 6,7 Hz, 1H), 4,85 - 4,71 (m, 2H), 3,98 - 3,85 (m, 5H), 3,39 - 3,28 (m, 4H), 2,25 - 2,12 (m, 2H), 1,94 - 1,82 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,18 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 7,01 - 6,88 (m, 2H), 6,42 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 5,15 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 633 435,2 4,79 (d, J = 5,7 Hz, 1H), 4,17 - 4,00 (m, 1H), 3,98 - 3,83 (m, 4H), 3,67 (td, J = 6,7, 4,0 Hz, 1H), 3,42 - 3,31 (m, 4H), 2,59 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 2,20 (q, J = 6,1 Hz, 2H), 2,03 - 1,86 (m, 6H), 1,26 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,71 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,19 (d, J = 5,1 Hz, 1H), 7,01 - 6,88 (m, 2H), 6,42 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 5,14 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 634 449,2 4,80 (dt, J = 7,8, 3,8 Hz, 1H), 4,06 (d, J = 4,1 Hz, 0H), 3,99 - 3,85 (m, 4H), 3,46 - 3,24 (m, 4H), 2,78 (hept, J = 7,0 Hz, 1H), 2,34 - 2,11 (m, 2H), 2,04 - 1,81 (m, 7H), 1,25 (d, J = 7,0 Hz, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,63 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,54 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,86 (dd, J = 16,2, 2,5 Hz, 2H), 5,85 (s, 1H), 4,75 (d, J = 5,5 Hz, 636 461,1 1H), 3,96 - 3,76 (m, 4H), 3,34 - 3,19 (m, 4H), 2,41 (s, 3H), 2,13 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 1,82 (q, J = 10,2, 8,8 Hz, 6H), 1,58 - 1,33 (m, 3H), 1,03 - 0,86 (m, 3H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,73 - 8,65 (m, 1H), 8,60 (d, J = 1,8 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,89 (d, J = 2,3 Hz, 1H), 4,75 (s, 1H), 641 371,56 3,95 - 3,87 (m, 4H), 3,39 - 3,28 (m, 4H), 3,05 - 2,93 (m, 1H), 2,82 - 2,69 (m, 1H), 2,24 - 2,08 (m, 2H), 1,80 - 1,71 (m, 6H), 1,07 (d, J = 6,2 Hz, 6H).
1H RMN (400 MHz, CDCl3) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 7,78 (d, J = 5,8 Hz, 1H), 6,96 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 642 424,53 6,36 - 6,26 (m, 1H), 5,99 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 4,79 (d, J = 2,4 Hz, 1H), 4,47 (d, J = 7,1 Hz, 1H), 3,99 - 3,85 (m, 4H), 3,56 - 3,49 (m, 1H), 3,39 - 3,26 (m, 4H), 2,28 - 2,16 (m, 2H), 1,98 - 1,80 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,57 - 8,45 (m, 1H), 7,81 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,18 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 16,8, 2,5 643 492,2 Hz, 2H), 5,48 (s, 1H), 4,83 (dp, J = 4,5, 2,4 Hz, 1H), 4,23 (dp, J = 8,3, 6,6 Hz, 1H), 4,00 - 3,85 (m, 4H), 3,42 - 3,23 (m, 4H), 2,35 - 2,15 (m, 2H), 1,97 - 1,76 (m, 6H), 1,26 (d, J = 6,6 Hz, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 17,5, 2,5 Hz, 2H), 5,47 (s, 1H), 4,90 (s, 1H), 4,31 (q, J 644 465,16 = 7,1 Hz, 2H), 3,92 (dd, J = 5,9, 3,7 Hz, 4H), 3,60 (s, 1H), 3,38 - 3,28 (m, 4H), 2,40 (s, 3H), 2,19 (d, J = 9,4 Hz, 2H), 1,97 - 1,80 (m, 6H), 1,36 (t, J = 7,1 Hz, 3H), 4,83 - 4,76 (m, 1H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,62 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,47 - 8,36 (m, 1H), 6,96 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,90 (d, J = 2,5 Hz, 650 447,2 1H), 6,18 (d, J = 1,2 Hz, 1H), 4,95 - 4,73 (m, 2H), 4,04 - 3,78 (m, 5H), 3,44 - 3,24 (m, 4H), 2,30 - 2,12 (m, 2H), 2,03 - 1,70 (m, 7H), 1,17 - 0,80 (m, 4H).
1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,50 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 15,9, 2,5 Hz, 2H), 6,17 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 4,98 (d, J = 8,1 Hz, 651 435,18 1H), 4,86 - 4,75 (m, 1H), 3,97 - 3,87 (m, 4H), 3,39 - 3,29 (m, 4H), 2,61 (q, J = 7,6 Hz, 2H), 2,21 (dt, J = 11,2, 5,0 Hz, 2H), 2,04 - 1,82 (m, 6H), 1,25 (t, J = 7,6 Hz, 3H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,70 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,61 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,52 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 6,93 (dd, J = 16,0, 2,5 Hz, 2H), 6,19 - 6,12 (m, 652 449,23 1H), 4,91 (d, J = 8,0 Hz, 1H), 4,81 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,13 - 3,77 (m, 5H), 3,40 - 3,29 (m, 4H), 2,80 (hept, J = 6,8 Hz, 1H), 2,27 - 2,00 (m, 2H), 1,99 - 1,83 (m, 6H), 1,40 - 1,12 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, Metanol-d4/ CDCl3) δ 8,82 - 8,68 (m, 2H), 8,61 (d, J = 0,8 Hz, 1H), 7,38 (t, J = 0,8 Hz, 1H), 7,18 (s, 1H), 5,11 - 653 451,07 4,99 (m, 1H), 4,47 - 4,31 (m, 1H), 3,99 - 3,88 (m, 4H), 3,74 - 3,58 (m, 4H), 2,37 - 2,23 (m, 2H), 2,13 - 1,80 (m, 6H).
1H RMN (300 MHz, CDCl3): ppm 1,37 (t, J = 7,0 HZ, 3 H), 1,84 - 1,94 (m, 6 H), 2,10 - 2,25 (m, 2 H), 3,29 - 3,38 (m, 4 H), 3,75 - 658 450,3 3,85 (m, 1 H), 3,88 - 3,95 (m, 4 H), 3,97 (q, J = 7,0 Hz, 2 H), 4,22 - 4,34 (m, 1 H), 4,73 - 4,80 (m, 1 H), 6,36 (d, J = 9,0 H 1H RMN (300 MHz, Clorofórmio-d) δ 8,69 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 8,60 (d, J = 1,9 Hz, 1H), 6,92 (dd, J = 19,6, 2,5 Hz, 2H), 5,25 (s, 659 451,34 1H), 4,76 (q, J = 8,3, 7,2 Hz, 2H), 3,97 - 3,87 (m, 4H), 3,58 - 3,28 (m, 8H), 2,40 (s, 3H), 2,24 - 2,13 (m, 2H), 2,07 - 1,78 (m, 6H).
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 660 661 662 663
Comp. 1H
ESMS RMN Estrutura do Composto Nº. (M+H) 664 665 666 Ensaio Biológico de compostos da invenção Exemplo 11 Ensaio de inibição de DNA-PK
[00420] Os compostos foram rastreados quanto à sua capacidade de inibir DNA-PK quinase usando um ensaio radiométrico padrão. Resumidamente, neste ensaio de quinase, a transferência do terminal 33 33 P-fosfato em P-ATP para um substrato peptídico é interrogada. O ensaio foi realizado em placas de 384 poços para um volume final de 50 µL por poço contendo aproximadamente 6 nM de DNA-PK, 50 mM de HEPES (pH 7,5), 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgCl2, 25 mM de NaCl, 0,01% de BSA, 1 mM de DTT, 10 µg/mL de DNA de filamento duplo quebrado (obtido da Sigma), 0,8 mg/mL de peptídeo DNA-PK (Glu-Pro- Pro-Leu-Ser-Gln-Glu-Ala-Phe-Ala-Asp-Leu-Trp-Lys-Lys-Lys, obtido da American Peptide) e 100 µM de ATP. Por conseguinte, os compostos da invenção foram dissolvidos em DMSO para produzir 10 mM de soluções estoque iniciais. Diluições seriadas em DMSO foram então feitas para obter as soluções finais para o ensaio. Uma alíquota de 0,75 µL de DMSO ou inibidor em DMSO foi adicionada a cada poço, seguida 33 pela adição de solução de substrato ATP contendo P-ATP (obtido da Perkin Elmer). A reação foi iniciada pela adição de DNA-PK, peptídeo e ds-DNA. Após 45 min, a reação foi arrefecida bruscamente com 25 µL de ácido fosfórico a 5%. A mistura de reação foi transferida para placas PH MultiScreen HTS de 384 poços (obtidas da Millipore), permitida se ligar por uma hora e lavada três vezes com ácido fosfórico a 1%. Após a adição de 50 µL de cintilante de alta eficiência Ultima GoldTM (obtido da Perkin Elmer), as amostras foram contadas em um contador de Cintilação e Luminescência de Microplacas Packard TopCount NXT (Packard BioScience). Os valores de Ki foram calculados usando macros do Microsoft Excel Solver para ajustar os dados ao modelo cinético para inibição competitiva da ligação forte.
[00421] Cada um dos compostos 18, 23, 24, 27-30, 32-34, 36-42, 44- 46, 49-55, 59-61, 63-67, 69, 71, 72, 84, 87, 93, 94, 104, 108, 109, 134, 135, 139, 140, 142-146, 152, 155, 158, 160-162, 164, 187, 189-191, 193-210, 215, 219, 223- 227, 233-237, 241-243, 245-247, 254, 256, 257, 260, 263-265, 267-269, 272, 273, 275-277, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 295, 297, 298, 308, 309, 312, 314, 315-319, 321, 323, 324, 333- 336, 340, 341, 351-354, 366, 369, 373-377, 380, 382, 386- 388, 393- 397, 399, 401, 402, 404-409, 417-422, 424, 427-430, 436, 438-451, 453-
457, 463, 465, 467, 469, 471, 472, 474, 476-478, 481, 482, 485, 486, 489-492, 494, 499, 511, 512, 525, 531-535, 537, 539, 547, 548, 553, 558, 565, 567, 572-577, 579, 582-584, 586-595, 597, 598, 600-605, 607- 609, 612, 614-616, 618, 622, 623, 625-627, 629, 630, 633, 634, 636, 642-644, 650-653 e 658-666 tem um Ki inferior a 1,0 micromolar para a inibição da DNA-PK. Cada um dos compostos 18, 23, 24, 27-30, 32- 34, 36-37, 39-41, 44-46, 49-55, 59-61, 63-67, 69, 71, 72, 84, 87, 93, 94, 104, 108, 109, 134, 135, 139, 140, 142-146, 152, 155, 158, 160-162, 164, 187, 189-191, 193-200, 202-210, 215, 219, 223-227, 233-237, 241- 243, 245-247, 254, 256, 257, 260, 263-265, 267-269, 272, 273, 275-277, 282, 283, 285, 286, 287, 291, 295, 297, 298, 308, 309, 312, 314, 315- 319, 321, 323, 324, 333-336, 340, 341, 351-354, 366, 369, 373-374, 376 -377, 380, 382, 386-388, 393-397, 399, 401, 402, 404-409, 417-422, 424, 427-430, 436, 438-451, 453-457, 463, 465, 467, 469, 471, 472, 474, 476-478, 481, 482, 485, 486, 489-492, 494, 499, 511, 512, 531- 535, 537, 539, 547, 548, 553, 558, 565, 567, 572-577, 579, 582-584, 586-595, 597, 598, 600-605, 607-609, 612, 614-616, 618, 622, 623, 625- 627, 629, 630, 633, 634, 636, 642-644, 650-653 e 658-666 tem um Ki inferior a 0,10 micromolar para a inibição de DNA-PK. Por exemplo, os compostos 661, 665 e 666 têm um Ki de 0,001 micromolar e o composto 663 tem um Ki de 0,008 miromolar para a inibição de DNA-PK.
EXEMPLOS DE EDIÇÃO DE GENE Exemplo 12: Materiais e métodos Métodos: Células e Cultura
[00422] As células epiteliais brônquicas (BECs) foram derivadas de doadores humanos diagnosticados com fibrose cística com um genótipo CFTR dF508/dF508.
[00423] As células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) foram derivadas de fibroblastos dérmicos humanos após transdução viral com os fatores de reprogramação de Yamanaka, Oct4, Sox2, KLF4 e c-Myc. As iPSCs derivadas foram capazes de se diferenciar em 3 camadas germinativas e continham um cariótipo normal com 23 pares de cromossomos.
[00424] As células tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs) CD34+ de sangue periférico mobilizado (mPB) humano primário foram adquiridas da Hemacare ou AllCells. As células foram descongeladas, lavadas e ressuspensas em meio completo composto por meio livre de soro CellGro SCGM (CellGenix) e suplementadas com mistura de citocinas (300 ng/mL de SCF, 300 ng/mL de Flt3L, 100 ng/mL de TPO, 100 ng/mL de TPO, 60 ng/ml de IL-3) a uma densidade de 1-3 x 105 células por mL e incubadas a 37ºC/incubadora de CO2 a 5% por 48 horas antes da eletroporação. Inibidores de DNA-PK:
[00425] Os compostos inibidores de DNA-PK 661, 663, 665 e 666 foram utilizados para os exemplos de edição de gene. 10 mM de soluções estoque foram preparados usando DMSO anidro e armazenados a -80°C. Eletroporação:
[00426] Os sgRNAs sintéticos utilizados foram adquiridos por HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência) purificados da Synthego e continham nucleotídeos quimicamente modificados (2'-O-metil 3'- fosforotioato) nas três posições terminais nas posições de extremidade 5' e 3'. As sequências dos sgRNAs com os nucleotídeos modificados estão sublinhadas da seguinte forma:
[00427] sAVN1 de AAVS1: 5'ACCCCACAGUGGGGCCACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAA
GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACC GAGUCGGUGCUUUU 3' (SEQ ID Nº: 3).
[00428] sgRNA NAV1.7: 5'GGCUGAGCGUCCAUCAACCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAA
GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACC GAGUCGGUGCUUUU 3' (SEQ ID Nº: 4)
[00429] mRNA de Cas9 foi adquirido da TriLink Biotechnologies (L- 7206). mRNA de Cas9 expressa uma versão da proteína Cas3 SF370 de Streptococcus pyogenes (proteína 9 associada a CRISPR) com sinais de localização nuclear. mRNA de spCas9 também contém uma estrutura CAP1, um sinal poliadenilado e uridinas modificadas para obter níveis ótimos de expressão em células de mamíferos.
[00430] ssODNs doadores foram comprados da IDT. ssODNs contêm uma sequência de inserção de 10 nucleotídeos, para medir os eventos de HDR pelo ensaio TIDE, flanqueado por 40 nucleotídeos de braços de homologia. ssODNs contêm 90 nucleotídeos no total e nucleotídeos modificados com fosforotioato nas três posições terminais nas extremidades 5' e 3'. As sequências de ssODNs doadores com os nucleotídeos modificados com Fosforotioato sublinhado são indicadas a seguir:
[00431] PAV AAVS1: 5'GGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGGGGCCAGAAT
TCTCAGCTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAG G3' (SEQ ID Nº: 5)
[00432] não PAM AAVS1: 5'CCTAAGGATGGGGCTTTTCTGTCACCAATCCTGTCCCTAGCTGA
GAATTCTGGCCCCACTGTGGGGTGGAGGGGACAGATAAAAGTAC CC3' (SEQ ID Nº: 6)
[00433] PAM NAV17: 5'AGCTGTCCATTGGGGAGCATGAGGGCTGAGCGTCCATCAACTG
AGAATTCCCAGGGAGACCACACCGTTGCAGTCCACAGCACTGTG CAT3' (SEQ ID Nº: 7)
[00434] não PAM NAV1.7: 5'ATGCACAGTGCTGTGGACTGCAACGGTGTGGTCTCCCTGGGAA
TTCTCAGTTGATGGACGCTCAGCCCTCTCATGCTCCCCAATGGAC AGCT3' (SEQ ID Nº: 8)
[00435] Todas as eletroporações foram realizadas no sistema Lonza 4D-Nucleofector™.
[00436] Para BECs, as seguintes condições foram usadas para eletroporação: células 1,8xE5, 250 ng de mRNA de CAS9, 500 ng de sgRNA e 0,66 uM de ssODN em 20 ul de tampão de eletroporação P4 usando o programa CM-138. As células eletroporadas foram transferidas para uma placa de 96 poços contendo 100 ul de meio de cultura de BECs suplementados com inibidores de DNA-PK ou deixados sem tratamento. As células foram incubadas a 37ºC em uma incubadora de 5% de CO2.
[00437] Para iPSCs, foram utilizadas as seguintes condições: células
2.0xE5, 250 ng de mRNA de CAS9, 500 ng de sgRNA e 0,66 uM de ssODN em 20 ul de tampão de eletroporação P3 usando o programa CA-137. As células eletroporadas foram transferidas para uma placa de 96 poços contendo 100 µL de meio mTEsR1 (Stem Cell Technologies) suplementado com 10 uM de Inibidor ROCK Y-27632 (Stem Cell Technologies) com ou sem inibidores de DNA-PK e depois incubadas a 37ºC em uma incubadora de 5% de CO2.
[00438] As células CD34+ foram eletroporadas dois dias após o descongelamento. As seguintes condições foram usadas para eletroporação: células 2.0xE6, 15 µg de proteína Cas9 (Feldan), 15 µg de sgRNA, 1 µM de ssODN em 100 µl de tampão de eletroporação P3 usando o programa CA-137. As células eletroporadas foram transferidas dividindo-as igualmente em oito poços de uma placa de 24 poços, cada poço contendo várias concentrações de inibidores de DNA- PK. As células foram incubadas a 37°C em uma incubadora de CO2 a
5% por dois dias e avaliadas quanto à viabilidade celular e edição de gene.
[00439] Transfecção de células mediada por lipídios:
[00440] Um dia antes da transfecção, as BECs foram semeadas em uma placa de 96 poços a uma densidade celular de 1 × células E4 por poço em meio de cultura de BECs. Primeiro, 0,15 ul de MessengerMax (ThermoFisher, LMRNA 003) foi diluído em 5 ul de Opti-MEM e incubados por 10 min à temperatura ambiente. Enquanto isso, 80 ng de mRNA de Cas9 (Trilink, L-7206), 20 ng de sgRNA (Synthego) e 1 picomol de ssODN foram adicionados a 5 ul de Opti-MEM e depois misturados com a solução MessengerMAx. A mistura foi incubada por 5 min antes da adição às células. A solução completa foi adicionada às células em um poço de placa de 96 poços com 100 ul de meio de cultura com ou sem inibidores de DNA-PK. As células foram incubadas a 37ºC em uma incubadora de CO2 a 5%.
[00441] Medição de Taxas de Sobrevivência Celular:
[00442] As células foram incubadas com 5 µg/ml de Hoechst 33342 (Life technologies: H3570) e 0,5 µg/ml de iodeto de propídio (PI; Life technologies: P3566) em meio de cultura por 1h a 37 graus. As células foram fotografadas para medir eventos positivos de Hoescht (células vivas e mortas) e eventos positivos de PI (células mortas) usando um Sistema de Imagiologia de Alto Teor (Molecular Devices). A taxa de sobrevivência relativa das células foi calculada da seguinte forma: [(eventos Hoescht+ - eventos PI+) de Amostra](eventos Hoescht+ - eventos PI+) de Controle] * 100. O controle foi células transfectadas Mock (Falsas) e a sua taxa de sobrevivência celular foi arbitrariamente definida como 100%.
[00443] A sobrevivência celular de HSPCs CD34+ foi medida usando o reagente Cell Titer Glo (CTG) (Promega). 100 µL de suspensão de células foram misturados com 100 µL de reagente CTG completo. O sinal quimioluminescente foi medido usando um luminômetro e a % de células viáveis foi calculada em comparação à de células de controle (células não tratadas com os inibidores de DNA-PK).
[00444] Medição de Taxas de Edição de Gene:
[00445] DNA genômico foi isolado incubando células com 50 ul de solução de Quickextract de DNA (Epicentro) por poço de placa de 96 poços por 30 minutos a 37°C. O extrato celular foi misturado e transferido para uma placa de PCR e depois incubado por 6 min a 65°C e 2 min a 98°C. As reações de PCR foram realizadas com 1 µL de solução contendo DNA genômico usando AccuPrime™ Pfx DNA Polimerase (Thermofisher, 12344024). As condições de PCR foram de 4 min a 94°C (1 ×), seguido de 15 s a 94°C, 15 s a 60°C e 1 min a 60°C (40 ×). Os produtos de PCR foram purificados e depois sequenciados por Sanger por GENEWIZ. Os seguintes pares de iniciadores abrangendo o sítio alvo foram utilizados para PCR (FW, frente; RV, reversa). Iniciadores usados pelo Sequenciamento de Sanger são indicados por um asterisco (*):
[00446] AAVS1_FW: 5'GGACAACCCCAAAGTACCCC 3' (SEQ ID Nº: 9)
[00447] AAVS1_RV*: 5' aggatcagtgaaacgcacca 3' (SEQ ID Nº: 10).
[00448] NAV1.7_FW*: 5' gccagtgggttcagtggtat 3' (SEQ ID Nº: 11).
[00449] NAV1.7_RV: 5' tcagcattatccttgcattttctgt 3' (SEQ ID Nº: 12).
[00450] Cada cromatograma de sequência foi analisado usando o software TIDE (Tracking of Indels by Decomposition) (http://tide.nki.nl) (vide também Brinkman et al., Nucleic Acids Research, Volume 42, Edição 22, 16 de dezembro de 2014, Páginas e168). Amostras eletroporadas com Mock foram usadas como sequência de referência, e os parâmetros foram ajustados para um tamanho de indel de 30 nt, e a janela de decomposição foi ajustada para cobrir a maior janela possível com traços de alta qualidade. As taxas totais de indel (inserção e deleções) foram obtidas diretamente do esquema TIDE. As taxas de HDR foram a porcentagem de eventos com a inserção de 10 nucleotídeos. Taxas de NHEJ foram calculadas como taxa Total de Indel - taxa HDR. O software GraphPad Prism 7 foi utilizado para fazer gráficos e calcular todas as informações estatísticas. Exemplo 13: Inibidores de DNA-PK melhoram as taxas de edição de gene de HDR em BECs
[00451] A Figura 1 ilustra o projeto das amostras de edição de gene usadas nos exemplos abaixo. Para investigar o efeito dos inibidores de DNA-PK nas taxas de edição de gene de HDR, BECs foram eletroporadas com mRNA de spCAS9, sgRNA de NAV1.7 e ssODN não- PAM NAV1.7 e incubadas com diferentes concentrações do composto 665 ou deixadas não tratadas (Controle). As taxas de edição de gene foram determinadas usando o ensaio TIDE 72 hs após eletroporação. As taxas de edição de gene foram expressas em porcentagens e classificadas em HDR e NHEJ. As taxas de sobrevivência de células são mostradas em porcentagens em que as células de controle foram definidas como 100%.
[00452] Como mostrado na Figura 2, o inibidor de DNA-PK do composto 665 melhora as taxas de edição de gene em BECs. Para o Composto 665, o IC50 de NHEJ foi de 0,4163 µM, o EC50 de HDR foi de 0,4834 µM e a % de HDR TOP foi de 76,03. Exemplo 14: Inibidores de DNA-PK melhoram taxas de edição de gene HDR em células CD34+
[00453] Para investigar o efeito de inibidores de DNA-PK nas taxas de edição de gene de HDR, as células CD34+ mPB foram eletroporadas com RNP (proteína spCAS9 + sgRNA NAV1.7) e ssODN Non-PAM NAV1.7. As células foram então incubadas com várias concentrações do Composto 665. As taxas de edição de gene foram determinadas usando o ensaio TIDE 48 horas após a eletroporação. As taxas de edição de gene foram expressas em porcentagens e classificadas como HDR e NHEJ, como mostrado na Figura 3A (Doador B) e Figura 3B (Doador C). As taxas de sobrevivência de células são mostradas em porcentagens em que as células de controle foram definidas como 100%.
[00454] Como mostrado nas Figuras 3A e 3B, o inibidor de DNA-PK do composto 665 melhora as taxas de edição de gene nas células CD34+. Os valores de EC50 de HDR e formação de Indel para o Doador B foram de 0,28 µM e 0,36 µM, respectivamente. Exemplo 15: Inibidores de DNA-PK melhoram as taxas de edição de gene de HDR em iPSCs
[00455] Para investigar o efeito de inibidores de DNA-PK nas taxas de edição de gene de HDR, as iPSCs foram eletroporadas com mRNA de spCAS9, sgRNA de AAVS1 e sAVN de ssODN AAVS1 PAM e depois incubadas com diferentes concentrações do composto 665 ou deixadas sem tratamento (Controle). As taxas de edição de gene foram determinadas usando o ensaio TIDE 72 horas após eletroporação. As taxas de edição de gene foram expressas em porcentagens e classificadas em HDR e NHEJ. As taxas de sobrevivência de células são mostradas em porcentagens em que as células de controle foram definidas como 100%.
[00456] Como mostrado na Figura 4, o inibidor de DNA-PK do composto 665 melhora as taxas de edição de gene em iPSCs. Para o Composto 665, o IC50 de NHEJ foi de 1,274 µM, o EC50 de HDR foi de 0,9337 µM e a % de HDR TOP foi de 26,27. Exemplo 16: Determinação de cinéticas de edição de gene em ECmax
[00457] Para investigar ass cinéticas de edição de gene em EC max, as BECs foram eletroporadas com mRNA de spCAS9, SgRNA de AAVS1 e ssODN AAVS1 PAM e depois incubadas em momentos diferentes com 10 µM de Composto 665 ou deixadas sem tratamento
(Controle). As taxas de edição de gene foram determinadas usando o ensaio TIDE e expressas em porcentagens de HDR e NHEJ. 10 µM é a Concentração de Melhoria Máxima (ECmax) do Composto 665.
[00458] A Figura 5 mostra que existe uma forte correlação inversa entre os eventos HDR e NHEJ. Exemplo 17: Determinação da cinética de edição de gene em EC50
[00459] BECs foram eletroporadas com mRNA de spCAS9, sgRNA de AAVS1 e ssODN AAVS1 PAM e depois incubadas em momentos diferentes com 0,7 µM de Composto 665 ou deixadas sem tratamento (Controle). As taxas de edição de gene foram determinadas usando o ensaio TIDE e expressas em porcentagens de HDR e NHEJ. 0,7 µM é a Concentração de Melhoria 50 (EC50) do Composto 665. A Figura 6 ilustra o curso do tempo da inibição de DNA-PK em HDR e NHEJ em BECs. Exemplo 18: Inibidores de DNA-PK melhoram taxas de HDR quando componentes de edição de gene foram entregues por transfecção mediada por lipídios em BECs
[00460] Para investigar os efeitos da transfecção mediada por lipídios, BECs foram transfectadas com mRNA de spCAS9, SgRNA de AAVS1 e SsODN AAVS1 PAM e depois incubadas com diferentes concentrações do Composto 665 ou deixadas sem tratamento (Controle). As taxas de edição de gene foram determinadas usando o ensaio TIDE 72 hs após a transfecção. Figura 7 mostra taxas crescentes de eficiência de HDR com concentrações crescentes de Composto 665 entregues por transfecção baseada em lipídios.
Tabela de Resumo: Inibidor de DNA-PK do composto 665 melhora a edição de gene acionados por HDR Composto 665 AAVS1 NaV1.7 Células HDR EC50 (µM) e Max % BECs 0,70 µM 0,48 µM 72% 76% iPSCs 0,93 µM N.D.
26% N.D.
CD34+'s Doador A 0,38 µM 0,29 µM 84% 81% Doador B N.D. 0,28 µM N.D. 86% Doador C 0,32 µM 0,34 µM 92% 68% Exemplo 19:
[00461] Células CD34+ mPB foram eletroporadas com RNP (proteína spCAS9 + sgRNA NAV1,7) e ssODN não-PAM NAV1,7. As células foram então incubadas com várias concentrações dos compostos 661, 663 e 666. As experiências foram realizadas como descritas nos métodos acima, exceto que foram usadas concentrações mais baixas de sgRNA (5 µg) e ssODN (0,2 µM). As taxas de edição de gene foram determinadas usando o ensaio TIDE 48 horas após a eletroporação. As taxas de edição de gene foram expressas em porcentagens e classificadas em HDR e NHEJ. Os resultados para cada composto testado em dois doadores separados são mostrados abaixo.
[00462] Composto 661 Composto 661 Doador A Doador D Conc. do % % % % Viabilidad % % Viabilidad Composto HD HDR Indels WT e Indels WT e (µM) R 10,00 28 47 18,9 6 13,4 64,2 11,1 11 3,33 32,2 57,8 5,1 47 11,5 76,7 6,4 75 1,11 31,7 59,4 4,2 60 10,8 77,5 6 62 0 11,9 77,4 3,3 100 3,2 76,2 7,5 100
[00463] Composto 663 Composto 663 Doador A Doador D Conc. do % % % Viabili- %HD % % Viabili- Composto (µM) HDR Indels WT dade R Indels WT dade 10,00 24,3 46,5 24,1 10 13,9 76,2 1 12 3,33 37 11,3 81,8 1,9 64 1,11 35,7 55,3 4,4 65 8,5 81,3 5,4 83 0 11,9 77,4 3,3 100 3,2 76,2 7,5 100
[00464] Composto 666 Composto 666 Doador A Doador D Conc. do % % % Viabili- % % % Viabili- Composto (µM) HDR Indels WT dade HDR Indels WT dade 10,00 33,6 52 9,7 36 13,7 69 11,8 34 3,33 32,4 56,5 5,8 42 14,3 73,8 5,3 69 1,11 31,5 58,8 3,5 65 11 77,5 6,2 76 0 11,9 77,4 3,3 100 3,2 76,2 7,5 100
Tabela de resumo para os compostos 661, 663, 666 Doador A Doador D Conc. (µM) % HDR % NHEJ % HDR % NHEJ Composto 666 0 11,9 77,4 3,2 76,2 0,37 23,2 67,3 5,5 79,2 1,11 31,5 58,8 11 77,5 10 33,6 52 13,7 69 Composto 661 0 11,9 77,4 3,2 76,2 0,37 21,8 66,2 6,9 78,1 1,11 31,7 59,4 10,8 77,5 10 28 47 13,4 64,2 Composto 663 0 11,9 77,4 3,2 76,2 0,37 24,6 64,8 8,9 79,4 1,11 35,7 55,3 8,5 81,3 10 24,3 46,5 13,9 76,2 Exemplo 20: Inibidores de DNA-PK melhoram as taxas de edição de gene HDR em células CD34+.
[00465] Para investigar o efeito dos inibidores de DNA-PK nas taxas de edição de gene de HDR, as células CD34+ foram eletroporadas com mRNA spCAS9, sgRNA de AAVS1 e ssODN não-PAM de AAVS1 e incubadas com diferentes concentrações dos compostos 666, 661, 663 ou deixadas sem tratamento (Controle). As taxas de edição de gene foram determinadas usando o ensaio TIDE 72 horas após eletroporação. As taxas de edição de gene foram expressas em porcentagens e classificadas em HDR e NHEJ. As taxas de sobrevivência de células são mostradas em porcentagens em que as células de controle foram definidas como 100%.
[00466] Como mostrado, os inibidores de DNA-PK dos compostos 666 (Figura 8), 661 (Figura 9) e 663 (Figura 10) melhoram as taxas de HDR nas células CD34+. Exemplo 21: Edição precisa de genes por HDR mediada por doadores de AAV, CRISPR-Cas9 e inibidores seletivos de DNA-PK.
[00467] A Figura 11 ilustra o projeto do ensaio de edição de gene usado neste exemplo. Células
[00468] Células progenitoras do pulmão (LPCs) foram derivadas de doadores de pulmão humano diagnosticados com fibrose cística. ID de doadores de LPC 14071 e 14335 contêm os genótipos CFTR dF508/dF508 e dF508/G542X, respectivamente. Reagentes de edição de gene CRISPR-Cas9
[00469] sgRNAs sintéticos foram comprados da Synthego. gRNAs foram purificados por HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência) e contêm nucleotídeos quimicamente modificados (2'-O-metil 3'- fosforotioato) nas três posições terminais nas extremidades 5' e 3'. gRNAs contêm uma sequência espaçadora de 22 nucleotídeos para promover a ligação específica ao sítio alvo e uma sequência de 80 nucleotídeos sequestrantes que permite a ligação à proteína saCAS9. As sequências completas de gRNA são mostradas na Tabela 3.
[00470] mRNA de saCas9 foi sintetizado pela TriLink Biotechnologies. O RNAm de saCas9 expressa um Staphylococcus aureus de Cas9 (código de entrada Uniprot J7RUA5) com sinais de localização nuclear SV40 e NucleoPlasmine. RNAm saCas9 também contém uma estrutura CAP1 e um sinal poliadenilado para obter níveis ótimos de expressão em células de mamíferos. mRNA de saCAS9 foi purificado por HPLC.
[00471] O doador de AAV constrói projeto e transduções de AAV.
[00472] Os construtos de doadores de AAV contêm 500 sequências longas de nucleotídeos de braços de homologia esquerda e direita em relação ao sítio de corte de gRNA e uma inserção exclusiva de 10 nucleotídeos na pegada de HDR. As preparações de doadores de AAV foram feitas usando o sorotipo AAV6, purificado e titulado por Vector Biolabs. A titulação do AAV foi relatada como genomas virais por ml. A transdução do AAV foi realizada adicionando o vetor AAV6 às células em cópias especificadas do genoma do vetor por célula durante 36 horas a 37°C. Eletroporação
[00473] Eletroporações foram realizadas usando o sistema Lonza 4D-Nucleofector™ acoplado ao sistema de transporte de 96 poços. As células LPC de 1,8xE5 foram ressuspensas em 20 ul de tampão de eletroporação P4 Lonza (V4SP-4096). 20 µl da mistura de células foram combinados com 2 µl da mistura de reagentes CRISPR-Cas9 contendo 1 µg de mRNA de saCAS9 e 1 µg de gRNA. 20 ul de célula e mistura CRISPR-Cas9 foram transferidos para um poço de uma placa de eletroporação de 96 poços. As células foram eletroporadas usando o programa CM-138. Uma porção de células LPC eletroporadas foi transferida para um poço de placa de 384 poços. As células foram transduzidas com AAV e inibidor de DNA-PK ou deixadas sem tratamento (Controle) durante 36 horas em uma incubadora de 5% de CO2. DNA genômico foi isolado após 72 horas.
[00474] Isolamento de DNA genômico.
[00475] DNA genômico foi isolado por incubação de células durante 30 minutos a 37ºC com 50 ul e 15 ul de solução de DNA Quickextract (Epicenter) por poço de placa de 96 poços e 384 poços, respectivamente. O extrato celular foi misturado e transferido para uma placa de PCR de 96 poços e depois incubado por 6 min a 65°C e 2 minutos a 98°C. O DNA genômico foi imediatamente usado em aplicações a jusante ou foi armazenado a 4°C.
Medição de Taxas INDEL
[00476] Mistura de PCR Phire Green Hot Start II Master (F126L, Thermo Scientific) foi usada para amplificar o fragmento de DNA correspondente aos genes alvo. As reações de PCR foram realizadas seguindo as instruções do fabricante. Em resumo, 1,25 µl de solução de DNA genômico foram combinados com 23,5 µl de Misutra de PCR Phire Green Hot Start II Master e os iniciadores reversos e diretos de genes alvo correspondentes (Tabela 4). Um dos iniciadores liga-se fora da sequência doadora de AAV para evitar a amplificação do doador de AAV. As reações de PCR foram realizadas com o seguinte protocolo de ciclagem térmica: 1) 98°C 30s; 2), 98°C 5s; 3), 62°C 5s; 4) 72°C 20s repetir as etapas 2 a 4, 30 vezes; 5) 72°C 4 minutos. Os produtos de PCR foram purificados enzimaticamente. As amostras de DNA foram sequenciadas por Sanger usando os iniciadores de sequenciamento, como mostrado na Tabela 4. Cada cromatograma de sequenciamento foi analisado usando o software TIDE em relação às sequências de referência (descritas acima). As sequências de referências foram obtidas a partir de amostras simuladas eletroporadas. Os parâmetros de maré foram ajustados para cobrir um espectro de indel de +/- 30 nucleotídeos do sítio de corte de gRNA e a janela de decomposição foi ajustada para cobrir a maior janela possível com traços de alta qualidade. As taxas totais de indel (inserção e deleções) foram obtidas diretamente das parcelas TIDE. O software GraphPad Prism 7 foi utilizado para fazer gráficos e calcular todas as informações estatísticas.
Tabela 3. Sequências de sgRNAs Alvo sgRNA
VEGFA AUUCCCUCUUUAGCCAGAGCGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCA AAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUU (SEQ ID Nº: 13) EMX1 CAACCACAAACCCACGAGGGGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCAA AAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUU (SEQ ID Nº: 14)
FANCF CAAGGCCCGGCGCACGGUGGGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGCA AAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUU (SEQ ID Nº: 15)
RUNX AAAGAGAGAUGUAGGGCUAGGUUUUAGUACUCUGGAAACAGAAUCUACUAAAACAAGGC AAAAUGCCGUGUUUAUCUCGUCAACUUGUUGGCGAGAUUUU (SEQ ID Nº: 16)
[00477] Nota: Cada sgRNA contém uma sequência espaçadora única de 22 nucleotídeos (Negrito) seguida por uma sequência comum de 80 nucleotídeos. Tabela 4. Iniciadores de PCR e de sequenciamento Gene Iniciador Direto de PCR Iniciador reverse de PCR Iniciador de Sequenciamento
VEGFA AGACGTTCCTTAGTGCTGGC AGGAGGGAGCAGGAAAGTGA ATTCCCTCTTTAGCCAGAGC (SEQ ID Nº: 17) (SEQ ID Nº: 18) (SEQ ID Nº: 19) EMX1 TGGCTGTCCAGGCACTGCTC GGCCTGTCCTCCCTCAAG CAACCACAAACCCACGAGGG (SEQ ID Nº: 20) (SEQ ID Nº: 21) (SEQ ID Nº: 22)
FANCF ACACGGATAAAGACGCTGGG ACACGGATAAAGACGCTGGG CAAGGCCCGGCGCACGGTGG (SEQ ID Nº: 23) (SEQ ID Nº: 24) (SEQ ID Nº: 25) RUNX1 AACCCAGCATAGTGGTCAGC TCTGTGCATGTGCCTGCTAA AAAGAGAGATGTAGGGCTAG (SEQ ID Nº: 26) (SEQ ID Nº: 27) (SEQ ID Nº: 28)
[00478] LPCs foram eletroporados com mRNA de saCAS9 em conjunto com um doador de sgRNA e AAV para atingir os Genes do grupo F de complementação de anemia de Fanconi (FANCF), fator de transcrição 1 (RUNX1) relacionado a runt, Homeobox 1 de Espiráculo Vazio (EMX1) e fator A de crescimento endotelial vascular (VEGFA). As células foram incubadas com o inibidor de DNA-PK Composto 665 ou deixadas sem tratamento (Controle). As taxas de inserção e deleções totais (INDELs) foram determinadas usando o ensaio TIDE 72 h após a eletroporação. As taxas de edição de gene foram expressas em porcentagens e classificadas em HDR (Bars) e NHEJ (Cículos). Eventos de HDR foram a quantidade de sequências com inserção de 10 nucleotídeos. As taxas de NHEJ foram calculadas usando a seguinte fórmula: NHEJ = Total de eventos INDEL - eventos HDR. Os resultados são mostrados na Figura 12.
[00479] Sumário:
[00480] Os resultados da adição de inibidores de DNA-PK a diferentes tipos de células e locais mostram aumento significativo de HDR entre tipos e locais de células. O aprimoramento da edição do gene HDR foi mostrado em vários tipos de células, incluindo BECs, iPSCs, CD34+ HPSCs (3 doadores separados). O aprimoramento da edição do gene HDR foi mostrado em vários locais. Resultados experimentais também mostraram que a entrega baseada em lipídios e eletroporação é eficaz. Exemplos de eletroporação incluem BECs, iPSCs, HPSCs CD34+ e entrega de efeito usando um sistema de entrega baseado em lipídios em BECs. Uma forte correlação inversa entre os eventos HDR e NHEJ foi observada nos locais, condições experimentais e tipos de células.
[00481] Embora a invenção anterior tenha sido descrita em alguns detalhes a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será facilmente aparente para os versados na técnica à luz dos ensinamentos desta invenção que certas alterações e modificações podem ser feitas sem sair do espírito ou escopo das reivindicações anexas.

Claims (65)

REIVINDICAÇÕES
1. Método para reparar uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas alvo por meio de uma via de reparo direcionado por homologia (HDR), caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a uma ou mais células que compreendem uma ou mais regiões genômicas alvo, um sistema de edição de genoma e um composto de fórmula (III-E-1) ou (III-E-2), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, (III-E-1) ou (III-E-2) em que: X é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila; Y é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila; R3 é hidrogênio, C1-4 alquila ou OC1-2 alquila; R1 é um anel heteroaromático de 6 membros contendo um ou dois átomos de nitrogênio, em que o anel heteroaromático pode ser substituído por 0, 1, 2 ou 3 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em halo, CN, C1-C4 alquila, C1-C4-haloalquila, C3-C4-cicloalquila, OR6, C(=O)OR6, C(=O)NR7R6 e NR4R5; em que cada C1-C4-alquila e C1-C4-haloalquila é substituído por 0, 1 ou 2 grupos OR6, cada R6 e R7 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C1- C4-haloalquila, cada R4 e R5 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C(=O)C1-C4 alquila; ou R4 e R5 em conjunto com o átomo de N ao qual estão ligados formam um anel heterocíclico compreendendo 0 ou 1 átomo de O ou N adicional, em que o referido anel heterocíclico pode ser substituído por C1-C4 alquila ou OR6; e O anel B é selecionado a partir do grupo que consiste em: , , e ; em que W é N ou CR7; e Z é O ou S; em que R7 é H ou C1- C4 alquila, em que o sistema de edição de genoma interage com um ácido nucleico das regiões genômicas alvo, resultando em uma quebra de DNA e em que a quebra de DNA é reparada pelo menos em parte através de uma via HDR.
2. Método para reparar uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas alvo por meio de uma via de reparo direcionado por homologia (HDR), caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a uma ou mais células que compreendem uma ou mais regiões genômicas alvo, um sistema de edição de genoma e um composto de fórmula (III-E-1) ou (III-E-2), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, (III-E-1) ou (III-E-2) em que: X é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila; Y é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila; R3 é hidrogênio, C1-4 alquila ou OC1-2 alquila; R1 é um anel heteroaromático de 6 membros contendo um ou dois átomos de nitrogênio, em que o anel heteroaromático pode ser substituído por 0, 1, 2 ou 3 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em halo, CN, C1-C4 alquila, C1-C4-haloalquila, C3-C4-cicloalquila, OR6, C(=O)OR6, C(=O)NR7R6 e NR4R5; em que cada C1-C4-alquila e C1-C4-haloalquila é substituído por 0, 1 ou 2 grupos OR6, cada R6 e R7 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C1- C4-haloalquila, cada R4 e R5 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C(=O)C1-C4 alquila; ou R4 e R5 em conjunto com o átomo de N ao qual estão ligados formam um anel heterocíclico compreendendo 0 ou 1 átomo de O ou N adicional, em que o referido anel heterocíclico pode ser substituído por C1-C4 alquila ou OR6; e O anel B é selecionado a partir do grupo consistindo em: , , e ; em que W é N ou CR7; e Z é O ou S; em que R7 é H ou C1- C4 alquila, em que o sistema de edição de genoma interage com um ácido nucleico das regiões genômicas alvo, resultando em uma quebra de DNA e em que a quebra de DNA é reparada pelo menos em parte através de uma via HDR.
3. Método para inibir ou suprimir o reparo de uma quebra de DNA em uma ou mais regiões genômicas alvo por meio de uma via de junção de extremidade não homóloga (NHEJ), caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a uma ou mais células que compreendem uma ou mais regiões genômicas alvo, um sistema de edição de genoma e um composto de fórmula (III-E-1) ou (III-E-2), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo,
(III-E-1) ou (III-E-2) em que: X é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila; Y é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila; R3 é hidrogênio, C1-4 alquila ou OC1-2 alquila; R1 é um anel heteroaromático de 6 membros contendo um ou dois átomos de nitrogênio, em que o anel heteroaromático pode ser substituído por 0, 1, 2 ou 3 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em halo, CN, C1-C4 alquila, C1-C4-haloalquila, C3-C4-cicloalquila, OR6, C(=O)OR6, C(=O)NR7R6 e NR4R5; em que cada C1-C4-alquila e C1-C4-haloalquila é substituído por 0, 1 ou 2 grupos OR6, cada R6 e R7 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C1- C4-haloalquila, cada R4 e R5 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C(=O)C1-C4 alquila; ou R4 e R5 em conjunto com o átomo de N ao qual estão ligados formam um anel heterocíclico compreendendo 0 ou 1 átomo de O ou N adicional, em que o referido anel heterocíclico pode ser substituído por C1-C4 alquila ou OR6; e O anel B é selecionado a partir do grupo que consiste em:
, , e ; em que W é N ou CR7; e Z é O ou S; em que R7 é H ou C1- C4 alquila, em que o sistema de edição de genoma interage com um ácido nucleico de uma ou mais regiões genômicas alvo, resultando em uma quebra de DNA e em que o reparo da quebra de DNA através de uma via NHEJ é inibido ou suprimido.
4. Método para modificar a expressão de um ou mais genes ou proteínas, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar a uma ou mais células que compreendem uma ou mais regiões genômicas alvo, um sistema de edição de genoma e um composto de fórmula (III-E-1) ou (III-E-2), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, (III-E-1) ou (III-E-2) em que: X é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila; Y é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila; R3 é hidrogênio, C1-4 alquila ou OC1-2 alquila; R1 é um anel heteroaromático de 6 membros contendo um ou dois átomos de nitrogênio, em que o anel heteroaromático pode ser substituído por 0, 1, 2 ou 3 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em halo, CN, C1-C4 alquila, C1-C4-haloalquila, C3-C4-cicloalquila, OR6, C(=O)OR6, C(=O)NR7R6 e NR4R5; em que cada C1-C4-alquila e C1-C4-haloalquila é substituído por 0, 1 ou 2 grupos OR6, cada R6 e R7 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C1- C4-haloalquila, cada R4 e R5 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C(=O)C1-C4 alquila; ou R4 e R5 em conjunto com o átomo de N ao qual estão ligados formam um anel heterocíclico compreendendo 0 ou 1 átomo de O ou N adicional, em que o referido anel heterocíclico pode ser substituído por C1-C4 alquila ou OR6; e O anel B é selecionado a partir do grupo que consiste em: , , e ; em que W é N ou CR7; e Z é O ou S; em que R7 é H ou C1- C4 alquila, em que o sistema de edição de genoma interage com um (s) ácido nucleico das uma ou mais regiões genômicas alvo de um ou mais gene (s) alvo, resultando na edição das uma ou mais regiões genômicas alvo e em que a edição modifica a expressão de um gene (s) e/ou proteína a jusante associada ao gene (s) alvo.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que X é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila; Y é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila; R3 é hidrogênio, C1-4 alquila ou OC1-2 alquila; R1 é um anel heteroaromático de 6 membros contendo um ou dois átomos de nitrogênio em que o anel heteroaromático pode ser substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C4-alquila, C1-C4- haloalquila, C(=O)NHR6 e NR4R5; em que
R6 é C1-C4 alquila, cada R4 e R5 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C(=O)C1-C4 alquila; ou R4 e R5 em conjunto com o átomo de N ao qual estão ligados formam um anel heterocíclico compreendendo 0 ou 1 átomo de N adicional, em que o referido anel heterocíclico pode ser substituído por C1-C4 alquila; e O anel B é selecionado a partir do grupo que consiste em: , , e ; em que W é N ou CR7; e Z é O ou S; em que R7 é H ou C1- C4 alquila.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que X é O ou NH, Y é O ou NH e R3 é hidrogênio.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 selecionados independentemente a partir de o grupo que consiste em C1-C4-alquila, C1-C4-haloalquila, C(=O)NHR6 e NR4R5.
8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por 0, 1, ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C4-alquila, C1-C4-haloalquila, C(=O)NHR6 e NR4R5; O anel B é selecionado a partir do grupo que consiste em: , e ; W é N ou CR7; e
Z é O ou S; em que R7 é H ou C1-C4-alquila.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo consistindo em C1-C4 alquila, haloalquila C1-C4, C(=O)NHR6 e NR4R5; O anel B é ; W é N ou CR7; e Z é O ou S; em que R7 é H ou C1-C4 alquila.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em C1-C4-alquila e C(=O)NHR6; O anel B é ; W é N; e Z é O ou S.
11. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que X é O ou NH, Y é O ou NH, R3 é hidrogênio e R1 é um anel de pirimidina que é substituído por um substituinte R2 selecionado a partir do grupo que consiste em C1- C2-alquila e C(=O)NH C1-C2-alquila; O anel B é ; W é N; e Z é O ou S.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações
1 a 5, caracterizado pelo fato de que o composto é representado por uma das seguintes fórmulas ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: , , , , , , ou .
13. Método, de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que a quebra de DNA compreende uma quebra de filamento duplo de DNA (DSB).
14. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 5, caracterizado pelo fato de que a eficiência de editar as regiões genômicas alvo em uma ou mais células é aumentada em comparação a células ou células idênticas, mas sem o composto.
15. Método, de acordo com a reivindicação 2 ou 5, caracterizado pelo fato de que a eficiência do reparo da quebra de DNA nas regiões genômicas alvo nas uma ou mais células através de uma via HDR é aumentada em comparação à célula ou células idênticas, mas sem a composto.
16. Método, de acordo com a reivindicação 3 ou 5, caracterizado pelo fato de que a eficiência de inibir ou suprimir a reparação da quebra de DNA nas regiões genômicas alvo nas uma ou mais células através de uma via NHEJ é aumentada em comparação à célula ou células idênticas mas sem o composto.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que a referida eficiência é aumentada em pelo menos duas vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes ou 100 vezes, em comparação à célula ou células idênticas, mas sem o composto.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que a referida eficiência é medida pela frequência da integração de polinucleotídeos direcionados.
19. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 17, caracterizado pelo fato de que a referida eficiência é medida pela frequência da mutagênese direcionada.
20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a mutagênese direcionada compreende mutações pontuais, deleções e/ou inserções.
21. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5,
caracterizado pelo fato de que a expressão de um gene (s) e/ou proteína (s) a jusante associados ao gene (s) alvo é aumentada em comparação ao nível de expressão da linha de base nas uma ou mais células antes da administração.
22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a referida expressão é aumentada em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, uma vez, 1,5 vez, duas vezes, 2,5 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes, 4 vezes, 4,5 vezes, 5 vezes ou 10 vezes em comparação ao nível de expressão da linha de base nas uma ou mais células antes da administração.
23. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a expressão de um gene (s) e/ou proteína (s) a jusante associados ao gene (s) alvo é diminuída em comparação ao nível de expressão da linha de base nas uma ou mais células antes da administração.
24. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a expressão do gene é reduzida em pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em comparação ao nível de expressão da linha de base em uma ou mais células antes da administração.
25. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a expressão de um gene (s) e/ou proteína (s) a jusante associados ao gene (s) alvo é substancialmente eliminada nas uma ou mais células.
26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizado pelo fato de que a célula é sincronizada na fase do ciclo celular S ou G2.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais células que são administradas ou contatadas com o referido composto aumentam a sobrevivência em comparação as uma ou mais células que não foram administradas ou contatadas com o referido composto.
28. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma e o composto são administrados nas uma ou mais células simultaneamente.
29. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma e o composto são administrados nas uma ou mais células sequencialmente.
30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é administrado nas uma ou mais células anteriores ao composto.
31. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o composto é administrado nas uma ou mais células antes de o sistema de edição de genoma.
32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que uma ou mais células são células cultivadas.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que uma ou mais células são células in vivo dentro de um organismo.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 31, caracterizado pelo fato de que uma ou mais células são células ex vivo de um organismo.
35. Método, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que o organismo é um mamífero.
36. Método, de acordo com a reivindicação 33 ou 34, caracterizado pelo fato de que o organismo é um humano.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36,
caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma e o composto são administrados pela mesma via.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma e o composto são administrados por via diferente.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é administrado por via intravenosa e o composto é administrado por via oral.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 39, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é selecionado a partir de um sistema baseado em meganuclease, um sistema baseado em nuclease de dedo de zinco (ZFN), um sistema de Nuclease Baseado em Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALEN), um sistema baseado em CRISPR ou um sistema baseado em NgAgo.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é um sistema baseado em CRISPR.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR- Cas ou um sistema CRISPR-Cpf.
43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR- Cas e em que o sistema CRISPR-Cas compreende: (a) pelo menos um elemento de RNA guia compreendendo: (i) um RNA direcionador compreendendo uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo nas uma ou mais regiões genômicas alvo ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica o RNA direcionador; (ii) e um RNA ativador compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com o RNA direcionador ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica o RNA ativador; e (b) um elemento de proteína Cas compreendendo uma proteína Cas ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência (s) de nucleotídeo que codifica a proteína Cas.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que o referido RNA alvo e RNA ativador são fundidos tal como uma molécula única.
45. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas9 Tipo II.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas9 é uma SaCas9, SpCas9, SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 ou D10A nickase ou qualquer combinação das mesmas.
47. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR- Cpf e em que o sistema CRISPR-Cpf compreende: (a) pelo menos um elemento de RNA guia ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica o elemento RNA guia, o RNA guia compreendendo um RNA direcionador que compreende uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo nas uma ou mais regiões genômicas alvo; e (b) um elemento de proteína Cpf compreendendo uma proteína Cpf ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica a proteína Cpf.
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 47, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é entregue por um ou mais vetores.
49. Método, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que um ou mais vetores são selecionados a partir de vetores virais, plasmídeos ou ssDNAs.
50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que os vetores virais são selecionados a partir do grupo que consiste em vetores virais retrovirais, lentivirais, adenovirais, adenoassociados e herpes simplex.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 49, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é entregue por RNA sintético.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 49, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é entregue por uma nanoformulação.
53. Kit ou composição para editar uma ou mais regiões genômicas alvo, caracterizado pelo fato de que compreende: um sistema de edição de genoma; e um composto de fórmula (III-E-1) ou (III-E-2), ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, (III-E-1) ou (III-E-2) em que: X é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila; Y é O ou NR; em que R é H ou C1-C4 alquila; R3 é hidrogênio, C1-4 alquila ou OC1-2 alquila; R1 é um anel heteroaromático de 6 membros contendo um ou dois átomos de nitrogênio, em que o anel heteroaromático pode ser substituído por 0, 1, 2 ou 3 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em halo, CN, C1-C4 alquila, C1-C4-haloalquila, C3-C4-cicloalquila, OR6, C(=O)OR6, C(=O)NR7R6 e NR4R5; em que cada C1-C4-alquila e C1-C4-haloalquila é substituído por 0, 1 ou 2 grupos OR6, cada R6 e R7 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C1- C4-haloalquila, cada R4 e R5 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C(=O)C1-C4 alquila; ou R4 e R5 em conjunto com o átomo de N ao qual estão ligados formam um anel heterocíclico compreendendo 0 ou 1 átomo de O ou N adicional, em que o referido anel heterocíclico pode ser substituído por C1-C4 alquila ou OR6; e O anel B é selecionado a partir do grupo que consiste em: , , e ; em que W é N ou CR7; e Z é O ou S; em que R7 é H ou C1- C4 alquila.
54. Kit ou composição, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que R1 é um anel heteroaromático de 6 membros contendo um ou dois átomos de nitrogênio em que o anel heteroaromático pode ser substituído por 0, 1 ou 2 substituintes R2 independentemente selecionados a partir do grupo que consiste em C1-C4-alquila, C1-C4- haloalquila, C(=O)NHR6 e NR4R5; em que R6 é C1-C4 alquila, cada R4 e R5 é independentemente H, C1-C4 alquila ou C(=O)C1-C4 alquila; ou R4 e R5, juntos com o átomo de N ao qual estão ligados, formam um anel heterocíclico compreendendo 0 ou 1 átomo de N adicional, em que o referido anel heterocíclico pode ser substituído por C1-C4 alquila.
55. Kit ou composição, de acordo com a reivindicação 53 ou
54, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é um sistema baseado em meganuclease, um sistema baseado em nuclease de dedo de zinco (ZFN), um sistema de Nuclease Baseado em Efetor do Tipo Ativador de Transcrição (TALEN), um sistema baseado em CRISPR, um sistema baseado em NgAgo.
56. Kit ou composição, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é um sistema baseado em CRISPR.
57. Kit ou composição, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de que o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas ou um sistema CRISPR-Cpf.
58. Kit ou composição, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cas e em que o sistema CRISPR-Cas compreende: (a) pelo menos um elemento de RNA guia compreendendo: (i) um RNA direcionador compreendendo uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo nas uma ou mais regiões genômicas alvo ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência (s) de nucleotídeo que codifica o RNA direcionador; (ii) e um RNA ativador compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é capaz de hibridizar com o RNA alvo, ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência (s) de nucleotídeo que codifica o RNA ativador; e (b) um elemento de proteína Cas compreendendo uma proteína Cas ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência (s) de nucleotídeo que codifica a proteína Cas.
59. Kit ou composição, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas é uma proteína Cas9 Tipo II.
60. Kit ou composição, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a proteína Cas9 é uma SaCas9, SpCas9,
SpCas9n, Cas9-HF, Cas9-H840A, FokI-dCas9 ou D10A nickase ou qualquer combinação das mesmas.
61. Kit ou composição, de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o sistema baseado em CRISPR é um sistema CRISPR-Cpf e em que o sistema CRISPR-Cpf compreende: (a) um RNA direcionador compreendendo uma sequência de nucleotídeo substancialmente complementar a uma sequência de nucleotídeo nas uma ou mais regiões genômicas alvo, ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica o RNA direcionador; e (b) um elemento de proteína Cpf compreendendo uma proteína Cpf ou um ácido nucleico compreendendo uma sequência (s) de nucleotídeos que codificam a proteína Cpf.
62. Kit ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 53 a 61, caracterizado pelo fato de que o sistema de edição de genoma é incluído ou empacotado em um ou mais vetores.
63. Kit ou composição, de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que um ou mais vetores são selecionados a partir de vetores virais, plasmídeos ou ssDNAs.
64. Kit ou composição, de acordo com a reivindicação 63, caracterizado pelo fato de que os vetores virais são selecionados a partir do grupo que consiste em vetores virais retrovirais, lentivirais, adenovirais, adenoassociados e herpes simplex.
65. Composto, caracterizado pelo fato de que é representado por qualquer uma das seguintes fórmulas ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo: ou .
Projeto de ensaios de edição de gene
Gene alvo selecionado
Petição 870200085960, de 10/07/2020, pág. 299/327 Identificação de sítios alvo de sgRNA ativo 1/8
Projeto de doadores de ssDNA Sítio de corte de spCAS9
40 nts de braço de homologia 10 nts de inserção 40 nts de braço de homologia Doador PAM Doador não PAM
Modificação de fosforotioato Pegada HDR exclusiva em ensaio TIDE
Eventos (%) 2/8
Sobrevivência celular
Log [composto 665], µM
Doador B composto 665 Viabilidade Eventos % Conc. de comp.
Doador C composto 665 Viabilidade celular Eventos % Conc. de comp.
Sobrevivência celular Eventos
Composto 665
Composto 665 Eventos
Composto 665
Eventos
Desdobramento
Composto 665
Composto Eventos % Conc. de comp.
Composto Eventos % Conc. de comp.
Composto Eventos %
Conc. de comp.
Sítio de corte de CRISPR Genoma
Reparo direcionado por homologia (HDR)
Pegada HDR de 10 nucleotídeos Doador AAV Eventos de edição de gene
Simulado gRNA de CAS9& Doador AAV Composto 665
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