CN111741955A - Dna-pk抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可用作DNA‑PK的抑制剂的化合物。本发明还提供了包含所述化合物的药学上可接受的组合物和在各种疾病、病症或障碍的治疗中使用所述组合物的方法。

Description

DNA-PK抑制剂
相关申请
本申请要求2018年1月17日提交的美国临时申请号US 62/618,598的权益，其通过引用整体并入本文。
序列表
本申请含有序列表，其已经以ASCII格式电子地提交，且特此通过引用整体并入。于2019年1月15日创建的ASCII副本命名为14390-686 Sequence listing_ST25.txt且具有8KB大小。
技术领域
本发明涉及可用作DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)的抑制剂的化合物。本发明还提供包含本发明化合物的药学上可接受的组合物以及在癌症治疗中使用所述组合物的方法，以及通过向细胞施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统来增加基因组编辑效率的方法。
发明背景
电离辐射(IR)诱导多种DNA损伤，其中双链断裂(DSB)是最具细胞毒性的。如果未快速和完全修复，这些DSB可经由细胞凋亡和/或有丝分裂突变而导致细胞死亡。除了IR以外，某些化学治疗剂(包括拓扑异构酶II抑制剂、博来霉素和多柔比星)也会引起DSB。这些DNA病变通过DNA损伤响应网络触发一系列复杂的信号，这些信号发挥作用而修复受损的DNA并维持细胞活力和基因组稳定性。在哺乳动物细胞中，DSB的主要修复途径是非同源末端连接途径(Non-Homologous End Joining)(NHEJ)。该途径无论处于细胞周期的哪个阶段均发挥作用，并且不需要模板来重新连接断裂的DNA末端。NHEJ需要许多蛋白和信号传导途径的协作。核心NHEJ机制由Ku70/80异源二聚体和DNA依赖性蛋白激酶的催化亚基(DNA-PKcs或DNA-PK)组成，它们一起构成活性的DNA-PK酶复合物。DNA-PKcs是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶(PIKK)家族的一个成员，该家族还包括共济失调毛细血管扩张突变(ATM)激酶、共济失调毛细血管扩张和Rad3相关(ATR)激酶、mTOR和四种PI3K同种型(isoform)。但是，虽然DNA-PKcs属于与ATM和ATR相同的蛋白激酶家族，但后两种激酶通过同源重组(HR)途径发挥作用来修复DNA损伤并且局限于细胞周期的S期和G2期。虽然ATM也被募集到DSB的位点，但ATR被募集到单链DNA断裂的位点。
认为NHEJ通过三个关键的步骤开展：识别DSB；进行DNA加工以移除端点(termini)处的不可连接末端或其它损伤形式；以及最后连接DNA末端。DSB的识别如下进行：Ku异源二聚体结合至粗糙的(ragged)DNA末端，然后募集两分子的DNA-PKcs至DSB的相邻侧；这用于保护断裂端点直至募集额外的加工酶。最近的数据支持以下假说：DNA-PKcs使加工酶Artemis以及其自身磷酸化以使DNA末端准备进行另外的加工。在某些情况下，在连接步骤之前可能需要DNA聚合酶来合成新的末端。据信DNA-PKcs的自磷酸化会诱导构象改变，该构象改变使中心DNA结合空穴打开，从DNA释放DNA-PKcs，并促进DNA末端的最终重新连接。
一段时间以来已经知道，DNA-PK-/-小鼠对IR的效应高度敏感并且DNA-PKcs的一些非选择性小分子抑制剂可使跨广泛遗传背景集合的多种肿瘤细胞类型放射致敏。虽然预计DNA-PK的抑制将会使正常细胞在一定程度上放射致敏，但已经观察到这种致敏的程度比对肿瘤细胞的致敏程度低，可能是由于这样的事实：肿瘤细胞具有较高基础水平的内源复制压力和DNA损伤(癌基因诱导的复制压力)并且在肿瘤细胞中的DNA修复机制是更低效的。最重要的是，从DNA-PK抑制剂与精确递送聚焦IR方面的最新进展(包括图像引导的RT(IGRT)和强度调节RT(IMRT))的组合将会赋予改善的治疗窗，更好地免除对正常组织的影响。
DNA-PK活性的抑制在周期和非周期细胞二者中引起效应。这是极其重要的，因为实体瘤中的大部分细胞在任何给定的时刻是不活跃复制的，这限制了许多靶向细胞周期的药剂的效力。同样令人感兴趣的是最近的报道，该报道表明NHEJ途径的抑制与杀死传统上抗放射性的癌症干细胞(CSC)的能力之间存在强联系。已在一些肿瘤细胞中证实，休眠CSC中的DSB主要通过NHEJ途径激活DNA修复；据信CSC通常处于细胞周期的静止期。这可解释为什么尽管进行了治疗但一半的癌症患者可能会经历局部或远处的肿瘤复发，因为目前的策略不能够有效地靶向CSC。DNA-PK抑制剂可能具有增加这些潜在的转移性祖细胞对IR效应的敏感性以及选择DSB诱导性化学治疗剂的能力。
鉴于DNA-PK在DNA修复过程中的参与，特异性的DNA-PK抑制性药物的应用将会充当可增强癌症化学疗法和放射疗法二者的效力的药剂。因此，需要开发可用作DNA-PK的抑制剂的化合物。
另外，需要精确的基因组靶向技术来实现遗传变异的系统工程。基因组编辑系统、尤其是基于CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-内切核酸酶的基因组编辑技术的应用已经在过去几年中呈指数增长。II型CRISPR-Cas9细菌先天免疫系统已成为用于人类基因组的靶向修饰的有效基因组编辑工具(Wiedenheft,B.2012；Hsu,P.D.等人.2014)。近年来，已描述了CRISPR-Cpf基因组编辑系统。基于CRISPR-内切核酸酶的基因组编辑部分地依赖于非同源末端连接(NHEJ)途径和同源定向修复(HDR)途径来修复DNA双链断裂。细胞修复机制对NHEJ的偏好胜过HDR。
虽然在一些报告中来自NHEJ的插入或缺失(插入/缺失(indels))的实现高达70％有效性，但HDR的效率仍具有挑战性且比率低于1％。
因此，需要增加基因组编辑效率，具体地，HDR效率。特异性DNA-PK抑制性药物的另一种应用是充当增强基因组编辑系统的效力的药剂。
发明内容
已经发现，本发明的化合物及其药学上可接受的组合物可有效作为DNA-PK的抑制剂。因此，本发明表征了具有如下通式的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002641974200000041
其中R1、R2、X、环A、环B和环C中的每一个如本文别处所定义。
本发明还提供包含式I的化合物以及药学上可接受的载体、辅助剂(adjuvant)或媒介物的药物组合物。这些化合物和药物组合物可用于治疗或减轻癌症的严重程度。
由本发明提供的化合物和组合物也可用于研究生物学和病理学现象中的DNA-PK；研究由这种激酶介导的细胞内信号转导途径；以及对新激酶抑制剂的对比评价。
本发明还可以通过使用DNA-PK抑制剂抑制NHEJ酶诸如DNA-PK来提高HDR效率。
在某些实施方案中，本公开内容提供了一种编辑一个或多个靶基因组区域的方法，该方法包括向具有一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用基因组编辑系统和由式I表示的化合物或其药学上可接受的盐:
Figure BDA0002641974200000042
其中R1、R2、X、环A、环B和环C中的每一个独立地如本文别处所定义。
在某些实施方案中，本公开内容还提供了一种经由同源性定向修复(HDR)途径修复一个或多个靶基因组区域中的DNA断裂的方法，该方法包括向具有一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用基因组编辑系统和由式I表示的化合物或其药学上可接受的盐。
基因组编辑系统与靶基因组区域的核酸相互作用，导致DNA断裂，并且其中DNA断裂至少部分地经由HDR途径修复。
在某些实施方案中，本公开内容还提供了一种抑制或遏制经由NHEJ途径对一个或多个靶基因组区域中的DNA断裂的修复的方法，该方法包括向具有一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用基因组编辑系统和由式I表示的化合物或其药学上可接受的盐。
基因组编辑系统与一个或多个靶基因组区域的核酸相互作用，导致DNA断裂，并且其中经由NHEJ途径的DNA断裂的修复被抑制或遏制。
在某些实施方案中，本公开内容还提供了一种修饰一个或多个基因或蛋白的表达的方法，该方法包括向包含一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用基因组编辑系统和由式I表示的化合物或其药学上可接受的盐。
基因组编辑系统与靶基因的一个或多个靶基因组区域的核酸相互作用，导致编辑所述一个或多个靶基因组区域，并且其中所述编辑修饰与靶基因有关的下游基因和/或蛋白的表达。
在某些实施方案中，提供了用于编辑一个或多个靶基因组区域的试剂盒或组合物。在某些实施方案中，所述试剂盒或组合物包括基因组编辑系统；和由式I表示的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的其它特征、目的和优点在下面的详细描述中是显而易见的。但是，应当理解，详细描述尽管指示了本发明的实施方案和方面，但是仅以示例而非限制的方式给出。本领域技术人员从详细描述会明白在本发明范围内的各种改变和修改。
附图说明
图1描绘了基因编辑测定的设计。
图2的图显示了用DNA-PK抑制剂处理的BEC中的基因编辑率。
图3A和3B的图显示了来自两种不同供体的CD34+细胞中DNA-PK抑制剂处理后的基因编辑率。
图4的图显示了用DNA-PK抑制剂处理的iPSC中的基因编辑率。
图5的图显示了在DNA-PK抑制剂ECmax时BEC中的基因编辑动力学。
图6的图显示了在DNA-PK抑制剂EC50时BEC中的基因编辑动力学。
图7的条形图显示了在BEC中通过脂质介导的转染递送的基因编辑组分的HDR率。
图8的图显示了用DNA-PK抑制剂处理的CD34+中的基因编辑率。
图9的图显示了用DNA-PK抑制剂处理的CD34+中的基因编辑率。
图10的图显示了用DNA-PK抑制剂处理的CD34+中的基因编辑率。
图11描绘了使用AAV供体使用CRISPR-Cas9执行同源性驱动的修复(HDR)的基因编辑策略的设计。
图12的图显示了由AAV供体、CRISPR-Cas9和选择性的DNA-PK抑制剂介导的HDR实现的精确基因编辑。
发明详述
定义和一般术语
如本文中使用的，以下定义适用，除非另外指出。为了本发明的目的，根据Periodic Table of the Elements,CAS版和Handbook of Chemistry and Physics,1994年第75版来鉴别化学元素。另外，有机化学的一般原理描述在“Organic Chemistry,”Thomas Sorrell,University Science Books,Sausalito:1999,和“March’s AdvancedOrganic Chemistry,”第5版,Smith,M.B.和March,J.,编.John Wiley&Sons,New York:2001，它们的整个内容特此通过引用并入。通常，本文描述的关于细胞和组织培养、分子生物学和蛋白和寡核苷酸或多核苷酸化学和杂交使用的命名法及其技术是本领域众所周知和常用的那些。关于重组DNA、寡核苷酸合成和组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)使用标准技术。酶反应和纯化技术根据生产商的说明书进行，或者如本领域常规实现的进行，或者如本文中所述进行。前述技术和操作通常根据本领域众所周知的常规方法执行，并且如在本公开内容中引用和讨论的各种一般性和更具体的参考文献中所述。参见例如，Sambrook等人.Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))。
如本文所述，本发明的化合物可以任选地被一个或多个取代基取代，所述取代基诸如上文一般性说明的取代基或如以本发明的具体类别、亚类和种类所示例的取代基。应当理解，短语“任选取代的”与短语“被取代的或未被取代的”互换使用。通常，术语“取代的”无论前面是否有术语“任选”，均是指给定结构中的一个或多个氢基团被指定取代基的基团所替代。除非另外指明，否则任选取代的基团可在该基团的每个可取代位置有取代基。当给定结构中超过一个位置可被超过一个选自指定组的取代基取代时，取代基在每个位置可相同或不同。
如本文中所述，当术语“任选取代的”处于一清单之前时，所述术语是指该清单中所有后续可取代的基团。例如，如果X是卤素；任选取代的C1-3烷基或苯基，则X可以是任选取代的烷基或任选取代的苯基。同样，如果术语“任选取代的”在一个清单之后，则除非另外指明，否则所述术语也指前面列表中的全部可取代基团。例如：如果X是卤素(halogen)、C1-3烷基或苯基，其中X任选被JX取代，则C1-3烷基和苯基二者均可任选被JX取代。如对本领域普通技术人员显而易见的，诸如H、卤素、NO2、CN、NH2、OH或OCF3这类的基团将不包括在内，因为它们不是可取代的基团。同样对技术人员显而易见的是，含有NH基团的杂芳基或杂环基环可任选通过用所述取代基替代氢原子而被取代。如果取代基基团或结构未确定或未定义为“任选取代的”，则该取代基基团或结构是未被取代的。
本发明所预想的取代基组合优选是能够形成稳定的或化学上可行的化合物的那些取代基组合。本文中使用的术语“稳定的”是指化合物在经受为了一种或多种本申请公开的目的而允许其产生、检测以及优选其回收、纯化和使用的条件时，不会实质上被改变。在某些实施方案中，稳定的化合物或化学上可行的化合物是在不存在水分或其它化学反应性条件的情况下，在40℃或更低温度下保持至少一周时不会实质上发生改变的化合物。
本文中使用的术语“烷基”或“烷基基团”意指直链(即无支链)或支链的、被取代的或未被取代的完全饱和的烃链。除非另外指明，否则烷基含有1-8个碳原子。在某些实施方案中，烷基含有1-6个碳原子，并且在其它实施方案中，烷基含有1-4个碳原子(表示为“C1-4烷基”)。在其它实施方案中，烷基表征为“C0-4烷基”，其代表共价键或C1-4烷基链。烷基的例子包括甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、仲丁基和叔丁基。本文中使用的术语“亚烷基(alkylene)”代表饱和的二价直链或支链烃基并且以亚甲基、亚乙基、亚异丙基等为示例。本文中使用的术语“亚烷基(alkylidene)”代表二价直链烷基连接基团。本文中使用的术语“烯基”代表含有一个或多个碳-碳双键的单价直链或支链烃基。本文中使用的术语“炔基”代表含有一个或多个碳-碳三键的单价直链或支链烃基。
术语“环烷基”(或“碳环”)是指单环C3-C8烃或双环C8-C12烃，该烃是完全饱和的并且具有与分子的其余部分的单个连接点，并且其中所述双环环系中的任何单独的环具有3-7个成员。合适的环烷基包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
本文中使用的术语“杂环”、“杂环基”、“杂环烷基”或“杂环的”是指这样的单环、双环或三环环系：其中环系中的至少一个环含有一个或多个相同或不同的杂原子，并且是完全饱和的或含有一个或多个不饱和单元，但是其不是芳族的，并且具有与分子的其余部分的单个连接点。在某些实施方案中，“杂环”、“杂环基”、“杂环烷基”或“杂环的”基团具有三至十四个环成员，其中一个或多个环成员是独立选自氧、硫、氮或磷的杂原子，并且环系中的每个环含有3至8个环成员。
杂环的例子包括但不限于如下单环：2-四氢呋喃基、3-四氢呋喃基、2-四氢噻吩基、3-四氢噻吩基、2-吗啉代(morpholino)、3-吗啉代、4-吗啉代、2-硫代吗啉代(thiomorpholino)、3-硫代吗啉代、4-硫代吗啉代、1-吡咯烷基、2-吡咯烷基、3-吡咯烷基、1-四氢哌嗪基、2-四氢哌嗪基、3-四氢哌嗪基、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、1-吡唑啉基、3-吡唑啉基、4-吡唑啉基、5-吡唑啉基、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-哌啶基、2-噻唑烷基、3-噻唑烷基、4-噻唑烷基、1-咪唑烷基、2-咪唑烷基、4-咪唑烷基、5-咪唑烷基；以及如下双环：3-1H-苯并咪唑-2-酮、3-(1-烷基)-苯并咪唑-2-酮、吲哚啉基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、苯并硫杂环戊烷(benzothiolane)、苯并二噻烷(benzodithiane)和1,3-二氢-咪唑-2-酮。
术语“杂原子”意指氧、硫、氮或磷中的一个或多个，包括氮、硫或磷的任何氧化形式；任何碱性氮的季铵化形式；或者杂环的可取代氮，例如N(如在3,4-二氢-2H-吡咯基中)、NH(如在吡咯烷基中)或NR+(如在N-取代的吡咯烷基中)。
本文中使用的术语“不饱和的”意指一个部分具有一个或多个不饱和单元。
本文中使用的术语“烷氧基”或“硫基烷基”是指通过氧(“烷氧基”)或硫(“硫基烷基”)原子连接至主碳链的如先前所定义的烷基。
术语“卤代烷基”、“卤代烯基”和“卤代烷氧基”意指视情况而被一个或多个卤素原子取代的烷基、烯基或烷氧基。术语“卤素”意指F、Cl、Br或I。
单独使用的或作为较大部分(如在“芳烷基”、“芳烷氧基”或“芳氧基烷基”中)的一部分使用的术语“芳基”是指总共具有六至十四个环成员的单环、双环或三环碳环环系，其中所述环系具有与分子的其余部分的单个连接点，该环系中的至少一个环是芳族的并且其中该环系中的每个环含有4至7个环成员。术语“芳基”可与术语“芳基环”互换使用。芳基环的例子包括苯基、萘基和蒽。
单独使用的或作为较大部分(如在“杂芳烷基”或“杂芳基烷氧基”中)的一部分使用的术语“杂芳基”是指总共具有五至十四个环成员的单环、双环和三环环系，其中所述环系具有与分子的其余部分的单个连接点，该环系中的至少一个环是芳族的，该环系中的至少一个环含有独立选自氮、氧、硫或磷的一个或多个杂原子，并且其中该环系中的每个环含有4至7个环成员。术语“杂芳基”可以与术语“杂芳基环”或术语“杂芳族”互换使用。
杂芳基环的另外例子包括如下单环：2-呋喃基、3-呋喃基、N-咪唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、5-咪唑基、3-异
Figure BDA0002641974200000102
唑基、4-异
Figure BDA0002641974200000103
唑基、5-异
Figure BDA0002641974200000104
唑基、2-
Figure BDA0002641974200000105
唑基、4-
Figure BDA0002641974200000106
唑基、5-
Figure BDA0002641974200000107
唑基、N-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶基、哒嗪基(例如，3-哒嗪基)、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、四唑基(例如，5-四唑基)、三唑基(例如，2-三唑基和5-三唑基)、2-噻吩基、3-噻吩基、吡唑基(例如，2-吡唑基)、异噻唑基、1,2,3-
Figure BDA0002641974200000108
二唑基、1,2,5-
Figure BDA0002641974200000109
二唑基、1,2,4-
Figure BDA00026419742000001010
二唑基、1,2,3-三唑基、1,2,3-噻二唑基、1,3,4-噻二唑基、1,2,5-噻二唑基、吡嗪基、1,3,5-三嗪基，以及如下双环：苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基(benzothiophenyl)、吲哚基(例如，2-吲哚基)、嘌呤基、喹啉基(例如，2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基)和异喹啉基(例如，1-异喹啉基、3-异喹啉基或4-异喹啉基)。
如本文所述，从取代基画向多环环系内的一个环的中心的键(如下面所示)代表该取代基在该多环环系内的任一个环中的任何可取代位置处取代。例如，结构a代表结构b中所示任一位置中的可能取代。
Figure BDA0002641974200000101
Figure BDA0002641974200000111
这也适用于稠合至任选环系(其将由虚线表示)的多环环系。例如，在结构c中，X是环A和环B二者的任选取代基。
Figure BDA0002641974200000112
然而，如果多环环系中的两个环各具有从各环的中心画出的不同取代基，则除非另外指明，否则每个取代基仅代表其所连接的环上的取代。例如，在结构d中，Y仅是环A的任选取代基，X仅是环B的任选取代基。
Figure BDA0002641974200000113
本文中使用的术语“保护基”代表旨在在合成程序过程中保护官能团(例如醇、胺、羧基、羰基等)免于不期望的反应的那些基团。通常使用的保护基在如下文献中公开：Greene和Wuts,Protective Groups In Organic Synthesis,第3版(John Wiley&Sons,NewYork,1999)，其通过引用并入本文。氮保护基的例子包括：酰基、芳酰基或氨基甲酰基诸如甲酰基、乙酰基、丙酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、2-氯乙酰基、2-溴乙酰基、三氟乙酰基、三氯乙酰基、邻苯二甲酰基、邻硝基苯氧基乙酰基、α-氯丁酰基、苯甲酰基、4-氯苯甲酰基、4-溴苯甲酰基、4-硝基苯甲酰基以及手性辅助助剂如受保护的或不受保护的D,L或D,L-氨基酸诸如丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸等；磺酰基诸如苯磺酰基、对甲苯磺酰基等；氨基甲酸酯基诸如苄氧基羰基、对氯苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、2-硝基苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、3,4-二甲氧基苄氧基羰基、3,5-二甲氧基苄氧基羰基、2,4-二甲氧基苄氧基羰基、4-甲氧基苄氧基羰基、2-硝基-4,5-二甲氧基苄氧基羰基、3,4,5-三甲氧基苄氧基羰基、1-(对联苯基)-1-甲基乙氧基羰基、α,α-二甲基-3,5-二甲氧基苄氧基羰基、二苯甲氧羰基、叔丁基氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、甲氧基羰基、烯丙氧基羰基、2,2,2,-三氯乙氧基羰基、苯氧基羰基、4-硝基苯氧基羰基、芴基-9-甲氧基羰基、环戊氧基羰基、金刚烷氧基羰基、环己氧基羰基、苯基硫基羰基等、芳基烷基诸如苄基、三苯基甲基、苄氧基甲基等和甲硅烷基诸如三甲基甲硅烷基等。优选的N-保护基是甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、叔丁基乙酰基、丙氨酰基、苯磺酰基、苄基、叔丁基氧基羰基(Boc)和苄氧基羰基(Cbz)。羟基保护基的例子包括醚，诸如四氢吡喃基、叔丁基、苄基、烯丙基等；甲硅烷基醚诸如三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、三异丙基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基等；酯诸如乙酰基、三氟乙酰基等；和碳酸酯。羟基保护基基团还包括适合于保护酚类的那些基团。
除非另外描绘或者说明，否则本文列举的结构意在包括该结构的所有异构(如对映异构的、非对映异构的和几何的(或构象的))形式；例如，每个不对称中心的R和S构型、(Z)和(E)双键异构体以及(Z)和(E)构象异构体。因此，本发明化合物的单一立体化学异构体以及对映异构的、非对映异构的和几何的(或构象的)混合物均在本发明范围之内。已画有立体化学中心(通常通过使用阴影键
Figure BDA0002641974200000121
或加粗键
Figure BDA0002641974200000122
定义)的化合物是立体化学纯的，但绝对立体化学仍未限定。这样的化合物可具有R或S构型。在已确定绝对构型的那些情形中，在绘图中手性中心标记有(R)或(S)。
除非另外说明，否则本发明化合物的所有互变异构形式均在本发明范围之内。另外，除非另外说明，否则本文描绘的结构也旨在包括差别仅在于一个或多个同位素富集的原子的存在的化合物。例如，具有本发明结构、差别在于用氘或氚替换氢或用13C-或14C-富集的碳替换碳的化合物是在本发明的范围内。这样的化合物可例如用作分析工具、生物测定中的探针或用作具有改善的治疗特性的DNA-PK抑制剂。
化合物的描述
在一个方面，本发明表征了具有式(III-E-1)或(III-E-2)的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure BDA0002641974200000131
X是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基。
Y是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基。
R3是氢、C1-4烷基或OC1-2烷基。
R1是含有1或2个氮原子的6-元杂芳族环，其中所述杂芳族环可以被0、1、2或3个取代基R2取代，所述取代基R2独立地选自卤代(halo)、CN、C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C3-C4-环烷基、OR6、C(＝O)OR6、C(＝O)NR7R6和NR4R5。
每个C1-C4-烷基和C1-C4-卤代烷基被0、1或2个OR6基团取代。
每个R6和R7独立地是H、C1-C4烷基或C1-C4-卤代烷基。
每个R4和R5独立地是H、C1-C4烷基或C(＝O)C1-C4烷基。
R4和R5与它们所连接的N原子一起形成包含0或1个额外O或N原子的杂环，其中所述杂环可以被C1-C4烷基或OR6取代。
环B选自：
Figure BDA0002641974200000132
其中W是N或CR7；且Z是O或S；其中R7是H或C1-C4烷基。
在另一个方面，R1是含有1或2个氮原子的6-元杂芳族环，其中所述杂芳族环可以被0、1或2个取代基R2取代，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR6和NR4R5。
R6是C1-C4-烷基。
每个R4和R5独立地是H、C1-C4-烷基或C(＝O)C1-C4烷基。
R4和R5与它们所连接的N原子一起形成包含0或1个额外N原子的杂环，其中所述杂环可以被C1-C4-烷基取代。
环B选自：
Figure BDA0002641974200000141
W是N或CR7；且Z是O或S；其中R7是H或C1-C4-烷基。
在一个实施方案中，所述化合物具有下式
Figure BDA0002641974200000142
在一个实施方案中，X是O。
在另一个实施方案中，X是NH。
在一个实施方案中，Y是O。
在另一个实施方案中，Y是NH。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，且R3是氢。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR2’和NR4R5。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被1个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR2’和NR4R5。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被1个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2选自C1-C4-烷基和C(＝O)NHR2’。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被1个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2选自C1-C2-烷基和C(＝O)NHC1-C2-烷基。
在另一个实施方案中，X是O，Y是NH，R3是氢且R1是被1个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2选自C1-C2-烷基和C(＝O)NHC1-C2-烷基。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR6和NR4R5；环B选自：
Figure BDA0002641974200000151
W是N或CR3；且Z是O或S；其中R3是H或C1-C4烷基。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR6和NR4R5；环B是
Figure BDA0002641974200000152
W是N或CR3；且Z是O或S；其中R3是H或C1-C4烷基。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR6和NR4R5；环B是
Figure BDA0002641974200000153
W是N；且Z是O或S。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基和C(＝O)NHR6；环B是
Figure BDA0002641974200000154
W是N；且Z是O或S。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C2-烷基和C(＝O)NH C1-C2-烷基；环B是
Figure BDA0002641974200000161
W是N；且Z是O或S。
在另一个实施方案中，所述化合物具有下式
Figure BDA0002641974200000162
在另一个实施方案中，X是NH。
在一个实施方案中，Y是O。
在另一个实施方案中，Y是NH。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，且R3是氢。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR6和NR4R5。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被1个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR6和NR4R5。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被1个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2选自C1-C4-烷基和C(＝O)NHR6。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被1个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2选自C1-C2-烷基和C(＝O)NHC1-C2-烷基。
在另一个实施方案中，X是O，Y是NH，R3是氢且R1是被1个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2选自C1-C2-烷基和C(＝O)NHC1-C2-烷基。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR2’和NR4R5；环B选自：
Figure BDA0002641974200000171
W是N或CR3；且Z是O或S；其中R3是H或C1-C4烷基。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR6和NR4R5；环B是
Figure BDA0002641974200000172
W是N或CR3；且Z是O或S；其中R3是H或C1-C4烷基。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR2’和NR4R5；环B是
Figure BDA0002641974200000173
W是N；且Z是O或S。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基和C(＝O)NHR6；环B是
Figure BDA0002641974200000174
W是N；且Z是O或S。
在另一个实施方案中，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C2-烷基和C(＝O)NH C1-C2-烷基；环B是
Figure BDA0002641974200000175
W是N；且Z是O或S。
在具有式(III-E-1)或(III-E-2)的化合物的一个实施方案中，
Figure BDA0002641974200000184
是
Figure BDA0002641974200000181
在另一个实施方案中，
Figure BDA0002641974200000182
是
Figure BDA0002641974200000183
在另一个实施方案中，本发明表征了选自表1中所列的化合物组的化合物。
在另一个实施方案中，本发明表征了选自表2中所列的化合物组的化合物。
化合物的组合物、制剂和施用
在另一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含本文所述任一式的化合物和药学上可接受的赋形剂。在另一个实施方案中，本发明提供了包含表1的化合物的药物组合物。在另一个实施方案中，该组合物另外包含另外的治疗剂。
根据另一个实施方案，本发明提供了包含本发明的化合物或其药学上可接受的衍生物以及药学上可接受的载体、辅助剂或媒介物的组合物。在一个实施方案中，本发明组合物中的化合物的量是使得能有效以可测量的程度抑制生物样品中或患者中的DNA-PK的量。在另一个实施方案中，本发明组合物中的化合物的量是使得能有效以可测量的程度抑制DNA-PK的量。在一个实施方案中，将本发明的组合物配制以供施用给需要这种组合物的患者。在另一个实施方案中，将本发明的组合物配制以供经口施用给患者。
本文中使用的术语“患者”意指动物，优选哺乳动物，最优选人。
术语“试剂”在本文中用于表示化学化合物、小分子、化学化合物的混合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物。
本文中使用的“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”或“减轻”或“改善”互换使用。这些术语表示用于获得有益或期望结果(包括但不限于治疗益处和/或预防益处)的方案。治疗益处是指对治疗中的一种或多种疾病、病症或症状的任何治疗相关的改善或作用。对于预防益处，可将组合物施用给有发展特定疾病、病症或症状的风险的受试者，或施用给报告疾病的一种或多种生理症状的受试者，即使所述疾病、病症或症状尚未表现出来。这些术语还意指对哺乳动物(例如人)的疾病的治疗，包括(a)抑制疾病，即阻止或防止其发展；(b)缓解疾病，即引起疾病状态的消退；或(c)治愈疾病。
术语“有效量”或“治疗有效量”表示足以产生有益结果或期望结果的试剂的量。治疗有效量可根据以下中的一个或多个而变化：所治疗的受试者和疾病状况、受试者的体重和年龄、疾病状况的严重程度、施用方式等，其可由本领域的普通技术人员容易地确定。该术语还适用于将提供图像以便通过本文所述的任一种成像方法进行检测的剂量。具体剂量可根据以下中的一个或多个而变化：所选择的特定试剂、要遵循的给药方案、是否与其它化合物联合施用、施用时机、待成像组织以及携带它的物理递送系统。
本文中使用的“施用”是指将DNA-PK抑制剂接触、注射、分配、递送或应用于受试者，将基因组编辑系统和/或DNA-PK抑制剂接触、注射、分配、递送或应用于细胞或受试者。在某些实施方案中，施用是使基因组编辑系统和/或DNA-PK抑制剂与细胞接触。在某些实施方案中，施用是将基因组编辑系统和/或DNA-PK抑制剂递送至细胞。在某些实施方案中，施用是将基因组编辑系统和/或DNA-PK抑制剂应用于细胞。在某些实施方案中，施用是将基因组编辑系统和/或DNA-PK抑制剂注入细胞中。施用可在体内、离体或在体外发生。向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂可以同时地或依序地进行。
如本文结合病症或疾病所用的术语“获得性的”意指在出生后产生的障碍或医学病症；与在出生时存在的先天性障碍形成对比。先天性障碍可能是获得性障碍的先兆(antecedent)。
术语“先天性的”或“遗传的”病症或疾病是在受试者的基因组中发现的遗传性障碍，其在出生时存在于受试者中。如本文所用的“基因组”包括细胞核和细胞质中的所有遗传物质，并且还包括线粒体基因组和核糖体基因组。先天性或遗传性可在受试者生命期间的任何时间表达，例如在出生时或在成年期。
术语“遗传性障碍”或“遗传性疾病”包括受试者基因组中引起或可能引起疾病的遗传性或获得性突变。
术语“多态性”或“遗传变异”意指在遗传基因座处的基因的不同形式。
还应当理解，本发明的某些化合物可以以游离形式存在以供治疗，或者在适当的情况下，作为其药学上可接受的衍生物存在。根据本发明，药学上可接受的衍生物包括、但不限于药学上可接受的前药、盐、酯、这类酯的盐或任意其它加成化合物或衍生物，其在施用给有需要的患者后，能够直接地或间接地提供本文别处描述的化合物或其代谢物或残余物。本文中使用的术语“其抑制性的活性代谢物或残余物”意指其代谢物或残余物也是DNA-PK的抑制剂。
本文中使用的术语“药学上可接受的盐”表示这样的盐：其在合理的医学判断范围内，适合用于接触人类和低等动物的组织，没有不适当的毒性、刺激、变应性应答等。
药学上可接受的盐是本领域众所周知的。例如，S.M.Berge等人在J.Pharmaceutical Sciences,66:1-19,1977(其通过引用并入本文)中详细描述了药学上可接受的盐。本发明的化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和碱的那些盐。药学上可接受的无毒的酸加成盐的例子是氨基与以下酸形成的盐：无机酸诸如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸和高氯酸，或有机酸诸如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸，或通过使用本领域所用的其它方法(诸如离子交换)。其它药学上可接受的盐包括：己二酸盐、海藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡萄糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘酸盐、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。衍生自适当碱的盐包括碱金属、碱土金属、铵和N+(C1-4烷基)4盐。本发明也预见到本文中公开的化合物的任意碱性含氮基团的季铵化。通过这种季铵化可以获得水或油可溶性的或可分散的产物。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。其它药学上可接受的盐包括，在适当时，使用抗衡离子如卤根(halide)、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、C1-8磺酸根和芳基磺酸根形成的无毒性铵、季铵和胺阳离子。
如上所述，本发明的药学上可接受的组合物还包括药学上可接受的载体、辅助剂或媒介物，本文使用的药学上可接受的载体、辅助剂或媒介物包括适合于特定预期剂型的任何或全部溶剂、稀释剂或其它液体媒介物、分散或混悬助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。在Remington:The Science and Practice ofPharmacy,第21版,2005,D.B.Troy,Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia著以及Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,J.Swarbrick和J.C.Boylan著,1988-1999,Marcel Dekker,New York(它们中的每一篇的内容通过引用并入本文)中公开了用于配制药学上可接受的组合物的各种载体及其制备的已知技术。除非任何常规的载体媒介物与本发明化合物不相容(例如由于产生任何不希望的生物学效应或在其它方面与药学上可接受的组合物的任意其它组分以有害的方式相互作用)，否则在本发明范围内预见到它的应用。
可以充当药学上可接受的载体的物质的一些例子包括但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白如人血清白蛋白、缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸或山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯(polyacrylate)、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、羊毛脂；糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，如可可脂和栓剂用蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇或聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇，和磷酸盐缓冲溶液，以及其它无毒的相容性润滑剂，如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，而且根据配制人员的判断，着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂以及芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
可以口服地、胃肠外地、通过吸入喷雾、局部地、直肠地、经鼻地、含服地、经阴道或经由植入的贮库(reservoir)施用本发明的组合物。本文中使用的术语“胃肠外”包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、眼内、肝内、病灶内、硬膜外、椎管内和颅内注射或输注技术。优选地，口服地、腹膜内地或静脉内地施用所述组合物。本发明组合物的无菌可注射形式可为水性或油性混悬剂。这些混悬剂可以按照本领域已知的技术，使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂制备。无菌注射制剂也可以是在无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或混悬剂，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可用的可接受的载体和溶剂是水、林格氏液溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常被用作溶剂或混悬介质。
为此目的，可采用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单脂或甘油二酯。脂肪酸(诸如油酸和它的甘油酯衍生物)可用于制备注射剂，天然的药学上可接受的油(诸如橄榄油或蓖麻油)也是如此，特别是其聚氧乙基化形式。这些油溶液或混悬剂还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳剂和混悬剂)中的类似分散剂。通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其它常用表面活性剂(诸如吐温类、司盘类和其它乳化剂或生物利用度促进剂)也可以用于实现制剂的目的。
可以以任何口服可接受的剂型(包括但不限于胶囊剂、片剂、水性混悬剂或溶液)来经口施用本发明的药学上可接受的组合物。在用于口服应用的片剂的情形下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。通常也加入润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于以胶囊剂形式口服施用，可用的稀释剂包括乳糖和干玉米淀粉。当口服使用需要水性混悬剂时，将活性成分与乳化剂和助悬剂组合。如果需要的话，还可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。
可替换地，可以以供直肠施用的栓剂形式施用本发明的药学上可接受的组合物。这些可以通过将所述试剂与合适的非刺激性赋形剂混合来制备，所述赋型剂在室温为固体、但是在直肠温度为液体，且因此将在直肠中熔化以释放出药物。这样的材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。
还可局部施用本发明的药学上可接受的组合物，特别是当治疗靶标包括通过局部(topically)施用可容易地达到的区域或器官时，包括眼部、皮肤或下肠道的疾病。针对这些区域或器官中的每一种，容易地制备合适的局部制剂。
用于下肠道的局部应用可以在直肠栓剂制剂(参见上面)中或在合适的灌肠剂制剂中实现。也可使用局部透皮贴剂。
对于局部应用，可将药学上可接受的组合物配制为含有悬浮或溶解于一种或多种载体中的活性组分的合适软膏剂。用于本发明化合物的表面施用的载体包括、但不限于矿物油、液体矿脂、白矿脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。可替换地，可将药学上可接受的组合物配制为含有悬浮或溶解于一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分的合适洗剂或乳膏剂。合适的载体包括、但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨酯60、十六烷基酯蜡、鲸腊硬脂醇(cetearyl alcohol)、2-辛基十二醇、苯甲醇和水。
对于眼科使用，可将药学上可接受的组合物配制为例如在等渗的、调过pH的无菌盐水或其它水溶液中的微粉化混悬剂，或优选配制为在等渗的、调过pH的无菌盐水或其它水溶液中的溶液，使用或不使用防腐剂诸如苯扎氯铵。可替换地，对于眼科使用，可将药学上可接受的组合物配制于软膏如凡士林中。本发明的药学上可接受的组合物还可以通过鼻用气雾剂或吸入施用。这样的组合物根据药物制剂领域众所周知的技术来制备，并且可采用苯甲醇或其它合适的防腐剂、吸收促进剂(以增强生物利用度)、碳氟化合物和/或其它常规增溶剂或分散剂制备成在盐水中的溶液。
最优选地，将本发明的药学上可接受的组合物配制成供口服施用。
用于口服施用的液体剂型包括、但不限于药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物以外，液体剂型可以含有本领域中通常使用的惰性稀释剂，例如，水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(具体地，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、及其混合物。除惰性稀释剂以外，口服组合物还可以包含辅助剂，诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。
根据已知技术，使用合适的分散剂或润湿剂和助悬剂，可以配制可注射制剂，例如无菌的可注射的水性或油性的混悬剂。所述无菌的可注射制剂也可以是在无毒的胃肠外地可接受的稀释剂或溶剂中的无菌的可注射的溶液、混悬剂或乳剂，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可采用的可接受的媒介物和溶剂是水、美国药典(U.S.P.)林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油通常被用作溶剂或混悬介质。为此目的，可以采用任意温和的不挥发性油(bland fixed oil)，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。另外，脂肪酸诸如油酸被用在可注射制剂的制备中。
可以将可注射制剂灭菌，例如通过穿过细菌截留滤器进行过滤，或通过掺入无菌固体组合物形式的灭菌剂，所述灭菌剂可以在使用前溶解或分散在无菌水或其它无菌的可注射的介质中。
为了延长本发明化合物的效果，常常需要减慢化合物从皮下或肌肉内注射的吸收。这可以通过使用具有差水溶性的结晶或无定形物的液体混悬剂实现。化合物的吸收速率则取决于其溶解速率，而溶解速率又可取决于晶体大小和晶体形式。可替换地，将化合物溶解或悬浮于油媒介物来实现胃肠外施用的化合物形式的延迟吸收。通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成化合物的微胶囊基质，制成可注射的贮库(depot)形式。根据化合物与聚合物之比以及所采用的特定聚合物的性质，可控制化合物释放速率。其它可生物降解聚合物的例子包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将化合物包埋(entrapping)在与身体组织相容的脂质体或微乳剂中来制备贮库型注射制剂。
用于直肠或阴道施用的组合物优选地为栓剂，其可以如下制备：混合本发明的化合物与合适的非刺激性的赋形剂或载体诸如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡，它们在环境温度为固体而在体温为液体，并因此在直肠或阴道腔内熔化和释放活性化合物。
用于口服施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒。在这样的固体剂型中，将活性化合物与至少一种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载体混合，所述赋形剂或载体是例如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸，b)粘合剂诸如羧甲纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，c)保湿剂诸如甘油，d)崩解剂诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液阻滞剂诸如石蜡，f)吸收促进剂诸如季铵化合物，g)润湿剂诸如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂诸如高岭土和皂粘土粘土，和i)润滑剂诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，及其混合物。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型也可包含缓冲剂。
使用赋形剂诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等，也可以将类似类型的固体组合物用作在软或硬填充的明胶胶囊中的填充剂。用包衣剂和壳诸如肠溶包衣和药物配制领域众所周知的其它包衣剂，可以制备片剂、糖衣丸(dragees)、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型。它们可以任选地含有遮光剂，且也可以是这样的组合物：其仅仅或优先在肠道的特定部分中任选地以延迟方式释放活性成分。可使用的包埋(embedding)组合物的例子包括聚合物质(polymeric substances)和蜡。使用赋形剂诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等，也可以将类似类型的固体组合物用作在软或硬填充的明胶胶囊中的填充剂。
所述活性化合物还可以与一种或多种如上所述的赋形剂一起形成微胶囊化形式。用包衣剂和壳诸如肠溶包衣剂、控释包衣剂和药物配制领域众所周知的其它包衣剂，可以制备片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂的固体剂型。在这种固体剂型中，活性化合物可与至少一种惰性稀释剂如蔗糖、乳糖或淀粉混合。如一般的做法，这种剂型还可包含除惰性稀释剂以外的另外物质，例如压片润滑剂和其它压片助剂如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊剂、片剂和丸剂的情况下，所述剂型也可以包含缓冲剂。它们可以任选地含有遮光剂，且也可以是这样的组合物：其仅仅或优先在肠道的特定部分中任选地以延迟方式释放活性成分。可使用的包埋组合物的例子包括聚合物质和蜡。
本发明化合物的局部或透皮施用剂型包括软膏剂、糊剂、乳膏剂、洗剂、凝胶、散剂、溶液、喷雾剂、吸入剂或贴剂。将活性组分在无菌条件下与药学上可接受的载体和任何需要的防腐剂或可能需要的缓冲剂相混合。也预见到眼用制剂、滴耳剂和滴眼剂在本发明的范围内。另外，本发明预见到使用透皮贴剂，其具有向身体提供化合物的受控递送的附加优点。可通过将化合物溶解或分配于恰当的介质中来制备这种剂型。还可以使用吸收增强剂增加所述化合物穿过皮肤的通量。通过提供控制速率的膜或通过在聚合物基质或凝胶中分散所述化合物，可以控制该速率。
优选地以施用容易和剂量均匀的剂量单位形式(dosage unit form)配制本发明的化合物。本文中使用的表述“剂量单位形式”表示适合于待治疗的患者的药剂的物理离散单元。然而，应当理解，本发明的化合物和组合物的总日用量由主治医师在合理的医学判断范围内确定。用于任何特定患者或生物体的具体有效剂量水平将取决于多种因素，所述因素包括：所治疗的病症和该病症的严重程度；使用的具体化合物的活性；所用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；所用具体化合物的施用时间、施用途径和排泄速率；治疗的持续时间；与所使用的具体化合物联合或同时使用的药物和医学领域中众所周知的类似因素。
可与载体材料组合以产生单一剂型的组合物的本发明化合物的量将根据所治疗的宿主、具体的施用模式而变化。优选地，应当配制组合物以使得可以给接受这些组合物的患者施用0.01-100mg/kg体重/天的抑制剂剂量。
根据要治疗的具体增殖性病症或癌症，通常施用来治疗或预防该病症的另外的治疗剂也可存在于本发明的组合物中。如本文中所述，通常施用来治疗或预防具体增殖性病症或癌症的另外的治疗剂被认为“适合于待治疗的疾病或病症”。下文提供了另外的治疗剂的例子。
存在于本发明组合物中的另外的治疗剂的量将不超过在包含该治疗剂作为唯一活性剂的组合物中通常施用的量。优选地，在本文公开的组合物中的另外的治疗剂的量将在包含该药剂作为唯一治疗活性剂的组合物中通常存在的量的约50％至100％的范围内。
化合物和组合物的应用
在某些实施方案中，本文提供了使细胞对诱导DNA损伤的治疗剂或疾病状态的敏感的方法，该方法包括下述步骤：使该细胞与本文中公开的一种或多种DNA-PK抑制剂诸如式(III-E-1)或(III-E-2)的那些或其药学上可接受的盐接触。
在某些实施方案中，本文提供了增强用于治疗癌症的治疗方案的方法，该方法包括下述步骤：给有此需要的个体施用有效量的本文中公开的DNA-PK抑制剂诸如式(III-E-1)或(III-E-2)的那些或其药学上可接受的盐。在一个方面，用于治疗癌症的治疗方案包括放射疗法。
本文中公开的DNA-PK抑制剂可用于其中放射疗法被指明提高这种治疗的治疗益处的情况中。另外，在癌症治疗中放射疗法常常被指明为外科手术的辅助治疗(adjuvent)。在辅助剂的背景中，放射疗法的目标是在原发性肿瘤已被控制时减少复发的风险以及增加无疾病存活。辅助性放射疗法被指明用于几种疾病，包括如下文所述的结肠癌、直肠癌、肺癌、胃食道癌和乳腺癌。
在某些实施方案中，另一种抗癌化学治疗剂与本文中公开的DNA-PK抑制剂一起用在用于治疗癌症的治疗方案中，使用或不用放射疗法。本文中公开的DNA-PK抑制剂与这样的其它药剂的组合可以增强化疗方案。例如，本文中公开的DNA-PK抑制剂可以与依托泊苷或博来霉素(已知会引起DNA链断裂的药剂)一起施用。
在某些实施方案中，进一步公开了利用本文中公开的DNA-PK抑制剂的化合物使肿瘤细胞放射致敏的方法。如本文中使用的，可使细胞“放射致敏”的DNA-PK抑制剂被定义为以治疗有效量施用给动物来增加细胞对电磁辐射的敏感性和/或促进可用电磁辐射(如X-射线)治疗的疾病的治疗的分子，优选低分子量分子。可用电磁辐射治疗的疾病包括肿瘤疾病(neoplastic diseases)、良性和恶性肿瘤以及癌细胞。
在某些实施方案中，本文还提供了治疗动物中的癌症的方法，该方法包括给该动物施用有效量的本文中公开的DNA-PK。在某些实施方案中，本文进一步提供了抑制生物系统中的癌细胞生长(包括细胞增殖、侵袭力和转移的过程)的方法。这样的方法包括将本文中公开的DNA-PK抑制剂用作癌细胞生长的抑制剂。在某些具体实施方案中，采用该方法来抑制或减少活动物如哺乳动物中的癌细胞生长、侵袭力、转移或肿瘤发病率。本文中公开的DNA-PK抑制剂可以单独使用，或与IR或一种或多种化学治疗剂的应用联合用于治疗癌症或抑制癌细胞生长。在某些实施方案中，这样的方法还可适用于测定系统，如测定癌细胞生长及其性质以及鉴定影响癌细胞生长的化合物。
肿瘤或赘生物(neoplasm)包括其中细胞的倍增是不受控制和进行性的组织细胞的生长。一些这样的生长是良性的，但其它被称为“恶性的”并且可导致生物体死亡。恶性赘生物或“癌症”与良性瘤(benign growth)的区别在于，除了展现出侵袭性的细胞增殖外，它们还可侵入周围的组织并转移。此外，恶性赘生物的特征在于，它们显示出更大程度的分化丧失(更大的“去分化”)及其相对于彼此和它们周围组织的组构(organization)。这种性质也称为“间变”。
可通过本发明治疗的赘生物还包括实体瘤，即癌和肉瘤。癌包括侵袭(侵入)周围组织并产生转移的源自上皮细胞的那些恶性赘生物。腺癌是源自腺组织或源自形成可识别的腺结构的组织的癌。另一广泛类别的癌症包括肉瘤，其为使细胞包埋在纤维状或均质物质如胚性结缔组织中的肿瘤。本文中公开的DNA-PK抑制剂还使得能治疗骨髓或淋巴系统的癌症，包括白血病、淋巴瘤和通常不作为肿瘤块存在而是分布在血管或淋巴网状系统中的其它癌症。
DNA-PK活性可与例如成人和小儿肿瘤学中的各种癌症形式以及如下癌症/肿瘤的生长相关：实体瘤/恶性肿瘤、粘液样和圆形细胞癌、局部晚期肿瘤、转移性癌症、人软组织肉瘤(包括尤因氏肉瘤)、癌转移物(包括淋巴转移物)、鳞状上皮细胞癌(尤其是头颈鳞状上皮细胞癌、食管鳞状上皮细胞癌)、口腔癌、血细胞恶性肿瘤(包括多发性骨髓瘤)、白血病(包括急性淋巴细胞性白血病、急性非淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病和毛细胞白血病)、渗出性淋巴瘤(基于体腔的淋巴瘤)、胸腺淋巴瘤、肺癌(包括小细胞癌)、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、肾上腺皮质的癌症、产生ACTH的肿瘤、非小细胞癌症、乳腺癌(包括小细胞癌和导管癌)、胃肠癌(包括胃癌、结肠癌、结肠直肠癌)、与结肠直肠瘤形成相关的息肉、胰腺癌、肝癌、泌尿系统癌症(包括膀胱癌，包括原发性浅表膀胱肿瘤、膀胱的侵袭性移行细胞癌和肌肉侵袭性膀胱癌)、前列腺癌、女性生殖道的恶性肿瘤(包括卵巢癌、原发性腹膜上皮细胞肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌和卵泡实体癌)、男性生殖道的恶性肿瘤(包括睾丸癌和阴茎癌)、肾癌(包括肾细胞癌)、脑癌(包括内源性脑肿瘤、成神经细胞瘤、星形细胞脑肿瘤、神经胶质瘤、中枢神经系统中的转移肿瘤细胞侵袭)、骨癌(包括骨瘤和骨肉瘤)、皮肤癌(包括恶性黑素瘤、人皮肤角质细胞的进行性肿瘤、鳞状细胞癌)、甲状腺癌、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、腹膜渗漏、恶性胸腔积液、间皮瘤、维尔姆斯肿瘤、胆囊癌、滋养层瘤、血管外皮细胞瘤和卡波西肉瘤。本文中也公开了增强癌症的这些及其它形式的治疗的方法。
本文还提供了抑制生物样品中的DNA-PK活性的方法，该方法包括使所述生物样品与本发明的化合物或组合物接触。本文中使用的术语“生物样品”意指在活生物体外的样品，并且包括但不限于：细胞培养物或其提取物；从哺乳动物获得的活组织检查材料或其提取物；以及血液、唾液、尿、粪便、精液、泪液或其它体液或它们的提取物。对生物样品中的激酶活性、尤其是DNA-PK活性的抑制可用于本领域技术人员已知的多种目的。这样的目的的例子包括但不限于生物样本储存和生物测定。在一个实施方案中，抑制生物样品中的DNA-PK活性的方法局限于非治疗性方法。
在某些实施方案中，本公开内容提供了用于编辑靶基因组的方法、组合物和试剂盒，例如通过修正突变。此类方法、组合物和试剂盒可通过使用DNA-PK抑制剂来提高基因组编辑效率。
基因组编辑系统可以刺激或诱导DNA断裂，例如在基因组(或靶基因组区域)中的所需基因座处的DSB。DNA裂解的形成通过易错NHEJ途径或通过无错HDR途径促使细胞酶修复断裂的位点。在NHEJ中，通过在涉及Ku70/80异源二聚体和DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)酶的一系列酶促过程中融合DNA断裂的两端来修复DNA损伤。修复机制涉及两个DNA末端的系链和比对、切除、延伸和连接(Rouet等人.；Dexheimer T.DNA repair pathways andmechanisms.见:Mathews L,Cabarcas S,Hurt E,编.DNA repair of cancer stemcells.Dordrecht:Springer；2013.第19-32页)，导致在断裂位点处形成小插入或缺失突变(插入/缺失)。引入基因的编码序列中的插入/缺失可引起过早终止密码子或移码突变，导致产生无功能的截短蛋白质。对HDR途径的机制的理解较少，其涉及一组不同的修复蛋白质，例如Rad51，其通过供体修复模板刺激链侵入以进行碱基插入或基因置换。因此，HDR允许引入外源DNA模板以在基因组内获得所需的DNA编辑结果，并且可以是用于转化疾病建模和治疗性基因组编辑以恢复基因功能的有力策略。
在这两种DNA修复途径中，NHEJ以高得多的频率发生，并且即使在神经元中也可以实现超过70％的报告效率(Swiech等人,“In vivo interrogation of gene function inthe mammalian brain using CRISPR-Cas9,”Nat Biotechnol.2015年1月；33(1):102-62014)。但是，HDR基因修正在S期和G2期期间在DNA复制完成时以非常低的频率发生，并且姊妹染色单体可用作修复模板(Heyer等人,Regulation of homologous recombinationin eukaryotes.Annual Review of Genetics 44:113-139,2010)。由于NHEJ在整个细胞周期中竞争发生，并且在S期和G2期期间优于HDR，因此经由HDR途径的靶向插入仍存在挑战并且是继续研究的焦点。
DNA蛋白激酶(DNA-PK)在各种DNA修复过程中起作用。DNA-PK通过激活非同源末端连接(NHEJ)途径参与DNA双链断裂修复。NHEJ被认为通过三个步骤进行：识别DSB，用于去除不可连接末端或末端的其它形式的损伤的DNA处理，最后是连接DNA末端。通过将Ku异源二聚体结合到不完全的DNA末端，然后将两分子的DNA依赖性蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)募集到DSB的相邻侧来进行DSB的识别；这用于保护断裂的末端，直到募集额外的加工酶。最近的数据支持这样的假设：DNA-PKcs使加工酶Artemis以及其自身磷酸化，以准备DNA末端进行额外的处理。在某些情况下，可能需要DNA聚合酶在连接步骤之前合成新的末端。DNA-PKcs的自磷酸化被认为诱导构象变化，该构象变化打开中心DNA结合腔，从DNA释放DNA-PKcs，并促进DNA末端的最终重新连接。
在某些实施方案中，本公开内容提供了增强基因编辑的方法、组合物和试剂盒，具体地讲提高经由HDR途径进行DNA断裂修复的效率，或者在基因组编辑系统中抑制或遏制经由NHEJ途径进行的DNA断裂修复(包括细胞中基于CRISPR的HDR修复)的效率。虽然不受特定理论的束缚，但据信施用给细胞的基因组编辑系统与靶基因的核酸相互作用，从而导致或引起DNA断裂；这种DNA断裂通过若干种修复途径(例如，HDR)修复，并且施用给细胞的DNA-PK抑制剂抑制、阻断或遏制NHEJ修复途径，并且可以提高或提升HDR DNA修复途径的频率或效率。
基因组编辑系统与靶基因的核酸之间的相互作用可以是至少部分基因组编辑系统与靶基因的核酸的杂交，或者基因编辑系统对靶基因的核酸的任何其它识别。在某些实施方案中，此类相互作用是碱基对之间的蛋白质-DNA相互作用或杂交。
在某些实施方案中，本公开内容提供了通过向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂来编辑细胞中的一个或多个靶基因组区域的方法。编辑可以同时或依序进行。一个或多个靶基因组区域的编辑包括细胞基因组的任何种类的遗传操纵或工程改造(engineered)。在某些实施方案中，一个或多个靶基因组区域的编辑可以包括细胞中基因组区域的插入、缺失或置换。基因组区域包含细胞中的遗传物质，例如DNA、RNA、多核苷酸和寡核苷酸。细胞中的基因组区域还包含细胞中包含的线粒体或叶绿体的基因组。
在某些实施方案中，插入、缺失或置换可以在编码或非编码基因组区域中、内含子或外显子区域中、或它们的包括其重叠或非重叠区段的任何组合中。本文中使用的“非编码区”是指不编码氨基酸序列的基因组区域。例如，非编码区包括内含子。编码区是指编码氨基酸序列的基因组区域。例如，编码区包括外显子。
在某些实施方案中，一个或多个靶基因组区域的编辑可以在细胞基因组中的任何一个或多个靶区域中发生。在某些实施方案中，一个或多个靶基因组区域的编辑可以发生在例如外显子、内含子、转录起始位点中，在启动子区域、增强子区域、沉默子区域、绝缘子区域、抗阻抑因子、翻译后调节元件、多腺苷酸化信号(例如，最小poly A)、保守区域、转录因子结合位点或它们的任何组合。
在某些实施方案中，与不向细胞施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统的条件相比，向细胞施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统导致靶向基因组编辑效率提高。在某些实施方案中，与不向细胞施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统的条件相比，或与向细胞仅施用基因组编辑系统并且不施用DNA-PK抑制剂的条件相比，提高的编辑效率为约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍或100倍。基因组编辑的效率可通过本领域已知的任何方法，例如通过确定靶向多核苷酸整合的频率的任何方法或通过测量靶向诱变的频率进行测量。靶向多核苷酸整合还可导致细胞染色质中基因组、染色体或感兴趣区域中的序列的改变或置换。靶向多核苷酸整合可导致靶向突变，包括、但不限于点突变(即，单个碱基对转化为不同碱基对)、置换(即，多个碱基对转化为不同的具有相同长度的序列)、一个或多个碱基对的插入、一个或多个碱基对的缺失以及前述序列改变的任何组合。
在某些实施方案中，编辑细胞中的一个或多个靶基因组区域的方法包括向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂。在某些实施方案中，细胞在S或G2细胞周期阶段同步化。S或G2细胞周期阶段的细胞同步化可通过本领域已知的任何方法实现。作为非限制性实例，可用于使细胞在S或G2细胞周期阶段同步化的试剂包括阿非迪霉素、羟基脲、洛伐他汀、含羞草碱(mimosine)、诺考达唑、胸苷或它们的任何组合。(参见，Lin等人.“Enhancedhomology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery,”Elife.2014年12月15日；3)。在某些实施方案中，可以在基因编辑过程中的任何时间施用用于细胞同步化的试剂。在某些实施方案中，可以在向细胞施用基因组编辑系统和/或DNA-PK抑制剂之前、期间或之后使细胞在细胞周期的S期或G2期同步化。
在某些实施方案中，通过向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂来编辑细胞中的一个或多个靶基因组区域的方法导致与不向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂的条件相比或与仅将基因编辑系统与细胞接触或施用给细胞而不施用DNA-PK抑制剂的条件相比，细胞存活率增加。
在某些实施方案中，本文提供了经由HDR途径修复一个或多个靶基因组区域中的DNA断裂的方法。向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂导致基因组的靶向区域的DNA断裂，随后至少部分地经由HDR途径修复DNA断裂。这些方法导致一个或多个靶基因组区域中HDR介导的修复(例如，HDR途径)的量增加，从而导致与不向细胞施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统的条件相比，HDR介导的修复的效率更高。在某些实施方案中，与不向细胞施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统的条件相比，或与向细胞仅施用基因组编辑系统并且不施用DNA-PK抑制剂的条件相比，HDR途径介导的DNA断裂修复的效率为约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍或100倍。HDR途径介导的修复的效率可通过本领域已知的任何方法，例如通过确定靶向多核苷酸整合的频率或通过测量靶向诱变的频率进行测量。
在某些实施方案中，本文的方法提供了通过提高HDR途径的效率来修复DNA断裂。
HDR途径可以是“典型的”或“替代的”。“HDR”(同源定向修复)是指例如在细胞中双链断裂或DNA切口的修复期间发生的特定形式的DNA修复。双链断裂的HDR通常基于核苷酸序列同源性，使用“供体”分子进行“靶”分子(例如，经历双链断裂的分子)的模板修复，并且可以导致遗传信息从供体转移到靶标。双链断裂的典型HDR通常基于BRCA2和RAD51，并且通常采用dsDNA供体分子。非典型或“替代”的HDR是由BRCA2、RAD51和/或功能相关基因阻抑的HDR机制。替代HDR可以使用ssDNA或带切口的dsDNA供体分子。参见例如WO 2014172458。
在某些实施方案中，通过向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂来经由HDR途径修复一个或多个靶基因组区域中的DNA断裂的方法导致与不向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂的条件相比或与仅向细胞施用基因编辑系统而不施用DNA-PK抑制剂的条件相比，细胞存活率增加。
在某些实施方案中，本文提供了抑制或遏制细胞的一个或多个靶基因组区域中NHEJ介导的DNA断裂修复的方法。在某些实施方案中，通过抑制或遏制NHEJ途径来进行NHEJ介导的DNA断裂修复的抑制或遏制。NHEJ途径可以是经典的(“典型的”)或替代的NHEJ途径(alt-NHEJ，或微同源介导的末端连接(MMEJ))。通过向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂，阻抑细胞中的NHEJ途径或alt-NHEJ途径。
经典的NHEJ修复途径是DNA双链断裂修复途径，其中双链断裂的末端在不具有广泛同源性的情况下连接。经典的NHEJ修复使用若干种因子，包括KU70/80异源二聚体(KU)、XRCC4、连接酶IV和DNA蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)。Alt-NHEJ是另一种用于修复双链断裂的途径。在接合断裂末端之前，Alt-NHEJ在断裂末端的比对期间使用5-25个碱基对的微同源序列。Alt-NHEJ很大程度上独立于KU70/80异源二聚体(KU)、XRCC4、连接酶IV、DNA蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)、RAD52和ERCC1。参见，Bennardo等人,“Alternative-NHEJ is aMechanistically Distinct Pathway of Mammalian Chromosome Break Repair,”PLOS Genetics,2008年6月27日。
在某些实施方案中，通过向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂来抑制或遏制NHEJ途径，从而在细胞的一个或多个靶基因组区域中抑制或遏制经由NHEJ途径进行的NHEJ介导的DNA断裂修复的方法导致与未接受基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂的细胞相比，或与细胞接受基因组编辑系统但未接收DNA-PK抑制剂的条件相比，抑制或遏制NHEJ介导的DNA断裂修复的效率提高。在某些实施方案中，与不向细胞施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统的条件相比，或与向细胞仅施用基因组编辑系统并且不施用DNA-PK抑制剂的条件相比，通过使细胞与DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统接触来抑制或遏制经由NHEJ途径进行的DNA断裂修复的效率的提高为约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍或100倍。抑制或遏制经由NHEJ途径进行的DNA断裂修复的效率可通过本领域已知的任何方法，例如通过确定靶向多核苷酸整合的频率或通过测量靶向诱变的频率进行测量。
在某些实施方案中，通过向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂来抑制或遏制NHEJ途径，从而在细胞的一个或多个靶基因组区域中抑制或遏制NHEJ介导的DNA断裂修复的方法导致与基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂不与细胞接触或施用给细胞的条件相比，或与仅基因编辑系统与细胞接触或施用给细胞而不使用DNA-PK抑制剂的条件相比，细胞存活率增加。
DNA断裂可以是双链断裂(DSB)或两个单链断裂(例如，两个DNA切口)。DSB可以是平端的或者具有5'或3'突出端，如果每个链都被切割开过远，则突出部将继续彼此退火并且以两个切口而不是一个DSB的形式存在。
在某些实施方案中，本文提供了通过向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂来修饰一种或多种基因(靶基因)和/或对应的或下游的蛋白质的表达的方法。在某些实施方案中，基因组编辑系统可以例如在细胞的靶基因的靶基因组区域中产生插入、缺失、置换、修饰或破坏，导致靶基因的经修饰的表达。在某些实施方案中，插入、缺失、置换、修饰或破坏可导致特定蛋白质或蛋白质组或下游蛋白质的靶向表达。在某些实施方案中，基因组编辑系统可以在非编码区或编码区中产生插入、缺失或置换。在某些实施方案中，基因组编辑系统可以在启动子区、增强子区和/或任何其它基因调节元件(包括外显子、内含子、转录起始位点、沉默子区、绝缘子区、抗阻抑因子、翻译后调节元件、多腺苷酸化信号(例如最小poly A)、保守区、转录因子结合位点或它们的任何组合)中产生插入、缺失、置换、修饰或破坏。在某些实施方案中，基因组编辑系统可以同时或依序地在多于一个靶区域中产生插入、缺失、置换、修饰或破坏。在某些实施方案中，向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂可以允许细胞中经靶向修饰的基因表达。这种靶向修饰的基因表达可导致特定蛋白质及其下游蛋白质的表达。
在某些实施方案中，与不向细胞施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统的条件相比，或与向细胞仅施用基因组编辑系统并且不施用DNA-PK抑制剂的条件相比，下游基因和/或蛋白质的表达增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍或10倍。
在某些实施方案中，与不向细胞施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统的条件相比，或与向细胞仅施用基因组编辑系统并且不施用DNA-PK抑制剂的条件相比，下游基因和/或蛋白质的基因表达降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
本文方法的细胞可以是任何细胞。在某些实施方案中，细胞是脊椎动物细胞。在某些实施方案中，脊椎动物细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，脊椎动物细胞是人细胞。
细胞可以是任何发育阶段的任何类型的细胞。在某些实施方案中，细胞可以是分化细胞、全能干细胞、多能干细胞、胚胎干细胞、胚胎生殖细胞、成体干细胞、前体细胞、诱导多能干细胞或它们的任何组合。分化细胞是在组织中发挥特定功能的特化细胞。全能干细胞是来自胚胎、胎儿或成人的未分化细胞，其可以分裂较长时间并且具有分化成生物体的三个胚层中任一个的任何细胞类型的能力。多能干细胞是来自胚胎、胎儿或成人的未分化细胞，其可以分裂较长时间并且具有分化成生物体的除胚胎外组织或胎盘之外的任何细胞类型的能力。胚胎干细胞是未分化的干细胞，其存在于胚胎的内细胞群中，并且具有分化成三个胚层中任一个的任何类型细胞的能力。胚胎生殖细胞是一种胚胎细胞，其可以产生生殖细胞，如精子细胞或卵细胞。成体干细胞是存在于分化组织中的未分化细胞，能够自我更新并且可以分化成其所在组织的任何细胞。前体或祖细胞是部分分化的细胞，其通常只能分化成一种细胞(例如单能细胞)。诱导的多能干细胞是一种多能干细胞，其由成体分化或部分分化的细胞生成。参见例如WO/2010/017562。
本文中使用的单数形式的“一个/种(a/an)”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确说明。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。例如，“一个或多个细胞”和“细胞”在本文中可互换使用。类似地，“一个或多个靶基因组区域”和“靶基因组区域”在本文中可互换使用。
术语“大约”和“约”在本文中可互换使用。应用于一个或多个感兴趣的值的术语“大约”或“约”是指与所述参考值类似的值。在某些实施方案中，除非另有说明或者说从上下文中显而易见(除非此数字将超过可能值的100％)，否则术语“大约”或“约”是指在任一方向(大于或小于)上落在规定参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小范围内的一系列值。
术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸(脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA))或其类似物的聚合形式。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、由连锁分析定义的一个或多个基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微型RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针和引物。多核苷酸可以包括一种或多种经修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。如果存在对核苷酸结构的修饰，则这些修饰可以在聚合物组装之前或之后实施。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可在聚合后进一步修饰，诸如与标记组分缀合。术语“ssDNA”意指单链DNA分子。术语“ssODN”意指单链寡脱氧核苷酸。
本文涉及的术语“天然存在的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。本文涉及的术语“修饰的核苷酸”包括具有经修饰的或置换的糖基等等的核苷酸。本文涉及的术语“寡核苷酸键”包括寡核苷酸键，诸如硫代磷酸酯(Phosphorothioate)、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺硫代磷酸酯、苯胺磷酸酯、氨基磷酸酯等等。如果需要，寡核苷酸可包含用于检测的标签。
术语“合成RNA”是指经工程改造的或非天然存在的RNA。
本文中使用的术语“野生型”是本领域技术人员理解的术语，意指生物体、菌株、基因或特征的典型形式，因为它存在于自然界中，区别于突变体或变体形式。
术语“非天然存在的”或“经工程改造的”可互换使用，指示人插手参与。当提及核酸分子或多肽时，术语意指核酸分子或多肽至少基本上不含在自然界中与它们天然相关的和天然存在的至少一种其它组分。
“互补性”是指核酸通过传统的Watson-Crick或其它非传统类型与另一种核酸形成氢键的能力。互补性百分比表示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如Watson-Crick碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中有5、6、7、8、9、10个为50％、60％、70％、80％、90％和100％互补)。“完全互补”意指核酸序列的所有连续残基将与第二核酸序列中相同数量的连续残基氢键结合。本文中使用的“基本上互补”是指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上互补程度为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％，或者是指两个核酸在严格条件下杂交。
本文中使用的“表达”是指多核苷酸从DNA模板转录(例如转录成mRNA或其它RNA转录物)的过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和编码的多肽可统称为“基因产物”。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可以包括在真核细胞中接合mRNA。
在本文可互换使用的术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”是指任何长度的氨基酸聚合物。该聚合物可以是直链的或支链的，它可包含经修饰的氨基酸，并且该氨基酸可被非氨基酸中断。该术语还包括经过修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操纵，例如与标记组分的缀合。本文中使用的术语“氨基酸”包括天然和/或非天然或合成的氨基酸，包括甘氨酸和D或L光学异构体，以及氨基酸类似物和模拟肽。
“病毒载体”被定义为重组产生的病毒或病毒颗粒，其包含待在体内、离体或体外递送至宿主细胞中的多核苷酸。病毒载体的例子包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体和嵌合病毒载体等。在其中基因转移由逆转录病毒载体介导的某些实施方案中，载体构建体是指包含逆转录病毒基因组或其部分的多核苷酸。
本公开内容的某些实施方案涉及包含一种或多种载体的载体系统或载体本身。载体可设计用于在原核细胞或真核细胞中表达CRISPR转录物(例如核酸转录物、蛋白质或酶)。例如，CRISPR转录物可以在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。
细胞可以是原代细胞、诱导多能干细胞(iPSC)、胚胎干细胞(hESC)、成体干细胞、祖细胞或细胞系。“原代细胞”是直接取自活组织并置于体外进行生长的细胞。原代细胞的群体倍增很少，并且在体外群体倍增具有有限的寿命。“干细胞”、“胚胎干细胞”和“诱导多能干细胞”是非特化且未分化的细胞，能够自我更新并且具有分化成具有特殊功能的不同类型细胞的潜力。“细胞系”包括衍生自一种细胞类型的细胞培养物或者可以无限增殖的一组相同类型的细胞。哺乳动物细胞系的非限制性实例可以包括CD34细胞、293细胞、HEK细胞、CHO细胞、BHK细胞、CV-1细胞、Jurkat细胞、HeLa细胞或它们的任何变体。
在某些实施方案中，载体能够使用哺乳动物表达载体驱动哺乳动物细胞中一个或多个序列的表达。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8和pMT2PC。当用于哺乳动物细胞中时，表达载体的控制功能通常由一种或多种调节元件提供。例如，常用的启动子衍生自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒、猿猴病毒40以及本文所公开的和本领域已知的其它启动子。其它启动子可以包括例如EF1启动子或EF1α启动子。其它适用于原核细胞和真核细胞的表达系统参见例如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，第2版,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,N.Y.,1989的第16章和第17章。
本文中使用的术语“标签”或“标记的”是指掺入可检测的标记物，例如通过掺入放射性标记的氨基酸，或连接至通过标记的抗生物素蛋白(例如，含有可通过光学或量热方法检测的荧光标记物或酶活性的链亲和素)检测的生物素基部分的多肽。在某些情况下，标签或标记物也可以是治疗性的。许多标记多肽和糖蛋白的方法是本领域已知的并且可以使用。用于多肽的标签的例子包括、但不限于：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光标签(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)、酶学标签(例如，辣根过氧化物酶、β(p)-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光剂、生物素基团、由第二报告基因识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二抗的结合位点、金属结合域、表位标签)。在某些实施方案中，标签通过多个长度的间隔臂连接，以减少潜在的空间位阻。本文中使用的术语“药剂或药物”是指当适当施用给患者时能够诱导所需的治疗效果的化学化合物或组合物。
本文中使用的“基本上纯的”意指对象物种(species)是存在的主要物种(即，以摩尔计丰度大于组合物中的任何其它单个物种)。在某些实施方案中，基本上纯化的级分是其中对象物种包含所有存在的大分子物种的至少约50％(以摩尔计)的组合物。
通常，基本上纯的组合物将包含超过约80％的组合物中所有存在的大分子物种。在某些实施方案中，基本上纯的组合物将包含大于约85％、90％、95％和99％的组合物中所有存在的大分子物种。在某些实施方案中，将目标物种纯化至基本上同质的(不能通过常规检测方法检测组合物中的杂质物种)，其中该组合物基本上由单个大分子物种组成。
基因组编辑系统
可使用各种类型的基因组工程系统。术语“基因组编辑系统”、“基因编辑系统”等在本文中可互换使用，并且是指编辑靶基因或其功能或表达的系统或技术。基因组编辑系统包括：至少一种内切核酸酶组分，其能够切割靶基因组区域(或靶序列)；以及至少一种基因组靶向元件，其将内切核酸酶组分带向或靶向靶基因组区域。基因组靶向元件的例子包括DNA结合结构域(例如，锌指DNA结合蛋白或TALE DNA结合结构域)、指导RNA元件(例如，CRISPR指导RNA)和指导DNA元件(例如，NgAgo指导DNA)。可编程基因组靶向元件和内切核酸酶元件通过在特定基因组位点处引入DNA断裂(例如双链断裂(DSB))来实现精确的基因组编辑。DSB随后募集内源性修复机制，以对DSB位点进行非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)，从而介导基因组编辑。“内切核酸酶组分”包括内切核酸酶或包含编码这种内切核酸酶的核苷酸序列的核酸。
术语“内切核酸酶”是指能够催化DNA或RNA分子内的核酸之间的键的水解(切割)的任何野生型酶、突变型酶、变体酶或工程酶。内切核酸酶可以识别并切割其靶基因组区域处的DNA或RNA分子。内切核酸酶的例子包括归巢内切核酸酶；限制酶，诸如FokI；嵌合锌指核酸酶(ZFN)，由工程化锌指结构域与限制酶如FokI的催化结构域融合产生；Cas酶和Cpf酶。化学内切核酸酶包括在术语“内切核酸酶”中，其中化学或肽裂解剂与核酸聚合物或识别特定靶序列的另一DNA缀合，从而将裂解活性靶向特定序列。化学内切核酸酶的例子包括合成核酸酶如邻菲咯啉的缀合物、DNA裂解分子和形成三链体的寡核苷酸(TFO)。
所谓“变体”是指通过用不同的氨基酸置换亲本蛋白质的氨基酸序列中的至少一个残基而获得的重组蛋白质。
在某些实施方案中，内切核酸酶如ZFN、TALEN和/或大范围核酸酶(meganuclease)包含裂解结构域和/或裂解半结构域。裂解结构域可以与DNA结合结构域同源或异源。例如，可使用来自一种核酸酶的锌指DNA结合结构域和裂解结构域或者来自另一种核酸酶的大范围核酸酶DNA结合结构域和裂解结构域。异源裂解结构域可以从任何内切核酸酶或核酸外切酶获得。可由其衍生裂解结构域的示例性内切核酸酶包括、但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶。参见例如WO2013/130824。已知裂解DNA的其它酶(例如，S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNase I；微球菌核酸酶；酵母HO内切核酸酶；还可参见Linn等人(编辑)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。这些酶(或其功能片段)中的一种或多种可用作裂解结构域和裂解半结构域的来源。
裂解半结构域可以衍生自如上所述的任何核酸酶或其部分，其需要二聚化以实现裂解活性。在某些实施方案中，如果融合蛋白包含裂解半结构域，则需要裂解两个融合蛋白。在某些实施方案中，可使用包含两个裂解半结构域的单一蛋白质。在某些实施方案中，两个裂解半结构域可以衍生自相同的内切核酸酶(或其功能片段)。在某些实施方案中，每个裂解半结构域可以衍生自不同的内切核酸酶(或其功能片段)。此外，优选地将两个融合蛋白的靶位点相对于彼此设置，使得这两个融合蛋白与它们各自的靶位点的结合将裂解半结构域相对于彼此以空间取向放置，这允许裂解半结构域例如通过二聚化形成功能性裂解结构域。因此，在某些实施方案中，靶位点的近边缘被5-50个核苷酸、5-8个核苷酸或15-18个核苷酸分开。应注意，任何整数个核苷酸或核苷酸对可介于两个靶位点之间(例如，2至50个核苷酸对或更多)。在某些实施方案中，裂解位点位于靶位点之间。
限制性内切核酸酶(限制酶)存在于许多物种中，并且能够与DNA(在识别位点处)进行序列特异性结合，并在结合位点处或附近裂解DNA。某些限制酶(例如，IIS型)在从识别位点移除的位点处裂解DNA，并且具有可分离的结合结构域和裂解结构域。例如，IIS型酶Fok I催化DNA的双链裂解。参见例如美国专利5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。
在某些实施方案中，内切核酸酶组分包含融合蛋白，所述融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制酶的裂解结构域(或裂解半结构域)以及可以或可以不经过工程改造的一个或多个锌指结合结构域。其裂解结构域可与结合结构域分开的示例性IIS型限制酶是FokI。该特定酶作为二聚体具有活性。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575。Fok I酶中用于这种融合蛋白的部分被认为是裂解半结构域。因此，对于使用锌指或TALE-Fok I融合进行的细胞序列的靶向双链裂解和/或靶向置换，可使用两个融合蛋白(均包含FokI裂解半结构域)重构催化活性裂解结构域。另选地，也可使用含有锌指结合结构域和两个Fok I裂解半结构域的单个多肽分子。
示例性IIS型限制酶在国际公布WO 07/014275中有所描述，该公布全文并入本文。另外的限制酶还含有可分离的结合结构域和裂解结构域，本公开内容设想了这些。参见例如Roberts等人(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420。
在某些实施方案中，裂解结构域包含最小化或防止同源二聚化的一个或多个工程化裂解半结构域(也称为二聚化结构域突变体)，如例如美国专利公开号20050064474和20060188987和WO 2013/130824所述。形成专性异源二聚体的Fok I的示例性工程化裂解半结构域包括其中第一裂解半结构域包含Fok I的490位和538位氨基酸残基处的突变且第二裂解半结构域包含氨基酸残基486和499处的突变的一对。参见例如美国专利公开号2008/0131962和2011/0201055。本文所述的工程化裂解半结构域可使用任何合适的方法制备，例如如美国专利公开号20050064474和20080131962所述，通过野生型裂解半结构域(Fok I)的定点诱变来制备。
术语“编辑”等是指任何类型的工程改造、改变、修饰或调节(在每种情况下，包括、但不限于通过基因敲除、基因标记、基因破坏、基因突变、基因插入、基因缺失、基因活化、基因沉默或基因敲入)。
本文中使用的“遗传修饰”、“基因组编辑”、“基因组修饰”、“基因修饰”和“基因编辑”是指对细胞的核苷酸的任何基因添加、缺失、敲除、敲入、标记、突变、活化、沉默、修饰和/或破坏。该上下文中的细胞可以是体外的、体内的或离体的。
“靶基因组区域”、“靶基因”、“DNA靶标”、“DNA靶序列”、“靶序列”、“靶核苷酸序列”、“靶位点”、“靶标”、“感兴趣的位点”、“识别位点”、“多核苷酸识别位点”、“识别序列”、“裂解位点”是指由基因组编辑系统识别和裂解的多核苷酸序列。这些术语是指不同的DNA位置，优选基因组位置，在该位置处DNA断裂(裂解)将由基因组编辑系统诱导。
上述编辑(包括工程改造、改变、修改和调节)可以同时地或依序地进行。可使用本领域已知的任何基因组编辑系统。在某些实施方案中，基因组编辑系统是基于大范围核酸酶的系统、基于锌指核酸酶(ZFN)的系统、基于类转录激活因子效应物的核酸酶(TALEN)系统、基于CRISPR的系统或基于NgAgo的系统。
基于大范围核酸酶、基于ZFN和基于TALEN均包含至少一个DNA结合结构域或含有编码DNA结合结构域的核酸序列的核酸，并且经由蛋白质-DNA相互作用实现靶基因组区域的特异性靶向或识别。基于CRISPR的系统包含至少一种指导RNA元件或含有编码指导RNA元件的核酸序列的核酸，并且经由与靶基因组区域的DNA的碱基配对实现靶基因组区域的特异性靶向或识别。基于NgAgo的系统包含至少一种指导DNA元件或含有编码指导DNA元件的核酸序列的核酸，并且经由与靶基因组区域的DNA的碱基配对实现靶基因组区域的特异性靶向或识别。
在某些实施方案中，基因组编辑系统是基于大范围核酸酶的系统。基于大范围核酸酶的系统采用大范围核酸酶，其是具有大(>14bp)识别位点的内切核酸酶，并且其DNA结合结构域还负责靶序列的裂解。大范围核酸酶的DNA结合结构域可具有12至45bp的双链DNA靶序列。在某些实施方案中，大范围核酸酶是二聚体酶，其中每个大范围核酸酶结构域位于单体上，或者单体酶包含位于单个多肽上的两个结构域。通过蛋白质工程不仅产生了野生型大范围核酸酶，还产生了各种大范围核酸酶变体，以覆盖大量独特的序列组合。在某些实施方案中，还可以使用具有由大范围核酸酶A的半位点和蛋白质B的半位点组成的识别位点的嵌合大范围核酸酶。这种嵌合大范围核酸酶的具体实例包括I-DmoI和I-CreI的蛋白质结构域。大范围核酸酶的例子包括来自LAGLIDADG家族的归巢内切核酸酶。
LAGLIDADG大范围核酸酶可以是I-SceI、I-ChuI、I-CreI、I-CsmI、PI-SceI、PI-TliI、PI-MtuI、I-CeuI、I-SceII、I-SceIII、HO、PI-CivI、PI-CtrI、PI-AaeI、PI-BsuI、PI-DhaI、PI-DraI、PI-MavI、PI-MchI、PI-MfuI、PI-MflI、PI-MgaI、PI-MgoI、PI-MinI、PI-MkaI、PI-MleI、PI-MmaI、PI-MshI、PI-MsmI、PI-MthI、PI-MtuI、PI-MxeI、PI-NpuI、PI-PfuI、PI-RmaI、PI-SpbI、PI-SspI、PI-FacI、PI-MjaI、PI-PhoI、PI-TagI、PI-ThyI、PI-TkoI、PI-TspI或I-MsoI；或者可以是其功能性突变体或变体，无论是同源二聚体、异源二聚体还是单体。在某些实施方案中，LAGLIDADG大范围核酸酶是I-CreI衍生物。在某些实施方案中，LAGLIDADG大范围核酸酶与天然I-CreI LAGLIDADG大范围核酸酶具有至少80％的相似性。在某些实施方案中，LAGLIDADG大范围核酸酶与天然I-CreI LAGLIDADG大范围核酸酶的残基1-152具有至少80％的相似性。在某些实施方案中，LAGLIDADG大范围核酸酶可以由在有或没有接头肽的情况下连接在一起的两种单体组成，所述两种单体与天然I-CreILAGLIDADG大范围核酸酶的残基1-152具有至少80％的相似性。
“LAGLIDADG大范围核酸酶”是指来自LAGLIDADG家族的归巢内切核酸酶，如Stoddard等人(Stoddard，2005)所定义，或者包含与所述天然归巢内切核酸酶具有至少80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更高的同一性或相似性的多肽的工程化变体。此类工程化LAGLIDADG大范围核酸酶可以衍生自单体或二聚体大范围核酸酶。当衍生自二聚体大范围核酸酶时，此类工程化LAGLIDADG大范围核酸酶可以是单链或二聚体内切核酸酶。
所谓“I-CreI”是指具有pdb登录号1g9y的序列的天然野生型I-CreI大范围核酸酶。
大范围核酸酶的DNA识别和裂解功能通常在单个结构域中错综复杂。与大范围核酸酶不同，基于ZFN的系统和基于TALEN的系统的DNA结合结构域与用于裂解功能的内切核酸酶不同。基于ZFN的系统包含：至少一种锌指蛋白或其变体，或者含有编码锌指蛋白或其变体的核苷酸序列作为其DNA结合结构域的核酸；以及内切核酸酶元件，例如锌指核酸酶(ZFN)或Fok1裂解结构域。锌指蛋白(ZFP)是非天然存在的，因为它被工程改造成与选择的靶位点结合。参见例如Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct Biol.10:411-416；美国专利号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；和美国专利公开号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061。
与天然存在的锌指蛋白相比，工程化锌指结合结构域可具有新的结合特异性。工程化方法包括、但不限于合理设计和各种类型的选择。合理设计包括例如使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单个锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一个或多个氨基酸序列相关联。参见例如美国专利6,453,242和6,534,261，通过引用整体并入本文。
各种选择方法可以与本文的方法一起使用。包括噬菌体展示和双杂交系统在内的示例性选择方法公开于美国专利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759；和6,242,568；以及WO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197和GB 2,338,237。此外，对锌指结合结构域的结合特异性的增强例如在WO 02/077227中已进行了描述。此外，如在这些和其它参考文献中所公开的那样，锌指结构域和/或多指锌指蛋白可使用任何合适的接头序列连接在一起，所述接头序列包括例如长度为5个或更多个氨基酸的接头。对于长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头序列，还可参见美国专利号6,479,626；6,903,185；和7,153,949。本文描述的蛋白质可以包括蛋白质的各个锌指之间的合适接头的任何组合。靶位点的选择；ZFP和用于设计和构建融合蛋白(和编码其的多核苷酸)的方法是本领域技术人员已知的，并且在美国专利号6,140,0815；789,538；6,453,242；6,534,261；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；WO 95/19431；WO96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970WO 01/88197；WO 02/099084；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496中进行了详细描述。
此外，如在这些和其它参考文献中所公开的那样，锌指结构域和/或多指锌指蛋白可使用任何合适的接头序列连接在一起，所述接头序列包括例如长度为5个或更多个氨基酸的接头。对于长度为6个或更多个氨基酸的示例性接头序列，还可参见美国专利号6,479,626；6,903,185；和7,153,949。本文描述的蛋白质可以包括蛋白质的各个锌指之间的合适接头的任何组合。
基于类转录激活因子效应物的核酸酶(TALEN)系统是指采用一个或多个类转录激活因子效应物(TALE)-DNA结合结构域和内切核酸酶元件如Fok1裂解结构域的基因组编辑系统。TALE-DNA结合结构域包含一个或多个TALE重复单元，每个TALE重复单元的长度为30-38(例如，31、32、33、34、35或36)个氨基酸。TALE-DNA结合结构域可采用全长TALE蛋白或其片段，或其变体。TALE-DNA结合结构域可通过接头与内切核酸酶结构域融合或连接。
术语“基于CRISPR的系统”、“基于CRISPR的基因编辑系统”、“CRISPR-基因组编辑”、“CRISPR-基因编辑”、“基于CRISPR-内切核酸酶的基因组编辑”等在本文中可互换使用，并且统称为基因组编辑系统，其包含一种或多种指导RNA元件；以及一种或多种RNA指导的内切核酸酶元件。指导RNA元件包含含有与一个或多个靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向因子RNA(targeter RNA)，或者含有编码靶向因子RNA的核苷酸序列的核酸。RNA指导的内切核酸酶元件包含通过指导RNA元件被导向或带到靶基因组区域的内切核酸酶；或者包含编码这种内切核酸酶的核苷酸序列的核酸。这种基于CRISPR的基因编辑系统的例子包括基于CRISPR的系统，即CRISPR-Cas系统或CRISPR-Cpf系统。
本文中使用的术语“指导RNA元件”、“指导RNA”、“gRNA”、“gRNA分子”和“合成指导RNA”可互换使用，并且是指包含与靶核酸序列杂交的靶向因子RNA或者含有编码靶向因子RNA的核苷酸序列的核酸的多核苷酸序列。gRNA的靶向因子RNA包含靶向结构域，该靶向结构域包含与靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列。短语“基本上互补”意指在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或更多个核苷酸的区域上互补程度为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％，或者是指两个核酸在严格条件下杂交。
指导RNA元件还可包含能够与靶向因子RNA杂交的激活因子RNA(activator RNA)或含有编码激活因子RNA的核苷酸序列的核酸。激活因子RNA和靶向因子RNA可经由接头环序列分离或融合为单个核酸，以形成单个gRNA分子。gRNA分子可包含许多结构域。例如，此类gRNA例如从5'至3'包含：靶向结构域(其与靶核酸互补)、第一互补结构域、连接结构域、第二互补结构域(与第一互补结构域互补)、近端结构域和任选的尾部结构域。参见WO2015048557。
“第一互补结构域”与第二互补结构域具有基本互补性，并且可以在至少一些生理条件下形成双链区域。
“连接结构域”用于将单分子gRNA的第一互补结构域与第二互补结构域连接。连接结构域可以共价或非共价地连接第一互补结构域和第二互补结构域。
“近端结构域”的长度可为3-25个核苷酸，或者长度可为5-20个核苷酸。近端结构域可与天然存在的近端结构域共享同源性或由其衍生。
“尾部结构域”可以不存在，或者是长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸。尾部结构域可包含彼此互补并且在至少一些生理条件下形成双链区域的序列。
指导RNA元件可以与RNA指导的内切核酸酶元件的内切核酸酶诸如Cas内切核酸酶形成复合物(“gRNA/核酸酶复合物”)。gRNA/核酸酶复合物的例子是下文关于基于CRISR的系统所述的CRISPR复合物。在某些实施方案中，CRISPR复合物包含与靶向因子RNA复合的RNA指导的内切核酸酶系统的内切核酸酶。在某些实施方案中，CRISPR复合物包含与靶向因子RNA和激活因子RNA复合的RNA指导的内切核酸酶系统的内切核酸酶。
靶向因子RNA的靶向结构域促进gRNA/核酸酶复合物特异性靶向或归巢至靶核苷酸序列。在某些实施方案中，靶向结构域可为10-30bp，诸如15-25bp、18-22bp或20bp。
用于设计gRNA的方法是本领域已知的，包括用于选择、设计和验证靶结构域的方法。参见例如WO2015048577,Mali等人,2013 SCIENCE 339(6121):823-826；Hsu等人,2013NATBIOTECHNOL,31(9):827-32；Fu等人,2014NATBTOTECHNOL,doi:10.1038/nbt.2808.PubMed PMID:24463574；Heigwer等人,2014NAT方法11(2):122-3.doi:l0.1038/nmeth.2812.PubMed PMID:24481216；Bae等人,2014BIOTNFORMATICS PubMedPMID:24463181；Xiao A等人,2014BIOINFORMATICS Pub Med PMID:24389662。
在某些实施方案中，可使用RNA指导的内切核酸酶，诸如Cas酶或蛋白(例如，II型Cas9蛋白)或者Cpf酶或蛋白(例如，Cpf1蛋白)。在某些实施方案中，也可使用这种Cas或Cpf酶或蛋白的修饰形式。
在某些实施方案中，基于CRISPR的系统是CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统包含：(a)至少一种指导RNA元件或含有编码指导RNA元件的核苷酸序列的核酸，该指导RNA元件包含靶向因子RNA和激活因子RNA，所述靶向因子RNA含有与一个或多个靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列，所述激活因子RNA含有能够与靶向因子RNA杂交的核苷酸序列；以及(b)包含Cas蛋白的Cas蛋白元件或包含编码Cas蛋白的核苷酸序列的核酸。靶向因子RNA和激活因子RNA可以分开或融合在一起以形成单个RNA。
在某些实施方案中，基于CRISPR的系统包括1类CRISPR和/或2类CRISPR系统。1类系统采用若干种Cas蛋白以及作为靶向因子RNA的CRISPR RNA(crRNA)，以构建功能性内切核酸酶。2类CRISPR系统采用单个Cas蛋白和作为靶向因子RNA的crRNA。2类CRISPR系统(包括基于II型Cas9的系统)包含单个Cas蛋白而不是1类系统采用的多亚基复合物来介导裂解。基于CRISPR的系统还包括II类V型CRISPR系统，该系统使用Cpf1蛋白和作为靶向因子RNA的crRNA。
Cas蛋白是CRISPR相关(Cas)双链核酸酶。在某些实施方案中，CRISPR-Cas系统包含Cas9蛋白。在某些实施方案中，Cas9蛋白是SaCas9、SpCas9、SpCas9n、Cas9-HF、Cas9-H840A、FokI-dCas9或D10A切口酶。术语“Cas蛋白”诸如Cas9蛋白包括野生型Cas蛋白或其功能衍生物(例如具有核酸酶活性的野生型Cas蛋白的截短形式或变体)。
在某些实施方案中，可使用来自除酿脓链球菌(S.pyogenes)和嗜热链球菌(S.thermophiles)之外的菌种(species)的Cas9蛋白。可获得并在本文中使用的另外的Cas9蛋白菌种包括：燕麦食酸菌(Acidovorax avenae)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、放线菌属的种(Actinomyces sp.)、cycliphilus denitrificans、少食氨基单胞菌(Aminomonas paucivorans)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)；史氏芽孢杆菌(Bacillus smithii)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、拟杆菌属的种(Bacteroides sp.)、Blastopirellula marina、慢生根瘤菌属的种(Bradyrhizobium sp.)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)、结肠弯曲菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、海鸥弯曲菌(Campylobacter lari)、Candidatus Puniceispirillum、解纤维梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfingens)、拥挤棒状杆菌(Corynebacterium accolens)、细长棒状杆菌(Corynebacterium dolichum)、马氏棒状杆菌(Corynebacterium matruchotii)、恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(Dinoroseobactershibae)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、γ变形菌(gamma proteobacterium)、重氮营养葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、Haemoplzilus parainfluenzae、生痰嗜血杆菌(Haemophilus sputorum)、加拿大螺杆菌(Helicobacter canadensis)、同性恋螺杆菌(Helicohacter cinaedi)、鼬鼠螺杆菌(Helicobacter mustelae)、营养泥杆菌(llyobacter polytropus)、金格氏杆菌(Kingella kingae)、卷曲乳杆菌(lactobacilluscrispatus)、伊氏李斯特菌(listeria ivanovii)、单核细胞增多性李斯特菌(listeriamonocytogenes)、李斯特氏菌科菌(listeriaceae bacterium)、甲基孢囊菌属的种(Methylocystis sp.)、发孢甲基弯曲菌(Methylosinus trichosporium)、羞怯动弯杆菌(Mobiluncus mulieris)、杆状奈瑟氏菌(Neisseria bacilliformis)、灰色奈瑟氏菌(Neisseria cinerea)、浅黄奈瑟氏菌(Neisseria flavescens)、乳糖奈瑟氏菌(Neisserialactamica)、奈瑟氏菌属的种(Neisseria sp.)、沃氏奈瑟氏菌(Neisseria wadsworthii)、亚硝化单胞菌属的种(Nitrosomonas sp.)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)、多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)、Phascolarctobacteriumsuccinatutells、蒲桃雷尔氏菌(Ralstonia syzygii)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、小红卵菌属的种(Rhodovulum sp.)、米氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)、鞘氨醇单孢菌属的种(Sphingomonas sp.)、Sporolactobacillus vineae、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、链球菌属的种(Streptococcus sp.)、罕见小球菌属的种(Subdoligranulum sp.)、运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)、密螺旋体属的种(Treponema sp.)或艾森虹蝴肾杆菌(Verminephrobacter eiseniae)。
在某些实施方案中，基于CRISPR的系统的一种或多种元件衍生自I型、II型或III型CRISPR系统。
在某些实施方案中，基于CRISPR的系统的一种或多种元件衍生自包含内源CRISPR系统的特定生物体，诸如酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、普雷沃菌属的种(Prevotella sp.)、氨基酸球菌属的种(Acidaminococcus sp.)和毛螺菌属的种(Lachnospiraceae sp)。通常，基于CRISPR的系统通过促进在靶基因组区域或靶序列(在内源CRISPR系统的上下文中也称为原型间隔序列(photospacer))的位点处形成CRISPR复合物的元件来表征。在形成CRISPR复合物的上下文中，“靶序列”是指指导序列被设计成与其具有基本互补性的序列，其中靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。不一定需要完全互补，只要有足够的互补性引起杂交并促进CRISPR复合物的形成即可。靶序列可包含任何多核苷酸，诸如DNA或RNA多核苷酸。在某些实施方案中，靶序列位于细胞的细胞核或细胞质中。在某些实施方案中，靶序列可以在真核细胞的细胞器诸如线粒体或叶绿体内。
可用于重组到包含靶序列的靶向基因座中的序列或模板被称为“编辑模板”或“编辑多核苷酸”或“编辑序列”。外源模板多核苷酸可被称为编辑模板或供体模板。在某些实施方案中，可以使用来自合成或生物学起源的单链DNA和双链DNA。作为非限制性例子,合适的编辑模板包括ssODN、dsODN、PCR产物、质粒和病毒，包括AAV、腺病毒、逆转录病毒、慢病毒等。另外的编辑模板也是可行的。在某些实施方案中，重组是同源重组。
在某些实施方案中，基于CRISPR的系统是CRISPR-Cas9系统。CRISPR-Cas9系统的靶向因子RNA包含CRISPR靶向因子RNA(crRNA)，并且CRISPR-Cas 9系统的激活因子RNA包含反式激活CRISPR RNA(tracRNA)。CRISPR-Cas9系统的Cas蛋白元件采用Cas9蛋白。crRNA和tracrRNA可以分开或经由接头环序列组合成单个RNA构建体。这种组合的RNA构建体被称为单指导RNA(sgRNA；或指导RNA)。
关于CRISPR-Cas系统的一般信息、其组分和这些组分的递送(包括方法、材料、递送媒介物、载体、颗粒、AAV及其制备和使用，包括关于量和配制)，可见于：美国专利号8,999,641,8,993,233,8,945,839,8,932,814,8,906,616,8,895,308,8,889,418,8,889,356,8,871,445,8,865,406,8,795,965,8,771,945和8,697,359；美国专利公开US 2014-0310830,US 2014-0287938 A1,US 2014-0273234 A1,US2014-0273232 A1,US 2014-0273231,US 2014-0256046 A1,US 2014-0248702 A1,US 2014-0242700 A1,US 2014-0242699 A1,US 2014-0242664 A1,US 2014-0234972 A1,US 2014-0227787 A1,US 2014-0189896 A1,US 2014-0186958,US 2014-0186919 A1,US 2014-0186843 A1,US 2014-0179770 A1和US 2014-0179006 A1,US 2014-0170753；欧洲专利EP 2 784 162 B1和EP 2771 468 B1；欧洲专利申请EP 2 771 468(EP13818570.7),EP 2 764 103(EP13824232.6),和EP 2 784 162(EP14170383.5)；和PCT专利公开WO 2014/093661,WO 2014/093694,WO2014/093595,WO 2014/093718,WO 2014/093709,WO 2014/093622,WO 2014/093635,WO2014/093655,WO 2014/093712,WO2014/093701,WO2014/018423,WO 2014/204723,WO2014/204724,WO 2014/204725,WO 2014/204726,WO 2014/204727,WO 2014/204728,WO2014/204729,和WO2016/028682。
在某些实施方案中，基于CRISPR的系统是CRISPR-Cpf系统。“CRISPR-Cpf系统”包含：(a)至少一种指导RNA元件或含有编码指导RNA元件的核苷酸序列的核酸，该指导RNA包含靶向因子RNA，所述靶向因子RNA具有与靶核酸的基因座处的核苷酸序列互补的核苷酸序列；以及(b)Cpf蛋白元件或含有编码Cpf蛋白元件的核苷酸序列的核酸。
Cpf蛋白元件的例子包括Cpf1核酸酶，诸如弗朗西斯氏菌属(Francisella)Cpf1(FnCpf1)及其任何变体。参见例如Zetsche等人，“Cpf1 is a single RNA-guidedendonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system,”Cell,163(3):第759-71页；以及Fonfara等人，“The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processesprecursor CRISPR RNA,”Nature 532(7600):第517-21页。Cpf1的优选PAM是5’-TTN，在基因组位置和GC含量方面不同于Cas9(3’-NGG)。CRISPR-Cpf系统可能不采用激活因子RNA(tracrRNA)。Cpf1及其指导RNA通常小于它们的SpCas9对应物。Cpf1基因座包含混合的α/β结构域、后接螺旋区的RuvC-I、RuvC-II和锌指状结构域。Cpf1蛋白具有RuvC样内切核酸酶结构域，类似于Cas9的RuvC结构域。此外，Cpf1不具有HNH内切核酸酶结构域，并且Cpf1的N末端不具有Cas9的α-螺旋识别叶。Cpf1基因座编码更类似于I型和III型而非II型系统的Cas1、Cas2和Cas4蛋白。Cpf1家族蛋白可见于许多细菌菌种中。
不受特定理论的束缚，CRISPR-Cpf系统采用Cpf1-crRNA复合物，与Cas9靶向的富含G的PAM相比，其通过识别原型间隔序列相邻基序5'-YTN-3’(其中"Y"为嘧啶，"N"为任何核碱基)或5'-TTN-3来裂解靶DNA或RNA。识别PAM后，Cpf1引入了具有4或5个核苷酸突出端的粘性末端样DNA双链断裂。
在某些实施方案中，基因组编辑系统是基于NgAgo的系统。基于NgAgo的系统包含至少一种指导DNA元件或含有编码指导DNA元件的核酸序列的核酸；以及DNA指导的内切核酸酶。基于NgAgo的系统采用DNA作为指导元件。其作用原理类似于CRISPR-Cas9技术，但其指导元件是CRISPR-Cas9技术中的一段指导DNA(dDNA)而非gRNA。DNA指导的内切核酸酶的例子是来自格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)的Argonaute内切核酸酶(NgAgo)。参见例如Feng Gao等人.“DNA-guided genome editing using theNatronobacterium gregoryi Argonaute,”Nature Biotechnology,(2016):doi:10.1038/nbt.3547。
所谓“接头”、“肽接头”或“肽间隔物”旨在表示允许融合蛋白中不同单体连接并且采用所述融合蛋白活性的正确构象的肽序列，它不会改变任一种单体的活性。肽接头可具有作为非限制性指示范围的1、2、3、4、5、10、15、20、30、40至50个氨基酸或该范围内的任何中间值的各种大小。
用于提高基因组编辑效率的DNA-PK抑制剂
通过向细胞施用本文所述的一种或多种化合物(例如，DNA-PK抑制剂)和基因组编辑系统，可以提高靶向基因组编辑效率。适合使用的基因组编辑系统包括例如基于大范围核酸酶的系统、基于锌指核酸酶(ZFN)的系统、基于类转录激活因子效应物的核酸酶(TALEN)系统、基于CRISPR的系统或基于NgAgo的系统。本公开内容的方法、组合物和试剂盒提供了用于提高基因组编辑效率的DNA-PK抑制剂和/或基因组编辑系统。在某些实施方案中，在向细胞施用DNA-PK抑制剂之后，HDR基因组编辑效率得到提高。
在某些实施方案中，基因组编辑系统是基于CRISPR的基因组编辑系统。基于CRISPR的基因组编辑系统可以是CRISPR-Cas系统或其变体。CRISPR-Cas系统可以使用任何Cas内切核酸酶，诸如Cas9内切核酸酶及其变体。Cas9内切核酸酶的例子包括Cas9内切核酸酶或其变体，诸如SaCas9、SpCas9、SpCas9n、Cas9-HF、Cas9-H840A、FokI-dCas9或CasD10A切口酶。Cas内切核酸酶可以是野生型、工程化的或切口酶突变体，或其任何变体。
在某些实施方案中，基于CRISPR的基因组编辑系统包括CRISPR序列、反式激活cr(tracr)序列、指导序列和Cas内切核酸酶或者它们的任何组合。
在某些实施方案中，基于CRISPR的基因组编辑系统包括含有CRISPR序列的RNA(crRNA)、含有反式激活cr(tracr)序列的RNA(tracrRNA)和Cas内切核酸酶或者它们的任何组合。
在某些实施方案中，基于CRISPR的基因组编辑系统包括CRISPR序列、指导序列和Cas内切核酸酶或Cpf内切核酸酶或者它们的任何组合。
在某些实施方案中，基于CRISPR的基因组编辑系统是CRISPR-Cpf系统。Cpf核酸酶是2类CRISPR-Cas系统内切核酸酶。Cpf是单个RNA指导的内切核酸酶。Cpf核酸酶可以是野生型、工程化的或切口酶突变体，或其任何变体。参见例如Zetsche等人，“CPF1is a singleRNA-guided endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System,”Cell,163(3):759-71。在某些实施方案中，Cpf核酸酶是Cpf 1内切核酸酶。
在某些实施方案中，基因组编辑系统是基于大范围核酸酶的系统。基于大范围核酸酶的基因组编辑使用识别大DNA靶位点(例如，通常约＞12bp)的序列特异性内切核酸酶。参见例如U.S.9,365,964。大范围核酸酶可以裂解独特的染色体序列，而不影响总体基因组完整性。在某些实施方案中，大范围核酸酶可以是归巢内切核酸酶。在某些实施方案中，大范围核酸酶可以是内含子内切核酸酶或内含肽内切核酸酶。归巢内切核酸酶可以属于LAGLIDADG家族。大范围核酸酶可以是野生型、工程化的或切口酶突变体。
在某些实施方案中，基因编辑系统是基于锌指核酸酶(ZFN)的系统。ZFN是基于锌指DNA结合结构域与DNA裂解结构域之间的融合而工程化的人工限制酶。参见例如U.S.9,145,565。
在某些实施方案中，基因编辑系统是基于类转录激活因子效应物的核酸酶(TALEN)。TALEN是工程化限制酶，其通过TAL效应物DNA结合结构域与DNA裂解结构域的融合而制备。参见例如U.S.9,181,535。
在某些实施方案中，基因编辑系统是基于Argonaute的系统。基于Argonaute的基因编辑系统包括Argonaute衍生的内切核酸酶和5'磷酸化ssDNA。在某些实施方案中，磷酸化ssDNA的长度可为10-40个核苷酸、15-30个核苷酸或18-30个核苷酸(例如，约24个核苷酸)。在某些实施方案中，Argonaute内切核酸酶可以是任何内切核酸酶。在某些实施方案中，Argonaute内切核酸酶衍生自嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)(TtAgo)、焦酚火球菌(Pyrococcus furiosus)(PfAgo)或格氏嗜盐碱杆菌(NgAgo)。在某些实施方案中，格氏嗜盐碱杆菌(NgAgo)是菌株2(即格氏嗜盐碱杆菌SP2)。在某些实施方案中，Argonaute内切核酸酶是NgAgo。参见例如Gao等人，“DNA-guided genome editing using theNatronobacterium gregoryi Argonaute,”Nature Biotechnology，2016年5月。
DNA-PK抑制剂可以是任何DNA-PK抑制剂。DNA-PK抑制剂可以是引起DNA-PK抑制的任何化合物或物质。DNA-PK抑制剂可以是化合物、小分子、抗体或核苷酸序列。在某些实施方案中，DNA-PK抑制剂是由式(III-E-1)或(III-E-2)表示的化合物。
在某些实施方案中，本公开内容提供了一种编辑一个或多个靶基因组区域的方法，该方法包括向具有一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用基因组编辑系统和由式(III-E-1)或(III-E-2)表示的化合物：
Figure BDA0002641974200000591
其中：
X是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基；
Y是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基；
R3是氢、C1-4烷基或OC1-2烷基；
R1是含有1或2个氮原子的6-元杂芳族环，其中所述杂芳族环可以被0、1或2个取代基R2取代，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR2’和NR4R5；其中
R2’是C1-C4烷基，
每个R4和R5独立地是H、C1-C4烷基或C(＝O)C1-C4烷基；或
R4和R5与它们所连接的N原子一起形成包含0或1个额外N原子的杂环，其中所述杂环可以被C1-C4烷基取代；且
环B选自：
Figure BDA0002641974200000592
其中W是N或CR3；且Z是O或S；其中R3是H或C1-C4烷基。
在某些实施方案中，本公开内容提供了一种编辑一个或多个靶基因组区域的方法，该方法包括向具有一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用基因组编辑系统和由式(III-E-1)或(III-E-2)表示的化合物或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，本公开内容也提供了一种经由同源性定向修复(HDR)途径修复一个或多个靶基因组区域中的DNA断裂的方法，该方法包括向具有一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用基因组编辑系统和由式(III-E-1)或(III-E-2)表示的化合物或其药学上可接受的盐。
所述基因组编辑系统与靶基因组区域的核酸相互作用，导致DNA断裂，且其中所述DNA断裂至少部分地经由HDR途径修复。
在某些实施方案中，本公开内容也提供了一种抑制或遏制经由NHEJ途径对一个或多个靶基因组区域中的DNA断裂的修复的方法，该方法包括向具有一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用基因组编辑系统和由式(III-E-1)或(III-E-2)表示的化合物或其药学上可接受的盐。
所述基因组编辑系统与一个或多个靶基因组区域的核酸相互作用，导致DNA断裂，并且其中经由NHEJ途径的DNA断裂的修复被抑制或遏制。
在某些实施方案中，本公开内容也提供了一种修饰一个或多个基因或蛋白的表达的方法，该方法包括向包含一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用基因组编辑系统和由式(III-E-1)或(III-E-2)表示的化合物或其药学上可接受的盐。
所述基因组编辑系统与靶基因的一个或多个靶基因组区域的核酸相互作用，导致编辑所述一个或多个靶基因组区域，并且其中所述编辑修饰与靶基因有关的下游基因和/或蛋白的表达。
在某些实施方案中，所述DNA断裂包括DNA双链断裂(DSB)。
在某些实施方案中，与在其它方面相同但没有所述化合物的情况下的一个或多个细胞相比，经由HDR途径对一个或多个细胞中的靶基因组区域处的DNA断裂的修复的效率增加。
在某些实施方案中，与在其它方面相同但没有所述化合物的情况下的一个或多个细胞相比，抑制或遏制经由NHEJ途径对一个或多个细胞中的靶基因组区域处的DNA断裂的修复的效率增加。
在某些实施方案中，与在其它方面相同但没有所述化合物的情况下的一个或多个细胞相比，所述效率增加了至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍或100倍。
在某些实施方案中，通过靶向多核苷酸整合的频率测量效率。在某些实施方案中，通过靶向诱变的频率测量效率。在某些实施方案中，靶向诱变包括点突变、缺失和/或插入。
在某些实施方案中，与施用前一个或多个细胞中的基线表达水平相比，与靶基因有关的下游基因和/或蛋白的表达增加。例如，与施用前一个或多个细胞中的基线表达水平相比，所述表达增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍或10倍。
在某些实施方案中，与施用前一个或多个细胞中的基线表达水平相比，与靶基因有关的下游基因和/或蛋白的表达减少。例如，与施用前一个或多个细胞中的基线表达水平相比，所述基因表达减少了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
在某些实施方案中，在一个或多个细胞中基本上消除了与靶基因有关的下游基因和/或蛋白的表达。
在某些实施方案中，细胞在S或G2细胞周期阶段同步化。
在某些实施方案中，与未施用或未接触所述化合物的一个或多个细胞相比，施用或接触所述化合物的一个或多个细胞具有增加的存活率。
在某些实施方案中，将基因组编辑系统和化合物同时施用进一个或多个细胞中。在某些实施方案中，将基因组编辑系统和化合物依序施用进一个或多个细胞中。在某些实施方案中，将基因组编辑系统在化合物之前施用进一个或多个细胞中。在某些实施方案中，将化合物在基因组编辑系统之前施用进一个或多个细胞中。
在某些实施方案中，一个或多个细胞是培养的细胞。在某些实施方案中，一个或多个细胞是生物体内的体内细胞。在某些实施方案中，一个或多个细胞是来自生物体的离体细胞。
在某些实施方案中，生物体是哺乳动物。在某些实施方案中，生物体是人。
在某些实施方案中，基因组编辑系统和化合物经由相同途径施用。在某些实施方案中，基因组编辑系统和化合物经由不同途径施用。在某些实施方案中，静脉内施用基因组编辑系统，并且口服施用化合物。
在某些实施方案中，基因组编辑系统选自基于大范围核酸酶的系统、基于锌指核酸酶(ZFN)的系统、基于类转录激活因子效应物的核酸酶(TALEN)系统、基于CRISPR的系统或基于NgAgo的系统。
在某些实施方案中，所述基因组编辑系统是基于CRISPR的系统。在某些实施方案中，所述基于CRISPR的系统是CRISPR-Cas系统或CRISPR-Cpf系统。
在某些实施方案中，所述基于CRISPR的系统是CRISPR-Cas系统且其中所述CRISPR-Cas系统包括：(a)至少一种指导RNA元件，其包含：(i)含有与一个或多个靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向因子RNA，或含有编码靶向因子RNA的核苷酸序列的核酸；(ii)以及含有能够与靶向因子RNA杂交的核苷酸序列的激活因子RNA，或含有编码激活因子RNA的核苷酸序列的核酸；以及(b)包含Cas蛋白的Cas蛋白元件或包含编码Cas蛋白的核苷酸序列的核酸。
在某些实施方案中，所述靶向因子RNA和激活因子RNA融合为单个分子。
在某些实施方案中，所述Cas蛋白是II型Cas9蛋白。在某些实施方案中，所述Cas9蛋白是SaCas9、SpCas9、SpCas9n、Cas9-HF、Cas9-H840A、FokI-dCas9或D10A切口酶或它们的任意组合。
在某些实施方案中，所述基于CRISPR的系统是CRISPR-Cpf系统且所述CRISPR-Cpf系统包括：(a)至少一种指导RNA元件或包含编码所述指导RNA元件的核苷酸序列的核酸，所述指导RNA包含靶向因子RNA，所述靶向因子RNA含有与一个或多个靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列；以及(b)Cpf蛋白元件，其包含Cpf蛋白或含有编码Cpf蛋白的核苷酸序列的核酸。
在某些实施方案中，所述基因组编辑系统由一种或多种载体递送。
在某些实施方案中，所述一种或多种载体选自病毒载体、质粒或ssDNA。
在某些实施方案中，所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
在某些实施方案中，所述基因组编辑系统通过合成RNA递送。
在某些实施方案中，所述基因组编辑系统通过纳米制剂递送。
在某些实施方案中，提供了用于编辑一个或多个靶基因组区域的试剂盒或组合物。在某些实施方案中，所述试剂盒或组合物包括基因组编辑系统；和由式(III-E-1)或(III-E-2)表示的化合物或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，所述试剂盒或组合物的基因组编辑系统是基于大范围核酸酶的系统、基于锌指核酸酶(ZFN)的系统、基于类转录激活因子效应物的核酸酶(TALEN)系统、基于CRISPR的系统或基于NgAgo的系统。在某些实施方案中，所述试剂盒或组合物的基因组编辑系统是基于CRISPR的系统。在某些实施方案中，所述试剂盒或组合物的基于CRISPR的系统是CRISPR-Cas系统或CRISPR-Cpf系统。
在某些实施方案中，所述试剂盒或组合物的基于CRISPR的系统是CRISPR-Cas系统且其中所述CRISPR-Cas系统包括：(a)至少一种指导RNA元件，其包含：(i)含有与一个或多个靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向因子RNA，或含有编码靶向因子RNA的核苷酸序列的核酸；(ii)以及含有能够与靶向因子RNA杂交的核苷酸序列的激活因子RNA，或含有编码激活因子RNA的核苷酸序列的核酸；以及(b)包含Cas蛋白的Cas蛋白元件或包含编码Cas蛋白的核苷酸序列的核酸。
在某些实施方案中，所述试剂盒或组合物的Cas蛋白是II型Cas9蛋白。在某些实施方案中，所述试剂盒或组合物的Cas9蛋白是SaCas9、SpCas9、SpCas9n、Cas9-HF、Cas9-H840A、FokI-dCas9或D10A切口酶或它们的任意组合。
在某些实施方案中，所述试剂盒或组合物的基于CRISPR的系统是CRISPR-Cpf系统，且其中所述CRISPR-Cpf系统包括：(a)含有与一个或多个靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向因子RNA，或含有编码靶向因子RNA的核苷酸序列的核酸；以及(b)Cpf蛋白元件，其包含Cpf蛋白或含有编码Cpf蛋白的核苷酸序列的核酸。
在某些实施方案中，所述试剂盒或组合物的基因组编辑系统被包含或包装在一种或多种载体中。在某些实施方案中，所述一种或多种载体选自病毒载体、质粒或ssDNA。在某些实施方案中，所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
在某些实施方案中，与不向细胞施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统的条件相比，或与向细胞仅施用基因组编辑系统并且不施用DNA-PK抑制剂的条件相比，提高的基因组编辑效率为约1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍或100倍。
DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统、其试剂盒及组合物的应用
其中特定基因组区域被精确改变的基因组编辑具有很大的治疗潜力。
在某些实施方案中，本文提供了用于编辑一个或多个靶基因组区域的方法，用于经由HDR途径修复一个或多个靶基因组区域中的DNA断裂的方法，用于抑制或遏制一个或多个靶基因组中NHEJ介导的DNA断裂修复的方法，以及通过向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂来修饰一种或多种基因或蛋白质的表达的方法。
在某些实施方案中，本文提供了修饰一种或多种基因或蛋白质的表达的方法，该方法包括向包含一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用本文描述的基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂，其中所述基因组编辑系统与靶基因的一个或多个靶基因组区域的核酸相互作用，导致编辑所述一个或多个靶基因组区域，并且其中所述编辑修饰与靶基因有关的下游基因和/或蛋白的表达。
基因组编辑系统可以是可编辑细胞中的靶基因组区域的任何基因组编辑系统。示例性基因组编辑系统在上文进行了详细描述且可以包括例如基于大范围核酸酶的系统、基于锌指核酸酶(ZFN)的系统、基于类转录激活因子效应物的核酸酶(TALEN)系统、基于CRISPR的系统或基于NgAgo的系统。
一个或多个靶基因组区域的编辑的编辑包括细胞基因组的任何种类的遗传操纵或工程改造。一个或多个靶基因组区域的编辑可以包括由一种或多种内切核酸酶进行的细胞中基因组区域的插入、缺失或替换。基因组区域包含细胞中的遗传物质，例如DNA、RNA、多核苷酸和寡核苷酸。细胞中的基因组区域还包含细胞中包含的线粒体或叶绿体的基因组。
在某些实施方案中，本文提供了治疗患有需要编辑受试者细胞中的一个或多个靶基因组区域的疾病或病症的受试者的方法，所述方法包括向一个或多个细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂。
在某些实施方案中，本文提供的方法用于修饰途径中的基因、RNA分子、蛋白质、蛋白质组或下游蛋白质的表达。这种修饰可用于治疗获得性的或遗传性的或由于衰老过程引起的疾病、功能障碍、异常的生理稳态。本文中使用的术语“修饰”包括调节、增强、减少、增加、插入、缺失、敲除、敲入等。
本领域的技术人员应当理解，获得性的或遗传性的或以其它方式获得的疾病涉及包括参与基因或蛋白质功能在内的稳态机制的失调。为此，技术人员可以使用本文提供的方法来调节、修饰、增强、减少或提供受试者中的其它方面的基因功能。
修饰细胞中基因的表达和随后的蛋白质表达可通过本文提供的方法来实现，例如通过在外显子、内含子、转录起始位点、启动子区域、增强子区域、沉默子区域、绝缘子区域、抗阻抑因子、翻译后调节元件、多腺苷酸化信号(例如最小poly A)、保守区域、转录因子结合位点或它们的任何组合的任一种中特异性编辑(例如，置换、插入或缺失，它们的任何组合)核酸序列来实现。
在某些实施方案中，本文提供的方法、试剂盒和组合物用于治疗患有癌症的受试者。治疗患有癌症或癌症相关病症的受试者的方法包括向受试者的细胞施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统。DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统的施用可以是体内的或离体的。
癌症可以是任何类型的癌症。癌症包括实体瘤，诸如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、睾丸癌、头颈癌、胰腺癌、脑癌、黑素瘤和其它组织器官肿瘤，以及血细胞癌，诸如淋巴瘤和白血病，包括急性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、T细胞淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤。癌症可以包括黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病，以及胰腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、垂体癌、肾癌、胃癌、食道癌和直肠癌。
在某些实施方案中，本文提供的方法、试剂盒和组合物用于治疗患有以下癌症中的任一种或多种的受试者：急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、附件癌、星形细胞瘤、儿童小脑或大脑基底细胞癌、胆管癌、肝外(见胆管癌)、膀胱癌、骨肿瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑癌、小脑星形细胞瘤脑肿瘤、大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤脑肿瘤、室管膜瘤脑肿瘤、成神经管细胞瘤脑肿瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤脑肿瘤、视觉传导通路和下丘脑神经胶质瘤脑肿瘤、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特氏淋巴瘤、类癌肿瘤、儿童类癌肿瘤、胃肠道原发灶不明癌、原发性中枢神经系统淋巴瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、儿童期癌症、软骨肉瘤、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促纤维增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮样血管内皮瘤(EHE)、食道癌、尤文氏肿瘤家族的尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼内黑色素瘤(眼癌)、成视网膜细胞瘤(眼癌)、胆囊癌、胃(胃的)癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、颅外、性腺外或卵巢生殖细胞瘤、妊娠滋养细胞肿瘤、脑干的胶质瘤、胶质瘤、儿童大脑星形细胞瘤胶质瘤、儿童视觉传导通路和下丘脑神经胶质瘤、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、儿童下丘脑和视觉传导通路胶质瘤、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病、急性淋巴细胞白血病(又称急性淋巴细胞性白血病)、急性髓性白血病(又称急性骨髓性白血病)、慢性淋巴细胞白血病(又称慢性淋巴细胞性白血病)、慢性髓细胞性白血病(又称慢性骨髓白血病)、多毛细胞白血病、唇癌和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、艾滋病相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金(除霍奇金之外的所有淋巴瘤的旧分类)淋巴瘤、原发性中枢神经系统巨球蛋白血症(瓦尔登斯特伦)、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤/骨肉瘤、成神经管细胞瘤、儿童黑色素瘤、眼内(眼)黑色素瘤、Merkel细胞癌、间皮瘤、成人恶性间皮瘤、儿童原发灶隐匿转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、骨髓性白血病、慢性粒细胞白血病、成人急性髓性白血病、儿童多发性急性骨髓瘤(骨髓癌)、骨髓增生性病症、慢性粘液瘤、鼻腔癌和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、少突神经胶质瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-间质瘤)、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低度恶性潜在肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞胰腺癌、鼻窦癌和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、浆细胞瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、原发性中枢神经系统性淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、肾盂和输尿管癌、移行细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、尤文肿瘤家族肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤、Sézary综合征、皮肤癌(非黑色素瘤)、皮肤癌(黑色素瘤)、Merkel细胞皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌-见皮肤癌(非黑色素瘤)、原发灶隐匿转移性鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(蕈样肉芽肿和Sézary综合征)、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、妊娠滋养细胞肿瘤、成人未知原发部位癌、儿童未知原发部位癌、输尿管和肾盂移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、阴道癌、视觉传导通路和下丘脑神经胶质瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(
Figure BDA0002641974200000681
macroglobulinemia)或肾母细胞瘤(肾癌)。
在某些实施方案中，与癌症相关的示例性靶基因包括ABL1、ABL2、ACSL3、AF15Q14、AF1Q、AF3p21、AF5q31、AKAP9、AT1、AKT2、ALDH2、AL、AL017、APC、ARHGEF12、ARHH、ARID1A、ARID2、ARNT、ASPSCR1、ASXL1、ATF1、ATIC、ATM、ATRX、AXIN1、BAP1、BCL10、BCL11A、BCL11B、BCL2、BCL3、BCL5、BCL6、BCL7A、BCL9、BCOR、BCR、BHD、BIRC3、BLM、BMPRIA、BRAF、BRCAl、BRCA2、BRD3、BRD4、BRIPI、BTG1、BUB1B、C12orf9、C15orf21、C15orf55、C16orf75、C2orf44、CAMTA1、CANT1、CARD11、CARS、CBFA2T1、CBFA2T3、C.BFB、CBL、CBLB、CBLC、CCDC6、CCNB1IP1、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CD273、CD274、CD74、CD79A、CD79B、CDH1、CDH11、CDK12、CDK4、CDK6、CD N2A、CD N2a(pl4)、CD N2C、CDX2、CEBPA、CEPl、CHCHD7、CHEK2、CHIC2、CHNl、CIC、Cin A、CLTC、CLTCL1、CMKOR1、CNOT3、COL1 Al、COPEB、COX6C、CREB1、CREB3L1、CREB3L2、CREBBP、CRLF2、CRTC3、CTNNB1、CYLD、D10S170、DAXX、DDB2、DDIT3、DDX10、DDX5、DDX6、DEK、D1CER1、DNM2、DNMT3A、DUX4、EBFI、ECT2L、EGFR、E1F4A2、ELF4、ELK4、ELKS、ELL、ELN、EML4、EP300、EPS 15、ERBB2、ERCC2、ERCC3、ERCC4、ERCC5、ERG、ETVl、ETV4、ETV5、ETV6、EVIl、EWSR1、EXTl、EXT2、EZH2、EZR、FACL6、FAM22A、FAM22B、FAM46C、1ANCA、EANCC、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FBXOl 1、FBXW7、FCGR2B、FEV、FGFR1、FGFRIOP、FGFR2、FGFR3、FTI、FIIIT、FIP1L1、FLU、FLJ27352、FLT3、FNBP1、FOXL2、FOXOIA、FOX03A、FOXP1、FSTL3、FUBP1、FUS、FVT1、GAS7、GATA1、GATA2、GATA3、GMPS、GNA11、GNAQ、GNAS、GOLGA5、GOPC、GPC3、GPHN、GRAF、H3F3A、IICMOGT-1、IIEAB、HERPUD1、IIEY1、IIIPl、HIST1IT3B、IIIST1II4I、IILF、HLXB9、HMGA1、HMGA2、HNRNPA2BI、HOOK3、HOXA11、HOXA13、HOXA9、HOXC11、HOXC13、HOXD11、HOXD13、HRAS、IIRPT2、HSPCA、HSPCB、IDHl、IDH2、IGH、IGK、IGL、IKZFl、IL2、TL21R、IL6ST、IL7R、IRF4、IRTA1、ITK、JAK1、JAK2、JAK3、JAZF1、JUN、KCNJ5、KDM5A、KDM5C、KDM6A、KDR、KIAA1549、KIF5B、KIT、KLF4、KLK2、KRAS、KTN1、LAF4、LASPl、LCK、LCP1、LCX、LHFP、LIFR、LMOl、LM02、LPP、LRIG3、LYL1、MADH4、MAF、MAFB、MALT1、MAML2、MAP2KL MAP2K2、ΜλΡ2K4、MAX、MDM2、MDM4、MDS1、MDS2、MECTl、MED12、MEN1、MET、MITF、MKL1、MLF1、MLIIl、MLL、MLL2、MLL3、MLLT1、MLLT10、MLLT2、MLLT3、MLLT4、MLLT6、MLLT7、MN1、MPL、MSF、MSH2、MSH6、MSI2、MSN、MTCP1、MUC1、MUTYH、MYB、MYC、MYCL1、MYCN、MYD88、MYH11、MYH9、MYST4、NACA、NBS1、NCOA1、NCOA2、NCOA4、NDRG1、NF1、NF2、NFE2L2、NFIB、NFKB2、NIN、NKX2-1、NONO、NOTCH I、NOTCH2、NPMl、NR4A3、NRAS、NSDl、NT5C2、NTRKl、NTRK3、NUMAl、NUP214、NUP98、OLIG2、OMD、P2RY8、PAFAH1B2、PALB 2、PAX3、PAX5、PAX7、PAX8、PBRM1、PBX1、PCM1、PCSK7、PDE4DIP、PDGFB、PDGFRA、PDGFRB、PERI、PIIF6、PHOX2B、PICALM、PIK3CA、PIK3R1、PIM1、PLAG 1、PML、PMS1、PMS2、PMX1、PNUTL1、POT1、POU2AF1、POU5F1、PPARG、PPP2R1A、PRCC、PRDM1、PRDM16、PRF1、PRKAR1 A、PRO1073、PSIP2、PTCH、PTEN、PTPN11、RAB5EP、RACl、RAD51L1、RAFl、RALGDS、RANBP17、RAPIGDSI、RARA、RBI、RBM15、RECQL4、REL、RET、RNF43、ROS1、RPL10、RPL22、RPL5、RPN1、RUNDC2A、RUNX1、RUNXBP2、SBDS、SDC4、SDH5、SDHB、SDHC、SDHD、SEPT6、SET、SETBP1、SETD2、SF3B1、SFPQ、SFRS3、SH2B3、SH3GL1、SIL、SLC34A2、SLC45A3、SMARCA4、SMARCB1、SMARCE1、SMO、SOCS1、SOX2、SRGAP3、SRSF2、SSI8、SS18L1、SSH3BP1、SSX1、SSX2、SSX4、STAT3、STK11、STL、SUFU、SIJZ12、SYK、TAF15、TALI、TAL2、TCEA1、TCF1、TCF12、TCF3、TCF7L2、TCL1A、TCL6、TERT、TET2、TFE3、TFEB、TFG、TFPT、TFRC、THRAP3、TIF1、TLX1、TLX 3、TMPRSS2、TNFAIP3、TNFRSF14、TNFRSF17、TNFRSF6、TOPI、TP53、TPM3、TPM4、TPR、TRA、TRAF7、TRB、TRD、TRIM27、TRIM33、TRIP11、TSC1、TSC2、TSHR、TTL、U2AF1、USP6、VHL、VTUA、WAS、WHSC1、WHSC1L1、WIF1、WRN、WT1、WTX、WWTR1、XPA、XPC、XPOl、YWHAE、ZNF145、ZNF198、ZNF278、ZNF331、ZNF384、ZNF521、ZNF9、ZRSR2或它们的任意组合。
在某些实施方案中，本文提供的方法用于治疗患有遗传性病症的受试者。治疗患有遗传性疾病或病症或遗传性病症的受试者的方法包括向受试者的细胞施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统。DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统的施用可以是体内的或离体的。
遗传性病症可以由染色体区域中的突变或复制(例如，由点突变、缺失、插入、移码、染色体复制或缺失)引起。遗传性病症可以是任何遗传性病症。
在某些实施方案中，遗传性病症是22q11.2缺失综合征、Angelman综合征、卡纳万病、Charcot–Marie–Tooth病、色盲、猫叫综合征(Cridu chat)、唐氏综合征、杜氏肌营养不良症、血色病、血友病、Klinefelter综合征、多发性神经纤维瘤、苯丙酮尿症、多囊性肾病、Prader–Willi综合征、镰状细胞病、脊髓性肌萎缩症、脊髓性肌萎缩症、Tay-Sachs病、特纳综合征、血红蛋白病或它们的任何组合。
在某些实施方案中，遗传性疾病是1p36缺失综合征、18p缺失综合征、21-羟化酶缺乏症、47XXX(三重X综合征)、47XXY(Klinefelter综合征)、5-ALA脱水酶缺乏卟啉病、ALA脱水酶缺乏症、5-氨基乙酰丙酸脱水酶缺乏卟啉病、5p缺失综合征、猫叫综合征(AKA5p综合征)、共济失调毛细血管扩张症(AKA AT)、α1-抗胰蛋白酶缺乏症(AAT)、血浆铜蓝蛋白缺乏症、II型软骨成长不全(ACG2)、软骨发育不全(ACH)、酸性β-葡萄糖苷酶缺乏症、戈谢病(任何类型，例如1型、2型、3型)、尖头并指畸形(Apert)、Apert综合征、尖头并指畸形(任何类型，例如1型、2型、3型、5型)、Pfeiffer综合征、塔头畸形、急性脑性戈谢病、急性间歇性卟啉病(AIP)、ACY2缺乏症、阿尔茨海默病(AD)、Adelaide型颅缝早闭症、Muenke综合征、腺瘤性结肠息肉病、家族性腺瘤性息肉病、结肠腺瘤性息肉病、家族性腺瘤性息肉病(ADP)、腺苷酸琥珀酸裂解酶缺乏症、肾上腺疾病、肾上腺性征综合征、肾上腺脑白质营养不良、雄激素不敏感综合征(AIS)、黑尿症(AKU)、ALA脱水酶卟啉病、ALA-D卟啉病、ALA脱水酶缺乏症、Alagille综合征、白化病、尿黑酸尿症(黑尿症)、亚历山大病(黑尿症)、黑尿性褐黃病、α-1蛋白酶抑制剂疾病、α-1相关肺气肿、α-半乳糖苷酶A缺乏症、法布里病、综合征、亚历山大病(ALX)、釉质发育不全、氨基乙酰丙酸脱水酶缺乏症、氨基酰化酶2缺乏症、卡纳万病、Anderson-Fabry病、雄激素不敏感综合征、遗传性铁粒幼细胞贫血、X连锁铁粒幼细胞性贫血和/或家族性贫血、弥漫性体血管角质瘤、弥漫性血管角质瘤、视网膜血管瘤、vonHippel–Lindau病、APC抵抗症、Leiden型、因子V Leiden血栓形成倾向、Apert综合征、AR缺乏症、雄激素不敏感综合征、Charcot-Marie-Tooth病(任何类型，例如CMT1、CMTX、CMT2、CMT4、严重早发性CMT)、蜘蛛脚样指、Marfan综合征、ARNSHL、非综合征型耳聋(常染色体隐性遗传、常染色体显性、x连锁或线粒体)、遗传进行性关节眼病、Stickler综合征(例如COL2A1、COL11A1、COL11A2、COL9A1)、先天性多发性关节松弛、Ehlers–Danlos综合征(例如运动过度型、关节松弛型、经典型、血管型、脊柱侧凸型、皮肤病型)、Asp缺乏症、Aspa缺乏症、天冬氨酸酰酶缺乏症、共济失调毛细血管扩张症、自闭-痴呆-共济失调-手运动失调综合征、Rett综合征、常染色体显性遗传青少年ALS、常染色体显性遗传opitz G/BBB综合征、常染色体隐性遗传形式的青少年ALS 3型、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(任何类型；例如ALS1、ALS2、ALS3、ALS4、ALS5、ALS5、ALS6、ALS7、ALS8、ALS9、ALS10、ALS11、ALS12、ALS13、ALS14、ALS15、ALS16、ALS17、ALS18、ALS19、ALS20、ALS21、ALS22、FTDALS1、FTDALS2、FTDALS3、FTDALS4、FTDALS4、IBMPFD2)、常染色体隐性遗传非综合征性听力损失、常染色体隐性遗传感音神经性听力损伤和甲状腺肿、Pendred综合征、亚历山大病(AxD)、Ayerza综合征、家族性肺动脉高压、己糖胺酶GM2神经节苷脂沉积症的B变体、Sandhoff疾病、BANF相关疾病、多发性神经纤维瘤(任何类型，例如NF1、NF2、神经鞘瘤病)、Beare-Stevenson皮肤旋纹综合征、良性阵发性腹膜炎、Benjamin综合征、β-地中海贫血、BH4缺乏症、四氢生物蝶呤缺乏症、双侧听神经纤维瘤、生物素酶缺乏症、膀胱癌、出血性疾病、因子V Leiden血栓形成倾向、Bloch-Sulzberger综合征、色素失调症、Bloom综合征、骨病、Bourneville病、结节性硬化症、脑部疾病、朊病毒病、乳腺癌、Birt–Hogg–Dubé综合征、脆骨病、成骨不全症、宽拇指-巨趾综合征、Rubinstein-Taybi综合征、青铜色糖尿病、血色素沉着病、青铜色肝硬变、脊髓延髓性肌肉萎缩症、X连锁脊髓延髓肌肉萎缩症、Burger-Grutz综合征、脂蛋白脂酶缺乏症、家族性CADASIL综合征、CGD慢性肉芽肿性疾病、短指发育不良、癌症家族综合征、遗传性非息肉病性结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、羧化酶缺乏症、多种晚发性生物素酶缺乏症、猫叫综合征、Caylor心-面综合征、神经酰胺三己糖苷酶缺乏症、小脑视网膜血管瘤、家族性vonHippel-Lindau病、脑动脉病、CADASIL综合征、常染色体显性遗传性脑动脉病、CADASIL综合征、大脑萎缩性高氨血症、Rett综合征、脑苷脂沉积综合征、Charcot病、CHARGE综合征、软骨营养不良、软骨营养不良综合征、软骨营养不良伴感音神经性耳聋、耳脊椎骨骺发育不良、软骨发育不全、舞蹈徐动症-自残-高尿酸血综合征、Lesch-Nyhan综合征、经典半乳糖血症、半乳糖血症、唇腭裂、Stickler综合征、三叶草颅伴致死性侏儒症、致死性发育不全(例如1型或2型)、Coffin-Lowry综合征(CLS)、Cockayne综合征、Coffin-Lowry综合征、II型和XI型胶原病、家族性非息肉病、遗传性非息肉病性结直肠癌、家族性结肠癌、家族性腺瘤性息肉病、结直肠癌、完全HPRT缺乏症、Lesch-Nyhan综合征、完全次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症、压迫性神经病变、遗传性神经病伴压迫性麻痹、结缔组织病、异常面容综合征、地中海贫血、β-地中海贫血、铜贮积病、威尔逊氏病、铜转运疾病、Menkes病、粪卟啉症、遗传性粪卟啉症、粪卟啉原氧化酶缺乏症、Cowden综合征、CPX缺乏症、颅面关节变形、Crouzon综合征、颅面骨发育不全、Crouzon综合征、克罗恩病、纤维性狭窄病、Crouzon综合征、Crouzon综合征伴黑棘皮病、Crouzonodermoskeletal综合征、Crouzonodermoskeletal综合征、Cockayne综合征(CS)、Cowden综合征、Curschmann-Batten-Steinert综合征、Beare-Stevenson的皮肤旋纹综合征、Beare-Stevenson皮肤旋纹综合征、D-甘油酸脱氢酶缺乏症、原发性高草酸尿症、斑点干骺端综合征、Strudwick型脊椎干骺端发育不良、阿尔茨海默病型痴呆(DAT)、遗传性高钙尿症、Dent病、肌肉萎缩症(例如Duchenne型和Becker型)、耳聋伴甲状腺肿、Pendred综合征、耳聋-视网膜色素变性综合征、Usher综合征、苯丙氨酸羟化酶缺乏症、退行性神经疾病、de Grouchy综合征1、De Grouchy综合征、Dejerine-Sottas综合征、δ-氨基乙酰丙酸脱水酶缺乏卟啉病、痴呆、CADASIL综合征、脱髓鞘发生性脑白质营养不良、亚历山大病、皮肤痉挛型Ehlers-Danlos综合征、皮肤脆裂症、遗传性发育障碍、远端遗传性运动神经病(dHMN)、远端遗传性运动神经病(例如DHMN-V)、DHTR缺乏症、雄激素不敏感综合征、弥漫性球样体硬化、Krabbe病、Di George综合征、二氢睾酮受体缺乏症、雄激素不敏感综合征、远端遗传性运动神经病、肌强直性营养不良(1型或2型)、远端脊髓性肌萎缩症(任何类型，包括例如1型、2型、3型、4型、5型、6型)、Duchenne/Becker肌营养不良、侏儒症(任何类型，例如软骨发育不全、致死性发育不良)、侏儒症-视网膜萎缩-耳聋综合征、Cockayne综合征、脱髓鞘发生性脑白质营养不良、亚历山大病、肌强直性营养不良、营养不良性视网膜色素变性-骨发育不全综合征、Usher综合征、早发性家族性阿尔茨海默病(EOFAD)、阿尔茨海默病(包括例如1型、2型、3型或4型)、Ekman-Lobstein病、成骨不全症、神经嵌压症、遗传性神经病伴压迫性麻痹、红细胞生成性原卟啉病(EPP)、成红细胞性贫血、β-地中海贫血、红细胞生成性原卟啉病、红细胞5-氨基乙酰丙酸合成酶缺乏症、X连锁铁粒幼细胞贫血、眼癌、成视网膜细胞瘤FA-Friedreich共济失调、Friedreich共济失调、FA、范科尼贫血、面部损伤和疾病、因子V Leiden血栓形成倾向、FALS、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、家族性听神经瘤、家族性腺瘤性息肉病、家族性阿尔茨海默病(FAD)、家族性肌萎缩性脊髓侧索硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、家族性自主神经异常、家族性脂致性高三酸甘油脂血症、家族性脂蛋白脂酶缺乏症、家族性血色素沉着病、血色素沉着病、家族性LPL缺乏症、家族性脂蛋白脂酶缺乏症、家族性非息肉病性结肠癌、遗传性非息肉病性结直肠癌、家族性阵发性多浆膜炎、家族性PCT(迟发性皮肤卟啉病)、家族性压迫敏感性神经病、遗传性神经病伴压迫性麻痹、家族性原发性肺动脉高压(FPPH)、家族性血管性白质脑病、CADASIL综合征、FAP(家族性腺瘤性息肉病)、FD(家族性自主神经异常)、亚铁螯合酶缺乏症、铁转运蛋白病、血色病(任何类型，例如1型、2A型、2B型、3型、4型、新生儿血色病、血浆铜蓝蛋白缺乏症(acaeruloplasminaemia)、先天性无转铁蛋白血症、gracile综合征)周期性发热综合征、家族性地中海热(FMF)、FG综合征、FGFR3相关性冠状缝早闭综合征、星形胶质细胞纤维蛋白样变性、亚历山大病、胰腺纤维化囊性病、Folling病、fra(X)综合征、脆性X染色体综合征、脆骨症、成骨不全症、FRAXA综合征、弗里德希氏共济失调(FRDA)、G6PD缺乏症、半乳糖激酶缺乏症(半乳糖血症)、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶缺乏症(半乳糖血症)、半乳糖神经酰胺酶缺乏症(克拉伯病)、半乳糖神经酰胺脂沉积症(克拉伯病)、半乳糖脑苷脂酶缺乏症、半乳糖苷鞘氨醇脂沉积症、GALC缺乏症、GALT缺乏症、半乳糖血症、类戈谢病、假戈谢病、GBA缺乏症、遗传脑失调、遗传性肺气肿、遗传性血色素沉着病、血色素沉着病、新生儿巨细胞肝炎、新生儿血色素沉着病、GLA缺乏症、视网膜胶质母细胞瘤(视网膜母细胞瘤)、视网膜胶质瘤(视网膜母细胞瘤)、球形细胞脑白质营养不良(GCL、GLD)、克拉伯病、球形细胞脑白质病、葡糖脑苷脂酶缺乏症、葡糖脑苷脂沉积病、葡糖脑苷脂沉积症、葡糖神经酰胺酶缺乏症、葡糖神经酰胺β-葡糖苷酶缺乏症、葡糖神经酰胺脂沉积症、甘氨酸尿症、原发性高草酸尿症、甘氨酸脑病、非酮性高苷胺酸血症、乙醇酸尿症、原发性高草酸尿症、GM2神经节苷脂沉积症、Tay-Sachs病、甲状腺-耳聋综合征、Pendred综合征、Graefe-Usher综合征、Usher综合征、Gronblad-Strandberg综合征、弹性假黄瘤、血色病、血色素沉着病、Hallgren综合征、Usher综合征、Harlequin型鱼鳞癣、Hb S病、软骨发育不全(HCH)、遗传性粪卟啉病(HCP)、头部和脑畸形、听力障碍和耳聋、儿童听力问题、HEF2A、HEF2B、血卟啉病、卟啉症、血红素合成酶缺乏症、血色素沉着病、血红蛋白M病、高铁血红蛋白症β球蛋白型、血红蛋白S病、血友病、肝红细胞生成性卟啉病(HEP)、肝AGT缺乏症、原发性高草酸尿症、肝豆状核变性综合征、Wilson病、遗传性关节眼病、Stickler综合征、遗传性异位脂沉积症、遗传性血色素沉着病(HHC)、血色素沉着病、遗传性出血性毛细血管扩张症(HHT)、遗传性包涵体肌病、骨骼肌再生、遗传铁负荷性贫血、X连锁铁粒幼细胞贫血、遗传性运动感觉性神经病、遗传性运动神经病V型、远端遗传性运动神经病、遗传性多发性骨软骨瘤、遗传性非息肉病性结直肠癌、遗传性周期性发热综合征、遗传性结肠息肉病、家族性腺瘤性息肉病、遗传性肺气肿、遗传性活化蛋白C抵抗症、因子V Leiden血栓形成倾向、遗传性感觉和自主性神经病III型、家族性自主神经异常、遗传性痉挛性截瘫、婴儿起病型上行遗传性痉挛性瘫痪、遗传性脊柱共济失调、弗里德希氏共济失调、遗传性脊髓硬化症、弗里德希氏共济失调、Herrick氏贫血、杂合OSMED、Weissenbacher-Zweymüller综合征、杂合性耳脊椎骨骺发育不良、Weissenbacher-Zweymüller综合征、HexA缺乏症、Tay-Sachs病、己糖胺酶A缺乏症、Tay-Sachs病、己糖胺酶α亚基缺乏症(任何变体，例如变体A、变体B)、Tay-Sachs病、HFE相关血色素沉着病、血色素沉着病、HGPS、早衰、Hippel-Lindau病、von Hippel-Lindau病、血色素沉着病(HLAH)、远端遗传性运动神经病(HMN V)、遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)、遗传性神经病伴压迫性麻痹(HNPP)、高胱氨酸尿症、尿黑酸氧化酶缺乏症、黑尿症、尿黑酸尿(黑尿症)、纯合型迟发性皮肤卟啉病、肝红细胞生成性卟啉病、原发性高草酸尿症(HP1)、高草酸尿症(HP2)、高苯丙氨酸血症(HPA)、HPRT-次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症、Lesch-Nyhan综合征、HSANIII型、家族性自主神经异常、家族性自主神经异常(HSAN3)、遗传性感觉神经病(任何类型，例如HSN-1、HSN-II、HSN-III)、家族性自主神经异常、人皮肤脆裂、亨廷顿病、Hutchinson-Gilford早衰综合征、早衰、雄激素过多症、非经典21-羟化酶缺乏症、高乳糜微粒血症、家族性脂蛋白脂酶缺乏症、高甘氨酸血症伴酮酸中毒和白血球减少症、丙酸血症、I型高脂蛋白血症、脂蛋白脂酶缺乏症、家族性高草酸尿症、原发性高苯丙氨酸血症、高苯丙氨酸血症、高苯丙氨酸血症、季肋发育不全、软骨发育不良、软骨形成不足、软骨发育不良、低色指数性贫血、X-连锁铁粒幼细胞贫血、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)缺乏症、Lesch-Nyhan综合征、婴儿起病型上行遗传性痉挛性瘫痪(IAHSP)、ICF综合征、免疫缺陷、着丝粒不稳定和面部异常综合征、特发性血色素沉着病、血色素沉着病3型、特发性新生儿血色素沉着症、新生儿血色素沉着症、特发性肺动脉高压、免疫系统疾病、X连锁重度联合免疫缺陷病、色素失调症、婴儿脑型戈谢病、婴儿戈谢病、婴儿起病型上行遗传性痉挛性瘫痪、不孕症、遗传性肺气肿、遗传性压迫性麻痹倾向、遗传性神经病伴压迫性麻痹、Insley-Astley综合征、耳脊椎骨骺发育不良、间歇性急性卟啉病综合征、急性间歇性卟啉病、肠息肉病-皮肤色素沉着综合征、Peutz-Jeghers综合征、色素失调症(IP)、铁贮积紊乱、血色素沉着病、Isodicentric 15、isodicentric 15、孤立性耳聋、非综合征性耳聋、Jackson-Weiss综合征、Joubert综合征、青少年原发性侧索硬化症(JPLS)、青少年肌萎缩性脊髓侧索硬化症、青少年痛风、舞蹈手足徐动症、智力低下综合征、Lesch-Nyhan综合征、青少年高尿酸血症综合征、Lesch-Nyhan综合征、Jackson-Weiss综合征(JWS)、脊髓延髓肌肉萎缩症、肯尼迪病、脊髓延髓肌肉萎缩症、肯尼迪脊髓延髓肌肉萎缩症、脊髓延髓肌肉萎缩症、角苷脂组织细胞增多症、角苷脂沉积症、角苷脂贮积病、酮症性甘氨酸血症(丙酸血症)、酮症性高甘氨酸血症(丙酸血症)、肾病、原发性高草酸尿症、Kniest发育不良、克拉伯病、Kugelberg–Welander病、脊髓性肌肉萎缩症、腔隙性痴呆、CADASIL综合征、Langer-Saldino软骨成长不全、Langer-Saldino发育不良、迟发性阿尔茨海默病、迟发性克拉伯病(LOKD)、克拉伯病、学习障碍、学习失能、口周着色斑病、Peutz-Jeghers综合征、Lesch-Nyhan综合征、脑白质营养不良、脑白质营养不良伴罗森塔尔纤维、亚历山大病、海绵状脑白质营养不良、Li-Fraumeni综合征(LFS)、Li-Fraumeni综合征、脂肪酶D缺乏症、脂蛋白脂酶缺乏症、家族性LIPD缺乏症、脂蛋白脂肪酶缺乏症、家族性脑苷脂沉积症、婴儿神经节苷脂沉积症、Tay-Sachs病、类脂性组织细胞增生症(kerasin型)、脂蛋白脂酶缺乏症、家族性肝脏疾病、半乳糖血症、Lou Gehrig病、Louis-Bar综合征、共济失调毛细血管扩张症、Lynch综合征、遗传性非息肉病性结直肠癌、赖氨酰羟化酶缺乏症、Machado-Joseph病、脊髓小脑性共济失调(任何类型，例如SCA1、SCA2、SCA3、SCA18、SCA20、SCA21、SCA23、SCA26、SCA28、SCA29)、男性乳腺癌、乳腺癌、男性生殖疾病、恶性乳腺肿瘤、乳腺癌、乳腺恶性肿瘤、乳腺癌、恶性膀胱肿瘤、膀胱癌、乳腺肿瘤、乳腺癌、马凡综合征、Marker X综合征、脆性X染色体综合征、Martin-Bell综合征、脆性X染色体综合征、McCune-Albright综合征、McLeod综合征、MEDNIK综合征、地中海贫血、β-地中海贫血、大骨骺侏儒症、耳脊椎骨骺发育不良、Menkea综合征、Menkes病、Menkes病、智力迟钝伴骨软骨异常、Coffin-Lowry综合征、代谢紊乱、II型间向性侏儒症、Kniest发育不良、变形性骨发育不良II型、Kniest发育不良、高铁血红蛋白症(任何类型，例如先天性、β-球蛋白型、先天性高铁血红蛋白症II型)、甲基丙二酸血症、马凡氏综合征(MFS)、MHAM、Cowden综合征、微综合征、头小畸型、MMA、甲基丙二酸血症、Menkes病(又称AKA MK或MNK)、单体性1p36综合征、运动神经元病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、运动障碍、Mowat-Wilson综合征、粘多糖贮积症(MPS I)、粘稠物阻塞症、多发梗塞性痴呆、CADASIL综合征、多种羧化酶缺乏症(迟发性)、生物素酶缺乏症、多发性错构瘤综合征、Cowden综合征、多发性神经纤维瘤、肌肉萎缩症(任何类型，包括Duchenne型和Becker型)、萎缩性肌强直、肌强直性营养不良、营养不良性肌强直症、Nance-Insley综合征、耳脊椎骨骺发育不良、Nance-Sweeney软骨发育不良、耳脊椎骨骺发育不良、NBIA1、泛酸激酶相关神经变性、Neill-Dingwall综合征、Cockayne综合征、成神经细胞瘤(视网膜)、成视网膜细胞瘤、神经变性伴脑内铁积累1型、泛酸激酶相关神经变性、神经系统疾病、神经肌肉障碍、远端遗传性运动神经元病、Niemann-Pick、Niemann-Pick病、Noack综合征、非酮性高苷胺酸血症、甘氨酸脑病、非神经元性高胆红素血症、非苯丙酮尿症高苯丙氨酸血症、四氢生物蝶呤缺乏症、非综合征性耳聋、Noonan综合征、Norrbottnian戈谢病、褐黄病(黑尿症)、褐黄病性关节炎(黑尿症)、Ogden综合征、成骨不全症(OI)、Osler-Weber-Rendu病、遗传性出血性毛细血管扩张症、OSMED、耳脊椎骨骺发育不良、成骨不全症、骨脆症(成骨不全症)、先天性骨硬化、耳脊椎骨骺发育不良、耳脊椎骨骺发育不良、耳脊椎骨骺发育不良、草酸过多症、原发性高草酸尿症、原发性草酸尿、原发性高草酸尿症、泛酸激酶相关神经变性、Patau综合征(13三体综合征)、PBGD缺乏症、急性间歇性卟啉病、PCC缺乏症、丙酸血症、迟发性皮肤卟啉病(PCT)、PDM病、Pendred综合征、周期性病、地中海热、家族性周期性腹膜炎、口周着色斑病综合征、Peutz-Jeghers综合征、周围神经病变、家族性自主神经异常、周围神经纤维瘤、腓骨肌萎缩症、过氧化物酶体丙氨酸:乙醛酸氨基转移酶缺乏症、高草酸尿症、原发性Peutz-Jeghers综合征、苯丙氨酸羟化酶缺乏症、嗜铬细胞瘤、von Hippel-Lindau病、Pierre Robin综合征伴胎儿软骨发育不良、Weissenbacher-Zweymüller综合征、色素性肝硬变、血色素沉着病、Peutz-Jeghers综合征(PJS)、泛酸激酶相关神经变性(PKAN)、PKU、苯丙酮尿症、铅性紫质病、ALA缺乏性卟啉病、PMA、多囊性肾病、多骨性纤维性结构不良、McCune-Albright综合征、家族性腺瘤性息肉病、错构瘤性肠息肉病、息肉黑斑综合征、Peutz-Jeghers综合征、胆色素原合成酶缺乏症、ALA缺乏性卟啉病、卟啉症、PPOX缺乏症、多样性卟啉病、Prader-Labhart-Willi综合征、Prader-Willi综合征、早老性和老年性痴呆、原发性纤毛运动障碍(PCD)、原发性血色素沉着症、血色素沉着症、原发性高尿酸血症综合征、Lesch-Nyhan综合征、原发性老年退行性痴呆、前胶原EDS VII型、突变体、早衰、Hutchinson Gilford早衰综合征、早衰样综合征、Cockayne综合征、早衰样侏儒症、Cockayne综合征、进行性舞蹈症、慢性遗传性(亨廷顿)、亨廷顿病、正常巩膜进行性畸形成骨不全症、成骨不全症(任何类型，例如I型、II型、III型、IV型、V型、VI型、VII型、VIII型)、近端肌强直性营养不良(PROMM)、丙酸血症、丙酰辅酶A羧化酶缺乏症、蛋白C缺乏症、蛋白S缺乏症、原卟啉病、原卟啉原氧化酶缺乏症、多样性卟啉病、近端肌强直性营养不良、肌强直性营养不良2型、近端强直性肌病、假戈谢病、弹性假黄瘤、鞘氨醇半乳糖苷脂沉积症、克拉伯病、肺动脉高压、肺动脉高血压、弹性假黄瘤(PXE)、弹性假黄瘤、成视网膜细胞瘤(Rb)、Recklinghausen病、复发性多浆膜炎、视网膜疾病、视网膜色素变性-耳聋综合征、Usher综合征、成视网膜细胞瘤、Rett综合征、RFALS 3型、Ricker综合征、Riley-Day综合征、家族性自主神经异常、Roussy-Levy综合征、Rubinstein-Taybi综合征(RSTS)、Rett综合征(RTS)、Rubinstein-Taybi综合征、Rubinstein-Taybi综合征、Sack-Barabas综合征、SADDAN病、李氏和Fraumeni肉瘤家族综合征、Li-Fraumeni综合征、SBLA综合征(肉瘤、乳腺、白血病和肾上腺综合征)、Li-Fraumeni综合征、脊髓延髓肌肉萎缩症(SBMA)、双侧听神经鞘瘤、多发性神经纤维瘤II型、Schwartz-Jampel综合征、X连锁重度联合免疫缺陷(SCIDX1)、先天性SED、先天性脊椎骨骺发育不良、SED Strudwick、Strudwick型脊椎干骺端发育不良、先天性脊椎骨骺发育不良(SEDc)、脊椎干骺端发育不良(SEMD)、Strudwick型SEMD、老年性痴呆、严重软骨发育不全伴发育迟缓和黑棘皮病、SADDAN病、Shprintzen综合征、由PHF8基因突变引起的Siderius X连锁智力低下综合征、骨骼-皮肤-脑综合征、皮肤色素沉着症、脊髓性肌萎缩(SMA)、脊柱-骺-骨骺发育不良(SMED)(任何类型，例如Studwick型、1型)、Smith-Lemli-Opitz综合征、Smith Magenis综合征、南非遗传性卟啉病、婴儿起病型上行性痉挛性瘫痪、婴儿起病型上行遗传性痉挛性瘫痪、言语和交流障碍、神经脂质病、Tay-Sachs、Tay-Sachs病、脊髓延髓肌肉萎缩症、脊髓性肌萎缩、脊髓性肌萎缩(远端V型)、远端遗传性运动神经病、远端上肢脊髓性肌萎缩、远端遗传性运动神经病、脊髓小脑性共济失调、先天性椎体骨骺结构不良、脊椎骨骺发育不良、胶原病(任何类型，例如II型和XI型)、脊椎干骺端发育不良、脊椎干骺端发育不良(SMD)、脊椎干骺端发育不良、中枢神经系统海绵状变性、脑海绵状变性、婴儿期白质海绵状变性、散发性原发性肺动脉高压、SSB综合征、钢发综合征、Menkes病、Steinert病、肌强直性营养不良、Steinert肌强直性营养不良综合征、肌强直性营养不良、Stickler综合征、中风、CADASIL综合征、Strudwick综合征、亚急性神经元病性戈谢病、瑞典遗传性卟啉病、急性间歇性卟啉病、急性间歇性卟啉症、瑞士奶酪软骨发育不良、Kniest发育不良、Tay-Sachs病、TD-致死性侏儒症、致死性发育不良、TD伴直股骨和三叶草颅、致死性发育不良2型、毛细血管扩张症(小脑-眼皮肤)、共济失调毛细血管扩张症、睾丸女性化综合征、雄激素不敏感综合征、四氢生物蝶呤缺乏症、睾丸女性化综合征(TFM)、雄激素不敏感综合征、中间型地中海贫血、β-地中海贫血、重型地中海贫血、β-地中海贫血、致死性发育不良、由活化蛋白C辅助因子缺乏引起的血栓形成、Leiden型、因子V Leiden血栓形成倾向、甲状腺疾病、腊肠样神经病、遗传性神经病伴压迫性麻痹、总HPRT缺乏症、Lesch-Nyhan综合征、总黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺乏症、Lesch-Nyhan综合征、Treacher Collins综合征、三叠系脆骨症、三重X综合征、三X综合征、三体21、三体X、Troisier-Hanot-Chauffard综合征、血色素沉着症、Tay-Sachs病(TSD)、结节性硬化症复合物(TSC)、结节性硬化症、Turner样综合征、Noonan综合征、UDP-半乳糖-4-差向异构酶缺乏症、半乳糖血症、UDP葡萄糖4-差向异构酶缺乏症、半乳糖血症、UDP葡萄糖己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶缺乏症、半乳糖血症、未分化性耳聋、非综合征性耳聋、UPS缺乏症、急性间歇性卟啉病、膀胱癌、膀胱癌、UROD缺乏症、尿卟啉原脱羧酶缺乏症、尿卟啉原合成酶缺乏症、急性间歇性卟啉病、Usher综合征、UTP己糖-1-磷酸尿苷酰转移酶缺乏症、半乳糖血症、Van Bogaert-Bertrand综合征、Van der Hoeve综合征、Velocardiofacial综合征、VHL综合征、von Hippel-Lindau病、视力障碍和失明、综合征、Von Bogaert-Bertrand病、von Hippel-Lindau病、Von Recklenhausen-Applebaum病、血色素沉着病、vonRecklinghausen病、多发性神经纤维瘤I型、Vrolik病、成骨不全症、Waardenburg综合征、Warburg Sjo Fledelius综合征、Micro综合征、Wilson病(WD)、Weissenbacher-Zweymüller综合征、Werdnig-Hoffmann病、脊髓性肌萎缩、Williams综合征、Wilson病、Wilson氏病、Wilson病、Wolf-Hirschhorn综合征、Wolff周期性疾病、Weissenbacher-Zweymüller综合征(WZS)、着色性干皮病、X连锁智力障碍-大睾丸、脆性X染色体综合征、X连锁原发性高尿酸血症、Lesch-Nyhan综合征、X连锁重度联合免疫缺陷、X连锁铁粒幼细胞贫血、X连锁脊髓延髓肌肉萎缩症、脊髓延髓肌肉萎缩症、X连锁尿酸尿酶缺乏症、Lesch-Nyhan综合征、X-SCID、X连锁重度联合免疫缺陷、X连锁铁粒幼细胞贫血(XLSA)、X-SCID、X连锁重度联合免疫缺陷、X连锁铁粒幼细胞贫血(XLSA)、XSCID、X连锁重度联合免疫缺陷、XXX综合征、三X综合征、XXXX综合征、XXXXX综合征、XXXXX、XXY综合征、XXY三体、Klinefelter综合征、XYY综合征、三联体重复疾病或它们的任何组合。
在实施方案中，通过施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统来靶向特定的转录后控制调节子以调节、修饰、增强或降低活性。举例来说，转录后控制调节子可以包括PARN、PAN、CPSF、CstF、PAP、PABP、PAB2、CFI、CFII、RNA三磷酸酶、RNA葡糖基鸟苷转移酶、RNA甲基转移酶、SAM合酶、泛素缀合酶E2R、SR蛋白SFRS1至SFR11、hnRNP蛋白(例如HNRNPA0、HNRNPA1、HNRNPA1L1、HNRNPA1L2、HNRNPA2、HNRNPA2B1、HNRNPAB、HNRNPB1、HNRNPC、HNRNPCL1、HNRNPD、HNRPDL、HNRNPF、HNRNHP1、HNRNPH2、HNRNPH3、HNRNPK、HNRNPL、HNRNPLL、HNRNPM、HNRNPR、HNRNPU、HNRNPUL1、HNRNPUL2、HNRNPUL3)、ADAR、Mex 67、Mtr2、Nab2；Dead-box解旋酶e1F4A、e1F4B、e1F4E、e1F4G、GEF、GCN2、PKR、HRI、PERK、eEF1、eEF2、GCN、eRF3；ARE特异性结合蛋白、EXRN1、DCP1、DCP2、RCK/p54、CPEB、eIF4E、微RNAS和siRNA、DICER、Ago蛋白、无义介导的mRNA衰变蛋白、UPF3A、UPF3BeIF4A3、MLN51、Y14/MAGOH、MG-1、SMG-5、SMG-6、SMG-7或它们的任何组合。
在某些实施方案中，通过施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统来调节、增强或降低与细胞周期相关的遗传途径的活性。与细胞周期相关的示例性途径和基因包括ATM、PMS2、FAS-L、MRE11、MLH1、FasR、NBS1、MSH6、Trail-L、RAD50、MSH2、Trail-R、53BP1、RFC、TNF-Ct、P53、PCNA、TNF-R1、CHKE、MSH3、FADD、E2F1、MutS同源物、TRADD、PML、MutL同源物、R1P1、FANCD2、核酸外切酶、MyD88、SMC1、DNA聚合酶δ、IRAK、BLM1、(POLD1、POLD2、POLD3、NIL、BRCA1和POLD4基因、IKK、H2AX编码亚基)、NFKβ、ATR、拓扑异构酶1、ΙκΒα、RPA、拓扑异构酶2、IAP、ATRIP、RNAseH1、半胱天冬酶3、RAD9、连接酶1、半胱天冬酶6、RAD1、DNA聚合酶1、半胱天冬酶7、HUS、DNA聚合酶3、半胱天冬酶8、RAD17、引发酶、半胱天冬酶10、RFC、螺旋酶、HDAC1、CHK1、单链结合、HDAC2、TLK1蛋白、细胞色素C、CDC25、Bx1-xL、STAT3、STAT5、DFF45、Vc1-2、ENDO-G、PI3K、Akt、钙蛋白酶、Bad、Bax、泛素介导的蛋白质水解、缺氧、细胞增殖、HIF-loc、MAPK、E1、HERC1、TRAF6、HIF-Ιβ、MAPKK、E2、UBE2Q、MEKK1、Ref1、MAPKKK、E3、UBE2R、COP！、HSP90、c-Met、UBLE1A、UBE2S、PIFH2、VEGF、HGF、UBLE1B、UBE2U、cIAP、PAS、ER、S1/2、UBLEIC、UBE2W、PIAS、ARNT、ATK、UBE2A、UBE2Z、SYVN、VHL、PKCs、UBE2B、AFC、LLC、N、NHLRC1、HLF、桩蛋白、UBE2C、UBE1、AIRE、EPF、FAK、UBE2A、E6AP、MGRN1、VDU2、内收蛋白、UBE2E、UBE3B、BRCA1、SUMORESUME、PYK1、UBE2F、Smurf、FANCL、SENP1、RB、UBE2G1、Itch、MIDI、钙调磷酸酶A、RBI、UBE2G2、HERC2、Cdc20、RACK1、Raf-1、UBE2I、HERC3、Cdh1、PTB、A-Raf、UBE2J1、HERC4、Apc1、Hur、B-raf、UBE2J2、UBE4A、Apc2、PHD2、MEK1/2、UBE2L3、UBE4B、Apc3、SSAT2、ERK1/2、UBE2L6、CHIP、Apc4、SSAT1、Ets、UBE2M、CYC4、Apc5、GSK3、E1k1、UBE2N、PPR19、Apc6、CBP、SAP1、UBE20、UIP5、Apc7、FOX04、cPLA2、WWPI、Mdm2、Apc8、F1H-1、WWP2、Parkin、Apc9、TRIP、12、Trim32、Ape、10、NEED4、Trim37、Ape、11、ARF-BP1、SIAH-1、Ape、12、EDD1、PML、细胞存活基因、细胞周期阻滞基因、SMADI、P21、SMAD5、BAX、SAMD8、MDR、LEF1、DRAIL、IGFBP3、TCF3、GADD45、TCF4、P300、HAT1、PI3、Akt、GF1或它们的任何组合。
在某些实施方案中，通过向细胞施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统，调节、增强或降低与血管生成相关的基因的活性。与血管生成和血管生成相关病症相关的示例性基因和遗传途径包括VEGF、VEGFR2、SHC、E2F7、VEGFB、VEGFR3、PI3、VEGFC、Nrp 1、PIP3、EGFDIP3、DAG、GRB2、SOS、Akt、PB、PKC、Ras、RAF1、DAG、eNOS、NO、ERK1、ER2、cPLA2、ME1、MEK2或它们的任何组合。
在某些实施方案中，通过向细胞施用DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统，调节、增强或降低与线粒体功能相关的遗传途径和/或基因的活性。与线粒体功能相关的示例性基因和遗传途径包括苹果酸脱氢酶氨基转移酶、水合酶、脱酰酶、脱氢酶、羧化酶、变位酶、脂肪酸氧化亮氨酸氧化异亮氨酸紊乱(酶途径氧化途径缺陷)氨基转移酶、OCTN2支链支链、FATP1-6氨基转移酶2、氨基转移酶2、CPT-1线粒体、CACT异丁基-CoA 2-甲基丁基-CoA、CPT-II脱氢酶脱氢酶、SCAD(支链(支链、MCAD酮酸酮酸、VLCAD脱氢酶、ETF-DH复合物)复合物)、α-ETF水合酶水合酶、β-ETF HMG-CoA裂解酶2-甲基-3-OH-SCHAD丁酰基-辅酶A、LCHAD脱氢酶、MTP 3-氧代硫解酶、LKAT、DECR 1、HMGCS2、HMGCL或它们的任何组合。
在某些实施方案中，与DNA损伤或基因组不稳定性相关的遗传途径和/或基因的活性被调节、增强或降低。与DNA损伤和基因组不稳定性相关的途径和/或基因相关的示例性基因和遗传途径包括53BP1、BLM、MBD2、DNA连接酶4、MDC1、H2AX、XLF、SMC1、53BP1、Rad50、P53、P53、Artemis、Rad27、TdT、APE1、PMS2、APE2、UvrA、RecA、MLH1、NEIL1、UvrB、SSB、MSH6、NEIL2、UvrC、Mre11、MSH2、NEIL3、XPC、Rad50、RFC、XRCC1、Rad23B、Nbs1、PCNA、PNKP、CEN2、CtIP、MSH3、Tdp1、DDB1、RPA、MutS、APTX、XPE、Rad51、MutL、DNA聚合酶βCSA、Rad52、DNA聚合酶δ、CSB、Rad54、拓扑异构酶1、DNA、TFT1H、BRCA1、拓扑异构酶2、PCNA、XPB、BRCA2、RNAseH1、FEN1、XPD、Exo1、连接酶1、RFC、XPA、BLM、DNA聚合酶1、PAR 1、RPA、Top111a、DNA、Lig1、XPG、GEN1、引发酶、Lig3、ERCC1 Yen1螺旋酶、UNG、XPF、S1x1、SSBs、MUTY DNA聚合酶δ、S1x4、SMUGDNA聚合酶ε、Mus8、MBD4、Eme1、Dss1、ASH1L、SETD4、DQT1L、SETD5、EHMT1、SETD6、EHMT2、SETD7、EZH1、SETD8、EZH2、SETD9、MLL、SETDB1、MLL2、SETDB2、MLL3、SETMAR、MLL4、SMYD 1、MLL5、SMYD2、NSD 1、SMYD3、PRDM2、SMYD4、SET、SMYD5、SETBP1、SUV39H1、SETD 1A、SUV39H2、SETD 1B、SUV420H1、SETD2、SUV420H2、SETD3或它们的任何组合。
在某些实施方案中，编码哺乳动物转录因子的基因被调节、增强、减少或提供给细胞。示例性人转录因子包括AFF4、AFF3、AFF2、AFF1、AR、TFAP2B、TFAP2D、TFAP2C、TFAP2E、TFAP2A、JARID2、KDM5D、ARID4A、ARID4B、KDM5A、ARID3A、KDM5B、KDM5C、ARID5B、ARID3B、ARID2、ARID5A、ARID3C、ARID1A、ARID1B、HIF1A、NPAS1、NPAS3、NPAS4、MLXIPL、ARNTL2、MXD1、AHRR、TFE3、HES2、MNT、TCF3、SREBF1、TFAP4、TCFL5、LYL1、USF2、TFEC、AHR、MLX、MYF6、MYF5、SIM1、TFEB、HAND1、HES1、ID2、MYCL1、ID3、TCF21、MXI1、SOHLH2、MYOG、TWIST1、NEUROG3、BHLHE41、NEUROD4、MXD4、BHLHE23、TCF15、MAX、ID1、MYOD1、ARNTL、BHLHE40、MYCN、CLOCK、HEY2、MYC、ASCL1、TCF12、ARNT、HES6、FERD3L、MSGN1、USF1、TAL1、NEUROD1、TCF23、HEYL、HAND2、NEUROD6、HEY1、SOHLH1、MESP1、PTF1A、ATOH8、NPAS2、NEUROD2、NHLH1、ID4、ATOH1、ARNT2、HES3、MLXIP、ASCL3、KIAA2018、OLIG3、NHLH2、NEUROG2、MSC、HES7、ATOH7、BHLHA15、BHLHE22、NEUROG1、FIGLA、ASCL2、OLIG1、TAL2、MITF、SCXB、HELT、ASCL4、MESP2、HES4、SCXA、TCF4、HES5、SREBF2、BHLHA9、OLIG2、MXD3、TWIST2、LOC388553、C13orf38-SOHLH2、CEBPE、XBP1、BATF3、CREB5、CEBPG、ATF3、ATF7、CEBPB、CEBPD、CEBPA、CBFB、CAMTA2、CAMTA1、EBF4、EBF3、EBF1、EBF2、NR2F6、NR2F1、NR2F2、GRHL2、TFCP2L1、GRHL1、TFCP2、UBP1、GRHL3、YBX2、CSDE1、CSDA、YBX1、LIN28A、CARHSP1、CSDC2、LIN28B、NFIX、NFIC、NFIB、NFIA、CUX2、ONECUT2、CUX1、ONECUT1、SATB1、ONECUT3、SATB2、DMRT3、DMRT1、DMRTC2、DMRTA2、DMRTB1、DMRT2、DMRTA1、E2F2、E2F1、E2F3、TFDP2、E2F8、E2F5、E2F7、E2F6、TFDP3、TFDP1、E2F4、NR1H3、NR1H2、ETV1、ETV7、SPI1、ELF4、ETV2、ERF、ELF2、ELK3、ETV3、ELF1、SPDEF、ELK1、ETS1、EHF、ELF5、ETV6、SPIB、FLI1、GABPA、ERG、ETS2、ELK4、ELF3、FEV、SPIC、ETV4、ETV5、FOXN3、FOXC1、FOXJ2、FOXF1、FOXN1、FOXM1、FOXP1、FOXO3、FOXA2、FOXP2、FOXJ1、FOXP4、FOXF2、FOXN4、FOXK2、FOXO1、FOXH1、FOXQ1、FOXK1、FOXI1、FOXD4、FOXA3、FOXN2、FOXB1、FOXG1、FOXR1、FOXL1、FOXC2、FOXE1、FOXS1、FOXL2、FOXO4、FOXD4L1、FOXD4L4、FOXD2、FOXI2、FOXE3、FOXD3、FOXD4L3、FOXR2、FOXJ3、FOXO6、FOXB2、FOXD4L5、FOXD4L6、FOXD4L2、KIAA0415、FOXA1、FOXP3、GCM2、GCM1、NR3C1、GTF2IRD1、GTF2I、GTF2IRD2B、GTF2IRD2、SOX8、SOX30、PMS1、CIC、TCF7、TOX4、SOX10、HMGXB4、HBP1、TFAM、UBTF、WHSC1、SOX6、HMGXB3、BBX、TOX2、SOX4、SOX21、SOX9、SOX15、SOX5、SOX3、LEF1、HMG20A、SOX13、TCF7L2、SSRP1、TCF7L1、SOX17、SOX14、PINX1、SOX7、SOX11、SOX12、SOX2、SOX1、SRY、SOX18、UBTFL1、UBTFL2、TOX、HMGB1、HMGB2、PBRM1、TOX3、SMARCE1、HMG20B、HMGB3、HMGA2、HMGA1、ARX、HOXA11、MEOX1、DLX6、ISL1、HOXC8、BARX2、ALX4、GSC2、DLX3、PITX1、HOXA9、HOXA10、LHX5、LASS4、ZFHX4、SIX4、VSX1、ADNP、RHOXF1、MEIS3、PBX4、DLX5、HOXA1、HOXA2、HOXA3、HOXA5、HOXA6、HOXA13、EVX1、NOBOX、MEOX2、LHX2、LHX6、LHX3、TLX1、PITX3、HOXB6、HNF1B、DLX4、SEBOX、VTN、PHOX2B、NKX3-2、DBX1、NANOG、IRX4、CDX1、TLX2、DLX2、VAX2、PRRX1、TGIF2、VSX2、NKX2-3、HOXB8、HOXB5、HOXB7、HOXB3、HOXB1、MSX2、LHX4、HOXA7、HOXC13、HOXC11、HOXC12、ESX1、BARHL1、NKX2-4、NKX2-2、SIX1、HOXD1、HOXD3、HOXD9、HOXD10、HOXD11、HOXD13、MNX1、CDX4、BARX1、RHOXF2、LHX1、GSC、MEIS2、RAX、EMX1、NKX2-8、NKX2-1、HLX、LMX1B、SIX3、LBX1、PDX1、LASS5、ZFHX3、BARHL2、LHX9、LASS2、MEIS1、DLX1、HMBOX1、ZEB1、VAX1、NKX6-2、VENTX、HHEX、TGIF2LX、LASS3、ALX3、HOXB13、IRX6、ISL2、PKNOX1、LHX8、LMX1A、EN1、MSX1、NKX6-1、HESX1、PITX2、TLX3、EN2、UNCX、GBX1、NKX6-3、ZHX1、HDX、PHOX2A、PKNOX2、CDX2、DRGX、NKX3-1、PBX3、PRRX2、GBX2、SHOX2、GSX1、HOXD4、HOXD12、EMX2、IRX1、IRX2、SIX2、HOXB9、HOPX、OTP、LASS6、HOXC5、HOXB2、RAX2、EVX2、ZHX3、PROP1、ISX、HOXD8、TGIF2LY、IRX5、SIX5、TGIF1、IRX3、ZHX2、LBX2、NKX2-6、ALX1、GSX2、HOXC9、HOXC10、HOXB4、NKX2-5、SIX6、MIXL1、DBX2、PBX1、SHOX、ARGFX、HMX3、HMX2、BSX、HOXA4、DMBX1、HOXC6、HOXC4、RHOXF2B、PBX2、DUXA、DPRX、LEUTX，NOTO、HOMEZ、HMX1、DUX4L5、DUX4L2、DUX4L3、DUX4L6、NKX1-1、HNF1A、HSF4、HSFY2、HSFX1、HSFX2、HSFY1、HSF1、LCORL、LCOR、IRF6、IRF1、IRF3、IRF5、IRF4、IRF8、IRF2、IRF7、IRF9、MBD3、BAZ2B、MBD4、SETDB2、MBD1、MECP2、SETDB1、MBD2、BAZ2A、SMAD7、SMAD5、SMAD9、SMAD6、SMAD4、SMAD3、SMAD1、SMAD2、ZZZ3、RCOR1、CDC5L、MYBL2、DNAJC2、TADA2A、RCOR3、MYB、TERF2、DMTF1、DNAJC1、NCOR1、TERF1、MIER3、MYSM1、SNAPC4、RCOR2、TADA2B、MYBL1、TERF1P2、NCOR2、CCDC79、SMARCC1、SMARCC2、TTF1、C11orf9、NFYA、NFYC、NFYB、NRF1、NR4A3、NR4A1、NR4A2、ESR1、NR0B2、NR0B1、PREB、EAF2、SPZ1、TP63、TP73、TP53、PAX6、PAX7、PAX2、PAX4、PAX8、PAX1、PAX3、PAX5、PAX9、SUB1、POU2F2、POU1F1、POU4F3、POU6F2、POU2F3、POU2F1、POU4F2、POU4F1、POU6F1、POU3F2、POU3F1、POU3F4、POU3F3、POU5F1、POU5F1B、PPARD、PPARG、PPARA、PGR、PROX1、PROX2、NR2E1、NR5A2、NR2C1、NR5A1、NR6A1、ESRRA、NR2C2、RFX3、RFX2、RFX4、RFX1、RFX5、RFX7、RFX6、RFX8、NFATC3、NFKB2、NFATC4、NFATC2、NFAT5、RELB、NFKB1、NFATC1、REL、RELA、RORA、RORC、NR1D2、RORB、RUNX3、RUNX1、SP100、SP140、GMEB2、SP110、AIRE、GMEB1、DEAF1、SP140L、LOC729991-MEF2B、MEF2A、SRF、MEF2D、MEF2B、STAT1、STAT5A、STAT4、STAT6、STAT3、STAT2、STAT5B、TBX21、TBX5、TBX15、TBX18、TBX2、TBX4、TBX22、TBX3、TBR1、TBX19、TBX6、EOMES、T、TBX20、TBX10、MGA、TBX1、TEAD3、TEAD2、TEAD1、TEAD4、CREBL2、NFE2L3、CREB3L3、FOSL2、NFE2L1、CREM、DBP、CREB3、HLF、BACH2、ATF2、NFE2L2、ATF6、CREB1、ATF1、NFE2、FOSB、ATF4、NRL、JUND、JDP2、CREB3L4、BATF、BACH1、CREB3L1、NFIL3、TEF、BATF2、ATF5、FOS、JUNB、DDIT3、FOSL1、JUN、MAF、CREB3L2、MAFA、MAFF、MAFG、MAFK、MAFB、ATF6B、CRX、OTX1、OTX2、THAP3、THAP10、THAP1、PRKRIR、THAP8、THAP9、THAP11、THAP2、THAP6、THAP4、THAP5、THAP7、NR1H4、NR2E3、RARB、HNF4A、VDR、ESRRB、THRA、NR1D1、RARA、ESR2、NR1I3、NR1I2、THRB、NR3C2、HNF4G、RARG、RXRA、ESRRG、RXRB、TSC22D1、TSC22D3、TSC22D4、TSC22D2、TULP3、TULP2、TULP1、TULP4、TUB、ZBTB33、ZBTB32、ZBTB11、MYNN、ZBTB25、PATZ1、ZBTB16、ZBTB24、BCL6、ZBTB47、ZBTB17、ZBTB45、GZF1、ZBTB1、ZBTB46、ZBTB8A、ZBTB7B、BCL6B、ZBTB49、ZBTB43、HIC2、ZBTB26、ZNF131、ZNF295、ZBTB4、ZBTB34、ZBTB38、HIC1、ZBTB41、ZBTB7A、ZNF238、ZBTB42、ZBTB2、ZBTB20、ZBTB40、ZBTB7C、ZBTB37、ZBTB3、ZBTB6、ZBTB44、ZFP161、ZBTB12、ZBTB48、ZBTB10、ZBED4、ZBED3、ZBED2、C11orf95、ZBED1、IKZF5、ZNF821、ZNF451、ZNF195、ZFX、ZNF263、ZNF200、HIVEP2、WIZ、ZNF582、SNAI2、ZFP64、IKZF2、ZIC2、ZNF800、PRDM1、PRDM6、ZFP112、ZNF275、ZNF76、ZFAT、KLF6、ZFY、ZXDC、GLI2、ZNF532、ZNF37A、ZNF510、ZNF506、ZNF324、ZNF671、ZNF416、ZNF586、ZNF446、ZNF8、ZNF264、REST、MECOM、ZNF213、ZNF343、ZNF302、ZNF268、ZNF10、HIVEP1、ZNF184、MZF1、SALL4、ZNF516、KLF8、KLF5、ZNF629、ZNF423、CTCF、ZNF500、ZNF174、SALL1、MAZ、ZNF419、OVOL3、ZNF175、ZNF14、ZNF574、ZNF85、SP4、ZKSCAN1、GLI3、GLIS3、KLF3、PRDM4、GLI1、PRDM13、ZNF142、PRDM2、ZNF684、ZNF541、KLF7、PLAGL1、ZNF430、KLF12、KLF9、ZNF410、BCL11A、EGR1、ZFP30、TSHZ3、ZNF549、ZSCAN18、ZNF211、ZNF639、ZSCAN20、GTF3A、ZNF205、ZNF644、EGR2、IKZF4、CTCFL、ZNF831、SNAI1、ZNF576、ZNF45、TRERF1、ZNF391、RREB1、ZNF133、OVOL2、ZNF436、PLAGL2、GLIS2、ZNF384、ZNF484、HIVEP3、BCL11B、KLF2、ZNF780B、FEZF1、KLF16、ZSCAN10、ZNF557、ZNF337、PRDM12、ZNF317、ZNF426、ZNF331、ZNF236、ZNF341、ZNF227、ZNF141、ZNF304、ZSCAN5A、ZNF132、ZNF20、EGR4、ZNF670、VEZF1、KLF4、ZFP37、ZNF189、ZNF193、ZNF280D、PRDM5、ZNF740、ZIC5、ZSCAN29、ZNF710、ZNF434、ZNF287、ZIM3、PRDM15、ZFP14、ZNF787、ZNF473、ZNF614、PRDM16、ZNF697、ZNF687、OSR1、ZNF514、ZNF660、ZNF300、RBAK、ZNF92、ZNF157、ZNF182、ZNF41、ZNF711、PRDM14、ZNF7、ZNF214、ZNF215、SALL3、ZNF827、ZNF547、ZNF773、ZNF776、ZNF256、ZSCAN1、ZNF837、PRDM8、ZNF117、ZIC1、FEZF2、ZNF599、ZNF18、KLF10、ZKSCAN2、ZNF689、ZIC3、ZNF19、ZSCAN12、ZNF276、ZNF283、ZNF221、ZNF225、ZNF230、ZNF222、ZNF234、ZNF233、ZNF235、ZNF362、ZNF208、ZNF714、ZNF394、ZNF333、ZNF382、IKZF3、ZNF577、ZNF653、ZNF75A、GFI1、ZNF281、ZNF496、ZNF2、ZNF513、ZNF148、KLF15、ZNF691、ZNF589、PRDM9、ZNF12、SP8、OSR2、ZNF367、ZNF22、GFI1B、ZNF219、SALL2、ZNF319、ZNF202、ZNF143、ZNF3、ZSCAN21、ZNF606、SP2、ZNF91、ZNF23、ZNF226、ZNF229、ZNF180、ZNF668、ZNF646、ZNF641、ZNF610、ZNF528、ZNF701、ZNF526、ZNF146、ZNF444、ZNF83、ZNF558、ZNF232、E4F1、ZNF597、INSM2、ZNF30、ZNF507、ZNF354A、ZEB2、ZNF32、KLF13、ZFPM2、ZNF764、ZNF768、ZNF35、ZNF778、ZNF212、ZNF282、PRDM10、SP7、SCRT1、ZNF16、ZNF296、ZNF160、ZNF415、ZNF672、ZNF692、ZNF439、ZNF440、ZNF581、ZNF524、ZNF562、ZNF561、ZNF584、ZNF274、ZIK1、ZNF540、ZNF570、KLF17、ZNF217、ZNF57、ZNF556、ZNF554、KLF11、HINFP、ZNF24、ZNF596、OVOL1、SP3、ZNF621、ZNF680、BNC2、ZNF483、ZNF449、INSM1、ZNF417、ZNF791、ZNF80、GLIS1、ZNF497、KLF14、ZNF266、ZIC4、ZNF408、ZNF519、ZNF25、ZNF77、ZNF169、ZNF613、ZNF683、ZNF135、ZSCAN2、ZNF575、ZNF491、ZNF620、ZNF619、ZNF354C、ZNF114、ZNF366、ZNF454、ZNF543、ZNF354B、ZNF223、ZNF713、ZNF852、ZNF552、ZFP42、ZNF664、EGR3、ZFPM1、ZNF784、ZNF648、FIZ1、ZNF771、TSHZ1、ZNF48、ZNF816、ZNF571、ZSCAN4、ZNF594、ZFP3、ZNF443、ZNF792、ZNF572、ZNF707、ZNF746、ZNF322A、ZNF467、ZNF678、ZFP41、HKR1、PLAG1、ZNF329、ZNF101、ZNF716、ZNF708、ZSCAN22、ZNF662、ZNF320、ZNF623、ZNF530、ZNF285、ZFP1、WT1、ZFP90、ZNF479、ZNF445、ZNF74、SP1、SNAI3、ZNF696、IKZF1、ZNF267、ZNF566、ZNF224、ZNF529、ZNF284、ZNF749、ZNF17、ZNF555、ZNF75D、ZNF501、ZNF197、ZNF396、ZFP91、ZNF732、ZNF397、ZSCAN30、ZNF546、ZNF286A、ZKSCAN4、ZNF70、ZNF643、ZNF642、ZSCAN23、ZNF490、ZNF626、ZNF793、ZNF383、ZNF669、ZNF559、ZNF177、ZNF548、MTF1、ZNF322B、ZNF563、ZNF292、ZNF567、SP6、ZNF573、ZNF527、ZNF33A、ZNF600、ZKSCAN3、ZNF676、ZNF699、ZNF250、ZNF79、ZNF681、ZNF766、ZNF107、ZNF471、ZNF836、ZNF493、ZNF167、ZNF565、ZNF34、ZNF781、ZNF140、ZNF774、ZNF658、ZNF765、ZNF124、ZNF569、ZNF777、ZNF775、ZNF799、ZNF782、ZNF846、ZNF136、ZKSCAN5、ZNF502、ZFP62、ZNF33B、ZNF512B、ZNF431、ZNF418、ZNF700、ZNF239、ZSCAN16、ZFP28、ZNF705A、ZNF585A、ZNF138、ZNF429、ZNF470、ZNF100、ZNF398、ZNF498、ZNF441、ZNF420、ZNF763、ZNF679、ZNF682、ZNF772、ZNF257、ZNF785、ZSCAN5B、ZNF165、ZNF655、ZNF98、ZNF786、ZNF517、ZNF675、ZNF860、ZNF628、ZNF665、ZNF624、ZNF841、ZNF615、ZNF350、ZNF432、ZNF433、ZNF460、ZNF81、ZNF780A、ZNF461、ZNF181、LOC100287841、ZNF44、ZNF790、ZNF677、ZNF823、ZNF311、ZNF347、ZNF71、ZNF121、ZNF335、ZNF560、ZNF273、ZNF84、ZNF667、ZNF649、ZNF248、ZNF544、ZNF770、ZNF737、ZNF251、ZNF607、ZNF334、ZXDA、ZNF485、ZIM2、PEG3、ZNF192、ZNF442、ZNF813、ZNF26、ZNF69、ZNF583、ZNF568、ZXDB、ZNF480、ZNF587、ZNF808、ZNF43、ZNF28、ZNF627、ZNF789、ZNF536、ZNF534、ZNF652、ZNF521、ZNF358、ZFP2、SP5、ZNF814、ZNF551、ZNF805、ZSCAN5C、ZNF468、ZNF616、ZFP57、ZNF155、ZNF783、ZNF425、ZNF580、ZNF611、ZNF254、ZNF625、ZNF134、ZNF845、ZNF99、ZNF253、ZNF90、ZNF93、ZNF486、REPIN1、LOC100131539、ZNF705D、LOC100132396、ZNF705G、SCRT2、ZNF407、SP9、ZNF579、ZNF880、ZNF630、ZNF844、ZNF469、ZNF717、ZNF865、ZNF492、ZNF688、YY2、ZNF878、ZNF879、ZNF736、ZNF323、ZNF709、ZNF512、ZNF585B、ZNF154、ZNF324B、ZNF564、ZFP82、GLI4、ZNF674、ZNF345、ZNF550、KLF1、YY1、MYST2、ST18、L3MBTL4、MYT1L、MYT1、L3MBTL1、MTA3、GATA1、TRPS1、GATA3、GATA5、GATA4、GATA6、GATAD2B、GATAD1、GATA2、MTA1、ZGLP1、MTA2、RERE、C16orf5、LITAF、PIAS1、PIAS2、PIAS4、ZMIZ1、ZMIZ2、PIAS3、RNF138、NFX1、NFXL1或它们的任意组合。
在某些实施方案中，将细胞从一种细胞类型操纵(例如，转化或分化)到另一种细胞类型。在某些实施方案中，将胰细胞操纵成β胰岛细胞。在某些实施方案中，将成纤维细胞操纵成iPS细胞。在某些实施方案中，将前脂肪细胞操纵成棕色脂肪细胞。其它示例性细胞包括例如肌细胞、神经细胞、白细胞和淋巴细胞。
在某些实施方案中，细胞是患病的或携带突变体的细胞。可操纵这些细胞以治疗疾病，例如纠正突变或改变细胞的表型，例如抑制癌细胞的生长。例如，细胞与本文描述的一种或多种疾病或病症相关。
在某些实施方案中，操纵的细胞是正常细胞。
在某些实施方案中，操纵的细胞是干细胞或祖细胞(例如，iPS、胚胎细胞、造血细胞、脂肪细胞、生殖细胞、肺细胞、神经干细胞或祖细胞)。在某些实施方案中，操纵的细胞可以是来自三个胚层中任一个的细胞(即，中胚层、内胚层或外胚层)。在某些实施方案中，操纵的细胞可以来自胚外组织，例如来自胎盘。
在某些实施方案中，被操纵的细胞选自成纤维细胞、单核细胞前体、B细胞、外分泌细胞、胰腺祖细胞、内分泌祖细胞、成肝细胞、成肌细胞或前脂肪细胞。在某些实施方案中，将细胞操纵(例如，转化或分化)成肌细胞、红细胞-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、iPS细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞、内分泌祖细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、肝细胞、胆管细胞、成血管细胞、中成血管细胞或棕色脂肪细胞。
在某些实施方案中，细胞是肌细胞、红细胞-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、iPS细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞、内分泌祖细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、肝细胞、胆管细胞或者白色或棕色脂肪细胞。
在某些实施方案中，细胞是前体细胞、多能细胞、全能细胞、成体干细胞、内细胞团细胞、胚胎干细胞或iPS细胞。
在某些实施方案中，操纵的细胞是癌细胞。在某些实施方案中，癌细胞可以是肺癌细胞、乳腺癌细胞、皮肤癌细胞、脑癌细胞、胰腺癌细胞、造血癌细胞、肝癌细胞、肾癌细胞、卵巢癌细胞、前列腺癌细胞、皮肤癌细胞。
在某些实施方案中，细胞是肌细胞、红细胞-巨核细胞、嗜酸性粒细胞、iPS细胞、巨噬细胞、T细胞、胰岛β细胞、神经元、心肌细胞、血细胞、内分泌祖细胞、外分泌祖细胞、导管细胞、腺泡细胞、α细胞、β细胞、δ细胞、PP细胞、肝细胞、胆管细胞或者白色或棕色脂肪细胞。
向细胞施用DNA-PK抑制剂和基因编辑系统
可通过本领域已知的任何方法对细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂。施用可以是体外的、离体的或体内的。向细胞施用基因组编辑系统和DNA-PK抑制剂可以同时地或依序地进行。在某些实施方案中，施用导致DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统组分进入细胞膜。在某些实施方案中，施用导致DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统组分进入细胞核中。在某些实施方案中，施用包括在存在DNA-PK抑制剂和基因组编辑系统的情况下温育细胞。
基因编辑系统可通过本领域已知的任何方法施用给细胞。例如，可使用本领域已知的任何核酸或蛋白质递送方法。通过编码基因编辑系统组分的核酸将基因编辑系统施用(例如，递送)至细胞。基因编辑系统可通过病毒载体或非病毒载体施用给细胞。在某些实施方案中，使用病毒载体。病毒载体可以是逆转录病毒(例如鼠白血病病毒、HIV病毒或慢病毒)或DNA病毒(例如腺病毒、单纯疱疹病毒和腺相关病毒)。在某些实施方案中，使用转染方法(例如非病毒递送方法)将基因组编辑系统引入细胞中。转染方法包括使细胞与DEAE-葡聚糖、磷酸钙、脂质体接触或将质粒电穿孔到细胞中。另外的非病毒递送方法包括电穿孔、脂质转染、微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸偶联物、裸DNA、裸RNA、人工病毒粒子以及试剂增强的DNA摄取。使用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声致穿孔也可用于递送核酸。在某些实施方案中，一种或多种核酸作为mRNA递送。在某些实施方案中，加帽的mRNA用于提高翻译效率和/或mRNA稳定性。在某些实施方案中，使用ARCA(抗反向帽类似物)帽或其变体。参见美国专利US7074596和US8153773。
在实施方案中，内切核酸酶(例如Cas、Cpf1等)和gRNA从DNA转录。
在实施方案中，内切核酸酶(例如Cas、Cpf1等)从DNA转录，并且gRNA作为RNA提供。
在实施方案中，内切核酸酶(例如Cas、Cpf1等)和gRNA作为RNA提供。
在实施方案中，内切核酸酶(例如Cas、Cpf1等)作为蛋白质提供，并且gRNA作为DNA提供。
在实施方案中，内切核酸酶(例如Cas、Cpf1等)作为蛋白质提供，并且gRNA作为RNA提供。
另外的核酸递送系统包括由Amaxa Biosystems(Cologne,Germany)、Maxcyte,Inc.(Rockville,Maryland)、BTX Molecular Delivery Systems(Holliston,MA)和Copernicus Therapeutics Inc提供的那些(参见例如US6008336)。脂质转染在例如美国专利号5,049,386、4,946,787和4,897,355中有所描述，并且脂质转染试剂可商购获得(例如，TransfectamTM和LipofectinTM和LipofectamineTM RNAiMAX)。适用于多核苷酸的高效受体识别脂质转染的阳离子脂质和中性脂质包括Feigner、WO 91/17424、WO 91/16024的那些脂质。递送可以是向细胞(离体施用)或靶组织(体内施用)进行的。
脂质:核酸复合物(包括靶向脂质体，诸如免疫脂质复合物)的制备是本领域技术人员所熟知的(参见例如Crystal,Science 270:404-410(1995)；Blaese等人,Cancer GeneTher.2:291-297(1995)；Behr等人,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994)；Remy等人,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994)；Gao等人,Gene Therapy 2:710-722(1995)；
额外的递送方法包括使用将待递送的核酸包装于EnGeneIC递送媒介物(EDV)中。使用双特异性抗体(其中该抗体的一条臂具有针对靶组织的特异性，而另一条臂具有针对EDV的特异性)将这些EDV特异性地递送到靶组织。该抗体将EDV带至靶细胞表面，随后EDV通过胞吞作用被带入细胞中。一旦进入细胞，就释放内容物(参见MacDiarmid等人(2009)Nature Biotechnology 27(7):643)Ahmad等人,Cancer Res.52:4817-4820(1992)；美国专利号4,186,183,4,217,344,4,235,871,4,261,975,4,485,054,4,501,728,4,774,085,4,837,028,和4,946,787)。
在某些实施方案中，转染可以是瞬时的，其中含有质粒的转染的基因组编辑系统进入细胞核，但在复制期间不会结合到细胞的基因组中。转染可以是稳定的，其中转染的质粒将整合到细胞的基因组区域中。
在使用瞬时表达的某些实施方案中，可以使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体在许多细胞类型中能够具有非常高的转导效率，并且不需要细胞分裂。使用这样的载体已经获得了高滴度和高水平的表达。该载体可以在相对简单的系统中大量产生。腺相关病毒(“AAV”)载体也用于用靶核酸转导细胞，例如，在体外产生核酸和肽，以及用于体内和离体基因治疗程序(参见例如West等人,Virology 160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；WO 93/24641；Kotin,Human Gene Therapy 5:793-801(1994)；Muzyczka,J..Clin.Invest.94:1351(1994)。重组AAV载体的构建在许多出版物中有所描述，包括美国专利号5,173,414；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin,等人,Mol Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat&Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984)；和Samulski等人,J.Virol 63:03822-3828(1989)。
在某些实施方案中，通过在存在DNA-PK抑制剂和允许DNA-PK抑制剂进入细胞膜和/或细胞核的任何合适培养基的情况下培养分离的细胞来进行DNA-PK抑制剂向细胞的施用。
在某些实施方案中，将DNA-PK抑制剂体外、体内或离体施用给细胞。在某些实施方案中，使DNA-PK抑制剂与细胞接触约5小时、10小时、15小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时、55小时、60小时、65小时、70小时、85小时、90小时、100小时、125小时、150小时、200小时或其间的任何时间段。在某些实施方案中，使DNA-PK抑制剂与细胞接触约1.5周、2.0周、2.5周、3.0周、3.5周、4周或其间的任何时间段。可在细胞培养基变化的情况下重新施用DNA-PK抑制剂。可在引入基因组编辑系统组分之前、期间或之后使DNA-PK抑制剂与细胞接触。
在某些实施方案中，将DNA-PK抑制剂以约0.1μM、0.25μM、0.5μM、0.75μM、1.0μM、1.25μM、1.50μM、1.75μM、2.0μM、2.5μM、3.0μM、3.5μM、4.0μM、4.5μM、5.0μM、5.5μM、6.0μM、6.5μM、7.0μM、7.5μM、8.0μM、8.5μM、9.0μM、9.5μM、10μM、10.5μM、11.0μM、11.5μM、12μM或其间任何浓度的浓度施用给细胞。在施用过程中可修改DNA-PK抑制剂浓度。
在某些实施方案中，基因编辑组分通过一种或多种载体或以RNA、mRNA的形式或在内切核酸酶组分作为纯化的蛋白质或mRNA(例如Cas9蛋白)的情况下递送到细胞中。一种或多种载体可以包括病毒载体、质粒或ssDNA。病毒载体可以包括逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体，或它们的任何组合。在某些实施方案中，基因编辑组分经由RNA或合成RNA递送。
在某些实施方案中，与不向细胞施用DNA-PK抑制剂的基线条件相比，将DNA-PK抑制剂与基因编辑系统一起施用给细胞会导致增加量的同源定向修复基因编辑结果。在某些实施方案中，将DNA-PK抑制剂与基因编辑系统一起施用给细胞会导致在靶标上或靶标外阻抑插入/缺失(来自NHEJ)。在某些实施方案中，将DNA-PK抑制剂与基因编辑系统一起施用给细胞会导致感兴趣基因的表达增加或减少。将DNA-PK抑制剂与基因编辑系统一起施用给细胞可导致非细胞内源的基因表达。在某些实施方案中，将DNA-PK抑制剂与基因编辑系统一起施用给细胞会导致从细胞完全或部分去除基因或修饰基因。在某些实施方案中，将DNA-PK抑制剂与基因编辑系统一起施用给细胞会导致完全或部分去除或者修饰细胞中的内含子和/或外显子。在某些实施方案中，将DNA-PK抑制剂与基因编辑系统一起施用给细胞会导致完全或部分去除或者修饰细胞中的非编码区。在某些实施方案中，将DNA-PK抑制剂与基因编辑系统一起施用给细胞会导致同时或依序、完全或部分去除或者修饰细胞中的编码遗传区和/或非编码遗传区。在某些实施方案中，将DNA-PK抑制剂与基因编辑系统一起施用给细胞会导致同时或依序、完全或部分去除或者修饰细胞中的编码遗传区和/或非编码遗传区，包括染色体外DNA或RNA。染色体外DNA可以是线粒体DNA、叶绿体DNA、染色体外环状DNA或病毒染色体外DNA。
在某些实施方案中，将DNA-PK抑制剂与基因组编辑系统一起施用给细胞会导致感兴趣基因的表达增加或表达减少。在某些实施方案中，与不向细胞施用DNA-PK抑制剂的基线条件相比，感兴趣基因的表达增加或减少可以为约下列或介于下列之间：2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。在某些实施方案中，与不向细胞施用DNA-PK抑制剂的基线表达水平相比，感兴趣基因的增加或减少可以为约下列或介于下列之间：0.5倍、1.0倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍或10倍。
在某些实施方案中，将DNA-PK抑制剂与基因组编辑系统一起施用给细胞导致基因组编辑的增加。在某些实施方案中，与不向细胞施用DNA-PK抑制剂的基线条件相比，基因组编辑的增加可以为约下列或介于下列之间：2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％。在某些实施方案中，与不向细胞施用DNA-PK抑制剂的基线表达水平相比，基因组编辑的增加可以为约下列或介于下列之间：0.5倍、1.0倍、1.5倍、2.0倍、2.5倍、3.0倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍或10倍。
在某些实施方案中，与向细胞群仅施用基因编辑系统且未施用DNA-PK抑制剂的基线条件相比，向细胞群施用DNA-PK抑制剂和基因编辑系统会导致更大的细胞存活率。在某些实施方案中，导致更大细胞存活率的DNA-PK抑制剂是式(III-E-1)或(III-E-2)的化合物或其药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，在S或G2细胞周期阶段，在施用DNA-PK抑制剂之前、之后或期间同步化细胞。在某些实施方案中，在S或G2细胞周期阶段，在引入基因编辑组分之前、之后或期间同步化细胞。S或G2细胞周期阶段的细胞同步化可通过本领域已知的任何方法实现。作为非限制性实例，可用于使细胞在S或G2细胞周期阶段同步化的试剂包括阿非迪霉素、羟基脲、洛伐他汀、含羞草碱、诺考达唑、胸苷或它们的任何组合。(参见Lin等人，Elife.2014年12月15日；32014)。在某些实施方案中，可以在基因编辑过程中的任何时间施用用于细胞同步化的试剂。
在某些实施方案中，DNA-PK抑制剂和/或基因组编辑系统可以连同使用说明书包含在容器、包装或分配器中。在某些实施方案中，包含在容器、包装或分配器中的DNA-PK抑制剂和/或基因组编辑系统连同使用说明书组成试剂盒。
在某些实施方案中，DNA-PK抑制剂和/或基因组编辑系统与使用说明书一起包含在试剂盒中。该试剂盒可含有任何基因组编辑系统和/或DNA-PK抑制剂和使用说明书。在某些实施方案中，DNA-PK抑制剂是由结构式(III-E-1)或(III-E-2)表示的化合物中的任一种。在某些实施方案中，基因组编辑系统选自基于大范围核酸酶的系统、基于锌指核酸酶(ZFN)的系统、基于类转录激活因子效应物的核酸酶(TALEN)系统、基于CRISPR的系统或基于NgAgo的系统。基因组编辑系统可以任何形式在试剂盒中提供，例如作为质粒、载体、DNA或RNA构建体。
在某些实施方案中，在体内施用DNA-PK抑制剂和/或基因组编辑系统。DNA-PK抑制剂和基因编辑系统被配制成与其预期施用途径相容。上面描述了施用途径的例子。
在某些实施方案中，制剂还可包含多于一种所治疗的特定适应症所必需的活性化合物，例如具有不会不利地影响彼此的互补活性的那些活性成分。另选地/除此之外，组合物可包含增强其功能的试剂，诸如细胞毒剂、细胞因子、化学治疗剂或生长抑制剂。此类分子以对于预期目的有效的量适当地联合存在。
在某些实施方案中，DNA-PK抑制剂和/或基因组编辑系统以组合疗法施用，即，与可用于治疗病理状况或病症(例如各种形式的癌症和炎症性疾病)的其它试剂例如治疗剂组合。在该上下文中，术语“组合”意指试剂基本上同时(同时地或依序地)施用。如果依序地施用，在开始施用第二种化合物时，两种化合物中的第一种优选地在治疗部位仍可检测到有效浓度。
基因组编辑筛选方法
本领域已知的任何方法可用于筛选细胞的基因组编辑效率，包括NHEJ和/或HDR的效率。例如，筛选方法可以包括基于PCR的靶向区域扩增，然后对扩增区域进行测序或深度测序以确认基因组编辑。PCR基因分型能够在刺激HDR时对化合物进行量化和排序。其它筛选方法可以包括新一代测序。参见例如Bell等人，“A high-throughput screeningstrategy for detecting CRISPR-Cas9 induced mutations using next-generationsequencing,”BMC Genomics,15:1002(2014)。
可对PCR引物进行工程改造以选择性扩增未修饰和经修饰的遗传区，从而产生取决于遗传修饰状态的不同长度的扩增子。然后可以在凝胶上分离扩增子，并使用Bio-Imager通过密度测定法估计HDR效率。另选地，新的PCR技术快速微滴数字PCR(DDPCR)可用于同时测量基因组编辑样品中的HDR和NHEJ事件。参见例如Miyaoka等人,“Systematicquantification of HDR and NHEJ reveals effectrs of locus,nuclease,and celltype on genome-editin,”Scientific Reports,6,2016。可用于筛选细胞进行基因组修饰的其它方法包括Sanger测序、深度测序和RT-PCR。
本发明的化合物的制备
本文中使用的所有缩写、符号和惯例与当代科学文献中使用那些一致。参见，例如，Janet S.Dodd,编,The ACS Style Guide:A Manual for Authors and Editors,第2版,Washington,D.C.:American Chemical Society,1997。如下定义描述了本文中使用的术语和缩写：
BPin 频哪醇硼酸酯
盐水 饱和的NaCl水溶液
DCM 二氯甲烷
DIAD 二异丙基偶氮二甲酸酯
DIEA 二异丙基乙胺
DMA 二甲基乙酰胺
DMF 二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
DTT 二硫苏糖醇
ESMS 电喷射质谱法
Et2O 乙醚
EtOAc 乙酸乙酯
EtOH 乙醇
HEPES 4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸
HPLC 高效液相色谱法
IPA 异丙醇
LAH 氢化铝锂
LC-MS 液相色谱法-质谱法
LDA 二异丙基乙基氨基锂
Me 甲基
MeOH 甲醇
MsCl 甲磺酰氯
MTBE 甲基叔丁基醚
NMP N-甲基吡咯烷
Pd2(dba)3 三(二亚苄基丙酮)二钯(0)
Pd(dppf)Cl2 1,1'双(二苯基膦基)-二茂铁二氯-钯
PG 保护基
Ph 苯基
(rac)-BINAP 外消旋的2,2'-双(二苯基膦基)-1,1'-联萘
RockPhos 二叔丁基(2',4',6'-三异丙基-3,6-二甲氧基-[1,1'-联苯]-2-基)膦
RT或rt 室温
SFC 超临界流体色谱法
SPhos 2-二环己基膦基-2',6'-二甲氧基联苯
TBAI 四丁基碘化铵
tBu 叔丁基
THF 四氢呋喃
TEA 三乙胺
TMEDA 四甲基乙二胺
VPhos [3-(2-二环己基膦基苯基)-2,4-二甲氧基-苯基]磺酰氧基钠
通用合成方法
一般而言，通过本文描述的方法或通过本领域技术人员已知的其它方法，可以制备本发明的化合物。
实施例1.式G的化合物的一般制备
Figure BDA0002641974200001021
方案1
可以如下文方案1中所概括的制备式(III-E-1)或(III-E-2)的化合物，其中X是NH。因此，如方案1的步骤1-i中所示，通过在极性非质子溶剂中加热混合物使式A的杂芳基化合物与吗啉或吗啉类似物反应，得到式B的化合物。使用钯催化的、膦配体辅助的Buchwald/Hartwig-型偶联，如方案1的步骤1-ii中所示，可以使式B的化合物与式C的氨基环己烷反应，得到式D的化合物，其中R1和R2如本文别处所述。在一个实例中，当制备式E的单被保护的内消旋环己烷-1,4-二胺类时，保护基的除去形成式F的化合物，如方案1的步骤1-iii中所示。然后可以使得到的游离胺与具有针对胺类反应的基团的不同部分(例如，R1a-L，其中L是离去基团，例如氯、溴、碘、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯或三氟甲磺酸酯；或其中L是反应性含羰基部分，例如活性酯或异氰酸根合基团)反应，得到式G的化合物，如方案1的步骤1-iv中所示。
实施例2.式M、N、R和S的化合物的一般制备
Figure BDA0002641974200001031
方案2a
可以如下文方案2a和2b中概括的制备(III-E-1)或(III-E-2)的化合物，其中X是O。因此，如方案2a的步骤2-i中所示，可以保护式H的杂芳基化合物的羟基，得到式J的化合物，然后可以通过在极性非质子溶剂中加热混合物使其与吗啉或吗啉类似物反应，除去保护基后得到式K的化合物，如方案2a的步骤2-ii和2-iii中所示。随后，如方案2a的步骤2-iv中所示，可以使式K的化合物与式L的化合物(例如其中L是离去基团，例如氯、溴、碘、甲苯磺酸酯、甲磺酸酯或三氟甲磺酸酯)在足以影响其离去基团的SN2置换的条件下反应，得到式M或式M的化合物，视R1或R2是否为氢而定。在那些情况中，当R1或R2是被保护的氮或氧部分时，可以通过除去保护基且随后合成操作得到的游离胺/醇生产本发明的化合物。
可替换地，如方案2b中所示，可以使式O的化合物的羟基与式L的化合物反应，得到式P的稠合的双环杂芳基溴，随后可以使所述双环杂芳基溴与吗啉或吗啉类似物反应，得到式M或式N的化合物。
Figure BDA0002641974200001041
方案2b
可替换地，如方案2c中所示，可以通过使式Q的化合物与(3,6-二氢-2H-吡喃-4-基)硼酸酯(boronate)反应制备本发明的化合物，其中环B是二氢吡喃环，得到式R的化合物。然后可以将式R的化合物还原成式S的化合物。
Figure BDA0002641974200001042
方案2c
实施例3.(4-((7-吗啉代喹喔啉-5-基)氨基)环己基)氨基甲酸乙酯(化合物6)和N1-(7-吗啉代喹喔啉-5-基)-N4-(嘧啶-2-基)环己烷-1,4-二胺(化合物18)的制备
Figure BDA0002641974200001051
方案3
如方案3的步骤3-i中所示，向3-溴-5-氟-苯-1,2-二胺(化合物1001,1.11g,5.41mmol)在甲醇(11mL)中的溶液中加入草醛(oxaldehyde)(1.57mL 40％w/v,10.8mmol)。将该反应混合物在室温在氮气下搅拌。2小时后，黄色固体沉淀。将反应混合物用水(20mL)稀释，搅拌另外5分钟，过滤，并将收集的固体在高真空下干燥，得到5-溴-7-氟喹喔啉(化合物1002,868mg,70.6％收率):1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ9.06(s,2H),8.36(dd,J＝8.5,2.7Hz,1H),8.00(dd,J＝9.2,2.7Hz,1H)；ESMS(M+H+)＝227.14。
如方案3的步骤3-ii中所示，向5-溴-7-氟喹喔啉(4.5g,19.8mmol)在NMP(67.5mL)中的溶液中加入吗啉(3.1mL,35.6mmol)。将反应混合物加热至140℃和搅拌15小时。冷却后，将混合物倒入水(200mL)中，用乙酸乙酯(2x 100mL)萃取，经硫酸镁干燥，过滤，在减压下蒸发，并通过中压硅胶(silica gel)色谱法(10-80％EtOAc/己烷类(hexanes)梯度)纯化，得到作为黄色固体的4-(8-溴喹喔啉-6-基)吗啉(化合物1003,3.86g,66％收率):1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.82(d,J＝1.6Hz,1H),8.73(d,J＝1.6Hz,1H),8.12(d,J＝2.5Hz,1H),7.27(d,J＝2.4Hz,1H),3.87-3.69(m,4H),3.44-3.34(m,4H)；ESMS(M+H+)＝227.14。
如方案3的步骤3-iii中所示，将4-(8-溴喹喔啉-6-基)吗啉(1.57g,5.34mmol)、N-(4-氨基环己基)氨基甲酸叔丁酯(1.37g,6.40mmol)、(rac)-BINAP(664mg,1.07mmol)、碳酸铯(5.22g,16.0mmol)和Pd2(dba)3(489mg,0.534mmol)在甲苯(50mL)中的混合物在100℃加热12小时。冷却后，将混合物用乙酸乙酯(150mL)和水(25mL)稀释，然后穿过硅藻土过滤，随后将其用乙酸乙酯洗涤。将合并的有机层用盐水洗涤，经硫酸钠干燥，在减压下浓缩，并通过中压硅胶色谱法(0-60％EtOAc/己烷类梯度)纯化以得到(-4-((7-吗啉代喹喔啉-5-基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(化合物1004,1.83g,83.2％收率):1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.65(d,J＝2.0Hz,1H),8.35(d,J＝2.0Hz,1H),6.60(d,J＝2.4Hz,1H),6.34(d,J＝2.4Hz,1H),6.11(d,J＝7.8Hz,1H),4.60(s,1H),3.97-3.86(m,4H),3.67(s,2H),3.41-3.25(m,4H),1.85(d,J＝3.0Hz,5H),1.74-1.57(m,3H),1.45(s,9H)。
如方案3的步骤3-iv中所示，向(-4-((7-吗啉代喹喔啉-5-基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(900mg,2.00mmol)在二氯甲烷(16mL)中的溶液中加入三氟乙酸(3mL,38.9mmol)。将得到的黑色反应混合物在氮气氛下在室温搅拌2小时。缓慢地加入饱和碳酸氢钠水溶液(150mL)，直到颜色从黑色变成橙色。将混合物用二氯甲烷(2x 100mL)萃取并将合并的有机层用盐水(50mL)洗涤，经硫酸钠干燥，并在减压下浓缩，得到-N1-(7-吗啉代喹喔啉-5-基)环己烷-1,4-二胺,三氟乙酸盐(化合物1005):1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.64(d,J＝1.9Hz,1H),8.36(d,J＝1.9Hz,1H),6.59(d,J＝2.3Hz,1H),6.34(d,J＝2.3Hz,1H),6.20(d,J＝7.9Hz,1H),3.95-3.84(m,4H),3.69(s,1H),3.41-3.25(m,4H),2.93(d,J＝8.9Hz,1H),2.09-1.87(m,2H),1.90-1.68(m,6H),1.58(dd,J＝11.2,8.7Hz,2H)；ESMS(M+H+)＝328.34。将该化合物不经进一步纯化原样使用。
如方案3的步骤3-v中所示，向N1-(7-吗啉代喹喔啉-5-基)环己烷-1,4-二胺(25mg,0.07mmol)和二异丙基乙胺(18.0mg,24.3μL,0.14mmol)在二氯甲烷(750μL)中的溶液中加入氯甲酸乙酯(11.4mg,10.0μL,0.105mmol)。将反应混合物搅拌12小时，用二氯甲烷(10mL)稀释，用饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)洗涤，经硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。将得到的残余物通过HPLC制备型色谱法纯化，使用10-90％乙腈/水(0.1％TFA)梯度作为洗脱剂，以得到(4-((7-吗啉代喹喔啉-5-基)氨基)环己基)氨基甲酸乙酯(化合物6,14mg,50％收率):1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.65(d,J＝2.0Hz,1H),8.36(d,J＝2.0Hz,1H),6.61(d,J＝2.4Hz,1H),6.35(d,J＝2.4Hz,1H),6.10(d,J＝7.6Hz,1H),4.72(s,1H),4.12(q,J＝7.0Hz,2H),3.96-3.82(m,4H),3.68(s,2H),3.42-3.23(m,4H),1.93-1.78(m,6H),1.69(dd,J＝15.0,6.3Hz,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H)；ESMS(M+H+)＝400.17。
如方案3的步骤3-vi中所示，将N1-(7-吗啉代喹喔啉-5-基)环己烷-1,4-二胺(185mg,0.56mmol)、2-溴嘧啶(93mg,0.58mmol)和三乙胺(143mg,197μL,1.41mmol)在1-甲基吡咯烷-2-酮(3mL)的混合物加热至130℃和搅拌15小时。冷却至室温(RT)以后，将混合物用乙酸乙酯(70mL)和甲基叔丁基醚(20mL)稀释，用水(3x 20mL)洗涤，用盐水(15mL)洗涤，经硫酸钠干燥，在减压下浓缩，并通过中压硅胶色谱法(10-100％EtOAc/己烷类梯度)纯化以得到N1-(7-吗啉代喹喔啉-5-基)-N4-(嘧啶-2-基)环己烷-1,4-二胺(化合物18,102mg,45％收率):1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.65(d,J＝2.0Hz,1H),8.37(d,J＝2.0Hz,1H),8.27(d,J＝4.8Hz,2H),6.60(d,J＝2.4Hz,1H),6.51(t,J＝4.8Hz,1H),6.36(d,J＝2.4Hz,1H),6.15(d,J＝7.8Hz,1H),5.20(d,J＝7.7Hz,1H),4.04(d,J＝7.9Hz,1H),3.96-3.82(m,4H),3.70(s,1H),3.39-3.24(m,4H),1.94(dd,J＝13.7,4.4Hz,6H),1.78(dt,J＝28.8,16.1Hz,2H)；ESMS(M+H+)＝328.34。
实施例4.1-(4-((7-(8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)喹喔啉-5-基)氨基)环己基)-3-乙基脲(化合物22)的制备
Figure BDA0002641974200001081
方案4
如方案4的步骤4-i中所示，在室温向5-溴-7-氟喹喔啉(化合物1002,150mg,0.66mmol)在NMP(2.3mL)中的溶液中加入8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷(178mg,1.2mmol)。将反应混合物密封在微波瓶中并在180℃加热20分钟。冷却至室温并倒入水中以后，将水相用EtOAc(3x)萃取。将合并的萃取物经MgSO4干燥，过滤，在减压下浓缩，并通过中压硅胶色谱法(0-100％EtOAc/己烷类梯度)纯化以得到作为深橙色油的3-(8-溴喹喔啉-6-基)-8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷(化合物1006,87mg,41％收率):ESMS(M+H+)＝320.07。
如方案4的步骤4-ii中所示，将3-(8-溴喹喔啉-6-基)-8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷(261mg,0.815mmol)、N-(4-氨基环己基)氨基甲酸叔丁酯(210mg,0.98mmol)、rac-BINAP(102mg,0.163mmol)、Cs2CO3(797mg,2.45mmol)和Pd2(dba)3(75mg,0.0815mmol)在甲苯(10.5mL)中的脱气溶液在密封微波管中在100℃(油浴温度)加热15小时。冷却后，将混合物直接应用于色谱柱并通过中压硅胶色谱法(0-100％EtOAc/己烷类梯度)纯化以得到作为白色固体的(4-((7-(8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)喹喔啉-5-基)氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(化合物1007,141mg,36％收率):1H-NMR(400MHz,CDCl3)d8.49(s,1H),8.23(d,J＝1.5Hz,1H),6.48(s,1H),6.18(d,J＝1.9Hz,1H),6.06(s,1H),4.52(s,1H),4.47(s,2H),3.60(s,2H),3.45(d,J＝11.6Hz,2H),3.14-3.12(m,2H),1.96-1.84(m,4H),1.79(s,5H),1.54(s,3H)和1.38(s,9H)ppm；ESMS(M+H+)＝453.96。
如方案4的步骤4-iii中所示，在室温向化合物1007(141mg,0.295mmol)在CH2Cl2(2.5mL)中的溶液中加入TFA(656mg,443μL,5.75mmol)。将得到的黑色溶液搅拌2小时，并然后通过加入饱和NaHCO3直到黑色逐渐变成橙色来猝灭反应。将反应混合物用CH2Cl2(3x)萃取并将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥和蒸发至干燥以得到N1-(7-(8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)喹喔啉-5-基)环己烷-1,4-二胺,三氟乙酸盐(化合物1008):ESMS(M+H+)＝354.20。将该物质不经任何进一步纯化用在后续反应中。
如方案4的步骤4-iv中所示，在室温向化合物1008(45mg,0.071mmol)和DIEA(36.5mg,49.0μL,0.28mmol)在CH2Cl2(1.4mL)中的溶液中加入异氰酸乙酯(20mg,0.28mmol)。将溶液在该温度搅拌15小时并然后直接应用于色谱柱，并通过中压硅胶色谱法(0-100％EtOAc/己烷类梯度)纯化以得到作为白色固体的1-(4-((7-(8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)喹喔啉-5-基)氨基)环己基)-3-乙基脲(化合物22,8mg,27％收率):1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.54(s,1H),8.22(s,1H),6.43(s,1H),6.19(s,1H),6.02(s,1H),4.47(s,2H),4.38(d,J＝5.2Hz,1H),4.28(s,1H),3.74(s,1H),3.60(s,1H),3.42(s,4H),3.14-3.09(m,4H),2.05-1.87(m,3H),1.79(s,3H),1.55(d,J＝7.1Hz,2H)和1.21-1.05(m,5H)ppm；ESMS(M+H+)＝425.35。
实施例5.N1-(6-吗啉代苯并[c][1,2,5]
Figure BDA0002641974200001102
二唑-4-基)-N4-(嘧啶-2-基)环己烷-1,4-二胺(化合物23)的制备
Figure BDA0002641974200001101
方案5
如方案5的步骤5-i中所示，将((顺式)-4-氨基环己基)氨基甲酸叔丁酯(化合物1009,490mg,2.3mmol)、2-氯嘧啶(262mg,2.3mmol)和TEA(463mg,637μL,4.6mmol)在DMF(10mL)中的混合物在150℃进行微波辐射20分钟。将反应混合物用EtOAc稀释，用H2O洗涤，经Na2SO4干燥，在减压下浓缩，并通过中压硅胶色谱法(0-50％EtOAc/己烷类梯度)纯化以得到作为白色固体的((顺式)-4-(嘧啶-2-基氨基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(化合物1010):1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.28(d,J＝4.8Hz,2H),6.53(t,J＝4.8Hz,1H),5.12(s,1H),4.56(s,1H),3.99(dq,J＝7.0,3.5Hz,1H),3.65(s,1H),1.83(tq,J＝10.2,3.6Hz,5H),1.66(s,8H),8.13-7.91(m,3H),1.47(s,9H)。
如方案5的步骤5-ii中所示，将HCl(3mL,4M的在THF中的溶液，12mmol)加入化合物1010。将混合物搅拌30min并在减压下浓缩以得到(顺式)-N1-(嘧啶-2-基)环己烷-1,4-二胺盐酸盐(化合物1011)。将该物质不经进一步纯化原样用在后续反应中。
如方案5的步骤5-iii中所示，将4-溴-6-吗啉代苯并[c][1,2,5]
Figure BDA0002641974200001111
二唑(化合物1012,147mg,0.5mmol)、(顺式)-N1-(嘧啶-2-基)环己烷-1,4-二胺盐酸盐(120mg,0.6mmol)、(rac)-BINAP(32mg,0.05mmol)、Pd2(dba)3(24mg,0.026mmol)和碳酸铯(506mg,1.55mmol)在甲苯(5mL)中的混合物用氮气净化并在90℃在氮气氛下搅拌过夜。将混合物穿过硅藻土层过滤，在减压下浓缩，并通过中压硅胶色谱法(0-80％EtOAc/己烷类梯度)纯化以得到作为橙色固体的(顺式)-N1-(6-吗啉代苯并[c][1,2,5]
Figure BDA0002641974200001112
二唑-4-基)-N4-(嘧啶-2-基)环己烷-1,4-二胺(化合物23):1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.20(d,J＝4.9Hz,2H),6.46(t,J＝4.8Hz,1H),6.05(d,J＝1.6Hz,1H),5.82(s,1H),5.24(s,1H),4.82(d,J＝7.0Hz,1H),3.98(s,1H),3.85-3.72(m,4H),3.60(s,1H),3.23-3.06(m,4H),1.95-1.62(m,8H)。
实施例6.5-甲氧基-N-((顺式)-4-((7-吗啉代喹喔啉-5-基)氧基)环己基)嘧啶-2-胺(化合物134)的制备
Figure BDA0002641974200001121
方案6
如方案6的步骤6-i中所示，向5-溴-2-氟-嘧啶(1g,5.651mmol)在iPrOH(10mL)中的混合物中加入TEA(1.143g,1.574mL,11.30mmol)和反式-4-氨基环己烷-1-醇(650.8mg,5.651mmol)。将混合物在150℃微波20min，在减压下浓缩，用EtOAc稀释，用水洗涤，并经Na2SO4干燥。在减压下除去挥发物以后，将残余物通过中压硅胶色谱法(0-80％EtOAc/己烷类梯度)纯化以得到(反式)-4-((5-溴嘧啶-2-基)氨基)环己醇(化合物1013,1.2g):1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.28(s,2H),5.03(d,J＝8.1Hz,1H),3.91-3.49(m,2H),2.31-1.90(m,4H),1.56-1.19(m,4H).。
如方案6的步骤6-ii中所示，向化合物1013(1.2g,4.41mmol)在DCM(20mL)中的溶液中加入TEA(1.134g,1.84mL,13.2mmol)和MsCl(505mg,341μL,4.41mmol)。将反应混合物搅拌1小时，在减压下浓缩，并通过中压硅胶色谱法(0-80％EtOAc/己烷类梯度)纯化以得到反式-4-((5-溴嘧啶-2-基)氨基)环己基甲磺酸酯(化合物1014):1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.29(s,2H),5.03(d,J＝7.8Hz,1H),4.70(tt,J＝10.6,3.9Hz,1H),3.80(dtt,J＝11.2,7.6,3.7Hz,1H),3.04(s,3H),2.30-2.12(m,4H),1.93-1.69(m,2H),1.51-1.33(m,2H)。
如方案6的步骤6-iii中所示，向2-氨基-3-硝基苯酚(5.00g,32.4mmol)在二
Figure BDA0002641974200001131
烷(50mL)中的溶液中加入溴(6.22g,2.01mL,38.9mmol)。将混合物搅拌2小时并形成沉淀物，将其收集，并用二
Figure BDA0002641974200001132
烷和乙醚洗涤。将得到的黄色固体用饱和NaHCO3溶液处理，将其用EtOAc(3x)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤，并在减压下浓缩以得到作为棕色固体的2-氨基-5-溴-3-硝基苯酚(化合物1015)。将该物质不经进一步纯化原样用在后续反应中。
如方案6的步骤6-iv中所示，向2-氨基-5-溴-3-硝基苯酚(7.5g,31.8mmol)在乙酸乙酯(60mL)中的溶液中加入兰尼镍(Raney nickel)TM(1.90g,214μL,32.4mmol)，并将反应混合物在H2气氛下在30p.s.i摇动2小时。过滤和经Na2SO4干燥以后，将混合物在减压下浓缩以得到2,3-二氨基-5-溴苯酚(化合物1016)，将其不经进一步纯化原样用在后续反应中。
如方案6的步骤6-v中所示，将2,3-二氨基-5-溴苯酚(6.0g,29.5mmol)溶解在甲醇中并向该溶液中加入乙二醛(3.77g,2.98mL,64.9mmol)和搅拌过夜。将反应混合物在减压下浓缩至最小体积并将得到的褐色固体通过过滤进行收集，并在高真空下干燥以得到7-溴喹喔啉-5-醇(化合物1017)，将其不经进一步纯化原样用在后续反应中。
如方案6的步骤6-vi中所示，向7-溴喹喔啉-5-醇(2.0g,8.89mmol)在DCM(20mL)中的溶液中加入咪唑(1.82g,26.7mmol)和叔丁基二甲基甲硅烷基氯(tert-butyldimethylsilyl chloride)(1.34g,1.65mL,8.89mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜，在减压下浓缩，并通过中压硅胶色谱法(0-20％EtOAc/己烷类梯度)纯化以得到作为无色油的7-溴-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)喹喔啉(化合物1018):1H-NMR(300MHz,CDCL3)δ8.69(q,J＝1.8Hz,2H),7.80(d,J＝2.1Hz,1H),7.22(d,J＝2.1Hz,1H),0.96(s,9H),0.81(s,7H)。
如方案6的步骤6-vii中所示，将7-溴-5-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)喹喔啉(700mg,2.06mmol)、吗啉(270mg,270μL,3.09mmol)、Pd2(dba)3(94.50mg,0.1032mmol)、(rac)-BINAP(129mg,0.206mmol)、碳酸铯(2.02g,6.19mmol)在甲苯(7mL)中的混合物用氮气净化10分钟。然后将混合物在100℃加热过夜。冷却后，将反应混合物用EtOAc稀释，穿过硅藻土层过滤，在减压下浓缩，并通过中压硅胶色谱法(0-30％EtOAc/己烷类梯度)纯化以得到7-吗啉代喹喔啉-5-醇。将该化合物(450mg,1.3mmol)溶解在THF(20mL)中并加入四正丁基氟化铵(539mg,2.06mmol)。将反应混合物搅拌0.5小时，在减压下浓缩，并通过中压硅胶色谱法(0-100％EtOAc/己烷类梯度)纯化以得到作为黄色固体的7-吗啉代喹喔啉-5-醇(化合物1019):1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.75(d,J＝2.0Hz,1H),8.46(d,J＝2.0Hz,1H),7.70(d,J＝41.8Hz,1H),7.01(d,J＝2.6Hz,1H),6.89(d,J＝2.5Hz,1H),4.12-3.78(m,4H),3.51-3.24(m,4H)。
如方案6的步骤6-viii中所示，将7-吗啉代喹喔啉-5-醇(100mg,0.432mmol)、(反式)-4-((5-溴嘧啶-2-基)氨基)环己基甲磺酸酯(化合物1014,303mg,0.865mmol)和CsCO3(282mg,0.865mmol)在二
Figure BDA0002641974200001141
烷(1.0mL)中的溶液在105℃搅拌16小时。冷却后，将反应混合物用EtOAc稀释，穿过硅藻土过滤，在减压下浓缩，并通过中压硅胶色谱法(0-5％MeOH/DCM梯度)纯化以得到作为黄色泡沫的5-溴-N-((顺式)-4-((7-吗啉代喹喔啉-5-基)氧基)环己基)嘧啶-2-胺(化合物1020,110mg):1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.70(d,J＝2.0Hz,1H),8.64(d,J＝1.9Hz,1H),8.29(s,2H),6.98(d,J＝2.5Hz,1H),6.92(d,J＝2.5Hz,1H),5.29(d,J＝8.3Hz,1H),4.81(s,1H),4.04-3.84(m,4H),3.42-3.31(m,4H),2.22(s,2H),1.92(d,J＝4.9Hz,6H)。
如方案6的步骤6-ix中所示，将5-溴-N-((顺式)-4-((7-吗啉代喹喔啉-5-基)氧基)环己基)嘧啶-2-胺(75mg,0.155mmol)、碳酸铯(101mg,0.309mmol)、烯丙基二氯化钯(II)二聚体(0.28mg,0.0015mmol)、RockPhos(2.17mg,0.0046mmol)和MeOH(9.9mg,12.5μL,0.31mmol)在甲苯(2mL)中的混合物用氮气净化并加热至100℃保持18小时。将反应混合物用EtOAc稀释，穿过硅藻土层过滤，并在减压下浓缩。通过中压硅胶色谱法(0-8％MeOH/DCM梯度)纯化，得到5-甲氧基-N-((顺式)-4-((7-吗啉代喹喔啉-5-基)氧基)环己基)嘧啶-2-胺(化合物134,43mg):1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.70(d,J＝1.9Hz,1H),8.63(d,J＝1.9Hz,1H),8.07(s,2H),6.96(d,J＝2.5Hz,1H),6.92(d,J＝2.5Hz,1H),5.01(d,J＝8.1Hz,1H),4.80(q,J＝5.6,4.2Hz,1H),4.03-3.87(m,5H),3.80(s,3H),3.42-3.27(m,4H),2.29-2.10(m,2H),1.99-1.82(m,6H)。
实施例7.4-(8-(((反式)-4-(嘧啶-2-基氧基)环己基)氧基)喹喔啉-6-基)吗啉(化合物34)和4-(8-(((顺式)-4-(嘧啶-2-基氧基)环己基)氧基)-喹喔啉-6-基)吗啉(化合物42)的制备
Figure BDA0002641974200001151
方案7
如方案7的步骤7-i中所示，向1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-醇(化合物1021,1.0g,6.32mmol)在DMF(10mL)中的溶液中加入NaH(370mg,9.25mmol)。将反应混合物搅拌20分钟，然后加入2-氯嘧啶(869mg,7.59mmol)。将混合物在室温搅拌30分钟，并然后加热至100℃保持9小时。冷却后，将混合物用EtOAc稀释，用H2O洗涤,经Na2SO4干燥，在减压下浓缩，并通过中压硅胶色谱法(0-40％EtOAc/己烷类)纯化以得到作为无色油的2-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-基氧基)嘧啶(化合物1022):1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ8.52(d,J＝4.8Hz,2H),6.92(t,J＝4.8Hz,1H),5.15(ddd,J＝10.7,6.5,4.2Hz,1H),4.05-3.87(m,4H),2.14-1.85(m,6H),1.79-1.65(m,2H)；ESMS(M+H+)＝237.12。
如方案7的步骤7-ii中所示，向2-(1,4-二氧杂螺[4.5]癸烷-8-基氧基)嘧啶(620mg,2.624mmol)中加入HCl(4.0mL 6M,8.86mmol)和将反应混合物搅拌2小时。将混合物的pH用饱和NaHCO3(水溶液)中和并将混合物在减压下浓缩为甲醇共沸物。向残余物中加入DCM(30mL)以得到沉淀物，随后搅拌另外20分钟。将固体滤出并将母液在减压下浓缩。将得到的残余物溶解在甲醇中并加入硼氢化钠(151mg,3.99mmol)固体。将混合物搅拌1小时并用HCl(6M,0.70mL)猝灭反应。继续搅拌直到气体形成停止。用1N氢氧化钠将混合物的pH调至约8，并用EtOAc(20mL)萃取。将有机物经硫酸钠干燥并在减压下浓缩以得到4-(嘧啶-2-基氧基)环己醇(化合物1023,248mg,64％收率)作为(顺式)-和(反式)-异构体的混合物。将样品的12mg等分试样通过HPLC制备型反相色谱法(含有0.1％TFA的10-90％CH3CN/水梯度)纯化以分离异构体:(反式)-4-嘧啶-2-基氧基环己醇-1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ8.54(d,J＝4.8Hz,2H),6.95(t,J＝4.8Hz,1H),5.05(tt,J＝9.4,4.0Hz,1H),3.91-3.75(m,1H),2.26-1.99(m,4H),1.76-1.41(m,4H)；ESMS(M+H+)＝195.07,(顺式)-4-嘧啶-2-基氧基环己醇-1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ8.62(d,J＝4.9Hz,2H),7.04(t,J＝4.9Hz,1H),5.21(tt,J＝5.3,2.6Hz,1H),4.56(s,1H),3.85(p,J＝5.9Hz,1H),2.17-2.02(m,2H),1.88-1.67(m,6H)；ESMS(M+H+)＝195.07。将剩余物作为顺/反混合物用在后续反应中。
如方案7的步骤7-iii中所示，向4-嘧啶-2-基氧基环己醇(244mg,1.256mmol)和三乙胺(350μL,2.51mmol)的顺/反混合物在二氯甲烷(5mL)中的溶液中加入甲烷磺酰氯(145μL,1.87mmol)。将反应混合物搅拌2小时，在减压下浓缩，并通过中压硅胶色谱法(0-20％EtOAc/二氯甲烷梯度)纯化以得到(4-嘧啶-2-基氧基环己基)甲磺酸酯(化合物1024,239mg,70％收率)作为顺/反异构体的混合物:1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ8.51(d,J＝4.8Hz,2H),6.93(t,J＝4.8Hz,1H),5.13(dq,J＝9.9,3.0Hz,1H),4.87(p,J＝3.8Hz,1H),3.04(d,J＝2.4Hz,3H),2.28-1.99(m,4H),1.99-1.74(m,4H)；ESMS(M+H+)＝273.52。
如方案7的步骤7-iv中所示，将(4-嘧啶-2-基氧基环己基)甲磺酸酯(105mg,0.386mmol)、7-吗啉代喹喔啉-5-醇(178.3mg,0.7712mmol)和Cs2CO3(125.6mg,0.3856mmol)在二
Figure BDA0002641974200001171
烷(1.5mL)中的混合物密封在5mL微波管中并使用油浴加热至110℃保持14小时。将反应混合物冷却至室温，用EtOAc稀释，和穿过硅藻土过滤，随后将其用乙酸乙酯洗涤。将滤液在减压下浓缩并将残余物通过制备型反相HPLC(含有0.1％TFA的10-90％CH3CN/水梯度)纯化。将含有顺式和反式异构体的混合物的级分通过SFC进一步纯化，其中使用手性OJ柱和用40％的MeOH在CO2中的溶液洗脱以得到21mg 4-(8-(((反式)-4-(嘧啶-2-基氧基)环己基)氧基)喹喔啉-6-基)吗啉(化合物34):1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ8.69(dd,J＝3.4,1.9Hz,1H),8.62(dd,J＝3.6,1.9Hz,1H),8.51(dd,J＝4.8,2.2Hz,2H),7.01-6.83(m,3H),5.18(tt,J＝7.0,3.4Hz,1H),4.79(tt,J＝6.9,3.1Hz,1H),4.00-3.85(m,4H),3.34(dq,J＝4.8,2.6Hz,4H),2.44-2.16(m,4H),1.92(tdd,J＝16.4,7.7,2.8Hz,4H)；ESMS(M+H+)＝408.56和22mg 4-(8-(((顺式)-4-(嘧啶-2-基氧基)环己基)氧基)-喹喔啉-6-基)吗啉(化合物42):1H NMR(300MHz,氯仿-d)δ8.70(d,J＝1.9Hz,1H),8.63(d,J＝1.9Hz,1H),8.52(d,J＝4.8Hz,2H),7.01-6.87(m,3H),5.17(ddt,J＝8.7,6.7,3.4Hz,1H),4.76-4.58(m,1H),4.00-3.87(m,4H),3.40-3.27(m,4H),2.43-2.22(m,4H),2.05-1.87(m,2H),1.86-1.71(m,2H)；ESMS(M+H+)＝408.56。
实施例8.N-[(顺式)-4-[7-(3,6-二氢-2H-吡喃-4-基)喹喔啉-5-基]氧基环己基]嘧啶-2-胺(化合物36)
Figure BDA0002641974200001181
方案8
如方案8的步骤8-i中所示，向7-溴喹喔啉-5-醇(化合物1018,200mg,0.89mmol)和碳酸铯(579mg,1.78mmol)在NMP(4.0mL)中的混合物中加入(反式)-4-(嘧啶-2-基氨基)环己基甲磺酸酯(化合物1014,241.1mg,0.8887mmol)。将混合物在90℃搅拌18小时，在此时加入另外0.5当量的化合物1014(241mg,0.89mmol)。在90℃搅拌另外6小时以后，将反应混合物用EtOAc稀释，用H2O洗涤，经Na2SO4干燥，浓缩，并通过中压硅胶色谱法(0-5％MeOH/DCM)纯化以得到N-((顺式)-4-((7-溴喹喔啉-5-基)氧基)环己基)嘧啶-2-胺(化合物1025):1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ9.01-8.77(m,2H),8.29(d,J＝4.8Hz,2H),7.89(d,J＝1.9Hz,1H),7.25(d,J＝2.0Hz,1H),6.53(t,J＝4.8Hz,1H),5.43-5.22(m,1H),4.79(td,J＝5.2,2.5Hz,1H),4.18-3.95(m,1H),3.51(s,1H),2.22(td,J＝10.2,9.6,5.4Hz,2H),2.09-1.86(m,6H)。
如方案8的步骤8-ii中所示，将N-((顺式)-4-((7-溴喹喔啉-5-基)氧基)环己基)嘧啶-2-胺(化合物1025,52mg,0.1299mmol)、Pd(dppf)Cl2(10.61mg,0.01299mmol)、2-(3,6-二氢-2H-吡喃-4-基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(dioxaborolane)(化合物1026,27.3mg,0.13mmol)、Na2CO3(195μL 2M(aq)溶液,0.39mmol)在DMF(1mL)中的混合物用氮气净化10分钟。对混合物在150℃进行微波辐射20min。冷却后，将混合物用EtOAc稀释，用H2O洗涤，经Na2SO4干燥，在减压下浓缩并通过中压硅胶色谱法(0-5％MeOH/DCM)纯化以得到作为灰白色固体的N-[(顺式)-4-[7-(3,6-二氢-2H-吡喃-4-基)喹喔啉-5-基]氧基环己基]嘧啶-2-胺(化合物36):1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.94-8.76(m,2H),8.29(d,J＝4.8Hz,2H),7.67(d,J＝1.7Hz,1H),6.53(t,J＝4.8Hz,1H),6.37(tt,J＝3.1,1.5Hz,1H),5.30(d,J＝7.9Hz,1H),4.87(dt,J＝7.5,3.6Hz,1H),4.43(q,J＝2.8Hz,2H),4.02(t,J＝5.5Hz,3H),2.68(dqd,J＝6.0,3.4,3.0,1.8Hz,2H),2.35-2.11(m,2H),2.07-1.84(m,6H)；ESMS(M+H+)＝404.2。
实施例9.N-((顺式)-4-((7-吗啉代喹喔啉-5-基)氧基)环己基)嘧啶-2-胺(化合物28)
Figure BDA0002641974200001191
方案9
如方案9的步骤9-i中所示，将7-溴喹喔啉-5-醇(化合物1017,5.4g,24.0mmol)、2-((反式)-4-羟基环己基)异吲哚啉-1,3-二酮(5.607g,22.86mmol)和三苯基膦(8.994g,7.945mL,34.29mmol)溶解在无水THF中并将烧瓶在冰浴中冷却。逐滴加入DIAD(6.93g,6.64mL,34.3mmol)并将反应物在0℃搅拌5分钟，然后温热至室温和搅拌18小时。将反应混合物在减压下浓缩，将残余物用Et2O处理和在室温搅拌0.5小时，将沉淀物滤出，将滤液在减压下浓缩，并将残余物通过中压硅胶色谱法(0-50％EtOAc/己烷类梯度)纯化以得到2-[(顺式)-4-(7-溴喹喔啉-5-基)氧基环己基]异吲哚啉-1,3-二酮(化合物1028,6.2g,60％收率):1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.95(d,J＝1.8Hz,1H),8.86(d,J＝1.8Hz,1H),7.91(d,J＝2.0Hz,1H),7.88-7.80(m,2H),7.77-7.68(m,2H),7.31(d,J＝2.0Hz,1H),4.96(t,J＝2.9Hz,1H),4.29(tt,J＝12.5,3.8Hz,1H),2.88(qd,J＝12.9,3.6Hz,2H),2.54-2.32(m,2H),1.94-1.61(m,4H)。
如方案9的步骤9-ii中所示，在配有冷凝器的圆底烧瓶中，将2-[4-(7-溴喹喔啉-5-基)氧基环己基]异吲哚啉-1,3-二酮(6.2g,12.34mmol)、吗啉(1.61g,1.62mL,18.5mmol)和Cs2CO3(12.06g,37.0mmol)在无水甲苯(73mL)中的混合物用rac-BINAP(768.4mg,1.234mmol)和Pd2(dba)3(565mg,0.617mmol)处理。将反应混合物在110℃加热18小时。冷却至室温以后，将混合物穿过硅藻土过滤并在减压下浓缩。将残余物与Et2O一起研磨并将固体通过过滤进行收集并用Et2O洗涤以得到作为黄色固体的2-((顺式)-4-((7-吗啉代喹喔啉-5-基)氧基)环己基)异吲哚啉-1,3-二酮(化合物1029,4.2g)。将滤液在减压下浓缩，并通过中压硅胶色谱法(0-100％EtOAc/己烷类梯度)纯化以得到另外300mg化合物1029:1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.76-8.63(m,2H),7.85(dd,J＝5.4,3.1Hz,2H),7.79-7.60(m,2H),7.09(d,J＝2.6Hz,1H),6.99(d,J＝2.5Hz,1H),5.06(t,J＝2.8Hz,1H),4.27(tt,J＝12.3,3.8Hz,1H),4.02-3.85(m,4H),3.49-3.27(m,4H),3.03-2.75(m,2H),2.37(d,J＝14.0Hz,2H),1.83-1.56(m,4H)。
如方案9的步骤9-iii中所示，向2-[(顺式)-4-(7-吗啉代喹喔啉-5-基)氧基环己基]异吲哚啉-1,3-二酮(2.3g,5.02mmol)在MeOH(25mL)中的悬浮液中加入肼(321mg,315μL,10.0mmol)并将反应混合物在室温搅拌18小时，经过该时间，最初的悬浮液变成均质的，随后出现沉淀物。加入Et2O(30mL)并将反应混合物搅拌另外30分钟。将沉淀物滤出，将滤液在减压下浓缩，将残余物用DCM(30mL)处理，并通过过滤除去任何残余的固体。将滤液在减压下浓缩以得到(顺式)-4-((7-吗啉代喹喔啉-5-基)氧基)环己胺(化合物1030)，将其原样用在后续反应中:1H-NMR(300MHz,CDCl3)δ8.69(d,J＝1.9Hz,1H),8.62(d,J＝1.9Hz,1H),6.95(d,J＝2.5Hz,1H),6.90(d,J＝2.5Hz,1H),5.00-4.67(m,3H),4.03-3.81(m,4H),3.49(s,1H),3.43-3.25(m,4H),2.88(q,J＝6.2Hz,2H),2.36-1.96(m,6H)。
如方案9的步骤9-iv中所示，向(顺式)4-(7-吗啉代喹喔啉-5-基)氧基环己胺(415mg,1.264mmol)和2-甲基磺酰基嘧啶(400mg,2.53mmol)的溶液中加入DIEA(490mg,661μL,3.79mmol)，并将反应混合物密封在容器中并加热至100℃保持16小时。该时间以后，在氮气气流下除去挥发物，并将粗残余物溶解在最小量的DCM中。通过中压硅胶色谱法(0-10％MeOH/DCM,1％Et3N]纯化，产生含有三乙胺盐酸盐作为杂质的N-((顺式)-4-((7-吗啉代喹喔啉-5-基)氧基)环己基)嘧啶-2-胺。将产物溶解在DCM中并与二氧化硅(silica)支持的胺(Silabond
Figure BDA0002641974200001212
40-63μm)一起搅拌。将清除剂混合物过滤，在减压下浓缩，并在高真空下干燥以得到N-((顺式)-4-((7-吗啉代喹喔啉-5-基)氧基)环己基)嘧啶-2-胺(化合物28,435mg):1H-NMR(400MHz,CDCl3)δ8.68(d,J＝1.9Hz,1H),8.61(d,J＝1.9Hz,1H),8.27(s,1H),8.26(s,1H),6.94(d,J＝2.4Hz,1H),6.90(d,J＝2.4Hz,1H),6.50(t,J＝4.8Hz,1H),4.78(s,1H),4.08-3.97(m,1H),3.94-3.86(m,4H),3.37-3.28(m,4H),2.20(d,J＝9.1Hz,2H),1.95-1.85(m,6H)。
实施例10.N-[4-[7-(6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.1]庚烷-3-基)喹喔啉-5-基]氧基环己基]嘧啶-2-胺(化合物291)的制备
Figure BDA0002641974200001211
方案10a
在21℃向7-溴喹喔啉-5-醇(47.53g,211.2mmol)、2-(4-羟基环己基)异吲哚啉-1,3-二酮(52.41g,213.7mmol)和PPh3(87.31g,332.9mmol)在THF(740mL)中的混合物中历时40min逐份加入(NZ)-N-叔-丁氧基羰基亚氨基氨基甲酸叔丁酯(DTBAD)(79.51g,328.0mmol)，从而维持温度低于30℃，并将得到反应混合物在室温搅拌另外20h。
将反应物在真空中蒸发。将残余赤褐色粘稠油溶解在CH2Cl2中并使用施加的气压穿过玻璃柱中的硅胶塞过滤(用悬浮于CH2Cl2中的1L干燥二氧化硅制备塞)。将塞用CH2Cl2洗脱，将级分合并和在真空中蒸发以得到棕红色粘稠油/泡沫，然后将其溶解在700mL MeOH中，然后沉淀。将混合物在室温搅拌1h，过滤，用冷MeOH(500mL)和Et2O(100mL)洗涤，然后在真空中干燥以得到褐色固体，将其悬浮于300mL MeOH中并保持回流10min。将悬浮液冷却至室温和过滤，用另外MeOH和Et2O(4:1)洗涤，并在真空中干燥以得到2-[4-(7-溴喹喔啉-5-基)氧基环己基]异吲哚啉-1,3-二酮(58.43g,126.6mmol,59.94％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.96(d,J＝1.8Hz,1H),8.86(d,J＝1.8Hz,1H),7.91(d,J＝1.9Hz,1H),7.89-7.82(m,2H),7.78-7.67(m,2H),7.30(d,J＝1.9Hz,1H),4.95(s,1H),4.29(tt,J＝12.5,3.7Hz,1H),2.87(qd,J＝13.1,3.5Hz,2H),2.44(d,J＝15.2Hz,2H),1.80(t,J＝14.1Hz,2H),1.67(d,2H)。ESI-MS m/z计算值451.05316，实测452.19(M+1)+；保留时间:0.92分钟。
Figure BDA0002641974200001221
方案10b
将2-[4-(7-溴喹喔啉-5-基)氧基环己基]异吲哚啉-1,3-二酮(1g,2.211mmol)、6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.1]庚烷HCl(180mg,1.328mmol)、碳酸铯(2.161g,6.633mmol)、Pd2(dba)3(202.5mg,0.2211mmol)和rac-BINAP(275.3mg,0.4422mmol)在二
Figure BDA0002641974200001232
烷(5mL)中的混合物在70℃搅拌过夜，然后在微波反应器中在150℃加热15min。然后将反应物用二氯甲烷稀释，穿过硅藻土过滤，并浓缩。硅胶快速柱色谱法(0-5％MeOH/DCM)产生作为黄色固体的2-[4-[7-(6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.1]庚烷-3-基)喹喔啉-5-基]氧基环己基]异吲哚啉-1,3-二酮(750mg,72.1％)，将其用于下一反应。
Figure BDA0002641974200001231
方案10c
向2-[4-[7-(6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.1]庚烷-3-基)喹喔啉-5-基]氧基环己基]异吲哚啉-1,3-二酮(800mg,1.700mmol)在EtOH(10mL)中的溶液中加入肼一水合物(85.10mg,83.35μL,1.700mmol)，并将反应物在回流搅拌过夜，然后浓缩，用DCM稀释，并过滤。将滤液浓缩，并用0-50％(20％NH3/MeOH)在40g硅胶柱上纯化以得到作为黄色固体的4-[7-(6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.1]庚烷-3-基)喹喔啉-5-基]氧基环己胺(450mg,77.8％)。1HNMR(300MHz,氯仿-d)
Figure BDA0002641974200001233
(d,J＝1.9Hz,1H),8.53(d,J＝1.9Hz,1H),6.83(q,J＝2.6Hz,2H),4.83(t,J＝6.0Hz,4H),3.87-3.60(m,5H),3.34(dt,J＝8.7,6.6Hz,1H),3.01-2.83(m,1H),2.23(dq,J＝11.3,5.8,4.8Hz,2H),2.07(d,J＝8.7Hz,1H),1.92-1.62(m,6H)。
Figure BDA0002641974200001241
方案10d
将4-[7-(6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.1]庚烷-3-基)喹喔啉-5-基]氧基环己胺(190mg,0.5581mmol)、2-氟嘧啶(60mg,0.6118mmol)和DIEA(200μL,1.148mmol)在2-丙醇(2mL)中的混合物在微波反应器中在150℃加热20min。将反应混合物浓缩，然后用0-6％MeOH/DCM从12g硅胶柱纯化以得到作为黄色固体的N-[4-[7-(6-氧杂-3-氮杂双环[3.1.1]庚烷-3-基)喹喔啉-5-基]氧基环己基]嘧啶-2-胺(120.2mg,48.9％)。质量+1:419.23；保留时间:0.72；NMR注解:1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.42(d,J＝1.9Hz,1H),8.30(d,J＝1.9Hz,1H),8.04(d,J＝4.8Hz,2H),6.65-6.56(m,2H),6.28(t,J＝4.8Hz,1H),4.99(d,J＝8.1Hz,1H),4.60(d,J＝6.5Hz,3H),3.79(dd,J＝8.2,4.0Hz,0H),3.62-3.38(m,4H),3.17-3.03(m,1H),2.07-1.90(m,2H),1.89-1.59(m,7H)。
实施例11.4-甲基-N-[4-[(6-吗啉代-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001242
二唑-4-基)氧基]环己基]嘧啶-2-胺(化合物665)的制备
Figure BDA0002641974200001251
将4,6-二溴-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001252
二唑(3g,10.80mmol)和N-(4-羟基环己基)氨基甲酸叔丁酯(2.5g,11.61mmol)的混合物溶解在THF(60mL)中并冷却至-30℃。向混合物中历时10min逐滴加入双(三甲基甲硅烷基)氨基钠(sodium bis(trimethylsilyl)amide)(NaHMDS,23mL 1M,23.00mmol)，溶液变成深蓝色。将混合物在-20至0℃搅拌30min和在室温搅拌30min。LC-MS表明仅期望产物峰，没有起始原料。冷却至0℃，用10％柠檬酸溶液猝灭，用EtOAc萃取，经Na2SO4干燥，并浓缩。通过0-40％EtOAc/庚烷纯化。回收1.9g(42％)((1s,4s)-4-((6-溴苯并[c][1,2,5]
Figure BDA0002641974200001253
二唑-4-基)氧基)环己基)氨基甲酸叔丁酯(C17H22BrN3O4)。
将N-[4-[(6-吗啉代-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001254
二唑-4-基)氧基]环己基]氨基甲酸叔丁酯(2.6g,6.306mmol)、碳酸铯(4g,12.28mmol)、二乙酰氧基钯(140mg,0.6236mmol)、RuPhos(580mg,1.243mmol)和吗啉(900μL,10.32mmol)在二
Figure BDA0002641974200001255
烷(30mL)中的混合物用N2净化5分钟。将混合物在90℃搅拌3h。LC-MS表明期望的产物。将混合物用DCM稀释，穿过硅藻土层过滤，浓缩并用80g硅胶柱纯化，用0-80％EtOAc/庚烷洗脱，回收N-[4-[(6-吗啉代-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001256
二唑-4-基)氧基]环己基]氨基甲酸叔丁酯(2.1g,80％)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.42(dd,J＝12.3,1.7Hz,2H),4.86(s,1H),4.58(s,1H),4.00-3.86(m,4H),3.38-3.18(m,4H),2.28-2.08(m,2H),1.94-1.62(m,6H),1.42(s,9H)。
N-[4-[(6-吗啉代-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001261
二唑-4-基)氧基]环己基]氨基甲酸叔丁酯
向N-[4-[(6-吗啉代-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001262
二唑-4-基)氧基]环己基]氨基甲酸叔丁酯(3.5g,8.363mmol)在DCM(30mL)中的溶液中加入TFA(大约953.6mg,644.3μL,8.363mmol)并搅拌1小时。将混合物浓缩并用40g硅胶柱纯化，用0-10％(7N NH3/MeOH/DCM)洗脱。回收4-[(6-吗啉代-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001263
二唑-4-基)氧基]环己胺(2.5g,94％)ESI-MS m/z计算值318.1692，实测319.2(M+1)+；保留时间:0.55分钟。
给微波瓶装入4-[(6-吗啉代-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001264
二唑-4-基)氧基]环己胺(1g,3.141mmol)、2-氯-4-甲基-嘧啶(600mg,4.667mmol)、RockPhos G3(80mg,0.3175mmol)和二
Figure BDA0002641974200001265
烷(10mL)。将NaOtBu(4mL 2M,8.000mmol)加入混合物中。将混合物在70℃搅拌15分钟。LC-MS表明转化，得到4-甲基-N-[4-[(6-吗啉代-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001266
二唑-4-基)氧基]环己基]嘧啶-2-胺。将混合物用DCM稀释，穿过硅藻土层过滤，浓缩，并用40g硅胶柱纯化，用0-10％MeOH/DCM洗脱。回收产物。将产物与Et2O一起研磨和在真空下干燥。4-甲基-N-[4-[(6-吗啉代-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001267
二唑-4-基)氧基]环己基]嘧啶-2-胺(795.3mg,59％),1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.16(d,J＝5.1Hz,1H),6.49(d,J＝1.7Hz,1H),6.47-6.40(m,2H),5.07(d,J＝8.0Hz,1H),4.95(s,1H),3.96-3.85(m,4H),3.32-3.24(m,4H),2.34(s,3H),2.25-2.08(m,2H),2.04-1.74(m,6H)。ESI-MS m/z计算值410.20663，实测411.3(M+1)+；保留时间:0.63分钟。
N-甲基-2-((4-((6-吗啉代苯并[c][1,2,5]
Figure BDA0002641974200001268
二唑-4-基)氧基)环己基)氨基)嘧啶-4-甲酰胺(化合物(666))的制备
Figure BDA0002641974200001271
在-78℃向4,6-二溴-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001272
二唑(1g,3.598mmol)、(4-甲氧基苯基)甲醇(500μL,4.010mmol)在THF(20mL)中的混合物中逐滴加入NaHMDS(4mL 1M,4.000mmol)。溶液变蓝。将混合物在-78℃搅拌30分钟。将混合物温热至室温，并在室温搅拌1h。LC-MS表明产物峰，且没有起始原料。TLC表明比起始原料稍微更少极性的斑点。将反应用饱和NH4Cl猝灭，用EtOAc萃取，用H2O洗涤，并经Na2SO4干燥，浓缩。将产物用40g硅胶柱纯化，用0-30％EtOAc洗脱，回收作为浅黄色固体的6-溴-4-[(4-甲氧基苯基)甲氧基]-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001273
二唑(850mg,70％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.48(d,J＝1.2Hz,1H),7.38-7.19(m,2H),6.94-6.74(m,2H),6.57(d,J＝1.1Hz,1H),5.11(s,2H),3.68(d,J＝9.4Hz,3H)。
将6-溴-4-[(4-甲氧基苯基)甲氧基]-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001274
二唑(830mg,2.476mmol)、碳酸铯(2.4g,7.366mmol)、Pd(OAc)2(50mg,0.2227mmol)、rac-BINAP(300mg,0.4818mmol)和吗啉(300μL,3.440mmol)在二
Figure BDA0002641974200001275
烷(10mL)中的混合物用N2鼓泡10分钟。将混合物加热至80℃。将混合物在80℃搅拌4.5h。LC-MS表明干净产物。将混合物冷却至室温，用DCM稀释，穿过硅藻土层过滤，并浓缩。将产物用4 0g硅胶柱用0-70％EtOAc/DCM纯化，回收4-[(4-甲氧基苯基)甲氧基]-6-吗啉代-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001281
二唑(750mg,89％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ7.42(d,J＝8.7Hz,2H),7.03-6.87(m,2H),6.48(d,J＝1.6Hz,1H),6.40(d,J＝1.6Hz,1H),5.30(d,J＝13.5Hz,2H),3.99-3.75(m,7H),3.31-3.17(m,4H)。
将4-[(4-甲氧基苯基)甲氧基]-6-吗啉代-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001282
二唑(750mg,2.197mmol)在DCM(10mL)中的溶液加入TFA(2mL,25.96mmol)和搅拌1h。将混合物浓缩并将产物用12g硅胶柱纯化，用0-10％MeOH/DCM洗脱。回收作为黄色泡沫的6-吗啉代-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001283
二唑-4-醇(400mg,82％)。
将6-吗啉代-2,1,3-苯并
Figure BDA0002641974200001284
二唑-4-醇(50mg,0.2260mmol)、[4-[[4-(甲基氨甲酰基)嘧啶-2-基]氨基]DMF,己基]甲磺酸酯(240mg,0.7308mmol)和碳酸铯(250mg,0.7673mmol)在DMF(1mL)中的混合物在80℃搅拌过夜。LC–MS表明期望的产物。将混合物用DCM和H2O稀释，用DCM萃取,经Na2SO4干燥，浓缩。将产物用4g硅胶柱纯化，用0-5％MeOH/DCM洗脱，回收期望的产物N-甲基-2-((4-((6-吗啉代苯并[c][1,2,5]
Figure BDA0002641974200001285
二唑-4-基)氧基)环己基)氨基)嘧啶-4-甲酰胺(41.8mg,39％)。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ8.50(d,J＝4.9Hz,1H),7.76(s,1H),7.34(d,J＝4.9Hz,1H),6.50(d,J＝1.3Hz,1H),6.43(d,J＝1.5Hz,1H),5.21(d,J＝7.2Hz,1H),4.96(s,1H),4.04(s,1H),3.94-3.81(m,4H),3.33-3.17(m,4H),3.01(t,J＝9.9Hz,3H),2.19(d,J＝8.2Hz,2H),2.06-1.78(m,6H)。ESI-MS m/z计算值453.21246，实测454.39(M+1)+；保留时间:0.72分钟。
表1和2提供了式(III-E-1和III-E-2)的某些化合物的分析表征数据(空白格指示，没有进行试验)。
表1.
Figure BDA0002641974200001291
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表2
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Figure BDA0002641974200003041
本发明的化合物的生物学测定法
实施例11DNA-PK抑制测定法
使用标准的放射测定法对化合物抑制DNA-PK激酶的能力进行了筛选。简而言之，在该激酶测定法中，考察了33P-ATP中的末端33P-磷酸(phosphate)向肽底物的转移。该测定法在384孔板中进行，最终体积为每孔50μL，含有大约6nM DNA-PK、50mM HEPES(pH 7.5)、10mM MgCl2、25mM NaCl、0.01％BSA、1mM DTT、10μg/mL剪切的双链DNA(得自Sigma)、0.8mg/mL DNA-PK肽(Glu-Pro-Pro-Leu-Ser-Gln-Glu-Ala-Phe-Ala-Asp-Leu-Trp-Lys-Lys-L ys，得自American Peptide)和100μM ATP。因此，将本发明的化合物溶解于DMSO中以制备10mM初始储备溶液。然后在DMSO中进行系列稀释以获得最终溶液供测定。将DMSO或DMSO中的抑制剂的0.75μL等分试样添加至每孔，随后加入含有33P-ATP(得自Perkin Elmer)的ATP底物溶液。通过添加DNA-PK、肽和ds-DNA来开始反应。45分钟后，用25μL的5％磷酸猝灭该反应。将反应混合物转移至MultiScreen HTS 384-孔PH平板(得自Millipore)，让其结合一小时，并用1％磷酸洗涤三次。添加50μL Ultima GoldTM高效闪烁剂(得自Perkin Elmer)后，将样品在Packard TopCount NXT微量培养板闪烁和发光计数器(Packard BioScience)中计数。使用Microsoft Excel Solver宏(macros)将数据拟合至竞争性紧密结合抑制的动力学模型来计算Ki值。
对于DNA-PK的抑制而言，化合物18、23、24、27-30、32-34、36-42、44-46、49-55、59-61、63-67、69、71、72、84、87、93、94、104、108、109、134、135、139、140、142-146、152、155、158、160-162、164、187、189-191、193-210、215、219、223-227、233-237、241-243、245-247、254、256、257、260、263-265、267-269、272、273、275-277、282、283、285、286、287、291、295、297、298、308、309、312、314、315-319、321、323、324、333-336、340、341、351-354、366、369、373-377、380、382、386-388、393-397、399、401、402、404-409、417-422、424、427-430、436、438-451、453-457、463、465、467、469、471、472、474、476-478、481、482、485、486、489-492、494、499、511、512、525、531-535、537、539、547、548、553、558、565、567、572-577、579、582-584、586-595、597、598、600-605、607-609、612、614-616、618、622、623、625-627、629、630、633、634、636、642-644、650-653和658-666中的每一个具有小于1.0微摩尔的Ki。对于DNA-PK的抑制而言，化合物18、23、24、27-30、32-34、36-37、39-41、44-46、49-55、59-61、63-67、69、71、72、84、87、93、94、104、108、109、134、135、139、140、142-146、152、155、158、160-162、164、187、189-191、193-200、202-210、215、219、223-227、233-237、241-243、245-247、254、256、257、260、263-265、267-269、272、273、275-277、282、283、285、286、287、291、295、297、298、308、309、312、314、315-319、321、323、324、333-336、340、341、351-354、366、369、373-374、376-377、380、382、386-388、393-397、399、401、402、404-409、417-422、424、427-430、436、438-451、453-457、463、465、467、469、471、472、474、476-478、481、482、485、486、489-492、494、499、511、512、531-535、537、539、547、548、553、558、565、567、572-577、579、582-584、586-595、597、598、600-605、607-609、612、614-616、618、622、623、625-627、629、630、633、634、636、642-644、650-653和658-666中的每一个具有小于0.10微摩尔的Ki。例如，对于DNA-PK的抑制，化合物661、665和666具有0.001微摩尔的Ki，且化合物663具有0.008微摩尔的Ki。
基因编辑实施例
实施例12:材料和方法
方法：
细胞和培养
从具有CFTR dF508/dF508基因型的、诊断出囊性纤维化的人供体衍生出支气管上皮细胞(BEC)。
在用Yamanaka氏重新程序化因子Oct4、Sox2、KLF4和c-Myc进行病毒转导以后，从人真皮成纤维细胞衍生出诱导的多能干细胞(iPSC)。衍生出的iPSC能够分化成3个胚层并含有具有23对染色体的正常核型。
原代人动员化的外周血(mPB)CD34+造血干和祖细胞(HSPC)购自Hemacare或AllCells。将细胞融化、洗涤和以1-3x 105细胞/mL的密度重新悬浮在完全培养基中，所述完全培养基包含无血清培养基CellGro SCGM(CellGenix)且补充了细胞因子混合物(300ng/mL SCF,300ng/mL Flt3L,100ng/mL TPO,60ng/ml IL-3)，并在电穿孔之前在37℃/5％CO2培养箱中温育48小时。
DNA-PK抑制剂：
将DNA-PK抑制剂化合物661、663、665和666用于基因编辑实施例。通过使用无水DMSO制备10mM储备溶液并在-80℃保存。
电穿孔：
使用的合成sgRNA是从Synthego购买的HPLC(高效液相色谱法)纯化的，且在5’和3’末端的三个末端位置处含有化学修饰的核苷酸(2’-O-甲基3’-硫代磷酸酯)。具有修饰的核苷酸的sgRNA的序列如下标有下划线：
AAVS1 sgRNA:
5’ACCCCACAGUGGGGCCACUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 3’(SEQ ID NO:3)。
NAV1.7 sgRNA：
5’GGCUGAGCGUCCAUCAACCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 3’(SEQ ID NO:4)
Cas9 mRNA购自TriLink Biotechnologies(L-7206)。Cas9 mRNA表达具有核定位信号的酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)SF370 Cas9蛋白(CRISPR相关蛋白9)的版本。spCas9 mRNA也含有CAP1结构、聚腺苷酸化信号和经修饰的尿苷以得到在哺乳动物细胞中的最佳表达水平。
供体ssODN购自IDT。ssODN含有10核苷酸插入序列(以通过TIDE测定来测量HDR事件)，侧接同源性臂的40个核苷酸。ssODN含有共计90个核苷酸和在5’和3’末端的三个末端位置处的硫代磷酸酯修饰的核苷酸。具有标有下划线的硫代磷酸酯修饰的核苷酸的供体ssODN的序列如下所示：
AAVS1 PAM：
5’GGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGGGGCCAGAATTCTCAGCTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGG3’(SEQ ID NO:5)
AAVS1非-PAM：
5’CCTAAGGATGGGGCTTTTCTGTCACCAATCCTGTCCCTAGCTGAGAATTCTGGCCCCACTGTGGGGTGGAGGGGACAGATAAAAGTACCC3’(SEQ ID NO:6)
NAV1.7 PAM：
5’AGCTGTCCATTGGGGAGCATGAGGGCTGAGCGTCCATCAACTGAGAATTCCCAGGGAGACCACACCGTTGCAGTCCACAGCACTGTGCAT3’(SEQ ID NO:7)
NAV1.7非-PAM：
5’ATGCACAGTGCTGTGGACTGCAACGGTGTGGTCTCCCTGGGAATTCTCAGTTGATGGACGCTCAGCCCTCATGCTCCCCAATGGACAGCT3’(SEQ ID NO:8)
在Lonza 4D-NucleofectorTM System上进行所有电穿孔。
对于BEC，将下述条件用于电穿孔：1.8xE5细胞,250ng CAS9 mRNA,500ng sgRNA和0.66uM ssODN在20ul P4电穿孔缓冲液中，使用程序CM-138。将电穿孔的细胞转移至含有100ul BEC培养基(补充了DNA-PK抑制剂)的96孔板或保持不处理。将细胞在37℃在5％CO2培养箱中温育。
对于iPSC，使用下述条件：2.0xE5细胞,250ng CAS9 mRNA,500ng sgRNA和0.66uMssODN在20ul P3电穿孔缓冲液中，使用程序CA-137。将电穿孔的细胞转移至含有100ulmTEsR1培养基(Stem Cell Technologies)的96孔板，所述mTEsR1培养基补充了10uM ROCK抑制剂Y-27632(Stem Cell Technologies)，含有或不含DNA-PK抑制剂，并然后在37℃在5％CO2培养箱中温育。
将CD34+细胞在融化后电穿孔2天。将下述条件用于电穿孔：2.0xE6细胞,15μgCas9蛋白(Feldan),15μg sgRNA,1μM ssODN在100μl P3电穿孔缓冲液中，使用程序CA-137。如下转移电穿孔的细胞：将它们均匀地分入24-孔板的8个孔中，每个孔含有不同浓度的DNA-PK抑制剂。将细胞在37℃在5％CO2培养箱中温育2天并评价细胞生存力和基因编辑。
脂质介导的细胞转染：
在转染前1天，将BEC在BEC培养基中以1×E4个细胞/孔的细胞密度接种在96-孔板中。首先，将0.15ul MessengerMax(ThermoFisher,LMRNA 003)在5ul Opti-MEM中稀释并在室温温育10min。同时，将80ng Cas9 mRNA(Trilink,L-7206)、20ng sgRNA(Synthego)和1皮摩尔的ssODN加入5ul Opti-MEM，并然后与MessengerMAx溶液混合。将混合物温育5min，然后加入细胞。将整个溶液加给含有100ul培养基的96-孔板的孔中的细胞，所述培养基含有或不含DNA-PK抑制剂。将细胞在37℃在5％CO2培养箱中温育。
细胞存活率的测量：
将细胞与在培养基中的5ug/ml Hoechst 33342(Life Technologies:H3570)和0.5ug/ml碘化丙啶(PI；Life Technologies:P3566)一起在37度温育1h。使用High-ContentImaging System(Molecular devices)将细胞拍照片以测量Hoescht阳性事件(活和死细胞)和PI阳性事件(死细胞)。如下计算相对细胞存活率：[样品的(Hoescht+事件-PI+事件)]/对照的(Hoescht+事件-PI+事件)]*100。对照为假转染的细胞，并将它的细胞存活率任意设定为100％。
使用Cell Titer Glo(CTG)试剂(Promega)测量CD34+ HSPC细胞存活。将100μl细胞悬浮液与100μl完全CTG试剂混合。使用光度计测量化学发光信号，并相对于对照细胞(未用DNA-PK抑制剂处理过的细胞)计算活细胞的百分比。
基因编辑率的测量：
通过将细胞与96孔板的50ul DNA Quickextract溶液(Epicentre)/孔一起在37℃温育30min，分离基因组DNA。将细胞提取物混合，并转移进PCR板，并然后在65℃温育6min和在98℃温育2min。使用AccuPrimeTM Pfx DNA聚合酶(Thermofisher,12344024)，用1ul含有基因组DNA的溶液进行PCR反应。PCR条件是在94℃保持4min(1×)，随后在94℃保持15s、在60℃保持15s和在60℃保持1min(40×)。将PCR产物纯化，并然后通过GENEWIZ进行Sanger测序。将下述跨靶位点的引物对用于PCR(FW,正向；RV,反向)。用星号(*)指示Sanger测序所用的引物：
AAVS1_FW:5’GGACAACCCCAAAGTACCCC 3’(SEQ ID NO:9)
AAVS1_RV*:5’aggatcagtgaaacgcacca 3’(SEQ ID NO:10)。
NAV1.7_FW*:5’gccagtgggttcagtggtat 3’(SEQ ID NO:11)。
NAV1.7_RV:5’tcagcattatccttgcattttctgt 3’(SEQ ID NO:12)。
使用TIDE(通过分解跟踪插入/缺失(Tracking of Indels by Decomposition))软件(http://tide.nki.nl)(也参见Brinkman等人,Nucleic Acids Research,第42卷,第22期,2014年12月16日,第e168页)，分析每个序列色谱图。将假电穿孔的样品用作参照序列，并将参数设定为30nt的插入/缺失大小，并将分解窗设定为覆盖具有高质量迹线的最大可能窗。从TIDE图直接得到总插入/缺失(插入和缺失)率。HDR率是具有10个核苷酸插入的事件的百分比。将NHEJ比率计算为总插入/缺失率-HDR率。使用GraphPad Prism 7软件作图并计算所有统计信息。
实施例13:DNA-PK抑制剂提高BEC中的HDR基因编辑率
图1解释了在下面实施例中使用的基因编辑测定的设计。为了研究DNA-PK抑制剂对HDR基因编辑率的影响，将BEC用spCAS9mRNA、NAV1.7 sgRNA和NAV1.7非-PAM ssODN电穿孔，并然后与不同浓度的化合物665一起温育或保持不处理(对照)。在电穿孔以后72h使用TIDE测定来确定基因编辑率。将基因编辑率以百分比表达并分类为HDR和NHEJ。以百分比显示细胞存活率，其中将对照细胞设定为100％。
如在图2中所示，化合物665的DNA-PK抑制剂提高了BEC中的基因编辑率。对于化合物665，NHEJ IC50为0.4163μM，HDR EC50为0.4834μM，和HDR TOP％为76.03。
实施例14:DNA-PK抑制剂提高CD34+细胞中的HDR基因编辑率
为了研究DNA-PK抑制剂对HDR基因编辑率的影响，将mPB CD34+细胞用RNP(spCAS9蛋白+NAV1.7 sgRNA)和NAV1.7非-PAM ssODN电穿孔。然后将细胞与不同浓度的化合物665一起温育。在电穿孔以后48h，使用TIDE测定来确定基因编辑率。将基因编辑率以百分比表达并分类为HDR和NHEJ，如在图3A(供体B)和图3B(供体C)中所示。以百分比显示细胞存活率，其中将对照细胞设定为100％。
如在图3A和3B中所示，化合物665的DNA-PK抑制剂提高了CD34+细胞中的基因编辑率。供体B的HDR和插入/缺失形成的EC50值分别为0.28μM和0.36μM。
实施例15:DNA-PK抑制剂提高了iPSC中的HDR基因编辑率
为了研究DNA-PK抑制剂对HDR基因编辑率的影响，将iPSC用spCAS9 mRNA、AAVS1sgRNA和AAVS1 PAM ssODN电穿孔，并然后与不同浓度的化合物665一起温育或保持不处理(对照)。在电穿孔以后72h使用TIDE测定确定基因编辑率。将基因编辑率以百分比表达并分类为HDR和NHEJ。以百分比显示细胞存活率，其中将对照细胞设定为100％。
如在图4中所示，化合物665的DNA-PK抑制剂提高了iPSC中的基因编辑率。对于化合物665，NHEJ IC50为1.274μM，HDR EC50为0.9337μM，且HDR TOP％为26.27。
实施例16:在ECmax确定基因编辑动力学
为了在EC max研究基因编辑动力学，将BEC用spCAS9 mRNA、AAVS1 sgRNA和AAVS1PAM ssODN电穿孔，并然后与10μM化合物665一起温育不同时间或保持不处理(对照)。使用TIDE测定确定基因编辑率，并以HDR和NHEJ的百分比表达。10μM是化合物665的最大增强浓度(ECmax)。
图5表明，在HDR和NHEJ事件之间存在紧密反相关(inverse correlation)。
实施例17:在EC50确定基因编辑动力学
将BEC用spCAS9 mRNA、AAVS1 sgRNA和AAVS1 PAM ssODN电穿孔，并然后与0.7μM化合物665一起温育不同时间或保持不处理(对照)。使用TIDE测定确定基因编辑率，并以HDR和NHEJ的百分比表达。0.7μM是化合物665的增强浓度50(EC50)。图6解释了DNA-PK对BEC中的HDR和NHEJ的抑制的时程。
实施例18:当在BEC中通过脂质介导的转染递送基因编辑组分时，DNA-PK抑制剂提高HDR率
为了研究脂质介导的转染的影响，将BEC用spCAS9 mRNA、AAVS1 sgRNA和AAVS1PAM ssODN转染，并然后与不同浓度的化合物665一起温育或保持不处理(对照)。在转染后72h使用TIDE测定确定基因编辑率。图7显示了随着基于脂质的转染递送的化合物665的浓度增加，HDR效率比率增加。
总结表：化合物665的DNA-PK抑制剂提高了HDR驱动的基因编辑
Figure BDA0002641974200003131
实施例19：
将mPB CD34+细胞用RNP(spCAS9蛋白+NAV1.7 sgRNA)和NAV1.7非-PAM ssODN电穿孔。然后将细胞与不同浓度的化合物661、663和666一起温育。如在以上方法中所述进行实验，但是使用更低浓度的sgRNA(5μg)和ssODN(0.2μM)。在电穿孔以后48h使用TIDE测定确定基因编辑率。将基因编辑率以百分比表达并分类为HDR和NHEJ。在下面显示了在两种单独供体中试验的每种化合物的结果。
化合物661
Figure BDA0002641974200003141
化合物663
Figure BDA0002641974200003142
化合物666
Figure BDA0002641974200003143
化合物661、663、666的总结表
Figure BDA0002641974200003151
实施例20:DNA-PK抑制剂提高CD34+细胞中的HDR基因编辑率.
为了研究DNA-PK抑制剂对HDR基因编辑率的影响，将CD34+细胞用spCAS9 mRNA、AAVS1 sgRNA和AAVS1非-PAM ssODN电穿孔，并然后与不同浓度的化合物666、661、663一起温育或保持不处理(对照)。在电穿孔以后72h使用TIDE测定确定基因编辑率。将基因编辑率以百分比表达并分类为HDR和NHEJ。以百分比显示细胞存活率，其中将对照细胞设定为100％。
如显示的，化合物666(图8)、661(图9)和663(图10)的DNA-PK抑制剂提高CD34+细胞中的HDR率。
实施例21：由AAV供体、CRISPR-Cas9和选择性的DNA-PK抑制剂介导的HDR的精确基因编辑.
图11解释了在该实施例中使用的基因编辑测定的设计。
细胞
从诊断出囊性纤维化的人肺供体衍生出肺祖细胞(LPC)。LPC供体ID 14071和14335分别含有CFTR基因型dF508/dF508和dF508/G542X。
CRISPR-Cas9基因编辑试剂
合成的sgRNA购自Synthego。gRNA是HPLC(高效液相色谱法)纯化的，且在5’和3’末端的三个末端位置处含有化学修饰的核苷酸(2’-O-甲基3’-硫代磷酸酯)。gRNA含有22个核苷酸长的间隔序列(以促进与靶位点的特异性结合)和80个核苷酸长的支架序列(其允许结合saCAS9蛋白)。在表3中显示了完整gRNA序列。
由TriLink Biotechnologies合成saCas9 mRNA。saCas9 mRNA表达具有SV40和NucleoPlasmine核定位信号的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9(Uniprot入口代码J7RUA5)。saCas9 mRNA也含有CAP1结构和聚腺苷酸化信号以在哺乳动物细胞中得到最佳表达水平。将saCAS9 mRNA进行HPLC纯化。
AAV供体构建体设计和AAV转导.
相对于gRNA切口位点和10个核苷酸的独特HDR足迹插入，AAV供体构建体含有左和右同源性臂的500个核苷酸长的序列。使用AAV6血清型制作AAV供体制品，通过VectorBiolabs纯化和滴定。将AAV滴定报告为病毒基因组/ml。通过在37℃在36h中将AAV6载体以每个细胞指定的载体基因组拷贝加入细胞来进行AAV转导。
电穿孔
使用与96-孔穿梭系统偶联的Lonza 4D-NucleofectorTM系统进行电穿孔。将1.8xE5 LPC细胞重新悬浮在20ul P4电穿孔缓冲液Lonza(V4SP-4096)中。将20ul细胞混合物与2ul含有1ug saCAS9 mRNA和1ug gRNA的CRISPR-Cas9试剂混合物组合。将20ul细胞和CRISPR-Cas9混合物转移进96-孔电穿孔板的一个孔中。使用程序CM-138将细胞电穿孔。将电穿孔的LPC细胞的一部分转移进384-孔板的一个孔。在36h中在5％CO2培养箱中将细胞用AAV和DNA-PK抑制剂转导或保持不处理(对照)。在72h以后分离基因组DNA。
基因组DNA分离.
通过将细胞在37℃分别与96-孔和384-孔板的50ul和15ul DNA Quickextract溶液(Epicentre)/孔一起温育30min，分离基因组DNA。将细胞提取物混合和转移进96-孔PCR板，并然后在65℃温育6min和在98℃温育2min。将基因组DNA立即用在下游应用中，或将它在4℃保存。
插入/缺失率的测量
使用Phire Green Hot Start II PCR Master Mix(F126L,Thermo Scientific)扩增与靶基因对应的DNA片段。按照生产商的说明书进行PCR反应。简而言之，将1.25ul基因组DNA溶液与23.5ul Phire Green Hot Start II PCR Master Mix和对应的靶基因正向引物和反向引物(表4)组合。引物之一结合在AAV供体序列外以避免AAV供体的扩增。用下述热循环方案进行PCR反应：1)98℃30s；2)98℃5s；3)62℃5s；4)72℃20s，重复步骤2-4 30次；5)72℃4min。将PCR产物酶促地纯化。使用如表4中所示的测序引物将DNA样品进行Sanger测序。使用TIDE软件相对于参照序列(上述)分析每个测序色谱图。参照序列得自假电穿孔的样品。将Tide参数设定为覆盖gRNA切口位点的±30个核苷酸的插入/缺失谱，并将分解窗设定为覆盖具有高质量迹线的最大可能窗。从TIDE图直接得到总插入/缺失(插入和缺失)率。使用GraphPad Prism 7软件作图并计算所有统计信息。
表3.sgRNA序列
Figure BDA0002641974200003171
Figure BDA0002641974200003181
注：每个sgRNA含有独特22核苷酸间隔序列(粗体)和随后的共有80核苷酸支架序列。
表4.PCR和测序引物
Figure BDA0002641974200003182
将LPC用saCAS9 mRNA与一组sgRNA和AAV供体一起电穿孔，以靶向范科尼贫血互补群F(FANCF)、runt相关的转录因子1(RUNX1)、Empty Spiracles Homeobox 1(EMX1)和血管内皮生长因子A(VEGFA)基因。将细胞与DNA-PK抑制剂化合物665一起温育或保持不处理(对照)。在电穿孔以后72h使用TIDE测定确定总插入和缺失(插入/缺失)率。将基因编辑率以百分比表达并分类为HDR(条)和NHEJ(圆)。HDR事件为具有10核苷酸插入的序列的量。使用下式计算NHEJ率：NHEJ＝总插入/缺失事件-HDR事件。结果显示在图12中。
总结：
DNA-PK抑制剂向不同细胞类型和基因座的添加的结果表明跨细胞类型和基因座的HDR的显著增强。已经在多种细胞类型(包括BEC、iPSC、CD34+ HPSC(3个单独供体))中证实了HDR基因编辑的增强。已经在多个基因座中证实了HDR基因编辑的增强。实验结果还表明，基因脂质的递送和电穿孔递送是有效的。电穿孔例子包括BEC、iPSC、CD34+ HPSC和在BEC中使用基于脂质的递送系统的有效递送。已经跨基因座、实验条件和细胞类型观察到HDR和NHEJ事件之间的紧密反相关。
尽管为了清楚理解的目的已经通过具体说明和实施例对前述发明进行了比较详细的描述，但是本领域普通技术人员考虑到本发明的教导会容易地明白，可以对其做出某些变化和改进，而不偏离所附权利要求书的精神或范围。
序列表
<110> Vertex Pharmaceuticals Incorporated
MAHAJAN, Sudipta
WEINBERG, Marc Saul
D'ASTOLFO, Diego Sebastian
<120> DNA-PK抑制剂
<130> 14390-686
<150> US 62/618,598
<151> 2018-01-17
<160> 28
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAVS1靶位点
<400> 1
accccacagt ggggccacta 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NAV1.7靶标
<400> 2
ggctgagcgt ccatcaacca 20
<210> 3
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAVS1 sgRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-甲基3'-硫代磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(99)
<223> 2'-O-甲基3'-硫代磷酸酯
<400> 3
accccacagu ggggccacua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 4
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NAV1.7 sgRNA
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-甲基3'-硫代磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(99)
<223> 2'-O-甲基3'-硫代磷酸酯
<400> 4
ggcugagcgu ccaucaacca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 5
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAVS1 PAM
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-甲基3'-硫代磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(89)
<223> 2'-O-甲基3'-硫代磷酸酯
<400> 5
gggtactttt atctgtcccc tccaccccac agtggggcca gaattctcag ctagggacag 60
gattggtgac agaaaagccc catccttagg 90
<210> 6
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAVS1非-PAM
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-甲基3'-硫代磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(89)
<223> 2'-O-甲基3'-硫代磷酸酯
<400> 6
cctaaggatg gggcttttct gtcaccaatc ctgtccctag ctgagaattc tggccccact 60
gtggggtgga ggggacagat aaaagtaccc 90
<210> 7
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NAV1.7 PAM
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-甲基3'-硫代磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(89)
<223> 2'-O-甲基3'-硫代磷酸酯
<400> 7
agctgtccat tggggagcat gagggctgag cgtccatcaa ctgagaattc ccagggagac 60
cacaccgttg cagtccacag cactgtgcat 90
<210> 8
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NAV1.7非-PAM
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3)
<223> 2'-O-甲基3'-硫代磷酸酯
<220>
<221> misc_feature
<222> (87)..(89)
<223> 2'-O-甲基3'-硫代磷酸酯
<400> 8
atgcacagtg ctgtggactg caacggtgtg gtctccctgg gaattctcag ttgatggacg 60
ctcagccctc atgctcccca atggacagct 90
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAVS1 FW
<400> 9
ggacaacccc aaagtacccc 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> AAVS1 RV
<400> 10
aggatcagtg aaacgcacca 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NAV1.7 FW
<400> 11
gccagtgggt tcagtggtat 20
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NAV1.7 RV
<400> 12
tcagcattat ccttgcattt tctgt 25
<210> 13
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFA
<400> 13
auucccucuu uagccagagc guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca 60
aaaugccgug uuuaucucgu caacuuguug gcgagauuuu 100
<210> 14
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EMX1
<400> 14
caaccacaaa cccacgaggg guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca 60
aaaugccgug uuuaucucgu caacuuguug gcgagauuuu 100
<210> 15
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FANCF
<400> 15
caaggcccgg cgcacggugg guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca 60
aaaugccgug uuuaucucgu caacuuguug gcgagauuuu 100
<210> 16
<211> 100
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RUNX
<400> 16
aaagagagau guagggcuag guuuuaguac ucuggaaaca gaaucuacua aaacaaggca 60
aaaugccgug uuuaucucgu caacuuguug gcgagauuuu 100
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFA FW
<400> 17
agacgttcct tagtgctggc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFA RV
<400> 18
aggagggagc aggaaagtga 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEGFA SEQ
<400> 19
attccctctt tagccagagc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EMX1 FW
<400> 20
tggctgtcca ggcactgctc 20
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EMX1 RV
<400> 21
ggcctgtcct ccctcaag 18
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EMX1 SEQ
<400> 22
caaccacaaa cccacgaggg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FANCF FW
<400> 23
acacggataa agacgctggg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FANCF RV
<400> 24
acacggataa agacgctggg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FANCF SEQ
<400> 25
caaggcccgg cgcacggtgg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RUNX1 FW
<400> 26
aacccagcat agtggtcagc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RUNX1 RV
<400> 27
tctgtgcatg tgcctgctaa 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> RUNX1 SEQ
<400> 28
aaagagagat gtagggctag 20

Claims (65)

1.经由同源性定向修复(HDR)途径修复一个或多个靶基因组区域中的DNA断裂的方法，所述方法包括：
向包含一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用基因组编辑系统和式(III-E-1)或(III-E-2)的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure FDA0002641974190000011
其中：
X是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基；
Y是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基；
R3是氢、C1-4烷基或OC1-2烷基；
R1是含有1或2个氮原子的6-元杂芳族环，其中所述杂芳族环可以被0、1、2或3个取代基R2取代，所述取代基R2独立地选自卤代、CN、C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C3-C4-环烷基、OR6、C(＝O)OR6、C(＝O)NR7R6和NR4R5；其中
每个C1-C4-烷基和C1-C4-卤代烷基被0、1或2个OR6基团取代，
每个R6和R7独立地是H、C1-C4烷基或C1-C4-卤代烷基，
每个R4和R5独立地是H、C1-C4烷基或C(＝O)C1-C4烷基；或
R4和R5与它们所连接的N原子一起形成包含0或1个额外O或N原子的杂环，其中所述杂环可以被C1-C4烷基或OR6取代；且
环B选自：
Figure FDA0002641974190000012
其中W是N或CR7；且Z是O或S；其中R7是H或C1-C4烷基，其中所述基因组编辑系统与靶基因组区域的核酸相互作用，导致DNA断裂，且其中所述DNA断裂至少部分地经由HDR途径修复。
2.经由同源性定向修复(HDR)途径修复一个或多个靶基因组区域中的DNA断裂的方法，所述方法包括：
向包含一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用基因组编辑系统和式(III-E-1)或(III-E-2)的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure FDA0002641974190000021
其中：
X是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基；
Y是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基；
R3是氢、C1-4烷基或OC1-2烷基；
R1是含有1或2个氮原子的6-元杂芳族环，其中所述杂芳族环可以被0、1、2或3个取代基R2取代，所述取代基R2独立地选自卤代、CN、C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C3-C4-环烷基、OR6、C(＝O)OR6、C(＝O)NR7R6和NR4R5；其中
每个C1-C4-烷基和C1-C4-卤代烷基被0、1或2个OR6基团取代，
每个R6和R7独立地是H、C1-C4烷基或C1-C4-卤代烷基，
每个R4和R5独立地是H、C1-C4烷基或C(＝O)C1-C4烷基；或
R4和R5与它们所连接的N原子一起形成包含0或1个额外O或N原子的杂环，其中所述杂环可以被C1-C4烷基或OR6取代；且
环B选自：
Figure FDA0002641974190000022
其中W是N或CR7；且Z是O或S；其中R7是H或C1-C4烷基，
其中所述基因组编辑系统与靶基因组区域的核酸相互作用，导致DNA断裂，且其中所述DNA断裂至少部分地经由HDR途径修复。
3.抑制或遏制经由非同源末端连接(NHEJ)途径对一个或多个靶基因组区域中的DNA断裂的修复的方法，所述方法包括：
向包含一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用基因组编辑系统和式(III-E-1)或(III-E-2)的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure FDA0002641974190000031
其中：
X是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基；
Y是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基；
R3是氢、C1-4烷基或OC1-2烷基；
R1是含有1或2个氮原子的6-元杂芳族环，其中所述杂芳族环可以被0、1、2或3个取代基R2取代，所述取代基R2独立地选自卤代、CN、C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C3-C4-环烷基、OR6、C(＝O)OR6、C(＝O)NR7R6和NR4R5；其中
每个C1-C4-烷基和C1-C4-卤代烷基被0、1或2个OR6基团取代，
每个R6和R7独立地是H、C1-C4烷基或C1-C4-卤代烷基，
每个R4和R5独立地是H、C1-C4烷基或C(＝O)C1-C4烷基；或
R4和R5与它们所连接的N原子一起形成包含0或1个额外O或N原子的杂环，其中所述杂环可以被C1-C4烷基或OR6取代；且
环B选自：
Figure FDA0002641974190000032
其中W是N或CR7；且Z是O或S；其中R7是H或C1-C4烷基，
其中所述基因组编辑系统与一个或多个靶基因组区域的核酸相互作用，导致DNA断裂，并且其中经由NHEJ途径的DNA断裂的修复被抑制或遏制。
4.修饰一个或多个基因或蛋白的表达的方法，所述方法包括：
向包含一个或多个靶基因组区域的一个或多个细胞施用基因组编辑系统和式(III-E-1)或(III-E-2)的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure FDA0002641974190000041
其中：
X是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基；
Y是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基；
R3是氢、C1-4烷基或OC1-2烷基；
R1是含有1或2个氮原子的6-元杂芳族环，其中所述杂芳族环可以被0、1、2或3个取代基R2取代，所述取代基R2独立地选自卤代、CN、C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C3-C4-环烷基、OR6、C(＝O)OR6、C(＝O)NR7R6和NR4R5；其中
每个C1-C4-烷基和C1-C4-卤代烷基被0、1或2个OR6基团取代，
每个R6和R7独立地是H、C1-C4烷基或C1-C4-卤代烷基，
每个R4和R5独立地是H、C1-C4烷基或C(＝O)C1-C4烷基；或
R4和R5与它们所连接的N原子一起形成包含0或1个额外O或N原子的杂环，其中所述杂环可以被C1-C4烷基或OR6取代；且
环B选自：
Figure FDA0002641974190000042
其中W是N或CR7；且Z是O或S；其中R7是H或C1-C4烷基，
其中所述基因组编辑系统与靶基因的一个或多个靶基因组区域的核酸相互作用，导致编辑所述一个或多个靶基因组区域，并且其中所述编辑修饰与靶基因有关的下游基因和/或蛋白的表达。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中
X是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基；
Y是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基；
R3是氢、C1-4烷基或OC1-2烷基；
R1是含有1或2个氮原子的6-元杂芳族环，其中所述杂芳族环可以被0、1或2个取代基R2取代，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR6和NR4R5；其中
R6是C1-C4烷基，
每个R4和R5独立地是H、C1-C4烷基或C(＝O)C1-C4烷基；或
R4和R5与它们所连接的N原子一起形成包含0或1个额外N原子的杂环，其中所述杂环可以被C1-C4烷基取代；且
环B选自：
Figure FDA0002641974190000051
其中W是N或CR7；且Z是O或S；其中R7是H或C1-C4烷基。
6.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中X是O或NH，Y是O或NH，且R3是氢。
7.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR6和NR4R5。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR6和NR4R5；
环B选自：
Figure FDA0002641974190000061
W是N或CR7；和
Z是O或S；其中R7是H或C1-C4-烷基。
9.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C4烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR6和NR4R5；环B是
Figure FDA0002641974190000062
W是N或CR7；且
Z是O或S；其中R7是H或C1-C4烷基。
10.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被0、1或2个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基和C(＝O)NHR6；环B是
Figure FDA0002641974190000063
W是N；且Z是O或S。
11.在权利要求1-7中的任一项中列举的化合物，其中X是O或NH，Y是O或NH，R3是氢且R1是被1个取代基R2取代的嘧啶环，所述取代基R2选自C1-C2-烷基和C(＝O)NH C1-C2-烷基；环B是
Figure FDA0002641974190000071
W是N；且Z是O或S。
12.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中所述化合物是由下式之一表示或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002641974190000072
13.根据权利要求3或4所述的方法，其中所述DNA断裂包括DNA双链断裂(DSB)。
14.根据权利要求1或5所述的方法，其中与在其它方面相同但没有所述化合物的情况下的一个或多个细胞相比，编辑一个或多个细胞中的靶基因组区域的效率增加。
15.根据权利要求2或5所述的方法，其中与在其它方面相同但没有所述化合物的情况下的一个或多个细胞相比，经由HDR途径修复一个或多个细胞中的靶基因组区域处的DNA断裂的效率增加。
16.根据权利要求3或5所述的方法，其中与在其它方面相同但没有所述化合物的情况下的一个或多个细胞相比，抑制或遏制经由NHEJ途径对一个或多个细胞中的靶基因组区域处的DNA断裂的修复的效率增加。
17.根据权利要求14-16中的任一项所述的方法，其中与在其它方面相同但没有所述化合物的情况下的一个或多个细胞相比，所述效率增加了至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、40倍、50倍或100倍。
18.根据权利要求14-17中的任一项所述的方法，其中通过靶向多核苷酸整合的频率测量效率。
19.根据权利要求14-17中的任一项所述的方法，其中通过靶向诱变的频率测量效率。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述靶向诱变包含点突变、缺失和/或插入。
21.根据权利要求4或5所述的方法，其中与施用前一个或多个细胞中的基线表达水平相比，与靶基因有关的下游基因和/或蛋白的表达增加。
22.根据权利要求21所述的方法，其中与施用前一个或多个细胞中的基线表达水平相比，所述表达增加了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、1倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍或10倍。
23.根据权利要求4或5所述的方法，其中与施用前一个或多个细胞中的基线表达水平相比，与靶基因有关的下游基因和/或蛋白的表达减少。
24.根据权利要求23所述的方法，其中与施用前一个或多个细胞中的基线表达水平相比，所述基因表达减少了至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。
25.根据权利要求4或5所述的方法，其中所述与靶基因有关的下游基因和/或蛋白的表达在一个或多个细胞中基本上消除。
26.根据权利要求1-25中的任一项所述的方法，其中所述细胞在S或G2细胞周期阶段同步化。
27.根据权利要求1-26中的任一项所述的方法，其中与未施用或未接触所述化合物的一个或多个细胞相比，施用或接触所述化合物的一个或多个细胞具有增加的存活率。
28.根据权利要求1-27中的任一项所述的方法，其中将所述基因组编辑系统和所述化合物同时施用进一个或多个细胞中。
29.根据权利要求1-27中的任一项所述的方法，其中将所述基因组编辑系统和所述化合物依序施用进一个或多个细胞中。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述基因组编辑系统在所述化合物之前施用进一个或多个细胞中。
31.根据权利要求29所述的方法，其中所述化合物在所述基因组编辑系统之前施用进一个或多个细胞中。
32.根据权利要求1-31中的任一项所述的方法，其中所述一个或多个细胞是培养的细胞。
33.根据权利要求1-31中的任一项所述的方法，其中所述一个或多个细胞是生物体内的体内细胞。
34.根据权利要求1-31中的任一项所述的方法，其中所述一个或多个细胞是来自生物体的离体细胞。
35.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述生物体是哺乳动物。
36.根据权利要求33或34所述的方法，其中所述生物体是人。
37.根据权利要求1-36中的任一项所述的方法，其中经由相同途径施用所述基因组编辑系统和所述化合物。
38.根据权利要求1-36中的任一项所述的方法，其中经由不同途径施用所述基因组编辑系统和所述化合物。
39.根据权利要求38所述的方法，其中静脉内地施用所述基因组编辑系统和口服地施用所述化合物。
40.根据权利要求1-39中的任一项所述的方法，其中所述基因组编辑系统选自基于大范围核酸酶的系统、基于锌指核酸酶(ZFN)的系统、基于类转录激活因子效应物的核酸酶(TALEN)系统、基于CRISPR的系统或基于NgAgo的系统。
41.根据权利要求40所述的方法，其中基因组编辑系统是基于CRISPR的系统。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述基于CRISPR的系统是CRISPR-Cas系统或CRISPR-Cpf系统。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述基于CRISPR的系统是CRISPR-Cas系统且其中所述CRISPR-Cas系统包含：(a)至少一种指导RNA元件，其包含：(i)含有与一个或多个靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向因子RNA或包含编码所述靶向因子RNA的核苷酸序列的核酸；(ii)和包含能够与所述靶向因子RNA杂交的核苷酸序列的激活因子RNA或包含编码所述激活因子RNA的核苷酸序列的核酸；和(b)包含Cas蛋白的Cas蛋白元件或包含编码Cas蛋白的核苷酸序列的核酸。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述靶向因子RNA和激活因子RNA融合为单个分子。
45.根据权利要求43所述的方法，其中所述Cas蛋白是II型Cas9蛋白。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述Cas9蛋白是SaCas9、SpCas9、SpCas9n、Cas9-HF、Cas9-H840A、FokI-dCas9或D10A切口酶或它们的任意组合。
47.根据权利要求42所述的方法，其中所述基于CRISPR的系统是CRISPR-Cpf系统且其中所述CRISPR-Cpf系统包含：(a)至少一种指导RNA元件或包含编码指导RNA元件的核苷酸序列的核酸，所述指导RNA包含靶向因子RNA，所述靶向因子RNA包含与一个或多个靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列；和(b)包含Cpf蛋白的Cpf蛋白元件或包含编码Cpf蛋白的核苷酸序列的核酸。
48.根据权利要求1-47中的任一项所述的方法，其中所述基因组编辑系统由一种或多种载体递送。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述一种或多种载体选自病毒载体、质粒或ssDNA。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
51.根据权利要求1-49中的任一项所述的方法，其中所述基因组编辑系统由合成RNA递送。
52.根据权利要求1-49中的任一项所述的方法，其中所述基因组编辑系统由纳米制剂递送。
53.用于编辑一个或多个靶基因组区域的试剂盒或组合物，其包含：
基因组编辑系统；和
式(III-E-1)或(III-E-2)的化合物或其药学上可接受的盐，
Figure FDA0002641974190000131
其中：
X是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基；
Y是O或NR；其中R是H或C1-C4烷基；
R3是氢、C1-4烷基或OC1-2烷基；
R1是含有1或2个氮原子的6-元杂芳族环，其中所述杂芳族环可以被0、1、2或3个取代基R2取代，所述取代基R2独立地选自卤代、CN、C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C3-C4-环烷基、OR6、C(＝O)OR6、C(＝O)NR7R6和NR4R5；其中
每个C1-C4-烷基和C1-C4-卤代烷基被0、1或2个OR6基团取代，
每个R6和R7独立地是H、C1-C4烷基或C1-C4-卤代烷基，
每个R4和R5独立地是H、C1-C4烷基或C(＝O)C1-C4烷基；或
R4和R5与它们所连接的N原子一起形成包含0或1个额外O或N原子的杂环，其中所述杂环可以被C1-C4烷基或OR6取代；且
环B选自：
Figure FDA0002641974190000132
其中W是N或CR7；且Z是O或S；其中R7是H或C1-C4烷基。
54.权利要求53的试剂盒或组合物，其中
R1是含有1或2个氮原子的6-元杂芳族环，其中所述杂芳族环可以被0、1或2个取代基R2取代，所述取代基R2独立地选自C1-C4-烷基、C1-C4-卤代烷基、C(＝O)NHR6和NR4R5；其中
R6是C1-C4烷基，
每个R4和R5独立地是H、C1-C4烷基或C(＝O)C1-C4烷基；或
R4和R5与它们所连接的N原子一起形成包含0或1个额外N原子的杂环，其中所述杂环可以被C1-C4烷基取代。
55.权利要求53或54的试剂盒或组合物，其中所述基因组编辑系统是基于大范围核酸酶的系统、基于锌指核酸酶(ZFN)的系统、基于类转录激活因子效应物的核酸酶(TALEN)系统、基于CRISPR的系统或基于NgAgo的系统。
56.权利要求55的试剂盒或组合物，其中基因组编辑系统是基于CRISPR的系统。
57.权利要求56的试剂盒或组合物，其中所述基于CRISPR的系统是CRISPR-Cas系统或CRISPR-Cpf系统。
58.权利要求57的试剂盒或组合物，其中所述基于CRISPR的系统是CRISPR-Cas系统且其中所述CRISPR-Cas系统包含：(a)至少一种指导RNA元件，其包含：(i)含有与一个或多个靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向因子RNA或包含编码所述靶向因子RNA的核苷酸序列的核酸；(ii)和包含能够与所述靶向因子RNA杂交的核苷酸序列的激活因子RNA，或包含编码所述激活因子RNA的核苷酸序列的核酸；和(b)包含Cas蛋白的Cas蛋白元件或包含编码Cas蛋白的核苷酸序列的核酸。
59.权利要求57的试剂盒或组合物，其中所述Cas蛋白是II型Cas9蛋白。
60.权利要求57的试剂盒或组合物，其中所述Cas9蛋白是SaCas9、SpCas9、SpCas9n、Cas9-HF、Cas9-H840A、FokI-dCas9或D10A切口酶或它们的任意组合。
61.权利要求57的试剂盒或组合物，其中所述基于CRISPR的系统是CRISPR-Cpf系统，且其中所述CRISPR-Cpf系统包含：(a)包含与一个或多个靶基因组区域处的核苷酸序列基本上互补的核苷酸序列的靶向因子RNA，或包含编码所述靶向因子RNA的核苷酸序列的核酸；和(b)包含Cpf蛋白的Cpf蛋白元件或包含编码Cpf蛋白的核苷酸序列的核酸。
62.权利要求53-61中的任一项所述的试剂盒或组合物，其中所述基因组编辑系统被包括或包装在一种或多种载体中。
63.权利要求62的试剂盒或组合物，其中所述一种或多种载体选自病毒载体、质粒或ssDNA。
64.权利要求63的试剂盒或组合物，其中所述病毒载体选自逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体。
65.由下式中的任一个表示的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002641974190000151
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