CN104245932A

CN104245932A - 具有简单糖型的重组蛋白的产生

Info

Publication number: CN104245932A
Application number: CN201380005345.XA
Authority: CN
Inventors: 林楠; 纳塔利·西洛弗; 亨利·乔治; 凯文·凯泽
Original assignee: Sigma Aldrich Co LLC
Current assignee: Sigma Aldrich Co LLC
Priority date: 2012-01-11
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2014-12-24
Also published as: JP2018023379A; US9670271B2; JP2015503360A; US20140349341A1; BR112014016614A2; US20160272696A1; KR20140111657A; CN110438083A; ES2733248T3; JP6262665B2; SG11201403814RA; US9376484B2; BR112014016614B1; JP2020072677A; EP2802654A1; EP2802654B1; EP2802654A4; KR102212865B1; WO2013106515A1

Abstract

本发明提供缺乏甘露糖基(α-1,3-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(Mgat1)的细胞系。本发明还提供用于产生所述Mga1缺乏的细胞系的方法以及用于使用所述Mgat1缺乏的细胞系来产生具有简单糖型的重组蛋白的方法。

Description

具有简单糖型的重组蛋白的产生

发明领域

本发明涉及具有简单糖型的重组蛋白。具体来说，本发明涉及用于产生具有一个或多个末端甘露糖残基的重组糖蛋白的组合物和方法。

发明背景

N-连接的糖基化是见于许多分泌以及膜结合糖蛋白上的一种常见蛋白质修饰。合成复杂糖型需要一系列以逐步方式在真核细胞的内质网和高尔基体中进行的酶促反应。尽管大多数重组治疗性蛋白质需要存在复杂聚糖以避免免疫原性以及改进蛋白质半衰期，但也存在应用具有简单N-聚糖结构的糖蛋白。举例来说，具有简单糖型的重组蛋白有利于X射线结晶学研究。另外，仅具有末端甘露糖残基的简单糖型可通过促进甘露糖受体介导的对这些蛋白质的摄取而导致一些治疗剂的功效增加。

然而，用于产生治疗性糖蛋白的大多数细胞系产生具有异质或复杂N-连接的糖型的蛋白质。因此，对被工程改造来产生具有简单糖型的重组糖蛋白的细胞系存在需要。此外，合乎需要的是这些工程改造细胞系稳定产生具有末端甘露糖残基的蛋白质，同时保留在化学成分确定的培养基中的高蛋白质产率和强健生长。

概述

在本公开的各个方面之中，提供一种缺乏甘露糖基(α-1,3-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(Mgat1)的细胞系。在一个实施方案中，缺乏Mgat1的细胞系不产生Mgat1蛋白。在另一实施方案中，相对于不缺乏Mgat1的亲本细胞系，缺乏Mgat1的细胞系产生的Mgat1蛋白的量降低。在一个实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系包含编码Mgat1的失活染色体序列。可用靶向性核酸内切酶使编码Mgat1的染色体序列失活。在某些实施方案中，靶向性核酸内切酶选自锌指核酸酶、转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶(meganuclease)和位点特异性核酸内切酶。在一个实施方案中，靶向性核酸内切酶是锌指核酸酶。在一些实施方案中，编码Mgat1的染色体序列是由于缺失至少一个碱基对、插入至少一个碱基对、取代至少一个碱基对或其组合而失活。在某些实施方案中，编码Mgat1的染色体序列是由于缺失2-55个碱基对而失活。在一个实施方案中，缺乏Mgat1的细胞系也缺乏谷氨酰胺合成酶(GS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或其组合。在另一实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系是CHO细胞系。在一个实施方案中，缺乏Mgat1的细胞系是通过缺失使编码Mgat1的染色体序列的单拷贝失活的CHO细胞系且所述细胞系不产生Mgat1。在另一实施方案中，缺乏Mgat1的细胞系是通过缺失使编码Mgat1的染色体序列的单拷贝失活的CHO GS-/-细胞系且所述细胞系不产生Mgat1。在一个实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系表达至少一种具有简单糖型的糖蛋白，其中所述简单糖型包含一个或多个末端甘露糖残基。在一个实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系与不缺乏Mgat1的细胞系具有类似生长速率。在一个实施方案中，缺乏Mgat1的细胞系与不缺乏Mgat1的细胞系产生类似蛋白质水平。

本公开的另一方面涵盖一种用于产生缺乏Mgat1的细胞的方法。所述方法包括用靶向编码Mgat1的染色体序列中的特定序列的靶向性核酸内切酶转染宿主细胞。靶向性核酸内切酶可为锌指核酸酶、转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶或位点特异性核酸内切酶。在一个实施方案中，靶向性核酸内切酶是锌指核酸酶。在一个实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞。在另一实施方案中，宿主细胞也缺乏谷氨酰胺合成酶(GS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或其组合。在一个实施方案中，宿主细胞是CHO细胞。在另一实施方案中，宿主细胞是GS-/-CHO细胞。在一个实施方案中，使转染的宿主细胞与蓖麻凝集素-I(Ricinuscommunis agglutinin-I，RCA-I)一起孵育。

本公开的另一方面是一种用于产生具有一个或多个末端甘露糖残基的重组蛋白的方法。所述方法包括将编码重组蛋白的核酸引入编码Mgat1的所有染色体序列都被失活以使细胞系不产生Mgat1的所述细胞系中，以及表达所述重组蛋白。在一个实施方案中，编码Mgat1的染色体序列是由选自锌指核酸酶、转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶和位点特异性核酸内切酶的靶向性核酸内切酶失活。在一个实施方案中，靶向性核酸内切酶是锌指核酸酶。在一个实施方案中，编码Mgat1的失活染色体序列包含缺失2-55个碱基对。在一个实施方案中，不产生Mgat1的细胞系是CHO细胞系。在另一实施方案中，不产生Mgat1的细胞系是GS-/-CHO细胞系。在一个实施方案中，表达的重组蛋白具有包含一个或多个末端甘露糖残基的简单糖型。

下文更详细描述本公开的其它方面和迭代。

附图简述

图1是显示Mgat1在N-聚糖合成中的作用的示意图。Mgat1催化GlcNAc残基向Man5GlcNAc2(Man5)糖型的转移。

图2说明靶向Mgat1的锌指核酸酶(ZFN)的设计和验证。(A)呈现ZFN被设计来结合且在Mgat1编码区域中切割的位置的图解说明。(B)显示通过Cel1核酸酶测定对ZFN活性的验证。显示的是在转染后第3天和第10天的来自模拟转染的细胞、用DNA转染的细胞和用RNA转染的细胞的基因组DNA消化物。两个DNA片段220bp和197bp存在于转染后第3天和第10天的消化物中。

图3呈现在RCA-I富集之前和之后的Cel1分析。显示的是用DNA或RNA转染的细胞在RCA-I富集之前和之后以及模拟转染的细胞的基因组DNA消化物。如通过密度计量术测定的改进百分比列于各泳道下方。

图4显示在进行或不进行RCA-I富集下，Mgat1ZFN转染的细胞的IgG糖谱。(A)呈现由模拟转染的细胞、用ZFN DNA或RNA转染的细胞在不进行RCA-I选择下、和用ZFN DNA或RNA转染的细胞在进行RCA-I选择下产生的IgG中的各糖型(Man5、G0、G0F、G1F和G2F)的百分比。(B)图解测定的各糖型的结构。

图5呈现Mgat1破坏的IgG产生性克隆的基因型。显示的是以下细胞系的序列比对：非转染的野生型(wt)；经受ZFN转染和克隆分离的两个野生型克隆(15号、46号)；在无RCA-I下选择的两个Mgat1破坏的细胞系(73号、92号)和在RCA-I存在下选择的四个Mgat1破坏的细胞系(21号、25号、27号、37号)。阴暗区域标记ZFN切割位点。

图6说明Mgat1敲除克隆对RCA-I的不敏感性。绘制的是在不存在或存在RCA-I下生长时，野生型(wt、15号、46号)和Mgat1敲除(73号、92号、21号、25号、27号、37号)克隆的分批培养物中的峰值活细胞密度。

图7显示野生型和Mgat1敲除IgG产生性克隆的IgG糖谱。(A)显示在第5天自非转染的(wt)和两个野生型(15号、46号)克隆收集的IgG样本中的不同糖型的百分比。(B)呈现在第5天自六个Mgat1敲除(73号、92号、21号、25号、27号、37号)克隆收集的IgG样本中的不同糖型的百分比。(C)显示在第8天自野生型克隆收集的IgG样本中的不同糖型的百分比。(D)呈现在第8天自六个Mgat1敲除克隆收集的IgG样本中的不同糖型的百分比。ND＝未检测出。

图8说明野生型和Mgat1敲除克隆随时间的生长。(A)呈现在分批培养中，野生型(wt、15号、46号)和Mgat1敲除(73号、92号、21号、25号、27号、37号)克隆历经13天的活细胞百分比。(B)显示野生型和六个Mgat1敲除克隆历经13天的分批培养中的活细胞密度。

图9显示野生型和Mgat1敲除克隆的IgG产率。绘制的是野生型(wt、15号、46号)和Mgat1敲除(73号、92号、21号、25号、27号、37号)克隆的峰值体积产率。

发明详述

本公开提供用于产生具有简单糖型的重组蛋白的组合物和方法，其中简单糖型包含一个或多个末端甘露糖残基。具体来说，本公开提供缺乏甘露糖基(α-1,3-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(Mgat1)的细胞系。在一些实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系包含失活或敲除的编码Mgat1的染色体序列以使所述细胞系不产生Mgat1。因此，细胞系产生具有一个或多个末端甘露糖残基的糖蛋白。本文公开的Mgat1缺乏的细胞系适用于疫苗产生，因为具有末端甘露糖残基的糖蛋白有助于甘露糖受体介导的摄取。另外，具有简单糖型的糖蛋白适用于X射线结晶学研究。此外，本文公开的Mgat1缺乏的细胞避免与随机化学突变诱发相关的潜在调控担忧且维持与亲本细胞系的生长和产率特征类似的生长和产率特征。

本公开也提供用于制备Mgat1缺乏的细胞的方法。举例来说，可通过使用靶向性核酸内切酶使编码Mgat1的染色体序列失活来制备缺乏Mgat1的细胞。也提供用于使用本文公开的Mgat1缺乏的细胞产生具有简单糖型的重组糖蛋白的方法。

(I)Mgat1缺乏的细胞系

(a)细胞系的性质

本公开的一个方面涵盖缺乏Mgat1的细胞系。Mgat1也称为N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(GlcAc-TI或GnTI)或N-糖基-寡糖-糖蛋白N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I。Mgat1催化N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)转移至增长N-聚糖的寡甘露糖核心(即Man5GlcNAc2(Man5)部分)上(参见图1)。

在一些实施方案中，相对于亲本细胞系，Mgat1缺乏的细胞系的Mgat1水平降低。举例来说，相对于不缺乏Mgat1的亲本细胞系，Mgat1缺乏的细胞系中的Mgat1的水平可从约5％降低至约10％，从约10％降低至约20％，从约20％降低至约30％，从约30％降低至约40％，从约40％降低至约50％，从约50％降低至约60％，从约60％降低至约70％，从约70％降低至约80％，从约80％降低至约90％，或从约90％降低至约99.9％。在其它实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系基本上不产生Mgat1。如本文所用，术语“基本上无Mgat1”是指使用本领域中熟知的程序，无Mgat1mRNA和/或蛋白质可在Mgat1缺乏的细胞系或源于其的溶解产物中被检测到。适用于测定mRNA或蛋白质的水平的程序的非限制性实例包括PCR、qPCR、蛋白质印迹和ELISA测定。

缺乏Mgat1的细胞系产生具有简单糖型的糖蛋白。简单糖型是指包含一个或多个末端甘露糖残基的糖型。一般来说，简单糖型缺乏半乳糖和/或唾液酸残基。示例性简单糖型是Man5GlcNac2或Man5。在一些实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系可产生末端甘露糖残基的水平从约1.1倍增加至约3倍，从约3倍增加至约10倍，从约10倍增加至约30倍，从约30倍增加至约100倍，或超过约100倍的糖蛋白。在其它实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系可产生末端半乳糖和/或唾液酸残基的水平从约1.1倍降低至约3倍，从约3倍降低至约10倍，从约10倍降低至约30倍，从约30倍降低至约100倍，或超过约100倍的糖蛋白。

Mgat1缺乏的细胞系的蛋白质产生水平或产率水平与不缺乏Mgat1的细胞系的蛋白质产生水平或产率水平类似。如本文所用，“类似蛋白质产生”是指Mgat1缺乏的细胞系产生的蛋白质水平与不缺乏Mgat1的细胞系大致相同或高于不缺乏Mgat1的细胞系。蛋白质产率可通过测定每单位体积产生的蛋白质的量(即峰值体积产率)来定量。在一些实施方案中，相对于由不缺乏Mgat1的细胞系产生的蛋白质的量，由Mgat1缺乏的细胞系产生的蛋白质的量可变化约±10％。在其它实施方案中，相对于由不缺乏Mgat1的细胞系产生的蛋白质的量，由Mgat1缺乏的细胞系产生的蛋白质的量可从约10％增加至约20％，从约20％增加至约30％，从约30％增加至约40％，或从约40％增加至约50％。

Mgat1缺乏的细胞系的生长速率与不缺乏Mgat1的细胞系的生长速率类似。如本文所用，“类似生长速率”是指相对于不缺乏Mgat1的细胞系增加或相对于不缺乏Mgat1的细胞系降低小于约50％的生长速率。可通过在培养某一时期之后测定活细胞的百分比或每单位体积的活细胞的数目(即活细胞密度)来定量生长速率。在一些实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系相对于不缺乏Mgat1的细胞系具有增加的生长速率。举例来说，相对于不缺乏Mgat1的细胞系，Mgat1缺乏的细胞系的活细胞百分比或活细胞密度可从约1％增加至约10％，从约10％增加至约30％，从约30％增加至约5％，从约50％增加至约100％，或超过100％。在其它实施方案中，相对于不缺乏Mgat1的细胞系，Mgat1缺乏的细胞系的活细胞百分比或活细胞密度可从约1％降低至约10％，从约10％降低至约30％，从约30％降低至约50％。

本文公开的Mgat1缺乏的细胞系具有稳定表型。举例来说，Mgat1缺乏的细胞系持续延长时期和/或历经无数代细胞产生具有简单糖型的糖蛋白。换句话说，本文公开的细胞系不回复产生具有复杂糖型的糖蛋白。另外，缺乏Mgat1的细胞系持续延长时期和/或历经无数代细胞维持高水平的蛋白质产率和出色生长速率。

(b)编码Mgat1的失活染色体序列

在一些实施方案中，缺乏Mgat1的细胞系包含编码Mgat1的失活染色体序列。举例来说，细胞系的基因组可被编辑以使编码Mgat1的染色体序列失活。如本文所用，术语“失活染色体序列”是指不能产生蛋白质产物的染色体序列。在细胞系包括整倍体细胞的实施方案中，编码Mgat1的失活染色体序列可为单等位基因以使细胞系产生的Mgat1的水平降低。在细胞系包括整倍体细胞的其它实施方案中，编码Mgat1的失活染色体序列可为双等位基因以使所述细胞系不产生Mgat1。在细胞系是非整倍体的其它实施方案中，可使编码Mgat1的染色体序列的一个或多个拷贝失活以使细胞产生的Mgat1的量降低。在细胞系是非整倍体的其它实施方案中，可使编码Mgat1的染色体序列的所有拷贝都失活以使所述细胞系不产生Mgat1。在示例性实施方案中，细胞系就编码Mgat1的染色体序列而言是单倍体，且编码Mgat1的染色体序列的失活导致Mgat1表达完全丧失。

可通过缺失至少一个碱基对(bp)、插入至少一个bp、取代至少一个bp或其组合使编码Mgat1的染色体序列失活。由于缺失、插入和/或取代，Mgat1编码序列经受阅读框移动，由此防止产生蛋白质产物。可使用如以下在章节(II)中详述的靶向性核酸内切酶介导的基因组编辑技术使编码Mgat1的染色体序列失活。在各种实施方案中，可通过缺失外显子编码区域的全部或一部分、缺失控制区域的全部或一部分、和/或缺失拼接位点以使Mgat1的表达消除来使编码Mgat1的染色体序列失活。在其它实施方案中，可通过缺失、插入和/或核苷酸取代以将过早终止密码子、新拼接位点和/或SNP引入染色体序列中以使细胞系不能产生Mgat1来使编码Mgat1的染色体序列失活。

在一个实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系包含在编码Mgat1的染色体序列的约1bp至整个编码区域的范围内的缺失。在另一实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系包含在Mgat1的编码区域的约2bp至约55bp、约55bp至约100bp、约100bp至约300bp、约300bp至约600bp、约600bp至约1200bp、或超过约1200bp的范围内的缺失。在示例性实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系包含编码Mgat1的染色体序列的2bp、4bp、7bp、10bp、18bp、24bp、28bp或55bp的缺失。在另一示例性实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系包含编码Mgat1的染色体序列的由104bp的插入所置换的157bp的缺失。

(c)任选的其它缺乏

在一些实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系也包含谷氨酰胺合成酶(GS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或其组合的缺乏。GS、DHFR和/或HPRT的缺乏可为天然存在的。或者，GS、DHFR和/或HPRT的缺乏可为工程改造的。举例来说，因为细胞包含失活的编码GS、DHFR或HPRT的染色体序列，所以细胞可分别缺乏GS、DHFR或HPRT。在一些实施方案中，可通过靶向性核酸内切酶介导的基因组编辑使编码GS、DHFR或HPRT的染色体序列失活。在示例性实施方案中，使编码GS、DHFR或HPRT的染色体序列的所有拷贝都失活以使细胞系分别不产生GS、DHFR或HPRT。在示例性实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系是GS-/-。

(d)细胞系类型

缺乏Mgat1的细胞系的类型可变化。细胞系可为人细胞系、非人哺乳动物细胞系、非哺乳动物脊椎动物细胞系、无脊椎动物细胞系或酵母细胞系。

适合哺乳动物细胞系的非限制性实例包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼小仓鼠肾(BHK)细胞；小鼠骨髓瘤NS0细胞、小鼠胚胎成纤维细胞3T3细胞(NIH3T3)、小鼠B淋巴瘤A20细胞；小鼠黑素瘤B16细胞；小鼠成肌细胞C2C12细胞；小鼠骨髓瘤SP2/0细胞；小鼠胚胎间质C3H-10T1/2细胞；小鼠癌瘤CT26细胞、小鼠前列腺DuCuP细胞；小鼠乳房EMT6细胞；小鼠肝细胞瘤Hepa1c1c7细胞；小鼠骨髓瘤J5582细胞；小鼠上皮MTD-1A细胞；小鼠心肌MyEnd细胞；小鼠肾RenCa细胞；小鼠胰腺RIN-5F细胞；小鼠黑素瘤X64细胞；小鼠淋巴瘤YAC-1细胞；大鼠成胶质细胞瘤9L细胞；大鼠B淋巴瘤RBL细胞；大鼠成神经细胞瘤B35细胞；大鼠肝细胞瘤细胞(HTC)；水牛鼠肝BRL3A细胞；犬肾细胞(MDCK)；犬乳腺(CMT)细胞；大鼠骨肉瘤D17细胞；大鼠单核细胞/巨噬细胞DH82细胞；猴肾SV-40转化的成纤维细胞(COS7)细胞；猴肾CVI-76细胞；非洲绿猴肾(VERO-76)细胞；人胚肾细胞(HEK293、HEK293T)；人宫颈癌细胞(HELA)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；人U2-OS骨肉瘤细胞、人A549细胞、人A-431细胞和人K562细胞。哺乳动物细胞系的详尽清单可见于美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)目录(ATCC,Mamassas,VA)中。

适合非哺乳动物细胞系的实例包括但不限于非洲蟾蜍属(Xenopus)细胞系(如S3、XTC、BB7、ff-2、15/0和15/40)；斑马鱼细胞系(如ZF4、PAC2等)；昆虫细胞系(如SF9、S2等)；和酵母细胞系，如毕赤酵母属细胞系以及酵母属细胞系。

在示例性实施方案中，细胞系是广泛用于产生重组蛋白，如抗体、糖蛋白等的类型。在示例性实施方案中，细胞系是CHO细胞系。众多CHO细胞系可从ATCC获得。适合CHO细胞系包括但不限于CHO-K1细胞及其衍生物。

(e)任选的核酸

在一些实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系可进一步包含至少一种编码重组蛋白的核酸序列。一般来说，重组蛋白是异源的，这指的是所述蛋白质不为细胞所天然具有。重组蛋白可不加限制地为抗体、抗体片段、单克隆抗体、人源化抗体、人源化单克隆抗体、嵌合抗体、IgG分子、IgG重链、IgG轻链、IgA分子、IgD分子、IgE分子、IgM分子、疫苗、生长因子、细胞因子、干扰素、白介素、激素、凝结(或凝血)因子、血液组分、酶、治疗性蛋白质、营养蛋白质、上文任一种的功能性片段或功能性变体、或包含上文蛋白质和/或其功能性片段或变体的任一种的融合蛋白。

在一些实施方案中，编码重组蛋白的核酸序列可连接于编码次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)、二氢叶酸还原酶(DHFR)和/或谷氨酰胺合成酶(GS)的核酸序列，以使HPRT、DHFR和/或GS可用作可扩增的可选择标记物。

在一些实施方案中，编码重组蛋白的核酸序列可为染色体外的。也就是说，编码重组蛋白的核酸可从质粒、粘粒、人工染色体、微型染色体或另一染色体外构建体短暂表达。表达构建体可包含其它表达控制序列(例如增强子序列、Kozak序列、聚腺苷酸化序列、转录终止序列等)、可选择标记物序列(例如抗生素抗性基因)、复制起点等。其它信息可见于“Current Protocols in Molecular Biology”Ausubel等,John Wiley&Sons,New York,2003或“Molecular Cloning:ALaboratory Manual”Sambrook和Russell,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY,第3版,2001中。

在其它实施方案中，编码重组蛋白的核酸序列可染色体性地整合入细胞的基因组中。因此，重组蛋白可被稳定表达。在这个实施方案的一些迭代中，编码重组蛋白的核酸序列可可操作地连接于适当异源表达控制序列(即启动子)。在其它迭代中，编码重组蛋白的核酸序列可置于内源性表达控制序列的控制之下。可使用同源重组、靶向性核酸内切酶介导的基因组编辑、病毒载体、转位子、质粒和其它熟知手段使编码重组蛋白的核酸序列整合入细胞系的基因组中。其它指导可见于Ausubel等2003(上文)以及Sambrook和Russell,2001(上文)中。

(f)示例性实施方案

在一个示例性实施方案中，细胞系是编码Mgat1的染色体序列的单拷贝被失活的CHO细胞系(即细胞的基因型是Mgat1-/0)。在另一示例性实施方案中，细胞系是编码Mgat1的染色体序列的单拷贝被失活的GS-/-CHO细胞系(即细胞的基因型是GS-/-,Mgat1-/0)。一般来说，通过缺失编码序列的一部分使编码Mgat1的染色体序列失活。

(II)用于制备缺乏Mgat1的细胞系的方法

可通过多种方法制备缺乏Mgat1的细胞系。在某些实施方案中，可通过靶向性核酸内切酶介导的基因组编辑方法制备Mgat1缺乏的细胞系。在其它实施方案中，可通过RNAi方法、随机突变诱发、位点特异性重组系统或本领域中已知的其它方法制备Mgat1缺乏的细胞系。

缺乏Mgat1的细胞系产生具有一个或多个末端甘露糖残基的糖蛋白。在其它实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系可通过与蓖麻凝集素-I(RCA-I)一起孵育来进一步富集。RCA-I是一种细胞毒性凝集素，其不结合末端甘露糖残基且因此允许选择缺乏Mgat1活性的细胞，因为所述细胞产生具有末端甘露糖残基的糖蛋白。

(a)靶向性核酸内切酶介导的基因组编辑

靶向性核酸内切酶可用于编辑(即失活或修饰)特定染色体序列。可通过将靶向性核酸内切酶或编码所述靶向性核酸内切酶的核酸引入细胞中使特定染色体序列失活，所述靶向性核酸内切酶被工程改造来靶向特定染色体序列。在一个实施方案中，靶向性核酸内切酶识别并结合特定染色体序列且引入通过非同源末端接合(NHEJ)修复过程修复的双链断裂。因为NHEJ是易出错的，所以可能发生缺失、插入和/或取代至少一个核苷酸，由此破坏染色体序列的阅读框以致不产生蛋白质产物。在另一实施方案中，靶向性核酸内切酶也可用于通过共同引入与靶向的染色体序列的一部分具有实质性序列同一性的聚核苷酸，通过同源重组反应来编辑染色体序列。由靶向性核酸内切酶引入的双链断裂是通过同源性定向修复过程来修复以使以导致染色体序列被编辑的方式使染色体序列与聚核苷酸交换。

(i)靶向性核酸内切酶

多种靶向性核酸内切酶可用于编辑染色体序列。靶向性核酸内切酶可为天然存在的蛋白质或工程改造蛋白质。在一个实施方案中，靶向性核酸内切酶可为大范围核酸酶。大范围核酸酶是特征在于识别序列较长，即识别序列通常在约12个碱基对至约40个碱基对的范围内的脱氧核糖核酸内切酶。由于这个要求，识别序列通常仅在任何给定基因组中出现一次。在大范围核酸酶之中，名为LAGLIDADG的归巢核酸内切酶的家族已成为基因组和基因组工程改造研究的一种有价值工具。可使用为本领域技术人员所熟知的技术，通过修饰大范围核酸酶的识别序列来使所述大范围核酸酶靶向特定染色体序列。

在另一实施方案中，靶向性核酸内切酶可为转录活化子样效应物(TALE)核酸酶。TALE是来自植物病原体黄单胞菌属的转录因子，其可易于被工程改造来结合新型DNA靶标。TALE或其截短形式可连接于如FokI的核酸内切酶的催化结构域以产生称为TALE核酸酶或TALEN的靶向性核酸内切酶(Sanjana等,2012,Nat Protoc,7(1):171-192)。

在另一实施方案中，靶向性核酸内切酶可为位点特异性核酸内切酶。具体来说，位点特异性核酸内切酶可为识别序列很少存在于基因组中的“稀有切点(rare-cutter)”核酸内切酶。通常，位点特异性核酸内切酶的识别序列仅在基因组中出现一次。在另一替代实施方案中，靶向性核酸内切酶可为靶向的DNA双链断裂人工诱导剂。

在示例性实施方案中，靶向性核酸内切酶可为锌指核酸酶(ZFN)。通常，ZFN包含DNA结合结构域(即锌指)和裂解结构域(即核酸酶)，其两者均在以下加以描述。

锌指结合结构域。锌指结合结构域可被工程改造来识别和结合任何所选核酸序列。参见例如Beerli等(2002)Nat.Biotechnol.20:135-141；Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等(2001)Nat.Biotechnol.19:656-660；Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；Zhang等(2000)J.Biol.Chem.275(43):33850-33860；Doyon等(2008)Nat.Biotechnol.26:702-708；和Santiago等(2008)Proc.Natl.Acad.Sci.USA105:5809-5814。相较于天然存在的锌指蛋白质，工程改造锌指结合结构域可具有新颖结合特异性。工程改造方法包括但不限于合理设计和各种类型的选择。合理设计包括例如使用包含双联体、三联体和/或四联体核苷酸序列和个别锌指氨基酸序列的数据库，其中各双联体、三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一个或多个氨基酸序列相关。参见例如美国专利号6,453,242和6,534,261，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。举例来说，美国专利6,453,242中所述的算法可用于设计锌指结合结构域以靶向预先选择的序列。替代方法，如使用非简并识别代码表的合理设计也可用于设计锌指结合结构域以靶向特定序列(Sera等(2002)Biochemistry41:7074-7081)。用于鉴定DNA序列中的潜在靶位点以及设计锌指结合结构域的公开可用的网络基工具在本领域中是已知的。举例来说，用于鉴定DNA序列中的潜在靶位点的工具可见于http://www.zincfingertools.org处。用于设计锌指结合结构域的工具可见于http://zifit.partners.org/ZiFiT处。(也参见Mandell等(2006)Nuc.Acid Res.34:W516-W523；Sander等(2007)Nuc.AcidRes.35:W599-W605。)

锌指结合结构域可被设计来识别并结合长度在约3个核苷酸至约21个核苷酸的范围内的DNA序列。在一个实施方案中，锌指结合结构域可被设计来识别并结合长度在约9至约18个核苷酸的范围内的DNA序列。一般来说，本文使用的锌指核酸酶的锌指结合结构域包含至少三个锌指识别区域或锌指，其中各锌指结合3个核苷酸。在一个实施方案中，锌指结合结构域包含四个锌指识别区域。在另一实施方案中，锌指结合结构域包含五个锌指识别区域。在另一实施方案中，锌指结合结构域包含六个锌指识别区域。锌指结合结构域可被设计来结合任何适合靶DNA序列。参见例如美国专利号6,607,882；6,534,261和6,453,242，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。

选择锌指识别区域的示例性方法包括描述于以下专利中的噬菌体展示和双杂交系统：美国专利号5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759；和6,242,568；以及WO98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197和GB2,338,237，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。此外，已例如在WO 02/077227中描述锌指结合结构域的结合特异性的增强，所述专利的整个公开内容以引用的方式并入本文。

设计和构建融合蛋白(和其编码聚核苷酸)的锌指结合结构域和方法为本领域技术人员所知且详述于例如美国专利号7,888,121中，所述专利以引用的方式整体并入本文。可使用适合接头序列(包括例如长度是五个或更多个氨基酸的接头)将锌指识别区域和/或多指锌指蛋白质连接在一起。对于长度是六个或更多个氨基酸的接头序列的非限制实例，参见美国专利号6,479,626；6,903,185；和7,153,949，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。本文所述的锌指结合结构域可在蛋白质的个别锌指之间包括适合接头的组合。

在一些实施方案中，锌指核酸酶进一步包含核定位信号或序列(NLS)。NLS是有助于将锌指核酸酶蛋白质靶向至核中以在染色体中的靶序列处引入双链断裂的氨基酸序列。核定位信号在本领域中是已知的。参见例如Makkerh等(1996)Current Biology6:1025-1027。

裂解结构域。锌指核酸酶也包括裂解结构域。锌指核酸酶的裂解结构域部分可从任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。可从其获得裂解结构域的核酸内切酶的非限制性实例包括但不限于限制核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见例如New England Biolabs目录或Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。裂解DNA的其它酶是己知的(例如S1核酸酶、绿豆核酸酶、胰腺DNA酶I、微球菌核酸酶、酵母HO核酸内切酶)。也参见Linn等(编)Nucleases,Cold Spring HarborLaboratory Press,1993。这些酶(或其功能性片段)的一个或多个可用作裂解结构域的来源。

裂解结构域也可源于裂解活性需要二聚化的如上所述的酶或其部分。两个锌指核酸酶可为裂解所需，因为各核酸酶包含活性酶二聚体的单体。或者，单一锌指核酸酶可包含两个单体以产生活性酶二聚体。如本文所用，“活性酶二聚体”是能够裂解核酸分子的酶二聚体。两个裂解单体可源于相同核酸内切酶(或其功能性片段)，或各单体可源于不同核酸内切酶(或其功能性片段)。

当两个裂解单体用于形成活性酶二聚体时，两个锌指核酸酶的识别位点优选被安置来使两个锌指核酸酶与它们的相应识别位点的结合使裂解单体彼此处于允许裂解单体例如通过二聚化来形成活性酶二聚体的空间定向。因此，识别位点的近侧边缘可由约5至约18个核苷酸分隔。举例来说，近侧边缘可由约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个核苷酸分隔。然而，应了解任何整数个核苷酸或核苷酸对都可插入两个识别位点之间(例如约2至约50个核苷酸对或更多个核苷酸对)。锌指核酸酶的识别位点的近侧边缘(诸如像本文详述的那些)可由6个核苷酸分隔。一般来说，裂解位点位于识别位点之间。

限制核酸内切酶(限制酶)存在于许多物种中且能够以序列特异性方式结合DNA(在识别位点处)，且在结合位点处或附近裂解DNA。某些限制酶(例如IIS型)在远离识别位点的位点处裂解DNA且具有可分开的结合结构域和裂解结构域。举例来说，IIS型酶FokI在距它的处于一条链上的识别位点9个核苷酸处且在距它的处于另一条链上的识别位点13个核苷酸处催化DNA的双链裂解。参见例如美国专利号5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279；Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764-2768；Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:883-887；Kim等(1994b)J.Biol.Chem.269:31978-31982。因此，锌指核酸酶可包含来自至少一种IIS型限制酶的裂解结构域和一个或多个可或可不加以工程改造的锌指结合结构域。示例性IIS型限制酶例如描述于国际公布WO 07/014,275中，所述公布的公开内容以引用方式整体并入本文。其它限制酶也含有可分开的结合结构域和裂解结构域，且这些酶也由本公开涵盖。参见例如Roberts等(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420。

裂解结构域可与结合结构域分开的示例性IIS型限制性酶是FokI。这个特定酶以二聚体形式具有活性(Bitinaite等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575)。因此，出于本公开的目的，在锌指核酸酶中使用的FokI酶的部分被认为是裂解单体。因此，对于使用FokI裂解结构域的靶向的双链裂解，两个各自包含FokI裂解单体的锌指核酸酶可用于重构活性酶二聚体。或者，也可使用含有锌指结合结构域和两个FokI裂解单体的单一多肽分子。

在某些实施方案中，裂解结构域包含一个或多个使均二聚化最小或防止均二聚化的工程改造裂解单体。作为非限制实例，在FokI的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538处的氨基酸残基都是影响FokI裂解半结构域的二聚化的靶标。形成专性杂二聚体的FokI的示例性工程改造裂解单体包括成对单体，其中第一裂解单体在FokI的氨基酸残基位置490和538处包括突变且第二裂解单体在氨基酸残基位置486和499处包括突变。

因此，在工程改造裂解单体的一个实施方案中，在氨基酸位置490处的突变将Glu(E)替换为Lys(K)；在氨基酸残基538处的突变将Iso(I)替换为Lys(K)；在氨基酸残基486处的突变将Gln(Q)替换为Glu(E)；且在位置499处的突变将Iso(I)替换为Lys(K)。具体来说，工程改造裂解单体可通过以下方法来制备：在一个裂解单体中将位置490自E突变为K且将位置538自I突变为K来产生称为“E490K:I538K”的工程改造裂解单体，且在另一裂解单体中将位置486自Q突变为E且将位置499自I突变为K来产生称为“Q486E:I499K”的工程改造裂解单体。上述工程改造裂解单体是异常裂解得以最小化或消除的专性杂二聚体突变体。工程改造裂解单体可使用适合方法，例如，如美国专利号7,888,121中所述，通过野生型裂解单体(FokI)的定点突变诱发制备，所述专利整体并入本文。

(ii)任选的聚核苷酸

在一些实施方案中，用于靶向的基因组编辑的方法进一步包括将至少一种聚核苷酸引入细胞中，所述聚核苷酸包含与在靶向的裂解位点的至少一侧上的序列具有实质性序列同一性的序列。举例来说，聚核苷酸可包含与在靶向的裂解位点的一侧上的序列具有实质性序列同一性的第一序列和与在靶向的裂解位点的另一侧上的序列具有实质性序列同一性的第二序列。或者，聚核苷酸可包含与在靶向的裂解位点的一侧上的序列具有实质性序列同一性的第一序列和与远离靶向的裂解位点定位的序列具有实质性序列同一性的第二序列。远离靶向的裂解位点定位的序列可为靶向的裂解位点的上游或下游的数十、数百或数千个核苷酸。

聚核苷酸中与染色体序列中的序列具有实质性序列同一性的第一和第二序列的长度可变化且将变化。一般来说，聚核苷酸中的第一和第二序列各自长度是至少约10个核苷酸。在各种实施方案中，与染色体序列具有实质性序列同一性的聚核苷酸序列的长度可在约10至30个核苷酸、约30至约100个核苷酸、约100至约300个核苷酸、约300至约1000个核苷酸、约1000至约3000个核苷酸、或超过3000的范围内。

短语“实质性序列同一性”是指聚核苷酸中的序列与目标染色体序列具有至少约75％序列同一性。举例来说，聚核苷酸中的至少一个序列可与靶向的染色体序列相同，例外之处是它含有缺失、插入和/或取代至少一个核苷酸以使在同源重组后将改变的序列引入染色体序列中。在各种实施方案中，聚核苷酸中的序列可与目标染色体序列具有约75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。

在替代实施方案中，聚核苷酸可包含由与染色体序列具有实质性序列同一性的序列侧接的另一序列。在同源重组后，另一序列可整合入染色体序列中，由此使染色体序列失活和/或修饰染色体序列。

聚核苷酸的长度可变化且将变化。举例来说，聚核苷酸的长度可在约20个核苷酸直至约200,000个核苷酸的范围内。在各种实施方案中，聚核苷酸的长度在约20个核苷酸至约100个核苷酸、约100个核苷酸至约1000个核苷酸、约1000个核苷酸至约10,000个核苷酸、约10,000个核苷酸至约100,000个核苷酸、或约100,000个核苷酸至约200,000个核苷酸的范围内。

通常，聚核苷酸将为DNA。。DNA可为单链或双链。供体聚核苷酸可为DNA质粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、病毒载体、一段线性DNA、PCR片段、裸核酸或与递送媒介物(如脂质体或泊洛沙姆(poloxamer))复合的核酸。

在一些实施方案中，聚核苷酸可进一步包含标记物。适合标记物的非限制性实例包括限制位点、荧光蛋白质或可选择标记物。所述标记物使得能够筛选靶向的整合物。

(iii)引入细胞中

可将靶向性核酸内切酶以蛋白质形式或以编码靶向性核酸内切酶的核酸形式引入细胞中。编码靶向性核酸内切酶的核酸可为DNA或RNA(即mRNA)。在编码核酸是mRNA的实施方案中，mRNA可被5'加帽和/或3'聚腺苷酸化。在编码核酸是DNA的实施方案中，DNA可为线性或环状。DNA可为载体的一部分，其中编码DNA任选可操作地连接于适合启动子。关于适当载体、启动子、其它控制元件以及将载体引入细胞中的手段的其它信息可例如见于Ausubel等,2003(上文)和/或Sambrook和Russell,2001(上文)中。

可通过多种手段将靶向性核酸内切酶或编码靶向性核酸内切酶的核酸和上述任选的聚核苷酸引入细胞中。适合递送手段包括显微注射、电穿孔、声致穿孔、基因枪法、磷酸钙介导的转染、阳离子转染、脂质体转染、树状体转染、热休克转染、核转染、磁转染、脂质体转染、刺穿转染(impalefection)、光转染、专有试剂增强的核酸摄取，以及通过脂质体、免疫脂质体、病毒体或人工病毒粒子来递送。在某些实施方案中，通过核转染或电穿孔将靶向性核酸内切酶分子和任选的聚核苷酸引入细胞中。

在将一种以上靶向性核酸内切酶分子和一种以上聚核苷酸引入细胞中的实施方案中，所述分子可同时或依序引入。举例来说，可同时引入各自对靶向的裂解位点(和任选的聚核苷酸)具有特异性的靶向性核酸内切酶分子。或者，可依序引入各靶向性核酸内切酶分子以及任选的聚核苷酸。

靶向性核酸内切酶(或编码核酸)分子与任选的聚核苷酸的比率可变化且将变化。一般来说，靶向性核酸内切酶分子与聚核苷酸的比率可在约1:10至约10:1的范围内。在各种实施方案中，靶向性核酸内切酶分子与聚核苷酸的比率是约1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1或10:1。在一个实施方案中，比率是约1:1。

(iv)示例性实施方案

在一些实施方案中，通过工程改造锌指核酸酶(ZFN)以裂解Mgat1基因中的特定序列来制备缺乏Mgat1的细胞系。在将ZFN或编码ZFN的核酸引入亲本细胞系中后，ZFN结合且裂解Mgat1基因中的特定序列。易出错的NHEJ过程修复Mgat1基因中的双链断裂，由此引入至少一个bp的缺失、插入和/或取代以使Mgat1基因失活。一般来说，缺失Mgat1编码序列的某一区域以使阅读框破坏且缺乏Mgat1的细胞系不产生Mgat1蛋白。在一些实施方案中，通过在RCA-I存在下进行选择来进一步富集通过ZFN介导的基因组编辑产生的Mgat1缺乏的细胞系。在一些实施方案中，通过使CHO细胞系与靶向Mgat1的ZFN接触来制备Mgat1缺乏的细胞系。在一些情况下，CHO细胞系是GS-/-。

(b)RNA干扰

在另一实施方案中，可使用抑制靶mRNA或转录物的表达的RNA干扰(RNAi)剂制备Mgat1缺乏的细胞系。RNAi剂可导致靶mRNA或转录物裂解。或者，RNAi剂可防止或破坏靶mRNA翻译成蛋白质。

在一些实施方案中，RNAi剂可为短干扰RNA(siRNA)。一般来说，siRNA包括长度在约15至约29个核苷酸的范围内的双链RNA分子。siRNA的长度可为约16-18、17-19、21-23、24-27或27-29个核苷酸。在特定实施方案中，siRNA的长度是约21个核苷酸。siRNA可任选进一步包含一个或两个单链突出部分，例如在一端或两端上的3’突出部分。siRNA可由杂交在一起的两个RNA分子形成，或者，可从短发夹RNA(shRNA)(参见下文)产生。在一些实施方案中，siRNA的两链完全互补，以使在两个序列之间形成的双链体中不存在错配或凸出部分。在其它实施方案中，siRNA的两链大致上互补，以使在两个序列之间形成的双链体中可存在一个或多个错配和/或凸出部分。在某些实施方案中，siRNA的一个或两个5’末端具有磷酸基团，而在其它实施方案中，一个或两个5’末端缺乏磷酸基团。在其它实施方案中，siRNA的一个或两个3’末端具有羟基，而在其它实施方案中，一个或两个5’末端缺乏羟基。

称为“反义链”或“引导链”的一个siRNA链包括与靶转录物杂交的部分。在某些实施方案中，siRNA的反义链与靶转录物的某一区域完全互补，即它与靶转录物杂交而历经长度在约15与约29个核苷酸之间，长度优选是至少16个核苷酸，且长度更优选是约18-20个核苷酸的靶区域无单一错配或凸出部分。在其它实施方案中，反义链大致上互补于靶区域，即由反义链和靶转录物形成的双链体中可存在一个或多个错配和/或凸出部分。通常，使siRNA靶向靶转录物的外显子序列。本领域技术人员熟识设计针对靶转录物的siRNA的程序、算法和/或商业服务。示例性实例是Rosetta siRNA设计算法(Rosetta Inpharmatics,North Seattle,WA)和siRNA(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)。可使用为本领域技术人员所熟知的方法体外酶促合成siRNA。或者，可使用本领域中熟知的寡核苷酸合成技术化学合成siRNA。

在其它实施方案中，RNAi剂可为短发夹RNA(shRNA)。一般来说，shRNA是包含至少两个互补部分的RNA分子，所述部分杂交或能够杂交以形成足够长以介导RNA干扰(如上所述)的双链结构，以及至少一个形成连接shRNA的形成双链体的区域的环的单链部分。所述结构也称为茎-环结构，其中茎是双链体部分。在一些实施方案中，所述结构的双链体部分完全互补，以使在shRNA的双链体区域中不存在错配或凸出部分。在其它实施方案中，所述结构的双链体部分大致上互补，以使在shRNA的双链体部分中存在一个或多个错配和/或凸出部分。所述结构的环的长度可为约1至约20个核苷酸，长度优选是约4至约10个核苷酸，且长度更优选是约6至约9个核苷酸。环可位于互补于靶转录物的区域(即shRNA的反义部分)的5’或3’末端。

shRNA可进一步在5’或3’末端上包含突出部分。任选的突出部分的长度可为约1至约20个核苷酸，且长度更优选是约2至约15个核苷酸。在一些实施方案中，突出部分包含一个或多个U残基，例如约1个与约5个之间的U残基。在一些实施方案中，shRNA的5’末端具有磷酸基团，而在其它实施方案中，它不具有磷酸基团。在其它实施方案中，shRNA的3’末端具有羟基，而在其它实施方案中，它不具有羟基。一般来说，shRNA由保守细胞RNAi机构处理成siRNA。因此，shRNA是siRNA的前体，且类似地能够抑制互补于shRNA的一部分(即shRNA的反义部分)的靶转录物的表达。本领域技术人员熟识用于设计和合成shRNA的可用资源(如上所详述)。一示例性实例是shRNA(Sigma-Aldrich)。

在其它实施方案中，RNAi剂可为RNAi表达载体。通常，RNAi表达载体用于细胞内(体内)合成RNAi剂，如siRNA或shRNA。在一个实施方案中，使用含有两个启动子的单一载体转录两个单独互补siRNA链，所述两个启动子各自引导单一siRNA链转录(即各启动子可操作地连接于siRNA的模板以使可发生转录)。两个启动子可呈相同定向，在所述情况下，各启动子可操作地连接于一个互补siRNA链的模板。或者，两个启动子可呈相对定向，侧接单一模板以使启动子的转录导致合成两个互补siRNA链。在另一实施方案中，RNAi表达载体可含有驱动包含两个互补区域的单一RNA分子的转录，以使转录物形成shRNA的启动子。

本领域技术人员将了解，siRNA和shRNA剂优选通过转录一个以上转录单元而在体内产生。一般说来，用于引导一个或多个siRNA或shRNA转录单元在体内表达的启动子可为RNA聚合酶III(Pol III)的启动子。如U6或H1启动子的某些Pol III启动子不需要转录的区域内的顺式作用调控元件，且因此，在某些实施方案中是优选的。在其它实施方案中，Pol II的启动子可用于驱动一个或多个siRNA或shRNA转录单元的表达。在一些实施方案中，可使用组织特异性、细胞特异性或诱导性Pol II启动子。

可使用标准重组DNA方法产生提供用于合成siRNA或shRNA的模板的构建体且插入适于在真核细胞中表达的广泛多种不同载体的任一种中。重组DNA技术描述于Ausubel等,2003(上文)以及Sambrook和Russell,2001(上文)中。本领域技术人员也了解，载体可包含其它调控序列(例如终止序列、翻译控制序列等)以及可选择标记物序列。DNA质粒在本领域中是已知的，包括基于pBR322、PUC等的那些DNA质粒。因为许多表达载体已含有一个或多个启动子，所以可能仅必须在关于启动子适当的位置处插入编码目标RNAi剂的核酸序列。病毒载体也可用于提供细胞内RNAi剂表达。适合病毒载体包括反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体等。在特定实施方案中，RNAi表达载体是shRNA慢病毒基载体或慢病毒粒子，如TRC shRNA产品(Sigma-Aldrich)中提供的载体或粒子。

可使用为本领域技术人员所熟知的方法将RNAi剂或RNAi表达载体引入细胞中。所述技术描述于例如Ausubel等,2003(上文)或Sambrook和Russell,2001(上文)中。在某些实施方案中，例如病毒载体的RNAi表达载体被稳定整合入细胞的基因组中，以使历经随后代细胞，Mgat1表达被破坏。

(c)位点特异性重组

在替代实施方案中，可使用位点特异性重组技术制备Mgat1缺乏的细胞系。举例来说，位点特异性重组技术可用于缺失全部或一部分目标染色体序列，或将单核苷酸多态性(SNP)引入目标染色体序列中。在一个实施方案中，使用Cre-loxP位点特异性重组系统、Flp-FRT位点特异性重组系统或其变体靶向目标染色体序列。所述重组系统可商购获得，且对于这些技术的其它教义见于例如Ausubel等,2003(上文)中。

(III)用于产生具有简单糖型的重组蛋白的方法

也提供使用Mgat1缺乏的细胞来产生具有简单糖型的重组蛋白的方法。简单糖型是指包含一个或多个末端甘露糖残基的糖型。一般来说，简单糖型缺乏半乳糖和/或唾液酸残基。示例性简单糖型是Man5GlcNac2或Man5。如上所提及，具有简单糖型的糖蛋白适用于X射线结晶学研究。具有简单糖型的糖蛋白具有其它应用。举例来说，Mgat1缺乏的细胞可用于产生疫苗。Mgat1缺乏的细胞产生含有末端甘露糖残基的糖蛋白。抗原上的末端甘露糖残基允许由抗原递呈细胞上的甘露糖受体达成对它的摄取。抗原递呈细胞(即巨噬细胞或树突细胞)接着递呈抗原以达成由T细胞识别，由此发动免疫反应。使用包含末端甘露糖残基的抗原可增强向T细胞递呈抗原的效率。另外，仅具有末端甘露糖残基的糖蛋白可通过促进甘露糖受体介导的对这些蛋白质的摄取而适用于其它治疗目的。

可制备具有简单糖型的糖蛋白。本公开的另一方面涵盖一种用于产生具有简单糖型的重组蛋白的方法。所述方法包括将编码重组蛋白的核酸引入缺乏Mgat1的细胞系中以及表达所述重组蛋白，其中所述表达的重组蛋白包含一个或多个末端甘露糖残基。以上在章节(I)中描述Mgat1缺乏的细胞系。

在Mgat1缺乏的细胞系中产生的重组糖蛋白可为任何适合糖蛋白，包括治疗性蛋白质和蛋白质生物剂。举例来说，重组蛋白可不加限制地为抗体、抗体片段、单克隆抗体、人源化抗体、人源化单克隆抗体、嵌合抗体、IgG分子、IgG重链、IgG轻链、IgA分子、IgD分子、IgE分子、IgM分子、疫苗、生长因子、细胞因子、干扰素、白介素、激素、凝结(或凝血)因子、血液组分、酶、营养蛋白质、上文任一种的功能性片段或功能性变体、或包含上文蛋白质和/或其功能性片段或变体的任一种的融合蛋白。在示例性实施方案中，重组糖蛋白是人蛋白质。

用于产生重组蛋白的方法在本领域中是熟知的，且其它教义由Ausubel等,2003(上文)提供。一般来说，重组蛋白是自外源引入的核酸表达。如以上在章节(I)(e)中所详述，编码重组蛋白的核酸可为染色体外的或编码重组蛋白的核酸可整合入基因组中。

用于培养细胞系以使重组蛋白得以表达的方法在本领域中是熟知的。适当培养基和培养系统在本领域中是已知的且可商购获得。在一个实施方案中，重组蛋白是由本文公开的细胞系通过无血清混悬培养产生。

定义

除非另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有由本发明所属领域的技术人员通常理解的含义。以下参考书目提供技术人员以本发明中使用的许多术语的一般性定义：Singleton等,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版1994)；TheCambridge Dictionary of Science and Technology(Walker编,1988)；TheGlossary of Genetics,第5版,R.Rieger等(编),Springer Verlag(1991)；以及Hale和Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。除非另外指定，否则如本文所用，以下术语具有归于它们的含义。

在介绍本公开或其优选实施方案的要素时，冠词“一个(种)”和“所述”意指存在一个或多个要素。术语“包含”、“包括”和“具有”意图是包括性的且意味可能存在除所列要素以外的其它要素。

如本文所用，术语“内源性序列”是指为细胞所天然具有的染色体序列。

术语“外源性序列”是指不为细胞所天然具有的染色体序列，或天然染色体位置在染色体中处于不同位置的染色体序列。

术语“编辑”、“基因组编辑”或“染色体编辑”是指特定染色体序列通过其被改变的过程。编辑的染色体序列可包含插入至少一个核苷酸、缺失至少一个核苷酸和/或取代至少一个核苷酸。

如本文所用的“基因”是指编码基因产物的DNA区域(包括外显子和内含子)以及调控基因产物的产生的所有DNA区域，无论所述调控序列是否邻近于编码序列和/或转录的序列。因此，基因包括但未必限于启动子序列、终止子、翻译调控序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区域。

术语“异源”是指实体不为目标细胞或物种所天然具有。

术语“核酸”和“聚核苷酸”是指呈线性或环状构形，且呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出于本公开的目的，这些术语不应被解释为限制聚合物的长度。术语可涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(如硫代磷酸酯骨架)中被修饰的核苷酸。一般来说，特定核苷酸的类似物具有相同碱基配对特异性；即A的类似物将与T配对。

术语“核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。核苷酸可为标准核苷酸(即腺苷、鸟苷、胞苷、胸苷和尿苷)或核苷酸类似物。核苷酸类似物是指具有修饰的嘌呤或嘧啶碱基或修饰的核糖部分的核苷酸。核苷酸类似物可为天然存在的核苷酸(例如肌苷)或非天然存在的核苷酸。核苷酸的糖或碱基部分上的修饰的非限制性实例包括添加(或移除)乙酰基、氨基、羧基、羧甲基、羟基、甲基、磷酰基和硫醇基团，以及用其它原子取代碱基的碳和氮原子(例如7-脱氮嘌呤)。核苷酸类似物也包括双脱氧核苷酸、2’-O-甲基核苷酸、锁定核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和吗啉代寡核苷酸。

术语“多肽”与“蛋白质”可互换用于指代氨基酸残基的聚合物。

术语“重组”是指在两个聚核苷酸之间交换遗传信息的过程。出于本公开的目的，“同源重组”是指例如在修复细胞中的双链断裂期间发生的所述交换的特殊化形式。这个过程需要两个聚核苷酸之间具有序列类似性，使用“供体”或“交换”分子为“靶”分子(即经受双链断裂的分子)的修复提供模板，且不同地称为“非交叉基因转换”或“短道基因转换”，因为它会导致遗传信息自供体转移至靶标。在不受任何特定理论束缚下，所述转移可涉及在断裂的靶标与供体之间形成的异源双链DNA的错配校正，和/或“合成依赖性链退火”，其中供体用于再合成将成为靶标的一部分的遗传信息；和/或相关过程。所述特殊化同源重组常导致靶分子的序列改变，以使供体聚核苷酸的部分或全部序列并入靶聚核苷酸中。

如本文所用，术语“靶位点”或“靶序列”是指限定染色体序列的待编辑的部分，且靶向性核酸内切酶被工程改造来对其进行识别、结合以及裂解的核酸序列。

术语“上游”和“下游”是指核酸序列中相对于固定位置的位置。上游是指在所述位置的5'(即靠近链的5'末端)的区域，且下游是指在所述位置的3'(即靠近链的3'末端)的区域。

用于测定核酸和氨基酸序列同一性的技术在本领域中是已知的。通常，所述技术包括测定基因的mRNA的核苷酸序列和/或测定由其编码的氨基酸序列，以及将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。也可以这个方式测定和比较基因组序列。一般来说，同一性是指两个聚核苷酸或多肽序列的分别核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的精确对应。两个或更多个序列(聚核苷酸或氨基酸)可通过确定它们的同一性百分比来进行比较。两个序列(无论核酸或氨基酸序列)的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配的数目除以较短序列的长度且乘以100。核酸序列的近似比对由Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics2:482-489(1981)的局部同源性算法提供。通过使用由Dayhoff,Atlas of Protein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff编,5增刊.3:353-358,National Biomedical ResearchFoundation,Washington,D.C.,USA开发，且由Gribskov,Nucl.AcidsRes.14(6):6745-6763(1986)加以标准化的计分矩阵，这个算法可应用于氨基酸序列。用以确定序列同一性百分比的这个算法的示例性执行程序由Genetics Computer Group(Madison,Wis.)在“BestFit”实用程序中提供。用于计算序列之间的同一性或类似性百分比的其它适合程序通常在本领域中是已知的，例如另一比对程序是以缺省参数加以使用的BLAST。举例来说，BLASTN和BLASTP可使用以下缺省参数来加以使用：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两者；截断＝60；预期＝10；矩阵＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序依据＝高分；数据库＝非冗余GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的细节可见于GenBank网站上。关于本文所述的序列，序列同一性的所需程度范围是约80％至100％以及介于其之间的任何整数值。通常，序列之间的同一性百分比是至少70-75％、优选80-82％、更优选85-90％、甚至更优选92％、仍更优选95％且最优选98％序列同一性。

因为可在不脱离本发明的范围下对上述细胞和方法做出各种改变，所以在以上描述中和在以下给出的实施例中含有的所有事项都应解释为说明性的而非具有限制性意义。

实施例

以下实施例说明本发明的某些方面。

实施例1：使用ZFN破坏CHO细胞中的Mgat1

A.制备ZFN表达载体和靶向Mgat1的ZFN mRNA

ZFN介导的敲除技术用于敲除CHO细胞中的Mgat1基因或使所述基因失活，由此产生会产生具有含有末端Man5部分的均质简单N-聚糖谱的蛋白质的细胞。使用小鼠同源性注解含有Mgat1基因座的Mgat1基因组重叠群(Xu等,2011,Nat Biotechnol,29:735-741)。使用专有算法设计靶向CHO Mgat1编码区域内的特定位点的ZFN。图2A图解Mgat1中的靶位点的位置。Mgat1中的靶序列是5’-AACAAGTTCAAGTTCccagcaGCTGTGGTAGTGGAGGAC-3’(SEQ ID NO:1；其中ZFN结合位点用大写表示且裂解位点用小写表示。)使用标准程序制备Mgat1ZFN表达构建体且使用体外转录、mRNA聚腺苷酸化和加帽方法，如敲除锌指核酸酶(ZFN)(Sigma-Aldrich)产品信息中所述，自ZFN质粒DNA产生Mgat1ZFN mRNA。简而言之，使质粒ZFN DNA线性化且使用苯酚/氯仿DNA提取法加以纯化。MessageMax^TMT7ARCA加帽信息转录试剂盒(Cell Script Inc.)用于对线性化DNA加帽。聚(A)聚合酶加尾试剂盒(EpiCentre)用于添加聚(A)尾巴。使用MEGAclear^TM试剂盒(Ambion)纯化ZFN mRNA。

B.在IgG产生性CHO细胞系中转染靶向Mgat1的ZFN

表达重组抗狂犬病人IgG的(GS-/-)细胞(Sigma Aldrich)以混悬培养物形式维持在补充有25μM氨基亚砜蛋氨酸的CHO CD融合培养基(Sigma-Aldrich)中。在转染之前1天将细胞在0.5×10⁶个细胞/毫升下接种在生物反应器管中。于150μL生长培养基中的1×10⁶个细胞和5μg Mgat1ZFN DNA或mRNA用于各转染。通过在140V和950μF下于0.2cm比色皿中进行电穿孔来进行转染。将电穿孔的细胞置放在2mL生长培养基中，进行6孔板静态培养。在转染后第3天和第10天，自培养物移除细胞且使用GeneElute^TM哺乳动物基因组DNA小型制备试剂盒(Sigma-Aldrich)分离基因组DNA。进行如敲除ZFN产品信息中所述的Cel-I核酸酶测定以测定ZFN介导的基因裂解的效率。

图2B描绘显示在ZFN转染的(ZFN质粒DNA或mRNA转染)细胞池中进行的Cel-I测定的结果的凝胶。两个裂解片段220bp和197bp存在于转染后第3天和第10天的基因组DNA消化物中，从而指示在两个时间点均具有阳性ZFN活性。在第3天和第10天的ZFN活性分别是8.8％和9.6％。在两个时间点，用RNA转染的细胞均具有稍微更强烈的条带。随时间的稳定ZFN活性暗示没有与Mgat1破坏相关的明显细胞毒性或生长抑制。换句话说，在ZFN转染的群体中，未观察到野生型细胞超过ZFN修饰的细胞的生长优势。

实施例2：凝集素选择和分离单细胞克隆

Mgat1ZFN转染的细胞用蓖麻凝集素-I(RCA-I)(一种结合半乳糖而非甘露糖的细胞毒性凝集素)处理过夜以富集Mgat1被破坏的细胞。在转染后第14天，接种等分的细胞以使用活细胞FACS进行单细胞克隆。使用FACSAria^TMIII细胞分选仪(Becton-Dickinson)在每孔一个细胞下将细胞于补充有10％胎牛血清(FBS)和4mM L-谷氨酰胺的汉姆氏(Ham’s)-F12营养混合物中接种在96孔组织培养处理板(Corning)中。扩增剩余细胞直至第18天且接着在1×10⁶个细胞/毫升下接种在T混悬培养烧瓶(Coring)中。使细胞与含10μg/mL最终浓度的RCA-I的生长培养基一起孵育过夜，接着用PBS洗涤并返回至生长培养基中。将细胞扩增至T烧瓶中并培养10天，且接着接种以如上所述进行单细胞克隆。在RCA-I处理后10天，测定细胞的ZFN活性。

图3描绘显示在RCA-1富集之前和之后，在ZFN转染的细胞池中进行的Cel-I测定的结果的凝胶。用RCA-I选择的细胞显示相较于未选择细胞的3.8-5.5％，ZFN活性是约33-36％，从而指示Mgat1破坏的细胞被成功富集。

实施例3：分泌的重组抗狂犬病人IgG的糖谱

相对高通量SEC-MS(Waters Acquity/Q-Tof Premier^TM)工艺流程用于糖分析。工艺流程利用蛋白质A自细胞培养上清液纯化IgG，随后对完整IgG重链组分进行准确质量分析。使用每孔具有50μl蛋白质A树脂和750μl克隆上清液的96孔过滤板来进行蛋白质A纯化。用100μl25mM柠檬酸盐(pH3.0)洗脱IgG。通过使用BiopharmaLynx^TM软件(Waters)以自动方式进行解卷积和数据处理来进行质量数据分析。通过胰蛋白酶消化所选样本且通过MALDI-TOF在糖肽层面上验证聚糖鉴定和相对分布(报道为总聚糖的a％)来确认糖肽形式。

评估各细胞池(ZFN转染和模拟转染，进行或不进行RCA-I选择)的分泌的重组抗狂犬病人IgG的糖谱。RCA-I富集的池显示相对于未暴露于RCA-I的细胞，Man5糖型的水平增加(图4)。相较于Mgat1ZFN转染的细胞的13.7％以及通过RCA-I选择富集的ZFN转染的细胞的92.8％，模拟转染的细胞显示0.3％Man5。在模拟转染的细胞和未经受RCA-I富集的ZFN转染的细胞中，G0F和G1F糖型最丰富。

实施例4：Mgat1修饰的单细胞克隆的基因型表征

自单细胞克隆(IgG产生性细胞系或宿主GS(-/-)细胞系)的培养物分离基因组DNA。通过PCR扩增Mgat1基因的一部分且使用TOPO系统(Life Technologies,Carlsbad,CA)克隆PCR产物。制备样本用于DNA测序。对最少10个TOPO克隆进行测序以进行基因型表征。

为比较在存在或不存在RCA-I富集下Mgat1修饰的克隆的频率，如上所述通过FACS对与或不与RCA-I一起培养的ZFN转染的细胞进行单细胞克隆。对于非富集的池，76个克隆中的2个克隆(2.63％)具有Mgat1基因的短缺失(参见图5和表1；73号和92号克隆)。对来自使用QuickExtract^TM DNA提取解决方案(Epicentre)获得的细胞溶解产物的巢式PCR产物的初始测序指示来自RCA-I富集的群体的所有克隆(52/52)都含有破坏的Mgat1基因序列。对这些克隆的测序揭示Mgat1的缺失是2bp缺失至55bp缺失(参见图5和表1，21号、25号、27号和37号克隆)。各克隆都含有一个破坏的等位基因，其中未检测到野生型序列。因此，这些细胞的基因型是MGAT-1(-/0)和GS(-/-)。

选择以下IgG产生性Mgat1敲除克隆用于进一步表征：在不进行RCA-I选择下分离的两个克隆(73号和92号克隆)；经历ZFN转染过程的保留野生型序列的两个克隆(15号和46号)；以及四个RCA-I选择的具有一定范围的缺失长度的克隆(21号、25号、27号和37号)。这些敲除克隆都不展现对RCA-I的敏感性(图6)，在观察到的IgG产率或生长的分布方面也无显著变化。

实施例5：Mgat1敲除IgG产生性细胞克隆的表征

评估(基本上如上在实施例3中所详述)以上提及的单细胞克隆的每一个的分泌的重组抗狂犬病人IgG的糖谱。图7A-B分别呈现第5天分批培养中野生型克隆和敲除克隆的糖谱，且图7C-D分别显示第8天分批培养中野生型克隆和敲除克隆的糖谱。在Mgat1敲除克隆中，最丰富的聚糖物质是Man5，而野生型克隆显示最高G0F峰值。在Mgat1敲除克隆中，Man5％显著较高(p<0.0001，采用韦尔奇氏校正的未配对t检验)。

为分析Mgat1敲除克隆的生长和产率，一式两份将细胞在0.3×10⁶个细胞/毫升下接种在TPP生物反应器管中的30mL生长培养基中。使用ViCell细胞活力分析器(Beckmann Coulter)测定细胞密度和活力。如图8A-B中所示，相较于具有野生型Mgat1的细胞，Mgat1敲除细胞克隆展现相同或改进的生长，如通过随时间的细胞活力和细胞密度所度量。

通过使用分析器(Pall Life Sciences)进行干扰测量术来测定体积IgG产率。如图9中所示，Mgat1敲除细胞克隆展现与野生型细胞相同或改进的峰值体积产率。

实施例6：分离CHO宿主细胞系中的Mgat1敲除克隆

为进一步评估这个方法用于生物医药应用，使用CHO K1GS(-/-)宿主细胞系重复ZFN转染和克隆分离。基本上如上在实施例1中所述用Mgat1ZFN mRNA转染GS(-/-)宿主细胞系(Sigma-Aldrich)。在使用Cel-1测定确认ZFN活性后，基本上如上在实施例2中所述，使用有限稀释法在0.5个细胞/孔下对转染的细胞进行单细胞克隆。分别在接种后第7天和第14天用显微镜验证克隆性和生长。这些细胞不用RCA-I处理来进行额外选择。

自GS(-/-)宿主细胞系产生的90个克隆中的5个克隆(5.6％)含有Mgat1破坏。在不进行RCA-I富集下产生的这些克隆中鉴定的缺失是7至28bp(参见表2)。如用IgG产生性克隆所观察到，这些亲本克隆仅具有一个破坏的等位基因且未鉴定出野生型序列。使用RCA-I进行凝集素细胞毒性测定，且与IgG产生性克隆类似，对于任何Mgat1敲除克隆而言都未观察到细胞毒性。

实施例7：Mgat1敲除宿主细胞系的稳定IgG表达和IgG糖谱分析

用含有人抗狂犬病IgG编码序列和重组仓鼠GS表达盒的表达载体转染5个Mgat1敲除宿主细胞系克隆(列于表2中)。在转染之前48小时，在5×10⁵个细胞/毫升下接种细胞。通过如实施例1中所述，使用30μg质粒DNA进行电穿孔来进行转染。将电穿孔的细胞于5mL生长培养基中置放入混悬25cm²细胞培养烧瓶中。在转染后48小时将细胞转移于缺乏L-谷氨酰胺的培养基中且在37℃下于5％CO₂中培养直至选择完成(12-14天)且产生稳定转染的培养物。在单独转染中，将细胞以200μL在5000个细胞/孔下接种于96孔板中以进行减除谷氨酰胺选择且在完成对“小型池”培养物的选择后按比例扩大至24孔(1mL)、25cm²烧瓶(5mL)和TPP管(30mL)。自这些稳定株系开始，如先前所述类似地产生TPP培养物，且在第4天和第7天向培养物馈入2g/L葡萄糖以及化学成分确定的馈料。在第8天收集培养物，且通过在3400rpm下离心使上清液澄清并随后使用Spectra/Pore4膜透析管(MWCO12kDa，Spectrum Labs,Rancho Dominguez,CA)在4℃下相对于1xPBS透析24小时，且使用1ml HiTrap蛋白质A速流柱(GE Healthcare)在系统(GE healthcare,Pittsburgh,PA)上纯化。将IgG洗脱于0.1M柠檬酸盐(pH3.0)中且通过添加1/10体积1.0M Tris HCl(pH9.0)来即刻中和洗脱份。基本上如实施例3中所述进行糖谱分析。

在全部5个Mgat1敲除宿主细胞系中产生的抗狂犬病IgG显示高度类似糖谱，其中Man5是主要物质，同时未检测到复杂聚糖。MS分析显示相较于野生型细胞(即50400)，在Mgat1敲除细胞系中，主要聚糖峰值存在质量移动(即50168-50172)。在BC9和BH11“小型池”中产生的IgG显示糖谱类似于它们的“大型”选择的稳定池。

Claims

1.一种细胞系，所述细胞系缺乏甘露糖基(α-1,3-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(Mgat1)。

2.如权利要求1所述的细胞系，其中所述细胞系包含编码Mgat1的失活染色体序列。

3.如权利要求2所述的细胞系，其中所述染色体序列是用靶向性核酸内切酶失活的。

4.如权利要求3所述的细胞系，其中所述靶向性核酸内切酶是锌指核酸酶。

5.如权利要求2至4中任一项所述的细胞系，其中所述失活染色体序列包含2bp至55bp的缺失。

6.如前述权利要求中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系不产生Mgat1。

7.如前述权利要求中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系进一步包含谷氨酰胺合成酶(GS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或其组合的缺乏。

8.如前述权利要求中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

9.如权利要求8所述的细胞系，其中所述CHO细胞系是GS-/-细胞系。

10.如前述权利要求中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系表达包含一个或多个末端甘露糖残基的至少一种糖蛋白。

11.如前述权利要求中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系具有与不缺乏Mgat1的细胞系的生长速率类似的生长速率。

12.如前述权利要求中任一项所述的细胞系，其中所述细胞系产生与不缺乏Mgat1的细胞系的蛋白质水平类似的蛋白质水平。

13.一种用于产生缺乏Mgat1的细胞的方法，所述方法包括用靶向编码Mgat1的染色体序列中的特定序列的靶向性核酸内切酶转染宿主细胞。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述靶向性核酸内切酶是锌指核酸酶。

15.如权利要求13或14所述的方法，所述方法进一步包括与蓖麻凝集素-I(RCA-I)一起孵育所述转染的细胞。

16.如权利要求13至15中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：

a)将编码重组蛋白的核酸引入所述细胞中；以及

b)表达所述重组蛋白。

17.一种用于产生具有一个或多个末端甘露糖残基的重组蛋白的方法，所述方法包括：

a)将编码所述重组蛋白的核酸引入细胞系中，在所述细胞系中，靶向性核酸内切酶使编码Mgat1的全部染色体序列失活以使所述细胞系不产生Mgat1；以及

b)表达所述重组蛋白。