KR20140111657A - 단순한 글리코형을 갖는 재조합 단백질의 생산 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 만노실 (알파-1,3-)-당단백질 베타-1,2-N-아세틸글루코사미닐전이효소 I (Mgat1)를 결여하는 세포주를 제시한다. 또한, Mga1 결여성 세포주를 생산하기 위한 방법, 그리고 단순한 글리코형을 갖는 재조합 단백질의 생산을 위해 Mgat1 결여성 세포주를 이용하기 위한 방법이 제시된다.
Description
발명의 분야
본 발명은 단순한 글리코형을 갖는 재조합 단백질에 관계한다. 특히, 본 발명은 하나 또는 그 이상의 말단 만노오스 잔기를 갖는 재조합 당단백질을 생산하기 위한 조성물과 방법에 관계한다.
발명의 배경
N-연결된 당화는 많은 분비되고 막-결합된 당단백질 상에서 발견되는 통상의 단백질 변형이다. 복합적인 글리코형의 합성은 진핵 세포의 소포체와 골지체에서 단계별 방식으로 수행되는 일련의 효소 반응을 필요로 한다. 대부분의 재조합 치료 단백질이 면역원성을 피하고 단백질 반감기를 향상시키기 위해 복합적인 글리칸의 존재를 필요로 하지만, 단순한 N-글리칸 구조를 갖는 당단백질에 대한 실용성 역시 존재한다. 가령, 단순한 글리코형을 갖는 재조합 단백질은 X-선 결정학 연구에 유리하다. 부가적으로, 단지 말단 만노오스 잔기만을 갖는 단순한 글리코형은 이들 단백질에 대한 만노오스 수용체-매개된 흡수를 조장함으로써, 일부 치료제의 증가된 효능을 유발할 수 있다.
하지만, 치료 당단백질의 생산에 이용되는 대부분의 세포주는 이종성 또는 복합적인 N-연결된 글리코형을 갖는 단백질을 생산한다. 따라서 단순한 글리코형을 갖는 재조합 당단백질을 생산하도록 조작된 세포주가 요구된다. 게다가, 이들 조작된 세포주는 말단 만노오스 잔기를 갖는 단백질을 안정되게 생산하면서, 화학적으로-규정된 배양 배지에서 높은 단백질 생산성 및 강건한 성장을 유지하는 것이 바람직하다.
요약
본 발명의 다양한 양상에는 만노실 (알파-1,3-)-당단백질 베타-1,2-N-아세틸글루코사미닐전이효소 I (Mgat1)을 결여하는 세포주의 제공이 포함된다. 한 구체예에서, Mgat1을 결여하는 세포주는 Mgat1 단백질을 생산하지 않는다. 다른 구체예에서, Mgat1을 결여하는 세포주는 Mgat1을 결여하지 않는 부모 세포주에 비하여 감소된 양의 Mgat1 단백질을 생산한다. 한 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 Mgat1을 인코딩하는 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열은 표적화 엔도뉴클레아제로 비활성화될 수 있다. 일정한 구체예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성화인자-유사 작동체 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 그리고 부위-특이적 엔도뉴클레아제에서 선택된다. 한 구체예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제이다. 일부 구체예에서, Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열은 적어도 하나의 염기쌍의 결실, 적어도 하나의 염기쌍의 삽입, 적어도 하나의 염기쌍의 치환, 또는 이들의 조합으로 인하여 비활성화된다. 일정한 구체예에서, Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열은 2-55 염기쌍의 결실로 인하여 비활성화된다. 한 구체예에서, Mgat1을 결여하는 세포주는 또한, 글루타민 신타아제 (GS), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 히폭산틴-구아닌 포스포리보실전이효소 (HPRT), 또는 이들의 조합을 결여한다. 다른 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 CHO 세포주이다. 한 구체예에서, Mgat1을 결여하는 세포주는 Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열의 단일 사본이 결실에 의해 비활성화된 CHO 세포주이고, 그리고 상기 세포주는 Mgat1을 생산하지 않는다. 다른 구체예에서, Mgat1을 결여하는 세포주는 Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열의 단일 사본이 결실에 의해 비활성화된 CHO GS -/- 세포주이고, 그리고 상기 세포주는 Mgat1을 생산하지 않는다. 한 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 단순한 글리코형을 갖는 적어도 하나의 당단백질을 발현하는데, 여기서 단순한 글리코형은 하나 또는 그 이상의 말단 만노오스 잔기를 포함한다. 한 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 Mgat1을 결여하지 않는 세포주에 필적하는 성장 속도를 갖는다. 한 구체예에서, Mgat1을 결여하는 세포주는 Mgat1을 결여하지 않는 세포주에 필적하는 수준의 단백질을 생산한다.
본 발명의 다른 양상은 Mgat1을 결여하는 세포를 생산하기 위한 방법을 포함한다. 상기 방법은 Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열 내에 특정한 서열을 표적으로 하는 표적화 엔도뉴클레아제로 숙주 세포를 형질감염시키는 것을 포함한다. 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성화인자-유사 작동체 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 또는 부위-특이적 엔도뉴클레아제일 수 있다. 한 구체예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제이다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 포유류 세포이다. 다른 구체예에서, 숙주 세포는 또한, 글루타민 신타아제 (GS), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 히폭산틴-구아닌 포스포리보실전이효소 (HPRT), 또는 이들의 조합을 결여한다. 한 구체예에서, 숙주 세포는 CHO 세포이다. 다른 구체예에서, 숙주 세포는 GS -/- CHO 세포이다. 한 구체예에서, 형질감염된 숙주 세포는 피마자 (Ricinus communis) 응집소-I (RCA-I)과 함께 배양된다.
본 발명의 또 다른 양상은 하나 또는 그 이상의 말단 만노오스 잔기를 갖는 재조합 단백질을 생산하기 위한 방법이다. 상기 방법은 세포주가 Mgat1을 생산하지 않도록 Mgat1을 인코딩하는 모든 염색체 서열이 비활성화된 세포주 내로 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 도입하고; 그리고 재조합 단백질을 발현하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열은 아연 핑거 뉴클레아제, 전사 활성화인자-유사 작동체 뉴클레아제 (TALEN), 메가뉴클레아제, 그리고 부위-특이적 엔도뉴클레아제에서 선택되는 표적화 엔도뉴클레아제에 의해 비활성화된다. 한 구체예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제이다. 한 구체예에서, Mgat1을 인코딩하는 비활성화된 염색체 서열은 2-55 염기쌍의 결실을 포함한다. 한 구체예에서, Mgat1을 생산하지 않는 세포주는 CHO 세포주이다. 다른 구체예에서, Mgat1을 생산하지 않는 세포주는 GS -/- CHO 세포주이다. 한 구체예에서, 발현된 재조합 단백질은 하나 또는 그 이상의 말단 만노오스 잔기를 포함하는 단순한 글리코형을 갖는다.
본 발명의 다른 양상과 반복은 하기에 더욱 상세하게 설명된다.
도면의 간단한 설명
도 1은 N-글리칸 합성에서 Mgat1의 역할을 보여주는 개요 다이어그램이다. Mgat1은 GlcNAc 잔기의 Man5GlcNAc2 (Man5) 글리코형으로의 전이를 촉매한다.
도 2는 Mgat1을 표적으로 하는 설계와 확인 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFNs)를 도시한다. (a)는 이들 ZFN이 Mgat1 코딩 영역 내에서 결합하고 절단하도록 설계되는 위치의 개요도를 제공한다. (b)는 Cel1 뉴클레아제 검정에 의한 ZFN 활성의 확인을 도시한다. 모의 형질감염된 세포, DNA로 형질감염된 세포, 그리고 RNA로 형질감염된 세포로부터 형질감염 후 3일자와 10일자에 게놈 DNA 소화물이 도시된다. 2개의 DNA 단편, 220과 197 bp가 형질감염 후 3일자와 10일자 소화물 둘 모두에서 존재한다.
도 3은 RCA-I 농축 전후에 Cel1 분석을 제공한다. RCA-I 농축 전후에 DNA 또는 RNA로 형질감염된 세포뿐만 아니라 모의 형질감염된 세포의 게놈 DNA 소화물이 도시된다. 밀도계측에 의해 측정될 때, 변형된 백분율은 각 레인 아래 열거된다.
도 4는 RCA-I 농축이 있거나 또는 없는 Mgat1 ZFN 형질감염된 세포의 IgG 글리코프로필 (glycoprofile)을 도시한다. (a)는 모의 형질감염된 세포, RCA-I 선별 없이 ZFN DNA 또는 RNA로 형질감염된 세포, 그리고 RCA-I 선별과 함께 ZFN DNA 또는 RNA로 형질감염된 세포에 의해 생산된 IgG에서 각 글리코형 (Man5, G0, G0F, G1F, 그리고 G2F)의 퍼센트를 제공한다. (b)는 검정된 각 글리코형의 구조를 도표로 표시한다.
도 5는 Mgat1 교란된 IgG 생산 클론의 유전형을 제공한다. 하기 세포주의 서열 정렬이 도시된다: 비-형질감염된 야생형 (wt); ZFN 형질감염 및 클론 단리를 겪은 2개의 야생형 클론 (#15, #46); RCA-I 없이 선별된 2개의 Mgat1 교란된 세포주 (#73, #92), 그리고 RCA-I의 존재에서 선별된 4개의 Mgat1 교란된 세포주 (#21, #25, #27, #37). 음영 구역은 ZFN 절단 부위를 표시한다.
도 6은 RCA-I에 대한 Mgat1 녹-아웃 클론의 무감각을 도시한다. RCA-I의 부재 또는 존재에서 성장될 때, 야생형 (wt, #15, #46) 클론 및 Mgat1 녹-아웃 (#73, #92, #21, #25, #27, #37) 클론의 배치 배양액 (batch culture) 내에서 피크 생존 세포 밀도가 플롯팅된다.
도 7은 야생형 클론 및 Mgat1 녹-아웃 IgG 생산 클론의 IgG 글리코프로필을 도시한다. (a)는 비-형질감염된 (wt) 클론 및 2개의 야생형 (#15, #46) 클론으로부터 5일자에 수확된 IgG 시료에서 상이한 글리코형의 백분율을 도시한다. (b)는 6개의 Mgat1 녹-아웃 (#73, #92, #21, #25, #27, #37) 클론으로부터 5일자에 수확된 IgG 시료에서 상이한 글리코형의 백분율을 제공한다. (c)는 야생형 클론으로부터 8일자에 수확된 IgG 시료에서 상이한 글리코형의 백분율을 도시한다. (d)는 6개의 Mgat1 녹-아웃 클론으로부터 8일자에 수확된 IgG 시료에서 상이한 글리코형의 백분율을 제공한다. ND = 검출되지 않음.
도 8은 시간의 흐름에서 야생형 클론 및 Mgat1 녹-아웃 클론의 성장을 도시한다. (a)는 배치 배양액 내에서 13일에 걸쳐 야생형 (wt, #15, #46) 클론 및 Mgat1 녹-아웃 (#73, #92, #21, #25, #27, #37) 클론에서 생존 세포의 퍼센트를 제공한다. (b)는 13일에 걸쳐 야생형 클론 및 6개의 Mgat1 녹-아웃 클론의 배치 배양액 내에서 생존 세포 밀도를 도시한다.
도 9는 야생형 클론 및 Mgat1 녹-아웃 클론의 IgG 생산성을 도시한다. 야생형 (wt, #15, #46) 클론 및 Mgat1 녹-아웃 (#73, #92, #21, #25, #27, #37) 클론에서 피크 체적 생산성이 플롯팅된다.
도 1은 N-글리칸 합성에서 Mgat1의 역할을 보여주는 개요 다이어그램이다. Mgat1은 GlcNAc 잔기의 Man5GlcNAc2 (Man5) 글리코형으로의 전이를 촉매한다.
도 2는 Mgat1을 표적으로 하는 설계와 확인 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFNs)를 도시한다. (a)는 이들 ZFN이 Mgat1 코딩 영역 내에서 결합하고 절단하도록 설계되는 위치의 개요도를 제공한다. (b)는 Cel1 뉴클레아제 검정에 의한 ZFN 활성의 확인을 도시한다. 모의 형질감염된 세포, DNA로 형질감염된 세포, 그리고 RNA로 형질감염된 세포로부터 형질감염 후 3일자와 10일자에 게놈 DNA 소화물이 도시된다. 2개의 DNA 단편, 220과 197 bp가 형질감염 후 3일자와 10일자 소화물 둘 모두에서 존재한다.
도 3은 RCA-I 농축 전후에 Cel1 분석을 제공한다. RCA-I 농축 전후에 DNA 또는 RNA로 형질감염된 세포뿐만 아니라 모의 형질감염된 세포의 게놈 DNA 소화물이 도시된다. 밀도계측에 의해 측정될 때, 변형된 백분율은 각 레인 아래 열거된다.
도 4는 RCA-I 농축이 있거나 또는 없는 Mgat1 ZFN 형질감염된 세포의 IgG 글리코프로필 (glycoprofile)을 도시한다. (a)는 모의 형질감염된 세포, RCA-I 선별 없이 ZFN DNA 또는 RNA로 형질감염된 세포, 그리고 RCA-I 선별과 함께 ZFN DNA 또는 RNA로 형질감염된 세포에 의해 생산된 IgG에서 각 글리코형 (Man5, G0, G0F, G1F, 그리고 G2F)의 퍼센트를 제공한다. (b)는 검정된 각 글리코형의 구조를 도표로 표시한다.
도 5는 Mgat1 교란된 IgG 생산 클론의 유전형을 제공한다. 하기 세포주의 서열 정렬이 도시된다: 비-형질감염된 야생형 (wt); ZFN 형질감염 및 클론 단리를 겪은 2개의 야생형 클론 (#15, #46); RCA-I 없이 선별된 2개의 Mgat1 교란된 세포주 (#73, #92), 그리고 RCA-I의 존재에서 선별된 4개의 Mgat1 교란된 세포주 (#21, #25, #27, #37). 음영 구역은 ZFN 절단 부위를 표시한다.
도 6은 RCA-I에 대한 Mgat1 녹-아웃 클론의 무감각을 도시한다. RCA-I의 부재 또는 존재에서 성장될 때, 야생형 (wt, #15, #46) 클론 및 Mgat1 녹-아웃 (#73, #92, #21, #25, #27, #37) 클론의 배치 배양액 (batch culture) 내에서 피크 생존 세포 밀도가 플롯팅된다.
도 7은 야생형 클론 및 Mgat1 녹-아웃 IgG 생산 클론의 IgG 글리코프로필을 도시한다. (a)는 비-형질감염된 (wt) 클론 및 2개의 야생형 (#15, #46) 클론으로부터 5일자에 수확된 IgG 시료에서 상이한 글리코형의 백분율을 도시한다. (b)는 6개의 Mgat1 녹-아웃 (#73, #92, #21, #25, #27, #37) 클론으로부터 5일자에 수확된 IgG 시료에서 상이한 글리코형의 백분율을 제공한다. (c)는 야생형 클론으로부터 8일자에 수확된 IgG 시료에서 상이한 글리코형의 백분율을 도시한다. (d)는 6개의 Mgat1 녹-아웃 클론으로부터 8일자에 수확된 IgG 시료에서 상이한 글리코형의 백분율을 제공한다. ND = 검출되지 않음.
도 8은 시간의 흐름에서 야생형 클론 및 Mgat1 녹-아웃 클론의 성장을 도시한다. (a)는 배치 배양액 내에서 13일에 걸쳐 야생형 (wt, #15, #46) 클론 및 Mgat1 녹-아웃 (#73, #92, #21, #25, #27, #37) 클론에서 생존 세포의 퍼센트를 제공한다. (b)는 13일에 걸쳐 야생형 클론 및 6개의 Mgat1 녹-아웃 클론의 배치 배양액 내에서 생존 세포 밀도를 도시한다.
도 9는 야생형 클론 및 Mgat1 녹-아웃 클론의 IgG 생산성을 도시한다. 야생형 (wt, #15, #46) 클론 및 Mgat1 녹-아웃 (#73, #92, #21, #25, #27, #37) 클론에서 피크 체적 생산성이 플롯팅된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 단순한 글리코형을 갖는 재조합 단백질의 생산을 위한 조성물과 방법을 제시하고, 여기서 단순한 글리코형은 하나 또는 그 이상의 말단 만노오스 잔기를 포함한다. 특히, 본 발명은 만노실 (알파-1,3-)-당단백질 베타-1,2-N-아세틸글루코사미닐전이효소 I (Mgat1)을 결여하는 세포주를 제시한다. 일부 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 이러한 세포주가 Mgat1을 생산하지 않도록, Mgat1을 인코딩하는 비활성화 또는 녹-아웃 염색체 서열을 포함한다. 결과적으로, 상기 세포주는 하나 또는 그 이상의 말단 만노오스 잔기를 갖는 당단백질을 생산한다. 본원에서 개시된 Mgat1 결여성 세포주는 백신 생산에 유용한데, 그 이유는 말단 만노오스 잔기를 갖는 당단백질이 만노오스 수용체-매개된 흡수를 조장하기 때문이다. 부가적으로, 단순한 글리코형을 갖는 당단백질은 X-선 결정학 연구에 유용하다. 게다가, 본원에서 개시된 Mgat1 결여성 세포는 무작위 화학적 돌연변이와 연관된 잠재적 조절 우려를 회피하고, 그리고 부모 세포주의 것들에 필적하는 성장과 생산성 특징을 유지한다.
본 발명은 또한, Mgat1 결여성 세포를 제조하기 위한 방법을 제시한다. 가령, Mgat1을 결여하는 세포는 표적화 엔도뉴클레아제를 이용하여 Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열(들)을 비활성화시킴으로써 제조될 수 있다. 또한, 본원에서 개시된 Mgat1 결여성 세포를 이용하여, 단순한 글리코형을 갖는 재조합 당단백질을 생산하기 위한 방법이 제시된다.
(I) Mgat1 결여성 세포주
(a) 세포주의 성질
본 발명의 한 양상은 Mgat1을 결여하는 세포주를 포함한다. Mgat1은 또한, N-아세틸글루코사미닐전이효소 I (GlcAc-TI 또는 GnTI) 또는 N-글리코실-올리고당-당단백질 N-아세틸글루코사미닐전이효소 I로서 알려져 있다. Mgat1은 N-아세틸글루코사민 (GlcNAc)의 성장하는 N-글리칸의 올리고만노오스 코어 (즉, Man5GlcNAc2 (Man5) 모이어티)로의 전이를 촉매한다 (도 1 참조).
일부 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 부모 세포주에 비하여 감소된 수준의 Mgat1을 갖는다. 가령, Mgat1 결여성 세포주에서 Mgat1의 수준은 Mgat1을 결여하지 않는 부모 세포주에 비하여 약 5% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 약 40% 내지 약 50%, 약 50% 내지 약 60%, 약 60% 내지 약 70%, 약 70% 내지 약 80%, 약 80% 내지 약 90%, 또는 약 90% 내지 약 99.9% 감소될 수 있다. 다른 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 Mgat1을 본질적으로 생산하지 않는다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "본질적으로 없는 Mgat1"은 어떤 Mgat1 mRNA 및/또는 단백질도 당분야에 널리 공지된 절차를 이용하여, Mgat1 결여성 세포주 또는 이들로부터 유래된 용해물에서 검출될 수 없다는 것을 의미한다. mRNA 또는 단백질의 수준을 결정하기 위한 적절한 절차의 무제한적 실례에는 PCR, qPCR, 웨스턴 블롯팅, 그리고 ELISA 검정이 포함된다.
Mgat1을 결여하는 세포주는 단순한 글리코형을 갖는 당단백질을 생산한다. 단순한 글리코형은 하나 또는 그 이상의 말단 만노오스 잔기를 포함하는 글리코형을 지칭한다. 일반적으로, 단순한 글리코형은 갈락토오스 및/또는 시알산 잔기가 결여된다. 예시적인 단순한 글리코형은 Man5GlcNac2 또는 Man5이다. 일부 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 말단 만노오스 잔기의 수준이 약 1.1-배 내지 약 3-배, 약 3-배 내지 약 10-배, 약 10-배 내지 약 30-배, 약 30-배 내지 약 100-배, 또는 약 100-배 이상 증가된 당단백질을 생산할 수 있다. 다른 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 말단 갈락토오스 및/또는 시알산 잔기의 수준이 약 1.1-배 내지 약 3-배, 약 3-배 내지 약 10-배, 약 10-배 내지 약 30-배, 약 30-배 내지 약 100-배, 또는 약 100-배 이상 감소된 당단백질을 생산할 수 있다.
Mgat1 결여성 세포주는 Mgat1을 결여하지 않는 세포주에 필적하는 수준의 단백질 생산 또는 생산성을 갖는다. 본원에서 이용된 바와 같이, "필적하는 단백질 생산"은 Mgat1 결여성 세포주가 Mgat1을 결여하지 않는 세포주와 거의 동일한 수준 또는 이보다 많은 단백질을 생산한다는 것을 의미한다. 단백질 생산성은 단위 체적당 생산된 단백질의 양 (즉, 피크 체적 생산성)을 결정함으로써 정량될 수 있다. 일부 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주에 의해 생산된 단백질의 양은 Mgat1을 결여하지 않는 세포주에 의해 생산된 양에 비하여 약 ± 10% 변할 수 있다. 다른 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주에 의해 생산된 단백질의 양은 Mgat1을 결여하지 않는 세포주에 의해 생산된 양에 비하여 약 10% 내지 약 20%, 약 20% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 40%, 또는 약 40% 내지 약 50% 증가될 수 있다.
Mgat1 결여성 세포주는 Mgat1을 결여하지 않는 세포주에 필적하는 성장 속도를 갖는다. 본원에서 이용된 바와 같이, "필적하는 성장 속도"는 Mgat1을 결여하지 않는 세포주에 비하여 증가되거나 또는 Mgat1을 결여하지 않는 세포주에 비하여 약 50% 이내로 감소된 성장 속도를 지칭한다. 성장 속도는 배양 동안 일정한 기간 후 단위 체적당 생존 세포의 백분율 또는 생존 세포의 숫자 (즉, 생존 세포 밀도)를 결정함으로써 정량될 수 있다. 일부 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 Mgat1을 결여하지 않는 세포주에 비하여 증가된 성장 속도를 갖는다. 가령, Mgat1 결여성 세포주에서 생존 세포 또는 생존 세포 밀도의 백분율은 Mgat1을 결여하지 않는 세포주에 비하여 약 1% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 5%, 약 50% 내지 약 100%, 또는 100% 이상 증가될 수 있다. 다른 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주에서 생존 세포의 백분율 또는 생존 세포 밀도는 Mgat1을 결여하지 않는 세포주에 비하여 약 1% 내지 약 10%, 약 10% 내지 약 30%, 약 30% 내지 약 50% 감소될 수 있다.
본원에서 개시된 Mgat1 결여성 세포주는 안정된 표현형을 갖는다. 가령, Mgat1 결여성 세포주는 연장된 기간 동안 및/또는 무수한 세포 세대에 걸쳐 단순한 글리코형을 갖는 당단백질을 생산한다. 달리 말하면, 본원에서 개시된 세포주는 복합적인 글리코형을 갖는 당단백질을 생산하도록 격세유전하지 않는다. 부가적으로, Mgat1을 결여하는 세포주는 연장된 기간 동안 및/또는 무수한 세포 세대에 걸쳐 높은 수준의 단백질 생산성 및 뛰어난 성장 속도를 유지한다.
(b) Mgat1을 인코딩하는 비활성화된 염색체 서열
일부 구체예에서, Mgat1을 결여하는 세포주는 Mgat1을 인코딩하는 비활성화된 염색체 서열을 포함한다. 가령, 세포주의 게놈은 Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열을 비활성화시키기 위해 편집될 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "비활성화된 염색체 서열"은 단백질 산물을 산출할 수 없는 염색체 서열을 지칭한다. 세포주가 정배수체 세포를 포함하는 구체예에서, Mgat1을 인코딩하는 비활성화된 염색체 서열은 세포주가 감소된 수준의 Mgat1을 생산하도록 단일대립유전자성일 수 있다. 세포주가 정배수체 세포를 포함하는 다른 구체예에서, Mgat1을 인코딩하는 비활성화된 염색체 서열은 세포주가 Mgat1을 생산하지 않도록 이중대립유전자성일 수 있다. 세포주가 이수체인 다른 구체예에서, Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열(들)의 하나 또는 그 이상의 사본은 세포가 감소된 양의 Mgat1을 생산하도록 비활성화될 수 있다. 세포주가 이수체인 또 다른 구체예에서, Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열(들)의 모든 사본은 세포주가 Mgat1을 생산하지 않도록 비활성화될 수 있다. 예시적인 구체예에서, 세포주는 Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열에 대해 반수체이고, 그리고 Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열의 비활성화는 Mgat1 발현의 완전한 상실을 유발한다.
Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열은 적어도 하나의 염기쌍 (bp)의 결실, 적어도 하나의 bp의 삽입, 적어도 하나의 bp의 치환, 또는 이들의 조합에 의해 비활성화될 수 있다. 결실(들), 삽입(들), 및/또는 치환(들)의 결과로서, Mgat1 코딩 서열은 해독틀에서 변동을 겪고, 따라서 단백질 산물의 생산을 방해한다. Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열은 하기 섹션 (II)에서 설명된 바와 같이 표적화 엔도뉴클레아제-매개된 게놈 편집 기술을 이용하여 비활성화될 수 있다. 다양한 구체예에서, Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열은 Mgat1의 발현이 소멸하도록 엑손 코딩 영역의 전부 또는 일부의 결실, 제어 영역의 전부 또는 일부의 결실, 및/또는 스플라이스 부위의 결실에 의해 비활성화될 수 있다. 다른 구체예에서, Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열은 세포주가 Mgat1을 생산할 수 없도록 미성숙 종결 코돈, 새로운 스플라이스 부위, 및/또는 SNP를 염색체 서열 내로 도입하기 위한 결실, 삽입, 및/또는 뉴클레오티드 치환에 의해 비활성화될 수 있다.
한 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열의 약 1 bp 내지 전체 코딩 영역 범위의 결실을 포함한다. 다른 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 Mgat1의 코딩 영역의 약 2 bp 내지 약 55 bp, 약 55 bp 내지 약 100 bp, 약 100 bp 내지 약 300 bp, 약 300 bp 내지 약 600 bp, 약 600 bp 내지 약 1200 bp, 또는 약 1200 bp 이상 범위의 결실을 포함한다. 예시적인 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열의 2 bp, 4 bp, 7 bp, 10 bp, 18 bp, 24 bp, 28 bp, 또는 55 bp의 결실을 포함한다. 다른 예시적인 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열의 104 bp의 삽입에 의해 대체되는 157 bp의 결실을 포함한다.
(c) 선택적인 추가 결여
일부 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 또한, 글루타민 신타아제 (GS), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 히폭산틴-구아닌 포스포리보실전이효소 (HPRT), 또는 이들의 조합에서 결여를 포함한다. GS, DHFR, 및/또는 HPRT에서 결여는 자연 발생일 수 있다. 대안으로, GS, DHFR, 및/또는 HPRT에서 결여는 조작될 수 있다. 가령, 세포는 GS, DHFR, 또는 HPRT를 결여할 수 있는데, 그 이유는 상기 세포가 GS, DHFR, 또는 HPRT를 각각 인코딩하는 비활성화된 염색체 서열을 포함하기 때문이다. 일부 구체예에서, GS, DHFR, 또는 HPRT를 인코딩하는 염색체 서열(들)은 표적화 엔도뉴클레아제-매개된 게놈 편집에 의해 비활성화될 수 있다. 예시적인 구체예에서, GS, DHFR, 또는 HPRT를 인코딩하는 염색체 서열(들)의 모든 사본은 세포주가 각각, GS, DHFR, 또는 HPRT를 생산하지 않도록 비활성화된다. 예시적인 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 GS -/-이다.
(d) 세포주 유형
Mgat1을 결여하는 세포주의 유형은 변할 수 있다. 세포주는 인간 세포주, 비-인간 포유류 세포주, 비-포유류 척추동물 세포주, 무척추동물 세포주, 또는 효모 세포주일 수 있다.
적절한 포유류 세포주의 무제한적 실례에는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 아기 햄스터 신장 (BHK) 세포; 생쥐 골수종 NS0 세포, 생쥐 배아 섬유아세포 3T3 세포 (NIH3T3), 생쥐 B 림프종 A20 세포; 생쥐 흑색종 B16 세포; 생쥐 근아세포 C2C12 세포; 생쥐 골수종 SP2/0 세포; 생쥐 배아 간엽 C3H-10T1/2 세포; 생쥐 암종 CT26 세포, 생쥐 전립선 DuCuP 세포; 생쥐 유방 EMT6 세포; 생쥐 간암 Hepa1c1c7 세포; 생쥐 골수종 J5582 세포; 생쥐 상피 MTD-1A 세포; 생쥐 심근 MyEnd 세포; 생쥐 신장 RenCa 세포; 생쥐 췌장 RIN-5F 세포; 생쥐 흑색종 X64 세포; 생쥐 림프종 YAC-1 세포; 쥐 교아종 9L 세포; 쥐 B 림프종 RBL 세포; 쥐 신경아세포종 B35 세포; 쥐 간암 세포 (HTC); 버팔로 쥐 간 BRL 3A 세포; 개과 신장 세포 (MDCK); 개과 유방 (CMT) 세포; 쥐 골육종 D17 세포; 쥐 단핵구/대식세포 DH82 세포; 원숭이 신장 SV-40 형질전환된 섬유아세포 (COS7) 세포; 원숭이 신장 CVI-76 세포; 아프리카 사바나 원숭이 신장 (VERO-76) 세포; 인간 배아 신장 세포 (HEK293, HEK293T); 인간 경부 암종 세포 (HELA); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 인간 U2-OS 골육종 세포, 인간 A549 세포, 인간 A-431 세포, 그리고 인간 K562 세포가 포함된다. 포유류 세포주의 광범위한 목록은 American Type Culture Collection 카탈로그 (ATCC, Mamassas, VA)에서 찾아볼 수 있다.
적절한 비-포유류 세포주의 실례에는 손톱개구리속 (Xenopus) 세포주 (가령, S3, XTC, BB7, ff-2, 15/0, 그리고 15/40); 제브라피시 세포주 (가령, ZF4, PAC2 등); 곤충 세포주 (가령, SF9, S2 등); 그리고 효모 세포주, 예를 들면, 피치아 (Pichia) 세포주 및 사카로미세스 (Saccharomyces) 세포주가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
예시적인 구체예에서, 세포주는 재조합 단백질, 예를 들면, 항체, 당단백질 등의 생산에 폭넓게 이용되는 유형이다. 예시적인 구체예에서, 세포주는 CHO 세포주이다. 다수의 CHO 세포주가 ATCC로부터 가용하다. 적절한 CHO 세포주에는 CHO-K1 세포 및 이들의 유도체가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다.
(e) 선택적 핵산
일부 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 재조합 단백질을 인코딩하는 적어도 하나의 핵산 서열을 더욱 포함할 수 있다. 일반적으로, 재조합 단백질은 이종기원성인데, 이것은 단백질이 세포에 선천적이지 않다는 것을 의미한다. 재조합 단백질은 제한 없이, 항체, 항체의 단편, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간화 단일클론 항체, 키메라 항체, IgG 분자, IgG 중쇄, IgG 경쇄, IgA 분자, IgD 분자, IgE 분자, IgM 분자, 백신, 성장 인자, 사이토킨, 인터페론, 인터류킨, 호르몬, 응혈 (또는 응고) 인자, 혈액 성분, 효소, 치료 단백질, 건강기능성 단백질, 전술한 것중 한 가지의 기능적 단편 또는 기능적 변이체, 또는 전술한 단백질 및/또는 기능적 단편 또는 이들의 변이체 중에서 한 가지를 포함하는 융합 단백질일 수 있다.
일부 구체예에서, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 HPRT, DHFR, 및/또는 GS가 증폭가능 선별가능 마커로서 이용될 수 있도록, 히폭산틴-구아닌 포스포리보실전이효소 (HPRT), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 및/또는 글루타민 신타아제 (GS)를 인코딩하는 핵산 서열에 연결될 수 있다.
일부 구체예에서, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 염색체외일 수 있다. 다시 말하면, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산은 플라스미드, 코스미드, 인공 염색체, 꼬마염색체, 또는 다른 염색체외 구조체로부터 일시적으로 발현될 수 있다. 발현 구조체는 추가의 발현 제어 서열 (가령, 인핸서 서열, Kozak 서열, 폴리아데닐화 서열, 전사 종결 서열 등), 선별가능 마커 서열 (가령, 항생제 내성 유전자), 복제 기점 등을 포함할 수 있다. 추가의 정보는 "Current Protocols in Molecular Biology" Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 또는 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3rd edition, 2001에서 찾아볼 수 있다.
다른 구체예에서, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 세포의 게놈 내로 염색체외 통합될 수 있다. 따라서 재조합 단백질이 안정되게 발현될 수 있다. 이러한 구체예의 일부 반복에서, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 적절한 이종기원성 발현 제어 서열 (즉, 프로모터)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 다른 반복에서, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 내인성 발현 제어 서열의 제어 하에 놓일 수 있다. 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 상동성 재조합, 표적화 엔도뉴클레아제-매개된 게놈 편집, 바이러스 벡터, 트랜스포손, 플라스미드, 그리고 다른 널리 공지된 수단을 이용하여, 세포주의 게놈 내로 통합될 수 있다. 추가의 보도는 Ausubel et al. 2003, supra 및 Sambrook & Russell, 2001, supra에서 찾아볼 수 있다.
(f) 예시적인 구체예
한 예시적인 구체예에서, 세포주는 Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열의 단일 사본이 비활성화된 CHO 세포주이다 (즉, 상기 세포의 유전형은 Mgat1 -/0이다). 다른 예시적인 구체예에서, 세포주는 Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열의 단일 사본이 비활성화된 GS -/- CHO 세포주이다 (즉, 상기 세포의 유전형은 GS -/-, Mgat1 -/0이다). 일반적으로, Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열은 코딩 서열의 일부의 결실에 의해 비활성화된다.
(II) Mgat1을 결여하는 세포주를 제조하기 위한 방법
Mgat1을 결여하는 세포주는 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 일정한 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 표적화 엔도뉴클레아제-매개된 게놈 편집 과정에 의해 제조될 수 있다. 다른 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 RNAi 방법, 무작위 돌연변이유발, 부위-특이적 재조합 시스템, 또는 당분야에 공지된 다른 방법에 의해 제조될 수 있다.
Mgat1을 결여하는 세포주는 하나 또는 그 이상의 말단 만노오스 잔기를 갖는 당단백질을 생산한다. 추가의 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 피마자 (Ricinus communis) 응집소-I (RCA-I)과 함께 배양에 의해 더욱 농축될 수 있다. RCA-I은 말단 만노오스 잔기에 결합하지 않고, 따라서 Mgat1 활성을 결여하는 세포의 선별을 가능하게 하는 세포독성 렉틴인데, 그 이유는 이런 세포가 말단 만노오스 잔기를 갖는 당단백질을 생산하기 때문이다.
(a) 표적화 엔도뉴클레아제-매개된 게놈 편집
표적화 엔도뉴클레아제는 특정한 염색체 서열을 편집 (즉, 비활성화 또는 변형)하는데 이용될 수 있다. 특정한 염색체 서열은 특정한 염색체 서열을 표적으로 하도록 조작된 표적화 엔도뉴클레아제 또는 이러한 표적화 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산을 세포 내로 도입함으로써 비활성화될 수 있다. 한 구체예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 특정한 염색체 서열을 인식하고 이에 결합하고, 그리고 비-상동성 말단-접합 (NHEJ) 복구 과정에 의해 복구되는 이중 가닥 절단 (double-stranded break)을 도입한다. NHEJ가 오류가 발생하기 쉽기 때문에, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 및/또는 치환이 발생할 수 있고, 따라서 어떤 단백질 산물도 생산되지 않도록 염색체 서열의 해독틀을 교란시킨다. 다른 구체예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 또한, 표적화된 염색체 서열의 일부와 실질적인 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 공동-도입함으로써, 상동성 재조합 반응에 의해 염색체 서열을 편집하는데 이용될 수 있다. 표적화 엔도뉴클레아제에 의해 도입된 이중-가닥 절단은 염색체 서열이 편집되도록 하는 방식으로 이러한 염색체 서열과 폴리뉴클레오티드가 교체되도록, 상동성-유도된 복구 과정에 의해 복구된다.
(i) 표적화 엔도뉴클레아제
염색체 서열을 편집하기 위해 다양한 표적화 엔도뉴클레아제가 이용될 수 있다. 표적화 엔도뉴클레아제는 자연-발생 단백질 또는 조작된 단백질일 수 있다. 한 구체예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 메가뉴클레아제일 수 있다. 메가뉴클레아제는 긴 인식 서열에 의해 특징되는 엔도데옥시리보뉴클레아제이다, 다시 말하면, 인식 서열은 일반적으로, 약 12개 염기쌍 내지 약 40개 염기쌍 범위이다. 이러한 요구의 결과로서, 인식 서열은 일반적으로, 임의의 소정의 게놈 내에 단지 1회 발생한다. 메가뉴클레아제 중에서, LAGLIDADG로 명명된 귀소성 엔도뉴클레아제의 패밀리는 게놈 및 게놈 조작의 연구를 위한 귀중한 도구가 되고 있다. 메가뉴클레아제는 당업자에게 널리 알려진 기술을 이용하여 인식 서열을 변형함으로써 특정한 염색체 서열에 표적화될 수 있다.
다른 구체예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 전사 활성화인자-유사 작동체 (TALE) 뉴클레아제일 수 있다. TALE는 새로운 DNA 표적에 결합하도록 쉽게 조작될 수 있는 식물 병원체 산토모나스속 (Xanthomonas)으로부터 전사 인자이다. TALE 또는 이들의 절두된 이형은 TALE 뉴클레아제 또는 TALEN으로 불리는 표적화 엔도뉴클레아제를 산출하기 위해 엔도뉴클레아제의 촉매 도메인, 예를 들면, FokI에 연결될 수 있다 (Sanjana et al., 2012, Nat Protoc, 7(1):171-192),
또 다른 구체예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 부위-특이적 엔도뉴클레아제일 수 있다. 특히, 부위-특이적 엔도뉴클레아제는 인식 서열이 게놈 내에서 드물게 발생하는 "드문 절단 (rare-cutter)" 엔도뉴클레아제일 수 있다. 일반적으로, 부위-특이적 엔도뉴클레아제의 인식 서열은 게놈 내에서 단지 1회 발생한다. 대안적 추가 구체예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 인공 표적화된 DNA 이중 가닥 절단 유도제일 수 있다.
예시적인 구체예에서, 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)일 수 있다. 전형적으로, ZFN은 DNA 결합 도메인 (즉, 아연 핑거) 및 개열 도메인 (즉, 뉴클레아제)를 포함하고, 이들 둘 모두 하기에 설명된다.
아연 핑거 결합 도메인. 아연 핑거 결합 도메인은 선택된 임의의 핵산 서열을 인식하고 이에 결합하도록 조작될 수 있다. 예로서, Beerli et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Zhang et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(43):33850-33860; Doyon et al. (2008) Nat. Biotechnol. 26:702-708; 그리고 Santiago et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:5809-5814를 참조한다. 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연-발생 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법에는 합리적 설계 및 다양한 유형의 선별이 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 합리적 설계는 예로서, 이중항, 삼중항, 및/또는 사중항 뉴클레오티드 서열 및 개별 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 이용하는 것을 포함하고, 여기서 각 이중항, 삼중항 또는 사중항 뉴클레오티드 서열은 특정 삼중항 또는 사중항 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 또는 그 이상의 아미노산 서열과 연관된다. 예로서, U.S. Pat. Nos. 6,453,242와 6,534,261을 참조하고, 이들의 내용은 본원에서 전제적으로 참조로서 편입된다. 실례로서, US patent 6,453,242에서 설명된 알고리즘은 미리 선별된 서열을 표적으로 하는 아연 핑거 결합 도메인을 설계하는데 이용될 수 있다. 대안적 방법, 예를 들면, 비축중성 인식 코드 표를 이용한 합리적 설계 역시 특정한 서열을 표적으로 하는 아연 핑거 결합 도메인을 설계하는데 이용될 수도 있다 (Sera et al. (2002) Biochemistry 41 :7074-7081). DNA 서열 내에서 잠재적 표적 부위를 확인할 뿐만 아니라 아연 핑거 결합 도메인을 설계하기 위한 공개적으로 가용한 웹-기초된 도구는 당분야에 공지되어 있다. 가령, DNA 서열 내에서 잠재적 표적 부위를 확인하기 위한 도구는 http://www.zincfingertools.org에서 찾아볼 수 있다. 아연 핑거 결합 도메인을 설계하기 위한 도구는 http://zifit.partners.org/ZiFiT에서 찾아볼 수 있다. (또한, Mandell et al. (2006) Nuc. Acid Res. 34:W516-W523; Sander et al. (2007) Nuc. Acid Res. 35:W599-W605를 참조한다.)
아연 핑거 결합 도메인은 길이에서 약 3개 뉴클레오티드 내지 약 21개 뉴클레오티드 범위의 DNA 서열을 인식하고 이에 결합하도록 설계될 수 있다. 한 구체예에서, 아연 핑거 결합 도메인은 길이에서 약 9 내지 약 18개 뉴클레오티드 범위의 DNA 서열을 인식하고 이에 결합하도록 설계될 수 있다. 일반적으로, 본원에서 이용된 아연 핑거 뉴클레아제의 아연 핑거 결합 도메인은 적어도 3개의 아연 핑거 인식 영역 또는 아연 핑거를 포함하고, 여기서 각 아연 핑거는 3개 뉴클레오티드에 결합한다. 한 구체예에서, 아연 핑거 결합 도메인은 4개의 아연 핑거 인식 영역을 포함한다. 다른 구체예에서, 아연 핑거 결합 도메인은 5개의 아연 핑거 인식 영역을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 아연 핑거 결합 도메인은 6개의 아연 핑거 인식 영역을 포함한다. 아연 핑거 결합 도메인은 임의의 적절한 표적 DNA 서열에 결합하도록 설계될 수 있다. 예로서, U.S. Pat. Nos. 6,607,882; 6,534,261과 6,453,242를 참조하고, 이들의 내용은 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
아연 핑거 인식 영역을 선별하는 예시적인 방법은 파지 전시 및 2-하이브리드 시스템을 포함하는데, 이들은 U.S. Pat. Nos. 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 그리고 6,242,568; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197과 GB 2,338,237에서 설명되고, 이들 각각은 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다. 이에 더하여, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 증강은 예로서, WO 02/077227에서 설명되고, 이의 전체 내용은 본원에서 참조로서 편입된다.
융합 단백질 (및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 설계와 작제를 위한 아연 핑거 결합 도메인과 방법은 당업자에게 알려져 있고, 그리고 예로서, U.S. Pat. No. 7,888,121에서 상세하게 설명되고, 이것은 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다. 아연 핑거 인식 영역 및/또는 다중-핑거드 아연 핑거 단백질은 예로서, 길이에서 5개 또는 그 이상의 아미노산의 링커를 비롯한 적절한 링커 서열을 이용하여 함께 연결될 수 있다. U.S. Pat. Nos. 6,479,626; 6,903,185; 그리고 7,153,949를 참조하고, 이들의 내용은 길이에서 6개 또는 그 이상의 아미노산의 링커 서열의 무제한적 실례에 대해 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다. 본원에서 설명된 아연 핑거 결합 도메인은 단백질의 개별 아연 핑거 사이에 적절한 링커의 조합을 포함할 수도 있다.
일부 구체예에서, 아연 핑거 뉴클레아제는 핵 국지화 신호 또는 서열 (NLS)을 더욱 포함한다. NLS는 아연 핑거 뉴클레아제 단백질을 핵 내로 표적화하여 염색체 내에 표적 서열에서 이중 가닥 절단을 도입하는 것을 조장하는 아미노산 서열이다. 핵 국지화 신호는 당분야에 공지되어 있다. 예로서, Makkerh et al. (1996) Current Biology 6:1025-1027을 참조한다.
개열 도메인. 아연 핑거 뉴클레아제는 또한, 개열 도메인을 포함한다. 아연 핑거 뉴클레아제의 개열 도메인 부분은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 획득될 수 있다. 개열 도메인이 유래될 수 있는 엔도뉴클레아제의 무제한적 실례에는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소성 엔도뉴클레아제가 포함되지만 이들에 국한되지 않는다. 예로서, New England Biolabs Catalog 또는 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388을 참조한다. DNA를 개열하는 추가의 효소는 알려져 있다 (가령, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 미구균 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제). 또한, Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993을 참조한다. 이들 효소 (또는 이들의 기능적 단편) 중에서 하나 또는 그 이상이 개열 도메인의 공급원으로서 이용될 수 있다.
개열 도메인은 또한, 개열 활성을 위해 이합체를 필요로 하는 전술한 바와 같은 효소 또는 이의 일부분으로부터 유래될 수 있다. 2개의 아연 핑거 뉴클레아제가 개열에 필요할 수 있는데, 그 이유는 각 뉴클레아제가 활성 효소 이합체의 단위체를 포함하기 때문이다. 대안으로, 단일 아연 핑거 뉴클레아제가 활성 효소 이합체를 창출하기 위해 양쪽 단위체를 포함할 수 있다. 본원에서 이용된 바와 같이, "활성 효소 이합체"는 핵산 분자를 개열할 수 있는 효소 이합체이다. 2개의 개열 단위체는 동일한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능적 단편)로부터 유래될 수 있고, 또는 각 단위체는 상이한 엔도뉴클레아제 (또는 이의 기능적 단편)으로부터 유래될 수 있다.
2개의 개열 단위체가 활성 효소 이합체를 형성하는데 이용될 때, 2개의 아연 핑거 뉴클레아제에 대한 인식 부위는 바람직하게는, 이들 2개의 아연 핑거 뉴클레아제의 그들의 개별 인식 부위에 대한 결합이 개열 단위체가 예로서, 이합체화에 의해 활성 효소 이합체를 형성할 수 있도록 하는 서로에 대한 공간적 배향 (spatial orientation)에 이들 개열 단위체를 놓도록 배치된다. 결과적으로, 인식 부위의 가까운 가장자리는 약 5 내지 약 18개 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 가령, 가까운 가장자리는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 또는 18개 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 하지만, 임의의 정수의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍 (가령, 약 2 내지 약 50개 뉴클레오티드 쌍 또는 그 이상)이 2개의 인식 부위 사이를 개재할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 아연 핑거 뉴클레아제, 예를 들면, 본원에서 상세하게 설명된 것들의 인식 부위의 가까운 가장자리는 6개 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 일반적으로, 개열 부위는 이들 인식 부위 사이에 위치한다.
제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 많은 종에서 존재하고 DNA (인식 부위에서) 내에 서열-특정한 결합을 하고, 그리고 결합 부위에서 또는 인근에서 DNA를 개열할 수 있다. 일정한 제한 효소 (가령, 타입 IIS)는 인식 부위로부터 떨어진 부위에서 DNA를 개열하고 분리가능한 결합과 개열 도메인을 갖는다. 가령, 타입 IIS 효소 FokI는 한쪽 가닥에서 인식 부위로부터 9개 뉴클레오티드에서, 그리고 다른 가닥에서 인식 부위로부터 13개 뉴클레오티드에서 DNA의 이중 가닥 개열을 촉매한다. 예로서, U.S. Pat. Nos. 5,356,802; 5,436,150과 5,487,994; 뿐만 아니라 Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31978-31982. 따라서 아연 핑거 뉴클레아제는 적어도 하나의 타입 IIS 제한 효소로부터 개열 도메인, 그리고 조작되거나 조작되지 않을 수 있는 하나 또는 그 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 타입 IIS 제한 효소는 예로서, International Publication WO 07/014,275에서 설명되는데, 이의 내용은 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다. 추가의 제한 효소 역시 분리가능한 결합과 개열 도메인을 내포하고, 그리고 이들 역시 본 발명에 의해 예기된다. 예로서, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420을 참조한다.
개열 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적인 타입 IIS 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특정 효소는 이합체로서 활성을 갖는다 (Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10, 570-10, 575). 따라서 본 발명을 위하여, 아연 핑거 뉴클레아제에서 이용된 FokI 효소의 일부는 개열 단위체인 것으로 간주된다. 따라서 FokI 개열 도메인을 이용한 표적화된 이중 가닥 개열을 위해, FokI 개열 단위체를 각각 포함하는 2개의 아연 핑거 뉴클레아제가 활성 효소 이합체를 재구성하는데 이용될 수 있다. 대안으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 FokI 개열 단위체를 내포하는 단일 폴리펩티드 분자 역시 이용될 수 있다.
일정한 구체예에서, 개열 도메인은 동종이합체화를 최소화하거나 예방하는 하나 또는 그 이상의 조작된 개열 단위체를 포함한다. 무제한적 실례로서, FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 그리고 538에서 아미노산 잔기 모두 FokI 개열 절반-도메인의 이합체화에 영향을 주기 위한 표적이다. 무조건적인 이형이합체를 형성하는 FokI의 예시적인 조작된 개열 단위체는 첫 번째 개열 단위체가 FokI의 아미노산 잔기 위치 490과 538에서 돌연변이를 포함하고, 그리고 두 번째 개열 단위체가 아미노산 잔기 위치 486과 499에서 돌연변이를 포함하는 쌍을 포함한다.
따라서 조작된 개열 단위체의 한 구체예에서, 아미노산 위치 490에서 돌연변이는 Glu (E)를 Lys (K)로 대체한다; 아미노산 잔기 538에서 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 대체한다; 아미노산 잔기 486에서 돌연변이는 Gln (Q)을 Glu (E)로 대체한다; 그리고 위치 499에서 돌연변이는 Iso (I)를 Lys (K)로 대체한다. 구체적으로, 조작된 개열 단위체는 "E490K:I538K"로 명명된 조작된 개열 단위체를 생산하기 위해 한 개열 단위체 내에서 위치 490을 E에서 K로 및 위치 538을 I에서 K로 돌연변이시키고, 그리고 "Q486E:I499K"로 명명된 조작된 개열 단위체를 생산하기 위해 다른 개열 단위체 내에서 위치 486을 Q에서 E로 및 위치 499를 I에서 K로 돌연변이시킴으로써 제조될 수 있다. 전술한 조작된 개열 단위체는 이상 개열이 최소화되거나 또는 완전히 없는 무조건적인 이형이합체 돌연변이체이다. 조작된 개열 단위체는 적절한 방법을 이용하여, 예를 들면, U.S. Pat. No. 7,888,121에서 설명된 바와 같은 야생형 개열 단위체 (FokI)의 특정 부위 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있고, 이것은 본원에서 전체적으로 참조로서 편입된다.
(ii) 선택적 폴리뉴클레오티드
일부 구체예에서, 표적화된 게놈 편집을 위한 방법은 표적화된 개열 부위의 적어도 하나의 측면 상에서, 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 것을 더욱 포함한다. 가령, 폴리뉴클레오티드는 표적화된 개열 부위의 한 측면 상에서 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 첫 번째 서열, 그리고 표적화된 개열 부위의 다른 측면 상에서 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 두 번째 서열을 포함할 수 있다. 대안으로, 폴리뉴클레오티드는 표적화된 개열 부위의 한 측면 상에서 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 첫 번째 서열, 그리고 표적화된 개열 부위로부터 멀리 떨어져 위치하는 서열에 실질적인 서열 동일성을 갖는 두 번째 서열을 포함할 수 있다. 표적화된 개열 부위로부터 멀리 떨어져 위치하는 서열은 표적화된 개열 부위의 상류 또는 하류에서 수십 개, 수백 개, 또는 수천 개의 뉴클레오티드일 수 있다.
염색체 서열 내에 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 내에 첫 번째와 두 번째 서열의 길이는 변할 수 있고 변할 것이다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드 내에 첫 번째와 두 번째 서열 각각은 길이에서 적어도 약 10개 뉴클레오티드이다. 다양한 구체예에서, 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열은 길이에서 약 10 내지 30개 뉴클레오티드, 약 30 내지 약 100개 뉴클레오티드, 약 100 내지 약 300개 뉴클레오티드, 약 300 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 약 1000 내지 약 3000개 뉴클레오티드, 또는 3000개 이상의 범위에서 변할 수 있다.
표현 "실질적인 서열 동일성"은 폴리뉴클레오티드 내에 서열이 관심되는 염색체 서열과 적어도 약 75% 서열 동일성을 갖는다는 것을 의미한다. 가령, 폴리뉴클레오티드 내에 서열 중에서 적어도 하나는 상동성 재조합 시에, 변경된 서열이 염색체 서열 내로 도입되도록 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 삽입, 및/또는 치환을 내포하는 점을 제외하고, 표적화된 염색체 서열과 동일할 수 있다. 다양한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 내에 서열은 관심되는 염색체 서열과 약 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 동일성을 가질 수 있다.
대안적 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 염색체 서열과 실질적인 서열 동일성을 갖는 서열과 측면에서 접하는 추가의 서열을 포함할 수 있다. 상동성 재조합 시에, 추가의 서열은 염색체 서열 내로 통합되고, 따라서 염색체 서열을 비활성화시키고 및/또는 염색체 서열을 변형할 수 있다.
폴리뉴클레오티드의 길이는 변할 수 있고 변할 것이다. 가령, 폴리뉴클레오티드는 길이에서 약 20개 뉴클레오티드 내지 길이에서 약 200,000개 뉴클레오티드 범위에서 변할 수 있다. 다양한 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 길이에서 약 20개 뉴클레오티드 내지 약 100개 뉴클레오티드, 길이에서 약 100개 뉴클레오티드 내지 약 1000개 뉴클레오티드, 길이에서 약 1000개 뉴클레오티드 내지 약 10,000개 뉴클레오티드, 길이에서 약 10,000개 뉴클레오티드 내지 약 100,000개 뉴클레오티드, 또는 길이에서 약 100,000개 뉴클레오티드 내지 약 200,000개 뉴클레오티드 범위에서 변한다.
전형적으로, 폴리뉴클레오티드는 DNA일 것이다. DNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 공여자 폴리뉴클레오티드는 DNA 플라스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 효모 인공 염색체 (YAC), 바이러스 벡터, DNA의 선형 조각, PCR 단편, 나신 핵산, 또는 전달 운반체, 예를 들면, 리포좀 또는 폴록사머와 복합된 핵산일 수 있다.
일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드는 마커를 더욱 포함할 수 있다. 적절한 마커의 무제한적 실례에는 제한 부위, 형광 단백질, 또는 선별가능 마커가 포함된다. 이런 마커는 표적화된 통합에 대한 스크리닝을 가능하게 한다.
(iii) 세포 내로 도입
표적화 엔도뉴클레아제는 표적화 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 단백질로서 또는 핵산으로서 세포 내로 도입될 수 있다. 표적화 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산은 DNA 또는 RNA (즉, mRNA)일 수 있다. 인코딩 핵산이 mRNA인 구체예에서, mRNA는 5' 캡핑되고 및/또는 3' 폴리아데닐화될 수 있다. 인코딩 핵산이 DNA인 구체예에서, DNA는 선형 또는 환형일 수 있다. DNA는 벡터의 일부일 수 있는데, 여기서 인코딩 DNA는 선택적으로, 적절한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 적절한 벡터, 프로모터, 다른 제어 요소, 그리고 벡터를 세포 내로 도입하는 수단에 관한 추가의 정보는 예로서, Ausubel et al, 2003, supra 및/또는 Sambrook & Russell, 2001, supra에서 찾아볼 수 있다.
표적화 엔도뉴클레아제 또는 표적화 엔도뉴클레아제를 인코딩하는 핵산, 그리고 전술한 선택적 폴리뉴클레오티드는 다양한 수단에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 적절한 전달 수단에는 현미주사, 전기천공, 소노포레이션 (sonoporation), 바이오리스틱스 (biolistics), 인산칼슘-매개된 형질감염, 양이온성 형질감염, 리포좀 형질감염, 덴드리머 형질감염, 열 쇼크 형질감염, 뉴클레오펙션 (nucleofection) 형질감염, 마그네토펙션 (magnetofection), 리포펙션 (lipofection), 임팔레펙션 (impalefection), 광학 형질감염, 핵산의 독점 작용제-증강된 흡수, 그리고 리포좀, 면역리포좀, 비로솜, 또는 인공 비리온에 의한 전달이 포함된다. 일정한 구체예에서, 표적화 엔도뉴클레아제 분자 및 선택적 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오펙션 또는 전기천공에 의해 세포 내로 도입된다.
하나 이상의 표적화 엔도뉴클레아제 분자 및 하나 이상 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입되는 구체예에서, 이들 분자는 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있다. 가령, 표적화된 개열 부위 (및 선택적 폴리뉴클레오티드)에 각각 특이적인 표적화 엔도뉴클레아제 분자는 동시에 도입될 수 있다. 대안으로, 각 표적화 엔도뉴클레아제 분자뿐만 아니라 선택적 폴리뉴클레오티드(들)는 순차적으로 도입될 수 있다.
선택적 폴리뉴클레오티드에 대한 표적화 엔도뉴클레아제 (또는 인코딩 핵산) 분자의 비율은 변할 수 있고 변할 것이다. 일반적으로, 표적화 엔도뉴클레아제 분자 대 폴리뉴클레오티드의 비율은 약 1:10 내지 약 10:1 범위에서 변할 수 있다. 다양한 구체예에서, 표적화 엔도뉴클레아제 분자 대 폴리뉴클레오티드의 비율은 약 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 또는 10:1이다. 한 구체예에서, 비율은 약 1:1이다.
(iv) 예시적인 구체예
일부 구체예에서, Mgat1을 결여하는 세포주는 Mgat1 유전자 내에서 특정한 서열을 개열하는 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN)를 조작함으로써 제조된다. 부모 세포주 내로 ZFN 또는 ZFN을 인코딩하는 핵산의 도입 시에, ZFN은 Mgat1 유전자 내에 특정한 서열에 결합하고 이를 개열한다. 오류가 쉽게 발생하는 NHEJ 과정은 Mgat1 유전자 내에 이중 가닥 절단을 복구하고, 따라서 Mgat1 유전자가 비활성화되도록 적어도 하나의 bp의 결실, 삽입, 및/또는 치환을 도입한다. 일반적으로, Mgat1 코딩 서열의 영역은 해독틀이 교란되도록 결실되고, 그리고 어떤 Mgat1 단백질도 Mgat1을 결여하는 세포주에 의해 생산되지 않는다. 일부 구체예에서, ZFN-매개된 게놈 편집에 의해 산출된 Mgat1 결여성 세포주는 RCA-I의 존재에서 선별에 의해 더욱 농축된다. 일부 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 CHO 세포주를 Mgat1에 표적화된 ZFN와 접촉시킴으로써 제조된다. 일부 상황에서, CHO 세포주는 GS -/-이다.
(b) RNA 간섭
다른 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 표적 mRNA 또는 전사체의 발현을 저해하는 RNA 간섭 (RNAi) 작용제를 이용하여 제조될 수 있다. RNAi 작용제는 표적 mRNA 또는 전사체의 개열을 유발할 수 있다. 대안으로, RNAi 작용제는 표적 mRNA의 단백질로의 번역을 예방하거나 또는 교란시킬 수 있다.
일부 구체예에서, RNAi 작용제는 짧은 간섭 RNA (siRNA)일 수 있다. 일반적으로, siRNA는 길이에서 약 15 내지 약 29개 뉴클레오티드 범위에서 변하는 이중 가닥 RNA 분자를 포함한다. siRNA는 길이에서 약 16-18, 17-19, 21-23, 24-27, 또는 27-29개 뉴클레오티드일 수 있다. 특정한 구체예에서, siRNA는 길이에서 약 21개 뉴클레오티드이다. siRNA는 선택적으로, 1개 또는 2개의 단일 가닥 오버행, 예를 들면, 한쪽 또는 양쪽 단부 상에서 3' 오버행을 더욱 포함할 수 있다. siRNA는 서로 혼성화하는 2개의 RNA 분자로부터 형성될 수 있거나, 또는 대안으로, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)로부터 산출될 수 있다 (하기 참조). 일부 구체예에서, siRNA의 2개의 가닥은 이들 두 서열 사이에 형성된 이중나선에서 미스매치 또는 벌지 (bulge)가 존재하지 않도록, 완전하게 상보성이다. 다른 구체예에서, siRNA의 2개의 가닥은 이들 두 서열 사이에 형성된 이중 나선에서 하나 또는 그 이상의 미스매치 및/또는 벌지가 존재하도록, 실질적으로 상보성이다. 일정한 구체예에서, siRNA의 5' 단부의 한쪽 또는 양쪽은 인산염 기를 갖는 반면, 다른 구체예에서 5' 단부의 한쪽 또는 양쪽은 인산염 기를 결여한다. 다른 구체예에서, siRNA의 3' 단부의 한쪽 또는 양쪽은 히드록실 기를 갖는 반면, 다른 구체예에서 5' 단부의 한쪽 또는 양쪽은 히드록실 기를 결여한다.
"안티센스 가닥" 또는 "가이드 가닥"으로 지칭되는 siRNA의 한 가닥은 표적 전사체와 혼성화하는 부분을 포함한다. 일정한 구체예에서, siRNA의 안티센스 가닥은 표적 전사체의 영역과 완전히 상보성이다, 다시 말하면, 이것은 길이에서 약 15 내지 약 29개 뉴클레오티드, 바람직하게는 길이에서 적어도 16개 뉴클레오티드, 그리고 더욱 바람직하게는, 길이에서 약 18-20개 뉴클레오티드의 표적 영역에 걸쳐 단일 미스매치 또는 벌지 없이, 표적 전사체에 혼성화한다. 다른 구체예에서, 안티센스 가닥은 표적 영역에 실질적으로 상보성이다, 다시 말하면, 하나 또는 그 이상의 미스매치 및/또는 벌지가 안티센스 가닥 및 표적 전사체에 의해 형성된 이중나선 내에 존재할 수 있다. 전형적으로, siRNA는 표적 전사체의 엑손 서열에 표적화된다. 당업자는 표적 전사체에 대한 siRNA를 설계하는 프로그램, 알고리즘, 및/또는 상업적 서비스에 익숙하다. 예시적인 실례는 Rosetta siRNA 설계 알고리즘 (Rosetta Inpharmatics, North Seattle, WA) 및 MISSION® siRNA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)이다. siRNA는 당업자에게 널리 알려진 방법을 이용하여 시험관내에서 효소적으로 합성될 수 있다. 대안으로, siRNA는 당분야에 널리 공지된 올리고뉴클레오티드 합성 기술을 이용하여 화학적으로 합성될 수 있다.
다른 구체예에서, RNAi 작용제는 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)일 수 있다. 일반적으로, shRNA는 RNA 간섭을 매개할 만큼 충분히 긴 이중 가닥 구조를 형성하기 위해 혼성화되거나 또는 혼성화할 수 있는 적어도 2개의 상보성 부분 (전술한 바와 같음), 그리고 이중나선을 형성하는 shRNA의 영역을 연결하는 루프를 형성하는 적어도 하나의 단일 가닥 부분을 포함하는 RNA 분자이다. 상기 구조는 또한, 스템-루프 구조로 불리는데, 스템은 이중나선 부분이다. 일부 구체예에서, 상기 구조의 이중나선 부분은 shRNA의 이중나선 영역 내에 미스매치 또는 벌지가 존재하지 않도록, 완전히 상보성이다. 다른 구체예에서, 상기 구조의 이중나선 부분은 shRNA의 이중나선 부분 내에 하나 또는 그 이상의 미스매치 및/또는 벌지가 존재하도록, 실질적으로 상보성이다. 상기 구조의 루프는 길이에서 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 바람직하게는 길이에서 약 4 내지 약 10개 뉴클레오티드, 그리고 더욱 바람직하게는 길이에서 약 6 내지 약 9개 뉴클레오티드일 수 있다. 루프는 표적 전사체에 상보성인 영역 (즉, shRNA의 안티센스 부분)의 5' 또는 3' 단부에서 위치할 수 있다.
shRNA는 5' 또는 3' 단부 상에서 오버행을 더욱 포함할 수 있다. 선택적 오버행은 길이에서 약 1 내지 약 20개 뉴클레오티드, 그리고 더욱 바람직하게는 길이에서 약 2 내지 약 15개 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구체예에서, 오버행은 하나 또는 그 이상의 U 잔기, 예를 들면, 약 1 내지 약 5개 U 잔기를 포함한다. 일부 구체예에서, shRNA의 5' 단부는 인산염 기를 갖는 반면, 다른 구체예에서 이것은 그렇지 않다. 다른 구체예에서, shRNA의 3' 단부는 히드록실 기를 갖는 반면, 다른 구체예에서 이것은 그렇지 않다. 일반적으로, shRNA는 보존된 세포 RNAi 기구에 의해 siRNA로 가공된다. 따라서 shRNA는 siRNA의 전구체이고, 그리고 shRNA의 부분 (즉, shRNA의 안티센스 부분)에 상보성인 표적 전사체의 발현을 유사하게 저해할 수 있다. 당업자는 shRNA의 설계와 합성을 위한 가용한 자원 (전술한 바와 같음)에 익숙하다. 예시적인 실례는 MISSION® shRNA (Sigma-Aldrich)이다.
또 다른 구체예에서, RNAi 작용제는 RNAi 발현 벡터일 수 있다. 전형적으로, RNAi 발현 벡터는 RNAi 작용제, 예를 들면, siRNA 또는 shRNA의 세포내 (생체내) 합성에 이용된다. 한 구체예에서, 2개의 별개의, 상보성 siRNA 가닥은 2개의 프로모터를 내포하는 단일 벡터를 이용하여 전사되고, 이들 프로모터 각각은 단일 siRNA 가닥의 전사를 주동한다 (즉, 각 프로모터는 전사가 일어날 수 있도록 siRNA에 대한 주형에 작동가능하게 연결된다). 2개의 프로모터는 동일한 방향에서 있을 수 있는데, 이런 경우에 각각은 상보성 siRNA 가닥 중에서 하나에 대한 주형에 작동가능하게 연결된다. 대안으로, 2개의 프로모터는 이들 프로모터의 전사가 2개의 상보성 siRNA 가닥의 합성을 유발하도록 반대 방향에서, 단일 주형의 측면에 접할 수 있다. 다른 구체예에서, RNAi 발현 벡터는 전사체가 shRNA를 형성하도록, 2개의 상보성 영역을 포함하는 단일 RNA 분자의 전사를 주동하는 프로모터를 내포할 수 있다.
당업자는 siRNA와 shRNA 작용제가 하나 이상의 전사 단위의 전사를 거쳐 생체내에서 생산되는 것이 바람직하다는 것을 인지할 것이다. 일반적으로 말하면, 하나 또는 그 이상의 siRNA 또는 shRNA 전사 단위의 생체내 발현을 주동하는데 이용되는 프로모터는 RNA 중합효소 III (Pol III)에 대한 프로모터일 수 있다. 일정한 Pol III 프로모터, 예를 들면, U6 또는 H1 프로모터는 전사되는 영역 내에 시스-작용 조절 요소 (cis-acting regulatory element)를 필요로 하지 않고, 그리고 따라서, 일정한 구체예에서 선호된다. 다른 구체예에서, Pol II에 대한 프로모터가 하나 또는 그 이상의 siRNA 또는 shRNA 전사 단위의 발현을 주동하는데 이용될 수 있다. 일부 구체예에서, 조직-특이적, 세포-특이적, 또는 유도성 Pol II 프로모터가 이용될 수 있다.
siRNA 또는 shRNA의 합성을 위한 주형을 제공하는 구조체는 표준 재조합 DNA 방법을 이용하여 생산되고, 그리고 진핵 세포에서 발현을 위해 적합한 임의의 매우 다양한 상이한 벡터 내로 삽입될 수 있다. 재조합 DNA 기술은 Ausubel et al, 2003, supra 및 Sambrook & Russell, 2001, supra에서 설명된다. 당업자는 또한, 벡터가 추가의 조절 서열 (가령, 종결 서열, 번역 제어 서열 등)뿐만 아니라 선별가능 마커 서열을 포함할 수 있다는 것을 인지한다. pBR322, PUC 등에 기초된 것들을 비롯한 DNA 플라스미드는 당분야에 공지되어 있다. 많은 발현 벡터가 적절한 프로모터 또는 프로모터들을 이미 내포하고 있기 때문에, 관심되는 RNAi 작용제를 인코딩하는 핵산 서열을 프로모터(들)에 대하여 적절한 위치에서 삽입하는 것만 필요할 수도 있다. 바이러스 벡터 역시 RNAi 작용제의 세포내 발현을 제공하는데 이용될 수 있다. 적절한 바이러스 벡터에는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터 등이 포함된다. 특정한 구체예에서, RNAi 발현 벡터는 shRNA 렌티바이러스-기초된 벡터 또는 렌티바이러스 입자, 예를 들면, MISSION® TRC shRNA 제품 (Sigma-Aldrich)에서 제공된 것이다.
RNAi 작용제 또는 RNAi 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지된 방법을 이용하여 세포 내로 도입될 수 있다. 이런 기술은 예로서, Ausubel et al., 2003, supra 또는 Sambrook & Russell, 2001, supra에서 설명된다. 일정한 구체예에서, RNAi 발현 벡터, 예를 들면, 바이러스 벡터는 Mgat1 발현이 차후 세포 세대에 걸쳐 교란되도록, 세포의 게놈 내로 안정되게 통합된다.
(c) 부위-특이적 재조합
대안적 구체예에서, Mgat1 결여성 세포주는 부위-특이적 재조합 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 가령, 부위-특이적 재조합 기술이 관심되는 염색체 서열의 전부 또는 일부를 결실시키고, 또는 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNPs)을 관심되는 염색체 서열 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 한 구체예에서, 관심되는 염색체 서열은 Cre-loxP 부위-특이적 재조합 시스템, Flp-FRT 부위-특이적 재조합 시스템, 또는 이들의 변이체를 이용하여 표적화된다. 이런 재조합 시스템은 상업적으로 가용하고, 그리고 이들 기술에 대한 추가의 교시는 예로서, Ausubel et al., 2003, supra에서 확인된다.
(III) 단순한 글리코형을 갖는 재조합 단백질을 생산하기 위한 방법
단순한 글리코형을 갖는 재조합 단백질을 생산하기 위해 Mgat1 결여성 세포를 이용하기 위한 방법 역시 제시된다. 단순한 글리코형은 하나 또는 그 이상의 말단 만노오스 잔기를 포함하는 글리코형을 지칭한다. 일반적으로, 단순한 글리코형은 갈락토오스 및/또는 시알산 잔기를 결여한다. 예시적인 단순한 글리코형은 Man5GlcNac2 또는 Man5이다. 전술한 바와 같이, 단순한 글리코형을 갖는 당단백질은 X-선 결정학 연구에 유용하다. 단순한 글리코형을 갖는 당단백질은 추가의 실용성을 갖는다. 가령, Mgat1 결여성 세포는 백신 생산에 이용될 수 있다. Mgat1 결여성 세포는 말단 만노오스 잔기를 내포하는 당단백질을 생산한다. 항원 상에서 말단 만노오스 잔기는 항원 제시 세포 상에서 만노오스 수용체에 의한 이의 흡수를 가능하게 한다. 항원 제시 세포 (즉, 대식세포 또는 수상돌기 세포)는 이후, T 세포에 의한 인식을 위한 항원을 제시하고, 따라서 면역 반응을 개시한다. 말단 만노오스 잔기를 포함하는 항원의 이용은 T 세포에 항원 제시의 효율을 증강시킬 수 있다. 부가적으로, 단지 말단 만노오스 잔기만을 갖는 당단백질은 이들 단백질의 만노오스 수용체-매개된 흡수를 조장함으로써 다른 치료 목적에 유용할 수 있다.
단순한 글리코형을 갖는 당단백질이 제조될 수 있다. 본 발명의 추가의 양상은 단순한 글리코형을 갖는 재조합 단백질을 생산하기 위한 방법을 포함한다. 상기 방법은 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 Mgat1을 결여하는 세포주 내로 도입하고 재조합 단백질을 발현하는 것을 포함하고, 여기서 발현된 재조합 단백질은 하나 또는 그 이상의 말단 만노오스 잔기를 포함한다. Mgat1 결여성 세포주는 상기 섹션 (I)에서 설명된다.
Mgat1 결여성 세포주에서 생산된 재조합 당단백질은 치료 단백질 및 단백질 생물제제를 비롯한 임의의 적절한 당단백질일 수 있다. 가령, 재조합 단백질은 제한 없이, 항체, 항체의 단편, 단일클론 항체, 인간화 항체, 인간화 단일클론 항체, 키메라 항체, IgG 분자, IgG 중쇄, IgG 경쇄, IgA 분자, IgD 분자, IgE 분자, IgM 분자, 백신, 성장 인자, 사이토킨, 인터페론, 인터류킨, 호르몬, 응혈 (또는 응고) 인자, 혈액 성분, 효소, 건강기능성 단백질, 전술한 것중 한 가지의 기능적 단편 또는 기능적 변이체, 또는 전술한 단백질 및/또는 기능적 단편 또는 이들의 변이체 중에서 한 가지를 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 예시적인 구체예에서, 재조합 당단백질은 인간 단백질이다.
재조합 단백질을 생산하기 위한 방법은 당분야에 널리 공지되어 있고, 그리고 추가의 교시는 Ausubel et al., 2003 supra에 의해 제공된다. 일반적으로, 재조합 단백질은 외인성으로 도입된 핵산으로부터 발현된다. 상기 섹션 (I)(e)에서 상술된 바와 같이, 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산은 염색체외이거나, 또는 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산은 게놈 내로 통합될 수 있다.
재조합 단백질이 발현되도록 세포주를 배양하기 위한 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 적절한 배지와 배양 시스템은 당분야에 공지되어 있고 상업적으로 구입가능하다. 한 구체예에서, 재조합 단백질은 혈청 없는 현탁 배양 (serum free suspension culture)에 의해, 본원에서 개시된 세포주에 의해 생산된다.
정의
달리 규정되지 않으면, 본원에서 이용된 모든 기술 용어와 과학 용어는 본 발명에 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 갖는다. 하기 참고문헌은 당업자에게 본 발명에서 이용된 많은 용어의 일반적인 정의를 제공한다: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); 그리고 Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). 본원에서 이용된 바와 같이, 하기 용어는 달리 특정되지 않으면, 그들에게 부여된 의미를 갖는다.
본 발명의 요소 또는 이들의 바람직한 구체예(들)을 소개할 때, 관사 ("a", "an", "the") 및 "상기"는 하나 또는 그 이상의 요소가 존재한다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 "포함하는", "내포하는" 및 "갖는"은 총괄적이고, 그리고 열거된 요소 이외에 추가의 요소가 있을 수도 있음을 의미하는 것으로 의도된다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "내인성 서열"은 세포에 선천적인 염색체 서열을 지칭한다.
용어 "외인성 서열"은 세포에 선천적이지 않은 염색체 서열, 또는 선천적인 염색체 장소가 염색체 내에서 상이한 장소에 있는 염색체 서열을 지칭한다.
용어 "편집", "게놈 편집" 또는 "염색체 편집"은 특정한 염색체 서열이 변경되는 과정을 지칭한다. 편집된 염색체 서열은 적어도 하나의 뉴클레오티드의 삽입, 적어도 하나의 뉴클레오티드의 결실, 및/또는 적어도 하나의 뉴클레오티드의 치환을 포함할 수 있다.
본원에서 이용된 바와 같이, "유전자"는 유전자 산물을 인코딩하는 DNA 영역 (엑손과 인트론 포함)뿐만 아니라 이런 조절 서열이 코딩 및/또는 전사된 서열에 인접하는 지에 상관없이, 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 지칭한다. 따라서 유전자에는 프로모터 서열, 종결인자, 번역 조절 서열, 예를 들면, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위, 인핸서, 사일런서, 절연요소, 경계 요소, 복제 기점, 기반 부착 부위, 그리고 좌위 제어 영역이 포함되지만 이들에 반드시 한정되지는 않는다.
용어 "이종기원성"은 관심되는 세포 또는 종에 선천적이지 않은 실체를 지칭한다.
용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 선형 또는 환형 입체형태에서, 그리고 단일- 또는 이중 가닥 형태에서 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 본 발명을 위하여, 이들 용어는 중합체의 길이에 대하여 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 이들 용어는 자연 뉴클레오티드의 공지된 유사체뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 인산염 모이어티 (가령, 포스포로티오에이트 중추)에서 변형되는 뉴클레오티드를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기-대합 특이성을 갖는다; 다시 말하면, A의 유사체는 T와 염기-대합할 것이다.
용어 "뉴클레오티드"는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드 (즉, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 티미딘, 그리고 우리딘) 또는 뉴클레오티드 유사체일 수 있다. 뉴클레오티드 유사체는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기 또는 변형된 리보오스 모이어티를 갖는 뉴클레오티드를 지칭한다. 뉴클레오티드 유사체는 자연 발생 뉴클레오티드 (가령, 이노신) 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드일 수 있다. 뉴클레오티드의 당 또는 염기 모이어티의 변형의 무제한적 실례에는 아세틸 기, 아미노 기, 카르복실 기, 카르복시메틸 기, 히드록실 기, 메틸 기, 포스포릴 기, 그리고 티올 기의 부가 (또는 제거)뿐만 아니라 염기의 탄소와 질소 원자의 다른 원자로의 치환 (가령, 7-데아자 퓨린)이 포함된다. 뉴클레오티드 유사체에는 또한, 디데옥시 뉴클레오티드, 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 잠금된 핵산 (LNA), 펩티드 핵산 (PNA), 그리고 모르폴리노가 포함된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 교체 가능하게 이용되고 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다.
용어 "재조합"은 2개의 폴리뉴클레오티드 사이에 유전자 정보의 교환 과정을 지칭한다. 본 발명을 위하여, "상동성 재조합"은 예로서, 세포 내에 이중 가닥 절단의 복구 동안 일어나는 이런 교환의 특수한 형태를 지칭한다. 이러한 과정은 2개의 폴리뉴클레오티드 사이에 서열 유사성을 필요로 하고, "표적" 분자 (즉, 이중 가닥 절단을 경험한 것)의 주형 복구에 "공여자" 또는 "교환" 분자를 이용하고, 그리고 "비-크로스오버 유전자 전환" 또는 "짧은 지역 유전자 전환"으로서 다양하게 알려져 있는데, 그 이유는 이것이 공여자로부터 표적으로 유전자 정보의 이전을 유발하기 때문이다. 임의의 특정 이론에 한정됨 없이, 이런 이전은 파괴된 표적과 공여자 사이에 형성되는 이형이중나선 DNA의 미스매치 교정, 및/또는 "합성-의존성 가닥 어닐링", 여기서 공여자는 표적의 일부가 되는 유전자 정보를 재합성하는데 이용되고, 및/또는 관련된 과정을 수반할 수 있다. 이런 특수한 상동성 재조합은 종종, 공여자 폴리뉴클레오티드의 서열 중에서 전부 또는 일부가 표적 폴리뉴클레오티드 내로 함입되는 표적 분자의 서열의 변경을 유발한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "표적 부위" 또는 "표적 서열"은 편집되는 염색체 서열의 부분을 규정하고, 그리고 표적화 엔도뉴클레아제가 인식하고, 결합하고, 그리고 개열하도록 조작되는 핵산 서열을 지칭한다.
용어 "상류" 및 "하류"는 핵산 서열 내에서 고정된 위치에 대비한 장소를 지칭한다. 상류는 상기 위치에 5' (즉, 가닥의 5' 단부에 가까운) 영역을 지칭하고, 그리고 하류는 상기 위치에 3' (즉, 가닥의 3' 단부에 가까운) 영역을 지칭한다.
핵산과 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 당분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이런 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고 및/또는 그것에 의해서 인코딩된 아미노산 서열을 결정하고, 그리고 이들 서열을 두 번째 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열 역시 이러한 방식으로 결정되고 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성은 각각, 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 대응을 지칭한다. 2개 또는 그 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)은 그들의 퍼센트 동일성을 결정함으로써 비교될 수 있다. 핵산 또는 아미노산 서열인지에 상관없이, 2개의 서열의 퍼센트 동일성은 더욱 짧은 서열의 길이에 의해 나눗셈되고 100에 의해 곱셈되는, 2개의 정렬된 서열 사이에 정확한 매치의 숫자이다. 핵산 서열에 대한 근사한 정렬은 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이러한 알고리즘은 Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA에 의해 개발되고, 그리고 Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)에 의해 정규화된 스코어링 매트릭스를 이용함으로써 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 퍼센트 동일성을 결정하기 위한 이러한 알고리즘의 예시적인 수행은 "BestFit" 유틸리티 적용에서 Genetics Computer Group (Madison, Wis.)에 의해 제공된다. 서열 사이에 퍼센트 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 다른 적절한 프로그램은 당분야에 전반적으로 공지되어 있다, 가령, 다른 정렬 프로그램은 디폴트 파라미터에서 이용되는 BLAST이다. 가령, BLASTN과 BLASTP는 하기 디폴트 파라미터에서 이용될 수 있다: 유전자 코드=표준; 필터=없음; 가닥=양쪽; 컷오프=60; 예상=10; 매트릭스=BLOSUM62; 설명=50개 서열; 분류=HIGH SCORE; 데이터베이스=비-중복성, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. 이들 프로그램의 상세는 GenBank 웹사이트에서 찾아볼 수 있다. 본원에서 설명된 서열에 대하여, 서열 동일성의 원하는 정도의 범위는 대략 80% 내지 100%, 그리고 그 사이에 임의의 정수 값이다. 전형적으로, 서열 사이에 퍼센트 동일성은 적어도 70-75%, 바람직하게는 80-82%, 더욱 바람직하게는 85-90%, 이보다 더욱 바람직하게는 92%, 이보다 더욱 바람직하게는 95%, 그리고 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성이다.
전술한 세포와 방법에서 다양한 변화가 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 만들어질 수 있기 때문에, 상기 상세한 설명 및 하기 제공된 실시예에 포함된 모든 사항은 예시이고 한정의 의미가 없는 것으로 해석되는 것으로 의도된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 일정한 양상을 예시한다.
실시예 1 : ZFN을 이용한 CHO 세포에서 Mgat1의 교란
A. Mgat1에 표적화된 ZFN 발현 벡터와 ZFN mRNA의 제조
CHO 세포에서 Mgat1 유전자를 녹-아웃하거나 또는 비활성화시키고, 따라서 상동한 단순한 N-글리칸 프로필 내포 말단 Man5 모이어티를 갖는 단백질을 생산하는 세포를 산출하기 위해 ZFN-매개된 녹아웃 기술이 이용되었다. Mgat1 좌위를 내포하는 Mgat1 게놈 콘틱 (Xu et al., 2011, Nat Biotechnol, 29:735-741)은 생쥐 상동성을 이용하여 주석되었다. CHO Mgat1 코딩 영역 내에 특정한 부위를 표적으로 하는 ZFN은 독점 알고리즘을 이용하여 설계되었다. 도 2a는 Mgat1 내에 표적 부위의 장소를 도표로 표시한다. Mgat1 내에 표적 서열은 5'- AACAAGTTCAAGTTCccagcaGCTGTGGTAGTGGAGGAC-3'(서열 번호:1; 대문자에서 ZFN 결합 부위 및 소문자에서 개열 부위). Mgat1 ZFN 발현 구조체는 표준 절차를 이용하여 제조되고, 그리고 Mgat1 ZFN mRNA는 시험관내 전사, mRNA 폴리아데닐화, 그리고 캡핑 방법을 이용하여, COMPOZR® 녹아웃 아연 핑거 뉴클레아제 (ZFN) (Sigma-Aldrich) 제품 정보에서 설명된 바와 같이 ZFN 플라스미드 DNA로부터 생산되었다. 간단히 말하면, 플라스미드 ZFN DNA는 선형화되고 페놀/클로로포름 DNA 추출을 이용하여 정제되었다. MessageMax™ T7 ARCA-캡핑된 메시지 전사 키트 (Cell Script Inc.)가 선형화된 DNA를 캡핑하는데 이용되었다. 폴리(A) 중합효소 꼬리달기 키트 (EpiCentre)가 폴리(A) 꼬리를 부가하는데 이용되었다. ZFN mRNA는 MEGAclear™ 키트 (Ambion)를 이용하여 정제되었다.
B. IgG 생산 CHO 세포주에서 Mgat1을 표적으로 하는 ZFN의 형질감염
재조합 항-광견병 인간 IgG를 발현하는 CHOZN® (GS -/-) 세포 (Sigma Aldrich)는 25 μM 메티오닌 술폭시민 (MSX)으로 보충된 EX-CELL® CHO CD Fusion 배지 (Sigma-Aldrich)에서 현탁 배양액으로서 유지되었다. 세포는 형질감염 하루 전에 생물반응기 튜브 내에 0.5 x 106 세포/mL로 파종되었다. 150 μL 성장 배지에서 1 x 106 세포 및 5 μg Mgat1 ZFN DNA 또는 mRNA가 각 형질감염에 이용되었다. 형질감염은 0.2 cm 큐벳 내에 140 V 및 950 μF에서 전기천공에 의해 수행되었다. 전기천공된 세포는 6-웰 평판 정치 배양 동안 2 mL 성장 배지에서 배치되었다. 형질감염 후 3일자와 10일자에, 세포는 배양액으로부터 이전되고, 그리고 게놈 DNA가 GeneElute™ Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit (Sigma-Aldrich)를 이용하여 단리되었다. ZFN-매개된 유전자 개열의 효율을 결정하기 위해, COMPOZR® 녹아웃 ZFN 제품 정보에서 설명된 바와 같은 Cel-I 뉴클레아제 검정이 수행되었다.
도 2b는 ZFN-형질감염된 (ZFN 플라스미드 DNA 또는 mRNA 형질감염) 세포 풀에서 Cel-I 검정의 결과를 보여주는 겔을 도시한다. 2개의 개열 단편, 220과 197 bp는 형질감염 후 3일자와 10일자 둘 모두에서 게놈 DNA 소화물 내에 존재하였는데, 이것은 양쪽 시점에서 양성 ZFN 활성을 지시하였다. 3일자와 10일자에 ZFN 활성은 각각, 8.8%과 9.6%이었다. 양쪽 시점에서, RNA로 형질감염된 세포는 약간 더 집중된 띠를 가졌다. 시간의 흐름에서 안정된 ZFN 활성은 Mgat1 교란과 관련된 겉보기 세포독성 또는 성장 저해가 없음을 암시한다. 다시 말하면, ZFN 형질감염된 집단에서 ZFN 변형된 세포에 비하여 야생형의 성장 이점 없음이 관찰되었다.
실시예 2: 단일-세포 클론의 렉틴 선별과 단리
Mgat1 ZFN 형질감염된 세포는 교란된 Mgat1을 갖는 세포를 농축하기 위해, 갈락토오스에 결합하지만 만노오스에 결합하지 않는 세포독성 렉틴인 피마자 (Ricinus communis) 응집소-I (RCA-I)로 하룻밤 동안 처리되었다. 형질감염 후 14일자에, 세포의 분취량이 생존 세포에 대한 FACS를 이용한 단일 세포 클로닝을 위해 도말되었다. 세포는 10% 소 태아 혈청 (FBS) 및 4 mM L-글루타민으로 보충된 Ham's - F12 영양소 혼합물에서 96-웰 조직 배양 처리된 평판 (Corning) 내에, FACSAria™ III 세포 분류기 (Becton-Dickinson)를 이용하여 웰당 1개 세포로 도말되었다. 남아있는 세포는 18일자까지 확대되고, 이후 T 현탁 배양 플라스크 (Coring) 내에 1x106 세포/mL로 파종되었다. 세포는 성장 배지에서 하룻밤 동안 10 μg/mL 최종 농도의 RCA-I와 함께 배양되고, 이후 PBS로 세척되고 성장 배지로 환원되었다. 세포는 T 플라스크로 확대되고, 10일 동안 배양되고, 이후 전술한 바와 같이 단일-세포 클로닝을 위해 도말되었다. RCA-I 처리 10일 후, 세포는 ZFN 활성에 대해 검정되었다.
도 3은 RCA-1 농축 전후에 ZFN-형질감염된 세포 풀에서 Cel-I 검정의 결과를 보여주는 겔을 도시한다. RCA-I로 선별된 세포는 선별되지 않은 세포에 대한 3.8-5.5%와 비교하여 약 33-36%의 ZFN 활성을 보였는데, 이것은 Mgat1 교란된 세포에 대한 성공적인 농축을 지시하였다.
실시예 3: 분비된 재조합 항-광견병 인간 IgG의 글리코프로필
상대적으로 고처리량 SEC-MS (Waters Acquity UPLC®/Q-Tof Premier™) 워크플로우가 당분석에 이용되었다. 상기 워크 플로우는 세포 배양 상층액으로부터 IgG의 단백질-A 정제, 그 이후에 본래 IgG 중쇄 구성물의 정확한 질량 분석을 이용하였다. 단백질 A 정제는 웰당 50 μl 단백질 A 수지 및 750 μl 클론 상층액을 포함하는 96-웰 필터 평판을 이용하여 수행되었다. IgG는 100 μl의 25 mM 구연산염, pH 3.0으로 용리되었다. 질량 데이터 분석은 디컨벌루션에 의해 수행되고, 그리고 데이터 처리는 BiopharmaLynx™ 소프트웨어 (Waters)를 이용한 자동화 방식으로 수행되었다. 당펩티드 형태는 선별 시료의 트립신 다이제스트, 그리고 당펩티드 수준에서 MALDI-TOF에 의한 글리칸 확인과 상대적 분포 (총 글리칸의 %로서 보고됨)의 검증에 의해 확증되었다.
분비된 재조합 항-광견병 인간 IgG의 글리코프로필은 세포의 각 풀에 대해 평가되었다 (ZFN 형질감염과 모의 형질감염, RCA-I 선별과 함께 또는 RCA-I 선별 없이). RCA-I 농축된 풀은 RCA-I에 노출되지 않은 세포에 비하여 Man5 글리코형의 증가된 수준을 전시하였다 (도 4). 모의 형질감염된 세포는 Mgat1 ZFN 형질감염된 세포의 경우에 13.7 % 및 RCA-I 선별에 의해 농축된 ZFN 형질감염된 세포의 경우에 92.8%과 비교하여 0.3 % Man5를 보였다. G0F와 G1F 글리코형은 모의 형질감염된 세포 및 RCA-I 농축에 종속되지 않은 ZFN 형질감염된 세포에서 가장 풍부하였다.
실시예 4: Mgat1 변형된 단일-세포 클론의 유전형 특징화
게놈 DNA는 단일-세포 클론 (IgG 생산 또는 숙주 GS (-/-) 세포주)의 배양액으로부터 단리되었다. Mgat1 유전자의 부분은 PCR에 의해 증폭되고, 그리고 PCR 산물은 TOPO 시스템 (Life Technologies, Carlsbad, CA)을 이용하여 클로닝되었다. 시료는 DNA 염기서열분석을 위해 준비되었다. 최소 10개의 TOPO 클론이 유전형 특징화 (genotypic characterization)를 위해 염기서열분석되었다.
RCA-I 농축의 존재 또는 부재에서 Mgat1 변형된 클론의 빈도를 비교하기 위해, RCA-I와 함께 또는 RCA-I 없이 배양된 ZFN-형질감염된 세포는 전술한 바와 같이, FACS에 의해 단일-세포 클로닝되었다. 비-농축된 풀의 경우에, 76개 클론 중에서 2개 클론 (2.63%)이 Mgat1 유전자에서 짧은 결실을 가졌다 (도 5와 표 1 참조; 클론 #73과 #92). QuickExtract™ DNA Extraction Solution (Epicentre)을 이용하여 획득된 세포 용해물로부터 내포 PCR 산물의 초기 염기서열분석은 RCA-I 농축된 집단으로부터 모든 클론 (52/52)이 교란된 Mgat1 유전자 서열을 내포한다는 것을 지시하였다. 이들 클론의 염기서열분석은 Mgat1에서 2 bp 결실에서부터 55 bp 결실까지 결실을 드러냈다 (도 5와 표 1 참조, 클론 #21, #25, #27, 그리고 #37). 각 클론은 1개의 교란된 대립유전자를 내포하고, 야생형 서열이 검출되지 않았다. 따라서 이들 세포의 유전형은 MGAT-1 (-/0)과 GS (-/-)이다.
| 클론 ID | 대립유전자 1 | 대립유전자 2 | 유전형 |
| #73 | 7 bp 결실 | 검출되지 않음 | 녹아웃 |
| #92 | 4 bp 결실 | 검출되지 않음 | 녹아웃 |
| #21 | 18 bp 결실 | 검출되지 않음 | 녹아웃 |
| #25 | 4 bp 결실 | 검출되지 않음 | 녹아웃 |
| #27 | 55 bp 결실 | 검출되지 않음 | 녹아웃 |
| #37 | 2 bp 결실 | 검출되지 않음 | 녹아웃 |
하기 IgG 생산 Mgat1 녹아웃 클론이 추가 특징화를 위해 선별되었다: RCA-I 선별 없이 단리된 2개의 클론 (클론 #73과 #92); 야생형 서열을 유지하는, ZFN 형질감염 과정을 겪는 2개의 클론 (#15와 #46); 그리고 일정한 범위의 결실 길이를 갖는 4개의 RCA-I 선별된 클론 (#21, #25, #27, 그리고 #37). 이들 녹아웃 클론 중에서 어느 것도 RCA-I에 민감성을 보이지 않았고 (도 6), IgG 생산성 또는 성장의 분포에서 유의미한 변화가 관찰되지 않았다.
실시예 5: Mgat1 녹-아웃 IgG 생산 세포 클론의 특징화
분비된 재조합 항-광견병 인간 IgG의 글리코프로필은 전술한 단일 세포 클론 각각에 대해 평가되었다 (실시예 3에서 전술한 바와 본질적으로 동일함). 도 7a-b는 5일자 배치 배양액에서 각각, 야생형과 녹-아웃 클론의 글리코프로필을 도시하고, 그리고 도 7c-d는 8일자 배치 배양액에서 각각, 야생형과 녹-아웃 클론의 글리코프로필을 도시한다. Mgat1 녹-아웃 클론에서 가장 풍부한 글리칸 화학종은 Man5이고, 반면 야생형 클론은 가장 높은 G0F 피크를 전시하였다. % Man5는 Mgat1 녹-아웃 클론에서 훨씬 높다 (p < 0.0001, 웰치 교정 (Welch's correction)과 함께 이표본 t 검정 (unpaired t-test)).
Mgat1 녹-아웃 클론의 성장과 생산성을 분석하기 위해, 세포는 TPP 생물반응기 튜브 내에 30 mL의 성장 배지에서 0.3 x 106 세포/ml로 이중으로 파종되었다. 세포 밀도와 생존능은 ViCell 세포 생존능 분석기 (Beckmann Coulter)를 이용하여 결정되었다. 도 8a-b에서 도시된 바와 같이, Mgat1 녹아웃 세포 클론은 세포 생존능에 의해 측정될 때 동일한 또는 향상된 성장을 나타내고, 그리고 시간의 흐름에서 세포 밀도는 야생형 Mgat1을 갖는 세포와 비교되었다.
체적 IgG 생산성은 ForteBio OCTET® 분석기 (Pall Life Sciences)를 이용한 간섭 측정 (interferometry)에 의해 결정되었다. 도 9에서 도시된 바와 같이, Mgat1 녹-아웃 세포 클론은 야생형 세포와 동일한 또는 향상된 피크 체적 생산성을 보였다.
실시예 6: CHO 숙주 세포주에서 Mgat1 녹-아웃 클론의 단리
생물약제학적 적용을 위한 이러한 방법을 더욱 사정하기 위해, ZFN 형질감염과 클론 단리는 CHO K1 GS (-/-) 숙주 세포주를 이용하여 반복되었다. GS (-/-)를 갖는 숙주 세포주 (CHOZN® Sigma-Aldrich)는 실시예 1에서 전술한 바와 본질적으로 동일하게 Mgat1 ZFN mRNA로 형질감염되었다. Cel-1 검정을 이용한 ZFN 활성의 확인 시에, 형질감염된 세포는 실시예 2에서 전술한 바와 본질적으로 동일하게 0.5 세포/웰에서 한계 희석 (limiting dilution)을 이용하여 단일-세포 클로닝되었다. 클론형성능 (clonality)과 성장은 각각, 도말 후 7일자와 14일자에 현미경으로 검증되었다. 이들 세포는 추가의 선별을 위해 RCA-I로 처리되지 않았다.
CHOZN® GS (-/-) 숙주 세포주로부터 산출된 90개 클론 중에서 5개 클론 (5.6%)은 Mgat1 교란을 내포하였다. RCA-I 농축 없이 산출된, 이들 클론에서 확인된 결실은 7 내지 28 bp이었다 (표 2 참조). IgG-생산 클론으로 관찰된 바와 같이, 이들 부모 클론은 단지 1개의 교란된 대립유전자를 갖고, 그리고 야생형 서열이 확인되지 않았다. 렉틴 세포독성 검정은 RCA-I를 이용하여 수행되고, 그리고 IgG 생산 클론과 유사하게, 임의의 Mgat1 녹-아웃 클론에 대해 세포독성이 전혀 관찰되지 않았다.
| 클론 ID | 대립유전자 1 | 대립유전자 2 | 유전형 |
| AB4 | 24 bp 결실 | 검출되지 않음 | 녹아웃 |
| BC9 | 7 bp 결실* | 검출되지 않음 | 녹아웃 |
| BD7 | 10 bp 결실 | 검출되지 않음 | 녹아웃 |
| BH11 | 104 bp 삽입에 의해 대체된 157 bp 결실 | 검출되지 않음 | 녹아웃 |
| CG10 | 28 bp 결실 | 검출되지 않음 | 녹아웃 |
실시예 7: Mgat1 녹아웃 숙주 세포주의 안정된 IgG 발현과 IgG 글리코프로파일링
5개의 Mgat1 녹아웃 숙주 세포주 클론 (표 2에 열거됨)은 인간 항-광견병 IgG 코딩 서열 및 재조합 햄스터 GS 발현 카세트를 내포하는 발현 벡터로 형질감염되었다. 형질감염 48시간 전에, 세포는 5 x 105 세포/mL로 파종되었다. 형질감염은 30 μg 플라스미드 DNA를 이용하여 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 전기천공에 의해 수행되었다. 전기천공된 세포는 5 mL 성장 배지에서 현탁 25 cm2 세포 배양 플라스크 내로 배치되었다. 세포는 형질감염 48시간 전에 L-글루타민을 결여하는 배지에서 이전되고, 선별이 완결될 때 (12 - 14일)까지 37℃, 5% CO2에서 배양되고, 그리고 안정되게 형질감염된 배양액이 확립되었다. 별개의 형질감염에서, 세포는 마이너스 글루타민 선별을 위해 96-웰 평판에서 200 μL에서 5000 세포/웰로 도말되었고, 그리고 "미니 풀" 배양액까지 선별의 완결 직후에 24-웰 (1 mL), 25 cm2 플라스크 (5 mL) 및 TPP 튜브 (30 mL)로 정률 증가되었다. 이들 안정된 계통으로부터, TPP 배양액은 전술한 바와 유사하게 셋업되고, 그리고 배양액은 4일자와 7일자에 화학적으로 규정된 원료와 함께 2 g/L 글루코오스가 제공되었다. 배양액은 8일자에 수확되고, 그리고 상층액은 3400 rpm에서 원심분리에 의해 투명해지고, 4℃에서 24시간 동안 Spectra/Pore 4 막 투석 배관 (MWCO 12kDa, Spectrum Labs, Rancho Dominguez, CA)을 이용하여 1xPBS에 대해 차후 투석되고, 그리고 1-ml HiTrap Protein A Fast Flow 칼럼 (GE Healthcare)을 이용한
KTA FPLC 시스템 (GE healthcare, Pittsburgh, PA)에서 정제되었다. IgG는 0.1M 구연산염 pH 3.0에서 용리되고, 그리고 분획물은 1/10 부피 1.0M Tris HCl pH9.0의 첨가에 의해 즉시 중화되었다. 글리코프로파일링은 실시예 3에서 설명된 바와 본질적으로 동일하게 수행되었다.
5개의 Mgat1 녹-아웃 숙주 세포주 모두에서 생산된 항-광견병 IgG는 매우 유사한 글리코프로필을 보였는데, Man5가 우세한 화학종이고 복합적인 글리칸이 검출되지 않았다. MS 분석은 야생형 세포 (즉, 50400)와 비교하여 Mgat1 녹-아웃 세포주 (즉, 50168 - 50172)에서 우세한 글리칸 피크의 질량 이동 (mass shift)을 보였다. BC9와 BH11 "미니풀"에서 생산된 IgG는 그들의 "벌크" 선별된 안정된 풀에 필적하는 글리코프로필을 보였다.
SEQUENCE LISTING
<110> SIGMA-ALDRICH CO. LLC
LIN, Nan
SEALOVER, Natalie
GEORGE, Henery
KAYSER, Kevin
<120> PRODUCTION OF RECOMBINANT PROTEINS WITH SIMPLE GLYCOFORMS
<130> 047497-450042
<150> US 61/585,508
<151> 2012-01-11
<150> US 61/636,680
<151> 2012-04-22
<150> US 61/720,268
<151> 2012-10-30
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 1
aacaagttca agttcccagc agctgtggta gtggaggac 39
<210> 2
<211> 85
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 2
aagttcaagt tcccagcagc tgtggtagtg gaggacgatc tggaggtggc accagacttc 60
tttgagtact tccaggccac ctacc 85
<210> 3
<211> 78
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 3
aagttcaagt agctgtggta gtggaggacg atctggaggt ggcaccagac ttctttgagt 60
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<210> 4
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<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 4
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agtacttcca ggccacctac c 81
<210> 5
<211> 67
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 5
aagttcaagt tggaggacga tctggaggtg gcaccagact tctttgagta cttccaggcc 60
acctacc 67
<210> 6
<211> 81
<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 6
aagttcaagt tcaagctgtg gtagtggagg acgatctgga ggtggcacca gacttctttg 60
agtacttcca ggccacctac c 81
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<212> DNA
<213> Cricetulus griseus
<400> 8
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tgagtacttc caggccacct acc 83
Claims (17)
- 만노실 (알파-1,3-)-당단백질 베타-1,2-N-아세틸글루코사미닐전이효소 I (Mgat1)을 결여하는 세포주.
- 청구항 1에 있어서, 세포주는 Mgat1을 인코딩하는 비활성화된 염색체 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포주.
- 청구항 2에 있어서, 염색체 서열은 표적화 엔도뉴클레아제로 비활성화된 것을 특징으로 하는 세포주.
- 청구항 3에 있어서, 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 세포주.
- 청구항 2 내지 4중 어느 한 항에 있어서, 비활성화된 염색체 서열은 2 bp 내지 55 bp의 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포주.
- 전술한 청구항중 어느 한 항에 있어서, 세포주는 Mgat1을 생산하지 않는 것을 특징으로 하는 세포주.
- 전술한 청구항중 어느 한 항에 있어서, 세포주는 글루타민 신타아제 (GS), 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR), 히폭산틴-구아닌 포스포리보실전이효소 (HPRT), 또는 이들의 조합에서 결여를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 세포주.
- 전술한 청구항중 어느 한 항에 있어서, 세포주는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주인 것을 특징으로 하는 세포주.
- 청구항 8에 있어서, CHO 세포주는 GS -/- 세포주인 것을 특징으로 하는 세포주.
- 전술한 청구항중 어느 한 항에 있어서, 세포주는 하나 또는 그 이상의 말단 만노오스 잔기를 포함하는 적어도 하나의 당단백질을 발현하는 것을 특징으로 하는 세포주.
- 전술한 청구항중 어느 한 항에 있어서, 세포주는 Mgat1을 결여하지 않는 세포주에 필적하는 성장 속도를 갖는 것을 특징으로 하는 세포주.
- 전술한 청구항중 어느 한 항에 있어서, 세포주는 Mgat1을 결여하지 않는 세포주에 필적하는 수준의 단백질을 생산하는 것을 특징으로 하는 세포주.
- Mgat1을 결여하는 세포를 생산하기 위한 방법에 있어서, Mgat1을 인코딩하는 염색체 서열 내에 특정한 서열을 표적으로 하는 표적화 엔도뉴클레아제로 숙주 세포로 형질감염시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 13에 있어서, 표적화 엔도뉴클레아제는 아연 핑거 뉴클레아제인 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 13 또는 14에 있어서, 형질감염된 세포를 피마자 (Ricinus communis) 응집소-I (RCA-I)과 함께 배양하는 것을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 청구항 13 내지 15중 어느 한 항에 있어서, 하기를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 세포 내로 도입하고; 그리고
b) 재조합 단백질을 발현한다. - 하나 또는 그 이상의 말단 만노오스 잔기를 갖는 재조합 단백질을 생산하기 위한 방법에 있어서, 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 세포주가 Mgat1을 생산하지 않도록 표적화 엔도뉴클레아제가 Mgat1을 인코딩하는 모든 염색체 서열을 비활성화시킨 세포주 내로 재조합 단백질을 인코딩하는 핵산을 도입하고; 그리고
b) 재조합 단백질을 발현한다.
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