CN115867644A - 生产具有末端为甘露糖的n聚糖的重组糖蛋白的基因修饰细胞系 - Google Patents

生产具有末端为甘露糖的n聚糖的重组糖蛋白的基因修饰细胞系 Download PDF

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Abstract

本发明提供了生产具有末端为甘露糖的N‑聚糖的重组糖蛋白的基因修饰细胞系以及用于生产该重组糖蛋白的方法或用于生成该细胞、克隆体或细胞系的方法。该细胞系在编码MGAT1的染色体序列的编码区包括少于600bp的插入。

Description

生产具有末端为甘露糖的N聚糖的重组糖蛋白的基因修饰细 胞系
技术领域
本申请整体上涉及生产具有末端为甘露糖的N聚糖的重组糖蛋白的基因修饰细胞系以及用于生产该重组糖蛋白的方法或用于生成该细胞、克隆体或细胞系的方法。
背景技术
一种商业上有用的糖蛋白是β-葡萄糖脑苷脂酶，其催化葡萄糖脑苷脂的水解生成神经酰胺和葡萄糖。由于体内缺乏β-葡萄糖脑苷脂酶致使葡萄糖神经酰胺积累在周围巨噬细胞内导致细胞增大，可能导致戈谢氏病，这是一种常染色体隐性溶酶体贮积病，会导致脾、肝、骨髓的功能异常和退化，外源施用重组表达的β-葡萄糖脑苷脂酶在本领域内被认为是治疗戈谢氏病的有吸引力的方式。
问题在于，源自胎盘的未经修饰的人β-葡萄糖脑苷脂酶由于缺少暴露的甘露糖残基几乎无法通过甘露糖受体介导的内吞作用被有需要的细胞(诸如树突细胞和巨噬细胞)摄入。相应的，对方便有效地诸如通过移除封闭N聚糖中的甘露糖的残基(将甘露糖作为N聚糖的末端残基来暴露)来生产具有末端为甘露糖的N聚糖的重组表达的糖蛋白(例如β-葡萄糖脑苷脂酶)来辅助有需要的细胞通过甘露糖受体介导吸收糖蛋白的需求日益增加。
因此，需要被改造为生产带有末端为甘露糖的N聚糖的重组糖蛋白的细胞系。另外，还需要这些改造细胞系能稳定的生产末端为甘露糖残基的蛋白，同时保留高蛋白生产率、高质量和高酶活性。
发明内容
本发明的发明人通过插入突变出人意料地发现了缺乏甘露糖基(α-1，3-)-重组糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶1(MGAT1)基因的基因修饰细胞系，其中，通过用RCA选定，该细胞系在编码MGAT1的染色体序列的编码区包括少于600bp的插入。由根据本发明的细胞系生产的重组糖蛋白具有高蛋白生产率、高蛋白质量和高酶活性。
在本发明的各个方面中，其中一个提供了缺乏甘露糖基(α-1，3-)-糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶1(MGAT1)的细胞系，其中该细胞系在编码MGAT1的染色体序列的编码区包括少于600bp的插入。在一个具体实施方式中，该细胞系在编码MGAT1的染色体序列的编码区包括少于400、200、100、50、30、10或5bp的插入。在一个具体实施方式中，该细胞系在编码MGAT1的染色体序列的编码区包括1bp的插入。在一个具体实施方式中，利用靶向核酸内切酶介导的基因组编辑技术来修饰编码MGAT1的染色体序列，举例而言，靶向核酸内切酶介导的基因组编辑技术为规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)、锌指核酸酶(zFN)或类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)。在一个具体实施方式中，细胞为动物细胞，优选的为哺乳动物细胞，更加优选的为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个具体实施方式中，该细胞系表达包括一个或一个以上末端甘露糖残基的至少一个糖蛋白。在一个具体实施方式中，糖蛋白为酶，如β-葡萄糖脑苷脂酶。
本发明的另一个方面包括一种用于生产重组糖蛋白的方法，该方法包括：
(1)培养该基因修饰细胞系，和
(2)回收糖蛋白。
本发明的另一个方面包括一种用于生产具有末端为甘露糖的N聚糖的重组糖蛋白的方法，该重组糖蛋白具有一个或一个以上末端甘露糖残基，该方法包括：
(1)将编码该重组糖蛋白的基因导入细胞系；
(2)使步骤(1)获取的细胞系中的甘露糖基(α-1，3-)-重组糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶1(MGAT1)基因突变；和
(3)表达该重组糖蛋白；
其中，通过CRISPR来使MGAT1基因突变，其中sgRNA包括SEQ ID NO：4核酸序列或由SEQ ID NO：4核酸序列组成，或者sgRNA包括与SEQ ID NO：4核酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的核酸序列或由与SEQ ID NO：4核酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的核酸序列组成。
在一个具体实施方式中，利用RCA来选定细胞系。在一个具体实施方式中，糖蛋白为酶，诸如β-葡萄糖脑苷脂酶。在一个具体实施方式中，该方法进一步包括在分批再补料实验(batch refeeding assay)中选定突变细胞系的步骤。在一个具体实施方式中，分批再补料实验包括每日更新生产介质的步骤。在一个具体实施方式中，重组糖蛋白具有包含一个或一个以上末端甘露糖残基的N聚糖以及不会封闭末端甘露糖残基的任选的1至3个岩藻糖残基，优选的包含1至9个末端甘露糖残基，更加优选的包含3至6个末端甘露糖残基，其中N聚糖选自Man3、Man4、Man4+1F、Man5、Man5+1F和Man6组成的组。在一个具体实施方式中，与重组糖蛋白相连的末端为甘露糖的N聚糖的比例高于80％、85％、86％、87％、88％或89％。在一个具体实施方式中，酶活性大于0.5U/mL。在一个具体实施方式中，细胞为动物细胞，优选的为哺乳动物细胞，更加优选的为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
本发明的另一个方面包括通过本发明中的细胞系或方法生产的重组糖蛋白，如β-葡萄糖脑苷脂酶。本发明的另一个方面包括用于治疗与β-葡萄糖脑苷脂酶缺乏相关疾病(如戈谢氏病)的方法，该方法包括对有需要的受试者施用本发明所公开的重组糖蛋白，如β-葡萄糖脑苷脂酶。本发明的又一个方面是通过该方法生成的细胞、克隆体或细胞系。
本发明的另一个方面是包括药学上有效量的重组酶、缓冲剂、渗透调节剂和表面活性剂的药物制剂。在一个具体实施方式中，酶是含量为50-150U/ml的β-葡萄糖脑苷脂酶。在一个具体实施方式中，缓冲剂是含量为2-10g/mL的柠檬酸缓冲剂。在一个具体实施方式中，渗透调节剂是含量为40-120g/L的蔗糖。在一个具体实施方式中，表面活性剂是含量为0.1-1g/L的聚山梨醇酯80。在一个具体实施方式中，该制剂的pH为5-7。
前文是总结性内容，因此仅包含简化和概括的必要内容，跳过了细节。因此，本领域的技术人员将会理解该总结性内容仅仅是例举性的，并不是为了以任何方式进行限定。本文所描述的方法、组合物和/或装置和/或其它主题事项的其它方面、特征和优点将在本发明所列的教导下变的清楚明了。该总结性内容是为了以简化的形式对概念的选定进行了介绍，在下文的具体实施方式部分将进一步说明。该总结性内容不是为了确认所主张的主题事项的关键特征或必要特征，也不是为了辅助确定所主张的主题事项的范围。另外，本申请引用的所有参考文献、专利和已公开专利申请均通过引用方式整体纳入本申请。
附图说明
图1是包含Cas9和sgRNA5的质粒。
图2是MGAT1基因已经突变的单克隆体的聚糖色谱图。
图3是带有野生型MGAT1的对照池的聚糖色谱图。
具体实施方式
本发明可以通过许多种不同的形式来实施，而本发明所公开的是示例性展示本发明的原则的具体的例举性实施方式。应当强调的是本发明并不局限于这些具体的例举性实施方式。另外，本发明所使用的任何部分标题都仅仅是为了文章组织之目的，而不会被解释为限定所描述的主题内容。
定义
除非本文另有限定，否则与本发明相关的科学与技术术语的含义应当与本领域的普通技术人员通常理解的含义相同。另外，除非上下文有需要，否则单数术语应当包括复数而复数术语应当包括单数。更具体而言，在本说明书和权利要求书中使用时，单数形式的“a’、“an”和“the”包括复数的参照对象，除非上下文另有明确说明。因此，举例而言，提及“蛋白(a protein)”时其包括复数个蛋白；提及“细胞(a cell)”时其包括细胞及其类似物的混合物。在本申请中，除非另有说明，否则“或”意为“和/或”。另外，使用术语“包括(comprising)”以及其它时态例如“comprises″和“comprised”并不是为了限定。另外，说明书和权利要求书中提供的范围包括两个端点以及这些端点之间的所有点。
“基因”在本发明中是指编码基因产品的DNA区域(包括外显子和内含子)，以及调控该基因产品生产的所有DNA区域，无论此类调控序列是否与编码和/或转录序列相邻。相应的，基因包括但不一定局限于启动子序列、终止子、翻译调控序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质结合位点以及基因座控制区。
在本发明的上下文中，MGAT1，也被称为N-乙酰葡萄糖胺基转移酶I(GlcAc-T I或GnT I)或N-糖基-寡糖-糖蛋白N-乙酰葡萄糖胺基转移酶I，催化转移N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)到成长N聚糖的甘露寡糖核心(即Man5GlcNAc2(Man5)部分)上。MGAT1的功能异常会影响N聚糖的性质，从而获得具有带有末端甘露糖残基的N聚糖的糖蛋白，如β-葡萄糖脑苷脂酶。在本发明的上下文中，MGAT1与GnT I可互换地被使用。
本发明中所使用的术语“单克隆体(monoclone)”是指通过重复的细胞复制从单个祖先细胞生产的一组细胞。在本发明更具体的上下文中，表达重组糖蛋白(如β-葡萄糖脑苷脂酶)的单克隆体可通过对源自表达重组糖蛋白(如β-葡萄糖脑苷脂酶)的细胞池(pool)的单个细胞克隆来生成。
本发明中所使用的术语”突变(mutation或mutating或mutated)”是指删除或插入突变。在本发明更具体的上下文中，插入突变意为在编码目标蛋白质的基因或可操作地与编码蛋白的基因相连的调控核酸序列(如启动子或增强子)中插入1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的碱基对。在具体实施例中，通过插入突变来使细胞系中的甘露糖基(α-1，3-)-重组糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶1(MGAT1)基因突变。删除突变意为在编码目标蛋白质的基因或可操作地与编码蛋白的基因相连的调控核酸序列(如启动子或增强子)中删除1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多的碱基对。本领域的技术人员知晓敲除(knock out)包括向编码目标蛋白质的基因或可操作地与编码蛋白的基因相连的调控核酸序列(如启动子或增强子)导入删除、替换或插入突变，其中突变降低了表达水平或功能缺失，例如蛋白失活。
本发明中所使用的术语“细胞池”是指混合的细胞群。在本发明更具体的上下文中，可通过转染编码重组糖蛋白(如β-葡萄糖脑苷脂酶)的基因至宿主细胞来生成表达重组糖蛋白(如β-葡萄糖脑苷脂酶)的细胞池。
术语“重组”是指两个多核苷酸之间遗传信息交换的过程。在本发明中，“同源重组”是指在例如修复细胞中的双链断裂过程中发生此类交换的特殊形态。该过程需要两个多核苷酸具有序列相似性，利用“供体”或“交换”分子来对“靶”分子(即经受双链断裂的分子)进行模板修复，并以不同的方式被称为“非交换基因转化(non-crossover geneconversion)”或“短轨基因转换(short tract gene conversion)”，因为它导致遗传信息从供体转移到靶。不受任何特定理论的约束，此类转移可涉及在断裂的靶和供体之间形成的异源双链DNA的失配校正，和/或供体被用于重新合成将成为靶的一部分的遗传信息的“合成依赖的链退火(synthesis-dependent strand annealing)”，和/或相关过程。此类特别的同源重组常常导致靶分子的序列被改变，使得供体多核苷酸的部分或全部序列被整合入靶多核苷酸中。
本发明中所使用的术语“序列一致性”是指序列在比较窗口上逐个核苷酸或逐个氨基酸比较所得的一致程度。因此，“序列一致性百分比”是通过以下方式来计算的：将两个以最优方式对齐的序列在比较窗口上比较、确定两个序列中一致的核酸碱基(例如A、T、C、G、I、U)或一致的氨基酸残基(例如Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met))出现的位点数量来生成匹配位点数量、将匹配位点数量除以比较窗口中位点总数(即窗口大小)并将该结果乘以100来生成序列一致性百分比。在本发明中，序列一致性百分比可以为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
术语“药物制剂”是指以使活性成分的生物学活性生效的形式存在的、并且不含有具有被施用制剂的受试者无法接受的毒性的额外组分的制剂。
在药物制剂的语境中所使用的术语“稳定”是指蛋白在存储中保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性。可在选定温度和选定时长下来测定稳定性。优选的，制剂可在室温(约25℃)或40℃下保持稳定至少3个月和/或在约2-8℃下保持稳定至少1年。
术语“缓冲剂”是指通过其酸碱共轭组分的作用抵御pH变化的缓冲溶液。本发明中的缓冲液的pH范围为约4-8；优选的为约4.5-7；最优选的，pH范围为约5.0-6.5。将pH控制在该范围内的缓冲剂示例包括乙酸盐缓冲剂、琥珀酸盐缓冲剂、葡萄糖酸盐缓冲剂、组氨酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂和其它有机酸缓冲剂。
术语“渗透调节剂”是指被加入制剂中以获得所需渗透压水平的试剂。渗透压可被表示为溶解在1kg溶液中的渗透活性粒子的浓度。渗透调节剂的示例包括糖和/或糖醇。
术语“表面活性剂”是指具有表面活性的试剂。本发明所使用的表面活性剂的示例包括聚山梨醇酯和泊洛沙姆(poloxamer)。
术语“重构”是指将冻干蛋白制剂溶解在稀释剂中，使得蛋白散布其中。重构制剂适于施用。
总体上，本发明中所描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白以及核酸化学和杂交相关的术语以及技术都是本领域中广为人知并广泛使用的。除非另有说明，否则根据本发明的方法和技术总体上是根据本领域已知的以及本说明书中所引用和探讨的各种一般和具体引用文献中所描述的常规方法来实施的。本发明所描述的与分析化学、合成有机化学以及医学和药物学化学相关的术语以及其实验室步骤和技术是本领域广为人知并常用的。另外，本发明中任何部分的标题仅仅是用于结构组织之目的，而不应被解释为对所描述的主题事项进行限定。
细胞系
本发明的一个方面包括缺乏甘露糖基(α-1，3-)-重组糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶1(MGAT1)的细胞系，其中该细胞系在编码MGAT1的染色体序列的编码区包括少于600bp的插入。
在一个具体实施方式中，该缺乏MGAT1的细胞系在编码MGAT1的染色体序列包括约1-599bp的插入。在另一个具体实施方式中，该缺乏MGAT1的细胞系在MGAT1的编码区包括约1-50bp、约50-100bp、约100-200bp、约200-300bp、约300-400bp或少于约600bp的插入。在示例性具体实施方式中，该缺乏MGAT1的细胞系在编码MGAT1的染色体序列中包括约1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、10bp、25bp或50bp的插入，这导致了MGAT1功能缺失。在编码MGAT1的染色体序列中插入约1-599bp导致MGAT1表达损失或失活。MGAT1编码序列经受了阅读框架内的移码，从而阻止生产蛋白产品。可使用下文所述的靶向核酸内切酶介导的基因组编辑技术使编码MGAT1的染色体序列突变。
在一个具体实施方式中，该缺乏MGAT1的细胞系在编码MGAT1的染色体序列包括约1-1300bp的删除。在另一个具体实施方式中，该缺乏MGAT1的细胞系在MGAT1的编码区包括约1-50bp、约50-100bp、约100-200bp、约200-300bp、约300-400bp、约400-600bp或多于约600bp的删除。在示例性具体实施方式中，该缺乏MGAT1的细胞系在编码MGAT1的染色体序列包括约1bp、2bp、3bp、4bp、5bp、10bp、25bp或50bp的删除，这导致了MGAT1功能缺失。在编码MGAT1的染色体序列中删除约1-599bp导致MGAT1表达损失或失活。MGAT1编码序列经受了阅读框架内的移码，从而阻止生产蛋白产品。可使用下文所述的靶向核酸内切酶介导的基因组编辑技术使编码MGAT1的染色体序列突变。
在一些具体实施方式中，可被用于生产重组糖蛋白的细胞原则上是本领域技术人员已知的有能力表达重组糖蛋白的所有细胞。该细胞可以为动物细胞，特别是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞的示例包括CHO(中国仓鼠卵巢)细胞，优选的为CHO-K1细胞、杂交瘤、BHK(乳仓鼠肾)细胞、骨髓瘤细胞、人类细胞(如HEK-293细胞、人淋巴母细胞、E1永生HER细胞)、小鼠细胞(如NSO细胞)。在一个具体实施方式中，该细胞为动物细胞，优选的为哺乳动物细胞，更加优选的为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在示例性具体实施方式中，该细胞系为广泛用于生产重组蛋白(如糖蛋白等)的类型。在示例性具体实施方式中，该细胞系为CHO细胞系。从ATCC可获得大量的CHO细胞系。合适的CHO细胞系包括但不限于CHO-K1细胞及其衍生物。
在一个具体实施方式中，该细胞系表达至少一个糖蛋白，该至少一个糖蛋白包括一个或一个以上末端甘露糖残基。在一个具体实施方式中，糖蛋白为β-葡萄糖脑苷脂酶。
靶向核酸内切酶介导的基因组编辑技术
在一个具体实施方式中，使用靶向核酸内切酶介导的基因组编辑技术来修饰编码MGAT1的染色体序列，举例而言，靶向核酸内切酶介导的基因组编辑技术是规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)、锌指核酸酶(ZFN)或类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)。
CRISPR系统，其在细菌中形成适应性免疫系统，已经被修饰用于基因组改造。改造的CRISPR系统含有两个组分：向导RNA(gRNA或sgRNA)和CRISPR相关的核酸内切酶(Cas核酸内切酶)。gRNA是由结合Cas所需的支架序列(scaffold sequence)和限定了待修饰基因组靶的、用户定义的约20个核苷酸的间隔序列组成的短合成RNA。在本发明中，gRNA和sgRNA可彼此互换使用。因此，可仅仅通过改变gRNA中出现的靶序列来改变Cas蛋白的基因组靶。
可以使用CRISPR通过共表达与Cas9或Cpfl类似的核酸内切酶和待靶向基因特异性的gRNA来生成敲除(例如突变)细胞或动物。基因组靶可为任意的约20个核苷酸的DNA序列，只要它符合两个条件：(1)该序列相对于基因组的其余部分具有独特性；和(2)该靶紧邻前间区序列邻近基序(PAM)。该PAM序列对靶结合是必需的，但是精确序列取决于所使用的是哪个Cas蛋白。常用的Cas蛋白是酿脓链球菌Cas9(SpCas9)。一旦表达，该Cas9蛋白和gRNA就通过gRNA支架和Cas9上的表面暴露带正电荷凹槽之间的相互作用来构成核糖核蛋白复合物。Cas9在gRNA结合时经受构型变化，该构型变化将分子从失活的、非DNA结合构型转变为活化的DNA结合构型。重要的是，gRNA的间隔区仍可自由地与靶DNA相互作用。
仅在gRNA间隔序列与靶DNA享有充分同源性时Cas9才切割给定的基因座。一旦Cas9-gRNA复合物结合了推定的DNA靶，种子序列(在gRNA靶向序列的3’端的8-10个碱基)会开始退火结合至靶DNA。如果种子序列和靶DNA序列配对，那么gRNA就继续沿着3’至5’方向退火结合至靶DNA。Cas9拉链状的退火机制可以解释为何3’种子序列中的靶序列之间的错配会完全停止靶切割，而朝向远离PAM的5’端的错配常常仍允许进行靶切割。
Cas9核酸酶具有两个功能性核酸内切酶域：RuvC和HNH。Cas9在靶结合时经受第二次构型变化将核酸酶域放置为切割靶DNA的相反链。Cas9介导的DNA切割的最终结果是靶DNA内(PAM序列上游的约3-4个核苷酸)形成双链断裂(DSB)。
所得的DSB之后通过两种一般修复途径之一来修复：(1)高效但容易出错的非同源末端连接(NHEJ)途径；和(2)效率较低但可靠性高的同源介导的修复(HDR)途径。NHEJ修复途径是最活跃的修复机制，它经常导致小核苷酸在DSB位点插入或删除(indels)。NHEJ介导的DSB修复的随机性具有重要的实际意义，因为表达Cas9和gRNA的细胞群将会导致多种多样的突变。在许多情形中，NHEJ在靶DNA中引发小的indels，致使氨基酸删除、插入或移码突变，导致靶基因的开放阅读框(ORF)内出现提前终止密码子。理想的最终结果是在靶基因内发生功能丧失突变。
在具体实施方式中，通过基于CRISPR的手段对MGAT1基因进行敲除突变可通过任何可行的方案来实施，例如但不限于Yang 2014(Yang，et al.，CRISPR/Cas9-DirectedGenome Editing of Cultured Cells.Current Protocols in Molecular Biology，2014，107(1)：31.1.1-31.1.17)中的教导。在一个更加具体的实施方式中，MGAT1基因通过基于以下CRISPR的手段来突变，其中sgRNA包括SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4组成，或包括与SEQID NO：4具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的核酸序列或由该核酸序列组成。
用于生产重组糖蛋白、细胞、克隆体或细胞系的方法
本发明的另一个方面包括用于生产末端为甘露糖的N聚糖的重组糖蛋白的方法，该末端为甘露糖的N聚糖具有一个或一个以上末端甘露糖残基，该方法包括：
(1)将编码该重组糖蛋白的基因导入细胞系；
(2)使步骤(1)获取的细胞系中的甘露糖基(α-1，3-)-重组糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶1(MGAT1)基因突变；和
(3)表达该重组糖蛋白；
其中，通过CRISPR来使MGAT1基因突变，其中sgRNA包括SEQ ID NO：4核酸序列或由SEQ ID NO：4核酸序列组成，或者sgRNA包括与SEQ ID NO：4核酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的核酸序列或由与SEQ ID NO：4核酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的核酸序列组成。
本发明的另一个方面包括用于生成生产具有末端为甘露糖的N聚糖的重组糖蛋白的细胞、克隆体或细胞系，该方法包括：
(1)将编码该重组糖蛋白的基因导入细胞系；
(2)使步骤(1)获取的细胞系中的甘露糖基(α-1，3-)-重组糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶1(MGAT1)基因突变；并且
其中，通过CRISPR来使MGAT1基因突变，其中sgRNA包括SEQ ID NO：4核酸序列或由SEQ ID NO：4核酸序列组成，或者sgRNA包括与SEQ ID NO：4核酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的核酸序列或由与SEQ ID NO：4核酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的核酸序列组成。
可用在本发明中的质粒可以为用于预期目的的任意一种商业上可获得的质粒。本领域技术人员会容易地知道哪些质粒适用于哪些目的并会理解使用的质粒的差异不会实质性地改变本发明的方法/产品的技术效果。
在一个具体实施方式中，可通过将诸如复制起点(ori)、启动子、用于转移目的基因的多克隆位点以及一个或一个以上选择标记编码基因(selection markers-encodinggenes)等要素整合入单个环状序列来人工制备用于将基因导入细胞(如CHO细胞)的质粒。用于将基因导入细胞(如CHO细胞)中的常规可用质粒的非限定示例可以为pMX241(AddgeneCat.No.23017)等。
在一个具体实施方式中，可通过将诸如复制起点(ori)、启动子、用于接受有意设计的sgRNA的sgRNA支架、编码CRISPR相关(Cas)核酸内切酶的基因以及一个或一个以上选择标记编码基因等要素整合入单个环状序列来人工制备采用CRISPR的质粒。采用CRISPR的常规可用敲除载体的非限定示例可以为pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0(AddgeneCat.No.62988)等。
在本发明中，选择标记可以为本领域商业上可获取的任意一种。举例而言，选择标记包括但不限于新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、吉欧霉素、杀稻瘟菌素等。
在一个具体实施方式中，用RCA来选定细胞系。在一个具体实施方式中，用蓖麻凝集素-I(RCA-I)来培养转染细胞。可通过用蓖麻凝集素-I(RCA-I)培养来进一步使缺乏MGAT1的细胞系富集。RCA-I是不与末端甘露糖残基结合的具有细胞毒性的凝集素，因此可用于选定缺少MGAT1活性的细胞，因为此类细胞生产具有末端甘露糖残基的糖蛋白。
在一个具体实施方式中，该细胞为动物细胞，特别是哺乳动物细胞，更加优选的是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在示例性具体实施方式中，该细胞系为广泛用于生产重组蛋白(如糖蛋白等)的类型。在示例性具体实施方式中，该细胞系为CHO细胞系。从ATCC可获得大量的CHO细胞系。合适的CHO细胞系包括但不限于CHO-K1细胞及其衍生物。
重组糖蛋白
本发明的另一个方面包括通过根据本发明的方法生产的重组糖蛋白(例如β-葡萄糖脑苷脂酶)，其具有末端为甘露糖的N聚糖。
在一个具体实施方式中，该重组糖蛋白是酶，如β-葡萄糖脑苷脂酶。在一个具体实施方式中，该重组糖蛋白具有包含一个或一个以上末端甘露糖残基的N聚糖。在一些具体实施方式中，该重组糖蛋白具有包含2至9个末端甘露糖残基(也称为Man2至Man9)-如3至6个末端甘露糖残基(也称为Man3至Man6))-以及不会封闭末端甘露糖残基的任选的1至3个岩藻糖残基(也称为1F至3F)-如1个岩藻糖残基(也称为1F)-的N聚糖。本发明中的示例性N聚糖选自Man3、Man4、Man4+1F、Man5、Man5+1F、Man6等组成的组。在一个具体实施方式中，连接至重组糖蛋白的末端为甘露糖的N聚糖的比例高于80％、85％、86％、87％、88％或89％。
使用p-硝基苯基-b-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma-N7006)作为基质来测定酶活性。释放的产物为4-硝基苯酚(Sigma-35836-1G)，其通过利用酶标仪(MOLECULAR DEVICE，i3X)测定405m处的吸光度来检测。同时测定参考标准曲线以定量4-硝基苯酚的浓度。酶活性被定义为在37℃每小时催化1纳摩尔的从每毫升p-硝基苯基-b-D-吡喃葡萄糖苷中释放的4-硝基苯酚所用酶的量。在一个具体实施方式中，通过根据本发明的细胞系生产的β-葡萄糖脑苷脂酶的酶活性大于约0.2U/mL、约0.3U/m、约0.4U/mL、约0.5U/mL、约0.6U/mL。
重组糖蛋白被纯化并且纯度大于约70％、大于约75％、大于约80％、大于约85％、大于约90％。纯度可分别通过Caliper-SDS和SEC-HPLC测定来检测。
治疗方法
本发明的另一个方面包括用于治疗缺乏β-葡萄糖脑苷脂酶相关疾病(如戈谢氏病)的方法，该方法包括对有需要的受试者施用根据本发明的具有末端为甘露糖的N聚糖的重组糖蛋白，如β-葡萄糖脑苷脂酶，或者包括根据本发明的具有末端为甘露糖的N聚糖的重组糖蛋白，如β-葡萄糖脑苷脂酶，在制造用于治疗缺乏β-葡萄糖脑苷脂酶相关疾病(如戈谢氏病)的组合物中的用途。
本发明的技术效果
根据本发明的方法/产品能达到的技术效果可被总结如下。
首先，通过使细胞(如CHO细胞)中的表达重组糖蛋白(如β-葡萄糖脑苷脂酶)的MGAT1基因突变，本发明具有高纯度、高质量和高酶活性。
第二，本发明开发出了包括具有更高突变效率的特异性sgRNA(例如，SEQ ID NO：4所列的sgRNA_5)的新质粒。
第三，在本发明中，在生产缺乏MGAT1的细胞系步骤中，可通过使用蓖麻凝集素-I(RCA-I)培养来进一步富集缺乏MGAT1的细胞系。
第四，在本发明中，在使细胞中的MGAT1基因突变前将编码重组糖蛋白的基因导入细胞中，这样做的好处是由于对用于克隆体筛选的关于被表达重组糖蛋白的产品质量属性(PQA)和生产率要求明确，生产具有末端为甘露糖的N聚糖的重组糖蛋白相较于在先技术中的方法更省时、省钱和省力。相反地，先筛选表现最佳的具有MGAT1基因突变的宿主细胞再将编码重组糖蛋白的基因导入已突变宿主细胞中将变得困难得多，因为用于筛选最佳宿主细胞的PQA和生产率不存在如此限定清晰的标准。筛选更好的克隆体比筛选宿主细胞所需的时间更短。另外，在根据本发明的方法中，突变和克隆是在同一步骤中进行的。
药物制剂
本发明的另一个方面包括β-葡萄糖脑苷脂酶的药物制剂。该制剂包括药学上有效量的β-葡萄糖脑苷脂酶、缓冲剂、渗透调节剂和表面活性剂。在一个具体实施方式中，β-葡萄糖脑苷脂酶的含量为50-150U/ml、75-125U/ml、80-120U/ml、90-110U/ml或100U/ml。在一个具体实施方式中，缓冲剂是含量为2-10g/mL、3-9g/mL、4-8g/mL、5-7g/mL或5-6g/mL的柠檬酸盐缓冲剂。在一个具体实施方式中，渗透调节剂是含量为40-120g/L、50-110g/L、60-100g/L、70-90g/L或80g/L的蔗糖。在一个具体实施方式中，表面活性剂是含量为0.1-1g/L、0.1-0.9g/L、0.1-0.8g/L、0.1-0.7g/L、0.1-0.6g/L、0.1-0.5g/L、0.1-0.4g/L、0.1-0.3g/L或0.2g/L的聚山梨醇酯80。在一个具体实施方式中，该制剂的pH为5-7。
本发明中所描述的药物制剂提供了β-葡萄糖脑苷脂酶的稳定制剂，其保质期更长，也更加稳定。该制剂在2-8℃能保持稳定至少12周，或在室温(约25℃)能保持稳定至少12周，或在40℃能保持稳定至少4周。在不同存储条件下，该制剂能保留其物理和/或化学和/或生物活性。
序列表总结
本申请所附的是包括如下大量核酸和氨基酸序列的序列表。
SEQ ID NO：1是人β-葡萄糖脑苷脂酶的氨基酸序列(NP 000148.2)(https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_000148.2)。
SEQ ID NO：2是人β-葡萄糖脑苷脂酶的核酸序列(NM_000157.3)(https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000157.3)。
SEQ ID NO：3是CHO-K1细胞中的MGAT1基因的基因组核酸序列。
SEQ ID NO：4是sgRNA_5的核酸序列。
缩写
Cas：CRISPR相关
CEX：阳离子交换
CHO细胞：中国仓鼠卵巢细胞
CRISPR：规律间隔成簇短回文重复序列
DSB：双链断裂
FACS：荧光活化细胞分选
GnT I：N-乙酰-葡萄糖胺转移酶I
gRNA：向导RNA
HDR：同源介导的修复
HILIC：亲水作用液相色谱
LDC：有限稀释克隆
MGAT1：甘露糖基(α-1，3-)-重组糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶
NHEJ：非同源末端连接
ORF：开放阅读框
ori：复制起点
PAM：前间区序列邻近基序
PCR：聚合酶链式反应
Qp：单位生产率
RT：响应对获取时间
sgRNA：单链向导RNA
SpCas9：酿脓链球菌Cas9
TALEN：类转录激活因子效应物核酸酶
UPLC：超高效液相色谱
VCD：可变细胞密度
VIA：存活率
ZFN：锌指核酸酶
2-AB：2-氨基苯甲酰胺
实施例
已经整体说明的本发明将通过结合以下的实施例变地更加易于理解，以下的实施例是处于例举之目的，而非对本发明进行限定。这些实施例并不是为了表明所有实验都已进行或仅仅进行了这些实验。
实施例I
生成稳定表达β-葡萄糖脑苷脂酶的CHO细胞
包含SEQ ID NO：2(NM_000157.3，可从https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NM_000157.3获得)所列的核酸序列、用于编码已在基因库登记、入藏号为NP_000148.2(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_000148.2，SEQ ID NO：1)的β-葡萄糖脑苷脂酶的质粒和两个抗生素通过可商业上获得的脂质体分别转染入在BM001H培养基中培养的CHO-K1细胞，该培养基可从Thermo Fisher Scientific Inc.购得。
使用p-硝基苯基-b-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma-N7006)作为基质来测定酶活性。释放的产物为4-硝基苯酚(Sigma-35836-1G)，其通过利用酶标仪(MOLECULAR DEVICE，i3X)测定405nm处的吸光度来检测。同时测定参考标准曲线以定量4-硝基苯酚的浓度。酶活性被定义为在37℃每小时催化1纳摩尔的从每毫升p-硝基苯基-b-D-吡喃葡萄糖苷中释放的4-硝基苯酚所用酶的量。
具有较高酶活性以及在分批再补料培养中存活率高的细胞池被筛选出并用于克隆。结果如表1所示。
表1：稳定细胞池分批再补料培养筛选
Figure BPA0000328507520000081
实施例II
稳定表达β-葡萄糖脑苷脂酶的细胞池中的MGAT1基因的突变
构建含有Cas9和靶向MGAT1的gRNA的质粒。靶向MGAT1的gRNA被设计然后连接(1igated)进入含有图1所示的Cas9蛋白的内部载体。选定SEQ ID NO：4(sgRNA_5，TGACAATGGCAAGGAGCAGA)所列的sgRNA5备用。
如图1所示的sgRNA_5质粒通过商业上可获得的脂质转染被转染进入用实施例I的方法制备的细胞池。
RCAI(蓖麻凝集素)也被用于克隆体筛选，因为蓖麻凝集素被发现对野生型CHO-K1细胞具有高毒性，所有从RCAI选定中存活下来的突变体都含有功能异常的MGAT1。一旦克隆体被回收在96孔板中，它们就被分为两板，一个板A在常规培养基中培养，而另一个板B则在具有RCA选定的培养基中培养。从具有RCAI的培养基的板B中回收的克隆体通过酶活性检测被选定和筛选。在酶活性筛选之后，具有较高酶活性和基于其单个细胞图像确认的单克隆性的单克隆体从在常规培养基中培养的板A中选出并从板A扩增。
单克隆体依序从96孔板扩增至24孔板，再到离心管。在扩增过程中生长不良的克隆体被弃置。同时，通过测序对所有单克隆体进行MGAT1突变分析，具有MGAT1突变的克隆体被选出用于分批再补料筛选。接种时，细胞培养物通过在离心管中以5×105细胞/mL的浓度稀释至新鲜生产培养基中以进行接种。从第3天开始，培养基的大部分每天都通过新鲜生产培养基来更新。当VCD到达稳定期(plateau)时，每天进行流放处理(bleeding process)，在该处理中，VCD被调节从而使它在下一天保持在峰值VCD。葡萄糖也根据消耗量加入培养物中。由于培养基的大部分被频繁更新，细胞能够以最优状态被培养，使得VIA通常比传统补料分批工艺(fed-batch process)保持得更好。结果就是，分批再补料更加适合于生产脆弱的生物制剂，如当前情况下易受内源性蛋白酶或酶影响的融合蛋白。对克隆体的分批再补料上清液进行酶活性分析。克隆体的酶活性也使用p-硝基苯基-b-D-吡喃葡萄糖苷(Sigma-N7006)作为基质来测定。释放的产物为4-硝基苯酚(Sigma-35836-1G)，其通过利用酶标仪(MOLECULAR DEVICE，i3X)测定405nm处的吸光度来检测。同时测定参考标准曲线以定量4-硝基苯酚的浓度。酶活性被定义为在37℃每小时催化1纳摩尔的从每毫升p-硝基苯基-b-D-吡喃葡萄糖苷中释放的4-硝基苯酚所用酶的量。根据中国专利申请CN108588127A的方法制备的克隆被用作对照。
选用具有较高β-葡萄糖脑苷脂酶酶活性和Qp的最优克隆体，通过阳离子交换色谱法和疏水作用色谱法对它们的上清液进行纯化。对被纯化的酶进行SEC、Caliper-SDS、N聚糖分析。
基于酶活性、Qp、细胞培养表现、单克隆性、低拷贝数及包括SEC、甘露糖水平、Caliper-SDS(未还原)在内的产品质量来选定最终克隆体。最终克隆体显示了单个核酸插入原始MGAT1序列的功能区，导致该基因功能异常(表2)。
表2：最终克隆体的排序结果
Figure BPA0000328507520000082
/>
Figure BPA0000328507520000091
最终克隆体展示了比对照克隆体更高的酶活性和更好的生产率(表3)。最终克隆体的平均酶活性为0.54U/mL，而对照克隆体的平均酶活性为0.26U/mL。并且最终克隆体的平均Qp为0.020U/mL/细胞/日，高于对照克隆体。
表3：分批再补料筛选中的最终克隆体表现
Figure BPA0000328507520000092
通过Caliper-SDS分析分别检测最终克隆体生产的β-葡萄糖脑苷脂酶的未还原纯度和已还原纯度，CaliperLC90CE-SDS凝胶技术，PerkinElmer
Figure BPA0000328507520000093
(Caliper)设计了能够在数分钟内以与标准SDS-PAGE相似的灵敏度分析蛋白的基于芯片的自动化荧光检测法。数据显示未还原β-葡萄糖脑苷脂酶的纯度为87.7％，而对照克隆体的为70.6％(表4)。/>
表4：最终克隆体的Caliper-SDS结果
Figure BPA0000328507520000101
开发了特异性SEC方法来分析最终克隆体的单体和聚集体。使用了AgilentAdvanceBio SEC柱(
Figure BPA0000328507520000105
7.8mm×300mm，2.7μm)，并使用等度洗脱梯度(isocratic elutiongradient)来进行分离。如表5所示，最终克隆体表达β-葡萄糖脑苷脂酶单体的百分比比对照克隆体的高。
表5：最终克隆体的SEC结果
Figure BPA0000328507520000102
确定了MGAT1基因突变对β-葡萄糖脑苷脂酶的N连接糖基化的影响。通过UPLC法分析了N聚糖的特性(profiling)。由快速肽N-糖苷酶F(PNGase F)释放N寡糖，然后释放的寡糖被2-AB标记。基于HILIC的UPLC被用于分离和定量N聚糖。具有野生型MGAT1基因的细胞池被用作对照。
如表6和图2所示，在所有与最终克隆体表达的β-葡萄糖脑苷脂酶相连的N聚糖中，有89.3％是末端为甘露糖的N聚糖，即N连接的Man3、Man4、Man4+1F、Man5、Man5+1F、Man6等。相较于对照池(图3)，N连接的Man5的比例在最终克隆体中显著提高，导致高得多的Man水平。这些数据清楚的表明表达β-葡萄糖脑苷脂酶的CHO细胞中MAGT1基因的突变显著提高了与重组β-葡萄糖脑苷脂酶相连的末端为甘露糖的N聚糖的比例。
表6：最终克隆体的聚糖结果
Figure BPA0000328507520000103
实施例III
制剂制备
从实施例II的最终克隆体生产的β-葡萄糖脑苷脂酶以表7所示方式制成制剂。
表7：β-葡萄糖脑苷脂酶的药物制剂
Figure BPA0000328507520000104
在该制剂中所使用的材料包括：20mM柠檬酸盐缓冲剂，8％(w/v)蔗糖，0.02％(w/v)PS80，pH 6.0。
制备1kg的PS80储备溶液(10％w/w)
成分称重如下：100g PS80和900g水。已称重材料被放入容器中。混合溶液直至目视全部PS80溶解。
制备1kg的制剂缓冲剂
成分称重如下：0.64g柠檬酸一水合物、4.81g柠檬酸三钠二水合物、77.52g蔗糖、1.94g的10％(w/w)PS80储备溶液、915.09g水。已称重的赋形剂全部转入1L容器中。将水加入容器直至总重量达到1000g。混合溶液直至目视全部赋形剂完全溶解。
稀释和混合1L的DS
制剂缓冲剂将被加入DS(如酶比活性为44.5U/mg并且酶活性为4.1mg/mL)来完成蛋白(100U/mL)混合。0.55L DS被倒入容器中，然后将0.45L制剂缓冲剂也放入同一容器中。然后均匀混合稀释的DS。
实施例IV
制剂研究
表8展现了该制剂的关键表现研究。该研究表明，该制剂在2-8℃能保持稳定至少12周，或在室温(约25℃)能保持稳定至少12周，或在40℃能保持稳定至少4周。在不同存储条件下，该制剂能保留其物理和/或化学和/或生物活性。
表8A制剂的外观/渗透压/pH/水分/重构时间
Figure BPA0000328507520000111
表8B制剂蛋白浓度/纯度
Figure BPA0000328507520000112
表8C制剂的DLS/HIAC/酶活性
Figure BPA0000328507520000121
外观
清洁玻璃瓶的外壁，然后将玻璃瓶的瓶颈靠近YB-2灯箱的遮光板边缘，距离为25cm。以2000-3750lx的照明水平对着黑白背景检查样本的外观，包括颜色、澄清度和可视颗粒。
渗透压
用Advanced 2020测定20μL未稀释样本的渗透压。在测定前后，使用290mOsm参考溶液校准渗压计。pH
在使用前用三种不同的标准缓冲剂(pH 4.01，7.00 and 9.21)校准pH计。此后，对每个样本以50μL的装样量(loading volume)测定pH。
水分
用Mettler Toledo C30D卡尔费休库仑计(Mettler Toledo C30D Karl Fischercoulometer)测定含水量。室温为约15-30℃，而空气湿度为50％以下。首先添加分析物，再平衡仪器直至相对漂移值低于15μg/分钟。然后打开冻干粉并称重，加入仪器中直至仪器显示水分含量读数。为了避免冻干粉从空气吸收水分，该过程从打开粉末到称重粉末必须快速进行。
重构时间
从玻璃瓶移除flip-off铝盖，用无菌注射器从瓶壁将超纯水加入瓶中以防止直接撞击冻干样本。轻微旋转瓶，并在被超纯水完全浸润后静置。记录从超纯水被注入到冻干样本全部溶解的时间。
蛋白浓度
在样本混合均匀后，使用NanoDrop 2000分光光度计通过UV280读数确定蛋白浓度。消光系数为1.703AU*mL*mg-1*cm-1。以每次2.5μL的装样量重复所有测定两次，取均值。
CE-SDS(NR&R)
由高压直流电场驱动的CE-SDS是可根据分子大小进行样本分离的毛细管电泳方法。介质为填充在毛细管中的连续凝胶，其构成毛细管中的分子筛并用作分离通道。对于CE-SDS，在电泳前的样本制备涉及在存在SDS的情况下对指定浓度的样本进行热变性，这掩蔽了样本的固有电荷并赋予所有物种(species)相似的电荷尺寸比。一经施加恒定电场，样本就基于其尺寸以不同的速度朝向阳极迁移。
CE-SDS-NR
用于WBP108的CE_NR法是在以下实验条件下进行的：50μg的样本被移入稀释溶液PB-CA中，使总体积为25μL，然后加入75μL的1％SDS样本缓冲剂和5μL的烷基化试剂使最终体积为105μL，并使溶液彻底混合。在加热块(heating block)中以60℃培育样本10分钟，然后在室温下冷却至少3分钟。将90μL的已制备样本移入插入物中，将插入物放入瓶中。盖好瓶，然后将瓶放入样本瓶托进行样本分析，注射时间为40秒。
CE-SDS-R
CE_R法是在以下实验条件下进行的：50μg的样本被移入稀释溶液PB-CA中，使总体积为25μL，然后加入75μL的1％SDS样本缓冲剂和5μL的还原试剂使最终体积为105μL，并使溶液彻底混合。在加热块中以60℃培育样本10分钟，然后在室温下冷却至少3分钟。将90μL的已制备样本移入插入物中，将插入物放入瓶中。盖好瓶，然后将瓶放入样本瓶托进行样本分析，注射时间为40秒。
RP-HPLC
反相色谱法(RPC)是指使用非极性反相介质作为固定相并使用极性有机溶剂的水溶液作为流动相来基于溶质极性(疏水性)的不同来分离和纯化溶质的洗脱色谱法。通过疏水相互作用使溶质分布在固定相的表面上。但是，RPC固定相的表面完全被非极性基团覆盖，显示了强疏水性。因此，需要使用极性有机溶剂(如甲醇、乙腈等)或其水溶液来进行洗脱和分离。
RP法是在HPLC系统上并在以下实验条件下进行的：用Waters BioResolve TM PRmAb聚苯，450A，2.7um，2.1mm*150mm，1/pk作为柱；含0.1％TFA的水溶液和含0.1％TFA的ACN溶液作为流动相；选定280nm作为UV探测器波长；柱温被设定为45℃；使样本处于5℃；等度流速为0.3mL/分钟；注射量为10μg，运行时间为27分钟。
SEC-HPLC
尺寸排阻色谱(SEC)法，也被称为凝胶过滤法，在分子通过封装在柱中的SEC树脂时基于尺寸(水力学半径)的不同分离分子。SEC树脂由球形颗粒的多孔基质组成，所述颗粒被设计为不与待分离分子相互作用。在被应用至柱后，比孔大的分子无法扩散至珠粒中，因此会被先洗脱。比孔尺寸小的分子可基于其尺寸不同程度地穿透孔。
SEC法是在HPLC系统上并在以下实验条件下进行的：用Agilent AdvanceBio SEC(
Figure BPA0000328507520000131
7.8mm*300mm，2.7μm)作为柱；应用55mM柠檬酸钠+200mM L-精氨酸(pH为5.5±0.1)作为流动相；选定280nm作为UV探测器波长；柱温被设定为25℃；使样本处于5℃；等度流速为0.6mL/分钟；注射量为30μg，运行时间为40分钟。除了下文所注明的例外情形，该SEC法被应用于本报告中的所有研究。
DLS
当激光束通过颗粒时由于溶液中颗粒的布朗运动会发生散射现象。可使用DLS通过测定溶液中颗粒的扩散系数来计算和获取颗粒的水力学半径。DLS分析在MalvemZEN3600上进行。将70μL样本加入生物安全罩中的一次性试管中在25℃测试。
HIAC
通过HIAC系统监视不溶性颗粒(Sub-visible particles)。每个样本被连续测试四轮(1mL/轮)。放弃第一轮的结果，记录剩余三轮的均值。最后，通过软件自动计算数据，并且结果以每毫升中≥10μm和≥25μm的颗粒的平均数呈现。
酶活性
稀释的酶与20mM p-NPG在37℃混合1h。加入1M甘氨酸来停止反应。测定405nm处的吸光度，生成与样本中酶的活性成正比的信号。绘制酶反应产物P-NP的标准曲线并使用SoftMax软件根据线性回归模型进行回归分析。通过将测试样本的OD值与标准曲线比较来计算测试样本的酶活性。
本领域的技术人员将会进一步理解可以其它具体形态来实现本发明，而不会背离本发明的宗旨或核心属性。由于本发明的前述说明仅仅公开了其示例性具体实施方式，应当理解，其它变形可被视为在本发明的范围内。因此，本发明并不局限于本说明书已经详细说明的特定具体实施方式。相反，应当参考表明了本发明的范围和内容的权利要求。
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Claims (27)

1.缺乏甘露糖基(α-1，3-)-重组糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶1(MGAT1)基因的基因修饰细胞系，其特征在于，所述基因修饰细胞系在编码MGAT1的染色体序列的编码区包括少于600bp的插入。
2.根据权利要求1所述的基因修饰细胞系，其特征在于，所述细胞系在所述编码MGAT1的染色体序列的编码区包括少于400、200、100、50、30、10或5bp的插入。
3.根据权利要求1或2所述的基因修饰细胞系，其特征在于，所述细胞系在所述编码MGAT1的染色体序列的编码区包括1bp的插入。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的基因修饰细胞系，其特征在于，利用靶向核酸内切酶介导的基因组编辑技术来修饰所述编码MGAT1的染色体序列。
5.根据权利要求4所述的基因修饰细胞系，其特征在于，所述靶向核酸内切酶介导的基因组编辑技术是规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)、锌指核酸酶(ZFN)或类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的基因修饰细胞系，其特征在于，所述细胞为动物细胞，优选的为哺乳动物细胞，更加优选的为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的基因修饰细胞系，其特征在于，所述细胞系表达包括一个或一个以上末端甘露糖残基的至少一个糖蛋白。
8.根据权利要求7所述的基因修饰细胞系，其特征在于，所述糖蛋白是酶，如β-葡萄糖脑苷脂酶。
9.用于生产重组糖蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)培养权利要求7或8所述的细胞系；和
(2)回收所述糖蛋白。
10.用于生产重组糖蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将编码所述重组糖蛋白的基因导入细胞系；
(2)使步骤(1)获取的细胞系中的甘露糖基(α-1，3-)-重组糖蛋白β-1，2-N-乙酰葡萄糖胺基转移酶1(MGAT1)基因突变；和
(3)表达所述重组糖蛋白，
其中，通过CRISPR来使所述MGAT1基因突变，其中sgRNA包括SEQ ID NO：4核酸序列或由SEQ ID NO：4核酸序列组成，或者sgRNA包括与SEQ ID NO：4核酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的核酸序列或由与SEQ ID NO：4核酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的核酸序列组成。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，利用RCA选定所述细胞系。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述重组糖蛋白是酶，如β-葡萄糖脑苷脂酶。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括在分批再补料实验中选定突变细胞系的步骤。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述分批再补料实验包括每日更新生产介质的步骤。
15.根据权利要求10-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组糖蛋白具有包含一个或一个以上末端甘露糖残基的N聚糖以及不会封闭所述末端甘露糖残基的任选的1至3个岩藻糖残基，所述一个或一个以上末端甘露糖残基优选的为1至9个末端甘露糖残基，更加优选的为3至6个末端甘露糖残基，其中所述N聚糖选自Man3、Man4、Man4+1F、Man5、Man5+1F和Man6组成的组。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，与所述重组β-葡萄糖脑苷脂酶相连的末端为甘露糖的所述N聚糖的比例高于80％、85％、86％、87％、88％或89％。
17.根据权利要求11-16中任一项所述的方法，其特征在于，所述重组糖蛋白的酶活性大于0.5U/mL。
18.根据权利要求11-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述细胞为动物细胞，优选的为哺乳动物细胞，更加优选的为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
19.用权利要求1-8任一项所述的细胞系或权利要求9-18中任一项所述的方法生产的重组糖蛋白，如β-葡萄糖脑苷脂酶。
20.用于治疗缺乏β-葡萄糖脑苷脂酶相关疾病-如戈谢氏病-的方法，其特征在于，所述方法包括对有需要的受试者施用权利要求19所述的重组糖蛋白，如β-葡萄糖脑苷脂酶。
21.通过权利要求9-18中任一项所述的方法生成的细胞、克隆体或细胞系。
22.药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括药学上有效量的重组酶、缓冲剂、渗透调节剂和表面活性剂。
23.根据权利要求22所述的制剂，其特征在于，所述酶是含量为50-150U/mL的β-葡萄糖脑苷脂酶。
24.根据权利要求22或23所述的制剂，其特征在于，所述缓冲剂是含量为2-10g/mL的柠檬酸盐缓冲剂。
25.根据权利要求22-24中任一项所述的制剂，其特征在于，所述渗透调节剂是含量为40-120g/L的蔗糖。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的制剂，其特征在于，所述表面活性剂是含量为0.1-1g/L的聚山梨醇酯80。
27.根据权利要求22-26中任一项所述的制剂，其特征在于，所述制剂的pH为5-7。
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